WO2021187766A1 - P38 제거능을 갖는 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 만성 염증성 질환 치료용 조성물 - Google Patents

P38 제거능을 갖는 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 만성 염증성 질환 치료용 조성물 Download PDF

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WO2021187766A1
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disease
ethoxy
integer
organic solvent
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PCT/KR2021/002361
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김남중
인경수
이종길
손승환
이나래
송채원
김동환
도지민
Original Assignee
(주)프레이저테라퓨틱스
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    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/30—Other Organic compounds

Definitions

  • the present invention relates to a novel compound having p38 scavenging ability, a method for preparing the same, and a composition for treating chronic inflammatory diseases comprising the same.
  • Inflammation is known to be caused by various causes, but according to recent studies, mitogen-activated protein kinases (MAPKs) can be activated by various stress stimuli. It plays a crucial role in the production of pro-inflammatory cytokines such as -6, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, rheumatoid arthritis, and multiple sclerosis. sclerosis), psoriasis, neuropathic pain, Alzheimer's disease, etc. are known to cause ( NATURE REVIEWS, Drug discovery (2003), Vol.2, 717-726).
  • MPKs mitogen-activated protein kinases
  • Chronic inflammation is a condition in which persistent inflammation occurs, which means that the immune system continuously responds inappropriately to a specific exposure.
  • Chronic inflammation may be caused by a single or multiple genetic factors or environmental factors such as food or fumes. Sometimes inflammation occurs and then subsides, but as it continues, sometimes the treatment becomes ineffective.
  • Chronic inflammatory disease causes significant damage to body tissues, and various problems occur depending on the location. For example, when chronic inflammation occurs in the liver or digestive system, it causes changes in the brain, causing fatigue, personality changes, organ dysfunction, and spreading inflammation throughout the body.
  • Psoriasis a representative chronic inflammatory disease, is a chronic recurrent skin disease of unknown cause characterized by rapid proliferation of keratinocytes and accompanying skin inflammation. Lesions such as erythema, scale, papule or pustule It can appear anywhere on this skin surface. Clinically, it can be classified into plaque psoriasis, drip psoriasis, pustular psoriasis, inverse psoriasis, and erythrodermic psoriasis. Psoriasis is caused by a combination of genetic and environmental factors.
  • the cause is still unknown, but hormonal changes, psychological aspects such as stress, trauma, infections such as tonsillitis, immunity, endocrine, inflammation, metabolism
  • causes of the disease such as ability, climate, dry skin, drugs, and heredity.
  • cytokines such as TNF- ⁇ are excessively expressed, it causes an inflammatory response in the skin, promotes hyperproliferation and division of keratinocytes, and inhibits differentiation.
  • Psoriasis is often referred to as a comorbidity because it is accompanied by other diseases.
  • Psoriatic arthritis, cardiovascular disease, depression, and Crohn's disease are frequently found in psoriasis patients.
  • Psoriatic arthritis is a chronic inflammatory disease accompanied by pain, and up to 30% of psoriasis patients show arthritis symptoms, and among them, psoriasis precedes arthritis in 85% of cases. The cause of the antecedent relationship is not yet clear.
  • Severe psoriasis is also associated with increased mortality and metabolic syndrome such as obesity, hypertension, hyperlipidemia, and type 2 diabetes, and an increased risk of cardiovascular disease, possibly due to the effects of chronic inflammatory responses on the endocrine system.
  • psoriasis skin is not aesthetically pleasing, and when it occurs on conspicuous areas such as hands or face, it causes atrophy in interpersonal relationships, and the rate of people suffering from depression or anxiety is 40% higher than that of the general public.
  • chronic inflammation is attracting attention as a cause of various diseases.
  • arteriosclerosis maintain normal cholesterol levels, but due to the activation of excessive inflammatory reactions, various inflammatory cells, including white blood cells, attach to unhealthy intravascular cell walls and proliferate abnormally, thereby preventing thrombosis and arteriosclerosis. known to cause
  • chronic inflammation is involved in the prevalence of a wide range of diseases, such as Alzheimer's disease due to brain cell damage to immune cells due to chronic inflammation, and congestive heart failure due to cardiomyocyte damage.
  • the therapeutic effect is low in preclinical and clinical test results, and it has not been commercialized as a therapeutic agent due to safety issues related to hepatotoxicity and neurological side effects.
  • This safety issue is due in part to a lack of kinase selectivity, which leads to inaccurate therapeutic effects.
  • the present inventors have completed the present invention by confirming that the efficacy of the compound represented by Formula A is very excellent while researching a compound that exhibits selective inhibition of P38 MAPK and has excellent safety and efficacy.
  • An object of the present invention is to provide a novel compound represented by the formula (A).
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a compound represented by the above formula (A).
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating chronic inflammatory diseases comprising the compound represented by Formula A.
  • Another object of the present invention is to provide a health functional food composition for preventing or improving chronic inflammatory disease comprising the compound represented by Formula A.
  • Another object of the present invention is to provide a health food composition for preventing or improving chronic inflammatory diseases comprising the compound represented by Formula A.
  • the present invention provides a compound represented by the following formula (A) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the p38 Ligand Moiety is ego;
  • the E3 Ligand Moiety is ego;
  • the Linker is , , , , or ego,
  • n and m are independently integers from 1 to 10,
  • a and b are independently integers from 1 to 10).
  • It provides a method for preparing compound A1, comprising the step of reacting compound 19A and compound 5 in an organic solvent to synthesize compound A1 (step 3).
  • L 1 is —(CH 2 ) n —OH or —(CH 2 CH 2 —O) n —CH 2 CH 2 OH, wherein n is an integer from 1 to 10;
  • L 2 is -(CH 2 ) m -O- or -(CH 2 CH 2 -O) m -, wherein m is an integer from 1 to 10).
  • It provides a method for preparing compound A2, comprising: synthesizing compound A2 by reacting compound 27A with compound 6 in an organic solvent (step 3).
  • L 1 is —(CH 2 ) n —OH or —(CH 2 CH 2 —O) n —CH 2 CH 2 OH, wherein n is an integer from 1 to 10;
  • L 2 is -(CH 2 ) m -O- or -(CH 2 CH 2 -O) m -, wherein m is an integer from 1 to 10).
  • It provides a method for preparing compound A3, including a step of reacting compound 38A and compound 40 in an organic solvent to synthesize compound A3 (step 3).
  • L 3 is -(CH 2 ) n -OMs or -(CH 2 CH 2 -O) n -CH 2 CH 2 OMs, wherein n is an integer from 1 to 10;
  • L 4 is -(CH 2 ) m -O- or -(CH 2 CH 2 -O) m -, wherein m is an integer from 1 to 10).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating chronic inflammatory diseases comprising the compound represented by Formula A or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving chronic inflammatory diseases comprising the compound represented by Formula A or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a health food composition for preventing or improving chronic inflammatory diseases comprising the compound represented by Formula A or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound represented by Formula A according to the present invention has a remarkably excellent effect of removing p38 MAPK, and may be useful as a therapeutic agent for chronic inflammatory diseases.
  • Figure 4 shows [p38 Ligand Moiety in Comparative Example 1 (Compound 43) and Example 2 (Compound 24) in which biotin was conjugated instead of [E3 Ligand Moiety (thalidomide derivative)] in Example 2 (Compound 24) of the present invention. ] is the result of evaluating the p38 MAPK binding ability of Comparative Example 2 (Compound 45) in which Biotin was bound to the Linker, respectively.
  • Example compound according to the present invention removes p38 MAPK using the intracellular proteasome system by immunoblotting method.
  • Example compound according to the present invention removes p38 MAPK using cereblon (CRBN), one of the E3 ligase complex proteins in cells, by immunoblotting method.
  • CRBN cereblon
  • Example compound according to the present invention removes p38 MAPK using the ubiquitination system by SDS-PAGE and immunoblotting methods.
  • Example 8 is a result confirming that the compound of Example according to the present invention induces a concentration-dependent decrease in p38 MAPK and P-p38 MAPK in neurons by an immunoblotting method.
  • Example compound of the present invention reduces the mRNA expression level of p38 MAPK-related cytokines by qRT-PCR method.
  • the present invention provides a compound represented by the following formula (A) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the p38 Ligand Moiety is ego;
  • the E3 Ligand Moiety is ego;
  • the Linker is , , , , or ego,
  • n and m are independently integers from 1 to 10,
  • a and b are independently integers from 1 to 10).
  • n is an integer from 1 to 5
  • n is an integer of 3 to 7
  • a is an integer from 1 to 5
  • the b may be an integer of 1 to 7.
  • n is an integer of 1 to 3
  • a is an integer of 1 to 2
  • b may be 2 or 5.
  • the compound represented by Formula A may be one selected from the following compound group.
  • the [p38 Ligand Moiety] serves to selectively target and bind p38 MAPK
  • the [E3 Ligand Moiety] serves to selectively target and bind E3 (Ubiquitin Ligase).
  • the active substance of the present invention can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and as the salt, an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful.
  • the expression pharmaceutically acceptable salt is a concentration having an effective action that is relatively non-toxic and harmless to patients, and any organic or means inorganic addition salts.
  • inorganic acids and organic acids can be used as free acids, and hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, perchloric acid, phosphoric acid, etc. can be used as inorganic acids, and citric acid, acetic acid, lactic acid, maleic acid, and fumarin can be used as organic acids.
  • Acid gluconic acid, methanesulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, tartaric acid, galacturonic acid, embonic acid, glutamic acid, aspartic acid, oxalic acid, (D) or (L) malic acid, maleic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid Phonic acid, 4-toluenesulfonic acid, salicylic acid, citric acid, benzoic acid or malonic acid may be used.
  • these salts include alkali metal salts (sodium salt, potassium salt, etc.) and alkaline earth metal salt (calcium salt, magnesium salt, etc.) and the like.
  • acid addition salts include acetate, aspartate, benzate, besylate, bicarbonate/carbonate, bisulfate/sulfate, borate, camsylate, citrate, edisylate, esylate, formate, fumarate, Gluceptate, gluconate, glucuronate, hexafluorophosphate, hebenzate, hydrochloride/chloride, hydrobromide/bromide, hydroiodide/iodide, isethionate, lactate, malate, malate ate, malonate, mesylate, methylsulfate, naphthylate, 2-naphsylate, nicotinate, nitrate, orotate, oxalate, palmitate, pamoate, phosphate/hydrogen phosphate/dihydrogen phosphate, saccharate Late, stearate, succinate, tartrate, tosylate, trifluoroacetate
  • the acid addition salt according to the present invention is prepared by a conventional method, for example, by dissolving an active substance in an organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, methylene chloride, acetonitrile, etc. and adding an organic or inorganic acid to filter and dry the resulting precipitate. or by distilling the solvent and excess acid under reduced pressure and then drying or crystallizing in an organic solvent.
  • an organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, methylene chloride, acetonitrile, etc.
  • a pharmaceutically acceptable metal salt may be prepared using a base.
  • the alkali metal or alkaline earth metal salt is obtained, for example, by dissolving the compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the undissolved compound salt, and evaporating and drying the filtrate.
  • it is pharmaceutically suitable to prepare a sodium, potassium or calcium salt as the metal salt.
  • the corresponding silver salt is also obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (eg silver nitrate).
  • the present invention includes all possible solvates, hydrates, isomers, optical isomers and the like that can be prepared therefrom, as well as active substances and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • It provides a method for preparing compound A1, comprising the step of reacting compound 19A and compound 5 in an organic solvent to synthesize compound A1 (step 3).
  • L 1 is —(CH 2 ) n —OH or —(CH 2 CH 2 —O) n —CH 2 CH 2 OH, wherein n is an integer from 1 to 10;
  • L 2 is -(CH 2 ) m -O- or -(CH 2 CH 2 -O) m -, wherein m is an integer from 1 to 10).
  • the organic solvent of steps 1 to 3 is independently DMF (dimethylformamide), DCM (dichloromethane), ethanol, tetrahydrofuran (THF), benzene, KOH / MeOH, MeOH, toluene, diisopropyl ether, diethyl ether, Dioxane, acetonitrile, dimethylacetamide (DMA), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetone, chlorobenzene, etc. may be used alone or in combination.
  • It provides a method for preparing compound A2, comprising: synthesizing compound A2 by reacting compound 27A with compound 6 in an organic solvent (step 3).
  • L 1 is —(CH 2 ) n —OH or —(CH 2 CH 2 —O) n —CH 2 CH 2 OH, wherein n is an integer from 1 to 10;
  • L 2 is -(CH 2 ) m -O- or -(CH 2 CH 2 -O) m -, wherein m is an integer from 1 to 10).
  • the organic solvent of steps 1 to 3 is independently DMF (dimethylformamide), DCM (dichloromethane), ethanol, tetrahydrofuran (THF), benzene, KOH / MeOH, MeOH, toluene, diisopropyl ether, diethyl ether, Dioxane, acetonitrile, dimethylacetamide (DMA), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetone, chlorobenzene, etc. may be used alone or in combination.
  • It provides a method for preparing compound A3, comprising: synthesizing compound A3 by reacting compound 38A with compound 40 in an organic solvent (step 3).
  • L 3 is -(CH 2 ) n -OMs or -(CH 2 CH 2 -O) n -CH 2 CH 2 OMs, wherein n is an integer from 1 to 10;
  • L 4 is -(CH 2 ) m -O- or -(CH 2 CH 2 -O) m -, wherein m is an integer from 1 to 10).
  • the organic solvent of steps 1 to 3 is independently DMF (dimethylformamide), DCM (dichloromethane), ethanol, tetrahydrofuran (THF), benzene, KOH / MeOH, MeOH, toluene, diisopropyl ether, diethyl ether, Dioxane, acetonitrile, dimethylacetamide (DMA), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetone, chlorobenzene, etc. may be used alone or in combination.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating chronic inflammatory diseases comprising the compound represented by Formula A or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the chronic inflammatory disease is Alzheimer's, Parkinson's disease, inflammatory bowel disease, non-alcoholic chronic hepatitis, chronic hepatitis, Crohn's disease, pancreatitis, esophagitis, gastritis, colitis, ulcerative colitis, pneumonia, bronchitis, sore throat, myocardial infarction, heart failure, arthritis , psoriatic arthritis, rheumatoid arthritis, renal failure, psoriasis, anemia, diabetes, fibrosis, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, ankylosing spondylitis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease, periodontitis, neuropathic pain, idiopathic inflammatory myopathy, and the like.
  • the active substance of the present invention can be administered in various oral and parenteral dosage forms during clinical administration, and when formulating, commonly used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, etc. are used. is manufactured by
  • Solid preparations for oral administration include tablets, patients, powders, granules, capsules, troches, etc., and such solid preparations include at least one or more excipients, for example, starch, calcium carbonate, It is prepared by mixing sucrose, lactose, or gelatin.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, It is prepared by mixing sucrose, lactose, or gelatin.
  • lubricants such as magnesium stearate talc are also used.
  • Liquid formulations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, or syrups.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. can
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspension solutions, emulsions, lyophilized formulations, suppositories, and the like.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • injectable esters such as ethyl oleate.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerol, gelatin, etc. may be used.
  • the effective dose of the active substance of the present invention to the human body may vary depending on the patient's age, weight, sex, dosage form, health status and disease degree, and is generally about 0.001-100 mg/kg/day, Preferably it is 0.01-35 mg/kg/day. Based on an adult patient weighing 70 kg, it is generally 0.07-7000 mg/day, preferably 0.7-2500 mg/day, and once a day at regular time intervals according to the judgment of a doctor or pharmacist It may be administered in several divided doses.
  • Health functional food/health food composition for preventing or improving chronic inflammatory disease
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving chronic inflammatory diseases comprising the compound represented by Formula A or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a health food composition for preventing or improving chronic inflammatory diseases comprising the compound represented by Formula A or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the chronic inflammatory disease is Alzheimer's, Parkinson's disease, inflammatory bowel disease, non-alcoholic chronic hepatitis, chronic hepatitis, Crohn's disease, pancreatitis, esophagitis, gastritis, colitis, ulcerative colitis, pneumonia, bronchitis, sore throat, myocardial infarction, heart failure, arthritis , psoriatic arthritis, rheumatoid arthritis, renal failure, psoriasis, anemia, diabetes, fibrosis, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, ankylosing spondylitis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease, periodontitis, neuropathic pain, idiopathic inflammatory myopathy, and the like.
  • Examples of foods to which the active substance of the present invention can be added include drinks, meat, sausage, bread, biscuits, rice cakes, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, There are various soups, beverages, alcoholic beverages and vitamin complexes, dairy products and processed dairy products, and includes all health foods and health functional foods in the ordinary sense.
  • the health food and health functional food composition containing the active substance according to the present invention may be added to food as it is or used together with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active substance may be appropriately determined depending on the purpose of its use (for prevention or improvement).
  • the amount of the composition in health food and health functional food may be added in an amount of 0.1 to 90 parts by weight based on the total weight of the food.
  • the above amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • the health food and health functional food composition of the present invention is not particularly limited in other ingredients other than containing the active substance of the present invention as an essential ingredient in the indicated ratio, and various flavoring agents or natural carbohydrates are added as additional ingredients like conventional beverages. may contain.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; disaccharides such as maltose, sucrose and the like; and polysaccharides such as conventional sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents such as, taumatine, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 1 to 20 g, preferably about 5 to 12 g, per 100 of the nutraceutical composition of the present invention.
  • health food and health functional food composition containing the active substance of the present invention are various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavoring agents and flavoring agents such as natural flavoring agents, coloring agents and thickening agents (cheese, chocolate, etc.) ), pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the health food and health functional food composition of the present invention may contain fruit for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage, and vegetable beverage.
  • These components may be used independently or in combination.
  • the proportion of these additives is not so important, but is generally selected in the range of 0.1 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the health food and health functional food composition containing the active substance of the present invention.
  • Another aspect of the present invention relates to a method of treating and/or preventing a disease, which relates to a therapeutic agent of the present invention.
  • Preferred examples of diseases that can be treated according to the method of the present invention include chronic inflammatory diseases.
  • Examples of the chronic inflammatory disease include Alzheimer's, Parkinson's disease, inflammatory bowel disease, non-alcoholic chronic hepatitis, chronic hepatitis, Crohn's disease, pancreatitis, esophagitis, gastritis, colitis, ulcerative colitis, pneumonia, bronchitis, sore throat, myocardial infarction, heart failure , arthritis, psoriatic arthritis, rheumatoid arthritis, renal failure, psoriasis, anemia, diabetes, fibrosis, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, ankylosing spondylitis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease, periodontitis, neuropathic pain, idiopathic inflammatory myopathy, etc. can be heard
  • another aspect of the present invention provides a method of treating a chronic inflammatory disease comprising administering to a subject in need thereof a pharmaceutically effective amount of the combination therapy.
  • the combination treatment can inhibit, stop, delay, or prevent the onset or progression of a disease state.
  • the subject can be used without limitation, such as humans, dogs, monkeys, cats, rodents, such as mice, genetically engineered mice, and the like.
  • the term "effective amount” means an amount necessary to delay or completely halt the onset or progression of the particular disease being treated. This amount depends on the health and physical condition of the subject to be treated, the taxonomic group of the subject to be treated, the degree of protection desired, the evaluation of the medical situation and other relevant factors, such as the type of formulation, the age, weight, general health of the patient. , depending on the degree of liver damage, sex and diet, administration time, administration route, number of administration and treatment period, and concomitant administration agents. This amount will fall within the relatively wide range that can be determined through routine practice.
  • the present invention provides the use of a compound represented by Formula A or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the manufacture of a therapeutic agent for chronic inflammatory diseases.
  • the synthesized compound 8 (220.2 mg, 0.794 mmol) and K 2 CO 3 (274.6 mg, 1.98 mmol) were dissolved in 5 mL of Acetone and 3 mL of DMF, followed by a reflux reaction for 30 minutes. Thereafter, 2-bromoethanol (0.155 mL, 2.185 mmol) was added dropwise, and the reaction was carried out overnight. When it was confirmed by TLC that the starting material disappeared, the reaction was stopped with 2N-HCl and diluted with EtOAc solvent. The organic layer was extracted by washing with EtOAc and H 2 O. The extracted organic layer was dried over MgSO 4 and the solvent was removed using an evaporator.
  • reaction mixture was purified through column chromatography to obtain compound 9 (223.4 mg, 87%) .
  • the synthesized compound 39 (100 mg, 0.257 mmol) was dissolved in 1 ml of CH 2 Cl 2 , and TFA (0.308 mmol) was added at 0° C. and the reaction proceeded. When it was confirmed by TLC that the reaction did not proceed any further, the solvent was evaporated and washed with ether several times to obtain compound 40, which was used in the next reaction without purification (114 mg, 99%).
  • the synthesized compound 16 (101 mg, 0.22 mmol) as a starting material, the final compound 20 was obtained in the same manner as in the derivative 19 (123 mg, 89%).
  • the synthesized compound 17 (150.5 mg, 0.299 mmol) as a starting material, the final compound 21 was obtained in the same manner as in the derivative 19 (131.8 mg, 66%).
  • the synthesized compound 18 (61.2 mg, 0.13 mmol) as a starting material, the final compound 22 was obtained in the same manner as in the derivative 19 (77.3 mg, 93%).
  • the synthesized compound 19 (50mg, 0.086mmol) and the synthesized compound 5 (23.53mg, 0.086mmol) were filled with Ar gas and dissolved with 3mL of anhydrous DMF. Then, NaH (3.1mg, 0.13mmol) was slowly added dropwise at 0 °C and reacted at room temperature (25 °C). When it was confirmed by TLC that the starting material was gone, aq. sat. The reaction was stopped using NH 4 Cl and then diluted with EtOAc solvent. The organic layer was extracted by washing with EtOAc and H 2 O. The extracted organic layer was dried over MgSO 4 and the solvent was removed using an evaporator. The reaction mixture was purified through column chromatography to obtain the final compound 23 (24.4 mg, 40%).
  • the synthesized compound 20 (70 mg, 0.112 mmol) as a starting material, the final compound 24 was obtained in the same manner as in the derivative 23 (25.8 mg, 30.4%).
  • the synthesized compound 21 (74.1 mg, 0.11 mmol) as a starting material, the final compound 25 was obtained in the same manner as in the derivative 23 (48.6 mg, 54.6%).
  • Step 1 and Examples 1 to 4 are the same.
  • the synthesized compound 17 (49.9 mg, 0.099 mmol) as a starting material, the final compound 29 was obtained through the same method as the derivative 27 (48 mg, 74%).
  • the synthesized compound 28 (47.4 mg, 0.077 mmol) as a starting material, the final compound 32 was obtained in the same manner as in the derivative 31 (16.9 mg, 31%).
  • the synthesized compounds 14 (23 mg, 0.062 mmol) and 36 (35 mg, 0.124 mmol) and K 2 CO 3 (26 mg, 0.186 mmol) were dissolved in 1 mL of DMF and the reaction was carried out at 90 °C. When it is confirmed by TLC that the reaction does not proceed any further, the reaction is stopped using NH 4 Cl. The organic layer was washed with EtOAc and H 2 O and extracted. The extracted organic layer is dried with MgSO 4 and the solvent is removed using an evaporator. The reaction mixture was purified through column chromatography to obtain compound 37 (14.4 mg, 42%).
  • the synthesized compound 38 (9 mg, 0.018 mmol), 40 (7 mg, 0.015 mmol), and HATU (6 mg, 0.015 mmol) were dissolved in 3 mL of DMF, and then DIPEA (0.045 mmol) was added thereto and the reaction proceeded.
  • DIPEA 0.045 mmol
  • NaHCO 3 is neutralized, and the organic layer is washed with CH 2 Cl 2 and H 2 O and extracted.
  • the extracted organic layer is dried with MgSO 4 and the solvent is removed using an evaporator.
  • the reaction mixture was purified through column chromatography to obtain compound 41 (12 mg, 89%).
  • the synthesized compound 38 (28 mg, 0.061 mmol) and commercially available 42 (15 mg, 0.061 mmol) were dissolved in 0.4 mL of DMF. EDC (0.073 mmol) and DMAP (0.9mg, 0.007mmol) were added at 0° C. and the reaction was carried out. When it is confirmed by TLC that the reaction does not proceed any further, the solvent is blown off, and the organic layer is washed with CH 2 Cl 2 and H 2 O and extracted. The extracted organic layer is dried with MgSO 4 and the solvent is removed using an evaporator. The reaction mixture was purified through column chromatography to obtain compound 43 (17.2 mg, 42%).
  • Huh7 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and penicillin/streptomycin (100 U/ml).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin/streptomycin 100 U/ml
  • Huh7 cells were treated with 20 ⁇ M each of Examples 1 to 3 (Compounds 23-25) and Examples 5 to 8 (Compounds 31-34) according to the present invention, and incubated in a CO 2 incubator for 24 hours. It was confirmed how each compound had an effect on the decrease in the amount of p38 MAPK in cells through immunoblotting.
  • Example 2 In order to determine whether compound 24 according to the present invention (Example 2) induces the removal of p38 MAPK even at a low concentration, HEK 293T (Human Embryonic Kidney 293T) cells were overexpressed with p38 MAPK-Flag and then treated with compound 24 for immunity. Blotting was performed.
  • HEK 293T Human Embryonic Kidney 293T
  • HEK 293T cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and penicillin/streptomycin (100 U/ml). Then, overexpression of p38 MAPK-Flag was induced in HEK 293T cells through transfection.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin/streptomycin 100 U/ml
  • the example compound of the present invention is composed of [p38 Ligand Moiety]-[Linker]-[E3 Ligand Moiety], and in order to find out which moiety is a moiety that selectively binds to p38 MAPK, the following experiment was performed.
  • Compound 43 (Comparative Example 1) in which Biotin was bound instead of E3 Ligase Ligand Moiety (thalidomide derivative) of Compound 24 (Example 2) was synthesized. Thereafter, a pull-down assay was performed using Biotin. For an accurate comparison of whether p38 MAPK is detected in the pull-down assay due to the binding of [p38 Ligand Moiety] and p38 MAPK of Compound 24, Compound 45 that binds Biotin to Linker except for [p38 Ligand Moiety] in Compound 24 was used. It was used as a control.
  • Biotin-pull-down asaay was performed as follows. BV-2 cells were lysed using 0.1% TritonX-100. Compound 43 synthesized with Biotin and Compound 45 synthesized with Linker were treated at a concentration of 20 ⁇ M in the lysate and reacted at 37° C. overnight. Then, 40 ⁇ L of agarose beads linked to Streptavidin, which is well known for binding to biotin, were added to the lysate and reacted at 37° C. for 4 hours. Then, Streptavidin was settled by centrifugation at 4000 rpm for 1 minute and the supernatant was removed.
  • Streptavidin was submerged again by centrifugation at 4000 rpm for 1 minute. This process was repeated 5 times to remove the Biotin compound bound to Streptavidin and other impurities from which the protein bound to the compound was removed. After adding 2X sample buffer, the sample was prepared by boiling at 100°C for 10 minutes. Protein samples were then analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting.
  • Figure 4 shows [p38 Ligand Moiety in Comparative Example 1 (Compound 43) and Example 2 (Compound 24) in which biotin was conjugated instead of [E3 Ligand Moiety (thalidomide derivative)] in Example 2 (Compound 24) of the present invention. ] is the result of evaluating the p38 MAPK binding ability of Comparative Example 2 (Compound 45) in which Biotin was bound to the Linker, respectively.
  • Example 4 Proteasome-dependent p38 MAPK removal confirmation of Example compound
  • Example compound of the present invention induces the removal of p38 MAPK using the intracellular proteasome system.
  • Huh7 cells were treated with 20 ⁇ M of compound 24 (Example 2) for 24 hours, and in the last 3 hours, lysosome inhibitor Chloroquine (CQ) and proteasome inhibitor MG132 were treated with 100 ⁇ M and 10 ⁇ M, respectively. Lysosome and proteasome functions in cells were blocked through the last 3 hours. Next, evaluation was performed in the same manner as in the immunoblotting method of Experimental Example 1, and significance was confirmed through repetition of three or more times.
  • CQ Chloroquine
  • proteasome inhibitor MG132 proteasome inhibitor MG132
  • Example compound according to the present invention removes p38 MAPK using the intracellular proteasome system by immunoblotting method.
  • Example compound of the present invention induces the removal of p38 MAPK using cereblon (CRBN), one of the E3 ligase complex proteins in the cell.
  • CRBN cereblon
  • BV2 cells were treated with Pomalidomide, a CRBN inhibitor, for 6 hours at each concentration to inhibit CRBN. Thereafter, the cells were separated and lysed after treatment with Compound 24 for 24 hours. Next, evaluation was performed in the same manner as in the immunoblotting method of Experimental Example 1.
  • Example compound according to the present invention removes p38 MAPK using cereblon (CRBN), one of the E3 ligase complex proteins in cells, by immunoblotting method.
  • CRBN cereblon
  • Example compound induces the removal of p38 MAPK using ubiquitination.
  • P38 MAPK protein was isolated by immunoprecipitation to determine whether proteasome-dependent protein reduction through ubiquitination of P38 MAPK occurred.
  • 2 X 10 7 HEK293T cells were prepared for each sample, treated with Compound 24 (Example 2) and Compound 16 (Comparative Example 3) with 10 ⁇ M and cultured for 24 hours. The cells were then lysed in 0.5% Triton X-100 lysis buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% triton X-100).
  • Example compound according to the present invention removes p38 MAPK using the ubiquitination system by SDS-PAGE and immunoblotting methods.
  • Example compound induces a decrease in p38 MAPK in neurons
  • an experiment was conducted in four different mouse cell lines.
  • compound 24 was treated at a concentration of 0.001 to 10 ⁇ M and then cultured for 24 hours. After culture, immunoblotting was performed in the same manner as in Experimental Example 1.
  • Example 8 is a result confirming that the compound of Example according to the present invention induces a concentration-dependent decrease in p38 MAPK and P-p38 MAPK in neurons by an immunoblotting method.
  • FIG. 8 As shown in FIG. 8, as a result of treatment with Compound 24 (Example 2) in glial cells (astrocyte, FIG. 8A) and neuroblastic cells (Neuroblast, FIG. 8B) concentration-dependently decreased, P-p38 MAPK was 0.01 ⁇ M, 0.1 It was confirmed that it also decreased in ⁇ M. As a result of the same experiment in microglia (Microglia, FIG. 8C) and hippocampal neuronal cells (FIG. 8D), it was confirmed that p38 was decreased in a compound 24 concentration-dependent manner, and P-p38 was decreased even at 0.1 ⁇ M. . 8A to 8D, it was found that Compound 24 more effectively reduced P-p38 MAPK in neurons.
  • Example 8 Evaluation of reduction in p38 MAPK-related cytokine production due to treatment with Example compound
  • microglia BV2 cells
  • compound 24 Example 2
  • compound 16 Comparative Example 3
  • the experimental conditions are as follows. Each compound was pretreated with 10 ⁇ M or 20 ⁇ M for 24 hours, and then diluted with LPS (lipopolysaccharide) at 1 ⁇ g/mL in a fresh cell culture medium to induce cytokine production, and then cultured.
  • LPS lipopolysaccharide
  • Example 9 Evaluation of decrease in mRNA expression level of p38 MAPK-related cytokines due to treatment with Example compounds
  • microglia BV2 cells
  • compound 24 Example 2
  • compound 24 was treated at a concentration of 10 ⁇ M and 20 ⁇ M for 24 hours.
  • the last 6 hours of the 24 hour treatment of the compound was treated with LPS 1 ⁇ g/mL.
  • mRNA transcription of cytokines was analyzed by qRT-PCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR).
  • qRT-PCR Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR
  • RNA of each sample cDNA (complementary DNA) was synthesized using a cDNA synthesis kit, and inflammatory cytokines interleukin 6 (IL-6) and interleukin 1 beta (IL-1 ⁇ ) were synthesized by qRT-PCR analysis using SYBR Green. and interleukin 12 (IL-12) mRNA expression levels were measured.
  • IL-6 interleukin 6
  • IL-1 ⁇ interleukin 1 beta
  • IL-12 interleukin 12
  • Example compound of the present invention reduces the mRNA expression level of p38 MAPK-related cytokines by qRT-PCR method.
  • the active substance according to the present invention can be formulated in various forms depending on the purpose.
  • the following exemplifies some formulation methods containing the active substance according to the present invention as an active ingredient, but the present invention is not limited thereto.
  • the powder was prepared by filling in an airtight cloth.
  • tablets were prepared by tableting according to a conventional method for manufacturing tablets.
  • the capsules were prepared by filling in gelatin capsules according to a conventional manufacturing method of capsules.
  • the active substance according to the present invention was dissolved in an appropriate volume of sodium chloride BP for injection, the pH of the resulting solution was adjusted to pH 3.5 using dilute hydrochloric acid BP, the volume was adjusted using sodium chloride BP for injection, and the mixture was sufficiently mixed. .
  • the solution was filled in a 5 ml Type I ampoule made of clear glass, sealed under an upper grid of air by dissolving the glass, and sterilized by autoclaving at 120° C. for 15 minutes or more to prepare an injection solution.
  • nasal absorbents According to a conventional method for preparing nasal absorbents, prepare to contain 3 mg of active substance per 1 mL of saline (0.9% NaCl, w/v, solvent is purified water), fill it in an opaque spray container, and sterilize to obtain nasal absorbent. prepared.
  • the active substance according to the present invention can be manufactured into various types of health functional food depending on the purpose.
  • the following exemplifies the manufacturing method of several health functional foods containing the active ingredient according to the present invention as an active ingredient, but the present invention is not limited thereto.
  • Vitamin A Acetate 70 ⁇ g
  • composition ratio of the vitamin and mineral mixture is relatively suitable for health functional food, but the composition is mixed in a preferred embodiment, but the mixing ratio may be arbitrarily modified, and the above ingredients are mixed according to a conventional health functional food manufacturing method Then, the granules can be prepared and used in the preparation of a health functional food composition according to a conventional method.
  • the composition ratio is a composition that is relatively suitable for a beverage of preference in a preferred embodiment, the mixing ratio may be arbitrarily modified according to regional and national preferences such as demand class, demand country, and use purpose.
  • the active substance according to the present invention can be manufactured into various types of health food depending on the purpose.
  • the following exemplifies the manufacturing method of several health foods containing the active ingredient according to the present invention as an active ingredient, but the present invention is not limited thereto.
  • Brown rice, barley, glutinous rice, and barley radish were pregelatinized by a known method and dried, and then roasted and prepared as a powder having a particle size of 60 mesh with a grinder.
  • Black soybeans, black sesame, and perilla were also steamed and dried by a known method, and then roasted and prepared as a powder having a particle size of 60 mesh with a grinder.
  • the active material of the present invention was concentrated under reduced pressure in a vacuum concentrator to obtain a dry powder.
  • the above-prepared grains, seeds, and dry powders of active substances were prepared by blending them in the following ratios.
  • the compound represented by Formula A according to the present invention has a remarkably excellent effect of removing p38 MAPK, and may be useful as a therapeutic agent for chronic inflammatory diseases.

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Abstract

본 발명은 p38 제거능을 갖는 신규한 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 만성 염증성 질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 화학식 A로 표시되는 화합물은 p38 MAPK 제거능이 현저히 우수한 효과가 있어, 만성 염증성 질환 치료제로 유용할 수 있다.

Description

P38 제거능을 갖는 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 만성 염증성 질환 치료용 조성물
본 발명은 p38 제거능을 갖는 신규한 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 만성 염증성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증은 여러 가지 원인에 의해서 발생하는 것으로 알려져 있으나, 최근 여러 연구에 의하면 다양한 스트레스 자극에 의해 MAPKs (mitogen-activated protein kinases)가 활성화될 수 있고, 특히 p38 MAPK는 TNF-α, IL-1β, IL-6 등과 같은 염증전구물질(pro-inflammatory 사이토카인s)의 생성에 결정적인 역할을 하여, 염증성장질환(inflammatory bowel disease), 크론병(Crohn's disease), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 다발성경화증(multiple sclerosis), 건선(psoriasis), 신경병증 통증(neuropathic pain), 알츠하이머 병(Alzheimer's disease) 등을 유발하는 것으로 알려져 있다(NATURE REVIEWS, Drug discovery (2003), Vol.2, 717-726).
만성 염증은 지속적인 염증이 일어나는 상태로, 면역체계가 특정한 노출에 대하여 지속적으로 부적절한 반응을 나타내는 것을 의미하는데, 특히 자가면역 질환은 면역 체계의 혼란으로 인해 장기를 공격하면서 발생한다. 만성 염증은 단일 또는 복합적인 유전 요소 또는 음식이나 매연같은 환경적 요인으로 발생하기도 한다. 염증이 발생했다 진정되기도 하나, 지속적으로 이어지면서 때로는 치료가 큰 효과가 없게 되기도 한다. 만성 염증성 질환은 체내 조직에 상당한 손상을 주게 되고 위치에 따라서는 여러 문제가 발생한다. 예를 들어, 간이나 소화기관에 만성염증이 올 경우 뇌에 변화를 일으켜 피로함이나 성격변화, 장기의 기능장애를 일으키며 전신으로 염증을 확산시키기도 한다.
만성 염증성 질환 중 대표적인 건선(psoriasis)은 피부각질형성세포(keratinocyte)가 빠르게 증식하고 피부염증을 동반함을 특징으로 하는 원인 미상의 만성 재발성 피부질환으로서, 홍반, 인설, 구진 또는 농포 등의 병변이 피부면 어디에서든 나타날 수 있다. 임상적으로 판상 건선, 물방울양 건선, 농포성 건선, 역위 건선, 홍피성 건선 등으로 분류할 수 있다. 건선은 유전적인 원인과 환경적인 요인이 복합적으로 작용하여 발생하는데, 그 원인 이 아직 명확히 밝혀지지 않았으나, 호르몬의 변화, 스트레스와 같은 심리적 측면, 외상, 편도선염과 같은 감염, 면역, 내분비, 염증, 대사능력, 기후, 건조한 피부, 약물, 유전 등으로 그 발병소인이 다양하다. 또한, 만성 염증성 질환으로 면역계의 과민화 또는 환자의 자가면역 이상에 의해 분화된 T 면역세포가 분비하는 IL23, IL-17, IL-6. TNF-α 등의 사이토카인들이 과도하게 발현되면 피부의 염증반응을 일으키고, 각질형성세포의 과다증식 및 분열을 촉진시키고 분화는 억제시킨다. 이러한 요인들로 인하여 피부 각질층의 세포가 정상세포 보다 6~7배 빠르게 증식하기 때문에 발생하며, 이렇게 과다하면서도 불완전하게 증식된 각질 세포가 하얀 인설의 비늘로 겹겹이 쌓여 떨어져 나가게 된다. 건선은 다른 질환을 동반하는 경우가 많아 이를 동반 질환이라 지칭하며 건선성 관절염, 심혈관 질환, 우울증, 크론병 등이 건선 환자에게서 빈번하게 발견되는 질환이다. 건선성 관절염은 통증을 동반한 만성 염증질환으로 건선 환자 중 최대 30%가 관절염 증상을 보이며, 그 중 건선이 관절염에 선행하는 경우는 85%이며 최근의 연구에서는 관절염과 건선의 동시 발병 사례도 보고되어 아직 선후 관계의 원인은 뚜렷하지 않다. 또한 중증의 건선은 비만, 고혈압, 고지혈증, 그리고 제 2형 당뇨병 등의 대사증후군과 사망률 증가와도 연관이 있고, 심혈관 질환 발생 위험도 증가하는데, 이는 만성 염증 반응이 내분비계에 미치는 영향 때문일 가능성이 있다. 그 밖에도 건선피부는 미관상 좋지 않아 손이나 얼굴 등 눈에 띄는 부위에 발생할 경우 대인관계에도 위축을 가져와 우울증이나 불안증을 앓는 이들의 비율이 일반인보다 40% 가량 높다는 보고가 있다.
또한, 만성 염증은 각종 다양한 질환의 원인으로 주목받고 있다. 실제로 동맥경화증을 앓고 있는 환자 중 30% 이상은 정상적인 콜레스테롤 수치를 유지하고 있으나, 과도한 염증반응의 활성화로 인해 백혈구를 비롯한 각종 염증세포들이 건강하지 않은 혈관 내 세포벽에 붙어 이상 증식함으로서 혈전 및 동맥경화를 야기하는 것으로 알려져 있다. 또한 만성염증으로 인해 면역세포들이 뇌 세포 손상으로 알츠하이머가 발생할 수 있으며, 심근 세포의 손상으로 울혈성 심부전이 발생하는 등 광범위한 질환의 유병에 만성 염증이 관여한다.
만성 염증(chronic inflammation)의 치료를 위해 TNF-α 또는 IL-1β를 직접적으로 무효화(neutralize)시키는 모노클론항체(monoclonal antibodies)가 크게 성공하면서, 지난 수십년간 p38 MAPK의 억제제로서 몇몇 저분자 의약품(small molecule)이 개발되어왔다.
그러나, 현재까지 전임상 및 임상 실험결과에서 치료효과가 낮고, 간독성 및 신경 부작용과 관련된 안전성 이슈 때문에 치료제로 상용화되지 못한 상태이다. 상기 안전성 이슈는 부분적으로는 키나아제 선택성이 부족하기 때문이고, 이는 부정확한 치료적 영향을 야기한다.
따라서, P38 MAPK에 선택적인 저해능을 나타내고, 안전성 및 효능이 우수한 만성 염증 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자는 P38 MAPK에 선택적인 저해능을 나타내고, 안전성 및 효능이 우수한 화합물을 연구하던 중, 화학식 A로 표시되는 화합물의 효능이 매우 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
NATURE REVIEWS, Drug discovery (2003), Vol.2, 717-726
본 발명의 목적은 신규한 화학식 A로 표시되는 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 A로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 A로 표시되는 화합물을 포함하는 만성 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 A로 표시되는 화합물을 포함하는 만성 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 A로 표시되는 화합물을 포함하는 만성 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 하기 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 A]
Figure PCTKR2021002361-appb-I000001
(상기 화학식 A에 있어서,
상기 p38 Ligand Moiety는
Figure PCTKR2021002361-appb-I000002
이고;
상기 E3 Ligand Moiety는
Figure PCTKR2021002361-appb-I000003
이고;
상기 Linker는
Figure PCTKR2021002361-appb-I000004
,
Figure PCTKR2021002361-appb-I000005
,
Figure PCTKR2021002361-appb-I000006
,
Figure PCTKR2021002361-appb-I000007
,
Figure PCTKR2021002361-appb-I000008
또는
Figure PCTKR2021002361-appb-I000009
이고,
상기 n 및 m은 독립적으로 1 내지 10의 정수이고,
상기 a 및 b는 독립적으로 1 내지 10의 정수이다).
또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,
화합물 8A와 화합물 13을 유기용매에서 반응시켜 화합물 14A를 합성하는 단계(단계 1);
화합물 14A와 4-니트로페닐클로로포르메이트를 유기용매에서 반응시켜 화합물 19A를 합성하는 단계(단계 2); 및
화합물 19A와 화합물 5를 유기용매에서 반응시켜 화합물 A1을 합성하는 단계(단계 3);를 포함하는 화합물 A1의 제조방법을 제공한다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2021002361-appb-I000010
(상기 반응식 1에서,
L1은 -(CH2)n-OH 또는 -(CH2CH2-O)n-CH2CH2OH이고, 여기서 상기 n은 1 내지 10의 정수이고;
L2는 -(CH2)m-O- 또는 -(CH2CH2-O)m-이고, 여기서 상기 m은 1 내지 10의 정수이다).
나아가, 본 발명은 하기 반응식 2에 나타난 바와 같이,
화합물 8A와 화합물 13을 유기용매에서 반응시켜 화합물 14A를 합성하는 단계(단계 1);
화합물 14A와 p-TsCl(p-Toluenesulfonyl chloride)를 유기용매에서 반응시켜 화합물 27A를 합성하는 단계(단계 2); 및
화합물 27A와 화합물 6을 유기용매에서 반응시켜 화합물 A2를 합성하는 단계(단계 3);를 포함하는 화합물 A2의 제조방법을 제공한다.
[반응식 2]
Figure PCTKR2021002361-appb-I000011
(상기 반응식 2에서,
L1은 -(CH2)n-OH 또는 -(CH2CH2-O)n-CH2CH2OH이고, 여기서 상기 n은 1 내지 10의 정수이고;
L2는 -(CH2)m-O- 또는 -(CH2CH2-O)m-이고, 여기서 상기 m은 1 내지 10의 정수이다).
또한, 본 발명은 하기 반응식 3에 나타난 바와 같이,
화합물 14와 화합물 36A를 유기용매에서 반응시켜 화합물 37A를 합성하는 단계(단계 1);
화합물 37A와 염산을 유기용매에서 반응시켜 화합물 38A를 합성하는 단계(단계 2); 및
화합물 38A와 화합물 40을 유기용매에서 반응시켜 화합물 A3을 합성하는 단계(단계 3);를 포함하는 화합물 A3의 제조방법을 제공한다.
[반응식 3]
Figure PCTKR2021002361-appb-I000012
(상기 반응식 3에서,
L3은 -(CH2)n-OMs 또는 -(CH2CH2-O)n-CH2CH2OMs이고, 여기서 상기 n은 1 내지 10의 정수이고;
L4는 -(CH2)m-O- 또는 -(CH2CH2-O)m-이고, 여기서 상기 m은 1 내지 10의 정수이다).
나아가, 본 발명은 상기 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 만성 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 만성 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 만성 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화학식 A로 표시되는 화합물은 p38 MAPK 제거능이 현저히 우수한 효과가 있어, 만성 염증성 질환 치료제로 유용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 실시예 1 내지 9의 화합물과 비교예 1 내지 3의 화합물의 화학구조식을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 화합물 7종의 p38 MAPK 제거능을 면역블롯팅 방법으로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에 따른 화합물 24의 처리 농도에 따른 p38(Flag) 및 P-p38의 제거능을 면역블롯팅 방법으로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2(화합물24)에서 [E3 Ligand Moiety(탈리도미드 유도체)] 대신에 비오틴을 결합한 비교예 1(화합물 43)과 실시예 2(화합물24)에서 [p38 Ligand Moiety]를 제외한 Linker에 Biotin을 결합한 비교예 2(화합물 45)를 각각 p38 MAPK 결합능을 평가한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 실시예 화합물이 세포 내의 Proteasome system을 사용하여 p38 MAPK를 제거시키는 것을 면역블롯팅 방법으로 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 실시예 화합물이 세포 내의 E3 ligase complex 단백질 중 하나인 cereblon (CRBN)을 사용하여 p38 MAPK를 제거시키는 것을 면역블롯팅 방법으로 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 실시예 화합물이 유비퀴틴화 시스템을 사용하여 p38 MAPK를 제거시키는 것을 SDS-PAGE 및 면역블롯팅 방법으로 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 실시예 화합물이 신경세포에서 농도 의존적으로 p38 MAPK 및 P-p38 MAPK 감소를 유도함을 면역블롯팅 방법으로 확인한 결과이다.
도 8(A): 신경아교세포(Astrocyte)
도 8(B): 신경모세포(Neuroblast)
도 8(C): 미세아교세포(Microglia)
도 8(D): 해마신경세포(Hippocampal Neuronal cell)
도 8(E): 미세아교세포(Microglia)에서 3회 이상 반복 실험한 후 상대적인 값을 수치화하여 나타냄.
도 9는 본 발명의 실시예 화합물 처리로 인한 p38 MAPK 관련 사이토카인 생성량이 감소됨을 ELISA 방법으로 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명의 실시예 화합물이 p38 MAPK 관련 사이토카인의 mRNA 발현량 감소시킴을 qRT-PCR 방법으로 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
화학식 A로 표시되는 화합물
본 발명은 하기 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 A]
Figure PCTKR2021002361-appb-I000013
(상기 화학식 A에 있어서,
상기 p38 Ligand Moiety는
Figure PCTKR2021002361-appb-I000014
이고;
상기 E3 Ligand Moiety는
Figure PCTKR2021002361-appb-I000015
이고;
상기 Linker는
Figure PCTKR2021002361-appb-I000016
,
Figure PCTKR2021002361-appb-I000017
,
Figure PCTKR2021002361-appb-I000018
,
Figure PCTKR2021002361-appb-I000019
,
Figure PCTKR2021002361-appb-I000020
또는
Figure PCTKR2021002361-appb-I000021
이고,
상기 n 및 m은 독립적으로 1 내지 10의 정수이고,
상기 a 및 b는 독립적으로 1 내지 10의 정수이다).
바람직하게는,
상기 n은 1 내지 5의 정수이고,
상기 m은 3 내지 7의 정수이며,
상기 a는 1 내지 5의 정수이고,
상기 b는 1 내지 7의 정수일 수 있다.
더욱 바람직하게는,
상기 n은 1 내지 3의 정수이고,
상기 m은 5이며,
상기 a는 1 내지 2의 정수이고,
상기 b는 2 또는 5일 수 있다.
특히 바람직하게는,
상기 화학식 A로 표시되는 화합물은 하기 화합물군으로부터 선택되는 1종일 수 있다.
1) 2-(4-(5'-(사이클로프로필카바모일)-2'-메틸-[1,1'-바이페닐]-4-카보닐)페녹시)에틸(2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)카바메이트 (23);
2) 2-(2-(4-(5'-(사이클로프로필카바모일)-2'-메틸-[1,1'-바이페닐]-4-카보닐)페녹시)에톡시)에틸(2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)카바메이트 (24);
3) 2-(2-(2-(4-(5'-(사이클로프로필카바모일)-2'-메틸-[1,1'-바이페닐]-4-카보닐)페녹시)에톡시)에톡시)에틸(2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)카바메이트 (25);
4) 5-(4-(5'-(사이클로프로필카바모일)-2'-메틸-[1,1'-바이페닐]-4-카보닐)페녹시)펜틸(2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)카바메이트 (26);
5) N-사이클로프로필-4'-(4-(2-((2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)옥시)에톡시)벤조일)-6-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아미드 (31);
6) N-사이클로프로필-4'-(4-(2-(2-((2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)옥시)에톡시)에톡시)벤조일)-6-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아미드 (32);
7) N-사이클로프로필-4'-(4-(2-(2-(2-((2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)옥시)에톡시)에톡시)에톡시)벤조일)-6-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아미드 (33);
8) N-사이클로프로필-4'-(4-((5-((2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)옥시)펜틸)옥시)벤조일)-6-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아미드 (34); 및
9) (S)-N-사이클로프로필-4'-(4-(2-(2-(2-((2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)옥시)아세트아미도)에톡시)에톡시)벤조일)-6-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-카르복스아미드 (41).
본 발명에 따른 화학식 A로 표시되는 화합물에 있어서,
상기 [p38 Ligand Moiety]는 p38 MAPK를 선택적으로 타겟팅하여 결합하는 역할을 하고,
상기 [E3 Ligand Moiety]는 E3(Ubiquitin Ligase)를 선택적으로 타겟팅하여 결합하는 역할을 한다.
본 발명에 따른 화학식 A로 표시되는 화합물의 p38 MAPK 제거 원리는 다음과 같다. 하기 단계 1 및 단계 2는 순서가 바뀔수도 있다.
(단계 1) [p38 Ligand Moiety]가 p38 MAPK에 결합
(단계 2) [E3 Ligand Moiety]에 E3 결합
(단계 3) 상기 결합된 E3가 p38 MAPK를 제거
약학적으로 허용가능한 염
본 발명의 유효물질은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 약학적으로 허용가능한 염이란 표현은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 유효물질의 염기 화합물의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 유효물질의 염기 화합물의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이들 염은 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다. 또한, 이들 염은 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를 들면, 산부가염으로는 아세테이트, 아스파테이트, 벤즈에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루큐로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오디드/요오디드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있으며, 이들 중 하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트가 바람직하다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 유효물질을 유기용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조하여 제조되거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조하거나 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은 염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
나아가, 본 발명은 유효물질 및 이의 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 이성질체, 광학 이성질체 등을 모두 포함한다.
제조방법 1
본 발명은 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,
화합물 8A와 화합물 13을 유기용매에서 반응시켜 화합물 14A를 합성하는 단계(단계 1);
화합물 14A와 4-니트로페닐클로로포르메이트를 유기용매에서 반응시켜 화합물 19A를 합성하는 단계(단계 2); 및
화합물 19A와 화합물 5를 유기용매에서 반응시켜 화합물 A1을 합성하는 단계(단계 3);를 포함하는 화합물 A1의 제조방법을 제공한다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2021002361-appb-I000022
(상기 반응식 1에서,
L1은 -(CH2)n-OH 또는 -(CH2CH2-O)n-CH2CH2OH이고, 여기서 상기 n은 1 내지 10의 정수이고;
L2는 -(CH2)m-O- 또는 -(CH2CH2-O)m-이고, 여기서 상기 m은 1 내지 10의 정수이다).
상기 단계 1 내지 단계 3의 유기용매는 독립적으로 DMF(dimethylformamide), DCM(dichloromethane), 에탄올, 테트라하이드로퓨란(THF), 벤젠, KOH/MeOH, MeOH, 톨루엔, 디이소프로필에테르, 디에틸에테르, 디옥산, 아세토니트릴, 디메틸아세트아미드(DMA), 디메틸설폭사이드(DMSO), 아세톤, 클로로벤젠 등을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
제조방법 2
본 발명은 하기 반응식 2에 나타난 바와 같이,
화합물 8A와 화합물 13을 유기용매에서 반응시켜 화합물 14A를 합성하는 단계(단계 1);
화합물 14A와 p-TsCl(p-Toluenesulfonyl chloride)를 유기용매에서 반응시켜 화합물 27A를 합성하는 단계(단계 2); 및
화합물 27A와 화합물 6을 유기용매에서 반응시켜 화합물 A2를 합성하는 단계(단계 3);를 포함하는 화합물 A2의 제조방법을 제공한다.
[반응식 2]
Figure PCTKR2021002361-appb-I000023
(상기 반응식 2에서,
L1은 -(CH2)n-OH 또는 -(CH2CH2-O)n-CH2CH2OH이고, 여기서 상기 n은 1 내지 10의 정수이고;
L2는 -(CH2)m-O- 또는 -(CH2CH2-O)m-이고, 여기서 상기 m은 1 내지 10의 정수이다).
상기 단계 1 내지 단계 3의 유기용매는 독립적으로 DMF(dimethylformamide), DCM(dichloromethane), 에탄올, 테트라하이드로퓨란(THF), 벤젠, KOH/MeOH, MeOH, 톨루엔, 디이소프로필에테르, 디에틸에테르, 디옥산, 아세토니트릴, 디메틸아세트아미드(DMA), 디메틸설폭사이드(DMSO), 아세톤, 클로로벤젠 등을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
제조방법 3
본 발명은 하기 반응식 3에 나타난 바와 같이,
화합물 14와 화합물 36A를 유기용매에서 반응시켜 화합물 37A를 합성하는 단계(단계 1);
화합물 37A와 염산을 유기용매에서 반응시켜 화합물 38A를 합성하는 단계(단계 2); 및
화합물 38A와 화합물 40을 유기용매에서 반응시켜 화합물 A3을 합성하는 단계(단계 3);를 포함하는 화합물 A3의 제조방법을 제공한다.
[반응식 3]
Figure PCTKR2021002361-appb-I000024
(상기 반응식 3에서,
L3은 -(CH2)n-OMs 또는 -(CH2CH2-O)n-CH2CH2OMs이고, 여기서 상기 n은 1 내지 10의 정수이고;
L4는 -(CH2)m-O- 또는 -(CH2CH2-O)m-이고, 여기서 상기 m은 1 내지 10의 정수이다).
상기 단계 1 내지 단계 3의 유기용매는 독립적으로 DMF(dimethylformamide), DCM(dichloromethane), 에탄올, 테트라하이드로퓨란(THF), 벤젠, KOH/MeOH, MeOH, 톨루엔, 디이소프로필에테르, 디에틸에테르, 디옥산, 아세토니트릴, 디메틸아세트아미드(DMA), 디메틸설폭사이드(DMSO), 아세톤, 클로로벤젠 등을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
만성 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 상기 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 만성 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 만성 염증성 질환은 알츠하이머, 파킨슨 병, 염증성 장질환, 비알콜성 만성 간염, 만성 간염, 크론병, 췌장염, 식도염, 위염, 대장염, 궤양성 대장염, 폐렴, 기관지염, 인후염, 심근경색, 심부전, 관절염, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 신부전, 건선, 빈혈, 당뇨, 섬유화증, 다발성 경화증, 전신 홍반 루프스, 강직성 척추염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 치주염, 신경병증 통증, 특발성 염증성 근육병증 등일 수 있다.
본 발명의 유효물질은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 유효물질에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 유효물질의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001-100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01-35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07-7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7-2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
만성 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품/건강식품 조성물
본 발명은 상기 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 만성 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 만성 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
상기 만성 염증성 질환은 알츠하이머, 파킨슨 병, 염증성 장질환, 비알콜성 만성 간염, 만성 간염, 크론병, 췌장염, 식도염, 위염, 대장염, 궤양성 대장염, 폐렴, 기관지염, 인후염, 심근경색, 심부전, 관절염, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 신부전, 건선, 빈혈, 당뇨, 섬유화증, 다발성 경화증, 전신 홍반 루프스, 강직성 척추염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 치주염, 신경병증 통증, 특발성 염증성 근육병증 등일 수 있다.
식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 유효물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품 및 건강기능성식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 유효물질을 함유하는 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효물질의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 및 건강기능성식품 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 유지를 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명 유효물질을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트라이톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능성 식품 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 유효물질을 함유하는 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 유효물질을 함유하는 건강식품 및 건강기능성식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
치료 방법
본 발명의 다른 측면은 질병의 치료 및/또는 예방 방법에 관련하여, 본 발명의 치료제와 관계된다. 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 질병의 바람직한 예로는 만성 염증성 질환을 들 수 있다.
상기 만성 염증성 질환의 예로는 알츠하이머, 파킨슨 병, 염증성 장질환, 비알콜성 만성 간염, 만성 간염, 크론병, 췌장염, 식도염, 위염, 대장염, 궤양성 대장염, 폐렴, 기관지염, 인후염, 심근경색, 심부전, 관절염, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 신부전, 건선, 빈혈, 당뇨, 섬유화증, 다발성 경화증, 전신 홍반 루프스, 강직성 척추염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 치주염, 신경병증 통증, 특발성 염증성 근육병증 등을 들수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 약제학적 유효량의 상기 조합치료를 만성 염증성 질환의 치료를 필요로 하는 대상체(subject)에 투여하는 것을 포함하는 만성 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 여기서, 조합 치료는 질병 상태의 발병 또는 진행을 저해, 중지 또는 지연시키거나, 예방할 수 있다.
상기 대상체는 사람, 개, 원숭이, 고양이, 설치류, 예컨대 마우스, 유전자 조작된 마우스 등 제한 없이 사용될 수 있다.
용어 "유효량"은 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미한다. 이 양은 치료되어야 할 대상체의 건강과 물리적 상태, 치료되어야 할 대상체의 분류적 군, 목적하는 보호의 정도, 의학적 상황의 평가 및 기타 관련인자, 예컨대 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강상태, 간의 손상정도, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 투여 횟수 및 치료 기간, 병용투여제 등에 따라 달라진다. 이 양은 통상적인 시도를 통해 측정될 수 있는 비교적 광범위한 범위에 속할 것이다.
용도
본 발명은 만성 염증성 질환 치료제의 제조에 있어서, 상기 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 탈리도미도 유도체(화합물 5 및 화합물 6)의 제조
Figure PCTKR2021002361-appb-I000025
tert-butyl (2,6-dioxopiperidin-3-yl)carbamate(2)의 제조
알려진 화합물 (tert-butoxycarbonyl)glutamine (100mg, 0.406mmol)와 N-Hydroxysuccinimide (52mg, 0.447mmol), DCC(92mg, 0.447mmol)를 Ar gas로 충진 후 DMF 3mL에 녹였다. 반응은 80℃에서 진행했다. TLC로 출발 물질이 없어진 것이 확인되면 evaporator와 high vacuum 장치를 이용해 DMF를 제거하였다. 이후 반응 중 생긴 urea를 EtOAc로 filtering 해주고, 차가운 ethyl ether를 이용하여 결정화하여 화합물 2를 얻어냈다(92mg. 99%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.72 (s, 1H), 7.10 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.17 (m, 1H), 2.67 (m, 1H), 2.41 (m, 1H), 1.86 (m, 2H), 1.35 (s, 9H).
2,2,2-trifluoroacetaldehyde, 2,6-dioxopiperidin-3-aminium salt(3)의 제조
합성된 화합물 2 (110.7mg, 0.485mmol)에 Ar gas 충진 후 CH2Cl2와 TFA를 각각 2mL씩 적가하여 상온(25℃)에서 반응을 진행했다. TLC로 출발 물질이 없어진 것이 확인되면 evaporator와 high vacuum 장치를 이용해 CH2Cl2를 제거하여 화합물 3을 얻어냈다(119.2mg, 99%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.31 (s, 1H), 8.51 (s, 3H), 4.21 (dd, J = 13.3, 5.5 Hz, 1H), 2.70 (m, 1H), 2.59 (m, 1H), 2.13 (m, 1H), 2.04 (m, 1H).
2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-nitroisoindoline-1,3-dione(4)의 제조
합성된 화합물 2 (100mg, 0.438mmol)에 Ar gas 충진 후 CH2Cl2와 TFA를 각각 2mL씩 적가하여 상온(25℃)에서 반응을 진행했다. TLC로 출발 물질이 없어진 것이 확인되면 evaporator와 high vacuum 장치를 이용해 CH2Cl2를 제거하여 화합물 3을 얻어내었다. 정제 없이 바로 화합물 3과 4-nitroisobenzofuran-1,3-dione(127mg, 0.657mmol)와 NaOAc(44mg, 0.526mmol)를 AcOH 3mL에 녹이고 reflux 반응을 진행했다. 출발 물질이 없어진 것이 TLC로 확인되면 evaporator와 high vacuum 장치를 이용해 AcOH를 제거하고 H2O를 이용하여 결정화하여 화합물 4를 얻어냈다(105mg. 79%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.18 (s, 1H), 8.51 (s, 3H), 8.35 (dd, J = 8.1, 0.8 Hz, 1H), 8.24 (dd, J = 7.5, 0.7 Hz, 1H), 8.12 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 5.20 (dd, J = 13.4, 5.3 Hz, 1H), 2.89 (m, 1H), 2.61 (m, 1H), 2.52 (m, 1H), 2.07 (m, 1H).
4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindoline-1,3-dione(5)의 제조
합성한 화합물 4(610mg, 2.012mmol)를 DMF 5mL에 녹인다. 이후 10% Pd/C (60mg, 0.056mmol)을 추가하고 H2 gas 충진 후 상온(25℃)에서 반응을 진행했다.
TLC로 출발 물질이 없어진 것이 확인되면 반응 후 남은 Pd을 제거하기 위해 DMF로 filtering 해주고, H2O를 이용하여 결정화하여 화합물 5를 얻어냈다(512mg, 93%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.10 (s, 1H), 7.47 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 7.01 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 6.53 (s, 2H), 5.05 (dd, J = 13.1, 5.3 Hz, 1H), 2.89 (m, 1H), 2.59 (m, 1H), 2.02 (m, 2H).
2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-hydroxyisoindoline-1,3-dione(6)의 제조
합성된 화합물 3 (94.5mg, 0.39mmol)와 4-hydroxyisobenzofuran-1,3-dione(57.64mg, 0.351mmol)와 KOAc(107.95mg, 1.1mmol)를 AcOH 3mL에 녹이고 reflux 반응을 진행했다. TLC로 출발 물질이 없어진 것이 확인되면 evaporator와 high vacuum 장치를 이용해 AcOH를 제거하고 H2O를 이용하여 결정화하여 화합물 6을 얻어냈다(54mg. 51%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.20 (s, 1H), 11.11 (s, 1H), 7.65 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 5.07 (m, 1H), 2.89 (m, 1H), 2.59 (m, 2H), 2.03 (m,1H).
<제조예 2> 화합물 9 내지 12의 제조
Figure PCTKR2021002361-appb-I000026
단계 1: 화합물 8의 제조
화합물 7과 피리디늄 하이드로클로라이드를 180℃에서 반응시켜, 화합물 8을 제조하였다.
단계 2: 화합물 9-12의 제조
(4-bromophenyl)(4-(2-hydroxyethoxy)phenyl)methanone (9)의 제조
합성된 화합물 8(220.2mg, 0.794mmol)과 K2CO3 (274.6mg, 1.98mmol)를 Acetone 5mL와 DMF 3mL에 녹여 30분 reflux 반응을 진행했다. 이후 2-bromoethanol (0.155mL, 2.185mmol)을 적가하여 overnight 반응을 진행했다. TLC로 출발 물질이 없어진 것이 확인되면 2N-HCl로 반응을 중지시키고 EtOAc 용매로 희석시켰다. 유기층은 EtOAc과 H2O로 씻어 추출했다. 추출한 유기층은 MgSO4로 건조시키고 evaporator를 이용해 용매를 제거했다.
Column chromatography를 통해 반응 혼합물을 정제하여 화합물 9를 얻어냈다(223.4mg, 87%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.80 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.63 (s, 4H), 4.18 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 7.80 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.02 (d, J = 3.8 Hz, 2H).
(4-bromophenyl)(4-(2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy)phenyl)methanone (10)의 제조
합성된 화합물 8(313.5mg, 1.13mmol)과 K2CO3 (468.53mg, 3.39mmol)를 Acetone 5mL와 DMF 3mL에 녹여 1시간 reflux 반응을 진행했다. 이후 2-(2-chloroethoxy)ethan-1-ol (0.24mL, 2.26mmol)와 NaI(169.37mg, 1.13mmol)을 적가 하여 overnight 반응을 진행했다. TLC로 출발 물질이 없어진 것이 확인되면 2N-HCl로 반응을 중지시키고 EtOAc 용매로 희석시켰다. 유기층은 EtOAc과 H2O로 씻어 추출했다. 추출한 유기층은 MgSO4로 건조시키고 evaporator를 이용해 용매를 제거했다. Column chromatography를 통해 반응 혼합물을 정제하여 화합물 10를 얻어냈다(364.2mg, 88%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.80 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.63 (s, 1H), 7.00 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.24 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.92 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.76 (m, 2H) 3.70 (t, J = 4.4 Hz, 2H).
(4-bromophenyl)(4-(2-(2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl)methanone (11)의 제조
합성한 화합물 8(319.2mg, 1.15mmol)와 2-(2-(2-chloroethoxy)ethoxy)ethan-1-ol (0.17mL, 1.15mmol)출발 물질로 하여 상기 유도체 10와 같은 방법을 통해 화합물 11를 얻어냈다(447mg, 95%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.62 (s, 4H), 6.98 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 4.22 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.90(t, J = 4.5 Hz, 2H), 3.77-3.68 (m, 6H), 3.62 (t, J = 4.3 Hz, 2H).
(4-bromophenyl)(4-((5-hydroxypentyl)oxy)phenyl)methanone (12)의 제조
합성한 화합물 8(141.5mg, 0.511mmol)와 5-bromopentan-1-ol(0.62mL, 0.511mmol)를 출발 물질로 하여 상기 유도체 10와 같은 방법을 통해 화합물 12를 얻어냈다(72.1mg, 39%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.75 (dd, J = 7.1,5.7 Hz, 2H), 7.59 (d, J = 5.8 Hz 4H), 6.92 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 4.02 (d, J = 6 Hz, 2H), 3.65 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.90 (m, dd, J = 31.7, 5.8 Hz, 2H), 1.86 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 1.62 (t, J = 6.2 Hz, 2H).
<제조예 3> 화합물 36의 제조
Figure PCTKR2021002361-appb-I000027
2-(2-((tert-butoxycarbonyl)amino)ethoxy)ethyl methanesulfonate (36)의 제조
상업적으로 구매 가능한 tert-butyl (2-(2-hydroxyethoxy)ethyl)carbamate (220 mg, 1.072 mmol)을 CH2Cl2 3ml에 녹이고 0℃에서 Et3N (2.358 mmol) 넣은 후 MsCl (1.179 mmol)을 천천히 dropwise하여 반응을 진행한다. TLC로 더 이상 반응이 진행되지 않음을 확인되면 NH4Cl을 이용하여 반응을 중지시킨다. 유기층은 CH2Cl2과 H2O로 씻어 추출한다. 추출한 유기층은 MgSO4로 건조시키고 evaporator를 이용해 용매를 제거한다. Column chromatography를 통해 반응 혼합물을 정제하여 화합물 36 을 얻어냈다(297 mg, 98%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.89(bs, 1H), 4.37(m, 2H), 3.73(m, 2H), 3.56(m, 2H), 3.33(m, 2H), 3.07(s, 3H), 1.45(s, 9H).
<제조예 4> 화합물 40의 제조
Figure PCTKR2021002361-appb-I000028
단계 1: 화합물 39의 제조
tert-butyl (S)-2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)oxy)acetate (39)의 제조
상업적으로 구매 가능한 (S)-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-hydroxyisoindoline-1,3-dione (100 mg, 0.365 mmol), tert-butyl 2-bromoacetate (0.365 mmol), K2CO3 (76mg, 0.548 mmol)을 DMF 2ml에 녹이고 반응을 진행한다. TLC로 더 이상 반응이 진행되지 않음을 확인되면 EtOAc용매로 희석시켰다. 유기층은 EtOAc, brine 과 H2O로 씻어 추출한다. 추출한 유기층은 MgSO4로 건조시키고 evaporator를 이용해 용매를 제거한다. Column chromatography를 통해 반응 혼합물을 정제하여 화합물 39 을 얻어냈다(118 mg, 83%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.11(s, 1H), 7.80(t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.48(d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.38(d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.10(m, 1H), 4.97(s, 2H), 2.95-2.83, 2.64-2.52, 2.08-1.99(m, 4H), 1.43(s, 9H).
단계 2: 화합물 40의 제조
(S)-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)oxy)acetyl) oxonium 2,2,2-trifluoroacetate (40)의 제조
합성한 화합물 39 (100 mg, 0.257 mmol)을 CH2Cl2 1ml에 녹인 후0℃에서 TFA (0.308 mmol)을 넣고 반응을 진행한다. TLC로 더 이상 반응이 진행되지 않음을 확인되면 용매를 날리고 ether로 여러 번 씻어서 화합물 40 를 얻어 정재 없이 다음반응에 사용했다(114 mg, 99%).
<실시예 1 내지 4> 화합물 23 내지 화합물 26의 제조
단계 1: 화합물 14 내지 18의 제조
Figure PCTKR2021002361-appb-I000029
N-cyclopropyl-4'-(4-hydroxybenzoyl)-6-methyl-[1,1'-biphenyl]-3-carboxamide (14)의 제조
합성한 화합물8 (200mg, 0.722mmol)와 알려진 boronic ester 13 (283mg, 1.083mmol)와 K2CO3 (200mg, 1.444mmol)와 Pd(pph3)4 (75mg, 0.065mmol)을 Ar gas 충진후 anhydrous DMF 6mL에 녹였다. 90℃에서 overnight 반응을 진행했다. TLC로 출발 물질이 없어진 것이 확인되면 2N-HCl로 반응을 중지시킨 뒤 celite로 여과하고 EtOAc용매로 희석시켰다. 유기층은 EtOAc과 H2O로 씻어 추출했다. 추출한 유기층은 MgSO4로 건조시키고 evaporator를 이용해 용매를 제거했다. Column chromatography를 통해 반응 혼합물을 정제하여 화합물 14를 얻어냈다(135mg, 50%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.46 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 7.77-7.71 (m, 6H ), 7.56-7.54 (m, 2H), 7.42 (m, 1H), 6.93 (m, 2H), 2.88 (m, 1H), 2.29 (s, 3H), 0.67 (m, 2H), 0.56 (m, 2H).
N-cyclopropyl-4'-(4-(2-hydroxyethoxy)benzoyl)-6-methyl-[1,1'-biphenyl]-3-carboxamide (15)의 제조
합성한 화합물 9(223.4mg, 0.696mmol)와 알려진 boronic ester 13 (181.63mg, 0.696mmol)를 출발 물질로 하여 상기 유도체 14와 같은 방법을 통해 화합물 15를 얻어냈다(190mg, 66%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.83 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.76 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.67 (d, J = 7.8 Hz, 1H ), 7.63 (s, 1H), 7.38 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.60 (s, 1H), 4.16 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 4.01(t, J = 4.1 Hz, 2H), 2.88 (m, 1H), 2.29 (s, 3H), 0.83 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 0.61 (s, 2H).
N-cyclopropyl-4'-(4-(2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy)benzoyl)-6-methyl-[1,1'-biphenyl]-3-carboxamide (16)의 제조
합성한 화합물 10 (364.2mg, 0.997mmol)와 알려진 boronic ester 13 (260mg, 0.997mmol)를 출발 물질로 하여 상기 유도체 14와 같은 방법을 통해 화합물 16를 얻어냈다(300mg, 66%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.86 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.81 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.67 (dd, J = 7.9,1.8 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.35 (s, 1H), 4.24 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 4.24(t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.92 (t, J = 4.6 Hz, 2H) 3.79 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 2.90 (m, 1H), 2.32 (s, 3H), 0.86 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 0.62 (m, 2H).
N-cyclopropyl-4'-(4-(2-(2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)benzoyl)-6-methyl-[1,1'-biphenyl]-3-carboxamide (17)의 제조
합성한 화합물 11 (457mg, 1.106mmol)와 알려진 boronic ester 13 (288.82mg, 1.106mmol)를 출발 물질로 하여 상기 유도체 14와 같은 방법을 통해 화합물 17을 얻어냈다(271.5mg, 49%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.11 (dd, J = 8.7 Hz, 4H), 7.67 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.38 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.54 (s, 1H), 4.21 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 3.90(t, J = 4.3 Hz, 2H), 3.71 (t, J = 6.1 Hz, 6H), 3.61 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 2.87 (m, 1H), 2.30 (s, 3H), 0.84 (m, 2H), 0.57 (m, 2H).
N-cyclopropyl-4'-(4-((5-hydroxypentyl)oxy)benzoyl)-6-methyl-[1,1'-biphenyl]-3-carboxamide (18)의 제조
합성한 화합물 12 (63.2mg, 0.174mmol)와 알려진 boronic ester 13 (45.43mg, 0.174mmol)를 출발 물질로 하여 상기 유도체 14와 같은 방법을 통해 화합물 18를 얻어냈다(300mg, 66%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.80 (dd, J = 21.1,8.3 Hz, 3H), 7.70-7.60 (m, 3H), 7.53 (m, 1H), 7.44 (td, J = 7.4,2.5 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.65 (s, 1H), 4.04 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.67 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.88 (m, 1H), 2.29 (s, 3H), 1.89-7.79 (m, 3H), 1.69-1.61 (m, 3H), 1.60-1.50 (m, 3H), 0.82 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 0.63-0.58 (m, 2H).
단계 2: 화합물 19 내지 22의 제조
Figure PCTKR2021002361-appb-I000030
2-(4-(5'-(cyclopropylcarbamoyl)-2'-methyl-[1,1'-biphenyl]-4-carbonyl)phenoxy)ethyl (4-nitrophenyl) carbonate (19)의 제조
둥근 바닥 플라스크에 4-nitro phenyl chloroformate(225.6mg, 1.12mmol)를 anhydrous CH2Cl2 3mL 녹인다. 그리고 vial에 합성한 화합물 15 (93mg, 0.224mmol)와 anhydrous pyridine(0.1mL, 1.12mmol)를 anhydrous CH2Cl2 2mL에 녹이고 이를 천천히 0℃에서 적가하고, 상온(25℃)에서 반응했다. TLC로 출발 물질이 없어진 것이 확인되면 2N-HCl로 반응을 중지시키고 EtOAc 용매로 희석시켰다. 유기층은 EtOAc과 H2O로 씻어 추출했다. 추출한 유기층은 MgSO4로 건조시키고 evaporator를 이용해 용매를 제거했다. Column chromatography를 통해 반응 혼합물을 정제하여 화합물 19를 얻어냈다(105mg, 81%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.27 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.82 (dd, J = 31.5, 8.3 Hz, 4H), 7.66 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.39 (d, J = 8.6 Hz, 4H ), 7.31 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.59 (s, 1H), 4.68 (d, J = 3.1 Hz, 2H), 4.37(d, J = 3.4 Hz, 2H), 2.88 (m, 1H), 2.30 (s, 3H), 0.83 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 0.61 (s, 2H).
2-(2-(4-(5'-(cyclopropylcarbamoyl)-2'-methyl-[1,1'-biphenyl]-4-carbonyl)phenoxy)ethoxy)ethyl (4-nitrophenyl) carbonate (20)의 제조
합성한 화합물 16(101mg, 0.22mmol)을 출발 물질로 하여 상기 유도체 19와 같은 방법을 통해 최종 화합물 20를 얻어냈다(123mg, 89%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.26 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.84 (dd, J = 20.6, 8.2 Hz, 4H), 7.67 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.42 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.36 (t, J = 8.8 Hz, 3H), 7.02 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.27 (s, 1H), 4.48 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 4.26(d, J = 4.0 Hz, 2H), 3.93 (dd, J = 17.8,3.9 Hz, 4H), 2.90 (m, 1H), 2.32 (s, 3H), 0.87 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 0.62 (s, 2H).
2-(2-(2-(4-(5'-(cyclopropylcarbamoyl)-2'-methyl-[1,1'-biphenyl]-4-carbonyl)phenoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl (4-nitrophenyl) carbonate (21)의 제조
합성한 화합물 17 (150.5mg, 0.299mmol)을 출발 물질로 하여 상기 유도체 19 와 같은 방법을 통해 최종 화합물 21를 얻어냈다(131.8mg, 66%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.24 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.81(dd, J = 20.4, 8.4 Hz, 4H), 7.67 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.42-7.30 (m, 4H), 6.98 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.49 (s, 1H), 4.46-4.41 (m, 2H), 4.22 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.91 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.82 (quint, J = 2.3 Hz, 2H), 3.79-3.70 (m, 4H), 2.89 (m, 1H), 0.84 (dd, J = 12.6, 6.8 Hz, 2H), 0.63-0.58 (m, 2H).
5-(4-(5'-(cyclopropylcarbamoyl)-2'-methyl-[1,1'-biphenyl]-4-carbonyl)phenoxy)pentyl (4-nitrophenyl) carbonate (22)의 제조
합성한 화합물 18 (61.2mg, 0.13mmol)을 출발 물질로 하여 상기 유도체 19와 같은 방법을 통해 최종 화합물 22 를 얻어냈다(77.3mg, 93%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.25 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.84 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.78 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.66 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.37 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 7.30 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.58 (s, 1H), 4.33 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 4.08 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.88 (m, 1H), 2.29 (s, 3H), 1.93-1.81 (m, 4H), 1.69-1.61 (m, 2H), 0.82 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 0.63-0.57 (m, 2H).
단계 3: 최종 화합물 23 내지 26의 제조
Figure PCTKR2021002361-appb-I000031
2-(4-(5'-(cyclopropylcarbamoyl)-2'-methyl-[1,1'-biphenyl]-4-carbonyl)phenoxy)ethyl(2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)carbamate (23)의 제조
합성한 화합물 19 (50mg, 0.086mmol)와 합성한 화합물 5 (23.53mg, 0.086mmol)에 Ar gas를 충진후 anhydrous DMF 3mL로 녹였다. 이후 NaH(3.1mg, 0.13mmol)를 0℃에서 천천히 적가하고 상온(25℃)에서 반응했다. TLC로 출발 물질이 없어진 것이 확인되면 aq. sat. NH4Cl을 이용하여 반응을 중지시킨 뒤 EtOAc 용매로 희석시켰다. 유기층은 EtOAc과 H2O로 씻어 추출했다. 추출한 유기층은 MgSO4로 건조시키고 evaporator를 이용해 용매를 제거했다. Column chromatography를 통해 반응 혼합물을 정제하여 최종 화합물 23 를 얻어냈다(24.4mg, 40%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.16 (s, 1H), 9.22 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 8.24 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.86 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.78 (q, J = 7.9 Hz, 5H), 7.60 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.13 (dd, J = 12.5, 5.2 Hz, 1H), 4.54 (s, 1H), 4.40 (s, 1H), 2.86 (m, 2H), 2.58 (d, J = 17.8 Hz, 2H), 2.31 (s, 3H), 2.04 (m, 1H), 1.99 (s, 1H), 0.68 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 0.56 (s, 2H); 13C-NMR (500 MHz, CDCL3) δ 195.3, 170.8, 168.9, 168.6, 167.9, 162.1, 152.8, 145.0, 141.2, 139.3, 137.8, 137.0, 136.6, 132.7(2C), 132.2, 131.5, 130.9, 130.8, 130.0(2C), 129.2(2C), 128.2, 126.3, 123.9, 118.1, 115.1, 114.4(2C), 66.2, 64.1 49.4, 31.5, 29.8, 23.3, 22.7, 20.6, 6.9
2-(2-(4-(5'-(cyclopropylcarbamoyl)-2'-methyl-[1,1'-biphenyl]-4-carbonyl)phenoxy)ethoxy)ethyl(2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)carbamate (24)의 제조
합성한 화합물 20 (70mg, 0.112mmol)을 출발 물질로 하여 상기 유도체 23와 같은 방법을 통해 최종 화합물 24 를 얻어냈다(25.8mg, 30.4%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.12 (s, 1H), 9.04 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.20 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 10.3 Hz, 6H), 7.51 (d, J = 7.8 Hz, 3H), 7.37 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.08 (m, 1H), 4.22 (d, J = 33.8 Hz, 4H), 3.76 (d, J = 27 Hz, 4H), 2.86-2.74 (m, 2H), 2.54 (d, J = 19.5 Hz, 1H), 2.26 (s, 3H), 2.03-1.91 (m, 2H), 0.63 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 0.51 (d, J = 1.3 Hz, 2H); 13C-NMR (500 MHz, CDCL3) δ 195.2, 170.9, 168.8, 168.6, 168.0, 166.7, 162.6, 153.1, 144.9, 141.2, 138.3, 137.9, 137.1, 136.5, 132.7(2C), 132.3, 131.4, 130.9, 130.3(2C), 129.9(2C), 129.1, 128.2, 126.3, 123.8, 118.0, 115.1, 114.4(2C), 69.8(2C), 67.5, 65.0, 49.3, 31.5, 29.7, 23.5, 22.3, 20.8, 6.6.
2-(2-(2-(4-(5'-(cyclopropylcarbamoyl)-2'-methyl-[1,1'-biphenyl]-4-carbonyl)phenoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl(2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)carbamate (25)의 제조
합성한 화합물 21 (74.1mg, 0.11mmol)을 출발 물질로 하여 상기 유도체 23와 같은 방법을 통해 최종 화합물 25 를 얻어냈다(48.6mg, 54.6%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.12 (s, 1H), 9.04 (s, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.20 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.80-7.64 (m, 6H), 7.51 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 7.37 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 5.07 (m, 1H), 4.18 (d, J = 32.2 Hz, 4H), 3.69 (d, J = 41 Hz, 4H), 3.57 (s, 4H), 2.88-2.73 (m, 2H), 2.53 (d, J = 19.4 Hz, 1H), 2.26 (s, 3H), 2.07-1.87(m, 2H), 0.63 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 0.50 (s, 2H); 13C-NMR (500 MHz, CDCL3) δ 195.3, 170.8, 168.8, 168.6, 168.0, 166.8, 162.6, 153.0, 141.2, 137.9, 137.0, 136.5, 132.6(2C), 132.2, 130.8(2C), 129.9(2C), 129.1, 128.2, 126.4, 123.8, 117.9, 115.0, 114.3(2C), 70.9, 70.6, 69.7, 69.2, 67.7, 65.1, 60.5, 49.3, 31.5, 29.6, 23.3, 22.7, 20.6, 6.8(2C).
5-(4-(5'-(cyclopropylcarbamoyl)-2'-methyl-[1,1'-biphenyl]-4-carbonyl)phenoxy)pentyl(2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)carbamate (26)의 제조
합성한 화합물 22 (41.4mg, 0.066mmol)을 출발 물질로 하여 상기 유도체 23와 같은 방법을 통해 최종 화합물 26 를 얻어냈다(16mg, 32%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.15 (s, 1H), 9.04 (s, 1H), 8.44 (d, J = 3.8 Hz. 1H), 8.28 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.87-7.73 (m, 7H), 7.57 (t, J = 8.1 Hz, 3H), 7.42 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 5.13 (dd, J = 12.7,5.4 Hz 1H), 4.20 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 4.14-4.06 (m, 2H), 2.93-2.80 (m, 2H), 2.60 (m, 1H), 2.54 (s, 1H) , 2.31 (s, 3H), 2.04 (m, 1H), 1.86-1.68 (m, 4H), 1.59-1.49 (m, 2H), 0.71-0.65 (m, 2H), 0.59-0.53 (m, 2H); 13C-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 194.0, 172.8, 169.7, 168.0, 166.5, 162.5, 152.8, 144.4, 140.0, 138.2, 136.8, 136.5, 136.4, 132.2(2C), 132.1, 131.5, 130.5, 129.4(2C), 129.3(2C), 129.2, 128.1, 126.7, 124.5, 117.7, 116.3, 114.2(2C), 79.2, 67.7, 65.4, 48.9, 30.9, 28.2, 27.9, 23.1, 21.9, 20.1, 5.7(2C).
<실시예 5 내지 8> 화합물 31 내지 34의 제조
단계 1: 화합물 15 내지 18의 제조
상기 실시예 1 내지 4와 단계 1은 동일하다.
단계 2: 화합물 27 내지 30의 제조
Figure PCTKR2021002361-appb-I000032
2-(4-(5'-(cyclopropylcarbamoyl)-2'-methyl-[1,1'-biphenyl]-4-carbonyl)phenoxy)ethyl 4-methylbenzenesulfonate (27)의 제조
합성한 화합물 15 (50.1mg, 0.109mmol)를 CH2Cl2 3mL에 녹인 후 0℃에서 NEt3 0.05mL를 천천히 적가한다. 이후 상온(25℃)에서 p-TsCl(25mg, 0.131mmol)를 적가하여 반응한다. TLC로 출발 물질이 없어진 것이 확인되면 H2O로 반응을 중지시키고 EtOAc 용매로 희석시킨다. 유기층은 EtOAc과 H2O로 씻어 추출한다. 추출한 유기층은 MgSO4로 건조시키고 evaporator를 이용해 용매를 제거한다. Column chromatography를 통해 반응 혼합물을 정제하여 화합물 27를 얻어냈다(74.8mg, 99%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.91-7.78 (m, 6H), 7.67 (dd, J = 7.9, 1.3 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 1.4 Hz, 1H ), 7.42 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.35 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 7.01 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.29 (s, 1H), 4.51-4.37 (m, 2H), 4.30-4.22 (m, 2H), 2.91 (m, 1H), 2.46 (s, 3H), 2.32 (s, 3H), 0.87 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 0.65-0.58 (m, 2H).
2-(2-(4-(5'-(cyclopropylcarbamoyl)-2'-methyl-[1,1'-biphenyl]-4-carbonyl)phenoxy)ethoxy)ethyl 4-methylbenzenesulfonate (28)의 제조
합성한 화합물 16 (50.1mg, 0.11mmol)을 출발 물질로 하여 상기 유도체 27와 같은 방법을 통해 최종 화합물 28 를 얻어냈다(47.4mg, 71%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.89-7.75 (m, 6H), 7.67 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.42 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.38-7.29 (m, 3H), 6.99 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.27 (s, 1H), 4.17 (dd, J = 19.4, 4.1 Hz, 4H), 3.87-3.75 (m, 4H), 2.90 (m, 1H), 2.42 (s, 3H), 2.32 (s, 3H), 0.87 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 0.62 (s, 2H).
2-(2-(2-(4-(5'-(cyclopropylcarbamoyl)-2'-methyl-[1,1'-biphenyl]-4-carbonyl)phenoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl 4-methylbenzenesulfonate (29)의 제조
합성한 화합물 17 (49.9mg, 0.099mmol)을 출발 물질로 하여 상기 유도체 27와 같은 방법을 통해 최종 화합물 29를 얻어냈다(48mg, 74%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.83 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.77 (dd, J = 8.1,2.1 Hz, 4H), 7.68 (d, J = 7.9 Hz, 1H ), 7.63 (s, 1H), 7.38 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 7.9 Hz, 3H), 6.98 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.58 (s, 1H), 4.19 (t, J = 4.3 Hz, 2H), 4.14 (t, J = 4.7 Hz, 2H), 3.85 (t, J = 4.3 Hz, 2H), 3.71-3.64 (m, 4H), 3.63-3.59 (m, 2H), 2.87 (m, 1H), 2.41 (s, 3H), 2.29 (s, 3H), 0.82 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 0.63-0.57 (m, 2H).
5-(4-(5'-(cyclopropylcarbamoyl)-2'-methyl-[1,1'-biphenyl]-4-carbonyl)phenoxy)pentyl 4-methylbenzenesulfonate (30)의 제조
합성한 화합물 18 (46.4mg, 0.101mmol)을 출발 물질로 하여 상기 유도체 27와 같은 방법을 통해 최종 화합물 30 를 얻어냈다(25.7mg, 59%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.83 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.78 (q, J = 3.8 Hz, 4H), 7.67 (dd, J = 7.9, 1.6 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.32 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 6.93 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.49 (s, 1H), 4.06 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 4.00 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.88 (m, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.30 (s, 3H), 1.81-1.67 (m, 4H), 1.57-1.46 (m, 2H), 0.87-0.80 (m, 2H), 0.64-0.58 (m, 2H).
단계 3: 최종 화합물 31 내지 34의 제조
Figure PCTKR2021002361-appb-I000033
N-cyclopropyl-4'-(4-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)oxy)ethoxy)benzoyl)-6-methyl-[1,1'-biphenyl]-3-carboxamide (31)의 제조
합성한 화합물 27 (63.4 mg, 0.11 mmol)와 합성한 화합물 6(15.3 mg, 0.05 mmol)와 K2CO3(23.1 mg, 0.16 mmol)을 Acetonitrile 3mL에 녹이고 reflux 반응을 진행한다. TLC로 더 이상 반응이 진행되지 않음을 확인하면 evaporator장치를 이용해 Acetonitrile를 제거한다. 이후 혼합물을 CH2Cl2 용매로 희석시킨다. 유기층은 CH2Cl2과 H2O로 씻어 추출한다. 추출한 유기층은 MgSO4로 건조시키고 evaporator를 이용해 용매를 제거한다. Column chromatography를 통해 반응 혼합물을 정제하여 화합물 31를 얻어냈다(10.3mg, 28%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.99(s, 1H), 10.25(s, 1H), 8.60(s, 1H), 7.99(d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 8.5, 1.6 Hz, 1H), 7.46 (s, 1H), 6.84 (dd, J = 6.4, 2 Hz, 4H), 6.20 (s, 1H), 5.32(m, 1H), 4.28 (s, 1H), 4.13 (t, J = 10.4 Hz, 2H), 3.90 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 3.67 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 2.67 (m, 1H), 2.05-1.93 (m, 3H) 1.40(s, 1H); 13C-NMR (500 MHz, CDCL3) δ 195.4, 170.9, 168.8, 168.6, 167.0, 165.7, 162.3, 162.1, 156.1, 145.1, 144.9, 141.2, 139.3, 137.1, 136.7, 132.7(2C), 132.2, 130.9(2C), 129.9(2C), 129.1(2C), 128.0, 126.5, 119.9, 117.8, 116.7, 114.4, 68.4, 66.8, 64.3, 31.8, 22.9, 20.4, 14.2, 6.6(2C).
N-cyclopropyl-4'-(4-(2-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)oxy)ethoxy)ethoxy)benzoyl)-6-methyl-[1,1'-biphenyl]-3-carboxamide (32)의 제조
합성한 화합물 28 (47.4mg, 0.077mmol)을 출발 물질로 하여 상기 유도체 31과 같은 방법을 통해 최종 화합물 32 를 얻어냈다(16.9mg, 31%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.10 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 7.73 (dd, J = 7.5,2.1 Hz, 5H), 7.52 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 7.44-7.34 (m, 2H), 7.58-7.50 (m, 2H), 7.07 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 5.11(m, 1H), 4.35 (s, 1H), 4.17 (dd, J = 17.9, 1.1 Hz, 2H), 3.92-3.79 (m, 3H), 3.73 (s, 1H), 3.48 (m, 1H), 3.53-3.43 (m, 1H), 2.95 (m, 1H), 2.83-2.49 (m, 2H), 2.27 (s, 1H), 2.16-1.87 (m, 2H), 0.65 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 0.53 (s, 2H); 13C-NMR (500 MHz, CDCL3) δ 195.5, 171.1, 168.7, 168.2, 167.2, 167.0, 165.8, 162.6, 156.4, 145.1, 141.2, 139.2, 137.1, 136.4, 133.8, 132.6(2C), 132.1, 130.9(2C), 130.3, 129.8(2C), 128.9(2C), 128.2, 119.4, 116.3, 114.1, 70.5, 69.8, 69.6, 68.8, 67.5, 29.7, 23.5, 20.6, 14.2, 6.8(2C).
N-cyclopropyl-4'-(4-(2-(2-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)oxy)ethoxy)ethoxy)ethoxy)benzoyl)-6-methyl-[1,1'-biphenyl]-3-carboxamide (33)의 제조
합성한 화합물 29 (38.9mg, 0.059mmol)을 출발 물질로 하여 상기 유도체 31과 같은 방법을 통해 최종 화합물 33 를 얻어냈다(7.5mg, 34%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.47 (s, 1H), 7.76 (d, J = 9.4 Hz, 7H), 7.55 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 7.41 (m, 1H), 7.15-7.06 (m, 2H), 5.17(m, 1H), 4.33 (s, 1H), 4.19 (s, 2H), 3.77 (s, 2H), 3.70-3.48 (m, 5H), 3.42 (m, 1H), 2.97 (m, 1H), 2.88-2.66 (m, 1H), 2.54 (s, 1H), 2.30 (s, 1H), 2.00 (m, 1H), 0.68 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 0.56 (s, 2H); 13C-NMR (500 MHz, CDCL3) δ 195.5, 171.1, 168.4, 167.2, 165.8, 162.7, 156.4, 144.9, 141.3, 139.3, 136.9, 136.4, 133.9, 132.6(2C), 132.2, 130.9(2C), 129.8(2C), 129.0(2C), 128.2, 126.4, 119.6, 117.5, 116.2, 114.3(2C), 72.7, 70.8, 70.5, 69.6, 69.2, 67.8, 61.8, 29.8, 23.4, 21.9, 20.6, 6.9(2C).
N-cyclopropyl-4'-(4-((5-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)oxy)pentyl)oxy)benzoyl)-6-methyl-[1,1'-biphenyl]-3-carboxamide (34)의 제조
합성한 화합물 30 (25.7mg, 0.042mmol)을 출발 물질로 하여 상기 유도체 31과 같은 방법을 통해 최종 화합물 34 를 얻어냈다(4.1mg, 53%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.45 (m, 1H), 7.80-7.73 (m, 4H), 7.65-7.59 (m, 4H), 7.57-7.51 (m, 3H), 7.41 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.10 (dd, J = 8.7, 2.8 Hz, 1H), 5.24 (m, 1H), 4.24 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 4.14-4.00 (m, 2H), 3.67 (m, 1H), 2.85 (m, 1H), 2.68 (m, 1H), 2.31 (s, 3H), 2.19-1.96 (m, 3H), 1.96-1.84 (m, 2H), 1.75 (m, 1H), 1.63 (m, 1H), 1.56-1.40 (m, 4H), 0.70-0.64 (m, 2H), 0.59-0.53 (m, 2H); 13C-NMR (500 MHz, CDCL3) δ 195.3, 171.2, 168.8, 168.6, 167.2, 165.8, 162.9, 156.6, 144.7, 141.2, 139.4, 136.6, 134.0, 132.7(2C), 132.3, 130.8(2C), 129.9(2C), 129.0(2C), 128.6, 128.1, 126.3, 119.1, 117.3, 115.9, 114.1, 69.3, 68.2, 62.9, 32.4, 31.0, 29.8, 28.9, 23.2, 22.5, 20.5, 6.9(2C).
<실시예 9> 화합물 41의 제조
단계 1: 화합물 37의 제조
Figure PCTKR2021002361-appb-I000034
tert-butyl (2-(2-(4-(5'-(cyclopropylcarbamoyl)-2'-methyl-[1,1'-biphenyl]-4-carbonyl)phenoxy)ethoxy)ethyl)carbamate (37)의 제조
합성한 화합물 14 (23 mg, 0.062 mmol)와 36 (35 mg, 0.124 mmol)와 K2CO3(26 mg, 0.186 mmol)을DMF 1mL에 녹이고 90 ℃에서 반응을 진행한다. TLC로 더 이상 반응이 진행되지 않음을 확인되면 NH4Cl을 이용하여 반응을 중지시킨다. 유기층은 EtOAc 와 H2O로 씻어 추출한다. 추출한 유기층은 MgSO4로 건조시키고 evaporator를 이용해 용매를 제거한다. Column chromatography를 통해 반응 혼합물을 정제하여 화합물 37 를 얻어냈다(14.4 mg, 42%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.88(d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.83(d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.69-7.61(m, 2H), 7.42(d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.35(d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.02(d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.22(s, 1H), 4.95(s, 1H), 4.24-4.20(m, 2H), 3.89-3.85(m, 2H), 3.65-3.61(m, 2H), 3.40-3.32(m, 2H), 2.92(m, 1H), 2.33(s, 3H), 1.45(s, 9H), 0.91-0.85(m, 2H), 0.65-0.60(m, 2H).
단계 2: 화합물 38의 제조
Figure PCTKR2021002361-appb-I000035
2-(2-(4-(5'-(cyclopropylcarbamoyl)-2'-methyl-[1,1'-biphenyl]-4-carbonyl)phenoxy)ethoxy)ethan-1-aminium chloride (38)의 제조
합성한 화합물 37 (13.5 mg, 0.024 mmol)을 CH2Cl2 0.8 m 에 녹인 후 HCl 4M in Dioxane (0. 2ml)을 넣고 반응을 진행한다. TLC로 더 이상 반응이 진행되지 않음을 확인되면 용매를 날리고 ether로 여러 번 씻어서 화합물 38 을 얻어냈다(8.1 mg, 68%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.48(d, J = 0,3 Hz, 1H), 7.93(bs, 3H), 7.83-7.74(m, 6H), 7.57(d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.42(d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.14(d, J = 8.9 Hz, 2H), 4.29-4.34(m, 2H), 3.87-3.82(m, 2H), 3.04-2.98(m, 2H), 2.85(m, 1H), 2.32(s, 3H), 0.71-0.66(m, 2H), 0.59-0.54(m, 2H).
단계 3: 최종 화합물 41의 제조
Figure PCTKR2021002361-appb-I000036
(S)-N-cyclopropyl-4'-(4-(2-(2-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)oxy)acetamido)ethoxy)ethoxy)benzoyl)-6-methyl-[1,1'-biphenyl]-3-carboxamide (41)의 제조
합성한 화합물 38 (9 mg, 0.018 mmol), 40 (7 mg, 0.015 mmol), HATU (6 mg, 0.015 mmol)을 DMF 3mL 녹인 후 DIPEA (0.045 mmol)를 넣고 반응을 진행한다. TLC로 더 이상 반응이 진행되지 않음을 확인하면 brine 넣고 Citiric acid로 pH 1로 만들어 준다. 다시 NaHCO3 중화하고 유기층은 CH2Cl2과 H2O로 씻어 추출한다. 추출한 유기층은 MgSO4로 건조시키고 evaporator를 이용해 용매를 제거한다. Column chromatography를 통해 반응 혼합물을 정제하여 화합물 41을 얻어냈다(12mg, 89%).
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.12(s, 1H), 8.44(d, J = 4.2 Hz, 1H), 8.03(t, J = 5.76 Hz, 1H), 7.81-7.73(m, 6H), 7.56(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.47(d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.43-7.37(m, 2H), 7.10(d, J = 8.9 Hz, 2H), 5.14-5.08(m, 1H), 4.23-4.19(m, 2H), 3.82-3.77(m, 2H), 3.59-3.54(m, 2H), 3.39-3.35(m, 2H), 2.90-2.82(m, 2H), 2.68-2.54(m, 1H), 2.31(s, 3H), 2.07-1.97(m, 2H), 0.71-0.68(m, 2H), 0.58-0.53(m, 2H).
<비교예 1> 화합물 43의 제조
Figure PCTKR2021002361-appb-I000037
합성한 화합물 38 (28 mg, 0.061 mmol), 상업적으로 구매 가능한 42 (15 mg, 0.061 mmol)를 DMF 0.4mL 녹였다. 0℃에서 EDC (0.073 mmol), DMAP(0.9mg, 0.007mmol)을 넣고 반응을 진행한다. TLC로 더 이상 반응이 진행되지 않음을 확인하면 solvent를 날리고 유기층은 CH2Cl2과 H2O로 씻어 추출한다. 추출한 유기층은 MgSO4로 건조시키고 evaporator를 이용해 용매를 제거한다. Column chromatography를 통해 반응 혼합물을 정제하여 화합물 43을 얻어냈다(17.2mg, 42%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.87-7.80(m, 4H), 7.70-7.68(m, 2H), 7.42(d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.42 7.34(d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.01(d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.50(s, 1H), 5.72(s, 1H), 5.17(s, 1H), 4.46(m, 1H), 4.25(d, J = 10.1 Hz, 5H), 3.91(m, 1H), 3.79(m, 1H), 3.12(s, 1H), 2.90(m, 1H), 2.87(m, 1H), 2.71(d, J = 12.6 Hz, 1H), 2.35(s, 2H), 2.32(s, 3H), 1.66(m, 4H), 1.42(s, 2H), 0.86-0.85(m, 2H), 0.62-0.61(m, 2H).
<비교예 2> 화합물 45의 제조
Figure PCTKR2021002361-appb-I000038
상업적으로 구매 가능한 44(33.6 mg, 0.184 mmol), 42 (38 mg, 0.221 mmol)를 출발 물질로 하여 상기 유도체 43과 같은 방법을 통해 최종 화합물 45 를 얻어냈다(33.8 mg, 45 %).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.30-7.28(m, 2H), 6.98-6.88(m, 3H), 5.59(s, 1H), 5.02(s, 1H), 4.48(m, 1H), 4.31-4.21(m, 3H), 4.14-4.12(m, 2H), 3.88-3.83(m, 2H), 3.80-3.75(m, 2H), 3.12(m, 1H), 2.88(m, 1H), 2.72(m, 1H), 2.37(t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.75-1.57(m, 4H), 1.48-1.38(m, 2H).
<비교예 3> 화합물 16의 제조
Figure PCTKR2021002361-appb-I000039
상기 실시예 1의 단계 1과 동일하게 수행하여, 화합물 16을 제조하였다.
<실험예 1> 실시예 화합물의 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinases) 제거능 평가
p38 MAPK의 제거를 확인하기 위해 p38 MAPK 가 일정하게 생성되는 간세포 유래 암종 세포주인 Huh7 세포에 각 화합물을 처리 후 p38 MAPK의 감소를 확인하였다.
구체적으로, Huh7 세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신(100U/ml)이 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle Medium)에서 배양하였다. 12 웰 플레이트에서 Huh7 세포에 본 발명에 따른 실시예 1 내지 3(화합물 23-25) 및 실시예 5 내지 8(화합물 31-34)을 20μM씩 처리하여 CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 면역블로팅을 통해 각 화합물이 세포의 p38 MAPK의 양의 감소에 어떤 영향을 미쳤는지 확인하였다.
실험 조건에 따라 세포의 배양이 끝난 후, 차가운 PBS로 세척한다. 이후 세포를 수거하여 12000 rpm에서 3분동안 분리한다. 펠렛을 2X sample buffer (1M Tris-HCl pH 6.8, 50 % 글리세롤, 10 % SDS, 2-머캅토 에탄올, 1% 브로모페놀블루)으로 세포를 용해하고, 100 ℃에서 10분 동안 끓였다. 제조된 단백질 샘플을 전기영동(Sodium Dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)하고, PVDF membrane(제조사: Millipore)으로 전사하였다. PVDF membrane에 비특이적으로 항체가 결합하는 것을 막기위하여 5 % bovine serum albumin (BSA, 제조사: RMbio) 용액으로 실온에서 1시간 blocking을 수행하였다. 5 % bovine serum albumin (BSA, 제조사: RMbio) 용액에 각각 타겟 항체를 희석하여 PVDF membrane을 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 이어서 항체가 희석된 BSA 용액을 폐기하고 PVDF membrane을 PBST buffer (PBS, 0.5 % tweene 20)로 5회 세척하였다. 마지막으로, PVDF membrane을 Horse radish peroxidase(HRP)-접합된 이차 항체 (제조사: Cell signaling Technology)가 희석된 PBST buffer를 넣고 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 5회 PBST buffer로 세척한 후 HRP substrate (제품명: Luminata Forte, 제조사: Millipore)를 사용하여 membrane의 단백질 양을 확인하였다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 화합물 7종의 p38 MAPK 제거능을 면역블롯팅 방법으로 확인한 결과이다.
도 2에 나타난 바와 같이, 각 화합물의 처리는 총 단백질 수준(β-actin; 세포유지유전자)에 영향을 주지 않으면서, p38 MAPK의 제거를 유도하였다. 그 중 화합물 24(실시예 2)가 가장 효과적으로 p38 MAPK의 감소를 유도하는 것을 확인할 수 있었다. 3회 반복 실험을 통해 화합물 24(실시예 2)가 가장 효과가 좋은 물질임을 확인하였다.
<실험예 2> 화합물 24(실시예 2)의 농도 의존적 p38 MAPK 제거능 평가
본 발명에 따른 화합물 24(실시예 2)가 낮은 농도에서도 p38 MAPK의 제거를 유도하는지 확인하기 위해 HEK 293T(Human Embryonic Kidney 293T) 세포에 p38 MAPK-Flag를 과다발현시킨 후 화합물 24를 처리하여 면역블로팅을 진행하였다.
구체적으로, HEK 293T 세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신(100U/ml)이 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle Medium)에서 배양하였다. 이후 Transfection을 통해 HEK 293T 세포에 p38 MAPK-Flag의 과다발현을 유도하였다. 12 웰 플레이트에서 HEK 293T 세포에 본 발명에 따른 화합물 24(실시예 2)를 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에 따른 화합물 24의 처리 농도에 따른 p38(Flag) 및 P-p38의 제거능을 면역블롯팅 방법으로 확인한 결과이다.
도 3에 나타난 바와 같이, 화합물 24의 처리는 총 단백질 수준에 영향을 주지 않으면서(β-actin), 농도 의존적으로 p38 MAPK-Flag를 제거하였으며, p38 MAPK가 인산화된 P-p38이 더 낮은 농도에서도 효과적으로 제거되는 것을 확인하였다. 이는 화합물 24(실시예 2)가 P-p38 선택적으로 유비퀴틴화를 유도하여 제거함을 나타낸다.
<실험예 3> 실시예 화합물에서 p38 MAPK에 선택적으로 결합하는 Moiety의 확인
본 발명의 실시예 화합물은 [p38 Ligand Moiety]-[Linker]-[E3 Ligand Moiety]으로 구성되며, 이 중에서 어느 부위가 p38 MAPK에 선택적으로 결합하는 Moiety인지 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 하였다.
구체적으로, 화합물 24(실시예 2)의 E3 Ligase Ligand Moiety (탈리도미드 유도체) 대신 Biotin을 결합한 화합물 43(비교예 1)을 합성하였다. 이 후 Biotin을 이용하여 pull-down assay를 진행하였다. 화합물 24의 [p38 Ligand Moiety]와 p38 MAPK의 결합으로 인해 pull-down assay에서 p38 MAPK 가 검출되는 것인지에 대한 정확한 비교를 위해, 화합물 24에서 [p38 Ligand Moiety]를 제외한 Linker에 Biotin을 결합한 화합물 45를 대조군으로 사용하였다.
Biotin-pull-down asaay는 다음과 같이 진행하였다. BV-2 세포를 0.1 % TritonX-100을 사용하여 용해시켰다. Biotin과 합성된 화합물 43, Linker와 합성된 화합물 45를 용해물에 20μM 농도로 처리하고 37 ℃에서 밤새 반응시켰다. 이어서, Biotin과 결합하는 것으로 잘 알려진 Streptavidin과 연결된 agarose bead를 용해물에 40μL 첨가하고 37 ℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 이후 4000rpm 1분 동안 원심분리를 통해 Streptavidin을 가라앉히고 상층액을 제거하였다. 0.1 % Triton X-100 Lysis buffer로 세척하고 다시 4000rpm 1분 원심분리를 통해 Streptavidin을 가라앉혔다. 이를 5회 반복하여 Streptavidin과 결합한 Biotin 화합물, 그 화합물과 결합한 단백질을 제거한 다른 불순물을 제거하는 과정을 거쳤다. 2X sample buffer를 첨가한 후 100℃에서 10 분 동안 끓여 샘플을 준비하였다. 이후 단백질 샘플을 SDS-PAGE 및 면역블롯팅으로 분석하였다.
도 4는 본 발명의 실시예 2(화합물24)에서 [E3 Ligand Moiety(탈리도미드 유도체)] 대신에 비오틴을 결합한 비교예 1(화합물 43)과 실시예 2(화합물24)에서 [p38 Ligand Moiety]를 제외한 Linker에 Biotin을 결합한 비교예 2(화합물 45)를 각각 p38 MAPK 결합능을 평가한 결과이다.
도 4에 나타난 바와 같이, [p38 Ligand Moiety]를 포함하고 있는 비교예 1(화합물 43)을 처리한 군에서 p38 MAPK의 검출이 확인된 반면에, [p38 Ligand Moiety]를 포함하지 않는 비교예 2(화합물 45)를 처리한 군에서는 p38 MAPK이 미검출을 확인하였다(Pull-down assay 참조). 이 결과는 본 발명의 실시예 화합물에서 [p38 Ligand Moiety] 부위가 p38 MAPK와 선택적으로 결합하는 것을 증명하는 결과이다.
<실험예 4> 실시예 화합물의 Proteasome 의존적 p38 MAPK 제거 확인
본 발명의 실시예 화합물이 세포 내의 proteasome system을 사용하여 p38 MAPK의 제거를 유도함을 확인하기 위하여 실험을 하였다.
구체적으로, 12 웰 플레이트에서 Huh7 세포에 화합물 24(실시예 2) 20μM을 24시간 처리하고 마지막 3시간에 Lysosome Inhibitor인 Chloroquine(CQ), Proteasome Inhibitor인 MG132를 각각 100μM, 10μM 처리하였다. 마지막 3시간을 통해 세포 내의 Lysosome과 Proteasome의 기능을 차단하였다. 다음으로, 실험예 1의 면역블롯팅 방법과 동일하게 수행하여 평가하였고, 3회 이상 반복을 통하여 유의성을 확인하였다.
도 5는 본 발명에 따른 실시예 화합물이 세포 내의 Proteasome system을 사용하여 p38 MAPK를 제거시키는 것을 면역블롯팅 방법으로 확인한 결과이다.
도 5에 나타난 바와 같이, Proteasome의 기능이 감소한 실험군(MG132 + 화합물 24 처리군)에서만 p38 MAPK 단백질 양의 복구를 확인하였다. 이는 실시예 화합물이 세포 내의 Proteasome system을 사용하여 p38 MAPK를 감소시킨다는 것을 확인할 수 있는 결과이다.
<실험예 5> 실시예 화합물의 CRBN 의존적 p38 MAPK 제거 확인
본 발명의 실시예 화합물이 세포 내의 E3 ligase complex 단백질 중 하나인 cereblon (CRBN)을 사용하여 p38 MAPK의 제거를 유도함을 확인하기 위하여 실험하였다.
구체적으로, 12 웰 플레이트에서 BV2 세포에 CRBN Inhibitor인 Pomalidomide를 농도별로 6시간 처리하여 CRBN을 저해하였다. 이후 화합물 24를 24시간 처리한 후 세포를 분리하여 용해하였다. 다음으로, 실험예 1의 면역블롯팅 방법과 동일하게 수행하여 평가하였다.
도 6은 본 발명에 따른 실시예 화합물이 세포 내의 E3 ligase complex 단백질 중 하나인 cereblon (CRBN)을 사용하여 p38 MAPK를 제거시키는 것을 면역블롯팅 방법으로 확인한 결과이다.
도 6에 나타난 바와 같이, Pomalidomide를 처리하여 CRBN를 저해한 후 화합물 24(실시예 2)를 처리한 군에서 P-p38 MAPK 단백질 양이 복구되는 것을 확인하였다. 이는 화합물 24가 CRBN를 매개로 P-p38 MAPK의 감소를 유도시킨다는 것을 확인할 수 있는 결과이다.
<실험예 6> 실시예 화합물의 유비퀴틴화(Ubiquitination) 의존적 p38 MAPK 제거 확인
실시예 화합물이 유비퀴틴화를 사용하여 p38 MAPK의 제거를 유도함을 확인하기 위하여 실험하였다.
구체적으로, P38 MAPK이 유비퀴틴화를 통한 proteasome 의존적 단백질 감소가 발생하는지 확인하기 위해 면역침강법을 사용하여 P38 MAPK 단백질을 분리하였다. 면역 침강법은 각 샘플 당 2 X 107개의 HEK293T 세포를 준비하여 화합물 24(실시예 2)와 화합물 16(비교예 3)을 10μM 로 처리하고 24시간 배양하였다. 이후 세포를 0.5% Triton X-100 lysis buffer (50mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5% triton X-100)에 용해시켰다. 이어서, 소량의 용해물을, 5X sample buffer를 통해 샘플링하고, Anti-p38 rabbit antibody (제조사: Cell Signaling Technology)를 용해물에 첨가하고 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 이어서, Protein A / G resins(제조사: Sigma-Aldrich)를 첨가하고 4 ℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 0.5 % Triton X-100 lysis buffer으로 세척하여 A/G resins과 결합한 단백질 외의 불순물을 제거하였다. 이후 단백질 샘플을 SDS-PAGE 및 면역블롯팅으로 분석하였다.
도 7은 본 발명에 따른 실시예 화합물이 유비퀴틴화 시스템을 사용하여 p38 MAPK를 제거시키는 것을 SDS-PAGE 및 면역블롯팅 방법으로 확인한 결과이다.
도 7에 나타난 바와 같이, 화합물 24(실시예 2)를 처리한 군에서 p38 MAPK 단백질의 유비퀴틴화가 발생함을 확인하였고, 반면 화합물 24에서 [E3 ligase Ligand Moiety]를 붙이기 전단계의 화합물인 화합물 16(비교예 3)을 처리한 군에서는 p38 MAPK 단백질의 유비퀴틴화가 증가되지 않음을 확인하였다.
<실험예 7> 신경세포에서 실시예 화합물의 p38 MAPK, P-p38 MAPK 감소 유도 확인
신경세포에서 실시예 화합물이 p38 MAPK의 감소를 유도하는지 확인하기 위해 네 종류의 다른 마우스 세포주에서 실험을 진행하였다.
구체적으로, 각 실험은 도 8에 표기된 바와 같이 화합물 24를 0.001~10μM의 농도로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 실험예 1과 동일하게 면역블로팅을 진행하였다.
도 8은 본 발명에 따른 실시예 화합물이 신경세포에서 농도 의존적으로 p38 MAPK 및 P-p38 MAPK 감소를 유도함을 면역블롯팅 방법으로 확인한 결과이다.
도 8(A): 신경아교세포(Astrocyte)
도 8(B): 신경모세포(Neuroblast)
도 8(C): 미세아교세포(Microglia)
도 8(D): 해마신경세포(Hippocampal Neuronal cell)
도 8(E): 미세아교세포(Microglia)에서 3회 이상 반복 실험한 후 상대적인 값을 수치화하여 나타냄.
도 8에 나타난 바와 같이, 신경아교세포(astrocyte, 도 8A)와 신경모세포(Neuroblast, 도 8B)에 화합물 24(실시예 2)를 처리한 결과 농도 의존적으로 감소하였고 P-p38 MAPK는 0.01μM, 0.1μM에서도 감소하는 것을 확인하였다. 미세아교세포(Microglia, 도 8C)와 해마신경세포(Hippocampal Neuronal cell, 도 8D)에서도 같은 실험을 진행한 결과 화합물 24 농도 의존적으로 p38이 감소하였고, 0.1μM에서도 P-p38이 감소하는 것을 확인하였다. 도 8A ~ 도 8D의 결과로 보았을 때 신경세포에서 화합물 24이 P-p38 MAPK를 더 효과적으로 감소시키는 것을 알 수 있었다.
<실험예 8> 실시예 화합물 처리로 인한 p38 MAPK 관련 사이토카인 생성 감소 평가
실시예 화합물 처리로 인하여 p38 MAPK가 제거되면, p38 MAPK에 의해 생성되는 사이토카인의 생성량이 감소할 것으로 예상되어, 이를 검증하기 위하여 실험하였다.
구체적으로, 24 웰 플레이트에 미세아교세포인 BV2 세포를 배양하였다. 화합물 24(실시예 2)가 세포 내에서 p38 MAPK를 유비퀴틴화하여 프로테아좀 의존적으로 p38을 제거함에 따라서, p38 관련 사이토카인의 생성도 감소되는지 비교하기 위하여, 화합물 16(비교예 3)을 대조군으로 처리하여 비교하였다. 실험 조건은 다음과 같다. 각 화합물을 10μM 또는 20μM로 24시간 선 처리한 후, 사이토카인의 생성을 유도하기 위해 LPS(lipopolysaccharide)를 1μg/mL로 새 세포배양액에 희석하여 처리한 후 배양하였다. 24시간 후에 세포배양액의 상층액을 모아 사이토카인 생산량을 효소면역흡착법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA, 제조사: Bio-kit)으로 분석하였다. 분석방법은 Bio-kit에 제시된 프로토콜을 따랐다. 실험은 3회 이상 반복하여 도 9의 그래프로 나타냈다.
도 9는 본 발명의 실시예 화합물 처리로 인한 p38 MAPK 관련 사이토카인 생성량이 감소됨을 ELISA 방법으로 확인한 결과이다.
도 9에 나타난 바와 같이, 화합물 24(실시예 2)를 처리한 군에서 p38 MAPK 관련 사이토카인인 인터루킨6 (IL-6), 종양괴사인자 알파 (TNF-α)의 생성량이 감소하는 것을 확인하였다. 화합물 16(비교예 3)과 비교시 더 효과적으로 감소한 것을 확인하였다.
<실험예 9> 실시예 화합물 처리로 인한 p38 MAPK 관련 사이토카인의 mRNA 발현량 감소 평가
실시예 화합물 처리로 인하여 p38 MAPK가 제거되면, p38 MAPK 관련 Cytokine의 mRNA 발현량도 감소할 것으로 예상되어, 이를 검증하기 위하여 실험하였다.
구체적으로, 6 웰 플레이트에 미세아교세포인 BV2 세포를 배양하였다. 이후 화합물 24(실시예 2)을 10μM, 20μM 농도로 24시간 처리하였다. P38 MAPK 관련 사이토카인의 발현을 증가시키기 위해 화합물의 24시간 처리 중 마지막 6시간은 LPS 1μg/mL을 함께 처리하였다. 이후 사이토카인의 mRNA 전사를 qRT-PCR (Real-Time　Quantitative Reverse Transcription　PCR) 로 분석하였다. RNA 분리는 RNA 정제 키트를 이용하여 순수한 RNA만 추출하였다. 분리된 RNA의 농도와 순도는 분광 광도계 (spectrophotometer) 로 측정된다. 각 샘플의 RNA는 cDNA 합성 키트를 이용하여 cDNA (complementary DNA)를 합성하고, SYBR Green을 이용한 qRT-PCR 분석법을 통해 염증성 사이토카인인 인터루킨6 (IL-6)와 인터루킨1 베타 (IL-1β) 및 인터루킨12 (IL-12)의 mRNA의 발현량을 측정하였다.
도 10은 본 발명의 실시예 화합물이 p38 MAPK 관련 사이토카인의 mRNA 발현량 감소시킴을 qRT-PCR 방법으로 확인한 결과이다.
도 10에 나타난 바와 같이, 인터루킨6 (IL-6)와 인터루킨1 베타 (IL-1β) 및 인터루킨12 (IL-12)의 mRNA양이 화합물 24(실시예 2)를 처리한 군에서 감소하는 것을 확인하였다. 이 결과로 보았을 때 화합물 24(실시예 2)는 p38 MAPK의 제거를 유도하고 이로 인하여 p38 MAPK 관련 염증성 사이토카인의 mRNA 발현량 또한 감소하는 것을 알 수 있다.
약제의 제조예
본 발명에 따른 유효물질은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 유효물질을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<약제 제조예 1> 산제의 제조
유효물질 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<약제 제조예 2> 정제의 제조
유효물질 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<약제 제조예 3> 캡슐제의 제조
유효물질 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<약제 제조예 4> 주사제의 제조
유효물질 10 ㎍/㎖
묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지
주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖
적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 유효물질을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.
<약제 제조예 5> 경비흡수제 (Nasal spray)의 제조
유효물질 1.0 g
아세트산나트륨 0.3 g
메틸파라벤 0.1 g
프로필파라벤 0.02 g
염화나트륨 적량
HCl 또는 NaOH pH 조정 적량
정제수 적량
통상의 경비흡수제의 제조방법에 따라, 염수 (0.9% NaCl, w/v, 용매는 정제수) 1 mL당 유효물질 3 mg이 포함되도록 제조하고, 이를 불투명한 스프레이 용기에 충진하고 멸균시켜 경비흡수제를 제조하였다.
<약제 제조예 6> 액제의 제조
유효물질 100 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라, 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 mL로 조절한 후 갈색 병에 충진하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.
건강기능식품의 제조예
본 발명에 따른 유효물질은 목적에 따라 여러 형태의 건강기능식품으로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 유효물질을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 건강기능식품의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<건강기능식품 제조예 1> 건강기능식품의 제조
유효물질 100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 μg
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 μg
비타민 C 10 mg
비오틴 10 μg
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 μg
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능성 식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능성 식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능성 식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
<건강기능식품 제조예 2> 건강 기능 음료의 제조
유효물질 100 mg
구연산 100 mg
올리고당 100 mg
매실농축액 2 mg
타우린 100 mg
정제수를 가하여 전체 500 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 1 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. 상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
건강식품의 제조예
본 발명에 따른 유효물질은 목적에 따라 여러 형태의 건강식품으로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 유효물질을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 건강식품의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<건강식품 제조예 1> 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 유효물질 0.01-1 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
<건강식품 제조예 2> 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 본 발명의 유효물질을 진공 농축기에서 감압농축하고 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 유효물질의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 34 중량부, 율무 19 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
유효물질 (2 중량부),
영지(1.5 중량부), 및
지황(1.5 중량부).
본 발명에 따른 화학식 A로 표시되는 화합물은 p38 MAPK 제거능이 현저히 우수한 효과가 있어, 만성 염증성 질환 치료제로 유용할 수 있다.

Claims (18)

  1. 하기 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 A]
    Figure PCTKR2021002361-appb-I000040
    (상기 화학식 A에 있어서,
    상기 p38 Ligand Moiety는
    Figure PCTKR2021002361-appb-I000041
    이고;
    상기 E3 Ligand Moiety는
    Figure PCTKR2021002361-appb-I000042
    이고;
    상기 Linker는
    Figure PCTKR2021002361-appb-I000043
    ,
    Figure PCTKR2021002361-appb-I000044
    ,
    Figure PCTKR2021002361-appb-I000045
    ,
    Figure PCTKR2021002361-appb-I000046
    ,
    Figure PCTKR2021002361-appb-I000047
    또는
    Figure PCTKR2021002361-appb-I000048
    이고,
    상기 n 및 m은 독립적으로 1 내지 10의 정수이고,
    상기 a 및 b는 독립적으로 1 내지 10의 정수이다).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 n은 1 내지 5의 정수이고,
    상기 m은 3 내지 7의 정수이며,
    상기 a는 1 내지 5의 정수이고,
    상기 b는 1 내지 7의 정수인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 n은 1 내지 3의 정수이고,
    상기 m은 5이며,
    상기 a는 1 내지 2의 정수이고,
    상기 b는 2 또는 5인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 A로 표시되는 화합물은 하기 화합물군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
    1) 2-(4-(5'-(사이클로프로필카바모일)-2'-메틸-[1,1'-바이페닐]-4-카보닐)페녹시)에틸(2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)카바메이트 (23);
    2) 2-(2-(4-(5'-(사이클로프로필카바모일)-2'-메틸-[1,1'-바이페닐]-4-카보닐)페녹시)에톡시)에틸(2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)카바메이트 (24);
    3) 2-(2-(2-(4-(5'-(사이클로프로필카바모일)-2'-메틸-[1,1'-바이페닐]-4-카보닐)페녹시)에톡시)에톡시)에틸(2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)카바메이트 (25);
    4) 5-(4-(5'-(사이클로프로필카바모일)-2'-메틸-[1,1'-바이페닐]-4-카보닐)페녹시)펜틸(2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)카바메이트 (26);
    5) N-사이클로프로필-4'-(4-(2-((2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)옥시)에톡시)벤조일)-6-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아미드 (31);
    6) N-사이클로프로필-4'-(4-(2-(2-((2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)옥시)에톡시)에톡시)벤조일)-6-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아미드 (32);
    7) N-사이클로프로필-4'-(4-(2-(2-(2-((2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)옥시)에톡시)에톡시)에톡시)벤조일)-6-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아미드 (33);
    8) N-사이클로프로필-4'-(4-((5-((2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)옥시)펜틸)옥시)벤조일)-6-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아미드 (34); 및
    9) (S)-N-사이클로프로필-4'-(4-(2-(2-(2-((2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-일)-1,3-다이옥소이소인돌린-4-일)옥시)아세트아미도)에톡시)에톡시)벤조일)-6-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-카르복스아미드 (41).
  5. 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,
    화합물 8A와 화합물 13을 유기용매에서 반응시켜 화합물 14A를 합성하는 단계(단계 1);
    화합물 14A와 4-니트로페닐클로로포르메이트를 유기용매에서 반응시켜 화합물 19A를 합성하는 단계(단계 2); 및
    화합물 19A와 화합물 5를 유기용매에서 반응시켜 화합물 A1을 합성하는 단계(단계 3);를 포함하는 화합물 A1의 제조방법:
    [반응식 1]
    Figure PCTKR2021002361-appb-I000049
    (상기 반응식 1에서,
    L1은 -(CH2)n-OH 또는 -(CH2CH2-O)n-CH2CH2OH이고, 여기서 상기 n은 1 내지 10의 정수이고;
    L2는 -(CH2)m-O- 또는 -(CH2CH2-O)m-이고, 여기서 상기 m은 1 내지 10의 정수이다).
  6. 제5항에 있어서,
    상기 단계 1 내지 단계 3의 유기용매는 독립적으로 DMF(dimethylformamide), DCM(dichloromethane), 에탄올, 테트라하이드로퓨란(THF), 벤젠, KOH/MeOH, MeOH, 톨루엔, 디이소프로필에테르, 디에틸에테르, 디옥산, 아세토니트릴, 디메틸아세트아미드(DMA), 디메틸설폭사이드(DMSO), 아세톤 및 클로로벤젠으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 하기 반응식 2에 나타난 바와 같이,
    화합물 8A와 화합물 13을 유기용매에서 반응시켜 화합물 14A를 합성하는 단계(단계 1);
    화합물 14A와 p-TsCl(p-Toluenesulfonyl chloride)를 유기용매에서 반응시켜 화합물 27A를 합성하는 단계(단계 2); 및
    화합물 27A와 화합물 6을 유기용매에서 반응시켜 화합물 A2를 합성하는 단계(단계 3);를 포함하는 화합물 A2의 제조방법:
    [반응식 2]
    Figure PCTKR2021002361-appb-I000050
    (상기 반응식 2에서,
    L1은 -(CH2)n-OH 또는 -(CH2CH2-O)n-CH2CH2OH이고, 여기서 상기 n은 1 내지 10의 정수이고;
    L2는 -(CH2)m-O- 또는 -(CH2CH2-O)m-이고, 여기서 상기 m은 1 내지 10의 정수이다).
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 단계 1 내지 단계 3의 유기용매는 독립적으로 DMF(dimethylformamide), DCM(dichloromethane), 에탄올, 테트라하이드로퓨란(THF), 벤젠, KOH/MeOH, MeOH, 톨루엔, 디이소프로필에테르, 디에틸에테르, 디옥산, 아세토니트릴, 디메틸아세트아미드(DMA), 디메틸설폭사이드(DMSO), 아세톤 및 클로로벤젠으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 하기 반응식 3에 나타난 바와 같이,
    화합물 14와 화합물 36A를 유기용매에서 반응시켜 화합물 37A를 합성하는 단계(단계 1);
    화합물 37A와 염산을 유기용매에서 반응시켜 화합물 38A를 합성하는 단계(단계 2); 및
    화합물 38A와 화합물 40을 유기용매에서 반응시켜 화합물 A3을 합성하는 단계(단계 3);를 포함하는 화합물 A3의 제조방법:
    [반응식 3]
    Figure PCTKR2021002361-appb-I000051
    (상기 반응식 3에서,
    L3은 -(CH2)n-OMs 또는 -(CH2CH2-O)n-CH2CH2OMs이고, 여기서 상기 n은 1 내지 10의 정수이고;
    L4는 -(CH2)m-O- 또는 -(CH2CH2-O)m-이고, 여기서 상기 m은 1 내지 10의 정수이다).
  10. 제9항에 있어서,
    상기 단계 1 내지 단계 3의 유기용매는 독립적으로 DMF(dimethylformamide), DCM(dichloromethane), 에탄올, 테트라하이드로퓨란(THF), 벤젠, KOH/MeOH, MeOH, 톨루엔, 디이소프로필에테르, 디에틸에테르, 디옥산, 아세토니트릴, 디메틸아세트아미드(DMA), 디메틸설폭사이드(DMSO), 아세톤 및 클로로벤젠으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제1항의 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 만성 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 만성 염증성 질환은 알츠하이머, 파킨슨 병, 염증성 장질환, 비알콜성 만성 간염, 만성 간염, 크론병, 췌장염, 식도염, 위염, 대장염, 궤양성 대장염, 폐렴, 기관지염, 인후염, 심근경색, 심부전, 관절염, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 신부전, 건선, 빈혈, 당뇨, 섬유화증, 다발성 경화증, 전신 홍반 루프스, 강직성 척추염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 치주염, 신경병증 통증 및 특발성 염증성 근육병증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제1항의 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 만성 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 만성 염증성 질환은 알츠하이머, 파킨슨 병, 염증성 장질환, 비알콜성 만성 간염, 만성 간염, 크론병, 췌장염, 식도염, 위염, 대장염, 궤양성 대장염, 폐렴, 기관지염, 인후염, 심근경색, 심부전, 관절염, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 신부전, 건선, 빈혈, 당뇨, 섬유화증, 다발성 경화증, 전신 홍반 루프스, 강직성 척추염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 치주염, 신경병증 통증 및 특발성 염증성 근육병증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  15. 제1항의 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 만성 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 만성 염증성 질환은 알츠하이머, 파킨슨 병, 염증성 장질환, 비알콜성 만성 간염, 만성 간염, 크론병, 췌장염, 식도염, 위염, 대장염, 궤양성 대장염, 폐렴, 기관지염, 인후염, 심근경색, 심부전, 관절염, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 신부전, 건선, 빈혈, 당뇨, 섬유화증, 다발성 경화증, 전신 홍반 루프스, 강직성 척추염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 치주염, 신경병증 통증 및 특발성 염증성 근육병증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 건강식품 조성물.
  17. 제1항의 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 치료적으로 유효한 양으로 만성 염증성 질환 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 만성 염증성 질환의 치료방법.
  18. 만성 염증성 질환 치료제의 제조에 있어서, 제1항의 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
PCT/KR2021/002361 2020-03-20 2021-02-25 P38 제거능을 갖는 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 만성 염증성 질환 치료용 조성물 WO2021187766A1 (ko)

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