WO2021180996A9 - Procedimiento para la obtención de un extracto fenólico procedente de alpeorujo - Google Patents

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Aranzazu GARCÍA BORREGO
Elisa María RODRÍGUEZ JUAN
Cristina RODRÍGUEZ ROMERO
Rocío ABIA GONZÁLEZ
Sara Jaramillo Carmona
María GARCÍA BORREGO
Alejandro OROZCO PONCELA
María De Itziar AGUIRRE JIMÉNEZ
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Universidad De Sevilla
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    • Y02P20/145—Feedstock the feedstock being materials of biological origin

Definitions

  • the present invention refers to a process for obtaining an extract rich in phenolic compounds from fresh olive oil using acidic-based natural eutectic solvents (NADES).
  • NADES acidic-based natural eutectic solvents
  • the invention also relates to the use of phenolic extract as a nutraceutical, food additive and as a phytosanitary, particularly for the treatment of microbial diseases.
  • the invention refers to alpeorujo extracted for composting and vermicomposting, particularly as a fertilizer and organic amendment.
  • Alpeorujo is the main by-product of the olive oil extraction process by the continuous 2-phase centrifugation system, in which approximately 20% oil is obtained from the olives and 80% by-product is generated.
  • Alpeorujo is a heterogeneous substance made up of the skin, pulp and bone of the olive with high humidity that ranges between 65% and 75%, it is of semi-solid consistency, expensive to manage, phytotoxic (E. Ben ⁇ tez, E., Sainz, H., Melgar, R., Nogales, R. 2002, Vermicomposting of a lignocellulosic waste from olive oil industry: A pilot scale study. Waste Manage Res. 134-142) and difficult biological degradation (Venieri, D., Rouvalis, A., Iliopoulou-Georgudaki, J. 2010. Microbial and toxic evaluation of raw and treated olive mili wastewaters. J Chem Tech & Biotech, Vol. 85, 1380-1388) that produces a strong environmental impact, making this by-product in an economic burden for the olive industry.
  • alpeorujo is rich in bioactive compounds, in particular phenolic compounds that are very abundant in olives and after extraction of olive oil, up to 80% remain retained in the alpeorujo.
  • alpeorujo contains other healthy and nutritionally valuable substances such as lipids, carbohydrates and proteins.
  • Phenolic compounds can have neuroprotective effects in various pathologies of the nervous system through the control of oxidative stress, inflammation, apoptosis and mitochondrial dysfunction.
  • dietary intake of phenolic compounds attenuates oxidative stress and reduces the risk of related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, strokes, multiple sclerosis, and Huntington's disease.
  • related neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, strokes, multiple sclerosis, and Huntington's disease.
  • they act as antioxidants, defending tissues against oxidative damage and eliminating free radicals.
  • Solvents with a high extractive capacity for bioactive substances are needed, which produce extracts of low toxicity that can be used in the agri-food industry and with low environmental impact.
  • NADES Natural Deep Eutectic Solvents
  • choline chloride associated with other components such as sugars, alcohols, or amino acids among others
  • Natural Deep Eutectic Solvents as a New Extraction Media for Phenolic Metabolites in Carthamus tinctorius. L. Anal. Chem. 85, 6272-6278).
  • NADES can present toxicity against cells and animals, which limits their use as a food additive or nutraceutical.
  • Alpeorujo is a by-product that can currently be recycled through different biotechnological procedures, including composting (Tortosa, G., Alburquerque, JA, Ait-Baddi, G., Cegarra, J. 2012. The production of commercial organicamendments and fertilizers by composting of two-phase olive mill waste ("alpeorujo"). Journal of Cleaner Production 26, 48-55) and vermicomposting.
  • Vermicomposting facilitates the transformation of organic waste through low-cost processes in which microorganisms and worms intervene, giving rise to a product, vermicompost, useful for agriculture as a fertilizer and / or soil amendment
  • the present invention refers to a process for obtaining a phenolic extract from alpeorujo that comprises the following steps: i. preparation of natural eutectic solvents (NADES) selected from citric acid and fructose in a 1: 1 w / w ratio, with a content of between 8% and 35% by weight of water; and ii.
  • NADES natural eutectic solvents
  • NADES comprised between 5: 1 to 1: 5 w / w
  • ALE extracted alpeorujo
  • step (ii) is repeated one or more times, preferably once or twice, and more preferably once.
  • the invention refers to the process as defined above, where in step (i) of preparation of natural eutectic solvents (NADES) the water content is between 10% and 30% by weight of water, and preferably 10% and 25% by weight of water, and more preferably 19% by weight of water.
  • NADES natural eutectic solvents
  • the invention refers to the process as defined above, where in stage (ii) the ratio of the NADES from stage (i) and alpeorujo is 1: 1 w / w.
  • step (ii) is carried out at a temperature between 30 ° C and 50 ° C, and preferably 40 ° C.
  • the invention refers to the process as defined above, where step (ii) is carried out by centrifuging between 7,000 g and 17,000 g.
  • Another aspect of the invention refers to the phenolic extract from alpeorujo obtained by the procedure described above.
  • the phenolic extract of the present invention is a set of bioactive compounds that can be used as a nutraceutical due to its anti-inflammatory activity and can also be used as food additives due to its antioxidant capacity.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the phenolic extract defined above as a nutraceutical or food additive.
  • Another aspect of the invention refers to the use of the phenolic extract defined above as a phytosanitary.
  • the invention refers to the use of the phenolic extract defined above as a phytosanitary in the treatment of microbial diseases of plants, preferably for the treatment of microbial diseases of plants caused by bacteria of the genera Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas and Rhizobium.
  • Another aspect of the invention refers to alpeorujo extracted with NADES (ALE) obtained by the procedure described above.
  • Another aspect of the invention refers to the use of alpeorujo extracted with NADES (ALE) defined above, as an organic supplement for composting and vermicomposting.
  • ALE alpeorujo extracted with NADES
  • the invention refers to the use of alpeorujo extracted with NADES (ALE) defined above, as an organic supplement for vermicomposting characterized in that a treatment of the ALE is carried out with worms of the Eisenia fetida species.
  • ALE alpeorujo extracted with NADES
  • vermicomposting thus obtained gives rise to a useful product as a fertilizer or organic amendment.
  • NADES natural eutectic solvents
  • the invention relates to natural solvents (NADES) defined above where the water content is between 10% and 30% by weight of water, preferably 10% and 25% by weight of water, and more preferably 19% by weight of water.
  • NADES natural solvents
  • fertilizer refers to a product used in agriculture or gardening that, due to its nutrient content, facilitates plant growth (Royal Decree 506/2013)
  • the unit "g” refers to the unit of relative centrifugal force, (RCF).
  • organic amendment refers to a product derived from carbonaceous materials of vegetable or animal origin, used mainly to maintain or increase the organic matter content of the soil, improve its physical properties and also improve its properties or chemical or biological activity ( Royal Decree 506/2013).
  • the present invention refers to alpeorujo extracted with NADES (ALE) as a carbonated material of vegetable origin.
  • extracted olive oil refers to the residue of olive oil after extraction.
  • NADES deep eutectic solvents
  • bioactive agent refers to products of natural origin that are found in the extract of alpeorujo, which can be administered as such in concentrated form or be added to a natural food and that are beneficial for health and with preventive and / or therapeutic capacity examples include among other phytosterols, phenolic compounds, etc.
  • food additive refers to products of natural origin that are found in the extract of the alperujo that, although they are not consumed as food by themselves, added to these during their manufacture fulfill an important technological function collaborating in the crucial task of obtain safe and quality food.
  • microbial disease refers to the response of plant cells and tissues to pathogenic microorganisms that cause damage to the physiology or integrity of the plant and can cause deterioration of the plant and even its death.
  • bacterial plant diseases include, among others, the "fire blight” caused by Erwinia amylovora on the pome fruit in rosaceae such as apple, medlar, quince, among others and which causes the death of the plant; "Tuberculosis” in oleáceas, among them the olive tree producing tumors, galls or warts with loss of vigor and productivity of the culture, the infection affects the organoleptic properties and stability of the oil caused by Pseudomonas savastanoi, necrosis, galls, chancres, destroys the tissue infected reducing the fruit plant such as pear, mango, citrus, other horticultural and ornamental caused by Pseudomonas siryngae; tumors in the neck of the
  • low toxicity acid-based NADES are used for the first time to obtain bioactive substances, especially phenolic compounds, from fresh olive oil, and a new by-product is generated.
  • the present invention represents a turning point in the integral use of the by-product of the olive oil production, the alpeorujo, which allows the integral use of it, to obtain, on the one hand, its bioactive compounds using extractive acidic eutectic mixtures and of low toxicity that generate bioactive extracts, and on the other hand, the by-product of this extraction, extracted alpeorujo, is transformed to be reincorporated into the soil.
  • this invention contributes to the integral use of alpeorujo and to the sustainable management of olive oil production with zero residue.
  • Fig. 1 Summary diagram of the phenolic extraction procedure.
  • Fig. 4 Shows the concentration of individual phenolic compounds (mg / kg) extracted from fresh alpeorujo varieties Manzanilla, Branquita, Picholine du Langedoc, Azapa, Picudo, Picholine marrocaine, Picual, Leccino, Ayvalic, Carolea, Soury, Hojiblanca, Koroneiki, Lech ⁇ n, Arbequina and Gordal by NADES 3.
  • Fig 6. Shows the sum of phenolic compounds (mg / kg) extracted from fresh alpeorujo varieties Manzanilla, Branquita, Picholine du Langedoc, Azapa, Picudo, Picholine marrocaine, Picual, Leccino, Ayvalic, Carolea, Soury, Hojiblanca, Koroneiki , Lech ⁇ n, Arbequina and Gordal by NADES 3.
  • Fig. 8a-8d Viability of BV2 microglia cells treated with different concentrations of NADES 3 with or without extract in the Varieties Manzanilla and Branquita at pH 0 and 3, (8a) Manzanilla pH 0, (8b) Branquita pH 0, (8c) Manzanilla pH 3, ( 8d) Branquita pH 3.
  • the X-axis shows the concentration of phenolic compounds in the extracts ( ⁇ g / mL) and the right Y-axis shows the mg of NADES 3 for each of the samples.
  • the dotted line indicates the value below which cellular toxicity occurs.
  • Fig. 9a-9d Viability of BV2 microglia cells treated with different concentrations of phenolic compounds isolated from the extracts with NADES 3 by means of a C18 column in Manzanilla and Branquita varieties at pH 0 and 3, (9a) Manzanilla pH 0, (9b) Branquita pH 0, (9c) Chamomile pH 3, (9d) Branquita pH 3.
  • Different letter for each column denotes significantly different for the different concentrations of phenolic compounds A (a, b, c. D, e, f) and for the different concentrations of phenolic compounds B (g, h, I, j, k, I ).
  • the dotted line indicates the value below which cellular toxicity occurs.
  • Fig. 10 Evolution of the total biomass of worms (adults + juveniles) in the starting materials.
  • ALP alpeorujo;
  • ALE extracted alpeorujo,
  • EST manure;
  • PAJ straw.
  • the shading of each line represents the 95% confidence interval.
  • Fig. 11 Total earthworm biomass (adults + juveniles) in the treatments with alpeorujo extracted during week 5.
  • the center line of the box represents the median, the bottom line of the box the 1st quartile, the top line the 3rd quartile and the points are the outliers or extreme values.
  • ALE alpeorujo extracted with NADES
  • EST manure
  • PAJ straw. Values with different lowercase letters are significantly different (P ⁇ 0.05).
  • Example 1 Preparation of NADES
  • the NADES components, citric acid and fructose are mixed in a 1: 1 w / w ratio, with 8-35% by weight of water.
  • the corresponding components are mixed in a round bottom flask and with continuous stirring at a temperature of 50-80 ° C until the solvent is constituted as a transparent and stable gel.
  • Alpeorujo and NADES are weighed in a alpeorujo: NADES ratio comprised between 5: 1 to 1: 5 w / w, stirring for 10 min to 6 h, at a temperature of 20-90 ° C.
  • the mixture is then centrifuged between 1000-17000 g to separate the phase consisting of phenolic extract plus NADES from the partially extracted alpeorujo.
  • the phenolic extract phase is taken and the extraction process is repeated on the partially extracted alpeorujo phase.
  • the 2 extract phases resulting from the 2 extractions are combined and constitute the "phenolic extract".
  • the phase of alpeorujo after the 2 extractions with NADES is called “extracted alpeorujo”.
  • liquid extracts (or gels) rich in phenols are obtained combined with NADES whose composition allows their use as nutraceuticals or as food additives since said liquid extracts are not toxic for said use, and for their phytosanitary use as antimicrobials, since the NADES have been described for that use.
  • alpeorujo extracted with NADES (ALE) is obtained, that is, with a low concentration of phenols, useful for use in vermicomposting when combined with organic substrates.
  • Table 1 shows the different components of the solvents used for the extraction of polyphenols from alpeorujo.
  • the NADES 3 are the acidic formulations that are the object of this study.
  • Solvents 10 and 11 correspond to aqueous mixtures of the solvent methanol and 15 with water, these solvents were used as extraction controls since they are the usual conventional mixtures for the extraction of polyphenols.
  • Figure 2 shows the concentration of phenols individually obtained by each solvent in decreasing order.
  • Solvents 1 to 4 showed a similar extraction pattern for phenolic compounds and the highest extraction efficiencies (see figure 3).
  • the NADES 3 exceeded 3900 mg / kg in wet weight of polyphenols extracted in the Picual variety, amounts statistically similar to those of the rest of the acidic-based solvents used.
  • the NADES 3 were significantly more extractive than the mixtures conventional aqueous methanol (10, 11) and than water (15).
  • NADES 3 consisting of citric acid / fructose was used as a polyphenol extractant in alpeorujos of 17 olive varieties. 18 phenolic compounds were quantified (see figure 4)
  • NADES 3 is an effective polyphenol extractant, with the varieties Branquita and Manzanilla being the richest in polyphenols. with more than 11000 mg / kg in fresh alpeorujo, while Arbequina and Gordal showed the lowest values of less than 2000 mg / kg of fresh alpeorujo in the case of the Gordal variety.
  • Example 5 Determination of the toxicity of acid NADES in study on phytopathogenic bacteria and the antimicrobial activity of phenolic extracts obtained by means of these NADES from fresh alpeorujo.
  • the analyzes of toxicity and antimicrobial activity were carried out with strains obtained from the Spanish Collection of Type Cultures (CECT). Pseudomonas savastanoi CECT 5019, Pseudomonas syringae CECT 4429, Erwinia toletana CECT 5263, Erwinia amylovora CECT 222, Rhizobium radiobacter CECT 4119 and Xanthomonas campestris CECT 97.
  • CECT Collection of Type Cultures
  • the strain was incubated under shaking aerobic conditions at 29 ° C for 24 h, obtaining broths with approximate values of 10 9 CFU / mL.
  • the determination of the antimicrobial capacity of the extracts was carried out by calculating the minimum inhibitory capacity (MIC) by serial dilution of the extracts. extracts in 96-well microtiter plates, the corresponding dilutions were made to obtain 10 6 CFU / mL per well.
  • NADES For the toxicity analysis of NADES, the effects of NADES 3 were compared at initial acidic pH, which is the original pH of NADES, and adjusted to pH 5.5 - 6 with NaHCO 3 . The pH adjustment was carried out to avoid an excessively acidic medium incompatible for optimal bacterial growth.
  • Other conventional control solvents were also included, such as glycerol of low toxicity and used for the cryopreservation of bacteria and dimethylsulfoxide (DMSO) also considered of low toxicity. Considering that a solvent shows low toxicity when it does not inhibit the growth of microorganisms at a concentration in the culture medium equal to or greater than 10%. Ethanol was also used, which is a toxic solvent against bacteria, these 3 solvents allow us to establish comparisons with the NADES object of this study. The results obtained are shown in figure 7.
  • NADES 3 at adjusted pH presented less or equal toxicity than the positive controls for the strains of the Erwinia genus, it was less toxic than DMSO in all cases except for X. campestris which showed the same toxicity and that of R. radiobacter in which it was more toxic.
  • the antimicrobial activity of the extracts obtained by NADES 3 of the three varieties of Manzanilla, Picual and Branquita olives against the 6 phytopathogenic strains was determined.
  • the pH of the extracts was adjusted to optimal values for bacterial growth at pH 5.5 - 6 with NaHCCO 3 Table.
  • Table 2 shows the antimicrobial activity against the 6 bacterial strains of the phenolic extracts obtained with NADES 3.
  • the microorganisms of the Erwinia genus were the most resistant to the phenolic extracts of the 3 varieties, with Picual extracts exerting on E. toletana the greatest antimicrobial effect in this genus.
  • P. savastanoi was the most sensitive strain against the extracts of the 3 varieties.
  • the extracts of the Manzanilla and Picual varieties were more inhibitory of microorganisms than those of Branquita for all strains except for E. amylovora, however, these extracts contain a lower total phenolic concentration than those of the Branquita variety, but are richer in Secoiridoid derivatives and simple phenols with known antimicrobial effect (Brenes, M., Garc ⁇ a, A., de los Santos, B., Medina, E., Romero, C. & de Castro, A., Romero, F. (2010) Olive glutaraldehyde-like compounds against plant pathogenic bacteria and fungi. Food Chemistry, Vol. 125, 1262-1266.).
  • the solvent NADES 3 exerts an inhibitory effect on the growth of strains X. campestris and R. radiobacter (Table 2).
  • the content of the phenolic extract of Manzanilla was more toxic than the solvent for X. campestris, however, the Picual and Branquita extracts showed the same toxicity as the solvent and in the case of R. radiobacter the solvent was more toxic than the extract For these two varieties, in these cases, the effect of polyphenols on the viability of microorganisms could not be evaluated due to the toxicity that NADES 3 exhibited even when adjusted.
  • Example 6 Cytotoxicity of alpeorujo extracted with NADES in murine BV2 microglia cells.
  • Figure 8 shows the percentage of living cells after incubation with the NADES 3 (0 phenolic compounds) and the extracts of alpeorujo of the varieties Manzanilla and Branquita with the NADES 3 with different concentrations of phenolic compounds (250, 200, 150, 100 , 50 and 25 ⁇ g / mL of cell medium) at pH 0 and 3.
  • the results showed that NADES 3 are cytotoxic for microglia cells from a concentration greater than 50-75 mg of NADES per milliliter of medium, both at pHO as at pH3.
  • the cytotoxic effect of NADES was counteracted with alpeorujo extracts in both varieties and both pH. Cell viability was higher for the Manzanilla variety than for Branquita.
  • the phenolic compounds present in the extracts of the Manzanilla and Branquita varieties were isolated by means of a solid phase column with C18 packing and their cytotoxic effect on murine microglia cells was determined.
  • the phenolic compounds of the Manzanilla variety showed a cytotoxic effect at high concentrations (250-150 ⁇ g / mL) in microglia cells at both pHO and pH3.
  • the Branquita variety showed cytotoxicity for concentrations of phenolic compounds of 250-100 ⁇ g / mL at both pH (figure 9).
  • the isolated extracts with NADES 3 could be used at initial pH, so that there would be no modification of the phenolic compounds due to changes in pH. Both extracts appear to contain compounds other than phenols that are promoting cell viability, counteracting the cytotoxic effect that phenols have in isolation at high concentrations in these cells. This data suggests that the extracts of the studied NADES could allow the use of high concentrations of phenolic compounds avoiding their cytotoxic factor in microgy cells and thus exerting anti-inflammatory and antioxidant functions typical of these compounds.
  • the alpeorujo extracted with NADES 3 has undesirable characteristics for the survival of the worms due mainly (although not exclusively) to its low pH and low porosity. For this reason, it is necessary to transform the product before putting it in contact with the worms.
  • Example 8 Stability test of phenolic extracts The stability of the phenolic extracts obtained with NADES 3 of the 16 varieties of alpeorujo after a period of 12 months of storage in the dark at room temperature was determined. The test was carried out keeping 5 ml of each extract in closed vials. After storage, the presence or absence of precipitation was determined. As a result, no precipitation was detected in any of the extracts and it was concluded that they were stable under the test conditions.

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Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de un extracto rico en compuestos fenólicos procedente de alpeorujo fresco de oliva mediante disolventes eutécticos naturales (NADES) de base acídica. La invención también se refiere al uso del extracto fenólico como nutracéutico, aditivo alimentario y como fitosanitario particularmente para el tratamiento de enfermedades microbianas. Asimismo, la invención se refiere al alpeorujo extractado para compostaje y vermicompostaje, particularmente como fertilizante y enmienda orgánica.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la obtención de un extracto fenólico procedente de alpeoruio
La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de un extracto rico en compuestos fenólicos procedente de alpeorujo fresco de oliva mediante disolventes eutécticos naturales (NADES) de base acídica. La invención también se refiere al uso del extracto fenólico como nutracéutico, aditivo alimentario y como fitosanitario particularmente para el tratamiento de enfermedades microbianas. Asimismo, la invención se refiere al alpeorujo extractado para compostaje y vermicompostaje, particularmente como fertilizante y enmienda orgánica.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El alpeorujo es el principal subproducto del proceso de extracción de aceite de oliva por el sistema de centrifugación en continuo a 2 fases, en el que a partir de las aceitunas se obtiene aproximadamente un 20% de aceite y se genera un 80% de subproducto.
El alpeorujo es una sustancia heterogénea constituida por la piel, pulpa y el hueso de la oliva con elevada humedad que oscila entre el 65% y el 75%, es de consistencia semisólida, de gestión costosa, fitotóxico (E. Benítez, E., Sainz, H., Melgar, R., Nogales, R. 2002, Vermicomposting of a lignocellulosic waste from olive oil industry: A pilot scale study. Waste Manage Res. 134-142) y de difícil degradación biológica (Venieri, D., Rouvalis, A., Iliopoulou-Georgudaki, J. 2010. Microbial and toxic evaluation of raw and treated olive mili wastewaters. J Chem Tech & Biotech, Vol. 85, 1380-1388) que produce un fuerte impacto ambiental, convirtiendo a este subproducto en una carga económica para la industria oleícola.
Sin embargo, el alpeorujo es rico en compuestos bioactivos, en particular compuestos fenólicos que son muy abundantes en la aceituna y tras la extracción del aceite de oliva permanecen retenidos hasta el 80% en el alpeorujo. Además, el alpeorujo contiene otras sustancias saludables y nutricionalmente valiosas como lípidos, carbohidratos y proteínas.
Los compuestos fenólicos pueden tener efectos neuroprotectores en varias patologías del sistema nervioso a través del control del estrés oxidativo, inflamación, apoptosis y disfunción mitocondrial. Según la literatura científica más reciente, la ingesta dietética de compuestos fenólicos atenúa el estrés oxidativo y reduce el riesgo de enfermedades neurodegenerativas relacionadas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, derrames cerebrales, esclerosis múltiple y la enfermedad de Huntington. También a nivel periférico, actúan como antioxidantes, defendiendo los tejidos contra el daño oxidativo y eliminando los radicales libres. [Polyphenols from Food and Natural Products: Neuroprotection and Safety. Silva RFM, Pogacnik L. Antioxidants (Basel). 2020 Jan 10;9(1)].
Muchos antioxidantes sintéticos se han utilizado para retrasar el proceso de oxidación, particularmente en los sistemas alimentarios (Shahidi, F. and Naczk, M. 2004. Phenolics in Food and Nutraceuticals, 576Boca Ratón, FL: CRC Press.). Sin embargo, el uso de antioxidantes sintéticos está bajo una estricta regulación debido a su potencial peligro para la salud en la promoción de la carcinogénesis, así como al rechazo general de los aditivos alimentarios sintéticos por parte de los consumidores. Los tocoferoles y el ácido ascórbico o sus derivados que se utilizan como alternativas a los antioxidantes sintéticos son antioxidantes mucho menos efectivos. (Emerging Role of Phenolic Compounds as Natural Food Additives in Fish and Fish Products. Sajid Maqsood, Soottawat Benjakul & Fereidoon Shahidi. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. Volume 53, 2013 - Issue 2).
Por otra parte, existe una demanda creciente de la industria agroalimentaria de antimicrobianos de origen natural asociada a las restricciones de la normativa europea en materia de fitosanitarios y a la regulación del uso sostenible de los mismos (Directiva 2009/128/CE. Reglamento (CE) n° 1107/2009 (Directiva 2009/128/CE) asociada a los riesgos para la salud y medioambiente que conllevan (toxicidad, persistencia a largo plazo, promoción de la resistencia de patógenos). Los consumidores demandan alimentos libres de residuos químicos de síntesis que se asocian con efectos perjudiciales para la salud (Balasubramanian, P., Karthickumar, P. 2017. Biofertilizers and biopesticides: A holistic approach for sustainable agriculture. Sustainable utilization of natural resources 256-284; Kulkarni, S. 2016. Sustainable agrochemicals for conservation of agriculture and climate change. Conservation agriculture: An approach to combat climate change in indian himalaya pp. 135-157).
Se ha descrito la actividad antimicrobiana de los compuestos fenólicos y entre ellos de los fenoles de la aceituna y del aceite de oliva (Brenes, M., Medina, E., García, A., Romero, C., de Castro, A. 2010. Olives and olive oil compounds active against pathogenic microrganisms, Health and disease prevention,109, 1013-1019). El alpeorujo es rico en estos compuestos y se conoce su acción antimicrobiana frente a un amplio espectro de microrganismos entre ellos las bacterias fitopatógenas (Medina, E., Romero, C., Santos, B., Castro, A., García, A., Romero, F., Romero, F., Brenes, M. 2011. Antimicrobial activity of olive Solutions from stored alpeorujo against plant pathogenic microorganisms. J. Agrie. Food Chem. 59, 6927-6932).
La industria agroalimentaria y la comunidad científica buscan además de la obtención de compuestos bioactivos de origen natural, que éstos sean obtenidos mediante extractantes no tóxicos, biodegradables y de bajo coste como una alternativa a los disolventes orgánicos convencionales que se utilizan de forma extensa y en su mayoría no cumplen estas premisas.
Se necesitan disolventes de alta capacidad extractiva de sustancias bioactivas, que produzcan extractos de baja toxicidad que se puedan utilizar en la industria agroalimentaria y de bajo impacto ambiental.
Los Disolventes Eutécticos Profundos Naturales (NADES) están constituidos por mezclas de sustancias naturales presentes en organismos vivos y pueden ser una alternativa a los disolventes convencionales en función de su formulación. Los NADES pueden constituirse por muy diferentes combinaciones de sustancias, típicamente se han formulado NADES para extracción de sustancias bioactivas basados en sales de amonio como cloruro de colina, asociado a otros componentes como azúcares, alcoholes, o aminoácidos entre otros (Dai, Y., Witkamp, G. J., Verpoorte, R., Choi, Y. H. 2013. Natural Deep Eutectic Solvents as a New Extraction Media for Phenolic Metabolites in Carthamus tinctorius. L. Anal. Chem. 85, 6272-6278). Sin embargo, estos NADES pueden presentar toxicidad frente a células y a animales, lo que limita su uso como aditivo alimentario o nutracéutico. Radosevic, K., Búbalo, M. C., Srcek, V. G., Grgas, D., Dragicevic, T. L, Redovnikovic, I. R. 2015. Evaluation of toxicity and biodegradability of choline chloride based deep eutectic solvents. Ecotoxicol Environ Saf. 112, 46-53. Se han utilizado diferentes disolventes eutécticos para la extracción de fenoles de aceites de oliva y alpeorujo basados en sales de amonio y otros componentes (García, A., Rodríguez-Juan, E., Rodríguez-Gutiérrez, G., Ríos, J. J., Fernández-Bolaños, J. 2016. Extraction of phenolic compounds from Virgin olive oil by deep eutectic solvents (DESs). Food Chem. 197, 554-561, García, A., Rodriguez-Juan, E., Fernandez- Bolaños, J. 2017. Extraction of phenolic compounds from olive pomace by deep eutectic solvents (DESs), Green Chemistry. 3:3) pero no se han usado disolventes de baja toxicidad y alta capacidad extractiva como los NADES acídicos. El alpeorujo es un subproducto que actualmente se puede reciclar mediante diferentes procedimientos biotecnológicos, entre ellos, el compostaje (Tortosa, G., Alburquerque, J.A., Ait-Baddi, G., Cegarra, J. 2012. The production of commercial organicamendments and fertilisers by composting of two-phase olive mili waste ("alpeorujo"). Journal of Cleaner Production 26, 48-55) y el vermicompostaje.
El vermicompostaje facilita la transformación de residuos orgánicos mediante procesos de bajo coste en los que intervienen microorganismos y lombrices dando lugar a un producto, el vermicompost, útil para la agricultura como fertilizante y/o enmienda de suelos (Melgar, R., Benitez, E., Nogales, R., 2009. Bioconversion of wastes from olive oil industries by vermicomposting process using the epigeic earthworm Eisenia andrei. Journal of Environmental Science and Health, Part B, 44, 488-495. Nogales, R., Romero, E., Fernandez-Gómez, M. J. 2014. Vermicompostaje: Procesos, productos y aplicaciones. Mundi-Prensa, Madrid). Por tanto, sería deseable disponer de un procedimiento para la obtención de un extracto bioactivo y antimicrobiano del alpeorujo mediante NADES y el aprovechamiento del alpeorujo extractado mediante procesos como el vermicompostaje que permitiese la gestión sostenible de la producción del aceite de oliva con residuo cero. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de un extracto fenólico procedente de alpeorujo que comprende las siguientes etapas: i. preparación de disolventes eutécticos naturales (NADES) seleccionados de ácido cítrico y fructosa en relación 1:1 p/p, con un contenido de entre el 8% y el 35% en peso de agua; y ii. adición de los NADES de la etapa (i) al alpeorujo en una relación alpeorujo: NADES comprendido entre 5:1 a 1:5 p/p, agitando durante un tiempo de entre 10 minutos a 6 horas, a una temperatura de entre 20 °C y 90 °C, y centrifugando entre 1.000 g y 17.000 g para separar la fase de extracto fenólico con los disolventes del alpeorujo extractado (ALE).
En otra realización la invención se refiere al procedimiento tal y como se ha definido anteriormente, donde la etapa (ii) se repite una o más veces, preferiblemente una o dos veces, y más preferiblemente una vez.
En otra realización la invención se refiere al procedimiento tal y como se ha definido anteriormente, donde en la etapa (i) de preparación de disolventes eutécticos naturales (NADES) el contenido de agua es de entre el 10% y el 30% en peso de agua, y preferiblemente 10% y el 25% en peso de agua, y más preferiblemente de 19% en peso de agua.
En otra realización la invención se refiere al procedimiento tal y como se ha definido anteriormente, donde en la etapa (ii) la relación de los NADES de la etapa (i) y alpeorujo es de 1 : 1 p/p.
En otra realización la invención se refiere al procedimiento tal y como se ha definido anteriormente, donde la etapa (ii) se lleva a cabo a una temperatura de entre 30 °C y 50 °C, y preferiblemente de 40 °C.
En otra realización la invención se refiere al procedimiento tal y como se ha definido anteriormente, donde la etapa (ii) se lleva a cabo centrifugando entre 7.000 g y 17.000 g.
Tras la extracción de los alpeorujos mediante NADES 3 (constituido por ácido cítrico/fructosa tal y como se ha definido anteriormente), se obtiene un extracto rico en polifenoles que denominamos “extracto fenólico”, y un residuo que denominamos “alpeorujo extractado con NADES (ALE)”. Atendiendo a principios de economía circular (ver figura 12), el ALE puede transformarse mediante procesos con prácticamente residuo cero.
Se podrían usar varios procesos biológicos, entre los que cabe señalar el compostaje y el vermicompostaje. En este caso se ha trabajado con vermicompostaje, incluyendo un tratamiento previo de acondicionamiento del material que podría considerarse de pre- compostaje. Se ha trabajado con lombrices de la especie Eisenia fétida. Se justifica este proceso de transformación biológica en la dificultad para usar el alpeorujo extractado (ALE) tal y como se obtiene. Sus propiedades químicas (especialmente su acidez) y físicas (elevada viscosidad y escasa aireación) hacen del alpeorujo extractado un producto difícil de transformar mediante mecanismos biológicos. Los procesos de compostaje y vermicompostaje utilizados en esta invención facilitan su transformación. Se ponen en marcha procesos de economía circular que hacen de esta invención un proceso de residuo prácticamente 0 a partir del subproducto de la elaboración del aceite de oliva.
Otro aspecto de la invención se refiere al extracto fenólico procedente de alpeorujo obtenido por el procedimiento descrito anteriormente.
El extracto fenólico de la presente invención es un conjunto de compuestos bioactivos que puede utilizarse como nutracéutico debido a su actividad antiinflamatoria y también pueden utilizarse como aditivos alimentarios debido a su capacidad antioxidante.
Así, otro aspecto de la invención se refiere al uso del extracto fenólico definido anteriormente como nutracéutico o aditivo alimentario.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del extracto fenólico definido anteriormente como fitosanitario.
En otra realización la invención se refiere al uso del extracto fenólico definido anteriormente como fitosanitario en el tratamiento de enfermedades microbianas de plantas, preferiblemente para el tratamiento de enfermedades microbianas de plantas causadas por las bacterias de los géneros, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas y Rhizobium. Otro aspecto de la invención se refiere al alpeorujo extractado con NADES (ALE) obtenido por el procedimiento descrito anteriormente.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del alpeorujo extractado con NADES (ALE) definido anteriormente, como suplemento orgánico para compostaje y vermicompostaje.
En otra realización la invención se refiere al uso del alpeorujo extractado con NADES (ALE) definido anteriormente, como suplemento orgánico para vermicompostaje caracterizado por que se lleva a cabo un tratamiento del ALE con lombrices de la especie Eisenia fétida.
El vermicompostaje así obtenido, da lugar a un producto útil como fertilizante o enmienda orgánica.
Otro aspecto de la invención se refiere a los disolventes eutécticos naturales (NADES) seleccionados de ácido cítrico y fructosa en relación 1:1 p/p.
En otra realización la invención se refiere a los disolventes naturales (NADES) definidos anteriormente donde el contenido de agua es de entre el 10% y el 30% en peso de agua, preferiblemente 10 % y el 25% en peso de agua, y más preferiblemente de 19% en peso de agua.
A lo largo de la descripción, el término “fertilizante” se refiere a un producto utilizado en agricultura o jardinería que, por su contenido en nutrientes, facilita el crecimiento de las plantas (Real Decreto 506/2013)
La unidad “g” se refiere a la unidad de fuerza centrífuga relativa, (FCR).
El término “enmienda orgánica” se refiere a un producto procedente de materiales carbonados de origen vegetal o animal, utilizado fundamentalmente para mantener o aumentar el contenido en materia orgánica del suelo, mejorar sus propiedades físicas y mejorar también sus propiedades o actividad química o biológica (Real Decreto 506/2013). La presente invención se refiere al alpeorujo extractado con NADES (ALE) como material carbonado de origen vegetal.
El término “alpeorujo extractado” se refiere a el residuo de alpeorujo tras la extracción mediante disolventes eutécticos profundos naturales (NADES) de compuestos bioactivos, principalmente compuestos fenólicos, por tanto, contiene poca cantidad de los mismos.
El término “nutracéutico” (agente bioactivo) se refiere a productos de origen natural que se encuentran en el extracto del alpeorujo, que se pueden administrar como tal en forma concentrada o ser adicionado a un alimento natural y que son beneficiosos para la salud y con capacidad preventiva y/o terapéutica ejemplos incluyen entre otros fitoesteroles, compuestos fenólicos, etc.
El término “aditivo alimentario” se refiere a productos de origen natural que se encuentran en el extracto del alperujo que, aunque no se consumen como alimentos por sí mismos, añadidos a estos durante su fabricación cumplen una importante función tecnológica colaborando en la crucial tarea de obtener alimentos seguros y de calidad.
El término “enfermedad microbiana” se refiere a la respuesta de las células y tejidos de las plantas a microorganismos patógenos que provocan daño en la fisiología o integridad de la planta y pueden ocasionar deterioro de la misma e incluso su muerte. Ejemplos de enfermedades bacterianas de plantas incluyen, entre otras, el “fuego bacteriano” causado por Erwinia amylovora sobre el frutal de pepita en rosáceas como el manzano, níspero, membrillero, entre otros y que provoca la muerte de la planta; “tuberculosis” en oleáceas, entre ellas el olivo produciendo tumores, agallas o verrugas con pérdida de vigor y productividad del cultivo, la infección afecta a las propiedades organolépticas y estabilidad del aceite causada por Pseudomonas savastanoi, necrosis, agallas, chancros, destruye el tejido infectado mermando a la planta frutal como peral, mango, cítricos, otras hortícolas y ornamentales causado por Pseudomonas siryngae ; tumores en el cuello de la planta disminuyendo la productividad y calidad de cultivos como la viña, frutal de pepita y de nuez causados por Rhizobium radiobacter, o marchitez de cultivos hortícolas y frutícolas causados por Xanthomonas campestris.
Así pues, en la presente invención se utilizan por primera vez NADES de base acídica de baja toxicidad para la obtención de sustancias bioactivas, especialmente compuestos fenólicos, de los alpeorujos frescos de oliva y se genera un nuevo subproducto alpeorujo extractado.
Tras la extracción del alpeorujo con NADES acídicos se genera un nuevo subproducto, “alpeorujo extractado”, difícilmente manejable por sus características de viscosidad y escasa aireación. Se ha desarrollado una metodología para el vermicompostaje de este nuevo subproducto. De este modo se recicla el alpeorujo extractado y se facilita el diseño de procesos de residuo cero en los que los materiales y nutrientes que contiene el producto vuelven a las parcelas agrícolas en el formato de fertilizantes y/o enmiendas.
Por tanto, la presente invención supone un punto de inflexión en el aprovechamiento integral del subproducto de la elaboración del aceite de oliva, el alpeorujo, que posibilita el aprovechamiento integral del mismo, para obtener por un lado sus compuestos bioactivos utilizando mezclas eutécticas acídicas extractivas y de baja toxicidad que generan extractos bioactivos, y por otra parte el subproducto de esta extracción, alpeorujo extractado, es transformado para ser reincorporado al suelo. Con esta invención, se contribuye al aprovechamiento integral del alpeorujo y a la gestión sostenible de la producción del aceite de oliva con residuo cero.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Esquema resumen del procedimiento de extracción fenólica.
Fig. 2. Concentración en compuestos fenólicos (mg/kg) extraídos de alpeorujo fresco de la variedad Picual mediante diferentes disolventes eutécticos naturales, mezclas acuosas de metanol y agua. Los números se corresponden con los disolventes que figuran en la tabla 1. Los análisis se realizaron mediante HPLC-UV con confirmación de estructuras mediante HPLC-MS. (n=2).
Fig. 3. Muestra la suma de los compuestos fenólicos extraídos (mg/kg) de alpeorujo fresco de la variedad Picual mediante diferentes disolventes eutécticos, mezclas acuosas de metanol y agua. Los números se corresponden con los disolventes que figuran en la tabla 1. Los análisis se realizaron mediante HPLC-UV con confirmación de estructuras mediante HPLC-MS (n=2).
Fig. 4. Muestra la concentración en compuestos fenólicos individuales (mg/kg) extraídos de alpeorujo fresco de las variedades Manzanilla, Branquita, Picholine du Langedoc, Azapa, Picudo, Picholine marrocaine, Picual, Leccino, Ayvalic, Carolea, Soury, Hojiblanca, Koroneiki, Lechín, Arbequina y Gordal mediante NADES 3. Los análisis se realizaron mediante HPLC-UV con confirmación de estructuras mediante HPLC-MS (n=2).
Fig. 5. Muestra la concentración en compuestos fenólicos (mg/kg) reunidos en 6 grupos de compuestos relacionados: agluconas secoiridoides, alcoholes, flavonoides, oleósidos, oleuropeína, verbascósido, expresados en mg/kg de alpeorujo fresco, extraídos de las variedades Manzanilla, Branquita, Picholine du Langedoc, Azapa, Picudo, Picholine marrocaine, Picual, Leccino, Ayvalic, Carolea, Soury, Hojiblanca, Koroneiki, Lechín, Arbequina y Gordal mediante NADES 3. Los análisis se realizaron mediante HPLC-UV con confirmación de estructuras mediante HPLC-MS (n=2).
Fig 6. Muestra la suma de los compuestos fenólicos (mg/kg) extraídos de alpeorujo fresco de las variedades Manzanilla, Branquita, Picholine du Langedoc, Azapa, Picudo, Picholine marrocaine, Picual, Leccino, Ayvalic, Carolea, Soury, Hojiblanca, Koroneiki, Lechín, Arbequina y Gordal mediante NADES 3. Los análisis se realizaron mediante HPLC-UV con confirmación de extructuras mediante HPLC-MS (n=2). Fig. 7a-7b. Efecto bactericida de diferentes disolventes sobre microorganismos fitopatógenos expresados como concentración mínima inhibitoria (MIC) en porcentaje, NADES 3 a pH ácido original y a pH ajustado 5,5-6, a), NADES 3 a pH ajustado, DMSO, glicerol y etanol b), sobre Pseudomonas savastanoi CECT 5019, Pseudomonas syringae CECT 4429, Erwinia toletana CECT 5263, Erwinia amylovora CECT 222, Rhizobium radiobacter CECT 4119, y Xanthomonas campestris CECT 97 (n=3). La línea de puntos indica el valor por debajo del cual no se considera toxicidad.
Fig. 8a-8d. Viabilidad de células microglía BV2 tratadas con distintas concentraciones de NADES 3 con o sin extracto en las Variedades Manzanilla y Branquita a pH 0 y 3, (8a) Manzanilla pH 0, (8b) Branquita pH 0, (8c) Manzanilla pH 3, (8d) Branquita pH 3. En el eje de las X se muestran la concentración de compuestos fenólicos en los extractos (μg/mL) y en el eje Y derecho se muestran los mg de NADES 3 para cada una de las muestras. Los resultados se expresan como porcentaje (%) de células vivas, según la siguiente relación: % = D.O de las células tratadas x 100/D. O de las células controles. P<0,5 . * Significativamente diferente para NADES 3 versus NADES 3 con su extracto. La línea de puntos indica el valor por debajo del cual se produce toxicidad celular.
Fig. 9a-9d. Viabilidad de células microglía BV2 tratadas con distintas concentraciones de compuestos fenólicos aislados de los extractos con NADES 3 mediante columna C18 en variedades Manzanilla y Branquita a pH 0 y 3, (9a) Manzanilla pH 0, (9b) Branquita pH 0, (9c) Manzanilla pH 3, (9d) Branquita pH 3. Los resultados se expresarán como porcentaje (%) de células vivas, según la siguiente relación: % = D.O de las células tratadas x 100/D. O de las células controles. P<0.5. Letra distinta para cada columna denota significativamente diferente para las distintas concentraciones de compuestos fénolicos A (a, b, c. d, e, f) y para las distintas concentraciones de compuestos fenólicos B (g, h, I, j, k, I). La línea de puntos indica el valor por debajo del cual se produce toxicidad celular.
Fig. 10. Evolución de la biomasa total de lombrices (adultas+juveniles) en los materiales de partida. ALP = alpeorujo; ALE = alpeorujo extractado, EST = estiércol; PAJ: paja. El sombreado de cada línea representa el intervalo de confianza al 95%.
Fig. 11. Biomasa total de lombrices (adultas+juveniles) en los tratamientos con alpeorujo extractado durante la semana 5. La línea central de la caja representa la mediana, la línea inferior de la caja el 1 er cuartil, la línea superior el 3ercuartil y los puntos los outliers o valores extremos., ALE=alpeorujo extractado con NADES, EST=estiércol, PAJ=paja. Valores con distinta letra minúscula son significativamente diferentes (P<0,05).
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Ejemplo 1 : Preparación de NADES Se mezclan los componentes del NADES, ácido cítrico y fructosa en relación 1 :1 p/p, con un 8-35% en peso de agua. Los componentes correspondientes se mezclan en un matraz de fondo redondo y en agitación continua a temperatura de 50-80 °C hasta la constitución del disolvente como un gel transparente y estable.
Ejemplo 2: Procedimiento de extracción fenólica:
Se pesan alpeorujo y NADES en una relación alpeorujo: NADES comprendido entre 5:1 a 1:5 p/p, agitando durante 10 min a 6 h, a una temperatura de 20-90 °C. A continuación, la mezcla se centrifuga entre 1000-17000 g para separar la fase constituida por extracto fenólico más NADES del alpeorujo parcialmente extractado. Se toma la fase de extracto fenólico y se repite el proceso de extracción sobre la fase de alpeorujo parcialmente extractado. Las 2 fases de extracto resultantes de las 2 extracciones se combinan y constituyen el “extracto fenólico”. La fase de alpeorujo tras las 2 extracciones con NADES se denomina “alpeorujo extractado”.
Mediante este procedimiento, se obtienen extractos líquidos (o geles) ricos en fenoles combinados con los NADES cuya composición permite su uso como nutracéuticos o como aditivos alimentarios dado que dichos extractos líquidos no son tóxicos para dicho uso, y para su uso fitosanitario como antimicrobianos, puesto que los NADES se han descrito para ese uso.
Y, también, por dicho procedimiento se obtiene alpeorujo extractado con NADES (ALE), es decir, con una baja concentración de fenoles, útil para su uso en vermicompostaje al combinarlo con sustratos orgánicos.
El procedimiento de la invención se resume en la figura 1.
Ejemplo 3: Eficiencia extractiva de los NADES acídicos en estudio
Mediante este ensayo se ha determinado la capacidad extractante de dos disolventes eutécticos naturales (NADES) con base acídica y se ha comparado con NADES de diferente formulación y con disolventes convencionales. Para ello, se analizó el contenido fenólico extraído por 17 disolventes diferentes sobre los compuestos fenólicos de alpeorujo fresco de la variedad Picual (fig. 2 ,3). Tabla 1 : Composición y pH de los diferentes disolventes utilizados.
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La tabla 1 muestra los diferentes componentes de los disolventes utilizados para la extracción de polifenoles de alpeorujo. Los NADES 3 son las formulaciones acídicas objeto de este estudio. Los disolventes 10 y 11 se corresponden con mezclas acuosas del disolvente metanol y 15 con agua, estos disolventes se utilizaron como controles de extracción ya que son las mezclas convencionales habituales para la extracción de polifenoles. En la figura 2 se muestran la concentración en fenoles de forma individualizada obtenida por cada disolvente por orden decreciente. Los disolventes 1 a 4 mostraron similar patrón de extracción de compuestos fenólicos y las mayores eficacias extractivas (ver figura 3). Los NADES 3 superaron 3900 mg/kg en peso húmedo de polifenoles extraídos en la variedad Picual, cantidades estadísticamente similares a las del resto de disolventes de base acídica utilizados.
Los NADES 3 fueron significativamente más extractivos que las mezclas convencionales acuosas de metanol (10, 11) y que el agua (15).
Ejemplo 4: Eficiencia extractiva de NADES 3 en alpeorujos de distintas variedades de aceituna
En este estudio se utilizó NADES 3 constituido por ácido cítrico/fructosa como extractante de polifenoles en alpeorujos de 17 variedades de olivas. Se cuantificaron 18 compuestos fenólicos (ver figura 4)
Se analizó el contenido fenólico de 16 variedades diferentes de olivas con NADES 3 (ver figura 5 y figura 6), y como resultado, se concluyó que NADES 3 es un eficaz extractante de polifenoles, siendo las variedades Branquita y Manzanilla las más ricas en polifenoles con más de 11000 mg/kg en alpeorujo fresco, mientras que Arbequina y Gordal mostraron los valores más bajos inferiores a 2000 mg/kg de alpeorujo fresco en el caso de la variedad Gordal.
Ejemplo 5: Determinación de la toxicidad de los NADES ácidos en estudio sobre bacterias fitopatógenas y la actividad antimicrobiana de extractos fenólicos obtenidos mediante estos NADES a partir de alpeorujos frescos.
Se analizó la toxicidad in vitro de los NADES 3 de base acídica (ácido cítrico/fructosa) sobre bacterias fitopatógenas de interés agronómico. Se determinó la actividad antimicrobiana de los extractos fenólicos obtenidos con los NADES 3 de alpeorujos frescos de las variedades Picual, Manzanilla y Branquita.
Los análisis de toxicidad y actividad antimicrobiana se realizaron con cepas obtenidas de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Pseudomonas savastanoi CECT 5019, Pseudomonas syringae CECT 4429, Erwinia toletana CECT 5263, Erwinia amylovora CECT 222, Rhizobium radiobacter CECT 4119 y Xanthomonas campestris CECT 97.
Para cada experimento se incubó la cepa en condiciones de aerobiosis en agitación a 29 °C durante 24 h con lo que se obtuvieron caldos con valores aproximados de 109 UFC/mL. La determinación de la capacidad antimicrobiana de los extractos se realizó calculando la mínima capacidad inhibitoria (MIC) mediante dilución seriada de los extractos en placas de microtitulación de 96 pocilios, se realizaron las diluciones correspondientes para obtener 106 UFC/mL por pocilio.
Para el análisis de toxicidad de los NADES, se compararon los efectos de los NADES 3 a pH ácido inicial, que es el pH original del NADES, y ajustado a pH 5,5 - 6 con NaHCO3. El ajuste de pH se llevó a cabo para evitar un medio excesivamente ácido incompatible para el desarrollo óptimo bacteriano. Se incluyeron además otros disolventes control convencionales como glicerol de baja toxicidad y utilizado para la crioconservación de bacterias y dimetilsulfóxido (DMSO) también considerado de baja toxicidad. Considerando que un disolvente muestra baja toxicidad cuando no inhibe el crecimiento de los microorganismos a una concentración en el medio de cultivo igual o superior al 10%. Se usó también etanol que es un disolvente tóxico frente a bacterias, estos 3 disolventes nos permiten establecer comparaciones con los NADES objeto de este estudio. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 7.
En todos los casos, se observó que los NADES 3 ajustados a pH 5,5 - 6 no resultaron tóxicos frente a las cepas del género Erwinia, E. amyiovora y E. toletana incluso sin ajustar el pH. A continuación, se estudió el efecto sobre el crecimiento bacteriano de NADES 3 a pH ajustado a 5,5-6 y de dos disolventes convencionales de baja toxicidad, glicerol y dimetilsulfóxido (DMSO) como controles positivos, más etanol (EtOH) que se usó como control negativo por su toxicidad frente a bacterias (Figura 7b).
NADES 3 a pH ajustado presentó menor o igual toxicidad que los controles positivos para las cepas del género Erwinia, fue menos tóxico que DMSO en todos los casos excepto para X. campestris que mostró la misma toxicidad y que R. radiobacter en el que fue más tóxico.
Se determinó la actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos mediante NADES 3 de las tres variedades de aceitunas Manzanilla, Picual y Branquita frente a las 6 cepas fitopatógenas. El pH de los extractos fue ajustado hasta valores óptimos para el crecimiento bacteriano a pH 5,5 - 6 con NaHCCO3 Tabla. 2: Efecto bactericida (MIC) mg/L de los extractos fenólicos obtenidos con NADES 3 procedentes de las variedades de aceituna Manzanilla, Picual y Branquita sobre Pseudomonas savastanoi CECT 5019, Pseudomonas syringae CECT 4429, Erwinia toletana CECT 5263, Erwinia amylovora CECT 222, Rhizobium radiobacter CECT 4119, y Xanthomonas campestris CECT 97T(n=3). Los extractos se ajustaron a pH 5,5-6. (n=3).
Figure imgf000017_0001
* el disolvente tiene igual actividad antimicrobiana que el extracto.
** el disolvente muestra mayor actividad antimicrobiana que el extracto.
No=106 UFC/ml, n=3.
En la Tabla 2 se muestra la actividad antimicrobiana frente a las 6 cepas bacterianas de los extractos fenólicos obtenidos con NADES 3. Los microorganismos del género Erwinia, fueron los más resistentes a los extractos fenólicos de las 3 variedades, ejerciendo los extractos de Picual sobre E. toletana el mayor efecto antimicrobiano en este género. P. savastanoi, fue la cepa más sensible frente a los extractos de las 3 variedades.
Los extractos de las variedades Manzanilla y Picual fueron más inhibidores de los microorganismos que los de Branquita para todas las cepas excepto para E. amylovora, sin embargo, estos extractos contienen menor concentración fenólica total que los de la variedad Branquita, pero son más ricos en derivados secoiridoides y fenoles simples de conocido efecto antimicrobiano (Brenes, M., García, A., de los Santos, B., Medina, E., Romero, C. & de Castro, A., Romero, F. (2010). Olive glutaraldehyde-like compounds against plant pathogenic bacteria and fungí. Food Chemistry, Vol. 125, 1262-1266.).
El disolvente NADES 3 ejerce un efecto inhibidor del crecimiento de las cepas X. campestris y R. radiobacter (Tabla 2). El contenido del extracto fenólico de Manzanilla fue más tóxico que el disolvente para X. campestris, sin embargo, los extractos de Picual y Branquita mostraron la misma toxicidad que el disolvente y en el caso de R. radiobacter el disolvente resultó más tóxico que el extracto para estas dos variedades, en estos casos, no pudo evaluarse el efecto de los polifenoles sobre la viabilidad de los microorganismos por la toxicidad que exhibía NADES 3 incluso ajustado.
Estos resultados se relacionan con la capacidad bactericida de los diferentes fenoles que componen los extractos. Es bien conocido el efecto antimicrobiano de los compuestos fenólicos, especialmente de derivados de oleuropeína como oleaceina, otros secoiridoides, oleósidos, alcoholes como hidroxitirosol y en menor medida fenilpropanoides como verbascósido.
Estos resultados indican que los extractos fenólicos obtenidos con NADES 3 de las variedades Manzanilla, Picual y Branquita muestran efecto antimicrobiano sobre las cepas estudiadas, que es comparable al que exhiben otros extractos fenólicos de origen natural.
Ejemplo 6: Citotoxicidad de alpeorujos extractados con NADES en células microglía BV2 múrinas.
Se analizó la citotoxicidad in vitro de los NADES 3 de base acídica (ácido cítrico/fructosa) y de los extractos obtenidos con dichos NADES de alpeorujos frescos de las variedades Manzanilla y Branquita en células microglía BV2 múrinas con el fin de determinar su potencial como nutracéutico frente a enfermedades neuronales tales como el Alzheimer debido a sus propiedades antiinflamatorias y antioxidantes.
La figura 8 muestra el porcentaje de células vivas tras la incubación con los NADES 3 (0 compuestos fenólicos) y los extractos de alpeorujo de la variedades Manzanilla y Branquita con los NADES 3 con distintas concentraciones de compuestos fenólicos (250, 200, 150, 100, 50 y 25 μg/mL de medio celular) a pH 0 y 3. Los resultados mostraron que los NADES 3 son citotóxicos para células microglía a partir de una concentración mayor a 50-75 mg de NADES por mililitro de medio, tanto a pHO como a pH3. Sorprendentemente, el efecto citotóxico de los NADES se vio contrarrestado con los extractos de alpeorujo en ambas variedades y ambos pH. La viabilidad celular fue mayor para la variedad Manzanilla que para Branquita.
Igualmente, se aislaron los compuestos fenólicos presentes en los extractos de las variedades de Manzanilla y Branquita mediante columna de fase sólida con relleno C18 y se determinó su efecto citotóxico en las células de microglía murinas. Los compuestos fenólicos de la variedad Manzanilla mostraron un efecto citotóxico a altas concentraciones (250-150 μg/mL) en células microglía tanto a pHO como a pH3. La variedad Branquita mostró citotoxicidad para concentraciones de compuestos fenólicos de 250-100 μg/mL a ambos pH (figura 9).
Los extractos aislados con NADES 3 podrían ser utilizados a pH inicial por lo que no se produciría ninguna modificación de los compuestos fenólicos debidos a cambios de pH. Ambos extractos parecen contener unos compuestos distintos de los fenoles que están favoreciendo la viabilidad celular, contrarrestando el efecto citotóxico que los fenoles tienen de manera aislada a concentraciones altas en estas células. Este dato sugiere que los extractos de los NADES estudiados podrían permitir el uso de altas concentraciones de compuestos fenólicos evitando su factor citotóxico en células de microgía y ejerciendo así funciones antiinflamatorias y antioxidantes típicas de estos compuestos.
Ejemplo 7: Vermicom postaje de alpeorujos extractados con NADES
El alpeorujo extractado con NADES 3 presenta unas características poco deseables para la supervivencia de las lombrices debido fundamentalmente (aunque no en exclusiva) a su bajo pH y escasa porosidad. Por ello es necesario transformar el producto antes de ponerlo en contacto con las lombrices.
Para mejorar sus propiedades físicas se ensayaron diferentes mezclas con materiales porosos (restos triturados de poda leñosa y paja de cereales), concluyendo que la mezcla de paja (PAJ): alpeorujo extractado (ALE) al 50% presenta buenas características.
Para la modificación de las propiedades químicas del material, se hizo un trabajo previo con la adición de CO3Ca en diferentes proporciones. Tras 15 días de maduración, el material adquiría un pH adecuado para la supervivencia de Eisenia, pero se encarecía notablemente el manejo del residuo.
Considerando que el alpeorujo extractado es un residuo de otro proceso, el de obtención de aceite de oliva, su transformación no puede suponer elevados costes ni derivar en la obtención de un producto (el vermicompost) excesivamente caro, por lo que era necesario buscar otros procesos de transformación de las propiedades tanto físicas como químicas del producto. Atendiendo al poder tampón del estiércol se realizaron mezclas en diferentes proporciones con el alpeorujo extractado. Los resultados previos permitieron concluir que el mejor estiércol era el fresco de caballo con alta proporción de paja.
Se diseñaron 14 tratamientos, consistentes en: 4 materiales base (alpeorujo (ALP), alpeorujo extractado (ALE), paja (PAJ) y estiércol de caballo (EST); 2 mezclas de alpeorujo con paja al 50% (ALP: PAJ y ALE: PAJ); 4 mezclas de alpeorujo con estiércol en diferentes proporciones (ALP87,5:EST12,5; ALP75:EST25; ALP50:EST50; ALP25:EST75) y sus equivalentes para el alpeorujo detoxificado (ALE87,5:EST12,5; ALE75:EST25; ALE50:EST50; ALE25:EST75). Los cálculos se hicieron en base a peso seco de los materiales base.
Todos los tratamientos se sometieron a un proceso de precompostaje durante 3 semanas. Una vez concluido este periodo, se colocaron las 14 dietas diseñadas, con 6 repeticiones (5 de ellas con lombrices y una sin ellas), en recipientes de 3 litros de capacidad. Se añadieron las lombrices sobre un cordón de estiércol con una proporción que varió desde el 20 al 50% para facilitar la aceptación de la dieta. Con ello se consiguió mejorar la supervivencia de las lombrices.
Tras el análisis de los resultados obtenidos, se puede concluir que el alpeorujo extractado (ALE):
Tarda más días que ALP en alcanzar un pH adecuado en el proceso de precompostaje
Puede mezclarse en cualquiera de las proporciones con estiércol ensayadas (87,5; 75; 50 y 25%) porque se consigue alcanzar un pH adecuado para la supervivencia de las lombrices. El plazo requerido está correlacionado con la proporción de alpeorujo. Mientras el tratamiento ALE25:EST75 necesitó 15 días, ALE87,5:EST12,5 necesitó 40 días.
Tuvo un comportamiento similar al de ALP en la variable “biomasa total” de lombrices en lo referente al tiempo, con un máximo a los 4 meses de iniciada la experiencia. Los valores finales de biomasa total de lombriz fueron diferentes a nivel estadístico, con 11,9 g de lombriz en ALP frente a 6,5 g en ALE para los materiales puros, sin mezclar (Figura 10)
Ralentizó el crecimiento de las lombrices y afectó en mayor medida a las lombrices adultas que a las jóvenes
Mostró su mejor comportamiento en el tratamiento ALE75:EST25 en las variables “número total” y “biomasa total” de lombrices (Figura 11). En el caso de la “biomasa total” en el momento final de la experiencia, ALE75:EST25 no mostró diferencias significativas con ALP75:EST25 Los resultados obtenidos indican que es factible realizar el reciclaje del alpeorujo extractado (ALE) con NADES 3 mediante técnicas de vermicompostaje.
Ejemplo 8: Ensayo de estabilidad de los extractos fenólicos Se determinó la estabilidad de los extractos fenólicos obtenidos con NADES 3 de las 16 variedades de alpeorujo tras un periodo de 12 meses de almacenamiento en oscuridad a temperatura ambiente. El ensayo se realizó conservando 5 mi de cada extracto en viales cerrados. Tras el almacenamiento se determinó la presencia o ausencia de precipitación. Como resultado no se detectó precipitación en ninguno de los extractos y se concluyó en que eran estables a las condiciones de ensayo.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para la obtención de un extracto fenólico procedente de alpeorujo que comprende las siguientes etapas: i. preparación de disolventes eutécticos naturales (NADES) seleccionados de ácido cítrico y fructosa en relación 1:1 p/p, con un contenido de entre el 8% y el 35% en peso de agua; y ii. adición de los NADES de la etapa (i) al alpeorujo en una relación alpeorujo: NADES comprendido entre 5:1 a 1:5 p/p, agitando durante un tiempo de entre 10 minutos a 6 horas, a una temperatura de entre 20 °C y 90 °C, y centrifugando entre 1.000 g y 17.000 g para separar la fase de extracto fenólico con los disolventes del alpeorujo extractado (ALE).
2. El procedimiento según la reivindicación 1 , en donde la etapa (ii) se repite una o más veces.
3. Extracto fenólico procedente de alpeorujo obtenido por el procedimiento descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
4. Uso del extracto fenólico según la reivindicación 3, como nutracéutico, aditivo alimentario o fitosanitario.
5. El uso según la reivindicación 4, como fitosanitario en el tratamiento de enfermedades microbianas de plantas, preferiblemente para el tratamiento de enfermedades microbianas de plantas causadas por las bacterias de los géneros, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas y Rhizobium
6. Alpeorujo extractado (ALE) obtenido por el procedimiento descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
7. Uso del alpeorujo extractado (ALE) según la reivindicación 6, como suplemento orgánico para compostaje y vermicompostaje.
8. El uso del alpeorujo extractado (ALE) según la reivindicación 7, como suplemento orgánico para vermicompostaje caracterizado por que se lleva a cabo un tratamiento del ALE con lombrices de la especie Eisenia fetida.
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