WO2021106814A1 - 非リボソームｒｎａ含有試料の製造方法 - Google Patents

非リボソームｒｎａ含有試料の製造方法 Download PDF

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WO2021106814A1
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rna
ribosome
mrna
rrna
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信太郎 岩崎
麻理 水戸
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国立研究開発法人理化学研究所
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a non-ribosome RNA-containing sample.
  • the present invention relates to a method for analyzing non-ribosomal RNA using a non-ribosomal RNA-containing sample produced by a method for producing a non-ribosomal RNA-containing sample.
  • the present invention relates to a kit used to carry out a method for producing a non-ribosome RNA-containing sample.
  • Next-generation sequencers can process tens of millions to hundreds of millions of randomly cut DNA fragments in parallel, from 1 billion bases (1 gigabase) to 100 billion bases (1 terabase) in a single sequence run. You can get the data until it arrives.
  • Next-generation sequencers are used in research such as whole-genome sequencing, target sequencing targeting genomic regions related to specific research subjects such as diseases, and epigenetics such as methylation sequencing.
  • next-generation sequencer is also used for research on the central dogma of molecular biology, that is, the concept that genetic information is transmitted in the order of "DNA-> (transcription)-> mRNA (messenger RNA)-> (translation)-> protein". ing.
  • RNA-Seq RNA sequence
  • RNA sequence can be used for comprehensive gene expression analysis by clarifying the presence and amount of RNA in a biological sample at a specific moment using a next-generation sequencer.
  • RNA sequence can be used for comprehensive gene expression analysis by clarifying the presence and amount of RNA in a biological sample at a specific moment using a next-generation sequencer.
  • RNA sequence can be used for comprehensive gene expression analysis by clarifying the presence and amount of RNA in a biological sample at a specific moment using a next-generation sequencer.
  • ribosome profiling using a next-generation sequencer. It is possible to comprehensively analyze whether or not the translation is done and get a bird's-eye view of the translation status.
  • Ribosome profiling is a method based on deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments (Patent Document 1). Information on ribosome profiling can be useful for investigating translational regulation, measuring gene expression, measuring protein synthesis rate, or predicting protein abundance.
  • Patent Document 1 U.S. Pat. No. 8486865
  • Non-Patent Document 1 Ingolia et al., 2009, Science, 324, 218-23
  • Non-Patent Document 2 Weinberg et al., 2016, Cell Rep, 14, 1787-1799
  • Non-Patent Document 3 McGlincy and Ingolia, 2017, Methods, 126, 112-129
  • the entire description of Patent Document 1 and Non-Patent Documents 1 to 3 is incorporated herein by reference.
  • ribosomal RNA In traditional ribosomal profiling, ribosomal RNA (rRNA) overoccupies the sequencing library, so the percentage of sequence reads available for analysis, specifically the sequence mapped to the protein coding region (CDS). There is a problem that the ratio of leads is small. For example, in Non-Patent Document 1, when 42 million fragments obtained using the ribosomal protection assay in Saccharomyces cerevisiae were sequenced, 7 million (16%) sequence reads were mapped to CDS, but the rest. Most of them are reported to be derived from rRNA. Because statistical analysis generally depends on the size of the mRNA sequence reads, low yields of sequence reads available in the library interfere with analysis with deep sequencing-based approaches such as ribosome profiling.
  • RNA-seq In addition to ribosomal profiling, RNA-seq also has the problem of contamination with excess rRNA in the sequencing library.
  • Non-Patent Document 2 reports that when a library for RNA-seq was prepared from total RNA in which mRNA was not concentrated, 90.2% of the 199.7 million reads were rRNA. The presence of excess rRNA sequence reads has the problem of significantly reducing the efficiency of transcriptome analysis.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing a non-ribosome RNA-containing sample, which comprises a new step for removing ribosomes.
  • the present inventors have found that the ribosome subunit can be efficiently removed by exfoliating the ribosome subunit and mRNA.
  • the present invention is based on this finding. According to the present invention, the following inventions are provided. [1] In a sample containing mRNA and ribosome A step (a) of exfoliating the subunit of the ribosome and the mRNA, and a step (b) of removing the subunit of the ribosome exfoliated in the step (a) are included.
  • a method for producing a non-ribosome RNA-containing sample are included in a sample containing mRNA and ribosome.
  • [2] The method for producing a non-ribosome RNA-containing sample according to [1], further comprising a step of degrading RNA or a step of fragmenting RNA in a sample containing mRNA and ribosome.
  • [3] The method for producing a non-ribosome RNA-containing sample according to [1] or [2], wherein the step (a) of stripping the subunit of ribosomal RNA from mRNA is performed using a chelating agent.
  • [5] The step of obtaining a non-ribosomal RNA-containing sample by carrying out the method for producing a non-ribosomal RNA-containing sample according to any one of [1] to [4], and the base sequence of RNA in the non-ribosomal RNA-containing sample.
  • a method for analyzing non-ribosomal RNA which comprises the step of determining.
  • [6] Includes reagents for exfoliating ribosome subunits and mRNA, and means for removing ribosome subunits.
  • FIG. 1 is a schematic view of the present invention.
  • a protein denaturant (monosome) fraction obtained by ultracentrifugation or gel-filtration after RNase treatment is used.
  • RNase treatment RNase treatment
  • treatment with a solution containing phenol, guanidine isothiocyanate is used to purify the Footprint.
  • the monosome fraction obtained by ultracentrifugation or gel-filtration is treated with a chelating agent to treat ribosomes with large and small subunits and footprints.
  • FIG. 2 shows the number of reads obtained by analyzing the libraries prepared by the standard method, the Ribosome splitting method, the standard method + rRNA depletion, and the Ribosome splitting method + rRNA depletion of the examples.
  • Mapped means the number of reads mapped to the protein coding region (CDS) and corresponds to the number of ribosomes in the mRNA. RPM is reads per million.
  • CDS protein coding region
  • RNA length means a nucleotide.
  • RNA-seq is a technology that enables genome-wide gene expression level profiling.
  • RNA-seq is expressed in all transcriptome sequences (total RNA-seq) that can comprehensively grasp the transcription profile of cells by biological moments, as well as expression differences and expression differences by measuring only the target transcript.
  • target RNA sequences for analyzing allele-specific gene expression low molecular weight non-coding RNA sequences for transcriptional and translational regulation (eg, transfer RNA, snoRNA, snRNA, etc.) and microRNA sequences.
  • snRNA small nuclear RNA
  • snRNA small nuclear RNA
  • SnoRNA nucleolar RNA
  • microRNAs are classified as functional non-coding RNAs, they are functional nucleic acids that are encoded on the genome and undergo a multi-step production process to eventually become microRNAs with a length of 20 to 25 bases, for example. It is involved in the regulation of basic biological phenomena such as cell development, differentiation, proliferation and cell death.
  • Ribosome profiling utilizes the fact that when an mRNA molecule is degraded by an enzyme or the like, a part of the mRNA to which the ribosome is bound remains protected from the degradation, and a large number of sequences of a part of the mRNA to which the ribosome is bound are arranged. It is a technique to determine and determine the region of mRNA that was actively translated in the cell at a particular time.
  • footprint means a part of mRNA that remains protected from degradation by enzymes or the like in ribosome profiling.
  • the length of the footprint is about 40 nt or less, about 30 nt.
  • read or “sequence read” generally means a data sequence of A, T, C, and G bases determined by a DNA sample or an RNA sample.
  • Reads or sequence reads herein are sequences determined specifically for DNA fragments in sequencing libraries prepared from non-ribosome RNA-containing samples of the invention.
  • non-coding RNA is used as a general term for RNAs that do not encode proteins, and examples of non-coding RNAs include rRNA, transfer RNA (tRNA), ribosomal RNA derived from mitochondria (Mt-rRNA), and transfer RNA derived from mitochondria. Examples thereof include RNA (Mt-tRNA), ribosomal RNA derived from chlorophyll, transfer RNA derived from chlorophyll, snRNA, snoRNA, microRNA and the like.
  • non-ribosomal RNA is used as a general term for RNAs other than ribosomal RNA (rRNA), and examples of non-ribosomal RNA include mRNA, transfer RNA (tRNA), and mitochondrial-derived transfer RNA (Mt-tRNA). Examples thereof include chloroplast-derived transfer RNA, snRNA, snoRNA, and microRNA.
  • the method for producing a non-ribosome RNA-containing sample of the present invention is a method for producing a non-ribosome RNA-containing sample in a sample containing mRNA and ribosome.
  • the step (a) of exfoliating the subunit of the ribosome and the mRNA, and the step (b) of removing the subunit of the ribosome exfoliated in the step (a) are included.
  • Non-Patent Document 1 reports that 16% of sequence reads obtained by ribosomal profiling were mapped to CDS, but most of the rest was derived from rRNA.
  • Non-Patent Document 2 reports that 90.2% of the sequence reads obtained when the RNA-seq library was prepared from total RNA in which mRNA was not concentrated was rRNA. Also in the examples below, the conventional standard method shows that 92% of all reads are derived from rRNA. In order to reduce sequence reads derived from rRNA, rRNA-subtraction oligonucleotides that can hybridize to rRNA and be trapped in magnetic beads are used (Non-Patent Documents 2 and 3). In the examples below, it is shown that even with this method, 77% of all reads were derived from rRNA and 18% of mRNA reads.
  • RNA-seq a library for ribosomal profiling or RNA-seq is prepared from the non-ribosome RNA-containing sample produced in the present invention, it is possible to efficiently obtain reads for mRNA and non-coding RNA, especially low-molecular-weight non-coding RNA and microRNA. it can.
  • the non-ribosome RNA-containing sample produced by the present invention is not limited to use in ribosomal profiling, and is also effective for RNA-seq.
  • sample containing mRNA and ribosome is a crude extract of a cell or tissue containing mRNA and ribosome, obtained by lysing or crushing a single cell, cell population, cultured cell or tissue (hereinafter referred to as lysate). ), And a cell, cell population, cultured cell or tissue is derived from any organism. Specific examples thereof include, but are not limited to, bacteria, fungi, animal cells or tissues, plant cells or tissues, or lysates of cultured cells thereof.
  • Lysates can be prepared by cell lysis with detergents or physical crushing (eg, mechanical crushing, homogenization in solution, sonication, freeze thawing, crushing with dairy pots and nipples), etc.
  • the adjustment method can be appropriately selected according to the species and the type of cell / tissue.
  • the method for producing a non-ribosomal RNA-containing sample of the present invention can include, as a pretreatment, a step of lysing or disrupting cells to obtain lysate.
  • Lysates are preferably prepared by mild means, eg, cytolysis with detergents, to avoid degradation or damage to the ribosomes. For the same reason, it is preferable to prepare lysate without using a protein denaturing agent, an Mg 2+ chelating agent, or an organic solvent such as phenol or chloroform. Since DNA interferes with subsequent cDNA synthesis, it may be degraded using, for example, DNase. In addition, lysates can be obtained in the presence of the protein translation inhibitor cycloheximide.
  • the lysate suspends the cells in a buffer containing a detergent and cycloheximide, incubates in the presence of DNase I (RNase-free), and centrifuges, as in the examples below. It can be obtained as a supernatant obtained in the above.
  • samples containing mRNA and ribosome include non-coding RNA such as rRNA, transfer RNA (tRNA), mitochondrial-derived ribosome RNA (Mt-rRNA), mitochondrial-derived transfer RNA (Mt-tRNA), and chloroplast. It can be said that it is a sample that can contain derived ribosome RNA, chlorophyll-derived transfer RNA, snRNA, snoRNA, microRNARNA and the like.
  • non-ribosome RNA-containing sample in the sample containing mRNA and ribosome, the ribosomal subunit and the mRNA are stripped, and the stripped ribosome subunit is removed in the step (a). It is obtained by carrying out the step (b).
  • the non-ribosome RNA-containing sample may contain mRNA, transfer RNA (tRNA), mitochondrial-derived transfer RNA (Mt-tRNA), chlorophyll-derived transfer RNA, snRNA, snoRNA, microRNA, and the like, and further specific RNA species. May be concentrated.
  • the non-ribosome RNA-containing sample may be a sample for preparing a sequencing library, and the sequencing library can be, for example, a library for ribosomal profiling or RNA-seq, but is not limited thereto. ..
  • the rRNA content in the non-ribosome RNA-containing sample of the present invention is reduced as compared with the content of the non-ribosome RNA-containing sample obtained by the conventional method (for example, the standard method of Example 1).
  • the ratio of the number of reads of rRNA determined by the sequencing library prepared from the non-ribosomal RNA-containing sample of the present invention to the total number of reads is the sequencing prepared from the sample obtained by the conventional method (for example, the standard method of Example 1). It is decreasing compared to the same ratio in the library.
  • a ribosome is a huge RNA-protein complex consisting of several rRNA molecules and about 50 types of proteins, and is composed of two large and small particles as a whole.
  • two large and small particles of ribosome are referred to as a large subunit and a small subunit, respectively.
  • the specific composition of the ribosome is, for example, in prokaryotic ribosomes, the large and small subunits are called the 50S and 30S subunits, respectively, and the 50S subunits are 23S rRNA (2904nt) and 5S.
  • rRNA 120nt
  • 34 proteins with a molecular weight of 1.6 million
  • 30S subunit consists of 16S rRNA (1542nt) and 21 proteins with a molecular weight of 900,000.
  • the aggregate of these two subunits becomes a 70S particle, which has a molecular weight of 2.7 million.
  • the large and small subunits are called the 60S and 40S subunits, respectively, and the 60S subunits are 28S rRNA (4718nt), 5.8S rRNA (160nt), and 5S rRNA.
  • the ribosome is a place where translation is performed by holding mRNA, reading its genetic information, and converting it into protein. By exfoliating the aggregates of both subunits into large and small subunits, the mRNA in the mouth can be separated from the ribosome.
  • the step (a) of exfoliating the subunits of the ribosome and the mRNA can be carried out by any method, for example, by removing Mg 2+ ions necessary for maintaining the aggregate of both subunits. be able to. Mg 2+ ions can be removed by any method, for example with a chelating agent. That is, the step (a) of exfoliating the subunit of the ribosome and the mRNA can be performed using a chelating agent.
  • the chelating agent examples include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), nitrilotriacetic acid (NTA), diethylenetriaminepentacetic acid (DTPA), glycol etherdiaminetetraacetic acid (EGTA, GEDTA) and the like, and in particular, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). ) Is preferable.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the concentration of the chelating agent can be 0.1 mM to 30 mM, preferably 5 mM to 15 mM.
  • the treatment with a chelating agent may be performed by leaving it on ice for 30 seconds to 60 minutes, and the treatment time can be appropriately changed.
  • Step (b) of removing the subunit of the ribosome exfoliated in step (a) includes the large and small subunits stripped in the step (a) of stripping the subunits of the ribosome and the mRNA, including the mRNA and the ribosome. This is the process of removing from the sample. Removal of large and small subunits can be carried out by adopting any method that can be removed based on their size, for example, by ultrafiltration, size exclusion chromatography (SEC), or the like. be able to.
  • SEC size exclusion chromatography
  • the molecular weight of the smallest prokaryotic subunit among the ribosomal subunits is about 900,000.
  • Transfer RNAs tRNAs
  • mitochondrial transfer RNAs Mt-tRNAs
  • chlorophyll-derived transfer RNAs snRNAs, snoRNAs, and microRNAs are well more than the smallest prokaryotic small subunits of the ribosome subunits. Since it is small, it can be separated from large and small subunits by the above method depending on the size difference.
  • the length of mRNA varies, and in the case of humans, it often exceeds 1000 bases, so it may not be possible to separate it from large and small subunits due to the difference in size. It is preferable to carry out the step of fragmenting the RNA described later before the step of removing the subunit of the ribosome (b) to fragment the mRNA into a size that can be separated from the large and small subunits.
  • Ultrafiltration is a method in which a solution is permeated through a membrane to concentrate or remove components in the solution.
  • the ultrafiltration membrane has a molecular weight cut off (MWCO), and molecules larger than the molecular weight fraction of the membrane are retained in the membrane, and the permeate contains more molecular weight than the molecular weight fraction of the membrane. Large molecules are removed.
  • the step of removing large and small subunits of ribosome can be performed by ultrafiltration. More specifically, ultrafiltration can be used to permeate RNA in a sample containing mRNA and ribosomes, and retain the large and small subunits of ribosomes on the membrane to obtain a permeate containing RNA.
  • RNA that is permeated through the ultrafiltration membrane and recovered may be any RNA, such as mRNA, tRNA, Mt-tRNA, chlorophyll-derived transfer RNA, snRNA, snoRNA, microRNA, and rRNA may also be contaminated. ..
  • an ultrafiltration membrane that allows RNA to permeate and retains the large and small subunits of ribosomes on the membrane may be used. Since the permeability and retention of the ultrafiltration membrane vary depending on various conditions such as filtration pressure, presence of other solutes, molecular shape, adsorptivity, ionic strength, etc., the ultrafiltration membrane is selected below. However, the above is not limited to these, and the optimum one can be appropriately selected in consideration of the recovery rate of RNA and the speed of filtration treatment.
  • the ultrafiltration membrane that can be used in step (b) of the method for producing a non-ribosomal RNA-containing sample of the present invention has a molecular weight cut-off (MWCO) in the range of 10 K (hereinafter, K represents 10 3 ) to 2000 K.
  • MWCO molecular weight cut-off
  • the molecular weight of the smallest prokaryotic small subunit among the ribosomal subunits is about 900,000, so the fractional molecular weight (MWCO) is 900 K.
  • a smaller ultrafiltration membrane preferably an ultrafiltration membrane with a MWCO of 150K to 300K, can be used to retain and remove prokaryotic large and small subunits on the membrane.
  • the molecular weight of the small subunit of eukaryote is about 1.5 million, if an ultrafiltration membrane with a MWCO of less than 1500K, preferably an ultrafiltration membrane with a MWCO of 250K to 500K, is used, the eukaryotic Large and small subunits can be held on the membrane and removed. From the viewpoint of the retention rate of large and small subunits on the membrane, it is preferable to use a membrane having a MWCO of 500 K or less, and more preferably a membrane having a MWCO of 300 K or less.
  • the method for producing a non-ribosomal RNA-containing sample of the present invention may include a step of decomposing RNA or a step of fragmenting it, as described later. When these steps are included, RNA degradation either leaves the RNA as a footprint of 40 nt or less in length or fragmentes it to a length that depends on the sequencing platform.
  • RNA degradation either leaves the RNA as a footprint of 40 nt or less in length or fragmentes it to a length that depends on the sequencing platform.
  • the selection of an ultrafiltration membrane for recovering RNA fragments based on the molecular weight of RNA (about 320.5 / base) will be examined below.
  • RNA molecular weight of about 13000
  • MWCO uses an ultrafiltration membrane in the range of 100K to 500K
  • at least about 100 nt RNA molecular weight about 32000
  • MWCO uses an ultrafiltration membrane in the range of 300K to 500K, it can permeate at least about 500 nt RNA (molecular weight about 160,000) and retain large and small subunits of prokaryotes and eukaryotes on the membrane. it can. If MWCO uses a 500K ultrafiltration membrane, it can permeate at least about 1000 nt RNA (molecular weight about 320,000) and retain large and small subunits of prokaryotes and eukaryotes on the membrane. It is considered that linear molecules such as RNA may pass through a membrane capable of blocking spherical molecules having the same molecular weight.
  • ultrafiltration can be performed using a centrifugal ultrafiltration filter unit composed of a tube with an ultrafiltration membrane.
  • the centrifugal ultrafiltration filter unit can be further inserted into a tube to form a double-structured centrifugal ultrafiltration tube.
  • the centrifugal ultrafiltration filter unit may be used according to the description in the instruction manual of the supplier.
  • the step (b) of removing the subunits of the ribosome exfoliated in the step (a) can be performed by size exclusion chromatography.
  • the step (b) of removing the subunits of the ribosome exfoliated in step (a) can be performed by gel filtration chromatography using a spin column. Specifically, for example, using illustra TM MicroSpin TM S-400 HR Columns (GE Healthcare, cat. No. 27-5140-01), the procedure can be performed as follows. 1. Mix the S-400 column well, remove the tip of the column and place in a 2 mL reservoir tube. 2.
  • step (b) of removing the ribosome subunits exfoliated in step (a) can be performed by a size exclusion chromatography method using ultra-high performance liquid chromatography (uHPLC) (Yoshikawa). et al. eLife 2018; 7: e36530 DOI: 10.7554 / eLife.36530). Specifically, a 7.8 x 300 mm column with 5 ⁇ m particles, such as a ThermoBioBasicSEC 300A, 1,000A, 2,000A column, or an Agilent BioSEC-5 2,000A column, can be used.
  • uHPLC ultra-high performance liquid chromatography
  • each SEC column is filtered with a 2-column volume (CV) SEC buffer (20 mM Hepes-NaOH (pH 7.4), 60 mM NaCl, 30 mM EDTA). , 0.3% CHAPS, 0.2 mg / mL heparin, 2.5 mM DTT) and 100 ⁇ L of 10 mg / mL filtered bovine serum albumin (BSA) solution diluted with PBS to block sites of non-specific interaction.
  • CV 2-column volume
  • SEC buffer 20 mM Hepes-NaOH (pH 7.4), 60 mM NaCl, 30 mM EDTA).
  • CHAPS 0.2 mg / mL heparin, 2.5 mM DTT
  • BSA bovine serum albumin
  • Flow rate is 0.8 mL / min, 48 x 100 ⁇ L fraction, 24 x 200 ⁇ L fraction, or 16 x 300 ⁇ L fraction, 4 in 9 to 14.6 minutes using a low protein binding 96 deep well plate 1 mL (Eppendorf). Collect at ° C. Quantify peaks using the Chromeleon 6.8 Chromatography Data System (Thermo Fisher Scientific).
  • the sample after the ribosome subunit has been removed by ultrafiltration, size exclusion chromatography, etc. can be used for purification.
  • Purification may be carried out by using a known RNA purification method, and for example, purification can be performed using a solution containing phenol / chloroform, phenol and guanidine isothiocyanate or the like.
  • the method for producing a non-ribosomal RNA-containing sample of the present invention can be combined with a known rRNA removal method, monosome enrichment method, and mRNA enrichment method.
  • a known rRNA removal method that can be combined there is a method using an rRNA-subtraction oligonucleotide that can hybridize to rRNA and be trapped in magnetic beads (Non-Patent Documents 2 and 3), and Ribo-Zero (registered trademark) rRNA Removal. It can be carried out using Kit (illumina).
  • poly A selection method in which poly A tail RNA is used as Oligotex (registered trademark) -dT30 ⁇ Super> mRNA Purification Kit (Takara) or oligo (dT) -Dynabeads. It can be concentrated using (registered trademark).
  • Known methods for concentrating monosomes that can be combined include a sucrose density gradient centrifugation method, a sucrose cushion centrifugation method, and gel filtration chromatography using the above spin column.
  • the number of rRNA reads can be reduced relative to the total number of reads.
  • the ratio of rRNA reads to total reads is 80% or less, 75% or less, 70% or less, 65% or less, 60% or less, 55% or less, 50% or less, 45% or less, 45. It can be reduced to% or less, 40% or less, 35% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% or less, or 10% or less.
  • Non-Patent Documents 2 and 3 by combining the production method of the present invention with a method using rRNA-subtraction oligonucleotides that can hybridize to rRNA and trap in magnetic beads (Non-Patent Documents 2 and 3), the number of rRNA reads relative to the total number of reads can be increased. Can be reduced. Specifically, the ratio of rRNA reads to total reads is 50% or less, 45% or less, 40% or less, 35% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% or less, or It can be reduced to 10% or less.
  • the method for producing a non-ribosome RNA-containing sample of the present invention can further include a step of degrading or fragmenting RNA in a sample containing mRNA and ribosome.
  • Ribosome profiling usually involves the step of degrading RNA, and in the present invention, the step of degrading RNA can be performed before the step (a) of stripping the subunits of the ribosome and the mRNA. If the RNA contained in the non-ribosome RNA-containing sample is long and cannot be separated from the large and small subunits based on the size, "step (a) of removing the stripped ribosomal subunits (b). ) ”MRNA fragmentation may be performed before.
  • the step of degrading RNA can be carried out for the purpose of obtaining a footprint analyzed by, for example, ribosome profiling.
  • the step of degrading RNA can be performed, for example, by enzymatic degradation.
  • RNA degradation refers to modifying RNA so that it is shorter than before degradation, and enzymatic degradation of RNA uses an enzyme that can modify RNA to be shorter than before degradation.
  • the enzyme used may be a ribonuclease (RNA degrading enzyme) such as endoribonuclease or exoribonuclease, and single-strand-specific RNA endonucleases such as RNase I can be used.
  • examples of other enzymes that can be used for RNA degradation include RNase A and RNase T1.
  • RNA degradation may be carried out by partial alkaline hydrolysis described below.
  • the step of degrading RNA is carried out before the step (a) of exfoliating the subunit of ribosome and mRNA.
  • RNA degradation can be performed by RNase I digestion. RNase I digestion degrades RNA molecules in samples containing mRNA and ribosomes, but protects some of the mRNA to which ribosomes are bound from degradation. A part of mRNA to which one ribosome is bound is called a monosome.
  • the monosome in the sample containing mRNA and ribosome can be concentrated by sucrose density gradient centrifugation, sucrose cushion centrifugation, gel filtration chromatography using the above spin column, or the like.
  • the RNA is sufficiently reduced so that the subunits of the ribosome can be separated based on the size. It can be carried out for the purpose and can be sized to the desired size by any means that can be carried out.
  • RNA fragmentation refers to cleaving RNA to an appropriate fragment size, for example, to a length that corresponds to the sequencing platform.
  • RNA fragmentation can be performed by partial alkaline hydrolysis.
  • 10 ⁇ L of 2x alkaline hydrolysis solution (2 mM EDTA, 12 mM Na 2 CO 3 , 88 mM LVDS 3 , pH 9.3 is added to an equal volume of RNA-containing solution (eg, lysate). And the mixture is incubated at 95 ° C.
  • Fragmentation by partial alkaline hydrolysis can be performed with high control over RNA to a suitable size, but for the present invention, for example, 100-3000 nt, preferably 100-1000 nt, more preferably. It is fragmented to 100-500 nt, and even more preferably 100-300 nt.
  • RNA fragmentation can be performed by ultrasonic shearing.
  • Ultrasonic shearing can be performed, for example, by placing lysate in a 15 mL falcon tube and sonicating it in a water bath at 4 ° C. using an existing ultrasonic crusher. Fragmentation by sonication can be performed with a high degree of control so that the RNA has an appropriate size, but for the present invention, for example, 100-3000 nt, preferably 100-1000 nt, more preferably 100- It is fragmented to 500 nt, even more preferably 100-300 nt.
  • RNA fragmentation can be performed enzymatically.
  • an enzyme that can randomly fragment single-stranded RNA to a desired size without depending on the base sequence.
  • RNase I, RNase A, RNase T1, RNase T2, MNase (Micrococcal Nuclease), RNase V1, RNase S1 and the like can be used.
  • Enzymatic fragmentation can be performed with a high degree of control so that the RNA has an appropriate size, but for the present invention, for example, 100-3000 nt, preferably 100-1000 nt, more preferably 100-500 nt, Even more preferably, it is fragmented to 100-300 nt.
  • RNA-containing sample for preparing a library for RNA-seq which is the step of fragmenting RNA or the step of exfoliating ribosomal subunits and mRNA (a) as long as the ribosome is not destroyed? May be done first.
  • a non-ribosomal RNA-containing sample may be produced by carrying out a method for producing a non-ribosome RNA-containing sample without performing a step of degrading RNA or a step of fragmenting RNA.
  • a method for producing a non-ribosome RNA-containing sample without performing a step of degrading RNA or a step of fragmenting RNA.
  • small non-coding RNA for example, tRNA, snoRNA, snRNA, etc.
  • microRNA small non-coding RNA
  • low-molecular-weight non-coding RNA has a short length of about 200 nt or less
  • microRNA has a short length of 30 nt or less, and can be separated based on the subunit and size of the ribosome without fragmentation.
  • the method for analyzing non-ribosomal RNA of the present invention is a step of obtaining a non-ribosomal RNA-containing sample by carrying out the above-mentioned method for producing a non-ribosomal RNA-containing sample, and a step of determining the base sequence of RNA in the non-ribosomal RNA-containing sample.
  • Non-ribosomal RNAs include mRNA (including footprint), tRNA, Mt-tRNA, chlorophyll-derived transfer RNA, snRNA, snoRNA, microRNA and the like.
  • the method for analyzing non-ribosome RNA more specifically means an RNA-seq (RNA sequencing) method or a ribosomal profiling method.
  • the step of determining the base sequence of RNA in the non-ribosomal RNA-containing sample is a step of determining the base sequence of RNA using the non-ribosomal RNA-containing sample obtained by carrying out the method for producing a non-ribosomal RNA-containing sample. Determining the base sequence includes determining the bases that make up RNA, as well as determining chemical modifications in the bases that make up RNA. RNA sequencing may be performed using amplification products contained in sequencing libraries prepared from non-ribosome RNA-containing samples.
  • the method for preparing the sequencing library typically includes a step of reverse transcribing into cDNA using reverse transcriptase and amplifying the obtained reverse transcriptase using an appropriate nucleic acid amplification method.
  • amplifying means to extend, replicate or transcribe the nucleic acid for at least one round for the purpose of increasing the number of copies of the nucleic acid (for example, exponentially increasing). Refers to the process of serving.
  • the copy of the nucleic acid may be a complementary copy of the nucleic acid. Also, in this process, it is more preferred to perform multiple rounds of elongation, replication or transcription.
  • the nucleic acid amplification method is not particularly limited, and examples thereof include PCR amplification and rolling circle amplification. Further, as for the method for adjusting the sequencing library, the above-mentioned descriptions of Patent Document 1 and Non-Patent Documents 1 to 3 and the like can be referred to as appropriate.
  • the method for producing a non-ribosome RNA-containing sample of the present invention can be carried out to obtain a non-ribosome RNA-containing sample that selectively contains a footprint.
  • a sample containing mRNA and ribosome a sample in which lysate is obtained in the presence of cycloheximide, RNA is decomposed with RNase I and monosomes are concentrated by performing a sucrose cushioning method
  • the subsome of ribosome for the preparation of a sequencing library for ribosome profiling, the method for producing a non-ribosome RNA-containing sample of the present invention can be carried out to obtain a non-ribosome RNA-containing sample that selectively contains a footprint.
  • a non-ribosome RNA-containing sample is produced by carrying out a method for producing a non-ribosome RNA-containing sample, which comprises a step (a) of exfoliating the unit and mRNA and a step (b) of removing the ribosomal subunits exfoliated in the step (a). To get. This makes it possible to obtain a non-ribosome RNA-containing sample that selectively contains the footprint at the time of preparing the lysate.
  • the sequencing library for ribosome profiling may be prepared as in the examples below.
  • a non-ribosome RNA-containing sample is electrophoresed on a modified polyacrylamide gel together with an RNA size marker, and RNA having a length of 26 nt to 34 nt is excised and purified from the gel. Then, according to the examples described later, it can be prepared by adding a linker, reverse transcribing to cDNA, cyclizing, PCR amplification and addition of barcode. Linker, adapter, or barcode addition, reverse transcription, and PCR amplification reactions after cutting RNA of the desired length and purifying it from the gel are used for analysis in any known method, preferably next-generation sequencers. It can be carried out according to any known method described above.
  • the method for producing a non-ribosomal RNA-containing sample of the present invention is carried out to selectively contain mRNA.
  • a containing sample can be obtained.
  • ribosomal subsystems and mRNA are stripped in a sample containing mRNA and ribosomal RNA (a sample in which lysate is obtained in the presence of cycloheximide, poly A of mRNA is selected, and then RNA is fragmented).
  • a non-ribosome RNA-containing sample is obtained by carrying out a method for producing a non-ribosome RNA-containing sample, which comprises a step (a) of causing the reaction and a step (b) of removing the ribosomal subunits exfoliated in the step (a). This makes it possible to obtain a non-ribosome RNA-containing sample containing a fragment of mRNA that was expressed at the time of preparing the lysate.
  • RNA of length corresponding to the sequencing platform for example RNA of 26 nt to 500 nt length, is excised. It can be prepared by purifying from a gel, adding a linker, reverse transcribing to cDNA, cyclizing, PCR amplification and bar code addition according to the examples described later. Linker, adapter, or barcode addition, reverse transcription, and PCR amplification reactions after cutting RNA of the desired length and purifying it from the gel are used for analysis in any known method, preferably next-generation sequencers. It can be carried out according to any known method described above.
  • the method for producing a non-ribosomal RNA-containing sample of the present invention is carried out to prepare a sequencing library for analysis of small RNAs such as tRNA, snRNA, and snoRNA, and for microRNA analysis. , SnRNA, snRNA, and microRNA-containing non-ribosomal RNA-containing samples can be obtained.
  • a step (a) of exfoliating the ribosomal subunit and the mRNA in a sample containing the mRNA and the ribosome, and a step (b) of removing the ribosomal subunit detached in the step (a) are included.
  • a method for producing a non-ribosome RNA-containing sample is carried out to obtain a non-ribosome RNA-containing sample.
  • a non-ribosomal RNA-containing sample was electrophoresed on a denatured polyacrylamide gel together with an RNA size marker, and RNA having a length of 18 nt to 30 nt was excised and purified from the gel.
  • it can be prepared by adding a linker, reverse transcribing to cDNA, cyclizing, PCR amplification and bar code addition.
  • Linker, adapter, or barcode addition, reverse transcription, and PCR amplification reactions after cutting RNA of the desired length and purifying it from the gel are used for analysis in any known method, preferably next-generation sequencers. It can be carried out according to any known method described above.
  • next-generation sequencer As a sequencing technique for sequence determination, a method using a next-generation sequencer can be adopted.
  • the type of the next-generation sequencer is not particularly limited, and examples thereof include HiSeq2000 (Illumina), Genome Analyzer IIx (Illumina), and Genome Sequencer-FLX (Roche).
  • Sequencing RNA using a next-generation sequencer involves immobilizing nucleic acids on a flow cell or microarray.
  • bridge amplification can occur in flow cells in which nucleic acids are immobilized, or in microarrays in which nucleic acids are immobilized.
  • RNA sequencing is accomplished using "sequencing by synthesis (SBS)" technology.
  • SBS sequencing by synthesis
  • the SBS technique may be selected from the group consisting of "pyrosequencing,” “sequencing by ligation,” and “sequencing by elongation.”
  • Pyrosequencing refers to a method of sequencing by detecting pyrophosphates that occur during nucleotide uptake.
  • Sequencing by ligation refers to a method of determining a nucleic acid sequence using ligase to identify a nucleotide present at a specified position in the nucleic acid sequence.
  • Sequencing by extension refers to a nucleic acid sequencing method in which a primer is extended with known or detectable nucleotides.
  • “Deep sequencing” can be adopted as a sequencing technology for sequence determination. “Deep sequencing” refers to a method of sequencing multiple nucleic acids in parallel (Bentley et al., Nature 2008, 456: 53-59). In a typical "deep sequencing” sequencing protocol, nucleic acids (eg, DNA fragments) are attached to the surface of a reaction platform (eg, flow cells, microarrays, etc.). The attached nucleic acid is amplified in situ and can be used as a template for synthetic sequencing (eg SBS) with a detectable label (eg, a fluorescently reversible terminator deoxyribonucleotide).
  • SBS synthetic sequencing
  • a detectable label eg, a fluorescently reversible terminator deoxyribonucleotide
  • Representative reversible terminator deoxyribonucleotides may include 3'-O-azidomethyl-2'-deoxynucleoside triphosphates, respectively, of adenine, cytosine, guanine and thymine, each via a linker to each other. It may be further labeled with a recognizable and removable fluorophore. Sequencing can be performed by the single read method or the paired end method.
  • RNA in a non-ribosomal RNA-containing sample when the base sequence of various sequencing libraries is determined, the sequence read is aligned with the reference sequence, and after the alignment, a single nucleotide polymorphism ( Various analyzes can be performed, such as identification of SNPs), insertions and deletions (indels), counting of reads for RNA techniques, phylogenetic evolution analysis, and metagenome analysis.
  • analyzes can be performed, such as identification of SNPs), insertions and deletions (indels), counting of reads for RNA techniques, phylogenetic evolution analysis, and metagenome analysis.
  • the presence of sequence reads of rRNA that may be contaminated is also clarified by aligning with the reference sequence.
  • the kit used to carry out the method for producing a non-ribosome RNA-containing sample of the present invention includes a reagent for exfoliating the subunit of ribosomal RNA and mRNA, and a means for removing the subunit of ribosomal RNA.
  • the reagent for exfoliating the subunit of the ribosome and the mRNA may be a chelating agent, and the chelating agent includes ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), nitrilotriacetic acid (NTA), diethylenetriaminetetraacetic acid (DTPA), glycol etherdiamine.
  • the means for removing the subunits of the ribosome may be a centrifugal ultrafiltration filter unit composed of a tube provided with an ultrafiltration membrane.
  • the centrifugal ultrafiltration filter unit may be a double-structured centrifugal ultrafiltration tube further inserted into the tube.
  • a library for ribosome profiling was prepared from HEK293 cells (ATCC, cat. No. CRL-1573) according to the procedure described in McGlincy NJ et al 2017 (Non-Patent Document 3).
  • the protocol based on McGlincy NJ et al 2017 (Non-Patent Document 3) is described below. In the present specification, the protocol described in Example 1 is referred to as a "standard method".
  • Working Solution Qubit RNA BR Reagent 1 ⁇ L: Qubit RNA BR Buffer 200 ⁇ L 2. Dispense 190 ⁇ L for standard and 199 ⁇ L for sample into 0.5 mL tubes. Add 10 ⁇ L of standard reagents # 1 and # 2 and 1 ⁇ L of sample, and vortex and spin down. Leave at room temperature for 2 min. 3.
  • RNA size marker (34 nt) and Lower size marker oligoribonucleotide NI801 (26 nt) described in Non-Patent Document 3 (McGlincy and Ingolia, 2017, Methods, 126, 112-129) were used. .. 2. Use WAKO SuperSep RNA 15% gel.
  • Preparation of 20 ⁇ M Preadenylated linker 1. Prepare the following solution in 8 tubes. Perform processing at 65 ° C 1 h ⁇ 85 ° C 5 min. For the 5'p-linker-ddC primer in the above table, NI-810 to NI-817 (Table 8) described in Non-Patent Document 3 (McGlincy and Ingolia, 2017, Methods, 126, 112-129) are used. did.
  • ⁇ Linker ligase> A separate linker is attached to each sample. Make a note. ⁇ Any linker can be attached to the marker 1. After dephosphorylation, treat at 95 °C for 2 min ⁇ 3 min on ice.
  • Reverse transcription primer NI-802 described in Non-Patent Document 3 (McGlincy and Ingolia, 2017, Methods, 126, 112-129) was used. 1. Prepare the following in 8-tube. (1) RT primer only (RNase-free water 10 ⁇ L) or (2) RT primer + linker (RNase-free water 9.5 ⁇ L + 20 uM liker 0.5 ⁇ L) or (3) Marker (after linker ligation) 10 ⁇ L or (4) Sample (after linker ligation) 10 ⁇ L + 1.25 uM RT primer NI802 2 ⁇ L total 12 ⁇ L 6 °C 5 min ⁇ 5 min on ice
  • Circularization 1. Dispense 8 ⁇ L of mixture into 8 tubes. 2. Dispense 12 ⁇ L of sample at a time 3. Treat at 60 °C for 1 h ⁇ 80 °C for 10 min. PAUSE POINT -20 °C
  • PCR Amplification and Barcode Addition The sample is cycled (6, 8, 10 cycles) to cut out bands with few non-singular bands. Control (1) RT primer only (2) RT primer + linker (3) Markers (after linker ligation) need only 8 cycles. 1. For the sample, make 100 ⁇ L of the reaction solution and divide it into 3 wells of 33 ⁇ L each (6, 8, 10 cycles).
  • Example 2 Preparation of Sequencing Library by Ribosome splitting method
  • the ribosome subunit was exfoliated and the ribosome was removed by ultrafiltration to prepare a ribosome profiling library.
  • lysates are prepared from cells (1. Preparation of lysates in Example 1), and ultracentrifugation is performed after RNase digestion to obtain ribosome pellets (Example 1-2). . RNase digestion-ultracentrifugation (sucrose cushion)).
  • Example 2 instead of the ⁇ direct RNA recovery> described in Section 3. Footprint Fragment Purification of Example 1, the following ⁇ ribosome exfoliation and ultrafiltration> is performed.
  • TRIzol sample Discard the upper filter cup and mix 360 ⁇ L of TRIzol LS reagent with the flow-through of the reservoir tube (called TRIzol sample).
  • Example 3 Preparation of Sequencing Library by "Standard Method + rRNA Depletion"
  • a sample was prepared by adding the rRNA Depletion step to the "Standard Method" described in Example 1.
  • Example 4 Preparation of Sequencing Library by "Ribosome Splitting Method + rRNA Depletion"
  • a sample was prepared by adding an rRNA Depletion step to the "Ribosome splitting method" described in Example 2.
  • Example 5 For the libraries prepared and quality checked in Examples 1 to 4, deep sequencing was performed using HiSeq4000 (Illumina). The results of the number of reads of the sequencing library prepared by the standard method, the Ribosome splitting method, the standard method + rRNA depletion, and the Ribosome splitting method + rRNA depletion are shown in FIG. “Mapped” in FIG. 2 means the number of reads mapped to the protein coding region (CDS) and corresponds to the number of ribosomes in mRNA.
  • CDS protein coding region
  • Ribosomal profiling of libraries prepared by the standard method from HEK293 cells showed that the number of rRNA reads was 9.2 x 10 5 reads per million (RPM), 92% of the library, and non-coding RNAs (rRNA, tRNA, Mt-rRNA, Mt-rRNA,). mt-tRNA, snRNA, snoRNA, useful leads that are not derived from microRNA etc.) was only 5.4% (0.54 ⁇ 10 5 RPM ) ( Fig. 2, Standard method).
  • the number of lead mRNA is 2.3 ⁇ 10 5 RPM, and increased 23% in the library (Fig. 2, Ribosome splitting method). Furthermore, when rRNA depletion was combined with the Ribosome splitting method, the number of mRNA reads increased to 5.0 ⁇ 10 5 RPM and 50% in the library (Fig. 2, Ribosome splitting method + rRNA depletion).
  • Pearson's correlation coefficient is a dimensionless quantity and takes a value of -1 or more and 1 or less. It is judged that there is a strong correlation when it is 0.7 or more and 1 or less.
  • FIG. 3 shows the correlation coefficient. The number of mRNA reads was reproducible when each method was repeated twice, and a high correlation of data was also observed between the above four methods.
  • TF-205-WB-RS Gel loading 20 ⁇ l filter tips (ThermoFisher Scientific, cat. No. 2155P) Refrigerated microcentrifuge (TOMY, cat. No. MX-307) Qubit 2.0 Fluorometer (ThermoFisher Scientific) Optima MAX-TL Ultracentrifuge (Beckman, cat. No. A95761) TLA 110 rotor (Beckman, cat. No. 366735) Dry block heater (Major science, cat. No. MC-0203) EasySeparator (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. cat. No. 058-07681) Electrophoresis power supply (Amercham Biosciences, cat. No.
  • EPS301 Blue light illuminator and orage filter cover (NA).
  • a standard UV transilluminator can be used instead.
  • Razors Fluors (Feather, cat. No. FAS-10) or (Feather, cat. No. No 11 stainless steel) Spin-X centrifuge tube filter 0.22 ⁇ M (costar, cat. No. 8160) Thermal cycler (Applied Biosystems, cat. No. 2720) DynaMag-2 separation rack (ThermoFisher Scientific, cat. No. 12321D) MixMate (eppendorf) MultiNA (SHIMAZU BIOTECH) Disposable homogenizer pestle R-1.5 (ASONE, cat. No. 1-2955-01)

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Abstract

本発明の課題は、リボソームを除去するための新たな工程を含む、非リボソームRNA含有試料の製造方法を提供することである。本発明によれば、mRNAとリボソームを含む試料中で、リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）、及び工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）を含む、非リボソームRNA含有試料の製造方法が提供される。

Description

非リボソームＲＮＡ含有試料の製造方法
　本発明は、非リボソームRNA含有試料の製造方法に関する。本発明は、非リボソームRNA含有試料の製造方法により製造された非リボソームRNA含有試料を用いる、非リボソームRNAの分析方法に関する。更に、本発明は、非リボソームRNA含有試料の製造方法を実施するために用いられるキットに関する。
関連出願の相互参照
　本出願は、２０１９年１１月２５日出願の日本特願２０１９－２１１９３３の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　次世代シーケンサーの登場により、シーケンス解析のスピードは飛躍的に向上し、大きなゲノム領域を対象とする研究ができるようになった。次世代シーケンサーはランダムに切断された数千万から数億のDNA断片を同時並列に処理することができ、1回のシーケンスランで10億塩基（1ギガベース）から1000億塩基（1テラベース）に届くまでデータを得ることができる。次世代シーケンサーは、全ゲノムシーケンスのほか、疾患などの特定の研究対象に関連するゲノム領域をターゲットにするターゲットシーケンスやメチル化シーケンスのようなエピジェネティクスなどの研究で利用されている。
　また、次世代シーケンサーは、分子生物学のセントラルドグマ、すなわち遺伝情報は「DNA→（転写）→mRNA(メッセンジャーRNA)→（翻訳）→タンパク質」の順に伝達されるという概念の研究にも利用されている。例えば、RNA-Seq(RNAシーケンス)は、次世代シーケンサーを使用して、特定の瞬間の生体サンプル中のRNAの存在と量を明らかにして、網羅的な遺伝子発現解析を行うことができる。更に、mRNAからタンパク質が作られる翻訳という反応がどのように制御されているのかを解明する研究では、次世代シーケンサーを使用するリボソームプロファイリングという技術により、どのようなmRNAのどのコドンがリボソームによって解読されているかを網羅的に解析して、翻訳の状態を俯瞰することができる。
　リボソームプロファイリングは、リボソームで保護されたmRNA 断片のディープシーケンシングに基づいた手法である（特許文献1）。リボソームプロファイリングの情報は、翻訳調節の調査、遺伝子発現の測定、タンパク質合成速度の測定、又はタンパク質の存在量の予測に役立てることができる。
特許文献1　米国特許第8486865号明細書
非特許文献1　Ingolia et al., 2009, Science, 324, 218-23
非特許文献2　Weinberg et al., 2016, Cell Rep, 14, 1787-1799
非特許文献3　McGlincy and Ingolia, 2017, Methods, 126, 112-129
特許文献1および非特許文献1から3の全記載は、参照により本明細書に援用される。
　従来のリボソームプロファイリングには、リボソームRNA（rRNA）がシーケンシングライブラリを過剰に占有しているため、分析に使用可能なシーケンスリードの割合、具体的にはタンパク質コード領域(CDS)にマッピングされるシーケンスリードの割合が少ないという問題がある。例えば、非特許文献１は、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeでリボソーム保護アッセイを使用して得た4200万個のフラグメントをシーケンスしたところ、700万（16％）のシーケンスリードがCDSにマッピングされたが、残りのほとんどはrRNAに由来したと報告している。一般に統計分析はmRNAのシーケンスリードの規模に依存するため、ライブラリで使用可能なシーケンスリードの収率が低いと、リボソームプロファイリングなどのディープシーケンシングベースのアプローチで分析の障害となる。
　リボソームプロファイリングのほか、RNA-seqにもシーケンシングライブラリ中に過剰なrRNAが混入するという課題が存在する。非特許文献2は、mRNAが濃縮されていないトータルRNAからRNA-seq用ライブラリを調製したところ、1億9970万のリードの90.2％がrRNAであったことを報告している。過剰なrRNAのシーケンスリードの存在は、トランスクリプトーム解析の効率を著しく低下させるという問題がある。
　rRNAのシーケンスリードを減らすために、rRNAにハイブリダイズして磁気ビーズにトラップできるrRNA-subtraction オリゴヌクレオチドが使用されている（非特許文献2,3）。しかしながら、rRNA-subtraction オリゴヌクレオチドを使用したrRNA-depletionでも、rRNAのシーケンスリードを十分に減らすことはできなかった。よって、rRNAのシーケンスリードを減じるための新たな方法が求められていた。
　よって、本発明の課題は、リボソームを除去するための新たな工程を含む、非リボソームRNA含有試料の製造方法を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、リボソームのサブユニットとmRNAを剥離することにより効率的にリボソームのサブユニットが除去できることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
　本発明によれば以下の発明が提供される。
［1］　mRNAとリボソームを含む試料中で、
リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）、及び
工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）を含む、
非リボソームRNA含有試料の製造方法。
［2］　mRNAとリボソームを含む試料中でRNAを分解する工程又はRNAを断片化する工程を更に含む、［1］に記載の非リボソームRNA含有試料の製造方法。
［3］　リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）がキレート剤を用いて行われる、［1］又は［2］に記載の非リボソームRNA含有試料の製造方法。
［4］　工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）が限外ろ過により行われる［1］～[3]の何れか一に記載の非リボソームRNA含有試料の製造方法。
［5］　［1］～[4]の何れか一に記載の非リボソームRNA含有試料の製造方法を実施して非リボソームRNA含有試料を得る工程、及び
非リボソームRNA含有試料中のRNAの塩基配列を決定する工程
を含む、非リボソームRNAの分析方法。
［6］　リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させるための試薬、及び
リボソームのサブユニットを除去するための手段を含む、
［1］～[4]の何れか一に記載の非リボソームRNA含有試料の製造方法を実施するために用いられるキット。
図1は、本発明の概要図である。従来の精製法(図中のPurification(standard method))では、RNase 処理（RNase treatment）後、超遠心又はゲルろ過（ultracentrifuge/gel-filtration）により得たモノソーム（monosome）画分をタンパク質変性剤（例えば、フェノール、グアニジンイソチオシアネート）を含む溶液で処理して、フットプリント(Footprint)を精製する。本発明の改良法（図中のModified method）では、超遠心又はゲルろ過（ultracentrifuge/gel-filtration）により得たモノソーム（monosome）画分をキレート剤で処理してリボソームを大小サブユニットとフットプリントに剥離し(Ribosome splitting with chelating agent)、続いて大小のサブユニットを除去する(Removal of ribosome subunits)ことによりフットプリントを精製する。 図2は、実施例のスタンダード法、Ribosome splitting法、スタンダード法+rRNA depletion、及びRibosome splitting法+rRNA depletionにより調製したライブラリの解析で得られたリード数を示す。「Mapped」は、タンパク質コード領域(CDS)にマップされたリード数を意味し、mRNA中のリボソームの数に対応する。RPM は、reads per million である。 図3は、実施例のスタンダード法、Ribosome splitting法、スタンダード法+rRNA depletion、及びRibosome splitting法+rRNA depletionの各方法（それぞれ2回の繰り返し）により調製したライブラリの解析で得られたリード数に関するピアソンの相関係数である。
　以下に記載する本発明の説明は、代表的な実施態様や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施態様に限定されるものではない。なお、本明細書において「～」を用いて表される数値範囲は「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。RNAの長さに関する「nt」はヌクレオチドを意味する。
　RNA-seq（RNAシーケンス）は、ゲノムワイドな遺伝子発現レベルのプロファイリングを行うことができる技術である。本明細書において、RNA-seqは、細胞の転写プロファイルを生物学的モーメントで包括的に把握できる全トランスクリプトームシーケンス（全RNA-seq）のほか、対象転写産物のみを測定して発現差異やアリル特異的な遺伝子発現を解析するターゲットRNA シーケンス、転写制御及び翻訳制御に関する低分子ノンコーディングRNAシーケンス（例えば、転移RNA、snoRNAやsnRNAなど）やmicroRNAシーケンスを含む。snRNA（核内低分子RNA）は、真核生物の核内に存在する低分子RNAの一群であり、他のタンパク質とともにRNAスプライシングやrRNAプロセシングを初めとした様々な反応過程に関わっている。snoRNA(核小体低分子RNA)は、rRNAや他のRNAの化学的修飾（メチル化やシュードウリジル化など）に関与する一群の低分子RNAである。microRNAは、機能性のノンコーディングRNAに分類されているが、ゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て最終的に20から25塩基長の微小RNAとなる機能性核酸であり、例えば細胞の発生、分化、増殖および細胞死などの基本的な生命現象の調節に関わっている。
　リボソームプロファイリングは、mRNA分子を酵素などで分解すると、リボソームが結合していたmRNAの一部は分解から保護されて残ることを利用して、リボソームが結合していたmRNAの一部の配列を多数決定し、ある特定時に細胞内でアクティブに翻訳されていたmRNAの領域を決定する技術である。
　本明細書中「フットプリント」は、リボソームプロファイリングにおいて、酵素等による分解から保護されて残ったmRNAの一部を意味する。フットプリントの長さは約40nt以下、概ね30nt程度である。
　本明細書中「リード」又は「シーケンスリード」は、一般に、DNAサンプル又はRNAサンプルで決定された、A、T、C、及びG 塩基のデータ列を意味する。本明細書のリード又はシーケンスリードは、特に、本発明の非リボソームRNA含有試料から調製されたシーケンシングライブラリ中のDNA断片について決定された配列である。
　本明細書中「ノンコーディングRNA」は、タンパク質をコードしないRNAの総称として用いられ、ノンコーディングRNAの例としてはrRNA、転移RNA(tRNA)、ミトコンドリア由来リボソームRNA （Mt-rRNA）、ミトコンドリア由来転移RNA （Mt-tRNA）、葉緑体由来リボソームRNA、葉緑体由来転移RNA、snRNA、snoRNA、microRNA等を挙げることができる。
　本明細書中「非リボソームRNA」は、リボソームRNA（rRNA）以外のRNAの総称として用いられ、非リボソームRNAの例としては mRNA、転移RNA(tRNA)、ミトコンドリア由来転移RNA （Mt-tRNA）、葉緑体由来転移RNA、snRNA、snoRNA、microRNA等を挙げることができる。
<非リボソームRNA含有試料の製造方法>
　本発明の非リボソームRNA含有試料の製造方法は、mRNAとリボソームを含む試料中で、
リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）、及び
工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）を含む。
　非特許文献１は、リボソームプロファイリングで得たシーケンスリードの16%がCDSにマッピングされたが、残りのほとんどはrRNAに由来したと報告している。非特許文献2は、mRNAが濃縮されていないトータルRNAからRNA-seqライブラリを調製したところ得られたシーケンスリードの90.2％がrRNAであったことを報告している。後記の実施例においても、従来のスタンダード法では、全リードの92％がrRNAに由来したことが示されている。rRNA由来のシーケンスリードを減らすために、rRNAにハイブリダイズして磁気ビーズにトラップできるrRNA-subtraction オリゴヌクレオチドが使用されている（非特許文献2,3）。後記の実施例では、この方法を採用しても、全リードの77％がrRNAに由来し、mRNAのリードは18％であったことが示されている。
　本発明で製造された非リボソームRNA含有試料から調製したリボソームプロファイリング用ライブラリの解析では、全リードの23%がmRNAに由来し、rRNA-subtraction オリゴヌクレオチドを使用する方法と組み合わせるとmRNAのリードは全リードの50％に増加したことが後記の実施例では示されている。本発明によれば、rRNA の含有割合が低減された非リボソームRNA含有試料を製造することができる。よって、本発明で製造された非リボソームRNA含有試料からリボソームプロファイリング用又はRNA-seq用ライブラリを調製すれば、効率よくmRNAやノンコーディングRNA、特に低分子ノンコーディングRNAやmicroRNAのリードを得ることができる。なお、本発明により製造された非リボソームRNA含有試料は、リボソームプロファイリングにおける使用に限定されるものではなく、RNA-seqにも有効である。
<mRNAとリボソームを含む試料〉
　本発明の「mRNAとリボソームを含む試料」は、mRNAとリボソームを含有する、一細胞、細胞集団、培養細胞又は組織を溶解又は破砕して得た細胞又は組織の粗抽出液（以下、ライセートという）を意味し、一細胞、細胞集団、培養細胞又は組織は任意の生物に由来するものである。具体的には、細菌、真菌、動物細胞若しくは組織、植物細胞若しくは組織、又はそれらの培養細胞のライセートを挙げることができるがこれらに限定されない。ライセートは、界面活性剤を用いた細胞溶解や物理的な破砕（例えば、機械的破砕、溶液中でのホモジナイズ、超音波処理、凍結融解、乳鉢と乳棒による破砕）などにより調製することができ、調整法は生物種や細胞・組織のタイプに応じて適宜選択することができる。本発明の非リボソームRNA含有試料の製造方法は、前処理として、細胞を溶解又は破砕してライセートを得る工程を含むことができる。
　ライセートは、リボソームの分解や損傷を避けるため、穏やかな手段、例えば、界面活性剤を用いた細胞溶解で調整することが好ましい。また、同様の理由で、タンパク質変性剤やMg2+キレート剤、フェノールやクロロホルム等の有機溶媒を使用せずにライセートを調製することが好ましい。DNAは、後のcDNA合成の妨げとなるため、例えば、DNase等を用いて分解してもよい。更に、タンパク質の翻訳阻害剤シクロへキシミドの存在下でライセートを得ることができる。一実施態様において、ライセートは、後記の実施例のように、細胞を、界面活性剤とシクロへキシミドを含むバッファー中に懸濁し、DNase I(RNase-free)の存在下でインキュベートし、遠心処理して得た上清として得ることができる。
　mRNAとリボソームを含む試料は、mRNAとリボソームのほか、ノンコーディングRNA、例えばrRNA、転移RNA(tRNA)、ミトコンドリア由来リボソームRNA （Mt-rRNA）、ミトコンドリア由来転移RNA （Mt-tRNA）、葉緑体由来リボソームRNA、葉緑体由来転移RNA、snRNA、snoRNA、microRNA RNA等を含み得る試料ということができる。
<非リボソームRNA含有試料>
　本発明の「非リボソームRNA含有試料」は、mRNAとリボソームを含む試料中で、リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）、及び工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）を実施することにより得られる。非リボソームRNA含有試料は、mRNA、転移RNA(tRNA)、ミトコンドリア由来転移RNA （Mt-tRNA）、葉緑体由来転移RNA、snRNA、snoRNA、microRNA等を含んでいてもよく、さらに特定のRNA種について濃縮されていてもよい。非リボソームRNA含有試料は、シーケンシングライブラリを調製するための試料であってもよく、シーケンシングライブラリは、例えば、リボソームプロファイリング用やRNA-seq用のライブラリであることができるが、これらに限定されない。本発明の非リボソームRNA含有試料中のrRNA含有量は、従来法（例えば実施例１のスタンダード法）により得た非リボソームRNA含有試料の同含有量と比較して減少している。本発明の非リボソームRNA含有試料から調製したシーケンシングライブラリで決定されたrRNAのリード数の全リード数に対する比率は、従来法（例えば実施例１のスタンダード法）により得た試料から調製したシーケンシングライブラリ中における同比率と比較して減少している。
<リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）>
　リボソームは、数本のrRNA分子と50種類ほどのタンパク質からなる巨大なRNA・タンパク複合体であり、全体として大小２つの粒子からなる。本明細書中、リボソームの大小２つの粒子について、それぞれ大サブユニット及び小サブユニットという。リボソームの具体的な構成は、例えば原核生物のリボソームでは、大サブユニット及び小サブユニットは、それぞれ 50Sサブユニット及び30Sサブユニットと呼ばれており、50Sサブユニットは、23S rRNA(2904nt)、5S rRNA(120nt)と34種類のタンパク質からなり、分子量は160万であり、30Sサブユニットは、16S rRNA(1542nt)と21種類のタンパク質からなり、その分子量は90万である。これらの両サブユニットの会合体が70S粒子となり、その分子量は270万である。真核生物のリボソームでは、大サブユニット及び小サブユニットは、それぞれ 60Sサブユニット及び40Sサブユニットと呼ばれており、60Sサブユニットは、28S rRNA(4718nt)、5.8S rRNA(160nt)、5S rRNA(120nt)と50種類のタンパク質からなり、分子量は300万であり、40Sサブユニットは、18S rRNA(1874nt)と33種類のタンパク質からなり、その分子量は150万である。これらの両サブユニットの会合体が80S粒子となる。
　リボソームはmRNAをくわえ込み、その遺伝情報を読み取ってタンパク質へと変換する翻訳が行われる場である。両サブユニットの会合体を大小の各サブユニットに剥離させることにより、くわえ込まれていたmRNAをリボソームから分離させることができる。
　リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）は、任意の方法で実施することができるが、例えば、両サブユニットの会合体を維持する為に必要な Mg2＋イオンを除くことにより実施することができる。Mg2＋イオンは、任意の方法で除くことができるが、例えばキレート剤により除去することができる。すなわち、リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）はキレート剤を用いて行うことができる。キレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ニトリロトリ酢酸(NTA)、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（EGTA、GEDTA）等を挙げることができ、特にエチレンジアミン四酢酸(EDTA)が好ましい。キレート剤の濃度は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)の場合には、0.1mMから30mMとすることができ、5mMから15mMとすることが好ましい。キレート剤による処理は、EDTAの場合には、氷上に30秒～60分置いて処理すればよく、処理時間は適宜変更することができる。
<工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）>
　工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）は、上記のリボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）において剥離させた大小サブユニットを、mRNAとリボソームを含む試料から除去する工程である。大小サブユニットの除去は、それらのサイズに基づき除去することができる任意の方法を採用して実施することができ、例えば、限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC：Size Exclusion Chromatography）等により行うことができる。後記のとおり、リボソームサブユニットの中で最も小さい原核生物の小サブユニットの分子量は約90万である。転移RNA(tRNA)、ミトコンドリア由来転移RNA （Mt-tRNA）、葉緑体由来転移RNA、snRNA、snoRNA、及びmicroRNAなどは、リボソームサブユニットの中で最も小さい原核生物の小サブユニットよりも十分に小さいので、上記の方法でサイズの違いによって、大小サブユニットと分離することができる。一方、mRNAの長さはさまざまで、ヒトの場合は、１０００塩基を超えるものが多いため、サイズの違いによって大小サブユニットと分離することができない場合があるので、「工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）」の前に後記のRNAを断片化する工程を実施し、mRNAを断片化して大小サブユニットと分離できるサイズにすることが好ましい。
　限外ろ過（Ultrafiltration)は、溶液を膜に透過させて、溶液中の成分を濃縮又は除去する方法である。限外ろ過膜には、分画分子量（MWCO：Molecular Weight Cut Off）が設定されており、膜の分画分子量よりも大きな分子が膜に保持され、透過液からは膜の分画分子量よりも大きな分子が除去される。本発明では、リボソームの大小サブユニットを除去する工程を限外ろ過により行うことができる。より具体的には、限外ろ過を用いて、mRNAとリボソームを含む試料中のRNAを透過させ、リボソームの大小サブユニットを膜上に保持して、RNAを含む透過液を得ることができる。限外ろ過膜を透過させ回収されるRNAは任意のRNAであってもよく、mRNA、tRNA、Mt-tRNA、葉緑体由来転移RNA、snRNA、snoRNA、microRNAなどであり、rRNAも混入しうる。
　限外ろ過膜としては、RNAを透過させ、リボソームの大小サブユニットを膜上に保持できる限外ろ過膜を使用すればよい。限外ろ過膜の透過性や保持性は、種々の条件、例えばろ過圧、他の溶質の存在、分子の形状、吸着性、イオン強度等により変動するので、以下に、限外ろ過膜の選定の例を示すがこれらに限らず、RNAの回収率やろ過処理の迅速性を考慮して、適宜最適なものを選定できる。
　本発明の非リボソームRNA含有試料の製造方法の工程（ｂ）で使用することができる限外ろ過膜は、分画分子量(MWCO)が10K（以下、Kは103を表す）から2000Kの範囲、10Kから1500Kの範囲、10Kから1000Kの範囲、10Kから900Kの範囲、10Kから800Kの範囲、10Kから700Kの範囲、10Kから600Kの範囲、10Kから500Kの範囲、10Kから400Kの範囲、10Kから300Kの範囲、10Kから100Kの範囲、30Kから2000Kの範囲、30Kから1500Kの範囲、30Kから1000Kの範囲、30Kから900Kの範囲、30Kから800Kの範囲、30Kから700Kの範囲、30Kから600Kの範囲、30Kから500Kの範囲、30Kから400Kの範囲、30Kから300Kの範囲、又は30Kから100Kの範囲の膜から選定できるが、これらに限定されない。
　より詳細には、限外ろ過膜による大小サブユニットの除去に関しては、リボソームサブユニットの中で最も小さい原核生物の小サブユニットの分子量が約90万であるので、分画分子量(MWCO)が900Kより小さい限外ろ過膜、好ましくはMWCOが150Kから300Kの限外ろ過膜を使用すれば、原核生物の大小サブユニットを膜上に保持して除去することができる。また、真核生物の小サブユニットの分子量が約150万であるので、MWCOが1500Kより小さい限外ろ過膜、好ましくはMWCOが250Kから500Kの限外ろ過膜を使用すれば、真核生物の大小サブユニットを膜上に保持して除去することができる。大小サブユニットの膜上への保持率の点からはMWCOが500K以下の膜を使用することが好ましく、MWCOが300K以下の膜を使用することがより好ましい。
　本発明の非リボソームRNA含有試料の製造方法は、後記のとおり、RNAを分解する工程又は断片化する工程を含む場合がある。これらの工程を含む場合には、RNA分解により、RNAは40nt長以下のフットプリントとして残るか、或いはシーケンシングプラットフォームに応じた長さに断片化される。RNAの分子量（約320.5 / 塩基）に基づいて、RNA断片を回収するための限外ろ過膜の選定を以下に検討する。例えば、MWCOが30K～500Kの範囲の膜を使用すれば、少なくとも約40ntのRNA（分子量約13000）を透過させ、原核生物及び真核生物の大小サブユニットを膜上に保持することができる。また、MWCOが100K～500Kの範囲の限外ろ過膜を使用すれば、少なくとも約100ntのRNA（分子量約32000）を透過させ、原核生物及び真核生物の大小サブユニットを膜上に保持することができる。MWCOが300K～500Kの範囲の限外ろ過膜を使用すれば、少なくとも約500ntのRNA（分子量約16万）を透過させ、原核生物及び真核生物の大小サブユニットを膜上に保持することができる。MWCOが500Kの限外ろ過膜を使用すれば、少なくとも約1000ntのRNA（分子量約32万）を透過させ、原核生物及び真核生物の大小サブユニットを膜上に保持することができる。なお、RNAのような直鎖状の分子は、同じ分子量の球状分子を阻止できるような膜を通りぬけることがあると考えられる。
　一実施態様では、限外ろ過は、限外ろ過膜を備えたチューブで構成される遠心式限外ろ過フィルターユニットを使用して実施することができる。当該遠心式限外ろ過フィルターユニットは、さらにチューブに挿入されて2重構造の遠心式限外ろ過チューブを形成することができる。遠心式限外ろ過フィルターユニットは、供給元の使用説明書の記載に従って使用すればよい。
　工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）はサイズ排除クロマトグラフィーにより行うことができる。一実施態様では、工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）は、スピンカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより行うことができる。具体的には、例えばillustraTM MicroSpinTM S-400 HR Columns (GE Healthcare, cat. no. 27-5140-01)を用いて、以下の手順で行うことができる。1. S-400カラムをよく混合し、カラムの先端を取り外し、2 mLのリザーバーチューブに入れる。2. 700 μlの溶解液（20 mM Tris-HCl （pH 7.5）、150 mM NaCl、5 mM EDTA, 1 mM ジチオトレイトール(DTT)、100 μg/mL シクロヘキサミド、RNase-free water；氷上に置く）をS-400カラムにロードし、740g、4℃で1分間遠心する。カラムを新しい2 mLリザーバーチューブに入れる。これを合計3回繰り返す。3. S-400カラムを新しい清潔な1.5 mLチューブに入れる。上記「リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）」を実施して得た溶液100 μLをカラムの樹脂の中央にロードし、740g、4℃で2分間遠心する。4.追加の溶解液100 μLをロードし、740g、4℃で2分間遠心する。溶出液を得る。
　別の実施態様では、工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）は、超高圧液体クロマトグラフィー（uHPLC）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー法で行うことができる（Yoshikawa et al. eLife 2018;7:e36530 DOI: 10.7554/eLife.36530）。具体的には、5μmの粒子の7.8×300 mmのカラム、例えば、Thermo BioBasic SEC 300A、1,000A、2,000Aカラム、またはAgilent Bio SEC-5 2,000Aカラムを使用することができる。 Dionex Ultimate 3,000 Bio-RS uHPLCシステム（Thermo Fisher Scientific）を使用して、各SECカラムを2カラム容量（CV）のろ過SECバッファー（20 mM Hepes-NaOH（pH 7.4）、60 mM NaCl、30 mM EDTA、0.3％ CHAPS、0.2 mg / mLヘパリン、2.5 mM DTT）で平衡化し、非特異的相互作用の部位をブロックするためにPBSで希釈した10 mg / mLのろ過ウシ血清アルブミン（BSA）溶液100μLを1回注入し、10μLの10 mg / mL BSA溶液と25μLのHyperLadder 1 kb（BIOLINE）を含む標準液を注入してカラムの状態をモニターした後、上記「リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）」を実施して得た溶液をカラムに注入する。 ダイオードアレイ検出器による1 Hzのデータ収集レートで、215、260、280 nmのUV吸光度を測定することにより、クロマトグラムを監視する。流速は0.8 mL / minで、48×100μLのフラクション、24×200μLのフラクション、または16×300μLのフラクションを、低タンパク質結合96ディープウェルプレート1 mL（エッペンドルフ）を使用して9分から14.6分に4℃で収集する。Chromeleon 6.8クロマトグラフィーデータシステム（Thermo Fisher Scientific）を使用して、ピークを定量化する。
　限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー等により、リボソームのサブユニットが除去された後の試料は精製に供することができる。精製は、公知のRNA精製法を用いればよく、例えば、フェノール／クロロホルム、フェノールとグアニジンイソチオシアネート等を含んだ溶液を用いて精製することができる。
　本発明非リボソームRNA含有試料の製造方法は、公知のrRNA除去方法、モノソームの濃縮法、mRNAの濃縮方法と組合せることができる。組合せ可能な公知のrRNA除去方法としては、rRNAにハイブリダイズして磁気ビーズにトラップできるrRNA-subtraction オリゴヌクレオチドを用いる方法（非特許文献2,3）があり、Ribo-Zero(登録商標) rRNA Removal Kit(illumina社)を用いて実施することができる。また、組合せ可能な公知のmRNAの濃縮方法としては、ポリA選択法があり、ポリAテイルRNAを、Oligotex(登録商標)-dT30<Super> mRNA Purification Kit(Takara)やoligo(dT)-Dynabeads(登録商標)を用いて濃縮することができる。組合せ可能な公知のモノソームの濃縮法としては、ショ糖密度勾配遠心法、ショ糖クッション遠心法、上記のスピンカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィー等がある。
　本発明で製造された非リボソームRNA含有試料からシーケンシングライブラリを調製すれば、全リード数に対するrRNAのリード数を減じることができる。具体的には、全リード数に対するrRNAのリード数の割合は、80％以下、75％以下、70%以下、65%以下、60%以下、55%以下、50%以下、45%以下、45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、25%以下、20%以下、15%以下、又は10%以下にまで減じることができる。更に、本発明の製造方法とrRNAにハイブリダイズして磁気ビーズにトラップできるrRNA-subtraction オリゴヌクレオチドを用いる方法（非特許文献2,3）とを組み合わせると、全リード数に対するrRNAのリード数をより減じることができる。具体的には、全リード数に対するrRNAのリード数の割合は、50％以下、45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、25%以下、20%以下、15%以下、又は10%以下にまで減じることができる。
<RNAを分解する工程又は断片化する工程>
　本発明の非リボソームRNA含有試料の製造方法は、mRNAとリボソームを含む試料中でRNAを分解する工程又は断片化する工程を更に含むことができる。リボソームプロファイリングは通常、RNAを分解する工程を含み、本発明では、RNAを分解する工程は、リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）の前に実施することができる。また、非リボソームRNA含有試料に含まれる解析目的のRNAが長く、大小サブユニットとサイズに基づく分離ができない場合には、「工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）」前にmRNAの断片化を実施すればよい。
　RNAを分解する工程は、例えばリボソームプロファイリングで解析されるフットプリントを得る目的において実施することができる。RNAを分解する工程は、例えば酵素的分解によって行うことができる。RNA分解とは、分解前より長さが短くなるようにRNAを修飾することいい、RNAの酵素的分解は分解前より長さが短くなるようにRNAを修飾することができる酵素を用いて、RNAの分解を行うことをいう。用いる酵素は、エンドリボヌクレアーゼ又はエキソリボヌクレアーゼなどのリボヌクレアーゼ（RNA分解酵素）であってもよく、1本鎖特異的RNAエンドヌクレアーゼ、例えばRNase I を用いることができる。RNA分解に使用できる他の酵素としては、RNase A、RNase T1等を挙げることができる。RNA分解は、後記の部分的アルカリ加水分解により実施してもよい。
　一実施態様において、リボソームプロファイリング用ライブラリを調製するための非リボソームRNA含有試料の製造方法において、RNAを分解する工程は、リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）の前に実施し、RNA分解は、RNase I消化により実施することができる。RNase I消化により、mRNAとリボソームを含む試料中のRNA分子は分解されるが、リボソームが結合しているmRNAの一部は分解から保護される。１つのリボソームが結合しているmRNAの一部を、モノソームという。mRNAとリボソームを含む試料中のモノソームは、ショ糖密度勾配遠心法、ショ糖クッション遠心法、又は上記スピンカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィー等により濃縮することができる。
　RNAを断片化する工程は、例えば、上記工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）において、リボソームのサブユニットをサイズに基づいて分離できるよう十分にRNAを小さくする目的で実施することができ、それを実施できる任意の手段で、所望のサイズにすることができる。
　RNAを断片化する工程は、例えば酵素的断片化、化学的断片化、及び／又は機械的断片化によって行うことができる。RNA断片化とは、RNAを適切な断片サイズに切断することいい、例えば、シーケンシングプラットフォームに応じた長さに切断することである。一実施態様において、RNA断片化は部分的アルカリ加水分解により実施することができる。部分的アルカリ加水分解は、例えば、10μＬの2xアルカリ加水分解液（2 mM EDTA、12 mM Na2CO3、88 mM NaHCO3、pH 9.3）を等量のRNA含有溶液（例えば、ライセート）に添加して混合し、混合液を95℃で20分インキュベートし、インキュベート後、氷上に置き、300μＬの0.3 M NaOAc (pH 5.2)を添加することにより実施することができる。部分的アルカリ加水分解による断片化はRNAが適当なサイズになるように高度に制御して行うことができるが、本発明のためには、例えば100～3000nt、好ましくは100～1000nt、より好ましくは100～500nt、さらにより好ましくは100～300ntに断片化される。
　一実施態様において、RNA断片化は超音波せん断により実施することができる。超音波せん断は、例えば、15mLファルコンチューブにライセートをいれ、4℃の水浴中で既存の超音波破砕機を用いて超音波処理することにより実施することができる。超音波処理による断片化はRNAが適当なサイズになるように高度に制御して行うことができるが、本発明のためには、例えば100～3000nt、好ましくは100～1000nt、より好ましくは100～500nt、さらにより好ましくは100～300ntに断片化される。
　一実施態様において、RNA断片化は酵素的に行うことができる。例えば、塩基配列に依存せず、一本鎖RNA をバイアスなしにランダムに、目的のサイズにまで断片化することができる酵素を使用することが好ましい。具体的には、RNase I、RNase A、RNase T1、RNase T2、 MNase（Micrococcal Nuclease）、RNase V1、RNase S1などを用いることができる。酵素による断片化はRNAが適当なサイズになるように高度に制御して行うことができるが、本発明のためには、例えば100～3000nt、好ましくは100～1000nt、より好ましくは100～500nt、さらにより好ましくは100～300ntに断片化される。
　RNA-seq用ライブラリを調製するための非リボソームRNA含有試料の製造方法において、リボソームが壊れない限り、RNAを断片化する工程とリボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）とは、どちらを先に行ってもよい。
　更に別の実施態様において、RNAを分解する工程又は断片化する工程を行わず、非リボソームRNA含有試料の製造方法を実施して、非リボソームRNA含有試料を製造する場合もある。例えば、低分子ノンコーディングRNA（例えば、tRNA、snoRNAやsnRNAなど）やmicroRNAを分析するためのRNA-seq用ライブラリを調製する場合である。低分子ノンコーディングRNA は約200nt長以下、microRNAは30nt長以下と短く、断片化せずとも、リボソームのサブユニットとサイズに基づいて分離できるためである。
<非リボソームRNAの分析方法>
　本発明の非リボソームRNAの分析方法は、上記の非リボソームRNA含有試料の製造方法を実施して非リボソームRNA含有試料を得る工程、及び非リボソームRNA含有試料中のRNAの塩基配列を決定する工程を含む。非リボソームRNAは、mRNA（フットプリントを含む）、tRNA、Mt-tRNA、葉緑体由来転移RNA、snRNA、snoRNA、microRNAなどである。非リボソームRNAの分析方法は、より具体的には、RNA-seq（RNAシーケンス）法やリボソームプロファイリング法を意味する。
　非リボソームRNA含有試料中のRNAの塩基配列を決定する工程は、非リボソームRNA含有試料の製造方法を実施して得た非リボソームRNA含有試料を用いてRNAの塩基配列を決定する工程であり、塩基配列の決定は、RNAを構成する塩基の決定のほかに、RNAを構成する塩基における化学的修飾の決定を含む。RNAの塩基配列決定は、非リボソームRNA含有試料から調製されたシーケンシングライブラリに含まれる増幅産物を用いて行ってもよい。
　シーケンシングライブラリの調製方法は、典型的には、逆転写酵素を用いてcDNAに逆転写をし、得られた逆転写産物を、適切な核酸増幅法を用いて増幅する工程を含んでいる。なお、ここで「（核酸を）増幅する」とは、当該核酸のコピーの数を増加させる（例えば、指数的に増加させる）目的で、当該核酸を、少なくとも１ラウンドの伸長、複製又は転写に供するプロセスを指す。核酸のコピーは当該核酸の相補的なコピーであってもよい。また、このプロセスでは、伸長、複製又は転写を複数ラウンド行うことがより好ましい。なお、核酸増幅法は特に限定されないが、例えば、PCR増幅又はローリングサークル増幅等が挙げられる。また、シーケンシングライブラリの調整法は、上述の特許文献１及び非特許文献１～３等の記載も適宜参照することができる。
　一実施態様において、リボソームプロファイリング用シーケンシングライブラリの調製のため、本発明の非リボソームRNA含有試料の製造方法を実施して、フットプリントを選択的に含む非リボソームRNA含有試料を得ることができる。例えば、mRNAとリボソームを含む試料中（シクロへキシミドの存在下でライセートを得て、RNAをRNase Iで分解しショ糖クッション法を実施することによりモノソームが濃縮された試料）で、リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）、及び工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）を含む非リボソームRNA含有試料の製造方法を実施して非リボソームRNA含有試料を得る。これにより、ライセートを調製した時点のフットプリントを選択的に含む非リボソームRNA含有試料を得ることができる。リボソームプロファイリング用シーケンシングライブラリの調製は、後記の実施例のとおり行えばよく、非リボソームRNA含有試料をRNA サイズマーカーと共に変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、26ntから34nt長のRNAを切り出してゲルから精製し、後記の実施例に準じて、リンカーを付与し、cDNAに逆転写し、環状化し、PCR増幅及びバーコード付加をすることにより作成することができる。目的の長さのRNAを切り出してゲルから精製した後のリンカー、アダプター、又はバーコードの付与、逆転写及びPCR増幅反応は、任意の公知の方法、好ましくは次世代シーケンサーでの解析に用いられている任意の公知の方法に準じて行うことができる。
　一実施態様において、全トランスクリプトームシーケンス（全RNA-seq）のシーケンシングライブラリの調製のため、本発明の非リボソームRNA含有試料の製造方法を実施して、mRNAを選択的に含む非リボソームRNA含有試料を得ることができる。好ましい実施態様では、mRNAとリボソームを含む試料中（シクロへキシミドの存在下でライセートを得て、mRNAのポリA選択後、RNAが断片化された試料）で、リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）、及び工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）を含む非リボソームRNA含有試料の製造方法を実施して非リボソームRNA含有試料を得る。これにより、ライセートを調製した時点で発現していたmRNAの断片を含む非リボソームRNA含有試料を得ることができる。全RNA-seq用シーケンシングライブラリの調製は、非リボソームRNA含有試料をRNA サイズマーカーと共に変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、シーケンシングプラットフォームに応じた長さのRNA、例えば26ntから500nt長のRNAを切り出してゲルから精製し、後記の実施例に準じて、リンカーを付与し、cDNAに逆転写し、環状化し、PCR増幅及びバーコード付加をすることにより作成することができる。目的の長さのRNAを切り出してゲルから精製した後のリンカー、アダプター、又はバーコードの付与、逆転写及びPCR増幅反応は、任意の公知の方法、好ましくは次世代シーケンサーでの解析に用いられている任意の公知の方法に準じて行うことができる。
　一実施態様において、tRNA、snRNA、snoRNAのような低分子RNA解析用、及びmicro RNA解析用のシーケンシングライブラリの調製のため、本発明の非リボソームRNA含有試料の製造方法を実施して、tRNA、snRNA、snoRNA、及びmicroRNAを含む非リボソームRNA含有試料を得ることができる。好ましい実施態様では、mRNAとリボソームを含む試料中で、リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）、及び工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）を含む非リボソームRNA含有試料の製造方法を実施して非リボソームRNA含有試料を得る。例えば、microRNA解析用のシーケンシングライブラリの調製は、非リボソームRNA含有試料をRNA サイズマーカーと共に変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、18ntから30nt長のRNAを切り出してゲルから精製し、後記の実施例に準じて、リンカーを付与し、cDNAに逆転写し、環状化し、PCR増幅及びバーコード付加をすることにより作成することができる。目的の長さのRNAを切り出してゲルから精製した後のリンカー、アダプター、又はバーコードの付与、逆転写及びPCR増幅反応は、任意の公知の方法、好ましくは次世代シーケンサーでの解析に用いられている任意の公知の方法に準じて行うことができる。
　配列決定を行うためのシーケンシング技術として、次世代シーケンサーを用いる方法を採用することができる。次世代シーケンサーの種類は特に限定されないが、例えば、HiSeq2000（Illumina社）、Genome Analyzer IIx（ Illumina社）、及び、Genome Sequencer-FLX（Roche社）等が挙げられる。次世代シーケンサーを用いるRNAの配列決定は、フローセル上又はマイクロアレイ上に、核酸を固定化する工程を含んでいる。配列決定のプロセスにおいて、ブリッジ増幅（特にブリッジPCR）が、核酸がその上に固定化されたフローセル内、又は、核酸がその中に固定されたマイクロアレイ内で発生しうる。
　RNAの配列決定は、「sequencing by synthesis (SBS)」技術を用いて達成される。ここで、SBS技術とは、対象となる核酸の相補鎖を合成することによって当該核酸の配列決定を行う技術を指す。SBS技術は、「ピロシーケンシング」、「ライゲーションによるシーケンシング」、及び、「伸長によるシーケンシング」からなる群より選択されてもよい。「ピロシーケンシング」は、ヌクレオチドの取り込みに際して生じるピロリン酸を検出することで配列決定を行う方法を指す。「ライゲーションによるシーケンシング」は、核酸配列内の指定された位置に存在するヌクレオチドを同定するために、リガーゼを使用して核酸配列を決定する方法を指す。「伸長によるシーケンシング」は、プライマーが、既知の又は検出可能なヌクレオチドを伴って伸長される核酸配列決定法を指す。
　配列決定を行うためのシーケンシング技術として、「ディープシーケンシング」を採用することができる。「ディープシーケンシング」は、並行して複数の核酸を配列決定する方法を指す（Bentleyら、Nature 2008、456： 53-59）。典型的な、「ディープシーケンシング」を用いた配列決定プロトコルでは、核酸（例えば、DNA断片）は、反応プラットホーム（例えば、フローセルやマイクロアレイ等）の表面に取り付けられる。取り付けられた核酸は、in situで増幅され、検出可能な標識（例えば、蛍光可逆的ターミネーターデオキシリボヌクレオチド）を用いた合成的シーケンシング（例えばSBS）のためのテンプレートとして使用することができる。代表的な可逆的ターミネーターデオキシリボヌクレオチドには、アデニン、シトシン、グアニン及びチミンそれぞれの3’-O-アジドメチル-2’-デオキシヌクレオシド三リン酸が含まれ得、これらはそれぞれ、リンカーを介して、互いに認識可能でかつ取り外し可能なフルオロフォアでさらに標識されていてもよい。配列決定は、シングルリード法で行うこともでき、ペアエンド法で行うこともできる。
　非リボソームRNA含有試料中のRNAの塩基配列を決定する工程において、各種シーケンシングライブラリの塩基配列を決定した場合には、シーケンスリードは、参照配列にアライメントされ、アライメントの後、一塩基多型（SNP）や挿入と欠失（indel）の同定、RNA 手法のためのリード数のカウント、系統進化解析やメタゲノム解析など、さまざまな解析を行うことができる。
　非リボソームRNA含有試料中のRNAの塩基配列を決定する工程において、混入している可能性があるrRNAのシーケンスリードの存在も、参照配列にアラインすることにより明らかとなる。
<キット>
　本発明の非リボソームRNA含有試料の製造方法を実施するために用いられるキットは、リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させるための試薬、及びリボソームのサブユニットを除去するための手段を含む。リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させるための試薬は、キレート剤であってもよく、キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ニトリロトリ酢酸(NTA)、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（EGTA、GEDTA）等を挙げることができ、特にエチレンジアミン四酢酸(EDTA)が好ましい。リボソームのサブユニットを除去するための手段は、限外ろ過膜を備えたチューブで構成される遠心式限外ろ過フィルターユニットであってもよい。当該遠心式限外ろ過フィルターユニットは、さらにチューブに挿入された2重構造の遠心式限外ろ過チューブでもよい。
　以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、本明細書において、特に記載しない限り、「％」等は質量基準であり、数値範囲はその端点を含むものとして記載される。
　実施例で使用した材料及び機器は、実施例の末尾に記載する。
（実施例１）
スタンダード法によるシーケンシングライブラリの調製
　McGlincy NJ et al 2017(非特許文献3)に記載の手順でリボゾームプロファイリング用ライブラリをHEK293 cells (ATCC, cat. no. CRL-1573)から調製した。以下に、McGlincy NJ et al 2017(非特許文献3)に基づくプロトコールを記載する。本明細書中、実施例１に記載のプロトコールを「スタンダード法」という。
1. ライセートの作製
<シクロへキシミド処理>
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 上記のバッファーを作製し、冷やしておく。
以下の試薬を使用直前に加える。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
1. 10 cmディッシュの細胞を冷PBS 5 mLでリンスする。
2. PBSをよく吸い捨て、Lysis buffer(EDTAフリー)を400 μL入れて全体に広げる。
3. ピペッティングで細胞を剥がし、DNA Lobind チューブに移す。Lysis buffer 200 μLで洗い込む。
4. 2 U/μL Turbo DNase I 7.5 μL 加え、氷上に10 minおく。
5. 20,000 g 4℃ 10 minで遠心する。
6. 上清をチューブに取り、転倒混和する。
7. 濃度測定用5 μL 1本、残りは100 μLずつ分注し、液体窒素で瞬間冷凍し-80℃で保存する。
<RNA濃度測定Qubit RNA BR Assay Kit>
1. Working Solution 200 μL×（スタンダード用2 本＋サンプル4本分）を用意する。Working Solution＝Qubit RNA BR Reagent 1 μL : Qubit RNA BR Buffer 200 μL
2. 0.5 mLチューブにスタンダード用190 μL 、サンプル用199 μLずつ分注。スタンダード試薬#1,#2を10μL、サンプルを1μLずつ加え、ボルテックス、スピンダウン。室温で2 min 置く。
3. Qubit 2.0 Fluorometer で測定、RNA BR Assayを選択。スタンダード、サンプルを測定する。
＊80% confluentのHEK cellで10 cmディッシュ1枚から200-300 ng/μLになる。（600 μL ライセートの場合）
2. RNase消化～超遠心(ショ糖クッション)
・ヒートブロック25℃準備
・超遠心機のローター冷やしておく
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Sucroseが溶けたら氷上で冷やしておき、使用直前に以下を加える。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 <サンプル準備>
・Rnase Iは 2 U/1ug RNAで使用する。（RNA 10 ugの時20 U使用）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
1. チューブにRNAをとり、Lysis bufferで298 μLにする
2. RNase Iを2 μLずつ入れ優しく混合、ヒートブロックで25℃ 45 min(サンプル間で反応時間に差が出ないよう正確に行う)。
3. 氷上へ移して、すぐに SUPERase In (RNase inhibitor)を各チューブに10 μL (200 U)ずつ加える。 (冷やすことで反応止める効果があるので先に氷上へ移す)。
4. 超遠心チューブにRNaseI消化後のサンプル300 μLを移す。
5. Sucrose cushion buffer 900 μLをサンプルの下から２層になるようゆっくり注ぐ。
6. TLA110 ローターで、100,000 rpm 4℃ 1 h遠心し、リボソームのペレットを得る。
7. ペレットを崩さないよう、上清を液面の上部から吸い捨てる。
3. Footprint Fragment 精製
＜ダイレクトRNAリカバリー＞
　ペレットにTRIzol reagent を300 μL入れて(ペレットが見えるようになる)よく溶かし（TRIzol sampleという）、DNA Lobindチューブに移す。
<Direct-zol MicroPrep kit カラム精製>
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
1. カラムに移して12,000 g, 1 min, 4℃. 受けチューブは1回ごとに使い捨てる。
2. PreWash buffer 400μL を加え12,000 g, 1 min, 4℃で遠心する。2回行う。
3. Wash Buffer 700 μLを加え12,000 g, 1 min, 4℃で遠心する。
4. 空遠心 12,000 g, 5 min, 4℃を行う
5. RNase-free waterを6 μL を加え 12,000 g, 2 min, 4℃で遠心する。
6. 2x RNA Loading Bufferを6 μL加える
<RNA サイズマーカー準備と泳動>
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
1. RNA サイズマーカーとサンプルをヒートブロックで95℃ 3 min → 氷上 2 min の処理を行う。RNA サイズマーカーは、非特許文献3(McGlincy and Ingolia, 2017, Methods, 126, 112-129)に記載の、Upper size marker oligoribonucleotide NI800 (34 nt)、Lower size marker oligoribonucleotide NI801 (26 nt)を使用した。
2. WAKO SuperSep RNA 15% ゲルを用する。
3. well掃除を行ってから、サンプルをアプライする。コンスタント10 mA で50 min泳動する。
4. 1 x TBE　50 mL + SYBRGold 5 μL (10,000倍希釈)でゲルを染色する。シェーカーで揺らしながら3 min行う。
5. ブルーライトに乗せて、バンドを確認しサンプルの26bp-34bpの間を切り出す。
6. マーカーも切り出しておく。
<gelからのRNA抽出>
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
1. 1.5 mLチューブに入れたゲル片をペッスルで潰す。
2. RNA gel extraction buffer 400 μLを入れ、ペッスルについたゲルを洗い込む。
3. -80℃, 30 min or 液体窒素で凍結する。
4. 室温 2 h以上転倒混和する。
5. Spin-XカラムをDNA Lobind 1.5 mLチューブにセットし、先太チップでゲル溶液を移す。
6. 10000 g, 1 min, 4℃
7. GlycoBlue 3 μL , イソプロパノール500 μLを加えよく混ぜる。
8. 冷凍庫に1 h入れた後、20,000 g, 30 min, 4℃で遠心する。
9. 上清を捨てて、70% エタノールリンス
10. ペレットに10 mM Tris pH7.5を7 μL入れ、溶かす。
4. 20 μM Preadenylated linker 作製
1. 以下の溶液を8連チューブに調製する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 65℃ 1 h → 85℃ 5 minの処理を行う。
　上記表中の5′p-linker-ddC primerは、非特許文献3(McGlincy and Ingolia, 2017, Methods, 126, 112-129)に記載の、NI-810からNI-817 (Table 8)を使用した。
2. Oligo clean & Concentrator カラム精製
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
カラムに移して12,000 g, 1 minで遠心する。Wash buffer 750 μL を加え、12,000 g, 1 min遠心する。空遠心 12,000 g, 5 minを行う。RNase-free water 6 μLでElution。
PAUSE POINT -20℃
5. Dephosphorylation and Linker Ligation
<脱リン酸化>
1. Mixtureの準備　マーカー + サンプル４つの場合
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 2. サンプルは8連チューブに移し、95℃2 min → 氷上3 minの処理を行う。
3. mixtureを3μLずつ分注し37℃ 1 h 置く。
PAUSE POINT -80℃
<リンカーライゲーション>
・サンプルごとにそれぞれ別のリンカーをつける。メモしておく。
・マーカーにはどのリンカーをつけても良い
1.脱リン酸化後 95℃2 min → 氷上3 minの処理を行う。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
2. サンプルに9 μLずつ分注する。
3. Preadenylated linker (20 uM)を1 μLずつ分注　mixする。
4. 22℃ 3 h → 4℃の処理を行う。
5. Oligo clean カラム精製(前述の通りに精製)する。
6. Elution 6 μL + 2 x RNA Loading Buffer 6 μL
PAUSE POINT -80℃
<泳動準備>
(1) linker のみ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 (2) Linker ligation後のマーカー
(3) Linker ligation後サンプル
1. ヒートブロック95℃ 3 min → 氷上2 minの処理を行う。
2. 前述の通りに泳動する。
3. Linker ligation後のサンプルとマーカーを切り出す。
＊切り出したサンプルはリンカーがそれぞれ違うので、以降は混ぜても良い。
4. gelからのRNA抽出(前述の通り)
6. 逆転写反応
　RT primerは、非特許文献3(McGlincy and Ingolia, 2017, Methods, 126, 112-129)に記載の、Reverse transcription primerNI-802を使用した。
1. 8連チューブに以下のものを用意する。
(1) RT primerのみ (RNase-free water 10μL) 又は
(2) RT primer + linker (RNase-free water 9.5 μL + 20 uM liker 0.5 μL) 又は
(3) マーカー（linker ligation後）10 μL 又は
(4) サンプル（linker ligation後）10 μL
＋
1.25 uM RT primer NI802 2 μL
total　12 μL
6℃ 5 min → 氷上 5 min
2. mixtureを(1)～(4)  + RT primerに8μLずつ分注する
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
3. 50℃ 30 minの処理をする。
4. 1 M NaOHを2.2 μLずつ加え、混ぜる。70℃ 20 minの処理をする。
5. Oligo clean & Concentrator カラム精製
RNase-free waterを28 μL足して50 μLにする。前述の通りに精製する。
Elution 6μL + 2x RNA Loading Buffer 6μL
PAUSE POINT -20℃
<泳動準備>
・リンカーとRT primerがアニールしたものがサンプルサイズと重なるため、ヒートブロックで100℃ 5 min → 氷上においてから泳動する。
DNA gel extraction buffer（泳動の間に作っておく）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　切り出したゲルはDNA gel extraction bufferを入れDNAを抽出し、前述の通りにイソプロ沈を行い、ペレットに10 mM Tris pH7.5を12 μL入れ溶かす。
7. Circularization
1. mixtureを8連チューブに8 μLずつ分注する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
 2. サンプルを12 μLずつ分注する
3. 60℃ 1 h → 80℃ 10 minの処理をする。
PAUSE POINT -20℃
8. PCR Amplification and Barcode Addition
　サンプルはサイクル数を振って（6 ,8, 10サイクル）、非特異バンドが少ないバンドを切り出す。
　コントロール(1) RT primerのみ(2) RT primer + linker (3) マーカー（linker ligation後）は8サイクルのみでよい。
1. サンプルは反応液100 μLを作り、33 μLずつ3つのwellに分ける（6 ,8, 10サイクル）
コントロールは100 μL 分のtemplateなし反応液作成、3つのwellに分け、templateを1.7 μLずつ加える（8サイクル）。
PCR後、ライブラリをさらにpoolする場合は、ライブラリごとに異なるRv primer (非特許文献3(McGlincy and Ingolia, 2017, Methods, 126, 112-129)に記載の、NI822-826)を必要に応じて用いる。
(poolできるサンプル数　= linkerバーコード X PCR primerバーコード)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
 NI798 Fw primer及びNI799 Rv primerは、非特許文献3(McGlincy and Ingolia, 2017, Methods, 126, 112-129)に記載の、Forward library PCR primer, NI-798 及びTable 9のIndexed reverse library PCR primer NI-799を使用した。
2. PCRをスタートさせたら、各サイクルの伸長反応が終わったところでチューブを回収していく。
1) 98℃ 30 sの処理をする。
2) [98℃ 10 s, 65℃ 10s, 72℃ 5 s] x6, x8, x10（になるよう2サイクルずつ回収する）
3) 72℃ 5 minの処理をする。
4) 4℃ に置く。
PAUSE POINT -20℃
9. PCR productのゲル精製
PCR productはdenatureさせてはいけない。ゲルはSuperSep DNA, 15%を使用する。 Loading Dyeは6 x non-denaturing purple loading dyeを使用する。
<泳動準備>
　サンプル33 μL + 6 x non-denaturing purple loading dye 6.5 μL を混合し、2 wellに19 μLずつ泳動する
　RT primer, linker, Marker 33 μL + 6 x non-denaturing purple loading dye 6.5 μL を混合し、2 wellに10 μLずつ泳動する
　20 mA 1 h 20min泳動し、前述の通りにゲル染色する
　最適サイクル数を確認して、バンドを切り出す
<gelからのDNA抽出>
1. 2 well分のゲル片をペッスルで潰し、DNA gel extraction buffer 230 μL入れる。
2. -80℃ or 液体窒素で凍結後、室温2 h以上転倒混和。Spin-Xカラムでゲル片を取り除く。
3. NucleoSpin Gel and Cleanカラム精製
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
4. カラムに移して、11,000 g, 1 min, 4℃で遠心する。
5. Buffer NT3 700μL でWASHし、11,000 g, 1 min, 4℃で遠心する。2回行う
6. 空遠心 11,000 g, 5 minを行う.
7. NE buffer 17 μL 加え、室温 1 minおく
8. Elution 11,000 g, 1 min, 4℃で遠心する。
10. Quality Check by MultiNA
<超高感度モードで測定>
・1/25 Gel Star（TEで25倍希釈したもの）
・1/5 島津マーカーDNA-1000（H2Oで5倍希釈したもの）
・1/50 100 bp DNA ラダー（TEで50倍希釈したもの）
1.分離Buffer の準備
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
 2.サンプル、ラダーの準備
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
 3. 機械にセットして測定
4. 濃度、mol数は結果を1/5した値になる。（超高感度測定のため）
シーケンスに必要な量は1 nM が15 μL分である。
足りない場合は最適サイクルのみを100μL分PCRし、同様にゲル精製を行う。
（実施例２）
Ribosome splitting法によるシーケンシングライブラリの調製
　本実施例では、リボソームのサブユニットを剥離し限外ろ過でリボソームを除去してリボソームプロファイリングライブラリを調製した。
　実施例１に記載の方法と同様に、細胞からライセートを作製し（実施例１の1. ライセートの作製の項）、RNase消化後に超遠心を行い、リボソームのペレットを得る（実施例１の2. RNase消化～超遠心(ショ糖クッション)の項）。本実施例２では、実施例１の3. Footprint Fragment 精製の項に記載の＜ダイレクトRNAリカバリー＞に替えて、下記＜リボソームの剥離と限外ろ過＞を実施する。
＜リボソームの剥離と限外ろ過＞
1.下記表に従い、ペレット懸濁液を調製し、氷上に5分程度置く。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
2.リボソームのペレットを限外ろ過用チューブに入れて、150μLペレット懸濁液に再懸濁する。 ペレット懸濁液中のEDTAが、リボソームを大サブユニット、小サブユニット、footprintに剥離する。
3.混合物を、付属のリザーバーチューブを備えたAMICON（登録商標） ULTRA 0.5ML-100KDa cutoff (Millipore, cat. no. UFC510024) のフィルターカップに移し、 4℃で10分間、14,000 gで遠心する。
4.上部フィルターカップを廃棄し、360 μLのTRIzol LS試薬をリザーバーチューブのフロースルーと混合する（TRIzol sampleという）。
5. 実施例１の3. Footprint Fragment 精製の項に<Direct-zol MicroPrep kit カラム精製>を行う。続いて、実施例１の「4. 20 μM Preadenylated linker 作製」の項～「10. Quality Check by MultiNA」の項に記載のとおり、実験を行う。
（実施例３）
「スタンダード法+rRNA Depletion」によるシーケンシングライブラリの調製
　本実施例では、実施例１に記載の「スタンダード法」に、rRNA Depletion工程を加えてサンプルの調製を行った。
　実施例１の「1. ライセートの作製」の項～「5. Dephosphorylation and Linker Ligation」の項に記載のとおり、実験を行う。実施例１の「6. 逆転写反応」の前に、「5. Dephosphorylation and Linker Ligation」において、Linker LigationしたRNAサンプルに対して、rRNA Depletionを下記のとおり行った。
<Ribosomal RNA Depletion>（Ribo-Zero処理）
　Ribo-Zero処理では４サンプルをまとめて処理する。全量が26 μLになるように、10 mM Tris pH 7.5で溶解する。
1. ビーズを225 μL チューブに移し、マグネットに立てる。
2. 上清を捨てて、RNase-free water 225 μL で2回洗浄する。
3. Resuspension solution 60 μLで懸濁する。室温においておく。
4. 1.5mLチューブに以下の溶液を作製。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
 68℃　10 min　→　室温　5 minの処理を行う。
5. 用意しておいたビーズ65 μLを入れピペッティング、vortex 10 s 行う。室温で5 minおいた後vortex 10 sを行い、マグネットに立てる。
6. 上清を新しいチューブに移す。
7. Oligo clean & Concentratorカラム精製を行う。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
(カラムには800 μLまでしか入らないので、2回に分けてカラムに通す)
前述の通りに精製し、RNase-free water 10 μLでElutionする。
（実施例４）
　「Ribosome splitting法+ rRNA Depletion」によるシーケンシングライブラリの調製
　本実施例では、実施例２に記載の「Ribosome splitting法」に、rRNA Depletion工程を加えてサンプルの調製を行った。
　実施例１の「1. ライセートの作製」の項～「5. Dephosphorylation and Linker Ligation」の項に記載のとおり、実験を行うが、実施例１の3. Footprint Fragment 精製の項に記載の＜ダイレクトRNAリカバリー＞に替えて、＜リボソームの剥離と限外ろ過＞を実施する。実施例１の「6. 逆転写反応」の前に、「5. Dephosphorylation and Linker Ligation」において、Linker LigationしたRNAサンプルに対して、rRNA Depletionを実施例３の<Ribosomal RNA Depletion>（Ribo-Zero処理）に記載のとおり行った。
（実施例５）
　実施例１～４でそれぞれ調製してQuality Checkしたライブラリついて、HiSeq4000(Illumina)を用いて、ディープシーケンシングを行った。
　スタンダード法、Ribosome splitting法、スタンダード法+rRNA depletion、及びRibosome splitting法+rRNA depletionで調製したシーケンシングライブラリのリード数の結果を図２に示す。図２中の「Mapped」は、タンパク質コード領域(CDS)にマップされたリード数を意味し、mRNA中のリボソームの数に対応する。
　HEK293細胞からのスタンダード法により調製したライブラリのリボソームプロファイリングでは、rRNAのリード数は9.2 × 105 reads per million (RPM)でライブラリの92%であり、ノンコーディングRNA（rRNA、tRNA、Mt-rRNA、Mt-tRNA、snRNA、snoRNA、microRNAなど）に由来しない有用なリードは、わずか5.4％（0.54×105 RPM）であった（図２、Standard method）。
　rRNAにハイブリダイズして磁気ビーズにトラップできるrRNA-subtraction オリゴヌクレオチドが、rRNAのリードを枯渇させるために使用されている（Ingolia et al., 2009, Science, 324, 218-23; Weinberg et al., 2016, Cell Rep, 14, 1787-1799; McGlincy and Ingolia, 2017, Methods, 126, 112-129）。このrRNA-subtraction オリゴヌクレオチドを用いたrRNA depletionの手段により、rRNAの混入が減少し、rRNAのリード数は7.7×105 RPMでライブラリで77％となり、mRNAのリード数が1.8×105 RPM、ライブラリで18％と増加した（図２、Standard method＋rRNA depletion）。
　一方、Ribosome splitting法では、mRNAのリード数が2.3 × 105 RPM、ライブラリで23％と増加した（図２、Ribosome splitting method）。更に、Ribosome splitting法にrRNA depletionを組み合わせると、mRNAのリード数が5.0 × 105 RPM、ライブラリで50%と増加した（図２、Ribosome splitting method＋rRNA depletion）
　スタンダード法、Ribosome splitting法、スタンダード法+rRNA depletion、及びRibosome splitting法+rRNA depletionで、それぞれ2回別個に繰り返してライブラリを調製しリボソームプロファイリングを行った結果のmRNAのリード数に関し、各方法と2回の繰り返しについて、ピアソンの相関係数を算出した。ピアソンの相関係数は、無次元量であり、－１以上１以下の値をとる。0.7以上1以下で強い相関があると判断される。図３に相関係数を示す。mRNAのリード数は、各方法で2回繰り返したところ再現性があり、更に上記4つの方法間でもデータの高い相関が観察された。
材料
 HEK293 cells (ATCC, cat. no. CRL-1573)
DMEM (1x) + GlutaMAX-I (ThermoFisher Scientific, cat. no. 10566-016), with 10% FBS before use.
 0.05% Trypsin-EDTA (ThermoFisher Scientific, cat. no. 25300-54)
 Cycloheximide 100 mg/ml (Sigma/Aldrich, cat. no. C4859-1ML)
 D-PBS (-)(1x) (nacalai tesque, cat. no. 14249-24)
RNase-free water, molecular biology grade (Millipore, cat. no. H20MB1001) or (ThermoFisher Scientific cat. no. 10977-015)
1 M Tris-HCl pH 7.5, molecular biology grade (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., cat. no. 318-90225)
 5 M NaCl, molecular biology grade (nacalai tesque, cat. no. 06900-14)
 1 M MgCl2, molecular biology grade (nacalai tesque, cat. no. 20942-34)
 Turbo DNase, 2 U/μl (ThermoFisher Scientific, cat. no. AM2238)
Triton X-100, molecular biology grade (nacalai tesque, cat. no. 12967-32)
 Qubit RNA BR Assay kit (ThermoFisher Scientific, cat. no. Q10210)
 SUPERase・In, 20 U/μl (ThermoFisher Scientific, cat. no. AM2694)
Sucrose, molecular biology grade (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., cat. no. 198-13525)
3 M NaOAc pH 5.2, molecular biology grade (nacalai tesque, cat. no. 06893-24)
 RNase I, 10 U/μl (Epicentre, cat. no. N6901K)
13 x 56 mm polycarbonate ultracentrifuge tube (Beckman Coulter, cat. no. 362305)
 Direct-zol RNA MicroPrep (Zymo Research, cat. no. R2062)
TRIzol (ThermoFisher Scientific, cat. no. 15596018) or other Direct-zol compatible reagent
Ethanol, molecular biology grade (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., cat. no. 054-07225)
Isopropanol, molecular biology grade (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., cat. no. 168-21675)
 GlycoBlue, 15 mg/ml (ThermoFisher Scientific, cat. no. AM9515)
0.5 M EDTA, molecular biology grade (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., cat. no. 311-90075)
2× RNA Loading Buffer without Ethidium Bromide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. cat. no. 182-02571)
SuperSepRNA, 15%, 17well (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. cat. no. 194-15881)
  10,000x SYBR Gold (ThermoFisher Scientific, cat. no. S11494)
  UltraPure 10% SDS (ThermoFisher Scientific, cat. no. 15553-027)
  T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs, cat. no. M0201S). Supplied with 10x T4 polynucleotide kinase buffer.
  T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q (New England Biolabs, cat. no. M0351S). Supplied with PEG 8000 50% w/v and 10x T4 RNA ligase buffer
 Preadenylated linkers at 20 μM
 Oligo Clean & Concentrator (Zymo Research, cat. no. D4060)
 10 mM dNTP mix (New England Biolabs, cat. no. N0447L)
ProtoScript II (New England Biolabs, cat. no. M0368L). Supplied with 5x first-strand buffer and 0.1 M DTT
  1M Sodium hydroxide (nacalai tesque, cat. no. 37421-05)
  CircLigaseII ssDNA ligase (Epicentre, cat. no. CL9025K). Supplied with 10x CircLigaseII buffer, 5 M Betaine, and 50 mM MnCl2.
  Phusion polymerase (New England Biolabs, cat. no. M0530S). Supplied with 5x HF buffer.
  Gel Loading Dye, Purple (6×) (New England Biolabs, cat. no. B7024S)
  SuperSep DNA, 15%, 17 well (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 190-15481)
  DNA-1000 kit (SHIMAZU BIOTECH)
  GelStar Nucleic Acid Gel Stain 10,000× (LONZA, cat. no. 50535)
  100 bp DNA Ladder (TAKARA BIO, cat. no. 3407A)
  NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (TAKARA, cat. no 740609.250)
機器
  DNA LoBind Tube 1.5 mL (eppendorf, cat. no. 022431021)
  8-strip PCR tube with lid (BIO-BIK, cat. no. 3247-00)
  Nunc 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes (ThermoFisher Scientific, cat. no. 339652)
  Eppendorf Tubes 5.0 mL (eppendorf, cat. no. 0030122313)
  Low retention filter tips (greiner bio-one, cat. nos. 771265, 773265, 738265, and 750265)
  Short 10 μl filter tips (watson, cat. no. 1252-207CS)
  Wide Bore 200 μl filter tips (Axygen, cat. no. TF-205-WB-R-S)
  Gel loading 20 μl filter tips (ThermoFisher Scientific, cat. no. 2155P)
  Refrigerated microcentrifuge (TOMY, cat. no. MX-307)
  Qubit 2.0 Fluorometer (ThermoFisher Scientific)
  Optima MAX-TL Ultracentrifuge (Beckman, cat. no. A95761)
  TLA 110 rotor (Beckman, cat. no. 366735)
  Dry block heater (Major science, cat. no. MC-0203)
  EasySeparator (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. cat. no. 058-07681)
  Electrophoresis power supply (Amercham Biosciences, cat. no. EPS301)
  Blue light illuminator and orage filter cover (NA). A standard UV transilluminator can be used instead.
  Razors (Feather, cat. no. FAS-10) or (Feather, cat. no. No 11 stainless steel)
  Spin-X centrifuge tube filter 0.22 μM (costar, cat. no. 8160)
  Thermal cycler (Applied Biosystems, cat. no. 2720)
  DynaMag-2 separation rack (ThermoFisher Scientific, cat. no. 12321D)
  MixMate (eppendorf)
  MultiNA (SHIMAZU BIOTECH)
  Disposable homogenizer pestle R-1.5 (ASONE, cat. no. 1-2955-01)

Claims (6)

  1. mRNAとリボソームを含む試料中で、
    リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）、及び
    工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）を含む、
    非リボソームRNA含有試料の製造方法。
  2. mRNAとリボソームを含む試料中でRNAを分解する工程又はRNAを断片化する工程を更に含む、請求項1に記載の非リボソームRNA含有試料の製造方法。
  3. リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させる工程（ａ）がキレート剤を用いて行われる、請求項1又は2に記載の非リボソームRNA含有試料の製造方法。
  4. 工程（ａ）で剥離されたリボソームのサブユニットを除去する工程（ｂ）が限外ろ過により行われる、請求項1～3の何れか一項に記載の非リボソームRNA含有試料の製造方法。
  5. 請求項1～4の何れか一項に記載の非リボソームRNA含有試料の製造方法を実施して非リボソームRNA含有試料を得る工程、及び
    非リボソームRNA含有試料中のRNAの塩基配列を決定する工程
    を含む、非リボソームRNAの分析方法。
  6. リボソームのサブユニットとmRNAを剥離させるための試薬、及び
    リボソームのサブユニットを除去するための手段を含む、
    請求項1～4の何れか一項に記載の非リボソームRNA含有試料の製造方法を実施するために用いられるキット。
     
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