WO2021181467A1 - 微粒子充填方法及び微粒子充填装置 - Google Patents

微粒子充填方法及び微粒子充填装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2021181467A1
WO2021181467A1 PCT/JP2020/010031 JP2020010031W WO2021181467A1 WO 2021181467 A1 WO2021181467 A1 WO 2021181467A1 JP 2020010031 W JP2020010031 W JP 2020010031W WO 2021181467 A1 WO2021181467 A1 WO 2021181467A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nozzle
fine particles
suspension
fine particle
concentration
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/010031
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
白井　正敬
友幸 坂井
Original Assignee
株式会社日立ハイテク
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社日立ハイテク filed Critical 株式会社日立ハイテク
Priority to US17/802,925 priority Critical patent/US20230288301A1/en
Priority to PCT/JP2020/010031 priority patent/WO2021181467A1/ja
Priority to JP2022507005A priority patent/JP7312313B2/ja
Publication of WO2021181467A1 publication Critical patent/WO2021181467A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34—Purifying; Cleaning
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/0098—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor involving analyte bound to insoluble magnetic carrier, e.g. using magnetic separation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/0289—Apparatus for withdrawing or distributing predetermined quantities of fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0642—Filling fluids into wells by specific techniques
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0652—Sorting or classification of particles or molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0657—Pipetting powder
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/14—Process control and prevention of errors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0654—Lenses; Optical fibres
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/02—Drop detachment mechanisms of single droplets from nozzles or pins
    • B01L2400/022—Drop detachment mechanisms of single droplets from nozzles or pins droplet contacts the surface of the receptacle
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/043—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces magnetic forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N2035/1027—General features of the devices
    • G01N2035/1034—Transferring microquantities of liquid
    • G01N2035/1037—Using surface tension, e.g. pins or wires

Definitions

  • the present disclosure relates to a fine particle filling method and a fine particle filling device.
  • single cell analysis is one of the analysis methods in life science, and is a technique for analyzing and quantifying biomolecules for each single cell.
  • Single cell analysis is a method for determining the base sequence of DNA and RNA (particularly mRNA) for each single cell and counting the number of molecules, in particular, using a DNA sequencer.
  • Non-Patent Document 1 a method using a microchannel (Non-Patent Document 2), a method using an emulsion (Non-Patent Document 3), a method using a microwell (Non-Patent Document 4), and penetrating.
  • a method using a microwell (Non-Patent Document 5) and the like are known.
  • a large number of cells to be analyzed are separated into single cells, and a cell-specific DNA base sequence (hereinafter referred to as "bar code") is introduced into the nucleic acid extracted from each cell.
  • bar code a cell-specific DNA base sequence
  • nucleic acid samples obtained from these multiple cells are put together, DNA sequencing is performed, and DNA sequence information is separated for each bar code sequence information from the obtained sequence data, so that single cell analysis data is obtained. Can be obtained.
  • Non-Patent Documents 3 to 5 a sample for a DNA sequencer from a large number of cells is prepared with a small amount of reagent by introducing a barcode after cell isolation and before nucleic acid amplification, and sequence data. Can be obtained.
  • the single cell analysis method described in Non-Patent Document 5 has a larger number of fine particles used for analysis of one cell than the methods described in Non-Patent Documents 3 and 4 (in Non-Patent Documents 3 and 4).
  • One fine particle the number of nucleic acid capture DNA probes used for analysis of one cell can be increased by about 100 times or more.
  • the cell disruption solution passes through a porous structure composed of a large number of fine particles, nucleic acids from a single cell can be trapped on the surface of the fine particles in a short time and with high efficiency.
  • Non-Patent Document 5 by utilizing the fact that there is a through hole on the bottom surface of the microreaction tank, the fine particle suspension is dispensed into the microreaction tank and excess water is discharged through the through hole to make the fine particles fine.
  • the reaction tank is filled. Further, since the diameter of the microreactor is as small as 50 to 100 ⁇ m, an inkjet device is used.
  • the fine particle density in the ejection nozzle must be stable and constant in order to stably eject the droplets. Since the physical characteristics of the solution are not constant, not only the discharge amount and the discharge direction are not stable, but also the discharge itself is stopped frequently. If ejection arrest occurs, the particulate suspension must be reprepared and refilled in the inkjet head. Therefore, the time for filling a large number of microreactors into a large number of microreaction tanks becomes longer by the amount of replacement work.
  • the fine particles can be concentrated to a concentration close to the close-packed density in advance and then the fine particles can be separated and filled in the microreaction tank, the above problem can be solved, but the fine particle precipitate concentrated to a high concentration. It is technically difficult to collect a certain amount of fine particles from.
  • the present disclosure provides a technique for filling a container with fine particles in a short time and stably.
  • the fine particle filling method of the present disclosure is a method of filling at least one or more containers with fine particles, and sucking a suspension of the fine particles into a nozzle and the suspension. Concentrating the fine particles inside to form a high-concentration suspension having a predetermined fine particle concentration at the tip of the nozzle, contacting the high-concentration suspension with the inner wall of the container, and the above. It is characterized by comprising filling the container with the high-concentration suspension by separating the nozzle from the container after contact.
  • the container can be filled with fine particles in a short time and stably. Issues, configurations and effects other than the above will be clarified by the following description of the embodiments.
  • Micro reaction tank A concave container formed on a flat substrate.
  • the diameter is several ⁇ m to several hundred ⁇ m, and in particular, those having a diameter of several tens of ⁇ m. It also includes the one described in Non-Patent Document 5 in which a through hole for capturing cells is formed on the bottom surface.
  • Nozzle A hollow structure that allows the solution and fine particles to move, and the tip can be inserted into a microreaction tank.
  • Buffer A solution in which fine particles are suspended.
  • the pH or salt concentration may be controlled in order to maintain the suspension state of the fine particles.
  • a surfactant may be mixed if necessary.
  • Fine particles Particles having a specific gravity larger than that of a solution and having a diameter of several hundred nm to several hundred ⁇ m, or particles having magnetism, charge or dielectric property and having a diameter of several nm to several hundred ⁇ m.
  • Contact The solution component (buffer) of the fine particle suspension sucked into the tip of the nozzle touches the inner wall (bottom surface and side wall surface) of the microreaction tank.
  • the state in which the contact angle can be defined between the solution and the inner wall.
  • “Concentration” Increasing the fine particle concentration (number of fine particles per unit volume (number density)) of the fine particle suspension to reach a fine particle concentration of 50% or more of the closest packing density of the fine particles.
  • Finelling The required number of fine particles (required fine particle concentration) is supplied to the inside of the microreactor.
  • “Judgment” A region (high-concentration suspension) in which the concentration of fine particles is increased is formed at the tip of the nozzle, and the concentration of the fine particles and the volume of the region occupy 50% or more of the volume of the microreaction tank. To determine whether or not it contains fine particles.
  • High concentration A state in which the fine particle concentration required for filling has been reached. It refers to the fine particle concentration such that the density is 50% or more of the close-packed density of the fine particles.
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view for explaining the fine particle filling method according to the first embodiment. As shown in FIG. 1, this method includes the following steps (i) to (v).
  • the flat substrate 1 is, for example, a chip (titer plate) for single cell analysis, and a plurality of microreaction tanks 2 may be formed on the flat substrate 1.
  • the microreaction tank 2 is formed with a through hole 4 extending from the bottom surface 3a of the microreaction tank 2 to the bottom surface of the flat substrate 1.
  • the nozzle 5 has a shape that tapers toward the tip, but if the nozzle 5 can be inserted into the microreaction tank 2 until the tip of the nozzle 5 contacts the bottom surface 3a of the microreaction tank 2, the outer diameter is constant. It may be in shape.
  • the outer diameter of the tip of the nozzle 5 can be, for example, 80% to 90% of the diameter of the bottom surface 3a of the microreaction tank 2, but is not limited thereto.
  • the predetermined volume is set to a value that includes, for example, a number of fine particles that occupy 50% or more of the volume of the microreaction tank 2 when the high-concentration suspension 7 is filled in the microreaction tank 2. ..
  • the predetermined concentration (high concentration) is, as described above, a fine particle concentration such that the density is 50% or more of the close-packed density of the fine particles.
  • the nozzle 5 is imaged with an external camera, and the temporal and spatial changes of the fine particles in the nozzle 5 are observed, so that the high concentration suspension in the nozzle 5 is performed. Estimate the volume of liquid 7. At this time, when the height of the liquid level of the high-concentration suspension 7 in the nozzle 5 reaches a predetermined value, it can be determined that the high-concentration suspension 7 having a predetermined volume has been obtained.
  • a high-concentration suspension 7 having a predetermined volume is obtained by irradiating the tip of the nozzle 5 with light and measuring the amount or distribution of scattered light, absorbed light, transmitted light, or the like. You can also. In this case, it is necessary to appropriately control the spot size and position of the emitted light in the vicinity of the nozzle 5. Further, the position of the nozzle 5 at a predetermined height is irradiated with light, and it is determined that the high-concentration suspension 7 having a predetermined volume is obtained based on the scattered light, the absorption or the transmitted light at that position. It may be.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view for explaining the principle of the fine particle filling method according to the present embodiment, and the tip portion of the nozzle 5 and the internal space of the microreaction tank 2 are shown in an enlarged manner.
  • FIG. 2A shows a state immediately after the solution 8 in the nozzle 5 comes into contact with the bottom surface 3a of the microreaction tank 2. As shown in FIG. 2A, when the nozzle 5 is lowered in the step (iii) and a part of the lower end of the nozzle 5 comes into contact with the bottom surface 3a (inner wall) of the microreaction tank 2, a high concentration suspension is provided. The solution 8 in 7 wets and spreads (contacts) the bottom surface 3a of the microreaction tank 2.
  • FIG. 2B shows a state in which the solution 8 is also in contact with the side wall surface 3b of the microreaction tank 2. As shown in FIG. 2B, the solution 8 seeps out until it comes into contact with at least a part of the side wall surface 3b.
  • the radius of the bottom surface 3a of the microreaction tank 2 is Rw
  • the radius of the outer wall 9 at the tip of the nozzle 5 is Rc
  • the contact angle of the solution 8 with respect to the inner wall of the microreaction tank 2 is ⁇ w
  • the outer wall 9 of the nozzle 5 is Let ⁇ c be the contact angle of the solution 8 with respect to.
  • the microreaction tank 2 can be filled with the high-concentration suspension 7 of fine particles by pulling up the nozzle 5 at a predetermined speed while maintaining the state of ⁇ P> 0.
  • the pulling speed of the nozzle 5 may be constant as long as ⁇ P> 0 can be maintained, or may be pulled while accelerating or decelerating.
  • the fine particle concentration of the high-concentration suspension 7 is 50% or more of the dense packing density. At least 50% or more of the volume of the reaction vessel 2 is filled with fine particles. If the fine particle concentration and volume of the high-concentration suspension 7 are set to appropriate conditions, 80% or more of the volume of the fine reaction tank 2 can be occupied by fine particles in a dry state.
  • the volume of the high-concentration suspension 7 formed in the nozzle 5 can be larger than the volume of the microreaction tank 2. Assuming that the microreaction tank 2 is formed without error, the opening angle is 90 °, and there is no deposit on the inner wall (shape in FIG. 2), when the nozzle 5 is pulled up in step (v), When the exuded solution 8 reaches the upper end of the microreaction tank 2, the contact angle ⁇ w becomes less than 90 °. When this contact angle ⁇ w is substituted into the equation (1), ⁇ P ⁇ 0, so that the discharge of the high-concentration suspension 7 from the nozzle 5 is theoretically stopped.
  • the microreaction tank 2 shown in FIG. 1 has a through hole 4 for capturing cells necessary for a single cell analysis chip, but the through hole 4 is not essential for the principle of filling fine particles.
  • the container without the through hole 4 can be filled with the fine particles. That is, the container filled with the fine particles by the technique of the present embodiment is not limited to the microreaction tank 2 of the single cell analysis chip, and may be a container into which the nozzle 5 can be inserted.
  • the cross-sectional shape of the container filled with the fine particles is not limited to the rectangle as shown in FIGS. 1 and 2, and other shapes such as a trapezoid whose bottom is narrower than the opening can be adopted.
  • the method of filling the single microreaction tank 2 with the fine particles has been described above, but when filling the plurality of microreaction tanks 2 with the fine particles, the above operation may be repeated. Specifically, after filling the first microreaction tank with the above steps (i) to (v) is completed, the nozzle 5 is moved directly above the second microreaction tank to cause a second microreaction. The process for filling the fine particles may be repeated so that the tank is in the initial state.
  • a storage container for a suspension in which various fine particles are suspended is prepared, and an empty nozzle 5 is immersed in a storage container for containing a desired suspension to cause a capillary phenomenon.
  • a syringe pump or the like is installed at the tip of the empty nozzle 5 opposite to the tip where the fine particle suspension is dispensed, and the fine particle suspension is sucked by a suction operation.
  • the nozzle 5 is moved directly above the predetermined microreaction tank 2 so as to be in the initial state of the step (i), and the steps (ii) to (v) are carried out.
  • the nozzle 5 is moved to the waste liquid container (waste liquid tube), and the fine particle suspension remaining in the nozzle 5 is discarded in the waste liquid container by, for example, operating a syringe pump.
  • the nozzle 5 is immersed in a plurality of types of cleaning liquids contained in a plurality of storage containers, and the cleaning liquid is repeatedly sucked and discarded to completely remove the fine particles adhering to the nozzle 5. Wash and remove.
  • the cleaning liquid for example, pure water such as filtered ion-exchanged water and alcohol such as ethanol can be used.
  • FIG. 3 is a schematic view showing the fine particle filling device 100 according to the first embodiment.
  • the fine particle filling device 100 is a device that automatically implements the above-mentioned fine particle filling method.
  • the fine particle filling device 100 includes a nozzle 5, a stage 101, a drive system 102, an optical system 103, a sensor system 104, a dispensing system 105, a plurality of storage containers 106, a camera system 107, a valve 108, and a tube. It includes 109 and a control system 110.
  • the stage 101 fixes and positions the flat substrate 1 having the microreaction tank.
  • the drive system 102 moves the nozzle 5 relative to the flat substrate 1 in the three axial directions by a set distance.
  • the drive system 102 for example, moves the nozzle 5 in the vertical direction and moves the stage 101 in the horizontal direction.
  • the drive system 102 may move only the stage 101 in the triaxial direction.
  • the optical system 103 observes the concentration state of the fine particle suspension in the nozzle 5 moved directly above the microreaction tank.
  • the optical system 103 may be a camera that images the tip of the nozzle 5, or may be an optical system that irradiates the tip of the nozzle 5 with light to analyze scattered light, light absorption, or transmitted light.
  • the sensor system 104 detects the contact between the nozzle 5 and the microreaction tank.
  • the sensor system 104 has, for example, a pressure sensor, and determines the contact between the nozzle 5 and the microreaction tank by detecting the upward force due to the contact between the nozzle 5 and the microreaction tank with the pressure sensor.
  • the sensor system 104 may be configured to detect contact by optical means such as a camera.
  • the dispensing system 105 has, for example, a syringe pump and controls suction and discharge of liquid to the nozzle 5.
  • the dispensing system 105 specifically controls the suction of the particulate suspension into the nozzle 5.
  • the nozzle 5 is connected to the dispensing system 105 by a tube 109 (eg, a PEEK tube).
  • the plurality of storage containers 106 include a storage container in which a fine particle suspension is stored, a storage container in which a cleaning liquid is stored, and a waste liquid container in which waste liquid is collected.
  • the camera system 107 is used for observing the positions of the flat substrate 1 and the nozzle 5 and aligning the tip of the nozzle 5 directly above the microreaction tank of the flat substrate 1.
  • the valve 108 can be provided as one of the parts of the dispensing system 105 and is used for atmospheric pressure release.
  • the control system 110 controls the operations of the drive system 102, the optical system 103, the sensor system 104, the dispensing system 105, and the camera system 107. Further, the control system 110 receives the detection signals of the optical system 103, the sensor system 104, and the camera system 107, and executes necessary arithmetic processing.
  • FIG. 4 is a flowchart showing the operation of the fine particle filling device 100.
  • step S1 the control system 110 builds the entire initial state of the fine particle filling device 100. Specifically, first, the user places the flat substrate 1 on the stage 101, and arranges the storage container 106 for the fine particle suspension and the storage container 106 for the cleaning liquid at predetermined positions. After that, when the user inputs an operation start instruction from, for example, an input device of the control system 110, the control system 110 confirms whether the flat substrate 1, the nozzle 5, and the storage container 106 are all located at predetermined initial positions. .. If any of these is not located in the initial position, the drive system 102 moves it to the initial position.
  • step S2 the control system 110 builds an initial state for each microreaction tank 2. Specifically, the control system 110 drives the drive system 102 and the dispensing system 105 to suck the cleaning liquid into the nozzle 5 and discharge it into a waste liquid container (not shown) to clean the nozzle 5. After that, the control system 110 sucks the fine particle suspension into the nozzle 5 and moves it directly above the predetermined microreaction tank 2.
  • step S3 the control system 110 determines whether the fine particles in the fine particle suspension in the nozzle 5 have settled to form a high-concentration suspension having a predetermined fine particle concentration by a predetermined volume.
  • the control system 110 calculates the size of the black region from the contrast of the image received from the optical system 103, and calculates the concentration and volume of the high-concentration suspension based on the size of the black region.
  • step S4 the control system 110 drives the drive system 102 to lower the nozzle 5 and bring the tip of the nozzle 5 into contact with the bottom surface of the microreaction tank.
  • the solution of the fine particle suspension at the tip of the nozzle 5 gets wet on the bottom surface and the side wall surface of the microreaction tank.
  • the nozzle 5 comes into contact with the fine particle suspension when it gets wet with the inner wall of the microreactor. This requires that the solution wet both the inner wall of the microreactor and the outer wall of the nozzle 5 to form an appropriate contact angle and the high concentration suspension in the nozzle 5 be drawn into the microreactor. And because it is essential.
  • a sensor system 104 is provided to detect the contact.
  • the interface of the fine particle suspension enters between the nozzle 5 and the side wall surface of the microreaction tank and rises.
  • the control system 110 maintains a contact state for 2 seconds due to this rise.
  • the reason why the contact state is set to 2 seconds is that, for example, when the diameter of the microreaction tank is 75 ⁇ m and the outer diameter of the tip of the nozzle 5 is 70 ⁇ m (inner diameter 52.5 ⁇ m), the contact between the nozzle 5 and the microreaction tank This is because after 2 seconds, the solution is surely wet with the bottom surface and the side wall surface of the microreaction tank. Needless to say, the time for maintaining the contact state can be appropriately changed according to the outer diameter of the nozzle 5 and the diameter of the microreaction tank 2.
  • step S5 the control system 110 drives the drive system 102 and pulls up the nozzle 5 at a speed of, for example, about 1 to 10 ⁇ m / s. As a result, the fine particles in the nozzle 5 are moved to the microreaction tank, and the fine particles are filled in the microreaction tank.
  • step S6 the control system 110 determines whether all the microreaction tanks 2 are filled with fine particles.
  • control system 110 drives the drive system 102 and the dispensing system 105 to fill the next microreaction tank 2 with the fine particle suspension remaining in the nozzle 5. Dispose in a waste liquid container.
  • the control system 110 drives the drive system 102 and the dispensing system 105 to suck and discharge two types of cleaning liquids to clean the nozzle 5.
  • the control system 110 drives the drive system 102 and the dispensing system 105 to provide a suspension of fine particles different from the previously filled fine particles (for example, fine particles having a different cell recognition tag sequence fixed from the previous one). It is sucked into the nozzle 5 and moved to just above the microreaction tank 2 different from the previous one. As a result, the initial state for the next microreaction tank 2 is constructed. After that, steps S3 to S6 are executed in the same manner as described above.
  • steps S2 to S6 are repeated for the second and subsequent micro reaction tanks 2, and if YES in step S6, the control system 110 ends the operation of the fine particle filling device 100.
  • step S4 step (iii)
  • step S5 step (iii)
  • the contact angle between the inner wall of the microreaction tank 2 and the solution and the contact angle between the outer wall of the nozzle 5 and the solution satisfy the conditions of the equation (1).
  • the hydrophilicity of the inner wall of the microreaction tank 2 and the hydrophilicity of the outer wall of the nozzle 5 are determined, and between the inner diameter of the microreaction tank 2 and the outer diameter of the tip of the nozzle 5. Certain conditions must be met.
  • the minimum outer diameter of the tip of the nozzle required for the suspension to rise is derived from equation (1) as 40 ⁇ m.
  • FIG. 5 is a graph showing the result of measuring the success rate of fine particle filling with respect to the outer diameter of the nozzle tip.
  • a flat substrate of dimethylpolysiloxane was processed using imprinting technology to form a plurality of microreaction tanks.
  • the shape and dimensions of the microreactor were cylindrical with a diameter of 75 ⁇ m and a height of 70 ⁇ m.
  • the success rate of was 80% or more.
  • the difference between the theoretical value (40 ⁇ m) of the minimum outer diameter of the nozzle tip calculated by using the formula (1) and the measurement result (60 ⁇ m or more) in FIG. 5 is considered to be due to the following reasons.
  • the radius of the nozzle is determined as a value corresponding to the condition of ⁇ P.
  • the radius of the nozzle cannot be raised successfully unless a certain region or more (a considerable region of the length of the outer circumference of the nozzle) satisfies the condition of ⁇ P.
  • the nozzle has a portion whose radius does not satisfy the condition of ⁇ P due to a manufacturing error or the like, but the nozzle is pulled up so that ⁇ P> 0 is satisfied including this portion. As a result, it is considered that the measurement result of FIG. 5 became larger than the theoretical value calculated using the maximum value of the contact angle.
  • a nozzle 5 having an outer diameter of 70 ⁇ m (inner diameter of 52.5 ⁇ m) is used.
  • the contact time between the nozzle 5 and the microreaction tank is set to 2 seconds, and the pulling speed of the nozzle 5 is set to 1 to 10 ⁇ m / s.
  • these values depend on the outer diameter of the nozzle 5 and the diameter of the microreaction tank 2. Needless to say, it can be changed as appropriate.
  • the suspension of fine particles is sucked into the nozzle, the fine particles in the suspension are concentrated, and predetermined fine particles are applied to the tip of the nozzle.
  • the high-concentration suspension is filled in the micro-reaction tank by forming a high-concentration suspension, contacting the high-concentration suspension with the inner wall of the micro-reaction tank, and separating the nozzle from the container after the contact. Includes what to do.
  • the dispensing time of the fine particles can be shortened as compared with the conventional method of dispensing the fine particle suspension to eliminate the excess solution.
  • the fine particles are concentrated to a predetermined concentration before being filled in the microreaction tank (container), a certain amount of fine particles can be filled with good reproducibility.
  • the principle of filling the fine particle suspension into the microreaction tank is dispensing using the surface tension (contact angle) of the solution with respect to the solid surface, the fine particle suspension with high viscosity and high concentration can be accurately microreacted. It is possible to dispense to the top of the tank.
  • the principle of such a dispensing method is different from that of a general solution (not containing fine particles).
  • FIG. 6A is a top view showing a chip 11 (substrate) for single cell analysis
  • FIG. 6B is a cross-sectional view showing a part of a cross section of the chip 11.
  • 10 ⁇ 10 microreaction tanks 12 are formed on the chip 11 at equal intervals.
  • the microreaction tank 12 is provided with a through hole 14 for cell capture, which has a chip structure capable of cell isolation for single cell analysis.
  • the chip 11 having such a structure can be molded by using imprinting technology, for example, using dimethylpolysiloxane (PDMS) as a material.
  • the through hole 14 can be perforated by laser processing, but other particle beam processing and molding processing by a mold are also possible.
  • Various materials can be used as the material of the chip 11, for example, various resin materials (polycarbonate-based, polycycloolefin-based, polyolefin-based, polypropylene-based, polyethylene-based, acrylic-based, acrylonitrile-based resin, etc.), metal materials. , Semiconductor materials such as silicon, oxide materials such as quartz and alumina, and amorphous materials such as glass. These materials can also be used in combination of a plurality of materials for processing or for controlling surface wettability.
  • the microreaction tank 12 has a cylindrical shape with a diameter of 75 ⁇ m and a height of 70 ⁇ m.
  • the center spacing of the adjacent microreaction tanks 12 was 105 ⁇ m.
  • the hole diameter of the through hole 14 was set to 3 ⁇ m at the smallest point, and the length was set to 30 ⁇ m.
  • the above size is an example of a size suitable for a single cell analysis device, and the size of the microreaction tank 12 to be filled with fine particles may be any of several ⁇ m to several hundred ⁇ m in both diameter and height.
  • the shape of the microreaction tank 12 does not have to be cylindrical, and if there is an opening capable of filling fine particles, a polygonal column such as a quadrangular prism or a tapered shape such as a truncated cone or a square thruster can be used. good.
  • the fine particles filled in the microreaction tank 12 of the chip 11 are fine particles for performing gene expression analysis for measuring the amount of mRNA in a single cell for each gene sequence.
  • the molecule to be fixed to the fine particles it can be applied to various single cell analysis.
  • magnetic fine particles (diameter 1 ⁇ m) in which a large number of streptavidin molecules are fixed on the surface are used.
  • mRNA to be measured is captured on the surface of fine particles, and a DNA probe is immobilized to introduce a barcode sequence for cell identification into a nucleic acid sample.
  • Biotin for tight binding to streptavidin is immobilized on the 5'end of the DNA probe.
  • the sequence of the DNA probe has a common sequence for PCR, a tag sequence for molecular recognition, a tag sequence for cell identification (7 base), and a continuous sequence of T for mRNA capture at the 3'end in order from the 5'end.
  • the sequences of the DNA probes are shown in SEQ ID NOs: 1 to 100.
  • the cell identification tag sequence is a 7-based 100 known sequence
  • the molecular recognition tag sequence is a 7-based random sequence.
  • the length and position of the cell identification tag sequence may be different from the above.
  • three types of 7-based known sequences may be arranged so as to sandwich two 3-based known sequences, or may be arranged as a random sequence instead of the known sequence.
  • the length and arrangement of the molecular recognition tag sequence can be changed.
  • the method of fixing the DNA probe on the fine particles is as follows. First, with fine particles in a 1xB & W buffer (5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 mM EDTA, 1M NaCl), being careful not to mix between DNA probes with different cell identification tag sequences. The DNA probe is mixed and the binding reaction is carried out at room temperature for about 30 minutes. Then, after washing twice with a 1xB & W buffer, a fine particle suspension is obtained by resuspending with a 10 mM Tris pH 8.0 buffer. As a fine particle suspension, 100 types having different cell identification tag sequences were prepared in 100 different storage tubes.
  • a 1xB & W buffer 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 mM EDTA, 1M NaCl
  • FIG. 7 is a schematic view showing the fine particle filling device 200 according to the second embodiment. Since the configuration of the fine particle filling device 200 is almost the same as that of the fine particle filling device 100 (FIG. 3) of the first embodiment, only the differences will be described.
  • the fine particle filling device 200 includes a control board 201, an image acquisition board 202, an AD conversion board 203, and a control computer 204 as control devices for each component.
  • the double line in FIG. 7 indicates that the signal can be transmitted or received (transmitted).
  • the control board 201 controls the drive of the drive system 102, the dispensing system 105, and the valve 108.
  • the drive system 102 moves the stage 101 on which the chip 11 is placed and the stage 111 on which the storage containers 106a and 106b are placed in the triaxial direction.
  • the image acquisition board 202 controls the operation of the optical system 103 and the camera system 107, and receives the signal or image acquired by the optical system 103 and the camera system 107.
  • the AD conversion board 203 converts the analog signal from the sensor system 104 into a digital signal.
  • the control computer 204 stores the control program of the fine particle filling device 200, and controls the control board 201, the image acquisition board 202, and the AD conversion board 203 according to the control program.
  • the nozzle 5 used was made by stretching a glass tube having a diameter of 1 mm to 3 mm and sharpening the tip. A puller and a microforge were used to process the glass tube.
  • the nozzle 5 was connected to the dispensing system 105 using a tube 109 to suck the fine particle suspension so that the nozzle 5 could be washed.
  • the nozzle 5 may be connected to a syringe so that the drive of the syringe is controlled by the control board 201.
  • the storage container 106a containing the suspension of fine particles to which the above 100 different cell identification tags are fixed is installed in the container stage 111.
  • the container stage 111 may be provided with a rotary motor that vibrates or rotates the storage container 106a, whereby the storage container 106a is stirred so that the fine particle suspension becomes a uniform solution immediately before suction by the nozzle 5. can do.
  • a storage container 106b for storing the cleaning liquid three containers for storing filtered ion-exchanged water (pure water) and one container for storing 100% EtOH are installed.
  • the storage containers 106a and 106b are, for example, microtubes.
  • the control computer 204 of the fine particle filling device 200 executes the following operations according to the control program.
  • the operation of the fine particle filling device 200 is basically the same as that of the first embodiment (FIG. 4).
  • the control computer 204 receives the captured image of the camera system 107 via the image acquisition board 202, and confirms the position of the microreaction tank 12 to be filled based on the captured image.
  • the control computer 204 closes the valve 108 for releasing atmospheric pressure by the control board 201, drives the drive system 102 and the dispensing system 105, repeats suction and discharge of pure water by the nozzle 5 several times, and then repeats suction and discharge of pure water by the nozzle 5.
  • the suction and discharge of 100% EtOH are repeated several times. This cleans the inside of the nozzle 5.
  • the control computer 204 opens the valve 108 by the control board 201, drives the drive system 102 to immerse the nozzle 5 in the storage container 106a of the fine particle suspension, and causes the fine particle suspension in the nozzle 5 by capillarity. To suck.
  • the control computer 204 drives the drive system 102 by the control board 201 to move the microreaction tank 12 to be filled with fine particles directly under the nozzle 5 and lower the nozzle 5 to a predetermined position (or the chip 11). To raise).
  • the control computer 204 receives a detection signal or an image of the optical characteristics of the tip of the nozzle 5 by the optical system 103 via the image acquisition board 202, and setstles the fine particles and the height (volume or volume or high concentration suspension) of the high-concentration suspension. Check the amount of fine particles).
  • control computer 204 After confirming that a predetermined amount of high-concentration suspension has been formed, the control computer 204 sends an instruction to the control board 201 to drive the drive system 102, and the numerical value of the sensor system 104 is changed. Lower the nozzle 5 (or raise the tip 11). Specifically, when the height of the high-concentration suspension reaches 95 ⁇ m, the nozzle 5 starts to descend.
  • the control computer 204 drives the drive system 102 by the control board 201, and after the tip of the nozzle 5 comes into contact with the bottom of the microreaction tank 12 (after the sensor system 104 detects the contact), the nozzle 5 is pressed for 2 seconds. It is stationary and the nozzle 5 is raised at a speed of 1 ⁇ m / s.
  • FIG. 8 is a perspective view showing an example of the configuration of the sensor system 104.
  • the sensor system 104 has two ferrules 92, a block 93, two leaf springs 94 (elastic bodies), a fixing jig 95 and a strain sensor 96.
  • the two ferrules 92 connect the nozzle 5 and the pipe 109.
  • the ferrule 92 is fixed to the block 93 (for example, manufactured by PMMA).
  • One end of the two leaf springs 94 in the longitudinal direction is screwed and fixed to the block 93.
  • the other end of the leaf spring 94 in the longitudinal direction is fixed to the metal fixing jig 95.
  • a strain sensor 96 is fixed to each leaf spring 94 along the surface of the leaf spring 94.
  • the tip of the nozzle 5 comes into contact with the bottom surface of the microreaction tank 12 and an upward force (stress) is applied to the nozzle 5, the leaf spring 94 bends, and the strain sensor 96 detects the amount of this bending.
  • the amount of deflection becomes equal to or greater than a predetermined value, it can be determined that the nozzle 5 has come into contact with the microreaction tank 12.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of the flow cell device 20 used in the single cell analysis device.
  • the flow cell device 20 includes an upper plate 21 and a lower plate 22 made of resin (for example, PMMA), and a chip 11 (see FIG. 6) is placed between the upper plate 21 and the lower plate 22. It is sandwiched and fixed.
  • the chip 11 incorporated in the flow cell device 20 is in a state where the fine particles to which the DNA probe is fixed are filled in the microreaction tank 12 by using the fine particle filling device 200 described above.
  • the chip 11 in this state is sometimes called a "Vertical Flow Array Chip (VFAC)".
  • VFAC Very Flow Array Chip
  • the flow cell device 20 can mount 12 chips 11, but the number of chips 11 can be arbitrarily selected.
  • the upper plate 21 is provided with as many wells 23 as the number of chips 11, and cell samples, washing solutions, enzyme reagents, etc. can be supplied from the wells 23 to the chips 11.
  • the bottom surface of the well 23 corresponds to the top surface of the chip 11 (the surface on the side where the through hole 14 is formed). That is, when the chip 11 filled with fine particles is used in a single cell analysis device, the vertical direction is the direction shown in FIG. 6 (b).
  • the through holes 14 are provided in each of the micro reaction tanks 12, and the flow path including the through holes 14 and the micro reaction tank 12 penetrates from the upper surface to the lower surface of the chip 11.
  • the lower plate 22 is provided with a flow path 24 that leads from the microreaction tank 12 to the outside, and a suction pump (not shown) is connected to the flow path 24.
  • a suction pump (not shown) is connected to the flow path 24.
  • the lower plate 22 for forming the flow path 24 can be formed by laminating a plurality of layers of plates.
  • the upper plate 21 and the lower plate 22 can be machined by cutting.
  • Step 1 A cell solution in which about 70 to 100 cells were suspended in 1.0 ⁇ L and 1.0 ⁇ L of PBS buffer were added dropwise onto the chip using a manual pipette. Immediately thereafter, a negative pressure of 90 kPa or higher was applied to capture the cells on a Vertical Flow Array Chip (VFAC). Cell capture is complete in 1-2 minutes. After confirming that the cell suspension was completely aspirated, a cell lysis buffer containing 1% SDS and 10% RNase OUT (0.5 M NaCl and 10 mM EDTA, 100 mM containing 1% SDS) under negative pressure.
  • VFAC Vertical Flow Array Chip
  • Tris: HCl pH 8.0 0.5 ⁇ L is added dropwise onto the chip and the cells are disrupted while aspirating the lysis solution for 1 minute. Then, 2.0 ⁇ L of high salt concentration buffer (0.5 M NaCl and 10 mM EDTA 100 mM Tris: HCl pH 8.0) was added dropwise and then aspirated for 2 minutes, and then 2.0 ⁇ L of the same buffer was added dropwise and then aspirated for 2 minutes. The lysis buffer in the reaction vessel was washed. Then, in order to avoid deformation of the VFAC chip due to a sudden pressure change, the pressure was returned to atmospheric pressure over 2 minutes.
  • high salt concentration buffer 0.5 M NaCl and 10 mM EDTA 100 mM Tris: HCl pH 8.0
  • Step2 Dispense 4.5 ⁇ L of reverse transcriptase solution per chip, connect the flow cell and 5 mL syringe with a silicon tube, and aspirate for 8 seconds using a 1.7 cm spacer to guide the reagent into the microreaction vessel. After that, a reverse transcription reaction was carried out at 50 ° C. for 50 minutes.
  • the amount of reverse transcriptase is about the same as the amount used for single cell analysis in a tube, and the amount of reagent used can be reduced by the number of cells that can be collected in one chip.
  • the processing effort is reduced in inverse proportion to the number of cells that can be processed in one chip as compared with the plate-based method of one tube and one cell. Is possible.
  • Step3 The mRNA hybridized to the cDNA was degraded so as not to inhibit the synthesis of the 2nd strand in the next step.
  • Step4 The primer corresponding to the gene to be measured (this is called a gene-specific primer) is hybridized with the 1st strand cDNA to synthesize the 2nd strand cDNA.
  • Step 5 PCR amplification was performed using a common primer, and in order to remove PCR products (non-specific amplification products) other than the target product at the time of amplification, selection and purification of nucleic acid by base length was carried out using AMpur fine particles manufactured by Agencourt.
  • the obtained sample was fragment-analyzed by 2100 Bioanalyzer manufactured by Agilent and Agilent High Sensitivity DNA Kit electrophoresis, and the target product was quantified.
  • Step 6 After purification with Purple fine particles, the target product was quantified by quantitative PCR, and the concentration was adjusted by dilution or evaporation concentration so that the target product concentration was 2 nM. After denaturation, it was introduced into Illumina (registered trademark) Miseq (registered trademark) and sequenced.
  • the data is divided for each cell identification tag, and the molecules before PCR amplification are counted using the molecule recognition tag, so that the single cell gene for each cell captured in the microreaction tank is used.
  • Expression analysis data can be obtained.
  • the DNA probe is fixed to the microreaction tank 12 formed on the chip 11 for single cell analysis by adopting the same fine particle filling method as in the first embodiment. It was shown that the fine particles can be filled. Since each of the plurality of microreaction tanks 12 can be filled with fine particles at high density with good reproducibility, as a result, the results of single cell analysis for a large number of cells can be obtained with good reproducibility. A highly sensitive single cell analysis device can be obtained.
  • FIG. 10 is a schematic cross-sectional view for explaining the fine particle filling method according to the third embodiment.
  • the step (ii) described in the first embodiment is subdivided into steps (ii-1) to (ii-3).
  • a magnet 300 to which an iron cone 301 for concentrating magnetic field lines is attached is used.
  • magnetic fine particles are used as the fine particles.
  • the nozzle 5 is located above the fine particle suspension 6 attracted by the nozzle 5.
  • the position of the magnet 300 is controlled.
  • the fine particles gather in the vicinity of the magnet 300 to form the high-concentration suspension 7.
  • the position of the magnet 300 is controlled by a drive system (not shown).
  • the nozzle 5 is moved relatively upward (in the direction of arrow 302) with respect to the magnet 300 at a predetermined speed (1 ⁇ m / s or less), and the high-concentration suspension 7 in the nozzle 5 is moved. Lower the position of.
  • step (ii-3) when the high-concentration suspension 7 reaches the tip of the nozzle 5, the movement of the magnet 300 is stopped. As a result, a predetermined amount of the high-concentration suspension 7 can be formed at the tip of the nozzle 5.
  • the nozzle 5 can be lowered into the microreaction tank and filled with fine particles in the same manner as in the first and second embodiments.
  • the magnet 300 is placed near the upper end interface of the fine particle suspension 6 and moved to the position of (ii-3) at an appropriate speed, whereby the fine particle suspension 6 is contained. It is possible to concentrate all the fine particles of the above as a high-concentration suspension 7.
  • FIG. 11 is a graph showing the relationship between the pulling speed of the nozzle 5 and the number of fine particles in the high-concentration suspension 7. As shown in FIG. 11, when the nozzle 5 is pulled up at a speed (relative speed) faster than 1 ⁇ m / s with respect to the magnet 300, it can be seen that the fine particle concentration is not sufficiently increased and all the fine particles cannot be collected. ..
  • the high concentration is obtained by controlling the approach speed of the magnet 300 to the nozzle 5. It is possible to control the amount of fine particles in suspension 7.
  • a mechanism for collecting fine particles by applying an electric force to the nozzle 5 can be used instead of the magnet 300.
  • the method of forming a high-concentration suspension using magnetic force is adopted.
  • the time for forming a high-concentration suspension of fine particles at the tip of the nozzle can be shortened as compared with the case where the fine particles in the nozzle are settled and concentrated by gravity.
  • Fine particle filling device 100, 200 Fine particle filling device 1 Flat substrate 2 Micro reaction tank 3a Bottom surface of micro reaction tank 3 b Side wall surface of micro reaction tank 4 Through hole 5 Nozzle 6 Fine particle suspension 7 High concentration suspension 8 Solution 9 Nozzle outer wall 11 Chip 12 Microreaction tank 14 Through hole 101 Stage 102 Drive system 103 Optical system 104 Sensor system 105 Dispensing system 106 Storage container 107 Camera system 108 Valve 109 Tube 110 Control system 201 Control system 201 Control board 202 Image acquisition board 203 AD conversion board 204 Control computer 300 Magnet 301 Iron cone

Abstract

本開示の微粒子充填方法は、少なくとも１つ以上の容器に微粒子を充填する方法であって、ノズルに前記微粒子の懸濁液を吸引することと、前記懸濁液中の前記微粒子を濃縮して、前記ノズルの先端部に、所定の微粒子濃度の高濃度懸濁液を形成することと、前記高濃度懸濁液と前記容器の内壁を接触させることと、前記接触後に前記ノズルを前記容器から離すことで前記高濃度懸濁液を前記容器に充填することと、を含む。

Description

微粒子充填方法及び微粒子充填装置
　本開示は、微粒子充填方法及び微粒子充填装置に関する。
　一般に、単一細胞解析とは、生命科学における解析方法の１つであり、単一細胞ごとの生体分子の解析や定量を行う技術である。単一細胞解析は、特に、ＤＮＡシーケンサを利用して、単一細胞ごとのＤＮＡ及びＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）の塩基配列を決定したり、分子数を計測したりする方法である。
　単一細胞解析の具体的な方法としては、チューブ（０．２ｍＬ～２ｍＬ程度の反応用プラスティック容器）やタイタープレート（樹脂製反応容器が９６個や３８４個など規定の数だけプレート状に集積したもの）を用いる方法（非特許文献１）、マイクロ流路を用いる方法（非特許文献２）、エマルジョンを用いる方法（非特許文献３）、マイクロウェルを用いる方法（非特許文献４）、貫通したマイクロウェルを用いる方法（非特許文献５）などが知られている。
　いずれの方法においても、解析対象となる多数の細胞が単一細胞ごとに分離され、それぞれの細胞から抽出された核酸に細胞固有のＤＮＡ塩基配列（以下「バーコード」という）が導入される。その後、これら複数の細胞から得られた核酸サンプルをひとまとめにして、ＤＮＡシーケンシングを実施し、得られる配列データから、バーコード配列情報ごとにＤＮＡ配列情報を分離することで、単一細胞解析データを得ることができる。
　特に、非特許文献３～５に記載の方法は、細胞単離後、核酸増幅前にバーコードを導入することによって、少ない試薬で多数の細胞からのＤＮＡシーケンサ用のサンプルを調製し、配列データを得ることができる。
　非特許文献５に記載の単一細胞解析法は、非特許文献３及び４に記載の方法に比べて、１つの細胞の解析のために用いる微粒子の数が多く（非特許文献３及び４では微粒子は１つ）、１つの細胞の解析に用いる核酸捕捉用ＤＮＡプローブ数を１００倍程度以上に増やすことができる。また、細胞破砕溶液が、多数の微粒子から構成された多孔質構造を通過するため、短時間で高効率に単一細胞からの核酸を微粒子表面上に捕捉することができる。
　このように、１つの細胞の解析に多数の微粒子を用いるためには、微小反応槽に多数の微粒子を充填することが求められる。
　非特許文献５において、微小反応槽の底面に貫通孔があることを利用して、微粒子懸濁液を微小反応槽に分注し、貫通孔を通して余分な水分を排出することで、微粒子を微小反応槽に充填している。また、微小反応槽の直径が５０～１００μｍと小さいため、インクジェット装置を用いている。
　この方法の他に、ガラスピペットを用いて微小反応槽に微粒子を分注することも可能である。
特許第６３０７１７９号公報 特許第５４１５５６０号公報 特許第５９９７２７８号公報
F. Tang, C. Barbacioru, Y. Wang, E. Nordman, C. Lee, N. Xu, X. Wang, J. Bodeau, B. B. Tuch, A. Siddiqui, K. Lao , M. A. Surani, "mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell," Nature Methods, 6, 377-382, 2009. A. K. Shalek, R. Satija, X. Adiconis, R. S. Gertner, J. T. Gaublomme, R. Raychowdhury, S. Schwartz, N. Yosef, C. Malboeuf, D. Lu, J. J. Trombetta, D. Gennert, A. Gnirke, A. Goren, N. Hacohen, J. Z. Levin, H. Park , A. Regev, "Single-cell transcriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immune cells," Nature, 498, 7453, p.236-240, 2013. A. Klein, L. Mazutis, I. Akartuna, N. Tallapragada, A. Veres, V. Li, L. Peshkin, D. Weitz , M. Kirschner, "Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells," Cell, 161, 5, p. 1187-1201, 2015. H. Fan, G. Fu , S. Fodor, "Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry," Science, 347, 6222, p.1258367, 2015. Masataka Shirai, Koji Arikawa, Kiyomi Taniguchi, Maiko Tanabe, Tomoyuki Sakai, "Vertical Flow Array Chip reliably identify cell types from single-cell mRNA sequencing experiments" Scientific Reports, 6, 36014 DOI: 10.1038/srep36014 (2016)
　しかしながら、インクジェット装置やガラスピペットを用いて微小反応槽（容器）に微粒子を充填するという、上述の方法には、以下のような課題がある。
　第１に、微粒子を微小反応槽中に充填するためには、微粒子が懸濁した溶液を微小反応槽に分注後、余分な溶液を微小反応槽から排出する必要がある。このとき、微粒子を残して、溶液だけを微小反応槽から排出するためには、微粒子よりも目の細かい網目を有する膜を用いて微粒子が流れ出ないようにしなければならない。しかし、微粒子の直径が数μｍ以下と小さい場合には、網目の開口部のサイズは微粒子直径よりも小さくなくてはならない。開口部が小さくかつ強度のある網目の膜を作製することは非常に困難であり、利用可能なそのようなサイズの網目を持つ膜を用いる場合には、強度を維持するために膜の厚みがｍｍオーダーとなってしまう。これにより、大きな圧力損失のために、素早く溶液を吸引することができない。さらに、高い圧力をかけて迅速に溶液を除去するためには、さらに強度の高い網目を持つ膜を用いる必要があるので、膜の強度の維持と溶液の吸引速度の向上を両立することはできない。
　第２に、充填後の微粒子数を制御するためには、微粒子懸濁液の微粒子密度を安定させ、溶液量で粒子数を制御する必要がある。しかし、微粒子の比重が溶媒より大きいとき、微粒子が沈降することで微粒子密度が変化するだけでなく、微粒子のミクロな凝集の程度によって沈降速度が変化してしまうので、安定した微粒子密度を維持することが困難である。
　さらに、インクジェット装置を用いて微粒子懸濁液を微小反応槽に分注する場合には、液滴を安定的に吐出するために、吐出ノズル内での微粒子密度が安定して一定でなければ、溶液の物理的特性が一定でなくなるので、吐出量及び吐出方向が安定しないだけでなく、高頻度で吐出自体が停止してしまう。吐出停止が起きた場合は、微粒子懸濁液を再度調製して、インクジェットヘッドに充填し直さなければならない。そのため、微粒子を多数の微小反応槽に充填するための時間が、交換作業の分だけ長くなってしまう。
　事前に微粒子を最密充填密度に近い濃度にまで濃縮してから、その微粒子を分取して微小反応槽に充填することができれば、上記問題は解決するが、高濃度に濃縮した微粒子沈殿物から微粒子を一定量採取すること自体が、技術的に困難である。
　そこで本開示は、短時間かつ安定的に容器に微粒子を充填する技術を提供する。
　上記課題を解決するために、本開示の微粒子充填方法は、少なくとも１つ以上の容器に微粒子を充填する方法であって、ノズルに前記微粒子の懸濁液を吸引することと、前記懸濁液中の前記微粒子を濃縮して、前記ノズルの先端部に、所定の微粒子濃度の高濃度懸濁液を形成することと、前記高濃度懸濁液と前記容器の内壁を接触させることと、前記接触後に前記ノズルを前記容器から離すことで前記高濃度懸濁液を前記容器に充填することと、を含むことを特徴とする。
　本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される請求の範囲の様態により達成され実現される。
　本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではない。
　本開示の技術によれば、短時間かつ安定的に容器に微粒子を充填することができる。
　上記以外の課題、構成及び効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。
第１の実施形態に係る微粒子充填方法を説明するための概略断面図である。 微小反応槽への微粒子の充填原理を説明するための概略断面図である。 第１の実施形態に係る微粒子充填装置を示す模式図である。 微粒子充填装置の動作を示すフローチャートである。 ノズル先端の外径に対する微粒子充填の成功率を計測した結果を示すグラフである。 単一細胞解析用のチップを示す模式図である。 第２の実施形態に係る微粒子充填装置を示す模式図である。 センサシステムの構成を示す斜視図である。 単一細胞解析デバイスに用いられるフローセルデバイスの模式図である。 第３の実施形態に係る微粒子充填方法を説明するための概略断面図である。 ノズルの引き上げ速度と高濃度懸濁液中の微粒子数の関係を示すグラフである。
　まず、本開示の各実施形態において用いられる用語の定義を説明する。
　「微小反応槽」：平面基板上に形成された凹形状の容器。典型的には直径は数μｍ～数百μｍであり、特に、直径数十μｍのもの。非特許文献５に記載の、細胞を捕捉するための貫通孔が底面に形成されたものも含む。
　「ノズル」：溶液及び微粒子が移動できる中空構造を有し、先端部を微小反応槽に挿入可能なもの。
　「バッファ」：微粒子が懸濁される溶液。微粒子の懸濁状態を維持するために、ｐＨ又は塩濃度が制御されていてもよい。また、ノズル外壁及び微小反応槽内壁との濡れ性（接触角）を制御するために、必要に応じて界面活性剤が混和していてもよい。
　「微粒子」：比重が溶液よりも大きく、直径が数百ｎｍから数百μｍの粒子、又は、磁性、電荷若しくは誘電性を有し、直径が数ｎｍから数百μｍの粒子。
　「接触」：ノズル先端部に吸引された微粒子懸濁液の溶液成分（バッファ）が微小反応槽の内壁（底面及び側壁面）に触れること。特に、溶液と内壁との間に接触角が定義できる状態のこと。
　「濃縮」：微粒子懸濁液の微粒子濃度（単位体積当たりの微粒子の数（数密度））を上昇させ、微粒子の最密充填密度の５０％以上の密度となる微粒子濃度まで到達させること。
　「充填」：必要な数（必要な微粒子濃度）の微粒子が微小反応槽の内部に供給されること。
　「沈降」:保存容器に保存されている微粒子懸濁液の微粒子濃度から逸脱して、一部の領域、特にノズル先端部で微粒子濃度が上昇すること。
　「判定」：ノズル先端部に微粒子濃度が上昇した領域（高濃度懸濁液）が形成され、その微粒子濃度とその領域の体積が、微小反応槽の容積の５０％以上が占有される数の微粒子を含む程度となったかどうかを判定すること。
　「高濃度」:充填に必要な微粒子の微粒子濃度に達した状態。微粒子の最密充填密度の５０％以上の密度となるような微粒子濃度を指す。
［第１の実施形態］
＜微粒子充填方法＞
　図１は、第１の実施形態に係る微粒子充填方法を説明するための概略断面図である。図１に示すように、本方法は、以下の工程（ｉ）～（ｖ）を含む。
（ｉ）初期状態
　凹部である微小反応槽２（容器）が形成された平面基板１を準備し、微粒子を溶液に懸濁した懸濁液６を分注用のノズル５に吸引して、ノズル５を微小反応槽２の直上に位置させる。
　平面基板１は、例えば単一細胞解析用のチップ（タイタープレート）であり、平面基板１に微小反応槽２が複数形成されていてもよい。微小反応槽２には、微小反応槽２の底面３ａから平面基板１の底面まで延設される貫通孔４が形成されている。ノズル５は、先端に向かって先細る形状を有しているが、ノズル５の先端が微小反応槽２の底面３ａに接触するまで微小反応槽２に挿入可能であれば、外径が一定の形状であってもよい。ノズル５の先端の外径は、例えば微小反応槽２の底面３ａの径の８０％～９０％とすることができるが、これに限定されない。
（ｉｉ）濃縮（沈降）
　初期状態のまま所定時間放置して、懸濁液６中の微粒子を重力によりノズル５の先端部に沈降させて濃縮し、所定の体積、所定の濃度の高濃度懸濁液７を得る。あるいは、微粒子が磁性微粒子である場合は、外部から磁力を印加することにより、ノズル５の先端部に微粒子を移動させて濃縮し、高濃度懸濁液７を得る。所定の体積は、例えば、高濃度懸濁液７を微小反応槽２に充填した際に、微小反応槽２の容積の５０％以上が占有される数の微粒子を含むような値に設定される。所定の濃度（高濃度）は、上述のように、微粒子の最密充填密度の５０％以上の密度となるような微粒子濃度である。
　上記工程（ｉ）の状態を構築した時点から、例えばノズル５を外部のカメラで撮像し、ノズル５内の微粒子の時間的・空間的変化を観察することにより、ノズル５内の高濃度懸濁液７の体積を推定する。このとき、ノズル５内の高濃度懸濁液７の液面の高さが所定値となった場合に、所定の体積の高濃度懸濁液７が得られたと判定することができる。
　あるいは、ノズル５の先端部に光を照射し、散乱光、吸光若しくは透過光などの光量又は分布を計測することにより、所定の体積の高濃度懸濁液７が得られたかどうかを判定することもできる。この場合、照射する光のノズル５付近でのスポットサイズと位置を適切に制御する必要がある。また、ノズル５の所定の高さの位置に光を照射して、その位置の散乱光、吸光若しくは透過光などに基づいて、所定の体積の高濃度懸濁液７が得られたと判定するようにしてもよい。
（ｉｉｉ）接触
　工程（ｉｉ）において所定の体積の高濃度懸濁液７が得られたら、ノズル５を下降させ、ノズル５の先端の溶液８の表面張力によって、微小反応槽２の内壁３（底面３ａ又は側壁面３ｂ）に溶液８を接触させる。これにより、溶液８が微小反応槽２内で濡れて拡がり、微小反応槽２の側壁面３ｂの少なくとも一部まで溶液８が浸み出して、微小反応槽２の底面３ａ及び側壁面３ｂに溶液８が接触した状態となる。
（ｉｖ）引き上げ
　工程（ｉｉｉ）において溶液８が微小反応槽２の底面３ａ及び側壁面３ｂに接触したら、所定の速度でノズル５を引き上げて、高濃度懸濁液７を微小反応槽２に充填する。この充填の原理については後述する。
（ｖ）終状態
　微小反応槽２に高濃度懸濁液７が充填された状態を終状態とする。
＜原理＞
　図２は、本実施形態に係る微粒子充填方法の原理を説明するための概略断面図であり、ノズル５の先端部と微小反応槽２の内部空間が拡大して示されている。図２（ａ）は、ノズル５内の溶液８が微小反応槽２の底面３ａに接触した直後の状態を示している。図２（ａ）に示すように、工程（ｉｉｉ）においてノズル５を下降させていき、ノズル５の下端の一部が微小反応槽２の底面３ａ（内壁）に接触すると、高濃度懸濁液７中の溶液８が微小反応槽２の底面３ａに濡れて広がる（接触する）。
　図２（ｂ）は、溶液８が微小反応槽２の側壁面３ｂにも接触した状態を示している。図２（ｂ）に示すように、溶液８は、側壁面３ｂの少なくとも一部に接触するまで浸み出していく。
　ここで、微小反応槽２の底面３ａの半径をＲｗとし、ノズル５の先端の外壁９の半径をＲｃとし、微小反応槽２の内壁に対する溶液８の接触角をθｗとし、ノズル５の外壁９に対する溶液８の接触角をθｃとする。
　下記式（１）で表される吸引圧力（ΔＰ）が正のとき、微粒子の高濃度懸濁液７をノズル５から引き出すことができる。したがって、工程（ｉｖ）において、ΔＰ＞０の状態を維持したままで、所定の速度でノズル５を引き上げることにより、微粒子の高濃度懸濁液７を微小反応槽２に充填することができる。ノズル５の引き上げ速度は、ΔＰ＞０を維持できる範囲であれば、一定とすることもできるし、加速若しくは減速しながら引き上げてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　微小反応槽２に充填された高濃度懸濁液７から追加で溶液を排出する必要はない。上述のように、高濃度懸濁液７の微粒子濃度は最密充填密度の５０％以上であるので、高濃度懸濁液７の体積を微小反応槽２の容積と同じにすることにより、微小反応槽２の容積の少なくとも５０％以上の微粒子が充填される。高濃度懸濁液７の微粒子濃度及び体積を適切な条件に設定すれば、乾燥状態で微小反応槽２の容積の８０％以上を微粒子で占めることができる。
　ノズル５中に形成する高濃度懸濁液７の体積は、微小反応槽２の容積より大きくすることもできる。微小反応槽２が誤差なく形成され、開口の角度が９０°に形成され、かつ内壁に付着物もないと仮定して（図２の形状）、工程（ｖ）におけるノズル５の引き上げの際、浸み出した溶液８が微小反応槽２の上端に到達すると、接触角θｗは９０°未満となる。この接触角θｗを式（１）に代入するとΔＰ＜０となるので、理論上はノズル５からの高濃度懸濁液７の排出は停止する。したがって、高濃度懸濁液７の体積が微小反応槽２の容積より大きくても、微小反応槽２の上端で排出が止まるので、高濃度懸濁液７が微小反応槽２から溢れることはないと考えられる。
　図１に示した微小反応槽２は、単一細胞解析チップに必要な細胞捕捉用の貫通孔４を有しているが、上記微粒子充填の原理に貫通孔４は必須のものではない。実際、上記原理に従って、貫通孔４のない容器への微粒子の充填を実施することができる。すなわち、本実施形態の技術により微粒子が充填される容器としては、単一細胞解析用チップの微小反応槽２に限定されず、ノズル５を挿入可能な容器であればよい。微粒子が充填される容器の断面形状も、図１及び２に示したような長方形に限定されず、底部が開口部より狭くなる台形など、他の形状を採用することができる。
　以上、単一の微小反応槽２への微粒子の充填方法を説明したが、複数の微小反応槽２へ微粒子を充填する場合には、上記の操作を繰り返せばよい。具体的には、第１の微小反応槽への充填を上記工程（ｉ）～（ｖ）に従って完了したのちに、第２の微小反応槽の直上にノズル５を移動させ、第２の微小反応槽に対して初期状態となるようにして、微粒子充填のための工程を繰り返せばよい。
　複数種類の微粒子を、それぞれ異なる微小反応槽２に充填する場合も同様の操作となる。例えば、非特許文献５及び特許文献１～３に記載の単一細胞解析用チップを作製するために、異なる配列のＤＮＡプローブが固定された複数種類の微粒子を、予め設定した微小反応槽に個別に充填する例を説明する。
　まず、各種の微粒子がそれぞれ懸濁された懸濁液の保存容器（保存チューブ）を用意し、所望の懸濁液を収容する保存容器内に空のノズル５を浸漬することによって、毛管現象を利用して微粒子懸濁液を吸引する。あるいは、空のノズル５の微粒子懸濁液が分注される先端とは反対側の先端にシリンジポンプ等を設置して、吸引操作により微粒子懸濁液を吸引する。
　次に、工程（ｉ）の初期状態となるように、所定の微小反応槽２の直上にノズル５を移動させ、工程（ｉｉ）～（ｖ）を実施する。
　次に、ノズル５を廃液容器（廃液チューブ）まで移動させ、例えばシリンジポンプの操作により、ノズル５内に余った微粒子懸濁液を廃液容器に廃棄する。
　次に、ノズル５の洗浄のために、複数の保存容器にそれぞれ収容された、複数種類の洗浄液にノズル５を浸漬して、洗浄液の吸引及び廃棄を繰り返し、ノズル５に付着した微粒子を完全に洗浄除去する。洗浄液は、例えば、フィルタろ過したイオン交換水などの純水及びエタノールなどのアルコールを用いることができる。
　次の種類の微粒子を次の位置の微小反応槽に充填するために、以上の操作を繰り返す。
＜微粒子充填装置＞
　図３は、第１の実施形態に係る微粒子充填装置１００を示す模式図である。微粒子充填装置１００は、上述の微粒子充填方法を自動で実施する装置である。図３に示すように、微粒子充填装置１００は、ノズル５、ステージ１０１、駆動システム１０２、光学システム１０３、センサシステム１０４、分注システム１０５、複数の保存容器１０６、カメラシステム１０７、バルブ１０８、管１０９並びに制御システム１１０を備える。
　ステージ１０１は、微小反応槽を有する平面基板１を固定して位置決めする。
　駆動システム１０２は、平面基板１に対してノズル５を相対的に三軸方向に、設定した距離だけ移動させる。駆動システム１０２は、例えば、ノズル５を上下方向に移動させ、ステージ１０１を水平方向に移動させる。駆動システム１０２は、ステージ１０１のみを三軸方向に移動させてもよい。
　光学システム１０３は、微小反応槽の直上に移動されたノズル５内の微粒子懸濁液の濃縮状況を観察する。光学システム１０３は、ノズル５の先端部を撮像するカメラであってもよいし、ノズル５の先端部に光を照射して散乱光、吸光若しくは透過光を分析する光学系であってもよい。
　センサシステム１０４は、ノズル５と微小反応槽との接触を検知する。センサシステム１０４は、例えば圧力センサを有しており、ノズル５と微小反応槽との接触による上向きの力を圧力センサで検知することにより、ノズル５と微小反応槽との接触を判断する。あるいは、センサシステム１０４は、カメラなどの光学的手段により接触を検知するように構成されていてもよい。
　分注システム１０５は、例えばシリンジポンプを有し、ノズル５に対する液体の吸引及び吐出を制御する。分注システム１０５は、特に、ノズル５への微粒子懸濁液の吸引を制御する。ノズル５は、管１０９（例えばＰＥＥＫ製チューブ）により分注システム１０５に接続される。
　複数の保存容器１０６には、微粒子懸濁液が収容される保存容器、洗浄液が収容される保存容器、廃液が回収される廃液容器が含まれる。
　カメラシステム１０７は、平面基板１及びノズル５の位置を観察し、平面基板１の微小反応槽の直上にノズル５の先端を位置合わせするために用いられる。
　バルブ１０８は、分注システム１０５の部品の１つとして設けることができ、大気圧解放のために用いられる。
　制御システム１１０は、駆動システム１０２、光学システム１０３、センサシステム１０４、分注システム１０５及びカメラシステム１０７の動作を制御する。また、制御システム１１０は、光学システム１０３、センサシステム１０４及びカメラシステム１０７の検出信号を受信して、必要な演算処理を実行する。
＜微粒子充填装置の動作＞
　図４は、微粒子充填装置１００の動作を示すフローチャートである。
　ステップＳ１において、制御システム１１０は、微粒子充填装置１００の全体の初期状態を構築する。具体的には、まず、ユーザは、平面基板１をステージ１０１に載置し、微粒子懸濁液の保存容器１０６と、洗浄液の保存容器１０６とを所定の位置に配置する。その後、ユーザが、例えば制御システム１１０の入力デバイスから動作開始の指示を入力すると、制御システム１１０は、平面基板１、ノズル５、保存容器１０６が全て所定の初期位置に位置しているかを確認する。これらのいずれかが初期位置に位置していない場合は、駆動システム１０２により初期位置に移動させる。
　ステップＳ２において、制御システム１１０は、微小反応槽２ごとの初期状態を構築する。具体的には、制御システム１１０は、駆動システム１０２及び分注システム１０５を駆動して、ノズル５に洗浄液を吸引し、不図示の廃液容器に吐出させて、ノズル５を洗浄する。その後、制御システム１１０は、ノズル５に微粒子懸濁液を吸引させ、所定の微小反応槽２の直上に移動させる。
　ステップＳ３において、制御システム１１０は、ノズル５内の微粒子懸濁液中の微粒子が沈降して、所定の微粒子濃度の高濃度懸濁液が所定の体積だけ形成されたかを判定する。ここで、高濃度懸濁液は、光学的に密な状態となるので、光学システム１０３により、低濃度の領域に比べて黒い領域として観察することができる。制御システム１１０は、光学システム１０３から受信した画像のコントラストなどから、黒い領域の大きさを算出し、それに基づき高濃度懸濁液の濃度及び体積を算出する。ステップＳ２の状態を構築してから、例えば９０～１２０秒保持することにより、高濃度懸濁液の濃度及び体積が所定の値になったと判定できる。
　ステップＳ４において、制御システム１１０は、駆動システム１０２を駆動してノズル５を降下させ、ノズル５の先端を微小反応槽の底面に接触させる。接触によってノズル５の先端部の微粒子懸濁液の溶液が微小反応槽の底面や側壁面に濡れる。本開示では、微粒子懸濁液が微小反応槽の内壁に濡れたことをノズル５が接触したと定義している。これは、溶液が微小反応槽の内壁とノズル５の外壁の両方の壁面を濡らして、適切な接触角を構成し、ノズル５中の高濃度懸濁液が微小反応槽に引き出されることが必要かつ本質的であるからである。しかし、実用上は、ノズル５の降下を必ずどこかで止めなければならないので、センサシステム１０４を設けて接触を検知している。
　ノズル５と微小反応槽との接触後、例えば２秒以内に、微粒子懸濁液の界面はノズル５と微小反応槽の側壁面との間に入り込み、上昇する。制御システム１１０は、この上昇のために、接触状態を２秒間維持する。ここで接触状態を２秒間とした理由は、例えば微小反応槽の径を７５μｍとし、ノズル５の先端の外径を７０μｍ（内径５２．５μｍ）とした場合、ノズル５と微小反応槽の接触から２秒経過すれば、溶液が微小反応槽の底面及び側壁面に確実に濡れた状態となるためである。接触状態を維持する時間は、ノズル５の外径及び微小反応槽２の径に応じて適宜変更され得ることは言うまでもない。
　ステップＳ５において、制御システム１１０は、駆動システム１０２を駆動して、例えば１～１０μｍ／ｓ程度の速度で、ノズル５を引き上げる。これにより、ノズル５内の微粒子を微小反応槽に移動させて、微粒子を微小反応槽内に充填する。
　ステップＳ６において、制御システム１１０は、すべての微小反応槽２に微粒子が充填されたかを判断する。
　ステップＳ６でＮＯの場合、制御システム１１０は、次の微小反応槽２への微粒子の充填のために、駆動システム１０２及び分注システム１０５を駆動して、ノズル５内に余った微粒子懸濁液を廃液容器に破棄する。
　次に、ステップＳ２に戻り、制御システム１１０は、駆動システム１０２及び分注システム１０５を駆動して２種類の洗浄液を吸引及び吐出させ、ノズル５を洗浄する。次に、制御システム１１０は、駆動システム１０２及び分注システム１０５を駆動して、前回充填された微粒子と異なる微粒子（例えば、前回と異なる細胞認識タグ配列が固定された微粒子）の懸濁液をノズル５に吸引し、前回と異なる微小反応槽２の直上まで移動させる。これにより、次の微小反応槽２についての初期状態を構築する。その後、上記と同様にステップＳ３～Ｓ６を実行する。
　２つ目以降の微小反応槽２について同様にステップＳ２～Ｓ６を繰り返し、ステップＳ６においてＹＥＳとなった場合、制御システム１１０は、微粒子充填装置１００の動作を終了する。
　微粒子が微小反応槽２に充填されるためには、ステップＳ４（工程（ｉｉ））で微粒子が濃縮されることと、次のステップＳ５（工程（ｉｉｉ））で微粒子懸濁液が濡れて、微小反応槽２の側壁面まで達し、微小反応槽２の内壁と溶液との接触角、ノズル５の外壁と溶液との接触角が式（１）の条件を満たす必要がある。この条件を満たすためには、微小反応槽２の内壁の親水性及びノズル５の外壁の親水性を決めるそれぞれの材料、及び、微小反応槽２の内径とノズル５の先端部の外径の間に一定の条件が成立してなければならない。
　ここで、平面基板（チップ材料）の材質をジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）をとし、ノズルの材質をガラスとして、水の接触角を測定したところ、ジメチルポリシロキサンに対する水の接触角は平均９７．９°（最大１０６°）であり、ガラスに対する水の接触角は平均４２．２°（最大５９．０°）であった（いずれもｎ＝１０）。
　接触角が最大値の場合、式（１）から、懸濁液が上昇するのに必要なノズルの先端の最小外径は４０μｍと導出された。
　図５は、ノズル先端の外径に対する微粒子充填の成功率を計測した結果を示すグラフである。本計測において、ジメチルポリシロキサンの平面基板をインプリンティング技術を用いて加工して、複数の微小反応槽を形成した。微小反応槽の形状及び寸法は、直径７５μｍ×高さ７０μｍの円筒形とした。図５に示すように、先端の外径が異なる複数のノズルを用いて、本実施形態の方法で微小反応槽に微粒子を充填したところ、ノズル先端の外径が６０μｍ以上の場合に、微粒子充填の成功率が８０％以上となることが分かった。
　式（１）を用いて計算により算出したノズル先端の最小外径の理論値（４０μｍ）と、図５の計測の結果（６０μｍ以上）との相違は、以下の理由によると考えられる。まず、接触角にはばらつきがあり、ノズルの引き上げの条件は、接触角の平均値をΔＰの式（１）に代入して定められる。ノズルの半径は、このΔＰの条件に対応する値として決定される。ノズルの半径は、ある一定以上の領域（ノズル外周の長さのうちかなりの領域）がΔＰの条件を満たしていないと、引き上げが成功しない。しかし、ノズルは、製造誤差などにより半径がΔＰの条件を満たしていない部分も有するが、この部分も含めてΔＰ＞０が満たされるように引き上げがされる。これにより、図５の計測の結果が、接触角の最大値を用いて算出した理論値よりも大きくなったと考えられる。
　上述の微粒子充填装置１００の動作においては、ノズル５の先端の外径が７０μｍ（内径５２．５μｍ）のものを使用した場合を想定している。ノズル５と微小反応槽との接触時間を２秒とし、ノズル５の引き上げ速度を１～１０μｍ／ｓとして説明したが、これらの値は、ノズル５の外径や微小反応槽２の径に応じて適宜変更され得ることは言うまでもない。
＜技術的効果＞
　以上のように、第１の実施形態に係る微粒子充填方法は、ノズルに微粒子の懸濁液を吸引することと、懸濁液中の微粒子を濃縮して、ノズルの先端部に、所定の微粒子濃度の高濃度懸濁液を形成することと、高濃度懸濁液と微小反応槽の内壁を接触させることと、接触後にノズルを容器から離すことで高濃度懸濁液を微小反応槽に充填することと、を含んでいる。このような方法により、従来の微粒子懸濁液を分注して余分な溶液を排除する方式に比べて、微粒子の分注時間を短縮させることができる。また、微小反応槽（容器）への充填前に微粒子を所定の濃度まで濃縮するので、再現性よく、一定量の微粒子を充填することができる。
　微粒子懸濁液の微小反応槽への充填の原理は、固体表面に対する溶液の表面張力（接触角）を用いた分注であるため、粘度の高い高濃度の微粒子懸濁液を正確に微小反応槽の上端まで分注することが可能となっている。このような分注方法は、一般的な溶液（微粒子を含まない）の分注方法とは原理が異なっている。
［第２の実施形態］
　第１の実施形態において、平面基板に形成された微小反応槽に微粒子を充填する技術を説明した。第２の実施形態においては、上述の技術を、単一細胞解析デバイスのチップ（基板）に設けられた微小反応槽への微粒子の充填に適用することを提案する。
＜チップの構成例＞
　図６（ａ）は、単一細胞解析用のチップ１１（基板）を示す上面図であり、図６（ｂ）は、チップ１１の断面の一部を示す断面図である。チップ１１上には等間隔で１０×１０個の微小反応槽１２が形成されている。微小反応槽１２には、細胞捕捉用の貫通孔１４が設けられ、これにより単一細胞解析用の細胞単離が可能なチップ構造となっている。このような構造のチップ１１は、例えばジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）を材料として、インプリンティング技術を用いて成型することができる。貫通孔１４はレーザ加工により穿孔加工できるが、他の粒子ビーム加工や、型による成型加工も可能である。
　チップ１１の材料としては様々な材料を使用することができ、例えば、各種樹脂材料（ポリカーボネート系、ポリシクロオレフィン系、ポリオレフィン系、ポリプロピレン系、ポリエチレン系、アクリル系、アクリロニトリル系樹脂など）、金属材料、シリコンなどの半導体材料、石英やアルミナなどの酸化物材料、ガラスなどの非晶質材料が挙げられる。これらの材料は、加工のため、若しくは表面濡れ性の制御のために、複数の材料を組み合わせて用いることも可能である。
　図６（ａ）及び（ｂ）には、チップ１１の寸法の一例が示されている。図示の例においては、微小反応槽１２は、直径７５μｍ、高さ７０μｍの円筒形とした。隣接する微小反応槽１２の中心間隔は１０５μｍとした。貫通孔１４の孔径は一番小さいところで直径３μｍとし、長さは３０μｍとした。なお、上記のサイズは単一細胞解析デバイスに適したサイズの一例であり、微粒子充填対象となる微小反応槽１２のサイズとしては、直径及び高さともに数μｍ～数百μｍまでいずれでもよい。また、微小反応槽１２の形状も円筒形である必要はなく、微粒子の充填が可能な開口部があれば、四角柱などの多角柱や、円錐台、四角推台などのテーパ状の形状でもよい。
　単一細胞解析デバイスにおいて、チップ１１の微小反応槽１２に充填される微粒子は、単一細胞中のｍＲＮＡの量を遺伝子配列ごとに計測する遺伝子発現解析を行うための微粒子である。解析目的に応じて、微粒子に固定する分子を変更することで、様々な単一細胞解析に応用することが可能となる。
　本実施形態においては、ストレプトアビジン分子が表面に多数固定された磁性微粒子（直径１μｍ）を用いることとする。単一細胞解析に用いるためには、微粒子表面に計測対象であるｍＲＮＡを捕捉し、細胞識別用のバーコード配列を核酸サンプルに導入するために、ＤＮＡプローブを固定する。ＤＮＡプローブの５’末端には、ストレプトアビジンと強固に結合するためのビオチンが固定されている。
　ＤＮＡプローブの配列は、５’末端から順に、ＰＣＲ用の共通配列、分子認識用タグ配列、細胞識別用タグ配列（７ベース）、３’末端にｍＲＮＡ捕捉用のＴの連続配列を持つ。ＤＮＡプローブの配列を配列番号１～１００に示す。細胞識別用タグ配列は７ベースの既知の１００種類の配列であり、分子認識用タグ配列は７ベースのランダム配列である。
　細胞識別用タグ配列の長さや位置は、上記と異なっていても構わない。例えば、３種類の７ベースの既知配列が２か所の３ベースの既知配列を挟む形で配置されていてもよいし、既知配列ではなくランダム配列として配置することも可能である。分子認識用タグ配列も同様に、長さや配置を変更することが可能である。
　微粒子上にＤＮＡプローブを固定する方法は、以下の通りである。まず、細胞識別用タグ配列が異なるＤＮＡプローブ間での混ざりこみがないように注意しながら、１ｘＢ＆Ｗバッファ（５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１Ｍ　ＮａＣｌ）中で、微粒子とＤＮＡプローブを混和し、３０分程度室温で結合反応させる。その後、１ｘＢ＆Ｗバッファで２回洗浄後、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８．０バッファで再懸濁することで微粒子懸濁液を得る。微粒子懸濁液として、細胞識別用タグ配列の異なる１００種類を異なる１００本の保存チューブ中に準備した。
＜ＤＮＡプローブ固定微粒子のチップへの充填＞
　ＤＮＡプローブが固定された微粒子をチップ１１に充填する方法について説明する。
　図７は、第２の実施形態に係る微粒子充填装置２００を示す模式図である。微粒子充填装置２００の構成は、第１の実施形態の微粒子充填装置１００（図３）とほぼ同様であるので、相違点のみを説明する。微粒子充填装置２００は、各構成要素の制御装置として、制御ボード２０１、画像取得ボード２０２、ＡＤ変換ボード２０３、制御コンピュータ２０４を備える。図７中の二重線は、信号の送信又は受信（伝送）が可能に接続されていることを示している。
　制御ボード２０１は、駆動システム１０２、分注システム１０５及びバルブ１０８の駆動を制御する。本実施形態においては、駆動システム１０２は、チップ１１が載置されるステージ１０１と、保存容器１０６ａ及び１０６ｂが載置されるステージ１１１とを三軸方向に移動させる。
　画像取得ボード２０２は、光学システム１０３及びカメラシステム１０７の動作を制御し、光学システム１０３及びカメラシステム１０７が取得した信号若しくは画像を受信する。
　ＡＤ変換ボード２０３は、センサシステム１０４からのアナログ信号をデジタル信号に変換する。
　制御コンピュータ２０４には、微粒子充填装置２００の制御プログラムが格納され、制御プログラムに従って制御ボード２０１、画像取得ボード２０２、ＡＤ変換ボード２０３を制御する。
　ノズル５は、直径１ｍｍ～３ｍｍのガラス管を引き延ばすことで先端を先鋭化することで作製したものを用いた。ガラス管の加工にはプーラー及びマイクロフォージを用いた。ノズル５を、管１０９を用いて分注システム１０５に接続して、微粒子懸濁液を吸引し、ノズル５を洗浄できるようにした。分注システム１０５を用いる代わりに、ノズル５をシリンジに接続して、このシリンジの駆動を制御ボード２０１により制御するようにしてもよい。
　上述の１００種類の異なる細胞識別タグが固定された微粒子の懸濁液が収容された保存容器１０６ａは、容器ステージ１１１に設置される。容器ステージ１１１には、保存容器１０６ａを振動若しくは回転させる回転モータを設けてもよく、これにより、ノズル５での吸引直前に微粒子懸濁液が均一な溶液となるように、保存容器１０６ａを攪拌することができる。また、容器ステージ１１１には、例えば、洗浄液を収容する保存容器１０６ｂとして、フィルタろ過したイオン交換水（純水）を収容する容器が３本、１００％ＥｔＯＨを収容する容器が１本、設置される。保存容器１０６ａ及び１０６ｂは、例えばマイクロチューブである。
　微粒子充填装置２００の制御コンピュータ２０４は、制御プログラムに従い、以下の動作を実行する。なお、微粒子充填装置２００の動作は、基本的には第１の実施形態（図４）と同様である。
　制御コンピュータ２０４は、画像取得ボード２０２を介して、カメラシステム１０７の撮像画像を受信し、撮像画像に基づいて、充填すべき微小反応槽１２の位置を確認する。
　制御コンピュータ２０４は、制御ボード２０１により、大気圧解放用のバルブ１０８を閉じ、駆動システム１０２及び分注システム１０５を駆動して、ノズル５での純水の吸引及び吐出を数回繰り返し、次いで、１００％ＥｔＯＨの吸引及び吐出を数回繰り返す。これによりノズル５内を洗浄する。
　制御コンピュータ２０４は、制御ボード２０１により、バルブ１０８を開放し、駆動システム１０２を駆動してノズル５を微粒子懸濁液の保存容器１０６ａに浸漬させて、毛細管現象により微粒子懸濁液をノズル５内に吸引する。
　制御コンピュータ２０４は、制御ボード２０１により、駆動システム１０２を駆動して、微粒子を充填すべき微小反応槽１２をノズル５の直下に移動させ、ノズル５を所定の位置まで降下させる（あるいは、チップ１１を上昇させる）。
　制御コンピュータ２０４は、画像取得ボード２０２を介して、光学システム１０３によるノズル５の先端部の光学特性の検出信号若しくは画像を受信して、微粒子の沈降及び高濃度懸濁液の高さ（体積若しくは微粒子量）を確認する。
　制御コンピュータ２０４は、所定量の高濃度懸濁液が形成されたことを確認した後に、制御ボード２０１に指示を送信し、駆動システム１０２を駆動して、センサシステム１０４の数値に変化が見られるまでノズル５を降下させる（あるいは、チップ１１を上昇させる）。具体的には、高濃度懸濁液の高さが９５μｍになったときに、ノズル５の降下を開始する。
　制御コンピュータ２０４は、制御ボード２０１により、駆動システム１０２を駆動して、ノズル５の先端が微小反応槽１２の底部に接した後（センサシステム１０４が接触を検知した後）、ノズル５を２秒間静止させ、ノズル５を１μｍ／ｓの速度で上昇させる。
　図８は、センサシステム１０４の構成の一例を示す斜視図である。図８に示すように、センサシステム１０４は、２つのフェルール９２、ブロック９３、２枚の板バネ９４（弾性体）、固定治具９５及びひずみセンサ９６を有する。
　２つのフェルール９２は、ノズル５と管１０９を接続する。フェルール９２は、ブロック９３（例えばＰＭＭＡ製）に固定される。
　２枚の板バネ９４の長手方向の一端部は、ブロック９３にねじ止めされて固定される。板バネ９４の長手方向の他端部は、金属製の固定治具９５に固定される。このような構成により、ノズル５に応力が加わると、応力がブロック９３を経由して板バネ９４に伝わり、板バネ９４が撓む（変形する）。
　各板バネ９４には、板バネ９４の面に沿うようにひずみセンサ９６が固定されている。ノズル５の先端が微小反応槽１２の底面に接触して、ノズル５に上方向の力（応力）が印加されると、板バネ９４が撓み、この撓み量をひずみセンサ９６が検出する。撓み量が所定値以上となった場合に、ノズル５が微小反応槽１２に接触したと判断することができる。
＜単一細胞解析デバイス＞
　図９は、単一細胞解析デバイスに用いられるフローセルデバイス２０の模式図である。図９に示すように、フローセルデバイス２０は、樹脂製（例えばＰＭＭＡ）の上側プレート２１及び下側プレート２２を備え、上側プレート２１及び下側プレート２２の間に、チップ１１（図６参照）が挟み込まれて固定されている。フローセルデバイス２０に組み込まれるチップ１１は、上述の微粒子充填装置２００を用いて、ＤＮＡプローブが固定された微粒子を微小反応槽１２に充填した状態のものである。この状態のチップ１１は、「Ｖｅｒｔｉｃａｌ　Ｆｌｏｗ　Ａｒｒａｙ　Ｃｈｉｐ（ＶＦＡＣ）」と呼ばれることがある。
　図９の例においては、フローセルデバイス２０は、１２個のチップ１１を搭載することができるが、チップ１１の数は任意に選択できる。
　上側プレート２１には、チップ１１の数と同じ数だけウェル２３が設けられており、ウェル２３から、チップ１１へ細胞サンプルや洗浄液、酵素試薬などを供給することができる。ウェル２３の底面はチップ１１の上面（貫通孔１４が形成されている側の面）に対応する。すなわち、微粒子が充填されたチップ１１を単一細胞解析デバイスにて使用する場合には、上下方向の向きは図６（ｂ）の向きとなる。貫通孔１４は微小反応槽１２の１つ１つに設けられており、貫通孔１４及び微小反応槽１２からなる流路はチップ１１の上面から下面まで貫通している。下側プレート２２には、微小反応槽１２から外部に通ずる流路２４が設けられており、流路２４には吸引ポンプ（不図示）が接続される。吸引ポンプにより流路２４に負圧を印加することにより、ウェル２３から供給され、貫通孔１４及び微小反応槽１２を通過してきた試薬を排出することができる。
　流路２４を形成するための下側プレート２２は、複数層のプレートを貼り合わせて形成することができる。上側プレート２１及び下側プレート２２は切削加工により加工できる。
＜単一細胞解析の実施＞
　フローセルデバイスを用いて単一細胞解析を行った実験例を説明する。
（Ｓｔｅｐ１）
　１．０μＬ中に７０～１００個程度の細胞を懸濁した細胞溶液と、１．０μＬのＰＢＳバッファを、マニュアルピペットを用いてチップ上に滴下した。その後、直ちに、９０ｋＰａ以上の負圧を印加し、細胞をＶｅｒｔｉｃａｌ　Ｆｌｏｗ　Ａｒｒａｙ　Ｃｈｉｐ（ＶＦＡＣ）上に捕捉した。細胞の捕捉は１～２分で完了する。細胞懸濁液が完全に吸引されたことを確認後、負圧をかけたまま、１％ＳＤＳと１０％ＲＮａｓｅ　ＯＵＴを含む細胞リシスバッファ（０．５Ｍ　ＮａＣｌと１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳを含む１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ　ｐＨ８．０）０．５μＬをチップ上に滴下し、１分間リシス溶液を吸引しながら、細胞を破砕する。その後、高塩濃度バッファ（０．５Ｍ　ＮａＣｌと１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ　ｐＨ８．０）２．０μＬを滴下後２分吸引し、さらに同じバッファを２．０μＬ滴下後２分吸引することで、微小反応槽中のリシスバッファを洗浄した。その後、急激な圧力変化によってＶＦＡＣチップが変形することを避けるために、２分かけて大気圧に戻した。
（Ｓｔｅｐ２）
　１チップあたり４．５μＬの逆転写酵素溶液を分注し、フローセルと５ｍＬシリンジをシリコンチューブで接続し、１．７ｃｍのスペーサを用いて８秒だけ吸引して、試薬を微小反応槽内に誘導した後、５０℃で５０分間逆転写反応を行った。逆転写酵素量はチューブ中の単一細胞解析に使用する量と同程度であり、使用する試薬量は１個のチップに採取できる細胞数分だけ低減できることになる。また、提案方法では１チップを１チューブで反応処理しているため、１チューブ１細胞のプレートベースの方法に比べて、１チップで処理できる細胞数に逆比例して処理の手間も低減することが可能である。
（Ｓｔｅｐ３）
　次のステップの２ｎｄ　ｓｔｒａｎｄの合成を阻害しないように、ｃＤＮＡにハイブリダイズしているｍＲＮＡを分解した。
（Ｓｔｅｐ４）
　計測したい遺伝子に対応するプライマ（これを遺伝子特異的プライマと呼ぶ）を１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡにハイブリダイズさせて、２ｎｄ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを合成する。
（Ｓｔｅｐ５）
　共通プライマを用いてＰＣＲ増幅し、増幅時に目的産物以外のＰＣＲ産物（非特異増幅産物）を除去するために、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ社製のＡＭｐｕｒｅ微粒子を用いた核酸の塩基長による選択・精製を実施した。得られたサンプルをＡｇｉｌｅｎｔ社製の２１００　ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒとＡｇｉｌｅｎｔ　Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ＤＮＡ　キット電気泳動でフラグメント解析し、目的産物を定量した。
（Ｓｔｅｐ６）
　Ａｍｐｕｒｅ微粒子による精製を行った後に、定量ＰＣＲにて目的産物を定量し、目的産物濃度が２ｎＭになるように、希釈又は蒸発濃縮によって濃度を調整した。Ｄｅｎａｔｕｒｅ後Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）　Ｍｉｓｅｑ（登録商標）に導入し、シーケンシングを行った。
　得られたシーケンシングデータから、細胞識別タグごとにデータを分割し、分子認識タグを用いて、ＰＣＲ増幅前の分子をカウントすることで、微小反応槽に捕捉された細胞別の単一細胞遺伝子発現解析データを得ることができる。
＜技術的効果＞
　以上のように、第２の実施形態において、第１の実施形態と同様の微粒子充填方法を採用して、単一細胞解析用のチップ１１に形成された微小反応槽１２に、ＤＮＡプローブが固定された微粒子を充填できることが示された。複数の微小反応槽１２のそれぞれに対し高密度に再現性良く微粒子を充填することができるので、結果として、同時に多数の細胞についての単一細胞解析の結果を再現性良く取得することができ、高感度の単一細胞解析デバイスを得ることができる。
［第３の実施形態］
　第１及び第２の実施形態では、重力による微粒子の沈降によって、ノズル内の微粒子懸濁液を濃縮して高濃度懸濁液を取得し、微小反応槽に充填する手法を説明した。これに対し、第３の実施形態においては、磁力を用いて高濃度懸濁液を形成する技術を提案する。
　図１０は、第３の実施形態に係る微粒子充填方法を説明するための概略断面図である。図１０においては、第１の実施形態で説明した工程（ｉｉ）が工程（ｉｉ－１）～（ｉｉ－３）に細分化して示されている。本方法において、磁力線を集中させるための鉄製コーン３０１が取り付けられた磁石３００を用いる。また、本方法において、微粒子として磁性微粒子が用いられる。
　ノズル５に微粒子懸濁液６を吸引して初期状態を構築後、工程（ｉｉ－１）において、磁石３００がノズル５に吸引された微粒子懸濁液６の上部に位置するように、ノズル５又は磁石３００の位置を制御する。これにより、微粒子が磁石３００の付近に集まり、高濃度懸濁液７が形成される。磁石３００の位置は、不図示の駆動システムにより制御される。
　工程（ｉｉ－２）において、ノズル５を磁石３００に対して相対的に上方（矢印３０２の方向）に所定の速度（１μｍ／ｓ以下）で移動させ、ノズル５内の高濃度懸濁液７の位置を下降させる。
　工程（ｉｉ－３）において、ノズル５の先端まで高濃度懸濁液７が到達したら、磁石３００の移動を停止する。これにより、所定の量の高濃度懸濁液７をノズル５の先端に形成することができる。
　工程（ｉｉ－３）が完了したら、第１及び第２の実施形態と同様にして、微小反応槽内へノズル５を下降させ、微粒子を充填することができる。
　工程（ｉｉ－１）において、微粒子懸濁液６の上端界面に近いところに磁石３００を配置して、（ｉｉ－３）の位置まで適切な速度で移動させることで、微粒子懸濁液６中のすべての微粒子を高濃度懸濁液７として濃縮することが可能である。
　図１１は、ノズル５の引き上げ速度と高濃度懸濁液７中の微粒子数の関係を示すグラフである。図１１に示すように、ノズル５を磁石３００に対し１μｍ／ｓよりも早い速度（相対速度）で引き上げると、微粒子濃度が十分に高められず、微粒子をすべて集めることができていないことがわかる。
　また、微粒子懸濁液の界面が、磁石３００がノズル５に最初に接近する位置と（上方に）十分離れている場合でも、磁石３００のノズル５への接近速度を制御することで、高濃度懸濁液７中の微粒子量を制御することが可能である。
　微粒子として、電荷若しくは誘電性を有するものを用いる場合は、磁石３００の代わりに、ノズル５に電気的な力を印加して（電場を形成するなど）、微粒子を集める機構を用いることができる。
＜技術的効果＞
　以上のように、第３の実施形態において、磁力を用いて高濃度懸濁液を形成する方法を採用している。これにより、重力によりノズル内の微粒子を沈降させて濃縮する場合と比較して、ノズルの先端部に微粒子の高濃度懸濁液を形成するための時間を短縮することができる。
［変形例］
　本開示は、上述した実施形態に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでいる。例えば、上述した実施形態は、本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要はない。また、ある実施形態の一部を他の実施形態の構成に置き換えることができる。また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることもできる。また、各実施形態の構成の一部について、他の実施形態の構成の一部を追加、削除又は置換することもできる。
１００、２００　微粒子充填装置
１　平面基板
２　微小反応槽
３ａ　微小反応槽の底面
３ｂ　微小反応槽の側壁面
４　貫通孔
５　ノズル
６　微粒子懸濁液
７　高濃度懸濁液
８　溶液
９　ノズルの外壁
１１　チップ
１２　微小反応槽
１４　貫通孔
１０１　ステージ
１０２　駆動システム
１０３　光学システム
１０４　センサシステム
１０５　分注システム
１０６　保存容器
１０７　カメラシステム
１０８　バルブ
１０９　管
１１０　制御システム
２０１　制御ボード
２０２　画像取得ボード
２０３　ＡＤ変換ボード
２０４　制御コンピュータ
３００　磁石
３０１　鉄製コーン

Claims (13)

  1. 　少なくとも１つ以上の容器に微粒子を充填する方法であって、
    　ノズルに前記微粒子の懸濁液を吸引することと、
    　前記懸濁液中の前記微粒子を濃縮して、前記ノズルの先端部に、所定の微粒子濃度の高濃度懸濁液を形成することと、
    　前記高濃度懸濁液と前記容器の内壁を接触させることと、
    　前記接触後に前記ノズルを前記容器から離すことで前記高濃度懸濁液を前記容器に充填することと、を含む微粒子充填方法。
  2. 　前記ノズルに加わる応力に基づいて、前記高濃度懸濁液と前記容器の内壁との前記接触を検知することをさらに含む、請求項１に記載の微粒子充填方法。
  3. 　前記ノズルの外径は、前記ノズルの先端が前記容器の底面まで到達可能な大きさである、請求項１に記載の微粒子充填方法。
  4. 　前記ノズルの撮像画像又は前記ノズルの光学特性により、前記高濃度懸濁液中の前記微粒子が所定の微粒子濃度に達したと判定することをさらに含む、請求項１に記載の微粒子充填方法。
  5. 　前記微粒子の比重が１より大きく、重力により前記微粒子を沈降させることにより前記ノズルの先端部に前記高濃度懸濁液を形成する、請求項１に記載の微粒子充填方法。
  6. 　前記微粒子が磁性微粒子であり、磁石により前記ノズル内の前記微粒子を前記ノズルの先端部に集めることで、前記高濃度懸濁液を形成する、請求項１に記載の微粒子充填方法。
  7. 　前記容器は、単一細胞解析用チップに形成された微小反応槽であり、前記微小反応槽は底部に貫通孔を有する、請求項１に記載の微粒子充填方法。
  8. 　前記所定の微粒子濃度は、単位体積あたりの前記微粒子の数が最密充填密度の５０％以上となる濃度である、請求項１に記載の微粒子充填方法。
  9. 　少なくとも１つ以上の容器に微粒子を充填する装置であって、
    　ノズルと、
    　前記ノズルへの前記微粒子の懸濁液の吸引を制御する分注システムと、
    　前記容器と前記ノズルとの相対位置を制御する駆動システムと、
    　前記分注システム及び前記駆動システムを制御する制御システムと、を備え、
    　前記制御システムは、
    　前記分注システムにより、前記ノズルに前記懸濁液を吸引させる処理と、
    　前記懸濁液中の前記微粒子を濃縮して、前記ノズルの先端部に、所定の微粒子濃度の高濃度懸濁液を形成させる処理と、
    　前記駆動システムにより、前記高濃度懸濁液と前記容器の内壁を接触させる処理と、
    　前記駆動システムにより、前記接触後に前記ノズルを前記容器から離すことで前記高濃度懸濁液を前記容器に充填する処理と、
    を実行する微粒子充填装置。
  10. 　前記ノズルの画像又は光学特性を取得する光学システムをさらに備え、
    　前記制御システムは、
    　前記光学システムが取得した前記画像又は前記光学特性に基づいて、前記高濃度懸濁液中の前記微粒子が所定の微粒子濃度に達したと判定する、請求項９に記載の微粒子充填装置。
  11. 　前記ノズルに加わる応力に基づいて、前記高濃度懸濁液と前記容器の内壁との前記接触を検知するセンサシステムをさらに備える、請求項９に記載の微粒子充填装置。
  12. 　前記センサシステムは、
    　前記ノズルを固定し、前記ノズルに応力が加わることにより変形する弾性体と、
    　前記弾性体の変形を検知するセンサと、を有し、
    　前記制御システムは、
    　前記センサの検知信号に基づいて前記接触を検知する、請求項１１に記載の微粒子充填装置。
  13. 　前記微粒子が磁性微粒子であり、
    　前記微粒子充填装置は、
    　前記ノズルに対し外部から磁力を印加する磁石をさらに備え、
    　前記駆動システムにより、前記磁石を前記ノズルに近づけた状態で前記ノズルを前記磁石に対し引き上げることにより、前記高濃度懸濁液を形成する、請求項９に記載の微粒子充填装置。
PCT/JP2020/010031 2020-03-09 2020-03-09 微粒子充填方法及び微粒子充填装置 WO2021181467A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/802,925 US20230288301A1 (en) 2020-03-09 2020-03-09 Microparticle filling method and microparticle filling device
PCT/JP2020/010031 WO2021181467A1 (ja) 2020-03-09 2020-03-09 微粒子充填方法及び微粒子充填装置
JP2022507005A JP7312313B2 (ja) 2020-03-09 2020-03-09 微粒子充填方法及び微粒子充填装置

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2020/010031 WO2021181467A1 (ja) 2020-03-09 2020-03-09 微粒子充填方法及び微粒子充填装置

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021181467A1 true WO2021181467A1 (ja) 2021-09-16

Family

ID=77672177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/010031 WO2021181467A1 (ja) 2020-03-09 2020-03-09 微粒子充填方法及び微粒子充填装置

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230288301A1 (ja)
JP (1) JP7312313B2 (ja)
WO (1) WO2021181467A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016125251A1 (ja) * 2015-02-03 2016-08-11 株式会社日立製作所 単一細胞解析用フローセルデバイス及び単一細胞解析装置
WO2017056274A1 (ja) * 2015-09-30 2017-04-06 株式会社日立製作所 細胞解析装置およびそれを用いた細胞解析方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6239257B2 (ja) 2013-04-24 2017-11-29 株式会社日立ハイテクノロジーズ 充填装置、方法、及び分析装置
WO2018134907A1 (ja) 2017-01-18 2018-07-26 株式会社日立ハイテクノロジーズ 同一細胞複数生体分子抽出装置および方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016125251A1 (ja) * 2015-02-03 2016-08-11 株式会社日立製作所 単一細胞解析用フローセルデバイス及び単一細胞解析装置
WO2017056274A1 (ja) * 2015-09-30 2017-04-06 株式会社日立製作所 細胞解析装置およびそれを用いた細胞解析方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20230288301A1 (en) 2023-09-14
JP7312313B2 (ja) 2023-07-20
JPWO2021181467A1 (ja) 2021-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11938710B2 (en) Microfluidic assay assemblies and methods of manufacture
US8741661B2 (en) Methods and devices for sampling flowable materials
US10786800B2 (en) Methods and systems for epi-fluorescent monitoring and scanning for microfluidic assays
US9546932B2 (en) Microfluidic assay operating system and methods of use
US9759718B2 (en) PDMS membrane-confined nucleic acid and antibody/antigen-functionalized microlength tube capture elements, and systems employing them, and methods of their use
US10220385B2 (en) Micro-tube particles for microfluidic assays and methods of manufacture
WO2007057989A1 (ja) 液滴生成搬送方法及び装置、並びに粒子操作装置
JP2015166707A (ja) マイクロ流路デバイス
CN106999850B (zh) 用于分离不混溶的液体以有效地隔离至少一种液体的方法和装置
US20180221881A1 (en) Specimen treatment chip, specimen treatment apparatus, and specimen treatment method
WO2018190336A1 (ja) 送液デバイス及び送液方法
WO2021181467A1 (ja) 微粒子充填方法及び微粒子充填装置
US20230415153A1 (en) Microfluidic devices and method for sampling and analysis of cells using optical forces and raman spectroscopy
JP7378994B2 (ja) 粒子懸濁液から単粒子を分離する装置及び方法
JP6487190B2 (ja) 分子検出システム
JP5599266B2 (ja) 反応プレートの吸引デバイスおよび洗浄デバイス
US20090123958A1 (en) Laboratory Devices, Methods and Systems Employing Acoustic Ejection Devices
JP5205922B2 (ja) 生体物質検出用チップおよび生体物質検出用チップの製造方法
JP4298617B2 (ja) 処理具
CN115867385A (zh) 用于分配液滴的装置和方法的改进或与之相关的改进
JP2007256190A (ja) スポットピン、スポット装置、液体の点着方法、および生化学解析用ユニットの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20924352

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022507005

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20924352

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1