WO2021230664A1 - 사쿠비트릴, 발사르탄 및 네비보롤을 포함하는 심부전 및 허혈성 심질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 이를 포함하는 약제학적 복합제제 - Google Patents

사쿠비트릴, 발사르탄 및 네비보롤을 포함하는 심부전 및 허혈성 심질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 이를 포함하는 약제학적 복합제제 Download PDF

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valsartan
sacubitril
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heart failure
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PCT/KR2021/005973
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김해양
손동민
이풍석
최근식
허홍구
손수진
이하나
박지은
동을원
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에리슨제약(주)
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    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating heart failure and ischemic heart disease, comprising sacubitril, valsartan and nebivolol, and a pharmaceutical combination formulation comprising the same.
  • Heart failure refers to a condition that occurs because the heart's ability to receive blood in its relaxation function or its contractile function to discharge blood decreases due to structural or functional abnormalities of the heart, which prevents it from supplying necessary blood to body tissues. This is not a specific disease but a complex pathophysiology. syndrome you have Heart failure is a disease in which the patient complains of not being able to breathe because of insufficient blood supply, not only with severe panting, difficulty breathing, but also extreme fatigue, as if he was drowning in water. When the heart function deteriorates, the compensatory mechanism to maintain blood flow to major organs is activated. is needed
  • ischemic heart disease angina pectoris, myocardial infarction, etc.
  • arrhythmias caused by a combination of chronic diseases that can cause abnormal tone in the heart muscle for a long period of time, such as high blood pressure, appear as the second cause.
  • patient noncompliance is a factor that aggravates heart failure.
  • the development of a therapeutic agent that can increase the patient's medication compliance by reducing the number of doses is required. have.
  • the ischemic heart disease is a disease caused by insufficient blood supply to a part of the heart muscle due to narrowing or blockage of a coronary artery supplying blood to the heart, and appears as angina pectoris, myocardial infarction or sudden death (sudden cardiac death).
  • tablets containing sacubitril, an inhibitor of neprilysin, and valsartan, an angiotensin receptor antagonist (ARB) are marketed under the product name Entresto.
  • the indication for Entresto Tablet is to reduce the risk of death from cardiovascular disease and hospitalization due to heart failure in chronic heart failure patients (NYHA class II-IV) with reduced left ventricular systolic function. It is administered twice a day, and in this regard, Korean Patent Registration No. 10-1589317, which is a prior patent, states that sacubitril and valsartan in tablet form release an average of 40% (by weight) or more of valsartan free acid after 10 minutes. Immediate release formulations exhibiting an in vitro dissolution profile are disclosed.
  • sacubitril and valsartan are in the form of free acids, sodium, calcium salts, etc., respectively, and tablets containing fillers, binders, lubricants, surfactants and/or lubricants as pharmaceutical additives, etc. Although disclosed, it is described as having the same release properties as Entresto tablets.
  • Chinese Patent No. 105748420 and Chinese Patent Laid-Open No. 105935358 disclose sustained-release formulations using hydroxypropylmethylcellulose, a hydrophilic sustained-release polymer, for oral administration once a day.
  • a sustained-release formulation to which a hydrophilic sustained-release polymer is applied it can be confirmed that the dissolution tendency of sacubitril and valsartan is different as disclosed in Chinese Patent Laid-Open No. 105935358.
  • the dissolution test results show that the dissolution rate of sacubitril is up to about 21% lower than that of valsartan at 8 hours, and about 18% lower even at 12 hours. This difference in dissolution rate may appear as a pharmacokinetic difference, and as a result, there is a possibility that it may act toward reducing the synergistic effect of sacubitril and valsartan.
  • the blood half-lives of valsartan and sacubitrilat are on the long side, 9.9 hours and 11.5 hours, respectively. It may be prolonged and cause unintended side effects by increasing the degree of exposure in the body.
  • side effects such as hypotension, renal dysfunction, and increased blood potassium concentration can be problematic.
  • Entresto tablet has a problem of reducing the Cmax and AUC of metformin when used in combination with metformin.
  • the present inventors have intensively studied a combination drug with fewer side effects while increasing the therapeutic effect of heart failure and ischemic heart disease. Of course, it was confirmed that there is an effect of suppressing cardiac hypertrophy and cardiac fibrosis and improving side effects.
  • the patient's dosing convenience can be improved by the optimal formulation composition that can reduce the number of twice-a-day dosing of sacubitril and valsartan to once a day and at the same time exhibit a dissolution tendency that matches sacubitril and valsartan.
  • the pharmaceutical composition and combination preparation of the present invention were completed.
  • 2019-0013509 discloses a pharmaceutical composition for the treatment of heart failure comprising sacubitril corresponding to a NEP inhibitor and nebivolol corresponding to a ⁇ -blocker.
  • sacubitril corresponding to a NEP inhibitor and nebivolol corresponding to a ⁇ -blocker.
  • none of these documents discloses the composition of combining sacubitril and valsartan with a specific beta blocker, nebivolol, and the synergistic effect exerted thereby.
  • It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising sacubitril and valsartan and nebivolol, which can exhibit excellent therapeutic effects for heart failure and ischemic heart disease and reduce side effects.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical combination preparation comprising sacubitril, valsartan, and nebivolol, which can exhibit a useful therapeutic effect even when taken once a day.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a pharmaceutical combination formulation comprising sacubitril and valsartan and nebivolol.
  • the present invention provides sacubitril and valsartan or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And nebivolol or a pharmaceutically acceptable salt thereof; relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of heart failure and ischemic heart disease, comprising as an active ingredient .
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include active ingredients sacubitril, valsartan, and nebivolol in a molar ratio of 1: 0.1 to 10: 0.001 to 0.5, preferably in a molar ratio of 1: 0.2 to 5: 0.002 to 0.3. can do.
  • the heart failure and ischemic heart disease include heart failure with reduced ejection fraction, heart failure with preserved ejection fraction, cardiac fibrosis due to heart failure, nonobstructive hypertrophic cardiomyopathy, heart failure with atrial fibrillation, heart failure with diabetes, angina, myocardial infarction, and myocardial infarction requiring lowering of blood pressure. may be selected.
  • the present invention sacubitril and valsartan, or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And nebivolol or a pharmaceutically acceptable salt thereof; relates to a pharmaceutical combination comprising as an active ingredient.
  • the pharmaceutical combination preparation of the present invention may include sacubitril and valsartan and nebivolol in a molar ratio of 1: 0.1 to 10: 0.001 to 0.5, preferably in a molar ratio of 1: 0.2 to 5: 0.002 to 0.3. have.
  • the combination formulation may include: a first release unit comprising sacubitril and valsartan or a pharmaceutically acceptable salt thereof; a second release portion comprising sacubitril and valsartan or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and at least one of a nonionic hydrophobic polymer and a lipid as a sustained release base; and a third release part comprising nebivolol or a pharmaceutically acceptable salt thereof; may include.
  • the first release unit and the third release unit may be immediate or sustained release, but preferably immediate release. That is, according to one preferred embodiment, the combination formulation of the present invention may include an immediate-release first-release portion, a sustained-release second-release portion, and an immediate-release third release portion.
  • the nonionic hydrophobic polymer is at least one of cellulose acetate and ethyl cellulose as a cellulose derivative, and the lipid is glyceryl dibehenate, glyceryl distearate, glyceryl monooleate, and glyceryl palmitostea as fatty acid esters. rate;
  • the fatty alcohol may be at least one selected from the group consisting of stearyl alcohol, cetostearyl alcohol, and myristyl alcohol.
  • the weight ratio of the active ingredient of the first emitting part and the second emitting part may be 1:3 to 1:9.
  • the first release part is to further include an excipient, a disintegrant, and a lubricant
  • the second release part is ethyl cellulose, glyceryl dibehenate, glyceryl distearate, stearyl alcohol, cetostearyl as a sustained-release base.
  • Alcohol and at least one selected from the group consisting of myristyl alcohol, and further comprises at least one of excipients and lubricants
  • the third release part is further excipients, disintegrants, surfactants, binders and lubricants. may include.
  • the excipient is at least one selected from the group consisting of lactose hydrate, corn starch, anhydrous calcium hydrogen phosphate, and microcrystalline cellulose
  • the lubricant is stearic acid magnesium, talc, stearic acid, sodium stearyl fumarate, and at least one selected from the group consisting of colloidal silicon dioxide
  • the disintegrant is croscarmellose sodium, starch It is at least one selected from the group consisting of sodium glycolate, low-substituted hydroxypropyl cellulose, carboxymethylcellulose calcium, and crospovidone
  • the binder in the third release part is polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylmethylcellulose , and at least one selected from the group consisting of hydroxypropyl cellulose
  • the surfactant may be at least one of polysorbate and sodium lauryl sulfate.
  • the first release part based on the total weight of the first release part, 10 to 70% by weight of active ingredients, 5 to 70% by weight of excipients, 15 to 35% by weight of disintegrants, and 0.5 to 3.5% by weight of lubricants;
  • the second release portion contains 40 to 70% by weight of an active ingredient, 15 to 50% by weight of a sustained release base, 1 to 25% by weight of at least one of excipients and lubricants, based on the total weight of the second release portion;
  • the third release portion based on the total weight of the third release portion, 0.5 to 5% by weight of active ingredient, 60 to 90% by weight of excipient, 1 to 20% by weight of disintegrant, 0.1 to 2% by weight of surfactant, 0.5 to 10% by weight of binder % and 0.2 to 3% by weight of the lubricant.
  • the combination formulation may be an oral dosage form twice a day or once a day, preferably, an oral dosage form once a day.
  • the combination formulation may be administered as a once-a-day regimen to satisfy the pharmacokinetic parameters of sacubitril and valsartan as follows:
  • the relative ratio of Cmax is 50-100% sacubitril, 50-100% sacubitrilat, and 50-100% valsartan, preferably Preferably, the relative proportions of Cmax are 50-90% sacubitril, 50-90% sacubitrilat, and 50-90% valsartan.
  • the pharmacokinetic parameters of nebivolol may be within the equivalence range of a conventionally marketed nebivolol immediate-release preparation administered as a once-a-day regimen.
  • the composite preparation may be in the form of a multi-layer tablet or a core tablet tablet, or a hard capsule preparation filled with granules, pellets, or mini-tablets.
  • the pharmaceutical combination formulation according to the dissolution test method 2 (paddle method) of the Korean Pharmacopoeia, when the dissolution test at 37 ⁇ 0.5 ° C and pH 6.8 dissolution conditions, sacubitril and valsartan 30 minutes each based on the weight Less than 40% after 2 hours, 40-70% after 2 hours, and 80% or more can be eluted after 12 hours.
  • the combination formulation according to the dissolution test method 2 (paddle method) of the Korean Pharmacopoeia, when the dissolution test at 37 ⁇ 0.5 °C, pH 1.2 dissolution conditions, nebivolol is more than 75% of the dissolution in 30 minutes based on its weight.
  • a method for preparing a pharmaceutical combination preparation comprising the steps of: (a) preparing a first release part comprising sacubitril and valsartan or a pharmaceutically acceptable salt thereof as active ingredients; (b) preparing a second release portion comprising sacubitril and valsartan or a pharmaceutically acceptable salt thereof as active ingredients, and at least one of a nonionic hydrophobic polymer and a lipid as a sustained-release agent; (c) preparing a third release part comprising nebivolol or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient; and (d) the first release part, the second release part, and the third release part are compressed together into a three-layer tablet, or granules, pellets or mini-tablets are prepared and then filled into hard capsules.
  • Sacubitril is a neprilysin (NEP) inhibitor, which is activated as sacubitrilat by deethylation of esterase, and is a blood pressure lowering peptide, atrial and brain natriuretic peptide. acts to decompose.
  • NEP neprilysin
  • One component 'Valartan' used in the present invention is (S)-N-(1-carboxy-2-methyl-propyl-1-phyll)-N-pentanoyl-N-[2'-(1H) -Tetrazol-5-yl)biphenyl-4-yl-methyl]amine, which has a structure of the following formula (2).
  • angiotensin-II receptor blocker As an angiotensin-II receptor blocker, valsartan not only relaxes blood vessels and lowers blood pressure by blocking the action of angiotensin-II, but is also used for the treatment of heart failure and ischemic heart disease.
  • Nebivolol is 1-(6-fluorochroman-2-yl)- ⁇ [2-(6-fluorochroman-2-yl) It is a compound named -2-hydroxy-ethyl]amino ⁇ ethanol and has a structure of the following formula (3).
  • Nebivolol is a drug with high selectivity for the ⁇ 1-adrenergic receptor and is used for the treatment of cardiovascular diseases such as essential hypertension, chronic heart failure, and arteriosclerosis.
  • the sacubitril and valsartan are treated with an initial dose of 50 mg twice a day, once (24.3/25.7 mg as sacubitril/valsartan), if necessary, 200 mg twice a day, once (sacubitril) As valsartan, the dose can be increased up to 97.2/102.8 mg).
  • nebivolol starts treatment at 1.25 mg once a day, and if necessary, it can be increased to 2.5 mg once a day, 5 mg once a day, 10 mg once a day, and the maximum daily dose is 10 mg. .
  • 'pharmaceutically acceptable salts' of sacubitril and valsartan mean salts commonly used in the art, and include salts prepared with inorganic ions, inorganic acids or organic acids, as well as hydrates of the salts. or solvates, and the like.
  • Examples of sacubitril and valsartan or pharmaceutically acceptable salts thereof suitable for the present invention include free acids or inorganic ionic salts of 1 to 3 sodium, calcium, potassium, magnesium, or monohydrates or trihydrates thereof.
  • Specific examples include a co-crystal form such as 2.5 hydrate of sacubitril/valsartan trisodium salt conventionally known as LCZ696, or a free acid or salt mixture form of each active ingredient, but is not limited thereto.
  • salts' of nebivolol include inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, and the like; or salts with organic acids such as acetic acid, propanoic acid, hydroxyacetic acid, 2-hydroxypropanoic acid, 2-oxopropanoic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc., preferably hydrochloric acid and acid addition salts of
  • the active ingredients sacubitril and valsartan and nebivolol may be included in a molar ratio of 1: 0.1 to 10: 0.001 to 0.5, preferably in a molar ratio of 1: 0.2 to 5: 0.002 ⁇ 0.3 can be included.
  • composition of the present invention in which sacubitril and valsartan are combined with nebivolol expands blood vessels by promoting nitric oxide generation compared to using each component alone or two components of sacubitril and valsartan, thereby providing blood to the heart muscle It can significantly increase the supply and cardiac output, and accordingly, ischemic heart disease such as angina pectoris, myocardial infarction, myocardial infarction requiring lowering of blood pressure, and decreased ejection fraction Heart failure, preservation of ejection fraction Heart failure, cardiac fibrosis due to heart failure, non-obstructive hypertrophic myocardium It can show a synergistic effect in the treatment of heart failure, such as heart failure with atrial fibrillation.
  • ischemic heart disease such as angina pectoris, myocardial infarction, myocardial infarction requiring lowering of blood pressure, and decreased ejection fraction Heart failure
  • preservation of ejection fraction Heart failure cardiac fibrosis due to heart failure
  • nebivolol reduces renin secretion and reduces angiotensinogen appearing at the upper level of RAS (Renin-Angiotensin System), thereby lowering ACE activity. It seems to reduce side effects.
  • RAS Renin-Angiotensin System
  • an increase in heart rate is a factor that increases mortality and cardiovascular risk in heart failure patients.
  • Nebivolol is a beta blocker that is effective in reducing heart rate, so it can be expected to be an optimal combination for a patient group where heart rate management is important.
  • nebivolol does not exhibit drug interaction when used in combination with metformin and has the advantage of not increasing the incidence of diabetes compared to other beta-blockers. It can be usefully applied to the group of patients with heart failure accompanied by diabetes who must be used in combination.
  • the pharmaceutical combination preparation includes: an immediate-release first release unit comprising sacubitril and valsartan or a pharmaceutically acceptable salt thereof; a sustained-release second-release portion comprising sacubitril and valsartan or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and at least one of a nonionic hydrophobic polymer and a lipid as a sustained-release agent; and an immediate-release third release unit comprising nebivolol or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • sacubitril and valsartan as an immediate-release first release portion and a sustained-release second release portion, it is possible to immediately release these components after drug administration, while enabling sustained release over 12 hours or more. There is this.
  • the weight ratio of the active ingredient of the first release part and the second release part is preferably 1:3 to 1:9, more preferably 1:4 to 1:9.
  • the ratio of the second release part increases because the weight ratio of the active ingredient exceeds 1:9, it is not preferable because the time until the drug effect occurs is delayed, and the ratio of the second release part is less than 1:3, It is undesirable because it is difficult to achieve a sustained release effect over 12 hours or more in the case of loss.
  • At least one of a nonionic hydrophobic polymer and a lipid is included.
  • the nonionic hydrophobic polymer or lipid is a material having a property of being immiscible with water molecules, and generally has no polarity, so it has a property of being well soluble in a non-polar solvent, and does not have a functional group having an anion or a cation.
  • the nonionic hydrophobic polymer is a cellulose derivative, such as cellulose acetate, ethyl cellulose, and the like, and the lipid is a fatty acid ester such as glyceryl dibehenate, glyceryl distearate, glyceryl monooleate, glyceryl palmitostearate, or stearyl Fatty acid alcohols, such as alcohol, cetostearyl alcohol, and myristyl alcohol. At least one selected from the group consisting of such nonionic hydrophobic polymers and lipids may be used as a sustained-release agent.
  • sustained-release base preferably at least one selected from the group consisting of ethyl cellulose, glyceryl dibehenate, glyceryl distearate, stearyl alcohol, cetostearyl alcohol, and myristyl alcohol is used, and more preferably uses at least one selected from the group consisting of ethyl cellulose, glyceryl dibehenate, and stearyl alcohol, and most preferably uses ethyl cellulose and glyceryl dibehenate.
  • the second release part of the present invention may be a granule material having an apparent density of 0.30 to 0.45 g/mL, a tap density of 0.40 to 0.60 g/mL, and a particle size (D 90 ) of 1000 ⁇ m or less, preferably 100 to 1000 ⁇ m.
  • D 90 particle size
  • the first release unit comprising sacubitril and valsartan, an excipient, a disintegrant, and a lubricant; and at least one selected from the group consisting of sacubitril and valsartan, ethyl cellulose, glyceryl dibehenate, glyceryl distearate, stearyl alcohol, cetostearyl alcohol, and myristyl alcohol as a sustained-release agent, excipients and lubricants
  • a second release unit comprising at least one of the agents; and a third release part comprising nebivolol, an excipient, a disintegrant, a surfactant, a binder, and a lubricant.
  • One or more selected from crospovidone, sodium starch glycolate, croscarmellose sodium, low-substituted hydroxypropyl cellulose, carboxymethyl cellulose, polysorbate, and sodium lauryl sulfate can be used as the disintegrant in the complex formulation of the present invention. have.
  • a pharmaceutically commonly used substance can be used within the range that does not affect the drug efficacy, and one selected from lactose hydrate, corn starch, anhydrous calcium hydrogen phosphate, and microcrystalline cellulose. more can be used.
  • the lubricant may prevent the surface of the tablet from adhering to the tableting punch during tableting and increase the fluidity of the granules.
  • at least one selected from magnesium stearate, talc, stearic acid, sodium stearyl fumarate, and colloidal silicon dioxide may be used.
  • the excipient used is at least one of lactose hydrate, corn starch, anhydrous calcium hydrogen phosphate, and microcrystalline cellulose, preferably microcrystalline cellulose, and one of lactose hydrate more than one species
  • the disintegrant is one or more of crospovidone, sodium starch glycolate, croscarmellose sodium, low-substituted hydroxypropyl cellulose, carboxymethyl cellulose, polysorbate, and sodium lauryl sulfate, preferably crospovidone, and croscarmellose sodium
  • the lubricant is at least one of magnesium stearate, talc, stearic acid, sodium stearyl fumarate, and colloidal silicon oxide, preferably magnesium stearate, talc, colloidal It is at least one kind of silicon dioxide.
  • the binder is at least one of polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylmethylcellulose, and hydroxypropylcellulose
  • the surfactant is at least one of polysorbate and sodium lauryl sulfate.
  • the excipient used in the second release part is at least one of lactose hydrate, corn starch, anhydrous calcium hydrogen phosphate, and microcrystalline cellulose, preferably at least one of microcrystalline cellulose and lactose hydrate, and the lubricant is stearic acid.
  • the first release part based on the total weight of the first release part, 10 to 70% by weight of active ingredients, 5 to 70% by weight of excipients, 15 to 35% by weight of disintegrants, and 0.5 to 3.5% by weight of lubricants
  • the second release portion may contain 40 to 70% by weight of an active ingredient, 15 to 50% by weight of a sustained-release agent, 1 to 25% by weight of at least one of excipients and lubricants, based on the total weight of the second release portion, and
  • 0.5 to 22 wt% of the excipient and 0.5 to 3 wt% of the lubricant may be included.
  • the third release portion based on the total weight of the third release portion 0.5 to 5% by weight of active ingredient, 60 to 90% by weight of excipients, 1 to 20% by weight of disintegrant, 0.1 to 2% by weight of surfactant, 0.5 to 10% by weight of binder It may be one containing 0.2 to 3% by weight of the lubricant.
  • the combination preparation of the present invention is a form that can be administered orally, and is not limited, but may be a tablet, a capsule, or the like.
  • the first release unit, the second release unit, and the third release unit may be in the form of tablets or capsules compressed and compressed after being prepared as separate granules.
  • the tablet may be in the form of a multi-layered tablet such as a double-layered tablet or a three-layered tablet, and the capsule may be in the form of a hard capsule including granules, pellets, and mini-tablets.
  • FIG. 1 A schematic diagram of a combination formulation according to a specific embodiment of the present invention is shown in FIG. 1 .
  • the combination preparation of the present invention comprises the steps of: (a) preparing a first release part comprising sacubitril and valsartan or a pharmaceutically acceptable salt thereof as active ingredients; (b) preparing a second release portion comprising sacubitril and valsartan or a pharmaceutically acceptable salt thereof as active ingredients, and at least one of a nonionic hydrophobic polymer and a lipid as a sustained-release agent; (c) preparing a third release part comprising nebivolol or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient; and (d) the first release part, the second release part, and the third release part are compressed together into a three-layer tablet, or granules, pellets or mini-tablets are prepared and then filled into hard capsules.
  • the first, second, and third discharge parts of steps (a), (b) and (c) may be manufactured through wet granulation.
  • step (a) of preparing the first release part is, (a-1) adding water, alcohol, or an aqueous alcohol solution solvent to a mixture containing an active ingredient, an excipient, and a disintegrant, and kneading to prepare a combined product ; (a-2) drying and sizing the kneaded product to prepare granules; (a-3) mixing an excipient and a disintegrant to the granulate; and (a-4) adding a lubricant.
  • step (a-1) water, alcohol, or an alcohol-aqueous solvent is added to perform the union.
  • the alcohol includes at least one of methanol, ethanol, and isopropanol.
  • Step (b) of preparing the second release part (b1-1) preparing a binding solution by dispersing the sustained-release base in a solvent containing alcohol or an aqueous alcohol solution; (b1-2) mixing an active ingredient, a sustained-release base, and an excipient, and then adding a binding solution to knead to prepare a kneaded product; (b1-3) preparing granules by curing and sizing the kneaded product after drying, or sizing and curing after drying; and (b1-4) adding a lubricant to the granules.
  • a binding solution by dispersing (b1-1) in an alcohol or an aqueous alcohol solution solvent in which the sustained-release agent is dispersed.
  • the alcohol includes at least one of methanol, ethanol, and isopropanol.
  • the sustained-release base in step (b1-2) may be the same as or different from the sustained-release base used in (b1-1).
  • drying is performed at 35 to 60° C. using a tray dryer or a fluidized bed granulator, and the LOD value is checked.
  • Sizing is carried out using a 20 mesh, and before and after sizing, it is heated to a temperature of 60 to 80° C. and cured for 20 minutes to 3 hours, preferably 25 minutes to 2 hours. In this way, by curing before or after sizing, the effect of maximizing the drug release delay of sacubitril and valsartan can be obtained.
  • the wet granulation process of step (b) is not particularly limited, but for example, a device used in the art, such as a high speed mixer (HSM) or a fluid bed granulator (FBG), is used. can be done by a high speed mixer (HSM) or a fluid bed granulator (FBG).
  • HSM high speed mixer
  • FBG fluid bed granulator
  • the step (b) of preparing the second release part comprises the steps of: (b2-1) mixing the active ingredient, and a sustained-release base, followed by hot-melt extrusion; (b2-2) preparing granules by sizing the extrudate; and (b2-3) adding a lubricant to the granules.
  • Step (c) of preparing the third release part (c-1) preparing a binding solution by putting a surfactant in an aqueous alcohol solvent; (c-2) adding a binding solution to a mixture containing an active ingredient, an excipient, a binder and a disintegrant and kneading to prepare a kneaded product; (c-3) drying and sizing the kneaded product to prepare granules; (c-4) mixing an excipient and a disintegrant to the granules; and (c-5) adding a lubricant.
  • the co-formulation may further include a pharmaceutically acceptable film coating as a final outer layer.
  • a pharmaceutically acceptable film coating agent a trade name of Opadry (Opadry, Colorcon), specifically, Opadry I, Opadry II, Opadry fx, Opadry AMB, etc. may be used.
  • the first release portion, the second release portion and the third release portion prepared as above may be in the form of a multi-layer tablet including a mini-tablet, a double-layer tablet, or a core tablet.
  • first discharge unit, the second discharge unit, and the third discharge unit use a hot melt extruder (HME), or a pellet manufacturing method using an extruder and a spheronizer It can be manufactured.
  • HME hot melt extruder
  • pellet manufacturing method using an extruder and a spheronizer It can be manufactured.
  • the pellets using the hot melt extrusion (HME) method are mixed with an active ingredient, a sustained-release agent, and an excipient, put into a heated hot melt extruder, and two screws are rotated in opposite directions to extrude granules.
  • HME hot melt extrusion
  • pellets using an extruder and a spheronizer are kneaded by adding an active ingredient and a binder to the binding solution, extruded into a mesh sieve using an extruder, spheronized using a spheronizer, dried, and then released Pellets are prepared by spraying and drying the chemical agent.
  • the first discharge unit, the second discharge unit, and the third discharge unit prepared as above may be in the form of a capsule filled with pellets.
  • the contents filled in the capsule are not limited to pellets, but may include granules, mini-tablets, and the like.
  • the combination formulation of the present invention according to the dissolution test method 2 (paddle method) of the Korean Pharmacopoeia, when the dissolution test at 37 ⁇ 0.5 °C, pH 6.8 dissolution conditions, the active ingredients sacubitril and valsartan the weight of the active ingredient As a standard, less than 40% after 30 minutes, 40-70% after 2 hours, and 80% or more after 12 hours may be eluted.
  • the combination formulation of the present invention through an in vitro dissolution test, is slowly and continuously released for more than 12 hours, so that it can be administered once a day. was found to be maximized.
  • the combination preparation of the present invention includes the patient's disease type, disease severity, dosage form, patient's age, sex, weight, health status, diet, administration time and administration method of the pharmaceutical composition for treatment, administration route, excretion rate, and It can be prescribed in various ways depending on factors such as reaction sensitivity.
  • the amount of blood supply and cardiac output to the heart muscle is reduced compared to using each component alone or two components of sacubitril and valsartan. It significantly increases and more effectively inhibits cardiac hypertrophy and cardiac fibrosis, thereby having an excellent treatment effect for ischemic heart disease and heart failure, as well as reducing side effects.
  • the combination formulation of the present invention can maximize the drug efficacy according to the combination with nebivolol while exhibiting a consistent dissolution tendency of sacubitril and valsartan, and enables drug release of sacubitril and valsartan from the initial stage of drug administration. There is an effect of minimizing side effects while maintaining the drug effect continuously in the body.
  • the cure rate of the group administered once a day (70.9) %) can be significantly improved than the cure rate (58.9%) of the group administered twice a day, improving the dosing regimen from twice a day administration to once a day administration
  • the present invention it is possible to improve not only the patient's medication compliance, but also the therapeutic effect.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a three-layer tablet according to a specific embodiment of the present invention.
  • 2(A) and 2(B) are graphs comparing the expression rates of biomarkers BNP and sST2 according to each test group in the in vitro test of Experimental Example 1 using H9C2(2-1) cells.
  • 3(A) and 3(B) are graphs comparing the expression rates of biomarkers BNP and Collagen I according to each test group as a result of Experimental Example 2 for a heart failure rat model.
  • FIG. 4 is a graph comparing the biomarker eNOS expression rate according to each test group as a result of Experimental Example 2 for a heart failure rat model.
  • FIG. 5(A) is an image of the result of Mason's trichrome staining of the heart tissue extracted from the heart failure rat model
  • FIG. 5(B) is a graph showing the quantified value of the degree of fibrosis.
  • FIG. 6(A) is an image of TNF- ⁇ immunohistochemical staining results for cardiac tissue extracted from a heart failure rat model
  • FIG. 6(B) is a graph showing the quantified value of the expression level of TNF- ⁇ .
  • FIG. 7 is a graph evaluating the dissolution patterns of valsartan and sacubitril of formulations prepared according to Examples 1-2.
  • FIG. 9 is a graph evaluating the dissolution patterns of valsartan and sacubitril of the formulation prepared according to Example 3-3.
  • FIG. 10 is a graph evaluating the valsartan dissolution pattern of formulations prepared according to Examples 3-1 and 3-4, and Comparative Examples 2-1 and 2-2.
  • FIG. 11 is a graph evaluating the dissolution patterns of valsartan, sacubitril and nebivolol of the combination formulation according to Example 4.
  • granules corresponding to the second release part were prepared and then compressed into tablets. That is, a binder solution is prepared by dispersing a portion of the sustained-release agent in an ethanol solvent, and sacubitril/valsartan, a sustained-release agent, and microcrystalline cellulose are added to a high speed mixer (HSM) and mixed, then the binder solution is added and stirred While kneading for 5 minutes to prepare a kneaded product. The combined product was dried using a tray dryer, and after sizing in the sizing machine, the sized product was again cured by raising the temperature to 60-80° C. in the tray drier for 25 minutes to 2 hours.
  • HSM high speed mixer
  • magnesium stearate was added to the granules, followed by lubrication mixing to form the final sustained-release granules. And the granules were compressed with a rotary tablet press (XENA-I-rotary, Raongena) to prepare tablets.
  • Example 1-1 1-2 1-3 1-4 1-5 1-6 active ingredient Sacubitril / Valsartan 55.0 39.4 39.4 39.4 39.4 39.4 39.4 39.4 Westernization gize ethyl cellulose 42.0 - - - - - glyceryl dibehenate - 57.6 - - - - Glyceryl Distearate - - 57.6 - - - stearyl alcohol - - - 57.6 - - myristyl alcohol - - - - 57.6 - cetostearyl alcohol - - - - - 57.6 excipient Microcrystalline Cellulose 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 lubricant magnesium stearate 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 Sum 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 10
  • sustained-release tablets were prepared using the dry granulation method described in Chinese Patent Laid-Open No. 105935358. That is, according to the component composition of Table 2 below, sacubitril/valsartan, HPMC K100M, a hydrophilic sustained-release base, and colloidal silicon dioxide and magnesium stearate as pharmaceutically acceptable additives were mixed, and a dry granulator (RC-60, Seoul Hi-Tech), colloidal silicon dioxide and magnesium stearate were added to the final granules formed by compression and pulverization, followed by mixing and tableting. Tablets were compressed using Opadry AMBTM in a film coating machine (Auto Tablet Coating Machine, KC50F, Geumseongsan Machinery) to obtain film-coated tablets.
  • a dry granulator RC-60, Seoul Hi-Tech
  • Example in 2 as sacubitril/valsartan, tablets were prepared using the free acid or mono-trisodium salt hydrate in a molar ratio of 1:1 to sacubitril and valsartan, and the ingredients listed in the table below. That is, sacubitril / valsartan, microcrystalline cellulose and crospovidone were put in a high speed mixer (High Speed Mixer, HSM: KMLC, Geumseongsan) and mixed, and then the binding solution was added and kneaded for 5 minutes while stirring to prepare a kneaded product.
  • HSM High Speed Mixer
  • the above-mentioned kneaded product was dried using a tray dryer (MOV-212F, SANYO) and sized in a sizing machine (UMA, Pharmaters). Crospovidone, colloidal silicon dioxide and magnesium stearate were added to the granulated material, followed by mixing and tableting. .
  • Example 2-1 Example 2-2
  • Example 2-3 Example 2-4 Sacubitril / Valsartan sodium salt water (N) 0
  • N 0
  • Microcrystalline Cellulose 12.4 12.4 12.4 12.4 crospovidone 29 29 29 colloidal silicon dioxide 0.5 0.5 0.5 0.5 magnesium stearate 1.5 1.5 1.5 1.5
  • Sacubitril / valsartan, microcrystalline cellulose, and crospovidone were put in a high speed mixer (HSM) and mixed, and then an ethanol solvent was added and kneaded while stirring to prepare a kneaded product.
  • HSM high speed mixer
  • the combined product was dried using a tray dryer. Thereafter, after sizing in a sizing machine, colloidal silicon dioxide and crospovidone were added, followed by post-mixing. Thereafter, magnesium stearate was added to the granules to form a final first-release granulate.
  • the first release unit granules and the second release unit granules prepared above are tableted using a multi-layer tableting machine, so that the weight ratio of the active ingredients of the first release unit and the second release unit is 1:2 to 1:10. was prepared.
  • Example 4 The manufacturing steps of Example 4 according to the component contents of Table 5 are as follows.
  • Sacubitril/valsartan, microcrystalline cellulose, and crospovidone were put in a high-speed mixer and mixed, and then an ethanol solvent was added and kneaded while stirring to prepare a kneaded product.
  • the combined product was dried using a tray dryer. Thereafter, after sizing in a sizing machine, colloidal silicon dioxide and crospovidone were added, followed by mixing, and magnesium stearate was added to the granules to form a final first-release granulate.
  • a binding solution was prepared by dispersing ethyl cellulose in an ethanol solvent. Sacubitril/valsartan, glyceryl dibehenate and microcrystalline cellulose were put into a fluid bed granulator (FBG: FBG-1, Enger) and mixed, and then the binder was sprayed to prepare a combined product. The combined product was dried, and the temperature was raised to 60-80° C. and cured for 25 minutes to 2 hours. Thereafter, after sizing in a sizing machine, magnesium stearate was added to the granules, followed by lubrication to form a final second-release granulated material.
  • FBG fluid bed granulator
  • nebivolol, croscarmellose sodium, hypromellose, lactose hydrate and corn starch are mixed in a high-speed mixer, and then the binder solution is added and kneaded while stirring. was prepared.
  • the combined product was dried using a fluidized bed dryer. Thereafter, after sizing in a sizing machine, croscarmellose sodium and microcrystalline cellulose were added, followed by mixing, and colloidal silicon dioxide and magnesium stearate were added to the granules to form a final third-release granule.
  • the first release part, the second release part, and the third release part prepared above were compressed together using a multi-layer tablet press (Autotab 200RT, Ichihashiceiki) to prepare a three-layer tablet.
  • a multi-layer tablet press Autotab 200RT, Ichihashiceiki
  • H9C2(2-1) cells (Rat origin/Heart/Myocardium) were purchased from ATCC (American Type Culture Collection) and used. H9C2(2-1) cells were cultured using a medium containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum/fetal bovine serum), penicillin 10,000U/ml, and streptomycin 10mg/ml in DMEM/F-12 medium. Using a cell culture vessel (cell culture dish/t75 flask) 5% CO 2 , cultured at 37 °C.
  • FBS Fetal Bovine Serum/fetal bovine serum
  • penicillin 10,000U/ml penicillin 10,000U/ml
  • streptomycin 10mg/ml in DMEM/F-12 medium.
  • the cells proliferated about 80% they were washed 3 times with 15 ml PBS, treated with 0.25% trypsin-EDTA (37°C, 5min), suspended the cells, and then centrifuged (1,200rpm, 5min, 4°C). The cell pellet was recovered, and subcultured by dispensing in a medium containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum/fetal bovine serum), penicillin 10,000 U/ml, and streptomycin 10 mg/ml in DMEM/F-12 medium again. The medium was refreshed every 2 days.
  • FBS Fetal Bovine Serum/fetal bovine serum
  • penicillin 10,000 U/ml penicillin 10,000 U/ml
  • streptomycin 10 mg/ml in DMEM/F-12 medium again. The medium was refreshed every 2 days.
  • H9C2 cells were cultured in a cell culture vessel, treated with 0.25% Trypsin-EDTA to float the cells, and then recovered by centrifugation.
  • the cells were aliquoted in a 6-well plate at 5 X 10 5 cells/1ml media/well, cultured for 24 hours, treated with Angiotensin II (20uM), and cultured for 12 hours.
  • the composition of the test group was shown in Table 6, and the test drug was treated with a treatment concentration within the range without cytotoxicity confirmed through MTT assay in advance, and cultured for 6, 12, and 24 hours.
  • the untreated group was not treated with both angiotensin II and the drug
  • the negative control group was treated with only angiotensin II and no drug, but cultured under the same conditions as other test groups.
  • the test drug was treated and cultured in H9C2 cells, and then washed once with PBS.
  • RiboEx TM was treated with 1 mL (37° C., 5 min) to float the cells, then recovered, and homogenized for 5 minutes at room temperature. After centrifugation (12,000rpm, 15min, 4°C), 0.2mL of chloroform was added, vortexed for 15 seconds at room temperature, or shaken well by hand, and then reacted at room temperature for 2 minutes. After centrifugation (12,000rpm, 15min, 4°C), the RNA of the supernatant was taken. RNA was extracted using the GeneAll hybrid-R RNA purification kit. The quantity and quality of RNA were checked with the nano-drop equipment, and RNA was quantified in each sample, and DNA synthesis was performed with the cDNA Synthesis Kit.
  • protein extraction was performed using H9C2 cells treated and cultured with the test drug. After removing the medium, it was washed with PBS. After separating the cells from the plate with a scraper, the separated cells were transferred to a microtube, and then all of the supernatant was removed after centrifugation (10,000 rpm, 5 min, 4° C.). In 800 ⁇ L of RIPA buffer, 32 ⁇ L (4%) of a protease inhibitor was added. The tube was placed on ice, fixed, and mixed well for 5 seconds. After centrifugation (13,000rpm, 10min, 4°C), only the supernatant was transferred to a microtube and stored at -20°C.
  • ELISA analysis was performed using the quantified protein. Antibodies were coated, washed with PBS, and wells were treated with 3% BSA (in PBS) and incubated at room temperature for 2 hours. After washing with PBS, 50 ⁇ L of primary antibody was added to each well of a sample and a standard protein sample in a 96-well plate. Antigen-antibody binding was performed at room temperature for 4 hours. After washing with PBS, 50 ⁇ L of HRP (horseradish peroxidase)-conjugated secondary antibody was added to each well, followed by incubation at 4° C. overnight (overnight) for binding, and analysis was performed with an ELISA reader.
  • HRP horseradish peroxidase
  • BNP B-type natriuretic peptides
  • aldosterone which are natriuretic peptides corresponding to heart failure biomarkers
  • sST2 Soluble Source of Tumorigenicity 2
  • cGMP cyclic guanosine monophosphate
  • PKG protein kinase G
  • sacubitril / valsartan and nebivolol treatment group As a result of biomarker measurement for the BNP, aldosterone, sST2, collagen I, collagen III, FAS, cGMP, PKG, etc., in the case of the sacubitril / valsartan and nebivolol treatment group according to the present invention, sacubitril / valsartan and other beta It was confirmed that it could inhibit cardiac hypertrophy and cardiac fibrosis more effectively and enhance the therapeutic effect of heart failure compared to the blocker (carbedilol or bisoprolol) treatment group.
  • the increase rate of NO production by activating eNOS was high, and it was confirmed that it effectively inhibits the secretion of cytokines such as TNF- ⁇ , IL-10, and IL-6, and CRP, thereby exhibiting an excellent anti-inflammatory action.
  • the BNP expression rate was higher in the angiotensin II untreated group compared to the angiotensin II treated group (G2 group). It decreased the most to a similar degree to that of sacubitril/valsartan and other beta-blockers (carbedilol or bisoprolol) treated group (G4 group or G5 group) (FIG. 2(A)).
  • the sacubitril/valsartan and nebivolol-treated group (G3 group) significantly decreased the expression rate of sST2 compared to the G2 group ( FIG. 2(B) ).
  • a heart failure model was prepared by performing a transverse aortic constriction (TAC) method on 7-week-old male SD rats (Sprague-Dawley Rat).
  • TAC transverse aortic constriction
  • Zoletil 50 VIRBAC, France
  • xylazine Rosun®, Bayer AG, Germany
  • Hair removal was performed, and disinfection was performed using povidone and 70% alcohol. After securing an airway using an endotracheal tube, it was connected to a ventilator.
  • test group was configured as shown in Table 7 below, and for the sham control group (G1 group), an open chest was performed without aortic stenosis (TAC), and the chest cavity and skin were sutured. All rats had free access to a standard diet and water and were maintained at room temperature at 20 ⁇ 3° C. and humidity at 50 ⁇ 2% and on a 12 hour light/dark cycle.
  • Sacubitril/valsartan and nebivolol were administered repeatedly once a day for a total of 4 weeks, and after the test was completed, the rats were anesthetized and euthanized for evaluation.
  • ischemic heart disease preferably reduced ejection fraction heart failure (HFrEF), ejection fraction preserved heart failure (HFpEF), cardiac fibrosis due to heart failure, nonobstructive hypertrophic cardiomyopathy, heart failure with atrial fibrillation, and
  • HFrEF reduced ejection fraction heart failure
  • HFpEF ejection fraction preserved heart failure
  • cardiac fibrosis due to heart failure preferably nonobstructive hypertrophic cardiomyopathy
  • nonobstructive hypertrophic cardiomyopathy ejection fraction preserved heart failure
  • heart failure with atrial fibrillation ejection fraction preserved heart failure
  • the test material was administered to the test animals for 4 weeks, and then changes in biomarkers were measured according to a known method using RT-PCR, Western blot, ELISA, and Immunohistochemistry methods. .
  • natriuretic peptides (B-type natriuretic peptides), which are biomarkers for heart failure, sST2 (Soluble Source of Tumorigenicity 2), collagen I, which are biomarkers related to cardiac remodeling and cardiac hypertrophy, and fibrosis Changes in biomarkers known to be associated with cardiac function and structural changes such as heart failure, cardiac fibrosis, cardiac remodeling and cardiac hypertrophy, including (collagen I) and collagen III, were measured.
  • eNOS endothelial nitric oxide synthase
  • TNF- ⁇ an inflammatory cytokine, was measured because it is known to show a prognosis of increased and increased mortality.
  • each echocardiogram was performed and left ventricular internal dimension diastole (LVIDD) , and Left Ventricular Interanl Dimension In Systole (LVIDS) were evaluated, and Fractional Shortening (FS) and End-Diastolic Volume (EDV), End-Systolic Volume, ESV) and ejection fraction (EF) were calculated.
  • LIDD left ventricular internal dimension diastole
  • LIDS Left Ventricular Interanl Dimension In Systole
  • FS Fractional Shortening
  • EDV End-Diastolic Volume
  • ESV End-Systolic Volume
  • EF ejection fraction
  • heart failure heart tissue is separated from the rat (SD), it undergoes a fixation process to prevent deformation of the heart tissue using formalin solution, and the fixed heart tissue is made into a paraffin block and is 4 ⁇ m thick using a microtome knife. It was sliced on the slide with a section of . To confirm the degree of cardiac fibrosis, Masson's trichrome staining was performed. As a way to know that collagen is generated, the part dyed in blue is the part where collagen is deposited.
  • FIG. 5(A) is an image of Mason's trichrome staining result in the heart tissue of an animal model of heart failure after TAC procedure
  • FIG. 5(B) is a quantified value (%) of the degree of fibrosis.
  • Vitrile/valsartan and nebivolol administration group (G5 group) significantly inhibited fibrosis compared to the group administered only with excipients without drug administration after TAC (G2 group), and sacubitril/valsartan administered group (G4 group) or nebivolol It was confirmed that there was an effect of inhibiting fibrosis even compared to the administration group (G3 group).
  • the sliced samples were incubated in 0.3% hydrogen peroxide diluted in methanol for 30 minutes to eliminate peroxidase activation. After washing with PBS (Phosphate buffer saline) for 20 minutes, the primary antibody slice sample was treated, reacted at room temperature for 20 minutes, and washed with PBS for 5 minutes. After reacting with 1% BSA (Bandeiraea simplicifolia agglutinin in PBS) for 20 minutes, washing with PBS for 5 minutes, removing PBS around the tissue, and then dropping the diluted primary antibody sufficiently on the tissue. Incubated for 30 minutes at room temperature in a chamber maintained in humidity, washed with PBS for 10 minutes taking care not to dry, and the secondary antibody was sufficiently dropped on the tissue.
  • PBS Phosphate buffer saline
  • the sacubitril/valsartan and nebivolol administration group (G5 group) according to the present invention was treated with TAC. Afterwards, the expression of TNF- ⁇ was decreased compared to the group administered with only the excipient (G2 group), and it was confirmed that the expression of TNF- ⁇ was decreased compared to the group administered with sacubitril/valsartan or nebivolol.
  • a dissolution test was performed to evaluate the dissolution pattern of the tablets prepared in Example 1 and Comparative Example 1, and more specific dissolution test conditions and HPLC analysis conditions are as follows.
  • Dissolution rate (%) pH6.8 Comparative Example 1 Dissolution time (h) valsartan Sacubitril 0.25 8.2 4.6 0.5 14.5 8.9 One 23.9 14.5 1.5 32.2 20.3 2 39.0 25.3 3 50.4 33.9 5 67.2 47.4 6 74.2 53.4 8 84.4 63.4 10 91.4 71.5 12 96.0 78.4
  • Example 1 the apparent density, tap density, Carr index, and particle size were evaluated in order to examine the characteristics of the sized granulate immediately before mixing after the lubricant. That is, the apparent density was determined by measuring the weight using a 100 mL cylinder, and the tap density was determined by measuring the volume by filling the 100 mL cylinder and tapping 1250 times with a tap density measuring device (SVM122, ERWEKA), Flowability was determined by obtaining Carr's Index using the apparent density and tap density values.
  • SVM122, ERWEKA tap density measuring device
  • the granules prepared according to the method of Examples 1-1 to 1-6 showed a uniform distribution having a particle size (D 90 ) in the range of 100 to 1000 ⁇ m, and also having an apparent density of 0.30 to 0.45. g/mL, and had a tap density of 0.40 to 0.60 g/mL.
  • D 90 particle size
  • valsartan and sacubitril match, respectively, to be less than 40% after 30 minutes, 40 to 70% after 2 hours, and 80% or more after 12 hours, based on the weight. It was confirmed that it has an effect on enabling sustained release and appropriate delayed release of these active ingredients by showing the released dissolution profile.
  • a commercially available Entresto tablet 100 mg (sacubitril 48.6 mg/valsartan 51.4 mg, sacubitril/valsartan 100 mg) (Lot No. TU149, expiration date: 2021.08.20) was used as a control formulation, and the control formulation and The dissolution test of the sacubitril/valsartan component was performed compared with the tablet of Example 2 prepared so that the active ingredient content was the same.
  • the specific test method is as follows, and the HPLC analysis conditions are the same as in Experimental Example 3.
  • Example 2-4 and 100 mg of Entresto Tablet, a control formulation showed a dissolution profile consistent with valsartan and sacubitril, and it was confirmed that 90% or more of the active ingredient was released within 30 minutes in water, pH 4.0, and pH 6.8. .
  • valsartan and sacubitril showed the same dissolution profile, and the active ingredient was found in water, pH4.0, and pH6.8 within 30 minutes. It was confirmed that more than 90% was emitted.
  • Example 3 In order to evaluate the dissolution pattern of the tablets prepared in Example 3 and Comparative Example 2, a dissolution test was performed under the same conditions as those of Experimental Example 3, and HPLC analysis conditions were the same as those of Experimental Example 3.
  • Example 3 and Comparative Example 2 The dissolution test results of Example 3 and Comparative Example 2 are shown in FIGS. 9 and 10 .
  • the tablet of Example 3-3 reached about 30% or less at 30 minutes of the dissolution test, and then the active ingredient was continuously released for 12 hours, and it was confirmed that sacubitril and valsartan were released in a very similar form.
  • the tablets of Examples 3-1 and 3-4 showed less than about 40% by weight of valsartan after 30 minutes, and 40-70% after 2 hours. And 80% or more was released after 12 hours, so it was confirmed to have fast-acting and long-acting.
  • the dissolution test results for the three-layer tablet of Example 4 are shown in FIG. 11 .
  • the three-layer tablet of Example 4 was confirmed to have fast-acting and long-lasting properties by releasing less than about 40% by weight of sacubitril and valsartan after 30 minutes, 40-70% after 2 hours, and 80% or more after 12 hours, respectively.
  • nebivolol reached more than 75% in 30 minutes of the dissolution test, indicating fast-acting.
  • Nebiret Tablet 5mg Before administration (0 hours), 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 8, 12 hours after the first administration (2nd administration) 12.5, 13, 13.5, 14, 16 , 20, 24 hours.
  • the collected blood was centrifuged to separate plasma and stored frozen until analysis. After a sufficient withdrawal period of 14 days, a 3x3 crossover design was conducted and the plasma drug concentration was analyzed by LC-MS/MS.
  • the inactive type sacubitril showed 98.45%
  • the active type sacubitrilat, valsartan and nebivolol were 91.10% and 117.58, respectively. %, 120.75%, so it is judged to be similar to the reference drug (Entresto tablet, Nebiret tablet) in terms of the therapeutic effect of each active ingredient.

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Abstract

본 발명은 사쿠비트릴 및 발사르탄과, 네비보롤을 포함하는 심부전 및 허혈성 심질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 이를 포함하는 약제학적 복합제제에 관한 것으로서, 상기 조성물은 우수한 심부전 치료 효과가 있을 뿐만 아니라, 부작용을 감소시킬 수 있는 효과가 있고, 상기 복합제제는 1일 1회 투여로도 1일 2회 투여하는 제제와 동등한 치료효과를 나타내는 것은 물론, 환자의 복약순응도를 크게 개선할 수 있다.

Description

사쿠비트릴, 발사르탄 및 네비보롤을 포함하는 심부전 및 허혈성 심질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 이를 포함하는 약제학적 복합제제
본 발명은 사쿠비트릴, 발사르탄 및 네비보롤을 포함하는 심부전 및 허혈성 심질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 이를 포함하는 약제학적 복합제제에 관한 것이다.
심부전은 심장의 구조적 또는 기능적 이상으로 인해 심장이 혈액을 받아들이는 이완 기능이나 혈액을 내보내는 수축 기능이 감소하여 신체조직에 필요한 혈액을 공급하지 못해 발생하는 상태를 말하며 이는 특정 질병이 아니라 복잡한 병태생리를 가지고 있는 증후군이다. 심부전은 환자가 혈액이 제대로 공급되지 않아, 심하게 헐떡거리고, 호흡이 곤란할 뿐 아니라 극도의 피로감을 호소하며 마치 물속에 빠져 숨을 쉴 수 없는 느낌을 호소하는 질환이다. 심장기능이 저하되면 주요 장기로의 혈류량을 유지하려는 보상기전이 활성화되나, 이러한 보상기전이 부적절하게 지속되면 심부전이 점차 악화되므로, 원인/악화요인 조절 등으로 부적절한 보상기전의 악순환의 고리를 끊는 치료가 필요하다.
심부전은 허혈성 심질환(협심증, 심근경색 등)에 의한 심근의 허혈이 가장 큰 원인이고 고혈압과 같이 심장 근육에 오랜 기간 긴장도 이상을 초래할 수 있는 만성질환이 합병되어 일어나는 부정맥이 2위 원인으로 나타난다. 이외 심부전을 악화시키는 인자로 환자의 복약 비순응(noncompliance)이 있음을 알 수 있는데, 만성 심부전 환자의 관리에 있어 복용 횟수 감소를 통해 환자의 복약 순응도(compliance)를 높일 수 있는 치료제 개발이 요구되고 있다.
상기 허혈성 심질환은 심장에 혈액을 공급해주는 관상동맥이 좁아지거나 막히게 되어 심장근육의 일부에 혈액 공급이 부족하여 발생하는 질환으로 협심증, 심근경색증 또는 급사(심장돌연사)로 나타난다.
심부전 치료제로서 네프릴리신 저해작용을 나타내는 사쿠비트릴(sacubitril)과 안지오텐신 수용체 길항제(ARB)인 발사르탄(valsartan) 성분을 포함하는 정제가 엔트레스토라는 제품명으로 시판되고 있다. 엔트레스토정은 그 적응증이 만성심부전, 구체적으로 좌심실 수축기능이 저하된 만성 심부전 환자(NYHA class II-IV)에서 심혈관 질환으로 인한 사망 및 심부전으로 인한 입원 위험성 감소이며, 성인 기준 1회 50~200mg을 1일 2회 투여하도록 되어 있고, 이와 관련하여 선행특허인 한국등록특허 제10-1589317호에 사쿠비트릴 및 발사르탄의 정제 형태로 10분 후에 평균 40%(중량 기준) 이상의 발사르탄 유리산을 방출하는 시험관내 용해 프로파일을 나타내는 즉시 방출 제형이 개시되어 있다.
국제공개특허 제2017/012600호에는 사쿠비트릴 및 발사르탄이 각각 유리산, 나트륨, 칼슘염 등의 형태로, 약학적 첨가제로서 충진제, 결합제, 윤활제, 계면활성제 및/또는 활택제 등과 함께 포함되는 정제가 개시되어 있으나 엔트레스토정과 마찬가지의 방출 특성을 갖는 것으로 기재되어 있다.
이러한 즉시 방출 제형의 경우 하루에 2번 이상 투여해야 하기 때문에 복용 횟수를 감소시킬 수 있는 서방성 제형에 관한 요구가 있어 왔다.
중국등록특허 제105748420호 및 중국공개특허 제105935358호에는 1일 1회 경구 투여를 위해 친수성 서방화 폴리머인 히드록시프로필메틸셀룰로오스를 사용한 서방 제형을 개시하고 있다. 그러나, 친수성 서방화 폴리머를 적용한 서방 제형의 경우 중국공개특허 제105935358호에 개시된 바와 같이 사쿠비트릴과 발사르탄의 용출 경향이 서로 다른 것을 확인할 수 있다. 이를 더 자세히 살펴보면, 용출시험 결과 8시간 시점에서 발사르탄에 비해 사쿠비트릴의 용출률이 최대 약 21% 낮으며, 12시간 시점에서도 약 18% 낮음을 확인할 수 있다. 이러한 용출률의 차이는 약물동태학적 차이로 나타날 수 있으며, 결과적으로 사쿠비트릴과 발사르탄의 시너지효과를 감소시키는 쪽으로 작용할 가능성이 있다.
Z. Kobalava et al. 논문에 따르면 엔트레스토정은 경구 투여시 사쿠비트릴과 발사르탄으로 해리되고, 사쿠비트릴은 빠르게 흡수되어 활성대사체인 사쿠비트릴라트(sacubitrilat)로 대사되며, 이 과정에서 사쿠비트릴과 발사르탄은 서로 흡수 및 대사에 영향을 주지 않는 것을 알 수 있다. 그 외에도 약리활성을 지닌 발사르탄과 사쿠비트릴라트의 약물동태학적 특성(시간에 따른 혈중농도 곡선), 특히 Tmax가 2시간 ~ 2.5시간으로 매우 유사함을 알 수 있으며, 위 결과로부터 엔트레스토정이 최대 효과를 얻기 위해서는 활성성분인 발사르탄과 사쿠비트릴라트의 약물동태학적 특성을 일치시키는 것이 매우 중요한 것으로 판단된다.
이런 관점에서 볼 때, 중국공개특허 제105935358호에 개시된 서방 제형의 경우 사쿠비트릴의 용출률이 발사르탄보다 낮기 때문에, 상기 논문과 달리, 활성성분인 발사르탄과 사쿠비트릴라트의 약물동태학적 특성이 서로 다르게 나타날 가능성이 높아 바람직하지 않다.
또한 USFDA 허가자료(NDA#207620, reference ID 375689)에 의하면, 발사르탄 및 사쿠비트릴라트의 혈중 반감기가 각각 9.9시간, 11.5시간으로 긴 편에 속하기 때문에 일반적인 서방화 기술을 적용할 경우, 반감기가 더욱 길어져서 체내 노출 정도가 증가함으로써 의도하지 않은 부작용을 유발할 수도 있다. 엔트레스토정의 경우 저혈압, 신장 기능 장애, 및 혈중 칼륨 농도 증가 등의 부작용이 문제될 수 있는 것으로도 알려져 있다. 또한, 엔트레스토정은 메트포민과의 병용시 메트포르민의 Cmax 및 AUC를 감소시키는 문제가 있어, 메트포민을 복용하는 당뇨병 환자에 대해서는 이러한 약물 간 상호작용(DDI)이 고려될 필요가 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 심부전 및 허혈성 심질환의 치료 효과를 상승시키면서 부작용이 적은 복합제에 관해 예의 연구한 결과, 사쿠비트릴 및 발사르탄을 특정 베타 차단제와 조합하는 구성에 의해 심부전 및 허혈성 심질환의 치료 효과가 상승하는 것은 물론, 심장 비대 및 심장 섬유화를 억제하고 부작용을 개선하는 효과가 있는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 사쿠비트릴 및 발사르탄의 1일 2회 복용 회수를 1일 1회로 감소시킬 수 있으면서 동시에 사쿠비트릴과 발사르탄이 일치하는 용출 경향을 나타낼 수 있는 최적의 제형 구성에 의해 환자의 복용편의성을 개선함은 물론 약효를 극대화할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명의 약제학적 조성물 및 복합제제를 완성하게 되었다.
이와 관련한 종래기술로서 미국공개특허 제2019-0125709호에서는 혈압 감소를 위해 LCZ696(사쿠비트릴/발사르탄)을 투여하는 것은 혈압 감소를 동반하면서 심박수의 보상효과, 예컨대 반사성 빈맥이 발생하는 단점이 있어, 가용성 구아닐레이트 시클라제(sGC) 자극물질을 LCZ696(사쿠비트릴/발사르탄)과 조합하는 구성에 의해 심박수 등의 혈류역학적 파라미터에 유리한 효과를 얻을 수 있음을 개시하면서, 여기에 추가로 칼슘 길항제, 안지오텐신 II 길항제, ACE 억제제, 베타 차단제 등의 다양한 활성성분을 조합할 수도 있음을 개시하고 있다. 또한, 한국공개특허 제2019-0013509호에서는 NEP 저해제에 해당하는 사쿠비트릴과 β-차단제에 해당하는 네비보롤을 포함하는 심부전 치료용 약제학적 조성물을 개시하고 있다. 그러나, 이들 문헌에는 사쿠비트릴 및 발사르탄을 특정 베타 차단제인 네비보롤과 조합하는 구성 및 이로 인해 발휘되는 상승 효과에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
KR 10-1589317 B1
CN 105935358 A
CN 105748420 B
WO 2017/012600 A1
US 2019-0125709 A1
KR 2019-0013509 A
[비특허문헌]
Z. Kobalava et al., Cardiovascular Therapeutics, 34 (2016), 191-198. Pharmacodynamic and pharmacokinetics profiles of sacubitril/valsartan (LCZ696) in patients with heart failure and reduced ejection fraction.
AXEL U. DIGNASS et al., Clinical Castroenterology and Hepatology, 7 (2009) 762-769, Mesalamine once daily is more effective than twice daily in patients with quiescent ulcerative colitis.
본 발명의 목적은 심부전 및 허혈성 심질환에 대해 우수한 치료 효과를 나타내고 부작용을 감소시킬 수 있는, 사쿠비트릴 및 발사르탄과 네비보롤을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은, 1일 1회 용법으로 복용시에도 유용한 치료 효과를 발휘할 수 있는, 사쿠비트릴 및 발사르탄과 네비보롤을 포함하는 약제학적 복합제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 사쿠비트릴 및 발사르탄과 네비보롤을 포함하는 약제학적 복합제제의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사쿠비트릴 및 발사르탄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 네비보롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는 심부전 및 허혈성 심질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 사쿠비트릴 및 발사르탄과 네비보롤을 몰비 1: 0.1~10: 0.001~0.5로 포함할 수 있고, 바람직하게는 몰비 1: 0.2~5: 0.002~0.3로 포함할 수 있다.
상기 심부전 및 허혈성 심질환은 박출률 감소 심부전, 박출률 보존 심부전, 심부전으로 인한 심장섬유증, 비폐색성 비대성 심근병증, 심방세동 동반 심부전, 당뇨병 동반 심부전, 협심증, 심근경색증, 및 혈압 강하가 필요한 심근경색증에서 선택된 것일 수 있다.
본 발명은, 다른 양태에 따르면, 사쿠비트릴 및 발사르탄, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 네비보롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;을 유효성분으로 포함하는 약제학적 복합제제에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 복합제제는 사쿠비트릴 및 발사르탄과 네비보롤을 몰비 1: 0.1~10: 0.001~0.5로 포함할 수 있고, 바람직하게는 몰비 1: 0.2~5: 0.002~0.3로 포함할 수 있다.
상기 복합제제는, 사쿠비트릴 및 발사르탄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 제1방출부; 사쿠비트릴 및 발사르탄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 서방화 기제로서 비이온성 소수성 폴리머 및 지질 중 1종 이상을 포함하는 제2방출부; 및 네비보롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 제3방출부;를 포함할 수 있다. 상기 제1방출부 및 제3방출부는 속방형 또는 서방형일 수 있으나, 바람직하게는 속방형일 수 있다. 즉, 바람직한 하나의 양태에 따르면, 본 발명의 복합제제는 속방형 제1방출부, 서방형 제2방출부, 및 속방형 제3방출부를 포함할 수 있다.
상기 비이온성 소수성 폴리머는, 셀룰로오스 유도체로서 셀룰로오스아세테이트 및 에틸셀룰로오스 중 1종 이상이고, 상기 지질은, 지방산 에스테르로서 글리세릴디베헤네이트, 글리세릴디스테아레이트, 글리세릴모노올레이트, 글리세릴팔미토스테아레이트; 지방산 알코올로서 스테아릴알코올, 세토스테아릴알코올, 및 미리스틸알코올;로 이루어진 그룹에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 제1방출부와 제2방출부의 유효성분 중량비가 1:3 내지 1:9일 수 있다.
상기 제1방출부는 추가로 부형제, 붕해제, 및 활택제를 포함하는 것이고, 상기 제2방출부는 서방화 기제로서 에틸셀룰로오스, 글리세릴디베헤네이트, 글리세릴디스테아레이트, 스테아릴알코올, 세토스테아릴알코올, 및 미리스틸알코올로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상, 및 추가로 부형제 및 활택제 중 1종 이상을 포함하는 것이며, 상기 제3방출부는 추가로 부형제, 붕해제, 계면활성제, 결합제 및 활택제를 포함하는 것일 수 있다.
상기 제1방출부, 제2방출부, 및 제3방출부에 있어서, 부형제는 유당수화물, 옥수수전분, 무수인산수소칼슘, 및 미결정셀룰로오스로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상이고, 활택제는 스테아르산마그네슘, 탤크, 스테아르산, 스테아릴푸마레이트나트륨, 및 콜로이드성이산화규소로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상이며, 상기 제1방출부 및 제3방출부에 있어서, 붕해제는 크로스카멜로오스나트륨, 전분글리콜산나트륨, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 및 크로스포비돈으로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상이며, 상기 제3방출부에 있어서 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 및 히드록시프로필셀룰로오스로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상이고 계면활성제는 폴리소르베이트 및 라우릴황산나트륨 중 1종 이상일 수 있다.
상기 제1방출부는 제1방출부 총 중량을 기준으로, 유효성분 10~70중량%, 부형제 5~70중량%, 붕해제 15~35중량%, 및 활택제 0.5~3.5중량%를 포함하고;
상기 제2방출부는 제2방출부 총 중량을 기준으로, 유효성분 40~70중량%, 서방화 기제 15~50중량%, 부형제 및 활택제 중 1종 이상 1~25중량%를 포함하며;
상기 제3방출부는 제3방출부 총 중량을 기준으로 유효성분 0.5~5중량%, 부형제 60~90중량%, 붕해제 1~20중량%, 계면활성제 0.1~2중량%, 결합제 0.5~10중량% 및 활택제 0.2~3중량%을 포함하는 것일 수 있다.
상기 복합제제는 1일 2회 또는 1일 1회 경구투여 제형일 수 있고, 바람직하게는 1일 1회 경구투여 제형일 수 있다.
상기 복합제제는 1일 1회 용법으로 투여되어 하기의 사쿠비트릴 및 발사르탄의 약동학적 파라미터를 만족하는 것일 수 있다:
(i) 1일 2회 용법으로 투여되는 속방성 제제와 비교하여, AUC0-24의 상대적 비율이 사쿠비트릴 75~130%, 사쿠비트릴라트 75~130%, 및 발사르탄 75~130%이고,
(ii) 1일 2회 용법으로 투여되는 속방성 제제와 비교하여, Cmax의 상대적 비율이 사쿠비트릴 50~100%, 사쿠비트릴라트 50~100%, 및 발사르탄 50~100%인 것이고, 바람직하게는 Cmax의 상대적 비율이 사쿠비트릴 50~90%, 사쿠비트릴라트 50~90%, 및 발사르탄 50~90%인 것.
상기 복합제제가 1일 1회 용법으로 투여되었을 때, 네비보롤의 약동학적 파라미터는 종래 시판되는 1일 1회 용법으로 투여되는 네비보롤 속방성 제제와 동등성 범위 내일 수 있다.
상기 복합제제는 다층정 또는 핵정의 정제 형태, 또는, 과립, 펠렛, 또는 미니정제를 충전한 경질캡슐제 형태일 수 있다.
상기 약제학적 복합제제는, 대한민국약전 용출시험법 제2법(패들법)에 따라, 37±0.5℃, pH6.8 용출액 조건에서 용출시험시, 사쿠비트릴 및 발사르탄이 그 중량기준으로 각각 30분 후 40% 미만, 2시간 후 40~70%, 및 12시간 후 80% 이상 용출될 수 있다.
상기 복합제제는, 대한민국약전 용출시험법 제2법(패들법)에 따라, 37±0.5℃, pH1.2 용출액 조건에서 용출시험시, 네비보롤이 그 중량기준으로 30분에 75% 이상 용출될 수 있다.
본 발명은, 또 다른 양태에 따르면, 약제학적 복합제제의 제조방법으로서, (a) 유효성분으로서 사쿠비트릴 및 발사르탄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 제1방출부를 제조하는 단계; (b) 유효성분으로서 사쿠비트릴 및 발사르탄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 서방화 기제로서 비이온성 소수성 폴리머 및 지질 중 1종 이상을 포함하는 제2방출부를 제조하는 단계; (c) 유효성분으로서 네비보롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 제3방출부를 제조하는 단계; 및 (d) 상기 제1방출부, 제2방출부 및 제3방출부를 함께 삼층정으로 타정하거나, 또는 과립, 펠릿 또는 미니정제로 제조한 후 경질캡슐에 충전하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 더 상세하게 설명한다.
본 발명에 사용되는 일 성분인 '사쿠비트릴(sacubitril)'은 4-{[(2S,4R)-1-(4-비페닐일)-5-에톡시-4-메틸-5-옥소-2-펜타닐]아미노}-4-옥소부타노산으로 명명되는 화합물로서 하기 화학식 1의 구조를 갖는다. 사쿠비트릴은 네프릴리신(neprilysin, NEP) 저해제로서, 에스테라제의 탈에틸화에 의해 사쿠비트릴라트(sacubitrilat)로 활성화되어, 혈류량 감소 작용을 하는 혈압 저하 펩티드인 심방 및 뇌 나트륨이뇨 펩티드를 분해시키는 작용을 한다.
Figure PCTKR2021005973-appb-C000001
본 발명에 사용되는 일 성분인 '발사르탄(Valsartan)'은 (S)-N-(1-카르복시-2-메틸-프로-1-필)-N-펜타노일-N-[2'-(1H-테트라졸-5-일)비페닐-4-일-메틸]아민으로 명명되는 화합물로서 하기 화학식 2의 구조를 갖는다. 발사르탄은 안지오텐신-II 수용체 차단제로서, 안지오텐신-II의 작용을 차단함으로써 혈관을 이완시켜 혈압을 낮추는 기능을 할 뿐만 아니라 심부전, 허혈성 심장질환 등의 치료에 이용되고 있다.
Figure PCTKR2021005973-appb-C000002
또한, 본 발명에 사용되는 또 다른 성분인 '네비보롤(Nebivolol)'은 1-(6-플루오로크로만-2-일)-{[2-(6-플루오로크로만-2-일)-2-하이드록시-에틸]아미노}에탄올로 명명되는 화합물로서 하기 화학식 3의 구조를 갖는다. 네비보롤은 β1-아드레날린 수용체에 대한 선택성이 높은 약물로서 본태성 고혈압, 만성 심부전, 동맥 경화 등의 심혈관 질환의 치료에 이용되고 있다.
Figure PCTKR2021005973-appb-C000003
상기 사쿠비트릴 및 발사르탄은 초기 용량을 1일 2회, 1회 50mg(사쿠비트릴/발사르탄으로서 24.3/25.7mg)으로 치료를 시작하여, 필요한 경우 1일 2회, 1회 200mg(사쿠비트릴/발사르탄으로서 97.2/102.8mg)까지 증량할 수 있다.
또한, 네비보롤은 1일 1회 1.25mg으로 치료를 시작하여, 필요한 경우 1일 1회 2.5mg, 1일 1회 5mg,　1일 1회 10mg까지 증량할 수 있고, 1일 최대 복용은 10mg이다.
본 발명에 있어서, 사쿠비트릴 및 발사르탄의 '약학적으로 허용가능한 염'이란 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 염을 의미하는 것으로서, 무기이온, 무기산 또는 유기산으로 제조된 염은 물론, 상기 염의 수화물 또는 용매화물 등을 모두 포함하여 지칭하는 것이다. 본 발명에 적합한 사쿠비트릴 및 발사르탄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서 유리산 또는 1~3개의 나트륨, 칼슘, 칼륨, 마그네슘 등의 무기이온염 또는 이들의 일수화물~삼수화물 등을 들 수 있고, 구체예로서 종래 LCZ696으로 공지된 사쿠비트릴·발사르탄 삼나트륨염의 2.5수화물 등과 같은 공결정 형태 또는 각 유효성분의 유리산 또는 염의 혼합물(mixtures) 형태 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 네비보롤의 ‘약학적으로 허용가능한 염’이란 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산; 또는 아세트산, 프로판산, 하이드록시아세트산, 2-하이드록시프로판산, 2-옥소프로판산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산 등과 같은 유기산과의 염을 예로 들 수 있고, 바람직하게는 염산과의 산부가염을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물에 있어서, 유효성분인 사쿠비트릴 및 발사르탄과 네비보롤을 몰비 1: 0.1~10: 0.001~0.5로 포함할 수 있고, 바람직하게는 몰비 1: 0.2~5: 0.002~0.3으로 포함할 수 있다.
본 발명의 사쿠비트릴 및 발사르탄에 네비보롤을 복합한 조성물은, 각 성분 단독 또는 사쿠비트릴 및 발사르탄의 2성분을 사용하는 것과 비교하여, 산화질소 발생 촉진으로 혈관을 확장시켜 심장근육에 대한 혈액 공급량 및 심박출량을 현저히 증가시킬 수 있고, 이에 따라 협심증, 심근경색증, 혈압 강하가 필요한 심근경색증 등의 허혈성 심질환, 및 박출률 감소 심부전, 박출률 보존 심부전, 심부전으로 인한 심장섬유증, 비폐색성 비대성 심근병증, 심방세동 동반 심부전 등의 심부전 치료에 있어 상승효과를 나타낼 수 있다.
엔트레스토의 부작용으로 브래디키닌 농도 증가로 인한 통증, 기침 및 혈관부종이 있다. 그러나, 네비보롤은 레닌분비를 감소시켜 RAS(Renin-Angiotensin System)의 상위에서 나타나는 안지오텐시노겐을 감소시켜 ACE의 활성이 낮아지게 하는 작용이 있으므로, 브래디키닌의 농도를 감소시켜 엔트레스토에서 나타나는 부작용을 감소시킬 것으로 보인다. 또한, 심박수의 상승은 심부전환자에서 사망률 상승 및 심혈관계 위험율 증가 요소인데 네비보롤은 베타차단제로서 심박수 감소에 유효하여 심박수 관리가 중요한 환자군에게 최적의 조합이 될 것으로 기대할 수 있다. 아울러, 네비보롤은 메트포민과 병용시에 약물 상호작용을 나타내지 않을 뿐만 아니라 다른 베타차단제 대비 당뇨병 발생을 증가시키지 않는 장점이 있어, 본 발명의 사쿠비트릴 및 발사르탄에 네비보롤을 복합한 조성물은 메트포민을 병용해야 하는 당뇨병 동반 심부전 환자군에 유용하게 적용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따른, 약제학적 복합제제는, 사쿠비트릴 및 발사르탄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 속방형 제1방출부; 사쿠비트릴 및 발사르탄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 서방화 기제로서 비이온성 소수성 폴리머 및 지질 중 1종 이상을 포함하는 서방형 제2방출부; 및 네비보롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 속방형 제3방출부;를 포함할 수 있다.
이처럼 사쿠비트릴 및 발사르탄을 동시에 속방형 제1방출부 및 서방형 제2방출부로 포함함으로써, 약물 투여 후 이들 성분의 즉시 방출을 가능하게 하는 한편, 12시간 이상에 걸친 지속 방출을 가능하게 하는 특징이 있다.
상기 제1방출부와 제2방출부의 유효성분 중량비는 1:3 내지 1:9인 것이 바람직하며, 1:4 내지 1:9인 것이 보다 바람직하다. 상기 유효성분 중량비가 1:9를 초과해서 제2방출부의 비율이 많아지는 경우에 약효 발생까지의 시간이 지연됨으로써 바람직하지 않고, 상기 유효성분 중량비가 1:3 미만으로 제2방출부의 비율이 적어지는 경우에 12시간 이상에 걸친 지속 방출 효과를 달성하기 어려워 바람직하지 않다.
상기 서방화기제로서 비이온성 소수성 폴리머 및 지질 중 1종 이상을 포함한다.
상기 비이온성 소수성 폴리머 또는 지질은 물 분자와 섞이지 못하는 특성을 갖는 물질로서 대체적으로 극성이 없기 때문에 무극성인 용매에 잘 녹는 특징을 갖고 있으며 또한 음이온 또는 양이온을 띄는 관능기를 가지고 있지 않다.
상기 비이온성 소수성 폴리머는 셀룰로오스 유도체로서 셀룰로오스아세테이트, 에틸셀룰로오스 등이고, 상기 지질은 글리세릴디베헤네이트, 글리세릴디스테아레이트, 글리세릴모노올레이트, 글리세릴팔미토스테아레이트 등의 지방산 에스테르이거나 또는 스테아릴알코올, 세토스테아릴알코올, 미리스틸알코올 등의 지방산 알코올이다. 이러한 비이온성 소수성 폴리머 및 지질로 이루어진 그룹에서 선택된 1종 이상이 서방화 기제로 사용될 수 있다. 서방화 기제로서, 바람직하게는 에틸셀룰로오스, 글리세릴디베헤네이트, 글리세릴디스테아레이트, 스테아릴알코올, 세토스테아릴알코올, 및 미리스틸알코올로 이루어진 그룹에서 선택된 1종 이상을 사용하고, 보다 바람직하게는 에틸셀룰로오스, 글리세릴디베헤네이트, 및 스테아릴알코올로 이루어진 그룹에서 선택된 1종 이상을 사용하고, 가장 바람직하게는 에틸셀룰로오스 및 글리세릴디베헤네이트를 사용한다.
본 발명의 제2방출부는 겉보기밀도 0.30~0.45g/mL, 탭밀도 0.40~0.60g/mL, 및 입도(D90) 1000㎛ 이하, 바람직하게는 100~1000㎛인 과립물일 수 있다. 상기와 같은 수치범위의 밀도를 가짐으로써 사쿠비트릴 및 발사르탄이 설정된 용출기준에 적합한 용출 프로파일을 보이면서, 유효성분의 지속 방출을 가능하게 하는 효과가 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 사쿠비트릴 및 발사르탄, 부형제, 붕해제, 및 활택제를 포함하는 제1방출부; 및 사쿠비트릴 및 발사르탄, 서방화 기제로서 에틸셀룰로오스, 글리세릴디베헤네이트, 글리세릴디스테아레이트, 스테아릴알코올, 세토스테아릴알코올, 및 미리스틸알코올로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상, 부형제 및 활택제 중 1종 이상을 포함하는 제2방출부; 및 네비보롤, 부형제, 붕해제, 계면활성제, 결합제 및 활택제를 포함하는 제3방출부;를 포함한다.
본 발명의 복합제제에서 붕해제로는 크로스포비돈, 전분글리콜산나트륨, 크로스카멜로오스나트륨, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리소르베이트 및 라우릴황산나트륨 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 복합제제에서 부형제로는 약효에 영향을 미치지 아니하는 범위 내에서 약제학적으로 통상 사용되는 물질을 사용할 수 있으며, 유당수화물, 옥수수전분, 무수인산수소칼슘, 및 미결정셀룰로오스 중에서 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.
상기 활택제는 타정 시 정제의 표면이 타정 펀치에 부착되는 문제를 방지하고, 과립의 유동성을 상승시킬 수 있다. 구체적인 예로 스테아르산마그네슘, 탤크, 스테아르산, 스테아릴푸마레이트나트륨, 및 콜로이드성이산화규소 중에서 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.
상기 복합제제의 제1방출부 및 제3방출부에 있어서, 사용되는 부형제는 유당수화물, 옥수수전분, 무수인산수소칼슘, 및 미결정셀룰로오스 중 1종 이상이고 바람직하게는 미결정셀룰로오스, 및 유당수화물 중 1종 이상이고, 붕해제는 크로스포비돈, 전분글리콜산나트륨, 크로스카멜로오스나트륨, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리소르베이트 및 라우릴황산나트륨 중 1종 이상이고 바람직하게는 크로스포비돈, 및 크로스카멜로오스나트륨 중 1종 이상이고, 활택제는 스테아르산마그네슘, 탤크, 스테아르산, 스테아릴푸마레이트나트륨, 및 콜로이드성이산화규소 중 1종 이상이고 바람직하게는 스테아르산마그네슘, 탤크, 콜로이드성이산화규소 중 1종 이상이다. 또한, 상기 제3방출부에 있어서, 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 및 히드록시프로필셀룰로오스 중 1종 이상이고, 계면활성제는 폴리소르베이트 및 라우릴황산나트륨 중 1종 이상이다.
상기 제2방출부에 사용되는 부형제는 유당수화물, 옥수수전분, 무수인산수소칼슘, 및 미결정셀룰로오스 중 1종 이상이고, 바람직하게는 미결정셀룰로오스, 및 유당수화물 중 1종 이상이며, 활택제는 스테아르산마그네슘, 탤크, 스테아르산, 스테아릴푸마레이트나트륨, 및 콜로이드성이산화규소 중 1종 이상이고, 바람직하게는 스테아르산마그네슘, 탤크, 콜로이드성이산화규소 중 1종 이상이다.
상기 제1방출부는 제1방출부 총 중량을 기준으로, 유효성분 10~70중량%, 부형제 5~70중량%, 붕해제 15~35중량%, 및 활택제 0.5~3.5중량%를 포함하고, 상기 제2방출부는 제2방출부 총 중량을 기준으로, 유효성분 40~70중량%, 서방화 기제 15~50중량%, 부형제 및 활택제 중 1종 이상 1~25중량%을 포함할 수 있고 여기서 부형제 및 활택제가 모두 사용되는 경우 부형제 0.5~22중량% 및 활택제 0.5~3중량%를 포함할 수 있다. 또한, 제3방출부는 제3방출부 총 중량을 기준으로 유효성분 0.5~5중량%, 부형제 60~90중량%, 붕해제 1~20중량%, 계면활성제 0.1~2중량%, 결합제 0.5~10중량% 및 활택제 0.2~3중량%을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 복합제제는 경구 투여 가능한 형태로서, 제한되지 않으나, 정제, 캡슐제 등일 수 있다. 바람직하게는, 제1방출부, 제2방출부 및 제3방출부를 별도의 과립물로 제조한 후 압축 타정한 정제 또는 캡슐제 형태일 수 있다. 정제는 이층정, 삼층정 등의 다층정 형태일 수 있고, 캡슐제는 과립, 펠렛, 미니정제를 포함하는 경질캡슐제 형태일 수 있다. 본 발명의 구체적 실시양태에 따른 복합제제의 모식도를 도 1에 나타내었다.
구체적 일 양태에 따르면, 본 발명의 복합제제는, (a) 유효성분으로서 사쿠비트릴 및 발사르탄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 제1방출부를 제조하는 단계; (b) 유효성분으로서 사쿠비트릴 및 발사르탄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 서방화 기제로서 비이온성 소수성 폴리머 및 지질 중 1종 이상을 포함하는 제2방출부를 제조하는 단계; (c) 유효성분으로서 네비보롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 제3방출부를 제조하는 단계; 및 (d) 상기 제1방출부, 제2방출부 및 제3방출부를 함께 삼층정으로 타정하거나, 또는 과립, 펠릿 또는 미니정제로 제조한 후 경질캡슐에 충전하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (a), (b) 및 (c)단계의 제1, 제2 및 제3방출부는 습식과립법(wet granulation)을 통해 제조될 수 있다.
구체적으로, 제1방출부를 제조하는 단계 (a)는, (a-1) 유효성분, 부형제, 및 붕해제를 포함하는 혼합물에 물, 알코올 또는 알코올수용액 용매를 넣고 연합하여 연합물을 제조하는 단계; (a-2) 상기 연합물을 건조하고 정립하여, 과립물을 제조하는 단계; (a-3) 상기 과립물에 부형제 및 붕해제를 혼합하는 단계; 및 (a-4) 활택제를 첨가하는 단계를 포함한다.
상기 (a-1)단계에서는 물, 알코올 또는 알코올수용액 용매를 넣어 연합을 실시한다. 알코올은 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 중 1종 이상을 포함한다.
상기 (a-2)에서는 트레이 건조기를 이용해 35~60℃에서 건조를 실시하며, LOD(Loss on Drying, 건조감량)를 확인하고, 20mesh를 이용하여 정립한다.
상기 제2방출부를 제조하는 단계 (b)는, (b1-1) 서방화 기제를 알코올 또는 알코올수용액을 포함하는 용매에 분산시켜 결합액을 제조하는 단계; (b1-2) 유효성분, 서방화 기제, 및 부형제를 혼합한 후 결합액을 넣어 연합하여 연합물을 제조하는 단계; (b1-3) 상기 연합물을 건조후 경화하고 정립하거나 또는 건조후 정립하고 경화하여 과립물을 제조하는 단계; 및 (b1-4) 상기 과립물에 활택제를 첨가하는 단계;를 포함하여 제조된다.
상기 (b1-1)은 서방화 기제를 분산시키는 알코올 또는 알코올수용액 용매에 분산시켜 결합액을 제조하는 것이 바람직하다. 알코올은 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 중 1종 이상을 포함한다.
상기 (b1-2) 단계의 서방화 기제는 (b1-1)에서 사용된 서방화 기제와 동일한 것 또는 다른 것이 사용될 수 있다.
상기 (b1-3)에서는 트레이(Tray) 건조기 또는 유동층 과립기를 이용해 35~60℃에서 건조를 실시하며, LOD값을 확인한다. 정립은 20mesh를 이용하여 실시하며, 정립 전·후에 온도 60~80℃로 가온하여 20분~3시간, 바람직하게는 25분~2시간 동안 경화를 실시한다. 이처럼 정립 전 또는 후에 경화를 실시함으로써 사쿠비트릴과 발사르탄의 약물방출 지연을 극대화시키는 효과를 얻을 수 있다.
상기 (b)단계의 습식과립 공정은, 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 고속혼합기(High Speed Mixer, HSM), 유동층과립기(Fluid Bed Granulator, FBG)와 같이 당업계에서 사용하는 장치를 이용하여 수행할 수 있다.
구체예로서, 상기 제2방출부를 제조하는 단계 (b)는, (b2-1) 유효성분, 및 서방화 기제를 혼합한 후 열용융 압출하는 단계; (b2-2) 압출물을 정립하여 과립물을 제조하는 단계; 및 (b2-3) 상기 과립물에 활택제를 첨가하는 단계;를 포함할 수 있다.
제3방출부를 제조하는 단계 (c)는, (c-1) 계면활성제를 알코올수용액 용매에 넣고 결합액을 제조하는 단계; (c-2) 유효성분, 부형제, 결합제 및 붕해제를 포함하는 혼합물에 결합액을 넣고 연합하여 연합물을 제조하는 단계; (c-3) 상기 연합물을 건조하고 정립하여, 과립물을 제조하는 단계; (c-4) 상기 과립물에 부형제 및 붕해제를 혼합하는 단계; 및 (c-5) 활택제를 첨가하는 단계를 포함한다.
상기 복합제제는 약제학적으로 허용가능한 필름 코팅을 최종 외층으로 추가로 포함할 수 있다. 상기 필름코팅제의 예로서 상품명 오파드라이(Opadry, Colorcon), 구체적으로는, 오파드라이 I, 오파드라이 II, 오파드라이 fx, 오파드라이 AMB 등을 사용할 수 있다.
위와 같이 제조된 제1방출부, 제2방출부 및 제3방출부는 미니정제, 이층정 또는 핵정을 포함하는 다층정제 형태일 수 있다.
이외에도, 제1방출부, 제2방출부 및 제3방출부는 열용융압출기(Hot Melt Extruder, HME)를 사용하거나, 압출기(Extruder) 및 구형화기(Spheronizer)를 사용한 펠렛 제조방법으로 제조될 수 있다.
열용융압출(HME) 방법을 사용한 펠렛은 유효성분, 서방화 기제 및 부형제를 혼합한 후 가열된 열용융압출기에 넣고 2개의 Screw를 서로 반대방향으로 회전하여 과립을 압출한다. 연속적으로 컨베이어밸트를 구동하여 순차적으로 압출된 압출물을 실온까지 냉각시키고 정립한다. 이어서 정립한 과립물에 부형제 및 활택제를 넣고 혼합하여 제조한다.
또는, 압출기(Extruder) 및 구형화기(Spheronizer)를 사용한 펠렛은 결합액에 유효성분 및 결합제를 넣어 연합을 실시하고, 압출기를 사용하여 메쉬체로 압출한 후 구형화기를 사용하여 구형화 및 건조한 후 서방화 기제를 분사 및 건조하여 펠렛을 제조한다.
위와 같이 제조된 제1방출부, 제2방출부, 및 제3방출부는 펠렛이 충전된 캡슐제 형태일 수 있다. 상기 캡슐제에 충전되는 내용물은 펠렛에 한정되지 않고 과립, 미니정제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 복합제제는, 대한민국약전 용출시험법 제2법(패들법)에 따라, 37±0.5℃, pH6.8 용출액 조건에서 용출시험 시, 유효성분인 사쿠비트릴 및 발사르탄이 당해 유효성분 중량기준으로 30분 후 40% 미만, 2시간 후 40~70%, 및 12시간 후 80% 이상 용출될 수 있다.
본 발명의 복합제제는, 시험관내 용출시험을 통해, 서서히 12시간 이상 지속적으로 방출되어 1일 1회 투여가 가능하고, 사쿠비트릴과 발사르탄이 일치하는 용출 경향을 가져 성분 복합에 따른 시너지 효과를 극대화할 수 있는 것으로 확인되었다.
본 발명의 복합제제는 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 제형의 종류, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 약제학적 치료용 조성물의 투여 시간 및 투여 방법, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은, 사쿠비트릴 및 발사르탄에 네비보롤을 복합함에 따라, 각 성분 단독 또는 사쿠비트릴 및 발사르탄의 2성분을 사용하는 것과 비교하여, 심장근육에 대한 혈액 공급량 및 심박출량을 현저히 증가시키고 심장 비대 및 심장 섬유증을 보다 더 효과적으로 억제시켜 우수한 허혈성 심질환 및 심부전 치료 효과가 있을 뿐만 아니라, 부작용을 감소시킬 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 복합제제는 사쿠비트릴 및 발사르탄이 일치된 용출 경향을 나타내면서 네비보롤과의 복합에 따른 약효를 극대화할 수 있고, 약물 투여 초기부터 사쿠비트릴 및 발사르탄의 약물 방출을 가능하게 하여 생체 내에서 약효가 지속적으로 유지되면서도 부작용을 최소화할 수 있는 효과가 있다.
1일 2회 투여군과 1일 1회 투여군의 효능 및 안전성을 평가한 논문(AXEL U. DIGNASS et al., 2009)에서, 12개월 동안의 시험결과, 1일 1회 투여한 그룹의 완치율(70.9%)이 1일 2회 투여한 그룹의 완치율(58.9%)보다 유의적으로 개선될 수 있다는 것을 개시하고 있는 것을 볼 때, 1일 2회 투여를 1일 1회 투여로 투여용법을 개선하는 것을 통해 본 발명은 환자의 복약순응도를 개선하는 것 뿐만 아니라 치료 효과도 개선할 수 있다.
도 1은 본 발명의 구체적 실시양태에 따른 삼층정의 모식도이다.
도 2(A) 및 2(B)는 H9C2(2-1) 세포를 이용한 실험예 1의 in vitro 시험에서 각 시험군에 따른 바이오마커 BNP 및 sST2 발현율을 비교한 그래프이다.
도 3(A) 및 3(B)는 심부전 래트 모델에 대한 실험예 2의 결과로서 각 시험군에 따른 바이오마커 BNP 및 Collagen I 발현율을 비교한 그래프이다.
도 4는 심부전 래트 모델에 대한 실험예 2의 결과로서 각 시험군에 따른 바이오마커 eNOS 발현율을 비교한 그래프이다.
도 5(A)는 심부전 래트 모델에서 적출한 심장 조직에 대한 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 염색 결과 이미지이고, 도 5(B)는 섬유화된 정도를 정량화한 값으로 나타낸 그래프이다.
도 6(A)는 심부전 래트 모델에서 적출한 심장 조직에 대한 TNF-α 면역조직화학 염색 결과 이미지이고, 도 6(B)는 TNF-α가 발현된 정도를 정량화한 값으로 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 1-2에 따라 제조된 제제의 발사르탄 및 사쿠비트릴 용출패턴을 평가한 그래프이다.
도 8은 시판중인 엔트레스토정100mg과 실시예 2-4에 따라 제조된 제제의 용출패턴을 평가한 그래프이다.
도 9는 실시예 3-3에 따라 제조된 제제의 발사르탄 및 사쿠비트릴 용출패턴을 평가한 그래프이다.
도 10은 실시예 3-1 및 3-4, 및 비교예 2-1 및 2-2에 따라 제조된 제제의 발사르탄 용출패턴을 평가한 그래프이다.
도 11는 실시예 4에 따른 복합제제의 발사르탄, 사쿠비트릴 및 네비보롤의 용출패턴을 평가한 그래프이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 제2방출부의 서방화 기제에 따른 제제의 제조>
하기 표 1에 기재된 조성으로 습식과립법을 이용하여 제2방출부에 해당하는 과립물을 제조한 후 정제로 타정하였다. 즉, 에탄올 용매에 서방화 기제를 일부 분산시켜 결합액을 제조하고 고속혼합기(High Speed Mixer, HSM)에 사쿠비트릴/발사르탄, 서방화 기제 및 미결정셀룰로오스를 넣어 혼합한 후 상기 결합액을 넣고 교반하면서 5분 동안 연합하여 연합물을 제조하였다. 상기의 연합물을 트레이 건조기를 이용해 건조하고, 정립기에서 정립한 후 정립물을 다시 트레이 건조기에서 온도를 60~80℃로 높여 25분~2시간 경화하였다. 이후 과립물에 스테아르산마그네슘을 첨가한 후 활택혼합을 실시하여 최종 서방성 과립물을 형성하였다. 그리고 상기 과립물을 로타리 타정기(XENA-I-rotary, 라온제나)로 타정하여 정제를 제조하였다.
구성성분 중량(%)
실시예
1-1 1-2 1-3 1-4 1-5 1-6
유효성분 사쿠비트릴/발사르탄 55.0 39.4 39.4 39.4 39.4 39.4
서방화
기제		 에틸셀룰로오스 42.0 - - - - -
글리세릴디베헤네이트 - 57.6 - - - -
글리세릴디스테아레이트 - - 57.6 - - -
스테아릴알코올 - - - 57.6 - -
미리스틸알코올 - - - - 57.6 -
세토스테아릴알코올 - - - - - 57.6
부형제 미결정셀룰로오스 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
활택제 스테아르산마그네슘 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
합계 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
위 표에서의 사쿠비트릴/발사르탄으로서 사쿠비트릴 및 발사르탄이 1:1 몰비인 삼나트륨염 2.5수화물이 사용되었고, 이하 실시예 및 비교예 등에서도 별도로 언급되지 않는 경우에 동일한 물질이 사용되었다.
<비교예 1. 서방 제제의 제조>
하기 표 2의 성분 조성으로 중국공개특허 제105935358호에 기재된 건식과립법을 사용하여 서방정을 제조하였다. 즉, 하기 표 2의 성분 조성대로, 사쿠비트릴/발사르탄, 친수성 서방화 기제인 HPMC K100M, 및 제약상 허용가능한 첨가제로서 콜로이드성이산화규소 및 스테아르산마그네슘을 혼합하고 건식과립기(RC-60, 서울하이테크)에 넣어 압착 후 분쇄하여 형성한 최종 과립물에 콜로이드성이산화규소 및 스테아르산마그네슘을 넣고 혼합하여 타정하였다. 타정한 정제는 필름코팅기(Auto Tablet Coating Machine, KC50F, 금성산기)에서 오파드라이 AMB™ 사용하여 필름 코팅된 정제를 수득하였다.
구성성분 중량(%)
비교예 1
사쿠비트릴/발사르탄 54.3
HPMC K100M 36.1
콜로이드성이산화규소 2.9
스테아르산마그네슘 2.9
오파드라이AMB™ 3.8
합계 100.0
<실시예 2. 본 발명의 제1방출부에 해당하는 제제의 제조>
실시예 2에서는 사쿠비트릴/발사르탄으로서 사쿠비트릴 및 발사르탄이 1:1 몰비인 유리산 또는 일~삼나트륨염 수화물과, 하기 표에 기재된 성분을 사용하여 정제를 제조하였다. 즉, 고속혼합기(High Speed Mixer, HSM: KMLC, 금성산기)에 사쿠비트릴/발사르탄, 미결정셀룰로오스 및 크로스포비돈을 넣어 혼합한 후 결합액을 넣고 교반하면서 5분동안 연합하여 연합물을 제조하였다. 상기의 연합물을 트레이 건조기(MOV-212F, SANYO)를 이용해 건조하고 정립기(UMA, Pharmaters)에서 정립한 후 과립물에 크로스포비돈, 콜로이드성이산화규소 및 스테아르산마그네슘을 첨가 후 혼합·타정하였다.
구성성분 중량(%)
실시예 2-1 실시예 2-2 실시예 2-3 실시예 2-4
사쿠비트릴/발사르탄의
나트륨염 수(N)		 0 1 2 3
사쿠비트릴/발사르탄 56.6 56.6 56.6 56.6
미결정셀룰로오스 12.4 12.4 12.4 12.4
크로스포비돈 29 29 29 29
콜로이드성이산화규소 0.5 0.5 0.5 0.5
스테아르산마그네슘 1.5 1.5 1.5 1.5
합계 100.0 100.0 100.0 100.0
<실시예 3 및 비교예 2. 본 발명의 제1방출부 및 제2방출부에 해당하는 제제의 제조>
하기 표 4의 성분 함량에 의한 각 실시예의 제조단계는 하기한 바와 같다.
1) 제1방출부의 제조
고속혼합기(High Speed Mixer, HSM)에 사쿠비트릴/발사르탄, 미결정셀룰로오스, 및 크로스포비돈을 넣어 혼합한 후 에탄올 용매를 넣어 교반하면서 연합하여 연합물을 제조하였다. 상기 연합물을 트레이 건조기를 이용해 건조하였다. 이후, 정립기에서 정립한 후 콜로이드성이산화규소 및 크로스포비돈을 첨가해서 후혼합을 실시하였다. 이후, 과립물에 스테아르산마그네슘을 첨가하여 최종 제1방출부 과립물을 형성하였다.
2) 제2방출부의 제조
사쿠비트릴/발사르탄, 글리세릴디베헤네이트를 혼합한 후 가열된 열용융 압출기(Hot Melt Extruder, HME: HTGD-16, Hartek)에 넣고 2개의 Screw를 서로 반대방향으로 회전하여 과립을 압출하였다. 연속적으로 컨베이어밸트를 구동하여 순차적으로 압출된 압출물을 실온까지 냉각시키고 정립하였다. 이어서 정립한 과립물에 탤크를 넣고 혼합 후 스테아르산마그네슘을 첨가하고 활택을 실시하여 최종 제2방출부 과립물을 형성하였다.
3) 이층정의 제조
위에서 제조된 제1방출부 과립물과 제2방출부 과립물을 다층정타정기를 사용하여 타정하여 제1방출부와 제2방출부는 유효성분 중량비가 1:2 ~ 1:10 비율이 되도록 이층정을 제조하였다.
Figure PCTKR2021005973-appb-T000001
<실시예 4. 본 발명에 따른 약제학적 복합제제의 제조-삼층정>
하기 표 5의 성분 함량에 의한 실시예 4의 제조단계는 하기와 같다.
1) 제1방출부의 제조
고속혼합기에 사쿠비트릴/발사르탄, 미결정셀룰로오스, 및 크로스포비돈을 넣어 혼합한 후 에탄올 용매를 넣어 교반하면서 연합하여 연합물을 제조하였다. 상기 연합물을 트레이 건조기를 이용해 건조하였다. 이후, 정립기에서 정립한 후 콜로이드성이산화규소 및 크로스포비돈을 첨가해서 후혼합을 실시한 후 과립물에 스테아르산마그네슘을 첨가하여 최종 제1방출부 과립물을 형성하였다.
2) 제2방출부의 제조
에탄올 용매에 에틸셀룰로오스를 분산시켜 결합액을 제조하였다. 유동층과립기(Fluid Bed Granulator, FBG: FBG-1, Enger)에 사쿠비트릴/발사르탄, 글리세릴디베헤네이트 및 미결정셀룰로오스를 넣어 혼합한 후 결합액을 분사하여 연합물을 제조하였다. 상기 연합물을 건조하고, 온도를 60~80℃로 높여 25분~2시간 경화하였다. 이후, 정립기에서 정립한 후 과립물에 스테아르산마그네슘을 첨가한 후 활택을 실시하여 최종 제2방출부 과립물을 형성하였다.
3) 제3방출부의 제조
에탄올 수용액에 폴리소르베이트를 분산시켜 결합액을 제조한 후 고속혼합기에 네비보롤, 크로스카멜로오스나트륨, 히프로멜로오스 및 유당수화물 및 옥수수전분을 혼합한 후 결합액을 넣어 교반하면서 연합하여 연합물을 제조하였다. 상기 연합물을 유동층 건조기를 이용해 건조하였다. 이후, 정립기에서 정립한 후 크로스카멜로오스나트륨 및 미결정셀룰로오스를 첨가해서 후혼합을 실시한 후 과립물에 콜로이드성이산화규소 및 스테아르산마그네슘을 첨가하여 최종 제3방출부 과립물을 형성하였다.
4) 삼층정의 제조
위에서 제조된 제1방출부, 제2방출부 및 제3방출부를 함께 다층정 타정기(Autotab 200RT, Ichihashiceiki)를 사용하여 타정하여 삼층정을 제조하였다.
구성성분 실시예 4
중량(%) 중량(mg)

제1방출부		 유효성분 사쿠비트릴/발사르탄 56.5 45.2
부형제 미결정셀룰로오스 12.5 10.0
붕해제 크로스포비돈 29.0 23.2
활택제 콜로이드성이산화규소 0.5 0.4
스테아르산마그네슘 1.5 1.2
합계 100.0 80.0
제2방출부 유효성분 사쿠비트릴/발사르탄 45.2 181.0
서방화기제 글리세릴디베헤네이트 26.2 105.0
에틸셀룰로오스 4.5 18.0
부형제 미결정셀룰로오스 23.3 93.2
활택제 스테아르산마그네슘 0.7 2.8
합계 100.0 400.0
제3방출부 유효성분 네비보롤 2.4 5.45
계면활성제 폴리소르베이트80 0.2 0.5
부형제 유당수화물 61.6 141.65
옥수수전분 20.0 46.0
미결정셀룰로오스 7.0 16.1
결합제 히프로멜로오스 2.0 4.6
붕해제 크로스카멜로오스나트륨 6.0 13.8
활택제 콜로이드성이산화규소 0.3 0.7
스테아르산마그네슘 0.5 1.2
합계 100.0 230.0
* 위 제1방출부 및 제2방출부에서의 유효성분인 사쿠비트릴/발사르탄은 사쿠비트릴 및 발사르탄이 1:1 몰비인 삼나트륨염 2.5수화물 형태이며 '사쿠비트릴/발사르탄으로서 200mg'이고, 제3방출부에서의 유효성분인 네비보롤은 네비보롤염산염 형태이며‘네비보롤로서 5mg’임
<실험예 1. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 효과 확인 - in vitro 시험>
1) 세포배양
세포배양은 다음과 같이 진행 하였다. H9C2(2-1) 세포(Rat 기원/Heart/Myocardium)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 분양 받아 사용하였다. H9C2(2-1) 세포는 DMEM/F-12 배지에 10% FBS(Fetal Bovine Serum/소태아혈청)과 페니실린 10,000U/㎖, 스트렙토마이신 10mg/㎖를 포함한 배지를 사용하여 배양을 하였다. 세포배양 용기(cell culture dish/t75 flask)를 이용하여 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 세포가 80% 정도 증식하면 15㎖ PBS로 3번 세척 후 0.25% 트립신-EDTA를 처리(37℃, 5min)하여 세포를 부유시킨 후 원심분리(1,200rpm, 5min, 4℃) 하였다. 세포 펠렛을 회수하고, 다시 DMEM/F-12 배지에 10% FBS(Fetal Bovine Serum/소태아혈청)과 페니실린 10,000U/㎖, 스트렙토마이신 10mg/㎖를 포함한 배지에 분주하여 계대 배양하였다. 배지는 2일마다 새로 교환하였다.
2) H9C2 세포에 안지오텐신 Ⅱ(Angiotensin Ⅱ) 및 시험 약물 처리
H9C2 세포를 세포배양 용기에서 배양한 후 0.25% Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 부유시킨 후 원심분리하여 회수하였다. 이 세포를 6-웰 플레이트에 5 X 105 cells/1㎖ media/well로 분주하고 24시간 배양한 후 안지오텐신 Ⅱ(Angiotensin Ⅱ)를 처리(20uM)한 후 12시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 갈아 주면서 시험 군 구성을 표 6과 같이 해서, 시험 약물을 사전 MTT 어세이 등을 통해 확인된 세포 독성이 없는 범위내 처리 농도로 처리하고, 6, 12, 24시간 배양하였다. 단, 무처리군(G1군)은 안지오텐신 II와 약물을 모두 처리하지 않았고 음성대조군(G2군)은 안지오텐신 II만 처리하고 약물을 처리하지 않았으나, 다른 시험군 등과 마찬가지의 조건하에 배양하였다.
군 유도물질 시험 약물 및 처리 농도
G1 - -
G2 Angiotensin II
20μM		 -
G3 Sacubitril/Valsartan (S/V) 20μM + Nebivolol 2μM
G4 S/V 20μM + Carvedilol 2μM
G5 S/V 20μM + Bisoprolol 2μM
3) Real-time PCR
표 6과 같이 시험 약물을 H9C2 세포에 처리하고 배양한 후, PBS를 이용하여 세척을 1회 실시하였다. RiboExTM를 1mL 처리(37℃, 5min)하여 세포를 부유시킨 후 회수하고, 상온에서 5분 동안 균질화(homogenate)를 진행하였다. 원심분리(12,000rpm, 15min, 4℃) 후 클로로포름을 0.2mL 넣어 주고, 상온에서 15초 동안 볼텍스(vortex)를 하거나 손으로 흔들어 잘 섞어준 후 상온에서 2분동안 반응시켰다. 원심분리(12,000rpm, 15min, 4℃) 후 상층액의 RNA를 취하였다. GeneAll hybrid-R RNA purification kit를 사용하여 RNA를 추출하였다. Nano-drop 장비로 RNA의 양과 퀄리티를 체크하고, 각각의 샘플에 RNA 정량을 하여 cDNA Synthesis Kit로 DNA 합성을 진행하였다.
- DNA 농도에 따른 real-time PCR 결과
같은 농도의 cDNA를 각각 4μL씩 넣고, forward primer(10μM) 1μL, reverse primer(10μM) 1μL, ROX Reference Dye 1μL, SYBR green I(2X) 25μL를 넣고 물을 18μL 넣어 최종 부피를 50μL로 맞추고, real-time PCR로 DNA를 증폭시켰다. Real-time PCR은 95℃로 10초간 가열 후, 95℃ 5초, 60℃ 30초의 cycle을 40번 반복하였다.
4) 효소면역정량법(ELISA) 분석
- 단백질 추출(Protein Extraction)
표 6과 같이 시험 약물을 처리하고 배양한 H9C2 세포를 사용하여 단백질 추출을 하였다. 배지를 제거한 후 PBS로 세척하였다. 스크레이퍼(scraper)로 세포를 플레이트에서 분리시킨 후 마이크로튜브에 분리된 셀을 옮기고 나서, 원심분리(10,000rpm, 5min, 4℃) 후 상층액을 모두 제거하였다. RIPA 버퍼 800μL에 프로테아제 억제제 32μL(4%)를 넣었다. 튜브를 얼음에 넣고 고정하여 5초씩 잘 섞어 주었다. 원심분리(13,000rpm, 10min, 4℃) 진행 후 상층액만 마이크로튜브에 옮겨 -20℃에서 보관하였다.
- Bradford 법
추출된 단백질을 정량하기 위하여 Bradford 법으로 정량을 실시하였다.
- ELISA 분석법
정량된 단백질을 이용하여 ELISA 분석법을 실시하였다. 항체를 코팅시키고, PBS로 세척을 진행하고 3% BSA(in PBS)를 웰에 처리하여 실온에서 2시간 동안 배양시켰다. PBS로 세척한 후 검체 및 표준단백질검체를 96-웰 플레이트에 1차 항체 50μL을 각 웰에 첨가하였다. 4시간 동안 실온에서 항원과 항체 결합을 실시하였다. PBS로 세척한 후 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체 50μL를 각 웰에 첨가한 후 4℃에서 밤새(overnight) 배양하여 결합시키고, ELISA reader로 분석을 진행하였다.
5) 분석 결과
In vitro 시험을 진행한 후 RT-PCR, Western blot, ELISA, Immunohistochemistry 방법을 사용하여 바이오마커들의 변화를 공지된 방법에 따라 측정하여, 심부전 및 허혈성 심질환에 대한 치료효력을 평가하였다. 특히 심부전 바이오마커에 해당하는 나트륨이뇨펩티드(Natriuretic peptides)인 BNP(B-type natriuretic peptides) 및 알도스테론(aldosterone), 심장 리모델링과 심장비대, 및 섬유증 관련 바이오마커에 해당하는 sST2(Soluble Source of Tumorigenicity 2), 콜라겐 I(collagen I) 및 콜라겐 III(collagen III), FAS(Cluster of differentiation 95), cGMP(cyclic guanosine monophosphate), PKG(protein kinase G) 등을 포함해서, 심부전, 심장섬유증, 심장 리모델링과 심장비대 등의 심장기능 및 구조적 변화와 관련이 있다고 알려져 있는 바이오마커의 변화를 측정하였다. 또한, 심부전 및 허혈성 심질환 치료에서의 혈압강하 및 혈관 이완 관련 NO(nitric oxide) 생성 효소인 eNOS(endothelial nitric oxide synthase) 및 브래디키닌(Bradykinin)의 활성도를 측정하였고, 심부전의 진행에 있어 만성 염증이 심부전의 악화, 입원 횟수의 증가, 및 사망률 증가의 예후를 보이는 것으로 알려져 있어 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-10, IL-6, 및 cGMP를 측정하였다.
상기 BNP, 알도스테론, sST2, collagen I, collagen III, FAS, cGMP, PKG 등에 대한 바이오마커 측정 결과, 본 발명에 따른 사쿠비트릴/발사르탄 및 네비보롤 처리군의 경우, 사쿠비트릴/발사르탄 및 다른 베타차단제(카르베딜롤 또는 비소프롤롤) 처리군 대비 심장 비대 및 심장 섬유증을 보다 더 효과적으로 억제시킬 수 있고 심부전 치료효과를 상승시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 또한, 본 발명에 따른 사쿠비트릴/발사르탄 및 네비보롤 처리군의 경우, 사쿠비트릴/발사르탄 및 다른 베타차단제(카르베딜롤 또는 비소프롤롤) 처리군과 비교하여, eNOS를 활성화시켜 NO 생성 증가율이 높았고, TNF-α, IL-10, 및 IL-6와 같은 사이토카인, 및 CRP의 분비를 효과적으로 억제하여 우수한 항염증 작용을 나타내는 것으로 확인되었다.
대표적으로 Real-time PCR 결과로서, 도 2에 제시된 바와 같이 사쿠비트릴/발사르탄 및 네비보롤 처리군(G3군)은, 안지오텐신 II 처리군(G2군)과 대비하여 BNP 발현율이 안지오텐신 II 무처리군과 유사한 정도로 가장 많이 감소하고 사쿠비트릴/발사르탄 및 다른 베타차단제(카르베딜롤 또는 비소프롤롤) 처리군(G4군 또는 G5군) 보다도 감소하였다(도 2(A)). 또한, 사쿠비트릴/발사르탄 및 네비보롤 처리군(G3군)은, G2군과 대비하여 sST2 발현율이 유의적으로 감소하였다(도 2(B)).
<실험예 2. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 효과 확인 - 동물 시험>
본 발명에 따른 사쿠비트릴, 발사르탄 및 네비보롤의 삼중 복합제의 효능을 심부전 래트 모델을 이용하여 다음과 같이 평가하였다.
1) 시험 방법
7 주령 수컷 SD 래트(Sprague-Dawley Rat)에 대동맥 교차 협착(Transverse aortic constriction: TAC)법을 실시하여 심부전 모델을 제작하였다. Zoletil 50(VIRBAC, France) 및 xylazine(Rompun®, Bayer AG, Germany)을 각각 20mg/kg 및 5mg/kg의 투여량으로 복강 내 투여하여 마취를 실시한 후, 동물 좌측 제 2-3 늑간 주변부에 대하여 제모를 실시하고, 포비돈 및 70% 알코올을 이용하여 소독하였다. 기관내 튜브(endotracheal tube)를 이용하여 기도를 확보한 뒤 산소호흡기(ventilator)에 연결하였다. 개흉을 실시한 뒤, 무명동맥(innominated artery)과 좌측총경동맥(left common carotid artery) 사이의 대동맥궁(aortic arch)을 확인한 다음, 4-0 봉합사를 이용하여 22 gauge needle을 적용한 채로 결찰하고 결찰 후 22 gauge needle을 제거하였다. 이후 흉강 및 피부를 봉합하였다. TAC 실시 후 2주의 기간 동안 심부전 모델을 유발 시킨후 심초음파 검사를 통해 확인 후 각 시험군(n=5)으로 나누어 2주간 시험물질 투여를 행하였다. 시험군은, 다음 표 7과 같이 구성하였고, 샴대조군(G1군)에 대해서는 대동맥 협착(TAC) 없이 개흉을 실시한 뒤 흉강 및 피부를 봉합하였다. 모든 래트가 표준 식이와 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였으며 실온은 20± 3℃, 및 습도 50± 2% 하에서 및 12시간 명/암 주기로 유지시켰다.
군 TAC 유발여부 투여물질 및 투여량(1day)
G1 N -
G2 Y 부형제(1% Tween 80 in DW)
G3 Y Nebivolol HCl 1.25mg/kg
G4 Y Sacubitril/Valsartan 50mg/kg
G5 Y Sacubitril/Valsartan 50mg/kg + Nebivolol HCl 1.25mg/kg
총 4주 동안 사쿠비트릴/발사르탄, 네비보롤을 1일 1회 각각 반복적으로 투여하였고 시험이 완료된 후 평가를 위해 래트를 마취하고 안락사시켰다.
2) 심부전 등 치료 효과 - 바이오마커 측정
심부전 및 허혈성 심질환에 대한 치료 효력을 평가하기 위해, 바람직하게는 박출률 감소 심부전(HFrEF), 박출률 보존 심부전(HFpEF), 심부전으로 인한 심장섬유증, 비폐색성 비대성 심근병증, 심방세동 동반 심부전, 및 허혈성 심질환에 대한 효력을 평가하기 위해, 상기 시험동물에 대해 4주 동안 시험물질을 투여한 후 RT-PCR, Western blot, ELISA, Immunohistochemistry 방법을 사용하여 바이오마커들의 변화를 공지된 방법에 따라 측정하였다. 특히 심부전 바이오마커에 해당하는, 나트륨이뇨펩티드(Natriuretic peptides)인 BNP(B-type natriuretic peptides), 심장 리모델링과 심장비대, 및 섬유증 관련 바이오마커에 해당하는 sST2(Soluble Source of Tumorigenicity 2), 콜라겐 I(collagen I) 및 콜라겐 III(collagen III) 등을 포함해서, 심부전, 심장섬유증, 심장 리모델링과 심장비대 등의 심장기능 및 구조적 변화와 관련이 있다고 알려져 있는 바이오마커의 변화를 측정하였다. 또한, 심부전 및 허혈성 심질환 치료에서의 혈압강하 및 혈관 이완 관련 NO(nitric oxide) 생성 효소인 eNOS(endothelial nitric oxide synthase)의 활성도를 측정하였고, 심부전의 진행에 있어 만성 염증이 심부전의 악화, 입원 횟수의 증가, 및 사망률 증가의 예후를 보이는 것으로 알려져 있어 염증성 사이토카인인 TNF-α를 측정하였다.
대표적인 ELISA 분석 결과로서, 도 3(A) 및 3(B)를 통해 사쿠비트릴/발사르탄 및 네비보롤 투여군(G5군)의 경우, TAC 유발후 약물 투여 없이 부형제만 투여된 군(G2군)에 비해 BNP 발현율 및 Collagen I 발현율이 유의적으로 감소한 것이 확인되며, 도 4를 통해 사쿠비트릴/발사르탄 및 네비보롤 투여군(G5군)이 G2군 대비 eNOS 발현율이 유의적으로 증가한 것이 확인되었다.
3) 심부전 치료 효과 - 심초음파 평가 결과
TAC 시행 2주 후 시험 약물 투여 전(0주), 약물 투여 중(2주), 및 약물 투여 종료(4주) 후에 각각 심장초음파검사를 하여, 이완기좌심실내경(Left Ventricular Internal Dimension Diastole, LVIDD), 및 수축기좌심실내경(Left Ventricular Interanl Dimension In Systole, LVIDS)을 평가하였고, 구획단출률(Fractional Shortening, FS) 및 이완기말 용적(End-Diastolic Volume, EDV), 수축기말 용적(End-Systolic Volume, ESV), 박출률(Ejection Fraction, EF)을 구하였다.
위와 같은 심초음파 평가 결과, 시험 약물 투여 전(0주)에 G2군 내지 G5군의 FS(%) 및 EF(%)는 차이가 없었으나, 약물 투여 종류(4주) 후 다음 표와 같이 사쿠비트릴/발사르탄 및 네비보롤 투여군(G5군)의 FS(%) 및 EF(%)은 TAC 시술 후 약물 투여 없는 군(G2군)에 비하여 향상되었다. 본 발명에 따른 사쿠비트릴/발사르탄 및 네비보롤 투여군은 사쿠비트릴/발사르탄 투여군, 또는 네비보롤 투여군 대비 심부전 치료 효과가 우수한 것으로 확인되었다.
군 LVIDd (mm) LVIDs (mm) FS (%) EDV (μl) ESV (μl) EF (%)
G1 Sham MEAN 2.90 1.53 47.40 32.50 6.38 80.34
SD 0.18 0.08 0.63 4.81 0.84 0.42
G2 TAC MEAN 2.67 1.74 34.94 26.85 9.01 66.15
SD 0.36 0.21 3.31 8.69 2.65 4.29
G3 Nebi MEAN 2.87 1.71 40.30 31.64 8.61 72.74
SD 0.26 0.14 1.14 6.95 1.79 1.24
G4 S/V MEAN 2.68 1.60 40.17 24.48 6.73 72.53
SD 0.22 0.12 0.62 3.59 1.00 0.13
G5 S/V
+Nebi		 MEAN 3.04 1.73 43.09 33.39 8.72 74.03
SD 0.37 0.18 1.20 11.22 3.12 0.80
4) 조직학적 분석 결과
- 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 염색
심부전 심장조직을 래트(SD)로부터 분리한 후 포르말린 용액을 이용하여 심장조직의 변형을 방지하는 고정 과정을 거치고, 고정된 심장조직을 파라핀 블록으로 만들어 마이크로톰칼(microtome knife)를 이용하여 4㎛ 두께의 절편으로 슬라이드에 박절하였다. 심장 섬유화정도를 확인하기 위하여 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 염색을 시행하였다. 콜라겐이 생기는 것을 알 수 있는 방법으로서, 파란색으로 염색된 부분이 콜라겐이 침착된 부분이다.
메이슨 트리크롬 염색 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5(A)는 TAC 시술 후 심부전 동물 모델의 심장조직에서의 메이슨 트리크롬 염색결과 이미지이고, 도 5(B)는 섬유화된 정도를 정량화한 값(%)으로 나타낸 것으로서, 본 발명에 따른 사쿠비트릴/발사르탄 및 네비보롤 투여군(G5군)은 TAC 시술 후 약물 투여 없이 부형제만 투여된 군(G2군) 대비 유의적으로 섬유화를 억제하였고, 사쿠비트릴/발사르탄 투여군(G4군) 또는 네비보롤 투여군(G3군)에 비해서도 섬유화를 억제하는 효과가 있는 것으로 확인되었다.
- 면역조직화학 염색 (IHC staining, Immunohistochemistry staining)
박절된 샘플에 과산화효소의 활성화를 없애기 위해 메탄올에 희석된 0.3% 과산화수소에 30분 배양하였다. PBS(Phosphate buffer saline)로 20분간 세척한 후 1차 항체(Primary antibody) 박절 샘플에 처리 후 상온에서 20분간 반응시키고, PBS로 5분간 세척하였다. 1% BSA(Bandeiraea simplicifolia agglutinin in PBS)에 20분간 반응시키고, PBS로 5분간 세척한 뒤 조직주변의 PBS 제거 후 희석한 1차 항체를 조직 위에 충분히 떨어뜨렸다. 습도가 유지되는 챔버에 상온에서 30분간 배양하며 마르지 않게 주의하면서 PBS로 10분간 세척하고 2차 항체(Secondary antibody)를 조직 위에 충분히 떨어뜨렸다. 습도가 유지되는 챔버에서 상온에서 30분간 배양하고, 마르지 않게 주의하여 PBS에 10분간 세척하고 형광시약으로 30분간 반응시킨 후 Mayer’s Hematoxylin으로 1분간 핵 염색을 진행하고, 물에서 10분간 세척 후 관찰하였다.
TNF-α에 대한 면역조직화학 염색 후 분석한 결과, 도 6(A) 및 6(B)에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 사쿠비트릴/발사르탄 및 네비보롤 투여군(G5군)은 TAC 시술 후 부형제만 투여한 군(G2군) 대비 TNF-α 발현이 감소하였고, 사쿠비트릴/발사르탄 투여군 또는 네비보롤 투여군과 비교해서도 TNF-α 발현이 감소하는 것으로 확인되었다.
조직학적 분석 결과, 본 발명에 따른 삼중 복합제 투여군은 사쿠비트릴/발사르탄 투여군 또는 네비보롤 투여군 대비 심장 섬유화 정도가 현저히 감소하였고 심근 비대 정도가 낮은 것으로 확인되었다.
<실험예 3. 실시예 1 및 비교예 1의 제제의 용출 시험>
실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 정제에 대한 용출패턴을 평가하기 위하여 용출시험을 실시하였고 보다 구체적인 용출시험 조건 및 HPLC 분석조건은 다음과 같다.
용출시험 조건
- 시험법: 대한약전 일반시험법 중 제2법(패들법)
- 용출액: pH6.8
- 용출액양: 900mL
- 용출온도: 37±0.5℃
- 회전속도: 50rpm
HPLC 분석조건
- 컬럼: Zorbax SB-C18, 5㎛, 4.6mm x 150mm 또는 이와 동등한 칼럼
- 이동상: 인산이수소칼륨수용액 : 90% 메탄올용액 = 350 : 650 (v/v)
- 주입량 : 10㎕
- 유속 : 1.5mL/min
- 검출기: 자외부 흡광광도계(281nm)
- 컬럼 온도 : 35℃
용출시험 결과
상기 비교예 1의 용출시험 결과는 아래 표 9에 나타내었다.
용출률(%)
pH6.8 비교예 1
용출시간(h) 발사르탄 사쿠비트릴
0.25 8.2 4.6
0.5 14.5 8.9
1 23.9 14.5
1.5 32.2 20.3
2 39.0 25.3
3 50.4 33.9
5 67.2 47.4
6 74.2 53.4
8 84.4 63.4
10 91.4 71.5
12 96.0 78.4
비교예 1의 서방정은 유효성분의 용출이 12시간에 걸쳐 지속되었으나, 2시간내 용출이 40% 이하로서 약효 발현 시간이 지연되는 것이 확인되었다. 또한, 발사르탄 및 사쿠비트릴의 용출률이 각각 30분 후 14.5% 및 8.9%, 2시간 후 39.0% 및 25.3%, 12시간 후 96.0% 및 78.4%로 차이가 있는 것으로 확인되었다. 반면에, 실시예 1-1 내지 1-6과 같이 서방화 기제로서 에틸셀룰로오스, 글리세릴디베헤네이트, 글리세릴디스테아레이트, 스테아릴알코올, 미리스틸알코올, 및 세토스테아릴알코올을 각각 사용한 경우, 사쿠비트릴과 발사르탄이 일치하는 용출 프로파일을 보이는 것으로 확인되었다. 대표적으로 글리세릴디베헤네이트에 대한 용출 프로파일을 도 7에 도시하였다.
<실험예 4. 실시예 1의 과립물의 특성 평가>
실시예 1의 제제에 있어서, 활택제 후혼합 직전의 정립된 과립물의 특성을 살펴보기 위하여, 겉보기밀도, 탭밀도, 카르 지표 및 입도를 평가하였다. 즉, 겉보기 밀도는 100mL 실린더를 사용하여 무게를 측정하여 결정하였으며, 탭밀도는 100mL 실린더에 충전한 후, 탭밀도 측정기(SVM122, ERWEKA)로 1250회 탭핑(tapping)하여 부피를 측정하여 결정하였으며, 흐름성은 겉보기밀도와 탭밀도 값을 이용해 카르 지표(Carr's Index)를 구하여 결정하였다.
구분 실시예
1-1 1-2 1-3 1-4 1-5 1-6
겉보기밀도(g/mL) 0.30 0.38 0.33 0.31 0.45 0.41
탭밀도(g/mL) 0.40 0.49 0.42 0.42 0.60 0.52
Carr's Index 25.0 22.4 21.4 26.2 25.0 21.2
입도(D90) 593㎛ 930㎛ 915㎛ 992㎛ 929㎛ 972㎛
위 표에서와 같이 실시예 1-1 내지 1-6의 방법에 따라 제조된 과립물은 그 입도(D90)가 100~1000㎛의 범위로 균일한 분포를 보였고, 또한 겉보기밀도가 0.30~0.45g/mL이고, 탭밀도가 0.40~0.60g/mL를 나타내었다. 이와 같이 과립물이 특정 밀도 및 입도를 갖는 경우에, 발사르탄 및 사쿠비트릴이 일치하여 그 중량기준으로 각각 30분 후 40% 미만, 2시간 후 40~70%, 및 12시간 후 80% 이상으로 방출되는 용출프로파일을 나타내어 이들 유효성분의 지속 방출 및 적절한 지연 방출을 가능하게 하는데 영향을 주는 것으로 확인되었다.
<실험예 5. 실시예 2와 대조제제의 용출 시험>
시판되고 있는 엔트레스토정100mg(사쿠비트릴 48.6mg/발사르탄 51.4mg, 사쿠비트릴/발사르탄으로서 100mg)(Lot No. TU149, 유효기간: 2021.08.20)을 대조제제로 사용하고, 상기 대조제제와 유효성분 함량이 동일하게 되도록 제조한 실시예 2의 정제와 비교하여 사쿠비트릴/발사르탄 성분의 용출시험을 실시하였으며 구체적인 시험방법은 아래와 같고, HPLC 분석조건은 실험예 3과 같다.
용출시험 조건
- 시험법: 대한약전 일반시험법 중 제2법(패들법)
- 용출액: 물, pH4.0, pH6.8, pH1.2
- 용출액양: 900mL
- 용출온도: 37±0.5℃
- 회전속도: 50rpm
용출시험 결과
상기 용출시험 결과는 도 8에 나타내었다. 실시예 2-4과 대조제제인 엔트레스토정 100mg 모두 발사르탄 및 사쿠비트릴이 일치하는 용출 프로파일을 보이면서 물, pH4.0, 및 pH6.8에서 30분 이내에 유효성분이 90% 이상 방출하는 것으로 확인되었다. 또한, 실시예 2-1 내지 2-3의 정제의 경우도 실시예 2-4과 같이 발사르탄 및 사쿠비트릴이 일치하는 용출 프로파일을 보이면서 물, pH4.0, pH6.8에서 30분 이내에 유효성분이 90% 이상 방출하는 것으로 확인되었다.
<실험예 6. 실시예 3 및 비교예 2의 제제의 용출 시험>
실시예 3 및 비교예 2에서 제조된 정제에 대한 용출패턴을 평가하기 위하여 용출시험을 실험예 3과 마찬가지의 조건으로 실시하였고 HPLC 분석조건은 실험예 3과 같다.
용출시험 결과
상기 실시예 3 및 비교예 2의 용출시험 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다. 실시예 3-3의 정제는 용출시험 30분에 약 30% 이하에 도달한 이후 12시간동안 지속적으로 유효성분이 방출되고, 또한 사쿠비트릴과 발사르탄이 매우 유사한 형태로 방출되는 것을 확인할 수 있었다. 아울러, 도 10과 같이 비교예 2-1 및 2-2의 정제에 비해, 실시예 3-1 및 3-4의 정제가 30분 후에 발사르탄 중량 기준 약 40% 미만, 2시간 후에 40~70% 및 12시간 후에 80% 이상이 방출됨으로써 속효성과 지속성을 갖는 것으로 확인되었다.
<실험예 7. 실시예 4의 복합제제의 용출 시험>
실시예 4의 사쿠비트릴 및 발사르탄에 대한 용출패턴을 평가하기 위하여 용출시험을 실험예 3과 마찬가지의 조건으로 실시하였고 HPLC 분석조건은 실험예 3과 동일하게 진행했고, 네비보롤에 대한 용출패턴을 평가하기 위하여 하기 조건에 따라 용출시험을 진행하였다.
용출시험 조건
- 시험법: 대한약전 일반시험법 중 제2법(패들법)
- 용출액: pH1.2
- 용출액양: 900mL
- 용출온도: 37±0.5℃
- 회전속도: 50rpm
용출시험 결과
실시예 4의 삼층정에 대한 용출시험 결과를 도 11에 나타내었다. 실시예 4의 삼층정은 30분 후에 사쿠비트릴 및 발사르탄 각각 중량 기준 약 40% 미만, 2시간 후에 40~70% 및 12시간 후에 80% 이상이 방출됨으로써 속효성과 지속성을 갖는 것으로 확인되었다. 또한 네비보롤은 용출시험 30분에 75%이상 도달하여 속효성을 나타내었다.
<실험예 8. 약물동태학적 평가>
1) 시험 방법
본 발명에 따른 복합제제의 동물시험모델 내에서의 약물 동태를 평가하기 위해 대조군으로써, 엔트레스토정100mg은 1일 2회(12시간 간격) 1정씩, 네비레트정5mg은 1일 1회 1정씩 투여하되, 1차 투여 시에 엔트레스토정100mg과 네비레트정5mg을 병용 투여하고, 2차 투여 시 엔트레스토정100mg를 단독 투여하였다. 시험군으로써, 실시예 4의 삼층정은 1일 1회 1정씩 단독 투여하였다. 각 3마리의 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey)에 경구투여한 후 대퇴정맥에서 채혈(약 1.5mL)하였고 채혈 시간은 아래와 같은 간격으로 실시하였다.
- 엔트레스토정100mg, 네비레트정5mg: 투여 전(0시간), 1차 투여 후 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 8, 12시간 (2차 투여) 12.5, 13, 13.5, 14, 16, 20, 24시간.
- 실시예 4: 투여 전(0시간), 투여 후 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24시간
채혈된 혈액을 원심분리하여 혈장을 분리하고, 분석시까지 냉동 보관하였다. 14일의 충분한 휴약 기간이 지난 후 3x3 교차 설계하여 시험하였으며 혈장 중의 약물농도는 LC-MS/MS로 분석하였다.
<LC-MS/MS 분석조건>
- 컬럼: Imtakt UNISON C18 (2.0×50mm, 3㎛)
- 이동상: 10mM Ammonium formate(0.1% formic acid) : Methanol = 30 : 70 (v/v)
- 주입량: 2㎕
- 유속: 0.25㎕/min
- 장비: LC/MS(Agilent 1200 series)
- 검출기: 4000 Qtrap MRM mode(positive)
2) 약동학적 파라미터 측정 결과
원숭이를 대상으로 엔트레스토정100mg(사쿠비트릴/발사르탄으로서 100mg) 2정(12시간 간격으로 투여)과 네비레트정5mg(네비보롤로서 5mg) 1정을 복용했을 때의 혈중 농도와 본 발명에 따른 실시예 4의 시험약(사쿠비트릴/발사르탄으로서 200mg, 및 네비보롤로서 5mg)을 1정 복용했을 때, 사쿠비트릴, 사쿠비트릴라트, 발사르탄, 및 네비보롤에 대한 혈중 농도를 비교하여 그 결과를 하기 표에 나타내었다.
약동학적 파라미터
(사쿠비트릴)		 Mean±SD
대조군
(엔트레스토정: 100mg*2ea) 		실험군
(실시예 4: 사쿠/발사로서 200mg*1ea)
Cmax(ng/mL) 4346.46±2288.75 3239.61±2691.45
AUC0-24(hr·ng/mL) 14283.23±3113.41 14062.17±5506.59
약동학적 파라미터
(발사르탄)		 Mean±SD
대조군
(엔트레스토정: 100mg*2ea) 		실험군
(실시예 4: 200mg*1ea)
Cmax(ng/mL) 3224.26±1201.06 2189.70±929.03
AUC0-24(hr·ng/mL) 21195.47±7768.01 24921.18±14181.69
약동학적 파라미터
(사쿠비트릴라트)		 Mean±SD
대조군
(엔트레스토정: 100mg*2ea) 		실험군
(실시예 4: 200mg*1ea)
Cmax(ng/mL) 17373.77±5226.67 11216.72±4471.42
AUC0-24(hr·ng/mL) 77448.51±16296.74 70557.34±17794.40
약동학적 파라미터
(네비보롤)		 Mean±SD
대조군
(네비레트정: 5mg*1ea)		 실험군
(실시예 4: 네비보롤로서 5mg*1ea)
Cmax(ng/mL) 7.71±3.27 8.78±4.40
AUC0-24(hr·ng/mL) 31.38±10.38 37.89±14.95
대조군에 대한 실험군의 AUC0-24 비율(T/R ratio)을 계산하면, 비활성형인 사쿠비트릴은 98.45%를 나타내고 있고, 활성형인 사쿠비트릴라트와 발사르탄 및 네비보롤의 경우 각각 91.10%, 117.58%, 120.75%를 나타내어 각 유효성분의 치료 효과적인 측면에서 대조약(엔트레스토정, 네비레트정)과 유사할 것으로 판단된다. 뿐만 아니라 Cmax의 T/R ratio를 보면, 사쿠비트릴 74.53%, 사쿠비트릴라트 64.56%, 발사르탄 67.91%로 엔트레스토정에 비해 낮은 값을 나타내 부작용 측면에서 유리할 것임이 예상되었고, 네비보롤은 113.88%로 동등성 범위 내 값을 나타냈다. 실제 실험을 통해 부작용 관련 임상증상이 감소하는 효과가 있는 것으로 확인되었다.

Claims (14)

  1. 사쿠비트릴 및 발사르탄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
    네비보롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;
    을 유효성분으로 포함하는 심부전 및 허혈성 심질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    사쿠비트릴 및 발사르탄과 네비보롤의 몰비가 1: 0.1~10: 0.001~0.5인 것을 특징으로 하는 하는 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 심부전 및 허혈성 심질환은 박출률 감소 심부전, 박출률 보존 심부전, 심부전으로 인한 심장섬유증, 비폐색성 비대성 심근병증, 심방세동 동반 심부전, 당뇨병 동반 심부전, 협심증, 심근경색증, 및 혈압 강하가 필요한 심근경색증에서 선택된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  4. 사쿠비트릴 및 발사르탄, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
    네비보롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;
    을 유효성분으로 포함하는 약제학적 복합제제.
  5. 제4항에 있어서,
    사쿠비트릴 및 발사르탄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 제1방출부;
    사쿠비트릴 및 발사르탄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 서방화 기제로서 비이온성 소수성 폴리머 및 지질 중 1종 이상을 포함하는 제2방출부; 및
    네비보롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 제3방출부;를
    포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 복합제제.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 비이온성 소수성 폴리머는, 셀룰로오스 유도체로서 셀룰로오스아세테이트 및 에틸셀룰로오스 중 1종 이상이고,
    상기 지질은, 지방산 에스테르로서 글리세릴디베헤네이트, 글리세릴디스테아레이트, 글리세릴모노올레이트, 글리세릴팔미토스테아레이트; 지방산 알코올로서 스테아릴알코올, 세토스테아릴알코올, 및 미리스틸알코올;로 이루어진 그룹에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약제학적 복합제제.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 제1방출부와 제2방출부의 유효성분 중량비가 1:3 내지 1:9인 것을 특징으로 하는 심부전 치료용 약제학적 복합제제.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 제1방출부는 추가로 부형제, 붕해제, 및 활택제를 포함하는 것이고,
    상기 제2방출부는 서방화 기제로서 에틸셀룰로오스, 글리세릴디베헤네이트, 글리세릴디스테아레이트, 스테아릴알코올, 세토스테아릴알코올, 및 미리스틸알코올로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상, 및 추가로 부형제 및 활택제 중 1종 이상을 포함하는 것이며,
    상기 제3방출부는 추가로 부형제, 붕해제, 계면활성제, 결합제 및 활택제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 복합제제.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제1방출부, 제2방출부, 및 제3방출부에 있어서, 부형제는 유당수화물, 옥수수전분, 무수인산수소칼슘, 및 미결정셀룰로오스로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상이고, 활택제는 스테아르산마그네슘, 탤크, 스테아르산, 스테아릴푸마레이트나트륨, 및 콜로이드성이산화규소로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상이며,
    상기 제1방출부 및 제3방출부에 있어서, 붕해제는 크로스카멜로오스나트륨, 전분글리콜산나트륨, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 및 크로스포비돈로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상이고,
    상기 제3방출부에 있어서, 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 및 히드록시프로필셀룰로오스로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상이며, 계면활성제는 폴리소르베이트 및 라우릴황산나트륨 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약제학적 복합제제.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 제1방출부는 제1방출부 총 중량을 기준으로, 유효성분 10~70중량%, 부형제 5~70중량%, 붕해제 15~35중량%, 및 활택제 0.5~3.5중량%를 포함하고;
    상기 제2방출부는 제2방출부 총 중량을 기준으로, 유효성분 40~70중량%, 서방화 기제 15~50중량%, 부형제 및 활택제 중 1종 이상 1~25중량%를 포함하며;
    상기 제3방출부는 제3방출부 총 중량을 기준으로, 유효성분 0.5~5중량%, 부형제 60~90중량%, 붕해제 1~20중량%, 계면활성제 0.1~2중량%, 결합제 0.5~10중량% 및 활택제 0.2~3중량%을 포함하는 것;을 특징으로 하는 약제학적 복합제제.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 복합제제는 1일 1회 경구투여 제형인 것을 특징으로 하는 약제학적 복합제제.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 복합제제는 다층정 또는 핵정의 정제 형태, 또는, 과립, 펠렛, 또는 미니정제를 충전한 경질캡슐제 형태인 것을 특징으로 하는 약제학적 복합제제.
  13. 제5항에 있어서,
    상기 약제학적 복합제제는, 대한민국약전 용출시험법 제2법(패들법)에 따라, 37±0.5℃, pH6.8 용출액 조건에서 용출시험시, 사쿠비트릴 및 발사르탄이 그 중량기준으로 각각 30분 후 40% 미만, 2시간 후 40~70%, 및 12시간 후 80% 이상 용출되는 것을 특징으로 하는 약제학적 복합제제.
  14. (a) 유효성분으로서 사쿠비트릴 및 발사르탄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 제1방출부를 제조하는 단계;
    (b) 유효성분으로서 사쿠비트릴 및 발사르탄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 서방화 기제로서 비이온성 소수성 폴리머 및 지질 중 1종 이상을 포함하는 제2방출부를 제조하는 단계;
    (c) 유효성분으로서 네비보롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 제3방출부를 제조하는 단계; 및
    (d) 상기 제1방출부, 제2방출부 및 제3방출부를 함께 다층정으로 타정하거나, 또는 과립, 펠릿 또는 미니정제로 제조한 후 경질캡슐에 충전하는 단계를 포함하는 약제학적 복합제제의 제조방법.
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