WO2021132662A1 - 哺乳動物細胞を培養するための血清の製造方法 - Google Patents

哺乳動物細胞を培養するための血清の製造方法 Download PDF

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WO2021132662A1
WO2021132662A1 PCT/JP2020/048984 JP2020048984W WO2021132662A1 WO 2021132662 A1 WO2021132662 A1 WO 2021132662A1 JP 2020048984 W JP2020048984 W JP 2020048984W WO 2021132662 A1 WO2021132662 A1 WO 2021132662A1
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production method
mammal
serum
cell
blood
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PCT/JP2020/048984
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本望　修
吉川　義洋
孝則 三分一
奈穂美 森川
一成 阿部
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北海道公立大学法人 札幌医科大学
ニプロ株式会社
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing serum for culturing mammalian cells.
  • the present invention also relates to a method for producing a medicament containing a culture of mammalian cells.
  • a proliferation promoting factor for example, serum
  • serum In the field of cell therapy, serum is often used to efficiently proliferate desired cells.
  • the serum used in the production of a drug for cell therapy must be an autologous serum derived from the subject, which has little effect on the subject because it enters the body together with the drug containing cultured cells when it is applied to the subject. Is desirable.
  • human serum alone does not provide the desired cell proliferation promoting activity, and fetal bovine serum (FBS) or other growth factors are added (Patent Documents 2 and 3).
  • the desired cell proliferation-promoting activity can be obtained by adding a proliferation-promoting factor of another species such as FBS to a medium containing human serum
  • the safety of the proliferation-promoting factor of another species to be added is safe.
  • the inspection is laborious and expensive. Therefore, there has been a demand in the art for a method for producing serum that exhibits desired cell proliferation activity without adding growth promoting factors derived from other species of living organisms.
  • the serum prepared from the blood has a desired cell proliferation activity.
  • the present invention was completed.
  • a first aspect of the invention is to maintain blood collected from a first mammal at a temperature of 15 ° C to 25 ° C, maintenance at that temperature within 48 hours, and serum from the blood.
  • a method for producing serum for culturing mammalian cells which comprises preparing.
  • a second aspect of the invention comprises culturing mammalian cells in a medium, the medium comprising serum for culturing the mammalian cells, the serum from the first mammal.
  • a drug containing a culture of mammalian cells prepared from the collected blood maintained at a temperature of 15 ° C. to 25 ° C., maintained at that temperature within 48 hours, and prepared from the blood.
  • the present invention provides a method for producing serum showing improved cell proliferation activity, and a method for producing a drug comprising growing mammalian cells using the serum produced by the method.
  • FIG. 1 is a bar graph showing the proliferation rate of cells obtained using serum prepared from blood that has been allowed to stand at 10 ° C., 20 ° C., or 25 ° C. for a predetermined time.
  • FIG. 2 is a bar graph showing the growth rate of cells obtained using serum prepared from blood that has been allowed to stand at 15 ° C., 20 ° C., or 25 ° C. for a predetermined time.
  • blood is a body fluid flowing in the body of a mammal, and means a body fluid containing blood cell components such as red blood cells, leukocytes, and platelets and plasma.
  • Blood collected from mammals may be, but is not limited to, venous blood, arterial blood, or peripheral blood.
  • the blood collected from a mammal is peripheral blood.
  • Blood can be drawn from mammals according to known methods, but not limited to.
  • blood can be collected using a needle and a blood collection vessel.
  • the blood for preparing serum does not contain preservatives.
  • the "blood collection container” means a container that can aseptically hold blood collected from a mammal.
  • the blood collection container may be, but is not limited to, a container known in the blood collection field and is commercially available.
  • the blood collection container may be, for example, a blood collection bag or a blood collection tube.
  • the blood collection vessel may be the blood containment device described in US Patent Application Publication No. US2013 / 0130382, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • serum means a liquid portion separated from a clot formed by coagulation of mammalian blood.
  • Serum can be produced, but not limited to, from blood collected from mammals using known methods.
  • serum can be used by adding it to a medium for culturing mammalian cells using a dispenser or the like.
  • blood clot means a structure formed in the process of coagulation of mammalian blood.
  • Clots include, but are not limited to, blood cell components and fibrin (also referred to as “fibrin").
  • a clot is formed by aseptically leaving mammalian blood in a container at room temperature (eg 22 ° C. to 27 ° C.) without an anticoagulant according to a known method. Can be done.
  • the term "serum for culturing mammalian cells” refers to blood collected from a mammal being maintained at a temperature of 15 ° C. to 25 ° C. and maintained at that temperature within 48 hours. Means serum obtained from blood. Maintaining the blood at a temperature of 15 ° C. to 25 ° C. is not limited to, but the container containing the blood is placed at a specific temperature or a specific temperature range of 15 ° C. to 25 ° C. It may be placed inside a container or device or a combination thereof that can control the temperature so that it is within the temperature range. Blood maintained at a temperature of 15 ° C. to 25 ° C. may be stationary or transported, without limitation.
  • the "temperature-adjustable container or device” means a container or device having a function of adjusting the temperature inside the container or device to a predetermined temperature range.
  • the temperature-controllable container or device may be, but is not limited to, a container or device that is covered with a heat insulating material and is not easily affected by the ambient environmental temperature.
  • the heat insulating material includes, for example, styrofoam, rigid urethane foam, or vacuum heat insulating material (for example, a structure in which a glass wool core material or carbon material is wrapped with a gas barrier film and the inside of the film packaging is evacuated and sealed) or their. It may be a combination.
  • the temperature-controllable container is, but is not limited to, a small cooling with a heat storage material, a heat generating agent, a cold storage material, a cold insulation agent, or a temperature control unit (for example, a thermostatically controlled Pertier element) inside the container. Equipment) or a combination thereof may be included.
  • the device capable of temperature control may include, but is not limited to, a temperature control unit (eg, a small cooling device with a thermostat-controlled Pertier element), and optionally a heat storage material or a cold storage material.
  • the temperature controllable device may be, for example, a means of transportation having a temperature control function (eg, a car, a ship and an airplane).
  • the combination of the temperature-controllable container and the device is not limited, but is to store the container containing blood in the temperature-controllable container and store the container in the temperature-controllable device. You can.
  • Blood collected from mammals includes, but is not limited to, a specific temperature range, for example, a temperature range of 15 ° C to 24 ° C, a temperature range of 15 ° C to 23 ° C, a temperature range of 15 ° C to 22 ° C, 15 Temperature range of ° C to 21 ° C, Temperature range of 15 ° C to 20 ° C, Temperature range of 16 ° C to 25 ° C, Temperature range of 16 ° C to 24 ° C, Temperature range of 16 ° C to 23 ° C, Temperature range of 16 ° C to 22 ° C Temperature range, 16 ° C to 21 ° C temperature range, 16 ° C to 20 ° C temperature range, 17 ° C to 25 ° C temperature range, 17 ° C to 24 ° C temperature range, 17 ° C to 23 ° C temperature range, 17 ° C -22 ° C temperature range, 17 ° C-21 ° C temperature range, 17 ° C-20 ° C temperature range, 18 ° C-25 °
  • blood collected from a mammal is at a particular temperature, eg, 15 ° C, 16 ° C, 17 ° C, 18 ° C, 19 ° C, 20 ° C, 21 ° C, 22 ° C, 23 ° C, 24 ° C or It is placed inside a container or device whose temperature can be adjusted to 25 ° C. or a combination thereof.
  • the specific temperature means a temperature within an error range of the controlled temperature of the temperature-controlled container. In one example, when the error range of the controlled temperature of a temperature-controlled container or device or a combination thereof is ⁇ 0.5 ° C., a specific temperature of 20 ° C. means 19.5 ° C. to 20.5 ° C.
  • blood collected from a mammal is a container or device whose temperature can be controlled to be in the temperature range of 17 ° C. to 23 ° C., 18 ° C. to 22 ° C., or 19 ° C. to 21 ° C., or a container or device thereof. Placed inside the combination.
  • the "time to maintain” or “time to maintain” at a particular temperature as described herein is from the time the blood collected from the mammal is placed in a temperature-controlled container or device or a combination thereof. , Means the period up to the time of removal from the container or device or a combination thereof.
  • the maintenance time is not particularly limited as long as it is within 48 hours, and may be, for example, within 45 hours, within 40 hours, within 35 hours, within 30 hours, or within 24 hours.
  • the temperature for a period of time maintained at a particular temperature can be ascertained by installing a temperature recorder with blood collected from the mammal, without limitation.
  • the time required for storing blood collected from a mammal in a temperature-controlled container or device or a combination thereof is within 1 hour from the time when blood is collected from the mammal, 0. Within 5 hours, within 0.3 hours, within 15 minutes, within 10 minutes, within 5 minutes, within 3 minutes.
  • the step of preparing serum is the step of allowing mammalian blood taken from a temperature-controlled container or device or a combination thereof to stand and separating the blood into a clot and a liquid portion. , And the step of recovering the liquid portion.
  • the standing step may be, but is not limited to, maintaining the blood at room temperature (eg, 21 ° C. to 27 ° C.).
  • the maintenance time in the standing step is not limited, but may be performed until the formation of blood clots can be confirmed, or a preset time (any of 0.5 hours to 2 hours). It may be.
  • the blood taken out from a temperature-adjustable container or device or a combination thereof is maintained at room temperature for a preset time (for example, 2 hours), and then the formation of blood clots is confirmed. If this is not possible, a further standing step may be added. Confirmation of blood clot formation may be performed visually, but not limited to.
  • the serum recovery step is not limited, but can be recovered from the blood clot using a known method.
  • the liquid portion separated from the blood clot is transferred to another container using an instrument such as a pipette, the blood clot is precipitated by a centrifugation method, and the supernatant is used as an instrument such as a pipette. It may be transferred to another container using the above, or the mixed solution separated into the blood clot and the liquid portion may be filtered through a filter to collect the serum as a filtrate.
  • the method for producing serum is either a test for serum tumor markers or a test for infectious agents on a partial sample of blood collected from a mammal or a partial sample of prepared serum. Or even more to do both.
  • the method of producing serum comprises performing one or both tests for serum tumor markers and / or infectious agents on a partial sample of blood taken from a mammal. These tests can be measured for each marker or each factor by a known measurement method, and positive or negative can be determined by comparing each marker or each factor with a known appropriate value or reference value. ..
  • Serum tumor markers include, for example, ferritin, CEA, AFP, BFP, CA125, CA15-3, CA19-9, CA72-4, STN, DUPAN-2, SLX, ST-439, SPAN-1, SCC, PSA, G.
  • the infectious agent is, for example, one or more selected from the group consisting of HIV, ATL, HBV, HCV, Treponema pallidum, and human parvovirus B19.
  • the serum production method may be continued if all tested serum tumor markers are negative and all tested infectious agents are negative. In other embodiments, the method of producing serum is discontinued if at least one of the serum tumor markers tested is positive or at least one of the infectious agents tested is positive. It's okay.
  • mammal means any individual mammal. Mammals are, but are not limited to, humans and non-human mammals. Mammals other than humans are not limited to rodents such as mice, rats, guinea pigs and hamsters, non-human primates such as chimpanzees, artiodactyls such as cows, goats and sheep, and odd-toed ears such as horses. It may be a pet animal such as an eye, a rabbit, a dog, or a cat. In one embodiment, the mammal is a horse, pet animal, non-human primate or human. In one embodiment, the mammal is a human.
  • the "first mammal” in the context of blood collection for producing serum, the "second mammal” in the context of mammalian cells, and the “third mammal” in the context of drug administration are: It may be the same individual or a different individual. When the first mammal, the second mammal, and the third mammal are different individuals, the first mammal, the second mammal, and the third mammal are the same. It may be a species (same species) or a different species (different species). In a preferred embodiment, the first mammal, the second mammal, and the third mammal are the same species. In a more preferred embodiment, the first mammal, the second mammal, and the third mammal are the same individual.
  • stem cell means a cell having both self-renewal ability and differentiation ability.
  • self-renewal ability means the ability to continuously produce stem cells having the same ability as self as at least one daughter cell through cell division.
  • differentiation ability means the ability to divide into specialized cells different from self.
  • Stem cells are, but are not limited to, pluripotent stem cells that can differentiate into multiple types of cells to which the three embryos of endoderm, ectoderm, and mesodermal belong, and multiple types limited to one embryo. It may be a multipotent stem cell that can differentiate into a single type of cell, or a unipotent stem cell that can differentiate into only one type of cell.
  • the pluripotent stem cell may be, for example, an embryonic stem cell or a recombinant cell (induced pluripotent stem cell) to which pluripotency has been imparted from a somatic cell by genetic engineering.
  • Multipotent stem cells may be, for example, hematopoietic stem cells or mesenchymal stem cells.
  • the monopoly stem cell may be, for example, a germline stem cell. Stem cells can be obtained from mammalian-derived biological samples using known methods or can be commercially available.
  • mesenchymal stem cells are non-hemogenic adhesive cells that have self-renewal ability and not only differentiate into connective tissue cells such as bone cells, cartilage cells, and adipocytes, but also. It has the ability to differentiate into nerve cells, myocardial cells, and liver cells. It is known that mesenchymal stem cells are present in the bone marrow fluid in a very small amount (0.001 to 0.01% in the cell population having a nucleus).
  • biological sample means a part of mammalian tissue or body fluid.
  • the biological sample may be, but is not limited to, a portion of the tissue or body fluid taken from the mammal itself, or may be treated appropriately as needed (eg, removal of unwanted components, specific). It may have been subjected to cell fraction purification, enzyme treatment, preservation treatment).
  • the body fluid may be, for example, bone marrow fluid, blood (peripheral blood or umbilical cord blood) or lymph fluid.
  • the tissue may be, for example, muscle tissue, bone tissue, skin, lymphoid tissue, vasculature, or tissue such as digestive organs, or embryos (eg, mammalian embryos excluding human embryos).
  • Biological samples can be obtained from mammals according to known methods.
  • the biological sample is bone marrow fluid
  • the collection of the biological sample is performed, for example, by anesthetizing a second mammal for which the bone marrow fluid is collected (local or general anesthesia), inserting a needle into the sternum or ilium, and sucking with a syringe. It can be done by doing.
  • the biological sample is umbilical cord blood
  • the biological sample can be collected, for example, by directly inserting a needle into the umbilical cord and sucking it with a syringe.
  • mammalian cell means a mammalian-derived cell that can be proliferated by cell culture.
  • the mammalian cell may be, but is not limited to, a cell present in a biological sample collected from the mammal, or a recombinant cell of mammalian origin produced by genetic engineering.
  • the mammalian cell may be, for example, a cell that can be cultured by adhering to a culture vessel, or a cell that can be cultured in a floating state.
  • the mammalian cell may be a cell present in a biological sample taken from a mammal, such as a somatic cell or a stem cell.
  • Somatic cells may be, for example, one or more of osteoblasts, fibroblasts, epithelial cells and vascular endothelial cells.
  • Stem cells include, for example, at least one type of mesenchymal stem cell.
  • the mammalian cell is a stem cell. In one embodiment, the mammalian cell is a mesenchymal stem cell. In a preferred embodiment, the mammalian cell is a human mesenchymal stem cell. In a more preferred embodiment, the mammalian cell is a bone marrow-derived human mesenchymal stem cell. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells can be obtained by proliferating, but not limited to, mesenchymal stem cells present in bone marrow fluid collected from humans by cell culture.
  • the term "pharmaceutical” comprising a culture of mammalian cells means a composition used in the treatment of a disease or disorder for which cell therapy may be successful.
  • Pharmaceuticals meet various standards required for medical products, such as standards for impurities derived from manufacturing processes.
  • the medicament may include, but is not limited to, pharmaceutically acceptable diluents, excipients and / or substrates depending on the application.
  • the medicament may be injectable (liquid) and transplanted (eg, sheet), but not limited to.
  • the method of delivering the drug to the treatment site is appropriate depending on the form of the drug.
  • the delivery method of the drug is, for example, local transplantation by surgical means, intravenous administration, lumbar puncture administration, local injection administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, intracerebral administration, intraventricular administration. , Or intravenous administration.
  • the drug is an injectable form and is administered intravenously.
  • the injectable form of the drug may be, for example, for bolus administration or infusion administration.
  • the drug can be used, but not limited to, for tissue repair or tissue regeneration.
  • the drug is used to treat a neurological disorder.
  • Neurological disorders include, but are not limited to, central and peripheral demyelinating disorders, central and peripheral degenerative disorders, strokes (including cerebral infarction, cerebral hemorrhage, and subarachnoid hemorrhage), brain tumors, and dementia. Includes higher dysfunction, mental illness, epilepsy, traumatic neurological disorders (including head trauma, cerebral contusion, spinal cord injury), and spinal cord infarction.
  • the drug is not limited to the treatment of neurological diseases, and can be used, for example, for the treatment of diseases related to tissue abnormalities such as myocardium, articular cartilage, liver, and bone marrow.
  • the medicament can be used, for example, to treat spinal cord injury, stroke, dementia, or spinal cord infarction. It is disclosed, for example, that the drug may be useful in the above-mentioned diseases, for example, in US Patent Application Publication No. US2010 / 254953, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • the culture of mammalian cells used in the medicine is produced by culturing the mammalian cells according to a known cell culture method using a medium containing serum prepared by the method for producing serum described in the present specification. Can be done.
  • a production method is disclosed in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2012-100662 (the contents thereof are incorporated in the present specification by reference).
  • the medium means a composition that enables maintenance of survival and cell division of mammalian cells in vitro.
  • the medium contains serum prepared by the method for producing serum described herein.
  • the medium can be produced by using a basal medium for cell culture containing amino acids, vitamins, and electrolytes as main components.
  • the basal medium can be, but is not limited to, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), NPBM, and ⁇ MEM.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • NPBM NPBM
  • ⁇ MEM ⁇ MEM
  • the medium is DMEM.
  • the medium can be prepared according to known methods and is commercially available.
  • the medium is not limited, but the basal medium is prepared by adding serum prepared by the method for producing serum described in the present specification to 1 to 20% by volume, preferably 5 to 15% by volume, more preferably. Is contained in an amount of 8 to 12% by volume.
  • the medium may be, but is not limited to, antibiotics commonly used in the field of cell culture (eg, penicillin, streptomycin, etc.), alone or in combination.
  • the medium may contain penicillin and streptomycin in an amount of 0.5 to 2% by volume, preferably 0.8 to 1.2% by volume, respectively, relative to the medium.
  • the medium comprises an anticoagulant in an amount less than 0.02 U / mL relative to the volume of the medium.
  • Growth / growth factors and / or differentiation-inducing factors may be added to the above basal medium as needed. Growth / growth factors and differentiation-inducing factors are selected according to the desired direction and level of differentiation, the required growth rate, and the like. For example, vitamins such as ascorbic acid and nicotine amide, neurotrophic factors such as NGF and BDNF, bone morphogenetic factors such as BMP, epidermal growth factor, basic fibroblast growth factor, insulin-like growth factor, IL-2, etc. Cytokines include, but are not limited to.
  • the medium does not contain serum prepared from blood of a different species (heterologous) than the serum prepared by the method for producing serum described herein.
  • Mammalian cells can be cultured under conditions known in the field of cell culture. Culturing of mammalian cells can be performed under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 without limitation. Mammalian cells can be cultured using culture vessels of any size and shape. The size or shape of the culture of mammalian cells can be adjusted by the size or shape of the cell adhesion surface in the culture vessel. The culture of mesenchymal stem cells is disclosed, for example, in JP2012-160222 (the contents of which are incorporated herein by reference).
  • substantially the cells do not come into contact with the anticoagulant means that the amount of anticoagulant used at any time from the collection of mammalian cells to the entire culture period is substantially reduced.
  • the anticoagulant is added to the extent that the inner wall of the container for collecting mammalian cells (such as a blood collection tube) is wetted with the anticoagulant solution, or not added at all, or when the culture is started. It means a state obtained when the anticoagulant in the sample is substantially removed. In order to proliferate mammalian cells more rapidly and in large quantities, it is preferable that the amount of anticoagulant added when collecting a biological sample is small.
  • the amount of anticoagulant added to the biological sample taken from the second mammal is the amount of the biological sample. It is less than 0.2 U / mL with respect to the volume.
  • an "anticoagulant” when present in a biological sample or medium, binds to the cell surface and interacts with an anticoagulant protein present in the extracellular matrix, cell-to-cell. It means an extracellular matrix, a substance that inhibits the adhesion between cells or between cells and a substrate.
  • Anticoagulants include, for example, heparin and heparin derivatives (eg, glycosaminoglycans desulfated from the 6-position of D-glucosamine constituting heparin) or salts thereof.
  • Embodiments of the present invention may be, for example, those described below, but are not limited to: [Item 1] A method for producing serum for culturing mammalian cells, in which blood collected from a first mammal is maintained at a temperature of 15 ° C to 25 ° C and maintained at that temperature. A method of production comprising: up to 48 hours and preparing serum from the blood. Item 2. The production method according to Item 1, wherein the first mammal is a human. Item 3 Item 1 or item, further comprising performing either or both of a test for a serum tumor marker and a test for an infectious agent on a partial sample of the blood or a partial sample of the prepared serum. The manufacturing method according to 2.
  • [Item 4] The production method according to any one of Items 1 to 3, wherein the mammalian cell is a cell derived from a second mammal of the same species as the first mammal. Item 5. The production method according to any one of Items 1 to 4, wherein the mammalian cell is a cell derived from the same individual as the first mammal. Item 6. The production method according to any one of Items 1 to 5, wherein the mammalian cell is a stem cell. Item 7. The production method according to any one of Items 1 to 6, wherein the mammalian cell is a bone marrow-derived mesenchymal stem cell.
  • [Item 8] A method for producing a drug containing a culture of mammalian cells, which comprises culturing the mammalian cells in a medium, wherein the medium contains serum for culturing the mammalian cells.
  • the serum was prepared from the blood collected from the first mammal, which was maintained at a temperature of 15 ° C to 25 ° C and maintained at that temperature for up to 48 hours. There is a manufacturing method.
  • Item 9 The production method according to Item 8, wherein the first mammal is a human.
  • the serum is one or both of a test for a serum tumor marker and a test for an infectious agent.
  • Item 12. The production method according to any one of Items 8 to 11, wherein the medium contains an anticoagulant in an amount of less than 0.02 U / mL with respect to the volume of the medium.
  • the mammalian cell is a cell derived from a second mammal of the same species as the first mammal.
  • the mammalian cell is a cell derived from the same individual as the first mammal.
  • the mammalian cell is a stem cell.
  • Item 16 The production method according to any one of Items 8 to 15, wherein the mammalian cell is a bone marrow-derived mesenchymal stem cell.
  • Item 17 The production method according to any one of Items 8 to 16, wherein the mammalian cell is a cell derived from the same individual as a third mammal requiring administration of the drug.
  • the anticoagulation of the mammalian cell is such that the amount of the anticoagulant added to the biological sample collected from the second mammal is less than 0.2 U / mL with respect to the volume of the biological sample.
  • Item 8. The production method according to any one of Items 8 to 17, which is collected from the mammal in a state of substantially no contact with the agent. Item 19.
  • Item 20 The production method according to any one of Items 8 to 19, wherein the drug is for treating spinal cord injury, stroke, dementia, or spinal cord infarction.
  • Item 21 The production method according to Item 8 to Item 20, further comprising collecting the mammalian cells cultured in the medium.
  • Serum was prepared in the same manner as the control except that the collected blood was allowed to stand at 20 ° C. for 9 hours (Example 1), 24 hours (Example 2), and 48 hours (Example 3).
  • Examples 4 to 6 Serum was prepared in the same manner as the control, except that the collected blood was allowed to stand at 25 ° C. for 9 hours (Example 4), 24 hours (Example 5), and 48 hours (Example 6).
  • Mesenchymal stem cells (Lonza) were added to medium A previously kept at 37 ° C., and the cells were seeded so as to be 2.0 * 10 5 cells per 100 mm culture dish. After culturing under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 , the cells were attached to the culture dish substrate, and then the medium was aspirated to remove the suspended components. The culture dish was washed with phosphate buffered saline. After washing, medium A was added to further culture the cells adhering to the culture dish substrate, and passage was performed after any dish reached about 80% confluence.
  • cultured cells were collected from the dish using a stripping solution consisting of trypsin and EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), suspended in medium A, and then the cells were cultured in a 100 mm culture dish so as to have 2.0 * 10 5 cells. It was done by sowing in.
  • a stripping solution consisting of trypsin and EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the cells seeded in the culture dish were cultured under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions, and after any dish reached about 80% confluence, the cultured cells were collected and the number of cells was counted. (Transition 2).
  • the number of cells when cultured using each serum is summarized in Table 1, and the relative values based on the number of cells proliferated when cultured using the control serum are summarized in FIG.
  • the relative value shown in FIG. 1 corresponds to the cell proliferation rate in passage 2 based on the growth rate of the control.
  • the collected blood was prepared from blood without standing (control), serum prepared from blood left at 15 ° C. for a predetermined time (Examples 7 to 9), 20 ° C.
  • Medium A containing serum prepared from blood that was allowed to stand at 25 ° C. for a predetermined time (Examples 10 to 12) and serum prepared from blood that was allowed to stand at 25 ° C. for a predetermined time (Examples 13 to 15), respectively.
  • the mesenchymal stem cells (Ronza) were cultured and passaged using sera (Table 2).
  • FIG. 2 shows the cell proliferation rate in passage 2 of Examples 10 to 15 based on the growth rate of the control.
  • FIG. 1 shows the cell proliferation rate when serum prepared from blood at a maintenance temperature of 10 ° C. (Comparative Examples 1 to 3) was used, and the cell proliferation rate when cultured using control (no transport) serum. Indicates below the rate. 1 and 2 show that in culture with serum prepared from blood at a maintenance temperature of 20 ° C. or 25 ° C., the cell proliferation rate hardly changes regardless of the maintenance time (Fig. 2), or It showed a tendency to decrease as the maintenance time became longer (Fig. 1). FIG. 2 showed that in the culture using serum prepared from blood at a maintenance temperature of 15 ° C., the cell proliferation rate tended to increase as the maintenance time became longer. Based on the results shown in FIGS.
  • the inventors set the maintenance temperature of blood within 48 hours to at least 15 ° C. or higher and 25 ° C. or lower to make the blood relatively low temperature (10 ° C.). It has been found that it is possible to prevent the decrease in cell proliferation rate due to the serum as seen in the serum prepared from blood.

Abstract

改善された細胞増殖活性を示す血清の製造方法を提供する。　第一の哺乳動物から採取された血液を、１５℃～２５℃の温度にて維持し、該温度での維持が４８時間以内までとし、および該血液から血清を調製することを含む、哺乳動物細胞を培養するための血清を製造する方法。

Description

哺乳動物細胞を培養するための血清の製造方法
　本発明は、哺乳動物細胞を培養するための血清を製造する方法に関する。本発明は、哺乳動物細胞の培養物を含む医薬を製造する方法にも関する。
　近年、中枢神経系における再生医療の研究開発が行われている。幹細胞を用いる再生医療として、損傷された細胞を補充する細胞療法がある。脳神経疾患に対する細胞療法では、神経系細胞への分化能を有する細胞を組織から抽出して培養した後に、該培養物が個体へ移植される（特許文献１）。
　事故等による脊髄損傷などの急性期障害を治療するために細胞療法を用いる場合、ドナーから提供される細胞（ドナー細胞）を、迅速かつ大量に増殖させることが重要である。生体外での細胞増殖に関して、細胞の生存率を向上させ、増殖率を高めるために、ドナー細胞を培養する際の培地に増殖促進因子（例えば血清）を添加することが報告されている。
　細胞療法の分野では、所望の細胞を効率的に増殖させるために血清が用いられることが多い。細胞療法用の医薬の製造に用いられた血清は、培養細胞を含む医薬を対象の体内に適用する際に一緒に体内に入るため、対象に対する影響の少ない、当該対象由来の自己血清であることが望ましい。しかし、ヒト血清単独では、所望の細胞増殖促進活性が得られず、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）または他の増殖因子が添加されている（特許文献２および特許文献３）。
　自己血清の原料となる血液を対象から採取する医療施設では、細胞療法用の医薬の製造に十分な量および品質の血清を調製する設備を有していることは稀であり、通常、所定の基準に適合した医療用細胞培養物の製造施設（例えば、ＧＭＰ基準に適合した細胞調製施設（Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｃｅｎｔｅｒ：ＣＰＣ）まで運搬した後に、そこで製造される。その場合、医療施設から製造施設まで血液を運搬する必要があるが、立地によっては長時間の運搬が必要となる場合があり、血液の質が低下する恐れがある。長時間の輸送から血液の質の低下を防ぐために、該血液に保存剤を添加する方法が提案されている（特許文献４）。
国際公開第　ＷＯ０２／００８４９　Ａ１号パンフレット 特開平１０－１７９１４８号公報 特開２００３－２３５５４８号公報 特開２０１５－１５１３３４号公報
　ＦＢＳなどの他種の生体由来の増殖促進因子を、ヒト血清を含む培地に追加することで所望の細胞増殖促進活性が得られるとしても、添加する他種の生体由来の増殖促進因子の安全性検査のために、手間と費用がかかる。従って、当該分野には、他種の生体由来の増殖促進因子を追加せずに、所望の細胞増殖活性を示す血清の製造方法に対する要望があった。
　自己血清を含む培地中で増殖させた自己細胞を利用する細胞療法では、対象個体の健康維持の観点から、一度に採取可能な血液量には制約がある。このため、当該分野には、採取可能な量の血液から、所望の細胞増殖活性を示す血清を製造する方法に対する要望があった。
　保存剤を添加することで長期輸送に対する保存性が得られるとしても、細胞療法用の医薬では、そのような保存剤も一緒に対象の体内に入ることから、安全性の観点からは保存剤を用いずに、所望の細胞増殖活性を示す血清の製造方法に対する要望があった。
　本発明者らは、個体から採取された血液を所定範囲内の温度に維持し、該温度で維持期間を所定時間以内とすることで、該血液から調製される血清が、所望の細胞増殖活性を示すことを見出し、本発明を完成させた。
　本発明の第一の態様は、第一の哺乳動物から採取された血液を、１５℃～２５℃の温度にて維持し、該温度での維持が４８時間以内であり、および該血液から血清を調製することを含む、哺乳動物細胞を培養するための血清を製造する方法を提供する。本発明の第二の態様は、哺乳動物細胞を、培地中で培養することを含み、該培地は、該哺乳動物細胞を培養するための血清を含み、該血清が、第一の哺乳動物から採取された血液を、１５℃～２５℃の温度にて維持し、該温度での維持が４８時間以内であり、および該血液から調製したものである、哺乳動物細胞の培養物を含む医薬を製造する方法を提供する。
　本発明は、改善された細胞増殖活性を示す血清の製造方法、および前記方法により製造される血清を用いて哺乳動物細胞を増殖させることを含む医薬を製造する方法を提供する。
図１は、１０℃、２０℃、または２５℃で所定時間静置された血液から調製された血清を用いて得られた、細胞の増殖率を示す棒グラフである。 図２は、１５℃、２０℃、または２５℃で所定時間静置された血液から調製された血清を用いて得られた、細胞の増殖率を示す棒グラフである。
　本明細書において「血液」は、哺乳動物の体内を流れる体液であって、赤血球、白血球、血小板などの血球成分と血漿とを含む体液を意味する。哺乳動物から採取された血液は、限定するものではないが、静脈血、動脈血、末梢血であってよい。１つの実施形態において、哺乳動物から採取された血液は、末梢血である。血液は、限定するものではないが、公知の方法に従って、哺乳動物から採取することができる。一例において、血液は、注射針および採血容器を用いて採取することができる。１つの実施形態において、血清を調製するための血液は、保存剤を含まない。
　本明細書において「採血容器」は、哺乳動物から採取された血液を無菌的に保持できる容器を意味する。採血容器は、限定するものではないが、採血分野で公知の容器であってよく、商業的に入手可能である。採血容器は、例えば、採血用バッグまたは採血用チューブであってよい。一例において、採血容器は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０１３０３８２号明細書（参照により、その内容が本明細書の一部とされる）に記載の血液収容デバイスであってよい。
　本明細書において「血清」は、哺乳動物の血液が凝固して形成された血餅から分離した、液体部分を意味する。血清は、限定するものではないが、哺乳動物から採取された血液から、公知の方法を用いて製造することができる。例えば血清は、哺乳動物細胞を培養するための培地に、分注器などを用いて添加することにより用いることができる。
　本明細書において「血餅」は、哺乳動物の血液が凝固する過程で形成される構造物を意味する。血餅は、限定するものではないが、血球成分および繊維素（「フィブリン」とも称される）を含む。一例において、血餅は、公知の方法に従って哺乳動物の血液を、抗凝固剤を含めずに、常温（例えば２２℃～２７℃）にて容器内で無菌的に放置することにより、形成させることができる。
　本明細書において「哺乳動物細胞を培養するための血清」は、哺乳動物から採取された血液を１５℃～２５℃の温度にて維持し、該温度での維持を４８時間以内とした、該血液から得られる血清を意味する。該血液を１５℃～２５℃の温度にて維持することは、限定するものではないが、該血液を収容した容器を、１５℃～２５℃の温度範囲のいずれかの特定の温度または特定の温度範囲となるように温度調節が可能な容器または装置もしくはそれらの組合せの内部に置くことであってよい。１５℃～２５℃の温度で維持された血液は、限定するものではないが、静置されていてもよく、または運搬されていてもよい。
　本明細書において「温度調節が可能な容器または装置」は、容器または装置内部の温度を、所定の温度範囲に調節する機能を備えた容器または装置を意味する。温度調節が可能な容器または装置は、限定するものではないが、断熱材で覆われ、周囲の環境温度の影響を受けにくい容器または装置であってよい。断熱材としては、例えば、発砲スチロール、硬質ウレタンフォーム、または真空断熱材（例えば、グラスウール芯材または炭素材をガスバリアフィルムで包み、該フィルム包装内部を真空状態にして密封した構造物）もしくはそれらの組合せであってよい。温度調節が可能な容器は、限定するものではないが、容器内部に蓄熱材、発熱剤、蓄冷材、保冷剤、または温度調節ユニット（例えば、サーモスタットにより制御されたペルチエ素子を備えた小型の冷却装置）もしくはそれらの組合せを含んでよい。温度調節が可能な装置は、限定するものではないが、温度調節ユニット（例えば、サーモスタットにより制御されたペルチエ素子を備えた小型の冷却装置）、場合により蓄熱材または蓄冷材を含んでよい。温度調節が可能な装置は、例えば、温度調節機能を備えた移動手段（例えば、車、船および飛行機）であってよい。温度調節が可能な容器および装置の組合せは、限定するものではないが、血液を収容した容器を温度調節が可能な容器に格納し、該容器を温度調節が可能な装置に格納することであってよい。
　哺乳動物から採取された血液は、限定するものではないが、特定の温度範囲、例えば１５℃～２４℃の温度範囲、１５℃～２３℃の温度範囲、１５℃～２２℃の温度範囲、１５℃～２１℃の温度範囲、１５℃～２０℃の温度範囲、１６℃～２５℃の温度範囲、１６℃～２４℃の温度範囲、１６℃～２３℃の温度範囲、１６℃～２２℃の温度範囲、１６℃～２１℃の温度範囲、１６℃～２０℃の温度範囲、１７℃～２５℃の温度範囲、１７℃～２４℃の温度範囲、１７℃～２３℃の温度範囲、１７℃～２２℃の温度範囲、１７℃～２１℃の温度範囲、１７℃～２０℃の温度範囲、１８℃～２５℃の温度範囲、１８℃～２４℃の温度範囲、１８℃～２３℃の温度範囲、１８℃～２２℃の温度範囲、１８℃～２１℃の温度範囲、１８℃～２０℃の温度範囲、１９℃～２５℃の温度範囲、１９℃～２４℃の温度範囲、１９℃～２３℃の温度範囲、１９℃～２２℃の温度範囲、１９℃～２１℃の温度範囲、または１９℃～２０℃の温度範囲となるように温度調節可能な容器または装置もしくはそれらの組合せの内部に置かれる。
　１つの実施形態において、哺乳動物から採取された血液は、特定の温度、例えば１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃または２５℃となるように温度調節が可能な容器または装置もしくはそれらの組合せの内部に置かれる。特定の温度は、温度調節が可能な容器の調節温度の誤差範囲内の温度を意味する。一例において、温度調節が可能な容器または装置もしくはそれらの組合せの調節温度の誤差範囲が±０．５℃である場合、特定の温度２０℃は１９．５℃～２０．５℃を意味する。
　１つの実施形態において、哺乳動物から採取された血液は、１７℃～２３℃、１８℃～２２℃、または１９℃～２１℃の温度範囲となるように温度調節可能な容器または装置もしくはそれらの組合せの内部に置かれる。
　本明細書に記載される特定の温度にて「維持する時間」または「維持時間」は、哺乳動物から採取された血液を、温度調節が可能な容器または装置もしくはそれらの組合せに収容した時点から、該容器または装置もしくはそれらの組合せから取り出した時点までの期間を意味する。該維持する時間は、４８時間以内であれば特に限定されず、例えば４５時間以内、４０時間以内、３５時間以内、３０時間以内に、または２４時間以内であってもよい。特定の温度に維持された時間の温度は、限定するものではないが、温度記録装置を哺乳動物から採取された血液とともに設置することにより、確認することができる。
　１つの実施形態において、哺乳動物から採取された血液を温度調節が可能な容器または装置もしくはそれらの組合せに収容するまでの時間が、該哺乳動物から血液を採取した時から１時間以内、０．５時間以内、０．３時間以内、１５分以内、１０分以内、５分以内、３分以内である。
　１つの実施形態において、血清を調製する工程は、温度調節が可能な容器または装置もしくはそれらの組合せから取り出した哺乳動物の血液を静置し、該血液を血餅と液体部分とに分離させる工程、および該液体部分を回収する工程を含む。該静置工程は、限定するものではないが、該血液を常温（例えば２１℃～２７℃）にて維持することであってよい。該静置工程における維持時間は、限定するものではないが、血餅の形成が確認できるまで行われてもよく、または、予め設定した時間（０．５時間～２時間のいずれかの時間）であってもよい。一例において、該静置工程は、温度調節が可能な容器または装置もしくはそれらの組合せから取り出した該血液を、予め設定した時間（例えば２時間）常温にて維持した後、血餅の形成が確認できない場合には、更に静置する工程を追加してもよい。血餅の形成の確認は、限定するものではないが、目視により行われてもよい。
　該血清の回収工程は、限定するものではないが、公知の方法を用いて血餅から回収することができる。該血清の回収工程は、例えば、血餅から分離した液体部分をピペットなどの器具を用いて他の容器に移すこと、遠心分離法により血餅を沈殿させて、その上清をピペットなどの器具を用いて他の容器に移すこと、または、血餅と液体部分とに分離した混合液をフィルターに通じてろ過して、ろ液として血清を回収することであってよい。
　１つの実施形態において、血清の製造方法は、哺乳動物から採取された血液の一部試料または調製された血清の一部試料に対して、血清腫瘍マーカーに関する検査および感染因子に関する検査のいずれか一方または両方を行うことをさらに含む。１つの実施形態において、血清の製造方法は、哺乳動物から採取された血液の一部試料に対して、血清腫瘍マーカーに関する検査および感染因子に関する検査のいずれか一方または両方を行うことを含む。これらの検査は、各マーカーまたは各因子について公知の測定方法により測定することができ、各マーカーまたは各因子について公知の適正値もしくは基準値と比較することにより、陽性または陰性を判定することができる。
　血清腫瘍マーカーは、例えば、フェリチン、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＢＦＰ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＳＴＮ、ＤＵＰＡＮ－２、ＳＬＸ、ＳＴ－４３９、ＳＰＡＮ－１、ＳＣＣ、ＰＳＡ、Ｇ－セミノプロテイン、ＴＰＡ、シフラ、ＰＡＰ、ＮＳＥ、Ｃ－ペプチド、ＰＩＶＫＡ、Ｐｒｏ－ＧＲＰ、ＨＣＧＢ、エラスターゼ、β２マイクログロブリン、Ｓ－ＮＴＸ、抗ｐ５３抗体、およびＨＥＲ２からなる群より選ばれる１種または２種以上である。感染因子は、例えば、ＨＩＶ、ＡＴＬ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、梅毒トレポネーマ、およびヒトパルボウイルスＢ１９からなる群より選ばれる１種または２種以上である。
　１つの実施形態において、血清の製造方法は、検査されたすべての血清腫瘍マーカーが陰性であり、検査されたすべての感染因子が陰性である場合に、血清の製造方法が継続されてよい。他の実施形態において、血清の製造方法は、検査された血清腫瘍マーカーが１種でも陽性であるか、または検査された感染因子が１種でも陽性である場合に、血清の製造方法は中止されてよい。
　本明細書において「哺乳動物」は、任意の哺乳動物個体を意味する。哺乳動物は、限定するものではないが、ヒト、ヒト以外の哺乳動物であってよい。ヒト以外の哺乳動物は、限定するものではないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯類、チンパンジーなどの非ヒト霊長類、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコなどの愛玩動物であってよい。１つの実施形態において、哺乳動物は、ウマ、愛玩動物、非ヒト霊長類またはヒトである。１つの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
　血清を製造するための血液採取の文脈における「第一の哺乳動物」と、哺乳動物細胞の文脈における「第二の哺乳動物」と、医薬投与の文脈における「第三の哺乳動物」とは、同一個体であっても、異なる個体であってもよい。第一の哺乳動物と、第二の哺乳動物と、第三の哺乳動物とが異なる個体である場合、第一の哺乳動物と、第二の哺乳動物と、第三の哺乳動物とは、同じ生物種（同種）であっても、異なる生物種（異種）であってもよい。好ましい実施形態において、第一の哺乳動物と、第二の哺乳動物と、第三の哺乳動物とは、同種である。より好ましい実施形態において、第一の哺乳動物と、第二の哺乳動物と、第三の哺乳動物とは同一個体である。
　本明細書において「幹細胞」は、自己複製（self-renewal）能と分化（differentiation）能をあわせもつ細胞を意味する。本明細書において「自己複製能」は、自己と同じ能力をもつ幹細胞を、細胞分裂を経て少なくとも一方の娘細胞として持続的に生み出す能力を意味する。本明細書において「分化能」は、自己と異なる特殊化した細胞に分裂できる能力を意味する。
　幹細胞は、限定するものではないが、内胚葉、外胚葉および中胚葉の三胚葉のそれぞれ属する複数の種類の細胞に分化できる多能性幹細胞（pluripotent stem cell）、一つの胚葉に限定した複数種の細胞に分化できる複能性幹細胞（multipotent stem cell）、および一種類の細胞にしか分化できない単能性幹細胞（unipotent stem cell）であってよい。多能性幹細胞は、例えば、胚性幹細胞または遺伝子工学により体細胞から多能性が与えられた組換え細胞（induced pluripotent stem cell）であってよい。複能性幹細胞は、例えば、造血幹細胞または間葉系幹細胞であってよい。単能性幹細胞は、例えば、生殖幹細胞であってよい。幹細胞は、公知の方法を用いて哺乳動物由来の生体試料から取得することができ、または商業的に入手することができる。
　本明細書において「間葉系幹細胞」は、非造血系の接着性の細胞であり、自己複製能をもち、骨細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞などの結合組織細胞に分化するだけでなく、神経細胞、心筋細胞、および肝臓細胞への分化能を有する。間葉系幹細胞は、骨髄液中にごくわずか（核を有する細胞集団中０．００１～０．０１％）しか存在しないことが知られている。
　本明細書において「生体試料」は、哺乳動物の組織または体液の一部を意味する。生体試料は、限定するものではないが、該哺乳動物から採取された組織または体液の一部そのものであってもよく、または必要に応じて適切な処理（例えば、不要な成分の除去、特定の細胞分画の精製、酵素処理、保存処理）を施したものであってよい。該体液は、例えば、骨髄液、血液（末梢血もしくは臍帯血）またはリンパ液であってよい。該組織は、例えば、筋肉組織、骨組織、皮膚、リンパ系組織、脈管、または消化器などの組織、または胚（例えばヒト胚を除く哺乳動物胚）であってよい。
　生体試料は、公知の方法に従って、哺乳動物から取得することができる。生体試料が骨髄液である場合、該生体試料の採取は、例えば、骨髄液を採取する第二の哺乳動物を麻酔（局所または全身麻酔）し、胸骨または腸骨に針を刺し、シリンジで吸引することにより行うことができる。生体試料が臍帯血である場合、該生体試料の採取は、例えば、臍帯に直接針を刺し、シリンジで吸引することにより行うことができる。
　本明細書において「哺乳動物細胞」は、細胞培養によって増殖させることができる哺乳動物由来の細胞を意味する。哺乳動物細胞は、限定するものではないが、該哺乳動物から採取された生体試料中に存在する細胞であってよく、または遺伝子工学により作出された哺乳動物起源の組換え細胞であってよい。哺乳動物細胞は、例えば、培養容器に付着させて培養できる細胞であってよく、または浮遊した状態で培養できる細胞であってもよい。一例において、哺乳動物細胞は、哺乳動物から採取された生体試料中に存在する細胞であってよく、例えば、体細胞または幹細胞であってよい。体細胞は、例えば、骨芽細胞、繊維芽細胞、上皮細胞および血管内皮細胞の一種または二種以上であってよい。幹細胞は、例えば、少なくとも一種の間葉系幹細胞を含む。
　１つの実施形態において、哺乳動物細胞は、幹細胞である。１つの実施形態において、哺乳動物細胞は、間葉系幹細胞である。好ましい実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト間葉系幹細胞である。より好ましい実施形態において、哺乳動物細胞は、骨髄由来のヒト間葉系幹細胞である。骨髄由来の間葉系幹細胞は、限定するものではないが、ヒトから採取された骨髄液中に存在する間葉系幹細胞を、細胞培養により増殖させて得ることができる。
　本明細書において、哺乳動物細胞の培養物を含む「医薬」は、細胞療法が奏功し得る疾患または障害の処置に用いられる組成物を意味する。医薬は、医療製品に求められる種々の基準、例えば、製造工程由来不純物に関する基準などを満たすものである。該医薬は、限定するものではないが、用途に応じて医薬的に許容される希釈剤、賦形剤および／または基材を含んでよい。該医薬は、限定するものではないが、注射形態（液体）および移植形態（例えばシート状）であってよい。該医薬を処置部位へ送達する方法は、医薬の形態に応じて適宜される。該医薬の送達方法は、例えば、外科的手段による局所移植、静脈内投与、腰椎穿刺投与、局所注入投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、脳内投与、脳室内投与、または静脈投与などであってよい。１つの実施形態において、医薬は、注射形態であり、静脈内投与される。注射形態の医薬は、例えば、ボーラス投与、または点滴投与用であってよい。
　該医薬は、限定するものではないが、組織修復または組織再生のために用いることができる。該医薬は、神経疾患を処置するために用いられる。神経疾患は、限定するものではないが、中枢性および末梢性の脱髄疾患、中枢性および末梢性の変性疾患、脳卒中（脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血を含む）、脳腫瘍、認知症を含む高次機能障害、精神疾患、てんかん、外傷性の神経疾患（頭部外傷、脳挫傷、脊髄損傷を含む）、および脊髄梗塞を含む。
　該医薬は、神経疾患の処置に限定されず、例えば、心筋、関節、軟骨、肝臓、骨髄などの組織の異常に関連する疾患の処置に用いることができる。１つの実施形態において、該医薬は、例えば、脊髄損傷、脳卒中、認知症、または脊髄梗塞を処置するために用いることができる。該医薬が、上記疾患に有用であり得るとは、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１０／２５４９５３号明細書（参照により、その内容が本明細書の一部とされる）に開示されている。
　該医薬に用いる哺乳動物細胞の培養物は、本明細書に記載の血清の製造方法にて調製した血清を含む培地を用い、公知の細胞培養方法に従って、哺乳細胞を培養することによって製造することができる。そのような製造方法としては、例えば特開２０１２－１００６６２号公報（参照により、その内容が本明細書の一部とされる）に開示されている。
　本明細書において「培地」は、生体外での哺乳動物細胞の生存の維持および細胞分裂を可能にする組成物を意味する。該培地は、本明細書に記載の血清の製造方法にて調製した血清を含む。培地は、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分とした細胞培養用の基礎培地を利用して製造することができる。基礎培地は、限定するものではないが、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＮＰＢＭ、αＭＥＭを用いることができる。１つの実施形態において、培地は、ＤＭＥＭである。培地は、公知の方法に従って調製することができ、また商業的に入手可能である。
　培地は、限定するものではないが、該基礎培地に、本明細書に記載の血清の製造方法にて調製した血清を、培地あたり１～２０容積％、好ましくは５～１５容積％、より好ましくは８～１２容積％で含有する。培地は、限定するものではないが、細胞培養の分野において通常使用される抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど）を、単独でまたは併用して使用してもよい。一例において、培地は、ペニシリンおよびストレプトマイシンを、培地に対して各０．５～２容積％、好ましくは０．８～１．２容積％含んでよい。１つの実施形態において、培地は、抗凝固剤を、培地の容積に対して０．０２Ｕ／ｍＬ未満の量で含む。
　上記の基礎培地に、必要に応じて増殖・成長因子および／または分化誘導因子を添加してもよい。増殖・成長因子および分化誘導因子は、所望の分化の方向およびレベル、必要な増殖率などに応じて選択される。例えば、アスコルビン酸およびニコチンアミドなどのビタミン類、ＮＧＦおよびＢＤＮＦなどの神経栄養因子、ＢＭＰなどの骨形成因子、上皮細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、ＩＬ－２などのサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、培地は、本明細書に記載の血清の製造方法にて調製した血清と異なる種（異種）の血液から調製された血清を含まない。
　哺乳動物細胞の培養は、細胞培養分野で公知の条件下で行うことができる。哺乳動物細胞の培養は、限定するものではないが、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行うことができる。哺乳動物細胞の培養は、任意のサイズおよび形状の培養容器を用いて行うことができる。哺乳動物細胞の培養物の大きさまたは形状は、培養容器における細胞付着面の大きさまたは形状によって調節することができる。間葉系幹細胞の培養は、例えば特開２０１２－１００６６２号公報（参照により、その内容が本明細書の一部とされる）に開示されている。
　本明細書において「細胞が抗凝固剤と実質的に接触しない」は、哺乳動物細胞の採取から培養期間全体のあらゆる時点において使用する抗凝固剤の量を実質的に減少させることを意味する。一例において、抗凝固剤を、哺乳動物細胞の採取のための容器（採血管など）の内壁を抗凝固剤溶液で濡らす程度に添加するか、もしくは全く添加しないか、または培養を開始する際に試料中の抗凝固剤を実質的に除去した場合に得られる状態を意味する。より迅速かつ大量に哺乳動物細胞を増殖させるためには、生体試料を採取する際に添加される抗凝固剤の量が少ないことが好ましい。
　１つの実施形態において、第二の哺乳動物から採取された生体試料に添加される（すなわち、採取された生体試料が収容される容器に予め添加される）抗凝固剤の量は、生体試料の容積に対して０．２Ｕ／ｍＬ未満である。
　本明細書において「抗凝固剤」は、生体試料中または培地中に存在する場合、細胞表面に結合して、細胞外マトリクスに存在する抗血液凝固作用を有するタンパク質と相互作用し、細胞と細胞外マトリクス、細胞同士または細胞と基質とが接着することを阻害する物質を意味する。抗凝固剤は、例えば、ヘパリンおよびヘパリン誘導体（例えばヘパリンを構成するＤ－グルコサミンの６位を脱硫酸したグリコサミノグリカン）またはそれらの塩を含む。
　本発明の実施形態は、例えば、以下に記載のものであってよいが、これらに限定されない：
[項１]　哺乳動物細胞を培養するための血清を製造する方法であって、第一の哺乳動物から採取された血液を、１５℃～２５℃の温度にて維持し、該温度での維持を４８時間以内までとし、および該血液から血清を調製することを含む、製造方法。
[項２]　該第一の哺乳動物が、ヒトである、項１に記載の製造方法。
[項３]　該血液の一部試料または調製された血清の一部試料に対して、血清腫瘍マーカーに関する検査および感染因子に関する検査のいずれか一方または両方を行うことをさらに含む、項１または項２に記載の製造方法。
[項４]　該哺乳動物細胞が、該第一の哺乳動物と同種の第二の哺乳動物由来の細胞である、項１～項３のいずれかに記載の製造方法。
[項５]　該哺乳動物細胞が、該第一の哺乳動物と同一個体由来の細胞である、項１～項４のいずれかに記載の製造方法。
[項６]　該哺乳動物細胞が、幹細胞である、項１～項５のいずれかに記載の製造方法。
[項７]　該哺乳動物細胞が、骨髄由来の間葉系幹細胞である、項１～項６のいずれかに記載の製造方法。
[項８]　哺乳動物細胞の培養物を含む医薬を製造する方法であって、哺乳動物細胞を、培地中で培養することを含み、該培地は、該哺乳動物細胞を培養するための血清を含み、該血清が、第一の哺乳動物から採取された血液を、１５℃～２５℃の温度にて維持し、該温度での維持を４８時間以内までとした、該血液から調製したものである、製造方法。
［項９］　該第一の哺乳動物が、ヒトである、項８に記載の製造方法。
［項１０］該血清が、血清腫瘍マーカーに関する検査および感染因子に関する検査のいずれか一方または両方が行われたものである、項８または項９に記載の製造方法。
［項１１］　該培地が、該血清を培地容積あたり１～２０％で含有する、項８～項１０のいずれかに記載の製造方法。
［項１２］　該培地が、抗凝固剤を培地の容積に対して０．０２Ｕ／ｍＬ未満の量で含む、項８～項１１のいずれかに記載の製造方法。
［項１３］　該哺乳動物細胞が、該第一の哺乳動物と同種の第二の哺乳動物由来の細胞である、項８～項１２のいずれかに記載の製造方法。
［項１４］　該哺乳動物細胞が、該第一の哺乳動物と同一個体由来の細胞である、項８～項１３のいずれかに記載の製造方法。
［項１５］　該哺乳動物細胞が、幹細胞である、項８～項１４のいずれかに記載の製造方法。
［項１６］　該哺乳動物細胞が、骨髄由来の間葉系幹細胞である、項８～項１５のいずれかに記載の製造方法。
［項１７］　該哺乳動物細胞が、該医薬の投与を必要とする第三の哺乳動物と同一個体由来の細胞である、項８～項１６のいずれかに記載の製造方法。
［項１８］　該哺乳動物細胞が、第二の哺乳動物から採取された生体試料に添加される抗凝固剤の量を該生体試料の容積に対して０．２Ｕ／ｍＬ未満として、該抗凝固剤と実質的に接触しない状態で、該哺乳動物から採取されたものである、項８～項１７のいずれかに記載の製造方法。
［項１９］　該抗凝固剤が、ヘパリン、ヘパリン誘導体またはこれらの塩である、項１２～項１８のいずれかに記載の製造方法。
［項２０］　該医薬が、脊髄損傷、脳卒中、認知症、または脊髄梗塞を処置する用である、項８～項１９のいずれかに記載の製造方法。
［項２１］　該培地中で培養した該哺乳動物細胞を回収することをさらに含む、項８～項２０に記載の製造方法。
　以下、具体的な実施例を記載するが、それらは本発明の好ましい実施形態を示すものであり、添付する特許請求の範囲に記載の発明をいかようにも限定するものではない。
［血清の調製］
（コントロール）
　ボランティアから末梢血をプラスチック製の遠心管に採取した。採取した血液を常温下にて静置させ、血餅と液体部分とを分離させた。該血餅を、室温、２３８０×ｇにて遠心分離することにより沈殿させ、上清を滅菌済みのプラスチック製容器に入れることにより、血清を調製した。
（比較例１～３）
　採取した血液を、１０℃にて９時間（比較例１）、２４時間（比較例２）、４８時間（比較例３）静置したこと除いて、コントロールと同様にして、血清を調製した。
（実施例１～３）
　採取した血液を、２０℃にて９時間（実施例１）、２４時間（実施例２）、４８時間（実施例３）静置したこと除いて、コントロールと同様にして、血清を調製した。
（実施例４～６）
　採取した血液を、２５℃にて９時間（実施例４）、２４時間（実施例５）、４８時間（実施例６）静置したこと除いて、コントロールと同様にして、血清を調製した。
　比較例１～３の血液から血清を調製した場合に、血餅と液体部分とを分離させるのに要した時間は、実施例１～６の血液から血清を調製した場合に要した時間よりも長くなる傾向がみられた。
［培地の調製］
　ＤＭＥＭ（８８ｖ／ｖ％）、Ｌ－グルタミン溶液（１ｖ／ｖ％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１ｖ／ｖ％）、および各血清（１０ｖ／ｖ％）を混合した後、フィルター（０．２μｍ）にてろ過滅菌して、培地Ａを調製した。
［哺乳動物細胞の培養］
　間葉系幹細胞（ロンザ社）を、予め３７℃に保った培地Ａに加え、１００ｍｍ培養ディッシュあたり２．０＊１０５個となるよう細胞を播種した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養して、細胞を培養ディッシュ基材に付着させた後、培地を吸引して浮遊成分を除去した。リン酸緩衝食塩水を用いて、培養ディッシュを洗浄した。洗浄後、培地Ａを加えて、培養ディッシュ基材に付着した細胞をさらに培養し、いずれかのディッシュが約８０％コンフルエントに達した後に、継代を行った。継代は、トリプシンおよびＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）からなる剥離液を用いてディッシュから培養細胞を回収し、培地Ａに懸濁した後、２．０＊１０５個となるよう細胞を１００ｍｍ培養ディッシュに播種することで行った。
　上記と同様、培養ディッシュに播種した細胞を、３７℃、５％ＣＯ２条件下培養した後、いずれかのディッシュが約８０％コンフルエントに達した後に、培養細胞を回収し、細胞数を計数した（継代２）。
　各血清を用いて培養した場合の細胞数を表１にまとめ、コントロールの血清を用いて培養した場合に増殖した細胞数を基準とした相対値を図１にまとめた。図１に示す相対値は、コントロールの増殖率を基準とした、継代２における細胞の増殖率に相当する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記と同様にして、採取した血液を、静置なしの血液から調製された血清（コントロール）、１５℃にて所定時間静置した血液から調製された血清（実施例７～９）、２０℃にて静置した血液から所定時間調製された血清（実施例１０～１２）、および２５℃にて所定時間静置した血液から調製された血清（実施例１３～１５）をそれぞれ含有する培地Ａを用いて、間葉系幹細胞（ロンザ社）を培養および継代した（表２）。コントロールの増殖率を基準とした、実施例１０～１５の継代２における細胞の増殖率を図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図１は、維持温度を１０℃とした血液から調製された血清（比較例１～３）を用いた場合の細胞増殖率は、コントロール（搬送無し）の血清を用いて培養した場合の細胞増殖率を下回ることを示す。図１および図２は、維持温度を２０℃または２５℃とした血液から調製された血清を用いた培養では、細胞の増殖率は、維持時間に関係なくほとんど変化しないか（図２）、または維持時間が長くなるにつれ低下する傾向（図１）を示した。図２は、維持温度を１５℃とした血液から調製された血清を用いた培養では、細胞の増殖率は、維持時間が長くなるにつれ、増加する傾向を示した。発明者らは、図１および図２で示される結果に基づき、４８時間以内までの血液の維持温度を少なくとも１５℃以上２５℃以下とすることによって、比較的低温（１０℃）とした場合の血液から調製した血清で見られたような、該血清による細胞増殖率の低下を防ぐことが可能であることを見出した。

Claims (20)

  1. 　哺乳動物細胞を培養するための血清を製造する方法であって、
    　第一の哺乳動物から採取された血液を、１５℃～２５℃の温度にて維持し、該温度での維持を４８時間以内までとし、および
    　該血液から血清を調製することを含む、製造方法。
  2. 　該第一の哺乳動物が、ヒトである、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　該血液の一部試料または調製された血清の一部試料に対して、血清腫瘍マーカーに関する検査および感染因子に関する検査のいずれか一方または両方を行うことをさらに含む、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　該哺乳動物細胞が、該第一の哺乳動物と同種の第二の哺乳動物由来の細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　該哺乳動物細胞が、該第一の哺乳動物と同一個体由来の細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 　該哺乳動物細胞が、幹細胞である、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　該哺乳動物細胞が、骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. 　哺乳動物細胞の培養物を含む医薬を製造する方法であって、
    　哺乳動物細胞を、培地中で培養することを含み、
    　該培地は、該哺乳動物細胞を培養するための血清を含み、
    　該血清が、第一の哺乳動物から採取された血液を、１５℃～２５℃の温度にて維持し、該温度での維持を４８時間以内までとした、該血液から調製したものである、製造方法。
  9. 　該第一の哺乳動物が、ヒトである、請求項８に記載の製造方法。
  10. 　該血清が、血清腫瘍マーカーに関する検査および感染因子に関する検査のいずれか一方または両方が行われたものである、請求項８または９に記載の製造方法。
  11. 　該培地が、該血清を培地容積あたり１～２０％で含有する、請求項８～１０のいずれか一項に記載の製造方法。
  12. 　該培地が、抗凝固剤を培地の容積に対して０．０２Ｕ／ｍＬ未満の量で含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の製造方法。
  13. 　該哺乳動物細胞が、該第一の哺乳動物と同種の第二の哺乳動物由来の細胞である、請求項８～１２のいずれか一項に記載の製造方法。
  14. 　該哺乳動物細胞が、該第一の哺乳動物と同一個体由来の細胞である、請求項８～１３のいずれか一項に記載の製造方法。
  15. 　該哺乳動物細胞が、幹細胞である、請求項８～１４のいずれか一項に記載の製造方法。
  16. 　該哺乳動物細胞が、骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項８～１５のいずれか一項に記載の製造方法。
  17. 　該哺乳動物細胞が、該医薬の投与を必要とする第三の哺乳動物と同一個体由来の細胞である、請求項８～１６のいずれか一項に記載の製造方法。
  18. 　該哺乳動物細胞が、第二の哺乳動物から採取された生体試料に添加される抗凝固剤の量を該生体試料の容積に対して０．２Ｕ／ｍＬ未満として、該抗凝固剤と実質的に接触しない状態で、該第二の哺乳動物から採取されたものである、請求項８～１７のいずれか一項に記載の製造方法。
  19. 　該抗凝固剤が、ヘパリン、ヘパリン誘導体またはこれらの塩である、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の製造方法。
  20. 　該医薬が、脊髄損傷、脳卒中、認知症、または脊髄梗塞を処置する用である、請求項８～１９のいずれか一項に記載の製造方法。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020187551A1 (en) * 1998-10-17 2002-12-12 Tai-Wook Yoon Method for culturing langerhans islets and islet autotransplantation islet regeneration
WO2009034708A1 (ja) * 2007-09-11 2009-03-19 Sapporo Medical University 細胞増殖方法ならびに組織の修復および再生のための医薬
JP2012100662A (ja) * 2011-12-05 2012-05-31 Sapporo Medical Univ 細胞増殖方法ならびに組織の修復および再生のための医薬
US20180050064A1 (en) * 2015-03-24 2018-02-22 Herr Marc Schrott, Central Apotheke Method for producing eye drops
JP2019089722A (ja) * 2017-11-13 2019-06-13 株式会社細胞応用技術研究所 多血小板血漿を製造する方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020187551A1 (en) * 1998-10-17 2002-12-12 Tai-Wook Yoon Method for culturing langerhans islets and islet autotransplantation islet regeneration
WO2009034708A1 (ja) * 2007-09-11 2009-03-19 Sapporo Medical University 細胞増殖方法ならびに組織の修復および再生のための医薬
JP2012100662A (ja) * 2011-12-05 2012-05-31 Sapporo Medical Univ 細胞増殖方法ならびに組織の修復および再生のための医薬
US20180050064A1 (en) * 2015-03-24 2018-02-22 Herr Marc Schrott, Central Apotheke Method for producing eye drops
JP2019089722A (ja) * 2017-11-13 2019-06-13 株式会社細胞応用技術研究所 多血小板血漿を製造する方法

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