WO2021164818A1 - Vorrichtung und methode zur analyse von blut - Google Patents

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WO2021164818A1 PCT/DE2021/100119 DE2021100119W WO2021164818A1 WO 2021164818 A1 WO2021164818 A1 WO 2021164818A1 DE 2021100119 W DE2021100119 W DE 2021100119W WO 2021164818 A1 WO2021164818 A1 WO 2021164818A1
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dye
spectrum
determination
measuring cuvette
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Benjamin Kern
Stefan Müller
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Technische Hochschule Lübeck
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    • G01N2201/129—Using chemometrical methods

Definitions

  • the invention relates to a device based on the principle of spectroscopy and a method for analyzing blood parameters, in particular blood parameters such as total hemoglobin, hemoglobin derivatives, hematocrit, bilirubin and glycated hemoglobin in blood.
  • blood parameters such as total hemoglobin, hemoglobin derivatives, hematocrit, bilirubin and glycated hemoglobin in blood.
  • e is a coefficient dependent on the substance and the wavelength and d is the optical Path length through the medium.
  • EP 0807 813 B1 proposes a device for determining blood gas values, in particular oxygen saturation, in whole blood conveyed extracorporeally.
  • the device comprises two monochromatic light sources of different wavelengths and two hollow spaces protruding into one another, one of which is spherical with a diffusely highly reflective surface and the second can accommodate the whole blood sample, which is guided like a tube.
  • the light from the two light sources should essentially only impinge on the surface of the cavity carrying the whole blood sample and be reflected from there into the second cavity, possibly also transmitted and then measured independently of the angle. Because of the monochromatic light sources used here, it is not possible to record broadband spectra of the sample with this method.
  • the sample cell for the spectroscopic determination of fluid samples, in particular whole blood samples.
  • the sample cell comprises two mutually movable parts whose position in relation to one another enables defined positions for calibration, measurement and cleaning of the sample cell.
  • the surface distance of the sections set with the aid of tolerance plates and spacers defines the optical path length d within an interval.
  • EP 2246692 B1 deals with the calibration and characterization of a measuring cuvette with regard to possible contamination by reference measurement with a dye solution.
  • hemoglobin derivatives e.g. oxygenated hemoglobin (0 2 Hb), reduced hemoglobin (HHb), carboxyhemoglobin (COHb ) and methemoglobin (MetHb)
  • hematocrit hematocrit
  • bilirubin and glycated hemoglobin using freely selectable cuvettes with non-predetermined optical path lengths.
  • the object of the invention is achieved by a spectroscopic device for measuring whole blood, which comprises the following components: light source (1) for emitting radiation in the wavelength range between 450 and 700 nm, lens (2), measuring cuvette (4), Integrating sphere (6), spectrometer (8), data processing and control unit (9), display unit (10), pump (11), valve (12) for dosing dye solution (16) and reference liquid (18), valve ( 14) for dosing the whole blood sample (5), storage container (15) for the dye solution (16) and for the reference liquid (18), tubing set (19), sample port (20) and container for collected liquid (21).
  • reference liquid (18) and dye solution (16) are accommodated in two separate storage containers (15) and (17) and are metered in via two separate valves (12, 13).
  • a schematic representation can be found in Figure 2.
  • the lens (2), a collimation lens and a pinhole diaphragm (3) are attached in front of the collimation lens. This is shown in Figure 1.
  • an optical waveguide (7) can be attached between the integrating sphere (6) and the spectrometer (8).
  • the broadband light source (1) which realizes the spectral range 450 to 700 nm, can be, for example, a tungsten-halogen lamp, xenon lamp or white LED.
  • the reference liquid can be a rinsing solution which contains protein remover, for example. Furthermore, the rinsing solution can additionally contain a dye with known absorption properties.
  • the object of the invention is achieved by a method for the spectroscopic determination of parameters in whole blood comprising the following steps: i. Determination of a reference spectrum k as part of a transmission measurement ii. Determination of the spectrum of a dye h as part of a transmission measurement iii. Determination of a correction factor for a measuring cuvette (4), the function of the measuring cuvette being such that dye, reference liquid and whole blood sample are injected into the measuring cuvette and each examined there optically by means of a whole blood spectroscopy device iv. Determination of a whole blood sample spectrum I P as part of a transmission measurement v.
  • k (step i) and k (step ii) are determined with a measurement.
  • incorrect measurement results can be caused by severe contamination and / or inferior and / or non-original measuring cuvette (4) and / or reference liquid (18) and / or dye solution (16) via the determination of the optical path length d are displayed.
  • the dye used does not absorb or fluoresce within the spectral range used to determine the blood parameters. In this way, the dye can be contained in the reference liquid (18) and does not affect the recording of the reference spectrum / 0 . If this is not the case, a calibration spectrum / F with dye solution (16) in the measuring cuvette (4) must first be recorded, which is then recorded with the stored extinction coefficient e, the concentration of the dye solution (16) c and that for the measuring cuvette (4 ) determined optical path length d using the law is corrected by Lambert-Beer in order to restore the original characteristic of the light source (1), the reference spectrum k.
  • NIR near-infrared spectral range
  • SNR signal-to-noise ratio
  • the concentration of the dye c is chosen so that a linear modulation of the spectrometer (8) is ensured and the change in the transmission DT becomes a maximum due to an optical path length Ad deviating from the desired value.
  • the absorption coefficient m 3 of the dye solution which is the product of the molar extinction coefficient e and concentration c, is chosen so that the transmission T at the desired path length d of 100 ⁇ m is between 30% and 45%, preferably between 35% and 42%, particularly preferably between 36% and 41%, very particularly preferably 36.8% (1 / e).
  • the change in the transmission DT is greatest and is approximately between 3.5% and 4%.
  • the optical path length d can be determined particularly precisely.
  • This relationship can be seen in Figure 3.
  • the relationship between signal swing and transmission is shown for the maximum expected deviation of the optical path length Do ⁇ noh 10 pm with a desired path length d of 100 pm, resulting in an optical path length d of 90 pm and 110 pm.
  • ADC analog-to-digital converter
  • the detected signal changes by approximately 2 16 0.9 0.035 «2064 counting events .
  • the noise of the detector may amount to approximately 206 counts for the desired accuracy of 1 pm.
  • Modern spectrometers (8) have an SNR of 300: 1 and better, which guarantees this (2 16 0.9 / 300 «197).
  • the optical path length d of the measuring cuvette (4) should be known to an accuracy of about 1 pm. Deviations lead to changes in the transmission behavior of the sample (5) and must therefore be taken into account in the calculation.
  • the determined optical path length d is outside a specified confidence interval, this can indicate particularly severe contamination or an inferior, possibly non-original measuring cuvette (4) or reference liquid (18) or dye solution (16).
  • the measurement can be stopped in this case and a warning can be displayed to the user.
  • the measurement process is initiated by the user by placing the sample (5) on the sample port (20) and pressing the "Start" control element.
  • the broadband light source (1) for example a tungsten-halogen lamp, xenon lamp or white LED, is switched on and a reference spectrum k or spectrum of a dye k is measured before the sample reaches the measuring cuvette (4). Then sample spectra in the spectral range from 450 to 700 nm are measured until the sample (5) has completely passed the measuring cuvette (4).
  • a sample spectrum / p is selected from the stable plateau that forms when the measuring cuvette (4) is completely filled and the volume flow is constant.
  • the light source (1) is switched off and dark spectra are recorded at the integration times that were used for measuring the reference spectrum k or the calibration spectrum k and sample spectrum l p.
  • the associated dark spectrum is subtracted from all spectra and the values normalized to counting events per second. If the calibration spectrum / F has been determined, it is corrected as described above and the reference spectrum k is calculated from this.
  • the quotient of the sample spectrum / p and the reference spectrum k is then formed, which represents the standardized transmission. This is corrected in a manner known to the person skilled in the art for non-linear effects that occur through the use of the integrating sphere (6) [Prahl2011 Scott A.
  • the correction factor is determined by the geometry of the integrating sphere (6), the ratio of a circular opening facing the sample and its diameter.
  • the measured transmission is greater than its actual value.
  • the feature vector V resulting therefrom serves as input for the regression models stored in the device for the blood parameters to be determined, each of which is represented by a feature vector VR generated from a database. These then supply the values for the blood parameters, which the device finally displays to the user.
  • the measured sample spectrum b is corrected by means of a correction function stored in the data processing and control unit (9) as a function of the previously determined optical path length d.
  • the function can be a constant factor for all wavelengths, but wavelength-dependent functions are also possible.
  • the regression models were previously determined from a large number of blood samples. Influencing variables relevant to the visual behavior, such as the hematocrit, the hemoglobin derivatives ⁇ Hb, HHb, COHb and MetHb and the osmotic concentration, were specifically set and varied over the clinically relevant range. The total transmission of each sample was then measured in a laboratory setup and the associated reference values of the blood parameters were determined. The total hemoglobin (ctHb) and the proportions of the hemoglobin derivatives ⁇ Hb, COHb and MetHb were determined with an OSM 3 hemoximeter radiometer. The mean value was formed from two measurements. HHb was calculated as the difference between the sum of the other derivatives and 100%. The hematocrit was determined by centrifugation of glass capillaries according to DIN 58933-1. Support Vector Regression (SVR) was used as the algorithm. Compared to some other methods, such as neural networks, SVR offers advantages for biological samples:
  • Non-linear relationships can be transformed using a kernel trick
  • a separate regression model was created for each blood parameter. This process is called training. Several so-called hyperparameters influence the adaptation of the models. Their optimal values were determined in an iterative process and the prediction errors of the models were thereby minimized. In order to avoid over- or under-fitting, a 5-fold cross-validation was carried out. Exemplary for one Test data set from 38 samples from 8 individuals that were not part of the data set used for training are the results in Figures 4 and 5 for the predicted values compared to their reference values for the blood parameters C> 2Hb, HHb, COHb, MetHb, ctHb and hematocrit.
  • the performance of the regression models was assessed using the metrics common in machine learning: correlation coefficient (R 2 ), mean square deviation (RMSE) and mean absolute deviation (MAE).
  • R 2 correlation coefficient
  • RMSE mean square deviation
  • MAE mean absolute deviation
  • the correlation coefficient R 2 is greater than 0.975 for all blood parameters and confirms the excellent correlation between prediction and reference.
  • the error in the prediction is sufficiently small with an MAE of always less than 1.97% over the entire clinically relevant range.
  • the cross-sensitivities between the individual parameters are sufficiently low.
  • Fig. 1 Schematic representation of the device according to the invention, with a collimation lens as a lens (2) and a pinhole (3).
  • Fig. 2 Schematic representation of the device according to the invention, with two separate storage containers (15) and (17) for reference liquid (18) and dye solution (16) and separate valves (12, 13) for metering reference liquid (18 ) and dye solution (16).
  • Fig. 3 Relationship between signal swing and transmission of the dye solution with Ad equal to 10 pm.
  • Fig. 4 Predicted fractional proportions of (a) oxygenated hemoglobin (C> 2Hb), (b) reduced hemoglobin (HHb), (c) carboxyhemoglobin (COHb) and (d) methemoglobin (MetHb).
  • C> 2Hb oxygenated hemoglobin
  • HHb reduced hemoglobin
  • COHb carboxyhemoglobin
  • MetHb methemoglobin
  • Fig. 5 Predicted values for (a) total hemoglobin and (b) hematocrit. List of reference symbols

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vollblut-Spektroskopie-Vorrichtung umfassend die folgenden Bestandteile Lichtquelle (1) zur Emission von Strahlung im Wellenlängenbereich zwischen 450 bis 700 nm, Linse (2), Messküvette (4), Ulbrichtkugel (6), Spektrometer (8), Datenverarbeitungs- und Steuereinheit (9), Anzeigeeinheit (10), Pumpe (11), Ventil (12) zur Dosierung von Farbstofflösung (16) und von Referenz-Flüssigkeit (18), Ventil (14) zur Dosierung der Vollblut-Probe (5), Vorratsbehälter (15) für die Farbstofflösung (16) und für die Referenz-Flüssigkeit (18), Schlauchset (19), Probenport (20) und Behälter für aufgefangene Flüssigkeit (21). Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur spektroskopischen Bestimmung von Parametern in Vollblut.

Description

Vorrichtung und Methode zur Analyse von Blut
Die Erfindung betrifft eine auf dem Prinzip der Spektroskopie basierende Vorrichtung und eine Methode zur Analyse von Blutparametern, insbesondere von Blutparametern wie Gesamthämoglobin, Hämoglobinderivaten, Hämatokrit, Bilirubin und glykiertem Hämoglobin in Blut.
Über das Gesetz von Lambert-Beer
I = I0 e £ C d ist ein Zusammenhang zwischen der Konzentration c einer Substanz in einem Medium und der spektroskopisch messbaren Abschwächung der Intensität / gegenüber der Anfangsintensität k gegeben, wobei e ein von der Substanz und der Wellenlänge abhängiger Koeffizient ist und d die optische Pfadlänge durch das Medium. Die Nutzung dieses Zusammenhangs zur Konzentrationsbestimmung wird aber durch einige Faktoren gestört und begrenzt.
So kommt es bei zu hohen Konzentrationen zu Abweichungen von diesem Gesetz, auch aufgrund von Sättigungseffekten. Bei sehr geringen Konzentrationen kann die Nachweisgrenze erreicht werden. Die spektrale Bandbreite und Abweichung der verwendeten Wellenlänge können das Ergebnis verfälschen. Eine besondere Herausforderung stellt die Vermessung von nicht homogenen Proben natürlichen Ursprungs dar, wie zum Beispiel Blut. Im Vollblut befindet sich der größte Teil des Hämoglobins und seiner Derivate in den roten Blutkörperchen. Das umgebende Blutplasma hat einen geringeren Brechungsindex, wodurch es zu Streueffekten an der Grenzschicht kommt. Daher werden Vollblutproben häufig vor der Bestimmung von Blutparametern wie Gesamthämoglobin, Hämoglobinderivaten, Hämatokrit, Bilirubin und glykiertem Hämoglobin einer Hämolyse zur Auflösung der roten Blutkörperchen unterzogen. Zur Hämolyse kommen dabei Ultraschall oder Reagenzien zum Einsatz. Die Notwendigkeit der Hämolyse wird als nachteilig gesehen, da es gegenüber der direkten Messung in Vollblut zu Zeitverlusten kommt und die Blutproben irreversibel verändert werden und so für weitere Messungen nicht mehr zur Verfügung stehen. Erfolgt die Hämolyse nicht vollständig, können weiter Streueffekte auftreten, die zu einem Fehler in der Bestimmung der Blutparameter führen. Ebenfalls nachteilig ist, dass zusätzliche Verbrauchsmittel (z.B. Reagenzien) und gegebenenfalls weitere Komponenten (z.B. Ultraschallerzeuger) für die Hämolyse benötigt werden, womit ein höherer Wartungsaufwand und zusätzliche Kosten verbunden sind.
Ein Verfahren, um Hämoglobinderivate ohne vorherige Hämolyse optisch bestimmen zu können, ist in US 6,262,798 B1 beschrieben. Dabei wird eine empirisch ermittelte Korrekturmatrix verwendet, um die bei 7 Wellenlängen gemessene Extinktion einer Vollblutprobe zu korrigieren und die Konzentrationen anschließend mittels Lambert-Beer bestimmen zu können. Hierfür müssen die verwendeten Einwegküvetten sehr präzise gefertigt werden, so dass deren optische Pfadlänge exakt bekannt ist. Die Probe wird anschließend zusammen mit der Küvette entsorgt und steht nicht für die Analyse weiterer Parameter zur Verfügung. Auch eine Erweiterung des Sensors um zusätzliche Parameter ist aufgrund des Messprinzips nicht ohne Modifikationen an der Hardware möglich.
In den Schriften US 10,088,360 B2, US 10,088,468 B2, US 10,151,630 B2, US 2017/0227397 A1, US 2019/0017993 A1 und US 2019/0033287 A1 werden diverse Aspekte, wie die Kompensation der thermischen Ausdehnung der achromatischen Linsen, sowie die kernel basierten Algorithmen zur Auswertung der Daten und eines optischen Spektrometers zur Vollblutanalyse unter Schutz gestellt. Ein Nachteil dieses modular aufgebauten Systems ist, dass die zu verwendenden Küvetten aufgrund von Fertigungstoleranzen mit einer festen optischen Pfadlänge kodiert werden müssen, welche werksseitig zunächst für jede einzelne Küvette ermittelt und eingespeichert werden muss. Andere Küvetten können nicht verwendet werden, da diesen keine optische Pfadlänge zugeordnet ist.
In der Veröffentlichung REDMER, B. [et al.]: Determination of hemoglobin derivatives in unaltered whole blood samples using Support Vector regression in the spectral ränge from 450 to 700nm. Proceedings of SPIE, Vol. 11247, 14.02.2020. DOI: 10.1117/12.2544806 wird die Anwendung von Support Vector Machines (SVM) zur Auswertung der diffusen Transmissions und Reflektionsspektren im Wellenlängen-Bereich zwischen 450 nm und 700 nm bei der spektroskopischen Untersuchung von Vollblutproben zwecks Bestimmung von Blutparametern wie Hämoglobinderivaten und Hämatokrit vorgeschlagen.
Bei der Veröffentlichung VINCELY, V. [et al.]: Extracting broadband optical properties from uniform optical phantoms using an integrating sphere and inverse adding-doubling. Proceedings of SPIE, Vol. 10486, 19.02.2018. DOI: 10.1117/12.2291950 wird die Verwendung einer Ulbricht- Kugel und die Anwendung von Inverse Adding-Doubling (IAD) Algorithmen zur Bestimmung der optischen Eigenschaften bei der Messung der Reflektions- und Transmissionsspektren beschrieben.
In der EP 0807 813 B1 wird eine Vorrichtung zur Bestimmung von Blutgaswerten insbesondere der Sauerstoffsättigung in extrakorporal gefördertem Vollblut vorgeschlagen. Die Vorrichtung umfasst zwei monochromatische Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlänge und zwei ineinander ragende Hohlräume von denen der eine kugelförmig mit diffus hochreflektierender Oberfläche ist und der zweite die schlauchartig geführte Vollblutprobe aufnehmen kann. Das Licht der beiden Lichtquellen soll dabei im Wesentlichen nur auf die Oberfläche des die Vollblutprobe führenden Hohlraums auftreffen und von dort in den zweiten Hohlraum reflektiert, gegebenenfalls auch transmittiert und anschließend winkelunabhängig vermessen werden. Aufgrund der hier verwendeten monochromatischen Lichtquellen ist es mit diesem Verfahren nicht möglich, breitbandige Spektren der Probe aufzunehmen.
In der DE 699 10 006 T2 wird eine Probenzelle zur spektroskopischen Bestimmung von fluiden Proben insbesondere Vollblutproben beschrieben. Die Probenzelle umfasst zwei gegeneinander bewegliche Teilstücke, deren Stellung zueinander definierte Positionen zur Kalibration, Messung und Reinigung der Probenzelle ermöglicht. Der mit Hilfe von Toleranzplatten und Abstandshaltern eingestellte Oberflächenabstand der Teilstücke definiert dabei die optische Weglänge d innerhalb eines Intervalls. Durch Anpassung kann der Fließweg und damit die Fließgeschwindigkeit der Probe variiert und somit Proben unterschiedlicher optischer Dichte (lysiertes oder Vollblut) vermessen werden. Die Einstellung der optischen Pfadlänge durch die mechanische Veränderung der Probenzelle erfordert eine extrem hohe Präzision und damit einen erheblichen technischen Aufwand sowohl die Fertigung wie auch die Handhabung der notwendigen Toleranzplatten und Abstandshalter betreffend.
Es wäre sehr wünschenswert über ein spektroskopisches Messsystem zu verfügen, welches Vollblutanalysen unter Verwendung von Küvetten zulässt, die nicht vorher einzeln kodiert werden müssen, sondern bei denen die Kodierung über das Gerät erfolgt, in dem die Küvetten genutzt werden. Die EP 2246692 B1 hat die Kalibration und Charakterisierung einer Messküvette in Bezug auf mögliche Verunreinigungen durch Referenzmessung mit einer Farbstofflösung zum Inhalt.
Daher ist es Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches die spektroskopische Analyse von nicht hämolysierten Vollblutproben unter Verwendung von frei wählbaren Küvetten mit nicht vorherbestimmter optischer Pfadlänge zulässt.
Insbesondere ist es Aufgabe der Erfindung eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches die spektroskopische Analyse von nicht hämolysierten Vollblutproben zur Bestimmung der Parameter Gesamthämoglobin, Hämoglobinderivaten (z.B. oxygeniertem Hämoglobin (02Hb), reduziertem Hämoglobin (HHb), Carboxyhämoglobin (COHb) und Methämoglobin (MetHb)), Hämatokrit, Bilirubin und glykiertem Hämoglobin unter Verwendung von frei wählbaren Küvetten mit nicht vorherbestimmter optischer Pfadlänge zulässt.
Die Erfinder haben nun festgestellt, dass sich Parameter in nicht hämolysiertem Vollblut unter Verwendung von frei wählbaren Küvetten, mit nicht vorherbestimmter optischer Pfadlänge bestimmen lassen, wenn die im folgenden beschriebene erfindungsgemäße Vorrichtung und ein spektroskopisches Verfahren mit den folgenden Merkmalen verwendet wird.
• Verwendeter Spektralbereich 450 bis 700 nm (sichtbares Licht) • Messen der im Transmissionsspektrum enthaltenen gestreuten und ungestreuten Anteile
• Erfassen der optischen Pfadlänge der Messküvette
• Erfassen von Verunreinigungen in der Messküvette
• Vermessung der nicht vorbehandelten Blutprobe in einer Messküvette
• Korrektur der gemessenen Spektren mit den Daten der Messküvette
• Extraktion eines Merkmalsvektors V aus dem gemessenen Spektrum
• Erzeugung eines generierten Merkmalsvektors VR mit Hilfe von Mustererkennung nach dem Verfahren Support Vector Regression (SVR)
• Vergleich des Merkmalsvektors V mit dem generierten Merkmalsvektor VR aus einer Datenbank
Dabei stellte sich in so nicht zu erwartender Weise heraus, dass die Präzision, Genauigkeit und Robustheit des erfindungsgemäßen Verfahrens und der ebenfalls erfindungsgemäßen Vorrichtung mehr als ausreichen, um Parameter in nicht hämolysiertem Vollblut unter Verwendung von frei wählbaren Küvetten, mit nicht vorherbestimmter optischer Pfadlänge zu bestimmen. Insbesondere stellte sich unerwarteter Weise heraus, dass bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder der erfindungsgemäßen Vorrichtung allein die Messung der Transmissionsspektren ausreichend ist.
In einem Aspekt wird die Aufgabe der Erfindung gelöst durch eine spektroskopische Vorrichtung zur Vermessung von Vollblut, welche die folgenden Bestandteile umfasst: Lichtquelle (1) zur Emission von Strahlung im Wellenlängenbereich zwischen 450 bis 700 nm, Linse (2), Messküvette (4), Ulbrichtkugel (6), Spektrometer (8), Datenverarbeitungs- und Steuereinheit (9), Anzeigeeinheit (10), Pumpe (11), Ventil (12) zur Dosierung von Farbstofflösung (16) und von Referenz-Flüssigkeit (18), Ventil (14) zur Dosierung der Vollblut-Probe (5), Vorratsbehälter (15) für die Farbstofflösung (16) und für die Referenz-Flüssigkeit (18), Schlauchset (19), Probenport (20) und Behälter für aufgefangene Flüssigkeit (21).
In einer besonderen Ausführungsform der spektroskopischen Vorrichtung sind Referenz- Flüssigkeit (18) und Farbstofflösung (16) in zwei getrennten Vorratsbehältern (15) und (17) untergebracht und werden über zwei Ventile separate Ventile (12, 13) zudosiert. Eine schematische Darstellung findet sich in Abbildung 2.
In einerweiteren besonderen Ausführungsform ist die Linse (2) eine Kollimationslinse und eine Lochblende (3) vor der Kollimationslinse angebracht. Dieses ist in Abbildung 1 dargestellt.
In einerweiteren Ausführungsform kann ein Lichtwellenleiter (7) zwischen der Ulbrichtkugel (6) und dem Spektrometer (8) angebracht sein. Bei der breitbandigen Lichtquelle (1), welche den Spektralbereich 450 bis 700 nm realisiert, kann es sich beispielsweise um eine Wolfram-Halogen-Lampe, Xenon-Lampe oder weiße LED handeln.
Bei der Referenz-Flüssigkeit kann es sich um eine Spüllösung handeln, welche beispielsweise Proteinentferner enthält. Weiterhin kann die Spüllösung zusätzlich einen Farbstoff mit bekanntem Absorptionseigenschaften enthalten.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe der Erfindung gelöst durch ein Verfahren zur spektroskopischen Bestimmung von Parametern in Vollblut umfassend die folgenden Schritte: i. Bestimmung eines Referenzspektrums k im Rahmen einer Transmissionsmessung ii. Bestimmung des Spektrums eines Farbstoffs h im Rahmen einer Transmissionsmessung iii. Ermittlung eines Korrekturfaktors für eine Messküvette (4), wobei die Funktion der Messküvette derart ist, dass Farbstoff, Referenz-Flüssigkeit als auch Vollblut-Probe in die Messküvette injiziert und dort jeweils optisch mittels einer Vollblut-Spektroskopie- Vorrichtung untersucht werden iv. Bestimmung eines Vollblut-Probenspektrums IP im Rahmen einer Transmissionsmessung v. Korrektur des gemessenen Vollblut-Spektrums IP mit dem Korrekturfaktor der Messküvette aus Schritt iii vi. Extraktion eines Merkmalsvektors V aus dem korrigierten gemessenen Vollblut- Probenspektrum Ip vii. Vergleich des Merkmalsvektors V mit einem generierten Merkmalsvektor VR aus einer Datenbank, wobei aus dem Vergleich die Parameter des Vollbluts bestimmt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Bestimmung von k (Schritt i) und k (Schritt ii) mit einer Messung.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können falsche Messergebnisse verursacht von starker Verschmutzung und/oder minderwertiger und/oder nicht originaler Messküvette (4) und/oder Referenz-Flüssigkeit (18) und/oder Farbstofflösung (16) über die Ermittlung der optischen Pfadlänge d angezeigt werden.
Idealerweise absorbiert und fluoresziert der verwendete Farbstoff nicht innerhalb des für die Bestimmung der Blutparameter genutzten Spektralbereichs. Auf diese Weise kann der Farbstoff in der Referenz-Flüssigkeit (18) enthalten sein und beeinflusst nicht die Aufnahme des Referenzspektrums /0. Ist dies nicht der Fall, so muss zunächst ein Kalibrierspektrum /F mit Farbstofflösung (16) in der Messküvette (4) aufgenommen werden, welches anschließend mit dem hinterlegten Extinktionskoeffizienten e, der Konzentration der Farbstofflösung (16) c und der für die Messküvette (4) ermittelten optischen Pfadlänge d unter Anwendung des Gesetzes von Lambert-Beer korrigiert wird, um die ursprüngliche Charakteristik der Lichtquelle (1), das Referenzspektrum k, wiederherzustellen.
Uber
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und
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ist dabei der Zusammenhang zwischen dem gemessenen Kalibrierspektrum und dem erforderlichen Referenzspektrum k gegeben, wobei T die Transmission ist.
Es ist aus zwei Gründen vorteilhaft, einen Farbstoff mit Anregungsmaximum im nahinfraroten Spektralbereich (NIR) zu wählen: Aufgrund des Emissionsspektrums der verwendeten Lichtquelle sowie der Sensitivität des halbleiterbasierten Detektors ergibt sich im NIR ein für die Messung besonders vorteilhaftes hohes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Außerdem ist das von angeregten Farbstoffen emittierte Licht (Fluoreszenz) zu höheren Wellenlängen hin verschoben und würde bei einer zu niedrigen Anregungswellenlänge den für die Messungen genutzten Spektralbereich überlagern. In Frage kommen beispielsweise Farbstoffe aus der Gruppe der Cyanine, wie Cyanin 7.5 oder Indocyaningrün, wobei die genauen optischen Eigenschaften von dem verwendeten Lösungsmittel abhängig sind.
Die Konzentration des Farbstoffs c ist so gewählt, dass eine lineare Aussteuerung des Spektrometers (8) gewährleistet ist und die Änderung der Transmission DT durch eine vom angestrebten Wert abweichende optische Pfadlänge Ad maximal wird. Dies ist der Fall, wenn der Absorptionskoeffizient m3 der Farbstofflösung, der das Produkt von molarem Extinktionskoeffizienten e und Konzentration c ist, so gewählt wird, dass die Transmission T bei der angestrebten Pfadlänge d von 100 pm zwischen 30 % und 45 %, bevorzugt zwischen 35 % und 42 %, besonders bevorzugt zwischen 36 % und 41 %, ganz besonders bevorzugt bei 36,8 % (1/e) liegt. Bei einer maximal zu erwartender Abweichung der optischen Pfadlänge Ad von 10 pm ist die Änderung in der Transmission DT am größten und liegt ungefähr zwischen 3,5 % und 4 %. Dadurch kann die optische Pfadlänge d besonders präzise bestimmt werden. Dieser Zusammenhang ist in Abbildung 3 zu sehen. Es ist der Zusammenhang zwischen Signalhub und Transmission für die maximal zu erwartende Abweichung der optischen Pfadlänge Doίnoh 10 pm bei einer angestrebten Pfadlänge d von 100 pm, resultierend in einer optischen Pfadlänge d von 90 pm und 110 pm, dargestellt. Hat das Spektrometer (8) einen Analog-Digital-Wandler (ADC) mit 16-Bit Auflösung und wird die maximale Aussteuerung auf 90 % des Wertebereichs begrenzt, so ändert sich das detektierte Signal dabei um circa 216 0,9 0,035 « 2064 Zählereignisse. Das bedeutet, dass das Rauschen des Detektors für die angestrebte Genauigkeit von 1 pm ungefähr 206 Zählereignisse betragen darf. Moderne Spektrometer (8) haben ein SNR von 300:1 und besser, wodurch dies gewährleistet ist (216 0,9 / 300 « 197).
Für eine präzise Vorhersage der Blutparameter sollte die optische Pfadlänge d der Messküvette (4) auf etwa 1 pm genau bekannt sein. Abweichungen führen zu Änderungen im Transmissionsverhalten der Probe (5) und müssen daher rechnerisch berücksichtigt werden.
Bei der Fertigung optischer Kunststoffteile im Spritzgussverfahren sind Toleranzen von bis zu ±10 pm zu erwarten. Entscheidend für eine genaue absorptionsspektroskopische Bestimmung der optischen Pfadlänge d ist die geschickte Wahl des Farbstoffs und seiner Konzentration c.
Falls die ermittelte optische Pfadlänge d außerhalb eines festgelegten Konfidenzintervalls liegt, kann dies auf eine besonders starke Verschmutzung oder eine minderwertige, möglicherweise nicht originale Messküvette (4) oder Referenz-Flüssigkeit (18) oder Farbstofflösung (16) hinweisen. Um falsche Ergebnisse zu vermeiden, kann die Messung in diesem Fall unterbunden und dem Anwender eine Warnung angezeigt werden.
Im Folgenden soll exemplarisch die Allgemeinheit der Lehre nicht einschränkend das Vorgehen beschrieben werden.
Der Messvorgang wird vom Benutzer initiiert, indem die Probe (5) auf den Probenport (20) gesetzt und das Bedienelement „Start“ betätigt wird. Die breitbandige Lichtquelle (1), beispielsweise eine Wolfram-Halogen-Lampe, Xenon-Lampe oder weiße LED, wird eingeschaltet und ein Referenzspektrum k bzw. Spektrums eines Farbstoffs k gemessen, bevor die Probe die Messküvette (4) erreicht. Anschließend werden Probenspektren im Spektral bereich von 450 bis 700 nm gemessen, bis die Probe (5) die Messküvette (4) vollständig passiert hat. Aus dem stabilen Plateau, welches sich bei vollständig gefüllter Messküvette (4) und konstantem Volumenstrom herausbildet, wird ein Probenspektrum /p ausgewählt.
Die Lichtquelle (1) wird ausgeschaltet und Dunkelspektren bei den Integrationszeiten aufgenommen, die für die Messung des Referenzspektrums k bzw. des Kalibrierspektrums k und Probenspektrums lp verwendet wurden. Von allen Spektren wird das zugehörige Dunkelspektrum abgezogen und die Werte auf Zählereignisse pro Sekunde normiert. Wurde das Kalibrierspektrum /F bestimmt, so wird dieses wie zuvor beschrieben korrigiert und daraus das Referenzspektrum k berechnet. Anschließend wird der Quotient aus Probenspektrum /p und Referenzspektrum k gebildet, der die normierte Transmission darstellt. Diese wird auf dem Fachmann bekannte Art und Weise um nichtlineare Effekte korrigiert, die durch die Verwendung der Ulbrichtkugel (6) auftreten [Prahl2011 Scott A. Prahl, „Everything I think you should know about Inverse Adding-Doubling“, Handbuch, 2011.] Der Korrekturfaktor ist durch die Geometrie der Ulbrichtkugel (6) bestimmt, dem Verhältnis von einer der Probe zugewandten kreisförmigen Öffnung und ihrem Durchmesser. Dabei ist die gemessene Transmission größer als ihr tatsächlicher Wert. Der daraus resultierende Merkmalsvektor V dient als Eingabe für die im Gerät hinterlegten Regressionsmodelle für die zu bestimmenden Blutparameter, jedes davon repräsentiert durch einen aus einer Datenbank generierten Merkmalsvektor VR. Diese liefern anschließend die Werte für die Blutparameter, welche das Gerät schließlich dem Benutzer anzeigt. Das gemessene Probenspektrum b wird mittels einer in der Datenverarbeitungs- und Steuereinheit (9) hinterlegten Korrekturfunktion abhängig von der zuvor bestimmten optischen Pfadlänge d korrigiert. Die Funktion kann im einfachsten Fall ein für alle Wellenlängen konstanter Faktor sein, jedoch sind auch wellenlängenabhängige Funktionen möglich.
Die Regressionsmodelle wurden zuvor aus einer großen Anzahl von Blutproben ermittelt. Für das optische Verhalten relevante Einflussgrößen, wie beispielsweise der Hämatokrit, die Hämoglobinderivate Ö Hb, HHb, COHb und MetHb und die osmotische Konzentration, wurden dabei gezielt eingestellt und über den klinisch relevanten Bereich variiert. Anschließend wurde die totale Transmission jeder Probe in einem Laboraufbau gemessen und die zugehörigen Referenzwerte der Blutparameter bestimmt. Das Gesamthämoglobin (ctHb) sowie die Anteile der Hämoglobinderivate Ö Hb, COHb und MetHb wurden mit einem Radiometer OSM 3 Hämoximeter bestimmt. Dabei wurde der Mittelwert aus zwei Messungen gebildet. HHb wurde als Differenz der Summe der sonstigen Derivate zu 100 % berechnet. Der Hämatokrit wurde mittels Zentrifugation von Glaskapillaren nach DIN 58933-1 bestimmt. Als Algorithmus kam Support Vector Regression (SVR) zum Einsatz. Gegenüber einigen anderen Verfahren, wie z.B. neuronalen Netzen, bietet SVR Vorteile für biologische Proben:
1. Nicht-lineare Zusammenhänge können über einen Kernel-T rick transformiert werden
2. Nur eine überschaubare Anzahl an Hyperparametern muss optimiert werden
3. Bereits eine relativ kleine Anzahl an Beobachtungen führt zu stabilen Modellen
Für jeden Blutparameter wurde ein eigenes Regressionsmodell erstellt. Dieser Vorgang wird Training genannt. Dabei beeinflussen mehrere sogenannte Hyperparameter die Anpassung der Modelle. Ihre optimalen Werte wurden in einem iterativen Prozess ermittelt und der Vorhersagefehler der Modelle dadurch minimiert. Um eine Über- bzw. Unteranpassung zu vermeiden wurde zudem eine 5-fache Kreuzvalidierung durchgeführt. Beispielhaft für einen Test-Datensatz aus 38 Proben von 8 Individuen, die nicht Bestandteil des zum Training verwendeten Datensatzes waren, sind die Ergebnisse in den Abbildungen 4 und 5 für die vorhergesagten Werte gegenüber ihren Referenzwerten für die Blutparameter C>2Hb, HHb, COHb, MetHb, ctHb und Hämatokrit dargestellt.
Die Performance der Regressionsmodelle wurde mit den im maschinellen Lernen geläufigen Metriken Korrelationskoeffizient (R2), mittlere quadratische Abweichung (RMSE) und mittlere absolute Abweichung (MAE) bewertet. Der Korrelationskoeffizient R2 ist für alle Blutparameter größer als 0,975 und bestätigt die hervorragende Korrelation von Vorhersage und Referenz. Der Fehler in der Vorhersage ist mit einem MAE von stets kleiner 1,97 % über den gesamten klinisch relevanten Bereich ausreichend klein. Die Querempfindlichkeiten zwischen den einzelnen Parametern sind hinreichend gering.
Verzeichnis der Abbildungen:
Abb. 1 : Schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung, mit Kollimationslinse als Linse (2) und Lochblende (3).
Abb. 2: Schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung, mit zwei getrennten Vorratsbehältern (15) und (17) für Referenz-Flüssigkeit (18) und Farbstofflösung (16) und separaten Ventilen (12, 13) für die Dosierung von Referenz-Flüssigkeit (18) und Farbstofflösung (16).
Abb. 3: Zusammenhang zwischen Signalhub und Transmission der Farbstofflösung mit Ad gleich 10 pm.
Abb. 4: Vorhergesagte fraktionelle Anteile von (a) oxygeniertem Hämoglobin (C>2Hb), (b) reduziertem Hämoglobin (HHb), (c) Carboxyhämoglobin (COHb) und (d) Methämoglobin (MetHb). Jedes Kreuz entspricht einer Blutprobe aus dem Testdatensatz. Die perfekte Vorhersage ist durch eine durchgezogene Linie dargestellt. Der lineare Fit der Messdaten ist durch eine gestrichelte Linie dargestellt.
Abb. 5: Vorhergesagte Werte für (a) Gesamthämoglobin und (b) Hämatokrit. Bezugszeichenliste
1 Lichtquelle
2 Linse
3 Lochblende
4 Messküvette
5 Probe
6 Ulbrichtkugel
7 Lichtwellenleiter
8 Spektrometer
9 Datenverarbeitungs- und Steuereinheit
10 Anzeigeeinheit
11 Pumpe
12 Ventil
13 Ventil
14 Ventil
15 Vorratsbehälter
16 Farbstofflösung
17 Vorratsbehälter
18 Referenz-Flüssigkeit
19 Schlauchset
20 Probenport
21 Auffangbehälter

Claims

A N S P R Ü C H E
1. Vollblut-Spektroskopie-Vorrichtung umfassend die folgenden Bestandteile: Lichtquelle (1) zur Emission von Strahlung im Wellenlängenbereich zwischen 450 bis 700 nm, Linse (2), Messküvette (4), Ulbrichtkugel (6), Spektrometer (8), Datenverarbeitungs- und Steuereinheit (9), Anzeigeeinheit (10), Pumpe (11), Ventil (12) zur Dosierung von
Farbstofflösung (16) und von Referenz-Flüssigkeit (18), Ventil (14) zur Dosierung der Vollblut-Probe (5), Vorratsbehälter (15) für die Farbstofflösung (16) und für die Referenz- Flüssigkeit (18), Schlauchset (19), Probenport (20) und Behälter für aufgefangene Flüssigkeit (21).
2. Vollblut-Spektroskopie-Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung für die Referenz-Flüssigkeit (18) ein separaten Vorratsbehälter (17) und ein weiteres Ventil (13) aufweist.
3. Vollblut-Spektroskopie-Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Linse (2) eine Kollimationslinse und eine Lochblende (3) vor der Kollimationslinse ist.
4. Vollblut-Spektroskopie-Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Lichtwellenleiter (7) zwischen der Ulbrichtkugel (6) und dem Spektrometer (8) vorhanden ist.
5. Verfahren zur spektroskopischen Bestimmung von Parametern in Vollblut umfassend die folgenden Schritte: i. Bestimmung eines Referenzspektrums k im Rahmen einer Transmissionsmessung ii. Bestimmung eines Spektrums eines Farbstoffs k im Rahmen einer T ransmissionsmessung iii. Ermittlung eines Korrekturfaktors für eine Messküvette (4), wobei die Funktion der Messküvette derart ist, dass Farbstoff, Referenz-Flüssigkeit als auch Vollblut-Probe in die Messküvette injiziert und dort jeweils optisch mittels einer Vollblut-Spektroskopie- Vorrichtung untersucht werden iv. Bestimmung eines Vollblut-Probenspektrums IP im Rahmen einer T ransmissionsmessung v. Korrektur des gemessenen Vollblut-Spektrums IP mit dem Korrekturfaktor der Messküvette (4) aus Schritt iii vi. Extraktion eines Merkmalsvektors Vaus dem korrigierten gemessenen Vollblut- Probenspektrum Ip vii. Vergleich des Merkmalsvektors V mit einem generierten Merkmalsvektor VR aus einer Datenbank, wobei aus dem Vergleich die Parameter des Vollbluts bestimmt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung von k (Schritt i) und IF (Schritt ii) mit einer Messung erfolgt.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 5 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Transmission der Farbstofflösung bei einer optischen Pfadlänge d von 100 pm zwischen 30 % und 45 %, bevorzugt zwischen 35 % und 42 %, besonders bevorzugt zwischen 36 % und 41 %, ganz besonders bevorzugt bei 36,8 % (1/e) liegt.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Farbstoff ein Anregungsmaximum im nahinfraroten Spektralbereich (NIR) aufweist.
9. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Farbstoff ein Cyan in- Farbstoff ist.
10. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Farbstoff Cyanin 7.5 und/oder Indocyaningrün ist.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass falsche Messergebnisse verursacht von starker Verschmutzung und/oder minderwertiger und/oder nicht originaler Messküvette (4) und/oder Referenz-Flüssigkeit (18) und/oder Farbstofflösung (16) über die Ermittlung der optischen Pfadlänge d angezeigt werden.
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