RU2720767C1 - Method for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into human genome in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in method - Google Patents

Method for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into human genome in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in method Download PDF

Info

Publication number
RU2720767C1
RU2720767C1 RU2019141298A RU2019141298A RU2720767C1 RU 2720767 C1 RU2720767 C1 RU 2720767C1 RU 2019141298 A RU2019141298 A RU 2019141298A RU 2019141298 A RU2019141298 A RU 2019141298A RU 2720767 C1 RU2720767 C1 RU 2720767C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
hiv
dna
proviral dna
rna
amplification
Prior art date
Application number
RU2019141298A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Василий Геннадьевич Акимкин
Александр Игоревич Тюменцев
Марина Алексеевна Тюменцева
Original Assignee
Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) filed Critical Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора)
Priority to RU2019141298A priority Critical patent/RU2720767C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2720767C1 publication Critical patent/RU2720767C1/en
Priority to PCT/RU2020/050300 priority patent/WO2021118408A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, specifically to RNA guides, ribonucleoprotein complexes of CRISPR / CAS system containing RNA guides, and sets containing ribonucleoprotein complexes of CRISPR / CAS system and specific oligonucleotides for pre-amplification of highly conserved areas of HIV-1 genome. Invention enables efficient detection of proviral DNA of HIV-1 after specific amplification of DNA fragments of HIV-1.
EFFECT: invention provides detecting single copies of proviral DNA of human immunodeficiency virus (HIV-1) integrated into the human genome.
5 cl, 11 dwg, 4 tbl, 5 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к числу средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления, обнаружения, детекции провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), интегрированной в геном человека, а также к диагностическим способам и наборам.The invention relates to the field of genetic engineering and biotechnology, and in particular to the number of RNA-guiding agents that can be used in CRISPR-Cas12 systems as part of ribonucleoprotein complexes for the detection, detection, and detection of proviral DNA of human immunodeficiency virus (HIV-1), integrated into human genome, as well as diagnostic methods and kits.

Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии молекул провирусной ДНК ВИЧ-1.EFFECT: invention allows in vitro detection of single copies of HIV-1 proviral DNA molecules.

Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции провирусной ДНК ВИЧ-1 после проведения специфической амплификации фрагментов ДНК ВИЧ-1. Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации.RNA guides described herein can be used to detect HIV-1 proviral DNA after specific amplification of HIV-1 DNA fragments. Amplification can be carried out in various ways, including polymerase chain reaction (PCR); loop isothermal amplification (LAMP); helicase-dependent amplification (HDA); recombinase-mediated amplification (RPA); chain offset amplification (SDA); nucleic acid sequence amplification (NASBA); transcription-mediated amplification (TMA); Nickel Enzyme Mediated Amplification (NEAR); circular amplification (RCA) and many other types of amplification.

Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для борьбы с распространением социально-значимых инфекций, таких как ВИЧ, для диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, для мониторинга инфекционной безопасности донорской крови, оценки вирусной нагрузки и лекарственной устойчивости вируса иммунодефицита человека.RNA guides described in this application can be used to develop highly sensitive and high-tech diagnostic systems of a new generation based on CRISPR technologies to combat the spread of socially significant infections, such as HIV, for the diagnosis of HIV infection in children born to HIV-infected mothers to monitor the infectious safety of donated blood, assess the viral load and drug resistance of the human immunodeficiency virus.

Уровень техникиState of the art

Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR/CAS. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR/CAS системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования.To solve the epidemiological problems of deciphering outbreaks of infectious diseases, identifying and identifying the causative agent, it is necessary to develop and put into practice the work of supervisory and monitoring services of modern molecular epidemiology technologies. One of these technologies is the use of genetic editing elements of the CRISPR / CAS system. This technology is developing quite effectively in relation to the creation of treatments for certain diseases, despite a number of difficulties associated with the occurrence of unforeseen mutations. With in-depth studies in the field of application of the CRISPR / CAS system, it was found that it can be used for delicate diagnostic procedures in identifying the causative agent / s of an infection in humans, as well as their genotyping.

В 2018 году было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Cas12 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную, а также двухцепочечную ДНК. Такое свойство Cas12 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA EndonucleaseTargeted CRISPR TransReporter - ДНК-нацеленная эндонуклеаза CRISPR транс репортер). Впервые DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека (HPV). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas12a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте HPV, флуоресцентную репортерную молекулу. Технология DETECTR используется для обнаружения целевой ДНК-мишени после предварительной амплификации (ChenJS, МаЕ, HarringtonLB, DaCostaM, TianX, PalefskyJM, DoudnaJA. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018 Apr 27; 360(6387): 436-439).In 2018, it was shown that one of the enzymes of the CRISPR system, Cas12, after recognizing its target DNA target, begins to non-specifically hydrolyze single-stranded as well as double-stranded DNA. This property of Cas12 can be used as an indicator of the presence of a specific target, for example, the genome of a virus or bacteria. The researchers used this discovery to create a technology platform for detecting nucleic acids, known as DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR TransReporter - DNA-targeted endonuclease CRISPR trans reporter). For the first time, DETECTR was used to detect and genotype human papillomavirus (HPV). The proposed platform combines Cas12a nuclease, its directing HPV nucleic acid specific RNA, a fluorescent reporter molecule. DETECTR technology is used to detect the target DNA target after preliminary amplification (ChenJS, MaE, HarringtonLB, DaCostaM, TianX, PalefskyJM, DoudnaJA. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018 Apr 27; 360 (6387) : 436-439).

В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления нуклеиновых кислот возбудителей социально-значимых инфекционных заболеваний, таких как ВИЧ, гепатиты В и С, туберкулез и др., основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR/CAS.In this regard, it is extremely urgent to develop new effective methods for detecting nucleic acids of causative agents of socially significant infectious diseases, such as HIV, hepatitis B and C, tuberculosis, etc., based on genetic technologies, such as CRISPR / CAS.

В ходе изучения уровня техники не найдено источников, описывающих разработку и получение направляющих РНК для выявления единичных копий провирусной ДНК ВИЧ-1 in vitro.During the study of the prior art, no sources were found that describe the development and preparation of RNA guides for the detection of single copies of HIV-1 proviral DNA in vitro.

Исходя из этого, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости получения направляющих РНК для выявления единичных копий провирусной ДНК ВИЧ-1 in vitro и разработке соответствующих способов обнаружения провирусной ДНК ВИЧ-1.Proceeding from this, a technical problem arises, consisting in the need to obtain RNA guides for identifying single copies of HIV-1 proviral DNA in vitro and developing appropriate methods for detecting HIV-1 proviral DNA.

Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология, основанная на CRISPR/CAS, является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, и генотипирования инфекционных агентов.The proposed technology is promising for a variety of applications, including DNA / RNA quantification, rapid multiplex expression detection, and other types of sensitive detection, for example, detection of contamination of samples with nucleic acids. CRISPR / CAS-based technology is a multifunctional, error-resistant DNA detection technology suitable for rapid diagnosis, including infectious diseases, and for the genotyping of infectious agents.

Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами:The application of the proposed technology makes it possible to create a new generation of diagnostic systems that will have the following properties:

• высокая чувствительность;• high sensitivity;

• возможность проведения диагностики у постели больного;• the ability to diagnose at the bedside;

• возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования;• the ability to conduct diagnostics in the field without the use of specialized high-tech equipment;

• скорость и простота анализа;• speed and ease of analysis;

• сниженная стоимость анализа;• reduced cost of analysis;

• отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием;• lack of need to equip the diagnostic laboratory with expensive equipment;

• отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя.• the absence of the need for the selection of nucleic acids of the pathogen.

Изобретение относится к новым средствам - направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), интегрированной в геном человека, в биологических образцах.The invention relates to new tools - directing RNAs that can be used in CRISPR-Cas12 systems for ultrasensitive detection, identification, detection or detection of proviral DNA of the human immunodeficiency virus (HIV-1) integrated into the human genome in biological samples.

Технической задачей настоящего изобретения является разработка новых средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 с белками Cas12, такими как белки AsCpf1 из Acidaminococcus или LbCpf1 из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления провирусной ДНК ВИЧ-1, интегрированной в геном человека.An object of the present invention is to develop new RNA-guiding agents that can be used in CRISPR-Cas12 systems with Cas12 proteins, such as AsCpf1 proteins from Acidaminococcus or LbCpf1 from Lachnospiraceae, for ultrasensitive detection of HIV-1 proviral DNA integrated into the human genome.

При осуществлении настоящего изобретения достигается неожиданный технический результат - возможность ультрачувствительного выявления провирусной ДНК ВИЧ-1 до единичных копий провирусной ДНК ВИЧ-1 в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления провирусной ДНК ВИЧ-1 с 100 до 10 копий/мл (ГЭ/мл).In the implementation of the present invention, an unexpected technical result is achieved - the possibility of ultra-sensitive detection of HIV-1 proviral DNA to single copies of HIV-1 proviral DNA in one reaction. The invention provides an increase in the detection efficiency of HIV-1 proviral DNA from 100 to 10 copies / ml (GE / ml).

Технический результат достигается за счет:The technical result is achieved due to:

• разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультрачувствительного выявления провирусной ДНК ВИЧ-1, интегрированной в геном человека, где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками генома ВИЧ-1, содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемыми ДНК-эндонуклеазами AsCpf1 из Acidaminococcus и/или LbCpf1 из Lachnospiraceae, с обеспечением выявления единичных копий провирусной ДНК ВИЧ-1.• the development of RNA guide molecule molecules that can be used in CRISPR-Cas12 systems for ultra-sensitive detection of HIV-1 proviral DNA integrated into the human genome, where these RNA guide molecules are selected from the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 with targeted highly conserved regions of the HIV-1 genome, contain an RNA hairpin that is recognized by AsCpf1 RNA-guided DNA endonucleases from Acidaminococcus and / or LbCpf1 from Lachnospiraceae, to ensure the detection of single copies of HIV-1 proviral DNA.

• применения РНК-направляемых ДНК-эндонуклеаз AsCpf1 из Acidaminococcus и/или LbCpf1 из Lachnospiraceae, полученных согласно способу, разработанному авторами ранее (Патент РФ №2707542, опубл. 27.11. 2019), для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РПК) системы CRISPR/CAS, пригодных для детекции провирусной ДНК ВИЧ-1 в ультранизких концентрациях (единичные копии).• the use of RNA-directed AsCpf1 DNA endonucleases from Acidaminococcus and / or LbCpf1 from Lachnospiraceae, obtained according to the method developed previously by the authors (RF Patent No. 2707542, publ. 27.11. 2019), to create CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes (RPK), suitable for the detection of HIV-1 proviral DNA in ultra-low concentrations (single copies).

• разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 3-6, для предварительной амплификации фрагментов генома ВИЧ-1.• development of a set of specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 3-6 for pre-amplification of fragments of the HIV-1 genome.

• оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагментов генома ВИЧ-1.• optimization of the conditions for preliminary amplification of fragments of the HIV-1 genome.

• определения условий проведения ультрачувствительной детекции провирусной ДНК ВИЧ-1 и установления последовательности стадий метода.• determining the conditions for the ultra-sensitive detection of HIV-1 proviral DNA and establishing the sequence of stages of the method.

Направляющие РНК согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативным фрагментам генома ВИЧ-1. Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемыми ДНК-эндонуклеазами AsCpf1 из Acidaminococcus или LbCpf1 из Lachnospiraceae, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:RNA guides of the present invention correspond to highly conserved fragments of the HIV-1 genome. Most preferred are RNA guides recognized by AsCpf1 RNA-guided DNA endonucleases from Acidaminococcus or LbCpf1 from Lachnospiraceae characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:

• SEQ ID NO: 1;• SEQ ID NO: 1;

• SEQ ID NO: 2;• SEQ ID NO: 2;

• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%;• or any of them is identical to at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%;

• или комплементарной любой из них;• or complementary to any of them;

• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.• or hybridizing with any of them under stringent conditions.

Набор специфических олигонуклеотидов для проведения предварительной амплификации фрагментов генома ВИЧ-1 согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативным участкам генома ВИЧ-1. Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:A set of specific oligonucleotides for preliminary amplification of fragments of the HIV-1 genome according to the present invention correspond to highly conserved regions of the HIV-1 genome. Most preferred are oligonucleotides characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:

• SEQ ID NO: 3;• SEQ ID NO: 3;

• SEQ ID NO: 4;• SEQ ID NO: 4;

• SEQ ID NO: 5;• SEQ ID NO: 5;

• SEQ ID NO: 6;• SEQ ID NO: 6;

• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%;• or any of them is identical to at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%;

• или комплементарной любой из них;• or complementary to any of them;

• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.• or hybridizing with any of them under stringent conditions.

Согласно настоящему изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и РНК-направляемой ДНК-нуклеазы системы CRISPR/CAS, выбранной из AsCpf1 из Acidaminococcus и/или LbCpf1 из Lachnospiraceae, пригодные для использования для выявления провирусной ДНК ВИЧ-1 в ультранизких концентрациях (единичные копии).According to the present invention, ribonucleoprotein complexes (RPKs) are prepared consisting of at least one RNA guide and an RNA-guided DNA nuclease of the CRISPR / CAS system selected from AsCpf1 from Acidaminococcus and / or LbCpf1 from Lachnospiraceae suitable for use in detecting HIV proviral DNA -1 in ultra-low concentrations (single copies).

Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, объединенную с белком системы CRISPR/CAS (AsCpf1 из Acidaminococcus и/или LbCpf1 из Lachnospiraceae) или лиофильно высушенные РПК.PKK preparations are solutions containing an RNA guide selected from SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, combined with a protein of the CRISPR / CAS system (AsCpf1 from Acidaminococcus and / or LbCpf1 from Lachnospiraceae) or freeze-dried RPK.

Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), интегрированной в геном человека, с инструкцией по применению.The resulting RNA guides can be used as part of a kit for the detection of proviral DNA of the human immunodeficiency virus (HIV-1), integrated into the human genome, with instructions for use.

Способ обнаружения провирусной ДНК ВИЧ-1, интегрированной в геном человека, предусматривает:A method for detecting HIV-1 proviral DNA integrated into the human genome comprises:

i) проведение предварительной амплификации материала образца от пациента, предположительно содержащего провирусную ДНК ВИЧ-1, интегрированную в геном человека, с использованием одного или нескольких специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 3-6, с целью получения мишени - предварительно амплифицированного фрагмента ДНК ВИЧ-1;i) pre-amplification of the sample material from a patient, presumably containing HIV-1 proviral DNA, integrated into the human genome, using one or more specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 3-6, in order to obtain a target - a pre-amplified DNA fragment HIV-1;

ii) приготовление реакционной смеси для детекции, содержащей мишень, полученную на стадии (i); рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/CAS, сформированный из по меньшей мере одной РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы, выбранной из AsCpf1 из Acidaminococcus и/или LbCpf1 из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ ID NO: 1 или 2; флюоресцентный зонд и буфер для детекции;ii) preparing a detection reaction mixture containing a target obtained in step (i); a CRISPR / CAS ribonucleoprotein complex formed from at least one RNA-driven DNA endonuclease selected from AsCpf1 from Acidaminococcus and / or LbCpf1 from Lachnospiraceae and at least one RNA guide with SEQ ID NO: 1 or 2; fluorescence probe and detection buffer;

iii) проведение 30-60 циклов детекции в реакционной смеси, полученной на стадии (ii), в амплификаторе,iii) conducting 30-60 cycles of detection in the reaction mixture obtained in stage (ii), in the amplifier,

с обнаружением таким образом провирусной ДНК ВИЧ-1, интегрированной в геном человека.with the discovery in this way of HIV-1 proviral DNA integrated into the human genome.

Предварительно амплифицированный фрагмент ДНК ВИЧ-1, согласно настоящему способу, может быть представлен LTR и/или POL ВИЧ-1.The pre-amplified HIV-1 DNA fragment, according to the present method, can be represented by LTR and / or POL HIV-1.

Способ по изобретению обеспечивает выявление провирусной ДНК ВИЧ-1, интегрированной в геном человека, в ультранизких концентрациях, вплоть до единичных копий провирусной ДНК.The method according to the invention provides for the detection of HIV-1 proviral DNA, integrated into the human genome, in ultra-low concentrations, up to single copies of proviral DNA.

Специфический олигонуклеотид для использования в способе выбирают из группы SEQ ID NO: 3-6 и используют для предварительной амплификации высококонсервативного фрагмента генома ВИЧ-1, который распознается рибонуклеопротеиновым комплексом.A specific oligonucleotide for use in the method is selected from the group of SEQ ID NO: 3-6 and is used for pre-amplification of a highly conserved fragment of the HIV-1 genome, which is recognized by the ribonucleoprotein complex.

Набор для использования в способе обнаружения провирусной ДНК ВИЧ-1, интегрированной в геном человека, содержит рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/CAS, сформированный из по меньшей мере одной РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы, выбранной из AsCpf1 из Acidaminococcus и/или LbCpf1 из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ ID NO: 1 или 2; специфический флюоресцентный зонд, буфер для амплификации и инструкцию по применению.The kit for use in the method for detecting HIV-1 proviral DNA integrated into the human genome contains a CRISPR / CAS ribonucleoprotein complex formed from at least one RNA-directed DNA endonuclease selected from AsCpf1 from Acidaminococcus and / or LbCpf1 from Lachnospiraceae, and at least one RNA guide with SEQ ID NO: 1 or 2; specific fluorescence probe, amplification buffer and instructions for use.

Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высококонсервативных фрагментов генома ВИЧ-1, в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 3-6.The kit may further include components for preliminary amplification of highly conserved fragments of the HIV-1 genome, including one or more specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 3-6.

При этом по меньшей мере одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR/CAS (AsCpf1 из Acidaminococcus и/или LbCpf1 из Lachnospiraceae) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах.At the same time, at least one RNA guide in the kit can be in complex with a protein of the CRISPR / CAS system (AsCpf1 from Acidaminococcus and / or LbCpf1 from Lachnospiraceae) in one container or separately in different containers.

Предложенная технология позволяет определить единичные копии провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), интегрированной в геном человека, в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих провирусную ДНК ВИЧ-1. Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие провирусной ДНК ВИЧ-1, интегрированной в геном человека.The proposed technology allows the determination of single copies of the proviral DNA of the human immunodeficiency virus (HIV-1) integrated into the human genome in biological samples of a patient selected from fluid and / or tissue presumably containing HIV-1 proviral DNA. A biological sample can be a sample of blood, serum or plasma, blood cells, saliva, sputum, lymphoid tissues, blood-forming organs and other biological materials from a patient, which can be used to analyze the presence of HIV-1 proviral DNA integrated into the human genome .

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Фиг. 1. Визуализация фрагментов LTR после предварительной амплификации при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:FIG. 1. Visualization of LTR fragments after preliminary amplification using agarose gel electrophoresis, where numbers 1-8 indicate:

1 - ПЦР-продукт LTR, полученный в ходе амплификации 1 нг модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3;1 - LTR PCR product obtained during amplification of 1 ng of the HIV-1 pNL4-3 proviral DNA model matrix;

2 - ПЦР-продукт LTR, полученный в ходе амплификации 0,1 нг модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3;2 - PCR product of LTR obtained during amplification of 0.1 ng of the HIV-1 pNL4-3 proviral DNA model matrix;

3 - ПЦР-продукт LTR, полученный в ходе амплификации 10 пг модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3;3 - LTR PCR product obtained during amplification of 10 pg of the HIV-1 pNL4-3 proviral DNA model matrix;

4 - ПЦР-продукт LTR, полученный в ходе амплификации 1 пг модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3;4 - LTR PCR product obtained during amplification of 1 pg of the HIV-1 pNL4-3 model of proviral DNA DNA;

5 - ПЦР-продукт LTR, полученный в ходе амплификации 0,1 пг модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3;5 - LTR PCR product obtained during amplification of 0.1 pg of the HIV-1 pNL4-3 proviral DNA model matrix;

6 - ПЦР-продукт LTR, полученный в ходе амплификации 10 фг модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3;6 - LTR PCR product obtained during amplification of 10 fg of the HIV-1 pNL4-3 proviral DNA model matrix;

7 - ПЦР-продукт LTR, полученный в ходе амплификации 1 фг модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3;7 - LTR PCR product obtained during amplification of 1 fg of the HIV-1 pNL4-3 proviral DNA model matrix;

8 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3;8 - negative control that does not contain a model matrix of HIV-1 pNL4-3 proviral DNA;

М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bpPlus, ThermoFisherScientific, США).M - molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 nucleotides (GeneRuler 100 bpPlus, ThermoFisher Scientific, USA).

Фиг 2. Визуализация фрагментов POL после предварительной амплификации при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:Fig 2. Visualization of POL fragments after preliminary amplification using agarose gel electrophoresis, where numbers 1-8 indicate:

1 - ПЦР-продукт POL, полученный в ходе амплификации 1 нг модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3;1 - PCR product POL, obtained during amplification of 1 ng model matrix of proviral DNA HIV-1 pNL4-3;

2 - ПЦР-продукт POL, полученный в ходе амплификации 0,1 нг модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3;2 - PCR product POL obtained during amplification of 0.1 ng of the HIV-1 pNL4-3 proviral DNA model matrix;

3 - ПЦР-продукт POL, полученный в ходе амплификации 10 пг модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3;3 - PCR product POL obtained during amplification of 10 pg of the HIV-1 pNL4-3 proviral DNA model matrix;

4 - ПЦР-продукт POL, полученный в ходе амплификации 1 пг модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3;4 - PCR product POL obtained during amplification of 1 pg of the HIV-1 pNL4-3 model of proviral DNA DNA;

5 - ПЦР-продукт POL, полученный в ходе амплификации 0,1 пг модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3;5 - PCR product POL obtained during amplification of 0.1 pg of the HIV-1 pNL4-3 proviral DNA model matrix;

6 - ПЦР-продукт POL, полученный в ходе амплификации 10 фг модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3;6 - POL PCR product obtained during amplification of 10 fg of the HIV-1 pNL4-3 proviral DNA model matrix;

7 - ПЦР-продукт POL, полученный в ходе амплификации 1 фг модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3;7 - POL PCR product obtained during amplification of 1 fg of the HIV-1 pNL4-3 proviral DNA model matrix;

8 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3;8 - negative control that does not contain a model matrix of HIV-1 pNL4-3 proviral DNA;

М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bpPlus, ThermoFisherScientific, США).M - molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 nucleotides (GeneRuler 100 bpPlus, ThermoFisher Scientific, USA).

Фиг. 3. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени POL, обработанной рибонуклеопротеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgPOL и белок AsCpf1.FIG. 3. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified POL target treated with a ribonucleoprotein complex containing the sgPOL RNA guide and AsCpf1 protein.

Фиг. 4. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени POL, обработанной рибонуклеопротеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgPOL и белок LbCpf1.FIG. 4. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified POL target treated with a ribonucleoprotein complex containing sgPOL RNA guide and LbCpf1 protein.

Фиг. 5. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени LTR, обработанной рибонуклеопротеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgLTR и белок LbCpf1. Предел обнаружения предварительно амплифицированной мишени LTR составляет 1 фг.FIG. 5. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified LTR target treated with a ribonucleoprotein complex containing sgLTR RNA guide and LbCpf1 protein. The detection limit of a pre-amplified LTR target is 1 fg.

Фиг. 6. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированной мишени LTR, обработанной рибонуклеопротеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgLTR и белок LbCpf1. Количество вносимой мишени не влияет существенно на значения флуоресценции в образце с минимальным количеством анализируемого материала (1 фг ДНК ВИЧ-1).FIG. 6. Endpoint fluorescence values (60 assay cycle, 60 minutes) for a pre-amplified LTR target treated with a ribonucleoprotein complex containing sgLTR RNA guide and LbCpf1 protein. The amount of the target introduced does not significantly affect the fluorescence values in the sample with the minimum amount of analyzed material (1 fg HIV-1 DNA).

Фиг. 7. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированной мишени POL, обработанной рибонуклеопротеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgPOL и белок LbCpf1. Количество вносимой мишени не влияет существенно на значения флуоресценции в образце с минимальным количеством анализируемого материала (1 фг ДНК ВИЧ-1).FIG. 7. Fluorescence values at the end point (60 analysis cycle, 60 minutes) for a pre-amplified POL target treated with a ribonucleoprotein complex containing sgPOL RNA guide and LbCpf1 protein. The amount of the target introduced does not significantly affect the fluorescence values in the sample with the minimum amount of analyzed material (1 fg HIV-1 DNA).

Фиг. 8. Профиль флуоресценции в реальном времени для смеси предварительно амплифицированных мишеней LTR и POL, обработанных смесью рибонуклеопротеиновых комплексов, содержащих направляющие РНК sgLTR и sgPOL и белок LbCpf1.FIG. 8. Real-time fluorescence profile for a mixture of pre-amplified LTR and POL targets treated with a mixture of ribonucleoprotein complexes containing sgLTR and sgPOL RNA guides and LbCpf1 protein.

Фиг. 9. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированной мишени LTR, обработанной рибонуклеопротеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgLTR и белок LbCpf1. При 25°С и 42°С рибонуклеопротеиновый комплекс CRISPR/CAS способен обнаруживать до 10 фг ДНК ВИЧ-1, при 37°С - до 1 фг ДНК ВИЧ-1.FIG. 9. Endpoint fluorescence values (60 analysis cycle, 60 minutes) for a pre-amplified LTR target treated with a ribonucleoprotein complex containing sgLTR RNA guide and LbCpf1 protein. At 25 ° C and 42 ° C, the CRISPR / CAS ribonucleoprotein complex can detect up to 10 fg of HIV-1 DNA, at 37 ° C up to 1 fg of HIV-1 DNA.

Фиг. 10. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированной мишени LTR, обработанной рибонуклеопротеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgLTR и белок LbCpf1. Увеличение количества циклов предварительной амплификации до 35-40 позволяет обнаруживать до 2 аг ДНК ВИЧ-1 (2×10-18 г, что соответствует 1,3 копиям ДНК, внесенным в реакцию предварительной амплификации).FIG. 10. Endpoint fluorescence values (60 analysis cycle, 60 minutes) for a pre-amplified LTR target treated with a ribonucleoprotein complex containing sgLTR RNA guide and LbCpf1 protein. An increase in the number of preliminary amplification cycles to 35–40 makes it possible to detect up to 2 ag of HIV-1 DNA (2 × 10 -18 g, which corresponds to 1.3 copies of DNA introduced into the preliminary amplification reaction).

Фиг. 11. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированной мишени POL, обработанной рибонуклеопротеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgPOL и белок LbCpf1. Увеличение количества циклов предварительной амплификации до 35-40 позволяет обнаруживать до 2 аг ДНК ВИЧ-1 (2×10-18 г, что соответствует 1,3 копиям ДНК, внесенным в реакцию предварительной амплификации).FIG. 11. Endpoint fluorescence values (60 assay cycle, 60 minutes) for a pre-amplified POL target treated with a ribonucleoprotein complex containing sgPOL RNA guide and LbCpf1 protein. An increase in the number of preliminary amplification cycles to 35–40 makes it possible to detect up to 2 ag of HIV-1 DNA (2 × 10 -18 g, which corresponds to 1.3 copies of DNA introduced into the preliminary amplification reaction).

Примеры осуществления изобретенияExamples of carrying out the invention

ПРИМЕР 1: ПОДБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ-МИШЕНЕЙ В ГЕНОМЕ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (ВИЧ-1) ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК.Example 1: Selection of Target Sequences in the Human Immunodeficiency Virus Virus Genome (HIV-1) to Generate Guiding RNAs.

Для подбора последовательностей-мишеней в геноме вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы insilico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology/) и HIV databases (https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html). Был составлен перечень участков генома ВИЧ-1 с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках генома. Из составленного перечня выбраны участки, соответствующие гену вирусной полимеразы (POL) и длинному концевому повтору (LTR). Направляющая РНК, специфически узнающая высоко консервативный участок гена вирусной полимеразы (POL), представлена уникальной последовательностью SEQ ID NO: 1. Направляющая РНК, специфически узнающая высоко консервативный участок длинного концевого повтора (LTR), представлена уникальной последовательностью SEQ ID NO: 2.To select target sequences in the genome of the human immunodeficiency virus (HIV-1) to create RNA directing, modern insilico algorithms for analysis of nucleotide sequences and publicly available programs, including Benchling (https://www.benchling.com/molecular- biology /) and HIV databases (https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html). A list of sections of the HIV-1 genome was compiled with the theoretically calculated probability of their cleavage in highly conserved parts of the genome. Plots corresponding to the viral polymerase gene (POL) and long terminal repeat (LTR) were selected from the compiled list. The directing RNA specifically recognizing the highly conserved region of the viral polymerase gene (POL) is represented by the unique sequence of SEQ ID NO: 1. The directing RNA specifically recognizing the highly conserved region of the long terminal repeat (LTR) is represented by the unique sequence of SEQ ID NO: 2.

ПРИМЕР 2: ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ПРОВИРУСНОЙ ДНК ВИЧ-1 МЕТОДОМ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ ФРАГМЕНТОВ ГЕНОМА ВИЧ-1.EXAMPLE 2: PREPARATION OF MATERIAL FOR DETECTION OF HIV-1 PROVIRUS DNA BY METHOD OF PRELIMINARY AMPLIFICATION OF HIV-1 GENOMIC FRAGMENTS.

Подготовку материала для обнаружения провирусной ДНК ВИЧ-1 проводят методом предварительной амплификации. В качестве модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 биологического образца используют плазмидную ДНК инфекционного молекулярного клона ВИЧ-1 pNL4-3. Физическая карта pNL4-3 доступна по адресу: https://aidsreagent.org/reagentdetail.cfm?t=molecular_clones&id=633.The preparation of material for the detection of HIV-1 proviral DNA is carried out by the preliminary amplification method. As a model matrix of the HIV-1 proviral DNA biological sample, the plasmid DNA of the HIV-1 infectious molecular clone pNL4-3 is used. The pNL4-3 physical map is available at: https://aidsreagent.org/reagentdetail.cfm?t=molecular_clones&id=633.

Предварительную амплификацию участков, соответствующих гену вирусной полимеразы (POL) и длинному концевому повтору (LTR), проводят с использованием одного или нескольких специфических олигонуклеотидов с SEQ ID NO: 3-6, приведенных в таблице 1.Pre-amplification of the sites corresponding to the viral polymerase gene (POL) and the long terminal repeat (LTR) is carried out using one or more specific oligonucleotides with SEQ ID NO: 3-6, are shown in table 1.

Figure 00000001
Figure 00000001

ПЦР-продукт, кодирующий фрагмент гена вирусной полимеразы POL, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Forpol и Revpol (Евроген, Россия). Размер амплифицированного фрагмента POL составляет 293 пары нуклеотидов.A PCR product encoding a fragment of the POL viral polymerase gene is obtained in an amplification reaction using a 2blue PCR mixture (FBUN Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific Forpol and Revpol oligonucleotides (Eurogen, Russia). The amplified POL fragment is 293 nucleotides in size.

ПЦР-продукт, кодирующий фрагмент длинного концевого повтора LTR, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов ForL и RevL (Евроген, Россия). Размер амплифицированного фрагмента LTR составляет 480 пар нуклеотидов.The PCR product encoding the LTR long terminal repeat fragment is obtained in the amplification reaction using the 2blue PCR mixture (FBUN Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific ForL and RevL oligonucleotides (Eurogen, Russia). The amplified LTR fragment is 480 nucleotides in size.

Температурный профиль амплификациидля получения ПЦР-продуктов, кодирующих фрагменты генома ВИЧ-1:Amplification temperature profile to obtain PCR products encoding fragments of the HIV-1 genome:

1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;1. denaturation: 95 ° C for 3 minutes;

2. 30 циклов амплификации:2. 30 cycles of amplification:

95°С - 15 сек,95 ° C - 15 sec,

55°С - 45 сек,55 ° C - 45 sec,

72°С - 30 сек;72 ° C - 30 sec;

3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.3. final elongation: 72 ° C for 5 minutes.

В ходе подготовки материала для обнаружения провирусной ДНК ВИЧ-1 методом предварительной амплификации проводят титрование модельной матрицы провирусной ДНК ВИЧ-1 pNL4-3 путем приготовления серийных разведений (Таблица 2).In the course of preparation of the material for detection of HIV-1 proviral DNA by the preliminary amplification method, the model matrix of HIV-1 pNL4-3 proviral DNA is titrated by preparing serial dilutions (Table 2).

Figure 00000002
Figure 00000002

Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные фрагменты генома ВИЧ-1 визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (фиг. 1, фиг. 2).To assess the effectiveness of preliminary amplification, the obtained fragments of the HIV-1 genome are visualized by agarose gel electrophoresis (Fig. 1, Fig. 2).

Подготовленный описанным способом материал используют дляThe material prepared by the described method is used for

экспериментов по выявлению провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов AsCpf1 из Acidaminococcus и/или LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющие РНК sgPOL и/или sgLTR, без предварительной очистки.experiments on the detection of proviral DNA of human immunodeficiency virus (HIV-1) using AsCpf1 ribonucleoprotein complexes from Acidaminococcus and / or LbCpf1 from Lachnospiraceae containing sgPOL and / or sgLTR RNA guides without preliminary purification.

ПРИМЕР 3: ПОЛУЧЕНИЕ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК И СОЗДАНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ПРОВИРУСНОЙ ДНК ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (ВИЧ-1).EXAMPLE 3: OBTAINING GUIDING RNA AND CREATION OF RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEXES FOR DETECTION OF PROVIRUS DNA OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS (HIV-1).

Для получения направляющих РНК для обнаружения провирусной ДНК ВИЧ-1 разработан набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 3.To obtain RNA guides for the detection of HIV-1 proviral DNA, a set of specific oligonucleotides is shown in Table 3.

Figure 00000003
Figure 00000003

Получение направляющих РНК проводят в несколько этапов:Obtaining RNA guides is carried out in several stages:

1. получение ПЦР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (Таблица 3), кодирующего направляющую РНК (sgPOL и/или sgLTR), способную связываться с целевым высоко консервативным участком генома ВИЧ-1 (POL или LTR, соответственно), содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемыми ДНК-эндонуклеазами AsCpf1 из Acidaminococcus, например, с SEQ ID NO: 7, или LbCpf1 из Lachnospiraceae, например с SEQ ID NO: 8;1. obtaining a PCR product using a set of specific oligonucleotides (Table 3) encoding an RNA guide (sgPOL and / or sgLTR) capable of binding to the target highly conserved region of the HIV-1 genome (POL or LTR, respectively) containing an RNA hairpin which is recognized by AsCpf1 RNA-directed DNA endonucleases from Acidaminococcus, for example with SEQ ID NO: 7, or LbCpf1 from Lachnospiraceae, for example with SEQ ID NO: 8;

2. очистка ПЦР-продукта, кодирующего направляющую РНК (sgPOL и/или sgLTR);2. purification of the PCR product encoding the guide RNA (sgPOL and / or sgLTR);

3. синтез направляющей РНК (sgPOL и/или sgLTR);3. synthesis of guide RNA (sgPOL and / or sgLTR);

4. очистка направляющей РНК (sgPOL и/или sgLTR).4. Cleaning the RNA guide (sgPOL and / or sgLTR).

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgLTR, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и tail L (Евроген, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgLTR, составляет 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding the sgLTR RNA guide is obtained in the amplification reaction using the 2blue PCR mixture (FBUN Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific T7pr and tail L oligonucleotides (Eurogen, Russia). The size of the amplified fragment encoding sgLTR is 62 pairs of nucleotides.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgPOL, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и tail pol (Евроген, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgPOL, составляет 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding the sgPOL RNA guide is obtained in the amplification reaction using the 2blue PCR mixture (FBUN Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific T7pr and tail pol oligonucleotides (Eurogen, Russia). The size of the amplified fragment encoding sgPOL is 62 pairs of nucleotides.

Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК:Amplification temperature profile for PCR products encoding RNA guides:

1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;1. denaturation: 95 ° C for 3 minutes;

2. 35 циклов амплификации:2. 35 cycles of amplification:

95°С - 15 сек,95 ° C - 15 sec,

55°С - 45 сек,55 ° C - 45 sec,

72°С - 30 сек;72 ° C - 30 sec;

3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.3. final elongation: 72 ° C for 5 minutes.

Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК sgPOL и/или sgLTR, проводят с использованием коммерчески доступного набора ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК sgPOL и/или sgLTR, используют в качестве матрицы для синтеза направляющей РНК.Purification of PCR products encoding sgPOL and / or sgLTR RNA guides is carried out using a commercially available ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, USA) according to the manufacturer's instructions. Purified PCR products encoding sgPOL and / or sgLTR RNA guides are used as a template for synthesizing the RNA guide.

Синтез направляющих РНК sgPOL и/или sgLTR осуществляют методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ Т7 HighYield RNA SynthesisKit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждают из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 mM и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК.The synthesis of sgPOL and / or sgLTR RNA guides is carried out by in vitro transcription using commercially available reagent kits (HiScribe ™ T7 HighYield RNA SynthesisKit, NEB, USA) according to the manufacturer's instructions. In vitro transcription reaction products are reprecipitated from the reaction mixture by adding sodium chloride to a final concentration of 400 mM and an equal volume of isopropyl alcohol. Such modifications of the manufacturer’s protocol made by the authors make it possible to increase the yield of the reaction product and obtain the desired concentration of the final preparation of the RNA guide.

Создание готового рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего белок семейства CRISPR/CAS AsCpf1 из Acidaminococcus и/или LbCpf1 из Lachnospiraceae, и направляющую РНК, авторы проводят по стандартному протоколу с некоторыми модификациями (In vitro enzymology of Cas9 // Anders C, Jinek M. MethodsEnzymol. 2014; 546:1-20. doi: 10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5).The creation of a ready ribonucleoprotein complex containing a protein of the CRISPR / CAS AsCpf1 family from Acidaminococcus and / or LbCpf1 from Lachnospiraceae, and RNA directing, the authors carried out according to the standard protocol with some modifications (In vitro enzymology of Cas9 // Anders C, Jinek M. Methods Enz. ; 546: 1-20. Doi: 10.1016 / B978-0-12-801185-0.00001-5).

Непосредственно перед объединением с CAS-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 нг) прогревают при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов CAS-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса.Immediately before combining with the CAS protein, the RNA guide preparation (in the amount of 250 ng) is heated at 90 ° C for 5 minutes and allowed to cool slowly to room temperature (incubation at room temperature for at least 10 minutes). Such heating is necessary to form the correct conformation of the studs contained in the RNA guide. Many manufacturers of commercial preparations of CAS proteins skip this step in the preparation of the ribonucleoprotein complex.

Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 нг CAS-белка AsCpf1 из Acidaminococcus и/или LbCpf1 из Lachnospiraceae и подготовленную направляющую РНК смешивают и инкубируют 15 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).To form the finished ribonucleoprotein complex, 250 ng of AsCpf1 CAS protein from Acidaminococcus and / or LbCpf1 from Lachnospiraceae and the prepared RNA guide are mixed and incubated for 15 minutes at room temperature. The ribonucleoprotein complex obtained in this way is ready for detection of the proviral DNA of the human immunodeficiency virus (HIV-1).

ПРИМЕР 4: ОБНАРУЖЕНИЕ ПРОВИРУСНОЙ ДНК ВИЧ-1 С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS.EXAMPLE 4: DETECTION OF HIV-1 PROVIRUS DNA BY CRISPR / CAS RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEXES.

Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, используют в качестве матрицы для обнаружения провирусной ДНК ВИЧ-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, полученных способом, описанным в Примере 3.Pre-amplified material obtained by the method described in Example 2 is used as a template for detection of HIV-1 proviral DNA using CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes obtained by the method described in Example 3.

Для обнаружения провирусной ДНК ВИЧ-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS готовят реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:To detect HIV-1 proviral DNA using CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes, a reaction mixture is prepared containing the following components:

• 10× буфер (100 mM TrisHCl рН 8,0,1 М NaCl);• 10 × buffer (100 mM TrisHCl pH 8.0.1 M NaCl);

• 50 mM MgCl2 (конечная концентрация в реакционной смеси 10 mM);• 50 mM MgCl 2 (final concentration in the reaction mixture is 10 mM);

• 250 нг рибонуклеопротеинового комплекса (AsCpf1 из Acidaminococcus и/или LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющие РНК sgPOL и/или sgLTR);• 250 ng of ribonucleoprotein complex (AsCpf1 from Acidaminococcus and / or LbCpf1 from Lachnospiraceae and sgPOL and / or sgLTR RNA guides);

• 20 pmol флуоресцентный зонд (6FAM-TTATT-BHQ1);• 20 pmol fluorescence probe (6FAM-TTATT-BHQ1);

• Мишень (предварительно амплифицированный фрагмент ДНК ВИЧ-1 LTR и/или POL);• Target (pre-amplified HIV-1 LTR and / or POL DNA fragment);

• вода mQ.• water mQ.

Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещают в амплификатор ДТПрайм 5 (ДНК-Технология, Россия) и задают следующие параметры реакции:Reaction mixtures containing all the necessary components are placed in a DTPrime 5 amplifier (DNA-Technology, Russia) and the following reaction parameters are set:

30-60 циклов:30-60 cycles:

37°С - 35 сек,37 ° C - 35 sec,

37°С - 25 сек, съемка флуоресценции.37 ° C - 25 sec, fluorescence imaging.

В первую очередь была предпринята попытка обнаружения провирусной ДНК ВИЧ-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, сформированных на основе AsCpf1 из Acidaminococcus и LbCpf1 из Lachnospiraceae. Было показано, что оба типа рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS обладают способностью выявлять ДНК ВИЧ-1. Типичные результаты анализа приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени POL, обработанной рибонуклеопротеиновыми комплексами, содержащими направляющую РНК sgPOL и белки AsCpf1 и LbCpf1, на Фиг. 3 и Фиг. 4, соответственно.First of all, an attempt was made to detect HIV-1 proviral DNA using CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes formed on the basis of AsCpf1 from Acidaminococcus and LbCpf1 from Lachnospiraceae. Both types of CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes have been shown to be capable of detecting HIV-1 DNA. Typical analysis results are shown by real-time fluorescence profiles for a pre-amplified POL target treated with ribonucleoprotein complexes containing sgPOL RNA guide and AsCpf1 and LbCpf1 proteins, FIG. 3 and FIG. 4, respectively.

В ходе работ был оценен предел обнаружения провирусной ДНК ВИЧ-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, сформированных на основе AsCpf1 из Acidaminococcus и LbCpf1 из Lachnospiraceae. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS обладают способностью выявлять до 1 фг ДНК ВИЧ-1 (что соответствует 65 копиям ДНК, внесенным в реакцию предварительной амплификации). Уже на 30-ом цикле (30 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) вдвое. Типичные результаты анализа приведены на Фиг. 5 на примере профиля флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени LTR, обработанной рибонуклеопротеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgLTR и белок LbCpf1.In the course of the work, the detection limit of HIV-1 proviral DNA was estimated using CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes formed on the basis of AsCpf1 from Acidaminococcus and LbCpf1 from Lachnospiraceae. It was shown that the CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes have the ability to detect up to 1 fg of HIV-1 DNA (which corresponds to 65 copies of DNA introduced into the preliminary amplification reaction). Already at the 30th cycle (30 minutes) of analysis, the signal value exceeded the value of “noise” (non-specific fluorescence of a control sample containing no target) by half. Typical analysis results are shown in FIG. 5 using an example of a real-time fluorescence profile for a pre-amplified LTR target treated with a ribonucleoprotein complex containing sgLTR RNA guide and LbCpf1 protein.

Была проведена оптимизация анализа. На первом этапе проведен эксперимент по изменению объема (количества) вносимой в анализ предварительно амплифицированной мишени. Было показано, что увеличение количества вносимой мишени не приводит к существенным изменениям значений флуоресценции в образце с минимальным количеством анализируемого материала (1 фг ДНК ВИЧ-1, что соответствует 65 копиям ДНК, внесенным в реакцию предварительной амплификации). Типичные результаты анализа приведены на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней LTR и POL, обработанных рибонуклеопротеиновыми комплексами, содержащими белок LbCpf1 и направляющие РНК sgLTR и sgPOL, на Фиг. 6 и Фиг. 7, соответственно.The analysis was optimized. At the first stage, an experiment was conducted to change the volume (quantity) of a pre-amplified target introduced into the analysis. It was shown that an increase in the number of introduced targets does not lead to significant changes in fluorescence values in the sample with a minimum amount of analyzed material (1 fg HIV-1 DNA, which corresponds to 65 copies of DNA introduced into the preliminary amplification reaction). Typical assay results are exemplified by endpoint fluorescence values (60 assay cycle, 60 minutes) for pre-amplified LTR and POL targets treated with ribonucleoprotein complexes containing LbCpf1 protein and sgLTR and sgPOL RNA guides, in FIG. 6 and FIG. 7, respectively.

На втором этапе проведен эксперимент по комбинированию вносимых в анализ предварительно амплифицированных мишеней LTR и POL. Показано, что комбинирование вносимых в анализ мишеней не приводит к существенным изменениям значений флуоресценции в конечной точке в образце с минимальным количеством анализируемого материала (1 фг ДНК ВИЧ-1, что соответствует 65 копиям ДНК, внесенным в реакцию предварительной амплификации). Стоит отметить, что уже на 30-ом цикле (30 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) вдвое, а к 60 циклу анализа - более чем в 3 раза. Типичные результаты анализа приведены на Фиг. 8 на примере профиля флуоресценции в реальном времени для смеси предварительно амплифицированных мишеней LTR и POL, обработанных смесью рибонуклеопротеиновых комплексов, содержащих направляющие РНК sgLTR и sgPOL и белок LbCpf1.At the second stage, an experiment was carried out to combine the pre-amplified LTR and POL targets introduced into the analysis. It was shown that the combination of the targets introduced into the analysis does not lead to significant changes in the fluorescence values at the end point in the sample with a minimum amount of the analyzed material (1 fg HIV-1 DNA, which corresponds to 65 copies of DNA introduced into the preliminary amplification reaction). It is worth noting that already at the 30th cycle (30 minutes) of analysis, the signal value exceeded the value of “noise” (non-specific fluorescence of a control sample containing no target) by half, and by the 60th cycle of analysis more than 3 times. Typical analysis results are shown in FIG. 8 using an example of a real-time fluorescence profile for a mixture of pre-amplified LTR and POL targets treated with a mixture of ribonucleoprotein complexes containing sgLTR and sgPOL RNA guides and LbCpf1 protein.

На третьем этапе проведен эксперимент по изменению температуры анализа. Показано, что при 25°С и 42°С рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS способны обнаруживать до 10 фг ДНК ВИЧ-1 (что соответствует 650 копиям ДНК, внесенным в реакцию предварительной амплификации). Причем, на 60-ом цикле (60 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) в 4,6 раз, в случае проведения анализа при 42°С, и в 2,9 раз, в случае проведения анализа при 25°С. Оптимальной температурой для проведения анализа является 37°С, поскольку рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS способны обнаруживать до 1 фг ДНК ВИЧ-1 (что соответствует 65 копиям ДНК, внесенным в реакцию предварительной амплификации) и значение сигнала превышает значение «шума» более чем в 2,5 раза. Типичные результаты анализа приведены на Фиг. 9 на примере значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированной мишени LTR, обработанной рибонуклеопротеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgLTR и белок LbCpf1.At the third stage, an experiment was conducted to change the analysis temperature. It was shown that at 25 ° C and 42 ° C the CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes are capable of detecting up to 10 fg of HIV-1 DNA (which corresponds to 650 copies of DNA introduced into the preliminary amplification reaction). Moreover, at the 60th cycle (60 minutes) of analysis, the signal value exceeded the value of “noise” (nonspecific fluorescence of a control sample containing no target) by 4.6 times, in the case of analysis at 42 ° C, and 2.9 times , in the case of analysis at 25 ° C. The optimal temperature for analysis is 37 ° C, since CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes are capable of detecting up to 1 fg of HIV-1 DNA (which corresponds to 65 copies of DNA introduced into the preliminary amplification reaction) and the signal value exceeds the “noise” value by more than 2 , 5 times. Typical analysis results are shown in FIG. 9 by the example of endpoint fluorescence values (60 analysis cycle, 60 minutes) for a pre-amplified LTR target treated with a ribonucleoprotein complex containing sgLTR RNA guide and LbCpf1 protein.

ПРИМЕР 5: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ ПРОВИРУСНОЙ ДНК ВИЧ-1 С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS.EXAMPLE 5: DETECTION OF SINGLE COPIES OF HIV-1 VIRUS DNA BY CRISPR / CAS RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEXES.

Для обнаружения единичных копий провирусной ДНК ВИЧ-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS было принято решение оптимизировать процесс предварительной амплификации за счет увеличения количества циклов.To detect single copies of HIV-1 proviral DNA using CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes, it was decided to optimize the preliminary amplification process by increasing the number of cycles.

Для предварительной амплификации титруют модельную матрицу провирусной ДНК ВИЧ-1pNL4-3 путем приготовления дополнительных серийных разведений (Таблица 4).For preliminary amplification, a model matrix of HIV-1pNL4-3 proviral DNA is titrated by preparation of additional serial dilutions (Table 4).

Figure 00000004
Figure 00000004

ПЦР-продукты, кодирующие фрагменты гена вирусной полимеразы POL и длинного концевого повтора LTR, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) как описано в Примере 2.PCR products encoding fragments of the POL virus polymerase gene and LTR long terminal repeat are obtained in the amplification reaction using the 2blue PCR mixture (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) as described in Example 2.

Температурный профиль амплификациидля получения ПЦР-продуктов, кодирующих фрагменты генома ВИЧ-1:Amplification temperature profile to obtain PCR products encoding fragments of the HIV-1 genome:

1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;1. denaturation: 95 ° C for 3 minutes;

2. 30, 35 или 40 циклов амплификации:2. 30, 35 or 40 amplification cycles:

95°С - 15 сек,95 ° C - 15 sec,

55°С - 45 сек,55 ° C - 45 sec,

72°С - 30 сек;72 ° C - 30 sec;

3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.3. final elongation: 72 ° C for 5 minutes.

Полученный таким способом материал используют в качестве матрицы для обнаружения единичных копий провирусной ДНК ВИЧ-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, полученных способом, описанным в Примере 3.The material obtained in this way is used as a matrix for the detection of single copies of HIV-1 proviral DNA using the CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes obtained by the method described in Example 3.

Обнаружение единичных копий провирусной ДНК ВИЧ-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS проводят способом, описанным в Примере 4.Detection of single copies of HIV-1 proviral DNA using CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes is carried out by the method described in Example 4.

В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS обладают способностью выявлять единичные копии ДНК ВИЧ-1. Увеличение количества циклов предварительной амплификации до 35-40 позволяет обнаруживать до 2 аг ДНК ВИЧ-1 (2×10-18 г, что соответствует 1,3 копиям ДНК, внесенным в реакцию предварительной амплификации). При этом уже на 10-15 цикле (10-15 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) вдвое, а к 60 циклу анализа - более чем в 3-10 раз, при внесении в анализ материала, предварительно амплифицированного в течение 35 циклов. Типичные результаты анализа приведены на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней LTR и POL, обработанных рибонуклеопротеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgLTR и sgPOL и белок LbCpf1, на Фиг. 10 и Фиг. 11, соответственно.In the course of the analysis, it was shown that the CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes have the ability to detect single copies of HIV-1 DNA. An increase in the number of preliminary amplification cycles to 35–40 makes it possible to detect up to 2 ag of HIV-1 DNA (2 × 10 -18 g, which corresponds to 1.3 copies of DNA introduced into the preliminary amplification reaction). Moreover, already at the 10-15th cycle (10-15 minutes) of the analysis, the signal value exceeded the “noise” value (nonspecific fluorescence of the control sample containing no target) by half, and by the 60th cycle of analysis more than 3-10 times, when introduced in the analysis of material pre-amplified for 35 cycles. Typical analysis results are shown by way of endpoint fluorescence values (60 assay cycle, 60 minutes) for pre-amplified LTR and POL targets treated with ribonucleoprotein complexes containing sgLTR and sgPOL RNA guides and LbCpf1 protein, in FIG. 10 and FIG. 11, respectively.

Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют ультрачувствительно выявлять единичные копии провирусной ДНК ВИЧ-1 в образце после предварительной амплификации в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS.Thus, the developed RNA guides allow ultra-sensitive detection of single copies of HIV-1 proviral DNA in a sample after preliminary amplification as part of CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes.

Figure 00000005
Figure 00000005

Figure 00000006
Figure 00000006

Figure 00000007
Figure 00000007

Figure 00000008
Figure 00000008

Figure 00000009
Figure 00000009

Figure 00000010
Figure 00000010

Figure 00000011
Figure 00000011

Figure 00000012
Figure 00000012

Claims (9)

1. Способ обнаружения провирусной ДНК ВИЧ-1, интегрированной в геном человека, содержащий:1. A method for detecting HIV-1 proviral DNA integrated into a human genome, comprising: i) проведение предварительной амплификации материала образца от пациента, предположительно содержащего провирусную ДНК ВИЧ-1, интегрированную в геном человека, с использованием одного или нескольких специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 3-6, с целью получения мишени – предварительно амплифицированного фрагмента ДНК ВИЧ-1,i) pre-amplification of the sample material from a patient, presumably containing HIV-1 proviral DNA, integrated into the human genome, using one or more specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 3-6, in order to obtain a target - a pre-amplified DNA fragment HIV-1 ii) приготовление реакционной смеси для детекции, содержащей мишень, полученную на стадии (i); рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/CAS, сформированный из по меньшей мере одной РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы, выбранной из AsCpf1 из Acidaminococcus и/или LbCpf1 из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК c SEQ ID NO:1 или 2; флюоресцентный зонд и буфер для детекции,ii) preparing a detection reaction mixture containing a target obtained in step (i); CRISPR / CAS ribonucleoprotein complex formed from at least one RNA-guided DNA endonuclease selected from AsCpf1 from Acidaminococcus and / or LbCpf1 from Lachnospiraceae and at least one RNA guide with SEQ ID NO: 1 or 2; fluorescent probe and detection buffer, iii) проведение 30-60 циклов детекции в реакционной смеси, полученной на стадии (ii), в амплификаторе,iii) conducting 30-60 cycles of detection in the reaction mixture obtained in stage (ii), in the amplifier, с обнаружением таким образом провирусной ДНК ВИЧ-1, интегрированной в геном человека.with the discovery in this way of HIV-1 proviral DNA integrated into the human genome. 2. Способ по п.1, где предварительно амплифицированный фрагмент ДНК ВИЧ-1 представлен LTR и/или POL ВИЧ-1.2. The method according to claim 1, where the pre-amplified HIV-1 DNA fragment is represented by LTR and / or POL HIV-1. 3. Способ по п.1 или 2, где способ обеспечивает выявление провирусной ДНК ВИЧ-1, интегрированной в геном человека, в ультранизких концентрациях, вплоть до единичных копий провирусной ДНК.3. The method according to claim 1 or 2, where the method provides for the detection of HIV-1 proviral DNA integrated into the human genome at ultra low concentrations, up to single copies of proviral DNA. 4. Специфический олигонуклеотид, выбранный из SEQ ID NO: 3-6, для использования в способе по пп.1, 2 или 3 для предварительной амплификации высококонсервативного фрагмента генома ВИЧ-1, который распознается рибонуклеопротеиновым комплексом.4. A specific oligonucleotide selected from SEQ ID NO: 3-6 for use in the method according to claims 1, 2 or 3 for pre-amplification of a highly conserved fragment of the HIV-1 genome, which is recognized by the ribonucleoprotein complex. 5. Набор для использования в способе обнаружения провирусной ДНК ВИЧ-1, интегрированной в геном человека, по пп.1, 2 или 3, содержащий один или несколько специфических олигонуклеотидов по п.4, рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/CAS, сформированный из по меньшей мере одной РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы, выбранной из AsCpf1 из Acidaminococcus и/или LbCpf1 из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК c SEQ ID NO:1 или 2; флюоресцентный зонд, буфер для детекции и инструкцию по применению. 5. A kit for use in a method for detecting HIV-1 proviral DNA integrated into a human genome according to claims 1, 2 or 3, containing one or more specific oligonucleotides according to claim 4, a CRISPR / CAS ribonucleoprotein complex formed from at least at least one RNA-directed DNA endonuclease selected from AsCpf1 from Acidaminococcus and / or LbCpf1 from Lachnospiraceae, and at least one RNA guide with SEQ ID NO: 1 or 2; fluorescent probe, detection buffer and instructions for use.
RU2019141298A 2019-12-13 2019-12-13 Method for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into human genome in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in method RU2720767C1 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019141298A RU2720767C1 (en) 2019-12-13 2019-12-13 Method for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into human genome in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in method
PCT/RU2020/050300 WO2021118408A1 (en) 2019-12-13 2020-10-28 Method for detecting proviral hiv dna, and oligonucleotides

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019141298A RU2720767C1 (en) 2019-12-13 2019-12-13 Method for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into human genome in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2720767C1 true RU2720767C1 (en) 2020-05-13

Family

ID=70735470

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019141298A RU2720767C1 (en) 2019-12-13 2019-12-13 Method for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into human genome in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in method

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2720767C1 (en)
WO (1) WO2021118408A1 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009017743A3 (en) * 2007-07-30 2010-11-18 Argos Therapeutics, Inc. Improved primers and probes for the amplification and detection of hiv gag, rev and nef polynucleotides
RU2018101666A (en) * 2015-06-18 2019-07-19 Те Брод Инститьют Инк. NEW ENZYMES AND CRISPR SYSTEMS

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009017743A3 (en) * 2007-07-30 2010-11-18 Argos Therapeutics, Inc. Improved primers and probes for the amplification and detection of hiv gag, rev and nef polynucleotides
RU2018101666A (en) * 2015-06-18 2019-07-19 Те Брод Инститьют Инк. NEW ENZYMES AND CRISPR SYSTEMS

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN J.S. et al., CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity, Science, 2018, v.360, n.6387, p.436-439. *
MA Y. et al., Live Visualization of HIV-1 Proviral DNA Using a Dual-Color-Labeled CRISPR System, Anal. Chem., 2017,v.89, n.23, p.12896-12901. *
MA Y. et al., Live Visualization of HIV-1 Proviral DNA Using a Dual-Color-Labeled CRISPR System, Anal. Chem., 2017,v.89, n.23, p.12896-12901. CHEN J.S. et al., CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity, Science, 2018, v.360, n.6387, p.436-439. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021118408A1 (en) 2021-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2720767C1 (en) Method for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into human genome in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in method
RU2720768C1 (en) Crispr-cas system for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into a human genome in ultra-low concentrations
RU2720769C1 (en) Method of producing a preparation of a ribonucleoprotein complex of crispr / cas and a preparation for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into a human genome in ultra-low concentrations
CN106191310A (en) A kind of primer combination simultaneously differentiating 3 kinds of calf diarrhea pathogen and GeXP detection method
RU2802783C1 (en) Crispr-cas12 system for detecting human immunodeficiency virus (hiv-1) rna in ultra-low concentrations in ultra-low concentrations
RU2802079C1 (en) Method of detection of rna of hepatitis c virus genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method
RU2802781C1 (en) Method of obtaining a preparation of the ribonucleoprotein complex crispr-cas12 and a preparation for detecting human immunodeficiency virus (hiv-1) rna in ultra-low concentrations
RU2782700C1 (en) Crispr-cas12 system for detection of hepatitis b virus dna at ultra-low concentrations
RU2782951C1 (en) Method for detecting the dna of the hepatitis b virus at ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method
RU2800420C1 (en) Method of detection of rna of hepatitis c virus genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method
RU2734520C1 (en) Method for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in the method
RU2800421C1 (en) Crispr-cas12 system for detecting hepatitis c virus rna genotypes 1b and 3a at ultra-low concentrations
RU2743861C1 (en) Crispr-cas system for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metallo-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa at ultra-low concentrations
RU2747820C1 (en) Crispr-cas system for detection of john cunningham virus (jcpyv) dna at ultra-low concentrations
RU2747819C1 (en) Method for obtaining preparation of ribonucleoprotein complex crispr / cas and preparation for detecting dna of john cunningham virus (jcpyv) in ultra-low concentrations
RU2747880C1 (en) Method for detecting dna of john cunningham virus (jcpyv) at ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in method
RU2745637C1 (en) Method for obtaining the crispr/cas ribonucleoprotein complex preparation and preparation for detection of the blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa antibiotic resistance gene in ultra-low concentrations
RU2799430C1 (en) Method of producing a preparation of a ribonucleoprotein complex crispr-cas and a preparation for detecting hepatitis c virus rna of genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations
RU2764022C1 (en) METHOD FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA AT ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN THE METHOD
RU2782739C1 (en) METHOD FOR PRODUCING A PREPARATION OF A RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX CRISPR-Cas AND A PREPARATION FOR DETECTING THE exoU GENE ENCODING AN EXOTOXIN OF THE THIRD TYPE SECRETION SYSTEM, PSEUDOMONAS AERUGINOSA
RU2764024C1 (en) METHOD FOR OBTAINING A PREPARATION OF THE RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX CRISPR / Cas14 AND A PREPARATION FOR DETECTING THE RNA OF THE SARS-CoV-2 VIRUS IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS
RU2791879C1 (en) Crispr-cas12 system for detecting the exou gene encoding the type 3 secretion system exotoxin, pseudomonas aeruginosa, at ultra-low concentrations
RU2792891C1 (en) METHOD FOR PRODUCING AN AGENT OF THE RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX CRISPR-Cas12 AND AGENT FOR DETECTING THE DNA OF THE HEPATITIS B VIRUS IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS
RU2764020C1 (en) CRISPR-CAS14 SYSTEM FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA AT ULTRA-LOW CONCENTRATIONS
RU2764023C1 (en) CRISPR-Cas 12 SYSTEM FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS

Legal Events

Date Code Title Description
HE4A Change of address of a patent owner

Effective date: 20200824