WO2021167497A1 - Генотерапевтический днк-вектор - Google Patents

Генотерапевтический днк-вектор Download PDF

Info

Publication number
WO2021167497A1
WO2021167497A1 PCT/RU2021/000073 RU2021000073W WO2021167497A1 WO 2021167497 A1 WO2021167497 A1 WO 2021167497A1 RU 2021000073 W RU2021000073 W RU 2021000073W WO 2021167497 A1 WO2021167497 A1 WO 2021167497A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
dna vector
gene therapy
ifna2
ifna14
Prior art date
Application number
PCT/RU2021/000073
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Антон ГАМОЛСКИ
Original Assignee
Генетик Диагностикс Энд Терапи 21 Лтд
Общество, С Ограниченной Ответственностью "Рекомбитех"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Генетик Диагностикс Энд Терапи 21 Лтд, Общество, С Ограниченной Ответственностью "Рекомбитех" filed Critical Генетик Диагностикс Энд Терапи 21 Лтд
Publication of WO2021167497A1 publication Critical patent/WO2021167497A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Definitions

  • the invention relates to genetic engineering and can be used in biotechnology, medicine and agriculture to create gene therapy drugs.
  • the expression of a gene means the production of a protein molecule with a specific amino acid sequence determined by the nucleotide sequence of this gene.
  • cytokines type I interferons
  • cytokines exhibit antiviral and antitumor activity and are an important component of innate immunity, and are also involved in cell differentiation.
  • Contact with pathogens leads to secretion of interferon I a type that binds to the corresponding receptor complex, which leads to the activation of transcription of genes for chemokines and pro-inflammatory cytokines.
  • interferon I a type that binds to the corresponding receptor complex, which leads to the activation of transcription of genes for chemokines and pro-inflammatory cytokines.
  • knockout mice for this interferon there is a violation of the maturation of the B cell link of immunity and an increase in susceptibility to viral infection.
  • Type I interferons include two groups of proteins, IFN-a and b, which have a variety of immunoregulatory functions that provide a link between innate and adaptive immune responses.
  • IFN-a / b The participation of IFN-a / b in the induction of MHC class I expression and activation of NK cells, as well as in the regulation of the expression of other cytokines has been shown.
  • type I interferons Based on the data of modern world literature, the following mechanism of action of type I interferons is known: in a controlled viral infection, not strongly expressed and mediated inducers, the functioning of type I interferons is not a systemic, but a local effect.
  • IFN-g is produced by CD4 T cells, including when antigens are exposed in the MHC I of CD8 T cells.
  • IFNB1 antiviral properties make it possible to control the replication of retroviruses, including HIV.
  • HIV infection of mononuclear cells of patients with already expressed IFNB1 gene resulted in suppression of HIV replication in comparison with control cells.
  • the transplantation of these cells into mice suppressed HIV replication to a level undetectable by standard methods in 40% of animals (Vieillard V et al., 1999). Similar data were obtained in work on primates (Gay W et al., 2004).
  • IFNB1 antitumor activity of IFNB1 was shown experimentally by transfection of human glioma cells with an IFNB1 expression plasmid vector, which resulted in an effective suppression of the proliferative activity of cells in culture (Mizuno M et al., 1990).
  • IFNB1 expression plasmid vector which resulted in an effective suppression of the proliferative activity of cells in culture.
  • IFNB1 modified cells have also been shown in a mouse model of metastatic choriocarcinoma (Kim GS et al., 2018).
  • Other pathologies in which IFNB1 is implicated are autoimmune diseases, with particular emphasis on multiple sclerosis (MS).
  • MS multiple sclerosis
  • PC IFNB1 therapy is the main one (Rebif, Betaseron, Avonex, etc.).
  • the use of gene therapy constructs with the IFNB1 gene seems to be a promising approach in the treatment of MS (Hamana A et al., 2018).
  • IFNB1 in nervous tissue also plays a role in the pathogenesis of Parkinson's disease.
  • IFNA14, IFNA2 are responsible for the expression of cytokines IFN-a subtypes 14 and 2, also related to type I interferons, which bind to the same type I interferon receptor (IFNAR), while the affinity for it within this group of interferons differs , which is associated with the induction of various signaling pathways.
  • IFNAR type I interferon receptor
  • IFN-a2 can play the role of the pathogenetically significant subtype itself. Although in this study, only six subtypes of IFN-a were analyzed using the HIV-1 strain implemented in laboratory studies (Sperber SJ et al., 1992). In another study, it was shown that there is an inverse relationship between the expression of IFN-a subtypes and the effectiveness of in vitro suppression of HIV-1 replication. with IFN-ab, -a14 and -a8 (Harper et al., 2015). Plasmid vectors expressing various subtypes of IFN-I demonstrated the longest suppressing HIV replication effect in mice receiving plasmids expressing the IFNB1 and IFNA14 genes (Abraham S et al., 2016).
  • each of the subtypes can be used to treat various pathologies of the immune system.
  • IL-12 Another cytokine, IL-12, which is pro-inflammatory, is expressed by dendritic cells, macrophages and B cells in response to infectious agents or tumor antigens.
  • the genes IL12A, IL12B encode the corresponding subunits - p35 and p40. Its induction stimulates the production of IFN-g by T cells and leads to the potentiation of antigen presentation antigen-presenting cells, stimulating, in turn, the differentiation of TH1 cells. In addition, it can induce the expression of IFN-g in NK cells.
  • the clinical manifestation of many infections depends on the ability of the agent to induce IL-12 production. In particular, infection with Candida albicans activates the synthesis of IL-12, which contributes to the further effective protection of cells from the pathogen.
  • HIV on the contrary, suppresses the expression of IL-I2, causing numerous disorders of the cellular immune link.
  • Leishmanias behave similarly, suppressing the synthesis of IL-12, which contributes to the chronicity of the infection.
  • Selective suppression of IL-12 production, while maintaining the expression of other pro-inflammatory cytokines, such as IL-1, TNF-a leads to long-term persistence of pathogens in the host organism (Okwor I, Uzonna JE., 2016).
  • the researchers proposed a gene therapy method using IL-12 expressing plasmid vectors to obtain a protective effect against leishmania and trypanosome lesions (Sakai T et al., 2000).
  • IL-12-mediated stimulation of TM made it possible to use it as a vaccine in gene therapy constructs for an immunomodulatory effect (Tapia E et al., 2003).
  • pathologies such as multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, primary biliary cirrhosis, Behcet's disease, celiac disease, Sjogren's syndrome, mutations associated with the IL12A, IL12B genes have been found.
  • the antitumor effect of IL-12 in a gene therapy approach, stimulating dendritic cells and, as a consequence, restoring antitumor immunity has been studied in a number of works (Razi Soofiyani S et al., 2016).
  • Denies et al. showed an antitumor effect using a plasmid vector expressing IL-12 in combination with antitumor adjuvant vaccination (Denies S et al., 2014). Due to the fact that the p40 subunit is part of a number of other cytokines from the IL-12 family, modulation of IL12B gene expression using a gene therapy approach offers potential opportunities to influence pathologies associated with insufficient expression of cytokines such as IL-23, IL-27 (Waldner MJ , Neurath MF, 2009).
  • the prior art indicates that the genes IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B have the potential to correct a number of abnormalities, including, but not limited to, infectious, autoimmune diseases, cancer, hereditary and acquired pathological conditions, as well as the need modulation of the immune response.
  • This is due to the combination of genes IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B within the framework of this patent into a group of genes.
  • Genetic constructs providing the expression of proteins encoded by genes from the group IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B can be used for development of drugs for the prevention and treatment of various diseases and pathological conditions.
  • these data indicate that insufficient expression of proteins encoded by the IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B genes included in the group of genes is associated not only with pathological conditions, but also with a predisposition to their development. Also, the given data indicate that insufficient expression of these proteins may not manifest itself explicitly in the form of pathology, which can be unambiguously described within the existing standards of clinical practice (for example, using the ICD code), but at the same time cause conditions that are unfavorable for humans and animals and are associated with a deterioration in the quality of life.
  • Gene therapy vectors are divided into viral, cellular and DNA vectors (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal Products EMA / CAT / 801 83/2014). Recently, in gene therapy, more and more attention is paid to the development of non-viral systems for the delivery of genetic material, among which plasmid vectors are in the lead. Plasmid vectors are free from the disadvantages inherent in cellular and viral vectors.
  • plasmid vectors for gene therapy are: 1) the presence of antibiotic resistance genes for production in bacterial strains, 2) the presence of various regulatory elements represented by the sequences of viral genomes, 3) the size of the therapeutic plasmid vector, which determines the efficiency of vector penetration into target cell It is known that the European Medicines Agency considers it necessary to avoid the introduction of antibiotic resistance markers into developing plasmid vectors for gene therapy (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011 EMA / CAT / GTWP / 44236/2009 Committee for advanced therapies).
  • This recommendation is associated, first of all, with the potential danger of penetration of the DNA vector or horizontal transfer of antibiotic resistance genes into the cells of bacteria present in the body as part of normal or opportunistic microflora.
  • the presence of antibiotic resistance genes significantly increases the size of the DNA vector, which leads to a decrease in the efficiency of its penetration into eukaryotic cells.
  • antibiotic resistance genes also make a fundamental contribution to the method of obtaining DNA vectors.
  • strains for the production of DNA vectors are usually cultivated in a medium containing a selective antibiotic, which creates the risk of the presence of trace amounts of antibiotic in insufficiently purified preparations of DNA vectors.
  • obtaining DNA vectors for gene therapy which lack genes for antibiotic resistance, is associated with obtaining strains with such a distinctive feature as the ability to stably amplify target DNA vectors in a medium without antibiotics.
  • the European Medical Agency recommends avoiding the presence of regulatory elements in the composition of therapeutic plasmid vectors to increase the expression of target genes (promoters, enhancers, post-translational regulatory elements), which are the nucleotide sequences of the genomes of various viruses (Draft Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products, http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library / Scientific_guideline / 2015/05 / WC500187020.pdf). These sequences, although they can increase the level of expression of the target transgene, however, pose a risk recombination with the genetic material of wild-type viruses and integration into the genome of a eukaryotic cell. Moreover, the feasibility of overexpression of a particular gene for therapy purposes remains an unresolved issue.
  • the size of the therapeutic vector is essential. It is known that modern plasmid vectors are often overloaded with non-functional regions that seriously increase the size of the vector (Mairhofer J, Grabherr R. // Mol Biotechnol. Lo 2008.39 (2): 97-104).
  • the ampicillin resistance gene in vectors of the pBR322 series as a rule, consists of at least 1000 bp, which is more than 20% of the size of the vector itself.
  • an inverse relationship is observed between the size of the vector and its ability to penetrate into eukaryotic cells - DNA vectors with a small size penetrate more effectively into human and animal cells.
  • a DNA vector for the sake of safety and maximum efficiency, 25 preference should be given to those constructs that do not contain antibiotic resistance genes, sequences of viral origin and the size of which allows efficient penetration into eukaryotic cells.
  • the strain for obtaining such a DNA vector in quantities sufficient for gene therapy purposes must provide the possibility of stable amplification of the DNA vector using nutrient media that do not contain antibiotics.
  • the vector is a supercoiled plasmid DNA vector and is intended for the expression of cloned genes in animal and human cells.
  • the vector consists of the origin of replication, regulatory elements, including the promoter and enhancer of human cytomegalovirus, regulatory elements from T-15 lymphotropic human virus.
  • the accumulation of the vector is carried out in a special strain of E. coli without the use of antibiotics due to antisense complementation of the sacB gene introduced into the strain by means of a bacteriophage.
  • the disadvantage of this invention is the presence of regulatory elements in the DNA vector, which are sequences of viral genomes.
  • the prototypes of the present invention in terms of the use of gene therapy approaches to increase the level of expression of genes from the group IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B are the following applications.
  • US Pat. No. 4,808,523A discloses a plasmid vector carrying a gene encoding IFNB1.
  • This vector allows you to increase expression of IFNB1 in mammalian cells.
  • the disadvantage of this invention is the method of use, limited to the production of IFNB1 protein in vitro and different from the gene therapy use of this vector. Also, the disadvantage of this invention is the presence in the vector of sequences of viral origin.
  • Patent RU2678756 describes a gene therapy DNA vector VTvaf17, a method for its production, an Escherichia coli SCSI 10-AF strain, a method for its production, an Escherichia coli SCSI 10-AF / VTvaf17 strain carrying a gene therapy DNA vector VTvaf17, a method for its production.
  • the disadvantage of this invention is the significant size of the vector part, which can negatively affect the efficiency of delivery of the DNA vector into cells.
  • US20040203118A1 discloses polynucleotides encoding various IFNA14 variants, as well as a therapeutic agent that is a vector expressing various IFNA14 variants.
  • the disadvantage of this invention is the ambiguity of the purposes of using this invention and the uncertain requirements for the safety of the vectors used.
  • Application CN101304758A describes a nucleotide sequence encoding IFNA2, as well as a vector expressing this sequence for the treatment of various diseases associated with impaired expression of this gene.
  • the disadvantage of this invention is the uncertainty of the safety requirements of the vector used.
  • US Pat. No. 5,723,127A describes a method for using IL12 protein for therapeutic immunomodulation, in particular as an adjuvant.
  • the disadvantage of this invention is the use of the IL12 protein instead of a gene therapy vector expressing the gene encoding the IL12 protein. Disclosure of invention
  • the objective of the invention is to design gene therapy DNA vectors to increase the level of expression of the IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B gene group in humans and animals, combining the following properties:
  • the object of the invention is also the design of strains carrying these gene therapy DNA vectors for the development and production on an industrial scale of gene therapy DNA vectors.
  • the task is solved due to the fact that a gene therapeutic DNA vector based on the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 has been created for the treatment of diseases characterized by impaired innate and adaptive immunity, for the therapy of autoimmune, oncological, viral diseases associated with an imbalance of the immune system, for immunomodulation, including during antitumor vaccination as a gene therapeutic adjuvant, while the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 contains the coding part of the target gene IFNB1, cloned into the gene therapeutic DNA vector
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 contains the coding portion of the target IFNA14 gene cloned into a gene therapy DNA vector
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 contains the coding portion of the target IFNA2 gene cloned into a gene therapy DNA vector
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A contains the coding portion of the target IL12A gene cloned into the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12, with the nucleotide sequence SEQ ID N ° 4
  • gene therapy DNA -vector GDTT1.8NAS12-IL12B contains the coding part of the target gene IL12B, cloned into a gene therapy DNA vector
  • GDTT1.8NAS12 with nucleotide sequence SEQ ID NQ5.
  • GDTT 1.8NAS12-IFNB1 As part of each of the created gene therapy DNA vectors: GDTT 1.8NAS12-IFNB1, or GDTT1 .8NAS12-IFNA14, or GDTT1.8NAS12-IFNA2, or GDTT1 .8NAS12-IL12A, or GDTT1.8NAS12-IL12B nucleotide sequences are used as structural elements , which are not genes of antibiotic resistance, viral genes and regulatory elements of viral genomes, ensuring the possibility of its safe use for genetic therapy of humans and animals.
  • DNA vectors based on the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target gene IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B which consists in the fact that each of the gene therapy DNA vectors: GDTT1.8NAS12-IFNB1, or GDTT1.8NAS12-IFNA14 , or GDTT1.8NAS12-IFNA2, or GDTT1.8NAS12-IL12A, or GDTT1.8NAS12-IL12B are obtained as follows: the coding portion of the target gene IFNB1, or IFNA14, or IFNA2, or IL12A, or IL12B is cloned into the gene therapy DNA vector GDTT1.
  • TTT GTCG ACT WITH AGTTTCGG AGGT AACCT GT AAGT CTG, and cleavage of the amplification product and cloning of the coding part of the IFNB1 gene into the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 is carried out using restriction endonucleases BamHI and Sail, and when obtaining gene therapeutic IFNT1 DNA vector GAS14.
  • oligonucleotides are used as the oligonucleotides created for this IFNA 14-Fw TTT GG AT CC ACC AT GGC ATT GCCCTTT GCTTT AAT IFNA14-RV TTT GTCGACT C AATCCTTCCTCCTT AAT CTTTTTTGC, and cleavage of the amplification product and cloning of the coding part of the IFNA14 gene into gene therapy with a restriction DNA vector GAS Sail, and when obtaining the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2, SEQID Ns3 for carrying out the reverse transcription reaction and PCR amplification, oligonucleotides IFNA2-FW are used as oligonucleotides created for this IFNA 14-Fw TTT GG AT CC ACC AT GGC ATT GCCCTTT GCTTT AAT IFNA14-RV TTT GTCGACT C AATCCTTCCTCCTT AAT CTTTTTTGC, and cleavage
  • cleavage of the amplification product and cloning of the coding part of the IFNA2 gene into the gene therapeutic DNA endon GDTT is carried out using the gene therapeutic DNA endon GDTT.
  • oligonucleotides are used as oligonucleotides created for this
  • DNA vector GDTT1.8NAS12 is carried out using restriction endonucleases Sail and Kpnl, and when obtaining gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12B, SEQID N ° 5 for carrying out the reaction of reverse transcription and PCR amplification, oligonucleotides IL12B are used as oligonucleotides created for this up
  • a method has been created for using a gene therapy DNA vector based on a gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target gene IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B for the treatment of diseases characterized by impaired innate and adaptive immunity, for the treatment of autoimmune, oncological, viral diseases associated with with an imbalance of the immune system, for immunomodulation, including during antitumor vaccination as a gene therapeutic adjuvant, which consists in transfection with a selected gene therapeutic DNA vector carrying the target gene based on the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12, or several selected gene therapeutic DNA target vectors carrying genes based gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12, from created gene therapy DNA vectors carrying target genes based on gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12, cells of organs and tissues of a patient or animal, and / or in the introduction into organs and tissues of a patient or animal autologous cells of this patient or animal transfected with the selected gene therapy DNA vector carrying the target gene based on the gene therapy
  • systems, for immunomodulation including during antitumor vaccination as a gene therapeutic adjuvant, which consists in obtaining electrocompetent cells of the Escherichia coli JM 110-NAS strain, followed by electroporation of these cells with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1, or DNAT1 vector GDNB1 -IFNA14, or DNA vector GDTT1.8NAS12- IFNA2, or DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A, or DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12B, after which the cells are plated on Petri dishes with agar selective medium containing yeast extract, peptone , 6% sucrose, and 10 ⁇ g / ml chloramphenicol, resulting in Escherichia coli strain JM110-NAS
  • NAS / GDTT1.8NAS12-IFNB1 carrying the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 for its development with the possibility of selection without the use of antibiotics when obtaining a gene therapeutic DNA vector or the Escherichiacoli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IFNA14 carrying DNA -vector GDTT1.8NAS12-IFNA14, for its development with the possibility of selection without the use of antibiotics when obtaining a gene therapeutic DNA vector or the Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IFNA2 carrying a gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12- IFNA2, for its production with the possibility of selection without the use of antibiotics when obtaining a gene therapeutic DNA vector, or the Escherichia coli JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IL12A strain, carrying the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A, for its production with the possibility of selection without the use of antibiotics in the preparation of a gene
  • Figure 1 shows a diagram of a gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying a target gene selected from the group of genes IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B, which is a circular double-stranded DNA molecule capable of autonomous replication in Escherichia coli cells.
  • Figure 1 shows the diagrams corresponding to:
  • EFIa pr is the promoter region of the human elongation factor EF1 A gene with its own enhancer contained in the first intron of the gene. Serves to ensure a high level of transcription of the recombinant gene in most human tissues;
  • the target gene reading frame corresponding to the coding portion of the gene IFNB1 (Fig. 1A), or IFNA14 (Fig. 1B), or IFNA2 (Fig. 1C), or IL12A (Fig. 1D) or IL12B (Fig. 1E), respectively; hGH TA - transcription terminator; pUCori - origin of replication, which serves for autonomous replication with a single nucleotide substitution to increase the copy number of the plasmid in the cells of most Escherichia coli strains; RNAout is a regulatory element of the RNA-out transposon Tn 10, which provides the possibility of positive selection without the use of antibiotics when using the Eshcerichia coli JM110NAS strain.
  • Figure 2 shows the graphs of the accumulation of cDNA amplicons of the target gene, namely the IFNB1 gene, in the primary culture of human lung fibroblast cells (ATCC PCS-201-020) before their transfection and 48 hours after transfection of these cells with the gene therapeutic DNA vector GDTT1 .8NAS12-IFNB1 to assess the ability to enter eukaryotic cells and functional is activity, that is, the expression of the target gene at the mRNA level.
  • the target gene namely the IFNB1 gene
  • Figure 2 shows the curves of accumulation of amplicons during the reaction, corresponding to:
  • the human B2M gene (Beta-2-microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene.
  • FIG. 3 shows the graphs of the accumulation of cDNA amplicons of the target gene, namely the IFNA14 gene, in the culture of human lung adenocarcinoma cells SK-LU-1 (ATCC ® ⁇ -57 TM ) before their transfection and 48 hours after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12 -IFNA14 in order to assess the ability to penetrate into eukaryotic cells and functional activity, that is, the expression of the target gene at the mRNA level.
  • the target gene namely the IFNA14 gene
  • Fig. 3 shows the accumulation curves of amplicons during the reaction, corresponding to:
  • FIG. 4 shows graphs of accumulation of cDNA amplicons of the target gene, namely the IFNA2 gene in human bronchial epithelial cells BZR (ATCC ® CRL-9483 TM ) before their transfection and 48 hours after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 with the purpose of assessing the ability to penetrate into eukaryotic cells and functional activity, that is, the expression of the target gene at the mRNA level.
  • Figure 4 shows the accumulation curves of amplicons during the reaction, corresponding to:
  • the human B2M gene (Beta-2-microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene.
  • Figure 5 shows the graphs of the accumulation of cDNA amplicons of the target gene, namely the IL12A gene, in the human umbilical vein endothelial cell culture HUVEC (ATCC ® PCS-1 00-010 TM ) before their transfection and 48 hours after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12- IL12A in order to assess the ability to penetrate into eukaryotic cells and functional activity, that is, the expression of the target gene at the mRNA level.
  • the target gene namely the IL12A gene
  • Figure 5 shows the accumulation curves of amplicons in the course of the reaction, corresponding to:
  • the human B2M gene (Beta-2-microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene.
  • Fig. 6 shows the graphs of the accumulation of cDNA amplicons of the target gene, namely the IL12B gene, in the cell culture of human skeletal myoblasts HSkM before their transfection and 48 hours after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12B in order to assess the ability to penetrate into eukaryotic cells and functional activity , that is, the expression of the target gene at the mRNA level.
  • Figure 6 shows the curves of accumulation of amplicons in the course of the reaction, corresponding to:
  • the human B2M gene (Beta-2-microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene.
  • Fig. 7 shows a diagram of the concentration of the IFNB1 protein in the cell lysate of the primary culture of human lung fibroblasts cells (ATCC PCS-201-020) after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 in order to assess the functional activity, that is, expression at the protein level, by changing the amount IFNB1 protein in the cell lysate.
  • Figure 7 shows the following elements: culture A - primary culture of human lung fibroblast cells transfected with an aqueous solution of dendrimers without plasmid DNA (control), culture B - primary culture of human lung fibroblast cells transfected with a DNA vector
  • GDTT1 .8NAS12 culture C - primary culture of human lung fibroblast cells transfected with a DNA vector
  • FIG. 8 shows a diagram of the concentration of IFNA14 protein in the lysate of human lung adenocarcinoma cells SK-LU-1 (ATCC ® TM
  • Fig. 8 the following elements are marked: culture A - human lung adenocarcinoma cells SK-LU-1 transfected with an aqueous solution of dendrimers without plasmid DNA (control), culture B - human lung adenocarcinoma cells SK-LU-1 transfected with a DNA vector
  • GDTT1.8NAS12 culture C - human lung adenocarcinoma cells SK-LU-1 transfected with a DNA vector
  • Figure 9 shows a diagram of the concentration of IFNA2 protein in the lysate of a culture of human bronchial epithelial cells BZR (ATCC ® CRL-9483 TM ) after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene at the level protein, and the possibility of increasing the level of protein expression using a gene therapeutic DNA vector based on the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target IFNA2 gene.
  • Figure 9 shows the following elements: culture A - culture of BZR human bronchial epithelium cells transfected with an aqueous solution of dendrimers without plasmid DNA (control), culture B - culture of human bronchial epithelial cells BZR transfected with the DNA vector GDTT1 .8NAS12, culture C - culture of BZR human bronchial epithelium cells transfected with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2.
  • FIG. 10 shows a diagram of the IL12A protein concentration in the lysate of the human umbilical vein endothelial cell culture HUVEC (ATCC ® PCS-100-010 TM ) after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene at the level protein, and the possibility of increasing the level of protein expression using a gene therapeutic DNA vector based on the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target IL12A gene.
  • Figure 10 shows the following elements: culture A - culture of human umbilical vein endothelial cells HUVEC transfected with an aqueous solution of dendrimers without plasmid DNA (control), culture B - culture of human umbilical vein endothelial cells HUVEC transfected with a DNA vector
  • GDTT1.8NAS12 culture C - culture of human umbilical vein endothelial cells HUVEC transfected with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A.
  • FIG. 11 shows a diagram of the concentration of IL12B protein in the lysate of human skeletal myoblast cell culture HSkM (Gibco, Cat., N ° A12555) after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12B in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene at the protein level, and the possibility of increasing the level of protein expression using a gene therapeutic DNA vector based on gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target IL12B gene.
  • Figure 10 shows the following elements: culture A - cell culture of human skeletal myoblasts HSkM transfected with an aqueous solution of dendrimers without plasmid DNA (control), culture B - culture of cells of human skeletal myoblasts HSkM transfected with the DNA vector GDTT1.8NAS12, culture C - cell culture of human skeletal myoblasts HSkM transfected with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12B.
  • FIG. 12 shows a diagram of the IL12A protein concentration in skin biopsies of three patients after the gene therapy DNA vector was injected into the skin of these patients.
  • GDTT1.8NAS12-IL12A in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene at the protein level, and the possibility of increasing the level of protein expression using a gene therapeutic DNA vector based on the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target gene IL12A.
  • the following elements are marked:
  • FIG. 13 shows a diagram of the concentration of IFNA2 protein in biopsies of the gastrocnemius muscle of three patients after the introduction of the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 into the gastrocnemius muscle of these patients, with the purpose of assessing the functional activity, that is, the expression of the target gene at the protein level, and the possibility of increasing the level of protein expression using a gene therapeutic DNA vector based on the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target IFNA2 gene.
  • GDTT1.8NAS12- IFNA2 P3II - biopsy specimen of the gastrocnemius muscle of the patient PZ in the area of injection of gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo),
  • Fig. 14 shows a diagram of the concentration of IFNA14 protein in skin biopsies of three patients after the introduction of a gene therapy DNA vector into the skin of these patients
  • GDTT1.8NAS12-IFNA14 in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene at the protein level, and the possibility of increasing the level of protein expression using a gene therapy DNA vector based on the is gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target reH-IFNA14.
  • FIG. 15 is a diagram of the concentration of IFNA14 protein in human skin biopsies after the introduction into the skin of a culture of autologous fibroblasts transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 in order to demonstrate the method of application by introducing autologous cells transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14
  • FIG. 16 shows a diagram of the concentrations of proteins: human IFNB1 protein, human IFNA14 protein, human IFNA2 protein, human IL12A protein, human IL12B protein in the muscle tissue of three Wistar rats after injection of a mixture of gene therapy vectors: gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1, gene therapy DNA vector, GDTT1.8NAS12-IFNA14, gene therapy DNA vector, GDTT1.8NAS12-IFNA2, gene therapy DNA vector, GDTT1 .8NAS12-IL12A, gene therapy DNA vector, GDTT1.8NAS12-IL12B to demonstrate the method of application, mixture of gene therapy DNA vectors.
  • Fig.16 the following elements are marked:
  • K1I - a fragment of K1 rat muscle tissue in the injection zone of a mixture of gene therapy DNA vectors: GDTT1.8NAS12- IFNB1, GDTT1.8NAS12- IFNA14, GDTT1.8NAS12- IFNA2, GDTT1.8NAS12- IL12A and GDTT1.8NAS12- IL12B,
  • K1II a fragment of K1 rat muscle tissue in the area of injection of gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo), K1 III - a fragment of muscle tissue from the intact control area of the K1 rat,
  • K2I - a fragment of K2 rat muscle tissue in the injection zone of a mixture of gene therapy DNA vectors: GDTT1.8NAS12- IFNB1, GDTT1 .8NAS12- IFNA14,
  • GDTT1.8NAS12- IFNA2 GDTT1.8NAS12- IL12A and GDTT1.8NAS12- IL12B
  • K2II - a fragment of K2 rat muscle tissue in the area of injection of gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo),
  • K2III - a fragment of muscle tissue from the control intact area of the K2 rat
  • K3I - a fragment of the muscle tissue of the KZ rat in the injection zone of a mixture of gene therapy DNA vectors: GDTT1.8NAS12- IFNB1, GDTT1.8NAS12- IFNA14,
  • GDTT1.8NAS12- IFNA2 GDTT1.8NAS12- IL12A and GDTT1.8NAS12- IL12B
  • K3II - a fragment of the muscle tissue of the KZ rat in the area of injection of gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo),
  • K3III - a fragment of muscle tissue from the control intact area of the K3 rat.
  • FIG. 17 shows the graphs of accumulation of cDNA amplicons of the target IFNA2 gene in bovine pulmonary artery endothelial cells CPAE (ATCC ® CCL-209) before and 48 hours after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 for the purpose of demonstration of the method of application by introducing a gene therapy DNA vector to animals
  • Figure 17 shows the accumulation curves of amplicons during the reaction, corresponding to: 1 - cDNA of the IFNA2 gene in the endothelial cells of the pulmonary artery of the bovine CPAE before transfection with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2,
  • bovine / bovine actin (ACT) gene listed in the GenBank database under the number AH001130.2 was used as a reference gene.
  • each gene therapy DNA vector carrying the target genes consists in the fact that the polylinker of the gene therapy DNA vectors GDTT1.8NAS12 clone the protein-coding sequence of the target gene selected from the group of genes: IFNB1 gene (encodes IFNB1 protein), IFNA14 gene (encodes IFNA14 protein), IFNA2 gene (encodes IFNA2 protein), IL12A gene (encodes IL12A protein) , human IL12B gene (encodes IL12B protein).
  • IFNB1 gene encodes IFNB1 protein
  • IFNA14 gene encodes IFNA14 protein
  • IFNA2 gene encodes IFNA2 protein
  • IL12A gene encodes IL12A protein
  • human IL12B gene encodes IL12B protein
  • DNA vectors it is known that the ability of DNA vectors to penetrate into eukaryotic cells is mainly determined by the size of the vector. At the same time, DNA vectors with the smallest size have a higher penetrating ability. Thus, it is preferable that the vector contains no elements that do not carry a functional load, but at the same time increase the size of the DNA vector.
  • DNA vectors were taken into account when obtaining a gene therapeutic DNA vector based on a gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying a target gene selected from the group of genes IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B due to the absence of large non-functional sequences and genes in the vector antibiotic resistance, which made it possible, in addition to technological advantages and advantages in terms of safety of use, to significantly reduce the size of the obtained gene therapy DNA vector
  • GDTT1.8NAS12 carrying a target gene selected from the group of genes IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B.
  • DNA vector GDTT 1.8NAS12-IFNB1, or GDTT1.8NAS12-IFNA14, or GDTT1.8NAS12-IFNA2, or GDTT1.8NAS12-IL12A, or GDTT1.8NAS12-IL12B was obtained as follows: gene IFNB1, or IFNA14, or IFNA2, or IL12A, or IL12B was cloned into the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 and the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1, SEQ ID NQ1, or GDTT1.8NAS12-IFNA14, SEQ ID N ° 2 or GDTT 1.8NAS12-IFNA2, SEQ ID Ne3, or GDTT1.8NAS12-IL12A, SEQ ID No.
  • the coding part of the 564 bp IFNB1 gene, or the 570 bp IFNA14 gene, or the 567 bp IFNA2 gene, or the 762 bp IL12A gene, or the 987 bp IL12B gene. was obtained by isolating total RNA from a biological tissue sample of a healthy person. The reverse transcription reaction was used to obtain the first cDNA strand of the human IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B genes. Amplification was carried out using oligonucleotides created for this by the method of chemical synthesis.
  • Cleavage of the amplification product with specific restriction endonucleases was carried out taking into account the optimal procedure for further cloning, and cloning into the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 was performed at the restriction sites BamHI, EcoRI, Hindlll, Kpnl, Sail located in the polylinker of the GDTT1.8NAS12 vector.
  • the choice of restriction sites was carried out in such a way that the cloned the fragment fell into frame of reference of the expression cassette of the vector GDTT1.8NAS12, while the protein-coding sequence did not contain restriction sites for the selected endonucleases.
  • oligonucleotides can be used to amplify the gene IFNB1, or IFNA14, or IFNA2, or IL12A, or IL12B, various restriction endonucleases, or laboratory techniques such as ligase-free gene cloning.
  • Gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1, or GDTT 1.8NAS1 2-IFNA14, or GDTT1.8NAS12-IFNA2, or GDTT1 .8NAS12-IL12A, or GDTT1 .8NAS12-IL12B has the nucleotide sequence SEQ ID Ns1, or SEQ ID Ns1, or SEQ ID Ns1 2, OR SEQ ID Ns3, or SEQ ID N ° 4, or SEQ ID N Q 5, respectively.
  • the scope of the present invention also includes variants of nucleotide sequences that differ by insertion, deletion or substitution of nucleotides that are not lead to a change in the polypeptide sequence encoded by the target gene, and / or do not lead to a loss of functional activity of the regulatory elements of the vector GDTT1.8NAS12.
  • the scope of the present invention also includes variants of nucleotide sequences of genes from the group of genes IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B, which at the same time encode various variants of amino acid sequences of IFNB1 proteins , IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B do not differ from those given in their functional activity under physiological conditions.
  • the ability to penetrate into eukaryotic cells and functional activity that is, the ability to express the target gene of the resulting gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1, or GDTT 1.8NAS12-IFNA14, or GDTT1.8NAS12-IFNA2, or GDTT1.8NAS12-IL121, or GDTT1.8NAS12-IL121 .8NAS12-IL12B was confirmed by introducing the resulting vector into eukaryotic cells and then analyzing the expression of the specific mRNA and / or protein product of the target gene.
  • GDTT1.8NAS12-IFNB1, or GDTT 1.8NAS12-IFNA14, or GDTT1.8NAS12-IFNA2, or GDTT1.8NAS12-IL12A, or GDTT1.8NAS12-IL12B to express the target gene at the th protein level in eukaryotic cells into which DNA was introduced -vector, the concentration of proteins encoded by the target genes is analyzed using immunological methods.
  • the presence of the protein IFNB1, or IFNA14, or IFNA2, or IL12A, or IL12B is confirms the efficiency of expression of target genes in eukaryotic cells and the possibility of increasing the level of protein concentration using a gene therapy DNA vector based on the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target gene.
  • the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 carrying the target gene namely, the IFNB1 gene
  • the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 25 carrying the target gene, namely the IFNA14 gene
  • gene therapy DNA - vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 carrying the target gene namely, the IFNA2 gene
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A carrying the target gene, namely the IL12A gene
  • the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12B carrying the target gene namely the IL12B gene
  • the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 carrying the target gene namely the IFNB1 gene
  • the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 carrying the target gene, namely the IFNA14 gene
  • the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 carrying the target gene namely the IFNA2 gene
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A carrying the target gene, namely the IL12A gene
  • gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12B carrying the target gene namely the IL12B gene
  • antibiotic resistance genes in 5 gene therapy DNA vectors are used to obtain these vectors in preparative quantities by increasing bacterial biomass in a nutrient medium containing a selective antibiotic.
  • a gene therapy DNA vector in order to be able to safely use a gene therapy DNA vector
  • GDTT1.8NAS12 carrying the target gene IFNB1, or IFNA14, or IFNA2, or IL12A, or IL12B
  • the use of selective culture media containing an antibiotic is not possible.
  • a technological solution for obtaining a gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying a target gene selected from the group of genes IFNB1, or IFNA14, or IFNA2, or IL12A, or IL12B for the possibility of scaling up to an industrial scale for obtaining gene therapy vectors it is proposed a method for obtaining strains for the development of the specified gene therapy vectors based on the bacterium Escherichia coli JM110-NAS.
  • JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IFNB1 or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IFNA14, or Escherichia coli strain JM1 10-NAS / GDTT 1.8NAS1 2-IFNA2, or Escherichia coli strain JM1 / GD1 .8NAS12-IL12A, 5 or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IL12B, transformation, selection, and subsequent expansion with isolation of plasmid DNA were carried out.
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12B, carrying the target gene, namely the IL12B gene was fermented on an industrial scale Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IFNB1 or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT 1.8NAS12-IFNA14 or Escherichia coli strain NAS / JM110-IFNA14 strain GDTT1 NAS
  • a method for scaling the production of bacterial mass to an industrial scale for isolation of a gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying a target gene selected from the group of genes IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B consists in the fact that a seed culture of Escherichia coli JM110- NAS / GDTT1.8NAS12-IFNB1, or Escherichia coli strain JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IFNA14, or Escherichia coli strain JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IFNA2, or Escherichia coli strain JM110T1 / GNAS IL12A, or 5 strains of Escherichia coli JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IL12B are incubated in a volume of culture medium without antibiotic content, providing a suitable dynamics of biomass accumulation, upon reaching a sufficient amount of biomass in the logarithmic growth phase, the bacterial culture is transferred to an industrial ferment
  • the cultivation conditions of the strains, the composition of the nutrient media (excluding the content of antibiotics), the equipment used, the DNA purification methods may vary within the framework of standard operating procedures 25 depending on the individual production line, but the known approaches to scaling, industrial production and purification of DNA vectors using Escherichia coli strain J M 110-N AS / G DTT 1.8NAS12-IFNB1, or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IFNA14, or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IFNA2, or Escherichia coli strain JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IL12A, or Escherichia coli strain JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IL12A, or Escherichia coli strain JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IL12A, or Escherichia coli strain JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IL12A
  • DNA vector GDTT1 .8NAS12-IFNB1 was constructed by cloning the 564 bp IFNB1 gene coding region. into the DNA vector GDTT1.8NAS12 with a size of 2591 bp. the restriction sites BamHI and Sal.
  • the 564 bp coding part of the IFNB1 gene. was obtained by isolating total RNA from a biological sample of human tissue, followed by a reverse transcription reaction using a commercial kit Mint-2 (Evrogen, Russia) and PCR amplification using oligonucleotides:
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 was constructed by combining six DNA fragments obtained from different sources:
  • the hGH-TA transcription terminator was obtained by PCR amplification of a region of human genomic DNA using the hGH-F and hGH-R oligonucleotides (sequence listing, (3) and (4));
  • a kanamycin resistance gene was obtained by PCR amplification of a portion of the commercial human plasmid pET-28 using oligonucleotides Kan-F and Kan-R (sequence listing, (10) and (11));
  • a polylinker was obtained by kininating and annealing four synthetic oligonucleotides MCS1, MCS2, MCS3 and MCS4 (sequence listing, (12) - (15));
  • PCR amplification was performed using a commercial Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase kit (New England Biolabs) according to the manufacturer's instructions. Fragments (a), (b), (c), and (d) had overlapping regions for the possibility of combining them with subsequent PCR amplification. Fragments (a), (b), (c) and (d) were combined using the hGH-F and Kan-R oligonucleotides (sequence listing, (3) and (11)). Further, the obtained DNA fragments were combined by restriction, followed by ligation at the BamHI and NcoI sites. As a result, a vector was obtained that does not yet contain a polylinker.
  • the plasmid was cleaved with restriction endonucleases at the BamHI and EcoRI sites, followed by ligation with the fragment (e).
  • an intermediate vector of 2408 bp was obtained, carrying the kanamycin resistance gene, which does not yet contain the promoter-regulatory region of the gene for the elongation factor EF1a with its own enhancer.
  • the resulting vector was digested with restriction endonucleases at the Sail and BamHI sites, followed by ligation with fragment (e).
  • a vector of 3608 bp was obtained, carrying the kanamycin resistance gene and the promoter-regulatory region of the gene for the elongation factor EF1a with its own enhancer. Further, the kanamycin resistance gene was isolated at the sites restriction Spel, after which the remaining fragment was ligated to itself.
  • a gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 with a size of 2591 bp was obtained, which is recombinant, with the possibility of selection without antibiotics.
  • Cleavage of the amplification product of the coding portion of the IFNB1 gene and the GDTT1.8NAS12 DNA vector was performed with restriction endonucleases BamHI and Sail (New England Biolabs, USA).
  • GDTT1.8NAS12-IFNA14 carrying the target gene, namely the IFNA14 gene.
  • Gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 was constructed by cloning the 570 bp coding part of the IFNA14 gene. into the DNA vector GDTT1.8NAS12 with a size of 2591 bp. by restriction sites BamHI and Sail.
  • the coding part of the IFNA14 gene is 570 bp. was obtained by isolating total RNA from a biological sample of human tissue, followed by a reverse transcription reaction using a commercial kit Mint-2 (Evrogen, Russia) and PCR amplification using oligonucleotides: IFNA14-FW
  • IFNA14 with a size of 3126 bp. with the nucleotide sequence SEQ ID NO Q 2 AND the general structure depicted in FIG. 1B.
  • the gene therapy DNA vector is GDTT1.8NAS12 was constructed according to Example 1.
  • IFNA2 was constructed by cloning the 567 bp coding portion of the IFNA2 gene. into the DNA vector GDTT1.8NAS12 with a size of 2591 bp. by restriction sites BamHI and Sail.
  • the 567 bp coding part of the IFNA2 gene. obtained 25 by isolating total RNA from a biological sample of human tissue, followed by a reverse transcription reaction using a commercial kit Mint-2 (Evrogen, Russia) and PCR amplification using oligonucleotides:
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 was constructed according to Example 1.
  • GDTT1.8NAS12-IL12A carrying the target gene, namely the IL12A gene.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A was constructed by cloning the 762 bp coding portion of the IL12A gene 25. into the DNA vector GDTT1.8NAS12 with a size of 2591 bp. by restriction sites Sail and Kpnl.
  • the 762 bp coding part of the IL12A gene obtained by isolating total RNA from a biological sample human tissue followed by a reverse transcription reaction using a commercial kit Mint-2 (Evrogen) and PCR amplification using oligonucleotides: IL12A-up
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 was constructed according to Example 1.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12B was constructed by cloning the 987 bp coding region of the IL12B gene. into the DNA vector GDTT1.8NAS12 with a size of 2591 bp. by restriction sites Sail and Kpnl.
  • the coding part of the IL12B gene is 987 bp. was obtained by isolating total RNA from a biological sample of human tissue, followed by a reverse transcription reaction using a commercial 5 kit Mint-2 (Evrogen) and PCR amplification using oligonucleotides:
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 was constructed according to Example 1.
  • test tube N ° 2 1 ⁇ l of solution was added to 25 ⁇ l of Opti-MEM medium (Gibco, USA) Lipofectamin 3000. Mix gently with gentle shaking. The contents of tube N ° 1 were added to the contents of tube N22, incubated for 5 min at room temperature. The resulting solution was added dropwise 5 to the cells in a volume of 40 ⁇ l.
  • Opti-MEM medium Gibco, USA
  • RNA from a primary culture of human lung fibroblast cells was isolated using Trizol Reagent (Invitrogen, USA) according to the manufacturer's recommendations. 1 ml of Trizol Reagent was added to a well with cells and homogenized, followed by heating for 5 min at 65 ° ⁇ .
  • the sample was centrifuged at 14000g for 10 min and again heated for 10 min at 65 ° C. Then, 200 ⁇ L of chloroform was added, smoothly mixed, and centrifuged at 14,000 g for 10 min. Then the aqueous phase was taken, 1/10 volume of 3M sodium acetate, pH 5.2, and an equal volume of isopropyl alcohol were added to 25 of it. The sample was incubated at -20 ° C for 10 min, followed by centrifugation at 14,000g for 10 min. The precipitate was washed with 1 ml of 70% ethanol, dried in air, and dissolved in 10 ⁇ L of RNase-free water.
  • oligonucleotides were used:
  • the reaction was carried out on a CFX96 amplifier (Bio-Rad, USA) under the following conditions: 1 cycle of reverse transcription at 42 ° C for 30 minutes, denaturation at 98 ° C for 15 min, then 40 cycles including denaturation at 94 ° C for 15 sec, annealing primers 60 ° ⁇ - 30 sec and elongation 72 ° ⁇ - 30 sec.
  • the B2M gene (Beta-2 microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene.
  • amplicons obtained by PCR on templates which are plasmids in known concentrations containing cDNA sequences genes IFNB1 and B2M.
  • Deionized water was used as a negative control.
  • the dynamics of accumulation of cDNA amplicons of the IFNB1 and B2M genes was assessed in real time using the Bio-RadCFXManager 2.1 thermocycler software (Bio-Rad, USA). The analysis plots are shown in FIG. 2.
  • SK-LU-1 human lung adenocarcinoma cells were cultured in DMEM (GIBCO) medium supplemented with 10% bovine embryo serum under standard conditions (37 ° C, 5% CO2). To obtain 90% confluence, 24 hours prior to transfection, cells were seeded in a 24-well plate at 5x10 4 cells / well. The Lipofectamine 3000 reagent (ThermoFisher is Scientific, USA) was used for transfection. Transfection with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 expressing the human IFNA14 gene was performed as described in Example 6. The B2M gene (Beta-2 microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene.
  • RNA isolation, reverse transcription reaction and real-time PCR were performed as described in example 6, with the exception of oligonucleotides with sequences differing from example 6.
  • oligonucleotides IFN14_SF GGC AACC AGTT CC AG AAAGC 5 IFN14_SR C AC AC AGGCTT CC AGGT CAT were used, the length of the amplification product was 168 bp.
  • DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 carrying the target gene penetrate into eukaryotic cells and confirm its functional activity at the level of mRNA expression of the target gene.
  • This example also demonstrates the feasibility of a method for using a gene therapy DNA vector carrying the target gene.
  • a culture of BZR human bronchial epithelium cells was grown using a BEGM Kit (Lonza, Catalog No. CC-3170) under standard conditions (37 ° C, 5% CO2). To obtain 90% confluence, 24 hours prior to transfection, cells were seeded in a 24-well plate at 5x10 4 cells / well. Lipofectamine 3000 reagent (ThermoFisher Scientific, USA) was used for transfection. Transfection with the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 expressing the human IFNA2 gene was performed as described in Example 6.
  • B The B2M gene (Beta-2-microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene.
  • a culture of BZR human bronchial epithelium cells transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12, which does not carry the target gene (cDNA of the IFNA2 gene before and after transfection with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12, which does not contain the insert of the target gene, is not shown in the figures) was used as a control.
  • Isolation of RNA, reverse transcription reaction and real-time PCR were performed as described in example 5, except for oligonucleotides with different sequences from example 6.
  • oligonucleotides IFNA2_SF AGCT G AAT G ACCT GG AAGCC were used
  • a human umbilical vein endothelial cell culture HUVEC was grown using Vascular Cell Basal Medium and Endothelial Cell Growth Kit-BBE (ATCC PCS-1 00-040) under standard conditions (37 ° C, 5% CO2). To obtain 90% confluence, 24 hours prior to transfection, cells were seeded in a 24-well plate at 5x10 4 cells / well. Lipofectamine 3000 reagent (ThermoFisher Scientific, USA) was used for transfection. Transfection with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A expressing the human IL12A gene was performed as described in Example 6.
  • the B2M gene (Beta-2-microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene. Deionized water was used as a negative control.
  • the amount of PCR products - cDNA of the IL12A and B2M genes obtained as a result of amplification was estimated in real time using the software of the Bio-RadCFXManager 2.1 amplifier (Bio-Rad, USA).
  • the analysis plots are shown in FIG. 5. From figure 5 it follows that as a result of transfection of the human umbilical vein endothelial cell culture HUVEC with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A, the level of specific mRNA of the human IL12A gene increased many times, which confirms the ability of the vector to penetrate into eukaryotic cells and express the IL12A gene on mRNA level.
  • the presented results also confirm the feasibility of the method of using the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A to increase the expression level of the IL12A gene in eukaryotic cells.
  • Example 10 Confirmation of the ability of the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12B carrying the target gene, namely, the IL12B gene, to penetrate into eukaryotic cells and confirmation of its functional activity at the level of mRNA expression of the target gene.
  • This example also demonstrates the feasibility of a method for using a gene therapy DNA vector carrying the target gene.
  • Changes in the accumulation of mRNA of the target IL12B gene in the HSkM human skeletal myoblast cell culture were evaluated 48 hours after their transfection with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12B carrying the human IL12B gene.
  • the amount of mRNA was determined by the dynamics of accumulation of cDNA amplicons in the real-time PCR reaction.
  • Human skeletal myoblast cells HSkM were grown according to the manufacturer's instructions under standard conditions (37 ° C, 5% CO2). To obtain 90% confluence, 24 hours prior to transfection, cells were seeded in a 24-well plate at 5x10 4 cells / well.
  • Lipofectamine 3000 reagent (ThermoFisher Scientific, USA) was used for transfection. Transfection with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12B expressing the human IL12B gene was performed as described in Example 6. As a control, we used a culture of HSkM human skeletal myoblasts cells transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12, which does not carry the target gene (cDNA of the gene IL12B before and after transfection gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12, not containing the insert of the target gene is not shown in the figures). Isolation of RNA, reverse transcription reaction and real-time PCR were performed as described in example 6, with the exception of oligonucleotides with different sequences from example 6. Oligonucleotides were used to amplify DNA specific for the human IL12B gene.
  • Human lung fibroblast cell culture was grown as described in example 6.
  • the DN1K / dendrimer complex was prepared according to the manufacturer's method (QIAGEN, SuperFect Transfection Reagent Flandbook, 2002) with some modifications.
  • culture medium was added to 1 ⁇ g of flFIK vector dissolved in TE buffer to a final volume of 60 ⁇ l, then 5 ⁇ l SuperFect Transfection Reagent was added and gently mixed by pipetting five times.
  • the complex was incubated at room temperature for 10-15 minutes. Next, the culture medium was taken from the wells, the wells were washed with 1 ml of PBS buffer.
  • the medium was carefully removed, the cell monolayer was washed with 1 ml of PBS buffer. Then added a medium containing 10 ⁇ g / ml gentamicin, and incubated for 24-48 hours at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO2.
  • IFNB1 protein was performed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the Human IFN-b (Interferon Beta) ELISA Kit (ElabBioscience E-EL-H0085) according to the manufacturer's procedure with optical density detection 5 using an automatic biochemical and enzyme-linked immunosorbent assay ChemWell (Awareness Technology Inc., USA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from 10 standard samples with a known concentration of IFNB1 protein included in the kit.
  • the sensitivity of the method was at least 18.75 pg / ml, the measurement range was from 31.25 pg / ml to 2000 pg / ml.
  • Statistical processing of the results was carried out using is software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https: //www.r-project.org/). The plots obtained as a result of the analysis are presented in FIG. 7.
  • Example 12 Confirmation of the efficiency and feasibility of the method of using the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 carrying the IFNA14 gene to increase the expression of the IFNA14 protein in mammalian cells.
  • the change in the amount of protein in the culture of human lung adenocarcinoma cells SK-LU-1 (ATCC ® ⁇ -57 TM ) after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 carrying the human IFNA14 gene was evaluated.
  • the cells were grown as described in example 7.
  • SuperFect reagent was used for transfection.
  • Transfection Reagent 6th generation (Qiagen, Germany).
  • a control we used an aqueous solution of dendrimers without a DNA vector (A), a DNA vector GDTT1.8NAS12 that does not contain the cDNA of the IFNA14 gene (B), as transfected agents, a DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 carrying the human IFNA14 gene ( WITH).
  • Preparation of the DNA-dendrimer complex and transfection of SK-LU-1 cells were performed as described in Example 11.
  • 0.1 ml of 1N HCl was added to 0.5 ml of culture fluid, mixed thoroughly and incubated for 10 minutes at room temperature. Then the mixture was neutralized by adding 0.1 ml of 1.2M NaOH / 0.5M HEPES (pH 7-7.6) and mixed thoroughly. Selected the supernatant and used it to quantify the target protein.
  • IFNA14 protein The quantitative determination of IFNA14 protein was carried out by the method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the Human IFNA14 / Interferon Alpha 14 ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences LS-F13512-1) according to the manufacturer's procedure with optical density detection using an automatic biochemical and enzyme immunoassay analyzer ChemWell (Awareness Technology Inc., USA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of IFNA14 protein included in the kit.
  • the sensitivity of the method was no less than 15.6 pg / ml, the measurement range was from 15.6 pg / ml to 1000 pg / ml.
  • Statistical processing of the obtained results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https: //www.r-project.org/). The plots obtained as a result of the analysis are presented in FIG. eight.
  • the change in the amount of IFNA2 protein in the lysate of human bronchial epithelial cells BZR after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 carrying the human IFNA2 gene was evaluated.
  • the cells were cultured as described in example 8.
  • the 6th generation SuperFect Transfection Reagent (Qiagen, Germany) was used for transfection.
  • As a control we used an aqueous solution of dendrimers without a DNA vector (A), a DNA vector GDTT1.8NAS12 without cDNA of the IFNA2 gene (B), as transfected agents, a DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 carrying the human IFNA2 gene ( WITH).
  • Preparation of the DNA-dendrimer complex and transfection of human bronchial epithelial cells with BZR were performed as described in example 11.
  • IFNA2 protein was carried out by the method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the Human Interferon Alpha 2 ELISA Kit (Abeam, ab233622) according to the manufacturer's method with optical density detection using an automatic biochemical and enzyme-linked immunosorbent assay ChemWell (Awareness Technology Inc., USA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of IFNA2 protein included in the kit.
  • the sensitivity of the method was no less than 56.04 pg / ml, the measurement range was from 187.5 pg / ml to 12000 pg / ml.
  • Statistical processing of the obtained results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https: //www.r-project.org/). The plots obtained as a result of the analysis are presented in FIG. nine.
  • the change in the amount of IL12A protein in the lysate of the human umbilical vein endothelial cell culture HUVEC after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A carrying the human IL12A gene was evaluated.
  • the cells were cultured as described in example 9.
  • the 6th generation SuperFect Transfection Reagent (Qiagen, Germany) was used for transfection.
  • As a control we used an aqueous solution of dendrimers without a DNA vector (A), a DNA vector GDTT1.8NAS12 that does not contain the IL12A gene cDNA (B), as transfected agents, a DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A carrying the human IL12A gene ( WITH).
  • Preparation of the DNA-dendrimer complex and transfection of HUVEC cells was performed as described in Example 11.
  • 0.1 ml of 1N HCl was added to 0.5 ml of culture fluid, mixed thoroughly and incubated for 10 minutes at room temperature. Then neutralize the mixture by adding 0.1 ml of 1.2M NaOH / 0.5M HEPES (pH 7-7.6) and mix thoroughly. The supernatant was taken and used to quantify the target protein.
  • the quantitative determination of the IL12A protein was carried out by the method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the Human IL12A / p35 ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences LS-F24142-1) according to the manufacturer's procedure with optical density detection using an automatic biochemical and enzyme immunoassay analyzer ChemWell ( Awareness Technology Inc., USA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of IL12A protein included in the kit.
  • the sensitivity of the method was no less than 4.688 pg / ml, the measurement range was from 7.813 pg / ml to 500 pg / ml.
  • Statistical processing of the obtained results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https: //www.r-project.org/). The analysis plots are shown in FIG. ten.
  • the change in the amount of IL12B protein in the lysate of the HSkM human skeletal myoblast cell culture after transfection of these cells with the GDTT1.8NAS12-IL12B DNA vector carrying the human IL12B gene was evaluated.
  • the cells were cultured as described in example 10.
  • the 6th generation SuperFect Transfection Reagent (Qiagen, Germany) was used for transfection.
  • As a control we used an aqueous solution of dendrimers without a DNA vector (A), a DNA vector GDTT1.8NAS12 that does not contain the cDNA of the IL12B gene (B), and as transfected agents, a DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12B carrying the human IL12B gene ( WITH).
  • Preparation of the DNA-dendrimer complex and transfection of HSkM cells was performed as described in Example 11.
  • 0.1 ml of 1N HCl was added to 0.5 ml of the culture fluid, mixed thoroughly and incubated for 10 minutes at room temperature. Then the mixture was neutralized by adding 0.1 ml of 1.2M NaOH / 0.5M HEPES (pH 7-7.6) and mixed thoroughly. The supernatant was taken and used to quantify the target protein.
  • the IL12B protein was quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the Human IL12B / IL12 p40 ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences LS-F24549-1) according to the manufacturer's procedure with optical density detection using an automatic biochemical and enzyme immunoassay analyzer ChemWell (Awareness Technology Inc., USA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of IL12B protein included in the kit.
  • the sensitivity of the method was at least 2 pg / ml, the measurement range was from 31.2 pg / ml to 2000 pg / ml.
  • Statistical processing of the results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https://www.r-project.org/). The analysis plots are shown in FIG. eleven.
  • the changes in the amount of IL12A protein in human skin were assessed when the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A was introduced into human skin. carrying the human gene IL12A.
  • three patients were injected into the skin of the forearm with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A carrying the IL12A gene and in parallel were injected with placebo, which was a gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12, which did not contain the cDNA of the IL12A gene.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) and the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A carrying the IL12A gene were injected in an amount of 1 mg for each genetic construct by the tunnel method with a 30G needle to a depth of 3 mm.
  • the volume of the injected solution of the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) and the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A carrying the IL12A gene is 0.3 ml for each genetic construct.
  • the foci of injection of each genetic construct were located on the forearm at a distance of 8-10 cm from each other.
  • Biopsy samples were taken on the 2nd day after the introduction of genetic constructs of gene therapy DNA vectors. Biopsies were taken from the skin areas of patients in the area of injection of the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL12A carrying the IL12A (I) gene, gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12
  • the skin of patients in the biopsy sampling area was preliminarily washed with sterile saline and anesthetized with lidocaine solution.
  • the biopsy sample size was about 10 cubic meters. mm, weight - about 11 mg.
  • the sample was placed in a buffer solution containing 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and homogenized until a homogeneous suspension was obtained.
  • the resulting suspension was centrifuged for 10 min at 14000 g.
  • the supernatant was taken and used for the quantitative determination of the target protein by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of IL12A protein included in the kit.
  • Statistical processing of the obtained results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https://www.r-project.org/). according to the manufacturer's method with optical density detection using an automatic biochemical and enzyme immunoassay analyzer ChemWell (Awareness Technology Inc., USA). The analysis plots are shown in FIG. 12.
  • the change in the amount of IFNA2 protein in human muscle tissue was assessed upon the introduction of the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 carrying the target gene, namely, human IFNA2 gene.
  • IFNA2 In order to analyze the change in the amount of IFNA2 protein, three patients were injected into the gastrocnemius muscle tissue with a gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 carrying the IFNA2 gene with a transport molecule, and in parallel, a placebo was injected, which is a gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12, which does not contain the cDNA of the gene IFNA2 with a transport molecule.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) and the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 carrying the IFNA2 gene were injected in an amount of 1 mg for each genetic construct by the tunnel method with a 30G needle to a depth of about 10 mm.
  • the volume of the injected solution of the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) and the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 carrying the IFNA2 gene is 0.3 ml for each genetic construct.
  • the foci of injection of each genetic construct were located medially at a distance of 8-10 cm from each other. Biopsy samples were taken on the 2nd day after the introduction of genetic constructs of gene therapy DNA vectors.
  • Biopsies were taken from areas of muscle tissue of patients in the injection zone gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 carrying the IFNA2 gene (I), gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) (II), as well as from an intact part of the gastrocnemius muscle (III) using a MAGNUM biopsy device (BARD, USA).
  • the skin of patients in the biopsy sampling area was preliminarily washed with sterile saline and anesthetized with lidocaine solution.
  • the biopsy sample size was about 20 cc. mm, weight - about 22 mg.
  • the sample was placed in a buffer solution containing 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and homogenized until a homogeneous suspension was obtained.
  • the resulting suspension was centrifuged for 10 min at 14000g. The supernatant was taken and used to quantify the target protein.
  • the quantitative determination of the IFNA2 protein was carried out by the method of enzyme-linked immunosorbent assay as described in example 13.
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of IFNA2 protein included in the kit.
  • Statistical processing of the obtained results was carried out using the software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https: //www.r-proiect.ora/y
  • the graphs obtained as a result of the analysis are presented in Fig. 13.
  • Example 18 Confirmation of the efficiency and feasibility of the method of using the gene therapeutic DNA vector GDTT1 .8NAS12-IFNA14 carrying the IFNA14 gene to increase the expression of the IFNA14 protein in human tissues.
  • the changes in the amount of IFNA14 protein in human skin were assessed when the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 was introduced into human skin. carrying the human gene IFNA14.
  • Gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 which contains the cDNA of the IFNA14 gene and the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12, used as a placebo, which does not contain the cDNA of the IFNA14 gene, each of which was dissolved in sterile water of Nuclease-Free purity.
  • DNA-cGMP grade in-vivo-jetPEI complexes were prepared in accordance with the manufacturer's recommendations.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) and the gene therapy DNA vector GDTT1 .8NAS12-IFNA14 carrying the IFNA14 gene were injected in an amount of 1 mg for each genetic construct by the tunnel method with a 30G needle to a depth of 3 mm.
  • the volume of the injected solution of the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) and the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 carrying the IFNA14 gene is 0.3 ml for each genetic construct.
  • the foci of injection of each genetic construct were located on the forearm at a distance of 8-10 cm from each other. Biopsy samples were taken on the 2nd day after the introduction of genetic constructs of gene therapy DNA vectors.
  • Biopsies were taken from the skin areas of patients in the area of injection of the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 carrying the IFNA14 gene (I), the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) (II), as well as from intact skin areas (III), using a device for taking a biopsy Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Italy).
  • the skin of patients in the biopsy sampling area was preliminarily washed with sterile saline and anesthetized with lidocaine solution.
  • the biopsy sample size was about 10 cubic meters. mm, weight - about 11 mg.
  • the sample was placed in a buffer solution containing 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and homogenized until a homogeneous suspension was obtained.
  • the resulting suspension was centrifuged for 10 min at 14000g. The supernatant was taken and used for the quantitative determination of the target protein by enzyme-linked immunosorbent assay as described in example 12.
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of IFNA14 protein included in the kit. Statistical processing of the results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https://www.r-project.org/). The analysis plots are shown in FIG. fourteen.
  • the patient was injected into the skin of the forearm with an appropriate culture of autologous fibroblasts transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 carrying the IFNA14 gene, and in parallel a placebo was injected, which was a culture of the patient's autologous fibroblasts transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS carrying the gene IFNA14. ...
  • the primary culture of human fibroblasts was isolated from biopsies of the patient's skin. Using an Epitheasy 3.5 skin biopsy device (Medax SRL, Italy), a skin biopsy sample was taken from an area protected from ultraviolet radiation, namely behind the auricle or from the lateral inner surface in the elbow joint area, about 10 sq. mm, weighing about 11 mg. The patient's skin was preliminarily washed with sterile saline and anesthetized with lidocaine solution. The cultivation of the primary cell culture was carried out at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO2 in DMEM medium with 10% fetal bovine serum and ampicillin 100 U / ml. Subculture of culture and change of culture medium was carried out every 2 days.
  • the total duration of culture growth did not exceed 25-30 days. An aliquot containing 5x1 0 4 cells was taken from the cell culture. The patient's fibroblast culture was transfected with a gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 carrying the IFNA14 gene or placebo - the GDTT1.8NAS12 vector, which does not carry the target IFNA14 gene.
  • Transfection was carried out using a cationic polyethyleneimine polymer JETPEI (Polyplus Transfection, France) according to the manufacturer's instructions.
  • the cells were cultured for 72 hours and then administered to the patient.
  • the concentration of modified autologous fibroblasts in the injected suspension was approximately 5 million cells per 1 ml of suspension, the number of injected cells did not exceed 15 million.
  • the foci of autologous fibroblast culture injection were located at a distance of 8-10 cm from each other.
  • Biopsy samples were taken on the 4th day after administration of the culture of autologous fibroblasts transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 carrying the target gene, namely, the IFNA14 gene and placebo. Biopsies were taken from the patient's skin areas in the zone of administration of the culture of autologous fibroblasts transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14, carrying the target gene, namely the IFNA14 gene (C), cultures of autologous fibroblasts transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12, not carrying the target IFNA14 gene (placebo) (B), as well as from intact skin areas (A), using the device for taking a biopsy Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Italy).
  • the skin in the biopsy sampling area of the patients was preliminarily washed with sterile saline and anesthetized with lidocaine solution.
  • the biopsy sample size was about 10 cubic meters. mm, weight - about 11 mg.
  • the sample was placed in a buffer solution containing 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and homogenized until a homogeneous suspension was obtained.
  • the resulting suspension was centrifuged for 10 min at 14000g. The supernatant was collected and used to quantify the target protein as described in Example 12.
  • FIG. 15 The analysis plots are shown in FIG. 15. From figure 15 it follows that in the patient's skin in the area of introduction of the culture of autologous fibroblasts transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 carrying the IFNA14 gene, there was an increase in the amount of IFNA14 protein in comparison with the amount of IFNA14 protein in the area of introduction of the culture of autologous fibroblasts transfected with the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12, which does not carry the IFNA14 gene (placebo), which indicates the efficacy of the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14 and confirms the feasibility of the method of its use to increase the expression level of IFNA14 in human tissues, in particular, with the introduction of autologous fibroblasts transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14.
  • the change in the amount of proteins IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A and IL12B in the area of muscle tissue was evaluated when a mixture of gene therapy vectors was combined into this area.
  • the study was carried out on 3 laboratory animals - male Wistar rats of 8 months of age weighing 240-290 g.
  • Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI polyethyleneimine (Polyplus Transfection, France) was used as a transport system.
  • An equimolar mixture of gene therapy DNA vectors was dissolved in sterile water of Nuclease purity grade. Free.
  • DNA-cGMP grade in-vivo-jetPEI complexes were prepared in accordance with the manufacturer's recommendations.
  • the volume of the intramuscularly administered solution was 0.1 ml with a total amount of DNA of 100 ⁇ g.
  • the solution was injected using an insulin syringe. 2 days after the procedure, the rats were decapitated.
  • Biopsy material was taken from areas of the right thigh muscle in the area of injection of a mixture of five gene therapy DNA vectors carrying genes IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B (zone I), from areas of the left muscle of the thigh in the area of introduction of gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) (zone II), as well as from areas of muscle tissue that have not undergone any manipulation (zone III).
  • Example 11 Quantifying IFNB1 protein
  • Example 12 Quantifying IFNA14 protein
  • Example 13 Quantifying IFNA2 protein
  • Example 14 quantifying IL12A protein
  • example 15 quantitative determination of IL12B protein
  • CPAE cells were cultured in DMEM (Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco) under standard conditions.
  • DMEM Gibco
  • fetal bovine serum Gibco
  • Transfection with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2 carrying the human IFNA2 gene and the DNA vector GDTT1.8NAS12 not carrying the human IFNA2 gene (control), RNA isolation, reverse transcription reaction, PCR amplification and data analysis was performed as described in example 8
  • the bovine actin (ACT) gene listed in the GenBank database under the number AH001 130.2 was used as a reference gene.
  • amplicons obtained by PCR on matrices were used, which were plasmids in known concentrations containing the sequences of the IFNA2 and ACT genes.
  • Deionized water was used as a negative control.
  • NAS / GDTT1.8NAS12-IL12A or Escherichia coli strain JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IL12B carrying gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1, or GDTT 1.8NAS12-IFNA14, or GDTT1.8NAS12-IFNA2, or GDTT1.8NAS12-IL12A or GDTT1.8NAS12-IL12B, respectively, for its development with the possibility of selection without the use of antibiotics consists in obtaining cells of the Escherichia coli JM110-NAS strain with electroporation of these cells with the gay therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1, or the DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA14, or the DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNA2, or the DNA vector GDTT1.8NAS IL12A, or DNA vector GDTT1 .8NAS12-IL12B, after which the cells are plated on Petri dishes with agar selective medium containing yeast extract, peptone, 6% sucrose,
  • the Escherichia coli JM110-NAS strain for the development of the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 or gene therapy DNA vectors based on it with the possibility of positive selection without the use of antibiotics was obtained by constructing a linear DNA fragment containing the regulatory element RNA-in of the transposon TnU for selection without the use of antibiotics 64 bp in size, the sacB levansacharase gene, the product of which provides selection on a sucrose-containing medium with a size of 1422 bp, the chloramphenicol resistance gene catR, which is necessary for the selection of strain clones in which homologous recombination of 763 bp underwent. n.
  • GDTT1.8NAS12-IFNB1 SEQ ID N ° 1
  • GDTT1.8NAS12-IFNA14 SEQ ID N ° 2
  • GDTT1.8NAS12-IFNA2 SEQ ID N23
  • GDTT1.8NAS12-IL12A SEQ ID N24
  • GDTT1.8NAS12-IL12B SEQ ID N ° 5
  • NAS / GDTT1.8NAS12-IL12B each containing gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target gene, namely IFNB1, or IFNA14, or IFNA2, or IL12A, or IL12B.
  • Each strain of Escherichia coli JM110- NAS / GDTT1.8NAS12-IFNB1, or Escherichia coli JM110- NAS / GDTT1 .8NAS12-IFNA14, or Escherichia coli JM110- NAS / GDTT1.8NAS12-IFNA2, or Escherichia NAST1 / 8NAS12-IFNA2, or Escherichia coli -IL12A, or Escherichia coli JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IL12B was obtained on the basis of the Escherichia coli JM110-NAS strain (Genetic Diagnostics and Therapy 21 Ltd, UK) according to example 22 by electroporation of competent cells of this strain with the gene
  • a medium was prepared containing 10 L: 100 g tryptone, 50 g yeast extract (Becton Dickinson, USA), made up to 8800 ml with water and autoclaved at 121 ° C for 20 min, then 1200 ml of 50% (w / v) sucrose was added. Then, a seed culture of the Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IFNB1 in a volume of 100 ml was inoculated into a flask. Incubated in an incubator shaker for 16 h at 30 ° C.
  • the seed culture was transferred to a Techfors S fermenter (Infors HT, Switzerland), grown until the stationary phase was reached.
  • the control was carried out by measuring the optical density of the culture at a wavelength of 600 nm.
  • the cells were precipitated by centrifugation for 30 min at 5000-10,000 days. The supernatant was removed, the cell mass was resuspended in 10% by volume of phosphate-buffered saline. They were re-centrifuged for 30 min at 5000-1 OOOOd.
  • the solution was centrifuged for 20-30 min at 15000 g, then filtered through a membrane filter with pores of 0.45 ⁇ m (Millipore, USA). Then ultrafiltration was carried out through a membrane with a cutoff size of YOkDa (Millipore, United States) and diluted to the initial volume with 25 mM TrisCI buffer, pH 7.0. The operation was repeated three to four times. The solution was applied to a column with 250 ml DEAE sepharose HP sorbent (GE, USA) equilibrated with a solution of 25 mM TrisCI, pH 7.0.
  • the column was washed with three volumes of the same solution, and then the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 was eluted with a linear gradient from a solution of 25 mM TrisCI, pH 7.0 to a solution of 25 mM TrisCI, pH 7.0, 1M NaCI in a volume of five column volumes. ... Elution was monitored by the optical density of the descending solution at 260 nm. Chromatographic fractions containing the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 were pooled and gel filtration was performed on a Superdex 200 sorbent (GE, USA). The column was equilibrated with PBS.
  • the reproducibility of the technical process and the quantitative characteristics of the final product yield confirm the manufacturability and the possibility of industrial production of the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1, or GDTT 1.8NAS12-IFNA14, or GDTT1.8NAS12-IFNA2, or GDTT1.8NAS12-IL12A, or is GDTT1.8NAS12-IL12B.
  • the created gene therapeutic DNA vector with the target gene can be used for introduction into the cells of the body of animals and humans, characterized by reduced or insufficient expression of the protein encoded by this gene, thus ensuring the achievement of a therapeutic effect.
  • the problem posed in this invention is solved, namely: the design of gene therapy DNA vectors to increase the expression level of genes IFNB1, 25 IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B, combining the following properties:
  • DNA vectors of regulatory elements which are nucleotide sequences of viral genomes and antibiotic resistance genes; III) Manufacturability of obtaining and the possibility of production in strains on an industrial scale;
  • Escherichia coli JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IL12B carrying a gene therapy DNA vector carrying a gene therapy DNA vector, a method for producing a gene therapy DNA vector, a method for industrial-scale production of a gene therapy DNA vector.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Создан генотерапевтический ДНК -вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта. Генотерапевтический ДНК- вектор GDTT 1.8NAS 12-IFNB 1 содержит кодирующую часть целевого гена IFNB1, генотерапевтический ДНК -вектор GDTT1.8NAS12-IFNA14 содержит кодирующую часть целевого гена IFNA14, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT 1.8NAS 12-IFNA2 содержит кодирующую часть целевого гена IFNA2, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL12A содержит кодирующую часть целевого гена IL12A, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL12B содержит кодирующую часть целевого гена IL12B. Каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов за счет ограниченного размера векторной части GDTT1.8NAS12, не превышающей 2600 и. н., обладает способностью эффективно проникать в клетки человека и животных и экспрессировать клонированный в него целевой ген IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A, или IL12B.

Description

ГЕНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ДНК-ВЕКТОР Область техники
Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве для создания препаратов генной терапии.
Уровень техники На сегодняшний день одним из перспективных методов лечения наследственных и приобретенных заболеваний связан с использованием современных методов генной терапии, с помощью которых проводится доставка генетического материала в клетки пациента для коррекции дефекта/мутации, компенсации овер- или гипоэксперссии гена(ов). В результате такой терапии в клетках запускается экспрессия или молекул РНК или белка, которые и проявляют терапевтический эффект, посредством регуляции белковой активности или активации/подавления экспрессии таргетных протеинов. Так или иначе конечной целью генетической терапии является регуляция на уровне трансляции или транскрипции метаболических или физиологических нарушений, связанных с повреждением или ненормальной активностью генетического аппарата клетки. В предлагаемом изобретении под экспрессией гена подразумевается продукция молекулы белка с определенной аминокислотной последовательностью, определяемой нуклеотидной последовательностью этого гена.
Ряд белков, являющихся модуляторами иммунной системы - IFNB1, IFNA14, IL12A, IL12B, IFNA2, имеют общее название -цитокины. Гены, кодирующие данные белки, играют важную роль во множестве как нормальных, так и патологических процессов у человека и животных. На сегодняшний день продемонстрирована корреляция между различными патологическими состояниями у человека с нарушением уровня экспрессии данных цитокинов, что делает их потенциальными мишенями для генетической терапии с целью коррекции.
Одни из цитокинов - интерфероны I типа проявляют противовирусную и противопухолевую активность и являются важнейшим компонентом врожденного иммунитета, а также вовлечены в дифференцировку клеток. Контакт с патогенами приводит к секреции интерферона I типа, который связывается с соотвествующим рецепторным комплексом, что приводит к активации транскрипции генов хемокинов и провоспалительных цитокинов. У нокаутных мышей по этому интерферону наблюдается нарушение созревание В клеточного звена иммунитета и повышается восприимчивость к вирусной инфекции.
К интерферонам I типа относятся две группы белков - IFN-a и b, которые обладают множеством иммунорегуляторных функций, обеспечивающих связь между врожденными и адаптивными иммунными ответами. Показано участие IFN-a / b в индукции экспрессии МНС класса I и активации NK клеток, а также регуляции экспрессии других цитокинов.
Исходя из данных современной мировой литературы, известен следующий механизм действия интерферонов I типа: при контролируемой вирусной инфекции, не сильно выраженных и опосредованных индукторов функционирование интерферонов I типа носит не системный, а локальный эффект. В случае активации другого провоспалительного цитокина - IL-12, наряду с IFN-a / b, продуцируется IFN-g CD4 Т клетками, в том числе и, при экспозиции антигенов в составе МНС I CD8 Т-клеткок. При распространенной вирусной инфекции и высоких уровнях секреции IFN-a / b значительно повышается цитотоксичность NK-клеток и с превалированием функционирования CD8-T- кпеточного звена. Исходя из данных литературы, противовирусные свойства IFNB1 позволяют контролировать репликацию ретровирусов, включая ВИЧ. Использование иммунодефицитных животных моделей подтверждает данное положение. Так было показано, что инфекция ВИЧ мононуклеарных клеток пациентов с уже экспрессирующимся геном IFNB1, приводила к подавлению репликации ВИЧ по сравнению с контрольными клетками. При этом, трансплантация данных клеток мышам супрессировала репликацию ВИЧ до недетектируемого стандартными методами уровня у 40% животных (Vieillard V et al., 1999). Подобные данные были получены в работе на приматах (Gay W et al., 2004).
Противоопухолевая активность IFNB1 была показана в экспериментах с помощью трансфекции клеток глиомы человека IFNB1 экспрессирующим плазмидным вектором, что приводило эффективному подавлению пролиферативной активности клеток в культуре (Mizuno М et al., 1990). В другой работе с помощью трансфекции клеток меланомы вирусным вектором, экспрессирующим ген IFNB1, было показано значительное повышение эффективности цитостатика блеомицина in vitro, приводящего к почти полной элиминации опухолевых клеток (Fondello С et al., 2018). Противопухолевая активность IFNB1 модифицированных клеток также была показана на мышиной модели метастазирующей хориокарциномы (Kim GS et al., 2018). Другие патологии, в которые вовлечен IFNB1 - это аутоимуннные заболевания, среди которых особое внимание уделяется рассеянному склерозу (PC). В настоящий момент терапия PC IFNB1 является основной (Rebif, Betaseron, Avonex и др.). Использование геннотерапевтических конструкций с геном IFNB1 представляется перспективным подходом в терапии PC (Hamana A et al., 2018).
Экспрессия IFNB1 в нервной ткани также играет роль и в патогенезе болезни Паркинсона. Результаты эксперимента на мышах с экспериментальной моделью болезни Паркинсона, которым вводили лентивирусный вектор с геном IFNB1, тормозило развитие патологии (Ejlerskov Р et al. , 2015).
Ряд генно-инженерных продуктов уже находятся на начальных фазах клинических испытаний. Так, уже на первой стадии КИ аденоассоциированный вирусный вектор, экспрессирующий ген IFNB1, который вводится внутрь сустава пациентам с ревматоидным артритом (NCT02727764). Другие гены IFNA14, IFNA2 отвечают за экспрессию цитокинов IFN-a подтипов 14 и 2, относящиеся также к интерферонам I типа, которые связываются с одним и тем же рецептором интерферона I типа (IFNAR), при этом, афинность к нему внутри этой группы интереферонов различается, что связывают с индукцией различных сигнальных путей. Эффективность разных подтипов интерферонов при инфекции HSV, MCMV и вируса гриппа у мышей различается. Было показано, что в случае заражения ВИЧ-1, IFN-a2 может играть роль самого патогенетически значимого подтипа. Хотя в данном исследовании анализировали всего шесть подтипов IFN-a с использованием имплементированного к лабораторным исследованиям штамма ВИЧ-1 (Sperber SJ et al., 1992). В другой работе было показано, что существует обратная зависимость между экспрессией подтипов IFN-a и эффективностью подавления in vitro репликации ВИЧ-1 Обнаружено, что под влиянием ВИЧ-инфекции наиболее распространенные подтипы, IFN-a2 и -a1 / 13 были менее эффективны по сравнению с IFN-аб, -а14 и -а8 (Harper et al., 2015). С помощью плазмидных векторов, экспрессирующих различные подтипы IFN-I, продемонстрирован наибольший по длительности подавляющий репликацию ВИЧ эффект у мышей, получавших плазмиды, экспрессирующие гены IFNB1, IFNA14 (Abraham S et al., 2016).
Таким образом, несмотря на противоречивые данные о сравнительной эффективности различных интерферонов I типа, каждый из подтипов может быть использован для терапии различных патологий иммунной системы.
Другой цитокин - IL-12, являющийся провоспалительным, экспрессируется дендритными клетками, макрофагами и В-клетками в ответ на инфекционные агенты или опухолевые антигены. Гены IL12A, IL12B кодируют соотвествующие субъединицы - р35 и р40. Его индукция стимулирует продукцию IFN-g Т-клетками и приводит к потенциированию презентации антигена антиген-презентирующими клетками, стимулируя, в свою очередь, дифференцировку ТН1 клеток. Кроме этого, он может индуцировать экспрессию IFN-g NK-клетками. Клиническое проявление многих инфекций зависит от способности агента индуцировать продукцию IL-12. В частности, заражение Candida albicans активирует синтез IL- 12, что способствует дальнейшей эффективной защите клеток от возбудителя. ВИЧ, наоборот подавляет экспрессию IL-I2, вызывая многочисленные нарушения клеточного иммуного звена. Аналогично ведут себы лейшмании, подавляя синтез IL-12, что способствует хронизации инфекции. Выборочное подавление продукции IL-12, при сохранении экспрессии других провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, TNF-a, приводит к длительному персистированию возбудителей в организме хозяина (Okwor I, Uzonna JE., 2016). В этой связи, исследователи предложили генотерапевтический метод с использованием экспрессирующих IL-12 плазмидных векторов, для получения протективного эффекта при поражении лейшманиями и трипаносомами (Sakai Т et al., 2000). IL-12 опосредованная стимуляция ТМ позволила использовать его в качестве вакцины в составе геннотерапевтических конструкций для иммуномодулирующего эффекта (Tapia Е et al. , 2003). При ряде патологий - таких как рассеянный склероз, системная красная волчанка, первичный билиарный цирроз, болезнь Бехчета, целиакия, синдром Шегрена найдены ассоциированые с генами IL12A, IL12B мутации. Противоопухолевое действие IL-12 при геннотерапевтическом подходе стимулирующее дендритные клетки и, как следствие, восстанавливающее противоопухолевый иммунитет, изучено в ряде работ (Razi Soofiyani S et al., 2016). Denies и савт. показали противоопухолевое действие с использованием плазмидного вектора, экспрессирующего IL-12, в комбинации с противоопухолевой адьювантной вакцинацией (Denies S et al., 2014). Благодаря тому, что субъединица р40 входит в состав ряда других цитокинов из семейства IL-12, модуляция экспрессии гена IL12B с помощью генотерапевтического подхода дает потенциальные возможности влиять на патологии, связанные с недостаточной экспрессией таких цитокинов как IL-23, IL-27 (Waldner MJ, Neurath MF, 2009).
Таким образом предшествующий уровень техники свидетельствует о том, гены IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B обладают потенциалом для коррекции ряда отклонений, включающих в себя, но не ограничивающихся, инфекционными, аутоиммунными заболеваниями, раком, наследственными и приобретенными патологическими состояниями, а также необходимостью модуляции иммунного ответа. Этим обусловлено объединение генов IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B в рамках данного патента в группу генов. Генетические конструкции, обеспечивающие экспрессию белков, кодируемых генами из группы IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B могут быть использованы для разработки лекарственных препаратов для предотвращения и терапии различных заболеваний и патологических состояний.
Более того, приведенные данные свидетельствуют о том, что недостаточная экспрессия белков, кодируемых генами IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B входящими в группу генов, связана не только с патологическими состояниями, но и с предрасположенность к их развитию. Также приведенные данные свидетельствуют о том, что недостаточная экспрессия данных белков может не проявляться в явном виде в форме патологии, которая может быть однозначно описана в рамках существующих стандартов клинической практики (например, с применением кода МКБ), однако при этом вызывать состояния, которые неблагоприятны для человека и животных и связанны с ухудшением качества жизни.
Анализ подходов для повышения экспрессии целевых генов подразумевает возможность использования различных генотерапевтических векторов. Генотерапевтические векторы разделяют на вирусные, клеточные и ДНК-векторы (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal Products EMA/CAT/801 83/2014). В последнее время в генной терапии всё большее внимание уделяется разработке невирусных систем доставки генетического материала, среди которых лидируют плазмидные векторы. Плазмидные векторы лишены недостатков, присущих клеточным и вирусным векторам. В клетке-мишени они существуют в эписомальной форме, не интегрируют в геном, производство их достаточно дешево, отсутствие иммунного ответа и побочных реакций на введение плазмидного вектора делают их удобным инструментом генной терапии и генетической профилактики (ДНК-вакцины) (Li L, Petrovsky N. // Expert Rev Vaccines. 2016;15(3):313-29).
Тем не менее, ограничениями для использования плазмидных векторов для генной терапии являются: 1) наличие генов устойчивости к антибиотикам для наработки в бактериальных штаммах, 2) наличие различных регуляторных элементов, представленных последовательностями вирусных геномов 3) размер терапевтического плазмидного вектора, определяющий эффективность проникновения вектора в клетку-мишень Известно, что Европейское агентство по лекарственным средствам считает необходимым избегать введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies). Данная рекомендация связана, в первую очередь, с потенциальной опасностью проникновения ДНК-вектора или горизонтального переноса генов антибиотикорезистентности в клетки бактерий, представленных в организме в составе нормальной или оппортунистической микрофлоры. Помимо этого, наличие генов антибиотикорезистентности значительно увеличивает размер ДНК-вектора, что приводит к снижению эффективности его проникновения в эукариотические клетки.
Необходимо отметить, что гены антибиотикорезистентности также вносят принципиальный вклад в способ получения ДНК-векторов. В случае наличия генов антибиотикорезистентности штаммы для наработки ДНК-векторов обычно культивируются в среде, содержащей селективный антибиотик, что создает риск наличия следовых количеств антибиотика в недостаточно очищенных препаратах ДНК-векторов. Таким образом, получение ДНК- векторов для генной терапии, в которых отсутствуют гены антибиотикорезистентности, связано с получением штаммов, обладающих такой отличительной особенностью как способность к стабильной амплификации целевых ДНК- векторов в среде без содержания антибиотиков.
Кроме того, Европейское Медицинское Агентство рекомендует избегать наличия в составе терапевтических плазмидных векторов регуляторных элементов для повышения экспрессии целевых генов (промоторов, энхансеров, посттрансляционных регуляторных элементов), являющихся нуклеотидными последовательностями геномов различных вирусов (Draft Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products, http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_libra ry/Scientific_guideline/2015/05/WC500187020. pdf). Данные последовательности, хотя и могут увеличивать уровень экспрессии целевого трансгена, однако создают риск рекомбинации с генетическим материалом вирусов дикого типа и интеграции в геном эукариотической клетки. Более того, целесообразность гиперэкспрессии того или иного гена в целях терапии остается нерешенным вопросом.
5 Также, существенным моментом является размер терапевтического вектора. Известно, что современные плазмидные векторы зачастую перегружены нефункциональными участками, серьезно увеличивающими размер вектора (Mairhofer J, Grabherr R. // Mol Biotechnol. lo 2008.39(2):97-104). Например, ген устойчивости к ампициллину в векторах серии pBR322, как правило, состоит из не менее чем 1000 п.н., что составляет более 20% от размера самого вектора. При этом наблюдается обратная зависимость между размером вектора и его способностью is проникать в эукариотические клетки - ДНК-векторы с небольшим размером эффективней проникаю в клетки человека и животных. Так, например, в серии экспериментов по трансфекции клеток HELA ДНК-векторами с размером от 383 до 4548 п.н. было показано, что разница в го эффективности проникновения может достигать двух порядков (отличаться в 100 раз) (Hornstein BD et al. // PLoS ONE. 2016; 11 (12): e0167537.).
Таким образом при выборе ДНК-вектора в целях безопасности и наибольшей эффективности следует 25 отдавать предпочтение тем конструкциям, в которых не содержатся гены устойчивости к антибиотикам, последовательности вирусного происхождения и размер которых позволяет эффективно проникать в эукариотические клетки. Штамм для получения такого ДНК-вектора в количествах, достаточных для целей генной терапии, должен обеспечивать возможность стабильной амплификации ДНК-вектора с использованием питательных 5 сред, не содержащих антибиотики.
Примером использования рекомбинантных ДНК- векторов для генной терапии является способ получения рекомбинантного вектора для генетической иммунизации по патенту US 9550998 В2. Вектор представляет собой ю суперскрученный плазмидный ДНК-вектор и предназначен для экспрессии клонированных генов в клетках животных и человека. Вектор состоит из ориджина репликации, регуляторных элементов, включающих промотор и энхансер цитомегаловируса человека, регуляторные элементы из Т- 15 лимфотропного вируса человека.
Накопление вектора проводят в специальном штамме Е. coli без использования антибиотиков за счет антисенс- комплементации гена sacB, введенного в штамм посредством бактериофага. Недостатком данного го изобретения является наличие в составе ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой последовательности вирусных геномов.
Прототипами настоящего изобретения в части использования генотерапевтических подходов для 25 повышения уровня экспрессии генов из группы IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B являются следующие заявки.
В патенте US4808523A описан плазмидный вектор, несущий ген, кодирующий IFNB1. Данный вектор позволяет повышать экспрессию IFNB1 в клетках млекопитающих. Недостатком данного изобретения является способ использования, ограниченный продукцией белка IFNB1 в условиях in vitro и отличный от генотерапевтического использования данного вектора. Также недостатком данного изобретения является наличие в составе вектора последовательностей вирусного происхождения.
В патенте RU2678756 описан генотерапевтический ДНК- вектор VTvaf17, способ его получения, штамм Escherichia coli SCSI 10-AF, способ его получения, штамм Escherichia coli SCSI 10-AF/VTvaf17, несущий генотерапевтический ДНК- вектор VTvaf17, способ его получения. Недостатком данного изобретения является значительный размер векторной части, что может негативно отразиться на эффективности доставки ДНК-вектора в клетки.
В заявке US20040203118A1 описаны полинуклеотиды, кодирующие различные варианты IFNA14, а также терапевтическое средство, представляющее собой вектор, экспрессирующий различные варианты IFNA14. Недостатком данного изобретения является неопределенность целей использования данного изобретения и неопределенные требования к безопасности используемых векторов.
В заявке CN101304758A описана нуклеотидная последовательность, кодирующая IFNA2, а также вектор, экспрессирующий данную последовательность для терапии различных заболеваний, связанных с нарушением экспрессии этого гена. Недостатком данного изобретения является неопределенность требований к безопасности используемого вектора.
В патенте US5723127A описан способ использования белка IL12 для терапевтической иммуномодуляции, в частности в качестве адъюванта. Недостатком данного изобретения является использование белка IL12 вместо генотерапевтического вектора, экспрессирующего ген, кодирующий белок IL12. Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является конструирование генотерапевтических ДНК-векторов для повышения уровня экспрессии группы генов IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B в организме человека и животных, сочетающих в себе следующие свойства:
I) Эффективность генотерапевтического ДНК- вектора для повышения уровня экспрессии целевых генов в эукариотических клетках.
II) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов.
III) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов антибиотикорезистентности. IV) Технологичность получения и возможность наработки генотерапевтического ДНК-вектора в промышленных масштабах.
Пункты II и III предусмотрены в данном техническом решении в соответствии с рекомендациями государственных регуляторов к лекарственным средствам для генной терапии, в частности, Европейского Агентства по лекарственным средствам касательно отказа от введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011,
EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies) и касательно отказа от введения в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии элементов вирусных геномов (Guideline on the quality, non- clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products /
23 March 2015, EMA/CAT/801 83/2014, Committee for Advanced Therapies). Задачей изобретения также является конструирование штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-вектора, для наработки и производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов.
Поставленная задача решается за счет того, что создан генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта, при этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1 содержит кодирующую часть целевого гена IFNB1, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор
GDTT1.8NAS12, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°1, генотерапёвтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNA14 содержит кодирующую часть целевого гена IFNA14, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор
GDTT1.8NAS12, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°2, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNA2 содержит кодирующую часть целевого гена IFNA2, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор
GDTT1.8NAS12, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°3, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL12A содержит кодирующую часть целевого гена IL12A, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°4, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL12B содержит кодирующую часть целевого гена IL12B, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор
GDTT1.8NAS12, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NQ5.
Каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: GDTT1.8NAS12-IFNB1, или GDTT1.8NAS12-IFNA14, или GDTT1.8NAS12-IFNA2, или GDTT1.8NAS12-IL12A, или GDTT1.8NAS12-IL12B за счет ограниченного размера векторной части GDTT1.8NAS12, не превышающей 2600 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки человека и животных и экспрессировать клонированный в него целевой ген IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A, или IL12B.
В составе каждого из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: GDTT 1.8NAS12-IFNB1 , или GDTT1 .8NAS12- IFNA14, или GDTT1.8NAS12-IFNA2, или GDTT1 .8NAS12-IL12A, или GDTT1.8NAS12-IL12B в качестве структурных элементов используются нуклеотидные последовательности, которые не являются генами антибиотикорезистентности, вирусными генами и регуляторными элементами вирусных геномов, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных Создан также способ получения генотерапевтического
ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B, заключающийся в том, что каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: GDTT1.8NAS12-IFNB1, или GDTT1.8NAS12-IFNA14, или GDTT1.8NAS12-IFNA2, или GDTT1.8NAS12-IL12A, или GDTT1.8NAS12-IL12B получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A, или IL12B клонируют в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 и получают генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1 , SEQ ID N°1, или GDTT1.8NAS12-IFNA14, SEQ ID Ns2 или GDTT1.8NAS12-IFNA2, SEQ ID NQ3, ИЛИ GDTT1.8NAS12-IL12A, SEQ ID N24, или GDTT1.8NAS12-IL12B, SEQ ID NQ5 соответственно, при этом кодирующую часть целевого гена IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A, или IL12B получают путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации с использованием созданных олигонуклеотидов и расщеплением продукта амплификации соответствующими эндонуклеазами рестрикции, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят по сайтам рестрикции Sail и Kpnl, или по сайтам рестрикции BamHI и Sail, причем селекцию проводят без антибиотиков, при этом при получении генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12- IFNB1, SEQID N°1 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды
IFNB1-FW AAAGG АТ СС ACC AT G ACC ААС AAGT GT СТССТСС ААА IFNB1-RV
ТТТ GTCG ACT С AGTTTCGG AGGT ААССТ GT AAGT CTG, а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IFNB1 в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, SEQID N°2 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды I F N A 14-Fw TTT GG AT CC ACC AT GGC ATT GCCCTTT GCTTT AAT IFNA14-RV TTT GTCGACT C AATCCTTCCTCCTT AAT CTTTTTTGC , а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IFNA14 в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IFNA2, SEQID Ns3 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды IFNA2-FW
GGGGG AT CC АССАТ GGCCTT G ACCTTTGCTTT ACTGG I F N A2-R V TTT GTCGACT С АТТССТТ АСТТ СТТ АААСТТТ СТТ GC , а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IFNA2 в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12A, SEQID N°4 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды
IL12A-up TTTGTCGACCACCATGTGGCCCCCTGGGTCAGCCTCC IL12A-IO
AATGGT АССТТ AGG AAGC ATT CAGAT AGCT CAT С ACT СТАТС , а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IL12A в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции Sail и Kpnl, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IL12B, SEQID N°5 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды IL12B-up
ТТТ GTCG ACC ACC AT GT GT С ACC AGC AGTT GGT CAT СТ С IL12B-IO ААТ GGT АССТ ААСТ GCAGGGC АС AG AT GCCC А, а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IL12B в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции Sall-Kpnl. Создан способ использования генотерапевтического ДНК- вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта, заключающийся в трансфекции выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК- векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, клеток органов и тканей пациента или 5 животного, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного аутологичных клеток этого пациента или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК- вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК- векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектораs GDTT1.8NAS12 и/или во введении в органы и ткани пациента или животного выбранного генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген на основе генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12 или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены нао основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, или в сочетании обозначенных способов.
Создан способ получения штамма для производства5 генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта, заключающийся в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichia coli JM 110- NAS с последующим проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- IFNA2, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- IL12A, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- IL12B, после чего клетки высеивают на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола с получением в результате штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1 или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA14, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA2, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B.
Заявлен штамм Escherichiacoli JM110-
NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущий генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора или штамм Escherichiacoli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNA14, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IFNA2, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора или штамм Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL12A, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IL12B, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта.
Создан способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IFNB1 или IFNA14 или IFNA2 или IL12A или IL12B для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта, заключающийся в том, что генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNA14, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNA2, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL12A, или генотерапевтический ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12B получают путем того, что засевают в колбу с приготовленной средой затравочную культуру, выбранную из штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA14, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA2, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B, затем инкубируют затравочную среду в шейкере-инкубаторе и переносят ее в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 приведена схема генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B, который представляет собой кольцевую двуцепочечную молекулу ДНК, способную к автономной репликации в клетках бактерии Escherichia coli. На фиг.1 приведены схемы, соответствующие:
1А - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IFNB1,
1В - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IFNA14,
1C - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IFNA2,
1D - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IL12A, 1Е - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-
IL12B.
На схемах отмечены следующие структурные элементы вектора:
EFIa pr - промоторная область гена человеческого фактора элонгации EF1 А с собственным энхансером, содержащимся в первом интроне гена. Служит для обеспечения высокого уровня транскрипции рекомбинантного гена в большинстве тканей человека;
Рамка считывания целевого гена, соответствующая кодирующей части гена IFNB1 (фиг. 1А), или IFNA14 (фиг. 1 В), или IFNA2 (фиг. 1C), или IL12A (фиг. 1D) или IL12B (фиг. 1Е) соответственно; hGH ТА - терминатор транскрипции; pUCori - ориджин репликации, служащий для автономной репликации с однонуклеотидной заменой для повышения копийности плазмиды в клетках большинства штаммов Escherichia coli; RNAout - регуляторный элемент РНК-out транспозона Tn 10, обеспечивающий возможность положительной селекции без использования антибиотиков при использовании штамма Eshcerichia coli JM110NAS.
5 Отмечены уникальные сайты рестрикции.
На фиг.2 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно, гена IFNB1, в первичной культуре ю клеток фибробластов легких человека (АТСС PCS-201-020) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной is активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.
На фиг.2 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
1 - кДНК гена IFNB1 в первичной культуре клеток го фибробластов легких человека до трансфекции ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1,
2 - кДНК гена IFNB1 в первичной культуре клеток фибробластов легких человека после трансфекции ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1,
25 3 - кДНК гена В2М в первичной культуре клеток фибробластов легких человека до трансфекции ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1, 4 - кДНК гена В2М в первичной культуре клеток фибробластов легких человека после трансфекции ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1.
В качестве референтного гена использовали ген В2М человека (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг. 3 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена IFNA14, в культуре клеток аденокарциномы легкого человека SK-LU-1 (АТСС® НТВ-57™) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.
На фиг.З отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
1 - кДНК гена IFNA14 в культуре клеток SK-LU-1 до трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14 2 - кДНК гена IFNA14 в культуре клеток SK-LU-1 после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14,
3 - кДНК гена В2М в культуре клеток SK-LU-1 до трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14,
4 - кДНК гена В2М в культуре клеток SK-LU-1 после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14.
В качестве референтного гена использовали ген В2М человека (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. На фиг.4 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена IFNA2 в клетках эпителия бронхов человека BZR (АТСС® CRL-9483™) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA2 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК. На фиг.4 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
1 - кДНК гена IFNA2 в клетках эпителия бронхов человека BZR до трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA2, 2 - кДНК гена IFNA2 в клетках эпителия бронхов человека BZR после трансфекции ДНК-вектором
GDTT 1.8NAS12-IFNA2,
3 - кДНК гена В2М в клетках эпителия бронхов человека BZR до трансфекции ДНК-вектором GDTT 1.8NAS12-IFNA2,
4 - кДНК гена В2М в клетках эпителия бронхов человека BZR после трансфекции ДНК-вектором
GDTT 1.8NAS12-IFNA2.
В качестве референтного гена использовали ген В2М человека (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг.5 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена IL12A, в культуре клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC (АТСС® PCS-1 00-010™) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12A с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.
На фиг.5 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
1 - кДНК гена IL12A в культуре клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC до трансфекции ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL12A,
2 - кДНК гена IL12A в культуре клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC после трансфекции ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL12A,
3 - кДНК гена В2М в культуре клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC до трансфекции ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL12A, 4 - кДНК гена В2М в культуре клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC после трансфекции ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL12A.
В качестве референтного гена использовали ген В2М человека (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг.6 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена IL12B, в культуре клеток скелетных миобластов человека HSkM до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL12B с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.
На фиг.6 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
1 - кДНК гена IL12B в культуре клеток скелетных миобластов человека HSkM до трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12B,
2 - кДНК гена IL12B в культуре клеток скелетных миобластов человека HSkM после трансфекции ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL12B,
3 - кДНК гена В2М в культуре клеток скелетных миобластов человека HSkM до трансфекции ДНК-вектором GDTT 1.8NAS12-IL12B, 4 - кДНК гена В2М в культуре клеток скелетных миобластов человека HSkM после трансфекции ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL12B,
В качестве референтного гена использовали ген В2М человека (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг.7 показана диаграмма концентрации белка IFNB1 в клеточном лизате первичной культуры клеток фибробластов легких человека (АТСС PCS-201-020) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- IFNB1 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии на уровне белка, по изменению количества белка IFNB1 в лизате клеток.
На фиг.7 отмечены следующие элементы: культура А - первичная культура клеток фибробластов легких человека, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль), культура В - первичная культура клеток фибробластов легких человека, трансфицированных ДНК-вектором
GDTT1 .8NAS12, культура С - первичная культура клеток фибробластов легких человека, трансфицированных ДНК-вектором
GDTT1.8NAS12-IFNB1.
На фиг. 8 показана диаграмма концентрации белка IFNA14 в лизате клеток аденокарциномы легкого человека SK-LU-1 (АТСС® тм
НТВ-57 ), после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-ве гора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IFNA14.
На фиг.8 отмечены следующие элементы: культура A - клетки аденокарциномы легкого человека SK- LU-1, трансфицированные водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль), культура В - клетки аденокарциномы легкого человека SK-LU-1, трансфицированные ДНК-вектором
GDTT1.8NAS12, культура С - клетки аденокарциномы легкого человека SK-LU-1, трансфицированные ДНК-вектором
GDTT1 .8NAS12-IFNA14.
На фиг.9 показана диаграмма концентрации белка IFNA2 в лизате культуры клеток эпителия бронхов человека BZR (АТСС® CRL-9483™) после трансфекции этих клеток ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IFNA2 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК- вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IFNA2.
На фиг.9 отмечены следующие элементы: культура А - культура клеток эпителия бронхов человека BZR, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль), культура В - культура клеток эпителия бронхов человека BZR, трансфицированных ДНК-вектором GDTT1 .8NAS12, культура С - культура клеток эпителия бронхов человека BZR, трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA2. На фиг. 10 показана диаграмма концентрации белка IL12A в лизате культуры клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC (АТСС® PCS-100-010™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12A с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК- вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IL12A. На фиг.10 отмечены следующие элементы: культура А - культура клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль), культура В - культура клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC, трансфицированных ДНК-вектором
GDTT1.8NAS12, культура С - культура клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC, трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12A.
На фиг. 11 показана диаграмма концентрации белка IL12B в лизате культуры клеток скелетных миобластов человека HSkM (Gibco, Кат., N° A12555) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12B с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК- вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IL12B.
На фиг.10 отмечены следующие элементы: культура А - культура клеток скелетных миобластов человека HSkM, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль), культура В - культура клеток скелетных миобластов человека HSkM, трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, культура С - культура клеток скелетных миобластов человека HSkM, трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12B.
На фиг. 12 показана диаграмма концентрации белка IL12A в биоптатах кожи трех пациентов после введения в кожу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12-IL12A с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IL12A. На фиг.12 отмечены следующие элементы:
P1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IL12A,
P1II - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо),
P1III - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка,
P2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IL12A
P2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо),
P2III - биоптат кожи пациента П2 из интактного участка,
P3I - биоптат кожи пациента ПЗ в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IL12A,
P3II - биоптат кожи пациента ПЗ в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо),
P3III - биоптат кожи пациента ПЗ из интактного участка.
На фиг. 13 показана диаграмма концентрации белка IFNA2 в биоптатах икроножной мышцы трех пациентов после введения в икроножную мышцу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IFNA2, с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IFNA2.
На фиг.13 отмечены следующие элементы:
P1I - биоптат икроножной мышцы пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- IFNA2,
P1II - биоптат икроножной мышцы пациента П 1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо),
P1III - биоптат интактного участка икроножной мышцы пациента П1,
P2I - биоптат икроножной мышцы пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора
GDTT1.8NAS12- IFNA2,
P2II - биоптат икроножной мышцы пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора
GDTT1.8NAS12 (плацебо),
P2III - биоптат интактного участка икроножной мышцы пациента П2,
P3I - биоптат икроножной мышцы пациента ПЗ в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора
GDTT1.8NAS12- IFNA2, P3II - биоптат икроножной мышцы пациента ПЗ в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо),
P3III - биоптат интактного участка икроножной мышцы 5 пациента ПЗ.
На фиг.14. показана диаграмма концентрации белка IFNA14 в биоптатах кожи трех пациентов после введения в кожу этих ю пациентов генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12-IFNA14 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе is генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой reH-IFNA14.
На фиг.14 отмечены следующие элементы:
P1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, го П 11I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо)
P1III - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка,
25 P2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, P2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо),
P2III - биоптат кожи пациента П2 из интактного 5 участка,
P3I - биоптат кожи пациента ПЗ в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14,
P3II - биоптат кожи пациента ПЗ в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 ю (плацебо),
P3III - биоптат кожи пациента ПЗ из интактного участка.
На фиг. 15 is показана диаграмма концентрации белка IFNA14 в биоптатах кожи человека после введения в кожу культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14 с целью демонстрации способа применения путем введения го аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14
На фиг.15 отмечены следующие элементы:
П1С - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения культуры аутологичных фибробластов пациента,
25 трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14, П1В - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12,
П1А - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка.
На фиг. 16 показана диаграмма концентраций белков: белка IFNB1 человека, белка IFNA14 человека, белка IFNA2 человека, белка IL12A человека, белка IL12B человека в мышечной ткани трех крыс линии Wistar после инъекционного введения смеси генотерапевтических векторов: генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, генотерапевтического ДНК-вектора, GDTT1.8NAS12-IFNA14, генотерапевтического ДНК-вектора, GDTT1.8NAS12-IFNA2, генотерапевтического ДНК-вектора, GDTT1 .8NAS12-IL12A, генотерапевтического ДНК-вектора, GDTT1.8NAS12-IL12B с целью демонстрации способа применения, смеси генотерапевтических ДНК- векторов. На фиг.16 отмечены следующие элементы:
K1I - фрагмент мышечной ткани крысы К1 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: GDTT1.8NAS12- IFNB1, GDTT1.8NAS12- IFNA14, GDTT1.8NAS12- IFNA2, GDTT1.8NAS12- IL12A и GDTT1.8NAS12- IL12B,
K1II - фрагмент мышечной ткани крысы К1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо), K1 III - фрагмент мышечной ткани контрольного интактного участка крысы К1,
K2I - фрагмент мышечной ткани крысы К2 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: GDTT1.8NAS12- IFNB1, GDTT1 .8NAS12- IFNA14,
GDTT1.8NAS12- IFNA2, GDTT1.8NAS12- IL12A и GDTT1.8NAS12- IL12B,
K2II - фрагмент мышечной ткани крысы К2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо),
K2III - фрагмент мышечной ткани контрольного интактного участка крысы К2,
K3I - фрагмент мышечной ткани крысы КЗ в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: GDTT1.8NAS12- IFNB1, GDTT1.8NAS12- IFNA14,
GDTT1.8NAS12- IFNA2, GDTT1.8NAS12- IL12A и GDTT1.8NAS12- IL12B,
K3II - фрагмент мышечной ткани крысы КЗ в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо),
K3III - фрагмент мышечной ткани контрольного интактного участка крысы КЗ.
На фиг. 17 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена IFNA2 в клетках эндотелия легочной артерии быка СРАЕ (АТСС® CCL-209) до и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA2 с целью демонстрации способа применения путем введения генотерапевтического ДНК-вектора животным
На фиг.17 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие: 1 - кДНК гена IFNA2 в клетках эндотелия легочной артерии быка СРАЕ до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- IFNA2,
2 - кДНК гена IFNA2 в клетках эндотелия легочной артерии быка СРАЕ после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1 .8NAS12- IFNA2
3 - кДНК гена ACT в клетках эндотелия легочной артерии быка СРАЕ до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- IFNA2
4 - кДНК гена ACT в клетках эндотелия легочной артерии быка СРАЕ после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- IFNA2
В качестве референтного гена использовали ген актина быка/ коровы (ACT), приведенного в базе данных GenBank под номером АН001130.2. Реализация изобретения
На основе ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. созданы генотерапевтические ДНК-векторы, несущие целевые гены человека, предназначенные для повышения уровня экспрессии этих целевых генов в тканях человека и животных. При этом способ получения каждого генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевые гены заключается в том, что в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 клонируют белок-кодирующую последовательность целевого гена, выбранного из группы генов: ген IFNB1 (кодирует белок IFNB1), ген IFNA14 (кодирует белок IFNA14), ген IFNA2 (кодирует белок IFNA2), ген IL12A (кодирует белок IL12A), ген IL12B (кодирует белок IL12B) человека. Известно, что способность ДНК-векторов проникать в эукариотические клетки обусловлена, главным образом, размером вектора. При этом ДНК-вектора с наименьшим размером обладают более высокой проникающей способностью. Таким образом, предпочтительным является отсутствие в составе вектора элементов, которые не несут функциональной нагрузки, но при этом увеличивают размер ДНК-вектора. Данные особенности ДНК-векторов были учтены при получении генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B путем отсутствия в составе вектора крупных нефункциональных последовательностей и генов антибиотикорезистентности, что позволило, помимо технологических преимуществ и преимуществ в плане безопасности применения, значительно уменьшить размер полученного генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B. Таким образом, способность проникать в эукариотические клетки полученного генотерапевтического ДНК-вектора обусловлена его небольшими размерами. Каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: ДНК- вектор GDTT 1.8NAS12-IFNB1 , или GDTT1.8NAS12-IFNA14, или GDTT1.8NAS12-IFNA2, или GDTT1.8NAS12-IL12A, или GDTT1.8NAS12-IL12B получали следующим образом: кодирующую часть целевого гена IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A, или IL12B клонировали в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 и получали генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1, SEQ ID NQ1, или GDTT1.8NAS12-IFNA14, SEQ ID N°2 или GDTT 1.8NAS12-IFNA2, SEQ ID Ne3, или GDTT1.8NAS12- IL12A, SEQ ID N°4, или GDTT1.8NAS12-IL12B, SEQ ID Ne5 соответственно. Кодирующую часть гена IFNB1 размером 564 п.н., или гена IFNA14 размером 570 п.н., или гена IFNA2 размером 567 п.н., или гена IL12A размером 762 п.н., или гена IL12B размером 987 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани здорового человека. Для получения первой цепи кДНК генов IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B человека использовали реакцию обратной транскрипции. Амплификацию проводили с использованием созданных для этого методом химического синтеза олигонуклеотидов. Расщепление продукта амплификации специфическими эндонуклеазами рестрикции проводили с учетом оптимальной процедуры дальнейшего клонирования, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводили по сайтам рестрикции BamHI, EcoRI, Hindlll, Kpnl, Sail, расположенными в полилинкере вектора GDTT1.8NAS12. Выбор сайтов рестрикции проводили таким образом, чтобы клонированный фрагмент попадал в рамку считывания экспрессионной кассеты вектора GDTT1.8NAS12, при этом белок- кодирующая последовательность не содержала сайты рестрикции для выбранных эндонуклеаз. При этом специалистам в данной области техники понятно, что методическая реализация получения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT 1.8NAS12-IFNB1 , или GDTT1 .8NAS12- IFNA14, или GDTT 1.8NAS12-IFNA2, или GDTT1.8NAS12- IL12A, или GDTT1.8NAS12-IL12B может варьировать в рамках выбора известных методов молекулярного клонирования генов, при этом эти способы подпадают под объем настоящего изобретения. Так, например, могут быть использованы различные последовательности олигонуклеотидов для амплификации гена IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A, или IL12B различные эндонуклеазы рестрикции или такие лабораторные техники как безлигазное клонирование генов.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IFNB1, или GDTT 1.8NAS1 2-IFNA14, или GDTT1.8NAS12- IFNA2, или GDTT1 .8NAS12-IL12A, или GDTT1 .8NAS12-IL12B обладает нуклеотидной последовательностью SEQ ID Ns1 , или SEQ ID N°2, ИЛИ SEQ ID Ns3, или SEQ ID N°4, или SEQ ID NQ5, соответственно. При этом специалистам в данной области техники известно свойство вырожденности генетического кода, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей, отличающихся инсерцией, делецией или заменой нуклеотидов, которые не приводят к изменению полипептидной последовательности, кодируемой целевым геном, и/или не приводят к потере функциональной активности регуляторных элементов вектора GDTT1.8NAS12. При этом специалистам в данной области техники известно явление генетического полиморфизма, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей генов из группы генов IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B, которые при этом кодируют различные варианты аминокислотных последовательностей белков IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B не отличающихся от приведенных по своей функциональной активности при физиологических условиях.
Способность проникать в эукариотические клетки и функциональную активность, то есть способность экспрессировать целевой ген, полученного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, или GDTT 1.8NAS12-IFNA14, или GDTT1.8NAS12-IFNA2, или GDTT1.8NAS12-IL12A, или GDTT1.8NAS12-IL12B подтверждают путем введения в эукариотические клетки полученного вектора и последующим анализом экспрессии специфической мРНК и/или белкового продукта целевого гена. Наличие специфической мРНК в клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1, или GDTT 1.8NAS12-IFNA14, или GDTT1.8NAS12-IFNA2, или GDTT1.8NAS12-IL12A, или GDTT1 .8NAS12-IL12B свидетельствует как о способности полученного вектора проникать в эукариотические клетки, так и о его способности экспрессировать мРНК целевого гена. При этом, как известно специалистам в данной области техники, наличие мРНК гена является обязательным условием, но не доказательством трансляции белка, 5 кодируемого целевым геном. Поэтому для подтверждения свойства генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12-IFNB1, или GDTT 1.8NAS12-IFNA14, или GDTT1.8NAS12-IFNA2, или GDTT1.8NAS12-IL12A, или GDTT1.8NAS12-IL12B экспрессировать целевой ген на ю уровне белка в эукариотических клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор, проводят анализ концентрации белков, кодируемых целевыми генами, с использованием иммунологических методов. Наличие белка IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A, или IL12B is подтверждает эффективность экспрессии целевых генов в эукариотических клетках и возможность повышения уровня концентрации белка с помощью генотерапевтического ДНК- вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы го генов IFNB1 , IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B. Таким образом для подтверждения эффективности экспрессии созданного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего целевой ген, а именно, ген IFNB1, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, 25 несущего целевой ген, а именно, ген IFNA14, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущего целевой ген, а именно, ген IFNA2, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12A, несущего целевой ген, а именно, ген IL12A, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12B, несущего целевой ген, а именно, ген IL12B, использовали следующие методы: А) ПЦР в реальном времени - изменение накопления ампликонов кДНК целевых генов в лизате клеток человека и животного, после трансфекции различных клеточных линий человека и животного генотерапевтическим ДНК-векторами;
B) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в лизате клеток человека, после трансфекции различных клеточных линий человека генотерапевтическими ДНК-векторами;
C) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека и животного, после введения в эти ткани генотерапевтических ДНК-векторов;
D) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека, после введения в эти ткани аутологичных клеток этого человека, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.
Для подтверждения реализуемости способа применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего целевой ген, а именно, ген IFNB1, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IFNA14, несущего целевой ген, а именно, ген IFNA14, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущего целевой ген, а именно, ген IFNA2, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12A, несущего целевой ген, а именно, ген IL12A, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12B, несущего целевой ген, а именно, ген IL12B, выполняли:
5 А) трансфекцию генотерапевтическими ДНК-векторами различных клеточных линий человека и животного;
B) введение генотерапевтических ДНК-векторов в различные ткани человека и животного;
C) введение в ткани животного смеси ю генотерапевтических ДНК-векторов;
D) введение в ткани человека аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.
Указанные способы применения характеризуются отсутствием потенциальных рисков для генетической is терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов, и за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов устойчивости к го антибиотикам, что подтверждается отсутствием участков, гомологичных вирусным геномам и генам антибиотикорезистентности в нуклеотидных последовательностях генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, или генотерапевтического ДНК- 25 вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, или генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, или генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12A, или генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IL12B (SEQ ID N°1 или SEQ ID N°2 или SEQ ID Ns3 или SEQ ID N°4 или SEQ ID NQ5 соответственно).
Как известно специалистам в данной области техники, гены антибиотикорезистентности в составе 5 генотерапевтических ДНК-векторов используются с целью получения этих векторов в препаративных количествах путем наращивания бактериальной биомассы в питательной среде, содержащей селективный антибиотик. В рамках настоящего изобретения в целях возможности безопасного ю применения генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A, или IL12B, использование селективных питательных сред, содержащих антибиотик, не представляется возможным. В качестве технологического is решения для получения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A, или IL12B для возможности масштабирования до промышленных масштабов получения генотерапевтических векторов го предлагается способ получения штаммов для наработки указанных генотерапевтических векторов на основе бактерии Escherichia coli JM110-NAS. Способ получения штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- 25 IFNA14, или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA2, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B, заключается в получении компетентных клеток штамма Escherichia coli JM110-NAS с введением в эти клетки генотерапевтического ДНК-вектора GDTT 1.8NAS12-IFNB1 , или ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, или ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- 5 IFNA2, или ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12A, или ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-IL12B соответственно с помощью методов трансформации (электропорации), общеизвестных специалистам в данной области техники. Полученный штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT 1.8NAS12-IFNB1 , io или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IFNA14, или штамм Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA2, или штамм Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A, или штамм Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B используется для is наработки генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12-IFNB1, или GDTT 1.8NAS12-IFNA14, или GDTT1.8NAS12-IFNA2, или GDTT1.8NAS12-IL12A, или GDTT1.8NAS12-IL12B соответственно с возможностью использования сред без содержания антибиотиков. 0 Для подтверждения получения штамма Escherichia coli
JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA14, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT 1.8NAS1 2-IFNA2, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A, 5 или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IL12B проводили трансформацию, селекцию и последующее наращивание с выделением плазмидной ДНК. Для подтверждения технологичности получения и возможности масштабирования до промышленного производства генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего целевой ген, а именно, ген IFNB1, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IFNA14, несущего целевой ген, а именно, ген IFNA14, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущего целевой ген, а именно, ген IFNA2, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12A, несущего целевой ген, а именно, ген IL12A, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12B, несущего целевой ген, а именно, ген IL12B, выполняли ферментацию в промышленном масштабе штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1 или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT 1.8NAS12-IFNA14 или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IFNA2, или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1 .8NAS12, несущий целевой ген, а именно IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A, или IL12B.
Способ масштабирования получения бактериальной массы до промышленных масштабов для выделения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B заключается в том, что затравочную культуру штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA14, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA2, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A, или 5 штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B инкубируют в объеме питательной среды без содержания антибиотика обеспечивающим подходящую динамику накопления биомассы, по достижению достаточного количества биомассы в логарифмической фазе роста, ю бактериальную культуру переносят в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы роста, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1, или генотерапевтический ДНК-вектор is GDTT1.8NAS12-IFNA14, или генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12-IFNA2, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL12A или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL12B многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами. При этом го специалистам в данной области техники понятно, что условия культивирования штаммов, состав питательных сред (за исключением содержания антибиотиков), используемое оборудование, методы очистки ДНК могут варьировать в рамках стандартных операционных процедур 25 в зависимости от отдельно взятой производственной линии, но известные подходы к масштабированию, промышленному получению и очистке ДНК-векторов с использованием штамма Escherichia coli J М 110-N AS/G DTT 1.8NAS12-IFNB1, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IFNA14, или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA2, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B или подпадают под объем настоящего изобретения.
Описанное раскрытие изобретения подтверждается примерами реализации настоящего изобретения. Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1.
Получение генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего целевой ген, а именно, гена IFNB1.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1 .8NAS12- IFNB1 конструировали клонированием кодирующей части гена IFNB1 размером 564 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и Sal. Кодирующую часть гена IFNB1 размером 564 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:
IFNB1-FW
AAAGG АТСС АССАТ G ACC ААС AAGT GT СТ ССТСС ААА IFNBI-Rv
TTT GT CG ACT C AGTTT CGGAGGT AACCT GT AAGT CT G и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США). Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали объединением шести фрагментов ДНК, полученных из разных источников:
(а) ориджин репликации получали путем ПЦР- амплификации участка коммерческой плазмиды pUC19 с использованием олигонуклеотидов UCori-Bam, UCori-Nco (перечень последовательностей, (1) -(2));
(б) терминатор транскрипции hGH-TA получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека с использованием олигонуклеотидов hGH-F и hGH-R (перечень последовательностей, (3) и (4));
(в) регуляторный участок транспозона ТпЮ PHK-out получали путем синтеза из олигонуклеотидов RO-F, RO-R, RO- 1 , RO-2, RO-3 (перечень последовательностей, (5) -(9));
(г) ген устойчивости к канамицину получали путем ПЦР- амплификации участка коммерческой плазмиды рЕТ-28 человека с использованием олигонуклеотидов Kan-F и Kan-R (перечень последовательностей, (10) и (11));
(д) полилинкер получали кинированием и отжигом четырех синтетических олигонуклеотидов MCS1, MCS2, MCS3 и MCS4 (перечень последовательностей, (12) - (15));
(е) промоторно-регуляторный участок человеческого гена фактора элонгации EF1a с собственным энхансером получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека с использованием олигонуклеотидов EF1-Xho и EF1-R (перечень последовательностей, (16) - (17)).
ПЦР-амплификацию проводили с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) в соответствии с инструкцией производителя. Фрагменты (а), (б), (в) и (г) имели перекрывающиеся области для возможности их объединения с последующей ПЦР-амплификацией. Объединяли фрагменты (а), (б), (в) и (г) с использованием олигонуклеотидов hGH-F и Kan-R (список последовательностей, (3) и (11)). Далее, полученные фрагменты ДНК объединялись путем рестрикции с последующим лигированием по сайтам BamHI и Ncol. В результате получали вектор, пока еще не содержащий полилинкер. Для его введения проводили расщепление плазмиды эндонуклеазами рестрикции по сайтам BamHI и EcoRI с последующим лигированием с фрагментом (д). В результате получали промежуточный вектор размером 2408 п.н, несущий ген устойчивости к канамицину, пока еще не содержащий промоторно-регуляторный участок гена фактора элонгации EF1a с собственным энхансером. Полученный вектор расщепляли эндонуклеазами рестрикции по сайтам Sail и BamHI с последующим лигированием с фрагментом (е). В результате получали вектор размером 3608 п.н., несущий ген устойчивости к канамицину и промоторно-регуляторный участок гена гена фактора элонгации EF1a с собственным энхансером. Далее ген устойчивости к канамицину выщепляли по сайтам рестрикции Spel, после чего оставшийся фрагмент лигировали сам на себя. Таким образом, получали генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н., который является рекомбинантным, с возможностью селекции без антибиотиков. Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена IFNB1 и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и Sail (New England Biolabs, США).
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IFNB1 размером 3120 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°1 и общей структурой изображенной на фиг.1А.
Пример 2. Получение генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущего целевой ген, а именно, гена IFNA14.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IFNA14 конструировали клонированием кодирующей части гена IFNA14 размером 570 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и Sail. Кодирующую часть гена IFNA14 размером 570 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов: IFNA14-FW
TTT GGAT CC ACC AT GGC ATTGCCCTTT GCTTT AAT IFNA14-RV
TTT GTCG ACT C AAT CCTTCCT CCTT AAT CTTTTTTGC 5 и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и Sail (New England Biolabs, США). ю В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-
IFNA14 размером 3126 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NQ2 И общей структурой изображенной на фиг.1В.
При этом генотерапевтический ДНК-вектор is GDTT1.8NAS12 конструировали по Примеру 1.
Пример 3
Получение ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущего целевой ген, а именно, гена IFNA2 человека го Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-
IFNA2 конструировали клонированием кодирующей части гена IFNA2 размером 567 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и Sail. Кодирующую часть гена IFNA2 размером 567 п.н. получали 25 путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:
IFNA2-FW
GGGGG АТ СС ACC ATGGCCTT G ACCTTTGCTTT ACT GG 5 IFNA2-RV
ТТТ GTCGACT С АТТССТТ АСТТ СТТ АААСТТТ CTTGC и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 ю проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и Sail (New England Biolabs, США).
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IFNA2 размером 3123 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID Ns3 и общей структурой is изображенной на фиг.1C.
При этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали по Примеру 1.
Пример 4. го Получение генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12-IL12A, несущего целевой ген, а именно, гена IL12A.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL12A конструировали клонированием кодирующей части гена 25 IL12A размером 762 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции Sail и Kpnl. Кодирующую часть гена IL12A размером 762 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов: IL12A-up
TTTGTCGACCACCATGTGGCCCCCTGGGTCAGCCTCC
IL12A-IO
AATGGTACCTTAGGAAGCATTCAGATAGCTCATCACTCTATC и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции Sail и Kpnl (New England Biolabs, США).
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IL12A размером 3307 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°4 и общей структурой изображенной на фиг.Ю.
При этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали по Примеру 1.
Пример 5.
Получение генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12B, несущего целевой ген, а именно, гена IL12B. Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL12B конструировали клонированием кодирующей части гена IL12B размером 987 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции Sail и Kpnl. Кодирующую часть гена IL12B размером 987 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого 5 набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:
IL12B-up
ТТТ GTCG АССАСС AT GT GT С ACC AGCAGTTGGT CAT СТ С IL12B-IO AATGGTACCTAACTGCAGGGCACAGATGCCCA ю и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции Sail и Kpnl (New England Biolabs, США). is В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-
IL12B размером 3543 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID Ne5 и общей структурой изображенной на фиг.1Е
При этом генотерапевтический ДНК-вектор го GDTT1.8NAS12 конструировали по Примеру 1.
Пример 6.
Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1 .8NAS12-IFNB1 , несущего целевой ген, а 25 именно, ген IFNB1, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.
Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена IFNB1, в первичной культуре клеток фибробластов легких человека (АТСС PCS-201-020) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущим ген IFNB1 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени Первичную культуру клеток фибробластов легких человека выращивали в стандартных условиях (37 °С, 5% С02) с использованием набора для приготовления питательной среды Fibroblast Growth Kit-Low serum АТСС® PCS-201-041 и среды Fibroblast Basal Medium АТСС® PCS- 201-030. В процессе культивирования каждые 48 ч происходила смена ростовой среды.
Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5x104 клеток/лунку. Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1, экспрессирующим ген IFNB1 человека, проводили с использованием Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США) согласно рекомендациям производителя. В пробирке Ne1 К 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco, США) добавляли 1 мкл раствора ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1 (концентрация 500 нг/мкл) и 1 мкл реагента Р3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. В пробирке N°2 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco, США) добавляли 1 мкл раствора Lipofectamin 3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. Добавляли содержимое пробирки N°1 к содержимому пробирки N22, инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Полученный раствор по каплям 5 добавляли к клеткам в объеме 40 мкл.
В качестве контроля использовали первичную культуру клеток фибробластов легких человека трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена IFNB1 до и ю после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора GDTT1.8NAS12 для трансфекции проводили как описано выше. is Суммарную РНК из первичной культуры клеток фибробластов легких человека выделяли с использованием Trizol Reagent (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. В лунку с клетками добавляли 1 мл Trizol Reagent и гомогенизировали с последующим прогреванием в го течении 5 мин при 65 °С. Далее образец центрифугировали при 14 000д в течении 10 мин и снова прогревали в течении 10 мин при 65 ОС. Далее добавляли 200 мкл хлороформа, плавно перемешивали и центрифугировали при 14 000д в течении 10 мин. Затем отбирали водную фазу, добавляли к 25 ней 1/10 объема ЗМ ацетата натрия, pH 5.2 и равный объем изопропилового спирта. Инкубировали образец при -20 °С в течении 10 мин с последующим центрифугированием при 14 000д в течении 10 мин. Осадок промывали 1 мл 70% этилового спирта, высушивали на воздухе и растворяли в 10 мкл воды, свободной от РНКаз. Определение уровня экспрессии мРНК гена IFNB1 после трансфекции проводили путем оценки динамики накопления ампликонов кДНК методом ПЦР в режиме реального времени. Для получения и амплификации кДНК, специфичной для гена IFNB1 человека, использовали олигонуклеотиды:
IFNB1_SF GT GGCAATT GAATGGGAGGC IFND1_RW AT AGAT GGT C AAT GCGGCGT дина продукта амплификации - 118 п.н.
Реакцию обратной транскрипции и ПЦР-амплификацию проводили с помощью набора реагентов SYBR
GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, США) для ПЦР в режиме реального времени. Реакцию проводили в объеме 20 мкл, содержащих: 25 мкл QuantiTect SYBR Green RT-PCR
MasterMix, 2,5 мМ хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого праймера, 5 мкл РНК. Реакцию осуществляли на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С - 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 30 сек. В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов IFNB1 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество динамику накопления ампликонов кДНК генов IFNB1 и В2М оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio- Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 2.
Из фигуры 2 следует, что в результате трансфекции первичной культуры клеток фибробластов легких человека генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1, уровень специфической мРНК гена IFNB1 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IFNB1 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1 для повышения уровня экспрессии гена IFNB1 в эукариотических клетках. Пример 7.
Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущего целевой ген, а именно, ген IFNA14, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген. Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена IFNA14, в культуре клеток аденокарциномы легкого человека SK-LU-1 (АТСС® НТВ-57™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором 5 GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущим ген IFNA14 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.
Клетки аденокарциномы легкого человека SK-LU-1 культивировали в среде DMEM (GIBCO) с добавлением 10 % ю сыворотки эмбрионов коров в стандартных условиях (37°С, 5% С02). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5x104 клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher is Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14, экспрессирующим ген IFNA14 человека, проводили как описано в примере 6. В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под го номером NM 004048.2. В качестве контроля использовали клетки аденокарциномы легкого человека SK-LU-1 трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим целевой ген (кДНК гена IFNA14 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором 25 GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 6, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 6 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена IFNA14 человека, использовали олигонуклеотиды IFN14_SF GGC ААСС AGTT СС AG AAAGC 5 IFN14_SR С АС АС AGGCTT СС AGGT CAT длина продукта амплификации - 168 п.н.
В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных ю концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов IFNA14 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов IFNA14 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального is времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 3.
Из фигуры 3 следует, что в результате трансфекции го клетки аденокарциномы легкого человека SK-LU-1 генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14, уровень специфической мРНК гена IFNA14 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген 25 IFNA14 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT 1.8NAS12-IFNA14 для повышения уровня экспрессии гена IFNA14 в эукариотических клетках.
Пример 8. Подтверждение способности генотерапевтического
ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущего целевой ген, а именно, ген IFNA2, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.
Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена IFNA2 в культуре клеток эпителия бронхов человека BZR (АТСС® CRL-9483™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущим ген IFNA2 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.
Культуру клеток эпителия бронхов человека BZR выращивали с использованием набора BEGM Kit (Lonza, Catalog No. CC-3170) в стандартных условиях (37°С, 5% С02). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5x104 клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IFNA2, экспрессирующим ген IFNA2 человека, проводили как описано в примере 6. В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве контроля использовали культуру клеток эпителия бронхов человека BZR трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим целевой ген (кДНК гена IFNA2 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 5, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 6 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена IFNA2 человека, использовали олигонуклеотиды IFNA2_SF AGCT G ААТ G АССТ GG AAGCC
IFNA2_SR CTGCTCTGACAACCTCCCAG длина продукта амплификации - 165 п.н.
В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов IFNA2 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов IFNA2 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Г рафики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 4.
Из фигуры 4 следует, что в результате трансфекции культуры клеток эпителия бронхов человека BZR генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA2 уровень специфической мРНК гена IFNA2 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IFNA2 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2 для повышения уровня экспрессии гена IFNA2 в эукариотических клетках. Пример 9.
Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12A, несущего целевой ген, а именно, ген IL12A, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.
Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена IL12A, в культуре клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC (АТСС® PCS-100-010™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12A, несущим ген IL12A человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов «ДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.
Культуру клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC выращивали с использованием среды Vascular Cell Basal Medium и набора Endothelial Cell Growth Kit-BBE (ATCC PCS-1 00-040) в стандартных условиях (37°C, 5% C02). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5x104 клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL12A, экспрессирующим ген IL12A человека, проводили как описано в примере 6. В качестве контроля использовали культуру клеток клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим целевой ген (кДНК гена IL12A до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 6, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 6 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена IL12A человека, использовали олигонуклеотиды
IL12A_SF GCT СС AGAAGGCCAG АСААА IL12A_SR GCC AGGC ААСТССС ATT AGT длина продукта амплификации - 183 п.н. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов IL12A и В2М. В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов IL12A и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio- RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 5. Из фигуры 5 следует, что в результате трансфекции культуры клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12A, уровень специфической мРНК гена IL12A человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IL12A на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12A для повышения уровня экспрессии гена IL12A в эукариотических клетках.
Пример 10. Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12B, несущего целевой ген, а именно, ген IL12B, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.
Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена IL12B, в культуре клеток скелетных миобластов человека HSkM (Gibco, Кат., Ns А12555) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12B, несущим ген IL12B человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени Культуру клеток скелетных миобластов человека HSkM выращивали согласно инструкции фирмы-производителя в стандартных условиях (37°С, 5% С02). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5x104 клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12B, экспрессирующим ген IL12B человека, проводили как описано в примере 6. В качестве контроля использовали культуру клеток скелетных миобластов человека HSkM, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим целевой ген (кДНК гена IL12B до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 6, за 5 исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 6 последовательностями. Для амплификации «ДНК, специфичной для гена IL12B человека, использовали олигонуклеотиды
I L 12 В _ S F AT GCCCCTGG AG АААТ GGT G ю IL12B_SR GGCCAGCATCTCCAAACTCT длина продукта амплификации - 141 п.н.
В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных is концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов IL12B и В2М. В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве отрицательного контроля использовали го деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов IL12B и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio- RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в 25 результате анализа представлены на фиг. 5.
Из фигуры 5 следует, что в результате трансфекции культуры клеток скелетных миобластов человека HSkM генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12B, уровень специфической мРНК гена IL12B человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IL12B на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12B для повышения уровня экспрессии гена IL12B в эукариотических клетках. Пример 11.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего ген IFNB1, для повышения экспрессии белка IFNB1 в клетках млекопитающих Оценивали изменение количества белка IFNB1 в лизате первичной культуре клеток фибробластов легких человека после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- IFNB1, несущим ген IFNB1 человека.
Клеточную культуру фибробластов легких человека выращивали как это описано в примере 6.
Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5x104 кпеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК- вектора (А), ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена IFNB1 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущий ген IFNB1 человека (С). Приготовление комплекса ДН1К/дендример проводили по методике производителя (QIAGEN, SuperFect Transfection Reagent Flandbook, 2002) с некоторыми изменениями. Для трансфекции клеток в одной лунке 24- луночного планшета к 1 мкг flFIK-вектора, растворенного в буфере ТЕ, добавляли культуральную среду до конечного объема 60 мкл, затем добавляли 5 мкп SuperFect Transfection Reagent и осторожно перемешивали пятикратным пипетированием. Комплекс инкубировали при комнатной температуре в течении 10-15 мин. Далее отбирали из лунок культуральную среду, лунки промывали 1 мл буфера PBS. К образовавшемуся комплексу добавляли 350 мкл среды, содержащей 10 мкг/мл гентамицина, осторожно перемешивали и добавляли к клеткам. Клетки инкубировали с комплексом 2-3 часа при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02.
Затем осторожно удаляли среду, промывали клеточный монослой 1 мл буфера PBS. Затем добавляли среду, содержащую 10 мкг/мл гентамицина, и инкубировали 24-48 часов при 37°С в атмосфере 5% С02.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCI, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOFI/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка IFNB1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human IFN-b (Interferon Beta) ELISA Kit (ElabBioscience E-EL- H0085) согласно методике производителя с детекцией 5 оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по ю стандартным образцам с известной концентрацией белка IFNB1, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 18,75 пг/мл, диапазон измерения - от 31,25 пг/мл до 2000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью is программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r- project.org/). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 7.
Из фигуры 7 следует, что трансфекция первичной го культуры клеток фибробластов легких человека генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1 приводит к увеличению количества белка IFNB1 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и 25 экспрессировать ген IFNB1 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1 для повышения уровня экспрессии IFNB1 в эукариотических клетках.
Пример 12. Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущего ген IFNA14, для повышения экспрессии белка IFNA14 в клетках млекопитающих. Оценивали изменение количества белка в культуре клеток аденокарциномы легкого человека SK-LU-1 (АТСС® НТВ-57™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- IFNA14, несущим ген IFNA14 человека. Клетки выращивали как описано в примере 7. Для трансфекции использовали реагент SuperFect
Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена IFNA14 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущий ген IFNA14 человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток SK-LU-1 проводили как описано в примере 11.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCI, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка IFNA14 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human IFNA14 / Interferon Alpha 14 ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences LS-F13512-1) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка IFNA14, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 15,6 пг/мл, диапазон измерения - от 15,6 пг/мл до 1000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r- project.org/). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 8.
Из фигуры 8 следует, что трансфекция культуры клеток аденокарциномы легкого человека SK-LU-1 генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14 приводит к увеличению количества белка IFNA14 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IFNA14 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14 для повышения уровня экспрессии IFNA14 в эукариотических клетках.
Пример 13.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущего ген IFNA2, для повышения экспрессии белка IFNA2 в клетках млекопитающих.
Оценивали изменение количества белка IFNA2 в лизате клеток эпителия бронхов человека BZR после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- IFNA2, несущим ген IFNA2 человека. Клетки культивировали как описано в примере 8.
Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена IFNA2 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущий ген IFNA2 человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток эпителия бронхов человека BZR проводили как описано в примере 11.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCI, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка IFNA2 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human Interferon Alpha 2 ELISA Kit (Abeam, ab233622) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка IFNA2, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 56.04 пг/мл, диапазон измерения - от 187.5 пг/мл до 12000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r- project.org/). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 9.
Из фигуры 9 следует, что трансфекция клеток эпителия бронхов человека BZR генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA2 приводит к увеличению количества белка IFNA2 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IFNA2 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2 для повышения уровня экспрессии IFNA2 в эукариотических клетках.
Пример 14.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12A, несущего ген IL12A, для повышения экспрессии белка IL12A в клетках млекопитающих.
Оценивали изменение количества белка IL12A в лизате культуры клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12A, несущим ген IL12A человека. Клетки культивировали как описано в примере 9.
Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена IL12A (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL12A, несущий ген IL12A человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендримеры и трансфекцию клеток HUVEC проводили как описано в примере 11.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCI, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка IL12A проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human IL12A / р35 ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences LS-F24142-1) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка IL12A, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 4.688 пг/мл, диапазон измерения - от 7.813 пг/мл до 500 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r- project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 10.
Из фигуры 10 следует, что трансфекция культуры клеток HUVEC генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12A приводит к увеличению количества белка IL12A по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IL12A на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12A для повышения уровня экспрессии IL12A в эукариотических клетках.
Пример 15.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12B, несущего ген IL12B, для повышения экспрессии белка IL12B в клетках млекопитающих.
Оценивали изменение количества белка IL12B в лизате культуры клеток скелетных миобластов человека HSkM после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12B, несущим ген IL12B человека. Клетки культивировали как описано в примере 10.
Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена IL12B (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL12B, несущий ген IL12B человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендримеры и трансфекцию клеток HSkM проводили как описано в примере 11.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCI, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
Количественное определение белка IL12B проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human IL12B / IL12 р40 ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences LS-F24549-1) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка IL12B, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 2 пг/мл, диапазон измерения - от 31,2 пг/мл до 2000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 11.
Из фигуры 11 следует, что трансфекция культуры клеток HSkM генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12B приводит к увеличению количества белка IL12B по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IL12B на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12B для повышения уровня экспрессии IL12B в эукариотических клетках.
Пример 16.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12A, несущего ген IL12A, для повышения экспрессии белка IL12A в тканях человека.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12A, несущего целевой ген, а именно, ген IL12A и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка IL12A в коже человека при введении в кожу человека генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12A, несущего ген человека IL12A. С целью анализа изменения количества белка IL12A трем пациентам вводили в кожу предплечья генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL12A, несущий ген IL12A и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена IL12A.
Пациент 1, мужчина 66 лет, (П1); пациент 2, женщина 65 лет, П2); пациент 3, мужчина, 52 года, (ПЗ). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL12A, который содержит кДНК гена IL12A и генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, используемый в качестве плацебо, который не содержит кДНК гена IL12A, каждый из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор GDTT1.8NAS12-IL12A, несущий ген IL12A вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IL12A, несущего ген IL12A - 0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагались на участке предплечья на расстоянии 8-10 см друг от друга.
Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IL12A, несущего ген IL12A (I), генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12
(плацебо) (II), а также из интактных участков кожи (III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCI pH 7.6, 100 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000д. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Количественное определение белка IL12A проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа как это описано в примере 14.
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка IL12A, входящим в состав набора. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 12.
Из фигуры 12 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- IL12A, несущего целевой ген IL12A человека, произошло увеличение количества белка IL12A в сравнении с количеством белка IL12A в области введения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо), не содержащего ген IL12A человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12A и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутрикожном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.
Пример 17.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущего ген IFNA2, для повышения экспрессии белка IFNA2 в тканях человека.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущего целевой ген IFNA2 и реализуемости способа его применения оценивали изменение количества белка IFNA2 в мышечной ткани человека при введении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущего целевой ген, а именно, ген IFNA2 человека. С целью анализа изменения количества белка IFNA2 трем пациентам вводили в ткань икроножной мышцы генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IFNA2, несущий ген IFNA2 с транспортной молекулой, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена IFNA2 с транспортной молекулой.
Пациент 1, женщина 48 лет, (П1); пациент 2, мужчина 32 года (П2); пациент 3, мужчина 54 года, (ПЗ). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция), пробо под готовку проводили в соответствии с рекомендациями производителя.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущий ген IFNA2 вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину около 10 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущего ген IFNA2 - 0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагали медиально на расстоянии 8-10 см друг от друга. Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков мышечной ткани пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущего ген IFNA2 (I), генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) (II), а также из интактного участка икроножной мышцы (III), используя устройство для взятия биопсии MAGNUM (BARD, США). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 20 куб. мм, масса - около 22 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-НС1 pH 7.6, 100 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000д. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
Количественное определение белка IFNA2 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа как это описано в примере 13.
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка IFNA2, входящим в состав набора. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-proiect.ora/y Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 13. Из фигуры 13 следует, что в икроножной мышце всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущего целевой ген, а именно, ген IFNA2 человека, произошло увеличение количества белка IFNA2 в сравнении с количеством белка IFNA2 в области введения генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо), не содержащего ген IFNA2 человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2 и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутримышечном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.
Пример 18. Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1 .8NAS12-IFNA14, несущего ген IFNA14, для повышения экспрессии белка IFNA14 в тканях человека.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущего целевой ген, а именно, ген IFNA14 и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка IFNA14 в коже человека при введении в кожу человека генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущего ген человека IFNA14.
С целью анализа изменения количества белка IFNA14 трем пациентам вводили в кожу предплечья генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущий ген IFNA14 и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена IFNA14. Пациент 1 , женщина 55 лет (П1 ); пациент 2, мужчина 47 лет (П2); пациент 3, мужчина, 60 лет (ПЗ). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNA14, который содержит кДНК гена IFNA14 и генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, используемый в качестве плацебо, который не содержит кДНК гена IFNA14, каждый из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор GDTT1 .8NAS12-IFNA14, несущий ген IFNA14 вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущего ген IFNA14 - 0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагались на участке предплечья на расстоянии 8-10 см друг от друга. Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущего ген IFNA14 (I), генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) (II), а также из интактных участков кожи (III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCI pH 7.6, 100 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000д. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка методом твердофазного иммуноферментного анализа как это описано в примере 12.
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка IFNA14, входящим в состав набора. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 14.
Из фигуры 14 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущего целевой ген IFNA14 человека, произошло увеличение количества белка IFNA14 в сравнении с количеством белка IFNA14 в области введения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо), не содержащего ген IFNA14 человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14 и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутрикожном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.
Пример 19.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущего ген IFNA14 и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка IFNA14 в тканях человека путем введения аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущего ген IFNA14 и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка IFNA14 в коже человека при введении в кожу пациента культуры аутологичных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT 1.8NAS12-IFNA14.
Пациенту вводили в кожу предплечья соответствующую культуру аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущим ген IFNA14, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой культуру аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим ген IFNA14.
Первичную культуру фибробластов человека выделяли из биоптатов кожи пациента. Используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия) брали образец биоптата кожи из зоны, защищенной от действия ультрафиолета, а именно за ушной раковиной или с боковой внутренней поверхности в зоне локтевого сустава, размером около 10 кв. мм, массой - около 11 мг. Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Культивирование первичной культуры клеток осуществляли при 37°С в атмосфере, содержащей 5 % С02 в среде DMEM с 10 % фетальной телячьей сывороткой и ампициллином 100 Ед/мл. Пересев культуры и смену культуральной среды осуществляли каждые 2 дня. Общая продолжительность роста культуры не превышала 25-30 дней. Из культуры клеток отбирали аликвоту, содержащую 5x1 04 клеток. Культуру фибробластов пациента трансфицировали генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущим ген IFNA14 или плацебо - вектор GDTT1.8NAS12, не несущий целевой ген IFNA14.
Трансфекцию осуществляли с помощью катионного полимера полиэтиленимина JETPEI (Polyplus Transfection, Франция), согласно инструкции фирмы-производителя. Клетки культивировали 72 часа и затем вводили пациенту. Введение пациенту культуры аутологичных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14, и плацебо, представляющее собой культуру аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, осуществляли туннельным методом в область предплечья иглой 30G длиной 13 мм на глубину около 3 мм. Концентрация модифицированных аутологичных фибробластов в вводимой суспензии составляла примерно 5 млн клеток на 1 мл суспензии, количество вводимых клеток не превышало 15 млн. Очаги введения культуры аутологичных фибробластов располагались на расстоянии 8-10 см друг от друга.
Биопсийные образцы отбирали на 4-е сутки после введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущим целевой ген, а именно, ген IFNA14 и плацебо. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациента в зоне введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущим целевой ген, а именно, ген IFNA14 (С), культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим целевой ген IFNA14 (плацебо) (В), а также из участков интактной кожи (А), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу в зоне отбора биоптата пациентов предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCI pH 7.6, 100 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000д. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка как это описано в примере 12.
Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 15. Из фигуры 15 следует, что в коже пациента в области введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущим ген IFNA14, произошло увеличение количества белка IFNA14 в сравнении с количеством белка IFNA14 в области введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим ген IFNA14 (плацебо), что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14 и подтверждает реализуемость способа его применения для повышения уровня экспрессии IFNA14 в тканях человека, в частности при введении аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14.
Пример 20.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа сочетанного применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего ген IFNB1, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, несущего ген IFNA14, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущего ген IFNA2, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12A, несущего ген IL12A, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12B, несущего ген IL12B, для повышения уровня экспрессии белков IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A и IL12B в тканях млекопитающих.
Оценивали изменение количества белков IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A и IL12B в зоне мышечной ткани при сочетанном введении в эту зону смеси генотерапевтических векторов. Исследование проводили на 3 лабораторных животных - самцах крысы линии Wistar 8 месячного возраста массой 240-290 г. В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Эквимолярную смесь генотерапевтических ДНК-векторов растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease- Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.
Объем внутримышечно вводимого раствора составлял 0,1 мл с суммарным количеством ДНК 100 мкг. Введение раствора осуществляли с помощью инсулинового шприца. Через 2 сутки после процедуры крыс декапитировали.
Образцы отбирали на 2 сутки после введения генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсийного материала осуществляли из участков правой мышцы бедра в зоне введения смеси пяти генотерапевтических ДНК- векторов, несущих гены IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B (зона I), из участков левой мышцы бедра в зоне введения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) (зона II), а также из участков мышечной ткани, не подвергавшихся никаким манипуляциям ( зона III). Каждый образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-НС1 pH 7.6, 100 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000д. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевых белков как это описано в примере 11 (количественное определение белка IFNB1), примере 12 (количественное определение белка IFNA14), примере 13 (количественное определение белка IFNA2), примере 14 (количественное определение белка IL12A), примере 15 (количественное определение белка IL12B). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 16.
Из фигур 16 следует, что в зоне I, в которую вводилась смесь генотерапевтических векторов: генотерапевтического 5 ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего целевой ген IFNB1, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IFNA14, несущего целевой ген IFNA14, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущего целевой ген IFNA2, генотерапевтического ДНК- ю вектора GDTT1.8NAS12-IL12A, несущего целевой ген IL12A, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12B, несущего целевой ген IL12B, произошло увеличение количества белков IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A и IL12B по сравнению с зоной II (зона плацебо) и зоной III (интактная is зона). Полученные результаты свидетельствуют об эффективности сочетанного применения генотерапевтических ДНК-векторов и подтверждает реализуемость способа применения для повышения уровня экспрессии целевых белков в тканях млекопитающих го Пример 21.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущего ген IFNA2 и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка IFNA2 в клетках млекопитающих.
25 Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущего ген IFNA2 оценивали изменение накопления мРНК целевого гена IFNA2 в клетках эндотелия легочной артерии быка СРАЕ (АТСС® CCL- 209) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- IFNA2, несущим ген IFNA2 человека.
Клетки СРАЕ культивировали в среде DMEM (Gibco) с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (Gibco) в стандартных условиях. Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA2, несущим ген IFNA2 человека и ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим ген IFNA2 человека (контроль), выделение РНК, реакцию обратной транскрипции, ПЦР амплификации и анализ данных проводили как описано в примере 8. В качестве референтного гена использовали ген актина быка/ коровы (ACT), приведенного в базе данных GenBank под номером АН001 130.2. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности генов IFNA2 и ACT. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов IFNA2 и ACT, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1. (Bio-Rad, USA).
Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 17.
Из фигуры 17 следует, что в результате трансфекции клеток эндотелия легочной артерии быка СРАЕ генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA2, уровень специфической мРНК гена IFNA2 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IFNA2 на уровне мРНК. Представленные результаты подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA2 для повышения уровня экспрессии гена IFNA2 в клетках млекопитающих. Пример 22.
Штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IFNB1 или штамм Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA14 или штамм Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA2 или штамм Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A или штамм Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1 .8NAS12-IL12B, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, и способ его получения.
Конструирование штамма для наработки в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК- вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B а именно штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA14, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IFNA2, или штамма Escherichia coli JM110-
NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B, несущего генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1, или GDTT 1.8NAS12-IFNA14, или GDTT1.8NAS12-IFNA2, или GDTT1.8NAS12-IL12A или GDTT1.8NAS12-IL12B соответственно для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков заключается в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichia coli JM110- NAS с проведением электропорации этих клеток гейотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14, или ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IFNA2, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL12A, или ДНК-вектором GDTT1 .8NAS12- IL12B после чего клетки высеваются на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола. При этом штамм Escherichia coli JM110- NAS для наработки генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 или генотерапевтических ДНК-векторов на его основе с возможностью положительной селекции без использования антибиотиков получали путем конструирования линейного фрагмента ДНК, содержащего регуляторный элемент RNA-in транспозона ТпЮ для селекции без применения антибиотиков размером 64 п.н., ген левансахаразы sacB, продукт которого обеспечивает селекцию на сахарозо-содержащей среде размером 1422 п.н., ген устойчивости к хлорамфениколу catR, необходимый для отбора клонов штамма, в которых прошла гомологичная рекомбинация размером 763 п.н. и две гомологичные последовательности, обеспечивающие процесс гомологичной рекомбинации в области гена гесА с одновременной его инактивацией размером 329 п.н. и 233 п.н., после чего проводили трансформацию клеток Escherichia coli путем электропорации и отбирали клоны, выжившие на среде, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола.
Полученные штаммы для наработки были внесены в коллекции Национального биоресурсного центра Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ), РФ и NCIMB Patent Deposit Service, UK с присвоением регистрационных номеров: штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IFNB1 - регистрационный Ns ВКПМ В-13534, дата депонирования 27.11.2019; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY N° NCIMB - 43525, дата депонирования
28.11.2019; штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IFNA14 - регистрационный Ns ВКПМ В-13539, дата депонирования 27.11.2019; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Ns NCIMB - 43520 дата депонирования
28.11.2019; штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IFNA2 - регистрационный Ns ВКПМ В-13536, дата депонирования 27.11.2019; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Ns NCIMB - 43521, дата депонирования
28.11.2019; штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IL12A - регистрационный Ns ВКПМ В-13537, дата депонирования 27.11.2019; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY N° NCIMB - 43524, дата депонирования 28.11.2019; штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IL12B - регистрационный N2 ВКПМ В-13535, дата депонирования 27.11.2019; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Ns NCIMB - 43523, дата депонирования 28.11.2019. Пример 23.
Способ масштабирования получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B до промышленного масштаба.
Для подтверждения технологичности получения и возможности производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1 (SEQ ID N°1), или GDTT1.8NAS12-IFNA14 (SEQ ID N°2), или GDTT1.8NAS12-IFNA2 (SEQ ID N23), или GDTT1.8NAS12- IL12A (SEQ ID N24), или GDTT1.8NAS12-IL12B (SEQ ID N°5) проводили масштабную ферментацию штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA14, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA2, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IL12A, или штамма Escherichia coli JM110-
NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген, а именно IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A, или IL12B. Каждый штамм Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1 .8NAS12-IFNA14, или Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA2, или Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A, или Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B получали на базе штамма Escherichia coli JM110-NAS (Genetic Diagnostics and Therapy 21 Ltd, Великобритания) по примеру 22 путем электропорации компетентных клеток этого штамма генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1, или GDTT1.8NAS12-IFNA14, или GDTT1.8NAS12-IFNA2, или GDTT 1.8NAS12-IL12A, или GDTT1.8NAS12-IL12B, несущим целевой ген, а именно, IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A или IL12B с последующим высевом трансформированных клеток на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы и отбором отдельных клонов.
Ферментацию полученного штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1 проводили в ферментере объемом 10 л с последующим выделением генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12-IFNB1.
Для ферментации штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1 готовили среду, содержащую на 10 л: 100 г триптон, 50 г дрожжевой экстракт (Becton Dickinson, США), доводили водой до 8800 мл и автоклавировали при 121 ОС 20 мин, затем добавляли 1200 мл 50% (вес/объем) сахарозы. Далее засевали в колбу затравочную культуру штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1 в объеме 100 мл. Инкубировали в шейкере-инкубаторе 16 ч при 30°С. Переносили затравочную культуру в ферментер Techfors S (Infors НТ, Швейцария), растили до достижения стационарной фазы Контроль осуществляли измерением оптической плотности культуры при длине волны 600 нм. Клетки осаждали центрифугированием 30 мин при 5000-10000 д. Супернатант удаляли, клеточную массу ресуспендировали в 10% по объему фосфатно-солевого буфера. Повторно центрифугировали 30 мин при 5000-1 ООООд. Супернатант удаляли, к клеточной массе добавляли раствор 20 мМ TrisCI, 1 мМ ЭДТА, 200 г/л сахароза, pH 8,0 в объеме 1000 мл, тщательно перемешивали до образования гомогенной суспензии. Добавляли раствор яичного лизоцима до конечной концентрации 100мкг/мл. Инкубировали 20 мин на льду при бережном перемешивании. Далее, добавляли 2500 мл раствора 0,2 М NaOH, 10 г/л додецил сульфат натрия, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании, затем добавляли 3500 мл раствора ЗМ ацетат натрия, 2М уксусная кислота, pH 5-5,5, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании. Полученный образец центрифугировали 20-30 мин при 15000 g или более. Раствор аккуратно декантировали, от остатков осадка избавлялись фильтрацией через грубый фильтр (фильтровальную бумагу). Добавляли РНКазу A (Sigma, США) до конечной концентрации 20 нг/мл, инкубировали ночь 16 ч при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 20-30 мин при 15000д, затем фильтровали через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм (Millipore, США). Далее проводили ультрафильтрацию через мембрану размером отсечения ЮОкДа (Millipore, США) и разбавляли до начального объема буфером 25 мМ TrisCI, pH 7.0. Операцию повторяли три - четыре раза. Наносили раствор, на колонку с 250 мл сорбента DEAE sepharose HP (GE, США), уравновешенную раствором 25 мМ TrisCI, pH 7.0. После нанесения образца колонку промывали тремя объемами этого же раствора, а затем проводили элюцию генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1 линейным градиентом от раствора 25 мМ TrisCI, pH 7.0 до раствора 25 мМ TrisCI, pH 7.0, 1М NaCI в объеме пяти объемов колонки. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм. Хроматографические фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1, объединяли и проводили гель-фильтрацию на сорбенте Superdex 200 (GE, США). Колонку уравновешивали фосфатно-солевым буфером. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм, фракции анализировали электрофорезом в агарозном геле. Фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1 объединяли и хранили при -20°C. Для оценки воспроизводимости техпроцесса обозначенные технологические операции повторяли пятикратно. Все технологические операции для штаммов Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA14, или 5 Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA2, или Escherichia coli J М 110-N AS/GDTT 1.8 NAS 12-I L 12 А или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B проводили аналогичным образом.
Воспроизводимость техпроцесса и количественные ю характеристики выхода конечного продукта подтверждают технологичность получения и возможность производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, или GDTT 1.8NAS12-IFNA14, или GDTT1.8NAS12-IFNA2, или GDTT1.8NAS12-IL12A, или is GDTT1.8NAS12-IL12B.
Таким образом, созданный генотерапевтический ДНК- вектор с целевым геном может быть использован для введения в клетки организма животных и человека, характеризующихся сниженной или недостаточной го экспрессией белка, кодируемого данным геном, обеспечивая таким образом достижение терапевтического эффекта.
Задача, поставленная в данном изобретении, решена, а именно: конструирование генотерапевтических ДНК- векторов для повышения уровня экспрессии генов IFNB1, 25 IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B, сочетающих в себе следующие свойства:
I) Эффективность повышения экспрессии целевых генов в эукариотических клетках за счет по полученных генотерапевтических векторов с минимальным размером;
II) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического
ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов и генов антибиотикорезистентности; III) Технологичность получения и возможность наработки в штаммах в промышленных масштабах;
IV) Также решена задача по конструированию штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК- вектора для производства этих генотерапевтических ДНК-векторов.
Это подтверждается примерами: для п. I - пример 1, 2, 3, 4, 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18, 19, 20, 21; для п. II - пример 1, 2, 3, 4, 5; для п. Ill и п. IV - пример 22, 23.
Промышленная применимость:
Все представленные выше примеры подтверждают промышленную применимость предлагаемого генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ген IFNB1, ген IFNA14, ген IFNA2, ген IL12A, ген IL12B для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1 или
Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA14 или Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA2 или
Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A или
Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B, несущего генотерапевтический ДНК-вектор, способа получения генотерапевтического ДНК-вектора, способа производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК- вектора.
Перечень сокращений
GDTT1.8NAS12 - вектор генотерапевтический, не содержащий последовательностей вирусных геномов и маркеров антибиотико-резистентности (vector therapeutic virus-antibiotic-free)
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота п.н. - пар нуклеотидов ПЦР - полимеразная цепная реакция мл - миллилитр, мкл - микролитр куб. мм - кубический миллиметр Л - литр мкг - микрограмм мг - миллиграмм г - грамм мкМ - микромоль мМ - миллимоль мин - минута сек - секунда об/мин - обороты в минуту нм - нанометр см - сантиметр мВт - милливатт о.е. ф-относительная единица флуоресценции РВС - фосфатно-солевой буфер PBMC - мононуклеарные клетки периферической крови МНС - главный комплекс гистосовместимости (major histocompatibility complex)

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена IFNB1, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°1.
2. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена IFNA14, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA14, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°2.
115
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
3. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена IFNA2, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNA2, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°3.
4. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена IL12A, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12A, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°4.
5. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения
116
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том 5 числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена IL12B, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением ю генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12B, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NQ5.
6. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B по п.1., п.2., is п.З., п.4., или п.5., отличающийся тем, что каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: GDTT1.8NAS12-IFNB1, или GDTT1.8NAS12-IFNA14, или GDTT1.8NAS12-IFNA2, или GDTT 1.8NAS12-IL12 А, или GDTT1.8NAS12-IL12B по п.1., п.2„ п.З., п.4., или п.5., за счет ограниченного размера векторной го части GDTT1.8NAS12, не превышающей 2600 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки человека и животных и экспрессировать клонированный в него целевой ген IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A, или IL12B .
7. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе 25 генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A, или IL12B по п.1., п.2., п.З., п.4., или п.5., отличающийся тем, что в составе каждого из созданных генотерапевтических ДНК-
117
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) векторов: GDTT 1.8NAS12-IFNB1 , или GDTT1.8NAS12-IFNA14, или GDTT1.8NAS12-IFNA2, или GDTT1.8NAS12-IL12A, или GDTT1.8NAS12-IL12B по п.1., п.2., п.З., п.4., или п.5., в качестве структурных элементов используют нуклеотидные последовательности, которые не являются генами антибиотикорезистентности, вирусными генами и регуляторными элементами вирусных геномов, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных. 8. Способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A, или IL12B по п.1., п.2., п.З., п.4., или п.5., заключающийся в том, что каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: GDTT 1.8NAS12-IFNB1 , или GDTT 1.8NAS12-IFNA14, или GDTT1.8NAS12-IFNA2, или GDTT1.8NAS12-IL12A, или GDTT1.8NAS12-IL12B получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A, или IL12B клонируют в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 и получают генотерапевтический ДНК-вектор GDTT 1.8NAS12-IFNB1 , SEQ ID Na1, или
GDTT1.8NAS12-IFNA14, SEQ ID N°2 или GDTT 1.8NAS12-IFNA2, SEQ ID N°3, или GDTT1.8NAS12-IL12A, SEQ ID NQ4, ИЛИ GDTT1.8NAS12-IL12B, SEQ ID N°5 соответственно, при этом кодирующую часть целевого гена IFNB1, или IFNA14, или IFNA2, или IL12A, или IL12B получают путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции и
118
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) ПЦР-амплификации с использованием созданных олигонуклеотидов и расщеплением продукта амплификации соответствующими эндонуклеазами рестрикции, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят по сайтам рестрикции Sail и Kpnl, или по сайтам рестрикции BamHI и Sail, причем селекцию проводят без антибиотиков, при этом при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 IFNB1, SEQID Ns1 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
IFNB1-FW
AAAGG AT СС ACC AT G ACC ААС AAGT GT CT CCTCC ААА,
IFNB1-RV TTT GTCG ACT С AGTTT CGG AGGT AACCT GT AAGT CT G , а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IFNB1 в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12-IFNA14, SEQID N°2 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют ол и гону кл еоти д ы : IFNA14-FW
TTT GG АТ СС ACCATGGC ATTGCCCTTT GCTTT ААТ,
IFNA14-RV
TTT GT CG ACT С ААТ CCTTCCT CCTT ААТ CTTTTTT GC ,
119
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IFNA14 в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail,
5 причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12- IFNA2, SEQID N°3 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды: ю IFNA2-FW
GGGGG АТ СС ACC AT GGCCTT G АССТТТ GCTTT ACTGG ,
IFNA2-RV
ТТТ GTCG ACT С ATT ССТТ АСТТ СТТ АААСТТТ СТТ GC , а расщепление продукта амплификации и клонирование 15 кодирующей части гена IFNA2 в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IL12A, SEQID N24 для проведения реакции го обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
IL12A-up
TTTGTCGACCACCATGTGGCCCCCTGGGTCAGCCTCC 25 IL12A-IO,
ААТ GGT АССТТ AGG AAGC ATT С AG AT AGCT CAT С АСТСТАТС , а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IL12A в генотерапевтический ДНК-
120
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции Sail и Kpnl, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IL12B, SEQID Ns5 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
IL12B-up
TTT GTCG ACC ACCAT GT GT С ACC AGC AGTT GGT CAT CT С , IL12B-IO AATGGT АССТ ААСТ GC AGGGC АС AG AT GCCC А, а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IL12B в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции Sail и Kpnl. 9. Способ использования генотерапевтического ДНК- вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B по п.1., п.2., п.З., п.4., и/или п.5., для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта, заключающийся в трансфекции выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12, или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК-векторами, несущими целевые гены
121
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, клеток органов и тканей пациента или животного, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного аутологичных клеток этого пациента или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК- вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК- векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 и/или во введении в органы и ткани пациента или животного выбранного генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген на основе генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12 или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, или в сочетании обозначенных способов.
10. Способ получения штамма для производства генотерапевтического ДНК-вектора по п.1., п.2., п.З., п.4., или п.5 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний,
122
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта, заключающийся в получении электрокомпетентных клеток 5 штамма Escherichia coli JM110-NAS с последующим проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNA14, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- IFNA2, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- IL12A, или ДНК- ю вектором GDTT1.8NAS12- IL12B, после чего клетки высеивают на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола с получением в результате штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1 или штамма is Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IFNA14, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IFNA2, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IL12A, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IL12B.
11. Штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT 1.8 NAS 12- го IFNB1, полученный способом по п.10., несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IFNB1, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК- вектора для лечения заболеваний, характеризующихся 25 нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для
123
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта.
12. Штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IFNA14, полученный способом по п.10., несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IFNA14, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта.
13. Штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IFNA2, полученный способом по п.10., несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IFNA2, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта.
14. Штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-
IL12A, полученный способом по п.10., несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IL12A, для его наработки с возможностью селекции без использования
124
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта.
15. Штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-
IL12B, полученный способом по п.10., несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IL12B, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве генотерапевтического адъюванта.
16. Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IFNB1 или IFNA14 или IFNA2 или IL12A или IL12B, по п.1., п.2., п.З., п.4 или п.5., для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением врожденного и адаптивного иммунитета, для терапии аутоиммунных, онкологических, вирусных заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы, для иммуномодуляции в том числе при противоопухолевой вакцинации в качестве
125
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) генотерапевтического адъюванта, заключающийся в том, что генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IFNB1, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNA14, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNA2, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL12A, или генотерапевтический ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL12B получают путем того, что засевают в колбу с приготовленной средой затравочную культуру, выбранную из штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA14, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA2, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B, затем инкубируют затравочную среду в шейкере-инкубаторе и переносят ее в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.
126
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2021/000073 2019-12-26 2021-02-20 Генотерапевтический днк-вектор WO2021167497A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019144190 2019-12-26
RU2019144190A RU2741570C1 (ru) 2019-12-26 2019-12-26 Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген, выбранный из группы генов IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA14, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA2, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021167497A1 true WO2021167497A1 (ru) 2021-08-26

Family

ID=74213122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2021/000073 WO2021167497A1 (ru) 2019-12-26 2021-02-20 Генотерапевтический днк-вектор

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2741570C1 (ru)
WO (1) WO2021167497A1 (ru)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4808523A (en) * 1984-11-07 1989-02-28 Yeda Research And Development Co., Ltd. Constitutive production of human IFN-β1 by mammalian cells transformed by the IFN-β1 gene fused to an SV40 early promoter
CN101304758B (zh) * 2005-06-29 2013-08-21 维兹曼科学研究所耶达研究与发展有限公司 重组干扰素α2（IFNα2）突变体
RU2678756C1 (ru) * 2017-08-25 2019-01-31 Селл энд Джин Терапи Лтд Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5571515A (en) * 1994-04-18 1996-11-05 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Compositions and methods for use of IL-12 as an adjuvant

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4808523A (en) * 1984-11-07 1989-02-28 Yeda Research And Development Co., Ltd. Constitutive production of human IFN-β1 by mammalian cells transformed by the IFN-β1 gene fused to an SV40 early promoter
CN101304758B (zh) * 2005-06-29 2013-08-21 维兹曼科学研究所耶达研究与发展有限公司 重组干扰素α2（IFNα2）突变体
RU2678756C1 (ru) * 2017-08-25 2019-01-31 Селл энд Джин Терапи Лтд Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения

Also Published As

Publication number Publication date
RU2741570C1 (ru) 2021-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11305015B2 (en) Cytomegalovirus vectors eliciting T cells restricted by major histocompatibility complex E molecules
CN114787357A (zh) 用于编辑靶标rna的添加了功能性区域的反义型指导rna
CN118256490A (zh) 一种环状rna、组合物和治疗疾病的方法
Zarghampoor et al. Improved translation efficiency of therapeutic mRNA
CN112481289A (zh) 一种转录环状rna的重组核酸分子及其在蛋白表达中的应用
Reyes-Sandoval et al. CpG methylation of a plasmid vector results in extended transgene product expression by circumventing induction of immune responses
JP2020535805A (ja) 細胞の遺伝子修飾のための非組込みｄｎａベクター
JP6918231B2 (ja) 遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７と生産方法；大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦと生産方法；遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７を保持する大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦ／ＶＴｖａｆ１７と生産方法
KR20160104062A (ko) 인공 핵산 분자
CN108929870B (zh) 抑制HBV的siRNA分子及其应用
EP2307575B1 (en) Unprocessed rolling circle amplification product
US20240307558A1 (en) Gene therapy DNA vector based on gene therapy DNA vector VTvaf17 carrying the therapeutic gene selected from the group of KRT5, KRT14, LAMB3, and COL7A1 genes for increasing the expression level of these therapeutic genes, method of its production and use, Escherichia coli strain SCS110-AF/VTvaf17-KRT5, or Escherichia coli strain SCS110-AF/VTvaf17-KRT14, or Escherichia coli strain SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3, or Escherichia coli strain SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 carrying the gene therapy DNA vector, m
WO2021206587A1 (en) Sars-cov-2 dna vaccine based on gene therapy dna vector gdtt1.8nas12
US9125845B2 (en) DNA vaccines, uses for unprocessed rolling circle amplification product and methods for making the same
RU2741570C1 (ru) Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген, выбранный из группы генов IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA14, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA2, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора
JP6385732B2 (ja) 免疫応答制御剤
JP2024516882A (ja) 構築物と免疫刺激性化合物の共発現
CN115998851A (zh) 一种个体化mRNA组合物、载体、mRNA疫苗及其应用
EP4123029A1 (en) In-vitro transcript mrna and pharmaceutical composition comprising same
WO2020130873A1 (en) Gene therapy dna vector vtvaf17
RU2734726C1 (ru) Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген, выбранный из группы генов DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-DDC, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL10, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL2, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора
CN114107303A (zh) sgRNA、质粒、IRF7功能缺失的细胞系及其构建方法和应用
WO2021137742A1 (ru) Генотерапевтический днк-вектор
Liu et al. Development and application of an uncapped mRNA platform
US20240238407A1 (en) Htlv-1 nucleic acid lipid particle vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21756466

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21756466

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 19/07/2023)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21756466

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1