WO2021108932A1 - Composición rica en polifenoles y flavonoides para uso como bioestimulante y antimicrobiano de aplicación en agricultura - Google Patents

Composición rica en polifenoles y flavonoides para uso como bioestimulante y antimicrobiano de aplicación en agricultura Download PDF

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WO2021108932A1
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Allison LEYTON
Daniela VAISMAN
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Botanitec Spa
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention provides compositions with biostimulant action made from plant extracts, preferably berry leaves.
  • the composition prepared according to the present invention makes it possible to prepare formulations for use in agricultural crops and has antimicrobial activity against various pathogens.
  • biostimulants which complement the nutrition and protection of crops, and which correspond to any substance or microorganism that, when applied to plants, is capable of improving their effectiveness. in the absorption and assimilation of nutrients, its tolerance to biotic or abiotic stress or other agronomic characteristics, regardless of the nutrient content of the substance. Products that contain mixtures of these substances or microorganisms are also considered a plant biostimulant.
  • Biostimulants include various formulations for use directly on plants or trees, or to be applied to soils or irrigation water to regulate and improve crops through various ways, making them more efficient, resistant and of better quality.
  • Biostimulants are also compatible with agricultural and food practices that promote a low environmental impact of crops, in conjunction with offering healthy food products.
  • biostimulants help fertilizers to be more effective, providing essential elements to crops to make them more resistant.
  • biostimulant products there are substances, microorganisms or mixtures of them, which are classified into the following categories: humic and fulvic acids; protein hydrolysates, amino acids and peptide mixtures; seaweed and plant extracts; chitosans and other biopolymers; inorganic compounds; as well as beneficial fungi and bacteria, among others.
  • it is essential to dispense with chemical synthesis compounds, because modern agriculture is tending to eliminate the use of these compounds due to their effects on the environment, on cultivated plants and eventually, on human health.
  • document W02010051814A1 although it is a product for the food industry and not a biostimulant for plants, it is indicated that it corresponds to an extract in water, alcohol or a mixture of them, for use as a natural additive obtained from of leaves or fruits of various species of berries, due to their content of polyphenols, tannins and other compounds with antioxidant, anti-inflammatory, antibacterial and antiviral properties.
  • the invention described in the document being directed to an antioxidant additive for use in food, does not suggest biostimulant actions in plants, it is a nutritional supplement with action as a growth promoter for use in food for domestic animals, characterized by the presence of tannins, compounds absent in the present invention.
  • Document CN105497101A describes a methodology where extracts are made from blueberry stems or leaves, which can be fresh or previously dried and crushed. It would be a low-cost process, however, the process contemplates extraction with ethanol, extraction with water, enzymatic hydrolysis, macroporous resin adsorption, membrane separation and use of ultrasound or microwaves. The process disclosed therein may be performed using an extraction in purified or deionized water at 50-60 Q C, performing extraction 2-3 times, followed by ultrafiltration, dialyzed and lyophilized.
  • the extracts described in this publication are directed to applications in the food and cosmetic industry, indicating that blueberry leaves contain polyphenols and flavonoids, with no suggestion of applications in other industries and even less of the potential as biostimulant or antimicrobial activity.
  • publication US4309207 presents an extract that can be obtained from blueberry leaves, among others, although the expected effect of this extract is the inhibition of plant growth, particularly to inhibit the germination of seeds, the growth of seedlings and fungi (that is, it would have potentially fungicidal action).
  • the extraction is carried out with acetone and water, followed by numerous steps such as evaporation, acidification, washing, dissolution, for which a particular component profile would be expected. Therefore, since it is a composition aimed at inhibiting growth, it would not be obvious to use it as a biostimulant in plants.
  • the process to prepare the inhibitor extract contemplates its acidification, treatment with acetate, washing, separation of organic and aqueous phases, evaporation and dissolution in solvent.
  • blueberry leaf extracts are described that are aimed at eliminating free radicals, where the importance of this use focuses on avoiding damage to tissues and cells of the body that could cause chronic diseases and aging.
  • the extraction process although initially it corresponds to an aqueous extraction, where the leaves are pulverized and mixed with hot water (decoction), has additional steps of concentration in macro-porous resin and elution with ethanol.
  • the eluted fraction is the one that shows the ability to sequester free radicals.
  • an extract made of plant material preferably the fruit, enriched in polyphenols and flavonoids is presented and, although an aqueous sample is mentioned, the extract is made with at least one stage that requires the use of an organic phase .
  • the uses for the extract are related to the inhibition of bacterial adherence on various surfaces and for various industries, but especially focused on oral care (rinses).
  • the preferred plant material corresponds to cranberries, although it is indicated that the material could be a blueberry fruit, the possibility of making extracts from the leaves is not explicitly identified. There is also no explicit mention for its use in plants, even less as a biostimulant.
  • compositions such as that shown by Bulgari et al. (2017), where biostimulants for use in plants are described to improve growth, increasing the yield and quality of the plants.
  • Borage extract was used that was sprayed on lettuce plants, improving various parameters, including biomass production, chlorophyll and the content of phenols and flavonoids, it is indicated that the levels of calcium and phenolic compounds in the extracts were measured.
  • Borage extracts are made from flowers or leaves, which are crushed and macerated in water for 25 days at room temperature and in the dark, being subsequently filtered and diluted in water for foliar application. Berries or their leaves are not used in this document, but a composition based on borage is used exclusively.
  • document US4308047A presents a method for applying an aqueous extract using previously dried oak leaves that are boiled in water to extract the soluble components.
  • the extract is used as a biostimulant, indicating that it would contain tannins and natural waxes from oak leaves. Although it is indicated that it can be applied to clean the leaves of plants or the root, it is not explicitly mentioned that it can be used as a foliar biostimulant. It is further noted that the product can be used to clean various surfaces. Since there is no reference to blueberry leaves, this document would not affect the novelty of the invention.
  • FIG. 1A Results of Test 1A, in which the effect of the composition of the invention on the yield of hydroponic lettuce type Lo lio bionda cv. Dabi subjected to abiotic stress (poor growth).
  • the trial had 7 treatments of 6 applications each: Control treatment without application (T0); biostimulant based on Macrocystis pyrifera A at 3 L / ha (TI) and 1.5 L / ha (T2); biostimulant based on Macrocystis pyrifera B at 3 L / ha (T3) and 1.5 L / ha (T4); and the composition of the invention at 3L / ha (T5) and at 1.5 L / ha (T6).
  • Figure 1A shows the results of the fresh weight of the plants in grams
  • Figure IB shows the percentages corresponding to the dry weight on the fresh weight. Different letters indicate significant differences (p value ⁇ 0.05).
  • Figure 2 Results of Test 2, in which the effect of the composition of the invention on the yield and size of blueberries cv. Duke. The trial had 2 treatments: Control treatment without application (T0); and 3 applications of the composition of the invention at 3 L / ha (TI).
  • Figure 2A shows the quantification of the total crop yield in kg / ha
  • Figure 2B shows the yields in the 5 harvest dates in percentage yield with respect to the total harvest
  • Figure 2C shows the average size of the fruits for the first 4 harvest dates (mm of the equatorial diameter of the fruit).
  • Figure 4 Results of Test 4, in which the effect of the composition of the invention on the yield and quality of hydroponic lettuce type Lo lio bionda cv. Dabi subjected to heat stress.
  • the applications were made the day before the stimulus (50 ° C for 4 hours).
  • the trial had 3 treatments: Control treatment without application (T0); 1 application of a commercial composition based on Ascophyllum nodosum at 3 L / ha (TI) and 1 application of the composition of the invention at 3 L / ha (T2).
  • Figure 4A shows the fresh weight (g); in Figure 4B, the dry weight (g); and in figure 4C, recovery from dehydration at week 1 post stress (%).
  • Results of Test 5 in which the effect of the composition of the invention on the yield and quality of hydroponic lettuces type Lo lio bionda cv. Dabi subjected to cold stress.
  • the applications were made the day before the stimulus (-3 ° C for 4 hours).
  • the trial had 3 treatments: Control treatment without application (T0); 1 application of a commercial composition based on Ascophyllum nodosum at 3 L / ha (TI) and 1 application of the composition of the invention at 3 L / ha (T2).
  • Figure 5A shows the fresh weight (g); in Figure 5B, the difference in fresh weight of each treatment versus T0 (%);
  • Figure 5C the dry weight (g); and in Figure 5D, the chlorophyll concentration (nmol / mg dry weight).
  • Results of Test 6 in which the effect of the composition of the invention on the yield and quality of hydroponic lettuce type Lo lio bionda cv. Dabi compared to other natural and synthetic compositions.
  • the trial had 6 treatments of 6 applications at 3L / ha each: Control treatment without application (T0); Composition of the Invention (TI); Composition 1 (same raw material, different process than the invention) (T2); Synthetic (synthetic composition based on gallic acid) (T3); Biortig (T4); and Composition 2 (same process, different raw material than the invention) (T5).
  • Figure 6A shows the fresh weight (g); in Figure 6B, the dry weight relative to the fresh weight (%); and in Figure 6C, the chlorophyll concentration (nmol / g dry weight).
  • Figures 6D and 6E show photographs of T0 and TI respectively of the samples at day 21 at 5 ° C, corresponding to the quantification of postharvest dehydration.
  • Figure 7 Inhibitory effect of the composition of the invention on Escherichia coli.
  • Figure 7A shows the effect of the composition of the invention at a concentration of 100%; and
  • Figure 7B shows the positive control corresponding to 0.1 g / L Ampicillin.
  • the test had 5 treatments of 2 applications of the composition of the invention with a dilution of 2%: Control treatment without application (T0); without Bio-3 (TI); with Bio-3 at 25% (T2); with Bio-3 at 50% (T3); and with Bio-3 at 100% (T4).
  • Figure 8A shows the height of the seedling (cm) and the diameter of its stem (mm); in Figure 8B, the fresh weight of the aerial part of the seedling (g) and its root (g); and in Figure 8C, the number of leaves and the length of the seedling root (cm).
  • the invention provides a composition based on plant extracts, rich in antioxidants, carbohydrates, proteins and micronutrients, essential for the growth and protection of plants against abiotic stress, minimizing their effect, favoring their recovery, quality and plant growth and its fruits.
  • the effect of the composition applied in vegetables and fruit trees allows to increase the yield in dry, fresh weight of the plant and / or the rooting of plants, and may even increase the size and general quality of the plant or fruits.
  • fresh weight in the context of the present invention is understood as the total weight of a fresh plant just harvested; it can also be considered as the wet weight of the plant under ambient conditions (ambient temperature and atmospheric pressure).
  • dry weight will be understood as the total weight of the plant after removing the water content, for example, oven or oven dried.
  • the process of preparing the composition made from vegetables comprising berry leaves (preferably blueberry leaves) according to the invention is done with leaves previously dried in the shade or in the sun, in a stove, by microwave, by air. cold or hot, or by lyophilization; in a temperature range between 15-100 ° C, for 0.5 to 96 hours, and ground using a milling equipment by blades, fluted discs, hammer, crushers or combinations of them.
  • the process comprises the following stages: a) mixing the dried berry leaves with water in a ratio by weight of solid: liquid between 1: 1 to 1:50 where the water is at a temperature between 20 and 90 ° C; b) stir the mixture at 50 to 800 rpm for 0.5 to 12 hours; c) optionally incorporating preservative or preservative additives and stabilizers while continuing to stir; d) stir the mixture at 50 to 800 rpm for up to an additional 30 min; e) separating the solids and remains of dry leaves from the aqueous portion, where the separation is carried out by filtration, being able to additionally use decantation and / or centrifugation.
  • this can be through filters made of paper, cloth, gauze, casing type, stainless steel, membrane, porcelain, plastics, steel or cross-flow filtration; and f) adjusting the concentration of total polyphenols between 4 and 12 g / L of the composition.
  • the weight ratio of dried berry leaves to water is between 1: 1 to 1:20, more preferably between 1: 5 to 1:10.
  • the extraction is carried out at a temperature between 20 and 80 ° C, preferably between 25 and 65 ° C, more preferably between 40 and 60 ° C.
  • the extraction is carried out during an extraction time between 1 to 3 hours.
  • an extraction time between 1 to 3 hours.
  • the elaborated composition is rich in antioxidants, carbohydrates, proteins and micronutrients.
  • the composition prepared has as major compounds flavonols, flavones, hydroxycinnamic acids, benzoic acids and phenols.
  • flavonols and flavones are:
  • micronutrients and components present in a composition made according to the present invention are:
  • the resulting composition is prepared in such a way as to achieve a concentration of total polyphenols between 4 and 12 g / L. Although it might be necessary to concentrate the composition, in general the product could exceed the indicated range, so in this case it could be diluted to the desired concentration in water and / or in an aqueous solution to dilute that includes preservatives or preservatives and stabilizers. .
  • a concentrated composition could be made for use with increased antimicrobial effect.
  • additives can be added to the finished product composition and / or formulation, such as: • Stabilizers, comprising vegetable gums such as, for example, gellan gum, arabic, xanthan, garrotin, guar, tragacanth, karaya and tara, and in general any admissible gum according to the food regulation. They allow to improve the adherence of the product, for example, in foliar application. An additional advantage of the use of gums is that they also have an action as a preservative or preservative.
  • Stabilizers comprising vegetable gums such as, for example, gellan gum, arabic, xanthan, garrotin, guar, tragacanth, karaya and tara, and in general any admissible gum according to the food regulation. They allow to improve the adherence of the product, for example, in foliar application.
  • An additional advantage of the use of gums is that they also have an action as a preservative or preservative.
  • Preservatives or preservatives such as sodium benzoate, potassium sorbate, calcium sorbate, salts of sorbate and organic acids such as propionic acid, lactic acid, citric acid, ascorbic acid and acetic acid; to improve the stability and durability of the product.
  • the additives are generally used in a concentration between 0.01 and 5% w / v each.
  • composition according to the present invention can comprise the supplementation of compounds necessary for plant growth, such as, for example:
  • Micronutrients such as iron, manganese, copper, zinc, boron, molybdenum, chlorine.
  • the concentration of each compound is up to 50% w / v in the case of macronutrients; up to 20% w / v in the case of secondary nutrients; and up to 10% w / v in the case of micronutrients.
  • compatibility analyzes of the invention with various agrochemicals were carried out. Tests were carried out with copper-based agrochemicals, insecticides and fungicides, showing that the composition of the present invention in combination with said compounds does not generate physicochemical changes (temperature, pH, precipitation, coloration, etc.), which is why it is shown that the composition is compatible with other agrochemicals.
  • compositions according to the invention can be used in agriculture as biostimulant and / or antimicrobial in formats such as: formulations for foliar application formulations for root application formulations for irrigation.
  • composition of the invention is carried out by any method available in the art, such as: spraying, application in furrows, in hydroponic crops, soaking of plant material, on wounds from pruning cuts, direct incorporation into soils or mixtures of sowing in a greenhouse, pots, field, or direct treatment of seeds, propagation material or grafts.
  • a composition according to the present invention can be used periodically to increase the yield, quality, rooting and / or size of the plant and / or fruit, and can also be used before, during or after the condition has occurred. of stress, to promote your recovery. In a preferred embodiment of the invention, it is used before the plant is exposed to stress conditions, since it is the moment when it is observed that the plant achieves a protective effect against adverse conditions.
  • composition of the invention can be used in a wide range of agricultural crops, especially vegetables and fruit trees, such as: blueberries, vines, cherry trees, apple trees, hazelnuts, walnuts, citrus fruits, lettuces, tomatoes, potatoes, among others.
  • Example I Process Conditions. Extraction tests varying operating conditions: temperature, solute: solvent ratio and extraction time.
  • Extractions were carried out by making variations of some parameters in order to prepare a composition with the maximum content of total polyphenols, without sacrificing the antioxidant concentration.
  • the temperature variations were in the range between 25 to 65 ° C for extractions between 1 to 3 hours.
  • the water ratio ranged from 1: 5 to 1:15. The results obtained are shown in Table I.
  • Table II Results of concentration of total polyphenols (PT), concentration of antioxidants (CA), total sugars (AT) and suspended solids (SS) for various extraction conditions. Evaluation of 15 tests with different combinations of process conditions: temperature, solid: liquid ratio and extraction time.
  • Example II Composition. Total content of polyphenols, flavanols and anthocyanins, as well as a polyphenolic profile of 2 types of samples.
  • Table 111 Content of total polyphenols (PT), total flavanols (FT) and total anthocyanins (AT) in early and late samples.
  • Early Composition composition of the invention from leaves harvested in an early season; Late Composition: composition of the invention from leaves harvested in late season.
  • Early Composition composition of the invention from leaves harvested in an early season; Late Composition: composition of the invention from leaves harvested in late season.
  • Table 113 Total polyphenols in sample without analytical extraction.
  • a composition batch was made using 500 g of berry leaves, where 80% of them are blueberry leaves, which were dried in the shade for 72 hours.
  • the mixture was kept at 50 ° C with stirring at 250 rpm for 3.5 hours.
  • 0.2% citric acid and 0.05% w / v xanthan gum were added, maintaining stirring between 200 and 250 rpm for an additional 30 minutes, without heating.
  • the solids were separated using a paper filter, rescuing the aqueous fraction, at which the concentration of total polyphenols was measured.
  • Example IV Preparation of a composition with blueberry leaves (100%).
  • a composition batch was made using 500 g of blueberry leaves which were dried in the shade for 72 hours.
  • the dried leaves were mixed with water in a ratio of 1: 5 by weight, with 2.5 L of water at a temperature of 65 ° C.
  • the mixture was kept at 65 ° C with stirring at 200 rpm for 4 hours. Then stirring was maintained at 200 rpm for 20 minutes, without heating.
  • Solids were removed using a shell type filter, separating the aqueous fraction.
  • the concentration of total polyphenols was measured, obtaining 8.41 g / L.
  • the composition was diluted with water until reaching a concentration of 6 g / L of total polyphenols.
  • Example V Composition. Quantification of the compounds of the composition of the invention.
  • composition is free of heavy metals (undetectable range according to the analytical techniques used).
  • Example 1 Performance and quality. Field trials on lettuce.
  • Test 1A A first test (Test 1A) was carried out to evaluate the effect of the foliar application of the present invention on the yield in fresh weight, dry weight and chlorophyll levels in hydroponic lettuces type LoHo bionda cv. Dabi.
  • the plants were subjected to abiotic stress (poor growth), and applications of various treatments were made (T).
  • a hydroponic lettuce garden was selected, the one that presented specimens with poor growth and early death, due to fertilization problems, generating abiotic stress.
  • the stimulus consisted of the nutrient solution presented a pH 3.8 (ideal pH 6.0) and high electrical conductivity (3,000 pS / cm), the ideal being 250 to 750 pS / cm.
  • the culture system used was hydroponics in NFT.
  • Test 1A The test was carried out using 7 treatments (of 25 lettuces each). A summary of Test 1A is shown in Table 1A.
  • Table IB Quality variables of lettuce from Trial 1A. Different letters indicate significant differences (p value ⁇ 0.05).
  • CieLAB scale index A negative values indicate greater intensity of green.
  • treatments T5 and T6 presented a fresh weight between 37.5 and 40% higher compared to treatment T0 (control, without application) and a dry weight between 46.6 and 59.5% higher compared to T0 treatment.
  • treatments T5 and T6 presented an increase of 30 and 17% in the chlorophyll levels of the plant, respectively, compared to treatment T0.
  • Trial IB lettuces (Trial IB), which had similar conditions, using a fixed dose of 3L / ha for all treatments, where a commercial control based on Ascophyllum nodosum was incorporated.
  • a summary of Trial IB is shown in Table 1C.
  • CieLAB scale index A negative values indicate greater intensity of green.
  • Example 2 Yield and gauge. Field trials on blueberries.
  • Trial 2 evaluated the effect of the foliar application of the composition of the present invention on the yield and size of the fruits corresponding to blueberries cv. Duke, which had a completely randomized design composed of 2 treatments with 8 repetitions of 5 plants each. A summary of Trial 3 is shown in Table 2A.
  • Figure 2A the crop yield of the different treatments is quantified in kg / ha.
  • Figure 2B shows the percentage of harvest distribution in the different blooms with respect to the total harvest, for each of the first 4 blooms. From these figures it is observed that the use of the composition of the invention (TI) increased the yield by 17%, promoting the harvest concentration.
  • TI composition of the invention
  • Figure 2C shows the effect of the treatments on the size of the fruits, where TI increased the size by 10% with respect to T0, generating a change in the category of the fruit: from medium size to large size (understanding that the small caliber is 6 to 8 mm, medium 8 to 11 mm and large greater than 12 mm).
  • Example 3 Gauge. Field trial in apples.
  • Test 3 A test was carried out (Test 3) to evaluate the effect of the foliar application of the composition of the present invention in the apple size cv. Cr ⁇ pps Pink subjected to abiotic stress (poor growth), which had a completely randomized design composed of 3 treatments with 10 repetitions of 1 plant each. The test was carried out in a productive field in the Pelarco area, Maulé Region. A summary of Test 3 is shown in Table 3A.
  • Example 4 Heat stress. Evaluation of the effect of the application of the composition of the invention on the productivity and quality of lettuce against heat stress.
  • a test (Test 4) was carried out at the Agr ⁇ cola Hidrogourmet, located in San Fernando, O'Higgins Region, Chile. The test consisted of 3 treatments of 20 plants each, of which the 5 central plants were evaluated. A NFT system was used, where the plants were periodically watered with a basal fertilizer solution. The plants were treated with a single application 1 day prior to heat stress, with an exposure to 50 ° C for 4 hours, 3 weeks before harvest. Treatment T0 without application was used as an absolute control.
  • T2 the application of the composition of the invention (T2) allows a significantly faster recovery compared to the use of a commercial composition based on Ascophyllum nodosum (TI), showing a 33% recovery from dehydration greater 1 week after heat stress.
  • TI Ascophyllum nodosum
  • Example 5 Cold stress. Evaluation of the effect of the application of the composition of the invention on the productivity and quality of lettuce against cold stress.
  • a test (Test 5) was carried out in the Agr ⁇ cola Hidrogourmet, located in San Fernando, O'Higgins Region, Chile. The test consisted of 3 treatments of 20 plants each, of which the 5 central plants were evaluated. A NFT system was used, where the plants were periodically watered with a basal fertilizer solution. The plants were treated with a single application 1 day prior to cold stress, with an exposure to -3 ° C for 4 hours, 1 week before harvest. Treatment T0 without application was used as an absolute control.
  • Table 5A Summary of treatments applied in Trial 5. Different letters indicate significant differences (p value ⁇ 0.05).
  • Table 5B Yield measures and percentage of lettuces in a marketable state from Trial 5. Different letters indicate significant differences (p value ⁇ 0.05).
  • composition of the invention (T2) generates 14% higher effects in terms of enhancing the yield of marketable lettuces, than the use of Ascophyllum nodosum (TI) using the same commercial dose.
  • TI and T2 showed higher results than the control without application (T0), where the composition of the invention (T2) is 150% higher in yield of marketable units per hectare, with respect to T0. This difference was statistically significant.
  • T2 the application of the composition of the invention (T2) generates a chlorophyll concentration (nmol / mg dry weight) more than 130% higher than the concentration observed using Ascophyllum nodosum (TI). Only treatment T2 presents significant differences compared to the control without application (T0).
  • Example 6 Comparison of compositions. Comparison of the composition of the invention with other natural and synthetic compositions.
  • a test (Test 6) was carried out to evaluate the effect of the foliar application of the present invention on the yield in fresh weight, dry weight and chlorophyll levels in hydroponic lettuces type Lollo blonda cv. Dabi, compared to other natural and synthetic compositions.
  • the test was carried out at Agr ⁇ cola Hidrogourmet, located in San Fernando, O'Higgins Region, Chile.
  • the trial evaluated 6 treatments of 5 plants each, in a NFT system. These 6 treatments aim to compare the composition of the invention with other compositions with the same level of total polyphenols (5g / L) of different nature or made by different processes.
  • the treatments are detailed below:
  • composition of the invention Composition of the invention.
  • T2 Composition 1 Composition based on the same raw material as the composition of the invention, made using a process based on patent CN103211852A, in which the use of organic phases was omitted so that the extract was also aqueous (variable: process).
  • Synthetic T3 Synthetic extract based on gallic acid and water (variable: synthetic source of polyphenols).
  • T4 Biortig Commercial nettle-based biostimulant (variable: commercial competitor based on plant extract, not based on algae).
  • T5 Composition 2 Strawberry leaf extract (100%), made with the same process of the invention (variable: vegetable source).
  • T0 presented 20% dehydration on day 21.
  • TI presented only 1.1% dehydration, verifying that the use of the composition of the invention has a delaying effect on the senescence of the plant. Photographs of the samples are shown at day 21 at 5 ° C, corresponding to T0 and TI in Figures 6D and 6E, respectively.
  • Example 7 Antimicrobial effect. Growth inhibitory effect of the composition of the invention against Bacillus sp, Enterobacter aerogenes, Salmonella sp, Staphylococcus aureus and Escherichia coli.
  • Routine tests were performed comparing the inhibition halo, using an antibiotic as a positive control, in particular, 0.1 g / L carbamycin for Bacillus sp, 0.1 g / L chloramphenicol for Enterobacter aerogenes, and 0.1 g / L ampicillin. for Salmonella sp, Staphylococcus aureus and Escherichia coli as shown in Table 7 below.
  • FIGS 7A and 7B An example of the inhibition halos is shown in Figures 7A and 7B: inhibition halo in Escherichia coli and ampicillin inhibition halo (antibiotic as positive control), respectively.
  • the tests show the inhibitory effect of the composition of the invention in all the microorganisms evaluated, the representative image of the effect is attached where the inhibition halo is more clearly appreciated in both plates (Escherichia coli).
  • Example 8 Plant quality. Field trial on tomato plants.
  • Test 8 was carried out to evaluate the effect of foliar application of the composition of the present invention on the quality of tomato plants cv. Cal Ace, which had a design composed of 4 treatments with 3 repetitions of 1 plant each. In rehearsal carried out at the Quillaja Experimental Center, of the Fitonova company, in Talca, Maulé Region. A summary of Test 8 is shown in Table 8A.
  • Bio-3 is a commercial product from Venavi, which corresponds to a hydrocolloid-based coating.
  • a summary of the results obtained in Test 8 is shown in Table 8B.
  • each seedling was divided into aerial part (stem and leaves) and root.
  • Figure 8A the effect of the different treatments on the height of the seedling and the diameter of its stem is compared.
  • the use of the composition of the invention increases this parameter between 47 and 96%, showing a complementary effect with the use of Bio-3 at 100%, the use of Bio-3 being indifferent to 25% and 50%.
  • the use of the composition of the invention increases this parameter between 28 and 100%, showing a synergistic effect with the use of Bio-3, since, the higher its concentration, the greater the diameter of the stem.
  • Figure 8B compares the effect of the different treatments on the fresh weight of the aerial part of the seedling and the weight of its root.
  • the use of the composition of the invention increases this parameter between 52 and 98%.
  • the weight of the root a similar effect is observed, increasing its weight between 94 and 169%. In both parameters a synergistic effect is observed with the use of Bio-3.
  • Figure 8C compares the effect of the different treatments on the number of leaves and the length of the seedling root.
  • the use of the composition of the invention increases this parameter between 53 and 97%, showing a synergistic effect with the use of Bio-3.
  • the length of the root a similar effect is observed, increasing its length between 39% and 58%, however, the concentration of use of Bio-3 does not have a relevant effect.
  • Example 9 Rooting. Evaluation of the effect of the application of the composition of the invention in the rooting of blueberry plants in farrowing.
  • Table 9A Summary of treatments applied in Trial 9.
  • Table 9B Rooting level obtained in Test 9.
  • Example 10 Rooting. Evaluation of the effect of the application of the composition of the invention in the rooting of cherry plants in maternity.
  • Table 10A Summary of treatments applied in Trial 10.
  • Table 10B Rooting level obtained in Test 10.
  • Example 11 Height of the plant. Evaluation of the effect of the application of the composition of the invention on the height of rooted cuttings of Nemaguard pattern.
  • Table 11A Summary of treatments applied in Trial 11.
  • Table 11B Average height of the plants obtained in Test 11.
  • Example 12 Performance. Evaluation of the effect of the application of the composition of the invention on the performance of potato tubers in aeroponics.
  • Test 12 was carried out to observe the effect of the foliar application of the composition of the invention in potato plants in aeroponics, evaluating the yield of the generated tubers.
  • Table 12A lists the treatments used in the trial:
  • Test 12 The results obtained in Test 12 are shown in Table 12B. Table 12B. Yields obtained in Test 12.
  • Table 12B shows that the average yield per plant of tubers over the 15mm diameter obtained showed an increase of 11% in the plants treated with the composition of the invention. These are the marketable tubers, so the objective of Trial 12 was precisely to increase this parameter, giving positive results.

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Abstract

La presente invención se relaciona con composiciones de origen natural para uso en cultivos agrícolas (hortalizas y frutales), en particular para uso en formulaciones bioestimulantes y/o con acción antimicrobiana, que permiten proteger a los cultivos del estrés, mejorando la calidad y rendimiento de las plantas y/o sus frutos. La invención provee una composición bioestimulante y/o antimicrobiana que comprende extractos elaborados a partir de vegetales que comprenden hojas de berries (bayas) ricas en polifenoles, flavonoides y micronutrientes. En una realización preferente de la invención la composición comprende extractos elaborados a partir de hojas de arándano. Se provee además un proceso para elaborar dicha composición.

Description

COMPOSICIÓN RICA EN POLIFENOLES Y FLAVONOIDES PARA USO COMO BIOESTIMULANTE Y ANTIMICROBIANO DE APLICACIÓN EN AGRICULTURA
MEMORIA DESCRIPTIVA
CAMPO TÉCNICO
La invención provee composiciones con acción bioestimulante elaboradas a partir de extractos vegetales, preferentemente hojas de berries. La composición preparada de acuerdo a la presente invención permite elaborar formulaciones para uso en cultivos agrícolas y tiene actividad antimicrobiana frente a diversos patógenos.
ANTECEDENTES
La agricultura enfrenta una constante demanda de productos para consumo humano, animal o como materia prima para diversas industrias, lo que plantea un constante desafío por lograr una producción de calidad con un buen rendimiento.
Frente a los desafíos de la industria agrícola, con el objetivo de prevenir el agotamiento de los suelos e incrementar la productividad, surge el uso de abonos, fertilizantes, enmiendas, mejoradores y/u otros productos de uso agrícola.
Dentro de los productos usados para mejorar el crecimiento de las plantas se encuentran los bioestimulantes, que complementan la nutrición y la protección de los cultivos, y que corresponden a cualquier sustancia o microorganismo que, al aplicarse a las plantas, sea capaz de mejorar su eficacia en la absorción y asimilación de nutrientes, su tolerancia al estrés biótico o abiótico u otras características agronómicas, independientemente del contenido en nutrientes de la sustancia. También se considera como un bioestimulante vegetal a los productos que contienen mezclas de estas sustancias o microorganismos. Los bioestimulantes abarcan variadas formulaciones para su uso directamente en las plantas o árboles, o para ser aplicados en los suelos o agua de riego para regular y mejorar los cultivos a través de diversas vías, haciéndolos más eficientes, resistentes y de mejor calidad.
Los bioestimulantes además son compatibles con las prácticas agrícolas y alimentarias que promueven un bajo impacto ambiental de los cultivos, en conjunto con ofrecer productos alimenticios saludables.
Independientemente del contenido en nutrientes que tengan los bioestimulantes, ayudan a los fertilizantes a ser más eficaces, aportando elementos esenciales a los cultivos para hacerlos más resistentes. Dentro de la gama de productos bioestimulantes se encuentran sustancias, microorganismos o mezclas de ellos, que se clasifican dentro de las siguientes categorías: ácidos húmicos y fúlvicos; hidrolizados de proteínas, aminoácidos y mezclas de péptidos; extractos de algas y de plantas; quitosanos y otros biopolímeros; compuestos inorgánicos; además de hongos y bacterias beneficiosas, entre otros. Por otra parte, es fundamental prescindir de compuestos de síntesis química, debido a que la agricultura moderna va en tendencia a eliminar el uso de esos compuestos por sus efectos en el medio ambiente, en las plantas cultivadas y eventualmente, en la salud humana. Esta tendencia se enmarca en el concepto de la agricultura orgánica, que, de acuerdo a lo recopilado por la FAO, consiste en la gestión del ecosistema, en vez de la simple utilización de insumos agrícolas. Así, se elimina el uso de fertilizantes y plaguicidas sintéticos, medicamentos veterinarios, semillas y especies modificadas genéticamente, conservadores, aditivos sintéticos e irradiación, optando por alternativas mecánicas, biológicas o culturales compatibles.
Algunas prácticas de gestión de la agricultura orgánica tienen en cuenta que las condiciones locales requerirán sistemas, productos y/o soluciones adaptados específicamente para la región en donde se deban aplicar o implementar.
Dentro de los incentivos para la agricultura orgánica, además de la influencia dada por las preferencias de los consumidores que cada vez demandan más productos orgánicos, existen subsidios con el fin de reducir la contaminación de las aguas subterráneas y los suelos, o promover la biodiversidad, tal como ocurre, por ejemplo, en la Unión Europea. También existe el interés de los propios agricultores, que buscan métodos sostenibles para mejorar la salud de ellos y sus familias, además de obtener a futuro los beneficios de la reducción de costos gracias a las economías de escala, una vez que la agricultura orgánica logre una mayor participación en el mercado.
En el estado del arte existen diversos desarrollos en la línea de extractos vegetales para diversos fines, en particular como bioestimulantes, obtenidos por métodos orientados a la agricultura orgánica.
Por ejemplo, el documento W02010051814A1, si bien se trata de un producto para la industria alimenticia y no de un bioestimulante para plantas, se indica que corresponde a un extracto en agua, alcohol o mezcla de ellos, de uso como aditivo natural obtenido a partir de hojas o frutas de diversas especies de berries, por su contenido de polifenoles, taninos y otros compuestos con propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, antibacterianas y antivirales. La invención descrita en el documento, al estar dirigida a un aditivo antioxidante de uso en alimentos, no sugiere acciones bioestimulantes en plantas, se trata de un complemento nutricional con acción como promotor del crecimiento de uso en alimentación de animales domésticos, caracterizado por la presencia de taninos, compuestos ausentes en la presente invención.
El documento CN105497101A describe una metodología donde se elaboran extractos a partir de tallos o de hojas de arándano, las que pueden ser frescas o previamente secadas y trituradas. Se trataría de un proceso de bajo costo, sin embargo, el proceso contempla extracción con etanol, extracción con agua, hidrólisis enzimática, adsorción de resina macroporosa, separación de membranas y uso de ultrasonido o microondas. El proceso descrito en ese documento se podría realizar usando una extracción en agua purificada o desionizada a 50-60QC, realizando la extracción 2-3 veces, seguido de ultrafiltración, dializado y liofilizado. Los extractos descritos en esta publicación están dirigidos a aplicaciones en la industria alimenticia y cosmética, indicando que las hojas de arándano contienen polifenoles y flavonoides, sin haber sugerencia de aplicaciones en otras industrias y menos aún del potencial como bioestimulante o actividad antimicrobiana. Por su parte, la publicación US4309207 (A) presenta un extracto que puede obtenerse a partir de hojas de arándano, entre otros, aunque el efecto esperado de este extracto es la inhibición del crecimiento de plantas, particularmente para inhibir la germinación de semillas, el crecimiento de plántulas y hongos (es decir, tendría acción potencialmente fungicida). La extracción se realiza con acetona y agua, seguido de numerosas etapas tales como evaporación, acidificación, lavado, disolución, por lo que se esperaría un perfil de componentes en particular. Por lo tanto, dado que es una composición orientada a inhibición de crecimiento, no sería obvio utilizarla como bioestimulante en plantas. Más aún, el proceso para elaborar el extracto inhibidor contempla la acidificación del mismo, tratamiento con acetato, lavado, separación de fases orgánicas y acuosas, evaporación y disolución en solvente.
En el documento CN103211852A se describen extractos de hojas de arándano que están dirigidos a eliminar radicales libres, en donde la importancia de este uso se enfoca en evitar el daño en tejidos y células del cuerpo que podría provocar enfermedades crónicas y envejecimiento. El proceso de extracción, si bien inicialmente corresponde a una extracción acuosa, en donde las hojas son pulverizadas y mezcladas con agua caliente (decocción), tiene etapas adicionales de concentración en resina macro-porosa y elución con etanol. La fracción eluida es la que muestra capacidad de secuestrar radicales libres. Así, queda claro que no hay mención a que dichos extractos tengan propiedades como bioestimulante, ni tampoco hay referencia a su uso para aplicación en plantas.
En relación al documento US5474774A, se presenta un extracto elaborado de material vegetal, preferentemente el fruto, enriquecido en polifenoles y flavonoides y, aunque se menciona una muestra acuosa, el extracto se elabora con al menos una etapa que requiere el uso de una fase orgánica. Los usos para el extracto se relacionan a la inhibición de adherencia de bacterias en diversas superficies y para diversas industrias, pero especialmente enfocada en el cuidado bucal (enjuagues). El material vegetal preferente corresponde a arándano rojo ( cranberries ), si bien se indica que el material podría ser un fruto de arándano, no se identifica explícitamente la posibilidad de elaborar extractos a partir las hojas. Tampoco hay mención explícita para el uso en plantas, menos aún como un bioestimulante.
En el ámbito de los bioestimulantes, se tienen también composiciones como la mostrada por Bulgari et al. (2017), donde se describen bioestimulantes para uso en plantas para mejorar el crecimiento, aumentando el rendimiento y la calidad de las plantas. Se usó extracto de borraja que fue rociado sobre plantas de lechuga, mejorando diversos parámetros, incluyendo la producción de biomasa, clorofila y el contenido de fenoles y flavonoides, se indica que se midieron los niveles de calcio y compuestos fenólicos en los extractos. Los extractos de borraja se elaboran a partir de flores u hojas, que son triturados y macerados en agua durante 25 días a temperatura ambiente y en oscuridad, siendo posteriormente filtrados y diluidos en agua para aplicación foliar. En dicho documento no se utilizan berries , ni sus hojas, sino que se utiliza exclusivamente una composición a base de borraja.
En cuanto a lo descrito por Ertani et al., se presenta el efecto de extractos vegetales, entre ellos arándano, sobre el crecimiento de plantas de maíz, donde los extractos contendrían compuestos de actividad bioestimulante. Se indicaría además que el ácido p-hidroxibenzoico (que estaría presente en los frutos de arándano) tendría actividad antifúngica y antibacteriana. Dado que en el caso del uso de arándano se analizan extractos de frutas, este documento no afectaría la novedad de la presente invención, pues al ser producido a partir del fruto y no de la hoja de la planta de arándano, es rico en ácido clorogénico y ácido hidroxibenzoico, careciendo de ácido gálico y ácido cumárico (no detectados). A diferencia de ello, la composición de acuerdo a la presente invención tiene una concentración despreciable de ácido clorogénico, podría contener ácido hidroxibenzoico, y es especialmente rica en ácido gálico, con una alta presencia de ácido cumárico.
Finalmente, en el documento US4308047A se presenta un método para aplicar un extracto acuoso en donde se utilizan hojas previamente secas de roble que se hierven en agua para extraer los componentes solubles. El extracto se usa como bioestimulante, indicando que contendría taninos y ceras naturales de las hojas de roble. Si bien se indica que se puede aplicar para limpiar las hojas de las plantas o la raíz, no se menciona explícitamente que se pueda usar como bioestimulante foliar. Se indica además que el producto se puede usar para limpiar diversas superficies. Dado que no hay referencia a hojas de arándano, este documento no afectaría la novedad de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Resultados del Ensayo 1A, en el que se determinó el efecto de la composición de la invención en el rendimiento de lechugas hidropónicas tipo Lo lio bionda cv. Dabi sometidas a estrés abiótico (crecimiento deficiente). El ensayo contó con 7 tratamientos de 6 aplicaciones cada uno: Tratamiento control sin aplicación (T0); bioestimulante a base de Macrocystis pyrifera A a 3 L/ha (TI) y a 1,5 L/ha (T2); bioestimulante a base de Macrocystis pyrifera B a 3 L/ha (T3) y a 1,5 L/ha (T4); y la composición de la invención a 3L/ha (T5) y a 1,5 L/ha (T6). La Figura 1A muestra los resultados del peso fresco de las plantas en gramos, y la Figura IB muestra los porcentajes correspondientes al peso seco sobre el peso fresco. Letras diferentes indican diferencias significativas (p valor < 0,05).
Figura 2. Resultados del Ensayo 2, en el que se determinó el efecto de la composición de la invención en el rendimiento y calibre de arándanos cv. Duke. El ensayo contó con 2 tratamientos: Tratamiento control sin aplicación (T0); y 3 aplicaciones de la composición de la invención a 3 L/ha (TI). Figura 2A muestra la cuantificación del rendimiento total del cultivo en kg/ha; la Figura 2B muestra los rendimientos en las 5 fechas de cosecha en rendimiento porcentual con respecto a la cosecha total, y la Figura 2C muestra el calibre promedio de los frutos para 4 primeras fechas de cosecha (mm del diámetro ecuatorial del fruto).
Figura 3. Resultados del Ensayo 3, en el que se determinó el efecto de la composición de la invención en el calibre en manzana cv. Cripps Pink sometidas a estrés abiótico (crecimiento deficiente). El ensayo contó con 3 tratamientos: Tratamiento control sin aplicación (T0); 4 aplicaciones de la composición de la invención a 3 L/ha (TI); y 8 aplicaciones de la composición de invención a 3L/ha (T2). El calibre se determinó en función del peso promedio del fruto (g).
Figura 4. Resultados del Ensayo 4, en el que se determinó el efecto de la composición de la invención en el rendimiento y calidad de lechugas hidropónicas tipo Lo lio bionda cv. Dabi sometidas a estrés por calor. Las aplicaciones se realizaron el día anterior al estímulo (50°C por 4 horas). El ensayo contó con 3 tratamientos: Tratamiento control sin aplicación (T0); 1 aplicación de una composición comercial a base de Ascophyllum nodosum a 3 L/ha (TI) y 1 aplicación de la composición de la invención a 3 L/ha (T2). En la figura 4A se muestra el peso fresco (g); en la figura 4B, el peso seco (g); y en la figura 4C, la recuperación de la deshidratación a la semana 1 post estrés (%). figura 5. Resultados del Ensayo 5, en el que se determinó el efecto de la composición de la invención en el rendimiento y calidad de lechugas hidropónicas tipo Lo lio bionda cv. Dabi sometidas a estrés por frío. Las aplicaciones se realizaron el día anterior al estímulo (-3°C por 4 horas). El ensayo contó con 3 tratamientos: Tratamiento control sin aplicación (T0); 1 aplicación de una composición comercial a base de Ascophyllum nodosum a 3 L/ha (TI) y 1 aplicación de la composición de la invención a 3 L/ha (T2). En la figura 5A se muestra el peso fresco (g); en la figura 5B, la diferencia de peso fresco del cada tratamiento versus T0 (%); la figura 5C, el peso seco (g); y en la figura 5D, la concentración de clorofila (nmol/mg peso seco). figura 6. Resultados del Ensayo 6, en el que se determinó el efecto de la composición de la invención en el rendimiento y calidad de lechugas hidropónicas tipo Lo lio bionda cv. Dabi e n comparación con otras composiciones naturales y sintéticas. El ensayo contó con 6 tratamientos de 6 aplicaciones a 3L/ha cada uno: Tratamiento control sin aplicación (T0); Composición de la Invención (TI); Composición 1 (misma materia prima, diferente proceso que la invención) (T2); Sintético (composición sintética a base de ácido gálico) (T3); Biortig (T4); y Composición 2 (mismo proceso, diferente materia prima que la invención) (T5). En la Figura 6A se muestra el peso fresco (g); en la Figura 6B, el peso seco con respecto al peso fresco (%); y en la Figura 6C, la concentración de clorofila (nmol/g peso seco). En las Figuras 6D y 6E se muestran fotografías de T0 y TI respectivamente de las muestras al día 21 a 5°C, correspondientes a la cuantificación de deshidratación postcosecha.
Figura 7. Efecto inhibidor de la composición de la invención sobre Escherichia coli. La Figura 7A muestra el efecto de la composición de la invención a una concentración del 100%; y la Figura 7B muestra el control positivo correspondiente a Ampicilina 0,1 g/L.
Figura 8. Resultados del Ensayo 8, en el que se determinó el efecto de la composición de la invención en las variables de calidad de plantas de tomate cv. Cal Ace. El ensayo contó con 5 tratamientos de 2 aplicaciones de la composición de la invención con una dilución del 2%:: Tratamiento control sin aplicación (T0); sin Bio-3 (TI); con Bio-3 al 25% (T2); con Bio-3 al 50% (T3); y con Bio-3 al 100% (T4). En la Figura 8A se muestra la altura de la plántula (cm) y el diámetro de su tallo (mm); en la Figura 8B, el peso fresco de la parte aérea de la plántula (g) y de su raíz (g); y en la Figura 8C, el número de hojas y el largo de la raíz de la plántula (cm).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La invención provee una composición a base de extractos vegetales, rica en antioxidantes, carbohidratos, proteínas y micronutrientes, fundamentales para el crecimiento y protección de las plantas frente al estrés abiótico, minimizando su efecto, favoreciendo su recuperación, calidad y crecimiento de la planta y sus frutos. El efecto de la composición aplicada en hortalizas y frutales permite incrementar el rendimiento en peso seco, fresco de la planta y/o el enraizamiento de las plantas, y pudiendo incluso aumentar el calibre y calidad general de la planta o frutos.
El término "peso fresco" en el contexto de la presente invención se entiende como el peso total de una planta fresca recién cosechada; se puede también considerar como el peso húmedo de la planta en condiciones ambientales (temperatura ambiente y presión atmosférica).
Por otra parte, el término "peso seco" se entenderá como el peso total de la planta una vez eliminado el contenido de agua, por ejemplo, secada en estufa u horno.
El proceso de preparación de la composición elaborada a partir de vegetales que comprenden hojas de berries (preferentemente de hojas de arándano) de acuerdo con la invención se hace con hojas previamente secadas a la sombra o al sol, en estufa, por microondas, por aire frío o caliente, o mediante liofilización; en un rango de temperatura entre 15-100°C, durante 0,5 a 96 horas, y molidas usando un equipo de molienda por cuchillas, discos estriados, martillo, chancadores o combinaciones de ellos.
El proceso comprende las siguientes etapas: a) mezclar las hojas de berries secas con agua en una razón en peso de sólido: líq u ido entre 1:1 a 1:50 donde el agua está a una temperatura entre 20 y 90°C; b) agitar la mezcla entre 50 a 800 rpm durante 0,5 a 12 horas; c) opcionalmente incorporar aditivos preservantes o conservantes y los estabilizantes sin dejar de agitar; d) agitar la mezcla entre 50 a 800 rpm por hasta 30 min adicionales; e) separar los sólidos y restos de hojas secas de la porción acuosa, en donde la separación se realiza mediante filtración, pudiendo usar adicionalmente decantación y/o centrifugación. En el caso de la filtración, ésta puede ser mediante filtros de papel, de tela, gasa, tipo carcasa, inoxidable, membrana, porcelana, plásticos, acero o filtración tangencial; y f) ajustar la concentración de polifenoles totales entre 4 y 12 g/L de la composición.
En una realización preferente de la invención, la razón en peso de hojas de berries secas y agua está entre 1:1 a 1:20, más preferentemente entre 1:5 a 1:10.
En una realización preferente de la invención, la extracción se realiza a una temperatura entre 20 y 80°C, preferentemente entre 25 y 65°C, más preferentemente entre 40 y 60°C.
En otra realización preferente de la invención, la extracción se realiza durante un tiempo de extracción entre 1 a 3 horas. Para el experto de la técnica será evidente que aumentar el tiempo de extracción no conllevaría ningún perjuicio para la composición obtenida, y que en términos generales a menor temperatura se requiere mayor tiempo de extracción para obtener el mismo extracto.
La composición elaborada es rica en antioxidantes, carbohidratos, proteínas y micronutrientes. La composición preparada tiene como compuestos mayoritarios flavonoles, flavonas, ácidos hidroxicinámicos, ácidos benzoicos y fenoles.
A continuación, se cuantifican sus compuestos calculados en base a mg por cada 100 g de muestra analizada. Entre los flavonoles y flavonas principales se encuentran:
• quercitina 3 - 6,5 mg/100g,
• miricetina 0,5 - 13,2 mg/100g, y
• isorhamnetina 0,7 - 1,7 mg/100g,
Por otra parte, entre los ácidos hidroxicinámicos, ácidos benzoicos y fenoles principales se encuentran:
• ácido clorogénico 0,2 - 0,9 mg/lOOg,
• ácido cafeico 0,4 - 1,4 mg/100g,
• ácido gálico 20 - 44,3 mg/100g,
• ácido feruloilquínico 5 - 17,5 mg/100g,
• ácido hidroxibenzoico 0,2 - 6,5 mg/100g,
• ácido ferúlico 0,5 - 13,3 mg/100g,
• ácido cumárico 6 - 22,2 mg/100g, y
• resveratrol 1 - 6,5 mg/100g.
Dentro de los micronutrientes y componentes presentes en una composición elaborada de acuerdo a la presente invención (analizados de acuerdo a la metodología TMECC, 2001) se encuentran:
• Amonio 75 - 235 mg/L,
• Azufre 200 - 450 mg/L,
• Boro 1 - 5 mg/L,
• Calcio 250 - 780 mg/L,
• fósforo 25 - 90 mg/L,
• Hierro 1 -4 mg/L,
• Magnesio 120 - 380 mg/L,
• Manganeso 5 - 18 mg/L,
• Nitrato 50 - 160 mg/L,
• Potasio 190 - 580 mg/L,
• Sodio 10 - 45 mg/L,
• Zinc 4 - 12 mg/L.
Considerando la variabilidad de la concentración de activos en la materia prima, la composición resultante se elabora de modo de alcanzar una concentración de polifenoles totales entre 4 y 12 g/L. Si bien podría ser necesario concentrar la composición, en general el producto podría superar el rango indicado, por lo que en dicho caso se podría diluir hasta la concentración deseada en agua y/o en una solución acuosa para diluir que incluye preservantes o conservantes y estabilizantes.
Opcionalmente, se podría elaborar una composición concentrada para uso con mayor efecto antimicrobiano.
Opcionalmente, se pueden agregar aditivos a la composición y/o formulación de producto terminado, tales como: • Estabilizantes, comprendiendo gomas vegetales como, por ejemplo, goma gellan, arábiga, xantana, garrotín, guar, tragacanto, karaya y tara, y en general cualquier goma admisible de acuerdo a la regulación para alimentos. Permiten mejorar la adherencia del producto, por ejemplo, en la aplicación foliar. Una ventaja adicional del uso de gomas es que además tienen acción como preservante o conservante.
• Preservantes o conservantes, tales como benzoato de sodio, sorbato de potasio, sorbato de calcio, sales de sorbato y ácidos orgánicos como ácido propiónico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido ascórbico y ácido acético; para mejorar la estabilidad y la duración del producto.
Los aditivos se usan en general en una concentración entre 0,01 y 5% p/v cada uno.
Si bien los bioestimulantes no necesariamente deben aportar nutrientes a los cultivos, opcionalmente la composición de acuerdo a la presente invención puede comprender la suplementación de compuestos necesarios para el crecimiento de la planta, como, por ejemplo:
• Macronutrientes, como nitrógeno, fósforo, potasio, carbono.
• Nutrientes secundarios, como calcio, magnesio, azufre.
• Micronutrientes, como fierro, manganeso, cobre, zinc, boro, molibdeno, cloro.
• Otros nutrientes, como aminoácidos.
La concentración de cada compuesto, de forma independiente, es de hasta un 50% p/v en el caso de los macronutrientes; de hasta un 20% p/v en el caso de los nutrientes secundarios; y de hasta 10% p/v en el caso de los micronutrientes.
Se realizaron análisis para evaluar la presencia de residuos químicos, en donde se obtuvo que el resultado es negativo para residuos cuantificables, es decir, la medición no arrojó valores superiores al límite de cuantificación para todas las variables analizadas, incluidos ácidos fosforosos, fosetil aluminio y sus sales.
Por otra parte, teniendo en cuenta que, al mezclar los agroquímicos con otros productos, podrían reaccionar desfavorablemente por incompatibilidad química, biológica y física, lo que afectaría la efectividad de la mezcla, se realizaron análisis de compatibilidad de la invención con diversos productos agroquímicos. Se hicieron ensayos con agroquímicos a base de cobre, insecticidas y fungicidas, demostrándose que la composición de la presente invención en combinación con dichos compuestos no genera cambios fisicoquímicos (temperatura, pH, precipitación, coloración, etc.), por lo que se demuestra que la composición es compatible con otros productos agroquímicos.
Así, dentro de las ventajas de la composición de la invención y de las formulaciones elaboradas con la misma, destacan:
• Bajo costo de producción.
• Eficacia comprobada (rendimiento, calidad, resistencia al estrés).
• Compatible con otros productos agroquímicos.
• Libre de residuos y orgánico.
Las composiciones de acuerdo a la invención se pueden utilizar en agricultura como bioestimulante y/o antimicrobiano en formatos tales como: formulaciones para aplicación foliar formulaciones para aplicación radicular formulaciones para irrigación.
La aplicación de la composición de la invención se realiza por cualquier método disponible en la técnica, tales como: aspersión, aplicación en surcos, en cultivos hidropónicos, empapado de material vegetal, sobre heridas de cortes de poda, incorporación directa en suelos o mezclas de siembra en invernadero, macetas, campo, o tratamiento directo de semillas, material de propagación o injertos.
Una composición de acuerdo a la presente invención se puede utilizar en forma periódica para incrementar el rendimiento, la calidad, el enraizamiento y/o calibre de la planta y/o fruto, y también se puede usar antes, durante o después de ocurrida la condición de estrés, para favorecer su recuperación. En una modalidad preferente de la invención, se utiliza antes de que la planta se exponga a las condiciones de estrés, pues es el momento en que se observa que la planta logra efecto de protección contra las condiciones adversas.
La composición de la invención se puede usar en una amplia gama de cultivos agrícolas, especialmente hortalizas y frutales, tales como: arándanos, vides, cerezos, manzanos, avellanos, nogales, cítricos, lechugas, tomates, papas, entre otros.
EJEMPLOS
OBTENCIÓN DE LA COMPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN
Ejemplo I: Condiciones del Proceso. Pruebas de extracción variando las condiciones de operación: temperatura, proporción de soluto:solvente y tiempo de extracción.
Se realizaron extracciones haciendo variaciones de algunos parámetros de modo de preparar una composición con el máximo contenido de polifenoles totales, sin sacrificar la concentración antioxidante. Las variaciones de temperatura estuvieron en el rango entre 25 a 65°C para extracciones entre 1 a 3 horas. La proporción de agua estuvo a una razón entre 1:5 a 1:15. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla I.
Tabla II. Resultados de concentración de polifenoles totales (PT), concentración de antioxidantes (CA), azúcares totales (AT) y sólidos suspendidos (SS) para diversas condiciones de extracción. Evaluación de 15 pruebas con diferentes combinaciones de condiciones de proceso: temperatura, razón sólido: líq u ido y tiempo de extracción.
Figure imgf000011_0001
Ejemplo II: Composición. Contenido total de polifenoles, flavonoles y antocianos, además de un perfil polifenólico de 2 tipos de muestras.
Se analizaron muestras de hojas cosechadas en forma temprana y tardía. Debido a que los métodos utilizados fueron cuantificación por ensayo espectrofotométrico de fenol sulfúrico y HPLC con detector DAD, fue necesario realizar previamente a la composición de la invención una extracción en solución de agua, metanol y ácido fórmico para los análisis.
Tabla 111. Contenido de polifenoles totales (PT), flavonoles totales (FT) y antocianos totales (AT) en muestras temprana y tardía. Composición Temprana: composición de la invención a partir de hojas cosechadas en época temprana; Composición Tardía: composición de la invención a partir de hojas cosechadas en época tardía.
Figure imgf000011_0002
Tabla 112. Perfil polifenólico en Composición Temprana y Composición Tardía. Composición Temprana: composición de la invención a partir de hojas cosechadas en época temprana; Composición Tardía: composición de la invención a partir de hojas cosechadas en época tardía.
Figure imgf000012_0001
Como comparación, a continuación, se presentan los resultados de polifenoles totales de muestras a las que no se le realizó extracción en solución de agua, metanol y ácido fórmico previo a esta cuantificación, de modo de tener una estimación aproximada de las pérdidas producidas por la etapa de extracción analítica (Tabla 113).
Tabla 113. Polifenoles totales en muestra sin extracción analítica.
Figure imgf000012_0002
Con este resultado se puede ver que, por el mismo mecanismo, sin hacer la extracción analítica previa, la concentración de polifenoles totales es 33,5% superior a lo estimado regularmente por el método analítico utilizado para determinar el contenido de polifenoles totales (PT), flavonoles totales (FT) y antocianos totales (AT) y su perfil polifenólico. Ejemplo III: Preparación de una composición con hojas de berries.
Se elaboró un lote de composición utilizando 500 g de hojas de berries, donde 80% de ellas son hojas de arándanos, que fueron secadas a la sombra durante 72 horas.
Una vez secas las hojas, se mezclaron con agua en proporción 1:15 en peso, con 7,5 L de agua a una temperatura de 50°C, añadiendo ácido ascórbico al 0,1 % y sorbato de potasio al 0,25% p/v.
La mezcla se mantuvo a 50°C con agitación a 250 rpm durante 3,5 horas. A esta mezcla se añadió ácido cítrico al 0,2% y goma xantana al 0,05% p/v, manteniendo la agitación entre 200 y 250 rpm durante 30 minutos adicionales, sin calentar.
Una vez terminado el tiempo de mezcla, se separaron los sólidos usando un filtro de papel, rescatando la fracción acuosa, a la que se midió la concentración de polifenoles totales.
Se obtuvo 7,86 g/L de polifenoles totales en la composición, por lo que se diluyó agregando una solución acuosa conteniendo los mismos aditivos agregados durante la extracción, en cantidad suficiente para lograr una concentración de 4,75 g/L de polifenoles totales en la composición, para su aplicación directa en cultivos.
Ejemplo IV: Preparación de una composición con hojas de arándanos (100%).
Se elaboró un lote de composición utilizando 500 g de hojas de arándanos que se secaron a la sombra durante 72 horas.
Las hojas secas se mezclaron con agua en proporción 1:5 en peso, con 2,5 L de agua a una temperatura de 65°C.
La mezcla se mantuvo a 65°C con agitación a 200 rpm durante 4 horas. Luego se mantuvo la agitación a 200 rpm durante 20 minutos, sin calentar.
Se removieron los sólidos usando un filtro tipo carcasa, separando la fracción acuosa.
Se midió la concentración de polifenoles totales, obteniendo 8,41 g/L. La composición fue diluida con agua hasta alcanzar una concentración de 6 g/L de polifenoles totales.
Ejemplo V: Composición. Cuantificación de los compuestos de la composición de la invención.
Se realizaron mediciones de la composición de una formulación líquida para su uso como bioestimulante foliar según la presente invención. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla V. Tabla V. Análisis de una composición de la invención para uso como bioestimulante.
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La composición es libre de metales pesados (rango indetectable de acuerdo a las técnicas analíticas utilizadas).
RESULTADOS DE APLICACIÓN DE LA COMPOSICIÓN BIOESTIM U LATE
Ejemplo 1: Rendimiento y calidad. Ensayos de campo en lechugas.
Se realizó un primer ensayo (Ensayo 1A) para evaluar el efecto de la aplicación foliar de la presente invención en el rendimiento en peso fresco, peso seco y niveles de clorofila en lechugas hidropónicas tipo LoHo bionda cv. Dabi. Las plantas fueron sometidas a estrés abiótico (crecimiento deficiente), y se realizaron aplicaciones de diversos tratamientos (T).
Para llevar a cabo este objetivo se seleccionó un huerto de lechugas hidropónicas, la que presentara ejemplares con un crecimiento deficiente y muerte anticipada, debido a problemas en la fertilización, generando estrés abiótico. El estímulo consistió en que la solución nutritiva presentó un pH 3,8 (ideal pH 6,0) y alta conductividad eléctrica (3.000 pS/cm), siendo el ideal de 250 a 750 pS/cm. El sistema de cultivo utilizado fue hidroponía en NFT.
El ensayo se realizó utilizando 7 tratamientos (de 25 lechugas cada uno). Un resumen del Ensayo 1A se muestra en la Tabla 1A.
Tabla 1A. Resumen de tratamientos aplicados en el Ensayo 1A.
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Tabla IB. Variables de calidad de lechugas del Ensayo 1A. Letras diferentes indican diferencias significativas (p valor < 0,05).
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1 índice A de escala CieLAB: valores negativos indican mayor intensidad de verde.
Al evaluar diferentes variables de calidad de las lechugas del Ensayo 1A, en la Figura 1A se observó que los tratamientos TI al T6 aumentaron significativamente el peso completo de la planta (parte aérea + raíz). Sin embargo, en la Figura IB se observó que solamente los tratamientos T3, T5 y T6 (solución comercial a base de Macrocystis pyrifera 2 y composición de la presente invención 1 y 2, respectivamente) lograron aumentar de forma significativa el porcentaje de materia seca en lechugas con estrés abiótico. En términos de color, los tratamientos T2 a T4 disminuyeron significativamente la intensidad de color verde, en comparación a T0, siendo T5 y T6, similares al testigo. Finalmente, los tratamientos TI a T6 lograron aumentar significativamente el contenido de clorofila.
A partir de los datos anteriores se tiene que los tratamientos T5 y T6 (composición de la presente invención) presentaron un peso fresco entre un 37,5 y 40% mayor en comparación con el tratamiento T0 (testigo, sin aplicación) y un peso seco entre un 46,6 y 59,5% mayor en comparación con el tratamiento T0. Finalmente, los tratamientos T5 y T6 presentaron un incremento de un 30 y 17% en los niveles de clorofila de la planta, respectivamente, en comparación con el tratamiento T0. Estos resultados corresponden a diferencias estadísticamente significativas.
Además de lo anterior, se hizo un segundo ensayo en lechugas (Ensayo IB), el que tuvo condiciones similares, usando una dosis fija de 3L/ha para todos los tratamientos, en donde se incorporó un testigo comercial a base de Ascophyllum nodosum. Un resumen del Ensayo IB se muestra en la Tabla 1C.
Tabla 1C. Resumen de tratamientos aplicados en el Ensayo IB.
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Tabla ID. Variables de calidad de lechugas en Ensayo IB. Letras diferentes indican diferencias significativas (p valor < 0,05).
Figure imgf000017_0001
1 índice A de escala CieLAB: valores negativos indican mayor intensidad de verde.
A partir de los resultados presentados en la Tabla ID se observa que los tratamientos T5 y T6 (composición de la presente invención) presentaron un peso fresco entre un 38,6 y 59,6% mayor en comparación con el tratamiento T0 (testigo, sin aplicación), donde el testigo comercial T4 muestra un aumento de solo 28,4%. Además, T5 y T6 presentaron un peso seco entre un 21,4 y 33,7% mayor en comparación con el tratamiento T0. Estos resultados corresponden a diferencias estadísticamente significativas.
Ejemplo 2: Rendimiento y calibre. Ensayos de campo en arándanos.
Este ensayo (Ensayo 2) evaluó el efecto de la aplicación foliar de la composición de la presente invención en el rendimiento y calibre de los frutos correspondientes a arándanos cv. Duke, el que contó con un diseño completamente aleatorizado compuesto de 2 tratamientos con 8 repeticiones de 5 plantas cada uno. Un resumen del Ensayo 3 se muestra en la Tabla 2A.
Tabla 2A. Resumen de tratamientos aplicados en el Ensayo 2.
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Al momento de cosecha se pesó toda la fruta de cada una de las plantas tratadas, estimando el rendimiento total expresado en kg/ha, presentando la distribución de cosecha para cada floreo. Después de la cosecha, se determinó el calibre de 10 frutos por planta tomados al azar, utilizando un calibrador metálico utilizado en la industria. Con estas medidas se obtuvo el promedio de diámetro de fruto por planta muestreada. Un resumen de los resultados obtenidos se muestra en las Tablas 2B, 2C y 2D.
Tabla 2B. Rendimiento total de los distintos tratamientos del Ensayo 2.
Rendimiento
Trata miento (kg / ha)
Figure imgf000018_0001
Media E.E
T0 6.741,9 1.539,1
TI 7.903,1 1.384,1
Tabla 2C. Distribución de cosecha para cada floreo y los distintos tratamientos del Ensayo 2. Medias con * indican diferencias significativas.
Figure imgf000018_0002
Tabla 2D. Medias de diámetro ecuatorial para cada floreo y los distintos tratamientos del Ensayo 2. Medias con * indican diferencias significativas.
Calibre
(mm)
Figure imgf000018_0003
En la Figura 2A se cuantifica el rendimiento del cultivo de los diferentes tratamientos en kg/ha. En la Figura 2B se muestra el porcentaje de distribución de cosecha en los diferentes floreos con respecto a la cosecha total, para cada uno de los 4 primeros floreos. A partir de estas figuras se observa que el uso de la composición de la invención (TI) aumentó el rendimiento en un 17%, promoviendo la concentración de cosecha.
Por otra parte, la Figura 2C muestra el efecto de los tratamientos en el calibre de los frutos, donde TI aumentó un 10% el calibre con respecto a T0, generando un cambio de categoría del fruto: de tamaño mediano a tamaño grande (entendiendo que el calibre chico equivale de 6 a 8 mm, mediano de 8 a 11 mm y grande mayor a 12 mm). Ejemplo 3: Calibre. Ensayo de campo en manzanas.
Se realizó un ensayo (Ensayo 3) para evaluar el efecto de la aplicación foliar de la composición de la presente invención en el calibre de manzana cv. Crípps Pink sometidas a estrés abiótico (crecimiento deficiente), el que contó con un diseño completamente aleatorizado compuesto de 3 tratamientos con 10 repeticiones de 1 planta cada uno. El ensayo fue realizado en un campo productivo en la zona de Pelarco, Región del Maulé. Un resumen del Ensayo 3 se muestra en la Tabla 3A.
Tabla 3A. Resumen de tratamientos aplicados en el Ensayo 3.
Figure imgf000019_0001
Un resumen de los resultados obtenidos se muestra en la Tabla 3B.
Tabla 3B. Peso promedio de fruto para los distintos tratamientos del Ensayo 3. Letras diferentes indican diferencias significativas (p valor < 0,05).
Figure imgf000019_0002
En la Figura 3 se compara el efecto de la cantidad de aplicaciones de la composición de la invención. Se observó un aumento del 12% en el calibre (peso promedio del fruto) en el caso de 4 aplicaciones (TI) y de 18% en el caso de 8 aplicaciones (T2) en comparación con el testigo sin aplicación (T0). Adicionalmente, se observó que las frutas tratadas con la composición de la invención presentaron un menor daño por insolación o exceso de sol, lo que se observa en una menor incidencia de manchas amarillas en la piel de los frutos (resultados no mostrados), lo que representa una mejora en la calidad del fruto.
Ejemplo 4: Estrés por calor. Evaluación del efecto de la aplicación de la composición de la invención en la productividad y calidad de en lechuga frente a estrés por calor.
Con el objetivo de evaluar el efecto de la aplicación foliar de la aplicación de la composición de la invención en la productividad y calidad en lechuga (Lactuca sativa ) frente a estrés por calor, se realizó un ensayo (Ensayo 4) en la Agrícola Hidrogourmet, ubicada San Fernando, Región de O'Higgins, Chile. El ensayo consistió en 3 tratamientos de 20 plantas cada una, de los que se evaluaron las 5 plantas centrales. Se contó con un sistema de NFT, donde las plantas fueron regadas periódicamente con solución de fertilizante basal. Las plantas fueron tratadas con una única aplicación 1 día previo al estrés por calor, con una exposición a 50°C por 4 horas, 3 semanas antes de cosecha. Se utilizó como testigo absoluto el tratamiento T0 sin aplicación. Como control positivo se utilizó una composición comercial a base de Ascophyllum nodosum (TI) y finalmente la composición de la invención (T2). Un resumen de las condiciones del Ensayo 4 se muestra en la Tabla 4A y en la Tabla 4B se muestra un resumen de los resultados obtenidos.
Tabla 4A. Resumen de tratamientos aplicados en el Ensayo 9.
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Tabla 4B. Variables de calidad de lechugas en Ensayo 4. Letras diferentes indican diferencias significativas (p valor < 0,05).
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De las Figuras 4A y 4B se concluye que la aplicación de la composición de la invención (T2) genera efectos superiores que el uso de una composición comercial a base de Ascophyllum nodosum (TI) en términos de aumentar el peso fresco y seco de las lechugas tratadas. Sólo el tratamiento T2 mostró un incremento significativo en comparación con el testigo sin aplicación (T0) en cuanto al peso seco (Figura 4B).
De la Figura 4C se concluye que la aplicación de la composición de la invención (T2) permite una recuperación significativamente más rápida en comparación con el uso de una composición comercial a base de Ascophyllum nodosum (TI), mostrando una recuperación de la deshidratación 33% mayor 1 semana posterior al estrés por calor.
Ejemplo 5: Estrés por frío. Evaluación del efecto de la aplicación de la composición de la invención en la productividad y calidad de en lechuga frente a estrés por frío.
Con el objetivo de evaluar el efecto de la aplicación foliar de la aplicación de la composición de la invención en la productividad y calidad en lechuga (Lactuca sativa ) frente a estrés por frío, se realizó un ensayo (Ensayo 5) en la Agrícola Hidrogourmet, ubicada San Fernando, Región de O'Higgins, Chile. El ensayo consistió en 3 tratamientos de 20 plantas cada una, de los que se evaluaron las 5 plantas centrales. Se contó con un sistema de NFT, donde las plantas fueron regadas periódicamente con solución de fertilizante basal. Las plantas fueron tratadas con una única aplicación 1 día previo al estrés por frío, con una exposición a -3°C por 4 horas, 1 semana antes de la cosecha. Se utilizó como testigo absoluto el tratamiento T0 sin aplicación. Como control positivo se utilizó una composición comercial a base de Ascophyllum nodosum (TI) y finalmente la composición de la invención (T2). Un resumen del Ensayo 5 se muestra en la Tabla 5A y los resultados obtenidos se muestran en las Tablas 5B y 5C.
Tabla 5A. Resumen de tratamientos aplicados en el Ensayo 5. Letras distintas indican diferencias significativas (p valor < 0,05).
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Tabla 5B. Medidas de rendimiento y porcentaje de lechugas en estado comercializable del Ensayo 5. Letras distintas indican diferencias significativas (p valor < 0,05).
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De lo anterior se concluye que la aplicación de la composición de la invención (T2) genera efectos 14% superiores en términos de potenciar el rendimiento de lechugas comercializables, que el uso de Ascophyllum nodosum (TI) utilizando la misma dosis comercial. TI y T2 mostraron resultados superiores al testigo sin aplicación (T0), donde la composición de la invención (T2) es 150% superior en rendimiento de unidades comercializables por hectárea, respecto a T0. Esta diferencia fue estadísticamente significativa.
Tabla 5C. Variables de calidad de lechugas en Ensayo 5. Letras distintas indican diferencias significativas (p valor < 0,05).
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De las Figuras 5A, 5B y 5C se concluye que la aplicación de la composición de la invención (T2) genera efectos superiores que el uso de Ascophyllum nodosum (TI) en términos de aumentar el peso fresco y seco de las lechugas tratadas. Ambos tratamientos mostraron incrementos significativos en comparación con el testigo sin aplicación (T0), donde la composición de la invención (T2) muestra un aumento de 49,7 y 22,3% superior en peso fresco y peso seco, respectivamente, respecto a T0.
De la Figura 5D se concluye que la aplicación de la composición de la invención (T2) genera una concentración de clorofila (nmol/mg peso seco) más de un 130% superior que la concentración observada usando Ascophyllum nodosum (TI). Solo el tratamiento T2 presenta diferencias significativas en comparación con el testigo sin aplicación (T0).
Ejemplo 6: Comparación de composiciones. Comparación de la composición de la invención con otras composiciones naturales y sintéticas.
Se realizó un ensayo (Ensayo 6) para evaluar el efecto de la aplicación foliar de la presente invención en el rendimiento en peso fresco, peso seco y niveles de clorofila en lechugas hidropónicas tipo Lollo blonda cv. Dabi, en comparación con otras composiciones naturales y sintéticas. El ensayo se realizó en Agrícola Hidrogourmet, ubicada San Fernando, Región de O'Higgins, Chile. El ensayo evaluó 6 tratamientos de 5 plantas cada una, en un sistema de NFT. Estos 6 tratamientos tienen por objetivo comparar la composición de la invención con otras composiciones con un mismo nivel de polifenoles totales (5g/L) de diferente naturaleza o elaborados mediante distintos procesos. Los tratamientos se detallan a continuación:
• T0 Testigo: Sin aplicación (control).
• TI Composición Invención: Composición de la invención.
• T2 Composición 1: Composición a base de la misma materia prima de la composición de la invención, elaborada mediante un proceso basado en la patente CN103211852A, en la que se omitió el uso de fase orgánicas para que el extracto también fuera acuoso (variable: proceso).
• T3 Sintético: Extracto sintético a base de ácido gálico y agua (variable: fuente sintética de polifenoles).
• T4 Biortig: Bioestimulante comercial a base de ortiga (variable: competidor comercial a base de extracto vegetal, no a base de alga).
• T5 Composición 2: Extracto de hoja de frutilla (100%), realizado con el mismo proceso de la invención (variable: fuente vegetal).
Un resumen de las condiciones del Ensayo 6 se muestra en la Tabla 6A.
Tabla 6A. Resumen de tratamientos aplicados en el Ensayo 6.
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Un resumen de los resultados obtenidos en el Ensayo 6 se muestra en la Tabla 6B. Tabla 6B. Resumen de los resultados del Ensayo 6.
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Al evaluar diferentes variables de calidad de las lechugas del Ensayo 6, en la Figura 6A se observó que los tratamientos TI al T5 aumentaron significativamente el peso completo de la planta (parte aérea + raíz). Sin embargo, en la Figura 6B se observó que solamente el tratamiento TI (composición de la presente invención) logró aumentar de forma significativa el porcentaje de materia seca en las lechugas. Esta ganancia significativa en materia seca fue de un 39% con respecto al testigo (T0). En términos del contenido de clorofila, la Figura 6C muestra que solo el tratamiento TI logró aumentar de forma significativa la concentración de clorofila en las lechugas tratadas. Este aumento normalizado por peso seco fue de un 212% con respecto a T0. Se infiere que el tratamiento utilizado pudo afectar positivamente la fotosíntesis y la formación de fotoasimilados, incrementando su porcentaje materia seca. Adicionalmente se observó que las hojas tratadas con TI mostraron un menor nivel de oxidación que T0, prolongando su vida post cosecha (resultados no mostrados).
El aumento significativo de la materia seca y de clorofila en las lechugas de TI en comparación con todos los otros tratamientos permite concluir que tanto la naturaleza de la materia prima, como el proceso utilizado en la composición de la invención son elementos significativos que en conjunto permiten lograr un efecto bioestimulante sorprendentemente mejor que al utilizar otras fuentes vegetales, otra naturaleza de polifenoles u otros procesos de extracción, a base de los mismos insumos.
Por último, a partir de los ejemplares del Ensayo 6, se realizó una cuantificación de deshidratación postcosecha para evaluar el efecto del uso de la composición de la invención en la deshidratación de la lechuga una vez cosechada y almacenada en frío. Para ello, 3 hojas representativas de cada uno de los tratamientos T0 y TI fueron refrigeradas durante 21 días a 5°C, y se cuantificó la pérdida de peso de cada una en dicho periodo. Un resumen de las condiciones y resultados de la cuantificación de deshidratación postcosecha se presenta en la Tabla 6C. Tabla 6C. Condiciones y resultados de cuantificación de deshidratación postcosecha.
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T0 presento un 20% de deshidratación al día 21. En cambio, TI presentó solo un 1,1% de deshidratación, comprobando el uso de la composición de la invención tiene un efecto retardante de la senescencia de la planta. Se muestran fotografías de las muestras al día 21 a 5°C, correspondientes a T0 y TI en las Figuras 6D y 6E, respectivamente.
Ejemplo 7: Efecto antimicrobiano. Efecto inhibitorio de crecimiento de la composición de la invención contra Bacillus sp, Enterobacter aerogenes, Salmonella sp, Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
Se realizaron ensayos rutinarios comparando el halo de inhibición, utilizando como control positivo un antibiótico, en particular, carbamicina 0,1 g/L para Bacillus sp, cloranfenicol 0,1 g/L para Enterobacter aerogenes, y ampicilina 0,1 g/L para Salmonella sp, Staphylococcus aureus y Escherichia coli como se muestra en la Tabla 7 a continuación.
Tabla 7. Resultados de la zona de inhibición para cada uno de los microorganismos en comparación con el control antibiótico.
Figure imgf000025_0002
Un ejemplo de los halos de inhibición se muestra en las Figuras 7A y 7B: halo de inhibición en Escherichia coli y halo de inhibición de ampicilina (antibiótico como control positivo), respectivamente. Si bien los ensayos muestran el efecto inhibidor de la composición de la invención en todos los microorganismos evaluados, se acompaña la imagen representativa del efecto en donde se aprecia más claramente el halo de inhibición en ambas placas ( Escherichia coli) .
Ejemplo 8: Calidad de la planta. Ensayo de campo en plantas de tomates.
Se realizó un ensayo (Ensayo 8) para evaluar el efecto de la aplicación foliar de la composición de la presente invención en la calidad de plantas de tomates cv. Cal Ace, el que contó con un diseño compuesto de 4 tratamientos con 3 repeticiones de 1 planta cada uno. En ensayo se realizó en el Centro Experimental Quillaja, de la empresa Fitonova, en Talca, Región del Maulé. Un resumen del Ensayo 8 se muestra en la Tabla 8A.
Tabla 8A. Resumen de tratamientos aplicados en el Ensayo 8.
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Donde Bio-3 es un producto comercial de la empresa Venavi, que corresponde a un recubrimiento a base de hidrocoloides. Un resumen de los resultados obtenidos en el Ensayo 8 se muestra en la Tabla 8B.
Tabla 8B. Variables de calidad de plantas de tomate en Ensayo 8.
Figure imgf000026_0002
1 medida a partir de la base del tallo por debajo del primer entrenudo hasta la parte superior de las ramas.
2 número de hojas verdaderas de cada plántula.
3 cada plántula fue dividida en parte aérea (tallo y hojas) y raíz.
En la Figura 8A se compara el efecto de los diferentes tratamientos sobre la altura de la plántula y el diámetro de su tallo. En cuanto a la altura de la plántula, el uso de la composición de la invención aumenta este parámetro entre un 47 y 96%, mostrando un efecto complementario con el uso de Bio-3 al 100%, siendo indiferente el uso de Bio-3 a 25% y 50%. En cuanto al diámetro del tallo de la plántula, el uso de la composición de la invención aumenta este parámetro entre un 28 y 100%, mostrando un efecto sinérgico con el uso de Bio-3, ya que, a mayor concentración de éste, mayor el diámetro del tallo.
En la Figura 8B se compara el efecto de los diferentes tratamientos sobre el peso fresco de la parte aérea de la plántula y el peso de su raíz. En cuanto al peso fresco de la parte aérea, el uso de la composición de la invención aumenta este parámetro entre un 52 y 98%. En cuanto al peso de la raíz, se observa un efecto similar, aumentando su peso entre un 94 y 169%. En ambos parámetros se observa un efecto sinérgico con el uso de Bio-3.
En la Figura 8C se compara el efecto de los diferentes tratamientos sobre el número de hojas y el largo de la raíz de la plántula. En cuanto al número de hojas, el uso de la composición de la invención aumenta este parámetro entre un 53 y 97%, mostrando un efecto sinérgico con el uso de Bio-3. En cuanto al largo de la raíz, se observa un efecto similar, aumentando su largo entre un 39% y 58%, sin embargo, la concentración de uso de Bio-3 no tiene un efecto relevante.
Ejemplo 9: Enraizamiento. Evaluación del efecto de la aplicación de la composición de la invención en el enraizamiento de plantas de arándanos en maternidad.
Con el objetivo de evaluar el efecto de la aplicación foliar de la composición de la invención en el crecimiento de plantas de arándano var. Emerald con 3 meses desde plantación, se evaluó su nivel de enraizamiento (% de exploración). Se aplicaron 3 bandejas de 200 cavidades por tratamiento (formato lOcc), 600 plantas en total por tratamiento.
Tabla 9A. Resumen de tratamientos aplicados en el Ensayo 9.
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Tabla 9B. Nivel de enraizamiento obtenidos en el Ensayo 9.
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1 medición de 15 plantas al azar por tratamiento.
De los resultados obtenidos mostrados en la Tabla 9B se observa que el porcentaje de exploración de raíces del pan con sustrato presenta un aumento de la exploración con la aplicación de la composición de la invención. El promedio más alto lo obtuvo T2, correspondiente a 2 aplicaciones del producto separadas cada 15 días, teniendo un aumento de un 25% de exploración respecto al control. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos.
Ejemplo 10: Enraizamiento. Evaluación del efecto de la aplicación de la composición de la invención en el enraizamiento de plantas de cerezo en maternidad.
Con el objetivo de evaluar el efecto de la aplicación de la composición de la invención en el crecimiento de plantas de cerezo G6 después de 10 días de trasplante, se evaluó su nivel de enraizamiento (% de exploración). Se aplicaron 3 bandejas de 72 cavidades por tratamiento (formato 60cc), 216 plantas en total por tratamiento.
Tabla 10A. Resumen de tratamientos aplicados en el Ensayo 10.
Figure imgf000028_0002
Tabla 10B. Nivel de enraizamiento obtenidos en el Ensayo 10.
Figure imgf000029_0001
1 medición de 15 plantas al azar por tratamiento.
De los resultados obtenidos mostrados en la Tabla 10B se observa que el porcentaje de exploración de raíces del pan con sustrato presenta un aumento de la exploración con la aplicación de la composición de la invención. El promedio más alto lo obtuvo T3, correspondiente a una aplicación dirigida al sustrato, teniendo un aumento de un 14% de exploración respecto al control. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos.
Ejemplo 11: Altura de la planta. Evaluación del efecto de la aplicación de la composición de la invención en la altura de estacas enraizadas de patrón Nemaguard.
Con el objetivo de evaluar el efecto de la aplicación foliar de la composición de la invención en el crecimiento de estacas de Nemaguard con 2 meses desde plantación, se evaluó la altura de planta obtenida. Se aplicaron 3 bandejas de 72 cavidades por tratamiento (formato 60cc), 216 plantas en total por tratamiento.
Tabla 11A. Resumen de tratamientos aplicados en el Ensayo 11.
Figure imgf000029_0002
Tabla 11B. Altura promedio de las plantas obtenidas en el Ensayo 11.
Figure imgf000030_0001
1 medición de 15 plantas al azar por tratamiento.
De los resultados obtenidos mostrados en la Tabla 11B se observa en la evaluación de altura, una tendencia de ésta a ser mayor en tratamientos con aplicaciones de la composición de la invención, siendo el aumento en promedio de un 17%. La cantidad de aplicaciones no muestra incidencia en los resultados. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos.
Ejemplo 12: Rendimiento. Evaluación del efecto de la aplicación de la composición de la invención en el rendimiento de tubérculos de papa en aeroponía.
Se realizó un ensayo (Ensayo 12) para observar el efecto de la aplicación foliar de la composición de la invención en plantas de papa en aeroponía, evaluando rendimiento de los tubérculos generados. Se evaluó una dilución de 1:100 equivalente a 3L/ha con un mojamiento de 300 L/ha. En la Tabla 12A se detallan los tratamientos utilizados en el ensayo:
Tabla 12A. Resumen de tratamientos aplicados en el Ensayo 12.
Figure imgf000030_0002
Los resultados obtenidos en el Ensayo 12 se muestran en la Tabla 12B. Tabla 12B. Rendimientos obtenidos en el Ensayo 12.
Figure imgf000031_0001
En la Tabla 12B se observa que el rendimiento promedio por planta de tubérculos sobre los 15mm de diámetro obtenidos presentó un incremento del 11% en las plantas tratadas con la composición de la invención. Éstos son los tubérculos comercializables, por lo que el objetivo del Ensayo 12 era justamente aumentar dicho parámetro, dando resultados positivos.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Una composición bioestimulante para aplicación agrícola, CARACTERIZADA porque comprende extractos vegetales de hojas de berries con una concentración de polifenoles totales ajustada en un rango entre 4 y 12 g/L.
2.- La composición de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADA porque las hojas de berries corresponden total o parcialmente a hojas de arándanos.
3.- La composición de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADA porque los compuestos mayoritarios comprenden:
• quercitina, miricetina, e isorhamnetina entre los flavonoles y flavonas; y
• ácido clorogénico, ácido cafeico, ácido gálico, ácido feruloilquínico, ácido hidroxibenzoico, ácido ferúlico, ácido cumárico, y resveratrol, entre los ácidos hidroxicinámicos, ácidos benzoicos y fenoles.
4.- La composición de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADA porque además comprende estabilizantes, y preservantes o conservantes.
5.- La composición de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADA porque los estabilizantes son gomas vegetales y se seleccionan de entre goma gellan, arábiga, xantana, garrotín, guar, tragacanto, karaya y tara.
6.- La composición de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADA porque los preservantes o conservantes se seleccionan de entre benzoato de sodio, sorbato de potasio, sorbato de calcio, sales de sorbato y ácidos orgánicos, tales como ácido propiónico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido ascórbico y ácido acético.
7.- La composición de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADA porque es suplementada con macronutrientes, como nitrógeno, fósforo, potasio, carbono; nutrientes secundarios, como calcio, magnesio, y azufre; micronutrientes, como fierro, manganeso, cobre, zinc, boro, molibdeno, y cloro; u otros nutrientes, como aminoácidos.
8.- Proceso de preparación de la composición de la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque comprende las siguientes etapas: a) mezclar las hojas de berries con agua en una razón en peso de sólido: líq u ido entre 1:1 a 1:50 donde el agua está a una temperatura entre 20 y 90°C; b) agitar la mezcla entre 50 y 800 rpm durante 0,5 a 12 horas; c) opcionalmente incorporar aditivos preservantes o conservantes y estabilizantes sin dejar de agitar; d) agitar la mezcla entre 50 a 800 rpm por hasta 30 min adicionales; e) separar los sólidos y restos de hojas secas de la porción acuosa; y f) ajustar la concentración de polifenoles totales en un rango entre 4 y 12 g/L de la composición.
9.- Proceso de acuerdo a la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque antes de ser procesadas, las hojas de berries se someten a secado y molienda.
10.- Proceso de acuerdo a la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque el secado se puede realizar a la sombra o al sol, en estufa, por microondas, por aire frío o caliente; o mediante liofilización.
11.- Proceso de acuerdo a la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque el agua usada en la etapa a) está preferentemente entre 40 y 60°C.
12.- Proceso de acuerdo a la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque la agitación en la etapa b) se hace preferentemente entre 1 y 3 horas.
13.- Proceso de acuerdo a la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque la separación en la etapa c) se realiza mediante filtración, centrifugación o decantación.
14.- Proceso de acuerdo a la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque contempla añadir a la composición los suplementos o nutrientes necesarios de acuerdo a la formulación deseada.
15.- Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, CARACTERIZADO porque sirve para preparar formulaciones bioestimulantes para cultivos agrícolas.
16.- Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, CARACTERIZADO porque sirve para preparar formulaciones con actividad antimicrobiana, en donde preferentemente tienen actividad contra Bacillus sp, Enterobacter aerogenes, Salmonella sp, Staphylococcus aureus Escherichia coli.
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