WO2021211012A1 - Crispr/cas system for detecting an antibiotic resistance gene - Google Patents

Crispr/cas system for detecting an antibiotic resistance gene Download PDF

Info

Publication number
WO2021211012A1
WO2021211012A1 PCT/RU2020/050305 RU2020050305W WO2021211012A1 WO 2021211012 A1 WO2021211012 A1 WO 2021211012A1 RU 2020050305 W RU2020050305 W RU 2020050305W WO 2021211012 A1 WO2021211012 A1 WO 2021211012A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
blavim
antibiotic resistance
pseudomonas aeruginosa
resistance gene
crispr
Prior art date
Application number
PCT/RU2020/050305
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Inventor
Василий Геннадьевич АКИМКИН
Александр Игоревич ТЮМЕНЦЕВ
Марина Алексеевна ТЮМЕНЦЕВА
Original Assignee
Федеральное Бюджетное Учреждение Науки "Центральный Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии" Федеральной Службы По Надзору В Сфере Защиты Прав Потребителей И Благополучия Человека
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное Бюджетное Учреждение Науки "Центральный Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии" Федеральной Службы По Надзору В Сфере Защиты Прав Потребителей И Благополучия Человека filed Critical Федеральное Бюджетное Учреждение Науки "Центральный Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии" Федеральной Службы По Надзору В Сфере Защиты Прав Потребителей И Благополучия Человека
Publication of WO2021211012A1 publication Critical patent/WO2021211012A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms

Definitions

  • the invention relates to the field of genetic engineering and biotechnology, namely to the number of means - guide RNAs that can be used in CRISPR-Casl2 systems as part of ribonucleoprotein complexes for the detection (detection, detection) of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 (metal-beta-lactamase class VIM-2) Pseudomonas aeruginosa.
  • blaVIM-2 metal-beta-lactamase class VIM-2
  • the invention allows in vitro detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
  • the guide RNAs described in this application can be used to detect the blaVIM-2 antibiotic resistance gene
  • Amplification in this case can be carried out in various ways, including polymerase chain reaction (PCR); loop isothermal amplification (LAMP); helicase-dependent amplification (HDA); recombinase-mediated amplification (RPA); strand displacement amplification (SDA); nucleic acid sequence based amplification (NASBA); transcription-mediated amplification (TMA); diving enzyme-mediated amplification (NEAR); circular amplification (RCA) and many other types of amplification.
  • PCR polymerase chain reaction
  • LAMP loop isothermal amplification
  • HDA helicase-dependent amplification
  • RPA recombinase-mediated amplification
  • SDA strand displacement amplification
  • NASBA nucleic acid sequence based amplification
  • TMA transcription-mediated amplification
  • NEAR diving enzyme-mediated amplification
  • RCA circular amplification
  • the guide RNAs described in this application can be used to develop highly sensitive and high-tech new generation diagnostic systems based on CRISPR technologies to combat the spread of antibiotic-resistant bacterial pathogens.
  • the proposed platform combines Casl2a nuclease, its guide RNA, HPV nucleic acid specific, and fluorescent reporter molecule.
  • DETECTR technology is used to detect a target DNA target after preliminary amplification (Chen JS, Ma E, Harrington LB, Da Costa M, Tian X, Palefsky JM, Doudna JA. CRISPR-Casl2a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018 Apr 27; 360 (6387): 436-439).
  • CRISPR / CAS system An equally important application of the CRISPR / CAS system is the identification of bacterial pathogens and the detection of specific bacterial genes. So, for example, using the SHERLOCK platform (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing - Specific
  • the proposed analysis only in the future can be applied to samples with a low concentration of DNA - the proposed method describes the analysis with samples containing about 10 8 copies of plasmid DNA carrying antibiotic resistance genes (60 yg DNA, plasmid DNA 67 kb in size). - 220 kb), which is its significant drawback. Also, the disadvantages of the described solution are the need to use expensive high-tech equipment (specialized nanofluid biochips, an inverted fluorescence microscope with a magnification of at least 100x), as well as the need for complex analysis of the data obtained using specialized software.
  • CRISPR / CAS based technology is a multifunctional, error resistant DNA detection technology suitable for rapid set-up diagnoses, including infectious diseases, genotyping of infectious agents and identification of genes for antibiotic resistance of bacterial pathogens.
  • the invention relates to new means - guide RNAs, which can be used in CRISPR-Casl2 systems for ultrasensitive detection, identification, detection or detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa in biological samples.
  • the technical objective of the proposed invention is the development of new means - guide RNAs that can be used in CRISPR-Casl2 systems with Casl2 proteins, for example, LbCpfl from Lachnospiraceae, for ultrasensitive detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
  • an unexpected technical result is achieved - the possibility of ultrasensitive detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa to single copies of DNA in one reaction.
  • the invention provides increasing the efficiency of detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa from 1-5x10 5 to 2-3x10 2 copies / ml.
  • RNA hairpin which is recognized by the RNA-directed DNA endonuclease LbCpfl from Lachnospiraceae, ensuring the detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
  • RNA-directed DNA endonuclease LbCpfl from Lachnospiraceae, obtained according to the method developed by the authors earlier (invention under RF patent N ° 2707542, priority date 03/28/2019, published 11/27/2019), to create ribonucleoprotein complexes (RPK) of the CRISPR / CAS, suitable for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa at ultra-low concentrations (single copies).
  • RPK ribonucleoprotein complexes
  • a CRISPR / CAS targeting RNA molecule has been proposed that can bind to target highly conserved regions of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa.
  • the nucleotide sequence of the guide RNA disclosed herein is selected from SEQ ID NO: 1-5.
  • the guide RNA molecule contains an RNA hairpin, which is recognized by the RNA guided DNA endonuclease LbCpfl from Lachno spiraceae.
  • the guide RNA molecule ensures the detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
  • the guide RNAs of the present invention correspond to highly conserved fragments of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene. Most preferred are guide RNAs recognized by the RNA-directed DNA endonuclease LbCpfl from Lachnospiraceae, characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
  • ribonucleoprotein complexes consisting of at least one guide RNA and RNA-guided DNA endonuclease of the CRISPR / CAS LbCpfl system from Lachnospiraceae, suitable for use for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa in ultra-low concentrations copies).
  • Ribonucleoprotein complex of the CRISPR / CAS system for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa formed from RNA-directed DNA endonuclease LbCpfl from Lachnospiraceae, and at least one guide RNA.
  • RPK The proposed ribonucleoprotein complex of the CRISPR / CAS system (hereinafter referred to as RPK) is suitable for detecting single copies of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa.
  • PKK preparations are solutions containing a guide RNA selected from SEQ ID NO: 1-5, combined with a CRISPR / CAS protein (LbCpfl from Lachnospiraceae) or freeze-dried PKK.
  • the resulting guide RNAs can be used as part of a kit for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, with instructions for use.
  • the kit for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 from Pseudomonas aeruginosa may contain a ribonucleoprotein complex and instructions for use.
  • At least one guide RNA in the kit can be complexed with a CRISPR / CAS protein (LbCpfl from Lachnospiraceae) in one container or separately in different containers.
  • a CRISPR / CAS protein LbCpfl from Lachnospiraceae
  • the kit may additionally include components for pre-amplifying highly conserved fragments of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene, including one or more specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7.
  • oligonucleotides for carrying out preliminary amplification of a fragment of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene correspond to the highly conserved region of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene.
  • Most preferred are oligonucleotides characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
  • a biological sample can be a sample of blood, serum or blood plasma, blood cells, saliva, sputum, lymphoid tissues, tissues of hematopoietic organs and other biological materials from a patient, which can be used to analyze for the presence of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
  • FIG. 1 Visualization of a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa from 37 to 447 and. O. (411 i.p.) after preliminary amplification using agarose gel electrophoresis, where numbers 1-8 indicate:
  • FIG. 2 Visualization of PCR products encoding guide RNAs specific to the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using agarose gel electrophoresis, where numbers 1-5 indicate:
  • M - molecular weight standards from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 base pairs (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, USA).
  • FIG. 3 Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 93 guide RNA and LbCpfl protein.
  • FIG. 4 Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2> 95 guide RNA and LbCpfl protein.
  • FIG. 5 Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 207 guide RNA and LbCpfl protein.
  • FIG. 6 Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 285 guide RNA and LbCpfl protein.
  • FIG. 7 Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing a guide RNA sgRNA blaVIM-2> 366 and LbCpfl protein.
  • FIG. 8 Endpoint fluorescence values (30 assay cycle, 30 minutes) for pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with ribonucleoportein complex containing guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 93, sgRNA blaVIM-2 N ° 95, sgRNA blaVIM-2 -2 JVb207, sgRNA blaVIM-2 JVb285 and sgRNA blaVIM-2 Zh366.
  • FIG. 9 Endpoint fluorescence values (30 assay cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples treated with ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 guide RNA N ° 93.
  • FIG. 10 Endpoint fluorescence values (30 analysis cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples treated with ribonucleoportein complex containing the blaVIM-2 sgRNA guide RNA> 95.
  • FIG. 11 Endpoint fluorescence values (30 assay cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples treated with ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 JVb207 guide RNA.
  • FIG. 12 Endpoint fluorescence values (30 analysis cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples treated with ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 * G ° 285 guide RNA.
  • FIG. 13 Endpoint fluorescence values (30 analysis cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples, treated with ribonucleoportein complex containing guide RNA sgRNA blaVIM-2 Zbb.
  • Example 1 Selection of target sequences in the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa to create guide RNAs.
  • To select target sequences in the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene to create guide RNAs modern algorithms for in silico analysis of nucleotide sequences and publicly available programs were used, including Benchling (https://www.benchling.com/molecularbiology /).
  • Benchling https://www.benchling.com/molecularbiology /.
  • a list of regions in the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa with a theoretically calculated probability of their cleavage in highly conserved regions was compiled (Table 1).
  • Table 1 List of regions in the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa with the theoretically calculated probability of their cleavage by LbCpfl from Lachnospiraceae.
  • the guide RNAs that specifically recognize the highly conserved antibiotic resistance site of blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa are represented by the unique sequences SEQ III NO: 1-5.
  • Example 2 Preparation of material for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa by the method of preliminary amplification.
  • Preparation of material for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa is carried out by the method of preliminary amplification.
  • a model matrix of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa of a biological sample plasmid DNA pGEM-T-blaVIM-2 containing a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa from 37 to 447 bp. (size 411 bp).
  • a PCR product encoding a fragment of the antibiotic resistance blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides For blaVIM-2 and Rev blaVIM-2 (GenTerra, Russia) ...
  • the size of the amplified blaVIM-2 fragment is 411 base pairs.
  • the obtained fragments of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa are visualized using agarose gel electrophoresis (Fig. 1).
  • the material prepared by the described method is used for experiments on the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes LbCpfl from Lachnospiraceae containing guide RNA sgRNA blaVIM-2 * G ° 93, sgRNA blaVIM-2 blaVIM-2 AN 5, sgRNA blaVIM-2 JVb285 and sgRNA blaVIM-2 JV “366, without preliminary purification.
  • Example 3 Obtaining guide RNAs and creation of ribonucleoprotein complexes for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
  • the PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 93 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7rg and sgRNA-93-Rev (GenTerra, Russia) ...
  • the size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 93 is 62 bp.
  • the PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 95 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7rg and sgRNA-95-Rev (GenTerra, Russia) ...
  • the size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 95 is 62 bp.
  • the PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 207 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7rg and sgRNA-207-Rev (GenTerra, Russia) ...
  • the size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 207 is 62 base pairs.
  • the PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 285 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7rg and sgRNA-285-Rev (GenTerra, Russia) ...
  • the size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 285 is 62 base pairs.
  • the PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 366 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7rg and sgRNA-366-Rev (GenTerra, Russia) ...
  • the size the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 366 is 62 base pairs.
  • Amplification temperature profile for obtaining PCR products encoding guide RNAs :
  • PCR products encoding guide RNAs specific to a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa were visualized by agarose gel electrophoresis (Fig. 2).
  • Pseudomonas aeruginosa is carried out using a commercially available ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, USA) according to the manufacturer's instructions. Purified PCR products encoding guide RNAs specific to the blaVIM-2 antibiotic resistance gene fragment
  • Pseudomonas aeruginosa is used as a template for the synthesis of guide RNAs.
  • the synthesis of guide RNAs specific to a fragment of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa is carried out by in vitro transcription using commercially available reagent kits (HiScribe TM T7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the products of the in vitro transcription reaction are reprecipitated from the reaction mixture by adding sodium chloride to a final concentration of 400 tM and an equal volume of isopropyl alcohol.
  • Such modifications of the manufacturer's protocol, introduced by the authors, allow increasing the yield of the reaction product and obtaining the desired concentration of the final guide RNA preparation.
  • the guide RNA preparation (250 ng) is heated at 90 ° C for 5 minutes and allowed to cool slowly to room temperature (incubation at room temperature for at least 10 minutes). This heating is necessary for the formation of the correct conformation of the hairpin contained in the guide RNA. Many manufacturers of commercial CAS protein preparations skip this step when preparing the ribonucleoprotein complex.
  • ribonucleoprotein complex 250 ng of the LbCpfl CAS protein from Lachnospiraceae and the prepared guide RNA are mixed and incubated for 15 minutes at room temperature.
  • the ribonucleoprotein complex obtained in this way is ready for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
  • Example 4 Detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS using a model matrix as an example.
  • the pre-amplified material obtained by the method described in Example 2 is used as a template for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS obtained by the method described in Example 3.
  • reaction mixture is prepared containing the following components:
  • reaction mixtures containing all the necessary components are placed in a DTPrime 5 thermocycler (DNA-Technology, Russia) and the following reaction parameters are set:
  • CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes are capable of detecting single copies of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa.
  • Typical analysis results are shown using real-time fluorescence profiles for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with ribonucleoportein complexes containing guide RNAs sgRNA blaVIM-2 JVb93, sgRNA blaVIM-2 JVb95, sg7-2 sgRNA blRNA blaVIM-2 J ⁇ ° 285 and sgRNA blaVIM-2 366 and LbCpfl protein, in FIG.
  • ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS formed on the basis of LbCpfl from Lachnospiraceae and guide RNAs, reveal single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa with different efficiencies, and they can be arranged in the following order of decreasing activity: sgRNA blaVIM 207> sgRNA blaVIM-2 N ° 93> sgRNA blaVIM-2 F 66> sgRNA blaVIM-2 L ° 285> sgRNA blaVIM-2> 95 (Fig. 8).
  • Example 5 Detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS on a limited panel of clinical samples.
  • the developed guide RNAs were tested on a limited panel of clinical samples (10 pcs.) Containing
  • PCR products encoding a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa are obtained in an amplification reaction using PCR-mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) as described in Example 2, using the described temperature profile and duration of the amplification reaction.
  • the material obtained in this way is used as a template for the detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS obtained by the method described in Example 3. Detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-
  • CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes are capable of detecting single copies (1.5 copies / reaction) of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa in DNA preparations isolated from clinical samples.
  • the signal value exceeded the value of "noise” (nonspecific fluorescence of the control sample containing no target) by three times, and by the 5-26 cycle (5-26 minutes) of the analysis - more than 5 times (wide range and difference in cycles are due to differences in guide RNAs used in the analysis, Table 5).
  • Typical assay results are exemplified by fluorescence endpoint values (30 assay cycles, 30 minutes) for pre-amplified blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa targets (10 independent clinical samples) treated with ribonucleoportein complexes containing guide RNA sgRNA blaVIM-2 JVb93, sgRNA blaVIM-2 JVb95, sgRNA blaVIM-2 JVb207, sgRNA blaVIM-2 JVT2285 and sgRNA blaVIM-2 K2Cp66, and protein Lb. 9, Fig. 10, Fig. 11, Fig. 12 and FIG. 13 respectively.
  • the efficiency of detecting single copies of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene contained in DNA preparations isolated from clinical samples using various guide RNAs in the CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes formed on the basis of LbCpfl from Lachnospiraceae can be presented in the following descending order : sgRNA blaVIM-2 207> sgRNA blaVIM-2 93> sgRNA blaVIM-2 J ⁇ ° 285> sgRNA blaVIM-2 K2Z66> sgRNA blaVIM-2 95 (Table 5).
  • the developed guide RNAs allow ultrasensitive detection of single copies of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa in clinical samples after preliminary amplification in the CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes.

Abstract

The invention relates to the field of genetic engineering and biotechnology, and more particularly to guide RNAs and ribonucleoprotein complexes of a CRISPR/Cas system which contain said guide RNAs, and to sets containing said ribonucleoprotein complexes of the CRISPR/Cas system and specific oligonucleotides for the preliminary amplification of a highly conserved region of the Pseudomonas aeruginosa antibiotic resistance gene blaVIM-2. The invention makes it possible to efficiently detect the Pseudomonas aeruginosa antibiotic resistance gene blaVIM-2 following specific amplification of a fragment of said gene. Guide RNAs are represented by the sequences SEQ ID NO: 1-5, and specific preliminary amplification oligonucleotides are represented by the sequences SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7. The invention makes it possible to detect single copies of the Pseudomonas aeruginosa antibiotic resistance gene blaVIM-2.

Description

СИСТЕМА CRISPR-CAS ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ Область техники CRISPR-CAS SYSTEM FOR ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE DETECTION Technical Field
Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к числу средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Casl2 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета-лактамаза класс В VIM-2) Pseudomonas aeruginosa. The invention relates to the field of genetic engineering and biotechnology, namely to the number of means - guide RNAs that can be used in CRISPR-Casl2 systems as part of ribonucleoprotein complexes for the detection (detection, detection) of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 (metal-beta-lactamase class VIM-2) Pseudomonas aeruginosa.
Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. The invention allows in vitro detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2The guide RNAs described in this application can be used to detect the blaVIM-2 antibiotic resistance gene
Pseudomonas aeruginosa после проведения специфической амплификации фрагмента ДНК гена blaVIM-2. Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации. Pseudomonas aeruginosa after specific amplification of the blaVIM-2 gene DNA fragment. Amplification in this case can be carried out in various ways, including polymerase chain reaction (PCR); loop isothermal amplification (LAMP); helicase-dependent amplification (HDA); recombinase-mediated amplification (RPA); strand displacement amplification (SDA); nucleic acid sequence based amplification (NASBA); transcription-mediated amplification (TMA); diving enzyme-mediated amplification (NEAR); circular amplification (RCA) and many other types of amplification.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для борьбы с распространением антибиотикоустойчивых бактериальных патогенов. Предшествующий уровень техники The guide RNAs described in this application can be used to develop highly sensitive and high-tech new generation diagnostic systems based on CRISPR technologies to combat the spread of antibiotic-resistant bacterial pathogens. Prior art
Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR/CAS. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR/CAS системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования. To solve epidemiological tasks for decoding outbreaks of infectious diseases, identifying and identifying the pathogen, as well as detection of specific bacterial genes requires the development and implementation of modern technologies of molecular epidemiology into the practice of supervisory and monitoring services. One of these technologies is the use of CRISPR / CAS genetic editing elements. This technology is developing quite effectively in relation to the creation of drugs for the treatment of certain diseases, despite a number of difficulties associated with the occurrence of unforeseen mutations. With in-depth studies in the field of application of the CRISPR / CAS system, it was found that it can be used for delicate diagnostic procedures in identifying the causative agent / s of infection in humans, as well as their genotyping.
В 2018 году было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Casl2 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную, а также двухцепочечную ДНК. Такое свойство Casl2 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter - ДНК- нацеленная эндонуклеаза CRISPR транс репортер). Впервые DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека (HPV). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Casl2a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте HPV, флуоресцентную репортерную молекулу. Технология DETECTR используется для обнаружения целевой ДНК-мишени после предварительной амплификации (Chen JS, Ма Е, Harrington LB, Da Costa M, Tian X, Palefsky JM, Doudna JA. CRISPR-Casl2a target binding unleashes indiscriminate single- stranded DNase activity. Science. 2018 Apr 27;360(6387):436-439). In 2018, it was shown that one of the enzymes of the CRISPR system, Casl2, after recognizing its target DNA target, begins to hydrolyze nonspecifically single-stranded as well as double-stranded DNA. This property of Casl2 can be used as an indicator of the presence of a specific target, for example, the genome of a virus or bacteria. The researchers used this discovery to create a technological platform for the detection of nucleic acids known as DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter). For the first time, DETECTR was used for the detection and genotyping of the human papillomavirus (HPV). The proposed platform combines Casl2a nuclease, its guide RNA, HPV nucleic acid specific, and fluorescent reporter molecule. DETECTR technology is used to detect a target DNA target after preliminary amplification (Chen JS, Ma E, Harrington LB, Da Costa M, Tian X, Palefsky JM, Doudna JA. CRISPR-Casl2a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018 Apr 27; 360 (6387): 436-439).
He менее важным приложением системы CRISPR/CAS является идентификация бактериальных патогенов и детекция специфических бактериальных генов. Так, например, с помощью платформы SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing - СпецифичноеAn equally important application of the CRISPR / CAS system is the identification of bacterial pathogens and the detection of specific bacterial genes. So, for example, using the SHERLOCK platform (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing - Specific
Высокочувствительное Ферментативное Репортерное Разблокирование) удалось корректно генотипировать ряд штаммов Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa при низкой перекрестной реактивности. Кроме того, платформа SHERLOCK использована для дифференциации клинических изолятов Klebsiella pneumoniae с двумя различными генами антибиотикоустойчивости, что открывает значительные перспективы к созданию мультиплексных систем для одновременной идентификации бактериальных патогенов и выявления у них генов антибиотикоустойчивости. High Sensitivity Enzymatic Reporter Unlock) a number of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa strains were correctly genotyped with low cross-reactivity. In addition, the SHERLOCK platform has been used to differentiate clinical isolates of Klebsiella pneumoniae with two different antibiotic resistance genes, which opens up significant prospects for the creation of multiplex systems for the simultaneous identification of bacterial pathogens and detection of antibiotic resistance genes in them.
В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления генов антибиотикоустойчивости у бактериальных патогенов, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR/CAS. In this regard, it is extremely urgent to develop new effective methods for detecting antibiotic resistance genes in bacterial pathogens based on genetic technologies such as CRISPR / CAS.
В ходе изучения уровня техники приняты во внимание научные статьи, описывающие разработку и получение направляющих РНК для выявления генов антибиотикоустойчивости у бактериальных патогенов с помощью технологии CRISPR/CAS (Muller, V., Rajer, F., Frykholm, К., Nyberg, L.K., Quaderi, S., Fritzsche, J., Kristiansson, E., Ambjornsson, T., Sandegren, L., Westerlund, F., 2016. Direct identification of antibiotic resistance genes on single plasmid molecules using CRISPR/Cas9 in combination with optical DNA mapping. Sci. Rep. 6. https://doi.org/10.1038/srep37938; Quan, J., Langelier, C., Kuchta, A., Batson, J., Teyssier, N., Lyden, A., Caldera, S., McGeever, A., Dimitrov, B., King, R., Wilheim, J., Murphy, M., Ares, L.P., Travisano, K.A., Sit, R., Amato, R., Mumbengegwi, D.R., Smith, J.L., Bennett, A., Gosling, R., Mourani, P.M., Calfee, C.S., Neff, N.F., Chow, E.D., Kim, P.S., Greenhouse, B., DeRisi, J.L., Crawford, E.D., 2019. FLASH: a next-generation CRISPR diagnostic for multiplexed detection of antimicrobial resistance sequences. Nucleic Acids Res. 47, e83. https://doi.org/10.1093/nar/gkz418). During the study of the prior art, scientific articles were taken into account describing the development and production of guide RNAs for the detection of antibiotic resistance genes in bacterial pathogens using CRISPR / CAS technology (Muller, V., Rajer, F., Frykholm, K., Nyberg, LK, Quaderi, S., Fritzsche, J., Kristiansson, E., Ambjornsson, T., Sandegren, L., Westerlund, F., 2016. Direct identification of antibiotic resistance genes on single plasmid molecules using CRISPR / Cas9 in combination with optical DNA mapping Sci Rep 6 https://doi.org/10.1038/srep37938; Quan, J., Langelier, C., Kuchta, A., Batson, J., Teyssier, N., Lyden, A. , Caldera, S., McGeever, A., Dimitrov, B., King, R., Wilheim, J., Murphy, M., Ares, LP, Travisano, KA, Sit, R., Amato, R., Mumbengegwi , DR, Smith, JL, Bennett, A., Gosling, R., Mourani, PM, Calfee, CS, Neff, NF, Chow, ED, Kim, PS, Greenhouse, B., DeRisi, JL, Crawford, ED, 2019. FLASH: a next-generation CRISPR diagnostic for multiplexed detecti on of antimicrobial resistance sequences. Nucleic Acids Res. 47, e83. https://doi.org/10.1093/nar/gkz418).
Ближайшим аналогом изобретения является решение, опубликованное в статье https://doi.org/10.1038/srep37938 (Muller, V., Rajer, F., Frykholm, К., Nyberg, L.K., Quaderi, S., Fritzsche, J., Kristiansson, E., Ambjornsson, T., Sandegren, L., Westerlund, F., 2016. Direct identification of antibiotic resistance genes on single plasmid molecules using CRISPR/Cas9 in combination with optical DNA mapping. Sci. Rep. 6. https://doi.org/10.1038/srep37938), представляющее собой анализ, основанный на оптическом картировании ДНК отдельных плазмид, несущих гены антибиотикоустойчивости, бактериальных изолятов в наножидкостных каналах, который предоставляет подробную информацию об этих плазмидах, в том числе о наличии/отсутствии в них генов антибиотикоустойчивости. Описанный анализ позволяет идентифицировать гены антибиотикоустойчивости с использованием CRISPR/CAS9 и направляющих РНК, специфических к генам антибиотикоустойчивости (ЫаСТХ-М группа 1, ЫаСТХ-М группа 9, blaNDM и ЫаКРС). В ходе анализа рибонуклеопротеиновый комплекс CRISPR/CAS9 линеаризует кольцевые плазмиды в районе гена антибиотикоустойчивости, полученные линейные молекулы ДНК идентифицируется с помощью оптического картирования ДНК. The closest analogue of the invention is the solution published in the article https://doi.org/10.1038/srep37938 (Muller, V., Rajer, F., Frykholm, K., Nyberg, LK, Quaderi, S., Fritzsche, J., Kristiansson, E., Ambjornsson, T., Sandegren, L., Westerlund, F., 2016. Direct identification of antibiotic resistance genes on single plasmid molecules using CRISPR / Cas9 in combination with optical DNA mapping. Sci. Rep. 6. https : //doi.org/10.1038/srep37938), which is an analysis based on optical mapping of the DNA of individual plasmids carrying antibiotic resistance genes, bacterial isolates in nanofluid channels, which provides detailed information about these plasmids, including the presence / absence of antibiotic resistance genes in them. The described analysis makes it possible to identify antibiotic resistance genes using CRISPR / CAS9 and guide RNAs specific to antibiotic resistance genes (NaCTX-M group 1, NaCTX-M group 9, blaNDM and NaKRS). During the analysis, the CRISPR / CAS9 ribonucleoprotein complex linearizes circular plasmids in the region of the antibiotic resistance gene, the resulting linear DNA molecules are identified using optical DNA mapping.
Предложенный анализ только в перспективе сможет быть применен к образцам с низкой концентрацией ДНК - предложенный способ, описывает проведение анализа с образцами, содержащими около 108 копий плазмидных ДНК, несущих гены антибиотикоустойчивости (60 иг ДНК, плазмидной ДНК размером 67 т.п.н. - 220 т.п.н.), что является его существенным недостатком. Также недостатками описанного решения является необходимость использования дорогостоящего высокотехнологичного оборудования (специализированные нанофлюидные биочипы, инвертированный флуоресцентный микроскоп с увеличением не менее 100х), а также необходимость проведения сложного анализа полученных данных с применением специализированного программного обеспечения. The proposed analysis only in the future can be applied to samples with a low concentration of DNA - the proposed method describes the analysis with samples containing about 10 8 copies of plasmid DNA carrying antibiotic resistance genes (60 yg DNA, plasmid DNA 67 kb in size). - 220 kb), which is its significant drawback. Also, the disadvantages of the described solution are the need to use expensive high-tech equipment (specialized nanofluid biochips, an inverted fluorescence microscope with a magnification of at least 100x), as well as the need for complex analysis of the data obtained using specialized software.
Исходя из этого, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости разработки и получения направляющих РНК для выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета- лактамаза класс В VIM-2) Pseudomonas aeruginosa in vitro. Based on this, a technical problem arises, consisting in the need to develop and obtain guide RNAs for the detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 (metallo-beta-lactamase class B VIM-2) of Pseudomonas aeruginosa in vitro.
Раскрытие изобретения Disclosure of invention
Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология, основанная на CRISPR/CAS, является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, генотипирование инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости бактериальных патогенов. The proposed technology is promising for a variety of applications, including quantitative determination of DNA / RNA, rapid multiplex expression detection, and other types of sensitive detection, for example, detection of contamination of samples with nucleic acids. CRISPR / CAS based technology is a multifunctional, error resistant DNA detection technology suitable for rapid set-up diagnoses, including infectious diseases, genotyping of infectious agents and identification of genes for antibiotic resistance of bacterial pathogens.
Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами: The use of the proposed technology makes it possible to create a new generation of diagnostic systems that will have the following properties:
- высокая чувствительность; - high sensitivity;
- возможность проведения диагностики у постели больного; - the possibility of diagnostics at the patient's bedside;
- возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования; - the ability to conduct diagnostics in the field without the use of specialized high-tech equipment;
- скорость и простота анализа; - speed and ease of analysis;
- сниженная стоимость анализа; - reduced cost of analysis;
- отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием; отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя. - no need to equip the diagnostic laboratory with expensive equipment; no need for isolation of nucleic acids of the pathogen.
Изобретение относится к новым средствам - направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Casl2 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в биологических образцах. The invention relates to new means - guide RNAs, which can be used in CRISPR-Casl2 systems for ultrasensitive detection, identification, detection or detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa in biological samples.
Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Casl2 с белками Casl2, например, LbCpfl из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. The technical objective of the proposed invention is the development of new means - guide RNAs that can be used in CRISPR-Casl2 systems with Casl2 proteins, for example, LbCpfl from Lachnospiraceae, for ultrasensitive detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат - возможность ультрачувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa до единичных копий ДНК в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM- 2 Pseudomonas aeruginosa с 1-5x105 до 2-3x102 копий/мл. When implementing the present invention, according to the set of essential features given in the claims, an unexpected technical result is achieved - the possibility of ultrasensitive detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa to single copies of DNA in one reaction. The invention provides increasing the efficiency of detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa from 1-5x10 5 to 2-3x10 2 copies / ml.
Технический результат достигается за счет: The technical result is achieved due to:
- разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Casl2 для ультрачувств ительного выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQ Ш NO: 1-5, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК- эндонуклеазой LbCpfl из Lachnospiraceae, с обеспечением выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. - development of guide RNA molecules that can be used in CRISPR-Casl2 systems for ultrasensitive detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa, where these guide RNAs are selected from SEQ III NO: 1-5 sequences, are able to bind to target highly conserved gene regions antibiotic resistance blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, contain an RNA hairpin, which is recognized by the RNA-directed DNA endonuclease LbCpfl from Lachnospiraceae, ensuring the detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
- применения РНК-направляемой ДНК -эндонуклеазы LbCpfl из Lachnospiraceae, полученной согласно способу, разработанному авторами ранее (изобретение по патент РФ N° 2707542, дата приоритета 28.03.2019, опубликовано 27.11.2019), для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РПК) системы CRISPR/CAS, пригодных для детекции гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях (единичные копии). - the use of RNA-directed DNA endonuclease LbCpfl from Lachnospiraceae, obtained according to the method developed by the authors earlier (invention under RF patent N ° 2707542, priority date 03/28/2019, published 11/27/2019), to create ribonucleoprotein complexes (RPK) of the CRISPR / CAS, suitable for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa at ultra-low concentrations (single copies).
- разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ Ш NO: 6 и SEQ Ш NO: 7, для предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. - development of a set of specific oligonucleotides selected from SEQ III NO: 6 and SEQ III NO: 7 for preliminary amplification of a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
- оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. - optimization of conditions for preliminary amplification of a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
- определения условий проведения ультрачувствительной детекции гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa и установления последовательности стадий метода. Предложена молекула направляющей РНК системы CRISPR/CAS, которая способна связываться с целевыми высоко консервативными участками гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Нуклеотидная последовательность раскрытой в настоящей заявке направляющей РНК выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 1-5. - determining the conditions for ultrasensitive detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa and establishing the sequence of the method steps. A CRISPR / CAS targeting RNA molecule has been proposed that can bind to target highly conserved regions of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa. The nucleotide sequence of the guide RNA disclosed herein is selected from SEQ ID NO: 1-5.
Молекула направляющей РНК содержит в своем составе РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК -эндонуклеазой LbCpfl из Lachno spiraceae . The guide RNA molecule contains an RNA hairpin, which is recognized by the RNA guided DNA endonuclease LbCpfl from Lachno spiraceae.
Молекула направляющей РНК обеспечивает выявление единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. The guide RNA molecule ensures the detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
Направляющие РНК согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативным фрагментам гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК -эндонуклеазой LbCpfl из Lachnospiraceae, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из: The guide RNAs of the present invention correspond to highly conserved fragments of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene. Most preferred are guide RNAs recognized by the RNA-directed DNA endonuclease LbCpfl from Lachnospiraceae, characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
- SEQ Ш NO: 1; - SEQ W NO: 1;
- SEQ Ш NO: 2; - SEQ W NO: 2;
- SEQ Ш NO: 3; - SEQ W NO: 3;
- SEQ Ш NO: 4; - SEQ W NO: 4;
- SEQ Ш NO: 5; - SEQ W NO: 5;
- или идентичной любой из них по меньшей мере на 80% - 99, 99%,- or identical to any of them at least 80% - 99, 99%,
- или комплементарной любой из них, - or complementary to any of them,
- или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях. - or hybridizing with any of them under stringent conditions.
Согласно предложенному изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и РНК-направляемой ДНК -эндонуклеазы системы CRISPR/CAS LbCpfl из Lachnospiraceae, пригодные для использования для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях (единичные копии). According to the proposed invention, ribonucleoprotein complexes (RPK) are obtained, consisting of at least one guide RNA and RNA-guided DNA endonuclease of the CRISPR / CAS LbCpfl system from Lachnospiraceae, suitable for use for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa in ultra-low concentrations copies).
Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/CAS для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpfl из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК. Ribonucleoprotein complex of the CRISPR / CAS system for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, formed from RNA-directed DNA endonuclease LbCpfl from Lachnospiraceae, and at least one guide RNA.
Предложенный рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/CAS (далее - РПК) пригоден для выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. The proposed ribonucleoprotein complex of the CRISPR / CAS system (hereinafter referred to as RPK) is suitable for detecting single copies of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa.
Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1-5, объединенную с белком системы CRISPR/CAS (LbCpfl из Lachnospiraceae) или лиофильно высушенные РПК. PKK preparations are solutions containing a guide RNA selected from SEQ ID NO: 1-5, combined with a CRISPR / CAS protein (LbCpfl from Lachnospiraceae) or freeze-dried PKK.
Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, с инструкцией по применению. The resulting guide RNAs can be used as part of a kit for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, with instructions for use.
Набор для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, может содержать рибонуклеопротеиновый комплекс и инструкцию по применению. The kit for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 from Pseudomonas aeruginosa may contain a ribonucleoprotein complex and instructions for use.
При этом, по меньшей мере, одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR/CAS (LbCpfl из Lachnospiraceae) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах. In this case, at least one guide RNA in the kit can be complexed with a CRISPR / CAS protein (LbCpfl from Lachnospiraceae) in one container or separately in different containers.
Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высоко консервативных фрагментов гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7. The kit may additionally include components for pre-amplifying highly conserved fragments of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene, including one or more specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7.
Специфические олигонуклеотиды для проведения предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативному участку гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из: Specific oligonucleotides for carrying out preliminary amplification of a fragment of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene according to the present invention correspond to the highly conserved region of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene. Most preferred are oligonucleotides characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
- SEQ Ш NO: 6; - SEQ W NO: 6;
- SEQ Ш NO: 7; - SEQ W NO: 7;
- или идентичной любой из них по меньшей мере на 80% - 99,99%, - или комплементарной любой из них, - or identical to any of them by at least 80% - 99.99%, - or complementary to any of them,
- или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях. - or hybridizing with any of them under stringent conditions.
Предложенная технология позволяет определить единичные копии гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих Pseudomonas aeruginosa. Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. The proposed technology makes it possible to determine single copies of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene in biological samples of a patient, selected from fluid and / or tissue, presumably containing Pseudomonas aeruginosa. A biological sample can be a sample of blood, serum or blood plasma, blood cells, saliva, sputum, lymphoid tissues, tissues of hematopoietic organs and other biological materials from a patient, which can be used to analyze for the presence of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
Краткое описание чертежей Brief Description of Drawings
Фиг. 1. Визуализация фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 и. о. (размером 411 и. о.) после предварительной амплификации при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены: FIG. 1. Visualization of a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa from 37 to 447 and. O. (411 i.p.) after preliminary amplification using agarose gel electrophoresis, where numbers 1-8 indicate:
1 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 1 иг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2; 1 - PCR product blaVIM-2, obtained during amplification of 1 needle of the pGEM-T-blaVIM-2 model template;
2 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,1 иг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2; 2 - PCR product blaVIM-2, obtained during the amplification of 0.1 ig of the model template pGEM-T-blaVIM-2;
3 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,01 иг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2; 3 - PCR product blaVIM-2, obtained during the amplification of 0.01 ygs of the model matrix pGEM-T-blaVIM-2;
4 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,001 иг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2; 4 - PCR product blaVIM-2, obtained during the amplification of 0.001 Iig of the model template pGEM-T-blaVIM-2;
5 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,0001 иг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2; 5 - PCR product blaVIM-2, obtained during the amplification of 0.0001 Iig of model matrix pGEM-T-blaVIM-2;
6 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,00001 иг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2; 6 - PCR product blaVIM-2, obtained during the amplification of 0.00001 Iig of model matrix pGEM-T-blaVIM-2;
7 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM- T-blaVIM-2; 7 - negative control that does not contain the pGEM-T-blaVIM-2 model matrix;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США). Фиг. 2. Визуализация ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к гену антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-5 обозначены: M - molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 base pairs (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, USA). FIG. 2. Visualization of PCR products encoding guide RNAs specific to the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using agarose gel electrophoresis, where numbers 1-5 indicate:
1 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 N°93; 1 - PCR product encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 93;
2 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 N°95; 2 - PCR product encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 95;
3 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 N°207; 3 - PCR product encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 207;
4 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 N°285; 4 - PCR product encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 285;
5 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 N°366; 5 - PCR product encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 366;
M - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США). M - molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 base pairs (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, USA).
Фиг. 3. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 93 и белок LbCpfl. FIG. 3. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 93 guide RNA and LbCpfl protein.
Фиг. 4. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 >95 и белок LbCpfl. FIG. 4. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2> 95 guide RNA and LbCpfl protein.
Фиг. 5. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 207 и белок LbCpfl. FIG. 5. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 207 guide RNA and LbCpfl protein.
Фиг. 6. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 285 и белок LbCpfl. FIG. 6. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 285 guide RNA and LbCpfl protein.
Фиг. 7. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 >366 и белок LbCpfl. FIG. 7. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing a guide RNA sgRNA blaVIM-2> 366 and LbCpfl protein.
Фиг. 8. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 N°93, sgRNA blaVIM-2 N°95, sgRNA blaVIM-2 JVb207, sgRNA blaVIM-2 JVb285 и sgRNA blaVIM-2 Ж366. FIG. 8. Endpoint fluorescence values (30 assay cycle, 30 minutes) for pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with ribonucleoportein complex containing guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 93, sgRNA blaVIM-2 N ° 95, sgRNA blaVIM-2 -2 JVb207, sgRNA blaVIM-2 JVb285 and sgRNA blaVIM-2 Zh366.
Фиг. 9. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 N°93. FIG. 9. Endpoint fluorescence values (30 assay cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples treated with ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 guide RNA N ° 93.
Фиг. 10. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 >95. FIG. 10. Endpoint fluorescence values (30 analysis cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples treated with ribonucleoportein complex containing the blaVIM-2 sgRNA guide RNA> 95.
Фиг. 11. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 JVb207. FIG. 11. Endpoint fluorescence values (30 assay cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples treated with ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 JVb207 guide RNA.
Фиг. 12. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 *G°285. FIG. 12. Endpoint fluorescence values (30 analysis cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples treated with ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 * G ° 285 guide RNA.
Фиг. 13. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 Збб. Варианты осуществления изобретения FIG. 13. Endpoint fluorescence values (30 analysis cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples, treated with ribonucleoportein complex containing guide RNA sgRNA blaVIM-2 Zbb. Embodiments of the invention
Пример 1. Подбор последовательностей-мишеней в гене антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa для создания направляющих РНК. Для подбора последовательностей-мишеней в гене антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.benchling.com/molecular- biology/). Был составлен перечень участков в гене антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках (Таблица 1). Example 1. Selection of target sequences in the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa to create guide RNAs. To select target sequences in the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene to create guide RNAs, modern algorithms for in silico analysis of nucleotide sequences and publicly available programs were used, including Benchling (https://www.benchling.com/molecularbiology /). A list of regions in the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa with a theoretically calculated probability of their cleavage in highly conserved regions was compiled (Table 1).
Таблица 1. Перечень участков в гене антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления LbCpfl из Lachnospiraceae.
Figure imgf000014_0001
Table 1. List of regions in the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa with the theoretically calculated probability of their cleavage by LbCpfl from Lachnospiraceae.
Figure imgf000014_0001
Направляющие РНК, специфически узнающие высоко консервативный участок антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, представлены уникальными последовательностями SEQ Ш NO: 1-5. The guide RNAs that specifically recognize the highly conserved antibiotic resistance site of blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa are represented by the unique sequences SEQ III NO: 1-5.
Пример 2. Подготовка материала для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa методом предварительной амплификации. Example 2. Preparation of material for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa by the method of preliminary amplification.
Подготовку материала для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa проводят методом предварительной амплификации. В качестве модельной матрицы гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa биологического образца используют плазмидную ДНК pGEM-T-blaVIM-2, содержащую в своем составе фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 п.о. (размером 411 п.о.). Preparation of material for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa is carried out by the method of preliminary amplification. As a model matrix of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa of a biological sample, plasmid DNA pGEM-T-blaVIM-2 containing a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa from 37 to 447 bp. (size 411 bp).
Предварительную амплификацию участка, соответствующего фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 и. о., проводят с использованием специфических олигонуклеотидов с SEQ Ш NO: 6-7, приведенных в Таблице 2. Preliminary amplification of the region corresponding to the fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa from 37 to 447 and. so, carried out using specific oligonucleotides with SEQ III NO: 6-7, shown in Table 2.
Таблица 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.
Figure imgf000015_0001
Table 2. Specific oligonucleotides for preliminary amplification of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene fragment.
Figure imgf000015_0001
ПЦР-продукт, кодирующий фрагмент антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов For blaVIM-2 и Rev blaVIM-2 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента blaVIM-2 составляет 411 пар нуклеотидов. A PCR product encoding a fragment of the antibiotic resistance blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides For blaVIM-2 and Rev blaVIM-2 (GenTerra, Russia) ... The size of the amplified blaVIM-2 fragment is 411 base pairs.
Температурный профиль амплификации для получения ПНР -продукта, фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 п.о.: 1. денатурация: 95°С в течение 3 минут; Temperature profile of amplification for obtaining the PNR -product, a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa from 37 to 447 bp: 1. denaturation: 95 ° C for 3 minutes;
2. 40 циклов амплификации: 2.40 amplification cycles:
95°С - 15 сек, 95 ° С - 15 sec,
55°С - 45 сек, 55 ° С - 45 sec,
72°С - 30 сек; 3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут. 72 ° С - 30 sec; 3. final elongation: 72 ° C for 5 minutes.
В ходе подготовки материала для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa методом предварительной амплификации проводят титрование модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2 путем приготовления серийных разведений (Таблица 3). During the preparation of material for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa by the method of preliminary amplification, titration of the model matrix pGEM-T-blaVIM-2 is carried out by preparing serial dilutions (Table 3).
Таблица 3. Серийные разведения образцов модельной матрицы, содержащей ген антибиотикоустойчивости blaVIM-2, и клинических образцов.
Figure imgf000016_0001
Table 3. Serial dilutions of the model matrix samples containing the blaVIM-2 antibiotic resistance gene and clinical samples.
Figure imgf000016_0001
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные фрагменты гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 1). To assess the efficiency of preliminary amplification, the obtained fragments of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa are visualized using agarose gel electrophoresis (Fig. 1).
Подготовленный описанным способом материал используют для экспериментов по выявлению гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpfl из Lachnospiraceae, содержащих направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 *Г°93, sgRNA blaVIM-2 AN 5, sgRNA blaVIM-2 JVb207, sgRNA blaVIM-2 JVb285 и sgRNA blaVIM-2 JV«366, без предварительной очистки. The material prepared by the described method is used for experiments on the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes LbCpfl from Lachnospiraceae containing guide RNA sgRNA blaVIM-2 * G ° 93, sgRNA blaVIM-2 blaVIM-2 AN 5, sgRNA blaVIM-2 JVb285 and sgRNA blaVIM-2 JV “366, without preliminary purification.
Пример 3. Получение направляющих РНК и создание рибонуклеопротеиновых комплексов для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Example 3. Obtaining guide RNAs and creation of ribonucleoprotein complexes for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
Для получения направляющих РНК для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa разработан набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 4. To obtain guide RNAs for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa, a set of specific oligonucleotides was developed, shown in Table 4.
Таблица 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ПЦР- продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к гену антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.
Figure imgf000017_0001
Table 4. Specific oligonucleotides for obtaining a PCR product encoding guide RNAs specific to the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
Figure imgf000017_0001
Получение направляющих РНК проводят в несколько этапов: The production of guide RNAs is carried out in several stages:
1. получение ПЦР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (табл. 4), кодирующего направляющую РНК, способную связываться с целевым высоко консервативным участком гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpfl из Lachnospiraceae; 1. Obtaining a PCR product using a set of specific oligonucleotides (Table 4) encoding a guide RNA capable of binding to the target highly conserved region of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene, containing an RNA hairpin that is recognized by RNA-directed DNA endonuclease LbCpfl from Lachnospiraceae;
2. очистка ПЦР-продукта, кодирующего направляющую РНК, специфичную к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa; 3. синтез направляющей РНК, специфичной к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa; 2. purification of the PCR product encoding a guide RNA specific to a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa; 3. synthesis of a guide RNA specific to a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa;
4. очистка направляющей РНК, специфичной к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. 4. Purification of guide RNA specific to a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 N°93, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и sgRNA-93-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 N°93, составляет 62 пары нуклеотидов. The PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 93 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7rg and sgRNA-93-Rev (GenTerra, Russia) ... The size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 93 is 62 bp.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 N°95, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и sgRNA-95-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 N°95, составляет 62 пары нуклеотидов. The PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 95 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7rg and sgRNA-95-Rev (GenTerra, Russia) ... The size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 95 is 62 bp.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 N°207, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и sgRNA-207-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 N°207, составляет 62 пары нуклеотидов. The PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 207 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7rg and sgRNA-207-Rev (GenTerra, Russia) ... The size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 207 is 62 base pairs.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 N°285, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и sgRNA-285-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 N°285, составляет 62 пары нуклеотидов. The PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 285 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7rg and sgRNA-285-Rev (GenTerra, Russia) ... The size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 285 is 62 base pairs.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 N°366, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и sgRNA-366-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 N°366, составляет 62 пары нуклеотидов. The PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 N ° 366 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7rg and sgRNA-366-Rev (GenTerra, Russia) ... The size the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 N ° 366 is 62 base pairs.
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК: Amplification temperature profile for obtaining PCR products encoding guide RNAs:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут; 1.denaturation: 95 ° C for 3 minutes;
2. 35 циклов амплификации: 2.35 amplification cycles:
95°С - 15 сек, 95 ° С - 15 sec,
55°С - 45 сек, 55 ° С - 45 sec,
72°С - 30 сек; 72 ° С - 30 sec;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут. 3. final elongation: 72 ° C for 5 minutes.
ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 2). PCR products encoding guide RNAs specific to a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa were visualized by agarose gel electrophoresis (Fig. 2).
Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2Purification of PCR products encoding guide RNAs specific to the blaVIM-2 antibiotic resistance gene fragment
Pseudomonas aeruginosa, проводят с использованием коммерчески доступного набора ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2Pseudomonas aeruginosa is carried out using a commercially available ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, USA) according to the manufacturer's instructions. Purified PCR products encoding guide RNAs specific to the blaVIM-2 antibiotic resistance gene fragment
Pseudomonas aeruginosa, используют в качестве матрицы для синтеза направляющих РНК. Pseudomonas aeruginosa is used as a template for the synthesis of guide RNAs.
Синтез направляющих РНК, специфичных к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, осуществляется методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ Т7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждают из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 тМ и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК. The synthesis of guide RNAs specific to a fragment of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa is carried out by in vitro transcription using commercially available reagent kits (HiScribe ™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, USA) according to the manufacturer's instructions. The products of the in vitro transcription reaction are reprecipitated from the reaction mixture by adding sodium chloride to a final concentration of 400 tM and an equal volume of isopropyl alcohol. Such modifications of the manufacturer's protocol, introduced by the authors, allow increasing the yield of the reaction product and obtaining the desired concentration of the final guide RNA preparation.
Создание готового рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего белок семейства CRISPR/CAS LbCpfl из Lachnospiraceae, и направляющую РНК авторы проводят по стандартному протоколу с некоторыми модификациями (In vitro enzymology of Cas9 // Anders C, Jinek M. Methods Enzymol. 2014;546:1-20. doi: 10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5). Creation of a ready-made ribonucleoprotein complex containing a protein of the CRISPR / CAS LbCpfl family from Lachnospiraceae, and a guide The authors carry out RNA according to the standard protocol with some modifications (In vitro enzymology of Cas9 // Anders C, Jinek M. Methods Enzymol. 2014; 546: 1-20.doi: 10.1016 / B978-0-12-801185-0.00001-5) ...
Непосредственно перед объединением с CAS-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 нг) прогревают при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов CAS-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса. Immediately before combining with the CAS protein, the guide RNA preparation (250 ng) is heated at 90 ° C for 5 minutes and allowed to cool slowly to room temperature (incubation at room temperature for at least 10 minutes). This heating is necessary for the formation of the correct conformation of the hairpin contained in the guide RNA. Many manufacturers of commercial CAS protein preparations skip this step when preparing the ribonucleoprotein complex.
Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 нг CAS-белка LbCpfl из Lachnospiraceae и подготовленную направляющую РНК смешивают и инкубируют 15 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. To form the finished ribonucleoprotein complex, 250 ng of the LbCpfl CAS protein from Lachnospiraceae and the prepared guide RNA are mixed and incubated for 15 minutes at room temperature. The ribonucleoprotein complex obtained in this way is ready for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
Пример 4. Обнаружение единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS на примере модельной матрицы. Example 4. Detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS using a model matrix as an example.
Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, используют в качестве матрицы для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, полученных способом, описанным в Примере 3. The pre-amplified material obtained by the method described in Example 2 is used as a template for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS obtained by the method described in Example 3.
Для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS готовят реакционную смесь, содержащую следующие компоненты: To detect the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS, a reaction mixture is prepared containing the following components:
- 10х буфер (100 mM TrisHCl pH 8,0, 1 М NaCl); - 10x buffer (100 mM TrisHCl pH 8.0, 1 M NaCl);
- 50 mM MgCb (конечная концентрация в реакционной смеси 10 mM); - 250 нг рибонуклеопротеинового комплекса (LbCpfl из Lachnospiraceae и направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 N°93, sgRNA blaVIM-2 JV«95, sgRNA blaVIM-2 207, sgRNA blaVIM-2 Ла285 и sgRNA blaVIM-2 366); - 50 mM MgCb (final concentration in the reaction mixture 10 mM); - 250 ng of ribonucleoprotein complex (LbCpfl from Lachnospiraceae and guide RNAs sgRNA blaVIM-2 N ° 93, sgRNA blaVIM-2 JV «95, sgRNA blaVIM-2 207, sgRNA blaVIM-2 La285 and sgRNA 366 blaVIM);
- 20 pmol флуоресцентный зонд (6FAM-TTATT-BHQ1); - 20 pmol fluorescent probe (6FAM-TTATT-BHQ1);
- мишень (предварительно амплифицированный фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa); - target (pre-amplified fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa);
- вода mQ. - water mQ.
Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещают в амплификатор ДТПрайм 5 (ДНК-Технология, Россия) и задают следующие параметры реакции: The reaction mixtures containing all the necessary components are placed in a DTPrime 5 thermocycler (DNA-Technology, Russia) and the following reaction parameters are set:
30-60 циклов: 30-60 cycles:
37°С - 35 сек, 37 ° С - 35 sec,
37°С - 25 сек, съемка флуоресценции. 37 ° С - 25 sec, fluorescence shooting.
В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, сформированных на основе LbCpfl из Lachnospiraceae, с использованием в качестве мишени модельной матрицы - плазмидной ДНК pGEM-T-blaVIM-2, содержащей в своем составе фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM- 2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 п.о. размером 411 п.о. Показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS обладают способностью выявлять единичные копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Типичные результаты анализа приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 JVb93, sgRNA blaVIM-2 JVb95, sgRNA blaVIM-2 *G°207, sgRNA blaVIM-2 J\°285 и sgRNA blaVIM-2 366 и белок LbCpfl, на Фиг. 3, Фиг. 4, Фиг. 5, Фиг. 6 и Фиг. 7 соответственно. Отметим, что уже на 30-ом цикле анализа (30 минут) значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,5 копий/реакция) гена blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) минимум втрое. В ходе работ была оценена эффективность выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержащегося в составе модельной матрицы, с использованием различных направляющих РНК. Показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS, сформированные на основе LbCpfl из Lachnospiraceae и направляющих РНК, выявляют единичные копии гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: sgRNA blaVIM-2 N°207 > sgRNA blaVIM-2 N°93 > sgRNA blaVIM-2 Ж 66 > sgRNA blaVIM-2 L°285 > sgRNA blaVIM-2 >95 (Фиг. 8). First of all, experiments were carried out to detect single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS, formed on the basis of LbCpfl from Lachnospiraceae, using as a target a model matrix - plasmid DNA pGEM-T-bla containing a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa from 37 to 447 bp. size 411 p.o. It was shown that CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes are capable of detecting single copies of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa. Typical analysis results are shown using real-time fluorescence profiles for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with ribonucleoportein complexes containing guide RNAs sgRNA blaVIM-2 JVb93, sgRNA blaVIM-2 JVb95, sg7-2 sgRNA blRNA blaVIM-2 J \ ° 285 and sgRNA blaVIM-2 366 and LbCpfl protein, in FIG. 3, FIG. 4, FIG. 5, Fig. 6 and FIG. 7 respectively. Note that already at the 30th cycle of analysis (30 minutes), the value of the signal obtained during the detection of single copies (1.5 copies / reaction) of the blaVIM-2 gene of Pseudomonas aeruginosa exceeded the value of "noise" (nonspecific fluorescence of the control sample, not containing targets) at least three times. In the course of the work, the efficiency of detecting single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa, contained in the model matrix, was assessed using various guide RNAs. It was shown that ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS, formed on the basis of LbCpfl from Lachnospiraceae and guide RNAs, reveal single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa with different efficiencies, and they can be arranged in the following order of decreasing activity: sgRNA blaVIM 207> sgRNA blaVIM-2 N ° 93> sgRNA blaVIM-2 F 66> sgRNA blaVIM-2 L ° 285> sgRNA blaVIM-2> 95 (Fig. 8).
Пример 5. Обнаружение единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS на ограниченной панели клинических образцов. Example 5. Detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS on a limited panel of clinical samples.
Разработанные направляющие РНК были апробированы на ограниченной панели клинических образцов (10 шт.), содержащихThe developed guide RNAs were tested on a limited panel of clinical samples (10 pcs.) Containing
Pseudomonas aeruginosa, несущую ген антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (ранее подтверждено микробиологическими методами и методом секвенирования следующего поколения). Pseudomonas aeruginosa carrying the blaVIM-2 antibiotic resistance gene (previously confirmed by microbiological methods and next generation sequencing).
Для обнаружения единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS была проведена предварительная амплификация фрагментов этого гена. Для проведения предварительной амплификации были подготовлены серийные (согласно Таблице 3) разведения препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов 10 пациентов с помощью коммерчески доступного набора DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, США) согласно инструкции производителя. To detect single copies of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS, preliminary amplification of fragments of this gene was carried out. For preliminary amplification, serial (according to Table 3) dilutions of DNA preparations isolated from clinical samples of 10 patients using a commercially available DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, USA) were prepared according to the manufacturer's instructions.
ПЦР-продукты, кодирующие фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) как описано в Примере 2, применяя описанный температурный профиль и продолжительность реакции амплификации. Полученный таким способом материал используют в качестве матрицы для обнаружения единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, полученных способом, описанным в Примере 3. Обнаружение единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-PCR products encoding a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa are obtained in an amplification reaction using PCR-mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) as described in Example 2, using the described temperature profile and duration of the amplification reaction. The material obtained in this way is used as a template for the detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS obtained by the method described in Example 3. Detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-
2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS проводят способом, описанным в Примере 4. 2 Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS is carried out according to the method described in Example 4.
В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS обладают способностью выявлять единичные копии (1,5 копий/реакция) гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в препаратах ДНК, выделенных из клинических образцов. При этом уже на 2-15 цикле (2-15 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) втрое, а к 5-26 циклу (5-26 минут) анализа - более чем в 5 раз (широкий диапазон и разница в циклах обусловлены различиями использованных в анализе направляющих РНК, Таблица 5). The analysis showed that CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes are capable of detecting single copies (1.5 copies / reaction) of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa in DNA preparations isolated from clinical samples. At the same time, already at 2-15 cycles (2-15 minutes) of the analysis, the signal value exceeded the value of "noise" (nonspecific fluorescence of the control sample containing no target) by three times, and by the 5-26 cycle (5-26 minutes) of the analysis - more than 5 times (wide range and difference in cycles are due to differences in guide RNAs used in the analysis, Table 5).
Таблица 5. Соотношения значений сигнала к значению «шума» при детекции единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в клинических образцах после предварительной амплификации с применением рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, содержащих разработанные направляющие РНК.
Figure imgf000023_0001
Table 5. Ratios of signal-to-noise values in the detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa in clinical samples after preliminary amplification using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS containing developed guide RNAs.
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000025_0001
Типичные результаты анализа приведены на примерах значений флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa (10 независимых клинических образцов), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 JVb93, sgRNA blaVIM-2 JVb95, sgRNA blaVIM-2 JVb207, sgRNA blaVIM-2 JVT2285 и sgRNA blaVIM-2 К2З66 и белок LbCpfl, на Фиг. 9, Фиг. 10, Фиг. 11, Фиг. 12 и Фиг. 13 соответственно. Эффективность выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержащегося в составе препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов, с использованием различных направляющих РНК в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, сформированных на основе LbCpfl из Lachnospiraceae, можно представить в следующем порядке по убыванию: sgRNA blaVIM-2 207 > sgRNA blaVIM-2 93 > sgRNA blaVIM-2 J\°285 > sgRNA blaVIM-2 К2З66 > sgRNA blaVIM-2 95 (Таблица 5). Typical assay results are exemplified by fluorescence endpoint values (30 assay cycles, 30 minutes) for pre-amplified blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa targets (10 independent clinical samples) treated with ribonucleoportein complexes containing guide RNA sgRNA blaVIM-2 JVb93, sgRNA blaVIM-2 JVb95, sgRNA blaVIM-2 JVb207, sgRNA blaVIM-2 JVT2285 and sgRNA blaVIM-2 K2Cp66, and protein Lb. 9, Fig. 10, Fig. 11, Fig. 12 and FIG. 13 respectively. The efficiency of detecting single copies of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene contained in DNA preparations isolated from clinical samples using various guide RNAs in the CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes formed on the basis of LbCpfl from Lachnospiraceae can be presented in the following descending order : sgRNA blaVIM-2 207> sgRNA blaVIM-2 93> sgRNA blaVIM-2 J \ ° 285> sgRNA blaVIM-2 K2Z66> sgRNA blaVIM-2 95 (Table 5).
Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют ультрачувствительно выявлять единичные копии гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в клинических образцах после предварительной амплификации в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS. Thus, the developed guide RNAs allow ultrasensitive detection of single copies of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa in clinical samples after preliminary amplification in the CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ CLAIM
1. Молекула направляющей РНК системы CRISPR/CAS, которая способна связываться с целевыми высоко консервативными участками гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета-лактамаза класс В VIM-2) Pseudomonas aeruginosa, где нуклеотидная последовательность направляющей РНК выбрана из последовательностей SEQ Ш NO: 1, SEQ Ш NO: 2, SEQ Ш NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5. 1. A CRISPR / CAS guide RNA molecule capable of binding to the target highly conserved regions of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 (metallo-beta-lactamase class B VIM-2) of Pseudomonas aeruginosa, where the nucleotide sequence of the guide RNA is selected from the sequences of SEQ III NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5.
2. Молекула направляющей РНК по п.1, отличающаяся тем, что содержит в своем составе РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК- эндонуклеазой LbCpfl из Lachnospiraceae. 2. A guide RNA molecule according to claim 1, characterized in that it contains an RNA hairpin that is recognized by the RNA directed DNA endonuclease LbCpfl from Lachnospiraceae.
3. Молекула направляющей РНК по п.1 или п.2, отличающаяся тем, что обеспечивает выявление единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. 3. A guide RNA molecule according to claim 1 or claim 2, characterized in that it provides detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
4. Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/CAS для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpfl из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной из направляющих РНК по из и. 1-3. 4. Ribonucleoprotein complex of the CRISPR / CAS system for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa, formed from the RNA-directed DNA endonuclease LbCpfl from Lachnospiraceae, and at least one of the targeting RNAs from and. 1-3.
5. Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/CAS по и.4, пригодный для выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. 5. Ribonucleoprotein complex of the CRISPR / CAS system according to i.4, suitable for detecting single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
6. Набор для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVTM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержащий: 6. Kit for detecting the antibiotic resistance gene blaVTM-2 Pseudomonas aeruginosa, containing:
(i) (а) молекулу направляющей РНК системы CRISPR/CAS по любому из и. и.1-3 и направляемую ДНК -эндонуклеазу LbCpfl из Lachnospiraceae; или (i) (a) a CRISPR / CAS guide RNA molecule according to any of and. and 1-3 and directed DNA endonuclease LbCpfl from Lachnospiraceae; or
(i) (Ь) рибонуклеопротеиновый комплекс по любому из и. и. 4-5; и (i) (b) a ribonucleoprotein complex according to any one of i. and. 4-5; and
(и) инструкцию по применению. (and) instructions for use.
7. Набор для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержащий: (i) (а) молекулу направляющей РНК системы CRISPR/CAS по любому из п.п.1-3 и направляемую ДНК -эндонуклеазу LbCpfl из Lachnospiraceae; или 7. Kit for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, containing: (i) (a) a CRISPR / CAS targeting RNA molecule according to any one of claims 1 to 3 and an LbCpfl DNA targeting endonuclease from Lachnospiraceae; or
(i) (Ь) рибонуклеопротеиновый комплекс по любому из п.п. 4-5; и (i) (b) a ribonucleoprotein complex according to any one of paragraphs. 4-5; and
(и) один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ Ш NO: 6 и SEQ Ш NO: 7, и (i) one or more specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, and
(ш) инструкцию по применению. (w) instructions for use.
PCT/RU2020/050305 2020-04-15 2020-10-28 Crispr/cas system for detecting an antibiotic resistance gene WO2021211012A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020114570 2020-04-15
RU2020114570A RU2743861C1 (en) 2020-04-15 2020-04-15 Crispr-cas system for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metallo-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa at ultra-low concentrations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021211012A1 true WO2021211012A1 (en) 2021-10-21

Family

ID=74857425

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2020/050305 WO2021211012A1 (en) 2020-04-15 2020-10-28 Crispr/cas system for detecting an antibiotic resistance gene

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2743861C1 (en)
WO (1) WO2021211012A1 (en)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016205711A1 (en) * 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2707542C1 (en) * 2019-03-28 2019-11-27 Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) METHOD OF PRODUCING A RECOMBINANT NUCLEASE CAS ESSENTIALLY FREE OF BACTERIAL ENDOTOXINS, THE PREPARATION OBTAINED BY THIS METHOD AND CONTAINING A KIT FOR USE IN A CRISPR/Cas SYSTEM

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016205711A1 (en) * 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JENAI QUAN ET AL.: "FLASH: a next-generation CRISPR diagnostic for multiplexed detection of antimicrobial resistance sequences", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 47, no. 14, 2019, XP055652008, DOI: 10.1093/nar/gkz418 *
VILHELM MULLER ET AL.: "Direct identification of antibiotic resistance genes on single plasmid molecules using CRISPR/Cas9 in combination with optical DNA mapping", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 6, no. 37938, 2016, XP055867315, DOI: 10.1038/srep37938 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2743861C1 (en) 2021-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200340068A1 (en) Direct amplification and detection of viral and bacterial pathogens
EP2143805B1 (en) Asymmetric PCR amplification
JP2009502137A (en) Method for rapid identification and quantification of nucleic acid variants
JPH09313181A (en) Preparation of sample material for amplifying nucleic acid
RU2743861C1 (en) Crispr-cas system for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metallo-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa at ultra-low concentrations
RU2734520C1 (en) Method for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in the method
RU2745637C1 (en) Method for obtaining the crispr/cas ribonucleoprotein complex preparation and preparation for detection of the blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa antibiotic resistance gene in ultra-low concentrations
RU2791879C1 (en) Crispr-cas12 system for detecting the exou gene encoding the type 3 secretion system exotoxin, pseudomonas aeruginosa, at ultra-low concentrations
RU2791880C1 (en) Method for detecting the exou gene encoding the type 3 secretion system exotoxin, pseudomonas aeruginosa at ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in the method
RU2720768C1 (en) Crispr-cas system for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into a human genome in ultra-low concentrations
RU2782588C1 (en) Method for detecting the meca antibiotic resistance gene of staphylococcus aureus in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method
RU2782739C1 (en) METHOD FOR PRODUCING A PREPARATION OF A RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX CRISPR-Cas AND A PREPARATION FOR DETECTING THE exoU GENE ENCODING AN EXOTOXIN OF THE THIRD TYPE SECRETION SYSTEM, PSEUDOMONAS AERUGINOSA
RU2747820C1 (en) Crispr-cas system for detection of john cunningham virus (jcpyv) dna at ultra-low concentrations
RU2747819C1 (en) Method for obtaining preparation of ribonucleoprotein complex crispr / cas and preparation for detecting dna of john cunningham virus (jcpyv) in ultra-low concentrations
RU2782315C1 (en) METHOD FOR OBTAINING A PREPARATION OF THE RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX CRISPR-Cas AND A PREPARATION FOR DETECTING THE mecA ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS
RU2747880C1 (en) Method for detecting dna of john cunningham virus (jcpyv) at ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in method
RU2720767C1 (en) Method for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into human genome in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in method
RU2782314C1 (en) Crispr-cas12 system for detecting the meca antibiotic resistance gene of staphylococcus aureus at ultra-low concentrations
RU2802783C1 (en) Crispr-cas12 system for detecting human immunodeficiency virus (hiv-1) rna in ultra-low concentrations in ultra-low concentrations
RU2720769C1 (en) Method of producing a preparation of a ribonucleoprotein complex of crispr / cas and a preparation for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into a human genome in ultra-low concentrations
RU2802079C1 (en) Method of detection of rna of hepatitis c virus genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method
RU2802781C1 (en) Method of obtaining a preparation of the ribonucleoprotein complex crispr-cas12 and a preparation for detecting human immunodeficiency virus (hiv-1) rna in ultra-low concentrations
RU2764023C1 (en) CRISPR-Cas 12 SYSTEM FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS
CN113151599A (en) Primer group, reagent, kit and detection method for detecting novel coronavirus
CN112813200A (en) Method for extremely short PCR amplification of nucleic acid, detection method and application

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20930879

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20930879

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1