WO2021193847A1 - 海水を用いたｐｈａの製造方法 - Google Patents
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- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
Definitions
- the present invention relates to a novel method for producing a PHA (polyhydroxyalkanoate) copolymer.
- the present invention also relates to a method of using surplus seawater.
- Biomass plastics and biodegradable plastics can be mentioned as solutions to such problems.
- Biomass plastic is a plastic whose raw material is not fossil fuel but biomass such as squeezed waste such as corn and sugar cane and wood, and biodegradable plastic is decomposed into water and carbon dioxide by the power of microorganisms in the environment after use. It is a plastic.
- PHA Polyhydroxyalkanoates
- Patent Document 2 A technique using seawater for the synthesis of PHA is also known (Patent Document 2, Patent Document 4).
- An object of the present invention is to provide a new method for producing PHA.
- the present invention relates to at least the following inventions: [1] Method for producing polyhydroxyalkanoic acid, which comprises the following steps: (A) A step of culturing a microorganism using a medium containing seawater; and (b) a step of obtaining polyhydroxyalkanoate as a culture product in the culture. [2] The production method according to [1], wherein the medium contains NaCl other than NaCl derived from seawater. [3] The production method [4] according to [1] or [2], wherein the halophilic bacterium is a highly halophilic bacterium.
- the ratio of the number of moles of 3-hydroxyvaleryl acid (3HV fraction) to the total number of moles of 3-hydroxybutanoic acid and 3-hydroxyvaleryl acid constituting the copolymer is 5.0% to 40.
- [7] Contains sugar as a carbon source, and the sugar is (a) glucose and / or its derivatives only (b) glucose and its derivatives and one from xylose, cellobiose, glucuronic acid, arabinose, mannose, galactose, sucrose and their derivatives. Species or two or more, or (c) one or more polyhydroxyalkanoic acids from xylose, cellobiose, glucuronic acid, arabinose, mannose, galactose, sucrose and derivatives thereof, according to [6]. Manufacturing method. [8] The production method according to any one of [1] to [7], wherein the weight average molecular weight of polyhydroxyalkanoate is greater than 3.61 million.
- [13] Use of seawater in a method for producing polyhydroxyalkanoates including the following steps: (A) A step of culturing halophilic bacteria using a medium containing concentrated seawater or unconcentrated seawater; and (b) a step of obtaining polyhydroxyalkanoate as a culture product in the culture. [14] A method for producing polyhydroxyalkanoate, which comprises culturing halophilic bacteria in a medium containing seawater to obtain polyhydroxyalkanoate as a culture product.
- the carbon source in the culture contains sugar and furfural compounds, and the sugar is (a) glucose and / or its derivatives only (b) glucose and its derivatives and xylose, cellobiose, glucuronic acid, arabinose, mannose, galactose, sucrose. And one or more of them, or (c) one or more of xylose, cellobiose, glucuronic acid, arabinose, mannose, galactose, glucose and their derivatives. [15] A method of culturing halophilic bacteria using a medium containing seawater to control the molecular weight of polyhydroxyalkanoate obtained as a culture product.
- the carbon source in the culture contains sugar and furfural compounds, and the sugar is (a) glucose and / or its derivatives only (b) glucose and its derivatives and xylose, cellobiose, glucuronic acid, arabinose, mannose, galactose, sucrose. And one or more of them, or (c) one or more of xylose, cellobiose, glucuronic acid, arabinose, mannose, galactose, glucose and their derivatives.
- Any of the above-mentioned production methods further comprising NaCl not derived from artificial seawater, NaCl not derived from deep sea water, or NaCl not derived from natural seawater.
- a method for producing PHA using a material that has not been used conventionally is provided.
- all of the methods disclosed in such reports merely disclose media intended for the growth of highly eophilic bacteria, and the production of PHA.
- the concentrations of various components are used while being maintained at the initial concentration or a predetermined concentration, and PHA is not produced using concentrated seawater. That is, it has not been known so far that PHA is produced using seawater, particularly concentrated seawater.
- Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2016-185087 describes a method of diluting concentrated seawater with water and using it for culturing algae. However, there is no description or suggestion in the same document about the use of concentrated seawater as it is or the use of halophilic bacteria.
- Patent Document 2 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2018-133997 describes a method for causing marine photosynthetic bacteria living in seawater to produce PHA, using seawater as a medium, and reducing the risk of contamination in a high-salt medium. Is disclosed. However, there is no description about halophilic bacteria in the same document, and there is no description about using concentrated seawater.
- Patent Document 3 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2014-5121944 merely discloses a method for producing salt containing a useful component contained in algae using concentrated seawater.
- Patent Document 4 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2012-210165 describes a PHA-producing bacterium isolated from the deep sea, the composition used remains at a concentration substantially the same as that of seawater.
- Non-Patent Document 1 Macromolecular Bioscience 2007, 7, 218) discloses that 77.8 g / L of PHA can be produced by culturing using Haloferax mediterranei. However, there is no description about seawater in the same document, much less concentrated seawater (concentrated seawater).
- halophilic bacteria preferably highly halophilic bacteria
- the characteristic of water resources is that they are renewable, but the areas are unevenly distributed during the period, and securing water for domestic use is an unavoidable issue for a healthy and cultural life in areas suffering from water shortages. .. Even in Japan, there are many areas that have been suffering from water shortages, such as Inami Town in Hyogo Prefecture, Kagawa Prefecture, Chita Peninsula and Atsumi Peninsula in Aichi Prefecture, Kujukuri Area in Chiba Prefecture, and Minami Boso Area.
- Water utilization facilities such as irrigation canals and water utilization facilities for accurate distribution of water such as cylindrical diversion have been constructed.
- the problem caused by the shortage of domestic water has been almost solved in Japan, but overseas, for example, in areas with limited water resources such as the Middle East, it is difficult to secure domestic water due to rain.
- agriculture is difficult in the first place, so agricultural products are procured by import, but methods for securing domestic water, such as seawater desalination, are powerful and important methods.
- the present invention enables the reuse of concentrated seawater, which is a problem in the Middle East and other parts of the world, enables the production of useful substances at low cost, and contributes to the protection of the abundance of the ocean. be.
- Haloarchaea highly halophilic bacteria
- cells that produce PHA in a high-concentration sodium chloride aqueous solution can be lysed in a low-concentration sodium chloride aqueous solution or in water after production, and the PHA stored in the cells can be taken out.
- PHA uses a large amount of an organic solvent, a surfactant, etc.
- the growth of the target microorganism can be promoted and the production efficiency of PHA can be improved by increasing the concentration of salts higher than that of ordinary seawater or a known medium. it is conceivable that.
- the molecular weight of PHA in the present specification is a numerical value measured by gel filtration chromatography using a polystyrene standard unless otherwise specified.
- the symbol "-" represents a numerical range (including the two numerical values) specified by a range between two numerical values connected by the symbol.
- the description "200,000 to 6 million” means a range composed of all numerical values existing between 200,000 and 6 million, including 200,000 and 6 million. In order to express the same meaning, the notation "200,000 or more and 6 million or less" may be used.
- a numerical value specified by including a range of numerical values understood by those skilled in the art is intended.
- the method for producing PHA of the present invention is as follows: Method for producing polyhydroxyalkanoic acid, which comprises the following steps: (A) A step of culturing a microorganism using a medium containing seawater; and (b) a step of obtaining polyhydroxyalkanoate as a culture product in the culture.
- the seawater used in the present invention is not limited.
- Seawater obtained using artificial seawater examples include (ii) deep sea water and (iii) natural seawater.
- the seawater used in the present invention one or more of the above seawaters (i) to (iii) may be mixed and used in an arbitrary ratio.
- the origin of (ii) deep sea water or (iii) natural seawater used in the present invention is not limited.
- the type of deep sea water used in the present invention is not limited, and examples thereof include seawater collected from a point having a depth of about 200 m or more.
- natural seawater means seawater other than (ii) deep seawater among naturally derived seawater. It is known that the content ratio of each metal salt in naturally-derived seawater is generally constant regardless of the place of collection.
- concentrated seawater sometimes referred to as “concentrated seawater” or “concentrated seawater” in the present specification
- unconcentrated seawater may also be used as an alternative to the concentrated seawater described below.
- the production method of the present invention using unconcentrated seawater does not require pretreatment of the collected seawater, and has advantages such as low work load and low cost.
- the concentrated seawater in the present invention (1) A composition in which only the water content of seawater collected from the sea is reduced without changing the amount of the contained components. (2) A composition obtained by concentrating seawater (composition) obtained from an artificial seawater composition, or a composition obtained by preparing an artificial seawater composition with a water content smaller than a predetermined water content. (3) A composition obtained by concentrating or diluting an aqueous solution containing salt collected from a place with salt water other than the ocean, such as a salt lake, to an appropriate or desired degree without changing the absolute amount of the contained components. Those adjusted to a higher salt concentration than ordinary seawater, and (4) compositions having the same composition as the compositions (1) to (3) above, or the same as the compositions (1) to (3).
- the salt concentration in these compositions is greater than about 3.5%.
- seawater collected from the sea is not limited, and includes seawater having a salt concentration of about 3.5%, seawater having a salt concentration of less than about 3.5%, and seawater having a high salt concentration.
- salt concentration or “salt concentration” of seawater or the like in the present specification contains about 78% sodium chloride, which is usually used in the present technical field, and other salts include magnesium chloride, magnesium sulfate, calcium sulfate, and the like.
- the concentration of salt in seawater or the like that is, the portion composed of salts, which contains about 21% to 22% of inorganic salts such as potassium chloride.
- the salt concentration of the concentrated seawater include 3.5% to 20%, preferably 7% to 14%.
- The% used in the notation of the concentration of seawater in the present invention is defined by w / v unless otherwise specified.
- the composition itself in which the proportion of the composition is relatively higher due to the evaporation of water is the present invention. It differs from the composition as concentrated seawater.
- the composition obtained by concentrating the seawater when a composition in which only the water content is reduced in seawater collected from the sea as concentrated seawater without changing the amount of the contained components is used, that is, the composition obtained by concentrating the seawater.
- the method of concentration is not limited, and a method of heat concentration, a method of using a reverse osmosis membrane, a method of concentrating by an ion exchange membrane electrodialysis method, or the like may be used.
- water may be added as needed to adjust the degree of concentration.
- the type of artificial seawater is not limited, and commercially available artificial seawater may be used for preparation.
- commercially available artificial seawater sources include Daigo Artificial Seawater SP for marine microalgae, Red Sea Salt, Artificial Seawater Marine Art, Artificial Seawater Tetra Marine Salt, and Instant Ocean.
- the concentrated seawater in the present invention a composition obtained by concentrating deep sea water or natural seawater may be used.
- the medium contains an artificial seawater element and NaCl not derived from the artificial seawater element because it contributes to the production of high molecular weight PHA and the increase in the production amount of PHA.
- the method of the present invention containing artificial seawater obtained by using an artificial seawater element at a concentration higher than the concentration usually used for producing artificial seawater is also preferable.
- the medium contains NaCl that is not derived from deep sea water or natural seawater because it contributes to the production of high molecular weight PHA.
- a medium using a known medium whose composition is partially defined by the components contained in the seawater is exemplified, and NBRC (Independent Administrative Institution Product Evaluation Technology Infrastructure Organization Bio) A modified version of No.1214 or No.1338 in the medium list (https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/culture-list.html) published on the website of the Technology Center). Is preferable.
- the composition of these media is as follows:
- the above (1) to (4) in addition to the medium using the compositions exemplified in the above (1) to (4), in the known medium for culturing microorganisms, the above (1) to (4) Those in which the amount of trace metal salts contained in the medium using the illustrated composition is about 1/32 to about 4 times are included.
- An example of such a medium is Daigo artificial seawater SP for marine microalgae, which is artificial seawater whose components are defined.
- the concentrations (mg / L) of salts other than sodium chloride (trace metal salts, etc.) in Daigo artificial seawater SP are as follows.
- a medium containing one or two or more of these metal salts in an amount of 1.5 times or more the value in the above table may be used, and a medium containing 3 times or more of the values may be used. Is preferable, and a medium containing about 4 times the amount is more preferable.
- one or two or more of the metals contained in these metal salts are 1.5 times or more the amount corresponding to the amount of the metal salt indicated by the values in the above table.
- a medium containing a salt different from the metal salt shown in the above table may be used, a medium containing 3 times or more the amount is preferable, and a medium containing about 4 times the amount is more preferable.
- unconcentrated seawater or concentrated seawater may be used as it is without adding one or more of specific salts to seawater or medium, or in a reduced amount. ..
- Such an embodiment makes it possible to replace the salts required as a component of the medium with a component of seawater, which is advantageous in terms of cost and labor for preparing the medium, which is preferable.
- Substitutable salts are not limited, and examples thereof include calcium salt, magnesium salt, potassium salt, and iron chloride.
- a medium can also be prepared by appropriately adding salts to unconcentrated seawater or concentrated seawater.
- the salts to be added are not limited as long as they are necessary for the growth of the microorganism used or promote the growth, and inorganic salts and organic salts are exemplified.
- examples of such salts include: -Inorganic salts such as NH 4 Cl, KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 , FeCl 3 , NaCl, MgCl 2 , DDL 4 , CaCl 2 , KCl, LVDS 3 , NaBr and Na 2 SO 4 and their hydrates; -Organic salts such as sodium citrate, disodium citrate, sodium glutamate, trisodium citrate, nitrilotriacetic acid, and their hydrates.
- the type and amount of the above salts in the medium used in the production method of the present invention are not limited.
- the following amounts (g / L) are exemplified for NH 4 Cl, KH 2 PO 4 , FeCl 3 , KCl, LVDS 3, NaCl and NaCl, respectively: NH 4 Cl: 0.1 to 2.5, KH 2 PO 4 : 0.005 to 5.0, FeCl 3 : 0.00001 to 0.01, KCl: 0.3 to 3, LVDS 3 : 0.01 ⁇ 0.3, NaBr: 0.03 ⁇ 0.5, NaCl: 30 ⁇ 300.
- Examples of the total salt concentration in the production method of the present invention include 100 g / L to 300 g / L. It is preferable that the total salt concentration is 150 g / L to 250 g / L.
- a list of media https://www.nite.go.jp/) published on the website of NBRC (National Institute of Technology and Evaluation Biotechnology Center) as the medium used in the method for producing PHA of the present invention.
- the modified mediums of No.1214, No.1338, and No.1380 in nbrc / cultures / cultures / culture-list.html) are preferable.
- the medium composition of No. 1380 is quoted from the above medium list (the medium composition of No. 1214 and No. 1338 is as described above):
- microorganisms and / or viruses are alive in the concentrated seawater. It is preferable to remove these other microorganisms and / or viruses before producing PHA.
- the method of such removal is not limited, and sterilization by adding an appropriate amount of salts to increase the salt concentration, or sterilization by a known method such as autoclave or filtration sterilization may be performed.
- sugar may be added to the medium.
- Such sugars do not include sugars contained in other nutrient sources such as yeast extract.
- the sugar refers to a sugar that is supplied separately from other nutrient sources such as yeast extract.
- the sugar used in the production method of the present invention also includes derivatives of each of the above sugars.
- the sugar derivative the above-mentioned sugar is assumed to be etherified and esterified.
- the etherified derivative is a methoxylated derivative
- the esterified derivative is an acetylated derivative.
- each is exemplified.
- PHA can be produced by controlling the molecular weight of PHA to a weight average molecular weight of 1 million to 6 million, but PHA is further added by adding a furfural compound as a carbon source. As a result, a PHA having a lower molecular weight can be obtained, and a PHA having a wider molecular weight can be produced.
- the molecular weight of the produced PHA is not limited, for example, the molecular weight of the PHA is controlled to a weight average molecular weight of 200,000 to 6 million. Can be manufactured.
- the production method of the present invention in which a furfural compound is used will be further described later.
- a method of producing PHA by controlling the molecular weight of PHA to a weight average molecular weight of 1 million to 5.75 million is preferable.
- a carbon source may be added in the production method of the present invention.
- a carbon source (A) When only glucose and / or its derivative is used, the molecular weight of PHA produced tends to be large.
- the carbon source (b) one or more of glucose and its derivatives and xylose, cellobiose, glucuronic acid, arabinose, mannose, galactose, sucrose and their derivatives. When is used, the molecular weight of the produced PHA tends to be smaller than that in the case of (a) above.
- the amount of sugar used in the production method of the present invention is not limited, and is exemplified by about 5 g / L to 910 g / L.
- the amount of sugar is preferably from about 5 g / L to about 500 g / L, more preferably from about 10 g / L to 50 g / L.
- the sugar used may be added in a plurality of times.
- the number of times, the timing, and the total amount of input are not limited, and the number of times may be 2, 3, 4, 5, or 6 times or more. Further, it is also possible to continuously supply sugar, and in that case, a method of controlling the sugar concentration to be kept constant and a method of controlling the sugar supply rate to be kept constant may be used.
- the molecular weight of PHA is controlled to a broader molecular weight, for example, a weight average molecular weight of 200,000 to 6 million. PHA can be produced.
- Furfural compounds are a type of aldehyde produced from sugar as a raw material, and 5-hydroxymethylfurfural (HMF) from 6 monosaccharides and furfural from 5 monosaccharides are produced by heating the sugar under acidic conditions. Is known to produce.
- furfural is a common name for 2-furfural aldehyde.
- the "furfural compound” in the present invention means furfural, 5-hydroxymethylfurfural, and derivatives thereof.
- the elongation of the polymer chain is stopped by promoting the movement of the growth end of the polymer chain having a relatively low molecular weight by the furfural compound, and the next polymer different from the polymer is used. Since the extension of the chain is started, it can be considered that the molecular weight of the obtained PHA is smaller than that in the case where the furfural compound is not used.
- furfural compounds used in the production method or control method of the present invention in which furfural compounds are used are not limited, and furfural and 5-hydroxymethylfurfural, and derivatives thereof are exemplified.
- examples of such derivatives include 5-hydroxymethylfurancarboxylic acid, 5-hydroxyfurfuryl alcohol, furan-2,5-bismethanol and those obtained by etherifying or esterifying them.
- Methoxylation is exemplified as etherification
- acetylation and methyl esterification are exemplified as esterification.
- the sugar is one or more from glucose and its derivatives, as well as xylose, cellobiose, glucuronic acid, arabinose, mannose, galactose, sucrose and their derivatives, and the furfural compounds are furfural and / or 5-hydroxymethylfurfural.
- the production method of the present invention or the control method of the present invention, which is a derivative thereof, is preferable.
- the amount of the furfural compound used in the production method of the present invention is not limited, and the initial concentration of the culture is exemplified by about 0.01 to about 3.0 g / L.
- the initial concentration of the furfural compound is preferably 0.01 g / L to 1 g / L.
- the ratio of the amount of furfural compound used to the amount of sugar is not limited, and is exemplified by about 0.0025 to about 0.6.
- the production method of the present invention or the control method of the present invention in which the ratio of the amount of the furfural compound used to the amount of sugar is 0.01 to 0.2 is preferable.
- the microorganism used in the production method of the present invention is not limited, and halophilic bacteria are preferable as the microorganism, and halophilic bacteria are particularly preferable. This is because halophilic bacteria (including halophilic bacteria) are microorganisms suitable for culturing in the production method of the present invention, and not only have high PHA-producing ability, but also the produced PHA can be easily recovered.
- the conditions other than the above carbon source and microorganisms are not limited, and conditions usually used in the present technology and known conditions may be used.
- the medium used for culturing in the production method of the present invention may be solid, liquid or gel, but a liquid medium is preferable from the viewpoint of production speed.
- the total salt concentration is, for example, 100 g / L to 300 g / L. As described above, it is preferable that the total salt concentration is 150 g / L to 250 g / L.
- Examples of the medium used include those containing inorganic salts such as NH 4 Cl, KH 2 PO 4 , FeCl 3 , NaCl, MgCl 2 , DDL 4 , CaCl 2 , KCl, LVDS 3 and NaBr.
- inorganic salts such as NH 4 Cl, KH 2 PO 4 , FeCl 3 , NaCl, MgCl 2 , DDL 4 , CaCl 2 , KCl, LVDS 3 and NaBr.
- the types and amounts of these inorganic salts are not limited, and for example, for NH 4 Cl, KH 2 PO 4 , FeCl 3 , KCl, LVDS 3 , NaCl and NaCl, the following amounts (g / L) are exemplified.
- the nutrient source contained in the medium used for culturing the microorganism in the production method of the present invention at least one of the above sugars is used as the carbon source.
- a carbon source different from the above-mentioned sugar at the time of culturing a carbon source usually used for culturing microorganisms such as amino acids, alcohols, fats and oils, and / or fatty acids may be used.
- As amino acids glycine, alanine, phenylalanine, lysine, leucine, casamino acid, glutamic acid
- As alcohols methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, glycerol
- Oils and fats include palm oil, palm kernel oil, corn oil, palm oil, olive oil, soybean oil, and rapeseed oil
- Fatty acids include acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, caproic acid, crotonic acid, citric acid, and pyruvate and fatty acid salts such as sodium salts and ammonium salts thereof.
- the amount of the fatty acids is preferably small.
- the medium used for culturing microorganisms in the production method of the present invention may further contain a nitrogen source, inorganic salts and the like.
- the nitrogen source include ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate, as well as peptone, meat extract, yeast extract, and the like.
- inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, manganese chloride (II), cobalt chloride (II), calcium chloride, zinc chloride, and copper chloride (II).
- the temperature of culturing when culturing a microorganism in the production method of the present invention is not limited as long as the microorganism can grow, and examples thereof include about 10 ° C. to about 65 ° C., preferably 20 ° C. to 50 ° C. , 35 ° C to 45 ° C are more preferable.
- the timing of adding the carbon source, the inorganic salt, and the organic nutrient source is not limited, but generally used methods such as batch culture, fed-batch culture, and continuous culture can be used depending on the purpose. It can be appropriately selected and used.
- Examples of the culture time of microorganisms in the production method of the present invention include a long period of 24 hours to 168 hours for batch culture, 72 hours to 14 days for fed-batch culture, and more than 14 days for continuous culture. Not limited to.
- a buffer solution can be added to make the pH less likely to change during culturing.
- Examples of such a buffer solution include Tris-hydrochloric acid buffer solution, PIPES, HEPES and the like. It is preferable to use PIPES and HEPES because the buffer solution itself is difficult to be used as a nitrogen source, a carbon source, and a sulfide source during culturing.
- the concentration of the buffer solution includes 5 g / L to 40 g / L, preferably 10 to 20 g / L.
- the pH does not change easily without adjusting the pH, so it should be considered that the conditions are similar to those in a jar fermenter that keeps the pH constant. Can be done.
- basic components such as ammonia, potassium hydroxide, sodium hydroxide and tripotassium phosphate may be appropriately added.
- the pH of the medium is not limited in the production method of the present invention, it is preferable that the initial pH of the medium is about 6.5 to about 7.5. It is more preferable that the initial pH of the medium is about 6.5 to about 7.5 and the pH of the medium being cultured is maintained at about 6.5 to about 7.5. It is more preferable to set these pH to about 7.0 to about 7.4.
- control method of the present invention other culture conditions used in the production method of the present invention can also be used.
- the type of PHA product in the production method of the present invention is not limited, but is PHBV, PHB (polyhydroxybutyrate), poly (hydroxybutyrate / hydroxyhexanoate, and poly (3 hydroxybutyrate / 4-hydroxy). Butyrate) is exemplified. Of these, PHBV and / or PHB are suitable products.
- the PHA produced by the production method of the present invention can be recovered from the cells by a known method by centrifugation, filtration or precipitation using an organic solvent, a surfactant, a low-concentration sodium chloride aqueous solution or water.
- the production amount and 3HV fraction of PHA produced by the microorganism in the production method of the present invention may be measured by using a known method such as the GC-MS method.
- the second component fraction may also be determined by using a known method such as the GC-MS method.
- the concentration of glucose or its derivative, other sugars, and furfural compounds For the measurement of the concentration of glucose or its derivative, other sugars, and furfural compounds, a measurement using a commercially available concentration measurement kit or a known method such as an HPLC method may be used.
- the production amount of the microbial cells is known such as an absorbance method or a dry cell weight measurement method. It may be measured by the method.
- the molecular weight of PHA obtained by the production method of the present invention may also be measured by a known method, for example, by gel filtration chromatography using a polystyrene standard. As described above, for the molecular weight of PHA in the present specification, the numerical value measured by gel filtration chromatography using a polystyrene standard is used unless otherwise specified.
- the weight average molecular weight of PHA produced by the production method of the present invention is about 1 million to about 6 million when the furfural compound is not used, and about 200,000 to about 6 million when the furfural compound is used. Is.
- the molecular weight of PHA obtained in each range can be controlled or adjusted in the production method of the present invention.
- PHBV a copolymer in which 3-hydroxybutanoic acid (3HB) and 3-hydroxyvalerylic acid (3HV) are randomly copolymerized (hereinafter, may be referred to as "PHBV") is also provided.
- PHBV has a weight average molecular weight of more than 3.61 million, preferably a molecular weight of more than 4 million.
- the PHBV of the present invention having a molecular weight of more than 5 million is more preferable, and a PHBV having a molecular weight of more than 5.7 million is more preferable.
- the PHBV of the present invention includes the structural units shown below as any combination in which the total molecular weight of PHBV exceeds 3.61 million (m and n represent integers in the formula below):
- the structure, composition and molecular weight of the PHBV of the present invention are not limited as long as the molecular weight exceeds 3.61 million.
- the PHBV of the present invention is linear, and the PHBV of the present invention, which is at least substantially linear, is preferred.
- the PHBV of the present invention is a copolymer in which 3HB and 3HV are randomly copolymerized as described above, and a copolymer produced by alternating copolymerization of 3HB and 3HV or block copolymerization is also included.
- the molar ratio of 3-hydroxybutanoic acid and 3-hydroxyvalerylic acid constituting PHBV is not limited.
- the 3HV fraction (the ratio of the number of moles of 3-hydroxyvalerylic acid to the total number of moles of 3-hydroxybutanoic acid and 3-hydroxyvalerylic acid constituting the copolymer) is about 5.0%.
- the PHBV of the present invention which is about 40.0%, is preferable, and the PHBV of the present invention, which is about 5.0% to about 28.0%, is more preferable, and the PHBV of the present invention is about 7.0% to 18.0%.
- the PHBV of the present invention is even more preferable, and the PHBV of the present invention, which is about 9.0% to about 15.0%, is even more preferable.
- PHBVs of the present invention those having characteristics higher than those of the conventional PHBV, particularly those having characteristics such as being more flexible than the conventional PHBV and / or being more excellent in strength are preferable.
- those having excellent tensile strength are preferable.
- those whose tensile strength is further improved by cold stretching are also preferable.
- those having a tensile strength of 240 MPa or more after cold stretching are preferable, those having a tensile strength of 250 MPa or more are more preferable, and those having a tensile strength of 255 MPa or more are even more preferable.
- the present invention also provides a cold-stretched film of a copolymer having a weight average molecular weight of more than 3.61 million, in which 3-hydroxybutanoic acid and 3-hydroxyvaleryl acid are randomly copolymerized.
- a film is characterized in that it is superior in tensile strength as compared with a normal molecular weight PHBV having a weight average molecular weight of 1 million.
- the films of the present invention those having a tensile strength of 240 MPa or more are preferable, those having a tensile strength of 250 MPa or more are more preferable, and those having a tensile strength of 255 MPa or more are even more preferable.
- the above-mentioned film in which cold stretching includes the following steps is preferable because a film having excellent tensile strength can be obtained more reliably: (1) A melted film is obtained by melting a copolymer in which 3-hydroxybutanoic acid and 3-hydroxyvalerylic acid are randomly copolymerized. (2) The melted film obtained in (1) is rapidly cooled in ice water. Then, the amorphous film is prepared.
- the method for producing PHBV of the present invention is not limited as long as it is a method including the above steps (a) and (b), and is a method capable of producing PHBV having a weight average molecular weight of more than 3.61 million. good.
- a method of culturing a microorganism to obtain PHBV of the present invention as a culture product is exemplified.
- a method of using a highly halophilic bacterium as a microorganism in the culture and glucose and / or a derivative thereof as a carbon source is used.
- the method using glucose is particularly preferred. This is because according to these methods, PHBV having a weight average molecular weight of more than 3.61 million can be efficiently produced, and the produced PHBV can be easily recovered.
- the saccharides as carbon sources are (a) glucose and / or its derivative only, or (b) glucose and its derivative and xylose, cellobiose, etc.
- the PHBV of the present invention is produced by using a yeast extract without adding a carbon source other than the carbon source such as amino acids contained in the yeast extract.
- a carbon source other than the carbon source such as amino acids contained in yeast extract, the PHBV of the present invention can be produced at a lower cost.
- the guard column used was TSKgel guardcolumn Super HZ-H, and the column used was two TSK gel Super HZM-H connected in series.
- Chloroform (0.6 mL / min) was used as the mobile phase, and the column temperature was 40 ° C.
- the sample concentration was about 0.5 mg / mL, and the sample injection volume was 10 ⁇ L.
- a polystyrene standard was used to prepare the calibration curve.
- the 3-hydroxyvalerylic acid (3HV) fraction and PHBV production of the copolymer were measured using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS method) as follows (device name: Agilent 6890 /). 5973 GCMS System).
- the values of PHA production, molecular weight, and 3HV fraction specified by these methods are accurately compared with the values of PHA production, molecular weight, and 3HV fraction described in publicly known documents. Is something that can be done.
- the weight of dried cells can be measured by a known method such as a freeze-drying method.
- a method of thermally decomposing all organic substances other than the inorganic salts at a high temperature may be used.
- artificial seawater, natural seawater, and deep seawater were used as seawater.
- Daigo artificial seawater SP was used for artificial seawater
- Ishigakijima seawater was used for natural seawater.
- the components of the artificial seawater are as shown in Table 1.
- the components of natural seawater and deep sea water are as shown in Table 2.
- the components other than the compounds shown in Table 2 have not been analyzed.
- Examples 1-12 [Materials and methods] For Haloferax mediterranei, a medium was prepared with reference to NBRC designated medium No. 1214 (the component composition of NBRC designated medium No. 1214 is as described above and below).
- NBRC designated medium No. 1214 the component composition of NBRC designated medium No. 1214 is as described above and below.
- artificial seawater, natural seawater, and deep seawater were used as seawater, respectively.
- the concentration rates of seawater were 1-fold (normal seawater), 2-fold, 3-fold, and 4-fold, respectively, and sodium chloride was added in order to match the total salt concentrations. Further additions were made in the amounts shown in Table 3. 50 mL of medium was added to a 300 mL Erlenmeyer flask, and the cells were cultured at 200 rpm and 37 ° C for 72 h.
- Examples 13-24 [Materials and methods] For Haloferax mediterranei , a medium was prepared with reference to NBRC designated medium No. 1338 (the component composition of NBRC designated medium No. 1338 is as described above and below).
- NBRC designated medium No. 1338 the component composition of NBRC designated medium No. 1338 is as described above and below.
- artificial seawater, natural seawater, and deep seawater were used as seawater, respectively.
- the concentration rates of seawater were 1-fold (normal seawater), 2-fold, 3-fold, and 4-fold, respectively, and sodium chloride was added to match the total salt concentrations. Further additions were made in the amounts shown in Table 5. 50 mL of medium was added to a 300 mL Erlenmeyer flask, and the cells were cultured at 200 rpm and 37 ° C for 72 h.
- Comparative Examples 1 and 2 were prepared as Comparative Examples corresponding to the above Examples. More specifically, in Examples 25 to 48, seawater and sodium chloride, and ammonium salt and phosphate were used in combination without changing the type and amount of the organic nutrient source. In Comparative Examples 1 and 2, only the same salts as in Examples (sodium chloride, ammonium salt and phosphate) were added as salts without using seawater. 50 mL of medium was added to a 300 mL Erlenmeyer flask, and the cells were cultured at 200 rpm and 37 ° C for 72 h.
- Comparative Examples 3 and 4 Examples 49 to 72 (Effect of suppressing change in pH) [Materials and methods] The culture was carried out under conditions similar to those of jar fermenter culture using a medium in which the pH did not change, and the effect brought about by suppressing the change in pH was confirmed.
- the media Comparative Example 3, Examples 49 to 60, Comparative Example 4, Examples 61 to 72
- Table 9 the media were prepared. These media were obtained by adding 15 g / L of PIPES as a buffer solution to each of the media corresponding to Comparative Example 1, Examples 25 to 36, Comparative Example 2 and Examples 37 to 48. 50 mL of medium was added to a 300 mL Erlenmeyer flask, and the cells were cultured at 200 rpm and 37 ° C for 72 h.
- NBRC designated medium No. 1380 the medium composition of NBRC designated medium No. 1380 is as described above. Furthermore, for the trace element solution in NBRC designated medium No. 1380, the input amount was changed as shown in the table below (Table 11). Incubation was carried out for 72 hours in a 300 mL Erlenmeyer flask with a total volume of the culture solution of 50 mL.
- Reference example B The initial glucose concentration was 10 g / L, the furfural concentration, and the HMF (5-hydroxymethylfurfural) concentration were 0.06 g / L to 1.6 g, respectively, in the same manner as in Examples 1 to 12 except that the furfural compound was further used.
- the concentration was changed to / L, and the Haloferax mediterranei NBRC14739 was cultured in a flask. More specifically, it is as follows. ⁇ (Materials and methods) In a 300 mL Erlenmeyer flask, the total volume of the culture solution was 50 mL, the following components were added, and the culture was shaken at 72 h, 37 ° C, and 200 rpm. The initial pH was adjusted to 7.2.
- PHBV having various molecular weights can be produced and the molecular weight can be controlled by changing the concentration of furfural and the concentration of HMF. It is considered that the molecular weight of PHBV produced by a furfural compound such as furfural or HMF is controlled even when a sugar other than glucose is used. It was also considered that the furfural compound could be used in the method for producing polyhydroxyalkanoate and the method for controlling the molecular weight of polyhydroxyalkanoate in the present invention.
- PHA can be produced while controlling the weight average molecular weight between, for example, 200,000 to 6 million. Therefore, the present invention greatly contributes to the development of the PHA manufacturing industry and related industries.
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Abstract
以下の工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法： （ａ）海水を含む培地を用いて好塩菌を培養する工程；及び （ｂ）前記培養における培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得る工程。
Description
本発明はＰＨＡ（ポリヒドロキシアルカン酸）共重合体の新規な製造方法に関する。また本発明は余剰海水の使用方法にも関する。
２０世紀後半、石油からプラスチックを作る技術が急速に発展し、プラスチックの普及によって人々の生活が一変した。プラスチックに関するノーベル賞の受賞も多数ある（カロザースのナイロン、チーグラーとナッタのポリエチレン、ポリプロピレンなど）。
現在では、プラスチックは日本だけでも年間で１０７５万ｔ生産されている（２０１６年）。一方で、プラスチックのほとんどは石油から作られており、その廃棄時の二酸化炭素の排出による温暖化への影響や石油資源の安定供給性などが問題となっている。さらに、通常のプラスチックは一度環境中に放出されると自然界で分解されないため、プラスチックがそのまま海に漂ってしまうことによる、マイクロプラスチックの問題が深刻化している。
このような問題の解決策としてバイオマスプラスチック、生分解プラスチックが挙げられる。バイオマスプラスチックは、原料が化石燃料ではなくトウモロコシやサトウキビなどの搾りかすや木質などのバイオマスであるプラスチックであり、生分解プラスチックは、使用後に環境中で微生物の力で水と二酸化炭素にまで分解されるプラスチックである。
このような問題の解決策としてバイオマスプラスチック、生分解プラスチックが挙げられる。バイオマスプラスチックは、原料が化石燃料ではなくトウモロコシやサトウキビなどの搾りかすや木質などのバイオマスであるプラスチックであり、生分解プラスチックは、使用後に環境中で微生物の力で水と二酸化炭素にまで分解されるプラスチックである。
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）はある種の微生物に脂質や糖質などのバイオマスを炭素源（栄養）として与えるとエネルギー貯蔵物質として蓄えるプラスチックであり、使用後は環境中で生分解する環境負荷の小さいバイオプラスチックである。
ＰＨＡとして最初に発見されたのはポリ［３－ヒドロキシブタン酸］（「Ｐ（３ＨＢ）」と表記されることがある）である（非特許文献１）には、モノマー成分として３－ヒドロキシブタン酸以外に第２成分としての３－ヒドロキシバレリル酸（「３ＨＶ」と表記されることがある）等についての開示がある。
ＰＨＡとして最初に発見されたのはポリ［３－ヒドロキシブタン酸］（「Ｐ（３ＨＢ）」と表記されることがある）である（非特許文献１）には、モノマー成分として３－ヒドロキシブタン酸以外に第２成分としての３－ヒドロキシバレリル酸（「３ＨＶ」と表記されることがある）等についての開示がある。
ＰＨＡの合成のために海水を用いる技術も知られている（特許文献２、特許文献４）。
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００７，７，２１８
ＰＨＡを製造するための方法に対する恒常的な需要がある。本発明はＰＨＡの新たな製造方法を提供することを課題とした。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、従来用いられることがなかった資材を用いることによりＰＨＡを製造できる可能性があることを見出し、さらに研究を進めた結果本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、少なくとも以下の発明に関する：
[１］
以下の工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法：
（ａ）海水を含む培地を用いて微生物を培養する工程；及び
（ｂ）前記培養における培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得る工程。
[２］
海水由来のＮａＣｌ以外のＮａＣｌを培地に含む、［１］に記載の製造方法。
[３］
好塩菌が、高度好塩菌である［１］又は［２］に記載の製造方法
[４］
高度好塩菌がHaloferax mediterraneiである［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
[５］
ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体である［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
[６］
共重合体を構成する３－ヒドロキシブタン酸のモル数と３－ヒドロキシバレリル酸のモル数の総和に対する３－ヒドロキシバレリル酸のモル数の割合（３ＨＶ分率）が５．０％～４０．０％である［５］に記載の製造方法。
[７］
炭素源として糖を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
であるポリヒドロキシアルカン酸を得る、［６］に記載の製造方法。
[８］
ポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が３６１万より大きい、［１］～［７］のいずれか］に記載の製造方法。
[９］
得られるポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が６００万以下である［１］～［８］のいずれかに記載の製造方法。
[１０］
海水が、濃縮された海水を含む［１］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
[１１］
濃縮された海水の塩分濃度が３．５％～２０％である、［１０］に記載の製造方法。
[１２］
培地が下記の成分又は海水の少なくとも一つを含む、［１］～［１１］のいずれかに記載の製造方法：
（i）人工海水の素、
（ii）海洋深層水、及び
（iii）天然海水。
[１３］
以下の工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法における、海水の使用：
（ａ）濃縮された海水又は濃縮されていない海水を含む培地を用いて好塩菌を培養する工程；及び
（ｂ）前記培養における培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得る工程。
［１４］
海水を含む培地を用いて好塩菌を培養し、培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得ることを含むポリヒドロキシアルカン酸の製造方法であって、
前記培養における炭素源が糖及びフルフラール系化合物を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
にして、
［１５］
海水を含む培地を用いて好塩菌を培養し、培養産物として得られるポリヒドロキシアルカン酸の分子量を制御する方法であって、
前記培養における炭素源が糖及びフルフラール系化合物を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
にして、
製造されるポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量を制御する、方法。
[１６］
人工海水の素由来でないＮａＣｌ、海洋深層水由来でないＮａＣｌ、又は天然海水由来でないＮａＣｌ、をさらに含む上記いずれかの製造方法。
[１７］
海水が人工海水であり、該人工海水に用いられる人工海水の素が、人工海水作製のために通常用いられる量より多い量で含まれる、上記いずれかの製造方法。
[１］
以下の工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法：
（ａ）海水を含む培地を用いて微生物を培養する工程；及び
（ｂ）前記培養における培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得る工程。
[２］
海水由来のＮａＣｌ以外のＮａＣｌを培地に含む、［１］に記載の製造方法。
[３］
好塩菌が、高度好塩菌である［１］又は［２］に記載の製造方法
[４］
高度好塩菌がHaloferax mediterraneiである［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
[５］
ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体である［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
[６］
共重合体を構成する３－ヒドロキシブタン酸のモル数と３－ヒドロキシバレリル酸のモル数の総和に対する３－ヒドロキシバレリル酸のモル数の割合（３ＨＶ分率）が５．０％～４０．０％である［５］に記載の製造方法。
[７］
炭素源として糖を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
であるポリヒドロキシアルカン酸を得る、［６］に記載の製造方法。
[８］
ポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が３６１万より大きい、［１］～［７］のいずれか］に記載の製造方法。
[９］
得られるポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が６００万以下である［１］～［８］のいずれかに記載の製造方法。
[１０］
海水が、濃縮された海水を含む［１］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
[１１］
濃縮された海水の塩分濃度が３．５％～２０％である、［１０］に記載の製造方法。
[１２］
培地が下記の成分又は海水の少なくとも一つを含む、［１］～［１１］のいずれかに記載の製造方法：
（i）人工海水の素、
（ii）海洋深層水、及び
（iii）天然海水。
[１３］
以下の工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法における、海水の使用：
（ａ）濃縮された海水又は濃縮されていない海水を含む培地を用いて好塩菌を培養する工程；及び
（ｂ）前記培養における培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得る工程。
［１４］
海水を含む培地を用いて好塩菌を培養し、培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得ることを含むポリヒドロキシアルカン酸の製造方法であって、
前記培養における炭素源が糖及びフルフラール系化合物を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
にして、
［１５］
海水を含む培地を用いて好塩菌を培養し、培養産物として得られるポリヒドロキシアルカン酸の分子量を制御する方法であって、
前記培養における炭素源が糖及びフルフラール系化合物を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
にして、
製造されるポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量を制御する、方法。
[１６］
人工海水の素由来でないＮａＣｌ、海洋深層水由来でないＮａＣｌ、又は天然海水由来でないＮａＣｌ、をさらに含む上記いずれかの製造方法。
[１７］
海水が人工海水であり、該人工海水に用いられる人工海水の素が、人工海水作製のために通常用いられる量より多い量で含まれる、上記いずれかの製造方法。
本発明によれば、ＰＨＡの新たな製造方法として、従来用いられることがなかった資材を用いてＰＨＡを製造する方法が提供される。
海水を用いたＰＨＡの製造に関する報告は過去になされている（ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター）のウェブサイトにおける培地一覧（https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/culture-list.html）。しかしながら、かかる報告に開示されている方法は、いずれも高度好塩菌の増殖を目的とした培地を開示するにすぎないものであり、ＰＨＡの製造に関するものではない。また、従来技術においては各種成分の濃度が初期の濃度又は所定の濃度に保たれたまま用いられており、濃縮された海水を用いてＰＨＡを製造することはなされていない。すなわち、海水、とくに、濃縮された海水を用いてＰＨＡを製造することについては、これまで知られていなかったのである。
海水を用いたＰＨＡの製造に関する報告は過去になされている（ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター）のウェブサイトにおける培地一覧（https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/culture-list.html）。しかしながら、かかる報告に開示されている方法は、いずれも高度好塩菌の増殖を目的とした培地を開示するにすぎないものであり、ＰＨＡの製造に関するものではない。また、従来技術においては各種成分の濃度が初期の濃度又は所定の濃度に保たれたまま用いられており、濃縮された海水を用いてＰＨＡを製造することはなされていない。すなわち、海水、とくに、濃縮された海水を用いてＰＨＡを製造することについては、これまで知られていなかったのである。
特許文献１（特開２０１６－１８５０８７号公報）には、濃縮海水を水で希釈して藻類の培養に用いる方法が記載されている。しかしながら同文献には、濃い海水をそのまま使うことや好塩菌を使うことについて記載も示唆もなされていない。
特許文献２（特開２０１８－１３３９９７公報）には、海水域に生息する海洋性光合成細菌にＰＨＡを作らせる方法、海水を培地として利用すること、高塩濃度培地ではコンタミネーションのリスクが少なくなることが開示されている。しかしながら同文献にも好塩菌に関する記載はないし、濃い海水を用いることについての記載はない。
特許文献３（特開２０１４－５１２１９４号公報）には、濃縮海水を用いて、藻類に含まれる有用成分を含有する食塩を製造する方法が開示されているにすぎない。
特許文献４（特開２０１２－２１０１６５号公報）には深海から単離したＰＨＡ生産菌に関する記載がある一方、用いられている組成物は海水とほぼ同濃度のものに留まる。
非特許文献１（Macromolecular Bioscience 2007, 7, 218）にはHaloferax mediterraneiを用いて培養を行うと、PHAを77.8g/L生産可能であることが開示されている。しかしながら同文献には海水に関する記載はないし、まして濃縮海水（濃縮された海水）については記載も示唆もなされていない。
特許文献２（特開２０１８－１３３９９７公報）には、海水域に生息する海洋性光合成細菌にＰＨＡを作らせる方法、海水を培地として利用すること、高塩濃度培地ではコンタミネーションのリスクが少なくなることが開示されている。しかしながら同文献にも好塩菌に関する記載はないし、濃い海水を用いることについての記載はない。
特許文献３（特開２０１４－５１２１９４号公報）には、濃縮海水を用いて、藻類に含まれる有用成分を含有する食塩を製造する方法が開示されているにすぎない。
特許文献４（特開２０１２－２１０１６５号公報）には深海から単離したＰＨＡ生産菌に関する記載がある一方、用いられている組成物は海水とほぼ同濃度のものに留まる。
非特許文献１（Macromolecular Bioscience 2007, 7, 218）にはHaloferax mediterraneiを用いて培養を行うと、PHAを77.8g/L生産可能であることが開示されている。しかしながら同文献には海水に関する記載はないし、まして濃縮海水（濃縮された海水）については記載も示唆もなされていない。
海水淡水化の際、海水から淡水を取り出すため、通常より濃い海水が大量に発生するという問題が生じる。現在は濃い海水の多くがそのまま海に放出されているがこれによる塩濃度の上昇など周辺環境の変化は生態系に悪影響を及ぼすことが懸念されている。
本発明の製造方法のうち、海水として濃縮された海水を含む製造方法によれば、海水淡水化技術などで廃棄される濃い海水を用いたＰＨＡの生物的な製造方法が提供されるため、食塩をはじめとする培地における無機塩類を調製するためのコストを、従来の方法より低廉のものとすることが可能になるという効果も奏される。
本発明の製造方法のうち、海水として濃縮された海水を含む製造方法によれば、海水淡水化技術などで廃棄される濃い海水を用いたＰＨＡの生物的な製造方法が提供されるため、食塩をはじめとする培地における無機塩類を調製するためのコストを、従来の方法より低廉のものとすることが可能になるという効果も奏される。
また本発明によれば、現在はそのまま廃棄されている濃い海水の新しい利用方法として、好塩菌(好ましくは高度好塩菌)を培養するための培地が提供されるといった効果も奏される。
水資源の特徴は再生可能であるが時期、地域が偏在していることであり、水不足に悩まされる地域では生活用水の確保は健康で文化的な生活のために避けては通れない課題である。日本でも、例えば兵庫県稲美町、香川県、愛知県の知多半島や渥美半島、千葉県の九十九里地域や南房総地域など水不足に悩まされてきた地域が多数あり、農業用水、生活用水に関してダムや用水路などの利水設備、円筒分水などの水を正確に分配するための利水施設が建設されてきた。
現代では、日本では生活用水の不足による問題はほぼ解決しているが、海外ではたとえば中東など水資源の限られた地域では雨による生活用水の確保が困難な地域がある。そのような地域では、そもそも農業は困難であるため農産物は輸入により調達するが、生活用水の確保のための手法、例えば海水淡水化は、有力かつ重要な手法である。
本発明は、中東地域をはじめとする世界各地でも問題となっている濃縮海水の再利用を可能とし、安価な有用物質生産を可能にする上に海洋の豊かさを守ることに貢献するものである。
水資源の特徴は再生可能であるが時期、地域が偏在していることであり、水不足に悩まされる地域では生活用水の確保は健康で文化的な生活のために避けては通れない課題である。日本でも、例えば兵庫県稲美町、香川県、愛知県の知多半島や渥美半島、千葉県の九十九里地域や南房総地域など水不足に悩まされてきた地域が多数あり、農業用水、生活用水に関してダムや用水路などの利水設備、円筒分水などの水を正確に分配するための利水施設が建設されてきた。
現代では、日本では生活用水の不足による問題はほぼ解決しているが、海外ではたとえば中東など水資源の限られた地域では雨による生活用水の確保が困難な地域がある。そのような地域では、そもそも農業は困難であるため農産物は輸入により調達するが、生活用水の確保のための手法、例えば海水淡水化は、有力かつ重要な手法である。
本発明は、中東地域をはじめとする世界各地でも問題となっている濃縮海水の再利用を可能とし、安価な有用物質生産を可能にする上に海洋の豊かさを守ることに貢献するものである。
本発明の製造方法のうち、高度好塩菌（「ハロアーキア」（Haloarchaea）と称されることもある）を用いるものによれば、ＰＨＡの製造・回収を低コストで行うことができるといった効果が奏される。
高濃度塩化ナトリウム水溶液中でのみ生きる高度好塩菌と呼ばれるタイプの中にもＰＨＡを生産する微生物がいることが知られている。高濃度塩化ナトリウム水溶液中でＰＨＡを生産する菌体は、生産後低濃度塩化ナトリウム水溶液中又は水中で溶菌し、中に蓄えているＰＨＡを取り出せることが知られている。通常、ＰＨＡは菌体から回収する際に有機溶媒や界面活性剤などを大量に使用するが、高度好塩菌の場合は水のみで回収できるため、コスト面でのメリットが一層大きい。
理論に束縛されるものではないが、本発明の製造方法においては、塩類の濃度を通常の海水又は公知の培地より高くすることにより対象微生物の生育が促進され、ＰＨＡの製造効率が向上しえると考えられる。
高濃度塩化ナトリウム水溶液中でのみ生きる高度好塩菌と呼ばれるタイプの中にもＰＨＡを生産する微生物がいることが知られている。高濃度塩化ナトリウム水溶液中でＰＨＡを生産する菌体は、生産後低濃度塩化ナトリウム水溶液中又は水中で溶菌し、中に蓄えているＰＨＡを取り出せることが知られている。通常、ＰＨＡは菌体から回収する際に有機溶媒や界面活性剤などを大量に使用するが、高度好塩菌の場合は水のみで回収できるため、コスト面でのメリットが一層大きい。
理論に束縛されるものではないが、本発明の製造方法においては、塩類の濃度を通常の海水又は公知の培地より高くすることにより対象微生物の生育が促進され、ＰＨＡの製造効率が向上しえると考えられる。
以下に本発明について、より詳細に説明する。なお本明細書におけるＰＨＡの分子量は、他の記載がない限りポリスチレン標準を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより測定された数値である。
本明細書において「～」の記号は、該記号により結ばれた２つの数値の間の範囲により特定される数値範囲（前記２つの数値を包含する）を表す。例えば「２０万～６００万」の記載は２０万及び６００万を含む、２０万から６００万の間に存在するすべての数値により構成される範囲を意味する。同じ意味を表すために、「２０万以上６００万以下」の表記が用いられることがある。
本明細書においてポリマーの分子量を数値により表す場合、本技術分野における当業者により理解される数値の幅を含むことにより特定される数値が意図される。
本明細書において「～」の記号は、該記号により結ばれた２つの数値の間の範囲により特定される数値範囲（前記２つの数値を包含する）を表す。例えば「２０万～６００万」の記載は２０万及び６００万を含む、２０万から６００万の間に存在するすべての数値により構成される範囲を意味する。同じ意味を表すために、「２０万以上６００万以下」の表記が用いられることがある。
本明細書においてポリマーの分子量を数値により表す場合、本技術分野における当業者により理解される数値の幅を含むことにより特定される数値が意図される。
本発明のＰＨＡの製造方法は、下記のものである：
以下の工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法：
（ａ）海水を含む培地を用いて微生物を培養する工程；及び
（ｂ）前記培養における培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得る工程。
以下の工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法：
（ａ）海水を含む培地を用いて微生物を培養する工程；及び
（ｂ）前記培養における培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得る工程。
本発明に用いられる海水は限定されず、
（i）人工海水の素を用いて得られる海水、
（ii）海洋深層水、及び
（iii）天然海水
が例示される。
本発明に用いられる海水は、上記（i）～（iii）の海水の１種又は２種以上を、任意の割合で配合して用いてもよい。
本発明に用いられる（ii）海洋深層水又は（iii）天然海水の産地は限定されない。
本発明において用いられる（ii）海洋深層水の種類は限定されず、例えば約２００ｍ以上の深度の地点から採取された海水が挙げられる。
本発明において用いられる（iii）天然海水は、天然由来の海水のうち、（ii）海洋深層水以外の海水を意味する。
なお、天然由来の海水における各金属塩類の含量比は、採取地にかかわらずおおむね一定であることが知られている。
（i）人工海水の素を用いて得られる海水、
（ii）海洋深層水、及び
（iii）天然海水
が例示される。
本発明に用いられる海水は、上記（i）～（iii）の海水の１種又は２種以上を、任意の割合で配合して用いてもよい。
本発明に用いられる（ii）海洋深層水又は（iii）天然海水の産地は限定されない。
本発明において用いられる（ii）海洋深層水の種類は限定されず、例えば約２００ｍ以上の深度の地点から採取された海水が挙げられる。
本発明において用いられる（iii）天然海水は、天然由来の海水のうち、（ii）海洋深層水以外の海水を意味する。
なお、天然由来の海水における各金属塩類の含量比は、採取地にかかわらずおおむね一定であることが知られている。
本発明において、海水として濃縮された海水（本明細書において「濃縮海水」又は「濃い海水」と記載することがある）を用いることは好ましい。
本発明においてはまた、濃縮されていない海水を、下記における濃縮された海水の代替として用いてよい。濃縮されていない海水を用いる本発明の製造方法は、採取した海水の前処理が不要であり、作業負担の小ささ及びコストの低さといった優位性がある。
本発明においてはまた、濃縮されていない海水を、下記における濃縮された海水の代替として用いてよい。濃縮されていない海水を用いる本発明の製造方法は、採取した海水の前処理が不要であり、作業負担の小ささ及びコストの低さといった優位性がある。
本発明における濃縮された海水には、
（１）海から採取された海水において、含有されている成分の量をほぼ変えずに水分含量のみが小さくなった組成物、
（２）人工海水組成物から得られる海水（組成物）を濃縮して得られる組成物、もしくは人工海水組成物を既定の水分量より少ない水分量により調製して得られる組成物、
（３）塩湖など海洋以外の塩水がある場所から採取される塩を含む水溶液を、含有されている成分の絶対量を変えずに適宜の又は所望の度合いで濃縮または希釈した組成物で、通常の海水より高い塩濃度に調整されたもの、及び
（４）前記（１）～（３）の組成物と同様な組成を有する組成物、又は（１）～（３）の組成物と同様な組成を有する組成物に塩類等の成分を追加して添加して得られる組成を有する組成物、
などが包含される。これらの組成物における塩濃度は約３．５％より大きい。
本発明において海から採取された海水は限定されず、塩濃度が約３．５％である海水のほか、塩濃度が約３．５％より低い海水及び高い海水も包含される。なお本明細書における海水等の「塩濃度」又は「塩分濃度」の語は、本技術分野において通常用いられる、塩化ナトリウムを約７８％含み、他の塩分として塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム、塩化カリウム等の無機塩類を約２１％～２２％含む、海水等における塩分、すなわち塩類により構成される部分の濃度を意味する。
濃縮海水の塩分濃度としては、たとえば３．５％～２０％が挙げられ、７％～１４％は好ましい。
本発明における海水の濃度の表記に用いられる％は、他に記載がない限りｗ／ｖにより規定されたものである。
（１）海から採取された海水において、含有されている成分の量をほぼ変えずに水分含量のみが小さくなった組成物、
（２）人工海水組成物から得られる海水（組成物）を濃縮して得られる組成物、もしくは人工海水組成物を既定の水分量より少ない水分量により調製して得られる組成物、
（３）塩湖など海洋以外の塩水がある場所から採取される塩を含む水溶液を、含有されている成分の絶対量を変えずに適宜の又は所望の度合いで濃縮または希釈した組成物で、通常の海水より高い塩濃度に調整されたもの、及び
（４）前記（１）～（３）の組成物と同様な組成を有する組成物、又は（１）～（３）の組成物と同様な組成を有する組成物に塩類等の成分を追加して添加して得られる組成を有する組成物、
などが包含される。これらの組成物における塩濃度は約３．５％より大きい。
本発明において海から採取された海水は限定されず、塩濃度が約３．５％である海水のほか、塩濃度が約３．５％より低い海水及び高い海水も包含される。なお本明細書における海水等の「塩濃度」又は「塩分濃度」の語は、本技術分野において通常用いられる、塩化ナトリウムを約７８％含み、他の塩分として塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム、塩化カリウム等の無機塩類を約２１％～２２％含む、海水等における塩分、すなわち塩類により構成される部分の濃度を意味する。
濃縮海水の塩分濃度としては、たとえば３．５％～２０％が挙げられ、７％～１４％は好ましい。
本発明における海水の濃度の表記に用いられる％は、他に記載がない限りｗ／ｖにより規定されたものである。
海水又は海水と同様な組成を有する組成物を用いて調製された培地を微生物の培養に用いる過程において、水分の蒸発により組成物の割合が相対的により高くなった組成物自体は、本発明の濃縮された海水としての組成物とは異なる。
本発明において、濃縮された海水として海から採取された海水において、含有されている成分の量を変えずに水分含量のみが小さくなった組成物を用いる場合、すなわち海水を濃縮して得られる組成物を用いる場合、濃縮の方法は限定されず、加熱濃縮、逆浸透膜を用いる方法、又はイオン交換膜電気透析法により濃縮する方法等を用いてよい。
また、濃縮の度合いを調整するために必要に応じて水を添加してよい。
また、濃縮の度合いを調整するために必要に応じて水を添加してよい。
本発明において人工海水を用いる場合、人工海水の種類は限定されず、市販の人工海水の素を用いて調製してよい。市販の人工海水の素として、海産微細藻類用ダイゴ人工海水SP、レッドシーソルト、人工海水マリンアート、人工海水テトラマリンソルト、インスタントオーシャン、が例示される。
本発明における濃縮された海水として、海洋深層水又は天然海水を濃縮して得られる組成物を用いてよい。
本発明において人工海水を用いる場合、培地が人工海水の素及び該人工海水の素由来でないＮａＣｌを含むことは、高分子量のＰＨＡの製造、PHAの生産量の増加に資するため好ましい。また、人工海水の素を、人工海水作製のために通常用いられる濃度より高い濃度で用いて得られる人工海水を培地に含む本発明の方法も好ましい。
本発明において海洋深層水又は天然海水を用いる場合、培地が海洋深層水又は天然海水由来でないＮａＣｌを含むことは、高分子量のＰＨＡの製造に資するため好ましい。
本発明において人工海水を用いる場合の培地の例として、海水に含有される成分により組成の一部が規定される公知の培地を用いるものが例示され、ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター）がウェブサイトにおいて公開している培地一覧（https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/culture-list.html）におけるNo.1214又はNo.1338を改変したものは好ましい。これらの培地の組成は以下のとおりである：
本発明において人工海水を用いる場合、培地が人工海水の素及び該人工海水の素由来でないＮａＣｌを含むことは、高分子量のＰＨＡの製造、PHAの生産量の増加に資するため好ましい。また、人工海水の素を、人工海水作製のために通常用いられる濃度より高い濃度で用いて得られる人工海水を培地に含む本発明の方法も好ましい。
本発明において海洋深層水又は天然海水を用いる場合、培地が海洋深層水又は天然海水由来でないＮａＣｌを含むことは、高分子量のＰＨＡの製造に資するため好ましい。
本発明において人工海水を用いる場合の培地の例として、海水に含有される成分により組成の一部が規定される公知の培地を用いるものが例示され、ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター）がウェブサイトにおいて公開している培地一覧（https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/culture-list.html）におけるNo.1214又はNo.1338を改変したものは好ましい。これらの培地の組成は以下のとおりである：
本発明における濃縮された海水を含む培地には、上記（１）～（４）に例示した組成物を用いる培地のほか、公知の微生物培養用の培地において、上記（１）～（４）に例示した組成物を用いる培地に含有される微量金属塩の量が約１／３２～約４倍であるものが包含される。
かかる培地の例として、成分が規定された人工海水である海産微細藻類用ダイゴ人工海水SPが挙げられる。ダイゴ人工海水SPの塩化ナトリウム以外の塩(微量金属塩等)の濃度(mg/L)は以下のとおりである。
本発明の製造方法においては、これらの金属塩の１つ又は２つ以上を、上記表中の値の１．５倍以上の量で含む培地を用いてよく、３倍以上の量で含む培地は好ましく、約４倍の量で含む培地はより好ましい。本発明の製造方法においてはまた、これらの金属塩に含有される金属の１つ又は２つ以上を、上記表中の値により示される金属塩の量に相当する量の１．５倍以上の量で、上記表により示される金属塩とは異なる塩の形態で含む培地を用いてよく、３倍以上の量で含む培地は好ましく、約４倍の量で含む培地はより好ましい。金属塩の量を増やすことにより、PHBV生産効率を高めるとともに、得られるPHBVの分子量を高くすることができる。
かかる培地の例として、成分が規定された人工海水である海産微細藻類用ダイゴ人工海水SPが挙げられる。ダイゴ人工海水SPの塩化ナトリウム以外の塩(微量金属塩等)の濃度(mg/L)は以下のとおりである。
本発明の製造方法においては、これらの金属塩の１つ又は２つ以上を、上記表中の値の１．５倍以上の量で含む培地を用いてよく、３倍以上の量で含む培地は好ましく、約４倍の量で含む培地はより好ましい。本発明の製造方法においてはまた、これらの金属塩に含有される金属の１つ又は２つ以上を、上記表中の値により示される金属塩の量に相当する量の１．５倍以上の量で、上記表により示される金属塩とは異なる塩の形態で含む培地を用いてよく、３倍以上の量で含む培地は好ましく、約４倍の量で含む培地はより好ましい。金属塩の量を増やすことにより、PHBV生産効率を高めるとともに、得られるPHBVの分子量を高くすることができる。
本発明の製造方法においては、濃縮されていない海水又は濃縮された海水をそのまま、特定の塩類の１種又は２種以上を海水又は培地に添加せずに、又は添加量を減らして用いてよい。かかる態様は、培地の成分として必要な塩類を海水の成分により置き換えることを可能とし、コストや培地を作る手間の面において優位であり好ましい。置き換えることが可能な塩類は限定されないところ、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、及び塩化鉄が例示される。
本発明の製造方法においてはまた、濃縮されていない海水又は濃縮された海水に、適宜塩類を加えて培地を作製することもできる。
添加する塩類は用いられる微生物の成長に必要であるか、又は成長を促進する塩類であれば限定されず、無機塩類及び有機塩類が例示される。かかる塩類として以下のものが例示される：
・NH4Cl、KH2PO4、K2HPO4、FeCl3、NaCl、MgCl2、MgSO4、CaCl2、KCl、NaHCO3、NaBr及びNa2SO4等の無機塩類とその水和物；
・クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、ニトリロ三酢酸、などの有機塩類とその水和物。
本発明の製造方法においてはまた、濃縮されていない海水又は濃縮された海水に、適宜塩類を加えて培地を作製することもできる。
添加する塩類は用いられる微生物の成長に必要であるか、又は成長を促進する塩類であれば限定されず、無機塩類及び有機塩類が例示される。かかる塩類として以下のものが例示される：
・NH4Cl、KH2PO4、K2HPO4、FeCl3、NaCl、MgCl2、MgSO4、CaCl2、KCl、NaHCO3、NaBr及びNa2SO4等の無機塩類とその水和物；
・クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、ニトリロ三酢酸、などの有機塩類とその水和物。
本発明の製造方法において用いられる培地における上記塩類の種類と量は限定されない。例えば無機塩類のうちNH4Cl、KH2PO4、FeCl3、KCl、NaHCO3、NaBr及びNaClについては、それぞれ以下の量(g/L)が例示される：
NH4Cl：０．１～２．５、KH2PO4：０．００５～５．０、FeCl3 ：０．００００１～０．０１、KCl：０．３～３、NaHCO3 ：０．０１～０．３、NaBr：０．０３～０．５、 NaCl： ３０～３００。
NH4Cl：０．１～２．５、KH2PO4：０．００５～５．０、FeCl3 ：０．００００１～０．０１、KCl：０．３～３、NaHCO3 ：０．０１～０．３、NaBr：０．０３～０．５、 NaCl： ３０～３００。
本発明の製造方法における総塩濃度としては例えば１００g/L～３００g/Lが挙げられる。総塩濃度が１５０g/L～２５０g/Lであることは好ましい。
本発明のＰＨＡの製造方法において用いられる培地として、ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター）がウェブサイトにおいて公開している培地一覧（https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/culture-list.html）におけるNo.1214、No.1338、No.1380の培地を改変したものは好ましい。当該No.1380の培地組成を上記培地一覧から引用して示す（No.1214、及びNo.1338の培地組成については前記のとおりである）：
本発明のＰＨＡの製造方法において用いられる培地として、ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター）がウェブサイトにおいて公開している培地一覧（https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/culture-list.html）におけるNo.1214、No.1338、No.1380の培地を改変したものは好ましい。当該No.1380の培地組成を上記培地一覧から引用して示す（No.1214、及びNo.1338の培地組成については前記のとおりである）：
また、たとえば富栄養状態の濃い海水を用いる場合はリンなどの過剰となっている栄養素を適宜沈殿させるなどの方法で精製することは好ましい。
濃縮された海水には他の微生物及び／又はウイルスなどが生存している可能性がある。これらの他の微生物及び／又はウイルスを、ＰＨＡを製造する前に除去することは好ましい。かかる除去の方法は限定されず、適当な量の塩類を加えて塩濃度を上昇させることによる滅菌や、オートクレーブ、ろ過滅菌などの公知の方法による滅菌であってよい。
本発明の製造方法においては、糖を培地に加えてよい。かかる糖には、例えば酵母エキスのような他の栄養源に含有される糖は包含されない。上記糖は、酵母エキスのような他の栄養源とは別に供給される糖を指す。
本発明の製造方法において用いられる糖には、上記各糖の誘導体も包含される。糖の誘導体としては、上記糖がエーテル化、エステル化されたものが想定され、とくにエーテル化されたものとしてはメトキシ化されてなる誘導体が、エステル化されたものとしてはアセチル化されてなる誘導体が、それぞれ例示される。
本発明の製造方法において用いられる糖には、上記各糖の誘導体も包含される。糖の誘導体としては、上記糖がエーテル化、エステル化されたものが想定され、とくにエーテル化されたものとしてはメトキシ化されてなる誘導体が、エステル化されたものとしてはアセチル化されてなる誘導体が、それぞれ例示される。
本発明の製造方法においては、例えば１００万～６００万の重量平均分子量に、ＰＨＡの分子量を制御してＰＨＡを製造することができるところ、炭素源としてのフルフラール系化合物をさらに添加することによりＰＨＡとしてより低分子量のものが得られ、さらに広範囲な分子量を有するＰＨＡを製造することができる。炭素源としてのフルフラール系化合物をさらに添加する本発明の製造方法においては、製造されるＰＨＡの分子量は限定されないところ、例えば２０万～６００万の重量平均分子量に、ＰＨＡの分子量を制御してＰＨＡを製造することができる。フルフラール系化合物が用いられる本発明の製造方法については、さらに後述する。
本発明の製造方法として、ＰＨＡの分子量を１００万～５７５万の重量平均分子量に制御してＰＨＡ製造する方法は好ましい。
本発明の製造方法として、ＰＨＡの分子量を１００万～５７５万の重量平均分子量に制御してＰＨＡ製造する方法は好ましい。
＜炭素源＞
本発明の製造方法においては炭素源を加えてよい。
かかる炭素源として、
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
を用いると、生成されるＰＨＡの分子量は大きくなる傾向にあり、
上記炭素源として
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、
を用いると、生成されるＰＨＡの分子量は上記（ａ）の場合より小さくなる傾向にあり、
上記炭素源として
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上を用いグルコース及び／又はその誘導体を用いないことにより、生成されるＰＨＡの分子量は上記（ｂ）の場合よりさらに小さくなる傾向にある。
本発明の製造方法においては炭素源を加えてよい。
かかる炭素源として、
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
を用いると、生成されるＰＨＡの分子量は大きくなる傾向にあり、
上記炭素源として
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、
を用いると、生成されるＰＨＡの分子量は上記（ａ）の場合より小さくなる傾向にあり、
上記炭素源として
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上を用いグルコース及び／又はその誘導体を用いないことにより、生成されるＰＨＡの分子量は上記（ｂ）の場合よりさらに小さくなる傾向にある。
本発明の製造方法に用いられる糖の量（培養の初期濃度）は限定されないところ、約5g/L～910g/Lが例示される。糖の量として約5g/L～約500g/Lは好ましく、約10g/L～50g/Lはより好ましい。
本発明の製造方法において、用いられる糖は複数回に分けて投入されてよい。投入される回数、タイミング及び総投入量は限定されず、回数としては２回、３回、４回、５回、又は６回以上であってよい。また、糖の供給を連続的に行うことも可能で、その場合には糖の濃度を一定に保つようなコントロール、供給速度を一定に保つようなコントロールをする方法を用いてよい。
本発明の製造方法において、用いられる糖は複数回に分けて投入されてよい。投入される回数、タイミング及び総投入量は限定されず、回数としては２回、３回、４回、５回、又は６回以上であってよい。また、糖の供給を連続的に行うことも可能で、その場合には糖の濃度を一定に保つようなコントロール、供給速度を一定に保つようなコントロールをする方法を用いてよい。
本発明の製造方法においては、上述のとおり、炭素源としてのフルフラール系化合物をさらに添加することにより、さらに広範囲な分子量、例えば２０万～６００万の重量平均分子量に、ＰＨＡの分子量を制御してＰＨＡを製造することができる。
フルフラール系化合物は糖質を原料に生産されるアルデヒドの一種であり、糖質を酸性下で加熱することなどにより６単糖からは５-ヒドロキシメチルフルフラール（HMF）が、５単糖からはフルフラールが生成することが知られている。フルフラール系化合物のうち、「フルフラール」は２－フリルアルデヒドの通称である。
本発明における「フルフラール系化合物」とは、フルフラール及び５－ヒドロキシメチルフルフラール、ならびにそれらの誘導体を意味する。
理論に束縛されるものではないが、フルフラール系化合物によりさらに広範囲な分子量にＰＨＡの分子量を制御してＰＨＡを製造することができる理由は、フルフラール系化合物が、重合により生成されたポリマー鎖の移動反応を起こしやすくすることによるものである可能性がある。重合によりポリマーが生成するときに、フルフラール系化合物により比較的低い分子量のポリマー鎖の成長末端が移動を促進されることにより該ポリマー鎖の伸長は停止され、該ポリマーとは別異の次のポリマー鎖の伸長が開始されることとなるため、得られるＰＨＡの分子量はフルフラール系化合物を用いない場合より小さくなると考えることができる。
本発明における「フルフラール系化合物」とは、フルフラール及び５－ヒドロキシメチルフルフラール、ならびにそれらの誘導体を意味する。
理論に束縛されるものではないが、フルフラール系化合物によりさらに広範囲な分子量にＰＨＡの分子量を制御してＰＨＡを製造することができる理由は、フルフラール系化合物が、重合により生成されたポリマー鎖の移動反応を起こしやすくすることによるものである可能性がある。重合によりポリマーが生成するときに、フルフラール系化合物により比較的低い分子量のポリマー鎖の成長末端が移動を促進されることにより該ポリマー鎖の伸長は停止され、該ポリマーとは別異の次のポリマー鎖の伸長が開始されることとなるため、得られるＰＨＡの分子量はフルフラール系化合物を用いない場合より小さくなると考えることができる。
フルフラール系化合物が用いられる本発明の製造方法又は制御方法において用いられるフルフラール系化合物の種類は限定されず、フルフラール及び５－ヒドロキシメチルフルフラール、ならびにそれらの誘導体が例示される。かかる誘導体として、５－ヒドロキシメチルフランカルボン酸、５－ヒドロキシフルフリルアルコール、フラン－２，５－ビスメタノールとそれらをエーテル化又はエステル化されてなるものが挙げられる。エーテル化としてはメトキシ化が、エステル化としてはアセチル化及びメチルエステル化が、それぞれ例示される。
糖がグルコース及びその誘導体、ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上であり、フルフラール系化合物がフルフラール及び/又は５－ヒドロキシメチルフルフラール又はそれらの誘導体である本発明の製造方法又は本発明の制御方法は、好ましい。
糖がグルコース及びその誘導体、ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上であり、フルフラール系化合物がフルフラール及び/又は５－ヒドロキシメチルフルフラール又はそれらの誘導体である本発明の製造方法又は本発明の制御方法は、好ましい。
本発明の製造方法において用いられるフルフラール系化合物の量は限定されず、培養の初期濃度として約０．０１～約３．０g/Lが例示される。フルフラール系化合物の初期濃度として、０．０１ｇ/Ｌ～１ｇ/Ｌは好ましい。
用いられるフルフラール系化合物の量の糖の量に対する割合は限定されず、約０．００２５～約０．６が例示される。用いられるフルフラール系化合物の量の糖の量に対する割合が、０．０１～０．２である本発明の製造方法又は本発明の制御方法は好ましい。
用いられるフルフラール系化合物の量の糖の量に対する割合は限定されず、約０．００２５～約０．６が例示される。用いられるフルフラール系化合物の量の糖の量に対する割合が、０．０１～０．２である本発明の製造方法又は本発明の制御方法は好ましい。
＜微生物＞
本発明の製造方法において用いられる微生物は限定されないところ、該微生物として好塩菌は好ましく、高度好塩菌はとくに好ましい。好塩菌（高度好塩菌を含む）は本発明の製造方法における培養に適合する微生物であり、また、ＰＨＡの生産能が高いばかりでなく、生産されたＰＨＡの回収が容易だからである。
高度好塩菌のうちHaloferax属、Halalkalicoccus属、Haloarchaeobius属、Haloarcula属、Halobacterium属、Halobaculum属、Halococcus属、Halogranum属、Halomarina属、Halorubrum属、Haloterrigena属、Natrialba属、Natronobacterium属は好ましく、Haloferax mediterraneiはとくに好ましい。
本発明の製造方法において用いられる微生物は限定されないところ、該微生物として好塩菌は好ましく、高度好塩菌はとくに好ましい。好塩菌（高度好塩菌を含む）は本発明の製造方法における培養に適合する微生物であり、また、ＰＨＡの生産能が高いばかりでなく、生産されたＰＨＡの回収が容易だからである。
高度好塩菌のうちHaloferax属、Halalkalicoccus属、Haloarchaeobius属、Haloarcula属、Halobacterium属、Halobaculum属、Halococcus属、Halogranum属、Halomarina属、Halorubrum属、Haloterrigena属、Natrialba属、Natronobacterium属は好ましく、Haloferax mediterraneiはとくに好ましい。
＜その他の培養条件＞
本発明のＰＨＡの製造方法における微生物の培養に関し、上記炭素源及び微生物以外の条件については限定されず、本技術分野において通常用いられる条件や公知の条件を用いてよい。
また本発明の製造方法における培養に用いられる培地としては、固体であっても液体であってもゲル状であっても構わないが、生産スピードの観点から液体培地であることは好ましい。
また本発明の製造方法における培養において、総塩濃度としては例えば100g/L～300g/Lが挙げられる。総塩濃度が150g/L～250g/Lであることは、前記のとおり好ましい。
用いられる培地としては、例えばNH4Cl、KH2PO4、FeCl3、NaCl、MgCl2、MgSO4、CaCl2、KCl、NaHCO3及びNaBr等の無機塩類を含有するものが挙げられる。これらの無機塩類の種類と量は限定されず、例えばNH4Cl、KH2PO4、FeCl3、KCl、NaHCO3、NaBr及びNaClについては、それぞれ以下の量(g/L)が例示されることも前記のとおりである：
NH4Cl：０．１～２．５、KH2PO4：０．００５～５．０、FeCl3 ：０．００００１～０．０１、KCl：０．３～３、NaHCO3 ：０．０１～０．３、NaBr：０．０３～０．５、 NaCl： ３０～３００。
本発明のＰＨＡの製造方法において用いられる培地として、ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター）がウェブサイトにおいて公開している培地一覧（https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/culture-list.html）におけるNo.1380の培地は好ましい。当該No.1380の培地組成を上記培地一覧から引用して示す：
本発明のＰＨＡの製造方法における微生物の培養に関し、上記炭素源及び微生物以外の条件については限定されず、本技術分野において通常用いられる条件や公知の条件を用いてよい。
また本発明の製造方法における培養に用いられる培地としては、固体であっても液体であってもゲル状であっても構わないが、生産スピードの観点から液体培地であることは好ましい。
また本発明の製造方法における培養において、総塩濃度としては例えば100g/L～300g/Lが挙げられる。総塩濃度が150g/L～250g/Lであることは、前記のとおり好ましい。
用いられる培地としては、例えばNH4Cl、KH2PO4、FeCl3、NaCl、MgCl2、MgSO4、CaCl2、KCl、NaHCO3及びNaBr等の無機塩類を含有するものが挙げられる。これらの無機塩類の種類と量は限定されず、例えばNH4Cl、KH2PO4、FeCl3、KCl、NaHCO3、NaBr及びNaClについては、それぞれ以下の量(g/L)が例示されることも前記のとおりである：
NH4Cl：０．１～２．５、KH2PO4：０．００５～５．０、FeCl3 ：０．００００１～０．０１、KCl：０．３～３、NaHCO3 ：０．０１～０．３、NaBr：０．０３～０．５、 NaCl： ３０～３００。
本発明のＰＨＡの製造方法において用いられる培地として、ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター）がウェブサイトにおいて公開している培地一覧（https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/culture-list.html）におけるNo.1380の培地は好ましい。当該No.1380の培地組成を上記培地一覧から引用して示す：
本発明の製造方法における微生物の培養に用いられる培地に含有される栄養源についてさらに説明するに、炭素源としては、上記いずれかの糖が少なくとも用いられることは上述のとおりであるところ、微生物を培養する際の上記糖とは別の炭素源として、アミノ酸類、アルコール類、油脂類、及び／又は脂肪酸類等の通常微生物培養に用いられる炭素源を用いてよい。具体的には以下のものが例示される：
アミノ酸類として、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、リシン、ロイシン、カザミノ酸、グルタミン酸；
アルコール類として、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、グリセロール；
油脂類として、パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、及び菜種油；
脂肪酸類として、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、クロトン酸、クエン酸、及びピルビン酸とそのナトリウム塩やアンモニウム塩などの脂肪酸塩。脂肪酸類が用いられる場合、該脂肪酸類の量は少量であることが好ましい。
アミノ酸類として、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、リシン、ロイシン、カザミノ酸、グルタミン酸；
アルコール類として、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、グリセロール；
油脂類として、パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、及び菜種油；
脂肪酸類として、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、クロトン酸、クエン酸、及びピルビン酸とそのナトリウム塩やアンモニウム塩などの脂肪酸塩。脂肪酸類が用いられる場合、該脂肪酸類の量は少量であることが好ましい。
本発明の製造方法における微生物の培養に用いられる培地には、窒素源や無機塩類等をさらに含んでよい。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩のほか、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マンガン（II）、塩化コバルト（II）、塩化カルシウム、塩化亜鉛、塩化銅（II）、ホウ酸（H3BO3）、マンガン酸ナトリウム（Na2MnO4)、及び塩化ニッケル（II）等が挙げられる。本発明においては、これらの無機塩類を包含する各種塩類を、水和物の形態で用いてよい。また、例えば、カルシウム塩にホタテの殻を用いるなど廃棄物を利用することは好ましい。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩のほか、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マンガン（II）、塩化コバルト（II）、塩化カルシウム、塩化亜鉛、塩化銅（II）、ホウ酸（H3BO3）、マンガン酸ナトリウム（Na2MnO4)、及び塩化ニッケル（II）等が挙げられる。本発明においては、これらの無機塩類を包含する各種塩類を、水和物の形態で用いてよい。また、例えば、カルシウム塩にホタテの殻を用いるなど廃棄物を利用することは好ましい。
本発明の製造方法において微生物を培養する際の培養の温度は、該微生物が生育可能な温度であれば限定されないところ、例えば約１０℃～約６５℃が挙げられ、２０℃～５０℃は好ましく、３５℃～４５℃はより好ましい。
本発明の製造方法において、炭素源、無機塩類、有機栄養源を添加するタイミングに関しては限定されないところ、一般的に用いられている回分培養、流加培養、連続培養等の方法を目的に応じて適宜選択して用いることができる。
本発明の製造方法における微生物の培養時間としては、回分培養では２４時間～１６８時間、流加培養では７２時間～１４日間、連続培養では１４日間を超える長期間が例示されるが、これらの時間に限定されない。
本発明の製造方法において、培養中にpHが変化しづらくするために緩衝液を加えることができる。かかる緩衝液としてはトリス塩酸緩衝液、PIPES、HEPES等が挙げられる。PIPES、HEPESを用いることは、培養時に緩衝液自体が窒素源、炭素源、硫化物源として用いられづらいことから好ましい。
緩衝液の濃度としては、5g/L～40g/Lが挙げられ、10～20g/Lであることは好ましい。
緩衝液を含む培地でフラスコを用いて振とう培養をする場合、pH調整をせずともpHが変化しづらいので、pHを常に一定に保つジャーファーメンターでの培養に近い条件であると考えることができる。
本発明の方法において培養中にpHを一定に保つために、アンモニア、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、リン酸３カリウムのような塩基性成分を適宜添加してよい。
本発明の製造方法において、炭素源、無機塩類、有機栄養源を添加するタイミングに関しては限定されないところ、一般的に用いられている回分培養、流加培養、連続培養等の方法を目的に応じて適宜選択して用いることができる。
本発明の製造方法における微生物の培養時間としては、回分培養では２４時間～１６８時間、流加培養では７２時間～１４日間、連続培養では１４日間を超える長期間が例示されるが、これらの時間に限定されない。
本発明の製造方法において、培養中にpHが変化しづらくするために緩衝液を加えることができる。かかる緩衝液としてはトリス塩酸緩衝液、PIPES、HEPES等が挙げられる。PIPES、HEPESを用いることは、培養時に緩衝液自体が窒素源、炭素源、硫化物源として用いられづらいことから好ましい。
緩衝液の濃度としては、5g/L～40g/Lが挙げられ、10～20g/Lであることは好ましい。
緩衝液を含む培地でフラスコを用いて振とう培養をする場合、pH調整をせずともpHが変化しづらいので、pHを常に一定に保つジャーファーメンターでの培養に近い条件であると考えることができる。
本発明の方法において培養中にpHを一定に保つために、アンモニア、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、リン酸３カリウムのような塩基性成分を適宜添加してよい。
本発明の製造方法において、培地における溶存酸素量を大きくすることは好ましく、培地における溶存酸素量を飽和量に保つことはより好ましい。
本発明の製造方法において培地のｐＨは限定されないところ、培地の初期のｐＨを約６．５～約７．５とすることは好ましい。培地の初期のｐＨを約６．５～約７．５とし、培養中の培地のｐＨを約６．５～約７．５に維持することはより好ましい。これらのｐＨを約７．０～約７．４にすることはさらに好ましい。
本発明の製造方法において培地のｐＨは限定されないところ、培地の初期のｐＨを約６．５～約７．５とすることは好ましい。培地の初期のｐＨを約６．５～約７．５とし、培養中の培地のｐＨを約６．５～約７．５に維持することはより好ましい。これらのｐＨを約７．０～約７．４にすることはさらに好ましい。
本発明の制御方法においても、本発明の製造方法に用いられるその他の培養条件を用いることができる。
＜本発明の製造方法により製造されるＰＨＡ＞
本発明の製造方法における生成物であるＰＨＡの種類は限定されないところ、ＰＨＢＶ、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブチレート）、ポリ(ヒドロキシブチレート／ヒドロキシヘキサノエート、及びポリ（３ヒドロキシブチレート／４－ヒドロキシブチレート）が例示される。これらのうち、ＰＨＢＶ及び／又はＰＨＢが好適な生成物である。
本発明の製造方法における生成物であるＰＨＡの種類は限定されないところ、ＰＨＢＶ、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブチレート）、ポリ(ヒドロキシブチレート／ヒドロキシヘキサノエート、及びポリ（３ヒドロキシブチレート／４－ヒドロキシブチレート）が例示される。これらのうち、ＰＨＢＶ及び／又はＰＨＢが好適な生成物である。
本発明の製造方法により製造されたＰＨＡは、有機溶媒や界面活性剤、低濃度塩化ナトリウム水溶液又は水を用いる遠心分離や濾過・沈殿による公知の方法により菌体から回収することができる。
本発明の製造方法において微生物が産生するＰＨＡの生産量と３HV分率は、ＧＣ－ＭＳ法等の公知の方法を用いて測定してよい。本発明の製造方法により得られるＰＨＡが共重合体である場合、第２成分分率もＧＣ－ＭＳ法等の公知の方法を用いて決定してよい。
グルコース又はその誘導体やその他の糖質、フルフラール系化合物の濃度の測定には、市販の濃度測定キットによる測定や、ＨＰＬＣ法などの公知の方法を用いてよい。
本発明の製造方法において微生物が培養された際の微生物菌体の生産量を特定することが必要な場合には、微生物菌体の生産量は吸光度法や乾燥菌体重量測定法などの公知の方法で測定してよい。
本発明の製造方法において微生物が産生するＰＨＡの生産量と３HV分率は、ＧＣ－ＭＳ法等の公知の方法を用いて測定してよい。本発明の製造方法により得られるＰＨＡが共重合体である場合、第２成分分率もＧＣ－ＭＳ法等の公知の方法を用いて決定してよい。
グルコース又はその誘導体やその他の糖質、フルフラール系化合物の濃度の測定には、市販の濃度測定キットによる測定や、ＨＰＬＣ法などの公知の方法を用いてよい。
本発明の製造方法において微生物が培養された際の微生物菌体の生産量を特定することが必要な場合には、微生物菌体の生産量は吸光度法や乾燥菌体重量測定法などの公知の方法で測定してよい。
また本発明の製造方法により得られるＰＨＡの分子量の測定も公知の方法により行ってよく、例えばポリスチレン標準を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより行うことができる。本明細書におけるＰＨＡの分子量には、他の記載がない限りポリスチレン標準を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより測定された数値を用いたことは前述のとおりである。
本発明の製造方法で製造されるＰＨＡの重量平均分子量は、フルフラール系化合物を用いない場合には約１００万から約６００万であり、フルフラール系化合物を用いる場合には約２０万から約６００万である。それぞれの範囲において得られるＰＨＡの分子量を、本発明の製造方法においては制御又は調節することができる。
本発明の製造方法で製造されるＰＨＡの重量平均分子量は、フルフラール系化合物を用いない場合には約１００万から約６００万であり、フルフラール系化合物を用いる場合には約２０万から約６００万である。それぞれの範囲において得られるＰＨＡの分子量を、本発明の製造方法においては制御又は調節することができる。
２．ＰＨＢＶ
本発明の製造方法により、３－ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）と３－ヒドロキシバレリル酸（３ＨＶ）とがランダムに共重合した共重合体（以下「ＰＨＢＶ」ということがある）も提供され、かかるＰＨＢＶは重量平均分子量が３６１万を超えるものであり、好ましくは分子量が４００万を超えるものである。本発明のＰＨＢＶとして分子量が５００万を超えるものはより好ましく、分子量が５７０万を超えるものは一層好ましい。
本発明のＰＨＢＶは、以下で示される構造単位を、ＰＨＢＶ全体の分子量が３６１万を超える任意の組み合わせとして含む（下式においてｍ及びｎは整数を表す）：
本発明のＰＨＢＶの構造、モノマーの組成及び分子量は限定されず、分子量が３６１万を超えるものであればよい。本発明のＰＨＢＶは線状であり、少なくとも実質的に直鎖状である本発明のＰＨＢＶは好ましい。
本発明のＰＨＢＶは上記のとおり３ＨＢと３ＨＶとがランダムに共重合した共重合体であるところ、３ＨＢと３ＨＶとの交互共重合又はブロック共重合により生成される共重合体も包含される。
本発明の製造方法により、３－ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）と３－ヒドロキシバレリル酸（３ＨＶ）とがランダムに共重合した共重合体（以下「ＰＨＢＶ」ということがある）も提供され、かかるＰＨＢＶは重量平均分子量が３６１万を超えるものであり、好ましくは分子量が４００万を超えるものである。本発明のＰＨＢＶとして分子量が５００万を超えるものはより好ましく、分子量が５７０万を超えるものは一層好ましい。
本発明のＰＨＢＶは、以下で示される構造単位を、ＰＨＢＶ全体の分子量が３６１万を超える任意の組み合わせとして含む（下式においてｍ及びｎは整数を表す）：
本発明のＰＨＢＶの構造、モノマーの組成及び分子量は限定されず、分子量が３６１万を超えるものであればよい。本発明のＰＨＢＶは線状であり、少なくとも実質的に直鎖状である本発明のＰＨＢＶは好ましい。
本発明のＰＨＢＶは上記のとおり３ＨＢと３ＨＶとがランダムに共重合した共重合体であるところ、３ＨＢと３ＨＶとの交互共重合又はブロック共重合により生成される共重合体も包含される。
本発明のＰＨＢＶにおいて、ＰＨＢＶを構成する３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシバレリル酸とのモル比は限定されない。３ＨＶ分率（共重合体を構成する３－ヒドロキシブタン酸のモル数と３－ヒドロキシバレリル酸のモル数の総和に対する３－ヒドロキシバレリル酸のモル数の割合）が、約５．０％～約４０．０％である本発明のＰＨＢＶは好ましく、約５．０％～約２８．０％である本発明のＰＨＢＶはより好ましく、約７．０％～１８．０％である本発明のＰＨＢＶは一層より好ましく、約９．０％～約１５．０％である本発明のＰＨＢＶは一層さらにより好ましい。
本発明のＰＨＢＶのうち、従来のＰＨＢＶを上回る特性、とくに従来のＰＨＢＶより柔軟である、及び／又はより強度に優れるといった特性を有するものは好ましい。本発明のＰＨＢＶのうち、引張強度に優れるものは好ましい。
本発明のＰＨＢＶのうち、冷延伸により引張強度が一層優れたものになるものも好ましい。冷延伸後の引張強度が２４０ＭＰａ以上であるものは好ましく、該引張強度が２５０ＭＰａ以上であるものはより好ましく、該引張強度が２５５ＭＰａ以上であるものは一層より好ましい。
本発明により、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した、重量平均分子量が３６１万より大きい共重合体を冷延伸したフィルムも提供される。かかるフィルムは重量平均分子量が100万の通常分子量PHBVと比べ引張強度に優れるといった特徴がある。
本発明のＰＨＢＶのうち、冷延伸により引張強度が一層優れたものになるものも好ましい。冷延伸後の引張強度が２４０ＭＰａ以上であるものは好ましく、該引張強度が２５０ＭＰａ以上であるものはより好ましく、該引張強度が２５５ＭＰａ以上であるものは一層より好ましい。
本発明により、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した、重量平均分子量が３６１万より大きい共重合体を冷延伸したフィルムも提供される。かかるフィルムは重量平均分子量が100万の通常分子量PHBVと比べ引張強度に優れるといった特徴がある。
本発明の上記フィルムのうち、引張強度が２４０ＭＰａ以上であるものは好ましく、該引張強度が２５０ＭＰａ以上であるものはより好ましく、該引張強度が２５５ＭＰａ以上であるものは一層より好ましい。
また、冷延伸が以下の工程を含む上記フィルムは、引張強度に優れるフィルムがより確実に得られるため好ましい：
（１）３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体を溶融させて溶融フィルムを得る
（２）（１）で得られた溶融フィルムを氷水中で急冷し、非晶フィルムを作製する
（３）（２）で得られた非晶フィルムをそのまま氷水中で１０倍の長さまで延伸し非晶フィルムを配向させる
（４）（３）で得られた配向後のフィルムに緊張熱処理を行い結晶化させ、冷延伸したフィルムを得る。
冷延伸による引張強度の向上を考慮すると、３HV分率が５％以上であるものは冷延伸による引張強度の向上が顕著であるため好ましい。これは、3HV成分を５％以上の割合で含んだ結晶がPHBと同等の強度を発揮する上に、170℃での融解が可能になるからであると推定されるが、本発明が効果を発揮するメカニズムについてはかかる理論に拘束されるものではない。３HV分率が５％～１５％である本発明のＰＨＢＶは、より好ましい。
また、冷延伸が以下の工程を含む上記フィルムは、引張強度に優れるフィルムがより確実に得られるため好ましい：
（１）３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体を溶融させて溶融フィルムを得る
（２）（１）で得られた溶融フィルムを氷水中で急冷し、非晶フィルムを作製する
（３）（２）で得られた非晶フィルムをそのまま氷水中で１０倍の長さまで延伸し非晶フィルムを配向させる
（４）（３）で得られた配向後のフィルムに緊張熱処理を行い結晶化させ、冷延伸したフィルムを得る。
冷延伸による引張強度の向上を考慮すると、３HV分率が５％以上であるものは冷延伸による引張強度の向上が顕著であるため好ましい。これは、3HV成分を５％以上の割合で含んだ結晶がPHBと同等の強度を発揮する上に、170℃での融解が可能になるからであると推定されるが、本発明が効果を発揮するメカニズムについてはかかる理論に拘束されるものではない。３HV分率が５％～１５％である本発明のＰＨＢＶは、より好ましい。
本発明のＰＨＢＶを製造するための方法は、上記工程（ａ）及び（ｂ）を含む方法であれば限定されず、重量平均分子量が３６１万を超えるＰＨＢＶを製造することができる方法であってよい。
かかる方法として、微生物を培養し、培養産物として本発明のＰＨＢＶを得る方法が例示されるところ、前記培養における微生物として高度好塩菌を用い、炭素源としてグルコース及び／又はその誘導体を用いる方法は好ましく、グルコースを用いる方法はとくに好ましい。これらの方法によれば、重量平均分子量が３６１万を超えるＰＨＢＶを効率的に製造することができ、また製造されたＰＨＢＶを簡便に回収することができるからである。
かかる方法として、微生物を培養し、培養産物として本発明のＰＨＢＶを得る方法が例示されるところ、前記培養における微生物として高度好塩菌を用い、炭素源としてグルコース及び／又はその誘導体を用いる方法は好ましく、グルコースを用いる方法はとくに好ましい。これらの方法によれば、重量平均分子量が３６１万を超えるＰＨＢＶを効率的に製造することができ、また製造されたＰＨＢＶを簡便に回収することができるからである。
本発明の上記ＰＨＡの製造方法を用いて本発明のＰＨＢＶを製造する場合、炭素源としての糖類は
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ、又は
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、
であってよい。
本発明のＰＨＢＶは、酵母エキスを用い、酵母エキスに含有されるアミノ酸などの炭素源以外の炭素源を添加しなくても製造される。酵母エキスに含有されるアミノ酸などの炭素源以外の炭素源を用いることにより、より小さいコストで本発明のＰＨＢＶを製造することができる。
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ、又は
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、
であってよい。
本発明のＰＨＢＶは、酵母エキスを用い、酵母エキスに含有されるアミノ酸などの炭素源以外の炭素源を添加しなくても製造される。酵母エキスに含有されるアミノ酸などの炭素源以外の炭素源を用いることにより、より小さいコストで本発明のＰＨＢＶを製造することができる。
（本発明の例）
本発明を実施例及び参考例によりさらに具体的に説明する。本発明は、いかなる意味においてもかかる実施例に限定されるものではない。
すべての実施例において他に記載がない限りNBRCより提供の菌株 Haloferax mediterranei NBRC 14739を用いて実験を行った。
すべての実施例において他に記載がない限り、上記菌を各例の項において示される方法・条件にて培養後、培養により得られたＰＨＡ（ＰＨＢＶ）の分子量をポリスチレン標準を用いたGPC(ゲルろ過クロマトグラフィー)により測定し、分子量として示した。
GPC測定には、東ソー株式会社製EcoSEC HLC-8320GPCを使用した。ガードカラムはTSKgel guardcolumn SuperHZ-Hを、カラムはTSKgel Super HZM-H２本を直列につないで用いた。移動相にはクロロホルム（０．６mL/min）を用い、カラム温度は４０℃とした。サンプル濃度は約0.5 mg/mLとし、サンプル注入量は10μLとした。検量線の作成には、ポリスチレン標準を用いた。
共重合体の3-ヒドロキシバレリル酸(３ＨＶ)分率とPHBV生産量の測定はガスクロマトグラフィー-質量分析(GC-MS法)を用いて以下のように行った（機器名：Agilent 6890 / 5973 GCMS System ）。すなわち、乾燥菌体の約2mg～25mgに2mlの硫酸－メタノール混液(15:85)と2mlのクロロホルムを添加して密栓し、100℃で140分間加熱することでポリエステル分解物のメチルエステルを得て、これに水１mLを加えて攪拌後、クロロホルム層をGC-MS法により分析して行った。
これらのＰＨＡの生産量、分子量、３HV分率の測定方法は、ＰＨＡの生産量、分子量、３HV分率を特定するための手法として本技術分野において通常用いられるものである。また、これらの方法により特定されたＰＨＡの生産量、分子量及び３HV分率の数値は公知文献に記載されているＰＨＡの生産量、分子量及び３HV分率の数値と、その大小をそれぞれ正確に比較することができるものである。
乾燥菌体重量は、凍結乾燥法などの公知の方法により測定することができる。乾燥菌体に含まれる無機塩を定量したいときは、高温で無機塩以外の有機物をすべて熱分解する方法を用いてもよい。
本実施例において、海水として、人工海水、天然海水、及び海洋深層水を用いた。人工海水にはダイゴ人工海水SPを、天然海水には、石垣島の海水を用いた。人工海水の成分は、表１に記載のとおりであった。天然海水及び海洋深層水の成分は、表２に記載の通りであった。なお、表２に記載の化合物以外の成分については分析を行っていない。
本発明を実施例及び参考例によりさらに具体的に説明する。本発明は、いかなる意味においてもかかる実施例に限定されるものではない。
すべての実施例において他に記載がない限りNBRCより提供の菌株 Haloferax mediterranei NBRC 14739を用いて実験を行った。
すべての実施例において他に記載がない限り、上記菌を各例の項において示される方法・条件にて培養後、培養により得られたＰＨＡ（ＰＨＢＶ）の分子量をポリスチレン標準を用いたGPC(ゲルろ過クロマトグラフィー)により測定し、分子量として示した。
GPC測定には、東ソー株式会社製EcoSEC HLC-8320GPCを使用した。ガードカラムはTSKgel guardcolumn SuperHZ-Hを、カラムはTSKgel Super HZM-H２本を直列につないで用いた。移動相にはクロロホルム（０．６mL/min）を用い、カラム温度は４０℃とした。サンプル濃度は約0.5 mg/mLとし、サンプル注入量は10μLとした。検量線の作成には、ポリスチレン標準を用いた。
共重合体の3-ヒドロキシバレリル酸(３ＨＶ)分率とPHBV生産量の測定はガスクロマトグラフィー-質量分析(GC-MS法)を用いて以下のように行った（機器名：Agilent 6890 / 5973 GCMS System ）。すなわち、乾燥菌体の約2mg～25mgに2mlの硫酸－メタノール混液(15:85)と2mlのクロロホルムを添加して密栓し、100℃で140分間加熱することでポリエステル分解物のメチルエステルを得て、これに水１mLを加えて攪拌後、クロロホルム層をGC-MS法により分析して行った。
これらのＰＨＡの生産量、分子量、３HV分率の測定方法は、ＰＨＡの生産量、分子量、３HV分率を特定するための手法として本技術分野において通常用いられるものである。また、これらの方法により特定されたＰＨＡの生産量、分子量及び３HV分率の数値は公知文献に記載されているＰＨＡの生産量、分子量及び３HV分率の数値と、その大小をそれぞれ正確に比較することができるものである。
乾燥菌体重量は、凍結乾燥法などの公知の方法により測定することができる。乾燥菌体に含まれる無機塩を定量したいときは、高温で無機塩以外の有機物をすべて熱分解する方法を用いてもよい。
本実施例において、海水として、人工海水、天然海水、及び海洋深層水を用いた。人工海水にはダイゴ人工海水SPを、天然海水には、石垣島の海水を用いた。人工海水の成分は、表１に記載のとおりであった。天然海水及び海洋深層水の成分は、表２に記載の通りであった。なお、表２に記載の化合物以外の成分については分析を行っていない。
［人工海水の成分］
［天然海水及び海洋深層水の成分］
［天然海水及び海洋深層水の成分］
実施例１～１２
［材料と方法］
Haloferax mediterraneiについて、NBRC指定培地No.1214を参考に培地を調製した（NBRC指定培地No.1214の成分組成は前記及び後記のとおり）。実施例１～４、５～８、９～１２はそれぞれ海水として人工海水、天然海水、海洋深層水を用いた。実施例１～４、５～８、９～１２では海水の濃縮率をそれぞれ１倍(通常の海水)、２倍、３倍、４倍とし、総塩濃度を一致させるために、塩化ナトリウムを表３中に示される量でさらに添加した。300 mL容三角フラスコに50 mLの培地を加え、200rpm、37℃で72 h培養した。
［材料と方法］
Haloferax mediterraneiについて、NBRC指定培地No.1214を参考に培地を調製した（NBRC指定培地No.1214の成分組成は前記及び後記のとおり）。実施例１～４、５～８、９～１２はそれぞれ海水として人工海水、天然海水、海洋深層水を用いた。実施例１～４、５～８、９～１２では海水の濃縮率をそれぞれ１倍(通常の海水)、２倍、３倍、４倍とし、総塩濃度を一致させるために、塩化ナトリウムを表３中に示される量でさらに添加した。300 mL容三角フラスコに50 mLの培地を加え、200rpm、37℃で72 h培養した。
［結果］
下表（表３及び表４、図１）に示すとおりであった。いずれの海水においても、海水の濃度が上がると、3HV分率が下がる、乾燥菌体重量が上がる、PHBV生産量が上がる、及び分子量は安定して高い値をとる、という結果になった。
下表（表３及び表４、図１）に示すとおりであった。いずれの海水においても、海水の濃度が上がると、3HV分率が下がる、乾燥菌体重量が上がる、PHBV生産量が上がる、及び分子量は安定して高い値をとる、という結果になった。
実施例１３～２４
［材料と方法］
Haloferax mediterraneiについて、NBRC指定培地No.1338を参考に培地を調製した（NBRC指定培地No.1338の成分組成は前記及び後記のとおり）。実施例１３～１６、１７～２０、２１～２４はそれぞれ海水として人工海水、天然海水、及び海洋深層水を用いた。実施例１３～１６、１７～２０、２１～２４では海水の濃縮率をそれぞれ１倍(通常の海水)、２倍、３倍、４倍とし、総塩濃度を一致させるために、塩化ナトリウムを表５中に示される量でさらに添加した。300 mL容三角フラスコに50 mLの培地を加え、200rpm、37℃で72 h培養した。
［材料と方法］
Haloferax mediterraneiについて、NBRC指定培地No.1338を参考に培地を調製した（NBRC指定培地No.1338の成分組成は前記及び後記のとおり）。実施例１３～１６、１７～２０、２１～２４はそれぞれ海水として人工海水、天然海水、及び海洋深層水を用いた。実施例１３～１６、１７～２０、２１～２４では海水の濃縮率をそれぞれ１倍(通常の海水)、２倍、３倍、４倍とし、総塩濃度を一致させるために、塩化ナトリウムを表５中に示される量でさらに添加した。300 mL容三角フラスコに50 mLの培地を加え、200rpm、37℃で72 h培養した。
［結果］
下表（表６、図２）に示す通りであった。いずれの海水においても、海水の濃度が上がると、3HV分率が下がる、乾燥菌体重量が上がる、PHBV生産量が上がる、及び分子量は安定して高い値をとる、という結果になった。
下表（表６、図２）に示す通りであった。いずれの海水においても、海水の濃度が上がると、3HV分率が下がる、乾燥菌体重量が上がる、PHBV生産量が上がる、及び分子量は安定して高い値をとる、という結果になった。
比較例１、実施例２５～３６、比較例２、実施例３７～４８（無機塩の、海水成分による置換の可否）
［材料と方法］
Haloferax mediterraneiについて、下表（表７）のとおりの、BSM培地(BSM培地については、参考例Bに記載)を改変した培地（実施例２５～３６）及び1380培地を改変した培地（実施例３７～４８）を調製した。
これらの実施例においては、BSM培地又は1380培地に含まれる無機塩類のうち、アンモニウム塩及びリン酸塩を除くすべての無機塩類（カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、微量金属塩類）を海水で置き換えた。上記実施例に対応する比較例として比較例１及び２を調製した。
より詳細には、有機栄養源の種類・量は変えずに、実施例２５～４８では塩として海水と塩化ナトリウム、ならびにアンモニウム塩及びリン酸塩を併用した。比較例１、２では海水を用いずに、塩として実施例と同様の塩（塩化ナトリウム、アンモニウム塩及びリン酸塩を）のみを添加した。300 mL容三角フラスコに50 mLの培地を加え、200rpm、37℃で72 h培養した。
［材料と方法］
Haloferax mediterraneiについて、下表（表７）のとおりの、BSM培地(BSM培地については、参考例Bに記載)を改変した培地（実施例２５～３６）及び1380培地を改変した培地（実施例３７～４８）を調製した。
これらの実施例においては、BSM培地又は1380培地に含まれる無機塩類のうち、アンモニウム塩及びリン酸塩を除くすべての無機塩類（カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、微量金属塩類）を海水で置き換えた。上記実施例に対応する比較例として比較例１及び２を調製した。
より詳細には、有機栄養源の種類・量は変えずに、実施例２５～４８では塩として海水と塩化ナトリウム、ならびにアンモニウム塩及びリン酸塩を併用した。比較例１、２では海水を用いずに、塩として実施例と同様の塩（塩化ナトリウム、アンモニウム塩及びリン酸塩を）のみを添加した。300 mL容三角フラスコに50 mLの培地を加え、200rpm、37℃で72 h培養した。
［結果］
下表（表８）に示す通りであった。比較例１、２と比べ、海水を用いることでより多くの超高分子量PHAが生産された。塩化ナトリウム以外の無機塩類についても、海水により置き換えられることが明らかになった。コスト面や培地を作る手間の面での優位性が示された。
一方で、表８において「PHA」と表記されるPHBV生産量は実施例１～２４（表４）と同等であった。培養中のpHが低下したことにより、細菌の生育への影響が生じたためである可能性が考えられた。
下表（表８）に示す通りであった。比較例１、２と比べ、海水を用いることでより多くの超高分子量PHAが生産された。塩化ナトリウム以外の無機塩類についても、海水により置き換えられることが明らかになった。コスト面や培地を作る手間の面での優位性が示された。
一方で、表８において「PHA」と表記されるPHBV生産量は実施例１～２４（表４）と同等であった。培養中のpHが低下したことにより、細菌の生育への影響が生じたためである可能性が考えられた。
比較例３、４、実施例４９～７２（pHの変化を抑制することの効果）
［材料と方法］
pHの変化しない培地を用いてジャーファーメンター培養に近い条件における培養を行い、pHの変化を抑制することによりもたらされる効果について確認を行った。
Haloferax mediterraneiについて、下表（表９）のとおりの培地（比較例３、実施例４９～６０、比較例４、実施例６１～７２）をそれぞれ調製した。これらの培地は、比較例１、実施例２５～３６、比較例２、実施例３７～４８に相当する培地のそれぞれに、緩衝液としてPIPESを15g/L加えたものである。300 mL容三角フラスコに50 mLの培地を加え、200rpm、37℃で72 h培養した。
［材料と方法］
pHの変化しない培地を用いてジャーファーメンター培養に近い条件における培養を行い、pHの変化を抑制することによりもたらされる効果について確認を行った。
Haloferax mediterraneiについて、下表（表９）のとおりの培地（比較例３、実施例４９～６０、比較例４、実施例６１～７２）をそれぞれ調製した。これらの培地は、比較例１、実施例２５～３６、比較例２、実施例３７～４８に相当する培地のそれぞれに、緩衝液としてPIPESを15g/L加えたものである。300 mL容三角フラスコに50 mLの培地を加え、200rpm、37℃で72 h培養した。
［結果］
下表（表１０－１）及び図３に示す通りであった。なお、pHの変化を、比較例１、実施例２５～３６、比較例２、実施例３７～４８におけるpHの変化と併せて示す（表１０－２）。
比較例１，２と比べ、海水を用いることでより多くの超高分子量PHAが生産された。また、人工海水及び天然海水では、海水濃度が濃くなるにつれてPHA生産量が増えた。さらに、緩衝液により培養中のpHの変化が抑えられたため、実施例25～48と比べPHBV生産量が多くなった（表１０－１及び図３）。
下表（表１０－１）及び図３に示す通りであった。なお、pHの変化を、比較例１、実施例２５～３６、比較例２、実施例３７～４８におけるpHの変化と併せて示す（表１０－２）。
比較例１，２と比べ、海水を用いることでより多くの超高分子量PHAが生産された。また、人工海水及び天然海水では、海水濃度が濃くなるにつれてPHA生産量が増えた。さらに、緩衝液により培養中のpHの変化が抑えられたため、実施例25～48と比べPHBV生産量が多くなった（表１０－１及び図３）。
濃縮海水を用いた培養予備試験
Haloferax mediterraneiについて、NBRC指定培地No.1380でグルコース濃度のみ5g/Lに変更した（NBRC指定培地No.1380の培地組成は前記のとおり）。さらに、NBRC指定培地No.1380におけるtrace element solutionについて、投入量を下表（表１１）のように変えた。300 mL三角フラスコに、培養液総量を50 mLにして培養を７２時間行った。
Haloferax mediterraneiについて、NBRC指定培地No.1380でグルコース濃度のみ5g/Lに変更した（NBRC指定培地No.1380の培地組成は前記のとおり）。さらに、NBRC指定培地No.1380におけるtrace element solutionについて、投入量を下表（表１１）のように変えた。300 mL三角フラスコに、培養液総量を50 mLにして培養を７２時間行った。
結果
下表（表１２）に示すとおりであった。
本発明の製造方法において用いられる濃縮海水において想定される、前記微量金属塩類（trace element）に包含される塩類の濃度が、NaClの濃度に比較して相対的に低い実施例（実施例９－２～１３－２）及び相対的に高い実施例（実施例１５－２及び１６－２）においても、高分子量のＰＨＡが産生された。すなわち本発明の製造方法により、高分子量のＰＨＡが産生されることがさらに裏付けられた。
また、本発明の製造方法において用いられる濃縮海水に含有される微量金属塩類（塩類）の量を変えることにより、微生物の増殖の程度や生産されるＰＨＡの分子量が変わることも明らかになった。
下表（表１２）に示すとおりであった。
本発明の製造方法において用いられる濃縮海水において想定される、前記微量金属塩類（trace element）に包含される塩類の濃度が、NaClの濃度に比較して相対的に低い実施例（実施例９－２～１３－２）及び相対的に高い実施例（実施例１５－２及び１６－２）においても、高分子量のＰＨＡが産生された。すなわち本発明の製造方法により、高分子量のＰＨＡが産生されることがさらに裏付けられた。
また、本発明の製造方法において用いられる濃縮海水に含有される微量金属塩類（塩類）の量を変えることにより、微生物の増殖の程度や生産されるＰＨＡの分子量が変わることも明らかになった。
参考例Ａ．
●（材料と方法）Haloferax mediterraneiについて、表１０に示す高度好塩菌用のＮＢＲＣ指定培地+5g/Lのグルコースを用いて、300 mL三角フラスコに、培養液総量を50 mLにして培養を行った。指定培地中にグルコースが含まれている場合には、もともと含まれているグルコース以外にさらに5 g/Lのグルコースを追加した。
各指定培地の成分は、ＮＢＲＣがウェブサイトにおいて公開している培地一覧（https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/culture-list.html）を引用して以下に示す。
●（材料と方法）Haloferax mediterraneiについて、表１０に示す高度好塩菌用のＮＢＲＣ指定培地+5g/Lのグルコースを用いて、300 mL三角フラスコに、培養液総量を50 mLにして培養を行った。指定培地中にグルコースが含まれている場合には、もともと含まれているグルコース以外にさらに5 g/Lのグルコースを追加した。
各指定培地の成分は、ＮＢＲＣがウェブサイトにおいて公開している培地一覧（https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/culture-list.html）を引用して以下に示す。
●(結果)
下表（表１３）に示すとおりであった。
培地を変更することにより、重量平均分子量の範囲が１３０万～５４０万であるＰＨＡを生産することが可能であった。
またＮＢＲＣNo.1380の培地では、PHA生産量が高いうえに、3HV分率、分子量が高くこれまでにないタイプのPHAを生産可能であることが明らかになった。
下表（表１３）に示すとおりであった。
培地を変更することにより、重量平均分子量の範囲が１３０万～５４０万であるＰＨＡを生産することが可能であった。
またＮＢＲＣNo.1380の培地では、PHA生産量が高いうえに、3HV分率、分子量が高くこれまでにないタイプのPHAを生産可能であることが明らかになった。
参考例Ｂ
フルフラール系化合物をさらに用いた以外は実施例１～１２と同様の方法で、初期グルコース濃度を10 g/L、フルフラール濃度、HMF（５-ヒドロキシメチルフルフラール）濃度をそれぞれ0.06g/Lから1.6g/Lまで変化させ、Haloferax mediterranei NBRC14739のフラスコ培養を行った。より具体的には以下のとおりである。
●（材料と方法）300 mL三角フラスコに、培養液総量を50 mLにして以下の各成分を加えて72 h、37 ℃、200 rpmで振とう培養を行った。初期pHは 7.2に合わせた。
培地中の成分(g/L)：NH4Cl 2、KH2PO4 0.0375、FeCl3 0.005、NaCl 194、
MgCl2 16、MgSO4 24、CaCl2 1、KCl 5、NaHCO3 0.2、
NaBr 0.5、酵母エキス 5
上記成分からなる培地(BSM培地)に、炭素源として、下表に示す糖質とフルフラール系化合物を所定量入れて、72 hの培養を行った。
●（結果）各条件で生産されたＰＨＢＶの３ＨＶ分率と重量平均分子量、多分散度、乾燥菌体重量、ＰＨＢＶ生産量を下表（表１４）に示す。
フルフラールの濃度及びHMF濃度を変化させることで、様々な分子量のＰＨＢＶを製造し、分子量を制御できること明らかになった。フルフラール又はHMFといったフルフラール系化合物による製造されるＰＨＢＶの分子量の制御は、グルコース以外の糖が用いられた場合においてもなされると考えられる。また、本発明のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法及びポリヒドロキシアルカン酸の分子量を制御する方法においても、フルフラール系化合物を用いることができると考えられた。
フルフラール系化合物をさらに用いた以外は実施例１～１２と同様の方法で、初期グルコース濃度を10 g/L、フルフラール濃度、HMF（５-ヒドロキシメチルフルフラール）濃度をそれぞれ0.06g/Lから1.6g/Lまで変化させ、Haloferax mediterranei NBRC14739のフラスコ培養を行った。より具体的には以下のとおりである。
●（材料と方法）300 mL三角フラスコに、培養液総量を50 mLにして以下の各成分を加えて72 h、37 ℃、200 rpmで振とう培養を行った。初期pHは 7.2に合わせた。
培地中の成分(g/L)：NH4Cl 2、KH2PO4 0.0375、FeCl3 0.005、NaCl 194、
MgCl2 16、MgSO4 24、CaCl2 1、KCl 5、NaHCO3 0.2、
NaBr 0.5、酵母エキス 5
上記成分からなる培地(BSM培地)に、炭素源として、下表に示す糖質とフルフラール系化合物を所定量入れて、72 hの培養を行った。
●（結果）各条件で生産されたＰＨＢＶの３ＨＶ分率と重量平均分子量、多分散度、乾燥菌体重量、ＰＨＢＶ生産量を下表（表１４）に示す。
フルフラールの濃度及びHMF濃度を変化させることで、様々な分子量のＰＨＢＶを製造し、分子量を制御できること明らかになった。フルフラール又はHMFといったフルフラール系化合物による製造されるＰＨＢＶの分子量の制御は、グルコース以外の糖が用いられた場合においてもなされると考えられる。また、本発明のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法及びポリヒドロキシアルカン酸の分子量を制御する方法においても、フルフラール系化合物を用いることができると考えられた。
本発明によればＰＨＡを、重量平均分子量を例えば２０万から６００万の間で制御しつつ製造することができる。したがって本発明はＰＨＡ製造業及びその関連産業の発展に寄与するところ大である。
Claims (15)
- 以下の工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法：
（ａ）海水を含む培地を用いて好塩菌を培養する工程；及び
（ｂ）前記培養における培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得る工程。 - 海水由来のＮａＣｌ以外のＮａＣｌを培地に含む、請求項１に記載の製造方法。
- 好塩菌が、高度好塩菌である請求項１又は２に記載の製造方法
- 高度好塩菌がHaloferax mediterraneiである請求項１～３のいずれかに記載の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシブタン酸と３－ヒドロキシバレリル酸とがランダムに共重合した共重合体である請求項１～４のいずれかに記載の製造方法。
- 共重合体を構成する３－ヒドロキシブタン酸のモル数と３－ヒドロキシバレリル酸のモル数の総和に対する３－ヒドロキシバレリル酸のモル数の割合（３ＨＶ分率）が５．０％～４０．０％である請求項５に記載の製造方法。
- 炭素源として糖を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
であるポリヒドロキシアルカン酸を得る、請求項６に記載の製造方法。 - ポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が３６１万より大きい、請求項１～７のいずれかに記載の製造方法。
- 得られるポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が６００万以下である請求項１～８のいずれかに記載の製造方法。
- 海水が、濃縮された海水を含む請求項１～９のいずれかに記載の製造方法。
- 濃縮された海水の塩分濃度が３．５％～２０％である、請求項１０に記載の製造方法。
- 培地が下記の成分又は海水の少なくとも一つを含む、請求項１～１１のいずれかに記載の製造方法：
（i）人工海水の素、
（ii）海洋深層水、及び
（iii）天然海水。 - 以下の工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法における、海水の使用：
（ａ）濃縮された海水又は濃縮されていない海水を含む培地を用いて好塩菌を培養する工程；及び
（ｂ）前記培養における培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得る工程。 - 海水を含む培地を用いて好塩菌を培養し、培養産物としてポリヒドロキシアルカン酸を得ることを含むポリヒドロキシアルカン酸の製造方法であって、
前記培養における炭素源が糖及びフルフラール系化合物を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
にして、
ポリヒドロキシアルカン酸を得る、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。 - 海水を含む培地を用いて好塩菌を培養し、培養産物として得られるポリヒドロキシアルカン酸の分子量を制御する方法であって、
前記培養における炭素源が糖及びフルフラール系化合物を含有し、該糖を
（ａ）グルコース及び／又はその誘導体のみ
（ｂ）グルコース及びその誘導体ならびにキシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上、又は
（ｃ）キシロース、セロビオース、グルクロン酸、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びそれらの誘導体からの１種もしくは２種以上
にして、
製造されるポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量を制御する、方法。
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| WO2020066937A1 (ja) * | 2018-09-25 | 2020-04-02 | 日本電産株式会社 | モータユニット、及びモータユニットの制御方法 |
-
2021
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- 2021-03-25 EP EP21774853.2A patent/EP4130285A1/en active Pending
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