WO2021162457A1 - 패칼리박테리움 속 미생물을 이용한 항암 치료 - Google Patents

패칼리박테리움 속 미생물을 이용한 항암 치료 Download PDF

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WO2021162457A1
WO2021162457A1 PCT/KR2021/001791 KR2021001791W WO2021162457A1 WO 2021162457 A1 WO2021162457 A1 WO 2021162457A1 KR 2021001791 W KR2021001791 W KR 2021001791W WO 2021162457 A1 WO2021162457 A1 WO 2021162457A1
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WO
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cancer
faecalibacterium
tumor
strain
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PCT/KR2021/001791
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English (en)
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곽민정
김현
강우림
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주식회사 천랩
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Definitions

  • the present invention relates to a use for improving, preventing, or treating cancer by using a microorganism of the genus Faecalibacterium to improve or increase the therapeutic efficacy of an anticancer agent.
  • Cancer chemotherapy is preferably based on the use of drugs that kill replicating cells faster than the agent kills normal cells in the patient.
  • Surgery is used to remove the tumor mass, but it has little effect once the cancer has metastasized. Radiation is only effective in localized areas.
  • Chemotherapy agents frequently cause two complications that require treatment with antibiotics: mucositis (a weakened mucosal barrier associated with bacterial translocation) and neutropenia.
  • mucositis a weakened mucosal barrier associated with bacterial translocation
  • neutropenia neutropenia
  • Immune checkpoint single antibody is a strategy to kill cancer cells through cancer cell-specific immune cell activation by suppressing this immune evasion mechanism.
  • immune checkpoint inhibitors may be associated with substantial toxicity, and only one subset of patients may benefit. It is still unclear what contributes to this enhanced response in these patients, and there is a great need to identify viable strategies to improve response to therapy in all patients.
  • One embodiment of the present invention provides a method, composition or kit for preventing, ameliorating or treating cancer by modulating a microorganism to enhance the efficacy of immune checkpoint blockade.
  • the present invention relates to the use of microorganisms or microbial agents for improving the efficacy of immune checkpoint blockade therapies.
  • An example of the present invention relates to a combination anticancer therapy of a microorganism of the genus Faecalibacterium and an immune checkpoint inhibitor.
  • the present invention relates to the use of the microbiome to improve the efficacy of immune checkpoint blockade therapy, and to prevent, ameliorate or treat cancer by modulating the microbiome to enhance the efficacy of immune checkpoint blockade. It relates to methods, compositions and kits for
  • an embodiment of the present invention provides a method and composition for preventing, ameliorating or treating cancer by modulating the microbiome to enhance the efficacy of immune checkpoint blockade.
  • the microorganism of the genus Faecalibacterium according to the present invention has anticancer activity, it is possible to achieve a more excellent anticancer therapeutic effect by improving the efficacy of checkpoint blocking therapy and providing anticancer activity.
  • the microorganism of the genus Faecalibacterium according to the present invention has anti-inflammatory activity, it can exhibit a more synergistic effect on the therapeutic effect of inflammation-related cancer, for example, colitis-related colorectal cancer.
  • An example of the present invention relates to a combination anticancer therapy of a microorganism of the genus Faecalibacterium and an immune checkpoint inhibitor.
  • a first microorganism preparation comprising an isolated microorganism of the genus Faecalibacterium having 16S rDNA having at least 98.5% sequence identity with the 16S rDNA sequence of Faecalibacterium cancerinhibens;
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising a second agent comprising at least one immune checkpoint inhibitor.
  • a further embodiment of the present invention is an isolated microbial preparation having 16S rDNA having at least 98.5% sequence identity with the 16S rDNA sequence of Faecalibacterium cancerinhibens; And it relates to a pharmaceutical kit for the prevention or treatment of cancer comprising at least one immune checkpoint inhibitor.
  • a further embodiment of the present invention is a first microbial preparation comprising an isolated microorganism of the genus Faecalibacterium having 16S rDNA having at least 98.5% sequence identity with the 16S rDNA sequence of Faecalibacterium cancerinhibens; and a second agent comprising at least one immune checkpoint inhibitor.
  • a further embodiment of the present invention is an immune checkpoint inhibitor comprising an isolated microorganism of the genus Faecalibacterium having 16S rDNA having at least 98.5% sequence identity with the 16S rDNA sequence of Faecalibacterium cancerinhibens. It relates to a microbial agent for enhancing the efficacy of
  • a further embodiment of the present invention is a microbial preparation containing a microorganism of the genus Faecalibacterium for use in a method for preventing, ameliorating or treating cancer in a human subject, wherein the method comprises administering the microbial preparation and an immune checkpoint inhibitor to a human subject. co-administration, wherein the microorganism of the genus Faecalibacterium is isolated having a 16S rDNA sequence having at least 98.5% sequence identity with a 16S rDNA sequence of Faecalibacterium cancerinhibens. It is a microorganism of the genus Faecalibacterium.
  • a further embodiment of the present invention is an immune checkpoint inhibitor for use in a method for preventing, ameliorating or treating cancer in a human subject, wherein the method comprises administering a microbial preparation comprising the immune checkpoint inhibitor and a microorganism of the genus Faecalibacterium to a human. Co-administration in a subject, wherein the microorganism of the genus Faecalibacterium has a 16S rDNA sequence of Faecalibacterium cancerinhibens and 16S rDNA having at least 98.5% sequence identity. It is an isolated microorganism of the genus Faecalibacterium.
  • the first microbial agent and the second agent may be formulated in effective amounts, respectively, and administered simultaneously or sequentially.
  • the pharmaceutical composition for concurrent administration includes a first pharmaceutical composition comprising an effective amount of a microorganism of the genus Faecalibacterium as an active ingredient, and a second pharmaceutical composition comprising an effective amount of an immune checkpoint inhibitor as an active ingredient.
  • it may be a pharmaceutical composition for combined pharmaceutical administration for sequential administration. In the case of sequential administration, the order may be interchanged.
  • said first microbial formulation comprises a liquid, suspension, gel, geltab, semi-solid, tablet, sachet, lozenge, capsule, or enteral formulation It may be formulated to be delivered into the intestine as a tablet or capsule, and more specifically, it may be a tablet or capsule formulated for oral delivery, and more specifically, the tablet or capsule may include an acid-resistant enteric coating.
  • the microbial preparation may further include prebiotics, and the additional prebiotics are not particularly limited as long as they help the growth, survival or proliferation of microorganisms in the genus Faecalibacterium according to the present invention. does not
  • the immune checkpoint inhibitor may be administered intratumorally, intraarterially, intravenously, intravascularly, intrapleurally, intraperitoneally, intratracheally, intrathecally, intramuscularly, endoscopically, intralesional, transdermally, subcutaneously, locally It may be administered regionally, stereotactically, orally, by direct injection or perfusion.
  • the immune checkpoint inhibitor may be administered intravenously, and the microbial agent may be administered orally.
  • the second agent is 0 days, within 1 day, within 5 days, within 1 week, within 8 days, within 2 weeks, within 3 weeks, within 1 month, within 1.5 months from the date of administration of the first microbial agent , within 2 months, within 2.5 months, within 3 months, or within 6 months.
  • the first agent is within 1 day, within 5 days, within 1 week, within 8 days, within 2 weeks, within 3 weeks, within 1 month, within 1.5 months from the date of administration of the second microbial agent, It may be administered within 2 months, within 2.5 months, within 3 months, or within 6 months.
  • the first microbial agent may be administered twice a day, once a day, once a day, or once every three days.
  • the anticancer activity of the composition according to the present invention may be an activity of inhibiting the occurrence or progression of cancer. Specifically, it may delay the development of a tumor or inhibit the growth rate of the tumor, and may further have an activity of preventing and/or inhibiting cancer metastasis by inhibiting the growth rate of the tumor.
  • Cancer refers to a physiological condition in an animal, typically characterized by abnormal or uncontrolled cell growth. Cancer and cancer pathology include, for example, metastasis, interference with normally functioning surrounding cells, release of cytokines or other secretion products at abnormal levels, inhibition or enhancement of inflammatory or immunological responses, neoplasia, precancer ( premalignancy, malignancy, surrounding or distant tissues or organs, such as lymph node invasion.
  • metastasis interference with normally functioning surrounding cells
  • release of cytokines or other secretion products at abnormal levels inhibition or enhancement of inflammatory or immunological responses
  • neoplasia precancer ( premalignancy, malignancy, surrounding or distant tissues or organs, such as lymph node invasion.
  • precancer premalignancy, malignancy, surrounding or distant tissues or organs, such as lymph node invasion.
  • the cancer may be gastrointestinal cancer or non-gastrointestinal cancer.
  • the gastrointestinal cancer may be, for example, one or more cancers selected from the group consisting of esophageal cancer, gallbladder cancer, liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, small intestine cancer, colorectal cancer, colon cancer, anal cancer and rectal cancer.
  • the non-gastrointestinal cancer includes, without limitation, malignant tumors occurring in organs other than the gastrointestinal tract or digestive system, for example, leukemia, lung cancer, prostate cancer, breast cancer, bladder cancer, kidney cancer, multiple myeloma, cervical cancer, thyroid cancer, ovarian cancer, urethral cancer cancer, skin cancer, osteosarcoma, glioblastoma, brain tumor or lymphoma, but is not limited thereto.
  • malignant tumors occurring in organs other than the gastrointestinal tract or digestive system for example, leukemia, lung cancer, prostate cancer, breast cancer, bladder cancer, kidney cancer, multiple myeloma, cervical cancer, thyroid cancer, ovarian cancer, urethral cancer cancer, skin cancer, osteosarcoma, glioblastoma, brain tumor or lymphoma, but is not limited thereto.
  • the cancer includes liver cancer, colorectal cancer, melanoma, lung cancer, kidney cancer, bladder cancer, stomach cancer, cervical cancer, esophageal cancer, B-cell lymphoma, Hodgkin's lymphoma, Merkel cell cancer, specifically liver cancer , colon cancer, melanoma, lung cancer.
  • the melanoma may be metastatic melanoma, malignant black wart, malignant black wart melanoma, superficial diffuse melanoma, nodular melanoma, lentiginous melanoma or fibrous melanoma.
  • the cancer may be colorectal cancer, and the colorectal cancer includes a malignant tumor occurring in one or more sites selected from the group consisting of ascending colon, transverse colon, descending colon, sigmoid colon, and rectal mucosa. do.
  • the colorectal cancer may be one or more types selected from the group consisting of adenocarcinoma, lymphoma, malignant carcinoid, leiomyosarcoma, Kaposi's sarcoma, and squamous cell carcinoma, but is not limited thereto.
  • the colorectal cancer is chromosomal instability (CIN) colorectal cancer, microsatellite stable or microsatellite instability (MSI) colorectal cancer, or CpG Island methylator phenotype (CIMP) according to molecular pathological classification. ), and the mechanism of occurrence due to chromosomal instability is called a microsatellite-stable pathway (MSS) or adenomatous polyposis coli (APC)/beta-catenin pathway.
  • the microorganism according to the present invention has anti-inflammatory activity along with anti-cancer activity, and thus has a preventive or therapeutic effect in both inflammatory colitis (IBD) and colorectal cancer.
  • the colorectal cancer may be colis associated colon cancer.
  • the combination composition of the microbial agent and the immune checkpoint inhibitor according to the present invention has a preventive or therapeutic effect on various carcinomas, and in particular can be effectively applied to colon cancer, liver cancer, and the like.
  • the microorganism according to the present invention includes microorganisms of the genus Faecalibacterium having anticancer activity, for example, anticancer activity against colon cancer.
  • the microorganism includes live cells, dead cells, dried cells, or freeze-dried products.
  • extracellular components cell membrane phospholipids, cell membrane proteins, cell membrane polysaccharides, etc.
  • live metabolites metabolites such as butyrate, secreted proteins, etc.
  • the content of microorganisms contained in the microbial preparation according to the present invention is at least 1X10 3 CFU or more per unit weight (g) in dry matter, for example, at least 1X 10 3 CFU or more, 1X 10 4 CFU or more, 1X 10 5 CFU or more, 1X It may be 10 6 CFU or more, 1X 10 7 CFU or more, or 1X 10 8 CFU or more, for example, 1X 10 2 CFU to 1X 10 12 CFU.
  • the content of microorganisms contained in the microbial preparation according to the present invention may be expressed as the number of viable cells, for example, the viable cell count (VCC) by cell staining is per unit weight (g) when provided as a dried product.
  • 1X10 3 or more may be in the range of 1X10 3 to 1X10 13.
  • the anticancer activity of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain provided by the present invention may be an activity of inhibiting the occurrence or progression of cancer. Specifically, it may delay the development of a tumor or inhibit the growth rate of the tumor, and may further have an activity of preventing and/or inhibiting cancer metastasis by inhibiting the growth rate of the tumor.
  • the tumor may be a tumor caused by colon cancer or a tumor caused by colon cancer and liver cancer.
  • the Faecalibacterium cancerinhibins CLCC1 strain was isolated from the feces of healthy adult males, and the effect of inhibiting tumor growth in mice subcutaneously transplanted with a human colorectal cancer cell line was confirmed.
  • the tumor volume in the experimental group was significantly reduced compared to the negative control group.
  • the average tumor size on the day (1 day) when the strain administration was started was the same as 105 mm 3 in all four groups, but after 36 days, the average tumor volume in the negative control group was 4330 mm 3 , whereas the CLCC1 strain was administered All of the experimental groups showed a volume of 3000 mm 3 or less, and it was confirmed that they had a tumor volume of about 60 to 67% compared to the control group.
  • the weight of the mouse is irrespective of whether the strain is administered or not.
  • the tumor weight was significantly lower than that of the negative control group in all three groups of the experimental group administered with the strain.
  • the weight of the tumor excised after autopsy was about 3.21 g, but in the experimental group, it was 1.94, 2.17, and 1.95 g at low, medium, and high concentrations, respectively, indicating that the weight of the tumor tissue was significantly lower.
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain provided by the present invention has a tumor growth inhibition rate of 5% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 5-90%, when the strain is administered, 5-70%, 5-50%, 10-90%, 10-70%, 10-50%, 15-90%, 15-70%, 15-50%, 20-90%, 20-70%, 20-50%, 25-90%, 25-70%, 25-50%, 30-90%, 30-70%, or 30-50%.
  • the tumor growth inhibition rate may be calculated by Equation 1 below.
  • IR is the tumor growth inhibition rate (IR)
  • T is the average tumor weight in each experimental group
  • C is the average tumor weight in the negative control group.
  • Equation 1 based on the tumor weight measurement results in the three experimental groups administered with the Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain at low, medium or high concentrations and the negative control group not administered with the strain, Equation 1 above is used. to measure the tumor growth inhibition rate.
  • the tumor growth inhibition rate was 39.6%
  • the tumor growth inhibition rate was 32.4%
  • the tumor growth inhibition rate was 39.3%, confirming that the tumor growth was inhibited by more than 30% in all experimental groups.
  • the effect of inhibiting tumor growth in mice induced or transplanted with liver cancer by separating Faecalibacterium cancerinhibins CLCC1 strain from feces of healthy adult males was confirmed.
  • the volume of liver cancer tumors in the experimental group orally administered with CLCC1 was 19.5% to 75.3%, and on average 32.9% lower. Therefore, it can be seen that the orally administered CLCC1 strain has the activity of inhibiting the development and progression of tumors in liver cancer.
  • the colorectal cancer tumor volume is 90% or less, 80% or less, 70% based on 100% of the colorectal cancer tumor volume of the negative control group not administered with the strain % or less, 67% or less, 10-90%, 10-80%, 10-70%, 10-67%, 20-90%, 20-80%, 20-70%, 20-67%, 30-90 %, 30-80%, 30-70%, 30-67%, 40-90%, 40-80%, 40-70%, 40-67%, 50-90%, 50-80%, 50-70 %, 50 to 67% or 60 to 67% level may have an activity that decreases.
  • the tumor volume was 90% or less, 85% or less, 80% or less, 77 based on 100% of the liver cancer tumor volume of the control group not administered with the strain % or less, 10-90%, 10-85%, 10-80%.
  • activity decreasing to a level of 10-77%, 15-90%, 15-85%, 15-80%, 15-77%, 18-90%, 18-85%, 18-80%, or 18-77% may be to have
  • the Faecalibacterium cancerinhibens strain provided by the present invention may be a 16S rRNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a 16S rRNA having a nucleotide sequence having 98.5% or more nucleotide sequence identity therewith. Specifically, it has at least 98.5%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9% or 100% sequence identity with the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 1 of the present specification.
  • the Faecalibacterium cancerinhibens strain provided by the present invention can be cultured at a temperature of 20 to 40 °C, 25 to 40 °C, 30 to 40 °C, 35 to 40 °C or 37 °C, characterized in that it is cultured under anaerobic conditions. have.
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain provided by the present invention has a characteristic of showing a lipid production pattern different from that of the existing Faecalibacterium genus strain Faecalibacterium prausnitzii.
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain provided by the present invention may be characterized in that it does not contain a 17:0 iso 3OH fatty acid.
  • CLCC1 additionally contained PL3, which is absent in Faecalibacterium prausnitzii (FIG. 3b).
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain provided by the present invention is 15:1 w8c fatty acid, 19:0 cyclo w10c/19w6 fatty acid, 20:1 w9c fatty acid, 14:0 3OH/16:1 iso I fatty acid, 15:0 3OH fatty acid, 16 It may include one or more fatty acids selected from the group consisting of :0 iso fatty acids and 16:0 iso 3OH fatty acids.
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain provided by the present invention has a high production of butyric acid among short chain fatty acids (SCFA).
  • SCFA short chain fatty acids
  • the butyric acid production of the Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain of the present invention is 2 to 50 times, 2 to 40 times, 2 to 30 times, 2 to 20 times, 2 to 15 times, 2 to 10 times, 5 times compared to Faecalibacterium prausnitzii species. to 50 times, 5 to 40 times, 5 to 30 times, 5 to 20 times, 5 to 15 times, or 5 to 10 times.
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain showed a butyric acid content 7.8 times higher than that of Faecalibacterium prausnitzii strain (FIGS. 3c to 3d) .
  • Faecalibacterium genus The preferred strain of Faecalibacterium genus according to the present invention was deposited at the National Institute of Biotechnology and Biotechnology Biological Resources Center located at 181 Ipsin-gil, Jeongeup-si, Jeollabuk-do, Republic of Korea on January 3, 2019, and was given an accession number KCTC 13783BP, and the scientific name was Facalli. It is Faecalibacterium cancerinhibens.
  • Faecalibacterium cancerinhibens strain forms colonies within 3 mm or within 2 mm when plated on an agar medium and cultured, and has a long rod-shaped cell shape when observed with an optical microscope.
  • Faecalibacterium cancerinhibens has a genome size of 2.9 Mbp, the number of protein coding regions (CDS) is 2695, the GC ratio is 56.1%, the number of rRNA genes is 21, the number of total tRNA genes was found to be 69.
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 according to the present invention butyric acid in a 7.8-fold higher content than Faecalibacterium prausnitzii was detected ( FIGS. 3c to 3d ).
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain provided by the present invention is characterized in that it has anticancer activity, for example, anticancer activity against colon cancer.
  • the anticancer activity of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain provided by the present invention may be an activity of inhibiting the occurrence or progression of cancer, for example, colon cancer. Specifically, it may delay the development of a tumor or inhibit the growth rate of the tumor, and may further have an activity of preventing and/or inhibiting the metastasis of colorectal cancer by the inhibition of the tumor growth rate.
  • Faecalibacterium00 cancerinhibens CLCC1 strain provided by the present invention may further have anticancer activity against liver cancer in addition to anticancer activity against colorectal cancer.
  • the colorectal cancer tumor volume is 90% or less, 80% or less, 70% based on 100% of the colorectal cancer tumor volume of the negative control group not administered with the strain % or less, 67% or less, 10-90%, 10-80%, 10-70%, 10-67%, 20-90%, 20-80%, 20-70%, 20-67%, 30-90 %, 30-80%, 30-70%, 30-67%, 40-90%, 40-80%, 40-70%, 40-67%, 50-90%, 50-80%, 50-70 %, 50 to 67% or 60 to 67% level may have an activity that decreases.
  • the liver cancer tumor volume was 90% or less, 85% or less, 80% or less, 77% or less, 10-90% compared to the control group not administered with the strain. , 10-85%, 10-80%. having an activity that decreases by 10-77%, 15-90%, 15-85%, 15-80%, 15-77%, 18-90%, 18-85%, 18-80%, or 18-77% it could be
  • the Faecalibacterium cancerinhibins CLCC1 strain was isolated from the feces of healthy adult males, and the effect of inhibiting tumor growth in mice subcutaneously transplanted with a human colorectal cancer cell line was confirmed.
  • the tumor volume in the experimental group was significantly reduced compared to the negative control group.
  • the average tumor size on the day (1 day) when strain administration was started was the same as 105 mm3 in all four groups, but after 36 days, the average tumor volume in the negative control group was 4330 mm3, whereas the experimental group administered with the CLCC1 strain All showed a volume of 3000 mm3 or less, and it was confirmed to have a tumor volume of about 60 to 67% compared to the control, confirming the colon cancer growth inhibitory effect of the Facalibacterium cancer inhibins strain.
  • the weight of the mouse is irrespective of whether the strain is administered or not.
  • the tumor weight was significantly lower than that of the negative control group in all three groups of the experimental group administered with the strain.
  • the weight of the tumor excised after autopsy was about 3.21 g, but in the experimental group, it was 1.94, 2.17, and 1.95 g at low, medium, and high concentrations, respectively, indicating that the weight of the tumor tissue was significantly lower.
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain provided by the present invention has a tumor growth inhibition rate of 5% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 5-90%, when the strain is administered, 5-70%, 5-50%, 10-90%, 10-70%, 10-50%, 15-90%, 15-70%, 15-50%, 20-90%, 20-70%, 20-50%, 25-90%, 25-70%, 25-50%, 30-90%, 30-70%, or 30-50%.
  • the tumor growth inhibition rate may be calculated by Equation 1 below.
  • IR is the tumor growth inhibition rate (IR)
  • T is the average tumor weight in each experimental group
  • C is the average tumor weight in the negative control group.
  • Equation 1 based on the tumor weight measurement results in the three experimental groups administered with the Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain at low, medium or high concentrations and the negative control group not administered with the strain, Equation 1 above is used. to measure the tumor growth inhibition rate.
  • the tumor growth inhibition rate was 39.6%
  • the tumor growth inhibition rate was 32.4%
  • the tumor growth inhibition rate was 39.3%, confirming that the tumor growth was inhibited by more than 30% in all experimental groups.
  • the effect of inhibiting tumor growth in mice induced or transplanted with liver cancer by separating Faecalibacterium cancerinhibins CLCC1 strain from feces of healthy adult males was confirmed.
  • liver cancer when liver cancer was generated through a subcutaneous tumor transplantation experiment of a liver cancer cell line, and Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain was orally administered during the liver cancer development process for 55 days, in the experimental group to which the Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain was orally administered It was confirmed that tumor development and progression were significantly inhibited compared to the control group ( FIGS. 4A to 4C ). On average, compared with the control group, the tumor volume in the experimental group orally administered with CLCC1 was 19.5% to 75.3%, and on average 32.9% lower. Therefore, it can be seen that the orally administered CLCC1 strain has the activity of inhibiting the development and progression of tumors.
  • An example of the present invention is useful information for detecting colorectal cancer or tumor in an individual and / or animal, comprising the step of measuring the ratio (%) of the Fa.
  • An example of the present invention a method for diagnosing colorectal cancer in an individual, comprising measuring the ratio (%) of the Facalibacterium cancer inhibins strain in the individual's intestinal flora, and a formulation for measuring the ratio of the strain It relates to a composition for diagnosing colorectal cancer comprising.
  • the agent for measuring the ratio of the microorganism is available without limitation as long as it has specificity to Facalibacterium cancer inhibins, for example, one or more agents selected from the group consisting of primers, probes, antibodies, and aptamers.
  • the step of measuring the proportion of microorganisms may include measuring the proportion of microorganisms from an intestinal sample isolated from an individual, for example, an intestinal biopsies or fecal sample.
  • the method for measuring the ratio of microorganisms may be appropriately selected and used by a person skilled in the art according to common knowledge in the art, for example, quantitative polymerase chain reaction (qPCR), massively parallel sequencing, fluorescent phosphorus - It may be performed using a molecular method selected from the group consisting of - in situ hybridization (FISH), microarray and PCR-ELISA, but is not limited thereto.
  • Another embodiment of the present invention is a method for detecting colorectal cancer or colorectal cancer and liver cancer, such as screening, diagnosis, differential diagnosis and/or monitoring of the onset and progression of colorectal cancer or colorectal cancer and liver cancer in an individual is about
  • the present invention relates to a method for predicting the efficacy of a therapeutic treatment for colorectal cancer or colorectal cancer and liver cancer of a drug in an animal subject, comprising the step of confirming the presence of Faecalibacterium cancerinhinbens CLCC1 in an intestinal sample of the subject.
  • An example of the present invention is from the group consisting of microorganisms of the genus Faecalibacterium having a preventive or therapeutic activity for colon cancer or colon cancer and liver cancer, the microorganism culture, the lysate of the microorganism, and an extract of the microorganism It relates to an anticancer composition comprising one or more selected.
  • the microorganism of the genus Faecalibacterium according to the present invention may be, for example, Faecalibacterium cancerinhibens, and exhibits an activity of inhibiting the occurrence and proliferation of colorectal cancer or colon cancer and liver cancer, and It has tumorigenic and/or tumor growth retarding activity.
  • the microorganism of the genus Faecalibacterium according to the present invention may further have an activity of reducing or reducing metastasis of cancer cells in addition to the tumor formation and/or growth retardation activity of the cancer cells.
  • the colorectal cancer tumor volume is 90% or less, 80% based on 100% of the colorectal cancer tumor volume of the negative control group not administered with the strain or less, 70% or less, 67% or less, 10-90%, 10-80%, 10-70%, 10-67%, 20-90%, 20-80%, 20-70%, 20-67%, 30 to 90%, 30 to 80%, 30 to 70%, 30 to 67%, 40 to 90%, 40 to 80%, 40 to 70%, 40 to 67%, 50 to 90%, 50 to 80%, It may have an activity that decreases to a level of 50 to 70%, 50 to 67%, or 60 to 67%.
  • the tumor volume is 90% or less, 85% or less, 80% or less, based on 100% of the liver cancer tumor volume of the control group not administered with the strain , 77% or less, 10-90%, 10-85%, 10-80%. activity decreasing to a level of 10-77%, 15-90%, 15-85%, 15-80%, 15-77%, 18-90%, 18-85%, 18-80%, or 18-77% may be to have
  • the mouse administered with the Facalibacterium cancer inhibins strain has a tumor volume (volume) that is reduced by about 30 to 40% compared to the mice not administered with the strain, thereby reducing the colorectal cancer of the strain. The effect of reducing the size of the tumor and inhibiting the growth rate of the tumor was confirmed.
  • mice administered with the strain Facalibacterium cancer inhibins have an average tumor size (volume) reduced by 32.9% compared to mice not administered with the strain, reducing the size of the tumor and growth of the tumor A speed-inhibiting effect was confirmed.
  • subcutaneous tumor cells were transplanted into mice administered with Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain and control mice not administered with the strain, and liver cancer occurrence and growth rates were confirmed using MR imaging.
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain When administered, the liver cancer tumor volume was 32.9% lower on average compared to the control group, confirming the delay in cancer development and the rate of tumor growth.
  • the size (volume) of tumors in the experimental group administered with Faecalibacterium cancerinhibins strain and the control group not administered was compared as a result, when the tumor size on the day of transplantation was set to 1, tumor growth in the experimental group administered with the Faecalibacterium cancerinhibins strain was significantly inhibited compared to the control group.
  • the genus strain of Faecalibacterium according to the present invention is Faecalibacterium cancerinhibens or Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1.
  • Faecalibacterium genus microorganisms having a 16S rRNA sequence that are at least 97%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5% or 99.9% identical to the 16S rRNA gene sequence of Faecalibacterium cancerinhibens strain can be used.
  • the Faecalibacterium sp Preferably, the Faecalibacterium sp.
  • strain of the present invention is at least 97% or more, 98% or more, 98.5% or more, 99% or more, 99.5% or more, or 99.9% or more identical to the base sequence of SEQ ID NO: 1 16S rRNA gene base have a sequence
  • the active ingredient of the composition is at least one selected from the group consisting of cells of the genus Faecalibacterium, the microorganism culture, the lysate of the microorganism, and the extract of the microorganism from 0.00001 wt% to 100 wt%, 0.001 wt% to 99.9 wt%, 0.1 wt% to 99 wt%, more preferably 1 wt% to 50 wt% may be included.
  • the microorganisms of the genus Faecalibacterium may include microorganisms or may be in a cell-free form that does not contain microorganisms.
  • the lysate means a lysate obtained by crushing the microorganism of the genus Faecalibacterium or a supernatant obtained by centrifuging the lysate.
  • the microorganism of the genus Faecalibacterium having anticancer activity is one selected from the group consisting of the microorganism cells, the culture of the microorganism, the lysate of the microorganism, and the extract of the microorganism. used to mean more than
  • composition of the present invention may contain freeze-dried bacteria. Freeze-drying of bacteria can be performed by a person skilled in the art by a method known in the art.
  • the composition of the present invention may comprise a live, active bacterial culture.
  • the microorganisms in the compositions of the present invention are not inactivated, eg, not heat-inactivated. In some embodiments, the microorganisms in the compositions of the present invention are not killed, eg, not heat-killed. In some embodiments, the microorganisms in the compositions of the present invention are not weakened, eg, not heat-attenuated. For example, in some embodiments, the microorganisms in the compositions of the present invention are not killed, inactivated and/or attenuated. In some embodiments, the microorganisms of the invention are viable and capable of partially or fully colonizing the intestine.
  • a composition of the present invention comprises a therapeutically effective amount of a microorganism of the present invention.
  • a therapeutically effective amount of the microorganism is sufficient to exert a beneficial effect on the patient.
  • a therapeutically effective amount of the microorganism may be sufficient to effect intestinal transport and/or partial or total colonization of the patient.
  • composition of the present invention is preferably formulated so as to transport microorganisms or microbial agents into the intestine, for example, may be encapsulated. Encapsulation protects the composition from degradation until transported to the target site, for example, through rupture by chemical or physical stimuli, such as physical disruption that may be caused by changes in pressure, enzyme activity, or pH.
  • immune checkpoint refers to a component of the immune system that provides an inhibitory signal to the component of the immune system to modulate an immune response.
  • An “immune checkpoint inhibitor” refers to any compound that inhibits the function of an immune checkpoint protein. Inhibition includes decreased function and complete blockade.
  • the immune checkpoint protein is a human immune checkpoint protein.
  • immune checkpoint protein inhibitors are, inter alia, inhibitors of human immune checkpoint proteins.
  • the at least one checkpoint inhibitor is from the group consisting of an inhibitor of CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, IDO, LAG-3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3, KIR, A2aR, VISTA, and STAT3 It may be one or more selected from.
  • the immune checkpoint inhibitor according to the present invention is a substance capable of specifically binding to an immune checkpoint protein and modulating or inhibiting its activity, and may be a protein, a peptide, an antibody, a nucleic acid molecule, or the like.
  • the PD-1 antagonist is a humanized antibody of nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, MEDI-0680, REGN2810, or AMP-224
  • the PD-L1 antagonist is BMS-936559/MDX-1105, MPDL3280A/RG7446/ate Zolizumab, MSB0010718C/Abelumab, or MEDI4736/Durvalumab
  • the CTLA-4 antagonist may be ipilimumab or tremelimumab.
  • the anti-PD-L1 antibody may be YW243.55.S70, MDX-1105, MPDL3280A, or MEDI4736.
  • such methods further comprise administering at least one additional anti-cancer treatment.
  • the at least one additional anti-cancer treatment is surgical therapy, chemotherapy, radiation therapy, hormone therapy, immunotherapy, small molecule therapy, receptor kinase inhibitor therapy, anti-angiogenesis therapy, cytokine therapy, cryotherapy, or biological therapy.
  • the biological therapy is a monoclonal antibody, siRNA, miRNA, antisense oligonucleotide, ribozyme, or gene therapy.
  • subject and “patient” refer to humans or non-humans, such as primates, mammals and vertebrates. In certain embodiments, the subject is a human.
  • the anticancer composition containing the microorganism of the genus Faecalibacterium according to the present invention has an activity to inhibit the occurrence and growth of cancer, and in particular, it is ingested by humans in the form of a pharmaceutical composition or health functional food to prevent, treat and / or may be used for improvement.
  • 1a is a photograph showing the colony form formed after culturing Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain in Reinforced clostridial media (RCM) medium for 3 days.
  • RCM Reinforced clostridial media
  • Figure 1b is a photograph of observing the cell appearance under an optical microscope in the exponential growth phase during liquid culture of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain.
  • Figure 1c is a photograph taken with a scanning electron microscope in the exponential growth phase (exponenetial growth phase) of the strain of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain in liquid culture.
  • Figure 2a is a diagram showing the phylogenetic position obtained through 16S rRNA analysis of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain.
  • Figure 2b is a diagram showing the phylogenetic position using 92 core genes present in the genome of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain.
  • 2C is a diagram of the relationship between Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain and related species based on mean nucleotide identity (ANI) values.
  • ANI mean nucleotide identity
  • 2D is a table comparing the ANI values of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain and related species.
  • Figure 3a is a graph showing the results of gas chromatography analysis comparing the fatty acid composition of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain and Faecalibacterium prausnitzii strain.
  • 3B is a photograph showing the results of two-dimensional chromatography analysis performed for comparison of polar lipids of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain and Faecalibacterium prausnitzii strain.
  • 3C is a graph of GC-MS analysis of short-chain fatty acid analysis of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1.
  • 3D is a graph of GC-MS analysis of short-chain fatty acids of Faecalibacterium prausnitzii.
  • 4a to 4c are graphs showing the change in tumor volume with time after liver cancer induction in order to measure the cancer-inducing effect of the CLCC1 strain in mice induced with liver cancer by the method of Example 4.
  • 4A is a dot graph showing each individual with a sword
  • FIG. 4B is a graph comparing the average values of the experimental group and the control group
  • FIG. 4C is a line graph showing the change in cancer volume for each individual, respectively.
  • FIG. 5A to 5C are a dot graph and a line graph of the cancer-inhibiting effect test results of the CLCC1 strain in a liver transplantation model, and each result.
  • FIG. 5A shows a direct comparison of tumor sizes
  • FIG. 5B shows a fold change in tumor size
  • FIG. 5C shows a delta value.
  • 6a is a graph showing the change in tumor volume according to the dose of the CLCC1 strain in a mouse subcutaneously transplanted with a human colorectal cancer cell line.
  • 6B is a graph showing the results of measurement of tumor weight according to the dose of the CLCC1 strain in mice subcutaneously transplanted with a human colorectal cancer cell line.
  • Figure 6c is the result of visually observing the change in the size of the tumor according to the dose of the CLCC1 strain in a mouse subcutaneously transplanted with a human colorectal cancer cell line.
  • Figure 6d is the result of visual observation of the tumor tissue from the negative control group (G1) and each experimental group (G2 to G4) after the end of the administration period of the CLCC1 strain in mice subcutaneously transplanted with a human colorectal cancer cell line.
  • 6e is a result of H&E staining to confirm cell necrosis according to the administration of the CLCC1 strain in the tumor tissue of a mouse subcutaneously transplanted with a human colorectal cancer cell line.
  • 6f is a result of performing TUNEL staining to confirm apoptosis (apoptosis) according to the administration of the CLCC1 strain in the tumor tissue of a mouse subcutaneously transplanted with a human colorectal cancer cell line.
  • Example 7 is a graph showing the tumor volume obtained as a result of administering various test agents in a colorectal cancer animal model transplanted with a colorectal cancer cell line according to Example 9;
  • Example 8 is a graph showing a decrease in tumor volume obtained by administering various test agents in an animal model of colorectal cancer transplanted with a colorectal cancer cell line according to Example 10;
  • FIG 9 shows an experimental design for administering various test agents in an animal model having cancer in order to test the anticancer efficacy according to an embodiment of the present invention.
  • Faecalibacterium is the dominant bacteria in the intestines of healthy adults, accounting for about 10% of the total intestinal bacteria, and is known to directly or indirectly affect health.
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain was isolated by diluting the feces of a healthy adult male in his 20s on Reinforced Clostridial Media (RCM) medium and then culturing at 37 °C anaerobic culture conditions at room temperature.
  • RCM Reinforced Clostridial Media
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 forms colonies of up to 2 to 3 mm when cultured on RCM agar medium for 3 days, and exhibits a long rod-shaped cell shape when observed with an optical microscope.
  • 1a and 1b show the results of observation of the colony morphology and the morphology of cells using an optical microscope.
  • Figure 1c shows a photograph of the morphology of the cells using a scanning electron microscope.
  • the Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain isolated by the method of Example 1 was cultured in RCM liquid medium at 37° C. in anaerobic culture conditions at room temperature for 1 day, followed by centrifugation to obtain a strain.
  • the entire genome was isolated from the obtained strain using FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals).
  • the genomic characteristics of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain are shown in Table 1 below.
  • the total genome size of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain was about 2.9 Mbp, the number of protein coding regions (CDS) was 2695, and the GC ratio (%) was 56.1%.
  • Genome size (bp) 2,941,967 Number of CDSs 2,695 GC ratio (GC ratio, %) 56.1 Number of rRNA genes 21 Number of tRNA genes 69
  • Phylogenetic analysis was performed by analyzing the rRNA of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain sequenced by the method of Example 2-1.
  • the 16S rRNA sequence of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain is shown in SEQ ID NO: 1.
  • Fig. 2a shows the phylogenetic position of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain identified by analyzing the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene.
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain showed 98% 16S rRNA similarity to Faecalibacterium prausnitzii ATCC 27768(T).
  • the phylogenetic position of CLCC1 is "Firmicutes phylum, Clostridia class, Clostridales order, Ruminococcaceae family.
  • phylogenetic analysis was performed using the similarity of 92 genes (up-to-date bacterial core gene (UBCG)) that can be used as taxonomic markers of bacteria.
  • the 92 genes refer to genes provided by the up-to-date bacterial core gene (UBCG) pipeline (Na, SI, Kim, YO, Yoon, SH, Ha, SM, Baek, I. & Chun, J (2016)).
  • the genome similarity value was analyzed by comparing the entire genome sequence between the Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain and other related species using the Genome-based identification for prokaryote (TrueBAC ID) pipeline, an analysis platform provided by ChunLab.
  • Fig. 2c shows the relationship between Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain and related species based on the ANI values.
  • 2D shows a comparison table of ANI values of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain and related species.
  • 1 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1
  • 2 Faecalibacterium prausnitzii ATCC 27768 (T)
  • 3 Fournierella massiliensis AT2 (T)
  • 4 is Intestinimonas butyriciproducens DSM 26588 (T)
  • 5 is Intestinimonas massiliensis 6
  • GD2 (T) is Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799(T)
  • 7 is Ruthenibacterium lactatiformans 585-1(T)
  • 8 is Subdoligranul um variabile DSM 15176(T)
  • 9 is Gemmiger formicilis ATCC 27749(T). (T) after each species name means type strain.
  • the CLCC1 strain showed an average nucleotide identity (ANI) value of 85.99% at the genome level with Faecalibacterium prausnitzil, the closest relative at the whole genome level. It can be seen that it is a new species that has not been isolated and reported in The Faecalibacterium genus strain identified by the above method was named Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1.
  • ANI nucleotide identity
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strains were compared with strains Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 fatty Faecalibacterium prausnitzii (fatty acid) configuration.
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain and Faecalibacterium prausnitzii strain were cultured in RCM medium at 37°C and anaerobic conditions, respectively, and then using about 40 mg of r cells, Miller's method (Miller, LT (1982) J. Clin. Microbiol. 18, 861-867) to obtain fatty acids.
  • FIG. 3a shows a graph of the results of gas chromatography analysis comparing the fatty acid composition of Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain and Faecalibacterium prausnitzii strain (ATCC 27768).
  • the names of fatty acids and their numerical values (%, w/v) It is shown in Table 2 below.
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain is contained in Faecalibacterium cancerinhibens It was confirmed that it was a different species from the known species, Faecalibacterium prausnitzii.
  • Faecalibacterium prausnitzii When comparing the fatty acid composition of the two strains, it can be seen that there is a difference in the composition of the major fatty acids between the two strains, and the results are shown in FIG. 3A and Table 2.
  • TLC Thin layer chromatography
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 and Faecalibacterium prausnitzii contained one phosphatidylglycerol (PG), two unidentified phospholipids (PL1, PL2), and a number of unknown lipids. (unidentified lipid, L) was confirmed.
  • CLCC1 additionally has unidentified phospholipids (PL3), which is absent in Faecalibacterium prausnitzii, and the results are shown in FIG. 3b.
  • PG phosphatidylglycerol
  • PL1 unidentified phospholipids
  • Faecalibacterium prausnitzii and Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain of the present invention were cultured in RCM medium for 16 hours, and then the cells were precipitated through centrifugation (4° C., 4,000 rpm, 10 min) to collect the supernatant. The collected supernatant was refrigerated after filtering using a 0.22um filter.
  • a sample for GC-MS for SCFA analysis from the supernatant was prepared using Takeshi Furuhashi's method (Takeshi Furuhashi, et al., Analytical Biochemistry, Volume 543, 2018, Pages 51-54), and a short Agilent's 6890 series instrument was used for chain fatty acid analysis.
  • SCFA Short chain fatty acid
  • butyric acid butanoic acid
  • butanoic acid butanoic acid
  • Butyric acid is known to have anticancer activity, and the Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain of the present invention has a higher production of butyric acid among short-chain fatty acids than Faecalibacterium prausnitzii, and it can be predicted that it exhibits excellent anticancer activity.
  • Example 6 Efficacy test for inhibiting cancer occurrence in a subcutaneous tumor model using a mouse liver cancer cell line
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 was orally administered 4 days before transplantation of the mouse liver cancer cell line into the mouse subcutaneous tissue.
  • the mouse liver cancer cell line Hep55.1c
  • the mouse liver cancer cell line was transplanted into the subcutaneous tissue of the right flank to become 2.0 x 10 6 cells.
  • Faecalibacte rium cancerinhibens CLCC1 strain was orally administered once a day for 55 days, 5 times a week. Thereafter, from the day of transplantation (day 0) to day 55, the size of the liver cancer tumor (tumor volume) was measured using Magnetic Resonance (MR) imaging at 7-day intervals.
  • MR Magnetic Resonance
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain was cultured in RCM medium, concentrated, and then stored frozen to a final glycerol concentration of 15% (v/v) using PBS buffer and glycerol. And after thawing immediately before administration to mice, 200ul (2x10 8 cells) per animal was orally administered. As a control group, 10 mice not administered with the CLCC1 strain were used. For the control group, 200ul each of PBS and glycerol (15%, v/v) solution containing no strain was orally administered.
  • Tables 5 and 6 show the tumor size results of the control and test bacteria in the hepatocarcinogenesis inhibitory efficacy test of the isolates in the subcutaneous tumor model.
  • Table 5 shows the results of changes in the volume of tumors relative to the control group, and
  • Table 6 shows the results of changes in the volume of tumors in the experimental group administered with Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain.
  • SD means standard deviation.
  • the tumor volume according to the change in time after inducing cancer in the mouse is shown as a graph, and the changes in the size of the tumor are shown in Tables 5 to 6 as numerical values.
  • the size of the tumor in the experimental group administered with Faecalibacterium canceerinhibens CLCC1 strain was significantly smaller than that of the control group, confirming the effect of inhibiting cancer occurrence.
  • the orally administered CLCC1 strain has the activity of inhibiting the development and progression of liver cancer.
  • Example 7 Efficacy test for inhibiting cancer occurrence in a liver transplantation model using a mouse liver cancer cell line
  • Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strains generates a liver cancer via implantation experiments liver, 8-week-old male C57BL / 6 liver cancer cell line from mouse 4 object to salpigi the effect on the growth of hepatic cancer cells, Faecalibacterium cancerinhibens bacteria from liver cancer course for 39 days The effect of oral administration of CLCC1 on the growth of liver cancer cells was investigated.
  • Hep55.1c was used as the liver cancer cell line, and the upper abdomen of an 8-week-old male C57BL/6 mouse was opened and the liver cancer cell line was transplanted to the left lobe of the liver so as to become 5.0 x 10 5 cells. After transplanting a tumor cell line into the liver, after a recovery period of 4 days, the size of the tumor was confirmed by MRI, and 4 well-formed tumors were selected and used for subsequent experiments.
  • the CLCC1 strain was prepared in the same manner as in Example 4 for 39 days from the day of the transplant operation (day 0) and was orally administered to 4 mice that had completed the transplantation operation, and the CLCC1 strain was not administered to the 4 control mice.
  • For the control group 200ul each of PBS and glycerol (15%, v/v) solution containing no strain was orally administered. Thereafter, the size and relative size of the tumor and the relative values of growth were measured periodically.
  • the size of the tumor was measured through magnetic resonance (MR) imaging at 7-day intervals, and the relative value of the tumor size was derived by calculating the relative size of the tumor on the day of transplantation.
  • 5a to 5c show the results and graphs of the cancer-inhibiting effect of the CLCC1 strain in the liver transplantation model.
  • Figure 5a is a dot graph and line graph directly comparing the size of the tumor
  • Figure 5b is a dot and line graph expressing the size change of the tumor in fold (fold)
  • Figure 5c is the amount of change in the size of the tumor (measurement day tumor size and It is a dot and line graph showing the difference in tumor size on the previous day of measurement).
  • Table 7 shows the relative numerical table of tumor size (Relative growth; Fold) and Table 8 shows the relative numerical table of tumor growth (Relative growth; Delta).
  • Example 8 Confirmation of anticancer effect in a mouse subcutaneous tumor model using a human colorectal cancer cell line
  • HCT-116 cells were used for the colon cancer cell line, and immunodeficient nude mice (CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlOri, SPF) were used.
  • the colorectal cancer cell line HCT-116 (2.5 ⁇ 10 7 cells/mL) was administered to mice that had undergone a one-week acclimatization period using a disposable syringe by subcutaneous administration of 0.2 mL/head each and transplanted.
  • mice per group were classified into a negative control group not administered with CLCC1 and an experimental group 3 groups administered with CLCC1 by concentration. Specifically, the test group were divided into three groups of high-low, medium, depending on the concentration of CLCC1, a low concentration is 2x10 6 cells / head, jungnong degree of 2x10 7 cells / head, a high concentration of F at a concentration of 2x10 8 cells / head
  • the cancerinhibins CLCC1 strain was administered. The administration of the strain was orally administered with a syringe once daily for 36 days. In the negative control group, only an excipient (PBS solution containing 15% (v/v) glycerol) was administered.
  • Table 9 below shows information of the negative control group and each experimental group.
  • the tumor volume (Tv) was calculated by the method of Equation 2 below by measuring the longitudinal (perpendicular width, W) and long (maximum length, L) of the tumor, respectively.
  • the average tumor size on the day (1 day) when the strain administration was started was the same as 105 mm 3 in all four groups, but after 36 days, the average tumor volume in the negative control group was 4330 mm 3 , whereas the CLCC1 strain was administered All of the experimental groups showed a volume of 3000 mm 3 or less, and it was confirmed that they had a tumor volume of about 60 to 67% compared to the control group.
  • IR tumor growth inhibition rate
  • T is the average tumor weight in each experimental group
  • C is the average tumor weight in the negative control group
  • Table 11 and Figure 6b show the results of tumor weight measurement in each group after the end of the strain administration experiment, and Table 12 below shows the average weight measurement results of mice in each group according to the experimental progress.
  • the weight of the tumor excised after autopsy was about 3.21 g, but in the experimental group, it was 1.94, 2.17, and 1.95 g at low, medium, and high concentrations, respectively, indicating that the weight of the tumor tissue was significantly lower.
  • the total body weight in each group did not show a significant difference between the control group and the experimental group.
  • the tumor growth inhibition rate was 39.6%
  • the tumor growth inhibition rate was 32.4%
  • the tumor growth inhibition rate was 39.3%. .
  • H&E staining Hematoxylin & Eosin staining
  • Figure 6e shows a photograph of the results of H&E staining for necrosis analysis of tumor cells. No significant difference was found in the level of necrosis of tumor cells between the negative control group and the test group. Therefore, it can be seen that the F. cancerinhibins cell line of the present application does not induce an inflammatory response due to tumor necrosis.
  • Figure 6f shows a photo of the result of TUNEL staining analysis for apoptosis analysis of tumor cells. It was confirmed that apoptosis of tumor cells was statistically significantly increased in the experimental group administered with Facalibacterium compared to the negative control group. Therefore, it was confirmed that the decrease in tumor volume in each group administered with Facalibacterium was not caused by tumor necrosis, but by apoptosis of the tumor and did not induce an inflammatory response.
  • Table 13 below shows the results of comparing tumor cell necrosis and apoptosis.
  • ⁇ is minimal
  • + is mild
  • ++ is moderate
  • +++ is marked
  • ++++ is severe. indicates. Below each symbol, the number of apoptotic cells corresponding to the corresponding stage is indicated.
  • control group control group, G1
  • the low concentration experimental group G2
  • G3 medium concentration
  • apoptosis of 12.4% or more was observed in the high concentration (G4) experimental group. Therefore, it was confirmed that the apoptosis of tumor cells was increased due to the administration of the Facalibacterium cancer inhibins strain.
  • Example 9 Efficacy evaluation of Faecalibacterium sp. strain using colorectal cancer subcutaneous tumor model
  • mice subcutaneously transplanted with colorectal cancer cells were used.
  • As the colorectal cancer cells MC38 cells, a mouse-derived colorectal cancer cell line, were used, and the mouse strain C57BL/6 was used.
  • the test groups are as follows, with 10 mice per group.
  • the MC38 cell line a colorectal cancer cell line
  • a subcutaneous tumor transplantation experiment to induce colorectal cancer. I looked.
  • Example 1 the Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 strain of Example 1 was cultured in RCM medium, concentrated, and finally glycerol using PBS buffer and glycerol. The concentration was 15% (v/v) and stored frozen. And after thawing immediately before administration to mice, low concentration live cells (2x10 7 cells/dose) (Sample 1 corresponds to G3 of Example 8-1) and high concentration live cells (2x10 8 cells/dose) 200ul per mouse (2x10 8 cells) ) (Sample 2 corresponds to G4 of Example 8-1). As a control group, 10 mice not administered with the CLCC1 strain were used.
  • Sample 3 was used as a high-concentration dead cell (2x10 8 cells/dose) by treating the prepared sample 2 in an oven at a temperature of 100° C. for 2 hours.
  • the control and test preparations of samples 1 to 3 were administered once a day for a total of 40 days, starting 2 weeks before inoculation of cancer cells.
  • the control and test formulations of Samples 1 to 3 were orally administered once a day for 40 days, and 14 days after the start of administration, colon cancer cells (5x105 MC38 cells in 0.1ml PBS) were injected into the subcutaneous tissue of the left flank. After inoculation and engraftment period of 1 week, the size of the tumor was observed from the 22nd day to the 40th day for 18 days.
  • the start date of tumor observation was regarded as day 0, and the size of the liver cancer tumor (tumor volume) was measured using Magnetic Resonance (MR) imaging for 18 days.
  • the size change of the tumor is measured by measuring the long axis (maximum length, L) and the short axis (perpendicular width, W) of the tumor for 22 days after cancer cell engraftment, and substituting it in Equation 2 below to determine the tumor volume (TV). ) was calculated.
  • the tumor volumes measured for the 18 days are shown in Table 13 and FIG. 7 below.
  • L is the long axis of the tumor (maximum length, L)
  • W2 is the short axis (perpendicular width, W).
  • the tumor volume of the sample relative to the tumor volume of the control group was calculated by Equation 3 below.
  • Table 14 shows the results of changes in tumor volume (volume, mm 3 ) in the colorectal cancer subcutaneous tumor model of the control group and the isolates according to samples 1 to 3.
  • the change in volume and volume obtained in the group administered with the strains of Samples 1 to 3 is shown in FIG. 7 , respectively.
  • the tumor volume of Samples 1 to 3 was calculated as a percentage by setting the tumor volume of the control group to 100%.
  • Sample 1 was 89.9% (10.1% reduction)
  • Sample 2 was 74.2% 25.8% decrease
  • Sample 3 was 75.9% (24.1 decrease)
  • the tumor growth was significantly inhibited in colorectal cancer model mice administered with CLCC1 compared to the control group as a result of the test. It was confirmed that tumor growth was significantly inhibited even when the dead cells of CLCC1 were administered.
  • looking at the decrease in tumor volume of Samples 1 and 2 using live cells of the CLCC1 strain but at different concentrations it was confirmed that the anticancer activity was increased in a concentration-dependent manner under the same experimental conditions.
  • control sample 1 sample 2 sample 3
  • One 20.60 20.79 20.60 21.17 4 20.03
  • 20.62 21.31 21.64 7 20.24 20.47 21.42 21.55 8
  • 20.26 20.41 21.22 21.52 11 20.05
  • 20.44 21.06 21.22 13 20.42
  • 20.44 21.17 21.28 15 20.54
  • 20.77 21.13 21.38 18 20.50 20.93 21.27 21.09
  • the total body weight of the experimental animals tends to be lower than that of the control group after cancer cell engraftment, but there was no significant difference between the control group and the test group overall.
  • Example 10 Evaluation of combined efficacy of Faecalibacterium spp. using a colorectal cancer tumor model
  • Example 9 The control (15% Glycerol in PBS) and Sample 2 of Example 9 were prepared in the same manner as in Example 9.
  • Anti-PD-1 was used as anti-mouse PD-1 (CD279) (Clone: RMP1-14).
  • Sample 4 used in Example 10 is a combination of Sample 2 of Example 9 and the test formulation of Comparative Example 1.
  • test formulations of the control group, Comparative Example 1 and Sample 2 of Example 9 were administered once a day for a total of 44 days, starting 2 weeks before inoculation of cancer cells.
  • the test formulation was orally administered once a day for 44 days, and after 14 days from the start of administration, cancer cells (5x105 MC38 cells in 0.1ml PBS) were inoculated into the left flank and engrafted for 1 week, Tumor size was observed from the 22nd day to the 44th day for 22 days.
  • Example 9 the control group was tested in substantially the same manner as in Example 9.
  • Sample 4 was orally administered to Sample 2 of Example 9 using a syringe once a day from 2 weeks before cancer cell inoculation.
  • cancer cells (5x105 MC38 cells in 0.1ml PBS) were inoculated into the left flank of the experimental animals, and after an engraftment period of about one week, from Day 0 after the engraftment period, anti-mouse PD-1 (CD279) (Clone: RMP1-14) was administered through intraperitoneal injection (IP) at 10 mg/ml twice a week.
  • IP intraperitoneal injection
  • the anti-mouse-PD1 antibody (clone: RMP1-14) according to Comparative Example 1 was performed in the same manner as in Sample 4, except that Sample 2 of Example 9 was not administered.
  • Day 22 the start date of tumor observation, was regarded as day 0 and observed for 18 days.
  • the size change of the tumor is measured by measuring the maximum length (L) and the short axis (perpendicular width, W) of the tumor for 22 days after engraftment of cancer cells, and substituting it into the following formula to calculate the tumor volume (TV). Calculated.
  • the tumor volumes measured for the 18 days are shown in Table 16 below.
  • the specific volume of the sample relative to the specific volume of the control was calculated by Equation 3 below. In Table 16 below, Mean means average volume and S.D. means standard deviation.
  • Tumor volume (TV) (mm 3 ) L (mm) ⁇ W 2 (mm 2 ) ⁇ 1/2
  • L is the long axis of the tumor (maximum length, L)
  • W2 is the short axis (perpendicular width, W).
  • Example 9 (Sample 2)
  • Example 10 (Sample 4) Mean S.D. Mean S.D. Mean S.D. Mean S.D.
  • Comparative Example 1 of Anti-PD-1 antibody alone administration group was 75.8% (24.2% decrease) compared to the control group, 80% (20% decrease) when high concentration CLCC1 of Example 9 was administered alone, and high concentration of CLCC1 live cells according to Example 10 and When anti-PD-1 antibody was co-administered, tumor size reduction was confirmed by 44.8% (55.2% reduction).
  • the tumor size reduction of the group administered with the antibody of Comparative Example 1 alone and the group administered with the CLCC1 live cells of Example 9 alone was about 20%
  • the tumor suppressive effect when the microorganism CLCC1 and anti-PD-1 were administered in combination was about 20%
  • the tumor volume reduction of the CLCC1 and anti-PD-1 combination group was 55.25, confirming a more pronounced tumor growth inhibitory effect than when administered alone.
  • Example 9 (Sample 2)
  • Example 10 (Sample 4)
  • One 20.6 21.37 20.6 22.07 4 20.03 21.01 21.31 22.52 7
  • 20.24 21.05 21.42 22.8 8 20.26 20.87 21.22 22.7 11
  • 20.87 21.06 22.22 13 20.42
  • 20.96 21.17 22.26 15 20.54 21.24 21.13 22.34 18 20.5 21.39 21.27 22.08 22 20.72 21.5 22.06 22.09
  • the total body weight of the experimental animals tends to be lower than that of the control group after cancer cell engraftment, but there was no significant difference between the control group and the test group overall.
  • Example 11 Evaluation of the combined efficacy of Faecalibacterium sp. strains using a liver cancer tumor model
  • hepatocellular carcinoma was generated in 10 6-week-old male C57BL/6 mice through a subcutaneous tumor transplantation experiment of a hepatocellular carcinoma cell line (Hep55.1c).
  • the test formulations of the control group, Comparative Example 1 and Sample 2 of Example 9 were administered once a day for a total of 44 days, starting 2 weeks before cancer cell inoculation.
  • the test formulation was orally administered once a day for 44 days, and 14 days after the start of administration, a mouse liver cancer cell line (5x10 5 Hep55.1c cells in 0.1ml PBS) was inoculated into the left flank and engraftment was performed for 1 week. After the period, the size of the tumor was observed from the 22nd day to the 44th day for 22 days.
  • the specific experimental method was performed substantially the same as Example 10.
  • Day 22, which is the start date of tumor observation was regarded as day 0 and observed for 18 days, and the size change of the tumor was also calculated in substantially the same manner as in Example 10.

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Abstract

본 발명은 패칼리박테리움 속 균주를 이용하여 암의 예방, 개선 또는 치료 용도를 제공하고자 한다.

Description

패칼리박테리움 속 미생물을 이용한 항암 치료
본 발명은 패칼리박테리움 속 미생물을 이용하여 항암 치료제의 개선 또는 치료 효능을 높이고 암을 개선, 예방, 또는 치료하는 용도에 관한 것이다.
종래의 암 치료는 환자의 신생물 세포를 제거하기 위한 화학요법, 수술, 호르몬 요법 및/또는 방사선 치료의 조합을 수반한다. 암 화학요법은 바람직하게는 제제가 환자의 정상 세포를 죽이는 것보다 빠르게 복제중인 세포를 죽이는 약물의 사용에 기반한다. 종양 종괴를 제거하기 위해 수술이 이용되지만, 일단 암이 전이되고 나면 영향력이 거의 없다. 방사선은 오직 국재화된 영역에서만 효율적이다.
이러한 모든 접근법은 상당한 단점과 감염에 대한 감수성 증가와 같은 부가적인 위험성을 드러낸다. 항암 화학요법제는 항생제의 치료를 필요로 하는 두 합병증, 즉 점막염(박테리아 전위와 연관된 약화성 점막 관문의 상처) 및 호중구 감소증(neutropenia)을 흔히 야기한다. 따라서, 상승작용 효과가 아니더라도, 화학요법 및/또는 방사선과 같은 치료와 면역력 간의 건설적인 상호작용을 지지하는 개선된 암 치료법의 개발에 대한 강한 필요성이 존재한다.
현재 가장 널리 사용되고 있는 면역항암제는 면역체크포인트라고 불리우는 면역조절 세포표면 단백질인 PD-1/PD-L1 혹은 CTLA-4를 저해하는 단일항체 제제다. 생체 내 면역시스템에 의하여 제거 가능한 암세포는 이러한 면역체크포인트 단백질들을 이용하여 종양미세환경이나 면역기관에서의 면역회피 기작을 발전시켜 생존한다. 면역체크포인트 단일항체는 이러한 면역회피 기작을 억제하여 암세포 특이적 면역세포 활성을 통하여 암세포를 죽이는 전략이다.
표적화 요법 및 면역 요법의 사용을 통해 흑색종의 치료에서 주된 진전이 이루어져 왔다. 특히, 면역 체크포인트 저해제로서 T 림프구의 표면 상에서 면역-조정 분자를 차단하는 몇몇 작용제(예를 들어 항-CTLA-4 항체 이필리무맙(Ipilimumab), 및 항-PD-1 항체 니볼루맙(Nivolumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab))의 FDA 승인을 이끌었다.
그러나, 면역 체크포인트 저해제는 실질적인 독성과 연관이 있을 수 있고, 단지 하나의 환자 서브셋만 이익을 얻을 수 있다. 이들 환자에서 이러한 증강된 반응에 기여하는 것이 무엇인지에 대해서는 아직까지 명확하지 않으며, 모든 환자에서 요법에 대한 반응을 개선하기 위해 실행 가능한 전략을 식별하는 것이 중대한 필요성으로 존재한다.
암 요법에 대한 반응에서 대상의 마이크로바이옴의 역할에 대한 인식이 증가하고 있으며, 연구들은 종양 및 장에 존재하는 박테리아가 치료 반응에 영향을 줄 수 있음을 제안한다. 또한, 건강 및 질병에서 면역 반응의 형상화(shaping)에서 위장 미생물유전체의 역할에 대한 인식이 커지고 있다.
본 발명의 일 예는 면역 체크포인트 차단의 효능을 증강시키기 위해, 미생물을 조정함으로써 암을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 방법, 조성물 또는 키트를 제공한다.
본 발명은 면역 체크포인트 차단 요법의 효능을 개선하기 위한 미생물 또는 미생물 제제의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는 패칼리박테리움(Faecalibacterium) 속 미생물과 면역 체크포인트 저해제의 병용 항암 요법에 관한 것이다.
본 발명은 면역 체크포인트 차단 요법의 효능을 개선하기 위한 마이크로바이옴(microbiome)의 용도, 면역 체크포인트 차단의 효능을 증강시키기 위해, 마이크로바이옴(microbiome)를 조정함으로써 암을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다.
더욱 자세하게는 본 발명의 일 예는 면역 체크포인트 차단의 효능을 증강시키기 위해, 마이크로바이옴(microbiome)를 조정함으로써 암을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 패칼리박테리움속 미생물은 항암활성을 가지므로, 체크포인트 차단 요법의 효능을 개선과 함께 항암 활성을 제공하여 더욱 우수한 항암 치료 효과를 달성할 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 패칼리박테리움속 미생물은 항염 활성을 가지므로, 염증 관련 암, 예컨대 대장염 연관 대장암의 치료 효과에 더욱 상승적 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 예는 패칼리박테리움(Faecalibacterium) 속 미생물과 면역 체크포인트 저해제의 병용 항암 요법에 관한 것이다. 구체적으로 패칼리박테리움 캔서인히벤스(Faecalibacterium cancerinhibens)의 16S rDNA 서열과 적어도 98.5% 의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA를 갖는 분리된 패칼리박테리움속 미생물을 포함하는 제1 미생물 제제; 및 적어도 하나의 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 제 2제제를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일예는 패칼리박테리움 캔서인히벤스 (Faecalibacterium cancerinhibens)의 16S rDNA 서열과 적어도 98.5% 의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA를 갖는 분리된 미생물 제제; 및 적어도 하나의 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 키트에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일예는 패칼리박테리움 캔서인히벤스(Faecalibacterium cancerinhibens)의 16S rDNA 서열과 적어도 98.5% 의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA를 갖는 분리된 패칼리박테리움속 미생물을 포함하는 제1 미생물 제제; 및 적어도 하나의 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 제 2제제를 병용-투여하는 것을 포함하는, 대상에서 암을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일예는 패칼리박테리움 캔서인히벤스 (Faecalibacterium cancerinhibens)의 16S rDNA 서열과 적어도 98.5% 의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA를 갖는 분리된 패칼리박테리움속 미생물을 포함하는, 면역 체크포인트 저해제의 효능 증진용 미생물 제제에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일예는 사람 대상에서 암을 예방, 개선 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 패칼리박테리움속 미생물을 포함하는 미생물 제제로서, 상기 방법은 상기 미생물 제제와 면역 체크포인트 저해제를 사람 대상에서 병용 투여(co-administration)하는 것을 포함하며, 상기 패칼리박테리움속 미생물은 패칼리박테리움 캔서인히벤스(Faecalibacterium cancerinhibens)의 16S rDNA 서열과 적어도 98.5% 의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA를 갖는 분리된 패칼리박테리움속 미생물인 것이다.
본 발명의 추가 일예는 사람 대상에서 암을 예방, 개선 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 면역체크포인트 저해제로서, 상기 방법은 상기 면역체크포인트 저해제와 패칼리박테리움속 미생물을 포함하는 미생물 제제를 사람 대상에서 병용 투여(co-administration)하는 것을 포함하며, 상기 패칼리박테리움속 미생물은 패칼리박테리움 캔서인히벤스(Faecalibacterium cancerinhibens)의 16S rDNA 서열과 적어도 98.5% 의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA를 갖는 분리된 패칼리박테리움속 미생물인 것이다.
상기 제1 미생물 제제 및 제2 제제는 유효량이 각각 제제화되어 각각 제제화되어 동시적 또는 순차적으로 투여되는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 병용 투여용 약학 조성물은 유효 성분으로 패칼리박테리움속 미생물의 유효량을 포함하는 제1 약학 조성물 및 유효성분으로 면역 체크포인트 저해제의 유효량을 포함하는 제2 약학 조성물을 포함하는 동시적 또는 순차적 투여를 위한 약학적 병용 투여용 약학 조성물일 수 있다. 순차적 투여의 경우 그 순서는 서로 바뀌어도 무방하다.
상기 제1 미생물 제제는 액체, 현탁액, 젤, 젤탭(geltab), 반고체, 정제, 사세(sachet), 함당정제(lozenge), 캡슐제(capsule)를 포함하는 것으로서, 또는 경장 제제(enteral formulation)로서 장내로 전달되도록 제제화되는 것일 수 있으며, 자세하게는 경구 전달용으로 제제화된 정제 또는 캡슐제일 수 있으며, 더욱 자세하게는 정제 또는 캡슐제가 산-내성 장용 코팅을 포함할 수 있다.
또한, 상기 미생물 제제는 프리바이오틱스를 추가로 포함할 수 있으며, 추가 가능한 프리바이오틱스는 본 발명에 따른 패칼리박테리움(Faecalibacterium) 속 미생물의 생장, 생존 또는 증식에 도움이 되는 것이면 특별히 제한되지 않는다.
상기 면역 체크포인트 저해제가 종양내로, 동맥내로, 정맥내로, 혈관내로, 흉막내로, 복강내로, 기관내로, 경막내로, 근육내로, 내시경적으로(endoscopically), 병변내로, 경피로, 피하로, 국지적으로(regionally), 정위적으로(stereotactically), 경구로, 직접 주사 또는 관류에 의해 투여되는 것일 수 있다. 구체적 일 예에서, 상기 면역 체크포인트 저해제가 정맥내로 투여되고, 상기 미생물 제제가 경구 투여되는 것일 수 있다.
상기 제2 제제는, 상기 제1 미생물 제제를 투여한 날로부터 0일, 1일 이내, 5일 이내, 1주 이내, 8일 이내, 2주 이내, 3주 이내, 1개월 이내, 1.5개월 이내, 2개월 이내, 2.5개월이내, 3개월이내 또는 6개월 이내 에 투여되는 것일 수 있다. 자세하게는 상기 제 1제제는, 상기 제2 미생물 제제를 투여한 날로부터 1일 이내, 5일 이내, 1주 이내, 8일 이내, 2주 이내, 3주 이내, 1개월 이내, 1.5개월 이내, 2개월 이내, 2.5개월이내, 3개월이내 또는 6개월 이내에 투여되는 것일 수 있다. 또한, 상기 제1 미생물 제제는 1일 2회, 1일 1회, 2일 1회, 또는 3일 1회로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 항암 활성은 암의 발생 또는 진행을 억제하는 활성일 수 있다. 구체적으로, 종양의 발생을 지연 또는 종양의 성장 속도를 저해하는 것일 수 있으며, 상기 종양 성장 속도 저해에 의한 암의 전이를 예방 및/또는 억제하는 활성을 추가로 가질 수 있다.
본 발명에서 "암"은 전형적으로 비정상적 또는 제어되지 않은 세포 성장의 특징을 가지는, 동물에서의 생리학적 상태를 의미한다. 암 및 암 병리는 예를 들어, 전이, 정상적으로 기능하는 주변 세포에 대한 간섭, 비정상 레벨에서 사이토카인 또는 다른 분비 산물의 방출, 염증성 또는 면역학적 반응의 억제 또는 증대, 종양 형성(neoplasia), 전암(premalignancy), 악성 종양(malignancy), 주위 또는 거리가 있는 조직 또는 기관, 예를 들어 림프절 침범(invasion) 등과 연관될 수 있다. 본 발명에서,
상기 암은 위장관암(gastrointestinal cancer) 또는 비위장관암일 수 있다. 상기 위장관암은 예를 들어 식도암, 담낭암, 간암, 담도암, 췌장암, 위암, 소장암, 대장암, 결장암, 항문암 및 직장암으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 암일 수 있다. 상기 비위장관암은 위장관 또는 소화기관계 외의 기관에 발생하는 악성 종양을 제한 없이 포함하며, 예를 들어 백혈병, 폐암, 전립선암, 유방암, 방광암, 신장암, 다발성골수종, 자궁경부암, 갑상선암, 난소암, 요도암, 피부암, 골육종, 교모세포종, 뇌종양 또는 림프종일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 예에서, 상기 암은 간암, 대장암, 흑색종, 폐암, 신장암, 방광암, 위암, 자궁경부암, 식도암, B세포림프종, 호지킨림프종, 메르켈세포암을 포함하며, 구체적으로 간암, 대장암, 흑색종, 폐암을 포함한다. 상기 흑색종이 전이성 흑색종, 악성 검정사마귀, 악성 검정사마귀 흑색종, 표재 확산 흑색종, 결절성 흑색종, 말단 흑자 흑색종 또는 섬유조직형성 흑색종일 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 상기 암은 대장암일 수 있으며, 상기 대장암은 상행결장, 횡행결장, 하행결장, S자 결장 및 직장 점막으로부터 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 부위에 발생하는 악성종양을 포함한다. 상기 대장암은 선암, 림프종, 악성 유암종, 평활근육종, 카포시 육종 및 편평상피암으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 종류일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 대장암은 분자병리학적 분류에 따라 염색체 불안정성(chromosomal instability, CIN) 대장암, 현미부수체 안정성(microsatellite stable) 또는 현미부수체 불안정성(microsatellite instability, MSI) 대장암, 또는 CpG Island methylator phenotype (CIMP) 일 수 있으며, 상기 염색체 불안정성에 의한 발생 기전은 microsatellite-stable pathway(MSS) 또는 APC(adenomatous polyposis coli)/beta-catenin pathway로 불려진다. 본 발명에 따른 미생물은 항암 활성과 함께 항염증 활성을 가지며, 이에 염증성 대장염(IBD) 및 대장암 모두에서 예방 또는 치료 효과를 가진다. 상기 대장암은 대장염 연관 대장암(colis associated colon cancer)일 수 있다. 본 발명에 따른 미생물 제제와 면역체크포인트 억제제의 병용 조성물은 다양한 암종에 대해 예방 또는 치료 효과를 가지며, 특히 대장암, 간암 등에 효과적으로 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 미생물은 항암 활성, 예를 들면 대장암에 대한 항암 활성을 갖는 패칼리박테리움(Faecalibacterium) 속 미생물의 균체를 포함한다. 상기 미생물은 생균체, 사균체, 건조균체, 또는 동결건조물을 포함한다. 세균의 경우, 세포 외부 구성성분 (세포막 인지지, 세포막단백질, 세포막 다당류 등)과 살아서 수행하는 대사 물질 (butyrate 등 대사물질, 분비단백질 등)등을 포함하며, 사균의 경우 세포 외부 구성 성분 (세포막 인지지, 세포막단백질, 세포막 다당류 등)와 세포 내부 구성 성분 (세포 안에 존재하던 단백질, 핵산 등)을 포함한다.
본 발명에 따른 미생물 제제에 포함되는 미생물 함량은 건조물인 경우 단위 중량(g)당 적어도 1X103 CFU 이상, 예를 들면 적어도 1X 103 CFU 이상, 1X 104 CFU 이상, 1X 105 CFU 이상, 1X 106 CFU 이상, 1X 107 CFU 이상, 또는 1X 108 CFU 이상일 수 있으며, 예를 들면, 1X 102 CFU 내지 1X 1012 CFU일 수 있다. 또는, 본 발명에 따른 미생물 제제에 포함되는 미생물 함량은 생균수로 표시할 수 있으며, 예를 들면 세포 염색에 의한 생균수(viable cell count, VCC)는 건조물로 제공되는 경우 단위 중량(g) 당 1X103 개 이상, 예를 들면 1X103 개 내지 1X1013 개 범위를 갖는 것일 수 있다.
본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 항암 활성은 암의 발생 또는 진행을 억제하는 활성일 수 있다. 구체적으로, 종양의 발생을 지연 또는 종양의 성장 속도를 저해하는 것일 수 있으며, 상기 종양 성장 속도 저해에 의한 암의 전이를 예방 및/또는 억제하는 활성을 추가로 가질 수 있다. 상기 종양은 대장암에 의한 종양 또는 대장암 및 간암에 의한 종양일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 건강한 성인 남성의 분변으로부터 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 분리하여 인간 대장암 세포주를 피하 이식한 마우스에서 종양의 성장을 억제하는 효과를 확인하였다. 상기 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 농도별로 투여한 3개의 실험군 그룹과 상기 균주를 투여하지 않는 음성 대조군의 종양 부피 변화를 비교한 결과, 음성 대조군에 비해 실험군에서의 종양 부피가 유의미하게 감소하였다. 구체적으로, 균주 투여를 시작한 당일(1일)의 평균 종양 크기는 4개 그룹에서 모두 105mm3로 같았으나, 36일 경과 후에는 음성 대조군에서 평균 종양 부피가 4330mm3로 나타난 반면, CLCC1 균주가 투여된 실험군에서는 모두 3000mm3 이하의 부피를 보여, 대조군 대비 약 60 내지 67%의 종양 부피를 가지는 것으로 확인되었는 바, 패칼리박테리움 캔서인히벤스 균주의 대장암 성장 억제 효과를 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 인간 대장암 세포주를 피하 이식한 마우스에서 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1의 투여 여부에 따른 종양의 무게 및 마우스의 체중을 측정한 결과, 마우스의 체중은 상기 균주의 투여 여부에 관계없이 큰 차이를 나타내지 않았으나, 종양의 무게는 상기 균주를 투여한 실험군 3개 그룹에서 모두 음성 대조군에 비해 현저히 낮게 나타났다. 구체적으로, 음성 대조군 (G1)에서는 부검 후 적출된 종양 무게가 약 3.21g으로 나타났으나, 실험군에서는 저, 중, 고농도에서 각각 1.94, 2.17 및 1.95g으로 나타나 종양 조직의 무게가 현저히 낮게 나타났다.
본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 상기 균주를 투여하였을 때, 종양 성장 억제율이 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 5 내지 90%, 5 내지 70%, 5 내지 50%, 10 내지 90%, 10 내지 70%, 10 내지 50%, 15 내지 90%, 15 내지 70%, 15 내지 50%, 20 내지 90%, 20 내지 70%, 20 내지 50%, 25 내지 90%, 25 내지 70%, 25 내지 50%, 30 내지 90%, 30 내지 70%, 또는 30 내지 50%일 수 있다. 상기 종양 성장 억제율은 하기 수학식 1에 의해 계산될 수 있다.
Figure PCTKR2021001791-appb-M000001
상기 수학식 1에서, IR은 종양의 성장 억제율 (Tumor growth inhibition rate, IR), T는 각 실험군 그룹에서의 평균 종양 무게이고, C는 음성 대조군에서의 평균 종양 무게이다.
본 발명의 일 실시예에서, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 저농도, 중농도 또는 고농도로 투여한 실험군 3개 그룹 및 상기 균주를 투여하지 않는 음성 대조군에서의 종양 무게 측정 결과를 토대로 상기의 수학식 1을 이용하여 종양 성장 억제율을 측정하였다. 상기 균주를 저농도(2x106 cells/head)로 투여한 실험군에서는 종양 성장 억제율이 39.6%, 중농도(2x107 cells/head)로 투여한 실험군에서는 종양 성장 억제율이 32.4%, 고농도(2x108 cells/head)로 투여한 실험군에서는 종양 성장 억제율이 39.3%로 나타나, 모든 실험군에서 종양의 성장이 30% 이상 억제되었음을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 건강한 성인 남성의 분변으로부터 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 분리하여 간암을 유도 또는 이식한 마우스에서 종양의 성장을 억제하는 효과를 확인하였다. 평균적으로 대조군에 비해 CLCC1을 경구 투여한 실험군에서 간암 종양의 부피가 19.5% 내지 75.3%, 평균 32.9% 가량 낮은 수치를 보였다. 따라서 경구 투여된 CLCC1 균주가 간암에 있어서 종양의 발생 및 진행을 억제하는 활성을 가짐을 알 수 있다.
본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 상기 균주를 투여하였을 때, 상기 균주를 투여하지 않는 음성 대조군의 대장암 종양 부피 100%를 기준으로, 대장암 종양 부피가 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 67% 이하, 10 내지 90%, 10 내지 80%, 10 내지 70%, 10 내지 67%, 20 내지 90%, 20 내지 80%, 20 내지 70%, 20 내지 67%, 30 내지 90%, 30 내지 80%, 30 내지 70%, 30 내지 67%, 40 내지 90%, 40 내지 80%, 40 내지 70%, 40 내지 67%, 50 내지 90%, 50 내지 80%, 50 내지 70%, 50 내지 67% 또는 60 내지 67% 수준으로 감소하는 활성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 상기 균주를 투여하였을 때, 상기 균주를 투여하지 않은 대조군의 간암 종양 부피 100%를 기준으로, 종양 부피가 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 77% 이하, 10 내지 90%, 10 내지 85%, 10 내지 80%. 10 내지 77%, 15 내지 90%, 15 내지 85%, 15 내지 80%, 15 내지 77%, 18 내지 90%, 18 내지 85%, 18 내지 80%, 또는 18 내지 77% 수준으로 감소하는 활성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens 균주는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 16S rRNA 또는 이와 뉴클레오타이드 서열 동일성이 98.5%이상인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 16S rRNA을 가지는 균주일 수 있다. 구체적으로, 본 명세서의 서열번호 1로 이루어진 뉴클레오티드 서열과 적어도 98.5%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 의 서열 동일성을 가진다.
발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens 균주는 20 내지 40 ℃온도, 25 내지 40 ℃온도, 30 내지 40 ℃온도, 35 내지 40 ℃ 또는 37 ℃온도에서 배양될 수 있으며, 혐기 조건에서 배양되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 기존 패칼리박테리움 속 균주인 패칼리박테리움 프라우스니치이(Faecalibacterium prausnitzii)와는 다른 지질 생산 패턴을 나타내는 특성이 있다.
본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1균주는 17:0 iso 3OH 지방산을 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주와 Faecalibacterium prausnitzii 종의 극성 지질 함량을 분석한 결과, CLCC1은 Faecalibacterium prausnitzii에는 없는 PL3를 추가로 가지고 있는 것을 확인하였다 (도 3b).
본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 15:1 w8c 지방산, 19:0 cyclo w10c/19w6 지방산, 20:1 w9c 지방산, 14:0 3OH/16:1 iso I 지방산, 15:0 3OH 지방산, 16:0 iso 지방산 및 16:0 iso 3OH 지방산으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 지방산을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주와 Faecalibacterium prausnitzii 종의 지방산 구성을 가스 크로마토그래피 분석을 수행하여 비교한 결과, 두 균주간 주요 지방산의 구성에 차이가 나는 것을 알 수 있었다. 구체적으로, 15:1 w8c 지방산, 19:0 cyclo w10c/19w6 지방산, 20:1 w9c 지방산, 14:0 3OH/16:1 iso I 지방산, 15:0 3OH 지방산, 16:0 iso 지방산 및 16:0 iso 3OH 지방산은 CLCC1 균주에서만 검출되었으며, 17:0 iso 3OH 지방산은 Faecalibacterium prausnitzii ATCC 27768 균주에서만 검출되었다.
본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 짧은 사슬 지방산(short chain fatty acid; SCFA) 중 부티르산의 생산량이 높은 특성을 가진다. 구체적으로, 본 발명의 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 부티르산 생산량은 Faecalibacterium prausnitzii 종에 비해 2 내지 50배, 2 내지 40배, 2 내지 30배, 2 내지 20배, 2 내지 15배, 2 내지 10배, 5 내지 50배, 5 내지 40배, 5 내지 30배, 5 내지 20배, 5 내지 15배, 또는 5 내지 10배일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주 및 Faecalibacterium prausnitzii 종의 배양 상등액의 SCFA 분석 결과, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 Faecalibacterium prausnitzii 종에 비해 7.8배 높은 부티르산 함량을 보였다 (도 3c 내지 3d).
본 발명에 따른 바람직한 패칼리박테리움 속 균주는 2019년 1월 3일자로 대한민국 전라북도 정읍시 입신길 181에 위치하는 국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 수탁번호 KCTC 13783BP를 부여받았으며, 학명은 패칼리박테리움 캔서인히벤스 (Faecalibacterium cancerinhibens)이다.
본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens 균주는 한천 배지에 도말하여 배양하는 경우, 3mm 이내 또는 2mm 이내의 콜로니를 형성하고, 광학 현미경으로 관찰하였을 때 긴 막대 모양의 세포 모양을 가진다. 본 발명의 일 실시예에서, Faecalibacterium cancerinhibens 은 2.9Mbp의 유전체 크기를 가지며, 단백질 암호화 부위(CDS)의 수는 2695개이고, GC 비율은 56.1%, rRNA 유전자의 수는 21개, 전체 tRNA 유전자의 수는 69개로 나타났다. 본 발명에 따른 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1는, Faecalibacterium prausnitzii 에 비해 7.8배 높은 함량의 부티르산(butanoic acid)이 검출되었다 (도 3c 내지 3d).
본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 항암 활성, 예를 들어 대장암에 대한 항암 활성을 가지는 것을 특징으로 한다. 본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 항암 활성은 암, 예를 들어 대장암의 발생 또는 진행을 억제하는 활성일 수 있다. 구체적으로, 종양의 발생을 지연 또는 종양의 성장 속도를 저해하는 것일 수 있으며, 상기 종양 성장 속도 저해에 의한 대장암의 전이를 예방 및/또는 억제하는 활성을 추가로 가질 수 있다. 본 발명이 제공하는 Faecalibacterium00 cancerinhibens CLCC1 균주는 대장암에 대한 항암 활성에 더하여 간암에 대한 항암 활성을 추가로 가질 수 있다.
본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 상기 균주를 투여하였을 때, 상기 균주를 투여하지 않는 음성 대조군의 대장암 종양 부피 100%를 기준으로, 대장암 종양 부피가 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 67% 이하, 10 내지 90%, 10 내지 80%, 10 내지 70%, 10 내지 67%, 20 내지 90%, 20 내지 80%, 20 내지 70%, 20 내지 67%, 30 내지 90%, 30 내지 80%, 30 내지 70%, 30 내지 67%, 40 내지 90%, 40 내지 80%, 40 내지 70%, 40 내지 67%, 50 내지 90%, 50 내지 80%, 50 내지 70%, 50 내지 67% 또는 60 내지 67% 수준으로 감소하는 활성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 상기 균주를 투여하였을 때, 상기 균주를 투여하지 않은 대조군에 비해 간암 종양 부피가 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 77% 이하, 10 내지 90%, 10 내지 85%, 10 내지 80%. 10 내지 77%, 15 내지 90%, 15 내지 85%, 15 내지 80%, 15 내지 77%, 18 내지 90%, 18 내지 85%, 18 내지 80%, 또는 18 내지 77% 감소하는 활성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 건강한 성인 남성의 분변으로부터 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 분리하여 인간 대장암 세포주를 피하 이식한 마우스에서 종양의 성장을 억제하는 효과를 확인하였다. 상기 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 농도별로 투여한 3개의 실험군 그룹과 상기 균주를 투여하지 않는 음성 대조군의 종양 부피 변화를 비교한 결과, 음성 대조군에 비해 실험군에서의 종양 부피가 유의미하게 감소하였다. 구체적으로, 균주 투여를 시작한 당일(1일)의 평균 종양 크기는 4개 그룹에서 모두 105mm3로 같았으나, 36일 경과 후에는 음성 대조군에서 평균 종양 부피가 4330mm3로 나타난 반면, CLCC1 균주가 투여된 실험군에서는 모두 3000mm3 이하의 부피를 보여, 대조군 대비 약 60 내지 67%의 종양 부피를 가지는 것으로 확인되었는 바, 패칼리박테리움 캔서인히벤스 균주의 대장암 성장 억제 효과를 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 인간 대장암 세포주를 피하 이식한 마우스에서 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1의 투여 여부에 따른 종양의 무게 및 마우스의 체중을 측정한 결과, 마우스의 체중은 상기 균주의 투여 여부에 관계없이 큰 차이를 나타내지 않았으나, 종양의 무게는 상기 균주를 투여한 실험군 3개 그룹에서 모두 음성 대조군에 비해 현저히 낮게 나타났다. 구체적으로, 음성 대조군 (G1)에서는 부검 후 적출된 종양 무게가 약 3.21g으로 나타났으나, 실험군에서는 저, 중, 고농도에서 각각 1.94, 2.17 및 1.95g으로 나타나 종양 조직의 무게가 현저히 낮게 나타났다.
본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 상기 균주를 투여하였을 때, 종양 성장 억제율이 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 5 내지 90%, 5 내지 70%, 5 내지 50%, 10 내지 90%, 10 내지 70%, 10 내지 50%, 15 내지 90%, 15 내지 70%, 15 내지 50%, 20 내지 90%, 20 내지 70%, 20 내지 50%, 25 내지 90%, 25 내지 70%, 25 내지 50%, 30 내지 90%, 30 내지 70%, 또는 30 내지 50%일 수 있다. 상기 종양 성장 억제율은 하기 수학식 1에 의해 계산될 수 있다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2021001791-appb-I000001
상기 수학식 1에서, IR은 종양의 성장 억제율 (Tumor growth inhibition rate, IR), T는 각 실험군 그룹에서의 평균 종양 무게이고, C는 음성 대조군에서의 평균 종양 무게이다.
본 발명의 일 실시예에서, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 저농도, 중농도 또는 고농도로 투여한 실험군 3개 그룹 및 상기 균주를 투여하지 않는 음성 대조군에서의 종양 무게 측정 결과를 토대로 상기의 수학식 1을 이용하여 종양 성장 억제율을 측정하였다. 상기 균주를 저농도(2x106 cells/head)로 투여한 실험군에서는 종양 성장 억제율이 39.6%, 중농도(2x107 cells/head)로 투여한 실험군에서는 종양 성장 억제율이 32.4%, 고농도(2x108 cells/head)로 투여한 실험군에서는 종양 성장 억제율이 39.3%로 나타나, 모든 실험군에서 종양의 성장이 30% 이상 억제되었음을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 건강한 성인 남성의 분변으로부터 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 분리하여 간암을 유도 또는 이식한 마우스에서 종양의 성장을 억제하는 효과를 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 간암 세포주의 피하 종양 이식 실험을 통해 간암을 발생시키고, 55일 동안의 간암 발생 과정에서 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 경구 투여한 경우, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 경구 투여한 실험군에서 대조군에 비해 통계적으로 유의미하게 종양 발생 및 진행이 억제됨이 확인되었다 (도 4a 내지 4c). 평균적으로 대조군에 비해 CLCC1을 경구 투여한 실험군에서 종양의 부피가 19.5% 내지 75.3%, 평균 32.9% 가량 낮은 수치를 보였다. 따라서 경구 투여된 CLCC1 균주가 종양의 발생 및 진행을 억제하는 활성을 가짐을 알 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 간암 세포주의 간 이식 실험을 통해 마우스에서 간암을 발생시키고, 39일 동안의 암 발생 과정에서 Faecalibacterium 속 세균 CLCC1를 경구 투여한 경우, CLCC1를 경구 투여한 실험군에서 CLCC1 균주를 투여하지 않은 대조군에 비해 통계적으로 유의미하게 암 발생과 진행이 억제되는 것을 확인 하였다(도 5a 내지 도 5c). 따라서 상기 CLCC1 균주가 종양의 발생 및 성장 억제 활성이 뛰어남을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 예는, 개체의 장내 전체 균총 내 패칼리박테리움 캔서인히벤스 균주의 비율(%)을 측정하는 단계를 포함하는, 개체에서 대장암 또는 종양을 검출하기 위한 유용한 정보 및/또는 동물 개체에서 대장암 또는 종양의 치료학적 처치시 약물의 효능을 예측하기 위한 유용한 정보를 입수하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는, 개체의 장내 균총 내 패칼리박테리움 캔서인히벤스 균주의 비율(%)을 측정하는 단계를 포함하는, 개체에서의 대장암 진단 방법 및 상기 균주의 비율 측정을 위한 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 미생물의 비율을 측정하는 제제는, 패칼리박테리움 캔서인히벤스에 특이성을 가지는 것이면 제한 없이 이용 가능하며, 예를 들어, 프라이머, 프로브, 항체, 및 압타머로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제제일 수 있다.
상기 미생물의 비율을 측정하는 단계는, 개체로부터 분리된 장 샘플, 예를 들어 장 바이옵시 또는 대변 샘플로부터 미생물의 비율을 측정하는 것일 수 있다. 상기 미생물의 비율 측정 방법은, 통상의 기술자가 당 업계의 기술 상식에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 예를 들어 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR), 대용량염기서열분석법(massively parallel sequencing), 형광 인-시추 혼성화(FISH), 마이크로어레이 및 PCR-ELISA로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자적 방법을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 개체에서 대장암 또는 대장암 및 간암의 발병과 이의 진행을 스크리닝, 진단, 차별적인 진단 및/또는 모니터링하는 등의, 대장암 또는 대장암 및 간암을 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개체의 장 샘플에서 Faecalibacterium cancerinhinbens CLCC1의 존재를 확인하는 단계를 포함하는, 동물 개체에서 약물의 대장암 또는 대장암 및 간암에 대한 치료학적 처치 효능을 예측하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는 대장암 또는 대장암 및 간암의 예방 또는 치료 활성을 갖는 패칼리박테리움(Faecalibacterium) 속 미생물의 균체, 상기 미생물 배양물, 상기 미생물의 파쇄물 및 상기 미생물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 항암 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 패칼리박테리움 속 미생물은 예를 들어, 패칼리박테리움 캔서인히벤스(Faecalibacterium cancerinhibens)일 수 있으며, 대장암 또는 대장암 및 간암의 발생 및 증식을 억제하는 활성을 나타내며, 암세포의 종양 형성 및/또는 종양의 성장 지연 활성을 가진다. 본 발명에 다른 패칼리박테리움 속 미생물은 상기 암세포의 종양 형성 및/또는 종양의 성장 지연 활성 외에 암세포의 전이를 줄이거나 감소시키는 활성을 추가로 가질 수 있다.
구체적으로, 치료 전의 동일한 개체에서의 상응하는 종양 크기, 암 세포의 수 또는 종양 성장 속도와 비교하여, 또는 치료를 받지 않은 다른 개체에서의 상응하는 활성과 비교하여 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 만큼 종양 크기, 암 세포의 수, 또는 종양의 성장 속도를 감소시키는 활성을 가질 수 있다. 구체적으로, 본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 미생물은 상기 균주를 투여하였을 때, 상기 균주를 투여하지 않는 음성 대조군의 대장암 종양 부피 100%를 기준으로, 대장암 종양 부피가 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 67% 이하, 10 내지 90%, 10 내지 80%, 10 내지 70%, 10 내지 67%, 20 내지 90%, 20 내지 80%, 20 내지 70%, 20 내지 67%, 30 내지 90%, 30 내지 80%, 30 내지 70%, 30 내지 67%, 40 내지 90%, 40 내지 80%, 40 내지 70%, 40 내지 67%, 50 내지 90%, 50 내지 80%, 50 내지 70%, 50 내지 67% 또는 60 내지 67% 수준으로 감소하는 활성을 가지는 것일 수 있다.
또한, 본 발명이 제공하는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 상기 균주를 투여하였을 때, 상기 균주를 투여하지 않은 대조군의 간암 종양 부피 100%를 기준으로, 종양 부피가 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 77% 이하, 10 내지 90%, 10 내지 85%, 10 내지 80%. 10 내지 77%, 15 내지 90%, 15 내지 85%, 15 내지 80%, 15 내지 77%, 18 내지 90%, 18 내지 85%, 18 내지 80%, 또는 18 내지 77% 수준으로 감소하는 활성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 패칼리박테리움 캔서인히벤스 균주를 투여한 마우스는 상기 균주를 투여하지 않은 마우스에 비해 종양 부피(volume)가 약 30 내지 40% 감소하여, 상기 균주의 대장암에 대한 종양의 크기 감소 및 종양의 성장 속도 저해 효과가 확인되었다.
본 발명의 일 실시예에서, 패칼리박테리움 캔서인히벤스 균주를 투여한 마우스는 상기 균주를 투여하지 않은 마우스에 비해 종양 크기(volume)가 평균 32.9% 감소하여, 종양의 크기 감소 및 종양의 성장 속도 저해 효과가 확인되었다.
본 발명의 일 실시예에서, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 투여한 마우스와 상기 균주를 투여하지 않은 대조군 마우스에 피하 종양 세포를 이식하여 간암 발생 및 성장 속도를 MR 촬영을 이용하여 확인한 결과, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 투여한 경우, 대조군에 비해 간암 종양의 부피가 평균 32.9% 낮은 수치를 나타내, 암 발생의 지연 및 종양의 성장 진행 속도의 지연이 확인되었다.
본 발명의 일 실시예에서, 8주령 마우스의 간 좌엽에 간암 세포주 Hep55.1c를 이식하여 간암을 발생시킨 후, Faecalibacterium cancerinhibens 균주를 투여한 실험군과 투여하지 않은 대조군의 종양의 크기 (volume)를 비교한 결과, 이식 수술 당일의 종양 크기를 1로 두었을 때, Faecalibacterium cancerinhibens 균주를 투여한 실험군에서의 종양 성장이 대조군에 비해 두드러지게 억제되었다.
본 발명에 따른 패칼리박테리움 속 균주는 Faecalibacterium cancerinhibens 또는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1이다. Faecalibacterium cancerinhibens 균주의 16S rRNA 유전자 서열과 적어도 97% 이상, 98%이상, 98.5% 이상, 99%이상, 99.5%이상 또는 99.9%이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖는 패칼리박테리움 속 미생물이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 패칼리박테리움 속 균주는 서열 번호 1의 염기 서열과 적어도 97% 이상, 98%이상, 98.5% 이상, 99%이상, 99.5%이상 또는 99.9%이상 동일한 16S rRNA 유전자 염기 서열을 갖는다.
상기 조성물의 유효성분인 패칼리박테리움 속 미생물의 균체, 상기 미생물 배양물, 상기 미생물의 파쇄물 및 상기 미생물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상은 0.00001 중량% 내지 100 중량%, 0.001 중량% 내지 99.9 중량 %, 0.1 중량% 내지 99 중량 %, 더욱 바람직하게는 1 중량% 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
상기 패칼리박테리움 속 미생물은 미생물을 포함하거나, 미생물을 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 상기 패칼리박테리움 속 미생물을 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것이다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 항암 활성을 가지는 패칼리박테리움 속 미생물은 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 파쇄물 및 상기 미생물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.
본 발명의 조성물은 동결 건조된 박테리아를 포함할 수 있다. 박테리아의 동결 건조는 통상의 기술자가 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 살아있는 활성 박테리아 배양물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 속의 미생물은 불활성화되어 있지 않으며, 예컨대, 열-불활성화되어 있지 않다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 속의 미생물은 사멸되어 있지 않으며, 예컨대, 열-사멸되어 있지 않다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 속의 미생물은 약화되어 있지 않으며, 예컨대, 열-약화되어 있지 않다. 예컨대, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 속의 미생물은 사멸되고/되거나, 불활성화되고/되거나 약화되어 있지 않다. 일부 구현예에서, 본 발명의 미생물은 생존가능하며 장을 부분적으로 또는 전체적으로 콜로니화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 치료 유효량의 본 발명의 미생물을 포함한다. 치료 유효량의 미생물은 환자에게 유익한 효과를 발휘하기에 충분하다. 미생물의 치료학적 유효량은 환자의 장내 수송 및/또는 부분적 또는 전체 콜로니화를 초래하기에 충분할 수 있다.
본 발명의 조성물은 미생물 또는 미생물 제제를 장내로 수송할 수 있도록 제제화하는 것이 바람직하며, 예를 들면 캡슐화될 수 있다. 캡슐화는 예를 들어 압력, 효소 활성 또는 pH의 변화에 의해 유발될 수 있는 물리적 붕괴와 같은 화학적 또는 물리적 자극에 의한 파열을 통해 표적 위치로 수송될 때까지 조성물이 분해되지 않도록 보호한다.
본 명세서에서 용어 "면역 체크포인트"는 면역 반응을 조절하기 위해 면역계의 구성성분에게 저해 신호를 제공하는 이러한 면역계의 구성성분을 지칭한다. "면역 체크포인트 저해제"는 면역 체크포인트 단백질의 기능을 저해하는 임의의 화합물을 지칭한다. 저해는 기능의 저하 및 완전 차단을 포함한다. 특히, 면역 체크포인트 단백질은 인간 면역 체크포인트 단백질이다. 따라서, 면역 체크포인트 단백질 저해제는 특히, 인간 면역 체크포인트 단백질의 저해제이다.
적어도 하나의 체크포인트 저해제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, IDO, LAG-3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3, KIR, A2aR, VISTA, 및 STAT3의 저해제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명에 따른 면역 체크포인트 저해제는 면역 체크포인트 단백질에 특이적으로 결합하여 그 활성을 조절 또는 저해할 수 있는 물질로서, 단백질, 펩타이드, 항체, 핵산분자 등일 수 있다.
상기 PD-1 길항제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, MEDI-0680, REGN2810, 또는 AMP-224의 인간화 항체, 상기 PD-L1 길항제는 BMS-936559/MDX-1105, MPDL3280A/RG7446/아테졸리주맙, MSB0010718C/아벨루맙, 또는 MEDI4736/두르발루맙, 또는 상기 CTLA-4 길항제는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙일 수 있다. 항-PD-L1 항체는 YW243.55.S70, MDX-1105, MPDL3280A, 또는 MEDI4736일 수 있다.
소정의 양태에서, 이러한 방법은 적어도 하나의 추가의 항암 치료를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 추가의 항암 치료는 수술 요법, 화학 요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 면역 요법, 저분자 요법, 수용체 키나제 저해제 요법, 항-혈관신생 요법, 사이토카인 요법, 한랭 요법 또는 생물학적 요법이다. 일부 양태에서, 생물학적 요법은 모노클로날 항체, siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임 또는 유전자 요법이다.
본 명세서에서 "대상체" 및 "환자"는 인간 또는 비-인간, 예컨대 영장류, 포유유 및 척추동물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
본 발명에 따른 패칼리박테리움 속 미생물을 포함하는 항암 조성물은, 암의 발생 및 성장을 억제하는 활성이 있으며, 특히 약학 조성물 또는 건강기능식품 등의 형태로 인간이 섭취하여 암의 예방, 치료 및/또는 개선에 이용될 수 있다.
도 1a는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 Reinforced clostridial media(RCM) 배지에 3일간 배양한 후 형성된 콜로니 형태를 나타낸 사진이다.
도 1b는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 액체 배양 시 대수기 상태(exponenetial growth phase)에서 세포 외형을 광학 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 1c는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 균주의 액체 배양 시 대수기 상태(exponenetial growth phase)에서 세포를 주사전자현미경으로 촬영한 사진이다.
도 2a는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 16S rRNA 분석을 통해 얻은 계통분류학적 위치를 나타낸 그림이다.
도 2b은 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 유전체에 존재하는 92개의 핵심 유전자를 이용하여 계통분류학적 위치를 나타낸 그림이다.
도 2c는 평균 뉴클레오타이드 일치도 (ANI) 값에 기반한 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주 및 근연종의 유연관계도이다.
도 2d는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주 및 근연종의 ANI값을 비교한 표이다.
도 3a는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주와 Faecalibacterium prausnitzii 균주의 지방산 구성을 비교한 가스 크로마토그래피 분석 결과 그래프이다.
도 3b는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주와 Faecalibacterium prausnitzii 균주의 극성 지질의 비교를 위해 수행한 2차원 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 3c는 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1의 짧은 사슬 지방산 분석을 수행한 GC-MS 분석 그래프이다.
도 3d는 Faecalibacterium prausnitzii의 짧은 사슬 지방산 분석을 수행한 GC-MS 분석 그래프이다.
도 4a 내지 4c는 실시예 4의 방법으로 간암을 유도한 마우스에서 CLCC1 균주의 암 발생 억제 효과를 측정하기 위해 간암 유도 후 시간에 따른 종양 부피 변화를 나타낸 그래프이다. 도 4a는 각 개체를 검으로 나타낸 점그래프, 도 4b는 실험군과 대조군의 평균값을 비교한 그래프, 도 4c는 각 개체별 암 부피 변화를 각각 나타낸 꺾은선 그래프이다.
도 5a 내지 도 5c는 간 이식 모델에서의 CLCC1 균주의 암 발생 억제 효과 시험 결과 및 각 결과의 점그래프와 꺾은선그래프이다. 도 5a는 종양의 크기를 직접 비교한 결과, 도 5b는 종양의 크기 변화를 배수(fold)로 표현한 결과, 도 5c는 델타 값을 의미한다.
도 6a는 인간 대장암 세포주를 피하 이식한 마우스에서 CLCC1 균주의 투여량에 따른 종양의 부피 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 인간 대장암 세포주를 피하 이식한 마우스에서 CLCC1 균주의 투여량에 따른 종양의 무게 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6c는 인간대장암 세포주를 피하 이식한 마우스에서 CLCC1 균주의 투여량에 따른 종양의 크기 변화를 육안 관찰한 결과이다.
도 6d는 인간 대장암 세포주를 피하 이식한 마우스에서 CLCC1 균주의 투여 기간 종료 후 음성 대조군(G1) 및 각 실험군(G2 내지 G4)에서의 종양 조직을 분리하여 육안 관찰한 결과이다.
도 6e는 인간 대장암 세포주를 피하 이식한 마우스의 종양 조직에서 CLCC1 균주의 투여에 따른 세포 괴사를 확인하기 위해 H&E 염색을 수행한 결과이다.
도 6f는 인간 대장암 세포주를 피하 이식한 마우스의 종양 조직에서 CLCC1 균주의 투여에 따른 세포 자멸사(apoptosis)를 확인하기 위해 TUNEL 염색을 수행한 결과이다.
도 7은 실시예 9에 따라 대장암 세포주가 이식된 대장암 동물 모델에서 다양한 시험 제제를 투여한 결과로 얻어진 종양 부피를 나타내는 그래프이다.
도 8는 실시예 10에 따라 대장암 세포주가 이식된 대장암 동물 모델에서 다양한 시험 제제를 투여하여 얻은 종양 부피 감소를 나타내는 그래프이다.
도 9은 본 발명의 일 예에 따라 항암 효능을 실험하기 위하여 암을 가지는 동물 모델에서 다양한 시험 제제를 투여하기 위한 실험디자인을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예에 의해 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주의 분리
Faecalibacterium 속 세균은 건강한 성인의 장내 우점 세균으로 전체 장내 세균 중 약 10%의 비율을 차지하며, 건강에 직간접적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 건강한 20대 성인 남성의 분변을 Reinforced clostridial media(RCM) 배지에 희석 도말한 후 37 ℃상온 혐기 배양 조건에서 배양하여 분리하였다.
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1은 RCM 한천 배지에서 3일간 배양하면 최대 2 내지 3mm의 콜로니를 형성하고, 광학 현미경으로 관찰하였을 때 긴 막대 모양의 세포 모양을 보이는 특성이 있다. 도 1a 및 1b에 상기 콜로니 형태 및 광학 현미경을 이용한 세포의 형태 관찰 결과를 나타내었다. 도 1c에 주사전자현미경을 이용하여 세포의 형태를 촬영한 사진을 나타내었다.
실시예 2. 균주의 계통분류학적 분석
2-1. Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 유전제 시퀀싱
실시예 1의 방법으로 분리된 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 RCM 액체 배지에서 37 ℃상온 혐기 배양 조건에서 1일간 배양 후, 원심분리하여 균주를 수득하였다. FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals)를 이용하여 수득된 균주로부터 전체 유전체를 분리하였다.
PacBio 시퀀싱 라이브러리 키트를 이용하여 시퀀싱 라이브러리 제작 후 PacBio RS II 플랫폼을 이용하여 전체 유전체 시퀀싱을 수행하고, 자사의 유전체 데이터 분석 플랫폼인 BIOiPLUG의 Whole Genome 분석 파이프라인을 이용하여 유전체 시퀀싱 정보를 분석하였다.
하기 표 1에 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 유전체 특성을 나타내었다. Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 전체 유전체 크기는 약 2.9Mbp이고, 단백질 암호화 부위(CDS)의 수는 2695개이며, GC 비율(GC ratio, %)은 56.1%로 나타났다. 전체 rRNA 유전자는 21개, 전체 tRNA 유전자는 69개로 나타났다.
항목 값
유전체 크기 (Genome size, bp) 2,941,967
단백질 암호화 부위 수 (Number of CDSs) 2,695
GC 비율 (GC ratio, %) 56.1
rRNA 유전자 수 (Number of rRNA genes) 21
tRNA 유전자 수 (Number of tRNA genes) 69
2-2. 16S rRNA 분석을 이용한 계통 분류학적 분석
실시예 2-1의 방법으로 서열 분석된 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 rRNA를 분석하여 계통 분류학적 분석을 수행하였다. Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 16S rRNA 서열은 서열번호 1에 나타내었다.
구체적으로, EzBioCloud 데이터베이스의 16S-based identification for prokaryote 파이프라인을 이용 16S rRNA의 유사성 분석을 수행하였고, MEGA 프로그램을 이용하여 계통분류학적 분석을 수행하였다. 도 2a에 16S rRNA 유전자 뉴클레오타이드 서열을 분석하여 동정한 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 계통분류학적 위치를 표시하였다.
16S rRNA 유사도 분석 결과, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 Faecalibacterium prausnitzii ATCC 27768(T)와 98%의 16S rRNA 유사성을 보였다. CLCC1의 계통분류학적 위치는 "퍼미큐테츠 (Firmicutes) 문, 클로스트리디아 (Clostridia) 강, 클로스트리데일즈 (Clostridiales) 목, 루미노코카씨에 (Ruminococcaceae) 과 이다.
2-3. 핵심 유전자를 이용한 계통 분류학 분석
실시예 2-1의 방법으로 얻은 유전체 서열 데이터를 이용하여 유전자 서열간 분석을 통한 계통 분류학 분석을 수행하였다.
구체적으로, 박테리아의 taxonomic marker로 사용될 수 있는 92개의 유전자들(up-to-date bacterial core gene (UBCG))의 유사성을 이용해 계통분류학 분석을 수행하였다. 상기 92개의 유전자는 UBCG(up-to-date bacterial core gene) 파이프라인에서 제공하는 유전자들을 의미한다 (Na, S. I., Kim, Y. O., Yoon, S. H., Ha, S. M., Baek, I. & Chun, J. (2018)).
도 2b에 92개 핵심 유전자를 분석하여 얻은 근연종과의 계통분류학적 위치를 나타낸 그림을 표시하였다.
2-4. 평균 뉴클레오타이드 일치도(Average Nucleotide Identity, ANI)를 이용한 유연관계 분석
실시예 2-1의 방법으로 얻은 유전체 분석 데이터를 이용하여, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주와 근연종 간의 ANI 값을 비교하여 유연관계를 분석하였다.
구체적으로, ㈜천랩에서 제공하는 분석 플랫폼인 Genome-based identification for prokaryote (TrueBAC ID) 파이프라인을 이용하여 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주와 다른 근연종들 간의 전체 유전체 서열을 비교하여 유전체 유사도 값을 분석하였다.
도 2c에 ANI 값에 기반한 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주 및 근연종의 유연관계도를 나타내었다. 도 2d에 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주 및 근연종의 ANI값 비교 표를 나타내었다. 각 행과 열은 1은 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1, 2는 Faecalibacterium prausnitzii ATCC 27768(T), 3은 Fournierella massiliensis AT2(T), 4는 Intestinimonas butyriciproducens DSM 26588(T), 5는 Intestinimonas massiliensis GD2(T), 6은 Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799(T), 7은 Ruthenibacterium lactatiformans 585-1(T), 8은 Subdoligranulum variabile DSM 15176(T), 9는 Gemmiger formicilis ATCC 27749(T)를 의미한다. 각 종명 뒤 (T)는 type strain을 의미한다.
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 유전체 해독 및 근연종과의 비교 결과, CLCC1 균주는 전체 유전체 수준에서 가장 가까운 근연종인 Faecalibacterium prausnitzil과 유전체 수준에서 85.99%의 평균 뉴클레오타이드 일치도(average nucleotide identity, ANI) 값을 보여, 기존에 분리 및 보고되지 않은 신규한 종(species)임을 알 수 있다. 상기의 방법으로 동정된 Faecalibacterium 속 균주를 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1로 명명하였다.
실시예 3. 균주의 지방산 함량 분석
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 분자생물학적 특성을 분석하기 위해, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주와 Faecalibacterium prausnitzii의 지방산(fatty acid) 구성을 비교하였다.
구체적으로, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주와 Faecalibacterium prausnitzii 균주를 각각 RCM 배지에서 37℃, 혐기 조건에서 배양 후, 약 40mg의 r균체를 이용해 Miller의 방법(Miller, L. T. (1982) J. Clin. Microbiol. 18, 861-867)에 따라 지방산을 얻었다.
상기 추출된 지방산의 분석에는 Agilent technologies 6890 Gas chromatography가 이용되었으며 separation column은 A30m X 0.320mm X 0.25μm Crosslinked Methyl siloxane column (HP-1)을 사용하였다. 도 3a에 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주와 Faecalibacterium prausnitzii 균주(ATCC 27768)의 지방산 구성을 비교한 가스 크로마토그래피 분석 결과 그래프를 나타내었다. 도 3a의 그래프에서 각 피크(peak)가 의미하는 지방산의 이름과 그 수치(%, w/v)를 하기 표 2에 나타내었다.
지방산 종류 CLCC1 내 함량 (%) ATCC 27768 내 함량 (%)
16:00 32.42 42.28
18:1 w7 28.15 14.88
17:0 2OH 12.51 8.09
16:1 w7c/16:1 w6c 5.22 6.04
16:1 w9c 3.89 1.57
14:00 2.44 14.93
17:0 anteiso 2.42 0.99
16:1 w5c 2.17 0.83
18:1 w9c 1.88 0.86
18:00 1.59 2.17
16:1 2OH 1.41 0.51
20:1 w7c 0.84 0.43
18:1 w5c 0.81 0.32
15:0 2OH 0.75 0.5
18:0 10-methyl, TBSA 0.45 0.21
15:1 w8c 0.44 -
15:1 iso H/13:0 3OH 0.35 1.44
16:0 3OH 0.32 0.11
15:0 anteiso 0.21 0.2
12:00 0.2 1.59
15:0 iso 3OH 0.17 0.49
17:00 0.17 0.2
19:0 cyclo w10c/19w6 0.16 -
20:00 0.14 0.1
13:1 at 12-13 0.13 0.35
10:00 0.13 0.2
20:1 w9c 0.13 -
17:0 iso 0.12 0.17
14:0 3OH/16:1 iso I 0.12 -
15:0 3OH 0.11 -
16:0 iso 0.1 -
16:0 iso 3OH 0.05 -
17:0 iso 3OH - 0.54
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 15:1 w8c 지방산, 19:0 cyclo w10c/19w6 지방산, 20:1 w9c 지방산, 14:0 3OH/16:1 iso I 지방산, 15:0 3OH 지방산, 16:0 iso 지방산 및 16:0 iso 3OH 지방산은 CLCC1 균주에서만 검출되었으며, 17:0 iso 3OH 지방산은 Faecalibacterium prausnitzii ATCC 27768 균주에서만 검출되었다.상기 분자생물학적 특징 비교 분석 결과, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 Faecalibacterium cancerinhibens에 포함되는 알려진 종인 Faecalibacterium prausnitzii와는 상이한 종임을 확인 할 수 있었다. 두 균주의 지방산(fatty acid) 구성을 비교해보았을 때 두 균주간 주요 지방산의 구성에 차이가 나는 것을 알 수 있고, 해당 결과는 도 3a와 표 2에 나타내었다.
실시예 4. 균주의 극성 지질(Polar lipid) 분석
극성 지질(polar lipid) 구성을 비교하기 위해 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography, TLC) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 50mg의 균주 동결건조 시료로부터 Minikin의 방법(Minikin, D.E., et al. (1984). J Microbial Meth 2, 233-241.)을 이용해 극성 지질을 추출하였다. 그리고 클로로포름, 메탄올 및 물 65:25:3.8(v/v)의 비율인 용매(chloroform:methanol:water = 65:25:3.8(v/v)) 에서 1차 전개를 수행하였다. 이후, 클로로포름, 메탄올, 아세트산 및 물의 비율 40:7.5:6:1.8(v/v)인 용매(chloroform:methanol:acetic acid:water = 40:7.5:6:1.8(v/v)) 하에서 2차 전개를 수행하였다. 2차 전개 이후 5%(w/v) 에탄올릭 몰리브덴인산(ethanolic molybdatophosphoric acid)을 이용하여 염색하였다.
또한 극성 지질(Polar lipid)의 조성을 비교하였을 때 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1과 Faecalibacterium prausnitzii는 1개의 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol, PG), 2개의 알려지지 않은 인지질(unidentified phospholipids: PL1, PL2), 그리고 다수의 밝혀지지 않은 지질(unidentified lipid, L)을 가지고 있는 것을 확인하였다. 또한 CLCC1은 Faecalibacterium prausnitzii에는 없는 unidentified phospholipids (PL3)를 추가로 가지고 있는 것을 알 수 있는 것을 확인하였고 해당 결과는 도 3b에 나타내었다. 상기 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1과 Faecalibacterium prausnitzii의 극성 지질 생산 패턴이 상이함을 알 수 있다.
실시예 5. 짧은사슬 지방산(short chain fatty acid; SCFA) 분석
Faecalibacterium prausnitzii과 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 짧은사슬 지방산 생산 패턴의 차이점을 살피기 위해 한국 의과학연구원에 분석 의뢰를 하여 짧은 사슬 지방산 분포 분석을 수행하였다.
구체적으로, Faecalibacterium prausnitzii과 본 발명의 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 RCM 배지에서 16시간 배양 후, 원심분리 (4℃, 4,000 rpm, 10min)를 통해 세포를 침전시켜 상등액을 수집하였다. 상기 수집된 상등액은 0.22um 필터를 이용하여 필터링 후 냉장보관하였다. 상기 상등액으로부터 SCFA 분석을 위한 GC-MS용 시료는 Takeshi Furuhashi의 방법(Takeshi Furuhashi, et al., Analytical Biochemistry, Volume 543, 2018, Pages 51-54)을 이용하여 준비하였으며, GC-MS를 이용한 짧은사슬 지방산 분석에는 Agilent 사의 6890 시리즈 장비를 이용하였다.
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1과 Faecalibacterium 속의 알려진 다른 종인 Faecalibacterium prausnitzii의 배양 상등액에 존재하는 짧은사슬 지방산(Short chain fatty acid, SCFA)을 비교 분석한 결과, 두 시료 모두에서 SCFA는 부티르산(butanoic acid)만 검출되었다. 또한 Faecalibacterium prausnitzii 시료에 비해 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 시료에서 7.8배 높은 함량의 부티르산(butanoic acid)이 검출되었다. 도 3c 내지 3d에 GC-MS 분석 결과 그래프를 표시하였다.
또한 각 시료 내 부티르산 비율로 보았을 때, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 배양 상등액에서는 91.64%가 부티르산으로 나타났고, Faecalibacterium prausnitzii의 배양 상등액에서는 76.40%가 부티르산이었다. 표 3에 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 짧은사슬 지방산 분석 결과를, 표 4에 Faecalibacterium prausnitzii의 짧은사슬 지방산 분석 결과를 나타내었다. 하기 표 3 내지 4에 표기된 기타 물질은 물질 라이브러리 데이터베이스 상에서 탐지가 되기는 하였지만 매칭률(quality)이 매우 낮아 정확히 물질을 특정 할 수 없는 노이즈 시그날로 분류되었다. 하기 표 3 및 표 4에서 RT는 머무름 시간(retention time)을 의미한다.
피크 RT Library/ID 매칭률 (Quality) Area 비율(% of total, %)
1 2.6965 Oxirane 58 606,058 3.132
2 3.1915 Butanoic acid (CAS); n-Butyric acid 94 17,732,337 91.635
3 3.5174 Ethane, methoxy- (CAS); Methane 50 497,085 2.569
4 4.1933 2-Pentanone, 4-hydroxy-4-methyl- (CAS) 43 515,638 2.665
피크 RT Library/ID 매칭률
(Quality)		 Area 비율(% of Total, %)
1 2.6908 2-Decanone (CAS) 38 338,372 11.491
2 3.0167 Butanoic acid (CAS); n-Butyric acid 93 2,249,717 76.401
3 4.2057 2-Pentanone, 4-hydroxy-4-methyl- (CAS) 47 356,542 12.108
부티르산은 항암 활성이 있는 것으로 알려져 있으며, 본 발명의 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 Faecalibacterium prausnitzii에 비해 짧은사슬 지방산 중 부티르산의 생산량이 높아, 우수한 항암 활성을 나타냄을 예측할 수 있다.
실시예 6. 마우스 간암 세포주를 이용한 피하 종양 모델에서의 암 발생 억제 효능 시험
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 암 발생 억제능을 확인하기 위해, 마우스 간암 세포주를 이용한 피하 종양 모델에서의 암 발생 억제 효능 시험하였다. 6주령 수컷 C57BL/6 마우스 10개체에서 간암 세포주 (Hep55.1c)의 피하 종양 이식 실험을 통해 간암을 발생시키고, 55일 동안의 간암 발생 과정에서 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 경구 투여가 간 암 세포의 성장에 미치는 영향을 살펴보았다.
구체적으로, 마우스 간암 세포주를 마우스 피하 조직에 이식하기 4일 전부터 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1을 경구투여 하였다. 경구 투여 4일째에 마우스 간암 세포주(Hep55.1c)를 2.0 x 106 cells이 되게 하여 오른쪽 옆구리 피하 조직에 이식하였다.
상기 마우스 간암 세포주를 이용한 피하 종양 모델에 대해, 55일간 1일 1회, 주5회 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 경구 투여하였다. 이후 이식 당일(0일)부터 55일이 되기까지 7일 간격으로 Magnetic Resonance (MR)촬영을 이용하여 간암 종양의 크기 (tumor volume)를 측정하였다.
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 RCM 배지에서 배양 후, 농축하여 PBS 버퍼와 글라이세롤을 이용해 최종 글라이세롤 농도 15%(v/v)가 되게 하여 냉동보관하였다. 그리고 마우스에 투여 직전 해동 후 마리당 200ul(2x108cells)이 되게 경구투여하였다. 대조군으로는 CLCC1 균주를 투여하지 않은 마우스 10개체를 사용하였다. 대조군은 균주가 포함되지 않은 PBS 및 글라이세롤 (15%, v/v) 용액을 200ul씩 경구투여 하였다.
하기 표 5 및 표 6에 피하 종양 모델에서 분리균주의 간암 발생 억제 효능시험에서 대조군과 시험균의 종양 크기 결과를 나타낸다. 표 5에는 대조군에 관한 종양의 부피(volume) 변화 결과이고, 표 6은 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주를 투여한 실험군 종양의 크기(volume) 변화 결과이다. 표에서 S.D는 표준편차를 의미한다.
Figure PCTKR2021001791-appb-T000001
Figure PCTKR2021001791-appb-T000002
도 4에 마우스에 암을 유도한 후 시간의 변화에 따른 종양의 부피(tumor volume)를 그래프로 나타내었으며, 상기 표 5 내지 표 6에 종양의 크기 변화를 수치로 나타내었다.
실험 결과, CLCC1을 경구 투여한 실험군에서 대조군에 비해 통계적으로 유의미하게 간암 발생 및 진행이 억제됨이 확인되었다. 평균적으로 대조군에 비해 CLCC1을 경구 투여한 실험군에서 종양의 부피가 19.5%에서 75.3%가량, 평균 32.9% 낮은 수치를 보여, Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주가 투여된 실험군에서의 간암 발생이 지연되고, 종양의 성장 진행 속도가 저해됨이 확인되었다.
또한 수술 후 첫 종양 크기 측정일인 4일에서, Faecalibacterium canceerinhibens CLCC1 균주를 투여한 실험군에서 종양의 크기가 대조군에 비해 확연히 작아, 암 발생 억제 효과가 있음을 확인할 수 있다.
따라서 경구 투여된 CLCC1 균주가 간암의 발생 및 진행을 억제하는 활성을 가짐을 알 수 있다.
실시예 7. 마우스 간암 세포주를 이용한 간 이식 모델에서의 암 발생 억제 효능 시험
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주가 간암 세포의 성장에 미치는 영향을 살피기 위해, 8 주령 수컷 C57BL/6 마우스 4개체에서 간암 세포주의 간 이식 실험을 통해 간암을 발생시키고, 39일 동안의 간암 발생 과정에서 Faecalibacterium cancerinhibens 세균 CLCC1의 경구 투여가 간 암 세포의 성장에 미치는 영향을 살펴보았다.
구체적으로, 간암 세포주는 Hep55.1c을 사용하였으며, 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스의 상복부를 개복하여 간의 좌엽에 5.0 x 105 cells이 되도록 간암 세포주를 이식하였다. 간에 종양 세포주를 이식 후 4일간 회복 기간을 거친 후 MRI 촬영을 통해 종양의 크기를 확인하고, 종양이 잘 형성된 4마리를 선별하여 이후 실험에 사용하였다.
이식 수술 당일(0일)부터 39일간 CLCC1 균주를 실시예 4와 동일한 방법으로 준비하여 이식 수술을 완료한 마우스 4마리에 경구 투여하였으며, 대조군 4마리에는 CLCC1 균주를 투여하지 않았다. 대조군은 균주가 포함되지 않은 PBS 및 글라이세롤 (15%, v/v) 용액을 200ul씩 경구투여 하였다. 이후 주기적으로 종양의 크기와 상대적인 크기 및 성장의 상대 수치를 측정하였다.
종양의 크기는 7일 간격으로 자기공명 (Magnetic Resonance, MR) 촬영을 통해 측정되었으며, 종양 크기의 상대 수치는 이식 당일 종양 크기에 대한 상대적인 크기를 계산하여 도출하였다. 도 5a 내지 도 5c에 간 이식 모델에서의 CLCC1 균주의 암 발생 억제 효과 시험 결과와 그래프를 나타내었다.
도 5a는 종양의 크기를 직접 비교한 점그래프 및 꺾은선그래프, 도 5b는 종양의 크기 변화를 배수(fold)로 표현한 점 및 꺾은선 그래프, 도 5c는 종양의 크기 변화량(측정일 종양 크기와 이전 측정일 종양 크기의 차) 값을 나타낸 점 및 꺾은선 그래프이다.
그 결과 CLCC1를 경구 투여한 실험군에서 분리주를 투여하지 않은 대조군에 비해 통계적으로 유의미하게 간암 발생과 진행이 억제되는 것을 확인 하였다. 간 암 발생 억제에 대한 결과 및 종양의 크기 변화 데이터는 도 5a 내지 5c에 나타내었다.
표 7에 종양크기의 상대수치표 (Relative growth; Fold) 및 표 8에는 종양 성장의 상대수치표 (Relative growth; Delta)를 나타낸다.
Figure PCTKR2021001791-appb-T000003
Figure PCTKR2021001791-appb-T000004
표 7 및 표 8와 도 5a 내지 5b에서 확인할 수 있는 바와 같이, CLCC1 균주를 경구투여한 마우스의 종양 성장이 대조군에 비해 두드러지게 억제됨을 확인할 수 있었다. 따라서 패칼리박테리움 켄서인히벤스 CLCC1 균주가 종양의 성장 억제능이 뛰어남을 확인할 수 있다.
실시예 8. 인간 대장암 세포주를 이용한 마우스 피하 종양 모델에서의 항암 효과 확인
8-1. 항암 효과 확인을 위한 실험 방법
Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 암 발생 억제능을 확인하기 위해, 인간 대장암 세포주를 이용한 피하 종양 모델에서의 암 발생 억제 효능 시험하였다. 상기 대장암 세포주는 HCT-116 세포를 이용하였고, 마우스는 면역 결핍 누드마우스 (CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlOri, SPF)를 이용하였다.
구체적으로, 1주일의 순화기간을 거친 마우스에 대장암 세포주 HCT-116 (2.5Х107 cells/mL)을 일회용 주사기를 이용하여 마우스의 우측 등 피하에 0.2 mL/head씩 투여하여 이식하였다.
암 세포 이식 후 암 세포의 크기가 약 85~119mm3 까지 자랐을 때, CLCC1을 투여하지 않는 음성대조군과 CLCC1을 농도별로 투여하는 실험군 3 그룹에 해당될 마우스들을 군 당 10마리씩 분류하였다. 구체적으로, 실험군은 CLCC1의 농도에 따라 저, 중, 고의 세 그룹으로 나누었으며, 저농도는 2x106 cells/head, 중농도는 2x107 cells/head, 고농도는 2x108 cells/head의 농도로 F. cancerinhibens CLCC1 균주를 투여하였다. 균주의 투여는 36일간 매일 1회 주사기로 경구 투여하였다. 음성 대조군은 부형제(글리세롤이 15%(v/v) 포함된 PBS 용액)만을 투여하였다.
하기 표 9에 음성 대조군과 각 실험군의 정보를 나타내었다.
기호 CLCC1 투여량 투여액량 설명 개체수 (마리)
G1 0 0.2mL/head 음성 대조군 10
G2 2x106(cells/head) 0.2mL/head 저농도 실험군 10
G3 2x107(cells/head) 0.2mL/head 중농도 실험군 10
G4 2x108(cells/head) 0.2mL/head 고농도 실험군 10
8-2. 균주 투여에 따른 종양의 크기 변화 및 성장 억제율 F. cancerinhibens CLCC1 균주의 항대장암 효과를 확인하기 위해, 종양의 크기 변화를 확인하였다. 구체적으로, 실시예 8-1의 균주 투여 시험 시작 이후 매일 1회씩 외관, 행동, 배설물 등의 일반 증상을 관찰하였고, 주 1회 몸무게를 측정하였으며, 주 2회 종양의 크기를 측정하고 부피를 계산하였다. 도 6c 및 6d에 종양의 크기를 육안 관찰한 결과를 나타내었다.
상기 종양의 부피(Tv)는 종양의 단축(perpendicular width, W)과 장축(maximum length, L)을 각각 측정하여 하기의 수학식 2의 방법으로 계산되었다.
Figure PCTKR2021001791-appb-M000002
36일에 걸쳐 종양의 부피 변화를 확인한 결과를 하기 표 10 및 도 6a에 나타내었다. 음성 대조군(G1)에 비해 CLCC1 균주를 투여한 실험군에서 모두 통계적으로 유의하게 종양의 크기가 감소한 것을 확인하였다. 하기 표 10에서, Mean은 평균 부피를, S.D.는 표준편차(standard deviataion)를 의미한다.
Figure PCTKR2021001791-appb-T000005
* p<0.05, Significant difference from the negative 대조군 group (G1) by Dunnett's t-test.
** p<0.01, Significant difference from the negative 대조군 group (G1) by Dunnett's t-test.
구체적으로, 균주 투여를 시작한 당일(1일)의 평균 종양 크기는 4개 그룹에서 모두 105mm3로 같았으나, 36일 경과 후에는 음성 대조군에서 평균 종양 부피가 4330mm3로 나타난 반면, CLCC1 균주가 투여된 실험군에서는 모두 3000mm3 이하의 부피를 보여, 대조군 대비 약 60 내지 67%의 종양 부피를 가지는 것으로 확인되었는 바, 패칼리박테리움 캔서인히벤스 균주의 대장암 성장 억제 효과를 확인하였다.
또한 종양의 무게 측정 결과를 바탕으로 각 실험군에서의 종양 성장 억제율(Tumor growth inhibition rate, IR)을 하기 수학식 1의 방법으로 계산하였다.
[수학식 1]
IR (%) = (1 - T/C) x 100
상기 수학식 1에서, T는 각 실험군 그룹에서의 평균 종양 무게이고, C는 음성 대조군에서의 평균 종양 무게이다.
하기 표 11 및 도 6b에 균주 투여 실험의 종료 후 각 그룹에서의 종양 무게 측정 결과를 나타내었으며, 하기 표 12에 실험 진행에 따른 각 그룹 마우스의 평균 체중 측정 결과를 나타내었다.
Figure PCTKR2021001791-appb-T000006
** p<0.01, Significant difference from the negative 대조군 group (G1) by Dunnett's t-test
Figure PCTKR2021001791-appb-T000007
음성 대조군 (G1)에서는 부검 후 적출된 종양 무게가 약 3.21g으로 나타났으나, 실험군에서는 저, 중, 고농도에서 각각 1.94, 2.17 및 1.95g으로 나타나 종양 조직의 무게가 현저히 낮게 나타났다. 반면 각 그룹에서의 전체 체중은 대조군과 실험군 사이에서 큰 차이를 나타내지 않았다.
저농도의 실험군에서는 종양 성장 억제율이 39.6%, 중농도의 실험군에서는 종양 성장 억제율이 32.4%, 고농도의 실험군에서는 종양 성장 억제율이 39.3%로 나타나, 모든 실험군에서 종양의 성장이 30% 이상 억제되었음을 확인하였다.
8-3. 종양세포의 괴사(Necrosis) 및 세포자멸사(Apoptosis) 확인
36일간의 CLCC1 균주 투여 종료 후 부검하여 종양 조직 내 종양세포의 괴사(necrosis)를 보기 위한 H&E 염색(Hematoxylin & Eosin staining)과 세포자멸사(apotosis)를 보기 위한 TUNEL assay를 수행하였다.
도 6e에 종양 세포의 괴사 분석을 위한 H&E 염색 결과 사진을 나타내었다. 음성 대조군과 시험군간 종양 세포의 괴사 수준에는 큰 차이가 발견되지 않았다. 따라서 본원의 패칼리박테리움 캔서인히벤스 세포주는 종양의 괴사에 의한 염증 반응을 유발하지 않음을 알 수 있다.
도 6f에 종양 세포의 자멸사 분석을 위한 TUNEL 염색 분석 결과 사진을 나타내었다. 음성 대조군에 비해 패칼리박테리움 투여 실험군에서 종양 세포의 자멸사가 통계적으로 유의미하게 증가하였음이 확인되었다. 따라서 각 패칼리박테리움 투여군에서의 종양 부피 감소가 종양의 괴사에 의한 것이 아닌, 종양의 세포 자멸사에 의한 것으로서 염증반응을 유발하지 않음을 확인하였다.
하기 표 13에 종양세포의 괴사와 자멸사를 비교한 결과를 나타내었다. 하기 표에서 세포 사멸의 정도에 따라 ± 는 최소(minimal), + 는 약함(mild) ++는 보통(moderate), +++는 뚜렷함(marked), ++++는 심함(severe)을 나타낸다. 각 기호 아래에 해당 단계에 해당하는 사멸 세포의 개수를 나타내었다.
Figure PCTKR2021001791-appb-T000008
## p<0.01, Significant difference from the negative 대조군 group (G1) by Steel's t-test.
상기 표 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군(대조군, G1)에서는 약 10.33%의 세포 사멸 비율을 보였으며, 저농도의 실험군(G2)에서는 대조군과 유사한 세포사멸 비율을 보였으나, 중농도(G3) 및 고농도(G4) 실험군에서는 12.4% 이상의 세포사멸이 관찰되었다. 따라서 패칼리박테리움 캔서인히벤스 균주의 투여로 인해 종양 세포의 자멸이 증가함이 확인되었다.
실시예 9: 대장암 피하 종양 모델을 이용한 Faecalibacterium 속 균주의 효능 평가
(1)동물 모델 준비
CLCC1 균주의 단독 또는 면역항암제 병용 투여 시 대장암에 대한 항암 효능을 확인하기 위해 대장암세포를 피하 이식한 마우스를 이용하였고 미국의 비임상 위탁시험 기관인 Champion's oncology에서 시험을 수행하였다. 대장암 세포는 마우스 유래 대장암 세포주인 MC38 세포를 이용하였고, 마우스 strain은 C57BL/6 를 이용하였다. 시험 그룹은 아래와 같고, 그룹 당 10마리의 마우스가 포함되어 있다.
구체적으로 6주령 수컷 C57BL/6 마우스에서 대장암 세포주인 MC38 세포주 의 피하 종양 이식 실험을 통해 대장암을 발생시키고, 간암 발생 과정에서 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주의 경구 투여가 간 암 세포의 성장에 미치는 영향을 살펴보았다.
(2) 시험 제제의 준비
실시예 8-1의 대조군 및 실험군의 시험 제제 제조방법과 실적으로 동일한 방법으로, 실시예 1의 Faecalibacterium cancerinhibens CLCC1 균주는 RCM 배지에서 배양 후, 농축하여 PBS 버퍼와 글라이세롤을 이용해 최종 글라이세롤 농도 15%(v/v)가 되게 하여 냉동보관하였다. 그리고 마우스에 투여 직전 해동 후 마리당 200ul 함량으로 저농도 생균 (2x107 cells/dose)(시료 1은 실시예 8-1의 G3에 상응)과 고농도 생균 (2x108 cells/dose) 마리당 200ul(2x108cells) (시료 2 은 실시예 8-1의 G4에 상응)이 되게 경구투여하였다. 대조군으로는 CLCC1 균주를 투여하지 않은 마우스 10개체를 사용하였다.
시료 3은 상기 제조된 시료 2를 100℃ 온도의 오븐에서 2시간 동안 처리하여 고농도 사균 (2x108 cells/dose)으로 사용하였다.
(3) 효능평가
도 9의 시험 디자인에 나타낸 바와 같이, 대조군과 시료 1 내지 3의 시험제제를 암세포 접종하기 2주전부터 투여를 시작하여 총 40일간 1일 1회 투여하였다. 구체적으로, 대조군과 시료 1 내지 3의 시험제제를 40일간 1일 1회씩 경구 투여하였으며, 투여 시작일로부터 14일 경과 후에, 대장암 세포(5x105 MC38 cells in 0.1ml PBS)를 왼쪽 옆구리의 피하 조직에 접종하고 1주일간의 생착기간을 거친 후, 종양의 크기를 관찰을 22일째부터 시작하여 40일째까지 18일간 수행하였다. 종양 관찰의 시작일인 22일을 0일로 간주하여 18일간 Magnetic Resonance (MR)촬영을 이용하여 간암 종양의 크기 (tumor volume)를 측정하였다. 종양의 크기 변화는, 암 세포 생착 후 22일 동안 종양의 장축 (maximum length, L)과 단축 (perpendicular width, W)을 측정하고, 다음의 수학식 2에 대입하여 종양의 부피 (tumor volume, TV)를 계산하였다. 상기 18일간 측정된 종양 부피를 하기 표 13과 도 7에 나타냈다.
[수학식 2]
Figure PCTKR2021001791-appb-I000002
상기 식에서 L은 종양의 장축 (maximum length, L)이고, W2는 단축 (perpendicular width, W)을 의미한다. 대조군의 종양 부피 기준으로 상대적인 시료의 종양 부피는 하기 수학식 3으로 계산하였다.
Figure PCTKR2021001791-appb-M000003
하기 표 14에서, Mean은 평균 부피를, S.D.는 표준편차(stardard deviataion)를 의미한다. 표 14는 대조군, 시료 1 내지 3에 따른 분리균주를 대장암 피하 종양 모델에서 종양 부피(volume, mm3) 변화 결과이다.
관찰일 대조군 시료1 시료2 시료3
Mean S.D. Mean S.D. Mean S.D. Mean S.D.
1 28.63 19.64 18.3 13.12 29.1 18.21 19 14.64
4 47.63 27.39 44.8 33.41 60.7 89.62 42.3 42.41
7 109.38 60.98 92.6 59.67 100.6 111.84 85.5 89.91
8 174.63 33.93 171.7 124.72 231.4 319.62 124.2 97.38
11 367.63 83.97 295.2 201.81 303.8 360.13 277.2 265.91
13 633.75 218.75 437.4 307.75 446.1 457.75 396.8 388.22
15 934.13 329.64 686.6 495.19 785.5 694.4 707.4 679.62
18 1441.86 444.79 1296 979.09 1070.56 852.65 1094.89 897
상기 결과, 대조군 대비 시료 1 내지 3의 균주를 투여한 그룹에서 얻어진 종량 부피변화를 도 7에 각각 나타냈다. 측정 마지막 날을 기준으로 하여, 대조군의 종양 부피를 100%로 설정하여 시료 1 내지 시료 3의 종양 부피를 퍼센트로 계산한 결과, 시료 1은 89.9% (10.1% 감소), 시료 2는 74.2% (25.8% 감소), 시료 3은 75.9% (24.1 감소)로서, 시험 결과 대조군에 비해 CLCC1을 투여한 대장암 모델 마우스에서 통계적으로 유의하게 종양의 성장이 억제됨을 확인하였다. CLCC1의 사균체를 투여하였을 때도 통계적으로 유의하게 종양의 성장이 억제됨을 확인하였다. 또한, CLCC1 균주의 생균을 사용하나 농도를 상이하게 설정한 시료 1과 시료 2의 종양 부피 감소를 살펴보면, 동일 실험 조건에서 농도 의존적 방식으로 항암 활성이 증가함을 확인할 수 있었다.
또한, 시험 제제를 투여한 날 이후 1~3일 간격으로 외관, 몸무게, 행동, 배설물 등의 일반 증상을 관찰하였다. 시험은 시험제제 투여 후부터 총 40일 간 수행되었으며, 암 세포 생착 후 18일간 관찰하였다. 상기 측정된 실험 동물의 몸무게(Kg)을 하기 표 15에 나타냈다.
관찰일 대조군 시료1 시료2 시료3
1 20.60 20.79 20.60 21.17
4 20.03 20.62 21.31 21.64
7 20.24 20.47 21.42 21.55
8 20.26 20.41 21.22 21.52
11 20.05 20.44 21.06 21.22
13 20.42 20.44 21.17 21.28
15 20.54 20.77 21.13 21.38
18 20.50 20.93 21.27 21.09
실험 동물의 전체 몸무게는 암세포 생착 이후 대조군 그룹에 해당하는 마우스들의 몸무게가 시험군들보다 낮은 경향을 보이나, 전체적으로는 대조군과 시험군 간에 큰 차이가 없었다.
실시예 10: 대장암 종양 모델을 이용한 Faecalibacterium 속 균주의 병용 효능 평가
(1)동물 모델 준비
상기 실시예 9과 실질적으로 동일한 동물 모델을 준비하였다.
(2) 시험 제제의 준비
대조군 (15% Glycerol in PBS)과 실시예 9의 시료 2는 실시예 9과 동일한 방법을 제조하였다. 또한, 비교예 1은 Anti-PD-1은 anti-mouse PD-1 (CD279) (Clone: RMP1-14)를 사용하였다. 본 실시예 10에 사용된 시료 4는 실시예 9의 시료 2와 비교예 1의 시험 제제를 함께 사용한 것이다.
(3)효능평가
도 9의 시험 디자인에 나타낸 바와 같이, 대조군, 비교예 1 및 실시예 9의 시료 2의 시험제제를 암세포 접종하기 2주전부터 투여를 시작하여 총 44일간 1일 1회 투여하였다. 구체적으로, 상기 시험제제를 44일간 1일 1회씩 경구 투여하였으며, 투여 시작일로부터 14일 경과 후에, 암세포(5x105 MC38 cells in 0.1ml PBS)를 왼쪽 옆구리에 접종하고 1주일간의 생착기간을 거친 후, 종양의 크기를 관찰을 22일째부터 시작하여 44일째까지 22일간 수행하였다.
구체적으로, 대조군은 상기 실시예 9과 실질적으로 동일한 방법으로 시험을 수행하였다. 시료 4는 실시예 9의 시료 2를 암 세포 접종 2주전부터 1일 1회 주사기를 이용해 경구 투여하였다. 상기 2주간 투여 후에, 암세포(5x105 MC38 cells in 0.1ml PBS)를 실험동물의 왼쪽 옆구리에 접종하고 약 1주일간의 생착기간을 거치고 난 후에, 생착기간 후 Day0부터 anti-mouse PD-1 (CD279) (Clone: RMP1-14)를 1주일에 2회씩 10mg/ml로 복강내주사(Intraperitoneal injection, IP)를 통해 투여하였다. 비교예 1에 따른 anti-mouse-PD1 antibody (clone: RMP1-14)는, 상기 시료 4와 동일하게 수행하나, 다만 실시예 9의 시료 2를 투여하지 않았다.
종양 관찰의 시작일인 22일을 0일로 간주하여 18일간 관찰하였다. 종양의 크기 변화는, 암 세포 생착 후 22일 동안 종양의 장축 (maximum length, L)과 단축 (perpendicular width, W)을 측정하고, 다음의 계산식에 대입하여 종양의 부피 (tumor volume, TV)를 계산하였다. 상기 18일간 측정된 종양 부피를 하기 표 16에 나타냈다. 대조군의 종량 부피 기준으로 상대적인 시료의 종량 부피는 하기 수학식 3으로 계산하였다. 하기 표 16에서, Mean은 평균 부피를, S.D.는 표준편차(standard deviataion)를 의미한다.
[수학식 2]
종양 부피(tumor volume, TV)(mm3) = L (mm) Х W2 (mm2) Х 1/2
상기 식에서 L은 종양의 장축 (maximum length, L)이고, W2는 단축 (perpendicular width, W)을 의미한다.
[수학식 3]
상대적 종양 부피(%)
= (대조군 종량부피 - 실험군 종양부피)/ 대조군 종양부피*100
　
관찰일 		대조군 비교예1 실시예 9(시료2) 실시예 10(시료4)
Mean S.D. Mean S.D. Mean S.D. Mean S.D.
1 28.63 19.64 24 19.93 29.1 18.21 30.8 17.2
4 47.63 27.39 35.1 20.54 60.7 89.62 47.4 29.9
7 109.38 60.98 65.4 44.22 100.6 111.84 75.8 47.23
8 174.63 33.93 104 77.19 231.4 319.62 179.4 171.57
11 367.63 83.97 180.6 111.17 303.8 360.13 237.8 209.2
13 633.75 218.75 321.3 217.48 446.1 457.75 301 300.72
15 934.13 329.64 512.1 333.69 785.5 694.4 463.6 443.53
18 1441.9 444.79 902.5 554.13 1070.6 852.65 600.9 512.86
22 2372.4 475.94 1797.4 944.13 1898.2 759.11 1062 1035.3
표 16 및 도 8에서 음성대조군(대조군)에 비해 anti-PD-1 antibody 투여군 에서 종양의 크기가 줄어든 것을 확인 할 수 있었다. 또한 도 8에서 CLCC1 생균을 anti-PD-1 antibody와 병용 투여하였을 때, CLCC1 균주 단독 또는 면역항암제 단독 투여보다 더 확연한 종양 억제가 확인되었다. 측정 마지막 날을 기준으로 하여, 대조군의 종양 부피를 100%로 설정하여 비교예 1, 실시예 9(시료2) 및 실시예 10(시료4)의 종양 부피를 퍼센트로 계산한 경우, 비교예 1의 Anti-PD-1 antibody 단독 투여군은 대조군 대비 75.8% (24.2% 감소)이고, 실시예 9의 고농도의 CLCC1 단독 투여시에는 80% (20% 감소), 그리고 실시예 10에 따른 CLCC1 생균 고농도와 anti-PD-1 antibody를 병용투여 하였을 때는 44.8% (55.2% 감소)로서 종양 크기 감소가 확인되었다. 즉, 비교예 1의 항체 단독 투여 및 실시예 9의 CLCC1 생균 단독 투여군의 종양 크기 감소가 20% 정도인 것으로 고려하면, 미생물 CLCC1과 anti-PD-1의 병용 투여 시 종양 억제 효과. CLCC1과 anti-PD-1 병용 투여군의 종양 부피 감소가 55.25로서 단독 투여 시보다 더 확연한 종양 성장 억제 효과를 확인 할 수 있었다.
또한, 시험 제제를 투여한 날 이후 1~3 일 간격으로 외관, 몸무게, 행동, 배설물 등의 일반 증상을 관찰하였다. 시험은 시험제제 투여 후부터 총 44일 간 수행되었으며, 암 세포 생착 후 22일간 관찰하였다. 상기 측정된 실험 동물의 몸무게(Kg)을 하기 표 17에 나타냈다.
관찰일 대조군 비교예1 실시예 9(시료2) 실시예 10(시료4)
1 20.6 21.37 20.6 22.07
4 20.03 21.01 21.31 22.52
7 20.24 21.05 21.42 22.8
8 20.26 20.87 21.22 22.7
11 20.05 20.87 21.06 22.22
13 20.42 20.96 21.17 22.26
15 20.54 21.24 21.13 22.34
18 20.5 21.39 21.27 22.08
22 20.72 21.5 22.06 22.09
실험 동물의 전체 몸무게는 암세포 생착 이후 대조군 그룹에 해당하는 마우스들의 몸무게가 시험군들보다 낮은 경향을 보이나, 전체적으로는 대조군과 시험군 간에 큰 차이가 없었다.
실시예 11: 간암 종양 모델을 이용한 Faecalibacterium 속 균주의 병용 효능 평가
(1)동물 모델 준비
상기 실시예 6의 마우스 간암 세포주를 이용한 피하 종양 모델과 실질적으로 동일한 동물 모델을 준비하였다. 구체적으로, 6주령 수컷 C57BL/6 마우스 10개체에서 간암 세포주 (Hep55.1c)의 피하 종양 이식 실험을 통해 간암을 발생시켰다.
(2) 시험 제제의 준비
대조군 (15% Glycerol in PBS), 비교예 2의 시료, 및 본 실시예에 사용된 시료 5는 실질적으로 실시예 9의 대조군, 시료 2 및 시료 4와 동일한 제제를 사용하였다. 본 실시예 11에 사용된 시료 5는 실시예 9의 시료 2와 비교예 1의 시험 제제를 함께 사용한 것이다.
(3)효능평가
도 9의 시험 디자인에 나타낸 바와 같이, 대조군, 비교예 1 및 실시예 9의 시료 2의 시험제제를 암세포 접종하기 2주전부터 투여를 시작하여 총 44일간 1일 1회 투여하였다. 구체적으로, 상기 시험제제를 44일간 1일 1회씩 경구 투여하였으며, 투여 시작일로부터 14일 경과 후에, 마우스 간암 세포주(5x105 Hep55.1c cells in 0.1ml PBS)를 왼쪽 옆구리에 접종하고 1주일간의 생착기간을 거친 후, 종양의 크기를 관찰을 22일째부터 시작하여 44일째까지 22일간 수행하였다. 구체적인 실험방법은 실시예 10과 실질적으로 동일하게 수행하였다. 종양 관찰의 시작일인 22일을 0일로 간주하여 18일간 관찰하고 종양의 크기 변화도 실시예 10과 실질적으로 동일한 방법으로 계산하였다.
상기 실험 결과, CLCC1 생균을 anti-PD-1 antibody와 병용 투여하였을 때, CLCC1 균주 단독 또는 면역항암제 단독 투여보다 더 확연한 종양 억제가 확인되었다.
또한, 시험 제제를 투여한 날 이후 1~3일 간격으로 외관, 몸무게, 행동, 배설물 등의 일반 증상을 관찰하였다. 시험은 시험제제 투여 후부터 총 44일 간 수행되었으며, 암 세포 생착 후 18일간 관찰하였다. 상기 측정된 실험 동물의 전체 몸무게는 암세포 생착 이후 대조군 그룹에 해당하는 마우스들의 몸무게가 시험군들보다 낮은 경향을 보이나, 전체적으로는 대조군과 시험군 간에 큰 차이가 없었다.
Figure PCTKR2021001791-appb-I000003

Claims (35)

  1. 패칼리박테리움 캔서인히벤스(Faecalibacterium cancerinhibens)의 16S rDNA 서열과 적어도 98.5% 의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA를 갖는 분리된 패칼리박테리움속 미생물을 포함하는 제1 미생물 제제; 및 적어도 하나의 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 제 2제제를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 미생물 제제 및 제2 제제는 각각 제제화되어 동시적 또는 순차적으로 투여되는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 미생물 제제는 미생물 생균체, 사균체 및 건조 균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 미생물 제제는 액체, 현탁액, 젤, 젤탭(geltab), 반고체, 정제, 사세(sachet), 함당정제(lozenge), 캡슐제(capsule)를 포함하는 것으로서, 또는 경장 제제(enteral formulation)로서 장내로 전달되도록 제제화되는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1 미생물 제제는 경구 전달용으로 제제화된 정제 또는 캡슐제인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1 미생물 제제는 정제 또는 캡슐제가 산-내성 장용 코팅을 포함하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제1 미생물 제제는 프리바이오틱스를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 동물 모델에서 종양 크기의 감소 및 종양 생장율 감소를 달성하는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은, 무처리 대조군에 비해 처리군의 종양부피가 75%이하, 80%이하, 85%이하, 90% 이하, 95%이하, 또는 97%이하인 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 암이 간암, 대장, 흑색종, 폐암, 신장암, 방광암, 위암, 자궁경부암, 식도암, B세포림프종, 호지킨림프종, 또는 메르켈세포암인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 흑색종이 전이성 흑색종, 악성 검정사마귀, 악성 검정사마귀 흑색종, 표재 확산 흑색종, 결절성 흑색종, 말단 흑자 흑색종 또는 섬유조직형성 흑색종인, 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 저해제가 종양내로, 동맥내로, 정맥내로, 혈관내로, 흉막내로, 복강내로, 기관내로, 경막내로, 근육내로, 내시경적으로(endoscopically), 병변내로, 경피로, 피하로, 국지적으로(regionally), 정위적으로(stereotactically), 경구로, 직접 주사 또는 관류에 의해 투여되는 것인, 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 저해제가 정맥내로 투여되고, 상기 미생물 제제가 경구 투여되는, 조성물.
  14. 제2항에 있어서, 상기 제2 제제는, 상기 제1 미생물 제제를 투여한 날로부터 0일, 1일 이내, 5일 이내, 1주 이내, 8일 이내, 2주 이내, 3주 이내, 1개월 이내, 1.5개월 이내, 2개월 이내, 2.5개월이내, 3개월이내 또는 6개월 이내 에 투여되는 것인 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 제 1제제는, 상기 제2 미생물 제제를 투여한 날로부터 1일 이내, 5일 이내, 1주 이내, 8일 이내, 2주 이내, 3주 이내, 1개월 이내, 1.5개월 이내, 2개월 이내, 2.5개월이내, 3개월이내 또는 6개월 이내에 투여되는 것인 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 제1 미생물 제제는 1일 2회, 1일 1회, 2일 1회, 또는 3일 1회로 투여되는 것인 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 저해제가 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, IDO, LAG-3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3, KIR, A2aR, VISTA, 및 STAT3의 저해제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가, 단백질, 펩티드 또는 항체인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 PD-1 길항제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, MEDI-0680, REGN2810, 또는 AMP-224의 인간화 항체,
    상기 PD-L1 길항제는 BMS-936559/MDX-1105, MPDL3280A/RG7446/아테졸리주맙, MSB0010718C/아벨루맙, 또는 MEDI4736/두르발루맙, 또는
    상기 CTLA-4 길항제는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙인 조성물.
  20. 제17항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가, 핵산인 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 CTLA-4 길항제가 (i) CD80, CD86, 및/또는 CTLA-4에 대해 지시된 안티센스 분자, (ii) CD80, CD86, 및/또는 CTLA-4에 대해 지시된 애드넥틴, (iii) CD80, CD86, 및/또는 CTLA-4의 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNAi 억제제, 또는 (iv) CD80, CD86, 또는 CTLA-4의 소분자 억제제인 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 상기 VISTA 길항제가 (i) VISTA에 대해 지시된 안티센스 분자, (ii) VISTA에 대해 지시된 애드넥틴, (iii) VISTA의 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNAi 억제제, 또는 (iv) VISTA의 소분자 억제제인 조성물.
  23. 패칼리박테리움 캔서인히벤스 (Faecalibacterium cancerinhibens)의 16S rDNA 서열과 적어도 98.5% 의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA를 갖는 분리된 패칼리박테리움속 미생물을 포함하는, 면역 체크포인트 저해제의 효능 증진용 미생물 제제.
  24. 제23항에 있어서, 상기 미생물 제제는 박테리아 생균체, 사균체 및 건조 균체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인. 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 상기 미생물 제제는 액체, 현탁액, 젤, 젤탭(geltab), 반고체, 정제, 사세(sachet), 함당정제(lozenge), 캡슐제(capsule)를 포함하는 것으로서, 또는 경장 제제(enteral formulation)로서 장내로 전달되도록 제제화되는 것인, 조성물.
  26. 제23항에 있어서, 상기 미생물 제제는 경구 전달용으로 제제화된 정제 또는 캡슐제인, 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 미생물 제제는 정제 또는 캡슐제가 산-내성 장용 코팅을 포함하는, 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 저해제가 종양내로, 동맥내로, 정맥내로, 혈관내로, 흉막내로, 복강내로, 기관내로, 경막내로, 근육내로, 내시경적으로(endoscopically), 병변내로, 경피로, 피하로, 국지적으로(regionally), 정위적으로(stereotactically), 경구로, 직접 주사 또는 관류에 의해 투여되는 것인, 방법.
  29. 제23항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 저해제가 프로그램된 사멸 1 (PD-1), 프로그램된 사멸 리간드 1 (PD-L1), 세포독성 T-림프구-연관 항원 4 (CTLA-4), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자 (VISTA), 프로그램된 사멸 리간드 2 (PD-L2), 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO), 아르기나제, B7 패밀리 억제성 리간드 B7-H3, B7 패밀리 억제성 리간드 B7-H4, 림프구 활성화 유전자 3 (LAG3), 2B4, B 및 T 림프구 감쇠인자 (BTLA), T 세포막 단백질 3, 아데노신 A2a 수용체 (A2aR), 킬러 억제성 수용체, 및 시그널 변환인자 및 전사 활성화인자 (STAT)3의 길항제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 조성물.
  30. 제23항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 저해제는, 면역 체크포인트 단백질에 특이적으로 결합하는, 단백질, 펩티드 또는 항체인 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 PD-1 길항제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, MEDI-0680, REGN2810, 또는 AMP-224의 인간화 항체,
    상기 PD-L1 길항제는 BMS-936559/MDX-1105, MPDL3280A/RG7446/아테졸리주맙, MSB0010718C/아벨루맙, 또는 MEDI4736/두르발루맙, 또는
    상기 CTLA-4 길항제는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙인 조성물.
  32. 제29항에 있어서, 상기 CTLA-4 길항제가 (i) CD80, CD86, 및/또는 CTLA-4에 대해 지시된 안티센스 분자, (ii) CD80, CD86, 및/또는 CTLA-4에 대해 지시된 애드넥틴, (iii) CD80, CD86, 및/또는 CTLA-4의 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNAi 억제제, 또는 (iv) CD80, CD86, 또는 CTLA-4의 소분자 억제제인 조성물.
  33. 제29항에 있어서, 상기 VISTA 길항제가 (i) VISTA에 대해 지시된 안티센스 분자, (ii) VISTA에 대해 지시된 애드넥틴, (iii) VISTA의 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNAi 억제제, 또는 (iv) VISTA의 소분자 억제제인 조성물.
  34. 패칼리박테리움 캔서인히벤스 (Faecalibacterium cancerinhibens)의 16S rDNA 서열과 적어도 98.5% 의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA를 갖는 분리된 미생물 제제; 및 적어도 하나의 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 키트.
  35. 패칼리박테리움 캔서인히벤스(Faecalibacterium cancerinhibens)의 16S rDNA 서열과 적어도 98.5% 의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA를 갖는 분리된 패칼리박테리움속 미생물을 포함하는 제1 미생물 제제; 및 적어도 하나의 면역 체크포인트 저해제를 포함하는 제 2제제를 병용-투여하는 것을 포함하는, 대상에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
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