WO2021131900A1 - Prenylflavonoid glycoside, method for producing same, and method for improving water-solubility of prenylflavonoid - Google Patents

Prenylflavonoid glycoside, method for producing same, and method for improving water-solubility of prenylflavonoid Download PDF

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栄一郎 小埜
祐子 福井
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Definitions

  • the present invention relates to a prenylflavonoid glycoside in which two or more hexoses are bound to prenylflavonoid, and a method for producing the same.
  • the present invention also relates to a method for producing a prenylflavonoid monoglycoside in which one hexose is bound to prenylflavonoid.
  • the present invention also relates to a method for improving the water solubility of prenylflavonoids.
  • the present invention further relates to methods for reducing the bitterness of prenylflavonoids, methods for improving stability, and the like.
  • Prenylflavonoids are known to have various useful biological activities such as antitumor activity and improvement of metabolic syndrome (Non-Patent Documents 1 to 3).
  • prenylflavonoids such as isoxanthohumol have extremely low polarity and are hardly soluble in water
  • the amount of prenylflavonoid added may be limited, for example, when blended in a beverage.
  • the present inventors have added hexose to the 7-position of isoxanthohumol and 8-prenylnaringenin by a bacterium belonging to the genus Rhizopus, which is a filamentous fungus. I found that I could do it.
  • the present inventors have found a plant-derived UDP-gluconosyltransferase (UGT) that adds hexose to the 7-position of isoxanthohumol.
  • UDP-gluconosyltransferase UDP-gluconosyltransferase
  • the present invention is not limited to this, but the present invention describes the following prenylflavonoid glycosides, a method for producing the same, a method for improving the water solubility of prenylflavonoid, a method for reducing the bitterness of prenylflavonoid, and stability of prenylflavonoid. Regarding methods for improving sex.
  • a prenylflavonoid glycoside represented by the following general formula (1).
  • a method for producing a prenylflavonoid glycoside which comprises a step of producing a prenylflavonoid monoglycoside (A2) and a step of adding 1 to 9 hexoses to the hexose residue of the prenylflavonoid monoglycoside (B).
  • (P1) Protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (p2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 1 to 9 amino acids consist of deleted, substituted, inserted and / or added amino acid sequences, and , A protein having an activity of adding a hex sauce to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2) (p3), which comprises an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a method for producing a prenyl flavonoid monoglycoside which comprises a step (A2) of producing a prenyl flavonoid monoglycoside in which one hex source is bound to the 7-position of the prenyl flavonoid from the above prenyl flavonoid and UDP-hexose.
  • (P1) Protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (p2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 1 to 9 amino acids consist of an amino acid sequence deleted, substituted, inserted and / or added, and , A protein having the activity of adding hexose to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2) (p3), which comprises an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the protein (q2) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the protein (q1) having the activity of adding hexose to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2).
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 9 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and having an activity of adding a hex source to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2) ( q3) A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having an activity of adding a hex source to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2).
  • [12] A method for reducing the bitterness of the prenylflavonoid by adding a sugar chain composed of 2 to 10 hexoses to the 7-position of the prenylflavonoid represented by the general formula (2).
  • [13] A method for improving the stability of the prenylflavonoid by adding a sugar chain composed of 2 to 10 hexoses to the 7-position of the prenylflavonoid represented by the general formula (2).
  • [14] The method according to any one of the above [7] to [13], wherein the hexose is glucose.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of NMR measurement of reaction products of UDP-glucose and isoxanthohumol by a soybean-derived UGT (Gm_UGT1) expressed in Escherichia coli.
  • FIG. 4A shows the results of HPLC analysis of the culture supernatant of Rhizopus oryzae (R. oryzae) IAM6049 cultured with the addition of isoxanthohumol.
  • FIG. 4B shows R. cerevisiae cultured without the addition of isoxanthohumol.
  • the HPLC analysis result of the culture supernatant (analytical sample for comparison) of oryzae IAM6049 is shown.
  • FIG. 5A shows the analysis results of isoxanthohumol (IX) and isoxanthohumol monoglucoside (IXG) in the culture supernatant obtained by adding isoxanthohumol to a bacterium belonging to the genus Risopas. ..
  • FIG. 5B shows the analysis results of isoxanthohumol (IX) and isoxanthohumol monoglucoside (IXG) in the cells when isoxanthohumol was added to the bacteria belonging to the genus Risopas and cultured. Is shown.
  • 8-prenylnaringenin (8-PN) was added and R.
  • FIG. 7A is an HPLC analysis result of a reaction solution (reaction time 0 hour) in which CGTase and cluster dextrin were added to isoxanthohumol monoglucoside (IXG).
  • FIG. 7B shows the results of HPLC analysis of the reaction solution obtained by adding CGTase and cluster dextrin to IXG and reacting for 2 hours (both detected: 280 nm).
  • R represents a methyl group or a hydrogen atom
  • X represents a hexose residue
  • n represents an integer of 2 to 10.
  • the 2 to 10 hexose residues are the same. It may or may not be different.
  • R represents a methyl group in the general formula (1).
  • the prenylflavonoid glycoside when R is a methyl group, is an isoxanthohumol glycoside.
  • R is a hydrogen atom in the general formula (1)
  • the prenylflavonoid glycoside is an 8-prenylnaringenin glycoside.
  • the prenylflavonoid glycoside of the present invention is preferably an isoxanthohumol glycoside.
  • the hexose in the present invention does not contain glucuronic acid.
  • the hexose is preferably D-form.
  • D-glucose and D-galactose are preferable, and D-glucose is more preferable.
  • the prenylflavonoid glycoside of the present invention exhibits excellent water solubility and has less bitterness than aglycones such as isoxanthohumol. Moreover, the prenylflavonoid glycoside of the present invention is excellent in stability. Therefore, the prenylflavonoid glycoside of the present invention is excellent in beverage suitability.
  • the composition of the present invention is preferably a liquid composition, more preferably a beverage.
  • the form of the beverage is not particularly limited, and can be a packaged beverage.
  • the container of the packaged beverage is not particularly limited, and a container of any form and material may be used.
  • the medium contains nitrogen sources (for example, various peptones (potato peptone, etc.), various extracts, ammonium sulfate, urea, etc.) and inorganic substances (dipotassium hydrogen phosphate, potassium phosphate, magnesium sulfate, zinc sulfate, iron, etc.), if necessary. , Manganese, molybdenum, sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, etc.) may be added.
  • a potato dextrose medium (PD medium) or the like can be used as the medium.
  • immobilized cells in which bacteria belonging to the genus Rhizopus are immobilized on a carrier can also be used.
  • the method for preparing the immobilized cells is not particularly limited, and a known method can be adopted.
  • spores of a bacterium belonging to the genus Rhizopus are added to an aqueous solution of sodium alginate, stirred and suspended, and then added dropwise to a calcium chloride solution to form beads in which the spores are immobilized. You can get a gel.
  • Immobilized cells can be obtained by culturing this bead-shaped gel in the medium and culture conditions used for culturing bacteria belonging to the genus Rhizopus.
  • step (A1) by carrying out the above culture, a prenylflavonoid monoglycoside in which one hexose is bound to the 7-position of the prenylflavonoid represented by the general formula (2) is produced and accumulated in the medium. To do.
  • the step (C) for separating the bacterial cells and the culture supernatant containing the prenylflavonoid monoglycoside may be performed. It does not have to be.
  • the method for separating the bacterial cells and the culture supernatant is not particularly limited, and a method such as centrifugation or filtration can be adopted.
  • the step (B) can also be carried out using the medium containing the prenylflavonoid monoglycoside and the bacterium belonging to the genus Lysopas as it is.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the protein (q2) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the protein (q1) having the activity of adding hexose to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2).
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of isoflavone 7-O-glucose transferase, which is a UDP-glycosyltransferase derived from soybean (Glycine max).
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of flavonoid UDP-glycosyltransferase (VvGT6), which is a UDP-glycosyltransferase derived from grape (Vitis vinifera). It has not been previously reported that these UDP-glycosyltransferases have the activity of adding hexose to the 7-position of isoxanthohumol or 8-prenylnaringenin.
  • the number of amino acids deleted, substituted, inserted and / or added in the proteins (p2) and (q2) is preferably 1 to 8, 1 to 7, or 1 to 6, and more preferably 1.
  • the number is ⁇ 5, more preferably 1 to 4, particularly preferably 1 to 3, particularly preferably 1 or 2, and most preferably 1.
  • step (A2) preferably, a protein consisting of the amino acid sequence shown in (p1) SEQ ID NO: 1 and / or a protein consisting of the amino acid sequence shown in (q1) SEQ ID NO: 2 is used.
  • step (A2) it is also preferable to use a protein consisting of the amino acid sequence shown in (p1) SEQ ID NO: 1 or a protein consisting of the amino acid sequence shown in (q1) SEQ ID NO: 2.
  • examples of the glucose source include glucose, cyclodextrin, dextrin (cluster dextrin and the like), starch and the like.
  • the amount of the hexose source added to the reaction solution is preferably 10 to 1000 times the molar ratio of prenylflavonoid monoglycoside in the reaction solution, for example.
  • the amount of hexose source in the reaction solution at the start of the reaction is preferably 10 to 1000 times the molar ratio of prenylflavonoid monoglycoside.
  • the prenylflavonoid monoglycoside produced in the step (A2) may be purified from the above reaction solution by a known method and subjected to the step (B), but the step (A2) and the step (A2) and the step (A2) without purification may be performed. (B) may be performed continuously.
  • the reaction solution containing the prenylflavonoid monoglycoside obtained in the step (A2) and the UGT protein is added with the enzyme having glycosyltransferase activity used in the step (B) and, if necessary, a hexose source in the step (B). Can also be done.
  • the present invention also includes the following methods for producing prenylflavonoid monoglycosides.
  • a method for producing a prenylflavonoid monoglycoside which comprises a step (A1) of producing a prenylflavonoid monoglycoside.
  • Examples of the extraction method include an extraction method using an ethanol solvent, which is used as a method for preparing a hop extract used for beer brewing.
  • the hop extract is commercially available, and a commercially available hop extract can also be used.
  • the heating of the hop extract for producing isoxanthohumol is preferably carried out at 80 to 140 ° C. (more preferably 85 to 100 ° C.) for 15 minutes to 5 hours (more preferably 20 minutes to 3 hours).
  • Purification of the hop extract for preparing isoxanthohumol is carried out by known methods. Examples of the purification method include the use of HPLC, an adsorption column, and the like, and a method such as precipitation utilizing a change in solubility.
  • Flavonoid 3-position Glucuronosyltransferase VvGT6 (Reference 3: Ono E et al (2010) Plant Cell 22 (8): 2856-2871) was examined for its reactivity to IX.
  • the amino acid sequence of VvGT6 (ACCESSION AB499075), which is a grape-derived UGT, is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding Gm_UGT1 is shown in SEQ ID NO: 3
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding VvGT6 is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the transformant (recombinant Escherichia coli) was cultured in LB medium (50 mL), and the protein was expressed using Overnight Expression TM Autumn System 1 (manufactured by Novagen). Recombinant protein was extracted from the collected Escherichia coli using BugBuster (registered trademark) Protein Extension Reagent (manufactured by Merck Millipore), and the target UG was obtained using a HisTrap TM High Performance (manufactured by GE Healthcare) column. did.
  • the peak fraction of the product (IX glucoside) was purified by eluting stepwise using a Sep-Pak column.
  • the peak fraction of the reaction product was loaded onto 35 cc of Sep-pakC18 (manufactured by Waters) and stepwise with 3 CV (column volume) washed with water, 3 CV of 5% acetonitrile aqueous solution, 3 CV of 40% acetonitrile aqueous solution, and 3 CV of 80% acetonitrile aqueous solution. Eluted into.
  • Table 1 and FIG. 3 show the results of NMR measurement of the reaction products of UDP-glucose and isoxanthohumol (IX) by recombinant UGT (Gm_UGT1).
  • Table 1 shows the chemical shifts of 1 H and 13 C.
  • FIG. 3 shows the results of HMBC (Heteroncular Multiple Bond Correlation) and NOE (Nuclear Overhauser Effect), which are the keys to determine the sugar binding position to IX.
  • HMBC Heteroncular Multiple Bond Correlation
  • NOE Nuclear Overhauser Effect
  • the culture supernatant and acetonitrile were mixed 1: 1 and filtered through a GL chromatodisk 4P 0.45 ⁇ m (manufactured by GL Sciences Co., Ltd.) to prepare an LC analysis sample of the culture supernatant.
  • 2 mL of ethyl acetate was added to the recovered cells, and the mixture was vigorously stirred and then centrifuged to recover the solvent layer. After removing the solvent with a centrifugal concentrator, the residue was dissolved in 200 ⁇ L of a 50% aqueous acetonitrile solution and filtered through a GL chromatodisk 4P 0.45 ⁇ m to prepare an LC analysis sample of the cells.
  • LC analysis sample was analyzed by HPLC under the following LC analysis condition (B).
  • FIG. 4A R. IX was added and cultured.
  • the results of HPLC analysis of the culture supernatant of oryzae IAM6049 are shown (detection: 280 nm).
  • FIG. 4B shows the results of HPLC analysis of the culture supernatant (comparative analysis sample) of IAM6049 cultured without adding IX (detection: 280 nm).
  • the retention time of the product was the same in all the strains, and it was also consistent with the retention time of IXG in which one glucose was added to the 7-position of the previously identified IX.
  • the analysis results of the culture supernatants of all the investigated strains are shown in FIG.
  • FIGS. 5A and 5B are both peak areas per medium.
  • ⁇ is an isoxanthohumol glycoside (IXG) in which one glucose is glycosidic bonded to the 7-position of isoxanthohumol (in FIGS. 5A and 5B), and ⁇ is isoxanthohumol. It is a mall (IX).
  • IXG isoxanthohumol glycoside
  • Rhizopus filamentous fungi Rhizopus filamentous fungi (R. microsporus, R. oligosporus, R. chinensis, R. chinensis var. It was.
  • PP (0.2) G (0.2) indicates that the medium contains 0.2% potato peptone CP and 0.2% glucose.
  • R. 100 ⁇ L of a spore suspension of oryzae IAM6256 was added, and the mixture was shake-cultured at 25 ° C. for 2 days.
  • the cells and the culture supernatant were separated with Kiriyama filter paper (5A).
  • the pH of each culture supernatant was measured, treated according to the method described in saccharification of isoxanthohumol (1), and analyzed by HPLC. The results are shown in Table 4. IX in the medium was almost converted to IXG in 2 days of culturing, and there was no significant difference in the conversion rate when glucose was added at 0.2% or more.
  • Example 5 (Sample preparation of CGTase reaction) 100 mL of PD medium was placed in a 500 mL Sakaguchi flask, and 200 ⁇ L of 50 mg / mL isoxanthoflav (containing 90% or more of IX, manufactured by Hopstainer) ethanol solution was added. R. 100 ⁇ L of spore suspension of oryzae IAM6022, IAM6049, IAM6067, IAM6256 or NRRL395 was inoculated into each of the two Sakaguchi flasks and cultured at 25 ° C. for 3 days.
  • the reaction solution having a reaction time of 0 hours (at the start of the reaction) and the reaction solution after the reaction for 2 hours were analyzed by HPLC under the condition (A) of Example 1.
  • the reaction solution after the reaction for 2 hours is also referred to as a CGTase reaction solution below.
  • LC-MS analysis of the CGTase reaction solution was carried out under the following conditions, and the number of glucose transferred from the precise mass was determined.
  • LC equipment UHPLC manufactured by Shimadzu Corporation MS device: Waters Q-TOF Premier Column: COSMOCORE Packed Volume (oven temperature: 40 ° C)
  • Mobile phase A Water containing 0.1% formic acid
  • Mobile phase B Acetonitrile LC gradient conditions containing 0.1% formic acid are shown in Table 6 below.
  • FIG. 8C is an MS spectrum of IXG2 (corresponding to the peak to the left of IX
  • the water base is the result of adding IX, IXG or IXGs to water (black bar)
  • the malt extract base is the result of adding IX, IXG or IXGs to the malt extract (white bar).
  • FIGS. 12A, 12B and 12C show the residual rates of IX, IXG and IXGs stored at 45 ° C. in citrate buffer (pH 3)
  • FIG. 12A residual rate of IX
  • FIG. 12B residual rate of IXG
  • FIG. 12C Residual rate of IXGs
  • the vertical axis (residual rate) of the graphs of FIGS. 12A, 12B and 12C is the concentration of IX, XG or IXGs in the sample immediately after preparation (IX conversion) in the sample after storage when the concentration (IX conversion) is 100%. It is a relative value of the concentration (IX conversion) of IX, XG or IXGs.
  • Example 6 Preparation of immobilized cells and production of IXG and IXGs R.
  • Spores of oryzae IAM6256 were added to 30 mL of a 2% sodium alginate solution to 1 ⁇ 10 5 cells / mL, and the suspension was added dropwise to 150 mL of an ice-cooled 2% calcium chloride solution. , Gelled into beads and left as it was at 4 ° C. for 2 hours. After removing the solution, the beads were washed with sterile water several times. 200 mL of the medium shown in Table 7 was added to the beads, and the beads were cultured at 24 ° C. with gentle stirring for 2 days to obtain immobilized cells.

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Abstract

The purpose of the present invention is to provide a prenylflavonoid glycoside in which two or more hexoses have been bonded to isoxanthohumol or 8-prenylnaringenin, a method for producing the same, a method for producing a prenylflavonoid monoglycoside in which one hexose has been bonded to isoxanthohumol or 8-prenylnaringenin, a method for improving the water-solubility of prenylflavonoids, a method for reducing the bitterness of prenylflavonoids, a method for improving the stability of prenylflavonoids, and the like. The present invention relates to a prenylflavonoid glycoside represented by general formula (1). (In general formula (1), R represents a methyl group or a hydrogen atom, X represents a hexose residue, and n represents an integer of 2-10. The 2-10 hexose residues may be the same or different.)

Description

プレニルフラボノイド配糖体、その製造方法及びプレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法Prenylflavonoid glycosides, their production methods and methods for improving the water solubility of prenylflavonoids
本発明は、プレニルフラボノイドに２個以上のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイド配糖体及びその製造方法に関する。本発明はまた、プレニルフラボノイドにヘキソースが１個結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法に関する。また、本発明は、プレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法に関する。本発明はさらに、プレニルフラボノイドの苦味を低減する方法及び安定性を向上させる方法などに関する。 The present invention relates to a prenylflavonoid glycoside in which two or more hexoses are bound to prenylflavonoid, and a method for producing the same. The present invention also relates to a method for producing a prenylflavonoid monoglycoside in which one hexose is bound to prenylflavonoid. The present invention also relates to a method for improving the water solubility of prenylflavonoids. The present invention further relates to methods for reducing the bitterness of prenylflavonoids, methods for improving stability, and the like.
植物二次代謝物であるフラボノイドは様々な植物原料由来の飲食品に含まれており、それらの多くがグリコシル化された水溶性の高い配糖体として存在している。一方で、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ　ｌｕｐｕｌｕｓ）の雌花に含まれるキサントフモールは、雌花のルプリンという表皮細胞が突出した特殊細胞群において生合成され、アグリコンの状態で蓄積している。キサントフモールやそれが異性化されたイソキサントフモールは、プレニル基を有するプレニルフラボノイドの一種である。 Flavonoids, which are secondary plant metabolites, are contained in foods and drinks derived from various plant raw materials, and most of them exist as glycosylated and highly water-soluble glycosides. On the other hand, xanthohumol contained in female flowers of hops (Humulus lupulus) is biosynthesized in a special cell group in which epidermal cells called lupulin of female flowers are prominent and accumulated in the state of aglycone. Xanthohumol and its isomerized isoxanthohumol are a type of prenylflavonoid having a prenyl group.
プレニルフラボノイドは抗腫瘍活性、メタボリックシンドローム改善などの多様な有用生物活性を有することが知られている（非特許文献１～３）。しかしながら、イソキサントフモール等のプレニルフラボノイドは極めて極性が低くほとんど水に溶解しないため、例えば飲料に配合する場合に添加量が制限される場合があった。 Prenylflavonoids are known to have various useful biological activities such as antitumor activity and improvement of metabolic syndrome (Non-Patent Documents 1 to 3). However, since prenylflavonoids such as isoxanthohumol have extremely low polarity and are hardly soluble in water, the amount of prenylflavonoid added may be limited, for example, when blended in a beverage.
プレニルフラボノイドを水溶化させるために糸状菌の持つ糖転移活性を利用し、イソキサントフモールをグルコース配糖体（グルコシド）に変換した例が知られている（非特許文献４）。この方法では、イソキサントフモールに糖が一つ転移したモノグリコシドが得られる。しかしながら、非特許文献４で使用される微生物は、昆虫病原糸状菌の一種であるＢｅａｕｖｅｒｉａ　ｂａｓｓｉａｎａ等であり、食経験がない菌である。従って、当該方法で得られるイソキサントフモール配糖体を飲食品等に利用するためには、高度に精製する必要があり、飲食品の製造への利用には適していない。また、フラボノイドに対するＵＤＰ（ウリジン二リン酸）－糖転移酵素（ＵＧＴ）は多数知られているが、プレニルフラボノイドに対してグルコシル化活性を有する植物ＵＧＴを同定した報告はない。 An example is known in which isoxanthohumol is converted into a glucose glycoside (glucoside) by utilizing the glycosyltransferase activity of filamentous fungi to solubilize prenylflavonoids (Non-Patent Document 4). In this method, a monoglycoside in which one sugar is transferred to isoxanthohumol is obtained. However, the microorganism used in Non-Patent Document 4 is Beauveria bassiana, which is a kind of entomopathogenic fungus, and is a fungus having no eating experience. Therefore, in order to use the isoxanthohumol glycoside obtained by this method for foods and drinks, it is necessary to highly purify it, and it is not suitable for use in the production of foods and drinks. In addition, although many UDP (uridine diphosphate) -glycosyltransferase (UGT) for flavonoids are known, there is no report of identifying a plant UGT having glucosyllation activity for prenylflavonoids.
難溶性の成分の溶解性を高めるための方法として、乳化剤、分散剤等を使用する方法も知られている。しかしながら飲料によっては乳化剤や分散剤を使用できない場合や、飲料に乳化剤、分散剤等を使用すると、乳化剤や分散剤由来の意図しない風味が付与される場合がある。乳化剤、分散剤等を使用せずにイソキサントフモール等のプレニルフラボノイドの水溶性を向上させることができる技術は、例えば飲料等において有用である。 As a method for increasing the solubility of a poorly soluble component, a method using an emulsifier, a dispersant or the like is also known. However, depending on the beverage, an emulsifier or a dispersant may not be used, or if an emulsifier, a dispersant or the like is used in the beverage, an unintended flavor derived from the emulsifier or the dispersant may be imparted. A technique capable of improving the water solubility of prenylflavonoids such as isoxanthohumol without using an emulsifier, a dispersant or the like is useful in, for example, beverages.
本発明は、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンに２個以上のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイド配糖体及びその製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンに１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを製造する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、プレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法、プレニルフラボノイドの苦味を低減する方法及びプレニルフラボノイドの安定性を向上させる方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a prenylflavonoid glycoside in which two or more hexoses are bound to isoxanthohumol or 8-prenylnaringenin, and a method for producing the same. Another object of the present invention is to provide a method for producing a prenylflavonoid monoglycoside in which one hexose is bound to isoxanthohumol or 8-prenylnaringenin. Another object of the present invention is to provide a method for improving the water solubility of prenylflavonoid, a method for reducing the bitterness of prenylflavonoid, and a method for improving the stability of prenylflavonoid.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、糸状菌であるリゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌により、イソキサントフモール及び８－プレニルナリンゲニンの７位にヘキソースを付加することができることを見出した。また、本発明者らは、イソキサントフモールの７位にヘキソースを付加する植物由来のＵＤＰ－糖転移酵素（ＵＧＴ）を見出した。そして、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌又はＵＧＴにより生成したイソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイド配糖体（プレニルフラボノイドモノグリコシド）のヘキソース残基にさらにヘキソースを付加して、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位に２個以上のヘキソースから構成される糖鎖が結合しているプレニルフラボノイド配糖体を製造することが可能であることを見出した。 As a result of diligent studies to solve the above problems, the present inventors have added hexose to the 7-position of isoxanthohumol and 8-prenylnaringenin by a bacterium belonging to the genus Rhizopus, which is a filamentous fungus. I found that I could do it. In addition, the present inventors have found a plant-derived UDP-gluconosyltransferase (UGT) that adds hexose to the 7-position of isoxanthohumol. Then, a hexose of a prenylflavonoid glycoside (prenylflavonoid monoglycoside) in which one hexsource is bound to the 7-position of isoxanthohumol or 8-prenylnaringenin produced by a bacterium belonging to the genus Rhizopus or UGT. It is possible to further add hexose to the residue to produce a prenylflavonoid glycoside in which a sugar chain composed of two or more hexsources is bound to the 7-position of isoxanthohumol or 8-prenylnaringenin. I found that.
また本発明者らは、イソキサントフモールの７位に２個以上のヘキソースから構成される糖鎖を付加することにより、イソキサントフモールの水溶性を向上させることができること、呈味（特に苦味）を改善できること、安定性を向上させることができることを見出した。イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位に２個以上のヘキソースから構成される糖鎖が結合したイソキサントフモール配糖体又は８－プレニルナリンゲニン配糖体は、これまで報告されていない。 Further, the present inventors can improve the water solubility of isoxanthohumol by adding a sugar chain composed of two or more hexoses to the 7-position of isoxanthohumol, and taste (particularly). It was found that bitterness) can be improved and stability can be improved. No isoxanthohumol glycoside or 8-prenylnaringenin glycoside in which a sugar chain composed of two or more hexoses is bound to the 7-position of isoxanthohumol or 8-prenylnaringenin has not been reported so far. ..
すなわち、これに限定されるものではないが、本発明は以下のプレニルフラボノイド配糖体、その製造方法、プレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法、プレニルフラボノイドの苦味を低減する方法、プレニルフラボノイドの安定性を向上させる方法等に関する。
〔１〕下記一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体。 That is, the present invention is not limited to this, but the present invention describes the following prenylflavonoid glycosides, a method for producing the same, a method for improving the water solubility of prenylflavonoid, a method for reducing the bitterness of prenylflavonoid, and stability of prenylflavonoid. Regarding methods for improving sex.
[1] A prenylflavonoid glycoside represented by the following general formula (1).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（一般式（１）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表し、Ｘはヘキソース残基を表し、ｎは、２～１０の整数を表す。２～１０個のヘキソース残基は、同じであってもよく、異なっていてもよい。）
〔２〕ヘキソースがグルコースである上記〔１〕に記載のプレニルフラボノイド配糖体。
〔３〕一般式（１）においてＲがメチル基を表す上記〔１〕又は〔２〕に記載のプレニルフラボノイド配糖体。
〔４〕上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のプレニルフラボノイド配糖体を含む組成物。
〔５〕飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料又は飼料である上記〔４〕に記載の組成物。
〔６〕容器詰飲料である上記〔４〕又は〔５〕に記載の組成物。
〔７〕上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のプレニルフラボノイド配糖体の製造方法であって、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を、下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養することにより、上記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ１）、及び、上記プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加する工程（Ｂ）を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法。 (In the general formula (1), R represents a methyl group or a hydrogen atom, X represents a hexose residue, and n represents an integer of 2 to 10. The 2 to 10 hexose residues are the same. It may or may not be different.)
[2] The prenylflavonoid glycoside according to the above [1], wherein the hexose is glucose.
[3] The prenylflavonoid glycoside according to the above [1] or [2], wherein R represents a methyl group in the general formula (1).
[4] A composition containing the prenylflavonoid glycoside according to any one of the above [1] to [3].
[5] The composition according to the above [4], which is a food or drink, a pharmaceutical product, a quasi drug, a cosmetic or a feed.
[6] The composition according to the above [4] or [5], which is a packaged beverage.
[7] The method for producing a prenylflavonoid glycoside according to any one of the above [1] to [3], wherein a bacterium belonging to the genus Rhizopus is represented by the following general formula (2). A step (A1) of producing a prenylflavonoid monoglycoside in which one prenylflavonoid is bound to the 7-position of the prenylflavonoid by culturing in the presence of a frabonoid and a hexose source, and a hexose of the prenylflavonoid monoglycoside. A method for producing a prenylflavonoid glycoside, which comprises a step (B) of adding 1 to 9 hexoses to residues.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）
〔８〕リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を、上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養することにより、上記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ１）を含む、プレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法。
〔９〕上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のプレニルフラボノイド配糖体の製造方法であって、下記（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースから、上記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ２）、及び、上記プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加する工程（Ｂ）を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法。
（ｐ１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｐ２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｐ３）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｑ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｑ２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｑ３）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
〔１０〕下記（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースから、上記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ２）を含む、プレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法。
（ｐ１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｐ２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｐ３）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｑ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｑ２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｑ３）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
〔１１〕上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、上記プレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法。
〔１２〕上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、上記プレニルフラボノイドの苦味を低減する方法。
〔１３〕上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、上記プレニルフラボノイドの安定性を向上させる方法。
〔１４〕ヘキソースがグルコースである上記〔７〕～〔１３〕のいずれかに記載の方法。 (In the general formula (2), R represents a methyl group or a hydrogen atom.)
[8] By culturing a bacterium belonging to the genus Rhizopus in the presence of a prenylflavonoid represented by the general formula (2) and a hexose source, one hexsource is bound to the 7-position of the prenylflavonoid. A method for producing a prenylflavonoid monoglycoside, which comprises a step (A1) of producing a prenylflavonoid monoglycoside.
[9] The method for producing a prenylflavonoid glycoside according to any one of [1] to [3] above, wherein the following (p1), (p2), (p3), (q1), (q2) and From the prenylflavonoid and UDP-hexose represented by the general formula (2), one hexsource is bound to the 7-position of the prenylflavonoid by one or more proteins selected from the group consisting of (q3). A method for producing a prenylflavonoid glycoside, which comprises a step of producing a prenylflavonoid monoglycoside (A2) and a step of adding 1 to 9 hexoses to the hexose residue of the prenylflavonoid monoglycoside (B).
(P1) Protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (p2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 1 to 9 amino acids consist of deleted, substituted, inserted and / or added amino acid sequences, and , A protein having an activity of adding a hex sauce to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2) (p3), which comprises an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In addition, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the protein (q2) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the protein (q1) having the activity of adding hexose to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2). A protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 9 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and having an activity of adding a hex source to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2) ( q3) A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having an activity of adding a hex source to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2). [10] One or more proteins selected from the group consisting of the following (p1), (p2), (p3), (q1), (q2) and (q3) are represented by the above general formula (2). A method for producing a prenyl flavonoid monoglycoside, which comprises a step (A2) of producing a prenyl flavonoid monoglycoside in which one hex source is bound to the 7-position of the prenyl flavonoid from the above prenyl flavonoid and UDP-hexose.
(P1) Protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (p2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 1 to 9 amino acids consist of an amino acid sequence deleted, substituted, inserted and / or added, and , A protein having the activity of adding hexose to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2) (p3), which comprises an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In addition, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the protein (q2) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the protein (q1) having the activity of adding hexose to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2). A protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 9 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and having an activity of adding a hex source to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2) ( q3) A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having an activity of adding a hex source to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2). [11] A method for improving the water solubility of the prenyl flavonoid by adding a sugar chain composed of 2 to 10 hex sauces to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2).
[12] A method for reducing the bitterness of the prenylflavonoid by adding a sugar chain composed of 2 to 10 hexoses to the 7-position of the prenylflavonoid represented by the general formula (2).
[13] A method for improving the stability of the prenylflavonoid by adding a sugar chain composed of 2 to 10 hexoses to the 7-position of the prenylflavonoid represented by the general formula (2).
[14] The method according to any one of the above [7] to [13], wherein the hexose is glucose.
本発明によれば、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位に、２個以上のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイド配糖体及びその製造方法を提供することができる。本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、アグリコンであるプレニルフラボノイド及びこれに１個のヘキソースが付加したプレニルフラボノイドモノグリコシドと比較して、水への溶解性が向上している。本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、アグリコンであるプレニルフラボノイドと比較して苦味が低減されている。さらに、本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、プレニルフラボノイド及びそのモノグリコシドと比較して安定性が向上している。 According to the present invention, it is possible to provide a prenylflavonoid glycoside in which two or more hexoses are bound to the 7-position of isoxanthohumol or 8-prenylnaringenin, and a method for producing the same. The prenylflavonoid glycoside of the present invention has improved solubility in water as compared with prenylflavonoid which is an aglycon and prenylflavonoid monoglycoside to which one hexose is added. The prenylflavonoid glycoside of the present invention has a reduced bitterness as compared with the aglycone prenylflavonoid. Furthermore, the prenylflavonoid glycosides of the present invention have improved stability as compared with prenylflavonoids and their monoglycosides.
また、本発明によれば、植物等に由来するＵＧＴ又は糸状菌のリゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を用いてイソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位にヘキソースを付加することで、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを製造する方法を提供することができる。上記プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基にさらにヘキソースを付加することによって、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位に、２個以上のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイド配糖体を製造することができる。リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌は、古くからアジアで食品加工に利用されており、例として中国の餅麹やインドネシアのテンペなどへの利用があげられる。このように、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌は長く飲食品の製造に使用されてきたことから、当該微生物を使用して得られるプレニルフラボノイド配糖体は、安全面において飲食品製造への利用に適しているといえる。 Further, according to the present invention, isoxanthohumol or 8-prenylnaringenin is added to the 7-position of isoxanthohumol or 8-prenylnaringenin by using a UGT derived from a plant or the like or a fungus belonging to the genus Rhizopus of filamentous fungi. It is possible to provide a method for producing a prenylflavonoid monoglycoside in which one hex source is bound to the 7-position of xanthofumol or 8-prenylnaringenin. By further adding hexose to the hexose residue of the above prenylflavonoid monoglycoside, a prenylflavonoid glycoside in which two or more hexoses are bound to the 7-position of isoxanthohumol or 8-prenylnaringenin is produced. be able to. Bacteria belonging to the genus Rhizopus have been used for food processing in Asia for a long time, and examples include their use in rice cake koji in China and tempeh in Indonesia. As described above, since the bacteria belonging to the genus Rhizopus have been used for the production of foods and drinks for a long time, the prenylflavonoid glycosides obtained by using the microorganisms can be used for the production of foods and drinks in terms of safety. It can be said that it is suitable for.
本発明によれば、イソキサントフモール等のプレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法、プレニルフラボノイドの苦味を低減する方法及びプレニルフラボノイドの安定性を向上させる方法を提供することができる。例えばイソキサントフモールの７位にヘキソースを２個以上付加することによって、乳化剤等を添加しなくても、イソキサントフモールの水溶性を向上させることができる。その結果、例えば水溶液の清澄度を高めることができる。また、イソキサントフモールの７位にヘキソースを２個以上付加することによって、イソキサントフモールの呈味（例えば苦味）を改善することや、安定性を向上させることが可能となる。従って本発明によれば、イソキサントフモール及び８－プレニルナリンゲニンの飲料適性を大きく改善することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a method for improving the water solubility of prenylflavonoids such as isoxanthohumol, a method for reducing the bitterness of prenylflavonoids, and a method for improving the stability of prenylflavonoids. For example, by adding two or more hexoses to the 7-position of isoxanthohumol, the water solubility of isoxanthohumol can be improved without adding an emulsifier or the like. As a result, for example, the clarity of the aqueous solution can be increased. Further, by adding two or more hexoses to the 7th position of isoxanthohumol, it is possible to improve the taste (for example, bitterness) of isoxanthohumol and improve the stability. Therefore, according to the present invention, the beverage suitability of isoxanthohumol and 8-prenylnaringenin can be greatly improved.
図１は、大腸菌に発現させたブドウ由来ＵＧＴ（ＶｖＧＴ６）を用いてＵＤＰ－グルコース及びイソキサントフモールを反応させた反応液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である（検出：２８０ｎｍ）。FIG. 1 is a diagram showing the results of HPLC analysis of a reaction solution obtained by reacting UDP-glucose and isoxanthohumol with grape-derived UGT (VvGT6) expressed in Escherichia coli (detection: 280 nm). 図２は、大腸菌に発現させたダイズ由来ＵＧＴ（Ｇｍ＿ＵＧＴ１）を用いてＵＤＰ－グルコース及びイソキサントフモールを反応させた反応液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である（検出：２８０ｎｍ）。FIG. 2 is a diagram showing the results of HPLC analysis of a reaction solution obtained by reacting UDP-glucose and isoxanthohumol using a soybean-derived UGT (Gm_UGT1) expressed in Escherichia coli (detection: 280 nm). 図３は、大腸菌に発現させたダイズ由来ＵＧＴ（Ｇｍ＿ＵＧＴ１）による、ＵＤＰ－グルコース及びイソキサントフモールの反応生成物のＮＭＲ測定の結果を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing the results of NMR measurement of reaction products of UDP-glucose and isoxanthohumol by a soybean-derived UGT (Gm_UGT1) expressed in Escherichia coli. 図４Ａは、イソキサントフモールを添加して培養を行ったＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）　ＩＡＭ６０４９の培養上清のＨＰＬＣ分析結果を示す。図４Ｂは、イソキサントフモールを添加せずに培養を行ったＲ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９の培養上清（比較用分析サンプル）のＨＰＬＣ分析結果を示す。FIG. 4A shows the results of HPLC analysis of the culture supernatant of Rhizopus oryzae (R. oryzae) IAM6049 cultured with the addition of isoxanthohumol. FIG. 4B shows R. cerevisiae cultured without the addition of isoxanthohumol. The HPLC analysis result of the culture supernatant (analytical sample for comparison) of oryzae IAM6049 is shown. 図５Ａは、リゾパス属に属する菌に、イソキサントフモールを添加して培養を行った培養上清中のイソキサントフモール（ＩＸ）及びイソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）の分析結果を示す。図５Ｂは、リゾパス属に属する菌に、イソキサントフモールを添加して培養を行った際の、菌体中のイソキサントフモール（ＩＸ）及びイソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）の分析結果を示す。FIG. 5A shows the analysis results of isoxanthohumol (IX) and isoxanthohumol monoglucoside (IXG) in the culture supernatant obtained by adding isoxanthohumol to a bacterium belonging to the genus Risopas. .. FIG. 5B shows the analysis results of isoxanthohumol (IX) and isoxanthohumol monoglucoside (IXG) in the cells when isoxanthohumol was added to the bacteria belonging to the genus Risopas and cultured. Is shown. 図６Ａは、８－プレニルナリンゲニン（８－ＰＮ）を添加し、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９を添加しなかったＰＤ培地上清のＨＰＬＣ分析結果である。図６Ｂは、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９を８－プレニルナリンゲニンを添加した培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果である。In FIG. 6A, 8-prenylnaringenin (8-PN) was added and R. It is the result of HPLC analysis of the PD medium supernatant to which oryzae IAM6049 was not added. FIG. 6B shows R. It is the result of HPLC analysis of the culture supernatant which cultivated oryzae IAM6049 in the medium to which 8-prenylnaringenin was added. 図７Ａは、イソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）に、ＣＧＴａｓｅ及びクラスターデキストリンを添加した反応液（反応時間０時間）のＨＰＬＣ分析結果である。図７Ｂは、ＩＸＧにＣＧＴａｓｅ及びクラスターデキストリンを添加して２時間反応を行った反応液のＨＰＬＣ分析結果である（いずれも検出：２８０ｎｍ）。FIG. 7A is an HPLC analysis result of a reaction solution (reaction time 0 hour) in which CGTase and cluster dextrin were added to isoxanthohumol monoglucoside (IXG). FIG. 7B shows the results of HPLC analysis of the reaction solution obtained by adding CGTase and cluster dextrin to IXG and reacting for 2 hours (both detected: 280 nm). 図８Ａは、イソキサントフモール（ＩＸ）に３個のグルコースが付加したＩＸ配糖体のＭＳスペクトルである。図８Ｂは、ＩＸに２個のグルコースが結合したＩＸ配糖体のＭＳスペクトルである。図８Ｃは、ＩＸモノグルコシドのＭＳスペクトルである。FIG. 8A is an MS spectrum of an IX glycoside in which three glucoses are added to isoxanthohumol (IX). FIG. 8B is an MS spectrum of an IX glycoside in which two glucoses are bound to IX. FIG. 8C is an MS spectrum of IX monoglucoside. 図９は、イソキサントフモール（ＩＸ）、イソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）及びＩＸにグルコースが平均２個程度付加したイソキサントフモール配糖体（ＩＸＧｓ）が水３５０ｍＬに溶ける量（ＩＸ換算）を調べた結果を示すグラフである。FIG. 9 shows the amount of isoxanthohumol (IX), isoxanthohumol monoglucoside (IXG), and isoxanthohumol glycosides (IXGs) obtained by adding about 2 glucoses to IX on average in 350 mL of water (IX). It is a graph which shows the result of having examined (conversion). 図１０は、イソキサントフモール（ＩＸ）、イソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）又はＩＸにグルコースが平均２個程度付加したイソキサントフモール配糖体（ＩＸＧｓ）を、ＩＸ換算で４５ｍｇ、３５０ｍＬの水に溶解させたサンプルの写真である。FIG. 10 shows isoxanthohumol (IX), isoxanthohumol monoglucoside (IXG), or isoxanthohumol glycosides (IXGs) in which an average of about 2 glucoses are added to IX, at 45 mg and 350 mL in terms of IX. It is a photograph of a sample dissolved in water. 図１１は、イソキサントフモール（ＩＸ）、イソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）又はＩＸにグルコースが平均２個程度付加したイソキサントフモール配糖体（ＩＸＧｓ）を、水又はマルトエキスに添加して苦味のマスク効果を評価した結果を示すグラフである。In FIG. 11, isoxanthohumol (IX), isoxanthohumol monoglucoside (IXG), or isoxanthohumol glycosides (IXGs) in which an average of about 2 glucoses are added to IX are added to water or malt extract. It is a graph which shows the result of having evaluated the masking effect of bitterness. 図１２Ａは、イソキサントフモール（ＩＸ）を、ｐＨ３、４５℃の条件で保管した際の残存率を示すグラフである。図１２Ｂは、イソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）を、ｐＨ３、４５℃の条件で保管した際の残存率を示すグラフである。図１２Ｃは、ＩＸにグルコースが平均２個程度付加したイソキサントフモール配糖体（ＩＸＧｓ）を、ｐＨ３、４５℃の条件で保管した際の残存率を示すグラフである。FIG. 12A is a graph showing the residual rate of isoxanthohumol (IX) when stored under the conditions of pH 3 and 45 ° C. FIG. 12B is a graph showing the residual rate of isoxanthohumol monoglucoside (IXG) when stored under the conditions of pH 3 and 45 ° C. FIG. 12C is a graph showing the residual rate of isoxanthohumol glycosides (IXGs) in which an average of about 2 glucoses are added to IX when stored under the conditions of pH 3 and 45 ° C.
＜プレニルフラボノイド配糖体＞
本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、下記一般式（１）で表される化合物である。 <Prenylflavonoid glycoside>
The prenylflavonoid glycoside of the present invention is a compound represented by the following general formula (1).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
（一般式（１）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表し、Ｘはヘキソース残基を表し、ｎは、２～１０の整数を表す。２～１０個のヘキソース残基は、同じであってもよく、異なっていてもよい。）
本発明においては、一般式（１）においてＲがメチル基を表すことが好ましい。一般式（１）において、Ｒがメチル基である場合、上記プレニルフラボノイド配糖体は、イソキサントフモール配糖体である。一般式（１）においてＲが水素原子である場合、上記プレニルフラボノイド配糖体は、８－プレニルナリンゲニン配糖体である。本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、好ましくはイソキサントフモール配糖体である。 (In the general formula (1), R represents a methyl group or a hydrogen atom, X represents a hexose residue, and n represents an integer of 2 to 10. The 2 to 10 hexose residues are the same. It may or may not be different.)
In the present invention, it is preferable that R represents a methyl group in the general formula (1). In the general formula (1), when R is a methyl group, the prenylflavonoid glycoside is an isoxanthohumol glycoside. When R is a hydrogen atom in the general formula (1), the prenylflavonoid glycoside is an 8-prenylnaringenin glycoside. The prenylflavonoid glycoside of the present invention is preferably an isoxanthohumol glycoside.
一般式（１）において、Ｘはヘキソース残基を表す。（Ｘ）ｎは、２～１０個のヘキソース残基から構成される糖鎖を表す。糖鎖を構成する２～１０個のヘキソース残基は、全て同じであってもよく、異なっていてもよい。換言すると、（Ｘ）ｎで表される糖鎖は、１種のヘキソースから構成されるものであってよく、２種以上のヘキソースから構成されるものであってもよい。
ヘキソースとして、グルコース、ガラクトース、ラムノース、フルクトース等が挙げられる。中でも、ヘキソースとして、グルコース、ガラクトースが好ましく、グルコースがより好ましい。本発明におけるヘキソースには、グルクロン酸は含まれない。本明細書中、ヘキソースは、好ましくはＤ体である。ヘキソースとして、Ｄ－グルコース、Ｄ－ガラクトースが好ましく、Ｄ－グルコースがより好ましい。 In the general formula (1), X represents a hexose residue. (X) n represents a sugar chain composed of 2 to 10 hexose residues. The 2 to 10 hexose residues that make up the sugar chain may all be the same or different. In other words, the sugar chain represented by (X) n may be composed of one kind of hexose or may be composed of two or more kinds of hexose.
Examples of the hexose include glucose, galactose, rhamnose, fructose and the like. Among them, glucose and galactose are preferable as the hexose, and glucose is more preferable. The hexose in the present invention does not contain glucuronic acid. In the present specification, the hexose is preferably D-form. As the hexose, D-glucose and D-galactose are preferable, and D-glucose is more preferable.
一般式（１）において、ｎは、好ましくは２～７である。（Ｘ）ｎは、２～７個のヘキソースから構成される糖鎖であることが好ましい。
本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を有し、プレニルフラボノイドポリグリコシドということもできる。
一態様において、（Ｘ）ｎにおいて、プレニルフラボノイドに結合している１個目のヘキソースはグルコース又はガラクトースであることが好ましく、グルコースであることがより好ましい。（Ｘ）ｎにおいて、プレニルフラボノイドに結合している２～１０個目のヘキソースとして、グルコースが好ましい。 In the general formula (1), n is preferably 2 to 7. (X) n is preferably a sugar chain composed of 2 to 7 hexoses.
The prenylflavonoid glycoside of the present invention has a sugar chain composed of 2 to 10 hexoses, and can also be referred to as a prenylflavonoid polyglycoside.
In one embodiment, in (X) n, the first hexose bound to the prenylflavonoid is preferably glucose or galactose, more preferably glucose. In (X) n, glucose is preferable as the 2nd to 10th hexose bound to prenylflavonoid.
本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位に、２～１０個（好ましくは２～７個）のヘキソース（ヘキソース残基）から構成される糖鎖がＯ－グリコシド結合しているイソキサントフモール配糖体又は８－プレニルナリンゲニン配糖体である。本発明の配糖体において、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンは、７位（の水酸基）において、ヘキソースの１位の水酸基とＯ－グリコシド結合している。グリコシド結合は、α結合であってもよく、β結合であってもよい。好ましくはβ結合である。糖鎖において、ヘキソース同士の結合様式は特に限定されず、αグリコシド結合であってもよく、βグリコシド結合であってもよい。一態様において、糖鎖を構成するヘキソース同士はα１，４グリコシド結合していることが好ましい。 The prenylflavonoid glycoside of the present invention has a sugar chain composed of 2 to 10 (preferably 2 to 7) hexoses (hexose residues) at the 7-position of isoxanthohumol or 8-prenylnaringenin. An isoxanthohumol glycoside or an 8-prenylnaringenin glycoside that is bound to O-glycoside. In the glycoside of the present invention, isoxanthohumol or 8-prenylnaringenin has an O-glycosidic bond with the hydroxyl group at the 1-position of hexose at the 7-position (hydroxyl group). The glycosidic bond may be an α bond or a β bond. It is preferably a β bond. In the sugar chain, the binding mode between hexoses is not particularly limited, and may be an α-glycosidic bond or a β-glycosidic bond. In one embodiment, the hexoses constituting the sugar chain are preferably α1,4 glycosidic bonds.
本発明の一態様において、プレニルフラボノイド配糖体として、イソキサントフモールの７位に、２～１０個（好ましくは２～７個）のグルコース（グルコース残基）から構成される糖鎖が結合しているイソキサントフモール配糖体（イソキサントフモールポリグルコシド（ｉｓｏｘａｎｔｈｏｈｕｍｏｌ　ｐｏｌｙｇｌｕｃｏｓｉｄｅ））が好ましい。また一態様において、本発明のプレニルフラボノイド配糖体として、８－プレニルナリンゲニンの７位に２～１０個（好ましくは２～７個）のグルコース（グルコース残基）から構成される糖鎖が結合している８－プレニルナリンゲニンポリグルコシドが好ましい。 In one embodiment of the present invention, as a prenylflavonoid glycoside, a sugar chain composed of 2 to 10 (preferably 2 to 7) glucoses (glucose residues) is bound to the 7-position of isoxanthohumol. Isoxanthohumol glycosides (isoxanthohumol polyglucoside) are preferable. In one embodiment, as the prenylflavonoid glycoside of the present invention, a sugar chain composed of 2 to 10 (preferably 2 to 7) glucoses (glucose residues) is bound to the 7-position of 8-prenylnaringenin. 8-Prenylnaringenin polyglucoside is preferred.
本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、アグリコン（イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニン）及びそれに１個のヘキソースが結合したプレニルナリンゲニンモノグリコシドと比較して、水溶性が大きく向上している。
本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、水への溶解性に優れるため、飲料等の液状の飲食品等に高濃度で含有させることができる。また本発明のプレニルフラボノイド配糖体の水溶液は、清澄度が高いものとなる。イソキサントフモール等のプレニルフラボノイドの水溶性を高めるために、これまで乳化剤や分散剤等が使用されてきたが、本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、乳化剤等を使用せずに水に高濃度で溶解させることが可能である。
本発明のプレニルフラボノイド配糖体では、アグリコンであるプレニルフラボノイドが呈する苦味が効果的に低減されている。さらに、本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、アグリコンであるプレニルフラボノイド及びそのモノグリコシドよりも、優れた安定性を示す。このため本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、保管中等に分解等が起こりにくいと考えられる。 The prenylflavonoid glycoside of the present invention has greatly improved water solubility as compared with aglycone (isoxanthohumol or 8-prenylnaringenin) and prenylnaringenin monoglycoside to which one hexose is bound.
Since the prenylflavonoid glycoside of the present invention has excellent solubility in water, it can be contained in a high concentration in liquid foods and drinks such as beverages. Further, the aqueous solution of the prenylflavonoid glycoside of the present invention has high clarity. Emulsifiers and dispersants have been used to increase the water solubility of prenylflavonoids such as isoxanthohumol, but the prenylflavonoid glycosides of the present invention are highly soluble in water without the use of emulsifiers and the like. It can be dissolved at a concentration.
In the prenylflavonoid glycoside of the present invention, the bitterness exhibited by prenylflavonoid, which is an aglycone, is effectively reduced. Furthermore, the prenylflavonoid glycosides of the present invention exhibit superior stability to the aglycone prenylflavonoids and their monoglycosides. Therefore, it is considered that the prenylflavonoid glycoside of the present invention is unlikely to be decomposed during storage or the like.
本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等の成分として使用することができる。本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、単独で、又は、当該配糖体以外の成分を配合して組成物の形態として、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等として使用することができる。 The prenylflavonoid glycoside of the present invention can be used as a component of foods and drinks, pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, feeds and the like. The prenylflavonoid glycoside of the present invention is used alone or in the form of a composition containing components other than the glycoside as foods and drinks, pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, feeds and the like. be able to.
本発明のプレニルフラボノイド配糖体（プレニルフラボノイドポリグリコシド）を含む組成物も、本発明の１つである。本発明の組成物は、上記一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体を含む。上記プレニルフラボノイド配糖体は、１種使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明の組成物は、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等であってよい。本発明の組成物は、上記プレニルフラボノイド配糖体に加えて、任意の添加剤、任意の成分を含有することができる。これらの添加剤及び成分は、組成物の形態等に応じて選択することができ、一般的に飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等に使用可能なものが使用できる。本発明の組成物は、水を含んでいてもよい。 A composition containing the prenylflavonoid glycoside (prenylflavonoid polyglycoside) of the present invention is also one of the present inventions. The composition of the present invention contains a prenylflavonoid glycoside represented by the above general formula (1). The prenylflavonoid glycoside may be used alone or in combination of two or more. The composition of the present invention may be a food or drink, a pharmaceutical product, a quasi drug, a cosmetic product, a feed or the like. The composition of the present invention can contain any additive and any component in addition to the above-mentioned prenylflavonoid glycoside. These additives and ingredients can be selected according to the form of the composition and the like, and generally, those that can be used for foods and drinks, pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, feeds and the like can be used. The composition of the present invention may contain water.
本発明の組成物を飲食品とする場合、上記プレニルフラボノイド配糖体に、飲食品に使用可能な成分（例えば、食品素材、必要に応じて使用される食品添加物等）を配合して、種々の飲食品とすることができる。飲食品は特に限定されず、例えば、一般的な飲食品、健康食品、健康飲料、機能性表示食品、特定保健用食品、健康補助食品、病者用飲食品等が挙げられる。飲食品には、食品添加物も含まれる。上記健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、健康補助食品等は、例えば、細粒剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、チュアブル剤、ドライシロップ剤、シロップ剤、液剤、飲料、流動食等の各種製剤形態であってよい。 When the composition of the present invention is used as a food or drink, the prenylflavonoid glycoside is mixed with ingredients that can be used in the food or drink (for example, food materials, food additives used as needed, etc.). It can be a variety of foods and drinks. Foods and drinks are not particularly limited, and examples thereof include general foods and drinks, health foods, health drinks, foods with functional claims, foods for specified health use, dietary supplements, foods and drinks for the sick, and the like. Foods and drinks also include food additives. The above-mentioned health foods, foods with functional claims, foods for specified health use, dietary supplements, etc. are, for example, fine granules, tablets, granules, powders, capsules, chewables, dry syrups, syrups, liquids, beverages, fluids. It may be in various forms such as food.
上記のように、本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、優れた水溶性を示し、イソキサントフモール等のアグリコンよりも苦味が抑制されている。また、本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、安定性に優れている。このため本発明のプレニルフラボノイド配糖体は、飲料適性に優れるものである。一態様において、本発明の組成物は、液体組成物であることが好ましく、飲料であることがより好ましい。飲料の形態は特に限定されず、容器詰飲料とすることができる。容器詰飲料の容器は特に限定されず、いずれの形態及び材質の容器を用いてもよく、例えば、アルミ缶、スチール缶等の金属製容器；ペットボトル等の樹脂製容器；紙パック等の紙容器；ガラス瓶等のガラス製容器；樽等の木製容器等の通常用いられる容器のいずれも用いることができる。このような容器に飲料を充填及び密閉することにより、容器詰飲料が得られる。 As described above, the prenylflavonoid glycoside of the present invention exhibits excellent water solubility and has less bitterness than aglycones such as isoxanthohumol. Moreover, the prenylflavonoid glycoside of the present invention is excellent in stability. Therefore, the prenylflavonoid glycoside of the present invention is excellent in beverage suitability. In one aspect, the composition of the present invention is preferably a liquid composition, more preferably a beverage. The form of the beverage is not particularly limited, and can be a packaged beverage. The container of the packaged beverage is not particularly limited, and a container of any form and material may be used. For example, a metal container such as an aluminum can or a steel can; a resin container such as a PET bottle; a paper such as a paper pack. Containers; glass containers such as glass bottles; commonly used containers such as wooden containers such as barrels can be used. By filling and sealing the beverage in such a container, a packaged beverage can be obtained.
本発明の組成物を医薬品又は医薬部外品とする場合、例えば、上記プレニルフラボノイド配糖体に、薬理学的に許容される担体、必要に応じて添加される添加剤等を配合して、各種剤形の医薬品又は医薬部外品とすることができる。そのような担体、添加剤等は、医薬品又は医薬部外品に使用可能な、薬理学的に許容されるものであればよい。医薬品又は医薬部外品の投与形態としては、経口又は非経口投与の形態が挙げられ、好ましくは経口投与の形態である。経口投与のための剤形としては、例えば、液剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、糖衣錠、カプセル剤、懸濁液、乳剤、チュアブル剤等が挙げられる。非経口投与のための剤型としては、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏剤、ローション剤、貼付剤、坐剤、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）等が挙げられる。医薬品は、非ヒト動物用医薬であってもよい。 When the composition of the present invention is a pharmaceutical product or a quasi-drug, for example, a pharmacologically acceptable carrier, an additive added as necessary, or the like is added to the prenylflavonoid glycoside. It can be a drug of various dosage forms or a quasi-drug. Such carriers, additives and the like may be pharmacologically acceptable as long as they can be used for pharmaceutical products or quasi-drugs. Examples of the administration form of the drug or quasi-drug include oral or parenteral administration, and preferably oral administration. Dosage forms for oral administration include, for example, liquids, tablets, powders, fine granules, granules, sugar-coated tablets, capsules, suspensions, emulsions, chewables and the like. Examples of the dosage form for parenteral administration include injections, infusions, ointments, lotions, patches, suppositories, nasal agents, pulmonary agents (inhalants) and the like. The drug may be a non-human veterinary drug.
本発明の組成物を化粧料とする場合、プレニルフラボノイド配糖体に、化粧料に許容される担体、添加剤等を配合することができる。化粧料の製品形態は特に限定されない。
本発明の組成物を飼料とする場合には、プレニルフラボノイド配糖体を飼料に配合すればよい。飼料には飼料添加剤も含まれる。 When the composition of the present invention is used as a cosmetic, the prenylflavonoid glycoside can be mixed with a carrier, additives and the like that are acceptable for the cosmetic. The product form of the cosmetic is not particularly limited.
When the composition of the present invention is used as a feed, prenylflavonoid glycosides may be added to the feed. The feed also contains feed additives.
本発明のプレニルフラボノイド配糖体の含有量は特に限定されず、例えば、組成物中にアグリコンであるプレニルフラボノイド換算で、０．０００１～４８重量％とすることができる。一態様において、飲料の場合は、本発明のプレニルフラボノイド配糖体の含有量は、プレニルフラボノイド（アグリコン）換算で、例えば、０．０００１～１重量％としてよい。プレニルフラボノイド配糖体の含有量は、プレニルフラボノイド配糖体の総含有量である。一態様において、本発明の組成物は、一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体として、イソキサントフモール配糖体を、イソキサントフモール換算で上記の量含有することが好ましい。
本発明のプレニルフラボノイド配糖体を含む組成物を、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等とする場合、その製造方法は特に限定されず、一般的な方法により製造することができる。例えば、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料又は飼料の製造において、本発明のプレニルフラボノイド配糖体を配合する工程を含む製造方法によって、プレニルフラボノイド配糖体を含む飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料又は飼料を製造することができる。 The content of the prenylflavonoid glycoside of the present invention is not particularly limited, and can be, for example, 0.0001 to 48% by weight in terms of prenylflavonoid, which is an aglycone, in the composition. In one aspect, in the case of a beverage, the content of the prenylflavonoid glycoside of the present invention may be, for example, 0.0001 to 1% by weight in terms of prenylflavonoid (aglycone). The content of prenylflavonoid glycosides is the total content of prenylflavonoid glycosides. In one aspect, the composition of the present invention preferably contains an isoxanthohumol glycoside in the above amount in terms of isoxanthohumol as the prenylflavonoid glycoside represented by the general formula (1). ..
When the composition containing the prenylflavonoid glycoside of the present invention is used as a food or drink, a pharmaceutical product, a quasi-drug, a cosmetic, a feed, etc., the production method thereof is not particularly limited, and the composition is produced by a general method. Can be done. For example, in the production of foods and drinks, pharmaceuticals, non-pharmaceutical products, cosmetics or feeds, foods and drinks, pharmaceuticals containing prenylflavonoid glycosides are produced by a production method including a step of blending the prenylflavonoid glycosides of the present invention. Can produce non-pharmaceutical products, cosmetics or feeds.
＜プレニルフラボノイド配糖体の製造方法＞
上記一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体は、例えば、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を、下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養することにより、上記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ１）、及び、上記プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加する工程（Ｂ）を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法により製造することができる。 <Manufacturing method of prenylflavonoid glycoside>
The prenylflavonoid glycoside represented by the above general formula (1) is obtained by culturing, for example, a bacterium belonging to the genus Rhizopus in the presence of the prenylflavonoid represented by the following general formula (2) and a hex source source. Thereby, the step of producing prenylflavonoid monoglycoside in which one hexose is bound to the 7-position of the prenylflavonoid (A1), and 1 to 9 hexoses are added to the hexsource residue of the prenylflavonoid monoglycoside. It can be produced by a method for producing a prenylflavonoid glycoside, which comprises the step (B) of addition.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
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（一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）
上記工程（Ａ１）及び工程（Ｂ）を含む、上記一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体の製造方法も本発明の１つである。上記工程（Ａ１）及び工程（Ｂ）を含む、一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体の製造方法を、本発明の第一の態様の製造方法ともいう。一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体は、上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に２～１０個のヘキソース（ヘキソース残基）から構成される糖鎖が結合している化合物である。
本発明の第一の態様の製造方法は、所望により工程（Ａ１）及び工程（Ｂ）以外の工程を有してもよい。 (In the general formula (2), R represents a methyl group or a hydrogen atom.)
A method for producing a prenylflavonoid glycoside represented by the general formula (1), which comprises the above steps (A1) and (B), is also one of the present inventions. The method for producing a prenylflavonoid glycoside represented by the general formula (1), which comprises the above steps (A1) and (B), is also referred to as a production method according to the first aspect of the present invention. The prenylflavonoid glycoside represented by the general formula (1) has a sugar chain composed of 2 to 10 hexoses (hexose residues) at the 7-position of the prenylflavonoid represented by the general formula (2). It is a compound that is bound.
The production method according to the first aspect of the present invention may include steps other than the step (A1) and the step (B), if desired.
一般式（２）において、Ｒがメチル基である化合物は、イソキサントフモールであり、Ｒが水素原子である化合物は、８－プレニルナリンゲニンである。Ｒは好ましくはメチル基である。工程（Ａ１）では、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌をイソキサントフモール及びヘキソース源の存在下で培養することにより、イソキサントフモールの７位に１個のヘキソース（ヘキソース残基）が結合しているイソキサントフモールモノグリコシドを生成させることが好ましい。 In the general formula (2), the compound in which R is a methyl group is isoxanthohumol, and the compound in which R is a hydrogen atom is 8-prenylnaringenin. R is preferably a methyl group. In step (A1), by culturing a bacterium belonging to the genus Rhizopus in the presence of isoxanthohumol and a hexose source, one hexose (hexose residue) is bound to the 7-position of isoxanthohumol. It is preferable to generate the isoxanthohumol monoglycoside.
リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養することにより、当該菌によりプレニルフラボノイドの７位にヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させることができる。工程（Ａ１）においては、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を上記プレニルフラボノイド及びヘキソース源を含む培地で培養すればよい。培地は、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を培養可能な培地を用いることができる。培地は、好ましくは液体培地である。
ヘキソースとして、上記のヘキソースが挙げられる。ヘキソースは１種又は２種以上であってよいが、好ましくはグルコース、ガラクトースであり、より好ましくはグルコースである。 By culturing a bacterium belonging to the genus Rhizopus in the presence of a prenylflavonoid represented by the general formula (2) and a hexose source, the prenylflavonoid mono is bound to the 7th position of the hexose by the bacterium. Glycosides can be produced. In the step (A1), bacteria belonging to the genus Rhizopus may be cultured in a medium containing the above-mentioned prenylflavonoid and hexose source. As the medium, a medium capable of culturing bacteria belonging to the genus Rhizopus can be used. The medium is preferably a liquid medium.
Examples of the hexose include the above-mentioned hexose. The hexose may be one or more, but is preferably glucose, galactose, and more preferably glucose.
リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌としては、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養した場合に、該プレニルフラボノイド（好ましくはイソキサントフモール）の７位にヘキソース（好ましくはグルコース）を付加する（グリコシド結合させる）ことができる菌であればよく特に制限されない。リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌は、野生株であってよく、ＵＶ照射、ＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。 As a bacterium belonging to the genus Rhizopus, when cultured in the presence of a prenylflavonoid represented by the general formula (2) and a hexose source, the hexose is located at the 7th position of the prenylflavonoid (preferably isoxanthohumol). The bacteria are not particularly limited as long as they can add (preferably glucose) (preferably glucose). Bacteria belonging to the genus Rhizopus may be wild strains, mutant strains obtained by ordinary mutation treatment such as UV irradiation and NTG treatment, and recombination induced by genetic methods such as gene recombination method. It may be any strain such as a strain.
リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌として、例えば、リゾパス・ミクロポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）（例えば、ＩＦＯ３１９８８）、リゾパス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）（例えば、ＩＦＯ８６３１、ＩＦＯ３１９８７、ＩＦＯ３２００２、ＩＦＯ３２００３）、リゾパス・シネンシス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）（例えば、ＩＦＯ４７６８、ＩＦＯ３０４９９、ＩＦＯ４７３７）、リゾパス・デレマル（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ）（例えば、ＩＡＭ６０３８、ＩＡＭ６２５２、ＡＴＣＣ３４６１２）、リゾパス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）（例えば、ＩＡＭ６００６、ＩＡＭ６０１０、ＩＡＭ６０２２、ＩＡＭ６０３６、ＩＡＭ６０４９、ＩＡＭ６０６１、ＩＡＭ６０６７、ＩＡＭ６２５６、ＮＲＲＬ３９５）、リゾパス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｖｅｕｓ）（例えば、ＳＡＭ５４３）等が好ましい。中でも、リゾパス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、リゾパス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）等が好ましい。 Examples of fungi belonging to the genus Rhizopus include Rhizopus microsporus (for example, IFO31988) and Rhizopus oligosporus (for example, IFO8631, IFO31987, IFO31987, IFO3202) (For example, IFO4768, IFO30499, IFO4737), Rhizopus delemar (for example, IAM6038, IAM6252, ATCC34612), Rhizopus oryzae (for example, IAM6006, IAM606, IAM606, IAM606, IAM606, IAM60 IAM6067, IAM6256, NRRL395), Rhizopus niveus (for example, SAM543) and the like are preferable. Among them, Rhizopus oligosae, Rhizopus oligosporus and the like are preferable.
工程（Ａ１）における培養の条件等は、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源を含む培地を使用する以外は、特に限定されず、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を培養する際に使用される培養条件で行うことができる。
工程（Ａ１）において、培地中のプレニルフラボノイドの濃度は特に限定されず、例えば、１ｍｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌであってよい。一態様において、プレニルフラボノイドの濃度は、培養開始時に上記濃度であればよい。プレニルフラボノイドは、培地に一度に添加してもよく、培養中に複数回に分けて培地に添加してもよい。プレニルフラボノイドは、例えば、エタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の溶媒に溶解させて培地に添加することができる。 The culture conditions and the like in the step (A1) are not particularly limited except that a medium containing prenylflavonoid represented by the general formula (2) and a hexose source is used, and a bacterium belonging to the genus Rhizopus is cultured. It can be carried out under the culture conditions used in the case.
In the step (A1), the concentration of prenylflavonoid in the medium is not particularly limited and may be, for example, 1 mg / L to 10 g / L. In one embodiment, the concentration of prenylflavonoid may be the above concentration at the start of culturing. Prenylflavonoid may be added to the medium at one time, or may be added to the medium in multiple portions during the culture. Prenylflavonoid can be added to the medium by dissolving it in a solvent such as ethanol, N, N-dimethylformamide (DMF) or dimethyl sulfoxide (DMSO).
工程（Ａ１）における培養は、プレニルフラボノイド配糖体のヘキソース残基の供給源となるヘキソース源の存在下で行う。ヘキソース源として、ヘキソース、ヘキソース供給源となるヘキソース単位を含む炭素源を使用することができる。ヘキソース源は１種使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明においては、ヘキソース源として、ヘキソース及び／又はヘキソース単位を含む炭素源を使用することができる。好ましいヘキソース源として、グルコース源、ガラクトース源が挙げられ、グルコース源がより好ましい。
工程（Ａ１）においては、培地にヘキソースを添加してもよく、ヘキソース供給源となるヘキソース単位を含む炭素源を添加してもよい。このようなヘキソース源として使用できる炭素源として、スクロース、ラクトース、デキストリン、シクロデキストリン（α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン）、アミロース、アミロペクチン、デンプン等が挙げられる。
ヘキソース源は、プレニルフラボノイド配糖体のヘキソース残基に応じて選択することができる。一態様において、７位にグルコースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシド（プレニルフラボノイドモノグルコシド）を生成させる場合は、グルコース源を用いることができる。グルコース源として、グルコース、グルコース単位を含む炭素源（例えば、スクロース、ラクトース、デキストリン、シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン）が挙げられる。グルコース源は１種又は２種以上を用いることができる。一態様において、ヘキソース源はヘキソースを含むことが好ましく、グルコースを含むことがより好ましい。
培地中のヘキソース源の濃度は、０．１～２０重量％が好ましく、０．２～１０重量％がより好ましい。一態様において、ヘキソース源の濃度は、培養開始時に上記濃度であればよい。ヘキソース源は、培地に一度に添加してもよく、培養中に複数回に分けて添加してもよい。 Culturing in step (A1) is carried out in the presence of a hexose source that is a source of hexose residues of prenylflavonoid glycosides. As the hexose source, a hexose or a carbon source containing a hexose unit serving as a hexose supply source can be used. One type of hexose source may be used, or two or more types may be used in combination. In the present invention, a carbon source containing a hexose and / or a hexose unit can be used as the hexose source. Preferred hexose sources include glucose sources and galactose sources, with glucose sources being more preferred.
In the step (A1), hexose may be added to the medium, or a carbon source containing a hexose unit as a hexose supply source may be added. Examples of carbon sources that can be used as such a hexose source include sucrose, lactose, dextrin, cyclodextrin (α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, γ-cyclodextrin), amylose, amylopectin, starch and the like.
The hexose source can be selected depending on the hexose residue of the prenylflavonoid glycoside. In one embodiment, a glucose source can be used to produce a prenylflavonoid monoglycoside (prenylflavonoid monoglucoside) in which glucose is bound at position 7. Glucose sources include glucose, carbon sources containing glucose units (eg, sucrose, lactose, dextrin, cyclodextrin, amylose, amylopectin, starch). One type or two or more types of glucose sources can be used. In one aspect, the hexose source preferably comprises hexose, more preferably glucose.
The concentration of the hexose source in the medium is preferably 0.1 to 20% by weight, more preferably 0.2 to 10% by weight. In one embodiment, the concentration of the hexose source may be the above concentration at the start of culturing. The hexose source may be added to the medium at one time, or may be added in multiple portions during the culture.
培地には、必要に応じて、窒素源（例えば、各種ペプトン（ポテトペプトン等）、各種エキス、硫酸アンモニウム、尿素等）、無機質（リン酸水素二カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、鉄、マンガン、モリブデン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等）等を添加してもよい。
本発明の第一の態様の製造方法において、培地として、例えば、ポテトデキストロース培地（ＰＤ培地）等を使用することができる。 The medium contains nitrogen sources (for example, various peptones (potato peptone, etc.), various extracts, ammonium sulfate, urea, etc.) and inorganic substances (dipotassium hydrogen phosphate, potassium phosphate, magnesium sulfate, zinc sulfate, iron, etc.), if necessary. , Manganese, molybdenum, sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, etc.) may be added.
In the production method of the first aspect of the present invention, for example, a potato dextrose medium (PD medium) or the like can be used as the medium.
リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌の培地ヘの添加方法は、培地に直接少量の菌体を接種することで増殖させることができるが、当該菌の胞子懸濁液を接種することが好ましい。胞子懸濁液は、通常行われる方法で調製すればよい。一態様において、後記の実施例に記載の方法で胞子懸濁液を調製することもできる。本発明の第一の態様の製造方法は、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌の胞子懸濁液を調製する工程を有していてもよい。
工程（Ａ１）においてリゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌の培養時間は、例えば、０．５～１２０時間とすることができる。 The method of adding a bacterium belonging to the genus Rhizopus to a medium can be grown by inoculating a small amount of cells directly into the medium, but it is preferable to inoculate a spore suspension of the bacterium. The spore suspension may be prepared by a usual method. In one embodiment, the spore suspension can also be prepared by the method described in Examples below. The production method of the first aspect of the present invention may include a step of preparing a spore suspension of a bacterium belonging to the genus Rhizopus.
In the step (A1), the culture time of the bacterium belonging to the genus Rhizopus can be, for example, 0.5 to 120 hours.
培養は、液体培地中で好気培養することが好ましい。好気培養を行う方法は特に限定されず、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を接種した液体培地を、例えば、振盪培養又は攪拌培養すればよい。また、所望により滅菌された空気又は酸素でバブリングを行ってもよい。また、培養形式は、回分培養、流加培養、連続培養のいずれでもよいが、回分培養が好ましい。本発明の製造方法においては、静置培養を行ってもよい。 The culture is preferably aerobic in a liquid medium. The method for performing aerobic culture is not particularly limited, and a liquid medium inoculated with a bacterium belonging to the genus Rhizopus may be, for example, shake-cultured or stirred-cultured. Bubbling may also be performed with sterilized air or oxygen, if desired. The culture form may be batch culture, fed-batch culture, or continuous culture, but batch culture is preferable. In the production method of the present invention, static culture may be performed.
本発明の第一の態様の製造方法では、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を担体に固定化した固定化菌体を使用することもできる。固定化菌体の調製方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。一例として、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌の胞子を、アルギン酸ナトリウム水溶液に添加して攪拌して懸濁したものを、塩化カルシウム溶液に滴下することで、上記胞子が固定化されたビーズ状のゲルを得ることができる。このビーズ状のゲルを、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を培養する際に使用される培地及び培養条件で培養することによって、固定化菌体を得ることができる。一態様においては、工程（Ａ１）において、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌の固定化菌体を、上記の一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源を含む培地で培養してもよい。 In the production method of the first aspect of the present invention, immobilized cells in which bacteria belonging to the genus Rhizopus are immobilized on a carrier can also be used. The method for preparing the immobilized cells is not particularly limited, and a known method can be adopted. As an example, spores of a bacterium belonging to the genus Rhizopus are added to an aqueous solution of sodium alginate, stirred and suspended, and then added dropwise to a calcium chloride solution to form beads in which the spores are immobilized. You can get a gel. Immobilized cells can be obtained by culturing this bead-shaped gel in the medium and culture conditions used for culturing bacteria belonging to the genus Rhizopus. In one embodiment, in step (A1), immobilized cells of a bacterium belonging to the genus Rhizopus may be cultured in a medium containing a prenylflavonoid represented by the above general formula (2) and a hexose source. Good.
工程（Ａ１）において、上記の培養を行うことにより、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドが生成し、培地中に蓄積する。 In the step (A1), by carrying out the above culture, a prenylflavonoid monoglycoside in which one hexose is bound to the 7-position of the prenylflavonoid represented by the general formula (2) is produced and accumulated in the medium. To do.
本発明の第一の態様の製造方法は、工程（Ａ１）を行った後、菌体と、プレニルフラボノイドモノグリコシドを含む培養上清とを分離する工程（Ｃ）を行ってもよいが、行わなくてもよい。工程（Ｃ）を行う場合は、菌体と培養上清とを分離する方法は特に限定されず、遠心分離、ろ過等の方法を採用することができる。工程（Ａ１）を行った後、プレニルフラボノイドモノグリコシド及びリゾパス属に属する菌を含む培地をそのまま用いて、工程（Ｂ）を行うこともできる。 In the production method of the first aspect of the present invention, after performing the step (A1), the step (C) for separating the bacterial cells and the culture supernatant containing the prenylflavonoid monoglycoside may be performed. It does not have to be. When the step (C) is performed, the method for separating the bacterial cells and the culture supernatant is not particularly limited, and a method such as centrifugation or filtration can be adopted. After performing the step (A1), the step (B) can also be carried out using the medium containing the prenylflavonoid monoglycoside and the bacterium belonging to the genus Lysopas as it is.
本発明は、下記工程（Ａ２）及び工程（Ｂ）を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法も包含する。
上記一般式（１）で表されるプレニルフラボノイドの製造方法であって、下記（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースから、上記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ２）、及び、上記プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加する工程（Ｂ）を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法。
（ｐ１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｐ２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｐ３）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｑ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｑ２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
（ｑ３）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
上記のタンパク質を使用するプレニルフラボノイド配糖体の製造方法を、本発明の第二の態様の製造方法ともいう。本発明の第二の態様の製造方法によっても、一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体を製造することができる。 The present invention also includes a method for producing a prenylflavonoid glycoside, which comprises the following steps (A2) and (B).
A method for producing prenylflavonoid represented by the general formula (1), which is selected from the group consisting of the following (p1), (p2), (p3), (q1), (q2) and (q3). A step of producing a prenylflavonoid monoglycoside in which one hexose is bound to the 7-position of the prenylflavonoid from the prenylflavonoid and UDP-hexose represented by the general formula (2) by one or more kinds of proteins (. A2) and a method for producing a prenylflavonoid glycoside, which comprises a step (B) of adding 1 to 9 hexoses to the hexose residues of the prenylflavonoid monoglycoside.
(P1) Protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (p2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 1 to 9 amino acids consist of deleted, substituted, inserted and / or added amino acid sequences, and , A protein having an activity of adding a hex sauce to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2) (p3), which comprises an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In addition, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the protein (q2) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the protein (q1) having the activity of adding hexose to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2). A protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 9 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and having an activity of adding a hex source to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2) ( q3) A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having an activity of adding a hex source to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2). The method for producing a prenylflavonoid glycoside using the above protein is also referred to as a method for producing a second aspect of the present invention. The prenylflavonoid glycoside represented by the general formula (1) can also be produced by the production method of the second aspect of the present invention.
本発明の第二の態様の製造方法において、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド、その好ましい態様等は、上述した本発明の第一の態様の製造方法と同じである。一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドは、好ましくはイソキサントフモールである。
ＵＤＰ－ヘキソースにおけるヘキソースとして、グルコース、ガラクトース、ラムノース、フルクトース等が挙げられ、好ましくはグルコース、ガラクトースであり、より好ましくはグルコースである。ヘキソースは、グルクロン酸以外のヘキソースである。ＵＤＰ－ヘキソースは、好ましくはＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－ガラクトースであり、より好ましくはＵＤＰ－グルコースである。 In the production method of the second aspect of the present invention, the prenylflavonoid represented by the general formula (2), a preferred embodiment thereof and the like are the same as the production method of the first aspect of the present invention described above. The prenylflavonoid represented by the general formula (2) is preferably isoxanthohumol.
Examples of the hexose in the UDP-hexose include glucose, galactose, rhamnose, fructose and the like, preferably glucose and galactose, and more preferably glucose. Hexose is a hexose other than glucuronic acid. The UDP-hexose is preferably UDP-glucose, UDP-galactose, and more preferably UDP-glucose.
本発明の第二の態様の製造方法では、上記の（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質を触媒として、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースからプレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる（工程（Ａ２））。
上記の（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）のタンパク質は、ＵＤＰ－糖転移酵素（ＵＧＴ）であり、ＵＤＰ－ヘキソース（糖供与体）からプレニルフラボノイド（糖受容体基質）にヘキソース残基を転移し、プレニルフラボノイドモノグリコシドを生じる反応を触媒する。これらのタンパク質は、通常、プレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加（転移）する。より詳細には、プレニルフラボノイドの７位の水酸基と、ヘキソースの１位の水酸基とを結合させる。（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）のタンパク質を、以下ではＵＧＴタンパク質ともいう。 In the production method of the second aspect of the present invention, one or more proteins selected from the group consisting of (p1), (p2), (p3), (q1), (q2) and (q3) described above are selected. As a catalyst, prenylflavonoid monoglycoside in which one hexose is bound to the 7-position of prenylflavonoid is produced from prenylflavonoid represented by the general formula (2) and UDP-hexose (step (A2)).
The proteins (p1), (p2), (p3), (q1), (q2) and (q3) above are UDP-Glucuronosyltransferase (UGT) and prenyl from UDP-hexose (sugar donor). It catalyzes the reaction that transfers hexose residues to flavonoids (glycosyl acceptor substrates) to produce prenylflavonoid monoglycosides. These proteins usually add (transfer) hexose to position 7 of prenylflavonoids. More specifically, the hydroxyl group at the 7-position of prenylflavonoid and the hydroxyl group at the 1-position of hexose are bonded. The proteins of (p1), (p2), (p3), (q1), (q2) and (q3) are also hereinafter referred to as UGT proteins.
配列番号１に示すアミノ酸配列は、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）由来のＵＤＰ－糖転移酵素であるイソフラボン７－Ｏ－グルコース転移酵素のアミノ酸配列である。配列番号２に示すアミノ酸配列は、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）由来のＵＤＰ－糖転移酵素である、フラボノイドＵＤＰ－糖転移酵素（ＶｖＧＴ６）のアミノ酸配列である。これらのＵＤＰ－糖転移酵素が、イソキサントフモール又は８－プレニルナリンゲニンの７位にヘキソースを付加する活性を有することは、これまで報告されていない。 The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of isoflavone 7-O-glucose transferase, which is a UDP-glycosyltransferase derived from soybean (Glycine max). The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of flavonoid UDP-glycosyltransferase (VvGT6), which is a UDP-glycosyltransferase derived from grape (Vitis vinifera). It has not been previously reported that these UDP-glycosyltransferases have the activity of adding hexose to the 7-position of isoxanthohumol or 8-prenylnaringenin.
上記（ｐ２）及び（ｑ２）のタンパク質における、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸の数は、好ましくは１～８個、１～７個又は１～６個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、特に好ましくは１～３個、特に好ましくは１又は２個、最も好ましくは１個である。 The number of amino acids deleted, substituted, inserted and / or added in the proteins (p2) and (q2) is preferably 1 to 8, 1 to 7, or 1 to 6, and more preferably 1. The number is ~ 5, more preferably 1 to 4, particularly preferably 1 to 3, particularly preferably 1 or 2, and most preferably 1.
本明細書中、タンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じていてもよい。 In the present specification, one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of a protein at any position in one or more amino acid sequences in the same sequence. Alternatively, it means that there are deletions, substitutions, insertions and / or additions of a plurality of amino acids, and two or more of the deletions, substitutions, insertions and additions may occur at the same time.
上記（ｐ３）のタンパク質において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の同一性（配列同一性）は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上又は９４％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上又は９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。上記（ｑ３）のタンパク質において、配列番号２に示すアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の同一性は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上又は９４％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上又は９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
アミノ酸配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出することができる。 In the above protein (p3), the amino acid sequence identity (sequence identity) with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more or 94% or more, more preferably 95. % Or more, 96% or more or 97% or more, more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more. In the above protein (q3), the amino acid sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more or 94% or more, more preferably 95% or more, 96%. More than or equal to 97% or more, more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
Amino acid sequence identity can be calculated with default parameters using, for example, analysis software such as BLAST.
工程（Ａ２）において、好ましくは、（ｐ１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質及び／又は（ｑ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を用いる。工程（Ａ２）において、（ｐ１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質又は（ｑ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることも好ましい。 In the step (A2), preferably, a protein consisting of the amino acid sequence shown in (p1) SEQ ID NO: 1 and / or a protein consisting of the amino acid sequence shown in (q1) SEQ ID NO: 2 is used. In the step (A2), it is also preferable to use a protein consisting of the amino acid sequence shown in (p1) SEQ ID NO: 1 or a protein consisting of the amino acid sequence shown in (q1) SEQ ID NO: 2.
上記の（ｐ１）～（ｐ３）及び（ｑ１）～（ｑ３）のタンパク質は、その由来や製造方法に制限されない。例えば、公知の遺伝子工学的手法によって、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを微生物等の非ヒト宿主に導入して、得られる形質転換体を培養して当該タンパク質を発現させて製造することができる。より具体的には、形質転換体を培養した培養物から、タンパク質を精製することにより、所望のタンパク質を得ることができる。タンパク質の精製は通常の方法に従って行うことができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
（ｐ１）～（ｐ３）及び（ｑ１）～（ｑ３）のタンパク質は、プレニルフラボノイド（好ましくはイソキサントフモール）の７位にヘキソース（好ましくはグルコース）を付加する活性を有するものであれば、その精製度も特に制限されない。本発明の効果を奏することになる限り、上記の培養物や、タンパク質の粗精製物を使用することもできる。培養物は、培養液、培養菌体又は培養細胞、培養菌体又は培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。 The above-mentioned proteins (p1) to (p3) and (q1) to (q3) are not limited in their origin or production method. For example, a polynucleotide encoding a protein can be introduced into a non-human host such as a microorganism by a known genetic engineering technique, and the obtained transformant can be cultured to express the protein for production. More specifically, a desired protein can be obtained by purifying the protein from the culture in which the transformant is cultured. Protein purification can be performed according to conventional methods. For example, as a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 can be mentioned. Examples of the polynucleotide encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 include the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
As long as the proteins (p1) to (p3) and (q1) to (q3) have an activity of adding hexose (preferably glucose) to the 7-position of prenylflavonoid (preferably isoxanthohumol), The degree of purification is not particularly limited. As long as the effects of the present invention are exhibited, the above-mentioned cultures and crude proteins can be used. Culture means any of culture medium, cultured cells or cultured cells, cultured cells or crushed cells of cultured cells.
具体的には、ＵＧＴタンパク質が培養菌体内又は培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体又は細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）によりタンパク質の粗抽出液を得ることができる。上記タンパク質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体又は細胞と培養上清とを分離することにより、所望のタンパク質を含む培養上清を得ることができる。
このようにして得られた抽出液又は培養上清中に含まれるタンパク質の精製は、通常の分離又は精製方法に従って行うことができる。分離又は精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。 Specifically, when the UGT protein is accumulated in the cultured cells or cells, after culturing, the cells or cells are disrupted by a usual method (for example, ultrasonic wave, lysozyme, freeze-thaw, etc.). , A crude protein extract can be obtained by conventional methods (eg, centrifugation, filtration, etc.). When the above protein is accumulated in the culture medium, the desired protein is obtained by separating the cells or cells from the culture supernatant by a usual method (for example, centrifugation, filtration, etc.) after the completion of the culture. A culture supernatant containing the mixture can be obtained.
Purification of the protein contained in the extract or culture supernatant thus obtained can be carried out according to a usual separation or purification method. As the separation or purification method, for example, ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, dialysis method, ultrafiltration method and the like are used alone or in combination as appropriate. be able to.
また、ＵＧＴタンパク質は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。 The UGT protein can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
工程（Ａ２）においては、上記のＵＧＴタンパク質を触媒として、プレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースを反応させて、プレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させることができる。
上記の反応は、好ましくは液（反応液）中、例えば水、緩衝液等の水性媒体中で行うことが好ましい。反応液のｐＨは、例えば、７～８とすることができ、好ましくは７．２～７．７である。反応温度は、２５～４０℃とすることができ、好ましくは３０～３７℃である。反応時間は適宜設定すればよい。ｐＨは、２５℃におけるｐＨである。ｐＨは市販のｐＨメーターで測定することができる。 In the step (A2), prenylflavonoid and UDP-hexose can be reacted with the above UGT protein as a catalyst to produce prenylflavonoid monoglycoside.
The above reaction is preferably carried out in a liquid (reaction liquid), for example, in an aqueous medium such as water or a buffer solution. The pH of the reaction solution can be, for example, 7 to 8, preferably 7.2 to 7.7. The reaction temperature can be 25-40 ° C, preferably 30-37 ° C. The reaction time may be set as appropriate. The pH is the pH at 25 ° C. The pH can be measured with a commercially available pH meter.
反応液中のプレニルフラボノイドの初期濃度は、例えば、０．１～５０ｍＭであってよい。プレニルフラボノイドは、例えば、エタノール、ＤＭＦ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の溶媒に溶解させて反応液に添加することができる。 The initial concentration of prenylflavonoid in the reaction solution may be, for example, 0.1 to 50 mM. Prenylflavonoid can be added to the reaction solution by dissolving it in a solvent such as ethanol, DMF or dimethyl sulfoxide (DMSO).
反応開始時の反応液中のＵＤＰ－ヘキソースの濃度（初期濃度）は、プレニルフラボノイドに対して、モル比で５～２０倍であることが好ましく、５～１５倍であることがより好ましい。 The concentration (initial concentration) of UDP-hexose in the reaction solution at the start of the reaction is preferably 5 to 20 times, more preferably 5 to 15 times, the molar ratio of prenylflavonoid.
工程（Ａ１）又は工程（Ａ２）により、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソース（ヘキソース残基）が結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドが生成する。プレニルフラボノイドモノグリコシドは、通常、プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースがＯ－グリコシド結合しているプレニルフラボノイド配糖体である。 The step (A1) or step (A2) produces a prenylflavonoid monoglycoside in which one hexose (hexose residue) is bound to the 7-position of the prenylflavonoid represented by the general formula (2). Prenylflavonoid monoglycosides are usually prenylflavonoid glycosides in which one hex source is O-glycosidically linked to the 7-position of prenylflavonoids.
本発明の第一の態様の製造方法及び第二の態様の製造方法においては、工程（Ａ１）又は工程（Ａ２）で生成したプレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加する（工程（Ｂ））。
工程（Ｂ）において、プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加する方法は特に限定されず、糖転移活性を有する酵素を触媒として、プレニルフラボノイドモノグリコシドにヘキソースを付加することができる。一態様において、工程（Ｂ）においては、糖転移活性を有する酵素により、プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加することが好ましい。糖転移活性を有する酵素として、シクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）、デキストリナーゼ、アミラーゼ、α－グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ等を使用することができる。糖転移活性を有する酵素は、１種使用してもよく、２種以上を組合わせて使用してもよい。一態様においては、ＣＧＴアーゼを使用することが好ましい。ヘキソースとして、上記と同じものが挙げられ、グルコース、ガラクトース等が好ましく、より好ましくはグルコースである。 In the production method of the first aspect and the production method of the second aspect of the present invention, 1 to 9 hexoses are added to the hexose residues of the prenylflavonoid monoglycoside produced in the step (A1) or the step (A2). (Step (B)).
In step (B), the method of adding 1 to 9 hexoses to the hexose residue of prenylflavonoid monoglycoside is not particularly limited, and the hexose is added to prenylflavonoid monoglycoside using an enzyme having glycoside activity as a catalyst. be able to. In one aspect, in step (B), it is preferable to add 1 to 9 hexoses to the hexose residues of prenylflavonoid monoglycoside by an enzyme having glycosyl transfer activity. As an enzyme having glycosyltransferase activity, cyclodextrin glosyltransferase (CGTase), dextrinase, amylase, α-glucosidase, glucoamylase and the like can be used. One type of enzyme having a transglycosylation activity may be used, or two or more types may be used in combination. In one aspect, it is preferable to use CGTase. Examples of the hexose include the same as above, and glucose, galactose and the like are preferable, and glucose is more preferable.
工程（Ｂ）における反応は、液（反応液）中で行うことができ、例えば水、緩衝液等の水性媒体中で行うことが好ましい。反応条件は、使用する酵素に応じて適宜設定することができる。例えば、反応液のｐＨは、５～７が好ましく、５．５～６．７５がより好ましい。工程（Ｂ）における反応温度は、４０～６０℃であってよく、４５～５５℃が好ましい。反応時間は適宜設定すればよいが、例えば、１～１０時間とすることができ、好ましくは１．５～７時間、より好ましくは２～７時間、さらに好ましくは３～５時間とすることができる。
上記反応液は、プレニルフラボノイド配糖体のヘキソース残基の供給源となるヘキソース源を通常含む。ヘキソース源として、ヘキソース、ヘキソース供給源となる糖源が挙げられる。ヘキソース源は１種であってもよく、２種以上であってもよい。
反応液には、グルコース等のヘキソースを添加してもよいが、ヘキソースの供給源となる糖源を使用することもできる。ヘキソース源は、ヘキソースの種類に応じて選択することができる。例えばグルコース源として、グルコース、シクロデキストリン、デキストリン（クラスターデキストリン等）、デンプン等が挙げられる。反応液に添加するヘキソース源の量は、反応液中のプレニルフラボノイドモノグリコシドに対して、例えば、モル比で１０～１０００倍が好ましい。一態様においては、反応液中の反応開始時のヘキソース源の量が、プレニルフラボノイドモノグリコシドに対してモル比で１０～１０００倍であることが好ましい。 The reaction in the step (B) can be carried out in a liquid (reaction liquid), and is preferably carried out in an aqueous medium such as water or a buffer solution. The reaction conditions can be appropriately set according to the enzyme used. For example, the pH of the reaction solution is preferably 5 to 7, more preferably 5.5 to 6.75. The reaction temperature in the step (B) may be 40 to 60 ° C, preferably 45 to 55 ° C. The reaction time may be appropriately set, but may be, for example, 1 to 10 hours, preferably 1.5 to 7 hours, more preferably 2 to 7 hours, still more preferably 3 to 5 hours. it can.
The reaction solution usually contains a hexose source that is a source of hexose residues of prenylflavonoid glycosides. Examples of the hexose source include hexose and a sugar source serving as a hexose supply source. The hexose source may be one kind or two or more kinds.
Hexose such as glucose may be added to the reaction solution, but a sugar source serving as a source of hexose can also be used. The hexose source can be selected according to the type of hexose. For example, examples of the glucose source include glucose, cyclodextrin, dextrin (cluster dextrin and the like), starch and the like. The amount of the hexose source added to the reaction solution is preferably 10 to 1000 times the molar ratio of prenylflavonoid monoglycoside in the reaction solution, for example. In one embodiment, the amount of hexose source in the reaction solution at the start of the reaction is preferably 10 to 1000 times the molar ratio of prenylflavonoid monoglycoside.
工程（Ａ１）により製造されるプレニルフラボノイドモノグリコシドは、上記の培地から、公知の方法で精製して工程（Ｂ）に供してもよいが、精製を行わずに、工程（Ａ１）及び工程（Ｂ）を連続して行ってもよい。例えば、工程（Ａ１）で得られるプレニルフラボノイドモノグリコシド及びリゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を含む培養液に、糖転移活性を有する酵素及び必要に応じてヘキソース源を添加して工程（Ｂ）を行うこともできる。また、工程（Ａ１）で得られるプレニルフラボノイドモノグリコシドを含む培養液を濃縮した後、得られる濃縮液に糖転移活性を有する酵素及び必要に応じてヘキソース源を添加して工程（Ｂ）を行ってもよい。工程（Ｂ）の前に、プレニルフラボノイドモノグリコシドを含む培養液又は培養液の濃縮液のｐＨを、工程（Ｂ）で使用する酵素に適したｐＨに調整することが好ましい。 The prenylflavonoid monoglycoside produced in the step (A1) may be purified from the above-mentioned medium by a known method and subjected to the step (B), but the step (A1) and the step (A1) and the step (A1) B) may be performed continuously. For example, step (B) is carried out by adding an enzyme having glycoside activity and, if necessary, a hexose source, to a culture medium containing prenylflavonoid monoglycoside and bacteria belonging to the genus Rhizopus obtained in step (A1). You can also do it. Further, after concentrating the culture solution containing the prenylflavonoid monoglycoside obtained in the step (A1), an enzyme having glycosyl transfer activity and, if necessary, a hexose source are added to the obtained concentrated solution to carry out the step (B). You may. Prior to step (B), it is preferable to adjust the pH of the culture solution containing prenylflavonoid monoglycoside or the concentrate of the culture solution to a pH suitable for the enzyme used in step (B).
工程（Ａ２）により製造されるプレニルフラボノイドモノグリコシドは、上記の反応液から、公知の方法で精製して工程（Ｂ）に供してもよいが、精製を行わずに、工程（Ａ２）及び工程（Ｂ）を連続して行ってもよい。工程（Ａ２）で得られるプレニルフラボノイドモノグリコシド及び上記ＵＧＴタンパク質を含む反応液に、工程（Ｂ）で使用される糖転移活性を有する酵素及び必要に応じてヘキソース源を添加して工程（Ｂ）を行うこともできる。工程（Ａ２）で得られるプレニルフラボノイドモノグリコシドを含む反応液を濃縮した後、得られる濃縮液に糖転移活性を有する酵素及び必要に応じてヘキソース源を添加して工程（Ｂ）を行ってもよい。工程（Ｂ）の前に、プレニルフラボノイドモノグリコシドを含む反応液又は反応液の濃縮液のｐＨを、工程（Ｂ）で使用する酵素に適したｐＨに調整することが好ましい。
工程（Ｂ）で使用するヘキソース源は酵素に応じて選択すればよい。一態様においては、グルコース源として、クラスターデキストリン等のデキストリンを使用することが好ましい。ＣＧＴアーゼを使用してグルコースを付加する場合は、クラスターデキストリン等のデキストリン、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン等のシクロデキストリン、可溶性デンプン等のグルコース源が好ましい。グルコース源は１種使用してもよく２種以上を使用してもよい。 The prenylflavonoid monoglycoside produced in the step (A2) may be purified from the above reaction solution by a known method and subjected to the step (B), but the step (A2) and the step (A2) and the step (A2) without purification may be performed. (B) may be performed continuously. The reaction solution containing the prenylflavonoid monoglycoside obtained in the step (A2) and the UGT protein is added with the enzyme having glycosyltransferase activity used in the step (B) and, if necessary, a hexose source in the step (B). Can also be done. After concentrating the reaction solution containing prenylflavonoid monoglycoside obtained in step (A2), an enzyme having glycosyl transfer activity and, if necessary, a hexose source may be added to the obtained concentrate to carry out step (B). Good. Prior to step (B), it is preferable to adjust the pH of the reaction solution containing prenylflavonoid monoglycoside or the concentrated solution of the reaction solution to a pH suitable for the enzyme used in step (B).
The hexose source used in step (B) may be selected according to the enzyme. In one aspect, it is preferable to use a dextrin such as cluster dextrin as the glucose source. When glucose is added using CGTase, a glucose source such as dextrin such as cluster dextrin, cyclodextrin such as α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, γ-cyclodextrin, and soluble starch is preferable. One type of glucose source may be used, or two or more types may be used.
上記工程（Ｂ）により、反応液中には、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２個以上、通常２～１０個（好ましくは２～７個）のヘキソース（ヘキソース残基）から構成される糖鎖が結合しているプレニルフラボノイド配糖体が生成する。工程（Ａ１）又は工程（Ａ２）、及び、工程（Ｂ）を行うことにより、一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体を製造することができる。
生成したプレニルフラボノイド配糖体は、溶液から公知の方法により分離又は精製することができる。具体的には、例えば、合成吸着剤による分離、逆相クロマトグラフィーによる分離、溶解度の変化を利用した析出等を単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。本発明の第一の態様の製造方法及び第二の態様のプレニルフラボノイド配糖体の製造方法は、一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体を精製する工程（Ｄ）を含んでいてもよい。 By the above step (B), 2 or more, usually 2 to 10 (preferably 2 to 7) hexoses (hexoses) are contained in the reaction solution at the 7-position of the prenylflavonoid represented by the general formula (2). A prenylflavonoid glycoside to which a sugar chain composed of (residues) is bound is produced. By performing the step (A1) or the step (A2) and the step (B), a prenylflavonoid glycoside represented by the general formula (1) can be produced.
The produced prenylflavonoid glycoside can be separated or purified from the solution by a known method. Specifically, for example, separation by a synthetic adsorbent, separation by reverse phase chromatography, precipitation utilizing a change in solubility, or the like can be used alone or in combination as appropriate. The method for producing a prenylflavonoid glycoside according to the first aspect of the present invention and the method for producing a prenylflavonoid glycoside according to the second aspect include a step (D) for purifying a prenylflavonoid glycoside represented by the general formula (1). You may.
所望の配糖体が得られたことは、公知の方法（例えば、質量分析、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等）で確認することができる。
本発明の製造方法で得られるプレニルフラボノイド配糖体は、１種であってもよく、アグリコン、糖鎖を構成するヘキソースの種類及び／又は数が異なる２種以上の配糖体の混合物であってもよい。
このように得られたプレニルフラボノイド配糖体は、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等の原料等として有用である。 It can be confirmed by a known method (for example, mass spectrometry, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), high performance liquid chromatography (HPLC), etc.) that the desired glycoside is obtained.
The prenylflavonoid glycoside obtained by the production method of the present invention may be one kind, and is a mixture of two or more kinds of glycosides having different types and / or numbers of aglycones and hexoses constituting sugar chains. You may.
The prenylflavonoid glycoside thus obtained is useful as a raw material for foods and drinks, pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, feeds and the like.
本発明は、以下のプレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法も包含する。
リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を、上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養することにより、上記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ１）を含む、プレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法。
上記のリゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を使用するプレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法を、本発明の第三の態様の製造方法ともいう。
上記（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースから、上記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ２）を含む、プレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法。
上記のタンパク質及びＵＤＰ－ヘキソースを使用するプレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法を、本発明の第四の態様の製造方法ともいう。
本発明の第三の態様の製造方法及び第四の態様の製造方法において、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドは、上記と同じである。
本発明の第三の製造方法において、工程（Ａ１）及びその好ましい態様は、上述した本発明の第一の態様の製造方法における、工程（Ａ１）及びその好ましい態様と同じである。
本発明の第四の態様の製造方法において、工程（Ａ２）及びその好ましい態様は、本発明の第二の態様の製造方法における、工程（Ａ２）及びその好ましい態様と同じである。 The present invention also includes the following methods for producing prenylflavonoid monoglycosides.
By culturing a bacterium belonging to the genus Rhizopus in the presence of a prenylflavonoid represented by the general formula (2) and a hexose source, one hexsource is bound to the 7-position of the prenylflavonoid. A method for producing a prenylflavonoid monoglycoside, which comprises a step (A1) of producing a prenylflavonoid monoglycoside.
The method for producing prenylflavonoid monoglycoside using the above-mentioned bacteria belonging to the genus Rhizopus is also referred to as a production method according to the third aspect of the present invention.
Prenylflavonoid represented by the above general formula (2) by one or more proteins selected from the group consisting of the above (p1), (p2), (p3), (q1), (q2) and (q3). A method for producing a prenylflavonoid monoglycoside, which comprises a step (A2) of producing a prenylflavonoid monoglycoside in which one hexose is bound to the 7-position of the prenylflavonoid from the UDP-hexose.
The method for producing a prenylflavonoid monoglycoside using the above protein and UDP-hexose is also referred to as a production method according to a fourth aspect of the present invention.
In the production method of the third aspect and the production method of the fourth aspect of the present invention, the prenylflavonoid represented by the general formula (2) is the same as described above.
In the third manufacturing method of the present invention, the step (A1) and its preferred embodiment are the same as the step (A1) and its preferred embodiment in the manufacturing method of the first aspect of the present invention described above.
In the production method of the fourth aspect of the present invention, the step (A2) and its preferred embodiment are the same as the step (A2) and its preferred embodiment in the production method of the second aspect of the present invention.
本発明の第三の態様の製造方法及び第四の態様の製造方法において、上記工程（Ａ１）又は（Ａ２）で生成したプレニルフラボノイドモノグリコシドは、培養液又は溶液から公知の方法により分離又は精製することができる。具体的には、例えば、合成吸着剤による分離、逆相クロマトグラフィーによる分離、溶解度の変化を利用した析出等を単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。本発明の第三の態様の製造方法及び第四の態様の製造方法は、生成したプレニルフラボノイドモノグリコシドを精製する工程（Ｃ）を含んでいてもよい。
所望の配糖体が得られたことは、既知のイソキサントフモールモノグリコシド又は８－プレニルナリンゲニンモノグリコシドの構造情報に基づいて、公知の方法（例えば、質量分析、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等）で確認することができる。 In the production method of the third aspect and the production method of the fourth aspect of the present invention, the prenylflavonoid monoglycoside produced in the above steps (A1) or (A2) is separated or purified from the culture solution or solution by a known method. can do. Specifically, for example, separation by a synthetic adsorbent, separation by reverse phase chromatography, precipitation utilizing a change in solubility, or the like can be used alone or in combination as appropriate. The production method of the third aspect and the production method of the fourth aspect of the present invention may include a step (C) of purifying the produced prenylflavonoid monoglycoside.
Obtaining the desired glycoside is based on known structural information of isoxanthohumol monoglycoside or 8-prenylnaringenine monoglycoside (eg, mass spectrometry, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)). ), High performance liquid chromatography (HPLC), etc.).
本発明の第三の態様の製造方法及び第四の態様の製造方法で得られるプレニルフラボノイドモノグリコシドは、イソキサントフモールの７位にヘキソース（好ましくはグルコース）が１個結合しているイソキサントフモールモノグリコシド及び／又は８－プレニルナリンゲニンの７位にヘキソース（好ましくはグルコース）が１個結合している８－プレニルナリンゲニンモノグリコシドである。プレニルフラボノイドモノグリコシドは、例えば、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等の原料として使用することができる。また、プレニルフラボノイドポリグリコシドの原料等として使用することができる。 The prenylflavonoid monoglycoside obtained by the production method of the third aspect and the production method of the fourth aspect of the present invention is isoxan in which one hexose (preferably glucose) is bound to the 7-position of isoxanthohumol. It is an 8-prenylnaringenine monoglycoside in which one hexose (preferably glucose) is bound to the 7-position of tofmol monoglycoside and / or 8-prenylnaringenin. The prenylflavonoid monoglycoside can be used, for example, as a raw material for foods and drinks, pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, feeds and the like. It can also be used as a raw material for prenylflavonoid polyglycosides.
本発明の第一の態様の製造方法、第二の態様の製造方法、第三の態様の製造方法及び第四の態様の製造方法で使用される一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドは、その製造方法等に何ら制限されない。イソキサントフモールは、例えば、ホップ抽出物から加熱等のプロセスを経て調製することができる。ホップ抽出物を加熱することにより、該抽出物中にイソキサントフモールを生成させることができる。ホップ抽出物は、通常、ホップの毬花を溶媒で抽出し、必要に応じて精製に係るプロセスを介して調製され、公知のホップ抽出物の調製方法により得ることができる。抽出方法として、例えば、ビール醸造に用いられるホップ抽出物の調製法として用いられる、エタノール溶媒による抽出法が挙げられる。ホップ抽出物は市販されており、市販のホップ抽出物を使用することもできる。イソキサントフモールを生成させるためのホップ抽出物の加熱は、８０～１４０℃（より好ましくは８５～１００℃）で１５分～５時間（より好ましくは２０分～３時間）行うことが好ましい。イソキサントフモールを調製するためのホップ抽出物の精製は、公知の方法で実施される。精製方法として、例えば、ＨＰＬＣや吸着カラム等の使用や、溶解度の変化を利用した析出などの方法が挙げられる。また、イソキサントフモールは、キサントフモールを加熱することによって製造することもできる。この際の加熱温度は、好ましくは８０～１４０℃（より好ましくは８５～１００℃）で１５分～５時間（より好ましくは２０分～３時間）を採用することができる。異性化処理により得られたイソキサントフモールは、必要に応じて、公知の方法（例えば、ろ過、減圧濃縮、凍結乾燥等）により濃縮したり、精製したりすることができる。イソキサントフモールは、市販品を使用することもできる。 The prenylflavonoid represented by the general formula (2) used in the production method of the first aspect, the production method of the second aspect, the production method of the third aspect and the production method of the fourth aspect of the present invention is , There are no restrictions on the manufacturing method, etc. Isoxanthohumol can be prepared, for example, from a hop extract through a process such as heating. By heating the hop extract, isoxanthohumol can be produced in the extract. The hop extract is usually prepared by extracting the hop flower with a solvent and, if necessary, through a process related to purification, and can be obtained by a known method for preparing a hop extract. Examples of the extraction method include an extraction method using an ethanol solvent, which is used as a method for preparing a hop extract used for beer brewing. The hop extract is commercially available, and a commercially available hop extract can also be used. The heating of the hop extract for producing isoxanthohumol is preferably carried out at 80 to 140 ° C. (more preferably 85 to 100 ° C.) for 15 minutes to 5 hours (more preferably 20 minutes to 3 hours). Purification of the hop extract for preparing isoxanthohumol is carried out by known methods. Examples of the purification method include the use of HPLC, an adsorption column, and the like, and a method such as precipitation utilizing a change in solubility. Isoxanthohumol can also be produced by heating xanthohumol. The heating temperature at this time is preferably 80 to 140 ° C. (more preferably 85 to 100 ° C.) for 15 minutes to 5 hours (more preferably 20 minutes to 3 hours). The isoxanthohumol obtained by the isomerization treatment can be concentrated or purified by a known method (for example, filtration, concentration under reduced pressure, freeze-drying, etc.), if necessary. Commercially available products can also be used for isoxanthohumol.
８－プレニルナリンゲニンは、その製造方法等に何ら制限されない。８－プレニルナリンゲニンは、ホップ等に含まれるプレニルフラボノイドの一種である。８－プレニルナリンゲニンは、例えば、ホップ抽出物から公知の方法で精製して調製することができる。８－プレニルナリンゲニンは、市販品を使用することもできる。
本発明においては、本発明の効果を奏することになる限り、精製されたイソキサントフモール及び／又は８－プレニルナリンゲニンを使用してもよく、イソキサントフモール及び／又は８－プレニルナリンゲニンを豊富に含む植物由来原料等を使用してもよい。 8-Prenyl naringenin is not limited to its production method or the like. 8-Prenyl naringenin is a kind of prenylflavonoid contained in hops and the like. 8-Prenyl naringenin can be prepared, for example, by purifying from a hop extract by a known method. Commercially available products can also be used for 8-prenyl naringenin.
In the present invention, purified isoxanthohumol and / or 8-prenylnaringenin may be used as long as the effects of the present invention are exhibited, and isoxanthohumol and / or 8-prenylnaringenin is abundant. The plant-derived raw materials contained in the above may be used.
＜プレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法、苦味を低減する方法及び安定性を向上させる方法＞
上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソース（ヘキソース残基）から構成される糖鎖を付加することにより、該プレニルフラボノイドの極性を変えることができる。このため、上記プレニルフラボノイドの水溶性を向上させることができる。また、上記糖鎖を付加することにより、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの苦味を低減することができる。さらに、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの安定性を向上させることができる
本発明は、上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、上記プレニルフラボノイドの溶解性を向上させる方法；上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、上記プレニルフラボノイドの苦味を低減する方法；上記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、上記プレニルフラボノイドの安定性を向上させる方法、も包含する。上記方法においては、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖をＯ－グリコシド結合させる。 <Methods for improving the water solubility of prenylflavonoids, methods for reducing bitterness, and methods for improving stability>
The polarity of the prenylflavonoid can be changed by adding a sugar chain composed of 2 to 10 hexoses (hexose residues) to the 7-position of the prenylflavonoid represented by the general formula (2). .. Therefore, the water solubility of the prenylflavonoid can be improved. Further, by adding the above sugar chain, the bitterness of prenylflavonoid represented by the general formula (2) can be reduced. Furthermore, the present invention, which can improve the stability of prenylflavonoid represented by the general formula (2), is derived from 2 to 10 hex sources at the 7-position of prenylflavonoid represented by the general formula (2). A method for improving the solubility of the prenylflavonoid by adding a constituent sugar chain; a sugar chain composed of 2 to 10 hex sauces is placed at the 7-position of the prenylflavonoid represented by the above general formula (2). A method for reducing the bitterness of the prenylflavonoid to be added; the prenylflavonoid to which a sugar chain composed of 2 to 10 hex sauces is added to the 7-position of the prenylflavonoid represented by the general formula (2). It also includes methods for improving stability. In the above method, a sugar chain composed of 2 to 10 hexoses is O-glycosidically bonded to the 7-position of prenylflavonoid represented by the general formula (2).
一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する方法としては、上記の本発明の第一の態様の製造方法又は第二の態様の製造方法における方法と同じ方法を採用することができる。上記工程（Ａ１）又は（Ａ２）により、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースがＯ－グリコシド結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させて、当該プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加することにより、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加することができる。
なお、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全ては、参照として本明細書に組み入れられる。 As a method for adding a sugar chain composed of 2 to 10 hexoses to the 7-position of prenylflavonoid represented by the general formula (2), the production method according to the first aspect of the present invention or the second method described above or the second method. The same method as in the manufacturing method according to the above embodiment can be adopted. By the above steps (A1) or (A2), a prenylflavonoid monoglycoside in which one hexose is O-glycosidic bonded to the 7-position of the prenylflavonoid represented by the general formula (2) is generated to produce the prenylflavonoid. By adding 1 to 9 hexoses to the hexose residue of the monoglycoside, a sugar chain composed of 2 to 10 hexoses is added to the 7-position of prenylflavonoid represented by the general formula (2). be able to.
All academic and patent documents described herein are incorporated herein by reference.
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。尚、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　２００１）に記載の方法に従った。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. The present invention is not limited to these examples.
The molecular biology method used in this example followed the method described in Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001), unless otherwise detailed.
＜実施例１＞
植物酵素によるイソキサントフモール（以下、ＩＸとも記載する）のグルコシル化反応によるイソキサントフモール配糖体の生産 <Example 1>
Production of isoxanthohumol glycosides by glucosylation reaction of isoxanthohumol (hereinafter, also referred to as IX) by a plant enzyme
（ＵＧＴについて）
植物においては特定のフラボノイドの位置特異的にＵＤＰ（ウリジン二リン酸）糖をドナーとして糖を転移する活性を有するＵＤＰ糖転移酵素（ＵＧＴ）遺伝子がゲノム中に１００を超える多重コピーとして存在しており、多くは低分子有機化合物の配糖体化に関わっていると考えられている。しかしながら前述のようにこれまでにプレニルフラボノイドに対して配糖化活性のある植物ＵＧＴは同定されていないために、配列から候補遺伝子の推定をすることはできなかった。 (About UGT)
In plants, the UDP glycosyltransferase (UGT) gene, which has the activity of transferring sugars using UDP (uridine diphosphate) sugar as a donor in a position-specific manner for a specific flavonoid, exists as multiple copies in the genome of more than 100. Most of them are considered to be involved in glycoside formation of low molecular weight organic compounds. However, as described above, since a plant UGT having a glycosylation activity against prenylflavonoid has not been identified so far, it has not been possible to estimate a candidate gene from the sequence.
（植物ＵＧＴの選定）
そこで、既報のフラボノイドＵＧＴの位置特異性の情報に基づいて、フラボノイドの７位を配糖体化できるＵＧＴとしてダイズ由来のＧｍ＿ＵＧＴ１／ＩＦ７ＧｌｃＴ／ＵＧＴ８８Ｅ３（参考文献１：Ｎｏｇｕｃｈｉ　Ａ　ｅｔ　ａｌ　（２００７）　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２８２（３２）：２３５８１－２３５９０及び参考文献２：Ｆｕｎａｋｉ　Ａ　ｅｔ　ａｌ　（２０１５）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　５６（８）：１５１２－１５２０）と、フラボノイド３位に特異性のあるＵＧＴであるブドウのフラボノイド３位グルコース・ガラクトース転移酵素ＶｖＧＴ６（参考文献３：Ｏｎｏ　Ｅ　ｅｔ　ａｌ　（２０１０）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　２２（８）：２８５６－２８７１）について、ＩＸへの反応性を検討した。
ダイズ由来のＵＧＴであるＧｍ＿ＵＧＴ１／ＩＦ７ＧｌｃＴ／ＵＧＴ８８Ｅ３（Ｇｍ＿ＵＧＴ１ともいう）（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＡＢ２９２１６４）のアミノ酸配列を、配列番号１に示す。ブドウ由来のＵＧＴであるＶｖＧＴ６（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＡＢ４９９０７５）のアミノ酸配列を、配列番号２に示す。Ｇｍ＿ＵＧＴ１をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号３に、ＶｖＧＴ６をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号４にそれぞれ示す。 (Selection of plant UGT)
Therefore, based on the previously reported information on the position specificity of flavonoid UGT, Gm_UGT1 / IF7GlcT / UGT88E3 derived from soybean as a UGT capable of glycoside the 7-position of flavonoid (Reference 1: Noguchi A et al (2007) J Biol). Chem. 282 (32): 23581-23590 and Reference 2: Funaki A et al (2015) Plant Cell Physiol. 56 (8): 1522-1520) and grapes, which are UGTs specific to the flavonoid 3-position. Flavonoid 3-position Glucuronosyltransferase VvGT6 (Reference 3: Ono E et al (2010) Plant Cell 22 (8): 2856-2871) was examined for its reactivity to IX.
The amino acid sequence of Gm_UGT1 / IF7GlcT / UGT88E3 (also referred to as Gm_UGT1) (ACCESSION AB292164), which is a soybean-derived UGT, is shown in SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence of VvGT6 (ACCESSION AB499075), which is a grape-derived UGT, is shown in SEQ ID NO: 2. The nucleotide sequence of the DNA encoding Gm_UGT1 is shown in SEQ ID NO: 3, and the nucleotide sequence of the DNA encoding VvGT6 is shown in SEQ ID NO: 4.
（組換えタンパク質の発現及び精製）
Ｇｍ＿ＵＧＴ１及びＶｖＧＴ６について、既報の方法（参考文献１～３）に従って、大腸菌発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にそれぞれのｃＤＮＡをＮ末にＨｉｓＴａｇを付加した形でクローン化し、大腸菌Ｏｎｅ　ＳｈｏｔＴＭ　ＢＬ２１　ＳｔａｒＴＭ　（ＤＥ３）　ｃｅｌｌｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に形質転換し、アンピシリンで組換え大腸菌（以下、組換え大腸菌（ＢＬ２１／ＤＥ３）ともいう）を選抜した。形質転換体（組換え大腸菌）はＬＢ培地（５０ｍＬ）で培養し、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ　ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ　Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を使ってタンパク質を発現させた。集菌した大腸菌からＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を使って組換えタンパク質を抽出し、ＨｉｓＴｒａｐＴＭ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）カラムを用いて、目的のＵＧＴタンパク質を精製した。 (Expression and purification of recombinant protein)
For Gm_UGT1 and VvGT6, each cDNA was cloned into an Escherichia coli expression vector pET15b (manufactured by Novagen) with HisTag added to the N-terminal according to the previously reported methods (References 1 to 3), and Escherichia coli One Shot TM BL21 Star TM was cloned. (DE3) Cells (manufactured by Thermo Fisher Scientific) was transformed, and recombinant Escherichia coli (hereinafter, also referred to as recombinant Escherichia coli (BL21 / DE3)) was selected with ampicillin. The transformant (recombinant Escherichia coli) was cultured in LB medium (50 mL), and the protein was expressed using Overnight Expression TM Autumn System 1 (manufactured by Novagen). Recombinant protein was extracted from the collected Escherichia coli using BugBuster (registered trademark) Protein Extension Reagent (manufactured by Merck Millipore), and the target UG was obtained using a HisTrap TM High Performance (manufactured by GE Healthcare) column. did.
（小スケール酵素反応）
組換え大腸菌の培養液（５０ｍＬ）から調製した組換えＵＧＴタンパク質を用いて小スケールで活性評価を行った。
組換えＵＧＴタンパク質（Ｇｍ＿ＵＧＴ１又はＶｖＧＴ６）に、ＩＸ（糖受容体）、ＵＤＰ－グルコース（糖供与体）をそれぞれ終濃度０．２ｍＭ、２ｍＭ濃度で加え、０．１ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）中で３０℃で２時間反応させた。反応液に等量のアセトニトリルを添加することで反応を停止し、Ｍｉｌｌｅｘ　フィルター（ＬＨ－４、０．４５μｍ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過し、遠心後の上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。 (Small scale enzyme reaction)
The activity was evaluated on a small scale using the recombinant UGT protein prepared from the culture solution of recombinant Escherichia coli (50 mL).
To the recombinant UGT protein (Gm_UGT1 or VvGT6), IX (glycosyl acceptor) and UDP-glucose (glycosyl donor) were added at a final concentration of 0.2 mM and 2 mM, respectively, and 0.1 mM potassium phosphate buffer (pH 7. In 5), the reaction was carried out at 30 ° C. for 2 hours. The reaction was stopped by adding an equal amount of acetonitrile to the reaction solution, filtered through a Millex filter (LH-4, 0.45 μm, manufactured by Merck Millipore), and the supernatant after centrifugation was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC). Analyzed in.
（生成物の分析）
代表的なＨＰＬＣの条件は下記の通りである。
（条件（Ａ））
（装置）
Ｓｙｓｔｅｍ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ：ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＳＩＬ－２０ＡＣ
Ｐｕｍｐ：Ａ、Ｂ：ＬＣ－１０ＡＤ
ＤＩＯＤＥ　ＡＲＲＡＹ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ：ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ（いずれも（株）島津製作所製）
（分析条件）
カラム：Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＦＣ－ＯＤＳ　１５０ｍｍ×４．６ｍｍφ３μｍ（（株）島津製作所製）
移動相：Ａ液：０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／水、Ｂ液：０．１％ＴＦＡ／１００％ＣＨ３ＣＮ
流速：０．６ｍＬ／分
グラジエントプログラム（Ｂ液濃度（％）はｖｏｌ％）：Ｂ液２０％→７０％（１０ｍｉｎ）、Ｂ液７０％（６ｍｉｎ）、Ｂ液７０％→２０％（０．５ｍｉｎ）、Ｂ液２０％（１３．５ｍｉｎ）
カラムオーブン：４０℃
ＰＤＡ検出：２３０～５００ｎｍを測定
サンプル注入量：１０μＬ (Analysis of product)
Typical HPLC conditions are as follows.
(Condition (A))
(apparatus)
System Controller: SHIMADZU SIL-20AC
Pump: A, B: LC-10AD
Diode ARRAY Detector: SHIMADZU SPD-M20A (both manufactured by Shimadzu Corporation)
(Analysis conditions)
Column: Sim-pack FC-ODS 150 mm x 4.6 mm φ3 μm (manufactured by Shimadzu Corporation)
Mobile phase: Solution A: 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) / water, Solution B: 0.1% TFA / 100% CH 3 CN
Flow velocity: 0.6 mL / min Gradient program (B solution concentration (%) is vol%): B solution 20% → 70% (10 min), B solution 70% (6 min), B solution 70% → 20% (0. 5 min), B liquid 20% (13.5 min)
Column oven: 40 ° C
PDA detection: Measure 230-500 nm Sample injection volume: 10 μL
（結果）グルコース転移酵素
図１は、大腸菌に発現させたブドウ由来ＵＧＴ（ＶｖＧＴ６）を用いて、ＵＤＰ－グルコース及びイソキサントフモール（ＩＸ）を反応させた反応液のＨＰＬＣ分析結果（クロマトグラム）を示す図である（検出：２８０ｎｍ）。図２は、大腸菌に発現させたダイズ由来ＵＧＴ（Ｇｍ＿ＵＧＴ１）を用いて、ＵＤＰ－グルコース及びＩＸを反応させた反応液のＨＰＬＣ分析結果（クロマトグラム）を示す図である（検出：２８０ｎｍ）。
図中、ＩＸは、基質であるイソキサントフモールを、Ｐは、生成物を示す。 (Results) Glucose transferase Fig. 1 shows the HPLC analysis result (chromatogram) of the reaction solution obtained by reacting UDP-glucose and isoxanthohumol (IX) with grape-derived UGT (VvGT6) expressed in Escherichia coli. (Detection: 280 nm). FIG. 2 is a diagram showing HPLC analysis results (chromatogram) of a reaction solution obtained by reacting UDP-glucose and IX using a soybean-derived UGT (Gm_UGT1) expressed in Escherichia coli (detection: 280 nm).
In the figure, IX indicates the substrate isoxanthohumol, and P indicates the product.
ＶｖＧＴ６は、ＵＤＰ－グルコースを糖供与体としたときに、ＩＸにグルコースが付加したＩＸグルコシドと思われる生成物（図１中に矢印で示すＰのピーク）が認められた（図１）。Ｇｍ＿ＵＧＴ１は、ＵＤＰ－グルコースを糖供与体としたときに、ＩＸグルコシドと思われる生成物（図２中に矢印で示すＰのピーク）が認められた（図２）。
以上の結果から、植物由来のフラボノイドＵＧＴを用いて、イソキサントフモールをグルコシル化できることが明らかとなった。 In VvGT6, when UDP-glucose was used as a sugar donor, a product (P peak indicated by an arrow in FIG. 1) was observed in which glucose was added to IX, which was considered to be an IX glucoside (FIG. 1). In Gm_UGT1, a product (the peak of P indicated by the arrow in FIG. 2), which seems to be IX glucoside, was observed when UDP-glucose was used as a sugar donor (FIG. 2).
From the above results, it was clarified that isoxanthohumol can be glucosylated using the plant-derived flavonoid UGT.
＜実施例２＞
下記の条件で調製したＧｍ＿ＵＧＴ１を用いてＩＸの大量グルコシル化反応を試みた。実施例１で作製したＧｍ＿ＵＧＴ１を組み込んだ組換え大腸菌（ＢＬ２１／ＤＥ３）を、３ＬのＬＢ培地で３０℃で２日間培養し、集菌した菌体すべてを実験に供した。集菌した菌体から、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔキット（メルク社）を用いて、製造業者が推奨する方法で、Ｇｍ＿ＵＧＴ１の粗タンパク質液を調製した。 <Example 2>
A large-scale glucosylation reaction of IX was attempted using Gm_UGT1 prepared under the following conditions. The recombinant Escherichia coli (BL21 / DE3) incorporating Gm_UGT1 prepared in Example 1 was cultured in 3 L of LB medium at 30 ° C. for 2 days, and all the collected bacterial cells were subjected to the experiment. From the collected cells, a crude protein solution of Gm_UGT1 was prepared by the method recommended by the manufacturer using the BugBuster (registered trademark) Protein Extraction Reagent Kit (Merck & Co., Inc.).
（反応条件）
基質：ＩＸ（純度約９５％）約５０ｍｇ／２５ｍＬの濃度でＤＭＦに溶解
ＵＤＰ－グルコース（ＵＤＰ－Ｇｌｃ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をＩＸの１０等量（８６２ｍｇ）を添加
酵素液：Ｇｍ＿ＵＧＴ１の粗酵素及び精製酵素の混合液（上記で調製したＧｍ＿ＵＧＴ１粗タンパク質液７ｍＬと、実施例１の方法で精製した精製酵素２ｍＬとの混合液）
温度：３５℃
バッファー：０．１Ｍ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）
酵素液を、プレインキュベートし、ＵＤＰ－Ｇｌｃを水で溶かして添加した。ボリュームは４５０ｍＬでバッファー中で反応させた。基質ＩＸは５０ｍｇ／２５ｍＬでＤＭＦに溶解したものを８ｍＬずつ反応０分と、０．５時間後に添加し、反応開始から１時間後に９ｍＬ添加した。反応開始から２２時間後に、反応液に等量のアセトニトリルを添加することで反応を停止し、Ｍｉｌｌｅｘ　フィルター（ＬＨ－４、０．４５μｍ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過し、遠心後の上清を実施例１と同じ方法でＨＰＬＣで分析した。 (Reaction condition)
Substrate: IX (purity about 95%) dissolved in DMF at a concentration of about 50 mg / 25 mL UDP-glucose (UDP-Glc) (manufactured by Sigma-Aldrich) is added in an equal amount (862 mg) of IX Enzyme solution: Gm_UGT1 Mixed solution of crude enzyme and purified enzyme (mixed solution of 7 mL of Gm_UGT1 crude protein solution prepared above and 2 mL of purified enzyme purified by the method of Example 1)
Temperature: 35 ° C
Buffer: 0.1M potassium phosphate buffer (pH 7.5)
The enzyme solution was pre-incubated and UDP-Glc was added dissolved in water. Volumes were reacted in buffer at 450 mL. Substrate IX was dissolved in DMF at 50 mg / 25 mL, and 8 mL each was added at 0 minutes and 0.5 hours after the reaction, and 9 mL was added 1 hour after the start of the reaction. Twenty-two hours after the start of the reaction, the reaction was stopped by adding an equal amount of acetonitrile to the reaction solution, filtered through a Millex filter (LH-4, 0.45 μm, manufactured by Merck Millipore), and the supernatant after centrifugation was obtained. It was analyzed by HPLC in the same manner as in Example 1.
＜結果＞
ＵＤＰ－グルコース及びＩＸをＧｍ＿ＵＧＴ１により反応させた反応液をＨＰＬＣで分析したところ、図２に示すＨＰＬＣクロマトグラムと同様の結果が得られた。反応２２時間後の生成物（ＩＸグルコシド）と残存基質（ＩＸ）の面積比から算出したところ、ＩＸについては反応収率７６．７％（理論収率５５．９ｍｇ）であった。 <Result>
When the reaction solution obtained by reacting UDP-glucose and IX with Gm_UGT1 was analyzed by HPLC, the same result as the HPLC chromatogram shown in FIG. 2 was obtained. When calculated from the area ratio of the product (IX glucoside) and the residual substrate (IX) 22 hours after the reaction, the reaction yield for IX was 76.7% (theoretical yield 55.9 mg).
（ＩＸグルコシドの精製）
生成物（ＩＸグルコシド）のピークの画分を、Ｓｅｐ－Ｐａｋカラムを用いてステップワイズに溶出することで精製を行った。反応生成物のピークの画分を３５ｃｃのＳｅｐ－ｐａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）に負荷し、水洗い３ＣＶ（カラムボリューム）、５％アセトニトリル水溶液３ＣＶ、４０％アセトニトリル水溶液３ＣＶ、８０％アセトニトリル水溶液３ＣＶでステップワイズに溶出した。水洗い及び５％アセトニトリル水溶液画分はピークがなく、４０％アセトニトリル水溶液溶出画分にＩＸグルコシドが検出された。
この生成物をさらに分取ＨＰＬＣで精製し、ＮＭＲ測定に供した。 (Purification of IX glucoside)
The peak fraction of the product (IX glucoside) was purified by eluting stepwise using a Sep-Pak column. The peak fraction of the reaction product was loaded onto 35 cc of Sep-pakC18 (manufactured by Waters) and stepwise with 3 CV (column volume) washed with water, 3 CV of 5% acetonitrile aqueous solution, 3 CV of 40% acetonitrile aqueous solution, and 3 CV of 80% acetonitrile aqueous solution. Eluted into. There was no peak in the washing with water and the 5% acetonitrile aqueous solution fraction, and IX glucoside was detected in the 40% acetonitrile aqueous solution elution fraction.
The product was further purified by preparative HPLC and subjected to NMR measurements.
（構造決定）
ＮＭＲ測定はＣＤ３ＯＤ中で実施した。表１及び図３に、組換えＵＧＴ（Ｇｍ＿ＵＧＴ１）による、ＵＤＰ－グルコース及びイソキサントフモール（ＩＸ）の反応生成物のＮＭＲ測定の結果を示す。表１は、１Ｈ及び１３Ｃの化学シフトである。図３は、ＩＸへの糖結合位置の決定の鍵となるＨＭＢＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｂｏｎｄ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）、ＮＯＥ（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ　Ｅｆｆｅｃｔ）の結果である。表１中、化学シフト（δ）の単位はｐｐｍ、カップリング定数（Ｊ）の単位はＨｚである。
これにより、生成物は、ＩＸの７位にグルコースが１つ付加されたイソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧと記載することもある）であることが確認された。表１中、化学シフト（δ）の単位はｐｐｍ、カップリング定数（Ｊ）の単位はＨｚである。 (Structural determination)
NMR measurements were performed in CD 3 OD. Table 1 and FIG. 3 show the results of NMR measurement of the reaction products of UDP-glucose and isoxanthohumol (IX) by recombinant UGT (Gm_UGT1). Table 1 shows the chemical shifts of 1 H and 13 C. FIG. 3 shows the results of HMBC (Heteroncular Multiple Bond Correlation) and NOE (Nuclear Overhauser Effect), which are the keys to determine the sugar binding position to IX. In Table 1, the unit of chemical shift (δ) is ppm, and the unit of coupling constant (J) is Hz.
This confirmed that the product was an isoxanthohumol monoglucoside (sometimes referred to as IXG) in which one glucose was added at the 7-position of IX. In Table 1, the unit of chemical shift (δ) is ppm, and the unit of coupling constant (J) is Hz.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
＜実施例３＞
糸状菌によるＩＸのグルコシル化反応によるイソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）の生産
これまで、糸状菌のもつ配糖化活性により、プレニルフラボノイドを配糖体化した例が報告されているが（前述の非特許文献４）、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属においてＩＸをグルコシル化する活性については確認されていない。表２に示した２１株のＲｈｉｚｏｐｕｓ属糸状菌を収集し使用した。 <Example 3>
Production of isoxanthohumol monoglucoside (IXG) by glucosylation reaction of IX by filamentous fungi So far, there have been reports of cases where prenylflavonoids are glycosided by the glycosyllating activity of filamentous fungi (described above). Non-Patent Document 4), the activity of glucosylating IX in the genus Rhizopus has not been confirmed. The 21 strains of Rhizopus filamentous fungi shown in Table 2 were collected and used.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
（胞子懸濁液の調製）
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属糸状菌をＰｏｔａｔｏ　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　Ａｇａｒ（ＰＤＡ、Ｄｉｆｃｏ（登録商標）　ベクトン・ディッキンソン社製）プレートに植菌し、２５℃、６日間培養した。胞子懸濁液を得るために、プレートに０．１％ｔｗｅｅｎ８０、０．８％ＮａＣｌを加え、胞子を懸濁した。ミラクロス（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）でろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、０．１％ｔｗｅｅｎ８０、０．８％ＮａＣｌで洗浄し、滅菌水に懸濁し、胞子数が１ｍＬあたり１０７個となるように調製し、胞子懸濁液とした。 (Preparation of spore suspension)
Rhizopus filamentous fungi were inoculated on Potato Glucose Agar (PDA, Difco®, manufactured by Becton Dickinson) plates and cultured at 25 ° C. for 6 days. To obtain a spore suspension, 0.1% tween80, 0.8% NaCl was added to the plate and the spores were suspended. After filtered through Miracloth (Calbiochem Corp.) and collected conidia by centrifugation, further washed with 0.1% tween80,0.8% NaCl, was suspended in sterilized water, 10 7 per number spore 1mL It was prepared as a spore suspension.
（イソキサントフモールの配糖化（１））
Ｐｏｔａｔｏ　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　Ｂｒｏｔｈ（ＰＤ、Ｄｉｆｃｏ（登録商標）　ベクトン・ディッキンソン社製）５００μＬに、２０ｍＭイソキサントフモール（ＩＸ、東京化成工業（株）製）エタノール溶液を５μＬ、胞子懸濁液を５μＬ添加して、２５℃、３日間、振とう培養した。遠心分離により培養上清と菌体を回収した。培養上清とアセトニトリルを１：１で混和し、ＧＬクロマトディスク　４Ｐ　０．４５μｍ（ジーエルサイエンス（株）製）でろ過し、培養上清のＬＣ分析サンプルとした。一方、回収した菌体に２ｍＬの酢酸エチルを添加し、激しく撹拌した後、遠心分離し、溶媒層を回収した。遠心濃縮機で溶媒を除去した後、残渣を２００μＬの５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、ＧＬクロマトディスク　４Ｐ　０．４５μｍでろ過し、菌体のＬＣ分析サンプルとした。比較のために、イソキサントフモールエタノール溶液の代わりにエタノールを添加した以外は同じ操作を行い、比較用の培養上清及び菌体のＬＣ分析サンプルを調製した。調製したＬＣ分析サンプルを、下記のＬＣ分析条件（Ｂ）で、ＨＰＬＣで分析した。 (Isoxanthohumol saccharification (1))
Add 5 μL of 20 mM isoxanthohumol (IX, manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) ethanol solution and 5 μL of spore suspension to 500 μL of Potato Dextrose Bross (PD, Difco®, manufactured by Becton Dickinson). , 25 ° C. for 3 days with shaking culture. The culture supernatant and bacterial cells were collected by centrifugation. The culture supernatant and acetonitrile were mixed 1: 1 and filtered through a GL chromatodisk 4P 0.45 μm (manufactured by GL Sciences Co., Ltd.) to prepare an LC analysis sample of the culture supernatant. On the other hand, 2 mL of ethyl acetate was added to the recovered cells, and the mixture was vigorously stirred and then centrifuged to recover the solvent layer. After removing the solvent with a centrifugal concentrator, the residue was dissolved in 200 μL of a 50% aqueous acetonitrile solution and filtered through a GL chromatodisk 4P 0.45 μm to prepare an LC analysis sample of the cells. For comparison, the same operation was performed except that ethanol was added instead of the isoxanthohumol ethanol solution, and a culture supernatant for comparison and an LC analysis sample of the cells were prepared. The prepared LC analysis sample was analyzed by HPLC under the following LC analysis condition (B).
ＬＣ分析条件（Ｂ）
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ　４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ（ナカライテスク（株）製）
Ａ液：０．１％ＴＦＡ　２：８（ｖ／ｖ）ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ
Ｂ液：０．１％ＴＦＡ　８：２（ｖ／ｖ）ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエントプログラム（Ｂ液濃度（％）はｖｏｌ％）：Ｂ液０％→８５％（１５ｍｉｎ）、Ｂ液８５％（１０ｍｉｎ）、Ｂ液８５％→０％（０．５ｍｉｎ）、Ｂ液０％（１５．５ｍｉｎ）
検出：２８０ｎｍ
サンプル注入量：１０μＬ LC analysis condition (B)
Column: COSMOSIL 5C 18- AR-II 4.6 mm I. D. × 250 mm (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.)
Solution A: 0.1% TFA 2: 8 (v / v) CH 3 CN: H 2 O
Solution B: 0.1% TFA 8: 2 (v / v) CH 3 CN: H 2 O
Flow velocity: 0.6 mL / min
Gradient program (B solution concentration (%) is vol%): B solution 0% → 85% (15 min), B solution 85% (10 min), B solution 85% → 0% (0.5 min), B solution 0% (15.5 min)
Detection: 280 nm
Sample injection volume: 10 μL
図４Ａに、ＩＸを添加して培養を行ったＲ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９の培養上清のＨＰＬＣ分析結果を示す（検出：２８０ｎｍ）。図４Ｂに、ＩＸを添加せずに培養を行ったＩＡＭ６０４９の培養上清（比較用分析サンプル）のＨＰＬＣ分析結果を示す（検出：２８０ｎｍ）。ＨＰＬＣ分析の結果、生成物のリテンションタイムはどの株でも同じであり、先に同定したＩＸの７位にグルコースが１つ付加されたＩＸＧのリテンションタイムとも一致した。
調査したすべての株の培養上清の分析結果を図５Ａに、菌体の分析結果を図５Ｂに示した。図５Ａ及び図５Ｂに示す結果は、いずれも培地あたりのピーク面積である。図５Ａ及び図５Ｂ中、■はイソキサントフモールの７位にグルコースが１つグリコシド結合したイソキサントフモール配糖体（ＩＸＧ）（図５Ａ及び図５Ｂ中）であり、□はイソキサントフモール（ＩＸ）である。生成物がＩＸＧであることは、生成物を精製後にＮＭＲで分析して確認した。
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属糸状菌（Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｒ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ、Ｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　ｖａｒ．　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒ、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ、Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ）にはＩＸをＩＸＧに変換する活性があることが分かった。 In FIG. 4A, R. IX was added and cultured. The results of HPLC analysis of the culture supernatant of oryzae IAM6049 are shown (detection: 280 nm). FIG. 4B shows the results of HPLC analysis of the culture supernatant (comparative analysis sample) of IAM6049 cultured without adding IX (detection: 280 nm). As a result of HPLC analysis, the retention time of the product was the same in all the strains, and it was also consistent with the retention time of IXG in which one glucose was added to the 7-position of the previously identified IX.
The analysis results of the culture supernatants of all the investigated strains are shown in FIG. 5A, and the analysis results of the bacterial cells are shown in FIG. 5B. The results shown in FIGS. 5A and 5B are both peak areas per medium. In FIGS. 5A and 5B, ■ is an isoxanthohumol glycoside (IXG) in which one glucose is glycosidic bonded to the 7-position of isoxanthohumol (in FIGS. 5A and 5B), and □ is isoxanthohumol. It is a mall (IX). The fact that the product was IXG was confirmed by analyzing the product by NMR after purification.
It has been found that Rhizopus filamentous fungi (R. microsporus, R. oligosporus, R. chinensis, R. chinensis var. It was.
（イソキサントフモール配糖化（２））
５００ｍＬの坂口フラスコに１００ｍＬのＰＤ培地を入れ、５０ｍｇ／ｍＬイソキサントフラブ（ＩＸ　９０％以上含有、Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社製）エタノール溶液を２００μＬ添加した。１Ｍリン酸カリウムバッファーを培地に１／１０添加する水準と、添加しない水準を設けた。Ｒ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ　ＩＦＯ３１９８７又はＲ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９の胞子懸濁液を１００μＬ植菌し、２５℃、４日間、振とう培養した。桐山濾紙（５Ａ）（有限会社桐山製作所製）で菌体と培養上清を分離した。各培養上清のｐＨを測定し、イソキサントフモールの配糖化（１）に記載の方法に従って処理し、ＨＰＬＣ分析した。結果を表３に示した。表３のバッファーの欄の「＋」は、培地に１Ｍリン酸カリウムバッファーを添加した水準であり、「－」は添加しなかった水準である。Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９株では、バッファーの有無にかかわらず、培地中のＩＸはほぼＩＸＧに変換された。 (Ixanthohumol saccharification (2))
100 mL of PD medium was placed in a 500 mL Sakaguchi flask, and 200 μL of 50 mg / mL isoxanthoflav (containing 90% or more of IX, manufactured by Hopstainer) ethanol solution was added. A level at which 1/10 potassium phosphate buffer was added to the medium and a level at which 1 M potassium phosphate buffer was not added were set. R. oligosporus IFO31987 or R. A 100 μL spore suspension of oryzae IAM6049 was inoculated and cultured with shaking at 25 ° C. for 4 days. The cells and the culture supernatant were separated with Kiriyama filter paper (5A) (manufactured by Kiriyama Glass Co., Ltd.). The pH of each culture supernatant was measured, treated according to the method described in saccharification of isoxanthohumol (1), and analyzed by HPLC. The results are shown in Table 3. “+” In the buffer column of Table 3 is the level at which 1M potassium phosphate buffer was added to the medium, and “−” is the level at which 1M potassium phosphate buffer was not added. R. In the oryzae IAM6049 strain, IX in the medium was converted to approximately IXG with or without buffer.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
（イソキサントフモールの配糖化（３））
培地に、ＰＤ培地、又は、窒素源にポテトペプトンＣＰを、炭素源にグルコースを使用した培地を使用した。５００ｍＬの坂口フラスコに１００ｍＬの各種培地を入れ、５０ｍｇ／ｍＬイソキサントフラブ（ＩＸ　９０％以上含有、Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社製）エタノール溶液を２００μＬ添加した。窒素源として、ポテトペプトンＣＰ（ＰＰ、極東製薬工業（株）製）、炭素源としてグルコース（Ｇ）を用いた培地については、ポテトペプトンＣＰ濃度は０．２％とし、グルコース濃度は０．２％、０．５％又は１．０％とした。表４について、例えばＰＰ（０．２）Ｇ（０．２）と記載したものはポテトペプトンＣＰが０．２％、グルコースが０．２％の培地であることを示す。これに、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６２５６の胞子懸濁液を１００μＬ添加し、２５℃、２日間振とう培養した。桐山濾紙（５Ａ）で菌体と培養上清を分離した。各培養上清のｐＨを測定し、イソキサントフモールの配糖化（１）に記載の方法に従って処理し、ＨＰＬＣ分析した。結果を表４に示した。培養２日間で培地中のＩＸはほぼＩＸＧに変換されており、０．２％以上のグルコース添加では変換率に大きな違いはなかった。 (Isoxanthohumol saccharification (3))
As the medium, PD medium or a medium using potato peptone CP as a nitrogen source and glucose as a carbon source was used. 100 mL of various media were placed in a 500 mL Sakaguchi flask, and 200 μL of 50 mg / mL isoxanthoflav (containing 90% or more of IX, manufactured by Hopstainer) ethanol solution was added. For media using potato peptone CP (PP, manufactured by Far East Pharmaceutical Co., Ltd.) as a nitrogen source and glucose (G) as a carbon source, the potato peptone CP concentration was 0.2% and the glucose concentration was 0.2. %, 0.5% or 1.0%. In Table 4, for example, PP (0.2) G (0.2) indicates that the medium contains 0.2% potato peptone CP and 0.2% glucose. In addition to this, R. 100 μL of a spore suspension of oryzae IAM6256 was added, and the mixture was shake-cultured at 25 ° C. for 2 days. The cells and the culture supernatant were separated with Kiriyama filter paper (5A). The pH of each culture supernatant was measured, treated according to the method described in saccharification of isoxanthohumol (1), and analyzed by HPLC. The results are shown in Table 4. IX in the medium was almost converted to IXG in 2 days of culturing, and there was no significant difference in the conversion rate when glucose was added at 0.2% or more.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
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＜実施例４＞
８－プレニルナリンゲニンの配糖化
ＰＤ培地２ｍＬに５０ｍｇ／ｍＬの８－プレニルナリンゲニンエタノール溶液を４μＬ添加し、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９又はＩＡＭ６２５６の胞子懸濁液を２μＬ植菌し、２５℃で３日間振とう培養した。遠心分離により、培養上清と菌体を回収した。培養上清とアセトニトリルを１：１で混和し、ＧＬクロマトディスク　４Ｐ　０．４５μｍ（ジーエルサイエンス（株）製）でろ過し、培養上清のＬＣ分析サンプルとした。比較のため、８－プレニルナリンゲニンエタノール溶液を添加し、胞子懸濁液を添加しないＰＤ培地の上清を準備した。サンプルを、実施例３に記載のＬＣ分析条件（Ｂ）でＨＰＬＣ分析した。 <Example 4>
To 2 mL of a saccharified PD medium of 8-prenylnaringenin, 4 μL of a 50 mg / mL 8-prenylnaringenin ethanol solution was added, and R. 2 μL of a spore suspension of oryzae IAM6049 or IAM6256 was inoculated and cultured with shaking at 25 ° C. for 3 days. The culture supernatant and bacterial cells were collected by centrifugation. The culture supernatant and acetonitrile were mixed 1: 1 and filtered through a GL chromatodisk 4P 0.45 μm (manufactured by GL Sciences Co., Ltd.) to prepare an LC analysis sample of the culture supernatant. For comparison, an ethanol solution of 8-prenylnaringenin was added, and a supernatant of PD medium without adding a spore suspension was prepared. The sample was HPLC analyzed under the LC analysis condition (B) described in Example 3.
分析結果を図６Ａ及び図６Ｂに示す（検出：２８０ｎｍ）。図６Ａは、８－プレニルナリンゲニンを添加し、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９を添加しなかったＰＤ培地上清のＨＰＬＣ分析結果（クロマトグラム）である。図６Ｂは、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０４９を８－プレニルナリンゲニン含有培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果（クロマトグラム）である。図６Ａ中の８－ＰＮは、８－プレニルナリンゲニンを、図６Ｂ中の８－ＰＮＧは、８－プレニルナリンゲニンにグルコースが１つ付加した８－プレニルナリンゲニン配糖体（８－ＰＮＧ）を指す。８－プレニルナリンゲニン含有培地で培養した場合でも配糖体のピークが検出された。 The analysis results are shown in FIGS. 6A and 6B (detection: 280 nm). In FIG. 6A, 8-prenylnaringenin was added and R. It is the HPLC analysis result (chromatography) of the PD medium supernatant to which oryzae IAM6049 was not added. FIG. 6B shows R. It is the HPLC analysis result (chromatography) of the culture supernatant which cultivated oryzae IAM6049 in the medium containing 8-prenylnaringenin. 8-PN in FIG. 6A refers to 8-prenylnaringenin, and 8-PNG in FIG. 6B refers to 8-prenylnaringenin glycoside (8-PNG) in which one glucose is added to 8-prenylnaringenin. Glycoside peaks were also detected when culturing in a medium containing 8-prenylnaringenin.
＜実施例５＞
（ＣＧＴａｓｅ反応のサンプル調製）
５００ｍＬの坂口フラスコに１００ｍＬのＰＤ培地を入れ、５０ｍｇ／ｍＬイソキサントフラブ（ＩＸ　９０％以上含有、Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社製）エタノール溶液を２００μＬ添加した。Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６０２２、ＩＡＭ６０４９、ＩＡＭ６０６７、ＩＡＭ６２５６又はＮＲＲＬ３９５の胞子懸濁液１００μＬを各２本の前記坂口フラスコに植菌し、２５℃で３日間培養した。培養終了後、桐山濾紙（５Ａ）（有限会社桐山製作所製）で菌体と培養上清を分離した。各フラスコの培養上清中のＩＸＧとＩＸの量を実施例１に記載の条件（Ａ）のＨＰＬＣ分析条件で分析した。各フラスコの培養上清中のＩＸＧ及びＩＸの濃度を表５に示す。 <Example 5>
(Sample preparation of CGTase reaction)
100 mL of PD medium was placed in a 500 mL Sakaguchi flask, and 200 μL of 50 mg / mL isoxanthoflav (containing 90% or more of IX, manufactured by Hopstainer) ethanol solution was added. R. 100 μL of spore suspension of oryzae IAM6022, IAM6049, IAM6067, IAM6256 or NRRL395 was inoculated into each of the two Sakaguchi flasks and cultured at 25 ° C. for 3 days. After completion of the culture, the cells and the culture supernatant were separated with Kiriyama filter paper (5A) (manufactured by Kiriyama Glass Co., Ltd.). The amounts of IXG and IX in the culture supernatant of each flask were analyzed under the HPLC analysis conditions of the condition (A) described in Example 1. Table 5 shows the concentrations of IXG and IX in the culture supernatant of each flask.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
得られた培養液を混合し、分析に供したところ、４５．８μｇ／ｍＬのイソキサントフモール配糖体（１つのグルコースが付加したもの（ＩＸＧ））が検出されたため、混合液１．０Ｌあたりに４５．８ｍｇのイソキサントフモール配糖体が含まれていると判断した。 When the obtained culture solution was mixed and subjected to analysis, 45.8 μg / mL isoxanthohumol glycoside (one glucose added (IXG)) was detected. Therefore, 1.0 L of the mixed solution was detected. It was judged that 45.8 mg of isoxanthohumol glycoside was contained in each.
（ＣＧＴアーゼによるαグルコシル化による高度配糖体化反応）
（連続酵素反応：ＣＧＴａｓｅ及びデキストリンを添加しての反応）
上記の培養液の混合液に水酸化ナトリウムを加え、ｐＨを５．５８に調節した。これにクラスターデキストリン（江崎グリコ（株））を４．５８ｇ添加し、インキュベーターにて５０℃に調整した。その後、ＣＧＴａｓｅ（天野エンザイム（株）、商品名「ＣＧＴ－ＳＬ」、４００ｕ／ｍＬ）０．９ｍＬを添加して反応を開始し、５０℃の条件下で２時間保持した。反応時間０時間（反応開始時）の反応液及び２時間反応後の反応液をＨＰＬＣで実施例１の条件（Ａ）にて解析した。２時間反応後の反応液を、以下ではＣＧＴアーゼ反応液ともいう。 (Highly glycosylated reaction by α-glucosylation by CGTase)
(Continuous enzyme reaction: reaction with addition of CGTase and dextrin)
Sodium hydroxide was added to the mixture of the above cultures to adjust the pH to 5.58. 4.58 g of cluster dextrin (Ezaki Glico Co., Ltd.) was added thereto, and the temperature was adjusted to 50 ° C. in an incubator. Then, 0.9 mL of CGTase (Amano Enzyme Co., Ltd., trade name "CGT-SL", 400 u / mL) was added to start the reaction, and the reaction was maintained at 50 ° C. for 2 hours. The reaction solution having a reaction time of 0 hours (at the start of the reaction) and the reaction solution after the reaction for 2 hours were analyzed by HPLC under the condition (A) of Example 1. The reaction solution after the reaction for 2 hours is also referred to as a CGTase reaction solution below.
図７Ａは、イソキサントフモールモノグルコシド（ＩＸＧ）に、ＣＧＴａｓｅ及びクラスターデキストリンを添加した反応液（反応時間０時間）のＨＰＬＣ分析結果（クロマトグラム）であり、図７Ｂは、ＩＸＧにＣＧＴａｓｅ及びクラスターデキストリンを添加して２時間反応を行った反応液（ＣＧＴアーゼ反応液）のＨＰＬＣ分析結果（クロマトグラム）である（いずれも検出：２８０ｎｍ）。
図７Ａ及び７Ｂ中、ＩＸＧは、イソキサントフモールに１個のグルコースが付加したイソキサントフモール配糖体（ＩＸモノグルコシド）である。図７Ｂ中、ＩＸＧ２及びＩＸＧ３のピークは、ＣＧＴアーゼによりＩＸＧにさらにグルコースが付加されたＩＸ配糖体（ＩＸＧｓとも記載する）だと予想された。 FIG. 7A is an HPLC analysis result (chromatogram) of a reaction solution (reaction time 0 hour) in which CGTase and cluster dextrin were added to isoxanthohumol monoglucoside (IXG), and FIG. 7B is CGTase and clusters in IXG. It is the HPLC analysis result (chromatography) of the reaction solution (CGTase reaction solution) which carried out the reaction for 2 hours to which dextrin was added (both detection: 280 nm).
In FIGS. 7A and 7B, IXG is an isoxanthohumol glycoside (IX monoglucoside) in which one glucose is added to isoxanthohumol. In FIG. 7B, the peaks of IXG2 and IXG3 were predicted to be IX glycosides (also referred to as IXGs) in which glucose was further added to IXG by CGTase.
次に下記の条件で、ＣＧＴアーゼ反応液のＬＣ－ＭＳ分析を実施し、精密質量から転移したグルコースの数を求めた。
（ＬＣ－ＭＳ分析条件）
ＬＣ装置：（株）島津製作所製ＵＨＰＬＣ
ＭＳ装置：Ｗａｔｅｒｓ社製Ｑ－ＴＯＦ　Ｐｒｅｍｉｅｒ
カラム：ＣＯＳＭＯＣＯＲＥ　Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｏｌｕｍｎ　（オーブン温度：４０℃）
移動相Ａ：０．１％ギ酸を含む水
移動相Ｂ：０．１％ギ酸を含むアセトニトリル
ＬＣグラジエント条件を下記の表６に示す。 Next, LC-MS analysis of the CGTase reaction solution was carried out under the following conditions, and the number of glucose transferred from the precise mass was determined.
(LC-MS analysis conditions)
LC equipment: UHPLC manufactured by Shimadzu Corporation
MS device: Waters Q-TOF Premier
Column: COSMOCORE Packed Volume (oven temperature: 40 ° C)
Mobile phase A: Water containing 0.1% formic acid Mobile phase B: Acetonitrile LC gradient conditions containing 0.1% formic acid are shown in Table 6 below.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
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この条件で、ＩＸ配糖体群（図７ＢのＩＸＧ、ＩＸＧ２及びＩＸＧ３）は保持時間９．５－１０．５分の辺りで溶出されてくる。
ＣＧＴアーゼ反応液のＬＣ－ＭＳ分析における各成分のＭＳスペクトルを、図８Ａ、図８Ｂ及び図８Ｃに示す。図８Ａは、イソキサントフモール（ＩＸ）に１個のグルコースが付加したＩＸ配糖体のＭＳスペクトル、図８Ｂは、ＩＸに２個のグルコースが結合したＩＸ配糖体のＭＳスペクトル、図８Ｃは、ＩＸモノグルコシドのＭＳスペクトルである。
図８Ｃから、ｍ／ｚ＝５１７．２０３４の基質であるＩＸにグルコースが一分子付加したプロトンのアダクトイオンが検出されたため、このピークは基質であるＩＸＧと確認できた。図８Ｂは、ＩＸＧ２（図７ＢのＩＸＧの左隣のピークに相当する）のＭＳスペクトルである。図８Ｂから、ｍ／ｚ＝６７９．２５９３のＩＸＧにグルコースが一分子付加（合計２個のグルコースが付加）したプロトンのアダクトイオンが検出されたため、このピークはＩＸに２つグルコースが付加されたＩＸ配糖体だと確認できた。
図８Ａは、ＩＸＧ３（図７ＢのＩＸＧ２の左隣のピークに相当する）のＭＳスペクトルである。図８Ａから、ｍ／ｚ＝８４１．３１３０のＩＸＧ２にグルコースが１分子付加（合計３個のグルコースが付加）したプロトンのアダクトイオンが検出されたため、このピークはＩＸに３つグルコースが付加されたＩＸ配糖体だと確認できた。 Under these conditions, the IX glycoside group (IXG, IXG2 and IXG3 in FIG. 7B) is eluted with a retention time of around 9.5-10.5 minutes.
The MS spectra of each component in the LC-MS analysis of the CGTase reaction solution are shown in FIGS. 8A, 8B and 8C. FIG. 8A is an MS spectrum of an IX glycoside in which one glucose is added to isoxanthohumol (IX), and FIG. 8B is an MS spectrum of an IX glycoside in which two glucoses are bound to IX, FIG. 8C. Is the MS spectrum of IX monoglucoside.
From FIG. 8C, the adduct ion of the proton in which one molecule of glucose was added to IX, which is a substrate of m / z = 517.2034, was detected, so that this peak could be confirmed as IXG, which is a substrate. FIG. 8B is an MS spectrum of IXG2 (corresponding to the peak to the left of IXG in FIG. 7B). From FIG. 8B, a proton adduct ion in which one molecule of glucose was added to IXG at m / z = 679.2593 (a total of two glucoses were added) was detected. Therefore, two glucoses were added to IX at this peak. It was confirmed that it was an IX glycoside.
FIG. 8A is an MS spectrum of IXG3 (corresponding to the peak to the left of IXG2 in FIG. 7B). From FIG. 8A, a proton adduct ion in which one molecule of glucose was added to IXG2 at m / z = 841.3130 (a total of three glucoses were added) was detected. Therefore, three glucoses were added to IX at this peak. It was confirmed that it was an IX glycoside.
（ＨＰ－２０による分画）
上記で得られたＣＧＴアーゼ反応液を冷却した後、ダイヤイオンＨＰ－２０（三菱ケミカル（株）製、カラムサイズ２００ｍＬ）に負荷し、８００ｍＬの水で洗浄した。次いで各４００ｍＬの５容量％、１０容量％、２０容量％、３０容量％、４０容量％のエタノール水溶液、８００ｍＬの５０容量％のエタノール水溶液を順次カラムに供した。回収した溶出液（２０容量％以上の画分は２００ｍＬずつ回収）を実施例１の条件（Ａ）にてＨＰＬＣに供した結果、４０容量％エタノール水溶液の画分から５０容量％エタノール水溶液の画分にかけて、ＩＸの７位の水酸基にグルコースが１個又は２個以上付加したイソキサントフモール配糖体が溶出されていることが分かったため、これらの画分を混合し、減圧濃縮した後、凍結乾燥して未精製物９０．０ｍｇを取得した。未精製物を実施例１の条件（Ａ）にてＨＰＬＣに供した結果、酵素反応による生成物（イソキサントフモール配糖体）の平均糖（グルコース）付加数が２．８であること、カラム分画前後の１つのグルコースが付加したイソキサントフモール配糖体（イソキサントフモールモノグルコシド：ＩＸＧ）の収率が９４．４８％であることが分かった。ＩＸの７位の水酸基にグルコースが２個以上付加したイソキサントフモール配糖体については、ＮＭＲにより、イソキサントフモールに付加しているグルコースは、２～７個であることを確認した。 (Separation by HP-20)
After cooling the CGTase reaction solution obtained above, it was loaded on Diaion HP-20 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation, column size 200 mL) and washed with 800 mL of water. Then, 400 mL each of 5% by volume, 10% by volume, 20% by volume, 30% by volume, 40% by volume of ethanol aqueous solution, and 800 mL of 50% by volume ethanol aqueous solution were sequentially applied to the column. As a result of subjecting the recovered eluate (collecting 200 mL each of the fractions of 20% by volume or more) to HPLC under the condition (A) of Example 1, the fraction of the 40% by volume ethanol aqueous solution to the fraction of the 50% by volume ethanol aqueous solution. Since it was found that an isoxanthohumol glycoside in which one or two or more glucoses were added to the hydroxyl group at the 7-position of IX was eluted, these fractions were mixed, concentrated under reduced pressure, and then frozen. It was dried to obtain 90.0 mg of an unpurified product. As a result of subjecting the unpurified product to HPLC under the condition (A) of Example 1, the average number of sugars (glucose) added to the product (isoxanthohumol glycoside) by the enzymatic reaction is 2.8. It was found that the yield of the isoxanthohumol glycoside (isoxanthohumol monoglucoside: IXG) to which one glucose was added before and after the column fractionation was 94.48%. Regarding the isoxanthohumol glycoside in which two or more glucoses were added to the hydroxyl group at the 7-position of IX, it was confirmed by NMR that the number of glucoses added to the isoxanthohumol was 2 to 7.
（評価１：溶解性）
上記の方法で調製したＩＸＧ及びＩＸＧｓについてアグリコンであるイソキサントフモール（ＩＸ）との水溶性評価を行った。
水にＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓを混合し、加熱（９０℃）後、３０℃まで冷却し溶解したＩＸ及びその配糖体の濃度を測定した。ＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓの濃度は、実施例１の条件（Ａ）で、ＨＰＬＣで測定した。溶解したＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓの量をモル比で（ＩＸとして）プロットした。図９は、ＩＸ、ＩＸＧ及びＩＸＧｓが水３５０ｍＬに溶ける量（ＩＸ換算）を調べた結果を示すグラフである。ＩＸは３５０ｍＬの水に可溶な量は３．０ｍｇだったのに対し、ＩＸＧはＩＸ換算で約１０倍の溶解性を示した。さらにＩＸＧｓ（ＩＸ換算の平均糖（グルコース）付加数は２．１）については、ＩＸより５０倍以上の溶解性を示すことが分かった（図９）。 (Evaluation 1: Solubility)
The water solubility of IXG and IXGs prepared by the above method was evaluated with isoxanthohumol (IX), which is an aglycone.
IX, IXG or IXGs were mixed with water, heated (90 ° C.), cooled to 30 ° C., and dissolved, and the concentration of IX and its glycoside was measured. The concentration of IX, IXG or IXGs was measured by HPLC under the condition (A) of Example 1. The amount of dissolved IX, IXG or IXGs was plotted in molar ratio (as IX). FIG. 9 is a graph showing the results of examining the amount of IX, IXG and IXGs dissolved in 350 mL of water (IX conversion). The amount of IX soluble in 350 mL of water was 3.0 mg, whereas IXG was about 10 times more soluble in terms of IX. Furthermore, it was found that IXGs (the average number of sugars (glucose) added in terms of IX is 2.1) are more than 50 times more soluble than IX (Fig. 9).
次に、室温で、３５０ｍＬの水に、ＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓをＩＸ換算で４５ｍｇ添加し、攪拌及び超音波処理により均一化してサンプルを調製した。図１０に、各サンプルの外観（写真）を示す。
ＩＸを４５ｍｇ／３５０ｍＬの水に添加したサンプル（図１０のｂのサンプル）においては、ＩＸは顕著に析出し、固形物が浮遊しているのが確認できる。一方で、ＩＸＧのサンプル（図１０のｃのサンプル）では混濁が改善され、ＩＸＧｓのサンプル（図１０のｄのサンプル）では完全に溶媒である水（図１０のａのサンプル）と同様の清澄度を保っていた。 Next, at room temperature, 45 mg of IX, IXG or IXGs was added to 350 mL of water in terms of IX and homogenized by stirring and sonication to prepare a sample. FIG. 10 shows the appearance (photograph) of each sample.
In the sample in which IX was added to 45 mg / 350 mL of water (sample b in FIG. 10), it can be confirmed that IX was remarkably precipitated and the solid matter was suspended. On the other hand, in the IXG sample (sample c in FIG. 10), the turbidity was improved, and in the sample IXGs (sample d in FIG. 10), the same clarification as water (sample a in FIG. 10) was completely used as a solvent. I kept the degree.
以上の結果から、ＩＸに糖を転移することで、大きく溶解性を高めることができることが示された。
ＩＸＧ（グルコース数：１）、ＩＸＧｓ（平均糖付加数：２．１）とヘキソース数が２．１倍のサンプルにおいて、溶解性は５倍近く高まっていることから、２つ目以上のヘキソースの付加の効果は相加的なものではなく、ＩＸの物性を劇的に向上させていることが分かった。 From the above results, it was shown that the solubility can be greatly enhanced by transferring the sugar to IX.
In a sample with IXG (glucose number: 1), IXGs (average glycosylation number: 2.1) and hexose number 2.1 times, the solubility was increased nearly 5 times, so that of the second or more hexoses. It was found that the effect of the addition was not additive and dramatically improved the physical properties of IX.
（評価２：呈味性）
ＩＸは苦味又は収斂味を呈することが知られており、飲食品への添加は味質に変化をもたらすと考えられる。水溶性の高まったＩＸＧ（付加糖（グルコース）数：１）及びＩＸＧｓ（平均糖（グルコース）付加数：２）を用いて配糖体化の味質への効果を味覚センサー（（株）インテリジェントセンサーテクノロジー製　味認識装置ＴＳ－５０００Ｚ）を用いて評価した。苦味の標準はアルファ酸で校正されたものである。 (Evaluation 2: Taste)
IX is known to exhibit a bitter taste or astringent taste, and addition to foods and drinks is considered to bring about a change in taste quality. Taste sensor (Intelligent Co., Ltd.) shows the effect of glycoside formation on the taste quality using IXG (number of added sugars (glucose): 1) and IXGs (number of added sugars (glucose): 2) with increased water solubility. It was evaluated using a taste recognition device TS-5000Z) manufactured by Sensor Technology. The bitterness standard is calibrated with alpha acids.
上述のＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓを４５ｍｇ／３５０ｍＬ（ＩＸ換算）の濃度で水に溶解させた水溶液と、マルトエキス（Ｂｒｉｘ：１４、ｐＨ４．９）にＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓを４５ｍｇ／３５０ｍＬ（ＩＸ換算）の濃度で添加した液を味質分析に供した。
図１１は、ＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓを、水又はマルトエキスに添加して苦味のマスク効果を評価した結果を示すグラフである。水ベースはＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓを、水に添加した結果（黒いバー）であり、マルトエキスベースは、マルトエキスに添加した結果（白いバー）である。
その結果、水を溶媒とした場合は顕著にＩＸのみで苦味が検出されたのに対して、ＩＸＧ及びＩＸＧｓにおいては、苦味はほとんど検出されなかった（図１１）。
また、マルトエキスを溶媒にした場合は、サンプルを添加していないコントロール区（無添加）においてバックグラント値として苦味が検出されたが、ＩＸを添加したものに対しては、このバックグラウンドの値から顕著に苦味が増大していた。それに対して、ＩＸＧ又はＩＸＧｓを添加したマルトエキスについてはバックグラウンドと同レベルの苦味であった。 An aqueous solution prepared by dissolving the above-mentioned IX, IXG or IXGs in water at a concentration of 45 mg / 350 mL (IX equivalent), and 45 mg / 350 mL (IX equivalent) of IX, IXG or IXGs in malto extract (Brix: 14, pH 4.9). ) Was added for taste analysis.
FIG. 11 is a graph showing the results of adding IX, IXG or IXGs to water or malt extract and evaluating the masking effect of bitterness. The water base is the result of adding IX, IXG or IXGs to water (black bar), and the malt extract base is the result of adding IX, IXG or IXGs to the malt extract (white bar).
As a result, when water was used as the solvent, bitterness was remarkably detected only in IX, whereas bitterness was hardly detected in IXG and IXGs (FIG. 11).
In addition, when malt extract was used as a solvent, bitterness was detected as a background value in the control group (without addition) to which no sample was added, but this background value was detected for those to which IX was added. The bitterness was significantly increased from the above. On the other hand, the malt extract to which IXG or IXGs was added had the same level of bitterness as the background.
以上の結果から、溶媒の種類にかかわらず、ＩＸの有する苦味は配糖体化によって溶媒レベルに緩和されることが示された。ＩＸについては実際に水とマルトエキスに溶解している濃度は、添加した理論濃度（４５ｍｇ／３５０ｍＬ）と比べ、水では２．１５ｍｇ／３５０ｍＬ、マルトエキスでは２２ｍｇ／３５０ｍＬであった。したがって溶解していないＩＸが残存しており、実際のＩＸ苦味強度より低く見積もっていると推察される。ＩＸＧはＩＸＧｓと比べて苦味に大きな差は認められなかったために、苦味マスク効果については１個のヘキソース付加（モノグリコシド）でも効果があることが分かった。 From the above results, it was shown that the bitterness of IX is alleviated to the solvent level by glycoside formation regardless of the type of solvent. Regarding IX, the concentration actually dissolved in water and malt extract was 2.15 mg / 350 mL for water and 22 mg / 350 mL for malt extract, as compared with the theoretical concentration (45 mg / 350 mL) added. Therefore, it is presumed that undissolved IX remains and is estimated to be lower than the actual IX bitterness intensity. Since IXG did not show a large difference in bitterness compared to IXGs, it was found that the bitterness mask effect was effective even with the addition of one hexose (monoglycoside).
（評価３：強制劣化による安定性）
ＩＸ配糖体は特徴的なＣ８位のプレニル基の近傍のＣ７位の水酸基が保護されていることから水溶性が高まると同時に分解耐性による物質の安定性が期待される。そこで次に、配糖体化によるＩＸの安定性について評価を行った。 (Evaluation 3: Stability due to forced deterioration)
Since the IX glycoside protects the hydroxyl group at the C7 position near the characteristic prenyl group at the C8 position, it is expected that the water solubility will increase and at the same time the substance will be stable due to decomposition resistance. Therefore, next, the stability of IX due to glycoside formation was evaluated.
クエン酸バッファー（ｐＨ３、終濃度１００ｍＭ）に、ＩＸ、ＩＸＧ又はＩＸＧｓを、ＩＸ換算で３ｍｇ／３５０ｍＬ添加してサンプルを調製した。調製したサンプルを、８５℃で１０分間熱殺菌を行ったあと、遮光した状態でバイアルをインキュベーター内に設置し、４５℃で保持した。１週間後ごとに、４週間にわたり継時的に添加した化合物（ＩＸ、ＩＸＧ、ＩＸＧｓ）の残存量を、実施例１の条件（Ａ）でＨＰＬＣで定量することで、安定性の評価を行った。 Samples were prepared by adding IX, IXG or IXGs to citrate buffer (pH 3, final concentration 100 mM) at 3 mg / 350 mL in terms of IX. The prepared sample was heat sterilized at 85 ° C. for 10 minutes, and then the vial was placed in an incubator in a light-shielded state and held at 45 ° C. Stability was evaluated by quantifying the residual amount of the compounds (IX, IXG, IXGs) added over time for 4 weeks every 1 week by HPLC under the condition (A) of Example 1. It was.
図１２Ａ、図１２Ｂ及び図１２Ｃに、クエン酸バッファー（ｐＨ３）中、４５℃で保管したＩＸ、ＩＸＧ及びＩＸＧｓの残存率を示す（図１２Ａ：ＩＸの残存率、図１２Ｂ：ＩＸＧの残存率、図１２Ｃ：ＩＸＧｓの残存率）。図１２Ａ、図１２Ｂ及び図１２Ｃのグラフの縦軸（残存率）は、調製直後のサンプル中のＩＸ、ＸＧ又はＩＸＧｓの濃度（ＩＸ換算）を１００％とした場合の、保管後のサンプル中のＩＸ、ＸＧ又はＩＸＧｓの濃度（ＩＸ換算）の相対値である。
図１２Ａ、図１２Ｂ及び図１２Ｃに示すグラフから回帰式を求めた。
図１２Ａに示すグラフから求めたＩＸの回帰式は、ｙ＝－２１．８８９ｘ＋１２２．６１であった。図１２Ｂに示すグラフから求めたＩＸＧの回帰式は、ｙ＝－１５．４４１ｘ＋１１８．５２であった。図１２Ｃに示すグラフから求めたＩＸＧｓの回帰式は、ｙ＝－５．７７４９ｘ＋９９．３４４であった。
これらのグラフから求められる回帰式の傾きは、分解速度を示す分解係数と考えることができる。
その結果、ＩＸの分解係数（傾き）が－２１．８８９なのに対して、ＩＸＧは分解係数が０．７倍程度（傾き：－１５．４４１）小さく、１．４倍安定な物質であることが分かった。さらに、ＩＸＧｓについては分解係数（傾き）が－５．７７４９と小さく、強制劣化条件においてＩＸの３．８倍程度安定性を保っていることが分かった。 12A, 12B and 12C show the residual rates of IX, IXG and IXGs stored at 45 ° C. in citrate buffer (pH 3) (FIG. 12A: residual rate of IX, FIG. 12B: residual rate of IXG, FIG. 12C: Residual rate of IXGs). The vertical axis (residual rate) of the graphs of FIGS. 12A, 12B and 12C is the concentration of IX, XG or IXGs in the sample immediately after preparation (IX conversion) in the sample after storage when the concentration (IX conversion) is 100%. It is a relative value of the concentration (IX conversion) of IX, XG or IXGs.
The regression equation was obtained from the graphs shown in FIGS. 12A, 12B and 12C.
The regression equation of IX obtained from the graph shown in FIG. 12A was y = -21.8889x + 122.61. The regression equation of IXG obtained from the graph shown in FIG. 12B was y = -15.441x + 118.52. The regression equation of IXGs obtained from the graph shown in FIG. 12C was y = −5.7749x + 99.344.
The slope of the regression equation obtained from these graphs can be considered as a decomposition coefficient indicating the decomposition rate.
As a result, the decomposition coefficient (slope) of IX is -21.8889, whereas the decomposition coefficient of IXG is about 0.7 times smaller (slope: -15.441), which means that the substance is 1.4 times more stable. Do you get it. Furthermore, it was found that the decomposition coefficient (slope) of IXGs was as small as −5.7794, and the stability was maintained about 3.8 times that of IX under forced deterioration conditions.
以上のように、ＩＸは配糖体化することで、熱及び低ｐＨという強制劣化条件において、顕著な安定性を示すことが分かった。一つの配糖体化（モノグルコシド）でもＩＸの安定性を向上させることができるが、２糖以上の配糖体化がより強く安定性に寄与することが分かった。この点では前述の溶解性と安定性は相関性が高い。 As described above, it was found that IX exhibits remarkable stability under forced deterioration conditions of heat and low pH by being glycosided. It was found that the stability of IX can be improved by one glycoside (monoglucoside), but the glycoside of two or more sugars contributes more strongly to the stability. In this respect, the above-mentioned solubility and stability are highly correlated.
＜実施例６＞
固定化菌体の調製とＩＸＧ及びＩＸＧｓの生産
Ｒ．ｏｒｙｚａｅ　ＩＡＭ６２５６の胞子を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように２％アルギン酸ナトリウム溶液３０ｍＬに、添加し、ゆっくりと撹拌して懸濁したものを、氷冷した２％塩化カルシウム溶液１５０ｍＬに滴下し、ビーズ状にゲル化させ、そのまま４℃で２時間放置した。溶液を除いたあと、ビーズを数回滅菌水で洗浄した。ビーズに２００ｍＬの表７に示した培地を添加し、２４℃でゆっくりと撹拌しながら２日間培養し、固定化菌体を得た。固定化菌体は培地を除いたあと滅菌水で洗浄し、反応に供するまで２００ｍＬの滅菌水に浸して４℃で保存した。
固定化菌体による反応を行うため、表７の「反応時のグルコース濃度」に示した濃度になるようにグルコースを添加し、さらにＩＸを０．１ｍｇ／Ｌとなるように添加した。２４℃にてスターラーでゆっくりと撹拌しながら反応させ、２４時間後に反応液とビーズを分離し、反応液の一部を実施例３のＬＣ分析条件（Ｂ）でＨＰＬＣ分析した。この２４時間反応後の反応液の分析結果（ＩＸＧ及びＩＸの濃度）を表７に示した。ＩＸＧは、ＩＸの７位の水酸基にグルコースが１個付加したＩＸ配糖体である。表７に示すＩＸＧの濃度は、ＩＸに換算した濃度である。 <Example 6>
Preparation of immobilized cells and production of IXG and IXGs R. Spores of oryzae IAM6256 were added to 30 mL of a 2% sodium alginate solution to 1 × 10 5 cells / mL, and the suspension was added dropwise to 150 mL of an ice-cooled 2% calcium chloride solution. , Gelled into beads and left as it was at 4 ° C. for 2 hours. After removing the solution, the beads were washed with sterile water several times. 200 mL of the medium shown in Table 7 was added to the beads, and the beads were cultured at 24 ° C. with gentle stirring for 2 days to obtain immobilized cells. After removing the medium, the immobilized cells were washed with sterilized water, immersed in 200 mL of sterilized water until subjected to the reaction, and stored at 4 ° C.
In order to carry out the reaction with the immobilized cells, glucose was added so as to have the concentration shown in "Glucose concentration at the time of reaction" in Table 7, and IX was further added so as to be 0.1 mg / L. The reaction was carried out at 24 ° C. with a stirrer while stirring slowly, and after 24 hours, the reaction solution and the beads were separated, and a part of the reaction solution was subjected to HPLC analysis under the LC analysis condition (B) of Example 3. The analysis results (concentrations of IXG and IX) of the reaction solution after the reaction for 24 hours are shown in Table 7. IXG is an IX glycoside in which one glucose is added to the hydroxyl group at the 7-position of IX. The concentration of IXG shown in Table 7 is the concentration converted to IX.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
表７に示すＮｏ．１～４について、さらに、回収した反応液それぞれ２００ｍＬに水酸化ナトリウム溶液を添加してｐＨを５．５に調整した。クラスターデキストリンを５ｇ／Ｌになるように添加して溶解し、５０℃のインキュベーターでしばらく保持した後、ＣＧＴａｓｅ（天野エンザイム（株）、商品名「ＣＧＴ－ＳＬ、４００ｕ／ｍｌ」）を１８０μＬ添加して５０℃で４時間反応させた。反応液の一部を実施例３のＬＣ分析条件（Ｂ）でＨＰＬＣ分析した。結果を表８に示す。表８中、Ｇ１～Ｇ６は、ＩＸの７位の水酸基にグルコースが１～６個付加したＩＸ配糖体を示す。ＩＸに付加しているグルコースの数は、Ｇ１（ＩＸＧ）が１個、Ｇ２が２個、Ｇ３が３個、Ｇ４が４個、Ｇ５が５個、Ｇ６が６個である。
表８に示す各配糖体の割合（％）は、反応液中の各配糖体の割合（％）である。この各配糖体の割合は、ＩＸに１個以上のグルコースが付加しているＩＸ配糖体（ＩＸＧ及びＩＸＧｓ）のＩＸ換算の合計重量を１００重量％とした場合の、各配糖体のＩＸ換算の重量％である。Ｇ１～Ｇ６の各配糖体の割合から、ＩＸ１分子に付加しているグルコースの数の平均（平均グルコース付加数）を求めた。 No. shown in Table 7. For 1 to 4, the pH was adjusted to 5.5 by further adding a sodium hydroxide solution to 200 mL of each of the recovered reaction solutions. Cluster dextrin was added to 5 g / L to dissolve it, and after holding it in an incubator at 50 ° C. for a while, 180 μL of CGTase (Amano Enzyme Co., Ltd., trade name “CGT-SL, 400 u / ml”) was added. The reaction was carried out at 50 ° C. for 4 hours. A part of the reaction solution was analyzed by HPLC under the LC analysis condition (B) of Example 3. The results are shown in Table 8. In Table 8, G1 to G6 represent IX glycosides in which 1 to 6 glucoses are added to the hydroxyl group at the 7-position of IX. The number of glucose added to IX is 1 for G1 (IXG), 2 for G2, 3 for G3, 4 for G4, 5 for G5, and 6 for G6.
The ratio (%) of each glycoside shown in Table 8 is the ratio (%) of each glycoside in the reaction solution. The ratio of each glycoside is the ratio of each glycoside when the total weight of IX glycosides (IXG and IXGs) in which one or more glucoses are added to IX is 100% by weight. It is IX-equivalent weight%. From the ratio of each glycoside of G1 to G6, the average number of glucose added to the IX1 molecule (average glucose addition number) was determined.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
以上のように、固定化菌体による反応により、ＩＸＧを生成させることができ、固定化菌体と分離した反応液を酵素処理することでＩＸＧｓを効率よく生成することができた。 As described above, IXG could be produced by the reaction with the immobilized cells, and IXGs could be efficiently produced by enzymatically treating the reaction solution separated from the immobilized cells.
本発明は、飲食品分野等において有用である。 The present invention is useful in the field of food and drink.

Claims (14)

  1. 下記一般式（１）で表されるプレニルフラボノイド配糖体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （一般式（１）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表し、Ｘはヘキソース残基を表し、ｎは、２～１０の整数を表す。２～１０個のヘキソース残基は、同じであってもよく、異なっていてもよい。）     A prenylflavonoid glycoside represented by the following general formula (1).
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     (In the general formula (1), R represents a methyl group or a hydrogen atom, X represents a hexose residue, and n represents an integer of 2 to 10. The 2 to 10 hexose residues are the same. It may or may not be different.)
  2. ヘキソースがグルコースである請求項１に記載のプレニルフラボノイド配糖体。 The prenylflavonoid glycoside according to claim 1, wherein the hexose is glucose.
  3. 一般式（１）においてＲがメチル基を表す請求項１又は２に記載のプレニルフラボノイド配糖体。 The prenylflavonoid glycoside according to claim 1 or 2, wherein R represents a methyl group in the general formula (1).
  4. 請求項１～３のいずれか一項に記載のプレニルフラボノイド配糖体を含む組成物。 A composition containing the prenylflavonoid glycoside according to any one of claims 1 to 3.
  5. 飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料又は飼料である請求項４に記載の組成物。 The composition according to claim 4, which is a food or drink, a pharmaceutical product, a quasi drug, a cosmetic or a feed.
  6. 容器詰飲料である請求項４又は５に記載の組成物。 The composition according to claim 4 or 5, which is a packaged beverage.
  7. 請求項１～３のいずれか一項に記載のプレニルフラボノイド配糖体の製造方法であって、
    リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を、下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養することにより、前記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ１）、及び、
    前記プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加する工程（Ｂ）を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）     The method for producing a prenylflavonoid glycoside according to any one of claims 1 to 3.
    By culturing a bacterium belonging to the genus Rhizopus in the presence of a prenylflavonoid represented by the following general formula (2) and a hexose source, one hexose is bound to the 7-position of the prenylflavonoid. Step of producing prenylflavonoid monoglycoside (A1), and
    A method for producing a prenylflavonoid glycoside, which comprises a step (B) of adding 1 to 9 hexoses to the hexose residue of the prenylflavonoid monoglycoside.
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     (In the general formula (2), R represents a methyl group or a hydrogen atom.)
  8. リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌を、下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養することにより、前記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ１）を含む、プレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）     By culturing a bacterium belonging to the genus Rhizopus in the presence of a prenylflavonoid represented by the following general formula (2) and a hexose source, one hexsource is bound to the 7-position of the prenylflavonoid. A method for producing a prenylflavonoid monoglycoside, which comprises a step (A1) of producing a prenylflavonoid monoglycoside.
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     (In the general formula (2), R represents a methyl group or a hydrogen atom.)
  9. 請求項１～３のいずれか一項に記載のプレニルフラボノイド配糖体の製造方法であって、下記（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースから、前記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ２）、及び、
    前記プレニルフラボノイドモノグリコシドのヘキソース残基に１～９個のヘキソースを付加する工程（Ｂ）を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法。
    （ｐ１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
    （ｐ２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
    （ｐ３）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
    （ｑ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
    （ｑ２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
    （ｑ３）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）     The method for producing a prenylflavonoid glycoside according to any one of claims 1 to 3, from the following (p1), (p2), (p3), (q1), (q2) and (q3). From the prenylflavonoids and UDP-hexoses represented by the following general formula (2), one hexose is bound to the 7-position of the prenylflavonoids, depending on one or more proteins selected from the group. Step of producing glycoside (A2) and
    A method for producing a prenylflavonoid glycoside, which comprises a step (B) of adding 1 to 9 hexoses to the hexose residue of the prenylflavonoid monoglycoside.
    (P1) Protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (p2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 1 to 9 amino acids consist of an amino acid sequence deleted, substituted, inserted and / or added, and , A protein having the activity of adding hexose to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2) (p3), which comprises an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In addition, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the protein (q2) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the protein (q1) having the activity of adding hexose to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2). A protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 9 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and having an activity of adding a hex source to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2) ( q3) A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having an activity of adding a hex source to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2).
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     (In the general formula (2), R represents a methyl group or a hydrogen atom.)
  10. 下記（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、（ｑ１）、（ｑ２）及び（ｑ３）からなる群より選択される１種以上のタンパク質により、下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースから、前記プレニルフラボノイドの７位に１個のヘキソースが結合しているプレニルフラボノイドモノグリコシドを生成させる工程（Ａ２）を含む、プレニルフラボノイドモノグリコシドの製造方法。
    （ｐ１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
    （ｐ２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
    （ｐ３）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
    （ｑ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
    （ｑ２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
    （ｑ３）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位にヘキソースを付加する活性を有するタンパク質
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）     Prenylflavonoid represented by the following general formula (2) by one or more proteins selected from the group consisting of the following (p1), (p2), (p3), (q1), (q2) and (q3). A method for producing a prenylflavonoid monoglycoside, which comprises a step (A2) of producing a prenylflavonoid monoglycoside in which one hexose is bound to the 7-position of the prenylflavonoid from the UDP-hexose.
    (P1) Protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (p2) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 1 to 9 amino acids consist of an amino acid sequence deleted, substituted, inserted and / or added, and , A protein having the activity of adding hexose to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2) (p3), which comprises an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In addition, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the protein (q2) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the protein (q1) having the activity of adding hexose to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2). A protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 9 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and having an activity of adding a hex source to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2) ( q3) A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having an activity of adding a hex source to the 7-position of the prenyl flavonoid represented by the general formula (2).
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     (In the general formula (2), R represents a methyl group or a hydrogen atom.)
  11. 下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、前記プレニルフラボノイドの水溶性を向上させる方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）     A method for improving the water solubility of prenylflavonoid by adding a sugar chain composed of 2 to 10 hexoses to the 7-position of prenylflavonoid represented by the following general formula (2).
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     (In the general formula (2), R represents a methyl group or a hydrogen atom.)
  12. 下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、前記プレニルフラボノイドの苦味を低減する方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）     A method for reducing the bitterness of the prenylflavonoid by adding a sugar chain composed of 2 to 10 hexoses to the 7-position of the prenylflavonoid represented by the following general formula (2).
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     (In the general formula (2), R represents a methyl group or a hydrogen atom.)
  13. 下記一般式（２）で表されるプレニルフラボノイドの７位に、２～１０個のヘキソースから構成される糖鎖を付加する、前記プレニルフラボノイドの安定性を向上させる方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （一般式（２）中、Ｒは、メチル基又は水素原子を表す。）     A method for improving the stability of the prenylflavonoid by adding a sugar chain composed of 2 to 10 hexoses to the 7-position of the prenylflavonoid represented by the following general formula (2).
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     (In the general formula (2), R represents a methyl group or a hydrogen atom.)
  14. ヘキソースがグルコースである請求項７～１３のいずれか一項に記載の方法。

          The method according to any one of claims 7 to 13, wherein the hexose is glucose.
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