WO2021131900A1

WO2021131900A1 - プレニルフラボノイド配糖体、その製造方法及びプレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法

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Publication number: WO2021131900A1
Application number: PCT/JP2020/046738
Authority: WO
Inventors: 美佐落合; 栄一郎小埜; 祐子福井; 慶造藤井
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
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Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2021-07-01
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Abstract

本発明は、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンにヘキソースが２個以上結合しているプレニルフラボノイド配糖体及びその製造方法、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンに１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを製造する方法、プレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法、プレニルフラボノイドの苦味を低減する方法及びプレニルフラボノイドの安定性を向上させる方法等を提供することを目的とする。本発明は、下記一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体などに関する。（一般式（１）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表し、Ｘはヘキソース残基を表し、ｎは、２～１０の整数を表す。２～１０個のヘキソース残基は、同じであってもよく、異なっていてもよい。）

Description

プレニルフラボノイド配糖体、その製造方法及びプレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法

本発明は、プレニルフラボノイドに２個以上のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイド配糖体及びその製造方法に関する。本発明はまた、プレニルフラボノイドにヘキソースが１個結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法に関する。また、本発明は、プレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法に関する。本発明はさらに、プレニルフラボノイドの苦味を低減する方法及び安定性を向上させる方法などに関する。

植物二次代謝物であるフラボノイドは様々な植物原料由来の飲食品に含まれており、それらの多くがグリコシル化された水溶性の高い配糖体として存在している。一方で、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ　ｌｕｐｕｌｕｓ）の雌花に含まれるキサントフモールは、雌花のルプリンという表皮細胞が突出した特殊細胞群において生合成され、アグリコンの状態で蓄積している。キサントフモールやそれが異性化されたイソキサントフモールは、プレニル基を有するプレニルフラボノイドの一種である。

プレニルフラボノイドは抗腫瘍活性、メタボリックシンドローム改善などの多様な有用生物活性を有することが知られている（非特許文献１～３）。しかしながら、イソキサントフモール等のプレニルフラボノイドは極めて極性が低くほとんど水に溶解しないため、例えば飲料に配合する場合に添加量が制限される場合があった。

プレニルフラボノイドを水溶化させるために糸状菌の持つ糖転移活性を利用し、イソキサントフモールをグルコース配糖体（グルコシド）に変換した例が知られている（非特許文献４）。この方法では、イソキサントフモールに糖が一つ転移したモノグリコシドが得られる。しかしながら、非特許文献４で使用される微生物は、昆虫病原糸状菌の一種であるＢｅａｕｖｅｒｉａ　ｂａｓｓｉａｎａ等であり、食経験がない菌である。従って、当該方法で得られるイソキサントフモール配糖体を飲食品等に利用するためには、高度に精製する必要があり、飲食品の製造への利用には適していない。また、フラボノイドに対するＵＤＰ（ウリジン二リン酸）－糖転移酵素（ＵＧＴ）は多数知られているが、プレニルフラボノイドに対してグルコシル化活性を有する植物ＵＧＴを同定した報告はない。

Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ　（２０１９）　Ｊ．　Ａｇｒｉｃ．　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ．　６７：　８２９１－８３０２Ｄｏｓｔａｌｅｋ　ｅｔ　ａｌ　（２０１７）　Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，　２２：　１７６１Ｍｕｋａｉ　（２０１７）　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　８２（２）：　２０７－２１５Ｂａｒｔｍａｎｓｋａ　（２００９）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃａｔａｌｙｓｉｓ　Ｂ：　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　６１：２２１－２２４

難溶性の成分の溶解性を高めるための方法として、乳化剤、分散剤等を使用する方法も知られている。しかしながら飲料によっては乳化剤や分散剤を使用できない場合や、飲料に乳化剤、分散剤等を使用すると、乳化剤や分散剤由来の意図しない風味が付与される場合がある。乳化剤、分散剤等を使用せずにイソキサントフモール等のプレニルフラボノイドの水溶性を向上させることができる技術は、例えば飲料等において有用である。

本発明は、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンに２個以上のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイド配糖体及びその製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンに１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを製造する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、プレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法、プレニルフラボノイドの苦味を低減する方法及びプレニルフラボノイドの安定性を向上させる方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、糸状菌であるリゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌により、イソキサントフモール及び８－プレニルナリンゲニンの７位にヘキソースを付加することができることを見出した。また、本発明者らは、イソキサントフモールの７位にヘキソースを付加する植物由来のＵＤＰ－糖転移酵素（ＵＧＴ）を見出した。そして、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌又はＵＧＴにより生成したイソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイド配糖体（プレニルフラボノイドモノグリコシド）のヘキソース残基にさらにヘキソースを付加して、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位に２個以上のヘキソースから構成される糖鎖が結合しているプレニルフラボノイド配糖体を製造することが可能であることを見出した。

また本発明者らは、イソキサントフモールの７位に２個以上のヘキソースから構成される糖鎖を付加することにより、イソキサントフモールの水溶性を向上させることができること、呈味（特に苦味）を改善できること、安定性を向上させることができることを見出した。イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位に２個以上のヘキソースから構成される糖鎖が結合したイソキサントフモール配糖体又は８－プレニルナリンゲニン配糖体は、これまで報告されていない。

すなわち、これに限定されるものではないが、本発明は以下のプレニルフラボノイド配糖体、その製造方法、プレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法、プレニルフラボノイドの苦味を低減する方法、プレニルフラボノイドの安定性を向上させる方法等に関する。
〔１〕下記一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体。

（一般式（１）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表し、Ｘはヘキソース残基を表し、ｎは、２～１０の整数を表す。２～１０個のヘキソース残基は、同じであってもよく、異なっていてもよい。）
〔２〕ヘキソースがグルコースである上記〔１〕に記載のプレニルフラボノイド配糖体。
〔３〕一般式（１）においてＲがメチル基を表す上記〔１〕又は〔２〕に記載のプレニルフラボノイド配糖体。
〔４〕上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のプレニルフラボノイド配糖体を含む組成物。
〔５〕飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料又は飼料である上記〔４〕に記載の組成物。
〔６〕容器詰飲料である上記〔４〕又は〔５〕に記載の組成物。
〔７〕上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のプレニルフラボノイド配糖体の製造方法であって、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を、下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養することにより、上記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ１）、及び、上記プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加する工程（Ｂ）を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法。

（一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）
〔８〕リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を、上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養することにより、上記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ１）を含む、プレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法。
〔９〕上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のプレニルフラボノイド配糖体の製造方法であって、下記（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースから、上記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ２）、及び、上記プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加する工程（Ｂ）を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法。
（ｐ１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｐ２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｐ３）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｑ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｑ２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｑ３）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
〔１０〕下記（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースから、上記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ２）を含む、プレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法。
（ｐ１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｐ２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｐ３）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｑ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｑ２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｑ３）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
〔１１〕上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、上記プレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法。
〔１２〕上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、上記プレニルフラボノイドの苦味を低減する方法。
〔１３〕上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、上記プレニルフラボノイドの安定性を向上させる方法。
〔１４〕ヘキソースがグルコースである上記〔７〕～〔１３〕のいずれかに記載の方法。

本発明によれば、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位に、２個以上のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイド配糖体及びその製造方法を提供することができる。本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、アグリコンであるプレニルフラボノイド及びこれに１個のヘキソースが付加したプレニルフラボノイドモノグリコシドと比較して、水への溶解性が向上している。本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、アグリコンであるプレニルフラボノイドと比較して苦味が低減されている。さらに、本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、プレニルフラボノイド及びそのモノグリコシドと比較して安定性が向上している。

また、本発明によれば、植物等に由来するＵＧＴ又は糸状菌のリゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を用いてイソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位にヘキソースを付加することで、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを製造する方法を提供することができる。上記プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基にさらにヘキソースを付加することによって、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位に、２個以上のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイド配糖体を製造することができる。リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌は、古くからアジアで食品加工に利用されており、例として中国の餅麹やインドネシアのテンペなどへの利用があげられる。このように、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌は長く飲食品の製造に使用されてきたことから、当該微生物を使用して得られるプレニルフラボノイド配糖体は、安全面において飲食品製造への利用に適しているといえる。

本発明によれば、イソキサントフモール等のプレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法、プレニルフラボノイドの苦味を低減する方法及びプレニルフラボノイドの安定性を向上させる方法を提供することができる。例えばイソキサントフモールの７位にヘキソースを２個以上付加することによって、乳化剤等を添加しなくても、イソキサントフモールの水溶性を向上させることができる。その結果、例えば水溶液の清澄度を高めることができる。また、イソキサントフモールの７位にヘキソースを２個以上付加することによって、イソキサントフモールの呈味（例えば苦味）を改善することや、安定性を向上させることが可能となる。従って本発明によれば、イソキサントフモール及び８－プレニルナリンゲニンの飲料適性を大きく改善することができる。

図１は、大腸菌に発現させたブドウ由来ＵＧＴ（ＶｖＧＴ６）を用いてＵＤＰ－グルコース及びイソキサントフモールを反応させた反応液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である（検出：２８０ｎｍ）。図２は、大腸菌に発現させたダイズ由来ＵＧＴ（Ｇｍ＿ＵＧＴ１）を用いてＵＤＰ－グルコース及びイソキサントフモールを反応させた反応液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である（検出：２８０ｎｍ）。図３は、大腸菌に発現させたダイズ由来ＵＧＴ（Ｇｍ＿ＵＧＴ１）による、ＵＤＰ－グルコース及びイソキサントフモールの反応生成物のＮＭＲ測定の結果を示す図である。図４Ａは、イソキサントフモールを添加して培養を行ったＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）　ＩＡＭ６０４９の培養上清のＨＰＬＣ分析結果を示す。図４Ｂは、イソキサントフモールを添加せずに培養を行ったＲ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９の培養上清（比較用分析サンプル）のＨＰＬＣ分析結果を示す。図５Ａは、リゾパス属に属する菌に、イソキサントフモールを添加して培養を行った培養上清中のイソキサントフモール（ＩＸ）及びイソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）の分析結果を示す。図５Ｂは、リゾパス属に属する菌に、イソキサントフモールを添加して培養を行った際の、菌体中のイソキサントフモール（ＩＸ）及びイソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）の分析結果を示す。図６Ａは、８－プレニルナリンゲニン（８－ＰＮ）を添加し、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９を添加しなかったＰＤ培地上清のＨＰＬＣ分析結果である。図６Ｂは、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９を８－プレニルナリンゲニンを添加した培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果である。図７Ａは、イソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）に、ＣＧＴａｓｅ及びクラスターデキストリンを添加した反応液（反応時間０時間）のＨＰＬＣ分析結果である。図７Ｂは、ＩＸＧにＣＧＴａｓｅ及びクラスターデキストリンを添加して２時間反応を行った反応液のＨＰＬＣ分析結果である（いずれも検出：２８０ｎｍ）。図８Ａは、イソキサントフモール（ＩＸ）に３個のグルコースが付加したＩＸ配糖体のＭＳスペクトルである。図８Ｂは、ＩＸに２個のグルコースが結合したＩＸ配糖体のＭＳスペクトルである。図８Ｃは、ＩＸモノグルコシドのＭＳスペクトルである。図９は、イソキサントフモール（ＩＸ）、イソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）及びＩＸにグルコースが平均２個程度付加したイソキサントフモール配糖体（ＩＸＧｓ）が水３５０ｍＬに溶ける量（ＩＸ換算）を調べた結果を示すグラフである。図１０は、イソキサントフモール（ＩＸ）、イソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）又はＩＸにグルコースが平均２個程度付加したイソキサントフモール配糖体（ＩＸＧｓ）を、ＩＸ換算で４５ｍｇ、３５０ｍＬの水に溶解させたサンプルの写真である。図１１は、イソキサントフモール（ＩＸ）、イソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）又はＩＸにグルコースが平均２個程度付加したイソキサントフモール配糖体（ＩＸＧｓ）を、水又はマルトエキスに添加して苦味のマスク効果を評価した結果を示すグラフである。図１２Ａは、イソキサントフモール（ＩＸ）を、ｐＨ３、４５℃の条件で保管した際の残存率を示すグラフである。図１２Ｂは、イソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）を、ｐＨ３、４５℃の条件で保管した際の残存率を示すグラフである。図１２Ｃは、ＩＸにグルコースが平均２個程度付加したイソキサントフモール配糖体（ＩＸＧｓ）を、ｐＨ３、４５℃の条件で保管した際の残存率を示すグラフである。

＜プレニルフラボノイド配糖体＞
本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、下記一般式（１）で表される化合物である。

（一般式（１）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表し、Ｘはヘキソース残基を表し、ｎは、２～１０の整数を表す。２～１０個のヘキソース残基は、同じであってもよく、異なっていてもよい。）
本発明においては、一般式（１）においてＲがメチル基を表すことが好ましい。一般式（１）において、Ｒがメチル基である場合、上記プレニルフラボノイド配糖体は、イソキサントフモール配糖体である。一般式（１）においてＲが水素原子である場合、上記プレニルフラボノイド配糖体は、８－プレニルナリンゲニン配糖体である。本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、好ましくはイソキサントフモール配糖体である。

一般式（１）において、Ｘはヘキソース残基を表す。（Ｘ）ｎは、２～１０個のヘキソース残基から構成される糖鎖を表す。糖鎖を構成する２～１０個のヘキソース残基は、全て同じであってもよく、異なっていてもよい。換言すると、（Ｘ）ｎで表される糖鎖は、１種のヘキソースから構成されるものであってよく、２種以上のヘキソースから構成されるものであってもよい。
ヘキソースとして、グルコース、ガラクトース、ラムノース、フルクトース等が挙げられる。中でも、ヘキソースとして、グルコース、ガラクトースが好ましく、グルコースがより好ましい。本発明におけるヘキソースには、グルクロン酸は含まれない。本明細書中、ヘキソースは、好ましくはＤ体である。ヘキソースとして、Ｄ－グルコース、Ｄ－ガラクトースが好ましく、Ｄ－グルコースがより好ましい。

一般式（１）において、ｎは、好ましくは２～７である。（Ｘ）ｎは、２～７個のヘキソースから構成される糖鎖であることが好ましい。
本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を有し、プレニルフラボノイドポリグリコシドということもできる。
一態様において、（Ｘ）ｎにおいて、プレニルフラボノイドに結合している１個目のヘキソースはグルコース又はガラクトースであることが好ましく、グルコースであることがより好ましい。（Ｘ）ｎにおいて、プレニルフラボノイドに結合している２～１０個目のヘキソースとして、グルコースが好ましい。

本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位に、２～１０個（好ましくは２～７個）のヘキソース（ヘキソース残基）から構成される糖鎖がＯ－グリコシド結合しているイソキサントフモール配糖体又は８－プレニルナリンゲニン配糖体である。本発明の配糖体において、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンは、７位（の水酸基）において、ヘキソースの１位の水酸基とＯ－グリコシド結合している。グリコシド結合は、α結合であってもよく、β結合であってもよい。好ましくはβ結合である。糖鎖において、ヘキソース同士の結合様式は特に限定されず、αグリコシド結合であってもよく、βグリコシド結合であってもよい。一態様において、糖鎖を構成するヘキソース同士はα１，４グリコシド結合していることが好ましい。

本発明の一態様において、プレニルフラボノイド配糖体として、イソキサントフモールの７位に、２～１０個（好ましくは２～７個）のグルコース（グルコース残基）から構成される糖鎖が結合しているイソキサントフモール配糖体（イソキサントフモールポリグルコシド（ｉｓｏｘａｎｔｈｏｈｕｍｏｌ　ｐｏｌｙｇｌｕｃｏｓｉｄｅ））が好ましい。また一態様において、本発明のプレニルフラボノイド配糖体として、８－プレニルナリンゲニンの７位に２～１０個（好ましくは２～７個）のグルコース（グルコース残基）から構成される糖鎖が結合している８－プレニルナリンゲニンポリグルコシドが好ましい。

本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、アグリコン（イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニン）及びそれに１個のヘキソースが結合したプレニルナリンゲニンモノグリコシドと比較して、水溶性が大きく向上している。
本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、水への溶解性に優れるため、飲料等の液状の飲食品等に高濃度で含有させることができる。また本発明のプレニルフラボノイド配糖体の水溶液は、清澄度が高いものとなる。イソキサントフモール等のプレニルフラボノイドの水溶性を高めるために、これまで乳化剤や分散剤等が使用されてきたが、本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、乳化剤等を使用せずに水に高濃度で溶解させることが可能である。
本発明のプレニルフラボノイド配糖体では、アグリコンであるプレニルフラボノイドが呈する苦味が効果的に低減されている。さらに、本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、アグリコンであるプレニルフラボノイド及びそのモノグリコシドよりも、優れた安定性を示す。このため本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、保管中等に分解等が起こりにくいと考えられる。

本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等の成分として使用することができる。本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、単独で、又は、当該配糖体以外の成分を配合して組成物の形態として、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等として使用することができる。

本発明のプレニルフラボノイド配糖体（プレニルフラボノイドポリグリコシド）を含む組成物も、本発明の１つである。本発明の組成物は、上記一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体を含む。上記プレニルフラボノイド配糖体は、１種使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明の組成物は、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等であってよい。本発明の組成物は、上記プレニルフラボノイド配糖体に加えて、任意の添加剤、任意の成分を含有することができる。これらの添加剤及び成分は、組成物の形態等に応じて選択することができ、一般的に飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等に使用可能なものが使用できる。本発明の組成物は、水を含んでいてもよい。

本発明の組成物を飲食品とする場合、上記プレニルフラボノイド配糖体に、飲食品に使用可能な成分（例えば、食品素材、必要に応じて使用される食品添加物等）を配合して、種々の飲食品とすることができる。飲食品は特に限定されず、例えば、一般的な飲食品、健康食品、健康飲料、機能性表示食品、特定保健用食品、健康補助食品、病者用飲食品等が挙げられる。飲食品には、食品添加物も含まれる。上記健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、健康補助食品等は、例えば、細粒剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、チュアブル剤、ドライシロップ剤、シロップ剤、液剤、飲料、流動食等の各種製剤形態であってよい。

上記のように、本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、優れた水溶性を示し、イソキサントフモール等のアグリコンよりも苦味が抑制されている。また、本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、安定性に優れている。このため本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、飲料適性に優れるものである。一態様において、本発明の組成物は、液体組成物であることが好ましく、飲料であることがより好ましい。飲料の形態は特に限定されず、容器詰飲料とすることができる。容器詰飲料の容器は特に限定されず、いずれの形態及び材質の容器を用いてもよく、例えば、アルミ缶、スチール缶等の金属製容器；ペットボトル等の樹脂製容器；紙パック等の紙容器；ガラス瓶等のガラス製容器；樽等の木製容器等の通常用いられる容器のいずれも用いることができる。このような容器に飲料を充填及び密閉することにより、容器詰飲料が得られる。

本発明の組成物を医薬品又は医薬部外品とする場合、例えば、上記プレニルフラボノイド配糖体に、薬理学的に許容される担体、必要に応じて添加される添加剤等を配合して、各種剤形の医薬品又は医薬部外品とすることができる。そのような担体、添加剤等は、医薬品又は医薬部外品に使用可能な、薬理学的に許容されるものであればよい。医薬品又は医薬部外品の投与形態としては、経口又は非経口投与の形態が挙げられ、好ましくは経口投与の形態である。経口投与のための剤形としては、例えば、液剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、糖衣錠、カプセル剤、懸濁液、乳剤、チュアブル剤等が挙げられる。非経口投与のための剤型としては、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏剤、ローション剤、貼付剤、坐剤、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）等が挙げられる。医薬品は、非ヒト動物用医薬であってもよい。

本発明の組成物を化粧料とする場合、プレニルフラボノイド配糖体に、化粧料に許容される担体、添加剤等を配合することができる。化粧料の製品形態は特に限定されない。
本発明の組成物を飼料とする場合には、プレニルフラボノイド配糖体を飼料に配合すればよい。飼料には飼料添加剤も含まれる。

本発明のプレニルフラボノイド配糖体の含有量は特に限定されず、例えば、組成物中にアグリコンであるプレニルフラボノイド換算で、０．０００１～４８重量％とすることができる。一態様において、飲料の場合は、本発明のプレニルフラボノイド配糖体の含有量は、プレニルフラボノイド（アグリコン）換算で、例えば、０．０００１～１重量％としてよい。プレニルフラボノイド配糖体の含有量は、プレニルフラボノイド配糖体の総含有量である。一態様において、本発明の組成物は、一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体として、イソキサントフモール配糖体を、イソキサントフモール換算で上記の量含有することが好ましい。
本発明のプレニルフラボノイド配糖体を含む組成物を、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等とする場合、その製造方法は特に限定されず、一般的な方法により製造することができる。例えば、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料又は飼料の製造において、本発明のプレニルフラボノイド配糖体を配合する工程を含む製造方法によって、プレニルフラボノイド配糖体を含む飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料又は飼料を製造することができる。

＜プレニルフラボノイド配糖体の製造方法＞
上記一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体は、例えば、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を、下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養することにより、上記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ１）、及び、上記プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加する工程（Ｂ）を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法により製造することができる。

（一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）
上記工程（Ａ１）及び工程（Ｂ）を含む、上記一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体の製造方法も本発明の１つである。上記工程（Ａ１）及び工程（Ｂ）を含む、一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体の製造方法を、本発明の第一の態様の製造方法ともいう。一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体は、上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に２～１０個のヘキソース（ヘキソース残基）から構成される糖鎖が結合している化合物である。
本発明の第一の態様の製造方法は、所望により工程（Ａ１）及び工程（Ｂ）以外の工程を有してもよい。

一般式（２）において、Ｒがメチル基である化合物は、イソキサントフモールであり、Ｒが水素原子である化合物は、８－プレニルナリンゲニンである。Ｒは好ましくはメチル基である。工程（Ａ１）では、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌をイソキサントフモール及びヘキソース源の存在下で培養することにより、イソキサントフモールの７位に１個のヘキソース（ヘキソース残基）が結合しているイソキサントフモールモノグリコシドを生成させることが好ましい。

リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養することにより、当該菌によりプレニルフラボノイドの７位にヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させることができる。工程（Ａ１）においては、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を上記プレニルフラボノイド及びヘキソース源を含む培地で培養すればよい。培地は、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を培養可能な培地を用いることができる。培地は、好ましくは液体培地である。
ヘキソースとして、上記のヘキソースが挙げられる。ヘキソースは１種又は２種以上であってよいが、好ましくはグルコース、ガラクトースであり、より好ましくはグルコースである。

リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌としては、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養した場合に、該プレニルフラボノイド（好ましくはイソキサントフモール）の７位にヘキソース（好ましくはグルコース）を付加する（グリコシド結合させる）ことができる菌であればよく特に制限されない。リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌は、野生株であってよく、ＵＶ照射、ＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。

リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌として、例えば、リゾパス・ミクロポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）（例えば、ＩＦＯ３１９８８）、リゾパス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）（例えば、ＩＦＯ８６３１、ＩＦＯ３１９８７、ＩＦＯ３２００２、ＩＦＯ３２００３）、リゾパス・シネンシス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）（例えば、ＩＦＯ４７６８、ＩＦＯ３０４９９、ＩＦＯ４７３７）、リゾパス・デレマル（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ）（例えば、ＩＡＭ６０３８、ＩＡＭ６２５２、ＡＴＣＣ３４６１２）、リゾパス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）（例えば、ＩＡＭ６００６、ＩＡＭ６０１０、ＩＡＭ６０２２、ＩＡＭ６０３６、ＩＡＭ６０４９、ＩＡＭ６０６１、ＩＡＭ６０６７、ＩＡＭ６２５６、ＮＲＲＬ３９５）、リゾパス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｖｅｕｓ）（例えば、ＳＡＭ５４３）等が好ましい。中でも、リゾパス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、リゾパス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）等が好ましい。

工程（Ａ１）における培養の条件等は、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源を含む培地を使用する以外は、特に限定されず、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を培養する際に使用される培養条件で行うことができる。
工程（Ａ１）において、培地中のプレニルフラボノイドの濃度は特に限定されず、例えば、１ｍｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌであってよい。一態様において、プレニルフラボノイドの濃度は、培養開始時に上記濃度であればよい。プレニルフラボノイドは、培地に一度に添加してもよく、培養中に複数回に分けて培地に添加してもよい。プレニルフラボノイドは、例えば、エタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の溶媒に溶解させて培地に添加することができる。

工程（Ａ１）における培養は、プレニルフラボノイド配糖体のヘキソース残基の供給源となるヘキソース源の存在下で行う。ヘキソース源として、ヘキソース、ヘキソース供給源となるヘキソース単位を含む炭素源を使用することができる。ヘキソース源は１種使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明においては、ヘキソース源として、ヘキソース及び／又はヘキソース単位を含む炭素源を使用することができる。好ましいヘキソース源として、グルコース源、ガラクトース源が挙げられ、グルコース源がより好ましい。
工程（Ａ１）においては、培地にヘキソースを添加してもよく、ヘキソース供給源となるヘキソース単位を含む炭素源を添加してもよい。このようなヘキソース源として使用できる炭素源として、スクロース、ラクトース、デキストリン、シクロデキストリン（α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン）、アミロース、アミロペクチン、デンプン等が挙げられる。
ヘキソース源は、プレニルフラボノイド配糖体のヘキソース残基に応じて選択することができる。一態様において、７位にグルコースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシド（プレニルフラボノイドモノグルコシド）を生成させる場合は、グルコース源を用いることができる。グルコース源として、グルコース、グルコース単位を含む炭素源（例えば、スクロース、ラクトース、デキストリン、シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン）が挙げられる。グルコース源は１種又は２種以上を用いることができる。一態様において、ヘキソース源はヘキソースを含むことが好ましく、グルコースを含むことがより好ましい。
培地中のヘキソース源の濃度は、０．１～２０重量％が好ましく、０．２～１０重量％がより好ましい。一態様において、ヘキソース源の濃度は、培養開始時に上記濃度であればよい。ヘキソース源は、培地に一度に添加してもよく、培養中に複数回に分けて添加してもよい。

培地には、必要に応じて、窒素源（例えば、各種ペプトン（ポテトペプトン等）、各種エキス、硫酸アンモニウム、尿素等）、無機質（リン酸水素二カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、鉄、マンガン、モリブデン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等）等を添加してもよい。
本発明の第一の態様の製造方法において、培地として、例えば、ポテトデキストロース培地（ＰＤ培地）等を使用することができる。

リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌の培地ヘの添加方法は、培地に直接少量の菌体を接種することで増殖させることができるが、当該菌の胞子懸濁液を接種することが好ましい。胞子懸濁液は、通常行われる方法で調製すればよい。一態様において、後記の実施例に記載の方法で胞子懸濁液を調製することもできる。本発明の第一の態様の製造方法は、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌の胞子懸濁液を調製する工程を有していてもよい。
工程（Ａ１）においてリゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌の培養時間は、例えば、０．５～１２０時間とすることができる。

培養は、液体培地中で好気培養することが好ましい。好気培養を行う方法は特に限定されず、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を接種した液体培地を、例えば、振盪培養又は攪拌培養すればよい。また、所望により滅菌された空気又は酸素でバブリングを行ってもよい。また、培養形式は、回分培養、流加培養、連続培養のいずれでもよいが、回分培養が好ましい。本発明の製造方法においては、静置培養を行ってもよい。

本発明の第一の態様の製造方法では、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を担体に固定化した固定化菌体を使用することもできる。固定化菌体の調製方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。一例として、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌の胞子を、アルギン酸ナトリウム水溶液に添加して攪拌して懸濁したものを、塩化カルシウム溶液に滴下することで、上記胞子が固定化されたビーズ状のゲルを得ることができる。このビーズ状のゲルを、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を培養する際に使用される培地及び培養条件で培養することによって、固定化菌体を得ることができる。一態様においては、工程（Ａ１）において、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌の固定化菌体を、上記の一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源を含む培地で培養してもよい。

工程（Ａ１）において、上記の培養を行うことにより、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドが生成し、培地中に蓄積する。

本発明の第一の態様の製造方法は、工程（Ａ１）を行った後、菌体と、プレニルフラボノイドモノグリコシドを含む培養上清とを分離する工程（Ｃ）を行ってもよいが、行わなくてもよい。工程（Ｃ）を行う場合は、菌体と培養上清とを分離する方法は特に限定されず、遠心分離、ろ過等の方法を採用することができる。工程（Ａ１）を行った後、プレニルフラボノイドモノグリコシド及びリゾパス属に属する菌を含む培地をそのまま用いて、工程（Ｂ）を行うこともできる。

本発明は、下記工程（Ａ２）及び工程（Ｂ）を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法も包含する。
上記一般式（１）で表されるプレニルフラボノイドの製造方法であって、下記（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースから、上記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ２）、及び、上記プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加する工程（Ｂ）を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法。
（ｐ１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｐ２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｐ３）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｑ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｑ２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｑ３）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
上記のタンパク質を使用するプレニルフラボノイド配糖体の製造方法を、本発明の第二の態様の製造方法ともいう。本発明の第二の態様の製造方法によっても、一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体を製造することができる。

本発明の第二の態様の製造方法において、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド、その好ましい態様等は、上述した本発明の第一の態様の製造方法と同じである。一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドは、好ましくはイソキサントフモールである。
ＵＤＰ－ヘキソースにおけるヘキソースとして、グルコース、ガラクトース、ラムノース、フルクトース等が挙げられ、好ましくはグルコース、ガラクトースであり、より好ましくはグルコースである。ヘキソースは、グルクロン酸以外のヘキソースである。ＵＤＰ－ヘキソースは、好ましくはＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－ガラクトースであり、より好ましくはＵＤＰ－グルコースである。

本発明の第二の態様の製造方法では、上記の（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質を触媒として、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースからプレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる（工程（Ａ２））。
上記の（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）のタンパク質は、ＵＤＰ－糖転移酵素（ＵＧＴ）であり、ＵＤＰ－ヘキソース（糖供与体）からプレニルフラボノイド（糖受容体基質）にヘキソース残基を転移し、プレニルフラボノイドモノグリコシドを生じる反応を触媒する。これらのタンパク質は、通常、プレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加（転移）する。より詳細には、プレニルフラボノイドの７位の水酸基と、ヘキソースの１位の水酸基とを結合させる。（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）のタンパク質を、以下ではＵＧＴタンパク質ともいう。

配列番号１に示すアミノ酸配列は、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）由来のＵＤＰ－糖転移酵素であるイソフラボン７－Ｏ－グルコース転移酵素のアミノ酸配列である。配列番号２に示すアミノ酸配列は、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）由来のＵＤＰ－糖転移酵素である、フラボノイドＵＤＰ－糖転移酵素（ＶｖＧＴ６）のアミノ酸配列である。これらのＵＤＰ－糖転移酵素が、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位にヘキソースを付加する活性を有することは、これまで報告されていない。

上記（ｐ２）及び（ｑ２）のタンパク質における、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸の数は、好ましくは１～８個、１～７個又は１～６個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、特に好ましくは１～３個、特に好ましくは１又は２個、最も好ましくは１個である。

本明細書中、タンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じていてもよい。

上記（ｐ３）のタンパク質において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の同一性（配列同一性）は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上又は９４％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上又は９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。上記（ｑ３）のタンパク質において、配列番号２に示すアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の同一性は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上又は９４％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上又は９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
アミノ酸配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出することができる。

工程（Ａ２）において、好ましくは、（ｐ１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質及び／又は（ｑ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を用いる。工程（Ａ２）において、（ｐ１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質又は（ｑ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることも好ましい。

上記の（ｐ１）～（ｐ３）及び（ｑ１）～（ｑ３）のタンパク質は、その由来や製造方法に制限されない。例えば、公知の遺伝子工学的手法によって、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを微生物等の非ヒト宿主に導入して、得られる形質転換体を培養して当該タンパク質を発現させて製造することができる。より具体的には、形質転換体を培養した培養物から、タンパク質を精製することにより、所望のタンパク質を得ることができる。タンパク質の精製は通常の方法に従って行うことができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
（ｐ１）～（ｐ３）及び（ｑ１）～（ｑ３）のタンパク質は、プレニルフラボノイド（好ましくはイソキサントフモール）の７位にヘキソース（好ましくはグルコース）を付加する活性を有するものであれば、その精製度も特に制限されない。本発明の効果を奏することになる限り、上記の培養物や、タンパク質の粗精製物を使用することもできる。培養物は、培養液、培養菌体又は培養細胞、培養菌体又は培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。

具体的には、ＵＧＴタンパク質が培養菌体内又は培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体又は細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）によりタンパク質の粗抽出液を得ることができる。上記タンパク質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体又は細胞と培養上清とを分離することにより、所望のタンパク質を含む培養上清を得ることができる。
このようにして得られた抽出液又は培養上清中に含まれるタンパク質の精製は、通常の分離又は精製方法に従って行うことができる。分離又は精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。

また、ＵＧＴタンパク質は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。

工程（Ａ２）においては、上記のＵＧＴタンパク質を触媒として、プレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースを反応させて、プレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させることができる。
上記の反応は、好ましくは液（反応液）中、例えば水、緩衝液等の水性媒体中で行うことが好ましい。反応液のｐＨは、例えば、７～８とすることができ、好ましくは７．２～７．７である。反応温度は、２５～４０℃とすることができ、好ましくは３０～３７℃である。反応時間は適宜設定すればよい。ｐＨは、２５℃におけるｐＨである。ｐＨは市販のｐＨメーターで測定することができる。

反応液中のプレニルフラボノイドの初期濃度は、例えば、０．１～５０ｍＭであってよい。プレニルフラボノイドは、例えば、エタノール、ＤＭＦ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の溶媒に溶解させて反応液に添加することができる。

反応開始時の反応液中のＵＤＰ－ヘキソースの濃度（初期濃度）は、プレニルフラボノイドに対して、モル比で５～２０倍であることが好ましく、５～１５倍であることがより好ましい。

工程（Ａ１）又は工程（Ａ２）により、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソース（ヘキソース残基）が結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドが生成する。プレニルフラボノイドモノグリコシドは、通常、プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースがＯ－グリコシド結合しているプレニルフラボノイド配糖体である。

本発明の第一の態様の製造方法及び第二の態様の製造方法においては、工程（Ａ１）又は工程（Ａ２）で生成したプレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加する（工程（Ｂ））。
工程（Ｂ）において、プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加する方法は特に限定されず、糖転移活性を有する酵素を触媒として、プレニルフラボノイドモノグリコシドにヘキソースを付加することができる。一態様において、工程（Ｂ）においては、糖転移活性を有する酵素により、プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加することが好ましい。糖転移活性を有する酵素として、シクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）、デキストリナーゼ、アミラーゼ、α－グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ等を使用することができる。糖転移活性を有する酵素は、１種使用してもよく、２種以上を組合わせて使用してもよい。一態様においては、ＣＧＴアーゼを使用することが好ましい。ヘキソースとして、上記と同じものが挙げられ、グルコース、ガラクトース等が好ましく、より好ましくはグルコースである。

工程（Ｂ）における反応は、液（反応液）中で行うことができ、例えば水、緩衝液等の水性媒体中で行うことが好ましい。反応条件は、使用する酵素に応じて適宜設定することができる。例えば、反応液のｐＨは、５～７が好ましく、５．５～６．７５がより好ましい。工程（Ｂ）における反応温度は、４０～６０℃であってよく、４５～５５℃が好ましい。反応時間は適宜設定すればよいが、例えば、１～１０時間とすることができ、好ましくは１．５～７時間、より好ましくは２～７時間、さらに好ましくは３～５時間とすることができる。
上記反応液は、プレニルフラボノイド配糖体のヘキソース残基の供給源となるヘキソース源を通常含む。ヘキソース源として、ヘキソース、ヘキソース供給源となる糖源が挙げられる。ヘキソース源は１種であってもよく、２種以上であってもよい。
反応液には、グルコース等のヘキソースを添加してもよいが、ヘキソースの供給源となる糖源を使用することもできる。ヘキソース源は、ヘキソースの種類に応じて選択することができる。例えばグルコース源として、グルコース、シクロデキストリン、デキストリン（クラスターデキストリン等）、デンプン等が挙げられる。反応液に添加するヘキソース源の量は、反応液中のプレニルフラボノイドモノグリコシドに対して、例えば、モル比で１０～１０００倍が好ましい。一態様においては、反応液中の反応開始時のヘキソース源の量が、プレニルフラボノイドモノグリコシドに対してモル比で１０～１０００倍であることが好ましい。

工程（Ａ１）により製造されるプレニルフラボノイドモノグリコシドは、上記の培地から、公知の方法で精製して工程（Ｂ）に供してもよいが、精製を行わずに、工程（Ａ１）及び工程（Ｂ）を連続して行ってもよい。例えば、工程（Ａ１）で得られるプレニルフラボノイドモノグリコシド及びリゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を含む培養液に、糖転移活性を有する酵素及び必要に応じてヘキソース源を添加して工程（Ｂ）を行うこともできる。また、工程（Ａ１）で得られるプレニルフラボノイドモノグリコシドを含む培養液を濃縮した後、得られる濃縮液に糖転移活性を有する酵素及び必要に応じてヘキソース源を添加して工程（Ｂ）を行ってもよい。工程（Ｂ）の前に、プレニルフラボノイドモノグリコシドを含む培養液又は培養液の濃縮液のｐＨを、工程（Ｂ）で使用する酵素に適したｐＨに調整することが好ましい。

工程（Ａ２）により製造されるプレニルフラボノイドモノグリコシドは、上記の反応液から、公知の方法で精製して工程（Ｂ）に供してもよいが、精製を行わずに、工程（Ａ２）及び工程（Ｂ）を連続して行ってもよい。工程（Ａ２）で得られるプレニルフラボノイドモノグリコシド及び上記ＵＧＴタンパク質を含む反応液に、工程（Ｂ）で使用される糖転移活性を有する酵素及び必要に応じてヘキソース源を添加して工程（Ｂ）を行うこともできる。工程（Ａ２）で得られるプレニルフラボノイドモノグリコシドを含む反応液を濃縮した後、得られる濃縮液に糖転移活性を有する酵素及び必要に応じてヘキソース源を添加して工程（Ｂ）を行ってもよい。工程（Ｂ）の前に、プレニルフラボノイドモノグリコシドを含む反応液又は反応液の濃縮液のｐＨを、工程（Ｂ）で使用する酵素に適したｐＨに調整することが好ましい。
工程（Ｂ）で使用するヘキソース源は酵素に応じて選択すればよい。一態様においては、グルコース源として、クラスターデキストリン等のデキストリンを使用することが好ましい。ＣＧＴアーゼを使用してグルコースを付加する場合は、クラスターデキストリン等のデキストリン、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン等のシクロデキストリン、可溶性デンプン等のグルコース源が好ましい。グルコース源は１種使用してもよく２種以上を使用してもよい。

上記工程（Ｂ）により、反応液中には、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２個以上、通常２～１０個（好ましくは２～７個）のヘキソース（ヘキソース残基）から構成される糖鎖が結合しているプレニルフラボノイド配糖体が生成する。工程（Ａ１）又は工程（Ａ２）、及び、工程（Ｂ）を行うことにより、一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体を製造することができる。
生成したプレニルフラボノイド配糖体は、溶液から公知の方法により分離又は精製することができる。具体的には、例えば、合成吸着剤による分離、逆相クロマトグラフィーによる分離、溶解度の変化を利用した析出等を単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。本発明の第一の態様の製造方法及び第二の態様のプレニルフラボノイド配糖体の製造方法は、一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体を精製する工程（Ｄ）を含んでいてもよい。

所望の配糖体が得られたことは、公知の方法（例えば、質量分析、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等）で確認することができる。
本発明の製造方法で得られるプレニルフラボノイド配糖体は、１種であってもよく、アグリコン、糖鎖を構成するヘキソースの種類及び／又は数が異なる２種以上の配糖体の混合物であってもよい。
このように得られたプレニルフラボノイド配糖体は、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等の原料等として有用である。

本発明は、以下のプレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法も包含する。
リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を、上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養することにより、上記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ１）を含む、プレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法。
上記のリゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を使用するプレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法を、本発明の第三の態様の製造方法ともいう。
上記（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースから、上記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ２）を含む、プレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法。
上記のタンパク質及びＵＤＰ－ヘキソースを使用するプレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法を、本発明の第四の態様の製造方法ともいう。
本発明の第三の態様の製造方法及び第四の態様の製造方法において、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドは、上記と同じである。
本発明の第三の製造方法において、工程（Ａ１）及びその好ましい態様は、上述した本発明の第一の態様の製造方法における、工程（Ａ１）及びその好ましい態様と同じである。
本発明の第四の態様の製造方法において、工程（Ａ２）及びその好ましい態様は、本発明の第二の態様の製造方法における、工程（Ａ２）及びその好ましい態様と同じである。

本発明の第三の態様の製造方法及び第四の態様の製造方法において、上記工程（Ａ１）又は（Ａ２）で生成したプレニルフラボノイドモノグリコシドは、培養液又は溶液から公知の方法により分離又は精製することができる。具体的には、例えば、合成吸着剤による分離、逆相クロマトグラフィーによる分離、溶解度の変化を利用した析出等を単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。本発明の第三の態様の製造方法及び第四の態様の製造方法は、生成したプレニルフラボノイドモノグリコシドを精製する工程（Ｃ）を含んでいてもよい。
所望の配糖体が得られたことは、既知のイソキサントフモールモノグリコシド又は８－プレニルナリンゲニンモノグリコシドの構造情報に基づいて、公知の方法（例えば、質量分析、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等）で確認することができる。

本発明の第三の態様の製造方法及び第四の態様の製造方法で得られるプレニルフラボノイドモノグリコシドは、イソキサントフモールの７位にヘキソース（好ましくはグルコース）が１個結合しているイソキサントフモールモノグリコシド及び／又は８－プレニルナリンゲニンの７位にヘキソース（好ましくはグルコース）が１個結合している８－プレニルナリンゲニンモノグリコシドである。プレニルフラボノイドモノグリコシドは、例えば、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等の原料として使用することができる。また、プレニルフラボノイドポリグリコシドの原料等として使用することができる。

本発明の第一の態様の製造方法、第二の態様の製造方法、第三の態様の製造方法及び第四の態様の製造方法で使用される一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドは、その製造方法等に何ら制限されない。イソキサントフモールは、例えば、ホップ抽出物から加熱等のプロセスを経て調製することができる。ホップ抽出物を加熱することにより、該抽出物中にイソキサントフモールを生成させることができる。ホップ抽出物は、通常、ホップの毬花を溶媒で抽出し、必要に応じて精製に係るプロセスを介して調製され、公知のホップ抽出物の調製方法により得ることができる。抽出方法として、例えば、ビール醸造に用いられるホップ抽出物の調製法として用いられる、エタノール溶媒による抽出法が挙げられる。ホップ抽出物は市販されており、市販のホップ抽出物を使用することもできる。イソキサントフモールを生成させるためのホップ抽出物の加熱は、８０～１４０℃（より好ましくは８５～１００℃）で１５分～５時間（より好ましくは２０分～３時間）行うことが好ましい。イソキサントフモールを調製するためのホップ抽出物の精製は、公知の方法で実施される。精製方法として、例えば、ＨＰＬＣや吸着カラム等の使用や、溶解度の変化を利用した析出などの方法が挙げられる。また、イソキサントフモールは、キサントフモールを加熱することによって製造することもできる。この際の加熱温度は、好ましくは８０～１４０℃（より好ましくは８５～１００℃）で１５分～５時間（より好ましくは２０分～３時間）を採用することができる。異性化処理により得られたイソキサントフモールは、必要に応じて、公知の方法（例えば、ろ過、減圧濃縮、凍結乾燥等）により濃縮したり、精製したりすることができる。イソキサントフモールは、市販品を使用することもできる。

８－プレニルナリンゲニンは、その製造方法等に何ら制限されない。８－プレニルナリンゲニンは、ホップ等に含まれるプレニルフラボノイドの一種である。８－プレニルナリンゲニンは、例えば、ホップ抽出物から公知の方法で精製して調製することができる。８－プレニルナリンゲニンは、市販品を使用することもできる。
本発明においては、本発明の効果を奏することになる限り、精製されたイソキサントフモール及び／又は８－プレニルナリンゲニンを使用してもよく、イソキサントフモール及び／又は８－プレニルナリンゲニンを豊富に含む植物由来原料等を使用してもよい。

＜プレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法、苦味を低減する方法及び安定性を向上させる方法＞
上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソース（ヘキソース残基）から構成される糖鎖を付加することにより、該プレニルフラボノイドの極性を変えることができる。このため、上記プレニルフラボノイドの水溶性を向上させることができる。また、上記糖鎖を付加することにより、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの苦味を低減することができる。さらに、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの安定性を向上させることができる
本発明は、上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、上記プレニルフラボノイドの溶解性を向上させる方法；上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、上記プレニルフラボノイドの苦味を低減する方法；上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、上記プレニルフラボノイドの安定性を向上させる方法、も包含する。上記方法においては、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖をＯ－グリコシド結合させる。

一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する方法としては、上記の本発明の第一の態様の製造方法又は第二の態様の製造方法における方法と同じ方法を採用することができる。上記工程（Ａ１）又は（Ａ２）により、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースがＯ－グリコシド結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させて、当該プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加することにより、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加することができる。
なお、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全ては、参照として本明細書に組み入れられる。

以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。尚、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　２００１）に記載の方法に従った。

＜実施例１＞
植物酵素によるイソキサントフモール（以下、ＩＸとも記載する）のグルコシル化反応によるイソキサントフモール配糖体の生産

（ＵＧＴについて）
植物においては特定のフラボノイドの位置特異的にＵＤＰ（ウリジン二リン酸）糖をドナーとして糖を転移する活性を有するＵＤＰ糖転移酵素（ＵＧＴ）遺伝子がゲノム中に１００を超える多重コピーとして存在しており、多くは低分子有機化合物の配糖体化に関わっていると考えられている。しかしながら前述のようにこれまでにプレニルフラボノイドに対して配糖化活性のある植物ＵＧＴは同定されていないために、配列から候補遺伝子の推定をすることはできなかった。

（植物ＵＧＴの選定）
そこで、既報のフラボノイドＵＧＴの位置特異性の情報に基づいて、フラボノイドの７位を配糖体化できるＵＧＴとしてダイズ由来のＧｍ＿ＵＧＴ１／ＩＦ７ＧｌｃＴ／ＵＧＴ８８Ｅ３（参考文献１：Ｎｏｇｕｃｈｉ　Ａ　ｅｔ　ａｌ　（２００７）　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２８２（３２）：２３５８１－２３５９０及び参考文献２：Ｆｕｎａｋｉ　Ａ　ｅｔ　ａｌ　（２０１５）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　５６（８）：１５１２－１５２０）と、フラボノイド３位に特異性のあるＵＧＴであるブドウのフラボノイド３位グルコース・ガラクトース転移酵素ＶｖＧＴ６（参考文献３：Ｏｎｏ　Ｅ　ｅｔ　ａｌ　（２０１０）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　２２（８）：２８５６－２８７１）について、ＩＸへの反応性を検討した。
ダイズ由来のＵＧＴであるＧｍ＿ＵＧＴ１／ＩＦ７ＧｌｃＴ／ＵＧＴ８８Ｅ３（Ｇｍ＿ＵＧＴ１ともいう）（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＡＢ２９２１６４）のアミノ酸配列を、配列番号１に示す。ブドウ由来のＵＧＴであるＶｖＧＴ６（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＡＢ４９９０７５）のアミノ酸配列を、配列番号２に示す。Ｇｍ＿ＵＧＴ１をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号３に、ＶｖＧＴ６をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号４にそれぞれ示す。

（組換えタンパク質の発現及び精製）
Ｇｍ＿ＵＧＴ１及びＶｖＧＴ６について、既報の方法（参考文献１～３）に従って、大腸菌発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にそれぞれのｃＤＮＡをＮ末にＨｉｓＴａｇを付加した形でクローン化し、大腸菌Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ^ＴＭ　ＢＬ２１　Ｓｔａｒ^ＴＭ　（ＤＥ３）　ｃｅｌｌｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に形質転換し、アンピシリンで組換え大腸菌（以下、組換え大腸菌（ＢＬ２１／ＤＥ３）ともいう）を選抜した。形質転換体（組換え大腸菌）はＬＢ培地（５０ｍＬ）で培養し、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓ^ＴＭ　Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を使ってタンパク質を発現させた。集菌した大腸菌からＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を使って組換えタンパク質を抽出し、ＨｉｓＴｒａｐ^ＴＭ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）カラムを用いて、目的のＵＧＴタンパク質を精製した。

（小スケール酵素反応）
組換え大腸菌の培養液（５０ｍＬ）から調製した組換えＵＧＴタンパク質を用いて小スケールで活性評価を行った。
組換えＵＧＴタンパク質（Ｇｍ＿ＵＧＴ１又はＶｖＧＴ６）に、ＩＸ（糖受容体）、ＵＤＰ－グルコース（糖供与体）をそれぞれ終濃度０．２ｍＭ、２ｍＭ濃度で加え、０．１ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）中で３０℃で２時間反応させた。反応液に等量のアセトニトリルを添加することで反応を停止し、Ｍｉｌｌｅｘ　フィルター（ＬＨ－４、０．４５μｍ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過し、遠心後の上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。

（生成物の分析）
代表的なＨＰＬＣの条件は下記の通りである。
（条件（Ａ））
（装置）
Ｓｙｓｔｅｍ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ：ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＳＩＬ－２０ＡＣ
Ｐｕｍｐ：Ａ、Ｂ：ＬＣ－１０ＡＤ
ＤＩＯＤＥ　ＡＲＲＡＹ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ：ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ（いずれも（株）島津製作所製）
（分析条件）
カラム：Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＦＣ－ＯＤＳ　１５０ｍｍ×４．６ｍｍφ３μｍ（（株）島津製作所製）
移動相：Ａ液：０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／水、Ｂ液：０．１％ＴＦＡ／１００％ＣＨ_３ＣＮ
流速：０．６ｍＬ／分
グラジエントプログラム（Ｂ液濃度（％）はｖｏｌ％）：Ｂ液２０％→７０％（１０ｍｉｎ）、Ｂ液７０％（６ｍｉｎ）、Ｂ液７０％→２０％（０．５ｍｉｎ）、Ｂ液２０％（１３．５ｍｉｎ）
カラムオーブン：４０℃
ＰＤＡ検出：２３０～５００ｎｍを測定
サンプル注入量：１０μＬ

（結果）グルコース転移酵素
図１は、大腸菌に発現させたブドウ由来ＵＧＴ（ＶｖＧＴ６）を用いて、ＵＤＰ－グルコース及びイソキサントフモール（ＩＸ）を反応させた反応液のＨＰＬＣ分析結果（クロマトグラム）を示す図である（検出：２８０ｎｍ）。図２は、大腸菌に発現させたダイズ由来ＵＧＴ（Ｇｍ＿ＵＧＴ１）を用いて、ＵＤＰ－グルコース及びＩＸを反応させた反応液のＨＰＬＣ分析結果（クロマトグラム）を示す図である（検出：２８０ｎｍ）。
図中、ＩＸは、基質であるイソキサントフモールを、Ｐは、生成物を示す。

ＶｖＧＴ６は、ＵＤＰ－グルコースを糖供与体としたときに、ＩＸにグルコースが付加したＩＸグルコシドと思われる生成物（図１中に矢印で示すＰのピーク）が認められた（図１）。Ｇｍ＿ＵＧＴ１は、ＵＤＰ－グルコースを糖供与体としたときに、ＩＸグルコシドと思われる生成物（図２中に矢印で示すＰのピーク）が認められた（図２）。
以上の結果から、植物由来のフラボノイドＵＧＴを用いて、イソキサントフモールをグルコシル化できることが明らかとなった。

＜実施例２＞
下記の条件で調製したＧｍ＿ＵＧＴ１を用いてＩＸの大量グルコシル化反応を試みた。実施例１で作製したＧｍ＿ＵＧＴ１を組み込んだ組換え大腸菌（ＢＬ２１／ＤＥ３）を、３ＬのＬＢ培地で３０℃で２日間培養し、集菌した菌体すべてを実験に供した。集菌した菌体から、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔキット（メルク社）を用いて、製造業者が推奨する方法で、Ｇｍ＿ＵＧＴ１の粗タンパク質液を調製した。

（反応条件）
基質：ＩＸ（純度約９５％）約５０ｍｇ／２５ｍＬの濃度でＤＭＦに溶解
ＵＤＰ－グルコース（ＵＤＰ－Ｇｌｃ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をＩＸの１０等量（８６２ｍｇ）を添加
酵素液：Ｇｍ＿ＵＧＴ１の粗酵素及び精製酵素の混合液（上記で調製したＧｍ＿ＵＧＴ１粗タンパク質液７ｍＬと、実施例１の方法で精製した精製酵素２ｍＬとの混合液）
温度：３５℃
バッファー：０．１Ｍ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）
酵素液を、プレインキュベートし、ＵＤＰ－Ｇｌｃを水で溶かして添加した。ボリュームは４５０ｍＬでバッファー中で反応させた。基質ＩＸは５０ｍｇ／２５ｍＬでＤＭＦに溶解したものを８ｍＬずつ反応０分と、０．５時間後に添加し、反応開始から１時間後に９ｍＬ添加した。反応開始から２２時間後に、反応液に等量のアセトニトリルを添加することで反応を停止し、Ｍｉｌｌｅｘ　フィルター（ＬＨ－４、０．４５μｍ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過し、遠心後の上清を実施例１と同じ方法でＨＰＬＣで分析した。

＜結果＞
ＵＤＰ－グルコース及びＩＸをＧｍ＿ＵＧＴ１により反応させた反応液をＨＰＬＣで分析したところ、図２に示すＨＰＬＣクロマトグラムと同様の結果が得られた。反応２２時間後の生成物（ＩＸグルコシド）と残存基質（ＩＸ）の面積比から算出したところ、ＩＸについては反応収率７６．７％（理論収率５５．９ｍｇ）であった。

（ＩＸグルコシドの精製）
生成物（ＩＸグルコシド）のピークの画分を、Ｓｅｐ－Ｐａｋカラムを用いてステップワイズに溶出することで精製を行った。反応生成物のピークの画分を３５ｃｃのＳｅｐ－ｐａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）に負荷し、水洗い３ＣＶ（カラムボリューム）、５％アセトニトリル水溶液３ＣＶ、４０％アセトニトリル水溶液３ＣＶ、８０％アセトニトリル水溶液３ＣＶでステップワイズに溶出した。水洗い及び５％アセトニトリル水溶液画分はピークがなく、４０％アセトニトリル水溶液溶出画分にＩＸグルコシドが検出された。
この生成物をさらに分取ＨＰＬＣで精製し、ＮＭＲ測定に供した。

（構造決定）
ＮＭＲ測定はＣＤ_３ＯＤ中で実施した。表１及び図３に、組換えＵＧＴ（Ｇｍ＿ＵＧＴ１）による、ＵＤＰ－グルコース及びイソキサントフモール（ＩＸ）の反応生成物のＮＭＲ測定の結果を示す。表１は、^１Ｈ及び^１３Ｃの化学シフトである。図３は、ＩＸへの糖結合位置の決定の鍵となるＨＭＢＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｂｏｎｄ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）、ＮＯＥ（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ　Ｅｆｆｅｃｔ）の結果である。表１中、化学シフト（δ）の単位はｐｐｍ、カップリング定数（Ｊ）の単位はＨｚである。
これにより、生成物は、ＩＸの７位にグルコースが１つ付加されたイソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧと記載することもある）であることが確認された。表１中、化学シフト（δ）の単位はｐｐｍ、カップリング定数（Ｊ）の単位はＨｚである。

＜実施例３＞
糸状菌によるＩＸのグルコシル化反応によるイソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）の生産
これまで、糸状菌のもつ配糖化活性により、プレニルフラボノイドを配糖体化した例が報告されているが（前述の非特許文献４）、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属においてＩＸをグルコシル化する活性については確認されていない。表２に示した２１株のＲｈｉｚｏｐｕｓ属糸状菌を収集し使用した。

（胞子懸濁液の調製）
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属糸状菌をＰｏｔａｔｏ　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　Ａｇａｒ（ＰＤＡ、Ｄｉｆｃｏ（登録商標）　ベクトン・ディッキンソン社製）プレートに植菌し、２５℃、６日間培養した。胞子懸濁液を得るために、プレートに０．１％ｔｗｅｅｎ８０、０．８％ＮａＣｌを加え、胞子を懸濁した。ミラクロス（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）でろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、０．１％ｔｗｅｅｎ８０、０．８％ＮａＣｌで洗浄し、滅菌水に懸濁し、胞子数が１ｍＬあたり１０^７個となるように調製し、胞子懸濁液とした。

（イソキサントフモールの配糖化（１））
Ｐｏｔａｔｏ　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　Ｂｒｏｔｈ（ＰＤ、Ｄｉｆｃｏ（登録商標）　ベクトン・ディッキンソン社製）５００μＬに、２０ｍＭイソキサントフモール（ＩＸ、東京化成工業（株）製）エタノール溶液を５μＬ、胞子懸濁液を５μＬ添加して、２５℃、３日間、振とう培養した。遠心分離により培養上清と菌体を回収した。培養上清とアセトニトリルを１：１で混和し、ＧＬクロマトディスク　４Ｐ　０．４５μｍ（ジーエルサイエンス（株）製）でろ過し、培養上清のＬＣ分析サンプルとした。一方、回収した菌体に２ｍＬの酢酸エチルを添加し、激しく撹拌した後、遠心分離し、溶媒層を回収した。遠心濃縮機で溶媒を除去した後、残渣を２００μＬの５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、ＧＬクロマトディスク　４Ｐ　０．４５μｍでろ過し、菌体のＬＣ分析サンプルとした。比較のために、イソキサントフモールエタノール溶液の代わりにエタノールを添加した以外は同じ操作を行い、比較用の培養上清及び菌体のＬＣ分析サンプルを調製した。調製したＬＣ分析サンプルを、下記のＬＣ分析条件（Ｂ）で、ＨＰＬＣで分析した。

ＬＣ分析条件（Ｂ）
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ_１８－ＡＲ－ＩＩ　４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ（ナカライテスク（株）製）
Ａ液：０．１％ＴＦＡ　２：８（ｖ／ｖ）ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏ
Ｂ液：０．１％ＴＦＡ　８：２（ｖ／ｖ）ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏ
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエントプログラム（Ｂ液濃度（％）はｖｏｌ％）：Ｂ液０％→８５％（１５ｍｉｎ）、Ｂ液８５％（１０ｍｉｎ）、Ｂ液８５％→０％（０．５ｍｉｎ）、Ｂ液０％（１５．５ｍｉｎ）
検出：２８０ｎｍ
サンプル注入量：１０μＬ

図４Ａに、ＩＸを添加して培養を行ったＲ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９の培養上清のＨＰＬＣ分析結果を示す（検出：２８０ｎｍ）。図４Ｂに、ＩＸを添加せずに培養を行ったＩＡＭ６０４９の培養上清（比較用分析サンプル）のＨＰＬＣ分析結果を示す（検出：２８０ｎｍ）。ＨＰＬＣ分析の結果、生成物のリテンションタイムはどの株でも同じであり、先に同定したＩＸの７位にグルコースが１つ付加されたＩＸＧのリテンションタイムとも一致した。
調査したすべての株の培養上清の分析結果を図５Ａに、菌体の分析結果を図５Ｂに示した。図５Ａ及び図５Ｂに示す結果は、いずれも培地あたりのピーク面積である。図５Ａ及び図５Ｂ中、■はイソキサントフモールの７位にグルコースが１つグリコシド結合したイソキサントフモール配糖体（ＩＸＧ）（図５Ａ及び図５Ｂ中）であり、□はイソキサントフモール（ＩＸ）である。生成物がＩＸＧであることは、生成物を精製後にＮＭＲで分析して確認した。
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属糸状菌（Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｒ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ、Ｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　ｖａｒ．　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒ、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ、Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ）にはＩＸをＩＸＧに変換する活性があることが分かった。

（イソキサントフモール配糖化（２））
５００ｍＬの坂口フラスコに１００ｍＬのＰＤ培地を入れ、５０ｍｇ／ｍＬイソキサントフラブ（ＩＸ　９０％以上含有、Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社製）エタノール溶液を２００μＬ添加した。１Ｍリン酸カリウムバッファーを培地に１／１０添加する水準と、添加しない水準を設けた。Ｒ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ　ＩＦＯ３１９８７又はＲ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９の胞子懸濁液を１００μＬ植菌し、２５℃、４日間、振とう培養した。桐山濾紙（５Ａ）（有限会社桐山製作所製）で菌体と培養上清を分離した。各培養上清のｐＨを測定し、イソキサントフモールの配糖化（１）に記載の方法に従って処理し、ＨＰＬＣ分析した。結果を表３に示した。表３のバッファーの欄の「＋」は、培地に１Ｍリン酸カリウムバッファーを添加した水準であり、「－」は添加しなかった水準である。Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９株では、バッファーの有無にかかわらず、培地中のＩＸはほぼＩＸＧに変換された。

（イソキサントフモールの配糖化（３））
培地に、ＰＤ培地、又は、窒素源にポテトペプトンＣＰを、炭素源にグルコースを使用した培地を使用した。５００ｍＬの坂口フラスコに１００ｍＬの各種培地を入れ、５０ｍｇ／ｍＬイソキサントフラブ（ＩＸ　９０％以上含有、Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社製）エタノール溶液を２００μＬ添加した。窒素源として、ポテトペプトンＣＰ（ＰＰ、極東製薬工業（株）製）、炭素源としてグルコース（Ｇ）を用いた培地については、ポテトペプトンＣＰ濃度は０．２％とし、グルコース濃度は０．２％、０．５％又は１．０％とした。表４について、例えばＰＰ（０．２）Ｇ（０．２）と記載したものはポテトペプトンＣＰが０．２％、グルコースが０．２％の培地であることを示す。これに、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６２５６の胞子懸濁液を１００μＬ添加し、２５℃、２日間振とう培養した。桐山濾紙（５Ａ）で菌体と培養上清を分離した。各培養上清のｐＨを測定し、イソキサントフモールの配糖化（１）に記載の方法に従って処理し、ＨＰＬＣ分析した。結果を表４に示した。培養２日間で培地中のＩＸはほぼＩＸＧに変換されており、０．２％以上のグルコース添加では変換率に大きな違いはなかった。

＜実施例４＞
８－プレニルナリンゲニンの配糖化
ＰＤ培地２ｍＬに５０ｍｇ／ｍＬの８－プレニルナリンゲニンエタノール溶液を４μＬ添加し、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９又はＩＡＭ６２５６の胞子懸濁液を２μＬ植菌し、２５℃で３日間振とう培養した。遠心分離により、培養上清と菌体を回収した。培養上清とアセトニトリルを１：１で混和し、ＧＬクロマトディスク　４Ｐ　０．４５μｍ（ジーエルサイエンス（株）製）でろ過し、培養上清のＬＣ分析サンプルとした。比較のため、８－プレニルナリンゲニンエタノール溶液を添加し、胞子懸濁液を添加しないＰＤ培地の上清を準備した。サンプルを、実施例３に記載のＬＣ分析条件（Ｂ）でＨＰＬＣ分析した。

分析結果を図６Ａ及び図６Ｂに示す（検出：２８０ｎｍ）。図６Ａは、８－プレニルナリンゲニンを添加し、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９を添加しなかったＰＤ培地上清のＨＰＬＣ分析結果（クロマトグラム）である。図６Ｂは、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９を８－プレニルナリンゲニン含有培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果（クロマトグラム）である。図６Ａ中の８－ＰＮは、８－プレニルナリンゲニンを、図６Ｂ中の８－ＰＮＧは、８－プレニルナリンゲニンにグルコースが１つ付加した８－プレニルナリンゲニン配糖体（８－ＰＮＧ）を指す。８－プレニルナリンゲニン含有培地で培養した場合でも配糖体のピークが検出された。

＜実施例５＞
（ＣＧＴａｓｅ反応のサンプル調製）
５００ｍＬの坂口フラスコに１００ｍＬのＰＤ培地を入れ、５０ｍｇ／ｍＬイソキサントフラブ（ＩＸ　９０％以上含有、Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社製）エタノール溶液を２００μＬ添加した。Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０２２、ＩＡＭ６０４９、ＩＡＭ６０６７、ＩＡＭ６２５６又はＮＲＲＬ３９５の胞子懸濁液１００μＬを各２本の前記坂口フラスコに植菌し、２５℃で３日間培養した。培養終了後、桐山濾紙（５Ａ）（有限会社桐山製作所製）で菌体と培養上清を分離した。各フラスコの培養上清中のＩＸＧとＩＸの量を実施例１に記載の条件（Ａ）のＨＰＬＣ分析条件で分析した。各フラスコの培養上清中のＩＸＧ及びＩＸの濃度を表５に示す。

得られた培養液を混合し、分析に供したところ、４５．８μｇ／ｍＬのイソキサントフモール配糖体（１つのグルコースが付加したもの（ＩＸＧ））が検出されたため、混合液１．０Ｌあたりに４５．８ｍｇのイソキサントフモール配糖体が含まれていると判断した。

（ＣＧＴアーゼによるαグルコシル化による高度配糖体化反応）
（連続酵素反応：ＣＧＴａｓｅ及びデキストリンを添加しての反応）
上記の培養液の混合液に水酸化ナトリウムを加え、ｐＨを５．５８に調節した。これにクラスターデキストリン（江崎グリコ（株））を４．５８ｇ添加し、インキュベーターにて５０℃に調整した。その後、ＣＧＴａｓｅ（天野エンザイム（株）、商品名「ＣＧＴ－ＳＬ」、４００ｕ／ｍＬ）０．９ｍＬを添加して反応を開始し、５０℃の条件下で２時間保持した。反応時間０時間（反応開始時）の反応液及び２時間反応後の反応液をＨＰＬＣで実施例１の条件（Ａ）にて解析した。２時間反応後の反応液を、以下ではＣＧＴアーゼ反応液ともいう。

図７Ａは、イソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）に、ＣＧＴａｓｅ及びクラスターデキストリンを添加した反応液（反応時間０時間）のＨＰＬＣ分析結果（クロマトグラム）であり、図７Ｂは、ＩＸＧにＣＧＴａｓｅ及びクラスターデキストリンを添加して２時間反応を行った反応液（ＣＧＴアーゼ反応液）のＨＰＬＣ分析結果（クロマトグラム）である（いずれも検出：２８０ｎｍ）。
図７Ａ及び７Ｂ中、ＩＸＧは、イソキサントフモールに１個のグルコースが付加したイソキサントフモール配糖体（ＩＸモノグルコシド）である。図７Ｂ中、ＩＸＧ２及びＩＸＧ３のピークは、ＣＧＴアーゼによりＩＸＧにさらにグルコースが付加されたＩＸ配糖体（ＩＸＧｓとも記載する）だと予想された。

次に下記の条件で、ＣＧＴアーゼ反応液のＬＣ－ＭＳ分析を実施し、精密質量から転移したグルコースの数を求めた。
（ＬＣ－ＭＳ分析条件）
ＬＣ装置：（株）島津製作所製ＵＨＰＬＣ
ＭＳ装置：Ｗａｔｅｒｓ社製Ｑ－ＴＯＦ　Ｐｒｅｍｉｅｒ
カラム：ＣＯＳＭＯＣＯＲＥ　Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｏｌｕｍｎ　（オーブン温度：４０℃）
移動相Ａ：０．１％ギ酸を含む水
移動相Ｂ：０．１％ギ酸を含むアセトニトリル
ＬＣグラジエント条件を下記の表６に示す。

この条件で、ＩＸ配糖体群（図７ＢのＩＸＧ、ＩＸＧ２及びＩＸＧ３）は保持時間９．５－１０．５分の辺りで溶出されてくる。
ＣＧＴアーゼ反応液のＬＣ－ＭＳ分析における各成分のＭＳスペクトルを、図８Ａ、図８Ｂ及び図８Ｃに示す。図８Ａは、イソキサントフモール（ＩＸ）に１個のグルコースが付加したＩＸ配糖体のＭＳスペクトル、図８Ｂは、ＩＸに２個のグルコースが結合したＩＸ配糖体のＭＳスペクトル、図８Ｃは、ＩＸモノグルコシドのＭＳスペクトルである。
図８Ｃから、ｍ／ｚ＝５１７．２０３４の基質であるＩＸにグルコースが一分子付加したプロトンのアダクトイオンが検出されたため、このピークは基質であるＩＸＧと確認できた。図８Ｂは、ＩＸＧ２（図７ＢのＩＸＧの左隣のピークに相当する）のＭＳスペクトルである。図８Ｂから、ｍ／ｚ＝６７９．２５９３のＩＸＧにグルコースが一分子付加（合計２個のグルコースが付加）したプロトンのアダクトイオンが検出されたため、このピークはＩＸに２つグルコースが付加されたＩＸ配糖体だと確認できた。
図８Ａは、ＩＸＧ３（図７ＢのＩＸＧ２の左隣のピークに相当する）のＭＳスペクトルである。図８Ａから、ｍ／ｚ＝８４１．３１３０のＩＸＧ２にグルコースが１分子付加（合計３個のグルコースが付加）したプロトンのアダクトイオンが検出されたため、このピークはＩＸに３つグルコースが付加されたＩＸ配糖体だと確認できた。

（ＨＰ－２０による分画）
上記で得られたＣＧＴアーゼ反応液を冷却した後、ダイヤイオンＨＰ－２０（三菱ケミカル（株）製、カラムサイズ２００ｍＬ）に負荷し、８００ｍＬの水で洗浄した。次いで各４００ｍＬの５容量％、１０容量％、２０容量％、３０容量％、４０容量％のエタノール水溶液、８００ｍＬの５０容量％のエタノール水溶液を順次カラムに供した。回収した溶出液（２０容量％以上の画分は２００ｍＬずつ回収）を実施例１の条件（Ａ）にてＨＰＬＣに供した結果、４０容量％エタノール水溶液の画分から５０容量％エタノール水溶液の画分にかけて、ＩＸの７位の水酸基にグルコースが１個又は２個以上付加したイソキサントフモール配糖体が溶出されていることが分かったため、これらの画分を混合し、減圧濃縮した後、凍結乾燥して未精製物９０．０ｍｇを取得した。未精製物を実施例１の条件（Ａ）にてＨＰＬＣに供した結果、酵素反応による生成物（イソキサントフモール配糖体）の平均糖（グルコース）付加数が２．８であること、カラム分画前後の１つのグルコースが付加したイソキサントフモール配糖体（イソキサントフモールモノグルコシド：ＩＸＧ）の収率が９４．４８％であることが分かった。ＩＸの７位の水酸基にグルコースが２個以上付加したイソキサントフモール配糖体については、ＮＭＲにより、イソキサントフモールに付加しているグルコースは、２～７個であることを確認した。

（評価１：溶解性）
上記の方法で調製したＩＸＧ及びＩＸＧｓについてアグリコンであるイソキサントフモール（ＩＸ）との水溶性評価を行った。
水にＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓを混合し、加熱（９０℃）後、３０℃まで冷却し溶解したＩＸ及びその配糖体の濃度を測定した。ＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓの濃度は、実施例１の条件（Ａ）で、ＨＰＬＣで測定した。溶解したＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓの量をモル比で（ＩＸとして）プロットした。図９は、ＩＸ、ＩＸＧ及びＩＸＧｓが水３５０ｍＬに溶ける量（ＩＸ換算）を調べた結果を示すグラフである。ＩＸは３５０ｍＬの水に可溶な量は３．０ｍｇだったのに対し、ＩＸＧはＩＸ換算で約１０倍の溶解性を示した。さらにＩＸＧｓ（ＩＸ換算の平均糖（グルコース）付加数は２．１）については、ＩＸより５０倍以上の溶解性を示すことが分かった（図９）。

次に、室温で、３５０ｍＬの水に、ＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓをＩＸ換算で４５ｍｇ添加し、攪拌及び超音波処理により均一化してサンプルを調製した。図１０に、各サンプルの外観（写真）を示す。
ＩＸを４５ｍｇ／３５０ｍＬの水に添加したサンプル（図１０のｂのサンプル）においては、ＩＸは顕著に析出し、固形物が浮遊しているのが確認できる。一方で、ＩＸＧのサンプル（図１０のｃのサンプル）では混濁が改善され、ＩＸＧｓのサンプル（図１０のｄのサンプル）では完全に溶媒である水（図１０のａのサンプル）と同様の清澄度を保っていた。

以上の結果から、ＩＸに糖を転移することで、大きく溶解性を高めることができることが示された。
ＩＸＧ（グルコース数：１）、ＩＸＧｓ（平均糖付加数：２．１）とヘキソース数が２．１倍のサンプルにおいて、溶解性は５倍近く高まっていることから、２つ目以上のヘキソースの付加の効果は相加的なものではなく、ＩＸの物性を劇的に向上させていることが分かった。

（評価２：呈味性）
ＩＸは苦味又は収斂味を呈することが知られており、飲食品への添加は味質に変化をもたらすと考えられる。水溶性の高まったＩＸＧ（付加糖（グルコース）数：１）及びＩＸＧｓ（平均糖（グルコース）付加数：２）を用いて配糖体化の味質への効果を味覚センサー（（株）インテリジェントセンサーテクノロジー製　味認識装置ＴＳ－５０００Ｚ）を用いて評価した。苦味の標準はアルファ酸で校正されたものである。

上述のＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓを４５ｍｇ／３５０ｍＬ（ＩＸ換算）の濃度で水に溶解させた水溶液と、マルトエキス（Ｂｒｉｘ：１４、ｐＨ４．９）にＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓを４５ｍｇ／３５０ｍＬ（ＩＸ換算）の濃度で添加した液を味質分析に供した。
図１１は、ＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓを、水又はマルトエキスに添加して苦味のマスク効果を評価した結果を示すグラフである。水ベースはＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓを、水に添加した結果（黒いバー）であり、マルトエキスベースは、マルトエキスに添加した結果（白いバー）である。
その結果、水を溶媒とした場合は顕著にＩＸのみで苦味が検出されたのに対して、ＩＸＧ及びＩＸＧｓにおいては、苦味はほとんど検出されなかった（図１１）。
また、マルトエキスを溶媒にした場合は、サンプルを添加していないコントロール区（無添加）においてバックグラント値として苦味が検出されたが、ＩＸを添加したものに対しては、このバックグラウンドの値から顕著に苦味が増大していた。それに対して、ＩＸＧ又はＩＸＧｓを添加したマルトエキスについてはバックグラウンドと同レベルの苦味であった。

以上の結果から、溶媒の種類にかかわらず、ＩＸの有する苦味は配糖体化によって溶媒レベルに緩和されることが示された。ＩＸについては実際に水とマルトエキスに溶解している濃度は、添加した理論濃度（４５ｍｇ／３５０ｍＬ）と比べ、水では２．１５ｍｇ／３５０ｍＬ、マルトエキスでは２２ｍｇ／３５０ｍＬであった。したがって溶解していないＩＸが残存しており、実際のＩＸ苦味強度より低く見積もっていると推察される。ＩＸＧはＩＸＧｓと比べて苦味に大きな差は認められなかったために、苦味マスク効果については１個のヘキソース付加（モノグリコシド）でも効果があることが分かった。

（評価３：強制劣化による安定性）
ＩＸ配糖体は特徴的なＣ８位のプレニル基の近傍のＣ７位の水酸基が保護されていることから水溶性が高まると同時に分解耐性による物質の安定性が期待される。そこで次に、配糖体化によるＩＸの安定性について評価を行った。

クエン酸バッファー（ｐＨ３、終濃度１００ｍＭ）に、ＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓを、ＩＸ換算で３ｍｇ／３５０ｍＬ添加してサンプルを調製した。調製したサンプルを、８５℃で１０分間熱殺菌を行ったあと、遮光した状態でバイアルをインキュベーター内に設置し、４５℃で保持した。１週間後ごとに、４週間にわたり継時的に添加した化合物（ＩＸ、ＩＸＧ、ＩＸＧｓ）の残存量を、実施例１の条件（Ａ）でＨＰＬＣで定量することで、安定性の評価を行った。

図１２Ａ、図１２Ｂ及び図１２Ｃに、クエン酸バッファー（ｐＨ３）中、４５℃で保管したＩＸ、ＩＸＧ及びＩＸＧｓの残存率を示す（図１２Ａ：ＩＸの残存率、図１２Ｂ：ＩＸＧの残存率、図１２Ｃ：ＩＸＧｓの残存率）。図１２Ａ、図１２Ｂ及び図１２Ｃのグラフの縦軸（残存率）は、調製直後のサンプル中のＩＸ、ＸＧ又はＩＸＧｓの濃度（ＩＸ換算）を１００％とした場合の、保管後のサンプル中のＩＸ、ＸＧ又はＩＸＧｓの濃度（ＩＸ換算）の相対値である。
図１２Ａ、図１２Ｂ及び図１２Ｃに示すグラフから回帰式を求めた。
図１２Ａに示すグラフから求めたＩＸの回帰式は、ｙ＝－２１．８８９ｘ＋１２２．６１であった。図１２Ｂに示すグラフから求めたＩＸＧの回帰式は、ｙ＝－１５．４４１ｘ＋１１８．５２であった。図１２Ｃに示すグラフから求めたＩＸＧｓの回帰式は、ｙ＝－５．７７４９ｘ＋９９．３４４であった。
これらのグラフから求められる回帰式の傾きは、分解速度を示す分解係数と考えることができる。
その結果、ＩＸの分解係数（傾き）が－２１．８８９なのに対して、ＩＸＧは分解係数が０．７倍程度（傾き：－１５．４４１）小さく、１．４倍安定な物質であることが分かった。さらに、ＩＸＧｓについては分解係数（傾き）が－５．７７４９と小さく、強制劣化条件においてＩＸの３．８倍程度安定性を保っていることが分かった。

以上のように、ＩＸは配糖体化することで、熱及び低ｐＨという強制劣化条件において、顕著な安定性を示すことが分かった。一つの配糖体化（モノグルコシド）でもＩＸの安定性を向上させることができるが、２糖以上の配糖体化がより強く安定性に寄与することが分かった。この点では前述の溶解性と安定性は相関性が高い。

＜実施例６＞
固定化菌体の調製とＩＸＧ及びＩＸＧｓの生産
Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６２５６の胞子を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように２％アルギン酸ナトリウム溶液３０ｍＬに、添加し、ゆっくりと撹拌して懸濁したものを、氷冷した２％塩化カルシウム溶液１５０ｍＬに滴下し、ビーズ状にゲル化させ、そのまま４℃で２時間放置した。溶液を除いたあと、ビーズを数回滅菌水で洗浄した。ビーズに２００ｍＬの表７に示した培地を添加し、２４℃でゆっくりと撹拌しながら２日間培養し、固定化菌体を得た。固定化菌体は培地を除いたあと滅菌水で洗浄し、反応に供するまで２００ｍＬの滅菌水に浸して４℃で保存した。
固定化菌体による反応を行うため、表７の「反応時のグルコース濃度」に示した濃度になるようにグルコースを添加し、さらにＩＸを０．１ｍｇ／Ｌとなるように添加した。２４℃にてスターラーでゆっくりと撹拌しながら反応させ、２４時間後に反応液とビーズを分離し、反応液の一部を実施例３のＬＣ分析条件（Ｂ）でＨＰＬＣ分析した。この２４時間反応後の反応液の分析結果（ＩＸＧ及びＩＸの濃度）を表７に示した。ＩＸＧは、ＩＸの７位の水酸基にグルコースが１個付加したＩＸ配糖体である。表７に示すＩＸＧの濃度は、ＩＸに換算した濃度である。

表７に示すＮｏ．１～４について、さらに、回収した反応液それぞれ２００ｍＬに水酸化ナトリウム溶液を添加してｐＨを５．５に調整した。クラスターデキストリンを５ｇ／Ｌになるように添加して溶解し、５０℃のインキュベーターでしばらく保持した後、ＣＧＴａｓｅ（天野エンザイム（株）、商品名「ＣＧＴ－ＳＬ、４００ｕ／ｍｌ」）を１８０μＬ添加して５０℃で４時間反応させた。反応液の一部を実施例３のＬＣ分析条件（Ｂ）でＨＰＬＣ分析した。結果を表８に示す。表８中、Ｇ１～Ｇ６は、ＩＸの７位の水酸基にグルコースが１～６個付加したＩＸ配糖体を示す。ＩＸに付加しているグルコースの数は、Ｇ１（ＩＸＧ）が１個、Ｇ２が２個、Ｇ３が３個、Ｇ４が４個、Ｇ５が５個、Ｇ６が６個である。
表８に示す各配糖体の割合（％）は、反応液中の各配糖体の割合（％）である。この各配糖体の割合は、ＩＸに１個以上のグルコースが付加しているＩＸ配糖体（ＩＸＧ及びＩＸＧｓ）のＩＸ換算の合計重量を１００重量％とした場合の、各配糖体のＩＸ換算の重量％である。Ｇ１～Ｇ６の各配糖体の割合から、ＩＸ１分子に付加しているグルコースの数の平均（平均グルコース付加数）を求めた。

以上のように、固定化菌体による反応により、ＩＸＧを生成させることができ、固定化菌体と分離した反応液を酵素処理することでＩＸＧｓを効率よく生成することができた。

本発明は、飲食品分野等において有用である。

Claims

下記一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体。

（一般式（１）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表し、Ｘはヘキソース残基を表し、ｎは、２～１０の整数を表す。２～１０個のヘキソース残基は、同じであってもよく、異なっていてもよい。）
ヘキソースがグルコースである請求項１に記載のプレニルフラボノイド配糖体。
一般式（１）においてＲがメチル基を表す請求項１又は２に記載のプレニルフラボノイド配糖体。
請求項１～３のいずれか一項に記載のプレニルフラボノイド配糖体を含む組成物。
飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料又は飼料である請求項４に記載の組成物。
容器詰飲料である請求項４又は５に記載の組成物。
請求項１～３のいずれか一項に記載のプレニルフラボノイド配糖体の製造方法であって、
リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を、下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養することにより、前記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ１）、及び、
前記プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加する工程（Ｂ）を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法。

（一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）
リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を、下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養することにより、前記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ１）を含む、プレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法。

（一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）
請求項１～３のいずれか一項に記載のプレニルフラボノイド配糖体の製造方法であって、下記（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースから、前記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ２）、及び、
前記プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加する工程（Ｂ）を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法。
（ｐ１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｐ２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｐ３）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｑ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｑ２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｑ３）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質

（一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）
下記（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースから、前記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ２）を含む、プレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法。
（ｐ１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｐ２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｐ３）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｑ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｑ２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｑ３）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質

（一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）
下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、前記プレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法。

（一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）
下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、前記プレニルフラボノイドの苦味を低減する方法。

（一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）
下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、前記プレニルフラボノイドの安定性を向上させる方法。

（一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）
ヘキソースがグルコースである請求項７～１３のいずれか一項に記載の方法。