WO2021118156A2 - 스위칭 결합제, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 약학 조성물, 검사 키트 및 항원과 항체의 분석 방법 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to immunoassay technology, and more particularly, to a switching binding agent, a method for preparing the same, and a pharmaceutical composition, test kit, and antigen and antibody analysis method using the same.
  • immunoassays are being used for bioassays such as various immunodiagnostic tests or environmental monitoring.
  • the immunoassay is a method for detecting or quantifying an antigen or an antibody using the high specificity of the antigen-antibody reaction. After labeling one or both of the antigen or antibody in various ways, reacting with the sample, If there is an antibody or antigen in the sample, an antigen-antibody reaction is generated, so it is possible to qualitatively or quantitatively measure the antibody or antigen by measuring the labeled product, and has an advantage of high sensitivity compared to other analysis methods.
  • the immunoassay can be used for various diagnoses such as cancer markers, infectious diseases, thyroid function, anemia, allergy, pregnancy, drug abuse or gout diagnosis.
  • antibodies having specific reactivity for each antigen must be prepared.
  • this method has limitations in detecting modern diseases that are rapidly diversifying in recent years or viruses having multiple mutant species.
  • an additional step of binding the antibody to a labeling substance may be required.
  • the binding property of the labeling material and the antibody is low, the accuracy or reliability of the immunoassay analysis may be reduced.
  • the conventional immunoassay there is also a problem in that various types of labeling substances capable of binding to various antibodies must be developed, respectively.
  • the technical problem to be achieved by the present invention is to provide a switching binding agent with improved applicability without being limited to the type of antibody as it can detect various types of diseases or antigens that cause the diseases.
  • the technical problem to be achieved by the present invention is to provide a method for manufacturing a switching binder having the above-mentioned advantages.
  • Another technical problem to be achieved by the present invention is to provide an analysis method that has the above-described advantages, improves analysis reliability and accuracy, and simplifies processing steps for analysis, thereby improving speed and ease of use.
  • the switching binding agent according to an embodiment of the present invention for solving the above problems reversibly binds to at least a portion of a framework region (FR) of an antibody, and the target antigen reacting specifically with the antibody is the When bound to the antibody, it can be separated from the framework region.
  • the switching binding agent may be bound to the framework region by the three-dimensional structure of the antibody.
  • the switching binding agent may include a moiety capable of binding to at least one or more of the framework regions and a moiety binding to at least one or more complementarity determining regions (CDRs).
  • the switching binding agent comprises an amino acid sequence selected from the framework region of the heavy chain constituting the antigen-binding site of the antibody, wherein the amino acid sequence is in the framework region of the light chain constituting the antigen-binding site together with the heavy chain. and a first antibody binding moiety that reversibly binds.
  • the switching binding agent comprises an amino acid sequence selected from a framework region of a light chain constituting an antigen-binding site of an antibody, wherein the amino acid sequence is a frame of a heavy chain constituting the antigen-binding site together with the light chain It may include a second antibody-binding portion reversibly binding to the work region.
  • the amino acid sequence of the switching binding agent may also reversibly bind to a complementarity determining region adjacent to the framework region of the heavy chain or the light chain.
  • the switching binding agent may be selected from the group consisting of a peptide, a protein, an aptamer, a nanobody, a phage display, a yeast display, and an antibody.
  • a portion of the amino acid of the switching binding agent may be substituted with an inorganic material.
  • the first antibody-binding portion may include at least one amino acid residue of -Y-, -I-, -W-, and -Q-.
  • the second antibody-binding portion may include at least one amino acid residue selected from -Y-, -Q-, -P-, -L-, and -F-.
  • SEQ ID NO: 1 S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E
  • SEQ ID NO: 2 V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K
  • SEQ ID NO: 3 T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K
  • SEQ ID NO: 4 V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K of the amino acid sequence of any of the included to be there.
  • the first antibody binding moiety comprises an amino acid residue that binds to the framework region of the light chain by at least one of electrostatic interactions, hydrogen bonding, van der Waals forces, hydrophobic interactions, and combinations thereof. can do.
  • the second antibody binding moiety comprises an amino acid residue that binds to the framework region of the heavy chain by at least one or more of electrostatic interactions, hydrogen bonding, van der Waals forces, hydrophobic interactions, and combinations thereof. can do.
  • the switching binding agent may be capable of regulating the binding force of the antibody binding site by amino acid modulation of the first antibody binding site. In another embodiment, the switching binding agent may be capable of regulating the binding force of the antibody binding site by amino acid modulation of the second antibody binding site. In another embodiment, the switching binder may be bonded to a polar region of a side chain functional group bond or a peptide bond between the switching binder and the framework region by the hydrogen bond.
  • the switching binding agent when the switching binding agent binds to the antigen binding site of the antibody, the switching binding agent is separated from the antibody by binding to the antibody and a target antigen that specifically reacts with the antibody.
  • the antibody-binding portion of the switching binding agent may be bound to the antigen-binding site of the heavy chain or the light chain within a range of 4 ⁇ to 8 ⁇ .
  • the switching binding agent may be labeled with a natural or artificial labeling material.
  • the switching binding agent binds to a human antibody, a non-human antibody, a humanized non-human antibody, or a combination thereof, and in a state in which the switching binding agent is bound to the antibody, binding of the antibody and the target antigen may be possible. .
  • the switching binding agent comprises a first antibody binding moiety or a second antibody binding moiety that reversibly specifically binds to at least some of the framework regions (FRs) of the antibody; and when the target antigen that specifically reacts with the antibody binds to the antibody, the binding ability of the first antibody-binding portion or the second antibody-binding portion to the framework region is such that the antibody-binding portion is separated from the framework region. It may include a binding force control unit to control the. In another embodiment, the binding force modulator may modulate the position of the first antibody binding part or the second antibody binding part in the switching binding agent or the three-dimensional shape of the switching binding agent to adjust the binding force of the antibody binding part to the antibody.
  • the first antibody-binding portion or the second antibody-binding portion and the avidity-controlling portion may be included as a unit structure to alternately bind the antibody-binding portion and the avidity-controlling portion to be continuously coupled.
  • a pharmaceutical composition for disease screening, diagnosis, prevention or treatment integration according to another embodiment of the present invention for solving the above problems may include the switching binding agent.
  • the switching binding agent in the pharmaceutical composition may be selected from the group consisting of peptides, proteins, aptamers and nanobodies, phage display, yeast display, and antibodies. .
  • the pharmaceutical composition from the switching agent is SEQ ID NO: 1: S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E, SEQ ID NO: 2: V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K, SEQ ID NO: 3: T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K, SEQ ID NO: 4: V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K of the amino acid sequence of any of the included to be there.
  • a test kit for solving the above problems includes the switching binding agent, the switching binding agent is labeled with a natural or artificial labeling material, and the switching binding agent binds to and separates from the framework region It is possible to measure the binding force of the antigen to the antibody by measuring the amount.
  • the switching binding agent may be selected from the group consisting of peptides, proteins, aptamers and nanobodies, phage display, yeast display, and antibodies.
  • the binding force may be measured by calculating the antigen binding coefficient (Kd) of the antibody.
  • the antigen binding coefficient (Kd) may include a range of 0.7 x 10 -6 M to 3.4 x 10 -6 M.
  • the test kit includes the switching binding agent, the switching binding agent is labeled with a natural or artificial labeling substance, and the amount of the switching binding agent binding to and dissociated from the framework region is measured. Identification of an antibody and a target antigen Or it can be quantified.
  • the test kit is an immunoassay kit, wherein the immunoassay kit includes a luminex assay, a protein microarray assay, an ELISA assay, an immuno-PCR assay, and a capture -ELISA assay, ELISPOT assay, radioimmunoassay (RIA), lateral flow immunoassay (LFIA), flow-through immunoassay (FTIA), protein microfluidic immunoassay, protein Microfluidic immunoassay, protein capillary electrophoresis (CE), electrochemical biosensor, radioimmunoprecipitation assay, immunoprecipitation assay, immunohistochemical staining assay, Ouchterlony immunodiffusion Assays, inhibition or competition assays, sandwich assays, flow cytometry, immunoelectrophoresis assays, tissue immunostaining assays, complement fixation assays, FACS assays, protein chip assays, immunofluorescence staining assays and
  • the analysis method using the switching binding agent according to another embodiment of the present invention for solving the above problem comprises the steps of selecting the amino acid sequence of the switching binding agent from the framework region constituting the antigen binding site of the antibody, the target antigen and specificity A pretreatment step of reversibly binding to at least a portion of a framework region (FR) of the antibody by providing the switching binding agent to an antibody that binds positively, Determination of whether the target antigen is included in the result of the pretreatment step Identifying or quantifying the target antigen in the analyte by providing the required analyte and quantifying at least one of the remaining amount of the switching binding agent bound to the framework region or the switching binding agent separated from the framework region It may include an analysis step of analyzing.
  • the switching binding agent may be selected from the group consisting of a peptide, a protein, an aptamer, a nanobody, a phage display, a yeast display, and an antibody.
  • the antibody may be immobilized on a support that is a substrate, a bead, a fiber, a polymer structure, or a combination thereof. In another embodiment, the antibody is not immobilized, but may be dissolved in a solution.
  • the pretreatment step comprises the steps of providing the switching binding agent to the antibody to obtain a mixed solution comprising a first conjugate of the antibody and the switching binding agent and a switching binding agent not bound to the antibody, and the mixed solution It may include removing the switching binding agent not bound to the antibody from the.
  • the switching binding agent is labeled with a natural or artificial labeling material, and in the analysis step, the analysis of the target antigen may be performed by measuring the labeling reaction.
  • the analyzing step may further include separating the switching binding agent separated from the antibody and the second conjugate of the antibody and the target antigen, and identifying or quantifying the separated switching binding agent.
  • the method for producing the switching binding agent according to another embodiment of the present invention for solving the above problems comprises the steps of confirming the amino acid sequence in which the framework regions of the heavy chain and the light chain of the antibody self-binding to each other. Comparing the step of obtaining a hydrophobicity index and the hydrophobicity index, a switching binder comprising the amino acid sequence of a portion having the same properties between the amino acid sequences of the framework regions constituting the antigen-binding site of the heavy chain and the light chain is selected may include the step of In one embodiment, the amino acid sequence may include a complementarity determining region adjacent to the framework region.
  • the switching binding agent may be selected from the group consisting of a peptide, an aptamer, a protein, a nanobody, a phage display, a yeast display, and an antibody.
  • the amino acid sequence may be bound by at least one of electrostatic interaction, hydrogen bonding, van der Waals force, hydrophobic interaction, and combinations thereof.
  • the switching binding agent according to an embodiment of the present invention is selected from the antigen-binding site of an antibody, in particular, a framework region having the same or substantially similar amino acid sequence for each antibody, so that it can bind to several types of antibodies, and is independent of the type of antibody It can be used for analysis for identification or quantification of an antibody and an antigen binding to the antibody without an antibody, and has the advantage of being able to control the binding force to the antibody through modulation of the selected amino acid sequence. Since it can bind to various types of antibodies, it can be used for analysis for identification or quantification of antibodies and antigens binding to the antibody regardless of the type of antibody, and has the advantage of controlling the binding force to the antibody.
  • the method for producing a switching binding agent according to another embodiment of the present invention is characterized in that it is extracted from the antigen-binding site of the antibody, particularly the framework region, and has the advantage of being able to prepare a switching binding agent capable of binding to various antibodies. .
  • compositions for integrating virus or disease screening, diagnosis, prophylaxis or treatment according to another embodiment of the present invention
  • the pharmaceutical composition uses a switching binding agent having the above-described advantages to diagnose, prevent, or There is an advantage in being able to develop a drug for treatment.
  • test kit using a switching binding agent according to another embodiment of the present invention by using the switching binding agent having the above-described advantages, not only the identification and quantification of the antigen and the antibody, but also the advantage of measuring the binding force of the antigen to the antibody There is this.
  • the step of washing an analyte such as an antibody or antigen or adding a reagent treatment is omitted to bind antigen Immunoassays with improved ease of use and rapid analysis of the presence and binding amount may be possible.
  • FIG. 1A is a diagram of a combination of a switching binder extracted from a framework region and a framework region according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 1B is a diagram illustrating the configuration of a switching binder according to an embodiment of the present invention. .
  • FIG. 2 is a view showing the coupling of a switching coupling agent to a framework region according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a switching coupling agent according to an embodiment.
  • FIG. 4A is a flowchart of an analysis method using a switching binder according to an embodiment
  • FIG. 4B is a flowchart of an analysis method using a switching binder according to another embodiment of the present invention
  • FIG. 4C is a switching binder according to another embodiment It is a flowchart of the analysis method using
  • 5A and 5B are diagrams showing the binding between the switching binding agent of SEQ ID NO: 2 and the switching binding agent of SEQ ID NO: 3, and FIG. 5C is the interaction between the switching binding agent of SEQ ID NO: 2 and the switching binding agent of SEQ ID NO: 3 by site.
  • 5d is a diagram showing the hydrophobicity index between the switching binding agent of SEQ ID NO: 2 and the switching binding agent of SEQ ID NO: 3, and
  • FIG. 5E is the switching binding agent of SEQ ID NO: 2 (H2) and the switching binding agent of SEQ ID NO: 3 ( L1) liver FRET analysis graph.
  • 6A and 6B are diagrams showing the binding between the switching binding agent of SEQ ID NO: 1 and the switching binding agent of SEQ ID NO: 4, and FIG. 6C is the interaction between the switching binding agent of SEQ ID NO: 1 and the switching binding agent of SEQ ID NO: 4 by site.
  • 6D is a diagram showing the hydrophobicity index between the switching binder of SEQ ID NO: 1 and the switching binder of SEQ ID NO: 4, and FIG. 6E is the switching binder of SEQ ID NO: 1 (H1) and the switching binder of SEQ ID NO: 4 ( L2) is a graph showing the results of liver FRET analysis.
  • Figure 7a is a diagram showing the measurement result of the antibody-binding force for each switching binding agent
  • Figure 7b is a diagram showing the SPR analysis result for the binding force for each switching binding agent binding to the antibody
  • Figures 7c and 7d are the antibody of the peptide binding to the antibody Figures showing the results for Fab site binding.
  • 8A to 8D are graphs illustrating analysis results according to an analysis method of a switching binder according to an embodiment.
  • 9A and 9B are graphs illustrating analysis results according to an analysis method using a switching binder according to another embodiment.
  • 10A to 10D are graphs illustrating analysis results according to an analysis method using a switching binder according to another embodiment.
  • references herein to a layer formed “on” a substrate or other layer refers to a layer formed directly on the substrate or other layer, or an intermediate layer or intermediate layers formed on the substrate or other layer. It may also refer to a layer. Also, for those skilled in the art, a structure or shape disposed "adjacent" to another shape may have a portion disposed above or below the adjacent shape.
  • peptide is an amino acid polymer chain, and is an amide in which an amino group of a first amino acid and a carboxy group of a second amino acid adjacent to the first amino acid are condensed while losing water molecules. All peptide sequences described herein are, by convention, written in an order with an N-terminal end to the left and a C-terminal end to the right. Also, in the present invention, the term 'peptide' may refer to a natural or synthetic protein, a protein fragment, or a peptide analog of a protein sequence. The analog is defined as a substance exhibiting similar physical properties such as size, charge or hydrophobicity exhibited by the corresponding basic amino acid or peptide in appropriate spatial orientation.
  • a peptide analog may be a compound in which an amide bond between one or more amino acids is replaced by a carbon-carbon bond or other bond known in the art.
  • the term “peptide” may be used interchangeably with the terms “protein” and “polypeptide”, which is a compound in which several amino acids are linked by peptide bonds. It may refer to a molecular structure in which the number of residues is 10 or more and 50 or less.
  • amino acid is a broad concept and includes not only naturally occurring amino acids and their residues, but also chemically modified amino acids, that is, amino acid mimetics and analogs, and in the present invention, the mimics and analogs Water may include functional equivalents.
  • aptamer refers to a DNA nucleic acid molecule that has a stable tertiary structure by itself and can bind to a specific substance with high affinity and specificity.
  • the aptamer may be prepared by a method well known in the art, and the method may be appropriately modified as necessary.
  • the term “antigen-antibody reaction” is a specific chemical interaction between antibodies produced in B cells of leukocytes and antigens in the course of an immune response.
  • each antibody can only bind to a specific antigen.
  • the specificity of the binding is due to the specific chemical structure of each said antibody.
  • the antigens bind to the antibody through weak non-covalent bonds such as electrostatic interactions, hydrogen bonds, van der Waals bonds, and hydrophobic interactions.
  • antibody refers to a basic 4-polypeptide chain consisting of two heavy chains and two light chains, the chains being stabilized by disulfide bonds with each other and having the ability to specifically bind antigen. Any molecular construct containing an antigen-binding moiety as a glycoprotein with
  • the antibody may be a basic component of serum, may be an aggregate of the antibodies, immunoglobulin molecules or fragments thereof, or may be a single molecule of an antibody or immunoglobulin.
  • the antibody molecule binds to an antigen or a specific antigenic determinant such as an epitope of the antigen, or reacts with the antigenic determinant.
  • NK natural killer cells recognize and remove the antibody. It can induce immunological effector mechanisms such as antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC).
  • the antibody may be monospecific, and the composition of the antibodies may be monoclonal, composed of identical antibodies, and different types of antibodies reacting with different epitopes of the same antigen or epitopes of different antigens. including polyclonal. Each antibody may have a unique structure that allows for specific binding of the antibody to the corresponding antigen.
  • the antibody may include an antibody, an antibody derivative, or a fragment thereof, and the detailed description of the antibody also applies to the antibody screening method of the present invention.
  • Antibodies include an Fc region, an immunoglobulin binding domain, a peptide mimicking a binding domain, a region homologous to the Fc region, or at least a portion thereof, among the fragments of the antibody, such as a polypeptide, or an antibody homologue.
  • Antibodies may also comprise chimeric molecules or equivalents thereof comprising an immunoglobulin binding domain fused to another polypeptide.
  • the antibodies may be intact immunoglobulin molecules, and the antibody's structure, such as Fab, Fab', F(ab')2, Fc, V H H, Fv, N-glycan structure and paratope, is It may include component parts and at least some of the component parts.
  • the antigen-binding fragment (fragment antibody binding: Fab) is an antigen-binding fragment of an antibody comprising an antigen-binding site, a light chain fragment comprising a variable region (VL) and a constant region (CL) of a light chain, and a heavy chain refers to an antibody fragment comprising a variable region (VH) and a first constant region (CH1).
  • the fragment crystallizable region corresponds to a portion that does not bind antigen but forms a crystal, and generally refers to a dimer complex comprising a C-terminal polypeptide sequence of an immunoglobulin heavy chain.
  • the Fc region may comprise a native or mutated Rc sequence.
  • the Fc sequence in the heavy chain of an immunoglobulin may have multiple boundaries, the IgG heavy chain Fc sequence is usually defined as extending from an amino acid residue at position Cys226 or about position Pro230 to the carboxyl terminus of the Fc.
  • the Fc sequence of an immunoglobulin generally comprises two constant regions of a heavy chain, a CH2 domain and a CH3 domain, and optionally a CH4 domain.
  • the Fc domain consists of two identical protein fragments derived from CH2 and CH3 of the two heavy chains of the antibody in the IgG, IgA and IgD isotypes, and the IgM and IgE Fc domains are each poly It contains three heavy chain constant domains in the peptide chain, CH2 to CH4.
  • the Fc region can form crystals when proteins are collected, which means that even if the antigen specificity of an IgG antibody is different, the amino acid sequence of the proteins constituting the Fc region is the same, and thus it is not involved in antigen binding.
  • the Fc region forms a higher-order structure by -S-S- loops with a certain number of amino acid residues as one division, and each division is linked by a peptide bond.
  • the Fv fragment variable is a variable region of an antibody that directly binds to an antigen, and is composed of a heavy chain variable domain (V H ) and a light chain variable domain (L H ).
  • the V H H is a single domain molecule without a light chain, a single variable domain also called a nanobody, and the naturally occurring single domain molecule is a camel, dromedary, alpaca, and guanaco, such as camels and sharks. It can be derived or obtained from, and can be obtained by recombination of an antibody molecule.
  • the heavy or light chain may include a variable region and a constant region, respectively.
  • the variable region has specificity for an antigen and is different for each antibody.
  • the variable region may include a hypervariable region (HVR), that is, complementarily determining regions (CDRs) and a framework region (FR) supporting the complementarity determining region.
  • HVR hypervariable region
  • CDRs complementarily determining regions
  • FR framework region supporting the complementarity determining region.
  • the complementarity determining region (CDR) has a different amino acid sequence for each antibody, so that it can specifically bind to each antigen.
  • the framework region (FR) refers to constant domain residues other than hypervariable region residues.
  • the framework region (FR) of the constant domain generally consists of four FR domains: FR1, FR2, FR3 and FR4, and is a region other than the CDRs present in the variable region, which serves as a scaffold connecting the three CDRs. It contributes to the structural stability of the CDRs.
  • the amino acid sequence of the framework region (FR) has a characteristic that there is little change compared to the complementarity determining region (CDR) even if the type of antibody, that is, the expression species of the antibody is different.
  • the CDRs and the FR sequences can generally appear in the variable region of the heavy chain (V H ) or the variable region of the light chain (V L ) in the following order: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2) )-FR3-H3(L3)-FR4.
  • the two variable regions of the heavy and light chains combine to form an antigen binding site.
  • the constant regions are substantially identical from antibody to antibody.
  • the constant region is usually a small molecule that modulates biological activity by selectively binding to proteins, various cells of the immune system, such as effector cells, and host tissues or factors including components of typical complement systems of immunoglobulins. binding can be mediated.
  • various embodiments of the present invention will be described in detail.
  • FIG. 1A shows that the switching binding agents 100 according to an embodiment of the present invention are bound to the framework regions (FR, FR′) of the antibody 10 .
  • the first switching agent which reversibly coupled to the switching agent 100 has the framework regions of the light chain (V L) that make up the antigen binding site 15 of the antibody (10) (FR ') ( HA, HB) or a second switching binding agent (LA, LB) that reversibly binds to the framework region (FR) of the heavy chain (V H ).
  • the first switching binding agent (HA, HB) may comprise an amino acid sequence selected from the framework region (FR) of the heavy chain (V H ) constituting the antigen binding site (15) of the antibody (10).
  • the second switching agent (LA, LB) may include an amino acid sequence selected from the light chain (V L) framework region (FR ') of that make up the antigen binding site 15 of antibody 10 .
  • the switching binding agent 100 comprises an amino acid selected from an amino acid sequence comprising a framework region (FR, FR') and a complementarity determining region (CDR, CDR') adjacent to the framework region (FR, FR').
  • CDR, CDR' complementarity determining region
  • the amino acid sequence of the first switching binding agent (HA, HB) is a CDR1 region (CDR1) and framework regions of the complementarity determining regions (CDR) of the heavy chain (V H ).
  • FR an amino acid sequence comprising a part or all of the sequence of the FR2 region (FR2) (hereinafter referred to as HAR region (HAR)) or the CDR3 region (CDR3) and FR3 region (FR3) of the heavy chain (V H ) It may be selected from an amino acid sequence (hereinafter referred to as an HBR region (HBR)) including some or all of.
  • HBR HBR region
  • An amino acid sequence comprising a part or all of the FR3' region (FR3') of (FR') and a part or all of the CDR3' region (CDR3') of the complementarity determining regions (CDR') adjacent thereto (hereinafter, LBR region) (referred to as LBR)).
  • the antigen-binding region 15 is to have a three-dimensional twisted structure.
  • the regions (HAR, LAR, HBR, LBR) have the framework regions (FR, FR') as essential components, the structure of the antibody 10 is supported through the above-described mutual binding properties. Since the switching peptide 100 according to an embodiment of the present invention includes the amino acid sequence of the above regions of the antibody 10, self-binding or cross-linking to the antigen-binding site of the antibody 10 is possible.
  • the switching binding agent 100 of the present invention is not limited to those selected from the HAR region (HAR), the HBR region (HBR), the LAR region (LAR), and the LBR region (LBR) shown in FIG. 1A . It can be variously selected from the amino acid sequence of the framework region (FR).
  • the amino acid sequence of the switching binding agent 100 may be selected from the FR3 region (FR3) or the FR3' region (FR3'), and a sequence used by linking the FR regions (FR) may also be used.
  • a region necessarily including at least one of the FR regions (FR, FR′), the FR1 region (FR1), the FR1 region (FR1) and the CDR1 region (CDR1), the FR2 region (FR2), the FR1 region region of heavy chain (V H ) such as (FR1) to FR2 region (FR2) or FR2 region (FR2) to FR3 region (FR3) or FR1' region (FR1'), FR1' region (FR1') and CDR1' light chains such as region (CDR1'), FR2' region (FR2'), FR1' region (FR1') to FR2' region (FR2') or FR2' region (FR2') to FR3' region (FR3') ( It is clear that the case of an amino acid sequence selected from the region of V L ) may also be included.
  • the switching binding agent 100 compares the complementarity determining regions (CDR, CDR') with the amino acid sequence of the framework region (FR, FR'), which is characterized by having the same or substantially similar sequence despite various antibodies. Since it is designed to include essential components, it is possible to bind to the antigen-binding site of the antibody regardless of the type of antibody or antigen. Various embodiments thereof will be described in detail with reference to FIG. 2 .
  • a first switching agent (HA, HB) can be reversibly coupled to the at least one of by the structural cross-binding properties of the above-mentioned antibody (10), the framework regions of the light chain (V L) (FR ') .
  • the first switching binding agent (HA) may bind to the LBR region (LBR), and the first switching binding agent (HB) may bind to the LAR region (LAR).
  • the second switching binder (LA, LB) is capable of reversibly binding to at least one of the framework regions (FR) of the heavy chain (V H ).
  • the second switching binding agent (LA) may bind to the HAR region (HAR)
  • the second switching binding agent (LB) may bind to the HBR region (HBR). This allows the switching binding agent 100 to bind to the framework regions (FR, FR') constituting the antigen binding site 15 of the antibody 10, thereby supporting the structure of the antigen binding site 15 of the antibody 10. do.
  • the first switching binding agent (HA, HB) may include a first antibody binding portion (AB1 of FIG. 5B and AB1' of FIG. 6B). 'By a first switching agent (HA, HB) is a framework region of the light chain (V L) of an antibody (10) (FR said first antibody binding part (AB1, AB1)') and can be principally coupled have.
  • the first antibody binding portion (AB1, AB1') may include at least one or more amino acid residues of -Y-, -I-, -W-, and -Q-.
  • the first antibody binding portion (AB1, AB1') may include an amino acid residue that specifically binds to the light chain (V L ) of the antibody 10 among the amino acid sequences selected from the heavy chain (V H ) of the antibody 10.
  • the sequence comprising the first antibody binding portion may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the underlined amino acid residue in the amino acid sequence may be the first antibody binding site (AB1, AB1').
  • the amino acid sequence in the N-terminal to C-terminal direction of the amino acid sequence may be as follows.
  • SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as H1): SYWIHWVK- Q -RPGQGLE- W -IGE
  • SEQ ID NO: 2 (hereinafter referred to as H2): VY- Y -CAREPTGTG- I -YFDV- W -GK
  • the ninth amino acid residue Q and the 17th amino acid residue W in the amino acid sequence may be the first antibody binding portion (AB1').
  • the third amino acid residue Y, the 13th amino acid residue I, and the 18th amino acid residue W of the amino acid sequence may be the first antibody binding portion (AB1). A detailed description thereof will be described in detail with reference to FIGS. 5A to 6E .
  • SEQ ID NOs: 1 and 2 are only non-limiting examples, and the embodiment of the present invention is any material comprising an amino acid sequence selected from the framework region (FR) of the heavy chain (V H ) capable of binding to each other can be
  • the second switching binding agent (LA, LB) may include a second antibody binding portion (AB2 of FIG. 5B and AB2' of 6B).
  • the second antibody binding portion (AB2) allows the second switching binding agent (LA, LB) to bind to the framework region (FR) of the heavy chain (V H ) of the antibody 10 .
  • the second antibody binding portion (AB2, AB2') may include at least one or more amino acid residues of -Y-, -Q-, -P-, -L- and -F-.
  • the second antibody binding portion (AB2, AB2') is an amino acid residue capable of specifically binding to the heavy chain (V H ) of the antibody 10 among the amino acid sequences selected from the light chain (V L ) of the antibody (10). may include.
  • the amino acid sequence comprising the second antibody binding portion (AB2, AB2'), preferably, the switching binding agent 100 may include one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 .
  • the underlined amino acid residue in the amino acid sequence may be a second antibody binding site (AB2, AB2').
  • the amino acid sequence in the N-terminal to C-terminal direction of the amino acid sequence may be as follows.
  • SEQ ID NO: 3 (hereinafter referred to as L1): TYLEW- Y -P- Q -K- P -GQS- P -K- L -LIYK
  • SEQ ID NO: 4 (hereinafter referred to as L2): VY- Y- CFQGSHVP- F- TK
  • the 6th amino acid residue Y, the 8th amino acid sequence Q, the 14th amino acid residue P, and the 16th amino acid residue L in the amino acid sequence may be the second antibody binding portion (AB2).
  • the third amino acid residue Y and the twelfth amino acid residue F in the amino acid sequence may be the second antibody binding portion (AB2').
  • This can include both the amino acid sequence containing the amino acid sequence selected from the non-limiting to the antigen binding site (15) comprising a framework region (FR) of the light chain (V L) that can be self-bonded to each other.
  • the first antibody-binding part (AB1, AB1 ') or second antibody binding part (AB2, AB2') is a framework region of the chain (V H) or light chain (V L) of said (FR , FR′) and at least one of electrostatic interaction, hydrogen bonding, van der Waals force, hydrophobic interaction, and combinations thereof.
  • the first antibody binding region (AB1, AB1') and the second antibody binding region (AB2, AB2') constituting the switching binding agent 100 are the framework regions (FR, FR') and the function of the side chain It can bond to each other by hydrogen bonding with the polar region of a group or peptide bond.
  • the first antibody binding part (AB1, AB1') and the second antibody binding part (AB2, AB2') are not limited to mutual binding through the polar region of the peptide bond with the functional group by the side chain, polarity
  • it may include various examples of binding that can bind to the switching binding agent 100 and the framework regions (FR, FR′) of the antibody 10 .
  • the switching coupling agent 100 may be designed to enable adjustment of coupling force, and a detailed description thereof will be described later with reference to FIG. 1B .
  • the switching binding agent 100 reversibly bound to the framework regions (FR, FR') of the antibody 10 is a target antigen (20 in FIG. 4A ) that specifically reacts with the antibody 10 .
  • a target antigen (20 in FIG. 4A ) that specifically reacts with the antibody 10 .
  • it can be separated from the framework regions (FR, FR').
  • the concentration of the antibody 10 in a state not bound to the target antigen 20 or the switching binding agent 100 may decrease, and according to the decrease in the concentration, the antibody ( 10) and the concentration of the antibody 10 to which the switching binding agent 100 is bound may also be reduced in order to maintain the equilibrium of the binding reaction of the switching binding agent 100 .
  • the switching binder 100 may be separated from the framework regions FR and FR′.
  • the binding of the switching binding agent 100 and the framework regions (FR, FR') may be weakened or destroyed by various factors.
  • One example does not limit the present invention.
  • the switching binding agent 100 may not affect the binding process of the target antigen 20 to the antibody 10 .
  • the switching binding agent 100 includes an amino acid sequence of a partial region of the framework region (FR, FR') of an antibody, or a portion of the framework region (FR, FR') or an adjacent region (HAR, HBR), and the target antigen 20 recognizes the complementarity determining regions (CDR, CDR') of the antibody 10 and binds to the antibody 10, so the target antigen 20 binds to the switching binding agent 100 It can be bound to the antibody (10).
  • the binding of the target antigen 20 and the antibody 10 causes a steric hindrance effect on the target antigen 20 , thereby causing separation of the bound switching binding agent 100 , so that detection or analysis of the target antigen 20 is possible. let it do
  • the switching binding agent 100 of the present invention has a switching property of performing a specific operation of binding and dissociation to the antibody 10, quantitation and analysis of antigen in one-step quickly and accurately while omitting the step of the washing process
  • FIG. 1B is a view showing a basic configuration of a switching coupling agent 100 according to an embodiment of the present invention.
  • the switching coupling agent 100 may be capable of adjusting coupling force.
  • it may be possible to control the binding force of the switching binding agent 100 by amino acid modulation of the antibody binding portion (AB).
  • AB amino acid modulation of the antibody binding portion
  • it can be selected in consideration of the three-dimensional structure of the amino acid sequence of the framework regions (FR, FR') constituting the switching binding agent 100 and the antigen binding site 15 for mutual binding, and the selected amino acid sequence
  • the modulation of the switching binding agent 100 and the framework region (FR, FR') it may be possible to control the binding force of the antibody binding site (15). Through this, it is possible to provide the switching binding agent 100 capable of binding to the antibody 10 of various species.
  • the switching binding agent 100 binds to the antibody binding part (AB, referred to as the first antibody binding part (AB1, AB1') or the second antibody binding part (AB2, AB2') in FIG. 1B) and the antibody binding part (AB) It may include a bonding strength regulating portion (bonding strength regulating portion, BR) as a basic unit configuration.
  • a bonding strength regulating portion bonding strength regulating portion, BR
  • -Antibody binding part (AB)-Avidity regulator (BR)-Antibody binding part (AB)- -Antibody binding part (AB)-Avidity regulator (BR)-Antibody binding part (AB)-Avidity control
  • the antibody binding part (AB)-binding force regulator (BR) is included as a unit structure, and the antibody binding part (AB) and the binding force regulator (BR)- are continuously bonded to the expanded polymer chain can be implemented.
  • the antibody binding portion (AB) may include an amino acid sequence of the switching binding agent 100 capable of recognizing and binding antibodies of various different species.
  • the antibody binding region (AB) is specific for at least a portion of the framework regions (FR, FR′) of the variable region included in the antigen binding site of the heavy or light chain of an antibody having the same or similar amino acid sequence in various types of antibodies. It can bind selectively or selectively and then separably or reversibly bind again. Such properties may occur, for example, depending on the structural properties of the switching binder 100 to be described later, but is not limited thereto, and all or part of the switching binder 100 is reversibly attached to at least a portion of the framework region of the antibody. This includes the case of combining. Since the antibody binding portion 101 is bound to the framework region (FR) of the antibody, there is an advantage applicable to various antibodies.
  • the switching binding agent 100 selects the idiotope through which the antibody selectively binds to the antigen, i.e., the framework region (FR) region present between these complementarity determining region (CDR) regions rather than the complementarity determining region (CDR) region.
  • the antibody selectively binds to the antigen, i.e., the framework region (FR) region present between these complementarity determining region (CDR) regions rather than the complementarity determining region (CDR) region.
  • CDR complementarity determining region
  • the binding force regulator (BR) does not affect the antigen-antibody binding coefficient for immunoassay because the stronger the binding force between the switching binding agent 100 and the antibody 10, the more likely it is to interfere with antigen binding to the antibody. To avoid this, the binding force between the switching binding agent 100 and the antibody is adjusted.
  • the binding force regulator (BR) may have a sequence of amino acids that are distinguished from each other according to the type of antibody to which they are applied.
  • the binding force of the switching binding agent 100 bound to each antibody may be controlled by the amino acid sequence difference of the binding force regulator (BR). Accordingly, the binding force of the switching binding agent 100 binding to the antibody may vary depending on the type of antibody in the antigen-antibody reaction.
  • the binding force between the antibody binding part (AB) and the antibody of the switching binding agent 100 can be controlled by the binding force adjusting part (BR), the antibody binding part (AB) under specific conditions in response to various types of the antibody 10 It can be designed to be easily separated from the framework region (FR) of the antibody 10 so that the switching binding agent 100 can be separated from the antibody 10 .
  • the antibody-binding portion (AB) is bound to the framework region (FR) of the antibody 10
  • the target antigen recognizes and specifically binds to the antigen-binding site of the antibody
  • the antibody (10) The antibody binding portion (AB) is easily separated from the framework region (FR) of the target antigen so that the target antigen can be easily bound to the antibody.
  • the switching binding agent 100 having a unit structure of the antibody binding part (AB)-binding force regulator (BR) has a specific action of binding and dissociation to the antibody in the antibody-antigen reaction. It has a switching characteristic that performs
  • the switching binding agent 100 of the present invention is bound to a predetermined antibody 10 and when the target antigen 20 is bound to the antibody, it is separated from the antibody 10, and by detecting the separated switching binding agent , enabling the identification and quantification of antigens (20).
  • a known method may be used for the specific and quantitative determination of the antigen 20 . That is, the switching binding agent 100 must bind to the antigen-binding site of the antibody 10, and is separated only when the antigen is bound to the antibody.
  • the antibody binding portion (AB) of the switching binding agent 100 binds somewhat non-specifically to a wide range of various antibodies, by the binding force regulator (BR), the target antigen to the antibody 10
  • the switching binding agent 100 is a specific reaction to the target antigen 20, that is, from the antibody (10).
  • the antigen can be titrated and/or quantified using the isolated switching binding agent.
  • unlike an anti-idiotype antibody used to interfere with binding to a specific antigen it may have non-limiting properties of binding to an antibody regardless of antigen-binding specificity.
  • the binding force of the switching binding agent 100 to the antibody 10 is such that the binding of the switching binding agent 100 and the antibody 10 does not affect the binding of the specific antigen to the antibody 10. 10) and may be designed to be smaller than the binding force between the specific antigen.
  • the present invention is not limited thereto, and in another embodiment, the binding force of the switching binding agent 100 to the antibody 10 is greater than the binding force of the antibody 10 and the target antigen 20 to the antigen and the antibody ( 10) can control the binding reaction between This can be applied when it is necessary to control the intensity of a reaction between an antigen and an antibody in the diagnostic field.
  • the antibody binding portion (AB) is a region capable of controlling binding force by modulation, and a detailed and detailed description thereof will be described later with reference to FIGS. 5A to 6E .
  • the binding force regulator (BR) can be bound to and separated from various antibodies other than a specific antibody, so that even when binding to an antibody of an unknown antigen such as a mutant virus, the binding force of the switching binding agent 100 is regulated so that the antibody ( Since separation of the switching binding agent 100 from 10) is facilitated, the speed and accuracy of the identification and quantification of antibodies to be described later can be improved.
  • a washing process is required because there are many non-specific reactions, and in the conventional antigen-antibody reaction, which is difficult to control, the steps of the washing process It has the advantage of enabling rapid and accurate one-step antigen quantification and analysis while omitting.
  • the antibody-binding portion (AB) may refer to the above description for the first antibody-binding portion (AB1, AB1') and the second antibody-binding portion (AB2, AB2') in FIG. 1A, in another embodiment
  • the binding force modulator (BR) comprises an amino acid sequence -SYWIHWVK-, -RPGQGLE-, -IGE-, -VY-, -CAREPTGTG-, -YFDV-, -GK-, -TYLEWY-, -KPGQS-, -K -, LIYK-, -CFQGSHVP- and -TK-, such as amino acid residues or sequences (hereinafter, binding force regulator amino acid sequence) may include one or more of, but is not limited thereto.
  • the switching binding agent 100 includes the antibody binding part (AB) and the binding force adjusting part (BR) as one or more unit structures so that the antibody binding part (AB) and the binding force adjusting part (BR) are continuously coupled. It can be expressed by the association of extended sequences. Accordingly, the binding force regulator (BR) may modulate the position of the antibody binding part (AB) in the switching binding agent 100 to control the binding force of the antibody binding part (AB) to the antibody (10).
  • the switching binding agent 100 is an antibody binding region (AB) selected from any one of the amino acid sequence of the antibody binding region (AB) and the binding force regulator (BR) selected from any one selected from the amino acid sequence of the binding modulator 102 ) may include an amino acid sequence that is repeated at least one or more times.
  • a sequence of it may include, but is not limited to, the antibody-binding portion amino acid sequence and the binding force-regulating amino acid sequence alternately repeated at least once or more.
  • the number of consecutively bound and extended amino acid residues by including the antibody binding part (AB) and the binding force regulator (BR) in one unit structure in the switching binding agent 100 is the framework region of the binding antibody
  • the number of amino acid residues may be the same, or may be many, but not limited thereto, and thus may include a small number.
  • the number of the extended amino acid sequence may be 6 to 30, but is not limited thereto.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating binding of a switching binder 100 to a framework region (FR) and a complementarity determining region (CDR) adjacent to the framework region (FR) according to another embodiment of the present invention.
  • the switching binders 100a and 100b are all or part of the FR1 region FR1 of the framework region FR, and the FR2 region FR2 of the framework region FR. all or part of, all or part of the FR3 region (FR3) of the framework region (FR), or all or a combination of all or part of the FR4 region (FR4) of the framework region (FR).
  • the switching binder 100a may be bound to the FR1 region FR1 of the framework regions FR
  • the switching binder 100b may be bound to the FR2 region FR2.
  • the switching binder 100 When the switching binder 100 is coupled to a portion of the framework region, it may be coupled to the framework region over about 30% to 70% of the framework region.
  • the switching binders 100a and 100b shown in FIG. 2 are bound only to the FR1 region (FR1) of the framework region (FR) and the FR2 region (FR2) of the framework region (FR), but this is not limiting. , can also bind to the FR3 region (FR3) of the framework region or the FR4 region (FR4) of the framework region, and, as described above, among the FR1 region (FR1) of the framework region (FR) to the framework region (FR) It can also bind to a sequence used by linking a framework region (FR) such as FR2 region (FR2) of FR2 region (FR2) or framework region (FR) to FR4 region (FR4) of framework region (FR).
  • the switching binder 100c may simultaneously bind to at least one or more framework regions (FR) and at least one or more complementarity determining regions (CDRs). For example, a portion of the entire amino acid sequence of the switching binding agent 100c may be bound to a framework region (FR), and another portion may be bound to a complementarity determining region (CDR). In another embodiment, the complementarity determining region (CDR) may be a region extending from the framework region (FR) to which the switching binder 100c is bound.
  • FR framework region
  • CDR complementarity determining region
  • the switching binder 100 is continuous in the CDR4 region (CDR4) of the complementarity determining region (CDR) between the FR3 region (FR3) in the framework region (FR) and the FR4 region (FR4) in the framework region (FR) can be combined.
  • the switching agent according to an embodiment of the present invention are also with the framework region (FR ') of the light chain (V L) can be similarly combined.
  • the antibody 10 may include any antibody, unless otherwise specified, including an isotype, hollotype, or idotype antibody.
  • the antibody 10 when the antibody 10 is an isotype antibody, the antibody 10 may include an antibody such as IgG, IgA, IgM, IgD or IgE.
  • antibody 10 may be a human antibody, a non-human antibody, a humanized non-human antibody, or a combination thereof.
  • the switching binding agent 100 is a framework region (FR, FR') region and a framework region (FR, FR') constituting the antigen binding site 15 that causes mutual binding to form the three-dimensional structure of the antibody as described above.
  • the switching binding agent 100 can be provided with an extended usable range by being applicable to various antibodies.
  • the switching binding agent 100 may be a peptide, protein, aptamer, nanobody, phage display, yeast display or another antibody.
  • the peptide can be produced by chemical synthesis, solid-phase technology using amino acid precursors, and synthetic or recombinant means by an automated peptide synthesizer.
  • the above-described methods for synthesizing peptides are non-limiting examples, and various known methods for synthesizing peptides may be applied.
  • the protein is a high molecular compound composed of several amino acids formed by peptide bonds of amino acids.
  • the protein can be synthesized using automated organic synthesis methods, and a genetically engineered recombinant protein can be expressed such that a nucleic acid sequence encoding a macromolecular delivery domain is cloned into a nucleic acid expression vector.
  • the aptamer may be obtained by an in vitro selection method using binding of a target molecule as a non-limiting example.
  • Selection of aptamers that specifically bind to the framework regions (FR, RR') of the target molecule, in particular the heavy chain (V H ) or the light chain (V L ) can include organic molecules, nucleotides, amino acids, peptides, polypeptides, This can be achieved by isolating an aptamer capable of specifically binding a marker molecule, ion, metal, salt, polysaccharide on the cell surface to each ligand.
  • selection of the aptamer may be performed using an in vivo or in vitro selection technique using a systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) method.
  • Nanobody is a single domain antibody, a monomer variable antibody domain composed of a single antibody fragment, like an antibody, can selectively bind to a specific antigen.
  • Nanobodies may comprise heavy chain antibodies, antibodies naturally devoid of light chains, single domain antibodies derived from conventional four-chain antibodies, engineered antibodies and single domain scaffolds other than those derived from antibodies.
  • phage display is to present a part or all of a protein such as a peptide or antibody on the surface of a bacteriophage. It is widely used for the identification of protein-protein interactions through the phage display, and in addition, it is useful for searching for important specific antibodies for treatment, diagnosis, or experiments.
  • yeast display is a protein engineering technique that uses the expression of recombinant proteins integrated into the yeast cell wall to isolate and engineer antibodies.
  • the antibody as the switching binding agent 100 may be a human antibody, a non-human antibody, or a humanized non-human antibody.
  • the human antibody may be an antibody having an amino acid sequence corresponding to an antibody produced by a human and/or prepared using any technique for making a human antibody as disclosed herein.
  • the human antibody may be formed by a phage-display, human hybridoma technique.
  • the non-human antibody may be an antibody obtained from a source of various species, for example, non-human mammals or birds such as rodents, rabbits, cattle, sheep, pigs, and dogs.
  • the humanized non-human antibody is a chimeric antibody that contains minimal sequence derived from non-human immunoglobulin.
  • the humanized non-human antibody may also contain a sequence selected from non-human antibodies instead of a human sequence.
  • the humanized antibody may contain conservative amino acid substitutions, i.e. non-natural residues derived from the same species or other species that do not significantly alter antibody binding and/or biological activity. These modifications can be made to further refine antibody performance, such as binding affinity.
  • Examples of the above-described switching binding agent 100 are non-limiting examples, and may include various examples including the above-described amino acid sequence capable of reversibly binding to a heavy chain or a light chain of an antibody.
  • an antigen comprising the framework regions (FR, FR') of the heavy or light chain of the antibody 10 It may bind to the binding site 15 , and the switching binding agent 100 may include a corresponding material.
  • the inorganic material is, for example, silicon dioxide (SiO 2 ), aluminum oxide (Al 2 O 3 ), calcium oxide (CaO), magnesium oxide (MgO), iron oxide (Fe 2 O 3 ), titanium oxide (TiO 2 ), Potassium oxide (K 2 O), sodium oxide (Na 2 O), limestone (CaCO 3 ), dolomite (CaMg(CO 3 ) 2 ), talc (Mg 3 Si 4 O 10 (OH) 2 ), silver oxide (Ag 2 ) O), chromium oxide (Cr 2 O 3 ), cobalt oxide (CoO 2 ), copper oxide (CuO), and zinc oxide (ZnO) may be formed of one or more of the group consisting of.
  • FIG 3 shows a switching coupling 100 according to one embodiment of the present invention.
  • the switching binder 100 may be labeled with a labeling material 200 that exhibits a chemical, electrical, magnetic or optical labeling reaction.
  • the antibody and the antigen can be identified and quantified by the label amount shown by the switching binding agent 100 binding to and separating the antibody 10, and an antibody to be described later. There is an advantage that can measure the binding force of the antigen to the.
  • an oligohistidine sequence-tag, chemical tagging with a dye, or the like may be included.
  • an electron current signal reaction generated by an oxidation-reduction reaction of an expression substrate may be included.
  • a specific radiolabeled binding member specifically an antibody molecule, may be loaded with a plurality of paramagnetic ions via a chelating group.
  • Chelating groups may include EDTA, porphyrin, polyamine crown ethers and polyoximes, and examples of paramagnetic ions may include gadolinium, iron, manganese, rhenium, europium, lanthanum, holmium and erbium.
  • the paramagnetic ions are loaded to allow identification and localization of antibodies through radiolabeled specific binding members, particularly antibodies and fragments of antibodies.
  • radiolabeled specific binding members particularly antibodies and fragments of antibodies.
  • luminescence, color development, fluorescence, turbidity, magnetic force or electrical resistance reaction may be included.
  • the labeling material 200 may be bound to at least any part of the switching binder 100 .
  • the label material 200 may be a color emitting material, a light emitting material, a fluorescent material, a magnetic material, a metal material, an organic synthetic material, or a combination thereof.
  • the labeling material 200 is Horseradish peroxidase (HRP)
  • the substrate is a peroxide such as hydrogen peroxide and/or 3,3',5,5'-tetramethyl It may be benzidine (Tetramethylbenzidine; TMB).
  • the labeling material 200 may be alkaline phosphatase (AP), and the substrate may be bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), or naphthol-ASB1-phosphate (naphthol).
  • BCIP bromochloroindolyl phosphate
  • NBT nitro blue tetrazolium
  • naphthol-ASB1-phosphate naphthol-ASB1-phosphate
  • ECF enhanced chemifluorescence
  • the fluorescent material Applied Biosystems' HEX TM , TAMRA, lumiprobe's Cy5 or sulforodamine 101 acid chloride (sulforodamine 101 acid chloride; Texas Red) may be used, preferably FAM fluorescence or TAMRA It may be fluorescent.
  • the metal material it may include any coordinated metal atom capable of undergoing an oxidation-reduction reaction, for example, a material such as iron, cobalt, ruthenium, zinc, copper, lithium or silver.
  • ferrocene zinc tetrabenzoporphyrin, cobalt phthalocyanine, tris-(2,2'-bipyrimidine)ruthenium, 4-ferrocenylbenzyl alcohol, 5-(4-hydroxymethylphenyl)-10,15, It may be selected from the group consisting of 20-trimesitylporfinatozinc (
  • the steps of identifying an amino acid sequence in the antigen binding site 15, obtaining a hydrophobicity index of the amino acid sequence, the Comparing the hydrophobicity index it may include the step of extracting the switching binder (100).
  • the description of the switching coupling agent 100 is the same as that described above without contradiction.
  • the antigen binding site 15 is an amino acid sequence having a characteristic of self-binding to each other. can confirm.
  • the framework regions (FR, FR') have the same or substantially similar amino acid sequence among various types of antibodies, and have the advantage of being applicable to various antibodies, so that the framework regions To identify the amino acid sequence to be selected from (FR, FR').
  • the hydrophobicity index for each amino acid sequence site for the antibody may be obtained.
  • the hydrophobicity index can be divided into a negative value and a positive value, and it can be confirmed that a positive value indicates a hydrophilic property, and a negative value indicates a portion having a hydrophobic property. A detailed description thereof will be described later with reference to FIGS. 5C and 5D and FIGS. 6C and 6D .
  • the amino acid sequence of the framework region (FR, FR ') of the chain (V H) and light chain (V L) of the above by comparing the hydrophobicity index, configure the antigen binding site 15 of the portion having the same properties It may include extracting the switching binding agent 100 including the amino acid sequence.
  • inter-sequences exhibiting hydrophilic properties or sequences exhibiting hydrophobic properties may be mutually bound.
  • the amino acid sequence of a portion capable of mutual binding due to hydrophilic properties or a portion having hydrophobic properties capable of mutual binding may be selected as all or part of the amino acid sequence of the switching binding agent 100 .
  • the step of selecting the switching binding agent 100 through the information of the amino acid sequence, the heavy chain (V H ) or the framework region (FR, FR') of the light chain (V L ) mutual binding characteristics Extracting the amino acid sequence with Through the property of binding between the antigen binding sites 15 including the framework regions (FR, FR') of the antibody 10, the switching binding agent 100 binds to the framework regions (FR, FR'), This is because it has the advantage of obtaining the same effect as the interaction between the work regions (FR, FR').
  • a detailed description of the switching binder 100 is the same as described above.
  • the switching binder 100 may be included as a pharmaceutical composition for disease screening, diagnosis, prophylaxis, treatment or integration of diagnosis and treatment.
  • the switching binding agent 100 has the advantage of enabling diagnosis, prevention or treatment of various viruses through the characteristic that it specifically binds to and isolates the framework regions of various antibodies 10 .
  • the pharmaceutical composition may be administered in various oral and parenteral formulations at the time of administration. In the case of formulation, it can be prepared using a diluent or excipient such as a filler, extender, binder, wetting agent, disintegrant, surfactant, etc. commonly used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations include at least one compound and at least an excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose. , is prepared by mixing gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Liquid formulations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc. In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc. may be included. . For a description of the switching binder 100, reference may be made to the foregoing.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • non-aqueous solvent and the suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
  • FIG. 4A shows a flow chart of an analysis method using the switching binder 100 according to an embodiment
  • FIG. 4B shows a flowchart of an analysis method using the switching binder 100 according to another embodiment of the present invention
  • 4c is a flowchart of an analysis method using the switching binder 100 according to another embodiment.
  • the analysis method may include a step (not shown) of selecting an amino acid sequence from the framework regions (FR, FR').
  • the amino acid sequence of the switching binding agent 100 may be selected from framework regions (FR, FR′) in which the heavy chain (V H ) and the light chain (V L ) of the antibody are located adjacent to each other and self-bond.
  • the step of selecting the amino acid sequence the disclosure of FIGS. 1A to 2 and the following description for those that can be selected from the framework regions (FR, FR′) constituting the antigen-binding site 15 of the antibody 10 . Examples may be referred to. Therefore, there is an advantage that can be applied to various antibodies 10 by extracting the amino acid sequence comprising the same or substantially similar framework region (FR) for each antibody 10 among the antigen binding sites 15 of the antibody 10. .
  • the antibody 10 may be prepared by being fixed to the support 30 .
  • the support 30 may be a substrate, a bead, a fiber, or a polymer structure.
  • a substrate that can be used as the support 30 is not limited as long as it can be used for a biochip or a biosensor.
  • it may be gold, ceramics, glass, polymers, silicon, modified silicon, fibers and metals whose surface has been modified or not by a separate treatment.
  • the polymer may be tetrafluoroethylene, polystyrene, polycarbonate or polypropylene, and the fiber is nitrocellulose, regenerated cellulose, nylon (nylon) may be a membrane, and the material that can be treated on the substrate to modify the surface is a material such as a polymer, plastic, resin, carbohydrate, silica, silica derivative, carbon, metal, inorganic glass, and a film.
  • the support 30 serves not only as the support 30 , but also provides a place for the reaction between the immobilized antibody and the sample.
  • the specification of the support and the position, size and shape of the antibody fixed thereon may vary depending on the purpose of analysis, a spotting machine, a dispensing machine, and an analysis device such as a scanner.
  • Figure 4a shows that the antibody 10 is immobilized on a substrate using a solid support 30, but is not limited thereto, and the antibody 10 is fixed to a bead and placed in a solution (see Fig. 4b);
  • the antibody 10 is not immobilized, but may be provided in a mixed state in a solution (see FIG. 4C ). That is, it can be applied to immunosorbent-type immunoassays and homogeneous-type immunoassays.
  • the switching binding agent 110 bound to the antibody 10 in the pretreatment step (S100) may be quantified.
  • the antibody 10 is immobilized on a substrate, and the switching binding agent 100 binds the labeling material 200 to the switching binding agent 100 to exhibit a labeling reaction, and the switching binding agent 100 on the lower surface of the substrate.
  • the intensity of the labeling reaction can be measured.
  • the switching binding agent 110 bound to the antibody 10 is quantified, and the switching binding agent bound to the antibody 10 ( 110) as an initial value, there is an advantage in that it is possible to identify or quantify the target antigen 20 with high accuracy.
  • the "amount" of the switching binder 100 may be used interchangeably with the "concentration” of the switching binder 100, and the description that the amount of the switching binder 100 is “large” or “small” can be understood as “high” or “low” concentration of the switching binder 100 .
  • the step of providing the analyte to the antibody 10 may be included.
  • the antigen processing step (S200) of binding the target antigen 20 to the antibody 10 and separating the bound switching binding agent 110 from the framework regions (FR, FR') may be performed.
  • the target antigen 20 may or may not be included in the analyte, and when the target antigen 20 is included in the analyte and the target antigen 20 is provided to the antibody 10, Due to the specific reactivity of the target antigen 20 with the antibody 10, at least some of the switching binding agents 110 bound to the antibody 10 are separated from the framework regions (FR, FR')
  • the antibody 10 may be released as a solution containing it. As the concentration of the target antigen 20 increases, the ratio of the switching binding agent 100 separated from the antibody 10 among the switching binding agents 110 bound to the antibody 10 may increase.
  • an analysis step (S300) of quantifying and analyzing the target antigen 20 may be performed.
  • the target antigen 20 in the analyte can be analyzed through the switching binding agents 100, 120, 130 without performing a washing step after providing the analyte to the antibody 10.
  • the remaining amount of the switching binder 120 bound to the framework regions FR and FR′ may be quantified.
  • the present invention can identify or quantify up to the amount or concentration of the target antigen 20 contained in the analyte (hereinafter referred to as the first analysis).
  • the switching binder 130 separated from the framework regions FR, FR' may be quantified.
  • the target antigen 20 may be included in the analyte (hereinafter, second analysis). called).
  • both the residual amount of the switching binder 120 bound to the framework regions FR and FR′ and the switching binder 130 separated from the framework regions FR and FR′ may be quantified.
  • the amount of the switching binding agent 110 bound to the antibody 10 measured in the pretreatment step (S100) and the remaining amount of the switching binding agent 120 bound to the framework regions (FR, FR′) in the analysis step (S300). 2 for quantification of the target antigen 20 using the difference in the amount of the (first assay) and the difference in the amount of the switching binding agent 130 separated from the framework (FR, FR′) (the second assay) Several analysis methods may be utilized.
  • the quantification can be determined by measuring the above-described labeling reaction of the labeling material 200 bound to the remaining amount of the switching binder 120 and/or the separated switching binder 130, for example, the fluorescence of the labeling reaction.
  • the amount of can be measured using a fluorescence resonance energy transfer (FRET) method.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the analysis method may include a step (not shown) of selecting an amino acid sequence from the framework regions (FR, FR′).
  • the description of the step of selecting the amino acid will be described in detail with reference to FIGS. 1A to 2 and the Examples to be described later.
  • the antibody 10 may be immobilized on the beads in the pretreatment step (S100').
  • the beads are non-limiting examples, and may be glass beads, magnetic beads, or polymer beads. According to an embodiment of the present invention, by using beads that can be disposed or dispersed in a solution rather than a substrate as the support 30 for fixing the antibody 10, it is easy to uniformly fix the antibody 10 to the beads. Then, there is an advantage in that the antibody 10 and the target antigen 20 are mixed in the antigen processing step (S200'), so that the degree of binding between the antibody 10 and the target antigen 20 is increased.
  • the beads can be dispersed or placed on a solution, unlike a fixed support such as a substrate, so there is an advantage that a solution phase process for the analysis of the target antigen 20 is possible, so the step of fixing the antibody 10 is omitted There is an advantage in that the accuracy of the analysis is improved by binding the target antigen 20 and the antibody 10 with a high probability.
  • the target antigen 20 which is the analyte
  • the antigen processing step (S200') the target antigen 20, which is the analyte
  • a switching binding agent Separation of (100) from the framework regions (FR, FR') may be performed.
  • the remaining amount of the switching binder 120 bound to the framework regions (FR, FR') after the antigen processing step and the switching binder separated from the framework regions (FR, FR') ( 130) can be isolated.
  • the remaining amount of the switching binding agent 120 and the framework regions (FR, FR) bound to the bead, the antibody 10 immobilized on the bead and the framework region (FR, FR') of the antibody 10 ') the separated switching binder 130 may be separated.
  • the density of the switching coupling agent may be greater than the density of the separated switching coupling agent 130 .
  • the switching coupling agent may be separated using a point that the density of the switching coupling agent is greater than the density of the separated switching coupling agent 130 .
  • a centrifuge may be used or the switching binder may be precipitated.
  • the analysis method may include a step (not shown) of selecting an amino acid sequence from the framework regions (FR, FR′).
  • a step of selecting the amino acid reference may be made to details described in FIGS. 1A to 2 .
  • the pretreatment step (S100 '') provides the antibody 10 with a switching binding agent 100 to provide a first conjugate (b1) of the antibody 10 and the switching binding agent 100 and a switching binding agent that is not bound to the antibody 10 ( 100) may include obtaining a mixed solution (S110) and removing the switching binding agent 100 that is not bound to the antibody 10 from the mixed solution (S120).
  • the mixed solution is passed through a desalting column to remove the unbound switching binder passing through the desalting column first, and only the first binder (b1) passing through the desalting column later can be obtained.
  • the above-described method is exemplary, and various known techniques for separating the first coupling agent and the switching coupling agent 100 may be referred to.
  • the antigen processing step (S200'') binds the target antigen 20 to the antibody 10 and converts the first conjugate (b1) into the framework regions (FR, FR') Separation from the may be performed.
  • the target antigen 20 is provided to the antibody 10
  • the target antigen 20 is bound to the antibody 10 in the first conjugate (b1) by specific reactivity with the antibody 10.
  • the switching binder 100 is separated into the framework regions FR and FR′ and released into the solution phase.
  • the analysis step (S300'') is a step of separating the second binder (b2) of the antibody 10 to which the switching binding agent 130 and the target antigen 20 separated from the antibody 10 are bound (S310) and quantifying the separated switching binder 130 ( S320 ).
  • the switching binder 130 separated from the second binder b2 may be separated using, for example, a protein-A column 40 . Thereafter, only the separated switching binding agent 130 may be selectively obtained and quantified through a labeling reaction. At this time, as the concentration of the target antigen 20 increases, the amount of the switching binder 130 separated from the second binder b2 increases, thereby increasing the fluorescence amount of the solution.
  • a test kit capable of identifying antibodies and antigens through the amount of the switching binding agent 130 separated according to an increase in the concentration of the target antigen 20 may be provided.
  • the test kit using the switching binding agent 100 may be performed according to an immunoassay method.
  • the test kit may include a luminex assay, a protein microarray assay, an ELISA assay, a capture-ELISA assay, an ELISPOT assay, a radioimmunoassay (RIA), a lateral flow immunoassay (LFIA), flow-through immunoassay (FTIA), protein microfluidic immunoassay, protein microfluidic immunoassay, protein capillary electrophoresis (CE), immunity -PCR) assays, electrochemical biosensors, radioimmunoprecipitation assays, immunoprecipitation assays, immunohistochemical staining assays, Ouchterlony immunodiffusion assays, inhibition or competition assays, sandwich assays, flow cytometry , immunoelectrophoresis analysis, tissue immunostaining analysis, complement fixation analysis, FACS analysis, protein chip analysis, immunofluorescence staining analysis, and immunoaffinity purification analysis methods may be applied.
  • test kit may include the switching binding agent 100 labeled with a natural or artificial labeling material 200 .
  • a description of the labeling material 200 may refer to FIG. 3 .
  • the binding force of the target antigen 20 to the antibody 10 is measured by measuring the amount of the separated switching binding agent 130 according to the increase in the concentration of the target antigen 20.
  • a test kit that can be measured can be provided.
  • the antigen binding coefficient (K d ) of the antibody 10 may be measured.
  • the antigen binding coefficient (K d ) may be an equilibrium dissociation constant indicating the strength of the antigen-antibody binding interaction.
  • the higher the antigen binding coefficient (K d ) the higher the binding affinity between the target antigen 20 and the antibody 10 may be.
  • the amount of fluorescence increases, and accordingly, it can be calculated by measuring each concentration. Accordingly, through the amount of the switching binding agent 100 released by the antigen-antibody binding, the strength of binding can be known by the difference between the antigen-antibody binding coefficient and the binding coefficient measured by a conventional method.
  • the test kit may provide a test kit capable of measuring the binding force of the antigen 20 to the antibody 10 in a solution to which the antibody 10 is not immobilized.
  • the antigen binding coefficient (K d ) is measured when the antibody 10 contained in the solution binds the target antigen 20 without fixing the antibody 10 on the solid support 30 .
  • the test kit may include the switching binding agent 100 labeled with a natural or artificial labeling material 200 .
  • Description of the switching binder 100 and the labeling material 200 may refer to FIGS. 1A to 3 .
  • Analysis results according to the analysis method of FIG. 4C will be described in detail with reference to FIGS. 10A to 10D .
  • Figure 5a shows the binding between the switching binding agent of SEQ ID NO: 2 (H2) and the switching binding agent of SEQ ID NO: 3 (L1)
  • Figure 5b shows the switching binding agent of SEQ ID NO: 2 (H2) and the switching binding agent of SEQ ID NO: 3 (L1) ) shows the specific binding between the amino acid sequences of
  • Figure 5c is a graph showing the interaction between the switching binding agent (H2) of SEQ ID NO: 2 and the switching binding agent (L1) of SEQ ID NO: 3 for each site
  • Figure 5d is SEQ ID NO: It is a diagram showing the hydrophobicity index between the switching binder of SEQ ID NO: 2 (H2) and the switching binder of SEQ ID NO: 3 (L1)
  • FIG. 5E is FRET between the switching binder of SEQ ID NO: 2 (H2) and the switching binder of SEQ ID NO: 3 (L1) analysis graph.
  • a three-dimensional structure is formed between the switching binding agent of SEQ ID NO: 2 (H2) and the switching binding agent of SEQ ID NO: 3 (L1) to form a mutual bond. That is, the switching binding agent of SEQ ID NO: 2 (H2) and the switching binding agent of SEQ ID NO: 3 (L1) do not interact in a straight line.
  • the lower end of the switching binder (H2) of SEQ ID NO: 2 the upper end of the switching binder (L1) of SEQ ID NO: 3, the upper end of the switching binder (H2) of SEQ ID NO: 2, and the lower end of the switching binder (L1) of SEQ ID NO: 3 are interacting
  • the binding of the adjacent region between the switching binding agent of SEQ ID NO: 2 (H2) and the switching binding agent of SEQ ID NO: 3 (L1) is performed at a short distance of about 4 ⁇ to 8 ⁇ , preferably about 3 ⁇ to 6 ⁇ .
  • Binding of adjacent sites may operate at a short distance of about 4 ⁇ to 8 ⁇ , preferably about 3 ⁇ to 6 ⁇ .
  • a portion of the amino acid sequence of the switching binding agent (H2) of SEQ ID NO: 2 and the switching binding agent (L1) of SEQ ID NO: 3 may cause hydrogen bonding.
  • the switching binding agent of SEQ ID NO: 2 (H2) comprises the sequence of V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K
  • the switching binding agent of SEQ ID NO: 3 (L1) may include the sequence of T-Y-L-E-I-K-Y-P-Q-S-P-I-K-Y-P-G.
  • the amino acid sequence may include a first antibody binding region (AB1) or a second antibody binding region (AB2) that mainly binds.
  • AB1 first antibody binding portion
  • AB2 second antibody binding region
  • the first antibody binding portion (AB1) the third amino acid sequence Y and the 18th amino acid sequence W among the amino acid sequence of the peptide sequence (H2) of SEQ ID NO: 2 interact through the amino acid side chain functional group
  • the 13th amino acid sequence I can cause interaction with the polar region of the peptide bond.
  • the amino acid sequence extracted from the light chain may include a second antibody-binding portion (AB2) that binds to the framework region of the heavy chain (VH) constituting the antigen-binding site together with the light chain.
  • a second antibody binding portion (AB2) it interacts through a side chain functional group of the 6th amino acid sequence Y and the 8th amino acid sequence Q among the amino acid sequence of the switching binder sequence (L1) of SEQ ID NO: 3,
  • the 14th amino acid sequence P and the 16th amino acid L interact with the polar region of the peptide bond. Accordingly, as shown in the figure, amino acids underlined in red may cause interactions through side chain functional groups, and amino acids shown in blue may cause interactions with polar sites of peptide bonds.
  • a first antibody binding region (AB1) and a second antibody binding region (AB2) between the switching binding agent of SEQ ID NO: 2 (H2) and the switching binding agent of SEQ ID NO: 3 (L1) ) may have a hydrophobicity index according to the side chain of the amino acid.
  • a portion having a positive hydrophobicity index may be located inside the protein, and a negative hydrophobicity may be located outside the protein because it is water-soluble.
  • the hydrophobic portion may cause interaction with the hydrophobic portion and the hydrophilic portion with the hydrophilic portion.
  • the upper end of the switching binder of SEQ ID NO: 2 (H2) and the switching binder of SEQ ID NO: 3 (L1) is hydrophilic, and the lower end is hydrophobic.
  • the hydrophilic moiety and the hydrophobic moiety interact on the same side, and the lower end of the switching binder (H2) of SEQ ID NO: 2 and the upper end of the switching binder (L1) of SEQ ID NO: 2 and the switching binder of SEQ ID NO: 2 (H2) ) and the lower end of the switching binding agent (L1) of SEQ ID NO: 3 may interact on a three-dimensional structure.
  • the SEQ ID NO: 2 switching agent (H2) are SEQ ID NO: 3 switching agent (L1) and can interact with the LAR region (LAR) of the light chain (V L) comprising the same amino acid sequence, SEQ ID NO: 3 in the
  • the switching binding agent (L1) may interact with the HAR region (HAR) of the heavy chain (V H ) comprising the same amino acid sequence as the switching binding agent (H2) of SEQ ID NO:2. If the amino acids at the four hydrogen bonding positions between the switching binding agent (H2) of SEQ ID NO: 2 and the switching binding agent (L1) of SEQ ID NO: 3 observed through the three-dimensional structure are modulated by considering the three-dimensional structure, the antibody binding site ( 15) has the advantage of controlling the binding force.
  • FIG. 5e provides a FRET experiment results showing the mutual binding between the antibody binding switching binding agent (100). This indicates the mutual binding between the switching binding agent of SEQ ID NO: 2 (H2) and the switching binding agent of SEQ ID NO: 3 (L1).
  • the switching binding agent (H1) of SEQ ID NO: 2 can self-binding and interact with the LAR region (LAR) of the light chain (V L ), and the switching binding agent (L1) of SEQ ID NO: 3 is the heavy chain (V H ) It can be confirmed that it can self-bind and interact with the HAR region (HAR) of Through this, the switching binding agent 100 having an amino acid sequence extracted from the heavy chain (V H ) can bind to the antigen binding site 15 including the framework region (FR) of the light chain (V L ) and cross-binding and , that the switching binding agent 100 having an amino acid sequence extracted from the light chain (V L ) is capable of cross-binding with the antigen binding site (15) comprising the framework region (FR) of the heavy chain (V H ) can be checked Through this mutual binding property, the switching binding agent 100 binds to the antigen-binding site 15 including the framework regions (FR, FR'), similar to the interaction between the framework regions (FR, FR') because the effect of
  • Figure 6a shows the binding between the switching binder of SEQ ID NO: 1 (H1) and the switching binder of SEQ ID NO: 4 (L2)
  • Figure 6b is the switching binder of SEQ ID NO: 1 (H1) and the switching binder of SEQ ID NO: 4 (L2)
  • 6C is a graph showing the interaction between the switching binding agent (H1) of SEQ ID NO: 1 and the switching binding agent (L2) of SEQ ID NO: 4 by site
  • FIG. 6D is The hydrophobicity index between the switching binder of SEQ ID NO: 1 (H1) and the switching binder of SEQ ID NO: 4 (L2) is shown
  • FIG. 6E is FRET between the switching binder of SEQ ID NO: 1 (H1) and the switching binder of SEQ ID NO: 4 (L2). It is a graph showing the analysis result.
  • the switching binding agent (H1) of SEQ ID NO: 1 and the switching binding agent (L2) of SEQ ID NO: 4 interact while forming a three-dimensional structure. That is, the switching binding agent (H1) of SEQ ID NO: 1 and the switching binding agent (L2) of SEQ ID NO: 4 do not interact in a straight line.
  • the lower end of the switching binder (H1) of SEQ ID NO: 1, the upper end of the switching binder (L2) of SEQ ID NO: 4, the upper end of the switching binder (H1) of SEQ ID NO: 1, and the lower end of the switching binder (L2) of SEQ ID NO: 4 are interacting
  • the binding of the adjacent region between the switching binding agent (H1) of SEQ ID NO: 1 and the switching binding agent (L2) of SEQ ID NO: 4 is performed at a short distance of about 4 ⁇ to 8 ⁇ , preferably about 3 ⁇ to 6 ⁇ .
  • FR work Framework regions (FR, FR') that self-bond and interact with the switching binding agent (H1) of SEQ ID NO: 1 or the switching binding agent (L2) of SEQ ID NO: 4 through the binding distance between the switching binding agents (H1, L2) are also similarly , due to structural characteristics, the bonding of adjacent sites may act at a short distance of about 4 ⁇ to 8 ⁇ , preferably about 3 ⁇ to 6 ⁇ .
  • a portion of the amino acid sequence of the switching binding agent (H1) of SEQ ID NO: 1 and the switching binding agent (L2) of SEQ ID NO: 4 may cause hydrogen bonding.
  • the switching binder (H1) of SEQ ID NO: 1 may include the sequence of S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E
  • the switching binder (L2) of SEQ ID NO: 4 may include the sequence of V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T.
  • the amino acid sequence may include a first antibody binding portion (AB1') or a second antibody binding portion (AB2') that mainly binds.
  • Q which is the ninth amino acid sequence among the amino acid sequence of the switching binding agent (H1) of SEQ ID NO: 1, interacts through the side chain functional group of the amino acid, and the 17th The amino acid sequence W interacts with the polar region of the peptide bond.
  • a second antibody binding portion (AB2') may be included.
  • the second antibody binding portion (AB2') As the second antibody binding portion (AB2'), it interacts through a side chain functional group of the third amino acid sequence Y among the amino acid sequence of the switching binding agent (L2) of SEQ ID NO: 4, and the 12th amino acid sequence F causes interaction with the polar region of the peptide bond. Therefore, as shown in the figure, amino acids underlined in red may cause an interaction through a side chain functional group, and amino acids indicated in blue may cause interaction with a polar site of a peptide bond.
  • the hydrophobicity index (hydrophobiciy) according to the side chain of amino acids between the switching binding agent (H1) of SEQ ID NO: 1 and the switching binding agent (L2) of SEQ ID NO: 4 can have In FIG. 6c , a portion having a positive hydrophobicity index may be located inside the protein, and a negative hydrophobicity may be located outside the protein because it is water-soluble. In addition, the hydrophobic portion may cause interaction with the hydrophobic portion and the hydrophilic portion with the hydrophilic portion.
  • the upper end of the switching binder of SEQ ID NO: 1 (H1) and the switching binder of SEQ ID NO: 4 (L2) is hydrophilic, and the lower end is hydrophobic.
  • the hydrophilic moiety and the hydrophobic moiety interact on the same side, and the lower end of the switching binder (H1) of SEQ ID NO: 1 and the upper end of the switching binder (L2) of SEQ ID NO: 1 and the switching binder (H1) of SEQ ID NO: 1 ) and the lower end of the switching binding agent (L2) of SEQ ID NO: 4 may interact in a conformational manner.
  • the switching agent (H1) of SEQ ID NO: 1 is the light chain (V L) LBR region (LBR) and a cross can act, SEQ ID NO: switching agent (L2) of 4 of the chain (V H) HBR intestine ( HBR).
  • the switching binder 100 and the heavy chain (V) having an amino acid sequence extracted from the site where the heavy chain (V H ) and the light chain (V L ) interact with hydrogen bonds H ) or any binding between the antigen binding site 15 including the framework region (FR) of the light chain (VL) may be included.
  • the results of a FRET experiment showing mutual binding between antibody binding switching binding agents are provided.
  • the switching binding agent (H1) of SEQ ID NO: 1 can mutually bind to the LBR region (LBR) of the light chain (V L ), and the switching binding agent (L2) of SEQ ID NO: 4 is the HBR of the heavy chain (V H ) It can be confirmed that it can be mutually bound to the region (HBR). This is because, through these characteristics, the switching binder 100 binds to the framework region FR, and the same effect as the interaction between the framework regions FR can be obtained.
  • Figure 7a shows the antibody-binding force measurement results for each switching binding agent 100
  • Figure 7b shows the SPR analysis results for the binding force of the antibody binding switching binding agent 100 according to the concentration
  • Figure 7c is switching binding to the antibody Shows the results of binding of the binding agent 100 to the Fab site of the antibody (10)
  • FIG. 7D shows the binding of the switching binding agent (100) to the antibody (10) with other antigens and proteins for binding to the Fab site of the antibody (10).
  • a comparative analysis graph is shown.
  • the switching binding agent 100 of the present invention binds to the antibody 10 and can be used for quantification of the bound switching binding agent 100 .
  • the antigen binding coefficient (K d ) may be measured by measuring the fluorescence amount for each concentration of the switching binding agent 100 .
  • the antigen binding coefficient (K d ) shown in FIG. 7A represents a value for the antibody 10 immobilized by the support 30 , but is not limited thereto, and the antibody 10 is the target in the solution. It is also possible to measure the antigen binding coefficient (K d ) upon binding to the antigen 20 , which will be described in detail with reference to FIGS. 10A to 10D .
  • SPR surface plasmon resonance
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • the switching binding agent 100 for each concentration shows the result value of the SPR signal treated with the peptide among the binding agents.
  • the gold surface was treated overnight with 1 mM Mercaptoundecanoic acid (MUA) and surface-modified prior to immobilization of the antibody 10, followed by Carbodiimide/N-Hydroxysuccinimide (EDC/NHS, 0.4). M/0.1 M) was mixed in a 1:1 ratio and treated for 10 minutes to activate functional groups.
  • Antibody immobilization was prepared by treating an anti-HRP antibody with an antibody concentration of 50 ⁇ g/mL for 1.5 hours. Thereafter, it was used after blocking with an ethanolamine concentration of 1 M for 10 minutes.
  • All of the switching binders 100 were treated by incubation for 30 minutes using two concentrations of 10 and 20 ⁇ M, respectively, and the SPR signal was measured for 3 minutes while the solution was stopped after flowing 1% Tween-20 washing solution for 1 minute.
  • the signal can be calculated as the average value by repeating the routine for measuring .
  • the embodiment is not limited to the embodiment of the present invention, and may include any method capable of measuring the binding force of the switching coupling agent 100 .
  • the SPR signal of the peptide of SEQ ID NO: 1 (H1) the SPR signal of the peptide of SEQ ID NO: 2 (H2)
  • the low concentration of 10 ⁇ M is shown in the graph (B1) on the left
  • the high concentration of 20 ⁇ M is shown in the graph (B2) on the right.
  • the peptides of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 synthesized by analyzing the amino acid sequence of the antigen-binding site of the antibody bind to the antibody, and among them, the peptide of SEQ ID NO: 4 binds the most. Able to know.
  • the switching binding agent 100 may bind to the antigen binding site 15 of the antibody 10 .
  • a fluorescence-labeled switching binding agent 100 was bound to the antibody 10 immobilized on the solid support 30 .
  • Antibody immobilization was prepared by treating the anti-HRP antibody (10) with an antibody concentration of 10 ⁇ g/mL for two hours, and was used after blocking with a BSA concentration of 8 mg/mL for 1 hour.
  • the switching binding agent (100) of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 was incubated for 1 hour at a switching binding agent (100) concentration of 10 ⁇ M, and papain was added at a concentration of 250 ⁇ g/mL for degradation of the Fab region and Fc region of the antibody (10). After 2 hours of treatment at 37° C., the change in the amount of fluorescence in the solution was measured, and the amount of fluorescence remaining in the solid support 30 was measured separately.
  • the amount of fluorescence at the bottom (A) and the amount of fluorescence in the solution (B) can be confirmed, and after treatment with papain, a proteolytic enzyme that decomposes the Fab and Fc regions of the antibody (10), a switching binder
  • a proteolytic enzyme that decomposes the Fab and Fc regions of the antibody (10), a switching binder
  • the amount of fluorescence (B) at the Fab site freed in solution after decomposition was higher than that at the bottom where the Fc region was fixed (A) point can be checked.
  • the switching binding agent 100 of SEQ ID NOs: 1 to 4 can selectively bind only the antibody 10 .
  • human IgG, rabbit IgG, goat IgG, and mouse IgG were treated overnight at an antibody concentration of 100 ⁇ g/mL for immobilization of the antibody 10 and protein on the solid support 30, and the immobilized proteins were HBsAg, CRP. , and protein A were prepared by overnight treatment at a concentration of 100 ⁇ g/mL, respectively. Then, it was used after blocking with a BSA concentration of 10 mg/mL for 1 hour.
  • the switching binding agents 100 of SEQ ID NOs: 1 to 4 were treated by incubation for 1 hour at a concentration of 20 ⁇ M, respectively.
  • the fluorescence-labeled peptides of SEQ ID NOs: 1 to 4 exhibited higher fluorescence levels in the antibodies human IgG, rabbit IgG, goat IgG and mouse IgG compared to the antigens HBsAg and CRP and the protein protein A. confirmed what was visible. This can be confirmed that the switching binding agent 100 of SEQ ID NOs: 1 to 4 selectively binds to the antibody (10).
  • FIG. 8A to 8D are graphs showing the analysis results of the target antigen 20 according to the analysis method of FIG. 4A in one embodiment of the present invention, and FIG. 8A is an anti-HRP antibody 10, and FIG.
  • FIG. 8A is an anti-HRP antibody 10
  • FIG. 8B shows the antibody 10 is an anti-hCG antibody 10
  • the target antigen 20 is hCG
  • FIG. 8C shows the antibody 10 is an anti-CRP antibody ( 10)
  • FIG. 8D is a graph showing the analysis results when the antibody 10 is an anti-HBsAg antibody 10 and the target antigen 20 is HBsAg.
  • the anti-HRP antibody was treated and fixed overnight on a solid support at a concentration of 1 ⁇ g/ml, and the switching binding agent 100 of SEQ ID NOs: 1 to 4 was added at a concentration of 10 ⁇ M (100 ⁇ l/well), respectively. was treated for 2 hours. At this time, after measuring the fluorescence of the bottom, the antigen HRP as an analyte for an IgG antibody of rabbit was treated at a concentration of 10 ⁇ g/ml for 1 hour. Referring to FIG.
  • the anti-hCG antibody was treated and fixed overnight on an immobilized support at a concentration of 1 ⁇ g/ml, and the switching binding agent 100 of SEQ ID NOs: 1 to 4 was added at a concentration of 20 ⁇ M (100 ⁇ l/well), respectively. was treated for 2 hours.
  • the antigen hCG as an analyte for the mouse IgG antibody was treated at a concentration of 100 ⁇ g/ml for 2 hours.
  • the anti-CRP antibody was treated and fixed overnight on a solid support at a concentration of 1 ⁇ g/ml, and the switching binder 100 of SEQ ID NOs: 1 to 4 was added at a concentration of 20 ⁇ M (100 ⁇ l/well), respectively. was treated for 2 hours.
  • the antigen HRP as an analyte for an IgG antibody of rabbit was treated at a concentration of 10 ⁇ g/ml for 1 hour.
  • the anti-HBsAg antibody was treated and fixed overnight on a solid support at a concentration of 1 ⁇ g/ml, and the switching binding agent 100 of SEQ ID NOs: 1 to 4 was added at a concentration of 20 ⁇ M (100 ⁇ l/well), respectively. was treated for 2 hours.
  • the antigen HBsAg as an analyte for the goat IgG antibody was treated at a concentration of 10 ⁇ g/ml for 1 hour.
  • the switching binding agent 100 was tested using the switching binding agent of SEQ ID NOs: 1 to 4, in particular, peptides in the binding agent 100 .
  • graph A is the measured value of the switching binding agent 110 bound to the antibody 10 in the pretreatment step (S100)
  • graph B is the residual amount bound to the framework region (FR) in the analysis step (S300)
  • the measured value of the switching binder 120 of the graph C may be the measured value of the switching binder 130 separated from the framework region FR, for example, the labeling material 200 bound to the switching binder 100 .
  • the intensity of the indicated labeling reaction was measured and quantified.
  • the labeling reaction may be a fluorescence reaction.
  • the materials described above are non-limiting examples and do not limit the present invention.
  • the decrease in the amount (B) of the remaining amount of the switching binding agent 120 bound to the framework region (FR) relative to the amount (A) of the switching binding agent 110 bound to the antibody 10 is the framework region ( It can be seen that the amount (C) of the switching coupling agent 130 separated from FR) is larger.
  • the amount (A) of the switching binding agent 110 bound to the antibody 10 is the intensity of fluorescence observed on the side of the support 30, but the amount of the switching binding agent 130 separated from the framework region (FR).
  • (C) is the intensity of the observed fluorescence in the solution phase. Accordingly, it can be seen that when the target antigen 20 is bound to the antibody 10, the switching binding agent 110 bound to the antibody 10 is separated from the framework region (FR) and released into a solution phase.
  • the amount of the switching binding agent 110 bound to the antibody 10 measured in the pretreatment step (S100) and the remaining amount bound to the framework region (FR) in the analysis step (S300) It is possible to quantify the target antigen 20 by the difference in the amount of the switching binding agent 120 .
  • the above results indicate that a sample containing the analyte antigen (20) HBsAg is treated with goat IgG antibody, and the measurement of the analyte by a one-step immunoassay without washing shows high reproducibility.
  • 9A and 9B are analysis graphs showing the analysis results of the target antigen 20 according to the analysis method of FIG. 4B.
  • FIG. 9A is a bead-based antibody binding one-step immunoassay result using a switching binding agent (H1) of SEQ ID NO: 1
  • FIG. 9B is a switching binding agent (L1) of SEQ ID NO: 3 shows
  • the anti-influenza B antibody (10) is fixed to the beads in the pretreatment step (S100'), and the analyte in the antigen treatment step (S200') contains CRP at a concentration of 10 ng/Ml, or It may contain influenza B at a concentration of 10 ng/Ml.
  • the left graph (A) is a graph quantifying the switching binding agent 130 isolated from the framework regions (FR, FR') of the analytes including different target antigens 200, that is, CRP and influenza B
  • the graph on the right (B) is a graph in which the residual amount of the switching binder 120 bound to the framework regions FR and FR' is quantified.
  • the materials described above are non-limiting examples and do not limit the present invention.
  • the analyte when the analyte contains CRP as compared to the case where the analyte contains influenza B, the amount of the separated switching binding agent 130 is small and the remaining amount of the switching binding agent 120 is large. It can be seen that This is because when the analyte is influenza B, the influenza B reacts with the anti-influenza B antibody (10) and the switching binding agent (100) dissociates from the framework regions (FR, FR′) of the antibody (10). . On the other hand, when the analyte contains CRP, the CRP does not specifically bind to anti-influenza B, so that the switching binding agent 100 does not dissociate from the framework regions (FR, FR').
  • the higher the concentration of the target antigen 20 in the analyte the greater the amount of the separated switching binding agent 130 may be.
  • the remaining amount of the switching binding agent 120 may be small. 9A and 9B, when the analytes equally contain influenza B as the target antigen 20, the higher the concentration of influenza B, the greater the amount of the isolated switching binding agent 130.
  • the concentration of influenza B included in the analyte is 100 ng/mL
  • the amount of the isolated switching binding agent 130 may be greater than when the concentration is 10 ng/mL. This is because the higher the concentration of the target antigen 20, the greater the amount of the target antigen 20 specifically reacts with the antibody 10, the greater the amount of the switching binding agent 100 is the framework regions (FR, FR') because it is dissociated from
  • the target antigen 20 contained in the analyte can be identified.
  • an analysis method capable of quantitative or concentration measurement may be provided.
  • a bead-based one-step immunoassay using the switching binding agent (H1) of SEQ ID NO: 1 in FIG. 9a is possible
  • a bead-based one-step immunoassay using the switching binding agent (L1) of SEQ ID NO: 3 It can be confirmed that assays are possible, so quantitative immunoassays are possible using beads as well as solid supports.
  • this is not limited to, and is not limited to, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3.
  • 10A to 10D are analysis graphs showing the analysis results of the target antigen 20 according to the analysis method of FIG. 4C in one embodiment of the present invention.
  • the switching binding agent 100 uses a switching binding agent having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4,
  • FIG. 10A is a switching binding agent (L1) of SEQ ID NO: 3
  • FIG. 10B is SEQ ID NO: 4 shows the results of measuring the antigen binding coefficient of the antibody in solution using the switching binding agent (L2)
  • FIG. 10C is the switching binding agent of SEQ ID NO: 1 (H1)
  • FIG. 10D is the switching binding agent (H2) of SEQ ID NO: 2.
  • the target antigen 20 may be HRP and the antibody 10 may be an anti-HRP antibody 10 .
  • the materials described above are exemplary and not limiting of the present invention.
  • the amount of the isolated switching binding agent 130 is measured while increasing the concentration of the target antigen 20 in the analyte, and the antibody 10 antigen-binding using the isolated amount of the switching binding agent 130
  • the coefficient (K d ) was calculated.
  • the antigen binding coefficient (K d ) as the amount of HRP, which is the target antigen (20), increased, the fluorescence amount of the solution increased.
  • the antigen binding coefficient (K d ) of the switching binding agent 100 may be 1.2 to 2.9 x 10 -6 M.
  • the coupling coefficient K d may have values of 8.9 x 10 -7 M, 1.2 x 10 -6 M, and 2.9 x 10 -6 M, respectively.
  • the kit provided in the present invention binds the antigen when the antibody binds the antigen in the solution.
  • the antigen-binding coefficient (K d ) of the antibody in solution can be measured using the switching binding agent 100 reversibly binding to the antigen-binding site of the antibody.

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Abstract

본 발명은 항체의 항원 결합 부위에 결합하는 스위칭 결합제, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약학 조성물, 검사 키트 및 항원과 항체의 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 스위칭 결합제는 항체의 항원 결합 부위를 구성하는 중 쇄 또는 경 쇄의 프레임워크 영역으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 상기 중 쇄 또는 상기 경 쇄와 함께 상기 항원 결합 부위를 구성하는 경 쇄 또는 중 쇄의 프레임워크 영역에 결합하는 제 1 항체 결합부 또는 제 2 항체 결합부를 포함하며, 특이적으로 상기 항체의 상기 항원 결합 부위에 결합한 후, 타겟 항원이 제공될 경우 상기 프레임워크 영역으로부터 분리될 수 있다.

Description

스위칭 결합제, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 약학 조성물, 검사 키트 및 항원과 항체의 분석 방법
본 발명은 임뮤노어세이(immunoassay) 기술에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 스위칭 결합제, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 약학 조성물, 검사 키트 및 항원과 항체의 분석 방법에 관한 것이다.
바이오 기술 분야에서 다양한 면역 진단 검사 또는 환경 모니터링과 같은 바이오 검사를 위하여 임뮤노어세이(또는 면역 검정법이라 함)가 사용되고 있다. 상기 임뮤노어세이는 항원-항체 반응이 갖는 고도의 특이성을 이용하여 항원 또 항체를 검출하거나 정량하는 방법으로서, 항원이나 항체 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 여러 가지 방법으로 표지한 다음 시료와 반응시킨 후, 시료에 항체 또는 항원이 있으면 항원-항체 반응물이 생기므로 표지한 생성물을 측정함으로써 항체 또는 항원을 정성적으로 또는 정량적으로 측정하는 것이 가능하며, 다른 분석 방법에 비해 높은 민감도를 갖는 이점이 있다.
상기 임뮤노어세이는 암 마커, 감염성 질환, 갑상선 기능, 빈혈, 알레르기, 임신, 약물 남용 또는 통풍 진단과 같은 다양한 진단에 이용될 수 있다. 상기 임뮤노어세이를 다양한 종류의 항원의 진단 또는 분석에 이용하기 위해서는 항원들 각각에 대하여 특이적인 반응성을 갖는 항체를 준비해야 한다. 그러나, 이러한 방법은 최근 빠른 속도로 다양화되고 있는 현대화된 질병들 또는 다수의 돌연변이종을 갖는 바이러스들을 감지하는데 한계점이 있다. 특히, 상기 바이러스의 경우, 상기 바이러스와 특이적 결합성을 갖는 항체를 확보하는 것이 불가능한 경우도 다수 있다.
또한, 상기 항원-항체 반응을 이용하는 경우, 상기 항체를 표지 물질과 결합시키는 추가적인 단계가 요구될 수 있다. 상기 표지 물질과 상기 항체의 결합성이 떨어지는 경우, 임뮤노어세이 분석 정확도 또는 신뢰도가 저하될 수 있다. 전술한 것과 같이, 종래의 이뮤노어세이에는 다양한 항체들마다 결합할 수 있는 다양한 종류의 표지 물질을 각각 개발해야 하는 문제도 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 다양한 종류의 질병들 또는 상기 질병들의 원인이 되는 항원을 검출할 수 있어 항체 종류에 제한되지 않고, 적용 가능성이 향상된 스위칭 결합제를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 전술한 이점을 갖는 스위칭 결합제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 전술한 이점을 갖는 스위칭 결합제를 이용하여, 분석의 신뢰도 및 정확도가 향상된 검사 키트를 제공하는 것뿐만 아니라, 항체에 대한 항원의 결합력을 측정할 수 있는 검사 키트를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는, 전술한 이점을 갖고, 분석 신뢰도 및 정확도가 향상되고, 분석을 위한 처리 단계들이 간소화되어 신속성 및 사용 용이성이 향상된 분석 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 스위칭 결합제는 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)의 적어도 일 부분에 가역적으로 결합하고, 상기 항체와 특이적으로 반응하는 타겟 항원이 상기 항체에 결합하는 경우, 상기 프레임워크 영역으로부터 분리될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 상기 항체의 3 차원 구조에 의하여 상기 프레임워크 영역에 결합될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 스위칭 결합제는 적어도 하나 이상의 상기 프레임워크 영역에 결합가능한 부분과 적어도 하나 이상의 상보성 결정 영역(complementarity determining regions; CDR)에 결합 가능한 부분을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 항체의 항원 결합 부위를 구성하는 중 쇄의 프레임워크 영역으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 상기 중 쇄와 함께 상기 항원 결합 부위를 구성하는 경 쇄의 프레임워크 영역에 가역적으로 결합하는 제 1 항체 결합부를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 스위칭 결합제는 항체의 항원 결합 부위를 구성하는 경 쇄의 프레임워크 영역으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 상기 경 쇄와 함께 상기 항원 결합 부위를 구성하는 중 쇄의 프레임워크 영역에 가역적으로 결합하는 제 2 항체 결합부를 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 스위칭 결합제의 아미노산 서열은 중 쇄 또는 상기 경 쇄의 프레임워크 영역에 인접한 상보성 결정 영역에도 가역적으로 결합할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 단백질, 압타머, 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display), 및 항체로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 스위칭 결합제의 아미노산 일부가 무기물로 치환될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제 1 항체 결합부는 -Y-, -I-, -W- 및 -Q- 중 적어도 어느 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 제 2 항체 결합부는 -Y-, -Q-, -P-, -L- 및 -F-중 적어도 어느 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 서열번호 1: S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E, 서열번호 2: V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K, 서열번호 3: T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K, 서열번호 4: V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제 1 항체 결합부는 상기 경 쇄의 프레임워크 영역과 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 및 이들의 조합 중 적어도 하나 이상에 의해 결합하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 제 2 항체 결합부는 상기 중 쇄의 프레임워크 영역과 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 및 이들의 조합 중 적어도 하나 이상에 의해 결합하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 상기 제 1 항체 결합부의 아미노산 변조에 의해 항체 결합 부위의 결합력의 조절이 가능할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 상기 제 2 항체 결합부의 아미노산 변조에 의해 항체 결합 부위의 결합력의 조절이 가능할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 상기 수소 결합에 의해, 상기 스위칭 결합제와 상기 프레임워크 영역 사이에 사이드 체인(side chain) 기능기 결합 또는 펩타이드 결합의 극성 부위와 결합이 이루어질 수 있다.
일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 상기 스위칭 결합제가 상기 항체의 상기 항원 결합 부위에 결합된 경우, 상기 항체와 특이적으로 반응하는 타겟 항원이 상기 항체에 결합함으로써, 상기 스위칭 결합제는 상기 항체로부터 분리될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 스위칭 결합제의 상기 항체 결합부는 상기 중 쇄 또는 상기 경 쇄의 상기 항원 결합 부위에 4 Å 내지 8 Å 범위 내로 결합될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 자연적 또는 인위적인 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 인간 항체, 비인간 항체, 인간화된 비인간 항체 또는 이들의 조합과 결합하며, 상기 스위칭 결합제가 상기 항체에 결합된 상태에서 상기 항체와 상기 타겟 항원의 결합이 가능할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)들 중 적어도 일부 상기 프레임워크 영역에 가역적으로 특이적 결합하는 제 1 항체 결합부 또는 제 2 항체 결합부; 및 상기 항체와 특이적으로 반응하는 타겟 항원이 상기 항체에 결합하는 경우, 상기 항체 결합부를 상기 프레임워크 영역으로부터 분리되도록 상기 제 1 항체 결합부 또는 상기 제 2 항체 결합부의 상기 프레임워크 영역에 대한 결합력을 조절하는 결합력 조절부를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 결합력 조절부는 상기 스위칭 결합제 내에서 상기 제 1 항체 결합부 또는 제 2 항체 결합부의 위치 또는 상기 스위칭 결합제의 입체적 형상을 변조하여 상기 항체에 대한 상기 항체 결합부의 결합력을 조절할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 결합력 조절부는 -S-Y-W-I-H-W-V-K-, -R-P-G-Q-G-L-E-, -I-G-E-, -V-Y-, -C-A-R-E-P-T-G-T-G-, -Y-F-D-V-, -G-K-, -T-Y-L-E-W-Y-, -K-P-G-Q-S-, -K-, L-I-Y-K-, -C-F-Q-G-S-H-V-P- 및 -T-K-의 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 제 1 항체 결합부 또는 상기 제 2 항체 결합부와 상기 결합력 조절부를 단위 구조체로 포함하여 상기 항체 결합부와 상기 결합력 조절부가 교번하여 연속적으로 결합될 수 있다.
상기의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따른 질병 스크리닝, 진단, 예방 또는 치료 통합의 약학 조성물은 상기 스위칭 결합제를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 약학 조성물에서 상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 단백질, 압타머 및 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display), 및 항체로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 약학 조성물에서 상기 스위칭 결합제는 서열번호 1: S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E, 서열번호 2: V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K, 서열번호 3: T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K, 서열번호 4: V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 검사 키트는 상기 스위칭 결합제를 포함하고, 상기 스위칭 결합제는 자연적 또는 인위적인 표지 물질로 표지되며, 상기 스위칭 결합제가 프레임워크 영역에 결합 및 분리되는 양을 측정하여 항체에 대한 항원의 결합력을 측정할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 단백질, 압타머 및 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display), 및 항체로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 다른 실시예에서 상기 결합력은 항체의 항원 결합 계수(Kd)의 산출을 통해 측정될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 항원 결합 계수(Kd)는 0.7 x 10-6 M 내지 3.4 x 10-6 M의 범위를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 검사 키트는 상기 스위칭 결합제를 포함하고, 상기 스위칭 결합제는 자연적 또는 인위적인 표지 물질로 표지되며, 상기 스위칭 결합제가 프레임워크 영역에 결합 및 분리되는 양을 측정 항체 및 타겟 항원을 식별 또는 정량할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 검사 키트는 면역 분석용(immunoassay) 키트로서, 상기 면역분석용 키트는 루미넥스 분석, 단백질 마이크로 어레이 분석, 엘리사 (ELISA) 분석, 면역-PCR 분석 (immune-PCR), 캡처-ELISA 분석, ELISPOT 분석, 방사선 면역 분석(RIA), 측방 흐름 면역 분석(lateral flow immunoassay: LFIA), 통과흐름 면역 분석(flow-through immunoassay: FTIA), 단백질 마이크로플루이딕(microfluidic) 면역 분석, 단백질 마크로플루이딕(microfluidic) 면역 분석, 단백질 모세관 전기영동 분석(capillary electrophoresis: CE), 전기 화학 바이오 센서, 방사 면역 침전 분석, 면역 침전 분석, 면역조직화학염색 분석, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산 분석, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역 전기 영동 분석, 조직면역 염색 분석, 보체 고정 분석, FACS 분석, 단백질 칩 분석, 면역 형광 염색 분석 및 면역 친화성 정제 분석 키트일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 검사 키트는 상기 항체가 고정되지 않은 용액 내에서 상기 항체가 항원과 결합할 때의 항원 결합 계수(Kd)를 측정할 수 있다.
상기의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 상기 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법은 항체의 항원 결합 부위를 구성하는 프레임워크 영역으로부터 스위칭 결합제의 아미노산 서열을 선택하는 단계, 타겟 항원과 특이적으로 결합하는 항체에 상기 스위칭 결합제를 제공하여 상기 항체의 프레임워크 영역(framework region: FR)의 적어도 일부분에 가역적으로 결합시키는 전처리 단계, 상기 전처리 단계의 결과물 내에 상기 타겟 항원을 포함하는지 여부의 판단이 필요한 피분석물을 제공하는 단계 및 상기 프레임워크 영역에 결합된 잔량의 스위칭 결합제 또는 상기 프레임워크 영역으로부터 분리된 스위칭 결합제 중 적어도 어느 하나를 정량하여 상기 피분석물 내에 상기 타겟 항원을 식별 또는 정량 분석하는 분석 단계를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 단백질, 압타머, 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display) 및 항체로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 항체는 기판, 비드(bead), 섬유, 고분자 구조체 또는 이들의 조합인 지지체에 고정될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 항체는 고정되지 않고, 용액에 용해된 상태일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 전처리 단계는, 상기 항체에 상기 스위칭 결합제를 제공하여 상기 항체와 상기 스위칭 결합제의 제 1 결합체 및 상기 항체와 결합되지 않은 스위칭 결합제를 포함하는 혼합 용액을 얻는 단계 및 상기 혼합 용액으로부터 상기 항체와 상기 결합되지 않은 스위칭 결합제를 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 자연적 또는 인위적 표지 물질로 표지되고, 상기 분석 단계에서, 상기 타겟 항원의 분석은 상기 표지 반응을 측정하여 이루어질 수 있다. 상기 분석 단계는, 상기 항체로부터 분리된 스위칭 결합제와 상기 항체와 상기 타겟 항원의 제 2 결합체를 분리하는 단계 및 상기 분리된 스위칭 결합제를 식별 또는 정량하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 상기 스위칭 결합제의 제조 방법은 상기 항체의 중 쇄 및 경 쇄의 상기 프레임워크 영역이 서로 자가 결합하는 아미노산 서열 확인하는 단계 상기 아미노산 서열의 소수성 지수를 얻는 단계 및 상기 소수성 지수를 비교하여, 상기 중 쇄 및 상기 경 쇄의 항원 결합 부위를 구성하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열간 동일한 성질을 가지는 부분의 상기 아미노산 서열을 포함하는 스위칭 결합제를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 아미노산 서열은 상기 프레임워크 영역에 인접한 상보성 결정 영역을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 압타머, 단백질, 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display) 및 항체로부터 구성된 군에서 선택될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 아미노산 서열은 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 및 이들의 조합 중 적어도 하나 이상에 의해 결합할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 스위칭 결합제는, 항체의 항원 결합 부위, 특히, 항체마다 동일 또는 상당히 유사한 아미노산 서열을 가진 프레임워크 영역으로부터 선택되어 여러 종류의 항체에 결합이 가능하고, 항체 종류에 상관없이 항체와 상기 항체에 결합하는 항원의 식별 또는 이들의 정량을 위한 분석에 이용될 수 있고, 상기 선택된 아미노산 서열의 변조를 통해 항체에 결합하는 결합력을 조절할 수 있는 이점이 있다. 여러 종류의 항체에 결합이 가능하여, 항체 종류에 상관없이 항체와 상기 항체에 결합하는 항원의 식별 또는 이들의 정량을 위한 분석에 이용될 수 있으며, 항체에 대한 결합력을 조절할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제의 제조 방법은, 항체의 항원 결합 부위 특히, 프레임워크 영역으로부터 추출되는 것을 특징으로 하여, 다양한 항체에 결합할 수 있는 스위칭 결합제를 제조할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 바이러스 또는 질병 스크리닝, 진단, 예방 또는 치료 통합의 약학 조성물 약학 조성물은, 전술한 이점을 갖는 스위칭 결합제를 이용하여, 다양한 바이러스를 포함하는 항원에 대한 진단, 예방 또는 치료를 위한 약제를 개발할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제를 이용한 검사 키트는, 전술한 이점을 갖는 스위칭 결합제를 이용하여, 항원과 항체의 식별 및 정량뿐만 아니라, 항원의 항체에 대한 결합력을 측정할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법은, 전술한 이점을 갖는 스위칭 결합제를 이용하여, 항체 또는 항원과 같은 분석대상물을 세척하거나 시약처리를 추가하는 단계를 생략하여 항원의 결합 여부 및 결합량을 신속하게 분석이 가능하고, 사용 용이성이 향상된 임뮤노어세이가 가능할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 프레임워크 영역으로부터 추출된 스위칭 결합제와 프레임워크 영역의 결합에 관한 도면이고, 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른, 스위칭 결합제의 구성을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 프레임워크 영역에 대한 스위칭 결합 제의 결합을 나타낸 도면이다.
도 3은 일 실시예에 따른 스위칭 결합제를 도시한 도면이다.
도 4a는 일 실시예에 따른 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법의 순서도이고, 도 4b는 본 발명의 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법의 순서도이며, 도 4c는 또 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법의 순서도이다.
도 5a 및 도 5b는 서열번호 2의 스위칭 결합제와 서열번호 3의 스위칭 결합제 사이의 결합을 도시한 도면이고, 도 5c는 서열번호 2의 스위칭 결합제와 서열번호 3의 스위칭 결합제간 상호 작용을 부위별로 표시한 그래프이고, 도 5d는 서열번호 2의 스위칭 결합제와 서열번호 3의 스위칭 결합제간 소수성 지수를 도시한 도면이며, 도 5e는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)간의 FRET 분석 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는 서열번호 1의 스위칭 결합제와 서열번호 4의 스위칭 결합제 사이의 결합을 도시한 도면이고, 도 6c는 서열번호 1의 스위칭 결합제와 서열번호 4의 스위칭 결합제간 상호 작용을 부위별로 표시한 그래프이고, 도 6d는 서열번호 1의 스위칭 결합제와 서열번호 4의 스위칭 결합제간 소수성 지수를 도시한 도면이며, 도 6e는 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)간 FRET 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7a는 스위칭 결합제별 항체-결합력 측정 결과를 나타내는 도면이고, 도 7b는 항체에 결합하는 스위칭 결합제별 결합력에 대한 SPR 분석 결과를 나타낸 도면이고, 도 7c 및 도 7d는 항체에 결합하는 펩타이드의 항체 Fab 부위 결합에 대한 결과를 도시한 도면이다.
도 8a 내지 8d는 일 실시예에 따른 스위칭 결합제의 분석 방법에 따른 분석 결과를 도시한 그래프이다.
도 9a 및 9b는 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법에 따른 분석 결과를 도시한 그래프이다.
도 10a 내지 도 10d는 또 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법에 따른 분석 결과를 도시한 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 하기 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 오히려, 이들 실시예는 본 개시를 더욱 충실하고 완전하게 하고, 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다.
도면에서 동일 부호는 동일한 요소를 지칭한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 해당 열거된 항목 중 어느 하나 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 또한, 본 명세서에서 단수로 기재되어 있다 하더라도, 문맥상 다수를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"이란 용어는 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.
본 명세서에서 기판 또는 다른 층 "상에(on)" 형성된 층에 대한 언급은 상기 기판 또는 다른 층의 바로 위에 형성된 층을 지칭하거나, 상기 기판 또는 다른 층 상에 형성된 중간 층 또는 중간 층들 상에 형성된 층을 지칭할 수도 있다. 또한, 당해 기술 분야에서 숙련된 자들에게 있어서, 다른 형상에 "인접하여(adjacent)" 배치된 구조 또는 형상은 상기 인접하는 형상에 중첩되거나 하부에 배치되는 부분을 가질 수도 있다.
본 명세서에서, "아래로(below)", "위로(above)", "상부의(upper)", "하부의(lower)", "수평의(horizontal)" 또는 "수직의(vertical)"와 같은 상대적 용어들은, 도면들 상에 도시된 바와 같이, 일 구성 부재, 층 또는 영역들이 다른 구성 부재, 층 또는 영역과 갖는 관계를 기술하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 용어들은 도면들에 표시된 방향뿐만 아니라 소자의 다른 방향들도 포괄하는 것임을 이해하여야 한다.
이하에서, 본 발명의 실시예들은 본 발명의 이상적인 실시예들(및 중간 구조들)을 개략적으로 도시하는 단면도들을 참조하여 설명될 것이다. 이들 도면들에 있어서, 예를 들면, 부재들의 크기와 형상은 설명의 편의와 명확성을 위하여 과장될 수 있으며, 실제 구현시, 도시된 형상의 변형들이 예상될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시예는 본 명세서에 도시된 영역의 특정 형상에 제한된 것으로 해석되어서는 아니 된다. 또한, 도면의 부재들의 참조 부호는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부재를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "펩타이드"는, 아미노산 중합체 쇄이며, 제 1 아미노산의 아미노기와 상기 제 1 아미노산에 인접하는 제 2 아미노산의 카복시기가 물 분자를 잃으면서 축합하여 중합되는 아마이드이다. 본 명세서에 설명되는 모든 펩타이드 서열은 관례에 따라서 왼쪽으로 N-말단 끝과 오른쪽으로 C-말단 끝을 가지는 순서로 기재된다. 또한, 본 발명에서 '펩타이드'라는 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편, 단백질 서열의 펩타이드 유사체를 지칭할 수 있다. 상기 유사체는 절절한 공간적 배향에서 이에 상응하는 기본적 아미노산 또는 펩타이드가 나타내는 크기, 전하 또는 소수성 등의 유사한 물리적 특성을 나타내는 물질로서 정의된다. 예를 들어, 펩타이드 유사체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 사이에 존재하는 아미드 결합이 탄소-탄소 결합 또는 당업계에 공지된 다른 결합으로 치환된 화합물일 수 있다. 또한, 본 발명에서 용어 "펩타이드(peptide)"는 "단백질(protein)" 및 "폴리펩타이드(polypeptide)"라는 용어와 호환적으로 사용될 수 있으며, 이는 여러 개의 아미노산이 펩타이드 결합에 의해 연결된 화합물로 아미노산 잔기들의 개수가 10 개 이상 50 개 이하인 분자 구조체를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산"은 광의적 개념으로 자연적으로 발생하는 아미노산과 그 잔기뿐만 아니라, 화학적으로 변형된 아미노산 즉, 아미노산 모방체 및 유사물을 포함하며, 본 발명에서 상기 모방체 및 유사물은 기능적 등가물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "압타머(aptamer)"는 그 자체로 안정된 3차 구조를 가지며, 특정 물질에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미한다. 상기 압타머는 당해 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있고, 상기 방법은 필요에 따라 적절히 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원-항체 반응"은 백혈구의 B 세포에서 생성된 항체들과 면역 반응 과정의 항원들 사이의 특정한 화학 상호작용이다. 여러 종류의 항체들과 항원들 사이에서, 각각의 항체는 특정한 항원에만 결합할 수 있다. 상기 결합의 특이성은 각각의 상기 항체의 특정한 화학적 구조 때문이다. 상기 항원들은 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 결합 그리고 소수성 상호작용과 같은 약한 비공유결합을 통해 항체와 결합하게 된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 2개의 중 쇄와 2개의 경 쇄로 구성된 기본적인 4-폴리펩티드쇄로 구성된 것을 지칭하며, 상기 쇄들은 서로 이황화 결합에 의해 안정화되며 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 가진 당단백질로서 항원 결합 부분을 포함하는 임의의 분자 구조체를 포함한다.
상기 항체는 혈청의 기본 구성요소일 수 있으며, 상기 항체들, 면역글로불린 분자들 또는 이의 단편들의 집합체일 수 있고, 항체 또는 면역글로불린의 단일 분자일 수 있다. 상기 항체 분자는 항원 또는 상기 항원의 에피토프와 같은 특이적인 항원 결정기에 결합되거나 상기 항원 결정기와 반응함으로써 항원에 항체가 결합하면 그 항체를 NK(natural killer) 세포가 인식하여 제거하는 항체의존성 세포 매개성 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC) 과 같은 면역학적 이펙터 메커니즘을 유도할 수 있다. 상기 항체는 단일특이적(monospecific)일 수 있으며, 상기 항체들의 조성물은 동일한 항체들로 구성되어 모노클로날일 수 있고, 동일한 항원의 다른 에피토프들 또는 다른 항원들의 에피토프들과 반응하는 다른 종류의 항체들을 포함하여 폴리클로날일 수 있다. 각 항체는 상기 항체의 대응하는 항원에 대한 특이적인 결합을 가능케 해주는 독특한 구조를 가질 수 있다.
상기 항체는 항체, 항체 유도체 또는 이의 단편이 포함될 수 있고, 항체에 관한 상세한 설명은 본 발명의 항체 선별 방법에도 적용된다. 항체는 상기 단편들 중 폴리펩타이드와 같은 항체의 등가물 또는 항체 동족체들은 Fc 영역, 면역글로불린 결합 도메인, 결합 도메인을 모방하는 펩타이드, Fc 영역에 상동성인 영역 또는 적어도 이의 일부를 포함한다. 또한, 항체는 다른 폴리펩타이드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 키메라 분자 또는 그의 등가물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체들은 온전한(intact) 면역글로불린 분자일 수 있고, Fab, Fab', F(ab')2, Fc, VHH, Fv, N-글리칸 구조 및 파라토프와 같은 상기 항체의 구성 부분들 및 상기 구성 부분들 중 적어도 일부를 포함할 수 있다.
상기 항원 결합 단편(fragment antibody binding: Fab)은 항원 결합 부위를 포함하는 항체의 항원 결합 단편이고, 경 쇄의 가변 영역(VL) 및 불변 영역(CL)을 포함하는 경 쇄 단편, 및 중 쇄의 가변 영역(VH) 및 제 1 불변 영역(CH1)을 포함하는 항체 단편을 의미한다.
상기 결정 분절 영역(fragment crystallizable region: Fc 영역)은 항원과 결합하지 않지만 결정을 형성하는 부분에 해당하고, 일반적으로 면역글로불린 중 쇄의 C-말단 폴리펩타이드 서열을 포함하는 이량체 콤플렉스를 말한다. Fc 영역은 천연 또는 변이 Rc 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린의 중 쇄에서 Fc 서열의 경계가 여러 개일 수 있지만, IgG 중 쇄 Fc 서열은 통상적으로 위치 Cys226의 아미노산 잔기 또는 약 위치 Pro230로부터 Fc의 카복실 말단으로 뻗는 것으로 정의된다. 면역글로불린의 Fc 서열은 일반적으로 중 쇄의 2개의 불변 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 임의로 CH4 도메인을 포함한다. 예를 들면, 천연 항체에서, Fc 도메인은 IgG, IgA 및 IgD isotype에서 항체의 2개의 중 쇄의 CH2 및 CH3으로부터 유래된 2개의 동일한 단백질 단편들로 이루어지고, IgM 및 IgE Fc 도메인은 각각의 폴리펩타이드 쇄에서 3개의 중 쇄 불변 도메인인, CH2 내지 CH4를 함유한다. Fc 영역은 단백질을 모아 놓으면, 결정을 형성할 수 있는데, 이는 비록 IgG 항체의 항원 특이성이 다르다 하더라도, 상기 Fc 영역을 구성하는 단백질의 아미노산 배열이 서로 같다는 것으로, 항원과의 결합에는 관여하지 않는다는 것이다. 또한, 상기 Fc 영역은 일정한 수의 아미노산 잔기를 하나의 구분으로 하여 -S-S- 루프에 의해 고차구조를 형성하며, 각 구분은 펩타이드 결합으로 연결되어 있다.
상기 Fv(fragment variable)는 항원과 직접적으로 결합하는 항체의 가변부위로 중 쇄 가변부위(heavy chain variable domain: VH) 와 경 쇄 가변부위(light chain variable domain: LH)로 구성되어 있다.
상기 VHH는 경쇄가 없는 단일 도메인 분자로, 나노바디(nanobody) 라고도 불리는 단일 가변도메인(single variable domain) 으로써, 천연 발생 단일 도메인 분자는 낙타, 단봉낙타, 알파카 및 과나코와 같은 낙타류와 상어로부터 유래 또는 수득 될 수 있고, 항체 분자를 재조합하여 확보할 수 있다.
상기 항체에 있어서, 상기 중 쇄 또는 경 쇄는 각각 가변 영역(variable region) 및 불변 영역(constant region)을 포함할 수 있다. 상기 가변 영역은 항원에 대한 특이성을 갖고 있으며, 항체마다 서로 다르다. 상기 가변 영역은, 초가변 영역(hypervariable region; HVR) 즉, 상보성 결정 영역(complementarily determining regions: CDRs) 및 상기 상보성 결정 영역을 지지하는 프레임 워크 영역(framework region: FR)을 포함할 수 있다. 상기 상보성 결정 영역(CDR)은 항체마다 상이한 아미노산 서열을 가져 각각의 항원과 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 프레임워크 영역(FR)은 초가변 영역 잔기 이외의 불변 도메인 잔기를 지칭한다. 불변 도메인의 상기 프레임워크 영역(FR)은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어지는 것으로 가변 영역에 존재하는 상기 CDR 이외의 영역으로, 3개의 CDR를 연결하는 발판 역할을 하여 상기 CDR의 구조적 안정성에 기여한다. 또한, 프레임워크 영역(FR)의 아미노산 서열은 항체의 종류, 즉, 항체의 발현 종이 달라지더라도 상보성 결정 영역(CDR)에 비하여 변화가 적은 특징이 있다. 따라서, 상기 CDR 및 상기 FR 서열은 일반적으로 중 쇄의 가변 영역(VH) 또는 경 쇄의 가변 영역(VL)에서 하기 순서로 나타날 수 있다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. 상기 중 쇄 및 경 쇄의 가변 영역 두 개가 합쳐져 항원 결합 부위(antigen binding site)를 형성하는 것이다.
상기 불변 영역은 항체마다 실질적으로 동일하다. 상기 불변 영역은, 일반적으로 단백질에 선택적으로 결합하여 생물학적 활성을 조절하는 소분자인 이펙터(effector) 세포와 같은 면역계의 다양한 세포 및 전형적인 보체 시스템의 구성요소를 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 이하, 본 발명의 다양한 실시예들에 대하여 상세히 설명하기로 한다.
도 1a은 본 발명의 일 실시예에 따른 스위칭 결합제들(100)이 항체(10)의 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 것을 도시한다.
도 1a을 참조하면, 스위칭 결합제(100)는 항체(10)의 항원 결합 부위(15)를 구성하는 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR')에 가역적으로 결합하는 제 1 스위칭 결합제(HA, HB) 또는 중 쇄(VH)의 프레임워크 영역(FR)에 가역적으로 결합하는 제 2 스위칭 결합제(LA, LB)를 포함한다.
제 1 스위칭 결합제(HA, HB)는 항체(10)의 항원 결합 부위(15)를 구성하는 중 쇄(VH)의 프레임워크 영역(FR)으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 유사하게, 제 2 스위칭 결합제(LA, LB)는 항체(10)의 항원 결합 부위(15)를 구성하는 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR')으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 스위칭 결합제(100)는 프레임워크 영역(FR, FR')과 프레임워크 영역(FR, FR')에 인접한 상보성 결정 영역(CDR, CDR')을 포함하는 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1a에 도시된 것과 같이, 제 1 스위칭 결합제(HA, HB)의 아미노산 서열은 중 쇄(VH)의 상보성 결정 영역들(CDR) 중 CDR1 영역(CDR1)과 프레임워크 영역들(FR) 중 FR2 영역(FR2)의 서열 일부 또는 전부를 포함하는 아미노산 서열(이하, HAR 부위(HAR)이라 지칭한다) 또는 중 쇄(VH)의 CDR3 영역(CDR3)과 FR3 영역(FR3)의 일부 또는 전부를 포함하는 아미노산 서열(이하, HBR 부위(HBR)이라 지칭한다)에서 선택될 수 있다.
유사하게, 제 2 스위칭 결합제(LA, LB)의 아미노산 서열은 경 쇄(VL)의 서로 인접한 프레임워크 영역들(FR') 중 FR2' 영역(FR2')의 일부 또는 전부와 이에 인접하는 상보성 결정 영역들(CDR') 중 CDR1' 영역(CDR1')의 일부 또는 전부를 포함하는 아미노산 서열(이하, LAR 부위(LAR)이라 지칭한다) 또는 경 쇄(VL)의 서로 인접한 프레임워크 영역들(FR') 중 FR3' 영역(FR3')의 일부 또는 전부와 이에 인접하는 상보성 결정 영역들(CDR') 중 CDR3' 영역(CDR3')의 일부 또는 전부를 포함하는 아미노산 서열(이하, LBR 부위(LBR)라 지칭한다)로부터 선택될 수 있다.
항체(10)의 HAR 부위(HAR)와 LBR 부위(LBR) 및 HBR 부위(HBR)와 LAR 부위(LAR)는 서로 상호 자가 결합 또는 형상학적 교차 결합이 가능하기 때문에, 항원 결합 부위(15)가 3차원적으로 꼬인 구조를 갖도록 한다. 또한, 상기 부위들(HAR, LAR, HBR, LBR)은 프레임워크 영역(FR, FR')을 필수 구성으로 갖기 때문에, 전술한 상호 결합 특성을 통해 항체(10)의 구조를 지지한다. 본 발명의 실시예에 따른 스위칭 펩타이드(100)는 항체(10)의 상기 부위들이 갖는 아미노산 서열을 포함하기 때문에, 항체(10)의 항원 결합 부위에 자가 결합 또는 교차 결합이 가능하다.
본 발명의 스위칭 결합제(100)는 도 1a에 도시된 HAR 부위(HAR), HBR 부위(HBR), LAR 부위(LAR) 또는 LBR 부위(LBR)로부터 선택되는 것에 한정되는 것은 아니다. 이는 프레임워크 영역(FR)의 아미노산 서열로부터 다양하게 선택될 수 있다. 예를 들면, FR3 영역(FR3) 또는 FR3' 영역(FR3')에서 스위칭 결합제(100)의 아미노산 서열이 선택될 수 있으며, FR 영역들(FR)을 연결하여 사용한 서열도 사용될 수 있다. 일 실시예에서, FR 영역(FR, FR') 중 적어도 어느 하나를 반드시 포함하는 부위로, FR1 영역(FR1), FR1 영역(FR1)과 CDR1 영역(CDR1), FR2 영역(FR2), FR1 영역(FR1) 내지 FR2 영역(FR2) 또는 FR2 영역(FR2) 내지 FR3 영역(FR3)와 같은 중 쇄(VH)의 영역 또는 FR1' 영역(FR1'), FR1' 영역(FR1')과 CDR1' 영역(CDR1'), FR2' 영역(FR2'), FR1' 영역(FR1') 내지 FR2' 영역(FR2') 또는 FR2' 영역(FR2') 내지 FR3' 영역(FR3')와 같은 경 쇄(VL)의 영역으로부터 선택된 아미노산 서열의 경우도 포함될 수 있음은 분명하다. 이와 같이, 스위칭 결합제(100)는 상보성 결정 영역(CDR, CDR')에 비하여, 다양한 항체들에도 불구하고 동일 또는 상당히 유사한 서열을 가지는 특징이 있는 프레임워크 영역(FR, FR')의 아미노산 서열을 필수 구성으로 포함하여 설계되기 때문에, 항체 또는 항원의 종류에 상관없이 항체의 항원 결합 부위에 결합이 가능해진다. 이에 대한 다양한 실시예는 도 2에서 상세히 설명한다.
제 1 스위칭 결합제(HA, HB)는 전술한 항체(10)의 구조적 상호 결합 특성에 의해, 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역들(FR') 중 적어도 어느 하나에 가역적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 제 1 스위칭 결합제(HA)는 LBR 부위(LBR)와, 제 1 스위칭 결합제(HB)는 LAR 부위(LAR)와 상호 결합할 수 있다. 유사하게, 제 2 스위칭 결합제(LA, LB)는 중 쇄(VH)의 프레임워크 영역들(FR) 중 적어도 어느 하나에 가역적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 제 2 스위칭 결합제(LA)는 HAR 부위(HAR)와, 제 2 스위칭 결합제(LB)는 HBR 부위(HBR)와 상호 결합할 수 있다. 이는 스위칭 결합제(100)가 항체(10)의 항원 결합 부위(15)를 구성하는 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합하여, 항체(10)의 항원 결합 부위(15)의 구조를 지지하게 된다.
일 실시예에서, 제 1 스위칭 결합제(HA, HB)는 제 1 항체 결합부(도 5b의 AB1 및 도 6b의 AB1')를 포함할 수 있다. 상기 제 1 항체 결합부(AB1, AB1')에 의해, 제 1 스위칭 결합제(HA, HB)는 항체(10)의 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR')과 주요하게 결합할 수 있다. 일 실시예에서, 제 1 항체 결합부(AB1, AB1')는 -Y-, -I-, -W- 및 -Q- 중 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 제 1 항체 결합부(AB1, AB1')는 항체(10)의 중 쇄(VH)에서 선택된 아미노산 서열 중 항체(10)의 경 쇄(VL)와 특이적으로 결합하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 제 1 항체 결합부(AB1, AB1')를 포함하는 서열로, 바람직하게는 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 아미노산 서열 중 밑줄 친 아미노산 잔기는 제 1 항체 결합부(AB1, AB1') 일 수 있다. 아미노산 서열의 N 터미널에서 C 터미널 방향의 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다.
서열번호 1(이하, H1이라 지칭한다): S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E
서열번호 2(이하, H2이라 지칭한다): V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K
서열번호 1(H1)의 경우, 아미노산 서열 중 9 번째 아미노산 잔기인 Q와 17 번째 아미노산 잔기인 W는 제 1 항체 결합부(AB1') 일 수 있다. 서열번호 2(H2)의 경우, 아미노산 서열 중 3 번째 아미노산 잔기인 Y, 13 번째 아미노산 잔기인 I와 18 번째 아미노산 잔기인 W는 제 1 항체 결합부(AB1)일 수 있다. 이에 대한 상세한 설명은 도 5a 내지 도 6e에서 상세히 설명한다.
전술한 서열번호 1 및 2는 비제한적인 예시일 뿐, 본 발명의 실시예는, 상호 결합할 수 있는 중 쇄(VH)의 프레임워크 영역(FR)으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 여하의 물질일 수 있다.
일 실시예에서, 제 2 스위칭 결합제(LA, LB)는 제 2 항체 결합부(도 5B의 AB2 및 6b의 AB2')를 포함할 수 있다. 제 2 항체 결합부(AB2)는 제 2 스위칭 결합제(LA, LB)가 항체(10)의 중 쇄(VH)의 프레임워크 영역(FR)에 결합할 수 있도록 한다. 일 실시예에서, 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')는 -Y-, -Q-, -P-, -L- 및 -F- 중 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')는 항체(10)의 경 쇄(VL)에서 선택된 아미노산 서열 중 항체(10)의 중 쇄(VH)와 특이적으로 상호 결합할 수 있는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')를 포함하는 아미노산 서열로, 바람직하게는, 스위칭 결합제(100)는 서열번호 3 및 서열번호 4의 아미노산 서열 중 하나를 포함할 수 있다. 상기 아미노산 서열 중 밑줄 친 아미노산 잔기는 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')일 수 있다. 아미노산 서열의 N 터미널에서 C 터미널 방향의 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다.
서열번호 3(이하, L1이라 지칭한다): T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K
서열번호 4(이하, L2이라 지칭한다): V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K
서열번호 3의 경우, 아미노산 서열 중 6 번째 아미노산 잔기인 Y, 8 번째 아미노산 서열인 Q, 14 번째 아미노산 잔기인 P와 16 번째 아미노산 잔기인 L은 제 2 항체 결합부(AB2) 일 수 있다. 서열번호 4의 경우, 아미노산 서열 중 3 번째 아미노산 잔기인 Y, 12 번째 아미노산 잔기인 F는 제 2 항체 결합부(AB2') 일 수 있다.
이는 비제한적인 것으로, 서로 자가 결합할 수 있는 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR)을 포함하는 항원 결합 부위(15)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 모두 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제 1 항체 결합부(AB1, AB1') 또는 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')는 상기 중 쇄(VH) 또는 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR, FR')과 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호 작용 및 이들의 조합 중 적어도 하나 이상에 의해 결합할 수 있다. 예를 들면, 스위칭 결합제(100)를 구성하는 제 1 항체 결합부(AB1, AB1') 및 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')는 프레임워크 영역(FR, FR')과 사이드 체인의 기능기 또는 펩타이드 결합의 극성부위와 수소 결합에 의해 상호 결합 할 수 있다. 다만, 상기 제 1 항체 결합부(AB1, AB1') 및 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')는 상기 사이드 체인에 의한 기능기와 펩타이드 결합의 극성 부위를 통한 상호 결합에 한정되는 것은 아니며, 극성 뿐만 아니라 무극성 결합의 경우와 같이, 스위칭 결합제(100)와 항체(10)의 프레임워크 영역(FR, FR')와 결합할 수 있는 다양한 결합 예시도 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 스위칭 결합제(100)는 결합력 조절이 가능하게 설계될 수 있으며, 이에 대한 상세한 설명은 도 1b에서 후술하기로 한다.
일 실시예에서, 항체(10)의 프레임워크 영역(FR, FR')에 가역적으로 결합된 스위칭 결합제(100)는 항체(10)와 특이적으로 반응하는 타겟 항원(도 4a의 20)이 항체(10)에 결합되는 경우, 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리될 수 있다. 타겟 항원(20)이 항체(10)와 결합되면 타겟 항원(20) 또는 스위칭 결합제(100)와 결합되지 않은 상태의 항체(10)의 농도가 감소할 수 있고, 상기 농도의 감소에 따라 항체(10)와 스위칭 결합제(100)의 결합 반응의 평형을 유지하기 위하여 스위칭 결합제(100)가 결합된 항체(10)의 농도도 감소할 수 있다. 다른 실시예에서, 스위칭 결합제(100)가 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 항체(10)가 타겟 항원(20)과 결합되는 경우, 타겟 항원(20)의 입체 장애(steric hindrance) 효과에 의하여 스위칭 결합제(100)가 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 떨어져 나갈 수 있다. 이는 비제한적 예시로, 항체(10)에 타겟 항원(20)이 결합하는 경우 다양한 요인에 의하여 스위칭 결합제(100)와 프레임워크 영역(FR, FR')의 결합이 약화되거나 파괴될 수 있으며, 전술한 예시들은 본원 발명을 한정하지 않는다.
일 실시예에서, 스위칭 결합제(100)는 타겟 항원(20)이 항체(10)에 결합하는 과정에 영향을 미치지 아니할 수 있다. 예를 들면, 스위칭 결합제(100)는 항체의 프레임워크 영역(FR, FR')의 일부 영역의 아미노산 서열을 포함하여 프레임워크 영역(FR, FR')의 일부 또는 이를 포함하는 인접 영역(HAR, HBR)과 결합되어 있고, 타겟 항원(20)은 항체(10)의 상보성 결정 영역(CDR, CDR')을 인식하여 항체(10)와 결합하므로 타겟 항원(20)은 스위칭 결합제(100)가 결합된 항체(10)에 결합될 수 있다. 이후, 타겟 항원(20)과 항체(10)의 결합은 타겟 항원(20)에 입체 장애 효과를 발생시킴으로써 결합되어 있던 스위칭 결합제(100)의 분리를 일으켜 타겟 항원(20)의 검출 또는 분석이 가능하도록 한다.
일반적으로 항원-항체 반응은 비특이적 반응이 많아 제어가 어렵고, 세척 공정 또는 추가적인 시약 처리를 필요로 한다. 본 발명의 스위칭 결합제(100)는 항체(10)에 대한 결합과 분리의 특이적 동작을 수행하는 스위칭 특성을 갖지만, 상기 세척 공정의 단계를 생략하면서도 신속하고 정확하게 one-step으로 항원의 정량 및 분석을 가능하게 하는 이점이 있다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스위칭 결합제(100)의 기본 구성을 나타낸 도면이다.
도 1b를 참조하면, 스위칭 결합제(100)는 결합력 조절이 가능할 수 있다. 예를 들어, 항체 결합부(AB)의 아미노산 변조에 의해 스위칭 결합제(100)의 결합력 조절이 가능할 수 있다. 구체적으로, 상호 결합을 하는 스위칭 결합제(100)와 항원 결합 부위(15)를 구성하는 프레임워크 영역(FR, FR')의 아미노산 서열 상 입체구조를 고려하여 선별할 수 있고, 상기 선별된 아미노산 서열의 변조에 따라 스위칭 결합제(100)와 프레임워크 영역(FR, FR')간 항체 결합 부위(15)의 결합력 조절이 가능할 수 있다. 이를 통해, 다양한 종들의 항체(10)에 결합할 수 있는 스위칭 결합제(100)를 제공할 수 있다.
스위칭 결합제(100)는 항체 결합부(AB, 도 1b에서 제 1 항체 결합부(AB1, AB1') 또는 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')를 지칭함)와 항체 결합부(AB)에 결합된 결합력 조절부(bonding strength regulating portion, BR)를 기본 단위 구성으로서 포함할 수 있다. 도 1b에는 항체 결합부(AB)와 결합력 조절부(BR)가 서로 연결된 '항체 결합부(AB)-결합력 조절부(BR)'를 기본 구성의 단일체로 예시하고 있지만, 이는 예시적인 것으로, 예를 들어, -항체 결합부(AB)-결합력 조절부(BR)-항체 결합부(AB)-, -항체 결합부(AB)-결합력 조절부(BR)-항체 결합부(AB)-결합력 조절부(BR)-와 같이, 항체 결합부(AB)-결합력 조절부(BR)를 단위 구조체로 포함하여 항체 결합부(AB)와 결합력 조절부(BR)-가 연속적으로 결합되어 확장된 중합체 쇄를 구현할 수 있다.
항체 결합부(AB)는 서로 다른 다양한 종들의 항체를 인식하여 결합할 수 있는 스위칭 결합제(100)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체 결합부(AB)는 다양한 종류의 항체에서 동일 또는 유사한 아미노산 서열을 갖는 항체의 중 쇄 또는 경 쇄의 항원 결합 부위 내에 포함되는 가변 영역의 프레임워크 영역(FR, FR')의 적어도 일부분에 특이적으로 또는 선택적으로 결합하였다가 다시 분리 가능한, 즉 가역적으로 결합할 수 있다. 이러한 특성은 예를 들면, 후술하는 스위칭 결합제(100)의 구조적 특성에 따라 일어날 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 스위칭 결합제(100)의 전체 또는 일부가 항체의 프레임워크 영역의 적어도 일부분에 가역적으로 결합하는 경우를 포함하는 것이다. 이러한, 항체 결합부(101)는 항체의 프레임워크 영역(FR)에 결합되기 때문에, 다양한 항체에 적용 가능한 이점이 있다.
또한, 스위칭 결합제(100)는 항체가 항원과 선택적인 결합을 일으키는 idiotope, 즉 상보성 결정 영역(CDR) 부위가 아닌 이들 상보성 결정 영역(CDR) 부위 사이에 존재하는 프레임워크 영역(FR) 부위에 선택적인 결합을 하기 때문에, 특정 항원과의 결합을 방해하는데 사용되는 anti-idiotype 항체와 달리 항원 결합 특이성에 상관없이 다양한 항체, 특히 IgG 항체에 결합되는 특성을 갖는다.
결합력 조절부(BR)는 스위칭 결합제(100)와 항체(10)의 결합력이 강할수록 항체에 대한 항원의 결합을 방해할 수 있기 때문에, 면역 분석을 위한 항원-항체간 결합계수에 영향을 끼치지 않도록, 스위칭 결합제(100)와 항체 사이의 결합력을 조절한다. 일 실시예에서, 결합력 조절부(BR)는 적용되는 종들의 항체에 따라 서로 구별되는 아미노산의 서열을 가질 수 있다. 결합력 조절부(BR)의 아미노산 서열의 상이성에 의해 항체들마다 결합되는 스위칭 결합제(100)의 결합력이 조절될 수 있다. 그에 따라, 항원-항체 반응에서 항체의 종류에 따라 상기 항체에 결합하는 스위칭 결합제(100)의 결합력이 달라질 수 있다. 결합력 조절부(BR)에 의해 스위칭 결합제(100)의 항체 결합부(AB)와 상기 항체간 결합력을 조절할 수 있기 때문에, 항체(10)의 다양한 종류에 대응하여 특정 조건에서 항체 결합부(AB)가 항체(10)의 프레임워크 영역(FR)으로부터 쉽게 분리되어 스위칭 결합제(100)가 항체(10)로부터 분리될 수 있도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 항체 결합부(AB)가 항체(10)의 프레임워크 영역(FR)에 결합되어 있을 때, 타겟 항원이 항체의 항원 결합 부위를 인식하여 특이적으로 결합할 때, 항체(10)의 프레임워크 영 역(FR)으로부터 항체 결합부(AB)가 쉽게 분리되어 상기 타겟 항원이 항체에 쉽게 결합될 수 있도록 한다. 그에 따라, 항체 결합부(AB)- 결합력 조절부(BR)의 단위 구조를 갖는 본 발명의 실시예에 따른 스위칭 결합제(100)는 항체-항원 반응에서, 항체에 대한 결합과 분리라는 특이적 동작을 수행하는 스위칭 특성을 가진다.
전술한 것과 같이, 본 발명의 스위칭 결합제(100)는 소정 항체(10)에 결합되어 있다가 타겟 항원(20)이 항체에 결합되면, 항체(10)로부터 분리되고, 분리된 스위칭 결합제를 검출함으로써, 항원(20)의 특정과 정량을 가능하게 한다. 상기 항원(20)의 특정과 정량은 공지의 방법이 이용될 수 있다. 즉, 상기 스위칭 결합제(100)는 항체(10)의 항원 결합 부위에 결합해야 하며, 항원이 항체에 결합시에만 분리가 된다. 본 발명의 실시예에 따른 스위칭 결합제(100)의 항체 결합부(AB)가 넓은 범위의 다양한 항체들에 대해 다소 비특이적으로 결합되지만, 결합력 조절부(BR)에 의해, 항체(10)에 타겟 항원(20)이 결합될 때, 스위칭 결합제(100) 전체가 항체(10)로부터 쉽게 분리되도록 함으로써, 스위칭 결합제(100)가 상기 타겟 항원(20)에 대한 특이적 반응, 즉, 항체(10)로부터의 분리 반응을 하도록 할 수 있으며, 분리된 스위칭 결합제를 이용하여, 상기 항원이 적정 및/또는 정량될 수 있다. 또한, 특정 항원과의 결합을 방해하는데 사용되는 anti-idiotype 항체와 달리 항원 결합 특이성에 상관없이 비제한적 항체에 결합하는 특성을 가질 수 있다. 나아가, 스위칭 결합제(100)의 이러한 특성을 이용하여, 진단 제제뿐만 아니라, 치료 제제 및 바이오 센서로의 응용이 도출될 수 있다. 전술한 것과 같이, 스위칭 결합제(100)와 항체(10)의 결합은, 특정 항원의 항체(10)에 대한 결합에 영향을 미치지 않도록 항체(10)에 대한 스위칭 결합제(100)의 결합력은 항체(10)와 특정 항원의 사이의 결합력보다 더 작도록 설계될 수 있다. 그러나, 본 발명이 이에 한정된 것은 아니며, 다른 실시예에서, 항체(10)에 대한 스위칭 결합제(100)의 결합력은 항체(10)와 타겟 항원(20)의 결합력보다 더 큰 결합력을 항원과 항체(10) 사이의 결합 반응을 조절할 수 있다. 이는, 진단 분야에서 항원과 항체 사이의 반응 세기 조절이 필요한 경우 응용될 수 있다. 항체 결합부(AB)는 변조에 의한 결합력 조절이 가능한 부위로 이에 대한 구체적이고 상세한 설명은 도 5a 내지 도 6e에서 후술하도록 한다.
또한, 결합력 조절부(BR)는 특정 항체가 아닌 다양한 항체에 결합 및 분리될 수 있어, 변종 바이러스와 같은 알려지지 않은 항원의 항체에 대한 결합시에도, 스위칭 결합제(100)의 결합력이 조절되어 항체(10)로부터 스위칭 결합제(100)의 분리가 용이하게 되므로, 후술하는 항체의 식별과 정량의 신속성과 정확성이 향상될 수 있다. 본 발명의 실시예들은, 스위칭 결합제(100)의 결합 및 분리의 스위칭 동작을 이용하여, 비특이적 반응이 많아 세척 공정이 필요하고, 제어가 어려운 종래의 항원-항체 반응에서, 상기 세척 공정의 단계를 생략하면서도 신속하고 정확하게 one-step으로 항원의 정량 및 분석을 가능하게 하는 이점이 있다.
일 실시예에서, 항체 결합부(AB)는 도 1a에서 제 1 항체 결합부(AB1, AB1')와 제 2 항체 결합부(AB2, AB2')에 대해 전술한 바를 참조할 수 있으며, 다른 실시예에서, 결합력 조절부(BR)는 아미노산 서열 -S-Y-W-I-H-W-V-K-, -R-P-G-Q-G-L-E-, -I-G-E-, -V-Y-, -C-A-R-E-P-T-G-T-G-, -Y-F-D-V-, -G-K-, -T-Y-L-E-W-Y-, -K-P-G-Q-S-, -K-, L-I-Y-K-, -C-F-Q-G-S-H-V-P- 및 -T-K-와 같이 아미노산 잔기 또는 서열(이하, 결합력 조절부 아미노산 서열) 중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 스위칭 결합제(100)는 전술한 바와 같이, 항체 결합부(AB)와 결합력 조절부(BR)를 하나 이상의 단위 구조체로 포함하여 항체 결합부(AB)와 결합력 조절부(BR)가 연속적으로 결합되어 확장된 서열들의 결합에 의해 표현될 수 있다. 따라서, 결합력 조절부(BR)는 스위칭 결합제(100) 내에서 항체 결합부(AB)의 위치를 변조하여 항체(10)에 대한 항체 결합부(AB)의 결합력을 조절할 수 있다. 일 실시예에서, 스위칭 결합제(100)는 항체 결합부(AB) 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 항체 결합부(AB)와 결합력 조절부(BR) 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 선택된 결합력 조절부(102)가 적어도 1회 이상 교번하여 반복되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, -T-Y-L-E-W-Q-K-W-, -V-Y-Y-, -V-Y-Y-G-K-, -K-P-G-Q-S-I-, -G-K-W-K-L-, -Y-F-D-V-W-G-K-, -F-C-F-Q-G-S-H-V-P-Q-, -R-P-G-Q-G-L-E-F-V-Y-, -S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-T-K-F-, W-I-G-E-Y-V-Y-Q-Y-F-D-V-P- 와 같이 물리적 및 화학적으로 가능한 여하의 서열로서, 상기 항체 결합부 아미노산 서열과 상기 결합력 조절 아미노산 서열이 적어도 1회 이상 교번하여 반복되는 것을 포함할 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 실시예에서, 스위칭 결합제(100) 중 항체 결합부(AB)와 결합력 조절부(BR)를 하나의 단위 구조체로 포함하여 연속적으로 결합 및 확장된 아미노산 잔기의 수는 결합하는 항체의 프레임워크 영역(도 2에 도시, FR)의 아미노산 잔기의 수를 비교하여, 동일하거나, 또는 많을 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니므로, 적은 경우를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 상기 연장된 아미노산 서열의 수는 6개 내지 30개일 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 프레임워크 영역(FR) 및 프레임워크 영역(FR)에 인접한 상보성 결정 영역(CDR)에 대한 스위칭 결합제(100)의 결합을 나타낸 도면이다.
도 2를 참조하면, 일 실시예에 따르면, 스위칭 결합제(100a, 100b)는 프레임워크 영역(FR) 중 FR1 영역(FR1)의 전부 또는 일부, 프레임워크 영역(FR) 중 FR2 영역(FR2)의 전부 또는 일부, 프레임워크 영역(FR) 중 FR3 영역(FR3)의 전부 또는 일부, 또는 프레임워크 영역(FR) 중 FR4 영역(FR4)의 전부 또는 일부의 조합에 결합될 수 있다. 예를 들면, 스위칭 결합제(100a)는 프레임워크 영역들(FR) 중 FR1 영역(FR1)에 결합되고, 스위칭 결합제(100b)는 FR2 영역(FR2)에 결합될 수 있다. 스위칭 결합제(100)가 프레임워크 영역의 일부에 결합되는 경우에는, 프레임워크 영역의 30 % 내지 70 % 정도에 걸쳐 프레임워크 영역에 결합될 수 있다. 다만, 도 2에 도시된 스위칭 결합제(100a, 100b)는 프레임워크 영역(FR) 중 FR1 영역(FR1), 프레임워크 영역(FR) 중 FR2 영역(FR2)에만 결합되어 있지만, 이는 비제한적인 것으로, 프레임워크 영역 중 FR3 영역(FR3) 또는 프레임워크 영역 중 FR4 영역(FR4)에도 결합 가능하며, 전술한 바와 같이, 프레임워크 영역(FR) 중 FR1 영역(FR1) 내지 프레임워크 영역(FR) 중 FR2 영역(FR2) 또는 프레임워크 영역(FR) 중 FR2 영역(FR2) 내지 프레임워크 영역(FR) 중 FR4 영역(FR4)와 같은 프레임워크 영역(FR)를 연결하여 사용한 서열에도 결합할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 스위칭 결합제(100c)는 적어도 하나 이상의 프레임워크 영역(FR) 및 적어도 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)에 동시에 결합할 수 있다. 예를 들면, 스위칭 결합제(100c)의 전체 아미노산 서열 중 일부는 프레임워크 영역(FR)에 결합되고, 다른 일부는 상보성 결정 영역(CDR)에 결합될 수 있다. 다른 실시예에서, 상보성 결정 영역(CDR)은 스위칭 결합제(100c)가 결합되는 프레임워크 영역(FR)으로부터 연장되는 영역일 수 있다. 예를 들면, 스위칭 결합제(100c)의 아미노산 서열 중 일 부분이 FR2 영역(FR2)와 결합되는 경우, 다른 부분은 상보성 결정 영역(CDR) 중 CDR1 영역(CDR1) 또는 상보성 결정 영역(CDR) 중 CDR2 영역(CDR2)와 접촉되어 결합될 수 있다. 다만 이는 비제한적인 것으로, 프레임워크 영역(FR)간 사이에 위치하는 상보성 결정 영역(CDR)에도 유사하게 결합될 수 있다. 예를 들어, 프레임워크 영역(FR) 중 FR3 영역(FR3)와 프레임워크 영역(FR) 중 FR4 영역(FR4) 사이 상보성 결정 영역(CDR) 중 CDR4 영역(CDR4)에 스위칭 결합제(100)이 연속하여 결합될 수 있다.
도 2를 참조하여, 중 쇄(VH)에 결합하는 스위칭 결합제들에 관하여 개시되어 있지만, 본 발명의 실시예에 따른 스위칭 결합제들은 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR')에 대해서도 유사하게 결합될 수 있다.
일 실시예에서, 항체(10)는 isotype, hollotype 또는 idotype 항체를 포함하여, 특정되지 않는 한 모든 항체를 포함할 수 있다. 특히, 항체(10)가 isotype 항체인 경우, 항체(10)는 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE과 같은 항체를 포함할 수 있다. 다른 실시예에 따르면, 항체(10)은 인간 항체, 비인간 항체, 인간화된 비인간 항체 또는 이들의 조합일 수 있다. 스위칭 결합제(100)는 전술한 바와 같이 항체의 3차원 구조를 이루기 위해 상호 결합을 일으키는 항원 결합 부위(15)를 구성하는 프레임워크 영역(FR, FR') 부위 및 프레임워크 영역(FR, FR')에 인접한 상보성 결정 영역(CDR, CDR')에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 것으로, 프레임워크 영역(FR, FR')의 아미노산 서열은 항체(10)의 종류가 달라지더라도 상보성 결정 영역(CDR, CDR')에 비하여 변화가 적어 유사하게 유지될 수 있다. 그러므로, 항체(10)의 source 동물, 예를 들어, mouse, rabbit, goat 또는 human에 대해 동일 또는 상당히 유사한 아미노산 서열을 가져 다양한 항체(10)에 비특이적인 결합을 할 수 있다. 이에 따라, 다양한 항체에 적용할 수 있어 가용 범위가 확장된 스위칭 결합제(100)가 제공될 수 있다.
일 실시예에서, 스위칭 결합제(100)는 펩타이드, 단백질, 압타머, 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display) 또는 또 다른 항체일 수 있다.
상기 펩타이드는 화학적 합성, 아미노산 전구체를 사용한 고체상 기술 및 자동화된 펩타이드 합성기에 의한 합성 또는 재조합 수단에 의해 생산될 수 있다. 전술한 펩타이드 합성 방법들은 비제한적 예시이며, 공지된 다양한 종류의 펩타이드 합성 방법들이 적용될 수 있다.
상기 단백질은 아미노산이 펩타이드 결합을 하여 생긴 여러 개의 아미노산으로 이루어진 고분자 화합물이다. 일 실시예에서, 상기 단백질은 자동화 유기 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있고, 거대 분자 전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열이 핵산 발현 벡터 내로 클로닝되는 것과 같이 유전적으로 조작된 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다.
상기 압타머는 비제한적 예로서 표적 분자의 결합을 이용한 시험관 내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 표적 분자, 특히 중 쇄(VH) 또는 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR, RR')에 특이적으로 결합하는 압타머의 선별은 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커 분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 압타머를 분리하는 것에 의해 달성될 수 있다. 또한, 압타머의 선별은 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment) 방법으로 생체 내 또는 시험관 내 선택 기술을 이용할 수도 있다.
나노바디(nanobody)는 단일 도메인 항체로서, 항체 단일 단편으로 구성된 단량체 가변 항체 도메인이며, 항체와 마찬가지로 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 나노바디는 중 쇄 항체, 경 쇄가 자연적으로 없는 항체, 종래의 4-쇄 항체에서 유래한 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체에서 유래된 것 외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함할 수 있다.
또한, 파지 디스플레이(phage display)는 펩타이드나 항체 같은 단백질의 일부 또는 전체 단백질을 박테리오파지의 표면에 제시하는 것이다. 상기 파지 디스플레이를 통해 단백질-단백질 상호 작용의 규명을 위해 널리 사용되고 있으며, 이 밖에도 치료, 진단 또는 실험용으로 중요한 특정 항체의 탐색에 유용하다. 또한, 이스트 디스플레이(yeast display)는 항체를 분리하고 공학적으로 만들기 위해 효모 세포벽에 통합된 재조합 단백질의 발현을 사용하는 단백질 공학적 기법이다.
스위칭 결합제(100)로서의 항체는 인간 항체, 비인간 항체 또는 인간화된 비인간 항체일 수 있다. 상기 인간 항체는 인간에 의해 생산된 항체에 대응하고/하거나 본원에서 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 이용해서 제조된 아미노산 서열을 보유하는 항체일 수 있다. 상기 인간 항체는 파지-디스플레이, 인간 하이브리도마(human hybridoma) 기법에 의해 형성될 수 있다. 상기 비인간 항체는 다양한 종의 공급원, 예를 들면, 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개와 같은 인간을 제외한 포유 동물이나 조류로부터 획득된 항체일 수 있다. 상기 인간화된 비인간 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일 실시예에서, 상기 인간화된 비인간 항체는 사람 배열 대신에 비인간 항체로부터 선택된 배열도 함유할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 인간화 항체는 보존적 아미노산의 치환, 즉 항체 결합 및/또는 생물학적 활성이 크게 바뀌지 않는 동종 또는 다른 종에서 유래된 비천연 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능, 예컨대 결합 친화도를 추가 정련하기 위해 제조될 수 있다. 전술한 스위칭 결합제(100)의 예시는 비제한적인 예로, 항체의 중 쇄 또는 경 쇄와 가역적으로 결합할 수 있는 전술한 아미노산 서열을 포함하는 다양한 예시를 포함할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 스위칭 결합제(100)에서, 상기 아미노산 서열 중 일부가 무기물로 대체되는 물질이라도, 항체(10)의 중 쇄 또는 경 쇄의 프레임워크 영역(FR, FR')을 포함하는 항원 결합 부위(15)에 결합할 수 있고, 스위칭 결합제(100)는 해당 물질을 포함할 수 있다. 상기 무기물은 예를 들면, 이산화규소(SiO2), 산화알루미늄(Al2O3), 산화칼슘(CaO), 산화마그네슘(MgO), 산화철(Fe2O3), 산화타이타늄(TiO2), 산화칼륨(K2O), 산화나트륨(Na2O), 석회석(CaCO3), 돌로마이트(CaMg(CO3)2), 활석(Mg3Si4O10(OH)2), 산화은(Ag2O), 산화크로늄(Cr2O3), 산화코발트(CoO2), 산화구리(CuO), 산화아연(ZnO)로 이루어진 그룹 중 하나 이상으로 이루어질 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 스위칭 결합제(100)를 도시한다.
도 3을 참조하면, 일 실시예에서, 스위칭 결합제(100)는 화학적, 전기적, 자기적 또는 광학적 표지 반응을 나타내는 표지 물질(200)로 표지될 수 있다. 표지 물질(200)의 표지로 항원-항체 반응에 있어서, 스위칭 결합제(100)가 항체(10)에 결합 및 분리함으로써 도시되는 표지량에 의해 항체 및 항원을 식별 및 정량할 수 있고, 후술할 항체에 대한 항원의 결합력을 측정할 수 있는 이점이 있다.
상기 화학적 표지 반응의 경우, 올리고히스티딘 서열-태그, 염료 등에 의한 화학적 태깅(tagging)을 포함할 수 있다. 상기 전기적 표지 반응의 경우, 발현 기질의 산화-환원 반응에 의하여 발생한 전자의 전류 신호 반응을 포함할 수 있다. 상기 자기적 표지 반응의 경우, 방사능 표지된 특이적 결합 구성원, 구체적으로 항체 분자에 킬레이트화 그룹을 통한 다수의 상자성 이온이 부하될 수 있다. 킬레이트화 그룹으로 EDTA, 포피린, 폴리아민 크라운 에테르 및 폴리옥심이 포함될 수 있고, 상자성 이온의 예로 가돌리늄, 철, 망간, 레늄, 유로퓸, 란탄, 홀뮴 및 에르븀을 포함할 수 있다. 상기 상자성 이온이 부하되어, 방사능 표지된 특이적 결합 구성원, 특히 항체 및 항체의 단편을 통해 항체의 식별 및 위치 확인이 가능하다. 상기 광학적 표지 반응의 경우, 발광, 발색, 형광, 탁도, 자기력 또는 전기 저항 반응을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 표지 물질(200)은 스위칭 결합제(100)의 적어도 어느 일부에 결합될 수 있다. 표지 물질(200)은 발색 물질, 발광 물질, 형광 물질, 자성 물질, 금속 물질, 유기 합성 물질 또는 이들의 조합할 수 있다. 상기 발색 물질에 대한 일 실시예로, 표지 물질(200)은 홀스래디쉬 퍼옥시다아제(Horseradish peroxidase; HRP)이고, 기질은 과산화수소와 같은 과산화물 및/또는 3,3',5,5'-테트라 메틸 벤지딘(Tetramethylbenzidine; TMB)일 수 있다. 또는, 표지 물질(200)은 알칼라인 포스파타아제(Alkaline phosphatase; AP)일 수 있고, 상기 기질은 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 물질이 이용될 수 있으며, 이는 상기 표지 물질(200)이 상기 기질을 분해하여 광학 반응, 화학 반응 또는 전기 반응을 나타내는 효소 역할을 할 수 있는 것이다. 상기 형광 물질에 대한 일 실시예로, Applied Biosystems 사의 HEXTM, TAMRA, lumiprobe 사의 Cy5 또는 술포로다민 101 산 클로라이드(술포로다민 101 산 클로라이드; Texas Red)일 수 있으며, 바람직하게는 FAM 형광 또는 TAMRA 형광일 수 있다. 상기 금속 물질에 대한 일 실시예로, 산화-환원 반응을 겪을 수 있는 임의의 배위된 금속 원자, 예를 들어, 철, 코발트, 루테늄, 아연, 구리, 리튬 또는 은과 같은 물질을 포함할 수 있으며, 일부 특정 예로, 페로센, 아연 테트라벤조포르피린, 코발트 프탈로시아닌, 트리스-(2,2'-바이피리미딘)루테늄, 4-페로세닐벤질 알코올, 5-(4-하이드록시메틸페닐)-10,15,20-트리메시틸포르피나토아연(∥) 및 산화-환원-활성 칼릭사렌으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 유기 합성 물질에 대한 일 실시예로, 플루오르세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 파이크에리쓰린(phycoerythrin), 파이코시아닌(phycocyanin), 알로파이코시아닌(allophycocyanin) 또는 플루오르카민(fluorecamine)을 포함할 수 있다. 이는 비제한적인 예시이며, 스위칭 결합제(100)를 표지하기 위한 다양한 종류의 공지 기술들이 참조될 수 있다.
도 1a 내지 도 3를 다시 참조하면, 일 실시예에서, 스위칭 결합제(100)의 제조 방법으로서, 항원 결합 부위(15)에서 아미노산 서열을 확인하는 단계, 상기 아미노산 서열의 소수성 지수를 얻는 단계, 상기 소수성 지수를 비교하여, 스위칭 결합제(100)를 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 스위칭 결합제(100)에 관한 설명은 모순되지 않는 범위내에서 전술하여 설명한 것과 마찬가지이다.
상기 아미노산 서열을 확인하는 단계는, 항체(10)의 중 쇄 및 경 쇄의 프레임워크 영역을 포함하는 항원 결합 부위(15)에서, 항원 결합 부위(15) 상호 간 자가 결합하는 특징을 가지는 아미노산 서열을 확인할 수 있다. 상보성 결정 영역(CDR, CDR')과 비교하여, 프레임워크 영역(FR, FR')은 다양한 종류의 항체 간에 동일 또는 상당히 유사한 아미노산 서열을 가지고, 다양한 항체에 적용될 수 있는 이점이 있어, 프레임워크 영역(FR, FR')에서 선택될 아미노산 서열을 확인하는 것이다.
상기 아미노산 서열의 소수성 지수를 얻는 단계는, 항체에 대한 아미노산 서열 부위별 소수성 지수를 얻을 수 있다. 상기 소수성 지수에서 음의 값과 양의 값으로 구분할 수 있고, 양의 값은 친수성 성질을, 음의 값은 소수성 성질을 갖는 부분임을 확인할 수 있다. 이에 대한 상세한 설명은 도 5c와 도 5d 및 도 6c와 도 6d에서 후술하기로 한다.
상기 소수성 지수를 비교하여, 항원 결합 부위(15)를 구성하는 상기 중 쇄(VH) 및 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR, FR')의 아미노산 서열간 동일한 성질을 가지는 부분의 상기 아미노산 서열을 포함하는 스위칭 결합제(100)를 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 친수성 성질을 나타내는 서열간 또는 소수성 성질을 나타내는 서열간 상호 결합할 수 있다. 이를 통해, 친수성 성질을 가져 상호 결합이 가능한 부분 또는 소수성 성질을 가져 상호 결합이 가능한 부분의 아미노산 서열을 스위칭 결합제(100)의 아미노산 서열의 전부 또는 일부로 선택할 수 있다. 구체적으로, 상기 스위칭 결합제(100)를 선택하는 단계는, 상기 아미노산 서열의 정보를 통해, 중 쇄(VH) 또는 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR, FR')에 상호 결합 특성을 갖는 아미노산 서열을 추출하는 것이다. 항체(10)의 프레임워크 영역(FR, FR')을 포함하는 항원 결합 부위(15) 상호간 결합하는 특성을 통해, 스위칭 결합제(100)가 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합하여, 프레임워크 영역(FR, FR')간 상호 작용하는 것과 마찬가지의 효과를 얻을 수 있는 이점을 가지기 때문이다. 스위칭 결합제(100)에 관한 상세한 설명은 전술한 바와 같다.
다른 실시예에서, 질병 스크리닝, 진단, 예방, 치료용 또는 진단과 치료 통합의 약학 조성물로서, 스위칭 결합제(100)를 포함할 수 있다. 스위칭 결합제(100)가 다양한 항체(10)의 프레임워크 영역에 특이적으로 결합 및 분리되는 특성을 통해, 다양한 바이러스에 대한 진단, 예방 또는 치료를 가능하게 하는 이점을 가진다. 상기 약학 조성물은 투여시에 경구 및 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있다. 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 부형제 예를 들면, 전분, 탄산 칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토스(lactose), 젤라틴 등을 혼합하여 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 스위칭 결합제(100)에 대한 설명은 전술한 내용을 참고할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함될 수 있다. 상기 비수성용제, 상기 현탁제로는 프로필렌슬리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다.
도 4a는 일 실시예에 따른 스위칭 결합제(100)를 이용한 분석 방법의 순서도를 도시하고, 도 4b는 본 발명의 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제(100)를 이용한 분석 방법의 순서도를 도시하며, 도 4c는 또 다른 실시예에 따른 스위칭 결합제(100)를 이용한 분석 방법의 순서도이다.
도 4a를 참조하면, 일 실시예에 따른 분석 방법은, 프레임워크 영역(FR, FR')로부터 아미노산 서열을 선택하는 단계(미도시)를 포함할 수 있다. 항체의 중 쇄(VH) 및 경 쇄(VL)가 인접하게 위치하여 상호 자가 결합하는 프레임워크 영역(FR, FR')로부터 스위칭 결합제(100)의 아미노산 서열을 선택할 수 있다. 상기 아미노산 서열을 선택하는 단계에 대해서는 항체(10)의 항원 결합 부위(15)를 구성하는 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 선택될 수 있는 것에 대해, 도 1a 내지 도 2의 개시사항 및 후술하는 실시예를 참조할 수 있다. 따라서, 항체(10)의 항원 결합 부위(15) 중 항체(10)마다 동일 또는 상당히 유사한 프레임워크 영역(FR)를 포함하는 아미노산 서열을 추출하여 다양한 항체(10)에 적용할 수 있는 이점이 있다.
일 실시예에서, 항체(10)는 지지체(30)에 고정되어 준비될 수 있다. 지지체(30)는 기판, 비드(bead), 섬유 또는 고분자 구조체일 수 있다. 지지체(30)으로 사용될 수 있는 기질은 바이오칩 또는 바이오센서에 사용될 수 있는 것이라면 한정되지 않는다. 바람직하게는 별도의 처리를 하여 표면이 개질되거나 개질되지 않은 금, 세라믹, 유리, 고분자, 실리콘, 변형된 실리콘, 섬유 및 금속일 수 있다. 구체적으로 상기 고분자는 테트라플루오로에틸렌(tetrafluoroethylene), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리카보네이트(polycarbonate) 또는 폴리프로필렌(polypropylene)일 수 있으며, 상기 섬유는 니트로셀룰로오스(nitrocellulose), 재생 셀룰로오스(regenerated cellulose), 나일론(nylon) 막(membrane)일 수 있으며, 상기 기판 상에 처리하여 표면을 개질시킬 수 있는 물질은 고분자, 플라스틱, 수지, 탄수화물, 실리카, 실리카 유도물질, 탄소, 금속 무기 유리 및 막과 같은 물질일 수 있다. 지지체(30)는 상기 지지체(30) 역할뿐만 아니라, 고정된 항체와 시료와의 반응을 위한 장소를 제공한다. 상기 지지체의 규격 및 그 위에 항체가 고정되는 위치, 크기 및 모양은 분석의 목적, 점적 기기(spotting machine), 분주 기기(dispensing machine) 및 스캐너 등의 분석기기에 따라 변화될 수 있다.
도 4a는 항체(10)가 고체 지지체(30)를 이용하여 기판 상에 고정된 것을 도시하고 있으나, 이에 제한되지 않고, 항체(10)는 비드에 고정되어 용액 내에 배치되거나(도 4b 참조), 항체(10)는 고정되지 않고, 용액 내에 혼합 상태로 제공될 수도 있다(도 4c 참조). 즉, immunosorbent 타입의 임뮤노어세이와 homogeneous 타입의 임뮤노어세이에 적용이 가능하다.
일 실시예에서, 전처리 단계(S100)에서 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)를 정량할 수 있다. 예를 들면, 항체(10)는 기판에 고정되어 있고, 스위칭 결합제(100)는 스위칭 결합제(100)에 표지 물질(200)이 결합되어 표지 반응을 나타내고, 상기 기판 하면에서 스위칭 결합제(100)의 상기 표지 반응의 강도를 측정할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 항체(10)에 타겟 항원(20)이 결합되기 전, 상기 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)를 정량하여, 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 양을 초기값으로 이용하여, 정확도 높은 타겟 항원(20)의 식별 또는 정량이 가능한 이점이 있다. 스위칭 결합제(100), 표지 물질(200) 및 표지 반응에 관한 상세한 설명은 전술한 개시 사항을 참조할 수 있다. 또한, 본 명세서에서, 스위칭 결합제(100)의 "양"은 스위칭 결합제(100)의 "농도"와 상호 호환되어 사용될 수 있고, 스위칭 결합제(100)의 양이 "많다" 또는 "적다"는 기재는 스위칭 결합제(100)의 농도가 "높다" 또는 "낮다"는 것으로 이해될 수 있다.
이후, 항체(10)에 피분석물을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 항체(10)에 타겟 항원(20)을 결합시켜 결합된 스위칭 결합제(110)를 프레임워크 영역(FR, FR')로부터 분리시키는 항원 처리 단계(S200)가 수행될 수 있다. 상기 피분석물 내에는 타겟 항원(20)이 포함되거나, 포함되지 않을 수 있으며, 상기 피분석물 내에 상기 타겟 항원(20)이 포함되어 항체(10)에 타겟 항원(20)이 제공되는 경우, 상기 타겟 항원(20)의 상기 항체(10)와의 특이적 반응성에 의하여, 상기 항체(10)와 결합된 스위칭 결합제(110) 중 적어도 어느 일부는 상기 프레임워크 영역(FR, FR')로부터 분리되어 상기 항체(10)가 포함된 용액 상으로 유리될 수 있다. 이는 타겟 항원(20)의 농도가 높을수록, 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110) 중 항체(10)로부터 분리되는 스위칭 결합제(100)의 비율이 증가할 수 있다.
이후, 항원 처리 단계 이후에 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120), 또는 프레임워크 영역(FR, FR')로부터 분리된 스위칭 결합제(130) 중 적어도 어느 하나를 정량 하여 타겟 항원(20)을 분석하는 분석 단계(S300)가 수행될 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 항체(10)에 피분석물을 제공한 후 세척 단계를 수행하지 않고 피분석물 내의 타겟 항원(20)을 스위칭 결합제(100, 120, 130)를 통해 분석할 수 있어, 신속한 분석이 가능하며, 세척을 위한 부가적인 장비가 요구되지 않고 추가적으로 항체 자체를 표지 시키는 단계를 포함하지 않아 one-step의 간소화가 가능하며, 적은 양을 사용하더라도 스위칭 결합제(100)에 표지되는 물질로 항원의 결합으로 인한 항원-항체 반응을 확인할 수 있어 소형화가 가능하므로, 사용 용이성이 향상된 one-step 임뮤노어세이를 제공할 수 있다.
일 실시예에서, 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)를 정량 할 수 있다. 이 경우, 전처리 단계(S100)의 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 양보다 분석 단계에서 측정된 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양이 감소된 경우, 상기 피분석물 내에 타겟 항원(20)이 포함되어 있는지에 관한 정보를 획득할 수 있다. 이는, 타겟 항원(20)이 항체(10)에 결합될 경우에만, 상기 스위칭 결합제(110)가 분리되기 때문이다.
또한, 전처리 단계(S100)의 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 양에 대한 분석 단계에서 측정된 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양의 차이가 클수록 타겟 항원(20)의 양이 많다는 정보 또는 농도가 높다는 정보를 획득할 수 있다. 이에 따라, 본원 발명은 피분석물에 포함된 타겟 항원(20)의 양 또는 농도까지 식별 또는 정량 할 수 있다(이하, 제 1 분석이라 함).
다른 실시예에서, 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)을 정량할 수 있다. 이 경우, 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)의 양이 임계 값 이상인 경우, 상기 피분석물에 타겟 항원(20)이 포함된 것일 수 있다(이하, 제 2 분석이라 함).
또 다른 실시예에서, 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제 (120) 및 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)를 모두 정량 할 수 있다. 정량된 결과 분석(제 1 분석, 제 2 분석)에 관한 상세한 설명은 전술한 개시 사항들이 참조될 수 있다. 이에 따라, 전처리 단계(S100)에서 측정된 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 양과 분석 단계(S300)에서 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양의 차이값(제 1 분석) 및 프레임워크(FR, FR')로부터 분리된 스위칭 결합제(130)의 양의 차이값(제 2 분석)을 이용하여 타겟 항원(20)의 정량을 위해 2가지 분석 방법이 활용될 수 있다. 상기 제 1 분석 및 제 2 분석을 통해 타겟 항원(20)의 정량 분석의 정확도 및 신뢰도가 향상된 one-step 임뮤노어세이를 제공할 수 있다. 상기 정량은 잔량의 스위칭 결합제(120) 및/또는 분리된 스위칭 결합제(130)에 결합된 표지 물질(200)의 전술한 표지 반응을 측정하여 판단할 수 있으며, 예를 들면, 상기 표지 반응의 형광의 양은 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer; FRET) 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 이를 통해, 스위칭 결합제(100)는 서로 다른 농도의 항원(20) 결합 시 항체(10)로부터 항원(20)의 농도에 정량적인 관계에 따라 유리되어 피분석물, 예를 들어 항원(20)의 정량이 가능한 one-step 임뮤노어세이의 구현이 가능하다. 도 4a에서 개시된 분석 방법에 대한 분석 결과는 도 8a 내지 도 8d에서 상세히 설명한다.
도 4b를 참조하면, 일 실시예에 따른 분석 방법은, 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 아미노산 서열을 선택하는 단계(미도시)를 포함할 수 있다. 상기 아미노산을 선택하는 단계에 관한 설명은 도 1a 내지 도 2와 후술하는 실시예에서 상세히 설명한다.
일 실시예에서, 전처리 단계(S100')에서 항체(10) 비드에 고정될 수 있다. 상기 비드는 비제한적인 예시로서, 글래스(glass) 비드, 마그네틱 비드 또는 고분자 비드일 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 항체(10)를 고정하기 위한 지지체(30)로 기판이 아닌 용액 중에 배치되거나 분산될 수 있는 비드를 사용함으로써, 상기 비드에 항체(10)를 균일하게 고정시키기 용이하고, 후에, 항원 처리 단계(S200')에서 항체(10)와 타겟 항원(20)이 혼합되어 항체(10)와 타겟 항원(20)의 결합도가 상승하는 이점이 있다. 또한, 상기 비드는 기판과 같은 고정된 지지체와 달리 용액 상에 분산 또는 배치될 수 있어, 타겟 항원(20) 분석을 위한 용액 상의 공정이 가능한 이점이 있어, 항체(10)를 고정시키는 단계가 생략될 수 있고, 타겟 항원(20)과 항체(10)가 높은 확률로 결합하여 분석의 정확도가 향상되는 이점이 있다.
이후, 도 4a에서 설명한 것과 마찬가지로, 피분석물을 제공하는 단계 구체적으로, 항원 처리 단계(S200')에서, 용액 내에 존재하는 항체(10)에 피분석물인 타겟 항원(20)을 결합시켜 스위칭 결합제(100)를 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리시키는 단계가 수행될 수 있다. 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 스위칭 결합제(100)가 분리되는 것의 상세한 설명은 전술한 기재를 참조할 수 있다.
이후, 분석 단계(S300')에서, 항원 처리 단계 이후에 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)와 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)를 분리할 수 있다. 예를 들면, 비드, 비드에 고정된 항체(10) 및 항체(10)의 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)의 스위칭 결합제와 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)를 분리할 수 있다. 상기 스위칭 결합제의 밀도는 분리된 스위칭 결합제(130)의 밀도보다 클 수 있다. 이때, 상기 스위칭 결합제의 밀도는 분리된 스위칭 결합제(130)의 밀도보다 크다는 점을 이용하여 상기 스위칭 결합제를 분리할 수 있다. 이를 위해, 원심분리기를 이용하거나, 상기 스위칭 결합제를 침전시킬 수 있다. 도 4b의 분석 방법에 대한 분석 결과는 도 9b 및 도 9c에서 상세히 설명한다.
도 4c를 참조하면, 일 실시예에 따른 분석 방법은, 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 아미노산 서열을 선택하는 단계(미도시)를 포함할 수 있다. 상기 아미노산을 선택하는 단계에 관한 설명은 도 1a 내지 도 2에서 상세히 설명한 사항을 참조할 수 있다.
전처리 단계(S100'')는 항체(10)에 스위칭 결합제(100)을 제공하여 항체(10)와 스위칭 결합제(100)의 제 1 결합체(b1) 및 항체(10)와 결합되지 않은 스위칭 결합제(100)을 포함하는 혼합 용액을 얻는 단계(S110) 및 상기 혼합 용액으로부터 항체(10)와 결합되지 않은 스위칭 결합제(100)를 제거하는 단계(S120)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 혼합 용액을 탈염 컬럼(desalting column)에 통과시켜 상기 탈염 컬럼을 먼저 통과하는 결합되지 않은 스위칭 결합제를 제거하고, 상기 탈염 컬럼을 나중에 통과하는 제 1 결합체(b1)만을 획득할 수 있다. 전술한 방법은 예시적인 것으로, 상기 제 1 결합체와 스위칭 결합제(100)를 분리하기 위한 다양한 공지 기술들이 참조될 수 있다.
이후, 피분석물을 제공하는 단계로서, 항원 처리 단계(S200'')는, 항체(10)에 타겟 항원(20)을 결합시켜 제 1 결합체(b1)를 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리시키는 단계가 수행될 수 있다. 상기 타겟 항원(20)이 상기 항체(10)에 제공되는 경우, 타겟 항원(20)의 항체(10)와의 특이적 반응성에 의하여, 제 1 결합체(b1)에서 상기 항체(10)에 결합된 상기 스위칭 결합제(100)이 프레임워크 영역(FR, FR')으로 분리되어 용액 상으로 유리된다.
이후, 분석 단계(S300'')는, 항체(10)로부터 분리된 스위칭 결합제(130)와 타겟 항원(20)이 결합된 항체(10)의 제 2 결합체(b2)를 분리하는 단계(S310) 및 분리된 스위칭 결합제(130)를 정량하는 단계(S320)를 더 포함할 수 있다. 제 2 결합체(b2)와 분리된 스위칭 결합제(130)는 예시적으로, 단백질-A 컬럼(40)을 이용하여 분리될 수 있다. 이후, 분리된 스위칭 결합제(130)만을 선택적으로 획득하여 표지 반응을 통해 정량할 수 있다. 이때, 타겟 항원(20)의 농도가 높아짐에 따라 제 2 결합체(b2)와 분리된 스위칭 결합제(130)의 양이 증가하여 용액의 형광량이 증가한다.
일 실시예에서, 분석 단계(S300'')는 타겟 항원(20)의 농도의 증가에 따른 분리된 스위칭 결합제(130)의 양을 통해 항체 및 항원을 식별할 수 있는 검사 키트가 제공될 수 있다. 일 실시예에 따르면, 스위칭 결합제(100)를 이용한 상기 검사 키트는 면역 분석(immunoassay) 방식을 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 검사 키트는 루미넥스 분석, 단백질 마이크로어레이 분석, 엘리사(ELISA) 분석, 캡처-ELISA 분석, ELISPOT 분석, 방사선 면역 분석(RIA), 측방 흐름 면역 분석(lateral flow immunoassay: LFIA), 통과흐름 면역 분석(flow-through immunoassay: FTIA), 단백질 마이크로플루이딕(microfluidic) 면역 분석, 단백질 마크로플루이딕(microfluidic) 면역 분석, 단백질 모세관 전기영동 분석(capillary electrophoresis: CE), 면역 유전자증폭(immune-PCR) 분석, 전기 화학 바이오 센서, 방사 면역 침전 분석, 면역 침전 분석, 면역조직화학염색 분석, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산 분석, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역 전기 영동 분석, 조직면역 염색 분석, 보체 고정 분석, FACS 분석, 단백질 칩 분석, 면역 형광 염색 분석 및 면역 친화성 정제 분석 방식에 따라 응용될 수도 있다. 전술한 분석 방식은 예시적일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석용 키트들에 관하여 상용화된 분석 방법에 관한 설명이 적용될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 검사 키트는 자연적 또는 인위적인 표지 물질(200)이 표지된 스위칭 결합제(100)을 포함할 수 있다. 상기 표지 물질(200)에 관한 설명은 도 3을 참조할 수 있다.
일 실시예에서, 분석 단계(S300'')는 타겟 항원(20)의 농도의 증가에 따른 분리된 스위칭 결합제(130)의 양을 측정하여 항체(10)에 대한 타겟 항원(20)의 결합력을 측정할 수 있는 검사 키트를 제공할 수 있다. 상기 결합력 측정을 위해, 항체(10)의 항원 결합 계수(Kd)를 측정할 수 있다. 상기 항원 결합 계수(Kd)는 항원과 항체의 결합 상호 작용의 세기를 나타내는 평형 해리 상수일 수 있다. 상기 항원 결합 계수(Kd)가 클수록 타겟 항원(20)과 항체(10)의 결합 친화도가 높을 수 있으며, 항원의 농도가 높아짐에 따라 분리된 스위칭 결합제(130)이 형광 표지 반응하여 용액의 형광량이 증가하고, 이에 따른 농도별 측정을 통해 계산할 수 있다. 이에 따라, 항원-항체간 결합에 의해 유리되는 스위칭 결합제(100)의 양을 통해 항원-항체 간의 결합 계수와 통상의 방법으로 측정한 결합 계수 간의 차이로 결합의 강도를 알 수 있다.
일 실시예에서, 상기 검사 키트는 항체(10)이 고정되지 않은 용액 내에서 항원(20)의 항체(10)에 대한 결합력을 측정할 수 있는 검사 키트를 제공할 수 있다. 본 발명의 실시예를 따르면, 고체 지지체(30)에 항체(10)을 고정시키지 않고 용액 내에 포함된 항체(10)가 타겟 항원(20)을 결합할 때의 항원 결합 계수(Kd)를 측정하는 방법을 이용하는 것으로, 항체(10)를 고정시키는 단계가 생략될 수 있어, 측정의 신뢰도 및 정확도가 향상되는 이점이 있다. 따라서, 항체의 프레임워크 영역(FR, FR')에 가역적으로 결합하는 스위칭 결합제(100)를 사용하여 용액내에서 항체가 항원과의 결합 강도인 항원 결합 계수(Kd)를 측정하는 분석 방법을 통해, one-step 임뮤노어세이가 가능한 검사 키트의 개발도 가능하다.
다른 실시예에서, 상기 검사 키트는 자연적 또는 인위적인 표지 물질(200)이 표지된 스위칭 결합제(100)을 포함할 수 있다. 스위칭 결합제(100)와 표지 물질(200)에 관한 설명은 도 1a 내지 3을 참조할 수 있다. 도 4c의 분석 방법에 따른 분석 결과는 도 10a 내지 도 10d에서 상세히 설명한다.
도 5a는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1) 사이의 결합을 도시하고, 도 5b는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 아미노산 서열 간 특이적 결합을 도시하고, 도 5c는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)간 상호 작용을 부위별로 표시한 그래프이고, 도 5d는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)간 소수성 지수를 도시하는 도면이며, 도 5e는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)간의 FRET 분석 그래프이다.
도 5a를 참조하면, 일 실시예에서, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1) 간에 입체 구조를 이루며 상호 결합을 하고 있다. 즉, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)는 일직선으로 상호 작용하고 있지 않다. 따라서, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)의 하단과 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 상단 및 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)의 상단과 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 하단이 상호 작용하고 있다. 다른 실시예에서, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1) 간의 인접 부위의 결합은 4 Å 내지 8 Å 정도, 바람직하게는 3 Å 내지 6 Å 정도의 짧은 거리에서 작용할 수 있다. 스위칭 결합제(H2, L1) 사이 결합 거리를 통해, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2) 또는 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)와 자가 결합하여 상호 작용하는 프레임워크 영역(FR)도 마찬가지로, 구조적 특성상 인접 부위의 결합은 4 Å 내지 8 Å 정도, 바람직하게는 3 Å 내지 6 Å 정도의 짧은 거리에서 작용할 수 있다.
도 5b를 참조하면, 일 실시예에서, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 아미노산 서열 일부가 수소 결합을 일으킬 수 있다. 구체적으로, 도 5b에 도시된 것과 같이, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)는 V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K의 서열을 포함하며, 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)는 T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K의 서열을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 아미노산 서열에서, 주요하게 결합을 하는 제 1 항체 결합부(AB1) 또는 제 2 항체 결합부(AB2)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제 1 항체 결합부(AB1)로서, 서열번호 2의 펩타이드 서열(H2)의 아미노산 서열 중 3 번째 아미노산 서열인 Y와 18 번째 아미노산 서열 W는 아미노산의 side chain 기능기를 통해 상호 작용을 일으키며, 13 번째 아미노산 서열 I는 펩타이드 결합의 극성 부위와 상호 작용을 일으킬 수 있다.
다른 실시예에서, 경 쇄에서 추출된 아미노산 서열은 상기 경 쇄와 함께 상기 항원 결합 부위를 구성하는 중 쇄(VH)의 프레임워크 영역에 결합하는 제 2 항체 결합부(AB2)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제 2 항체 결합부(AB2)로서, 서열번호 3의 스위칭 결합제 서열(L1)의 아미노산 서열 중 6 번째 아미노산 서열 Y와 8 번째 아미노산 서열 Q의 사이드 체인 기능기를 통해 상호 작용을 일으키며, 14 번째 아미노산 서열 P와 16 번째 아미노산 L은 펩타이드 결합의 극성 부위와 상호 작용을 일으킨다. 따라서, 도면에 도시된 바와 같이, 빨간색으로 밑줄 표시된 아미노산은 사이드 체인 기능기를 통한 상호작용을 일으키며, 파란색으로 표시된 아미노산은 펩타이드 결합의 극성 부위 상호작용을 일으킬 수 있다. 다만, 이는 비제한적인 것으로, 도 1a에서 전술한 바와 같이, 상호 교차하여 결합하는 항체의 항원 결합 부위의 구조적 특성뿐만 아니라, 극성 또는 비극성 결합과 같은 다양한 결합에 의해 상호 결합하는 아미노산 서열로 추출된 경우를 모두 포함할 수 있다.
도 5c 및 도 5d를 참조하면, 일 실시예에서, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)간의 제 1 항체 결합부(AB1) 및 제 2 항체 결합부(AB2)는 아미노산의 side chain에 따른 소수성 지수(hydrophobiciy)를 가질 수 있다. 도 5c에서 소수성 지수가 양성인 부분의 경우 단백질의 안쪽에 위치하고 소수성이 음성인 경우 수용성이므로 단백질의 외부에 위치할 수 있다. 또한, 소수성 부분은 소수성 부분과 친수성 부분은 친수성 부분과 상호 작용을 일으킬 수 있다. 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 상단은 친수성이고, 하단은 소수성이다.
이에 따라, 친수성 부분과 소수성 부분은 성질이 같은 쪽에서 상호 작용을 일으키고, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)의 하단 및 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 상단과 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)의 상단 및 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 하단이 입체 구조 상 상호 작용할 수 있다. 따라서, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)는 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경 쇄(VL)의 LAR 부위(LAR)와 상호 작용할 수 있고, 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중 쇄(VH)의 HAR 부위(HAR)와 상호 작용할 수 있다. 입체 구조를 통해 관찰된 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)간의 4개의 수소 결합 위치의 아미노산을 입체 구조를 고려하여 상기 위치의 아미노산을 변조한다면 항체 결합 부위(15)의 결합력을 조절할 수 있는 이점이 있다.
도 5e를 참조하면, 일 실시예에서, 항체 결합 스위칭 결합제(100) 간의 상호 결합을 보여주는 FRET 실험 결과를 제공한다. 이는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)와 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)간의 상호 결합을 나타낸다. 이에 따라, 서열번호 2의 스위칭 결합제(H1)는 경 쇄(VL)의 LAR 부위(LAR)와 자가 결합하여 상호 작용할 수 있고, 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)는 중 쇄(VH)의 HAR 부위(HAR)와 자가 결합하여 상호 작용할 수 있다는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 중 쇄(VH)에서 추출된 아미노산 서열을 가지는 스위칭 결합제(100)는 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR)를 포함하는 항원 결합 부위(15)와 상호 결합할 수 있고, 경 쇄(VL)에서 추출된 아미노산 서열을 가지는 스위칭 결합제(100)는 중 쇄(VH)의 프레임워크 영역(FR)를 포함하는 항원 결합 부위(15)와 상호 결합할 수 있다는 점을 확인할 수 있다. 이러한 상호 결합 특성을 통해, 스위칭 결합제(100)가 프레임워크 영역(FR, FR')을 포함하는 항원 결합 부위(15)에 결합하여, 프레임워크 영역(FR, FR')간 상호 작용하는 것과 마찬가지의 효과를 얻을 수 있기 때문이다.
도 6a 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2) 사이의 결합을 도시하고, 도 6b는 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 아미노산 서열과 서열 내에서 특이적 결합을 도시하고, 도 6c는 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)간 상호 작용을 부위별로 표시한 그래프이고, 도 6d는 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)간 소수성 지수를 도시하며, 도 6e는 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)간 FRET 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a를 참조하면, 일 실시예에서, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2) 간에 입체 구조를 이루며 상호 작용을 하고 있다. 즉, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)는 일직선으로 상호 작용하고 있지 않다. 따라서, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)의 하단과 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 상단 및 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)의 상단과 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 하단이 상호 작용하고 있다. 다른 실시예에서, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2) 간의 인접 부위의 결합은 4 Å 내지 8 Å 정도, 바람직하게는 3 Å 내지 6 Å 정도의 짧은 거리에서 작용할 수 있다. 스위칭 결합제(H1, L2) 사이 결합 거리를 통해, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1) 또는 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)와 자가 결합하여 상호 작용하는 프레임워크 영역(FR, FR')도 마찬가지로, 구조적 특성상 인접 부위의 결합은 4 Å 내지 8 Å 정도, 바람직하게는 3 Å 내지 6 Å 정도의 짧은 거리에서 작용할 수 있다.
도 6b를 참조하면, 일 실시예에서, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 아미노산 서열의 일부가 수소 결합을 일으킬 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)는 S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E의 서열을 포함하며, 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)는 V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K의 서열을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 도 5b와 유사하게, 상기 아미노산 서열에서, 주요하게 결합을 하는 제 1 항체 결합부(AB1') 또는 제 2 항체 결합부(AB2')를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제 1 항체 결합부(AB1')로서, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)의 아미노산 서열 중 9 번째 아미노산 서열인 Q는 아미노산의 사이드 체인 기능기를 통해 상호 작용을 일으키며, 17 번째 아미노산 서열인 W는 펩타이드 결합의 극성 부위와 상호 작용을 일으킨다. 다른 실시예에서, 제 2 항체 결합부(AB2')를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제 2 항체 결합부(AB2')로서, 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 아미노산 서열 중 3 번째 아미노산 서열 Y의 사이드 체인 기능기를 통해 상호 작용을 일으키며, 12 번째 아미노산 서열 F는 펩타이드 결합의 극성 부위와 상호 작용을 일으킨다. 따라서, 도면에 도시된 바와 같이, 빨간색으로 밑줄 표시된 아미노산은 side chain 기능기를 통한 상호작용을 일으키며, 파란색으로 표시된 아미노산은 펩타이드 결합의 극성 부위 상호작용을 일으킬 수 있다.
도 6c 및 도 6d를 참조하면, 일 실시예에서, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)간의 아미노산의 사이드 체인(side chain)에 따른 소수성 지수(hydrophobiciy)를 가질 수 있다. 도 6c에서 소수성 지수가 양성인 부분의 경우 단백질의 안쪽에 위치하고 소수성이 음성인 경우 수용성이므로 단백질의 외부에 위치할 수 있다. 또한, 소수성 부분은 소수성 부분과 친수성 부분은 친수성 부분과 상호 작용을 일으킬 수 있다. 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 상단은 친수성이고, 하단은 소수성이다.
이에 따라, 친수성 부분과 소수성 부분은 성질이 같은 쪽에서 상호 작용을 일으키고, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)의 하단 및 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 상단과 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)의 상단 및 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 하단이 입체 구조상 상호 작용할 수 있다. 따라서, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)는 경 쇄(VL)의 LBR 부위(LBR)와 상호 작용할 수 있고, 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)는 중 쇄(VH)의 HBR 부위(HBR)와 상호 작용할 수 있다. 입체 구조를 통해 관찰된 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)간의 2개의 수소 결합 위치의 아미노산을 입체 구조를 고려하여 상기 제 1 항체 결합부(AB1') 또는 제 2 항체 결합부(AB2')의 아미노산 잔기를 변조한다면 항체 결합 부위의 결합력을 조절할 수 있는 이점이 있다. 다만, 이는 본 발명을 한정하는 것은 아니며, 중 쇄(VH)와 경 쇄(VL)가 수소 결합하며 상호 작용하는 부위에서 추출된 아미노산 서열을 갖는 스위칭 결합제(100)와 상기 중 쇄(VH) 또는 경 쇄(VL)의 프레임워크 영역(FR)을 포함하는 항원 결합 부위(15) 사이의 결합이라면 모두 포함할 수 있다.
도 6e를 참조하면, 일 실시예에서, 항체 결합 스위칭 결합제 간의 상호 결합을 보여주는 FRET 실험 결과를 제공한다. 이는 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)와 서열번호 4의 스위칭 결합제(H2)간의 상호 결합을 나타낸다. 이를 통해, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)는 경 쇄(VL)의 LBR 부위(LBR)와 상호 결합할 수 있고, 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)는 중 쇄(VH)의 HBR 부위(HBR)와 상호 결합할 수 있다는 것을 확인할 수 있다. 이러한 특성을 통해, 스위칭 결합제(100)가 프레임워크 영역(FR)에 결합하여, 프레임워크 영역(FR)간 상호 작용하는 것과 마찬가지의 효과를 얻을 수 있기 때문이다.
도 7a는 스위칭 결합제(100)별 항체-결합력 측정 결과를 도시하고, 도 7b는 농도에 따른 항체 결합 스위칭 결합제(100)의 결합력에 대한 SPR 분석 결과를 도시하며, 도 7c는 항체에 결합하는 스위칭 결합제(100)의 항체(10) Fab 부위 결합에 대한 결과를 도시하고, 도 7d는 항체(10)에 결합하는 스위칭 결합제(100)의 항체(10) Fab 부위 결합에 대한 다른 항원 및 단백질과의 비교 분석 그래프를 나타낸다.
도 7a를 참조하면, 스위칭 결합제(100)의 농도에 따른 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)의 형광량을 나타내는 그래프(A1), 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)의 형광량을 나타내는 그래프(A2), 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 형광량을 나타내는 그래프(A3) 및 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 형광량을 나타내는 그래프(A4)를 도시하고 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 스위칭 결합제(100)는 농도가 높아질수록, 형광량의 세기가 강해지는 경향을 확인할 수 있다. 이를 통해, 본 발명의 스위칭 결합제(100)가 항체(10)와 결합하여, 결합된 스위칭 결합제(100)의 정량에 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 스위칭 결합제(100)의 농도별 형광량 측정을 통해 항원 결합 계수(Kd)를 측정할 수 있다. 각각의 서열번호 1 내지 서열번호 4 스위칭 결합제(100)의 항원 결합 계수는 Kd(H1)=1.42 x 10-6 M, Kd(H2)=1.94 x 10-5 M, Kd(L1)=6.62 x 10-6 M 및 Kd(L2)=6.68 x 10-6 M로 계산되었다.
이를 통해 각 스위칭 결합제별, 타겟 항원(20)의 항체(10)에 대한 상대적 결합력을 산출하여 정량 하는 이점이 있다. 상기 형광 분석의 구체적인 실험 방법은 실시예 3에서 후술하기로 한다. 다만, 도 7a에서 도시하고 있는 상기 항원 결합 계수(Kd)는 지지체(30)에 의해 고정된 항체(10)에 대한 값을 나타내는 것이나, 이에 한정하지 않고, 용액 내에서 항체(10)가 타겟 항원(20)을 결합할 때의 항원 결합 계수(Kd)를 측정하는 것도 가능하며 이는 도 10a 내지 10d에서 상세히 설명하기로 한다.
도 7b를 참조하면, 일 실시예에서, 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance: SPR) 분석 결과를 확인할 수 있다. 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance: SPR)은 금과 같은 금속 박막 표면에 물질이 결합하였을 때 금속 표면의 굴절률이 변하게 되는 현상으로서 빛을 조사하였을 때 반사되는 빛 중 SPR 현상이 일어나는 공명각을 조사하면 금속 표면에 결합된 물질의 농도를 측정할 수 있는 기술로서, 농도별 스위칭 결합제(100), 본 실험 예에서는 결합제 중 펩타이드를 처리한 SPR 신호 결과 값을 도시한다.
구체적으로, SPR 신호 결과 값을 확인하기 위해, 항체(10)의 고정에 앞서 금 표면을 Mercaptoundecanoic acid(MUA)를 1 mM로 overnight 처리하고 표면 개질하였으며, Carbodiimide/N-Hydroxysuccinimide (EDC/NHS, 0.4 M/0.1 M)를 1:1 비율로 섞어 10 분 처리하여 작용기를 활성화하였다. 항체 고정은 항-HRP 항체를 항체 농도 50 μg/mL로 1.5 시간을 처리하여 준비하였다. 이후, Ethanolamine 농도 1 M로 10분 블로킹한 후에 사용하였다. 스위칭 결합제(100) 모두는 10 및 20 μM의 두가지 농도에서 각각 사용하여 30분 인큐베이션하여 처리하였고, SPR 신호의 측정은 1 % Tween-20 세척액을 1 분간 흘린 후 용액이 멈춘 상태에서 3 분간 SPR 신호를 측정하는 루틴을 3차례 반복하여 평균값으로 신호를 산정할 수 있다.
다만, 상기 실시예는 본 발명의 실시예를 한정하는 것은 아니며, 스위칭 결합제(100)의 결합력을 측정할 수 있는 방법을 모두 포함할 수 있다. 그래프에서 서열번호 1의 펩타이드의 SPR 신호(H1), 서열번호 2의 펩타이드의 SPR 신호(H2), 서열번호 3의 펩타이드의 SPR 신호(L1) 및 서열번호 4의 펩타이드의 SPR 신호(L2)에 대하여, 저농도인 10 μM를 좌측에 그래프(B1)으로, 고농도인 20 μM를 우측에 그래프(B2)로 도시하고 있다. 좌측에 그래프(B1)로 도시된 저농도인 10 μM에서의 펩타이드 처리 결과 SPR 신호는 서열번호 1의 펩타이드(H1) = 34.4±3.3 (9.6%) RU, 서열번호 2의 펩타이드(H2) = 51.5±5.6 (10.9%) RU, 서열번호 3의 펩타이드(L1) = 25.3±3.2 (12.5%) RU 및 서열번호 4의 펩타이드(L2) = 124.6±16.9 (13.6%) RU, 로 계산되었다.
우측에 그래프(B2)로 도시된 고농도인 20 μM에서의 펩타이드 처리 결과 SPR 신호는 서열번호 1의 펩타이드(H1) = 121.4±3.7 (3.1%) RU, 서열번호 2의 펩타이드(H2) = 192.0±1.8 (0.9%) RU, 서열번호 3의 펩타이드(L1) = 40.4±3.2 (7.9%) RU 및 서열번호 4의 펩타이드(L2) = 418.2±26.5 (6.4%) RU의 분석 결과를 확인할 수 있다. 이를 통해 항체의 항원 결합 부위의 아미노산 서열을 분석하여 합성한 서열번호 1 내지 서열번호 4의 펩타이드가 항체에 결합하는 것을 알 수 있고, 그 중 상대적으로 서열번호 4의 펩타이드가 가장 많이 결합한다는 점을 알 수 있다.
도 7c 및 도 7d를 참조하면, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)의 형광량을 나타내는 그래프(C1 D1), 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)의 형광량을 나타내는 그래프(C2, D2), 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)의 형광량을 나타내는 그래프(C3, D3) 및 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)의 형광량을 나타내는 그래프(C4, D4)를 도시하고 있다. 일 실시예에서, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)는 항체(10)의 단편 중 항원 결합 부위(15)를 포함하는 Fab 부위에만 결합함을 알 수 있다.
도 7c를 다시 참조하면, 일 실시예에서, 스위칭 결합제(100)는 항체(10)의 항원 결합 부위(15)에 결합할 수 있다. 구체적으로, 고체 지지체(30)에 고정된 항체(10)에 형광이 표지된 스위칭 결합제(100)를 결합시켰다. 항체 고정은 항-HRP 항체(10)를 항체 농도 10 μg/mL로 두 시간 처리하여 준비하였고, BSA 농도 8 mg/mL로 1 시간 블로킹을 한 후 사용하였다. 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)는 스위칭 결합제(100) 농도 10 μM로 1 시간 인큐베이션 처리하였고, 항체(10)의 Fab 부위와 Fc 영역의 분해를 위해 papain을 농도 250 μg/mL로 37 도에서 2시간 처리한 후, 용액에서의 형광량 변화를 측정하고, 고체 지지체(30)에 남은 형광량을 구별하여 측정하였다.
일 실시예에서, 바닥에서의 형광량(A)과 용액에서의 형광량(B)을 확인할 수 있고, 항체(10)의 Fab 부위와 Fc 부위를 분해하는 단백질 분해 효소인 papain으로 처리 후 스위칭 결합제(100)에 형광 측정을 한 결과, 형광량은 papain이 처리된 경우, Fc 부위가 고정된 바닥에서의 형광량(A)보다 분해되어 용액 속에 유리된 Fab 부위에서의 형광량(B) 더 높은 점을 확인할 수 있다. 즉, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)에 대해 항체 분해 효소인 papain 처리 전의 경우, 형광이 항체가 고정된 고체지지체(30)에서만 크게 관찰되는 것과 비교하여, papapin 처리 후의 경우, 항체(10)가 고정된 고체지지체에서 형광이 크게 감소하고 용액에서 크게 관찰되었다. 이를 통해, papain으로 분해되어 용액에 분포하는 Fab 영역에 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)가 결합되는 것이고, 고체 지지체(30)로 고정되어 있는 Fc 영역에선 결합하지 않는 것을 알 수 있다.
도 7d를 다시 참조하면, 일 실시예에서, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)는 항체(10)에만 선택적으로 결합할 수 있다. 구체적으로, 고체지지체(30)에 항체(10) 및 단백질의 고정을 위해 human IgG, rabbit IgG, goat IgG 및 mouse IgG를 항체농도 100 μg/mL로 overnight 처리하여 준비하였고, 고정단백질은 HBsAg, CRP, protein A를 각각 농도 100 μg/mL로 overnight 처리하여 준비하였다. 이후 BSA 농도 10 mg/mL로 1시간 블로킹한 후 사용하였다. 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)는 20 μM 농도를 각각 사용하여 1시간 인큐베이션하여 처리하였다.
도 7e를 참고하면, 형광이 표지된 서열번호 1 내지 서열번호 4의 펩타이드는 항원인 HBsAg 및 CRP와 단백질인 protein A에 비하여 항체인 human IgG, rabbit IgG, goat IgG 및 mouse IgG에 높은 형광량을 보이는 것을 확인하였다. 이는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)가 항체(10)에 선택적으로 결합한다는 점을 확인할 수 있다.
도 8a 내지 도 8d는 본 발명의 일 실시예 중 도 4a의 분석 방법에 따른 타겟 항원(20)의 분석 결과를 나타낸 그래프로, 도 8a는 항체(10)는 항-HRP 항체(10)이고, 타겟 항원(20)은 HPR 일 때, 도 8b는 항체(10)는 항-hCG 항체(10)이고, 타겟 항원(20)은 hCG 일 때, 도 8c는 항체(10)는 항-CRP 항체(10)이고, 타겟 항원(20)은 CRP 일 때, 도 8d는 항체(10)는 항-HBsAg 항체(10)이고, 타겟 항원(20)은 HBsAg 일 때, 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8a와 관련하여, 항-HRP 항체를 고체지지체에 농도 1 μg/ml로 overnight 처리하여 고정하고, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)를 각각 10 μM 농도(100 μl/well)로 2시간동안 처리하였다. 이때 바닥의 형광을 측정한 후, rabbit의 IgG 항체에 대한 분석물로 항원 HRP를 농도 10 μg/ml로 1시간 처리하였다. 도 8b와 관련하여, 항-hCG 항체를 고정지지체에 농도 1 μg/ml로 overnight 처리하여 고정하고, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)를 각각 20 μM 농도(100 μl/well)로 2시간동안 처리하였다. 이때 바닥의 형광을 측정한 후, mouse의 IgG 항체에 대한 분석물로 항원 hCG를 농도 100 μg/ml로 2시간 처리하였다.
도 8c와 관련하여, 항-CRP 항체를 고체지지체에 농도 1 μg/ml로 overnight 처리하여 고정하고, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)를 각각 20 μM 농도(100 μl/well)로 2시간동안 처리하였다. 이때 바닥의 형광을 측정한 후(A), rabbit의 IgG 항체에 대한 분석물로 항원 HRP를 농도 10 μg/ml로 1시간 처리하였다. 도 8d와 관련하여, 항-HBsAg 항체를 고체지지체에 농도 1 μg/ml로 overnight 처리하여 고정하고, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제(100)를 각각 20 μM 농도(100 μl/well)로 2시간동안 처리하였다. 이때 바닥의 형광을 측정한 후(A), goat의 IgG 항체에 대한 분석물로 항원 HBsAg를 농도 10 μg/ml로 1시간 처리하였다.
도 8a 내지 도 8d를 참조하면, 스위칭 결합제(100)는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 스위칭 결합제로, 특히, 결합제(100) 중 펩타이드를 이용하여 실험하였다. 도 8a 내지 도 8d에서 그래프 A는 전처리 단계(S100)에서 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 측정값, 그래프 B는 분석 단계(S300)에서 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)의 측정값, 그래프 C는 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)의 측정값일 수 있으며, 예시적으로, 스위칭 결합제(100)에 결합된 표지 물질(200)이 나타내는 표지 반응의 세기를 측정하여 정량하였다. 상기 표지 반응은 형광 반응일 수 있다. 전술한 물질들은 비제한적인 예시이며, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
도 8a 내지 도 8d를 참조하면, 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1), 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2), 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1) 및 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2)에서 모두 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 양(A)보다 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양(B)이 감소하였음을 알 수 있다. 또한, 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)의 양(C)이 측정됨을 알 수 있다. 이 결과, 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 양(A)에 대한 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양(B)의 감소량이 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)의 양(C)보다 큰 것을 알 수 있다.
이는, 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 양(A)은 지지체(30)의 면 상에서 관찰된 형광의 세기이나, 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)의 양(C)은 용액 상에서 관찰된 형광의 세기이기 때문이다. 이에 따라, 타겟 항원(20)이 항체(10)에 결합되는 경우, 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)는 프레임워크 영역(FR)으로부터 분리되어 용액상으로 유리됨을 알 수 있으며, 본 발명의 실시예에 따라, 전술한 바와 같이 전처리 단계(S100)에서 측정된 항체(10)에 결합된 스위칭 결합제(110)의 양과 분석 단계(S300)에서 프레임워크 영역(FR)에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양의 차이 값에 의한 타겟 항원(20)의 정량이 가능하다. 동시에, 프레임워크(FR)로부터 분리된 스위칭 결합제(130)의 양을 이용한 타겟 항원(20)의 정량이 가능하여, 타겟 항원(20)의 분석을 2 트랙(2 track)으로 수행할 수 있어, 분석의 신속도, 정확도 및 신뢰도를 향상시킬 수 있는 이점이 있다.
또한, 정량 분석을 위한 측정간 재현성을 산출하기 위해, 서열번호 3의 결합제(L1)를 이용하여, HBsAg 농도 3.4 μg/ml에서 8번 반복실험을 한 후, HBsAg의 농도가 0인 baseline에서의 값으로 노멀라이즈 하였다. 이때, 해당 농도에서의 측정값은 3.1 ± 9.3% (n=8)로 산출되었다. 상기 결과는 분석물인 항원(20) HBsAg가 포함된 시료를 goat IgG 항체에 처리하여 세척 없이 one-step 임뮤노어세이에 의한 분석물의 측정이 높은 재현성을 보인다는 점을 나타낸다.
도 9a 및 9b는 도 4b의 분석 방법에 따른 타겟 항원(20)의 분석 결과를 나타낸 분석 그래프이다.
도 9a 및 도 9b를 참조하면, 일 실시예에서, 도 9a는 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1), 도 9b는 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)를 이용한 비드 기반 항체 결합 원스텝 임뮤노어세이 결과를 보여준다.
일 실시예에서, 전처리 단계(S100')에서 항-인플루엔자 B 항체(10)를 비드에 고정시키고, 항원 처리 하단계(S200')에서 피분석물은 10 ng/Ml 농도의 CRP를 포함하거나, 10 ng/Ml 농도의 인플루엔자 B를 포함할 수 있다. 좌측 그래프(A)는 서로 다른 타겟 항원(200)들 즉, CRP, 인플루엔자 B를 포함하는 피분석물들의 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 분리된 스위칭 결합제(130)를 정량한 그래프이고, 우측 그래프(B)는 프레임워크 영역(FR, FR')에 결합된 잔량의 스위칭 결합제(120)를 정량한 그래프이다. 전술한 물질들은 비제한적 예시로서, 본 발명을 제한하지 않는다.
일 실시예에서, 피분석물이 인플루엔자 B를 포함하는 경우에 비하여 피분석물이 CRP를 포함하는 경우, 분리된 스위칭 결합제(130)의 양이 작고, 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양이 많은 것을 알 수 있다. 이는 피분석물이 인플루엔자 B인 경우, 상기 인플루엔자 B가 항-인플루엔자 B 항체(10)와 반응하여 스위칭 결합제(100)가 항체(10)의 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 해리되기 때문이다. 반면에, 피분석물이 CRP를 포함하는 경우에는 상기 CRP가 항-인플루엔자 B와 특이적으로 결합하지 않아 스위칭 결합제(100)가 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 해리되지 않는다.
일 실시예에서, 피분석물 내의 타겟 항원(20)의 농도가 높을수록 분리된 스위칭 결합제(130)의 양이 많을 수 있다. 또한, 피분석물 내의 타겟 항원(20)의 농도가 높을수록 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양은 적을 수 있다. 도 9a 및 도 9b를 참조하면, 피분석물들이 동일하게 타겟 항원(20)으로 인플루엔자 B를 포함하는 경우에, 상기 인플루엔자 B의 농도가 높을수록 분리된 스위칭 결합제(130)의 양이 많은 것을 볼 수 있다. 예를 들면, 상기 피분석물에 포함된 상기 인플루엔자 B의 농도가 100 ng/mL인 경우에, 농도가 10 ng/mL인 경우에 비하여 분리된 스위칭 결합제(130)의 양이 많을 수 있다. 이는 타겟 항원(20)의 농도가 높을수록 많은 양의 타겟 항원(20)들이 항체(10)와 특이적으로 반응하여, 더 많은 양의 스위칭 결합제(100)가 프레임워크 영역(FR, FR')으로부터 해리되기 때문이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 분리된 스위칭 결합제(130)의 양 및/또는 잔량의 스위칭 결합제(120)의 양을 측정함으로써, 피분석물 내에 포함된 타겟 항원(20)을 식별할 수 있을 뿐만 아니라, 정량 또는 농도 측정까지 가능한 분석 방법이 제공될 수 있다. 이를 통해, 도 9a에서 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1)을 이용한 비드 기반의 원스텝 임뮤노어세이가 가능하다는 점과, 도 9b에서 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1)을 이용한 비드 기반의 원스텝 임뮤노어세이가 가능하다는 점에 대해 확인할 수 있어, 고체 지지체뿐만 아니라, 비드를 이용해 정량적인 임뮤노어세이가 가능하다. 다만, 이는 비제한적인 것으로, 서열번호 1 및 서열번호 3의 아미노산 서열에 한정되는 것은 아니다.
도 10a 내지 도 10d는 본 발명의 일 실시예 중 도 4c의 분석 방법에 따른 타겟 항원(20)의 분석 결과를 나타낸 분석 그래프이다.
도 10a 내지 10d를 참조하면, 스위칭 결합제(100)는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 스위칭 결합제를 이용한 것으로, 도 10a는 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1), 도 10b는 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2), 도 10c는 서열번호 1의 스위칭 결합제(H1) 및 도 10d는 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)를 이용한 용액 내 항체의 항원 결합 계수를 측정한 결과를 보여준다. 일 실시예에서, 타겟 항원(20)은 HRP일 수 있고, 항체(10)는 항-HRP 항체(10)일 수 있다. 전술한 물질은 예시적인 것으로 본 발명을 한정하지 않는다.
일 실시예에서, 피분석물 내의 타겟 항원(20)의 농도를 증가시키면서 분리된 스위칭 결합제(130)의 양을 측정하고, 분리된 스위칭 결합제(130)의 양을 이용하여 항체(10) 항원 결합 계수(Kd)를 계산하였다. 상기 항원 결합 계수(Kd)는 타겟 항원(20)인 HRP의 양이 증가할수록 용액의 형광량이 증가하였다. 일 실시예에서, 상기 스위칭 결합제(100)의 상기 항원 결합 계수(Kd)는 1.2 ~ 2.9 x 10-6 M 일 수 있다. 바람직하게는, 도 10a에 도시된 서열번호 3의 스위칭 결합제(L1), 도 10b에 도시된 서열번호 4의 스위칭 결합제(L2) 및 도 10d에 도시된 서열번호 2의 스위칭 결합제(H2)의 항원 결합 계수(Kd)는 각각 8.9 x 10-7 M, 1.2 x 10-6 M 및 2.9 x 10-6 M의 값을 가질 수 있다. 이를 통해, 고체 지지체에 항체(10)를 결합한 후 항원 결합 계수(Kd)를 측정하는 도 4a의 방법과 달리, 본 발명에서 제공하는 키트가 용액 내에서 항체가 항원을 결합할 때의 항원 결합 계수(Kd)를 측정하는 방법을 제공하여, 항체의 항원 결합 부위에 가역적으로 결합하는 스위칭 결합제(100)을 이용하여 용액 내 항체의 항원 결합 계수(Kd)를 측정할 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명이 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것은, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
<110> OPTOLANE TECHNOLOGIES INC.
<120> Switching bonding agent, method of fabricating the same, and
pharmaceutical composition, assay kit, and method of analyzing
antigen and antibody using the same
<130> IN00300PCT
<150> KR 10-2019-0162707
<151> 2019-12-09
<150> KR 10-2020-0073508
<151> 2020-06-17
<150> KR 10-2020-0138705
<151> 2020-10-23
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 1
<400> 1
Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
1 5 10 15
Trp Ile Gly Glu
20
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 2
<400> 2
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Thr Gly Thr Gly Ile Tyr Phe Asp
1 5 10 15
Val Trp Gly Lys
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 3
<400> 3
Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Pro Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu
1 5 10 15
Leu Ile Tyr Lys
20
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide 4
<400> 4
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr Lys
1 5 10

Claims (45)

  1. 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)의 적어도 일 부분에 가역적으로 결합하고,
    상기 항체와 특이적으로 반응하는 타겟 항원이 상기 항체에 결합하는 경우, 상기 프레임워크 영역으로부터 분리되는 스위칭 결합제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 상기 항체의 3차원 구조에 의하여 상기 프레임워크 영역에 결합되는 스위칭 결합제.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 적어도 하나 이상의 상기 프레임워크 영역에 결합가능한 부분과 적어도 하나 이상의 상보성 결정 영역(complementarity determining regions; CDR)에 결합 가능한 부분을 포함하는 스위칭 결합제.
  4. 항체의 항원 결합 부위를 구성하는 중 쇄의 프레임워크 영역으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며,
    상기 아미노산 서열은 상기 중 쇄와 함께 상기 항원 결합 부위를 구성하는 경 쇄의 프레임워크 영역에 가역적으로 결합하는 제 1 항체 결합부를 포함하는 스위칭 결합제.
  5. 항체의 항원 결합 부위를 구성하는 경 쇄의 프레임워크 영역으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며,
    상기 아미노산 서열은 상기 경 쇄와 함께 상기 항원 결합 부위를 구성하는 중 쇄의 프레임워크 영역에 가역적으로 결합하는 제 2 항체 결합부를 포함하는 스위칭 결합제.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 아미노산 서열은 상기 중 쇄 또는 상기 경 쇄의 프레임워크 영역에 인접한 상보성 결정 영역에도 가역적으로 결합하는 스위칭 결합제.
  7. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 단백질, 압타머, 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display), 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 스위칭 결합제.
  8. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제의 아미노산 일부가 무기물로 치환된 스위칭 결합제.
  9. 제 4 항에 있어서,
    상기 제 1 항체 결합부는 -Y-, -I-, -W- 및 -Q- 중 적어도 어느 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 스위칭 결합제.
  10. 제 5 항에 있어서,
    상기 제 2 항체 결합부는 -Y-, -Q-, -P-, -L- 및 -F-중 적어도 어느 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 스위칭 결합제.
  11. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는
    서열번호 1: S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E
    서열번호 2: V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K
    서열번호 3: T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K
    서열번호 4: V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 스위칭 결합제.
  12. 제 4 항에 있어서,
    상기 제 1 항체 결합부는 상기 경 쇄의 프레임워크 영역과 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 및 이들의 조합 중 적어도 하나 이상에 의해 결합하는 아미노산 잔기를 포함하는 스위칭 결합제.
  13. 제 5 항에 있어서,
    상기 제 2 항체 결합부는 상기 중 쇄의 프레임워크 영역과 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 및 이들의 조합 중 적어도 하나 이상에 의해 결합하는 아미노산 잔기를 포함하는 스위칭 결합제.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 제 1 항체 결합부의 아미노산 변조에 의해 항체 결합 부위의 결합력의 조절이 가능한 스위칭 결합제.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 제 2 항체 결합부의 아미노산 변조에 의해 항체 결합 부위의 결합력의 조절이 가능한 스위칭 결합제.
  16. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    상기 수소 결합에 의해, 상기 스위칭 결합제와 상기 프레임워크 영역 사이에 사이드 체인(side chain) 기능기 결합 또는 펩타이드 결합의 극성 부위와 결합이 이루어지는 스위칭 결합제.
  17. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제가 상기 항체의 상기 항원 결합 부위에 결합된 경우,
    상기 항체와 특이적으로 반응하는 타겟 항원이 상기 항체에 결합함으로써, 상기 스위칭 결합제는 상기 항체로부터 분리되는 스위칭 결합제.
  18. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제의 상기 항체 결합부는 상기 중 쇄 또는 상기 경 쇄의 상기 항원 결합 부위에 4 Å 내지 8 Å 범위 내로 결합된 스위칭 결합제.
  19. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 자연적 또는 인위적인 표지 물질로 표지된 스위칭 결합제.
  20. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 인간 항체, 비인간 항체, 인간화된 비인간 항체 또는 이들의 조합과 결합하며,
    상기 스위칭 결합제가 상기 항체에 결합된 상태에서 상기 항체와 상기 타겟 항원의 결합이 가능한 스위칭 결합제.
  21. 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)들 중 적어도 일부 상기 프레임워크 영역에 가역적으로 특이적 결합하는 제 1 항체 결합부 또는 제 2 항체 결합부; 및
    상기 항체와 특이적으로 반응하는 타겟 항원이 상기 항체에 결합하는 경우, 상기 항체 결합부를 상기 프레임워크 영역으로부터 분리되도록 상기 제 1 항체 결합부 또는 상기 제 2 항체 결합부의 상기 프레임워크 영역에 대한 결합력을 조절하는 결합력 조절부를 포함하는 스위칭 결합제.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 결합력 조절부는 상기 스위칭 결합제 내에서 상기 제 1 항체 결합부 또는 제 2 항체 결합부의 위치 또는 상기 스위칭 결합제의 입체적 형상을 변조하여 상기 항체에 대한 상기 항체 결합부의 결합력을 조절하는 스위칭 결합제.
  23. 제 21 항에 있어서,
    상기 결합력 조절부는 상기 결합력 조절부는 -S-Y-W-I-H-W-V-K-, -R-P-G-Q-G-L-E-, -I-G-E-, -V-Y-, -C-A-R-E-P-T-G-T-G-, -Y-F-D-V-, -G-K-, -T-Y-L-E-W-Y-, -K-P-G-Q-S-, -K-, L-I-Y-K-, -C-F-Q-G-S-H-V-P- 및 -T-K-의 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 스위칭 결합제.
  24. 제 21 항에 있어서,
    상기 제 1 항체 결합부 또는 상기 제 2 항체 결합부와 상기 결합력 조절부를 단위 구조체로 포함하여 상기 항체 결합부와 상기 결합력 조절부가 교번하여 연속적으로 결합된 스위칭 결합제.
  25. 제 4 항 또는 제 5 항에 기재된 스위칭 결합제를 포함하는 질병 스크리닝, 진단, 예방 또는 치료 통합의 약학 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 단백질, 압타머 및 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display), 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 질병 스크리닝, 진단, 예방 또는 치료 통합의 약학 조성물.
  27. 제 25 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는
    서열번호 1: S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E
    서열번호 2: V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K
    서열번호 3: T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K
    서열번호 4: V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 질병 스크리닝, 진단, 예방 또는 치료 통합의 약학 조성물.
  28. 제 4 항 또는 제 5 항에 기재된 스위칭 결합제를 포함하고,
    상기 스위칭 결합제는 자연적 또는 인위적인 표지 물질로 표지되며,
    상기 스위칭 결합제가 프레임워크 영역에 결합 및 분리되는 양을 측정하여 항체에 대한 항원의 결합력을 측정하는 검사 키트.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 단백질, 압타머 및 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display), 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 검사 키트.
  30. 제 28 항에 있어서,
    상기 결합력은 항체의 항원 결합 계수(Kd)의 산출을 통해 측정되는 검사 키트.
  31. 제 29 항에 있어서,
    상기 항원 결합 계수(Kd)는 0.7 x 10-6 M 내지 3.4 x 10-6 M의 범위를 포함하는 검사 키트.
  32. 제 29 항에 있어서,
    상기 검사 키트는 상기 항체가 고정되지 않은 용액 내에서 상기 항체가 항원과 결합할 때의 항원 결합 계수(Kd)를 측정하는 검사 키트.
  33. 제 4 항 또는 제 5항에 기재된 스위칭 결합제를 포함하고,
    상기 스위칭 결합제는 자연적 또는 인위적인 표지 물질로 표지되며,
    상기 스위칭 결합제가 프레임워크 영역에 결합 및 분리되는 양을 측정 항체 및 타겟 항원을 식별 또는 정량하는 검사 키트.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 검사 키트는 면역 분석용(immunoassay) 키트로서,
    상기 면역분석용 키트는 루미넥스 분석, 단백질 마이크로 어레이 분석, 엘리사 (ELISA) 분석, 면역-PCR 분석 (immune-PCR), 캡처-ELISA 분석, ELISPOT 분석, 방사선 면역 분석(RIA), 측방 흐름 면역 분석(lateral flow immunoassay: LFIA), 통과흐름 면역 분석(flow-through immunoassay: FTIA), 단백질 마이크로플루이딕(microfluidic) 면역 분석, 단백질 마크로플루이딕(microfluidic) 면역 분석, 단백질 모세관 전기영동 분석(capillary electrophoresis: CE), 전기 화학 바이오 센서, 방사 면역 침전 분석, 면역 침전 분석, 면역조직화학염색 분석, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산 분석, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역 전기 영동 분석, 조직면역 염색 분석, 보체 고정 분석, FACS 분석, 단백질 칩 분석, 면역 형광 염색 분석 및 면역 친화성 정제 분석 키트인 검사 키트.
  35. 항체의 항원 결합 부위를 구성하는 프레임워크 영역으로부터 스위칭 결합제의 아미노산 서열을 선택하는 단계;
    타겟 항원과 특이적으로 결합하는 항체에 상기 스위칭 결합제를 제공하여 상기 항체의 프레임워크 영역(framework region: FR)의 적어도 일부분에 가역적으로 결합시키는 전처리 단계;
    상기 전처리 단계의 결과물 내에 상기 타겟 항원을 포함하는지 여부의 판단이 필요한 피분석물을 제공하는 단계; 및
    상기 프레임워크 영역에 결합된 잔량의 스위칭 결합제 또는 상기 프레임워크 영역으로부터 분리된 스위칭 결합제 중 적어도 어느 하나를 정량하여 상기 피분석물 내에 상기 타겟 항원을 식별 또는 정량 분석하는 분석 단계를 포함하는 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 단백질, 압타머, 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display) 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법.
  37. 제 35 항에 있어서,
    상기 항체는 기판, 비드(bead), 섬유, 고분자 구조체 또는 이들의 조합인 지지체에 고정된 분석 방법.
  38. 제 35 항에 있어서,
    상기 항체는 고정되지 않고, 용액에 용해된 상태인 분석 방법.
  39. 제 35 항에 있어서,
    상기 전처리 단계는,
    상기 항체에 상기 스위칭 결합제를 제공하여 상기 항체와 상기 스위칭 결합제의 제 1 결합체 및 상기 항체와 결합되지 않은 스위칭 결합제를 포함하는 혼합 용액을 얻는 단계; 및
    상기 혼합 용액으로부터 상기 항체와 상기 결합되지 않은 스위칭 결합제를 제거하는 단계를 포함하는 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법.
  40. 제 35 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 자연적 또는 인위적 표지 물질로 표지되고,
    상기 분석 단계에서,
    상기 타겟 항원의 분석은 상기 표지 반응을 측정하여 이루어지는 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법.
  41. 제 35 항에 있어서,
    상기 분석 단계는,
    상기 항체로부터 분리된 스위칭 결합제와 상기 항체와 상기 타겟 항원의 제 2 결합체를 분리하는 단계; 및
    상기 분리된 스위칭 결합제를 식별 또는 정량하는 단계를 더 포함하는 스위칭 결합제를 이용한 분석 방법.
  42. 항체의 프레임워크 영역(framework region: FR)에 가역적으로 특이적 결합하고, 상기 항체와 특이적 반응하는 타겟 항원이 결합되는 경우, 상기 프레임워크 영역으로부터 분리되는 스위칭 결합제의 제조 방법으로서,
    상기 항체의 중 쇄 및 경 쇄의 상기 프레임워크 영역이 서로 자가 결합하는 아미노산 서열 확인하는 단계;
    상기 아미노산 서열의 소수성 지수를 얻는 단계; 및
    상기 소수성 지수를 비교하여, 상기 중 쇄 및 상기 경 쇄의 항원 결합 부위를 구성하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열간 동일한 성질을 가지는 부분의 상기 아미노산 서열을 포함하는 스위칭 결합제를 선택하는 단계를 포함하는 스위칭 결합제 제조 방법.
  43. 제 35 항에 있어서,
    상기 아미노산 서열은 상기 프레임워크 영역에 인접한 상보성 결정 영역을 포함하는 스위칭 결합제 제조 방법.
  44. 제 35 항에 있어서,
    상기 스위칭 결합제는 펩타이드, 압타머, 단백질, 나노바디(nanobody), 파지 디스플레이(phage display), 이스트 디스플레이(yeast display) 및 항체로부터 구성된 군에서 선택되는 스위칭 결합제 제조 방법.
  45. 제 35 항에 있어서,
    상기 아미노산 서열은 정전기 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 및 이들의 조합 중 적어도 하나 이상에 의해 결합하는 스위칭 결합제 제조 방법.
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