WO2021065749A1 - ソバ由来ｃ－配糖化酵素遺伝子及びその使用 - Google Patents

ソバ由来ｃ－配糖化酵素遺伝子及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
WO2021065749A1
WO2021065749A1 PCT/JP2020/036451 JP2020036451W WO2021065749A1 WO 2021065749 A1 WO2021065749 A1 WO 2021065749A1 JP 2020036451 W JP2020036451 W JP 2020036451W WO 2021065749 A1 WO2021065749 A1 WO 2021065749A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polynucleotide
seq
gene
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/036451
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
典子 中村
奈央子 興津
幸久 勝元
Original Assignee
サントリーホールディングス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by サントリーホールディングス株式会社 filed Critical サントリーホールディングス株式会社
Priority to CA3149161A priority Critical patent/CA3149161A1/en
Priority to CN202080068986.XA priority patent/CN114450404A/zh
Priority to EP20872757.8A priority patent/EP4039804A4/en
Priority to JP2021551206A priority patent/JPWO2021065749A1/ja
Priority to US17/765,692 priority patent/US20230220357A1/en
Publication of WO2021065749A1 publication Critical patent/WO2021065749A1/ja
Priority to CONC2022/0002050A priority patent/CO2022002050A2/es

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/02—Flowers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/74—Rosaceae, e.g. strawberry, apple, almonds, pear, rose, blackberries or raspberries
    • A01H6/749—Rosa, i.e. roses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01002—Formate dehydrogenase (1.2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/02—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with a cytochrome as acceptor (1.2.2)
    • C12Y102/02001—Formate dehydrogenase (cytochrome) (1.2.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13088—Flavonoid 3',5'-hydroxylase (1.14.13.88)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/14—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced flavin or flavoprotein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01047—N-Acylsphingosine galactosyltransferase (2.4.1.47)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01105—2-Hydroxyisoflavanone dehydratase (4.2.1.105)

Definitions

  • the present invention comprises a buckwheat-derived C-glycosylation enzyme (CGT) gene or a homologue thereof, and a step of coexisting delphinidin-type anthocyanin and flavone mono-C-glycoside in plant cells using these genes. It relates to a method for producing a transformed plant having a flower color.
  • CCT buckwheat-derived C-glycosylation enzyme
  • Roses, chrysanthemums, carnations, etc. are industrially important flowers worldwide. Roses, in particular, are the most popular flower plant, have been cultivated since BC and have been bred artificially for hundreds of years. However, it has been difficult to produce rose varieties having a bluish flower color by conventional cross breeding or mutation breeding due to problems such as the absence of blue-colored wild species among closely related species that can be crossed. The creation of a completely new bluish flower color will stimulate new demand accompanying the expansion of flower usage, leading to increased production and consumption. Therefore, attempts have been made to produce roses with a bluish flower color by genetic engineering techniques.
  • the color of the flower changes not only by the structure of the anthocyanin itself, but also by the coexisting flavonoids (called copigments), metal ions, and the pH of the vacuole.
  • Flavones and flavonols are typical pigments, and by stacking them in a sandwich shape with anthocyanins, they have the effect of making anthocyanins blue and appear dark (Non-Patent Document 2).
  • This is known as the copigmentation effect.
  • flavone is known to exhibit a strong copigmentation effect.
  • it has been reported that flavone exhibits a significant copigmentation effect in the analysis of genetically modified carnations (Non-Patent Document 3).
  • Dutch iris it has been reported that the higher the ratio of the total flavone amount to the total delphinidin amount, the stronger the copigmentation effect and the bluer the color (Non-Patent Document 4).
  • Patent Document 1 a gene encoding a protein having an activity of synthesizing flavanone from flavanone in such a plant.
  • flavones are also distributed as glycosides in addition to the free form, and mainly flavone O-glycosides and flavone C-glycosides are produced, but in particular, flavone C-glycosides.
  • isovitexin which is a type of flavone C-glycoside, exhibits a copigmentation effect on anthocyanins in Hanashobu (Iris ensata Thunberg) and turns the flower color blue by stabilizing anthocyanins. (Non-Patent Document 5).
  • flavanone C-glycoside As one of the biosynthetic pathways of flavanone C-glycoside, it is synthesized from flavanone by a reaction catalyzed by flavanone 2-hydroxylase (F2H), C-glycoside enzyme (CGT), and dehydration enzyme (FDH). Is known (Non-Patent Document 6).
  • the problem to be solved by the present invention is to investigate the cause of redness in flower color, thereby uniformly and stably bluish flower color (RHS color chart 5th edition: Violet-Blue group / Blue group and / or hue). Angle: 339.7 ° -270.0 °) to produce a transformed plant.
  • the inventors of the present application have found that the cause of redness is flavone di-C-glycoside, and the copigmentation effect with delphinidin-type anthocyanin is flavone mono-C.
  • -glycosides were significantly higher than flavone di-C-glycosides.
  • the inventors of the present application have succeeded in significantly accumulating only flavone mono-C-glycosides in the petals of plants by introducing the buckwheat-derived CGT gene among various CGT genes. Based on such findings, the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • the buckwheat-derived CGT gene or its homologue (1-a) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11; (1-b) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 11, and has the same activity as the polynucleotide shown in (1-a).
  • the untranslated region (5'-UTR) derived from the Arabidopsis ADH gene (SEQ ID NO: 15) or the untranslated region derived from the Arabidopsis HSPRO gene (5'-UTR) (SEQ ID NO: 13) is added.
  • Arabidopsis-derived CGT gene or its homologue is added.
  • the buckwheat-derived CGT gene or its homologue (1-a) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11; (1-b) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 11, and has the same activity as the polynucleotide shown in (1-a).
  • the Arabidopsis ADH gene-derived untranslated region (5'-UTR) (SEQ ID NO: 15) or Arabidopsis HSPRO gene-derived untranslated region (5'-UTR) (SEQ ID NO: 13) is present in the Arabidopsis-derived CGT gene or its homologue.
  • the vector according to 3 which has been added.
  • the vector according to 3 or 4 further comprising a flavanone 2-hydroxylase (F2H) gene or a homolog thereof, and a dehydratase (FDH) gene or a homolog thereof.
  • F2H flavanone 2-hydroxylase
  • FDH dehydratase
  • the F2H gene or its homologue is (2-a) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5; (2-b) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 5, and has the same activity as the polynucleotide shown in (2-a).
  • a polynucleotide encoding a protein that has similar activity to the protein encoded by (3-e) Has an amino acid sequence having 90% or more identity with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and has the same activity as the protein encoded by the polynucleotide according to (3-c). 5.
  • the vector according to 5 selected from the group consisting of polynucleotides encoding proteins.
  • F3'5'H flavonoid F3'5'hydroxylase
  • MT methyltransferase
  • the F3'5'H gene or its homologue is (4-a) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; (4-b) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1, and has the same activity as the polynucleotide shown in (4-a).
  • a polynucleotide encoding a protein that has similar activity to the protein encoded by (4-e) Has an amino acid sequence having 90% or more identity with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and has the same activity as the protein encoded by the polynucleotide described in (4-c).
  • the vector according to 7 selected from the group consisting of polynucleotides encoding proteins.
  • the transformed plant according to 9 wherein the plant is selected from roses, chrysanthemums, carnations or lilies, or its self-fertilized or allogeneic progeny.
  • the transformed plant according to 10 wherein the plant is a rose, or a self-fertilized or cross-grown progeny thereof.
  • a method for producing a transformed plant having a bluish flower color which is a method for introducing a buckwheat-derived C-glycoside enzyme (CGT) gene or a homolog thereof into a host plant to introduce a delphinidin-type anthocyanin and a flavone mono.
  • CCT buckwheat-derived C-glycoside enzyme
  • a method comprising the step of coexisting a C-glycoside within a plant cell.
  • the flavone mono-C-glycoside is apigenin 6-C-glucoside, luteolin 6-C-glucoside, tricetin 6-C-glucoside, apigenin 8-C-glucoside, luteolin 8-C-glucoside, tricetin. 14. The method according to 14, wherein the 8-C-glucoside or a derivative thereof.
  • the delphinidin-type anthocyanin is selected from the group consisting of malvidin, delphinidin, petunidin and combinations thereof.
  • a plant variety having a bluish flower color (RHS color chart 5th edition: Violet-Blue group / Blue group and / or hue angle: 339.7 ° to 270.0 °) can be uniformly and stably produced. Can be created.
  • the biosynthetic pathway of flavone mono-C-glycoside in plants is shown.
  • the structure of pSPB6486 is shown.
  • the structure of pSPB7473 is shown.
  • the detailed structure of pSPB7473 is shown.
  • the detailed structure of pSPB7472 is shown.
  • the detailed structure of pSPB7808 is shown.
  • the detailed structure of pSPB7809 is shown.
  • Anthocyanins are a group of pigments that are widely present in plants, and are known to exhibit red, blue, and purple flower colors. According to the number of hydroxy groups in the B ring of the anthocyanidin moiety, which is an aglycone, it is classified into three strains, pelargodinin, cyanidin and delphinidin.
  • the chromophore is the aglycone part, and pelargonidin-type anthocyanins are orange, cyanidin-type anthocyanins are red, and delphinidin-type anthocyanins are purple to blue.
  • delphinidin-type anthocyanin includes derivatives having delphinidin, malvidin, and petunidin as a skeleton, and malvidin is preferable.
  • Delphinidin-type anthocyanins may develop a bluish color by intermolecular interaction with substances such as flavonols, flavonols, organic acid esters, and tannins. This phenomenon is called the copying action, and the substance that causes such a phenomenon is called the copying (accessory pigment).
  • the copying action has not only a deep color effect that causes the appearance of blue color, but also a dark color effect and an effect of improving color stability.
  • the present inventors have confirmed that the petals of roses appear blue due to the pigmenting action of delphinidin-type anthocyanins and flavone C-glycosides (Patent Document 2).
  • Flavone is a kind of organic compound, is a cyclic ketone of a flavan derivative, and exists mainly as a glycoside in plants. Flavones, in a narrow sense, refer to compounds having a chemical formula of C 15 H 10 O 2 , a molecular weight of 222.24, and 2,3-didehydroflavan-4-one, while flavones (flaves) in a broad sense are one of the flavonoid categories. Of the flavonoids, those with a flavon structure as the basic skeleton and no hydroxyl group at the 3-position are classified as "flvon".
  • flavone C-glycoside means a flavone in a broad sense, that is, a glycoside obtained by directly binding aglycone to the anomeric carbon of aldose among the glycosides of derivatives belonging to flavones.
  • flavone C-glycoside examples include, but are not limited to, luteolin C-glycoside, tricetin C-glycoside, apigenin C-glycoside, and acacetin C-glycoside.
  • Flavone C-glycosides also include glycosides of apigenin, luteolin, tricetin, and acacetin derivatives.
  • the pathway shown in FIG. 1 is known as one of the biosynthetic pathways of flavone C-glycosides. In this pathway, flavone C-glycosides are produced through the action of F2H, CGT, and FDH.
  • flavone di-C-glycosides such as bisenin-2 (apigenin 6,8-di-C-glucoside) are also synthesized.
  • the inventors have now found that the cause of redness is the flavone di-C-glycoside, and the copying effect with delphinidin-type anthocyanin is that the flavone mono-C-glycoside is the flavone di-C-glycoside.
  • the flavone mono-C-glycoside is typically flavone 6-C-glucoside or flavone 8-C-glucoside, preferably flavone 6-C-glucoside.
  • flavone mono-C-glycosides include apigenin 6-C-glucoside (isobitexin), luteolin 6-C-glucoside (isoorientin), tricetin 6-C-glucoside, and apigenin 8-C-. Examples thereof include glucoside (vitexin), luteolin 8-C-glucoside (orientin), trisetin 8-C-glucoside or derivatives thereof.
  • the accumulation of flavone C-glycosides is to transform the host plant with a vector containing essential genes (ie, F2H gene, CGT gene, and FDH gene) in the above synthetic pathway or their homologues. Can be achieved by.
  • essential genes ie, F2H gene, CGT gene, and FDH gene
  • the buckwheat-derived CGT gene or its homologue in particular, as the translation-enhancing sequence, the untranslated region derived from the Shiroinu-nazuna ADH gene (5'-UTR) (SEQ ID NO: 15) or the untranslated region derived from the Shiroinu-nazuna HSPRO gene (5'-
  • UTR Shiroinu-nazuna HSPRO gene
  • the flavon mono-C-glycosylate is significantly accumulated in the petals as compared with the flavone di-C-glycosylate. It is possible to make it.
  • the buckwheat-derived CGT gene or its homologue is composed of the following polynucleotides: (1-a) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11; (1-b) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 11, and has the same activity as the polynucleotide shown in (1-a).
  • a polynucleotide encoding a protein that has similar activity to the protein encoded by (1-e) Has an amino acid sequence having 90% or more identity with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and has the same activity as the protein encoded by the polynucleotide described in (1-c). It is selected from the group consisting of polynucleotides encoding proteins.
  • the origin of the F2H gene or its homologue is not particularly limited as long as it has a desired function, but it is preferably a licorice-derived F2H gene or its homologue, and the following polynucleotide: (2-a) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5; (2-b) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 5, and has the same activity as the polynucleotide shown in (2-a).
  • a polynucleotide encoding a protein that has similar activity to the protein encoded by (2-e) Has an amino acid sequence having 90% or more identity with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and has the same activity as the protein encoded by the polynucleotide described in (2-c). It is selected from the group consisting of polynucleotides encoding proteins.
  • the origin of the FDH gene or its homolog is not particularly limited as long as it has a desired function, but it is preferably a Lotus japonicus-derived FDH gene or its homolog, and the following polynucleotide: (3-a) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; (3-b) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 9, and has the same activity as the polynucleotide shown in (3-a).
  • a polynucleotide encoding a protein that has similar activity to the protein encoded by (3-e) Has an amino acid sequence having 90% or more identity with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and has the same activity as the protein encoded by the polynucleotide according to (3-c). It is selected from the group consisting of polynucleotides encoding proteins.
  • the origin of the F3'5'H gene or its homologue is not particularly limited as long as it has a desired function, but it is preferably the F3'5'H gene derived from Campanula or its homologue.
  • a polynucleotide encoding a protein that has similar activity to the protein encoded by (4-e) Has an amino acid sequence having 90% or more identity with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and has the same activity as the protein encoded by the polynucleotide described in (4-c). It is selected from the group consisting of polynucleotides encoding proteins.
  • the MT gene or its homologue is not particularly limited in its origin as long as it has a desired function, but is preferably a torenia-derived MT gene or its homologue.
  • 5-a A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3;
  • 5-b A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 3, and has the same activity as the polynucleotide shown in (5-a).
  • a polynucleotide encoding a protein that has similar activity to the protein encoded by (5-e) Has an amino acid sequence having 90% or more identity with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and has the same activity as the protein encoded by the polynucleotide described in (5-c). It is selected from the group consisting of polynucleotides encoding proteins.
  • the Arabidopsis ADH gene-derived untranslated region (5'-UTR) (SEQ ID NO: 15) or the Arabidopsis HSPRO gene-derived untranslated region (5'-UTR) (SEQ ID NO: 13) is included as a translation-enhancing sequence. Can be added.
  • polynucleotide means DNA or RNA.
  • stringent condition is a condition that allows selective and detectable specific binding of a polynucleotide or oligonucleotide to genomic DNA.
  • Stringent conditions are defined by the appropriate combination of salt concentration, organic solvent (eg, formamide), temperature, and other known conditions. That is, the stringency increases depending on whether the salt concentration is decreased, the organic solvent concentration is increased, or the hybridization temperature is increased.
  • the conditions of washing after hybridization also affect stringency. This cleaning condition is also defined by salt concentration and temperature, and decreasing salt concentration and increasing temperature increase the stringency of cleaning.
  • the term “stringent condition” means that the degree of "identity” between each base sequence is, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more on average. Further preferably, it means a condition that specifically hybridizes only between base sequences having high identity, such as 97% or more, and most preferably 98% or more.
  • the "stringent condition” include conditions such that the sodium concentration is 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, and the pH is 6 to 8 at a temperature of 60 ° C to 68 ° C. Specific examples thereof include 5.
  • Hybridization was performed under the conditions of ⁇ SSC (750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate), 1% SDS, 5 ⁇ Denhardt solution 50% formaldehyde, and 42 ° C., and 0.1 ⁇ SSC (15 mM NaCl, 1.5 mM citrate). (Trisodium), 0.1% SDS, and those that perform washing under the conditions of 55 ° C. can be mentioned.
  • Hybridization is performed by a method known in the art such as a method described in Current Protocols in Molecular Biology (edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987). It can be carried out according to the same method. When using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the gene selected by such hybridization may be a naturally derived gene, for example, a plant-derived gene or a non-plant-derived gene.
  • the gene selected by hybridization may be cDNA, genomic DNA, or chemically synthesized DNA.
  • an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added means, for example, 1 to 20, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 1.
  • the site-specific mutagenesis method which is one of the genetic engineering methods, is useful because it can introduce a specific mutation at a specific position. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. et al. Y. , 1989 and the like.
  • the polynucleotide is a nucleic acid using a method known to those skilled in the art, for example, a method chemically synthesized by a phosphoamidide method or the like, a nucleic acid sample using a plant nucleic acid sample as a template, and a primer designed based on the nucleotide sequence of the target gene. It can be obtained by an amplification method or the like.
  • the term “identity” refers to each amino acid residue constituting a strand between two strands in a polypeptide sequence (or amino acid sequence) or polynucleotide sequence (or base sequence). Or, it means the amount (number) of things that can be determined to be the same in the mutual compatibility relationship of each base, and means the degree of sequence correlation between two polypeptide sequences or two polynucleotide sequences. Therefore, “identity” can be easily calculated. Many methods are known to measure the identity between two polynucleotide sequences or polypeptide sequences, and the term “identity” is well known to those skilled in the art (eg, Lesk, AM (Ed.).
  • the numerical value of "identity” described in the present specification may be a numerical value calculated by using an identity search program known to those skilled in the art, unless otherwise specified, but MacVector is preferable. It is a numerical value calculated by using the Clustal W program of the application (version 9.5 Oxford Molecular Ltd., Oxford, England).
  • the degree of "identity" between each polynucleotide sequence or amino acid sequence is, for example, about 90% or more, preferably about 95% or more, more preferably about 97% or more, and most preferably about 98%. That is all.
  • the polynucleotide (nucleic acid, gene) of the present invention "encodes" the protein of interest.
  • encoding means expressing the protein of interest in a state having its activity.
  • encoding includes both meanings of encoding the protein of interest as a continuous structural sequence (exon) and encoding via an intervening sequence (intron).
  • a gene having a natural base sequence can be obtained, for example, by analysis with a DNA sequencer.
  • the DNA encoding the enzyme having the modified amino acid sequence can be synthesized based on the DNA having the innate base sequence by using the usual site-specific mutagenesis or PCR method.
  • a DNA fragment to be modified is obtained by restriction enzyme treatment of native cDNA or genomic DNA, and using this as a template, site-specific mutagenesis or PCR method is carried out using a primer into which a desired mutation is introduced, and desired. Obtain a modified DNA fragment.
  • the DNA fragment into which this mutation has been introduced may then be ligated to the DNA fragment encoding the other portion of the enzyme of interest.
  • a DNA encoding an enzyme consisting of a shortened amino acid sequence for example, a DNA having an amino acid sequence longer than the target amino acid sequence
  • a DNA encoding a full-length amino acid sequence is cleaved with a desired limiting enzyme, and the result is If the obtained DNA fragment does not encode the entire target amino acid sequence, the DNA fragment consisting of the missing sequence may be synthesized and ligated.
  • the obtained polynucleotide is expressed using a gene expression system in Escherichia coli and yeast, and the enzyme activity is measured to confirm that the obtained polynucleotide encodes a protein having a desired activity. Can be done.
  • the present invention also relates to a (recombinant) vector containing the polynucleotide, particularly an expression vector, and a plant transformed with the vector.
  • the vectors of the present invention contain expression control regions, such as promoters, terminators, origins of replication, etc., depending on the type of host plant into which they are introduced.
  • expression control regions such as promoters, terminators, origins of replication, etc.
  • promoters that constitutively express polynucleotides in plant cells include the 35S promoter of Califlower Mosaic Virus, the El 2 35S promoter in which two enhancer regions of the 35S promoter are linked, the rd29A gene promoter, the rbcS promoter, and mac-1. Promoters and the like can be mentioned.
  • tissue-specific gene expression a promoter of a gene specifically expressed in the tissue can be used.
  • the vector can be prepared according to a conventional method using a restriction enzyme, ligase, or the like.
  • transformation of the host plant with an expression vector can also be carried out according to a conventional method.
  • a technique for introducing a polynucleotide into a plant and expressing the polynucleotide in a constitutive or tissue-specific manner can be carried out by a method known to those skilled in the art, for example, an Agrobacterium method, a binary vector method, an electroporation method, a PEG method, a particle gun method or the like.
  • the plants that can be used as the host are not particularly limited, but plants of the genus Rosaceae, the genus Asteraceae, the genus Dianthus (Carnation, etc.), and the genus Yuri of the family Rosaceae can be used, and in particular. It is preferably a cultivated rose of the genus Rosa in the family Rosaceae (scientific name: Rosa hybrida).
  • the term "rose plant” used in the present specification refers to a cultivated rose of the Rosaceae rose genus (scientific name: Rosa hybrida) in terms of taxonomic position. Roses are mainly divided into hybrid tea type, floribunda type, polyansa type, etc.
  • the main pigments (anthocyanins) contained in the petals of all types are cyanidin type and pelargonidin type.
  • the type of rose plant used as a host in the present invention is not particularly limited, and can be suitably used for these varieties and strains.
  • rose varieties that can be used as hosts include ocean song, noblesse, Rita perfumera, cool water, fame, topless, peach avalanche and the like.
  • a transformed plant having a bluish flower color preferably Rosaceae, Asteraceae, or Dianthus (Carnation, etc.), particularly preferably a rose plant, is produced uniformly and stably.
  • the obtained transformed plants were blue group or Violet-Blue group on the RHS color chart, and / or CIEL * a * b * color system hue angle of 339.7 ° to 270.0 °, preferably 315. Shows a flower color below °.
  • the present invention is a processed product prepared from the transformed plant obtained above or a cut flower of a self-propagating or other-reproductive progeny thereof, a vegetative propagule thereof, a part of the plant, a tissue, or a cell, or a cut flower. Also related to (especially cut flower processed products).
  • the cut flower processed product includes, but is not limited to, a pressed flower using the cut flower, a preserved flower, a dried flower, a resin sealed product, and the like.
  • Example 1 Simulation of copigmentation effect of flavone C-glycoside on anthocyanin (malvin)] Malvin and flavone C-glycosides were adjusted to simulate the copigmentation effect of flavone C-glycosides on anthocyanins (malvin).
  • Malvin malvidin 3,5-diglucoside
  • flavone C-glycoside flavone C-glycoside
  • isovitexin apigenin 6-C-glucoside
  • orientin luteolin 8-C-glucoside
  • Isoorientin luteolin 6-C-glucoside
  • bisenin-2 apigenin 6,8-di-C-glucoside
  • Each flavone C-glycoside was added to the malvin thus obtained in a buffer solution of pH 5.0 at a molar concentration ratio of 5 equivalents. Then, the absorption spectrum was measured. The concentration of malvin was 0.5 mM.
  • the copigmentation effect of the flavone mono-C-glycoside was higher than that of the flavone di-C-glycoside. Furthermore, it was found that the flavone 6-C-glycoside has a particularly high copigmentation effect among the flavone mono-C-glycosides.
  • pSPB6486 has pBINPLUS as a basic skeleton and contains the following five expression cassettes.
  • the pSPB6486 produced in this way was introduced into the blue rose variety "Ocean Song” to obtain a total of 27 transformants.
  • the accumulation of malvidin could be confirmed in 26 individuals, and the malvidin content was up to 74.5% (average 57.0%).
  • isovitexin (apigenin 6-C-glucoside), vitexin (apigenin 8-C-glucoside), isoorientin (luteolin 6-C-glucoside), orientin (luteolin 8-C-glucoside).
  • Visenin-2 (apigenin 6,8-C-diglucoside) was identified and quantified.
  • Flavone C-glycoside could be detected in all the individuals in which malvidin could be detected, and flavone di-C-glycoside visenin-2 was detected as the main component.
  • the amount produced was large in the order of vitexin-2> isovitexin> vitexin> isoorientin> orientin, and the total amount was 1.563 mg per 1 g of fresh petal weight at the maximum.
  • the total amount of flavone C-glycoside was about 10 times or more that of malvidin.
  • pSPB7473 has pBINPLUS as a basic skeleton and contains the following five expression cassettes.
  • the pSPB7473 thus produced was introduced into the blue rose variety "Ocean Song" to obtain a total of 35 transformants.
  • the accumulation of malvidin could be confirmed in 21 individuals, and the malvidin content was up to 20.8% (average 9.1%).
  • isovitexin (apigenin 6-C-glucoside), vitexin (apigenin 8-C-glucoside), isoorientin (luteolin 6-C-glucoside), orientin (luteolin 8-C-glucoside).
  • Visenin-2 (apigenin 6,8-C-diglucoside) was identified and quantified.
  • Flavone C-glycoside was detected in all the individuals in which malvidin could be detected, and isovitexin, which is a flavone 6-C-glycoside, was detected as a main component.
  • the amount produced was large in the order of isovitexin> vitexin> vitexin-2> isoorientin> orientin, and the total amount was 7.418 mg per 1 g of fresh petal weight, which was a very high content.
  • the total amount of flavone C-glycosides is as high as 3 mg or more per 1 g of fresh petal weight in most individuals, which is about 100 times or more that of delphinidin. It was the amount of production.
  • pSPB7472 has pBINPLUS as a basic skeleton and contains the following five expression cassettes.
  • the pSPB7472 thus produced was introduced into the blue rose variety "Ocean Song” to obtain a total of 33 transformants.
  • flavone C-glycosides isovitexin (apigenin 6-C-glucoside), bitexin (apigenin 8-C-glucoside), isoorientin (luteolin 6-C-glucoside), orientin (luteolin 8-C-glucoside).
  • Visenin-2 apigenin 6,8-C-diglucoside as anthocyanidins, delphinidin, cyanidin, petunidin, pelargonidin, and malvidin were identified and quantified.
  • flavone C-glycoside As a result, accumulation of flavone C-glycoside and malvidin could be confirmed in 11 individuals.
  • the average content of flavone C-glycoside was 3.75 mg per 1 g of fresh petal weight, and isovitexin, which is a flavone 6-C-glycoside, was detected as a main component.
  • the maximum malvidin content was 15.6% (average 8.8%).
  • the average content of flavone C-glycoside per 1 g of fresh petal weight was 4.19 mg higher in the OS / 7473 strain shown in Example 3.
  • the codon-modified CGT gene can produce flavone C-glycosides more efficiently than the original buckwheat-derived CGT gene.
  • pSPB7808 has pBINPLUS as a basic skeleton and contains the following five expression cassettes.
  • the pSPB7808 produced in this way was introduced into the blue rose variety "Ocean Song” to obtain a total of 65 transformants.
  • flavone C-glycosides isovitexin (apigenin 6-C-glucoside), bitexin (apigenin 8-C-glucoside), isoorientin (luteolin 6-C-glucoside), orientin (luteolin 8-C-glucoside).
  • Visenin-2 apigenin 6,8-C-diglucoside as anthocyanidins, delphinidin, cyanidin, petunidin, pelargonidin, and malvidin were identified and quantified.
  • flavone C-glycoside As a result, accumulation of flavone C-glycoside and malvidin could be confirmed in 32 individuals.
  • the average content of flavone C-glycoside was 3.00 mg per 1 g of fresh petal weight, and isovitexin, which is a flavone 6-C-glycoside, was detected as a main component.
  • the maximum malvidin content was 69.2% (average 43.9%).
  • pSPB7809 has pBINPLUS as a basic skeleton and contains the following five expression cassettes.
  • the pSPB7809 thus produced was introduced into the blue rose variety "Ocean Song” to obtain a total of 143 transformants.
  • flavone C-glycosides isovitexin (apigenin 6-C-glucoside), bitexin (apigenin 8-C-glucoside), isoorientin (luteolin 6-C-glucoside), orientin (luteolin 8-C-glucoside).
  • Visenin-2 apigenin 6,8-C-diglucoside as anthocyanidins, delphinidin, cyanidin, petunidin, pelargonidin, and malvidin were identified and quantified.
  • flavone C-glycosides could be confirmed in 58 individuals.
  • the average content of flavone C-glycoside was 3.24 mg per 1 g of fresh petal weight, and isovitexin, which is a flavone 6-C-glycoside, was detected as a main component.
  • the maximum malvidin content was 80.3% (average 46.6%).
  • the average content of flavone C-glycoside per 1 g of fresh petal weight was higher in the OS / 7809 strain shown in this example. Therefore, similar to the results obtained in Examples 3 and 4, it was shown that the codon-modified CGT gene can produce flavone C-glycosides more efficiently than the original buckwheat-derived CGT gene. ..
  • Example 7 Evaluation of flower color of rose containing flavone C-glycoside
  • CM-2022 Minolta Co., Ltd.
  • SpectroMagicTM Minolta Co., Ltd.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

青系花色を有する形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞を提供する。　ソバ由来Ｃ－配糖化酵素（ＣＧＴ）遺伝子又はそのホモログを宿主植物に導入することにより、デルフィニジン型アントシアニンとフラボン モノ－Ｃ－配糖体を植物の細胞内で共存させる。

Description

ソバ由来Ｃ－配糖化酵素遺伝子及びその使用
　本発明は、ソバ由来Ｃ－配糖化酵素（ＣＧＴ）遺伝子又はそのホモログ、及びこれらを用いてデルフィニジン型アントシアニンとフラボン モノ－Ｃ－配糖体を植物の細胞内で共存させる工程を含む、青系花色を有する形質転換植物を作出するための方法に関する。
　バラ、キク、カーネーション等は世界的に産業上重要な花卉である。特にバラは最も人気のある花卉植物であり、紀元前から栽培されていた記録があり、数百年にわたり人為的な品種改良がされてきた。しかしながら、交雑可能な近縁種に青系の花色の野生種が無いなどの問題により、従来の交雑育種や突然変異育種では、青系花色を有するバラ品種の作出は困難であった。全く新しい青系花色の創出は、花卉の利用場面の拡大に伴う新たな需要を喚起し、生産や消費の拡大に繋がる。そこで、遺伝子工学的手法により青系花色をもつバラの作出が試みられてきた。
　例えば、紫から青色の花には、デルフィニジン、ペチュニジン及びマルビジンを骨格としたデルフィニジン型アントシアニンが多く含まれることが知られているが、バラなどの花卉は、このようなデルフィニジン型アントシアニンを生産できないため、これらの合成に必要なフラボノイド３’，５’－水酸化酵素遺伝子を発現させることにより、デルフィニジンを人為的に生産させる研究が行われている（非特許文献１）。しかしながら、目的の物質を生産する酵素遺伝子を組換え植物において発現させるために植物の代謝を人為的に改変したとしても、目的の物質の蓄積がまったく、あるいはほとんど起こらないことが多い。
　さらに、花の色は、アントシアニン自身の構造のほかに、共存するフラボノイド（コピグメントと呼ばれる）や金属イオン、液胞のｐＨなどによっても変化する。フラボンやフラボノールは、代表的なコピグメントであり、アントシアニンとサンドイッチ状に積み重なることにより、アントシアニンを青くし、濃く見えるようにする効果がある（非特許文献２）。これはコピグメント効果として知られている。特にフラボンは強いコピグメント効果を示すことが知られており、たとえば遺伝子組換えカーネーションの解析ではフラボンが有意なコピグメント効果を示すことが報告されている（非特許文献３）。また、ダッチアイリスにおいて、総デルフィニジン量に対する総フラボン量の比が高いほど強いコピグメント効果を示し、色が青くなることが報告されている（非特許文献４）。
　しかしながら、すべての植物がフラボンを生産できるわけではなく、バラやペチュニアなどはフラボンを蓄積しない。したがって、フラバノンからフラボンを合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をこのような植物で発現させ、花色を改変させる試みが行われている（特許文献１）。
　また、植物では、フラボンは遊離形態の他に配糖体としても分布しており、主にフラボン Ｏ－配糖体とフラボン Ｃ－配糖体が生成されるが、特にフラボン Ｃ－配糖体は強いコピグメント効果を示すことが知られている。例えば、フラボン Ｃ－配糖体の一種であるイソビテキシンは、ハナショウブ（Ｉｒｉｓ　ｅｎｓａｔａ　Ｔｈｕｎｂ．）においてアントシアニンに対しコピグメント効果を示し、アントシアニンを安定化することにより花色を青色化することが報告されている（非特許文献５）。フラボン Ｃ－配糖体の生合成経路の１つとして、フラバノン ２-水酸化酵素（Ｆ２Ｈ）及びＣ－配糖化酵素（ＣＧＴ）、脱水酵素（ＦＤＨ）が触媒する反応によりフラバノンから合成されることが知られている（非特許文献６）。
　これまでに、カンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子とトレニア由来ＭＴ遺伝子、カンゾウ由来Ｆ２Ｈ遺伝子、イネ由来ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサ由来ＦＤＨ遺伝子を導入して、デルフィニジン型アントシアニンとフラボン Ｃ－配糖体を植物の細胞内で共存させることにより、青系花色を有するバラを作出したことが報告されている（特許文献２）。しかしながら、このようにして作出されたバラ系統の花色は、赤みの強い傾向が認められており、均一的かつ安定的に、より青い花色をもつバラの作出可能にするための青色発現制御技術の開発が依然として望まれている。
特開２０００－２７９１８２号公報 国際公開第２０１９／０６９９４６号 国際公開第２００８／１５６２０６号
Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　５，２８３－２９１ Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｏｒｇ．Ｎａｔｌ．Ｐｒｏｄ．５２ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６３，１５－２３（２００３） Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈ．７２，１１６－１２４（２０１３） Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ　１１５，１－５（２０００） ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．５８９，１８２－１８７（２０１５）
　本発明が解決しようとする課題は、花色における赤みの原因を究明することにより、均一的かつ安定的に、青系花色（ＲＨＳカラーチャート第５版：Ｖｉｏｌｅｔ－Ｂｌｕｅグループ／Ｂｌｕｅグループかつ／または色相角度：３３９．７°～２７０．０°）を有する形質転換植物を作出することである。
　本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討し、実験を重ねた結果、赤みの原因がフラボン ジ－Ｃ－配糖体にあり、デルフィニジン型アントシアニンとのコピグメント効果はフラボン モノ－Ｃ－配糖体の方が、フラボン ジ－Ｃ－配糖体よりも有意に高いことを見出した。さらに、本願発明者らは、様々なＣＧＴ遺伝子の中で、ソバ由来ＣＧＴ遺伝子を導入することにより、植物の花弁において、フラボン モノ－Ｃ－配糖体のみを有意に蓄積させることに成功した。このような知見に基づき、本発明を完成するに至った。
　本発明は、以下の通りである。
［１］　ソバ由来Ｃ－配糖化酵素（ＣＧＴ）遺伝子又はそのホモログであって、
　前記ソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログが、
　（１－ａ）配列番号１１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（１－ｂ）配列番号１１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（１－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド；
　（１－ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される、ソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログ。
［２］シロイヌナズナＡＤＨ遺伝子由来非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）（配列番号１５）又はシロイヌナズナＨＳＰＲＯ遺伝子由来非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）（配列番号１３）が付加されている、１に記載のソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログ。
［３］　ソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログを含むベクターであって、
　前記ソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログが、
　（１－ａ）配列番号１１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（１－ｂ）配列番号１１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（１－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド；
　（１－ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（１－ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（１－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（１－ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（１－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される、ベクター。
［４］　前記ソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログにシロイヌナズナＡＤＨ遺伝子由来非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）（配列番号１５）又はシロイヌナズナＨＳＰＲＯ遺伝子由来非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）（配列番号１３）が付加されている、３に記載のベクター。
［５］　フラバノン ２-水酸化酵素（Ｆ２Ｈ）遺伝子又はそのホモログ、及び脱水酵素（ＦＤＨ）遺伝子又はそのホモログをさらに含む、３又は４に記載のベクター。
［６］　前記Ｆ２Ｈ遺伝子又はそのホモログが、
　（２－ａ）配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（２－ｂ）配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（２－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド；
　（２－ｃ）配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（２－ｄ）配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（２－ｅ）配列番号６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（２－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
　前記ＦＤＨ遺伝子又はそのホモログが、
　（３－ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（３－ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（３－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド；
　（３－ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（３－ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（３－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（３－ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（３－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、５に記載のベクター。
［７］　フラボノイドＦ３’５’水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素（ＭＴ）遺伝子又はそのホモログをさらに含む、３～６のいずれかに記載のベクター。
［８］　前記Ｆ３’５’Ｈ遺伝子又はそのホモログが、
　（４－ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（４－ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（４－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド；
　（４－ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（４－ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（４－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（４－ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（４－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
　前記ＭＴ遺伝子又はそのホモログが、
　（５－ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（５－ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（５－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド；
　（５－ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（５－ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（５－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（５－ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（５－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、７に記載のベクター。
［９］　１又は２に記載のソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログ、あるいは３～８のいずれかに記載のベクターを含む形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１０］　前記植物がバラ、キク、カーネーション又はユリから選択される、９に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１１］　前記植物がバラである、１０に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１２］　９～１１のいずれかに記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代の栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
［１３］　９～１１のいずれかに記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、又は該切り花から作成された加工品。
［１４］　青系花色を有する形質転換植物を作出するための方法であって、ソバ由来Ｃ－配糖化酵素（ＣＧＴ）遺伝子又はそのホモログを宿主植物に導入することにより、デルフィニジン型アントシアニンとフラボン モノ－Ｃ－配糖体を植物の細胞内で共存させる工程を含む、方法。
［１５］　前記フラボン モノ－Ｃ－配糖体が、アピゲニン ６－Ｃ－グルコシド、ルテオリン ６－Ｃ－グルコシド、トリセチン ６－Ｃ－グルコシド、アピゲニン ８－Ｃ－グルコシド、ルテオリン ８－Ｃ－グルコシド、トリセチン ８－Ｃ－グルコシド又はそれらの誘導体である、１４に記載の方法。
［１６］　前記デルフィニジン型アントシアニンが、マルビジン、デルフィニジン、ペチュニジン及びそれらの組み合せから成る群から選択される、１４又は１５に記載の方法。
［１７］　１又は２に記載のソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログ、あるいは３～８のいずれかに記載のベクターを宿主植物の細胞内に導入する工程を含む、１４～１６のいずれかに記載の方法。
［１８］　前記植物がバラ、キク、カーネーション又はユリから選択される、１４～１７のいずれかに記載の方法。
［１９］　前記植物がバラである、１８に記載の方法。
　本発明により、均一的かつ安定的に、青系花色（ＲＨＳカラーチャート第５版：Ｖｉｏｌｅｔ－Ｂｌｕｅグループ／Ｂｌｕｅグループかつ／または色相角度：３３９．７°～２７０．０°）を有する植物品種を作出できる。
植物におけるフラボン モノ－Ｃ－配糖体の生合成経路を示す。 ｐＳＰＢ６４８６の構造を示す。 ｐＳＰＢ７４７３の構造を示す。 ｐＳＰＢ７４７３の詳細な構造を示す。 ｐＳＰＢ７４７２の詳細な構造を示す。 ｐＳＰＢ７８０８の詳細な構造を示す。 ｐＳＰＢ７８０９の詳細な構造を示す。
　アントシアニンは、植物において広く存在する色素群であり、赤色、青色、紫色の花色を呈することが知られている。アグリコンであるアントシアニジン部位のＢ環のヒドロキシ基の数により、ペラルゴジニン、シアニジン及びデルフィニジンの３系統に分類される。発色団はアグリコン部分であり、ペラルゴニジン型アントシアニンは橙色、シアニジン型アントシアニンは赤色、デルフィニジン型アントシアニンは紫～青色を呈する。本願明細書中、例えば、「デルフィニジン型アントシアニン」は、デルフィニジン、マルビジン、ペチュニジンを骨格にもつそれらの誘導体が挙げられるが、好ましくはマルビジンである。
　デルフィニジン型アントシアニンは、フラボン、フラボノール、有機酸エステル類、タンニン類などの物質と共存することで、それらと分子間相互作用をして青みを帯びた色を発現する場合がある。この現象はコピグメント作用と呼ばれ、このような現象を引き起こす物質はコピグメント（補助色素）と呼ばれる。コピグメント作用には青色の発現を引き起こす深色効果だけでなく、濃色効果や色の安定性向上の効果もある。本発明者らにより、デルフィニジン型アントシアニンとフラボン Ｃ－配糖体とのコピグメント作用によって、バラの花弁が青色発現することが確認されている（特許文献２）。
　フラボンは、有機化合物の一種で、フラバン誘導体の環状ケトンであり、植物内では、主に配糖体として存在する。フラボンは、狭義には化学式Ｃ15Ｈ10Ｏ2、分子量２２２．２４の化合物、２，３－ジデヒドロフラバン－４－オンを指すが、広義のフラボン（フラボン類）は、フラボノイドのカテゴリーの１つであり、フラボノイドの中でフラボン構造を基本骨格とし、さらに３位に水酸基を持たないものが「フラボン」に分類される。本願明細書中、「フラボン Ｃ－配糖体」は、広義のフラボン、すなわち、フラボン類に属する誘導体の配糖体のうち、アルドースのアノメリック炭素に直接アグリコンが結合した配糖体を意味する。フラボン Ｃ－配糖体としては、ルテオリン Ｃ－配糖体、トリセチン Ｃ－配糖体、アピゲニン Ｃ－配糖体、アカセチン Ｃ－配糖体が挙げられるがこれらに限定されない。フラボン Ｃ－配糖体はまた、アピゲニン、ルテオリン、トリセチン、アカセチン誘導体の配糖体も含む。植物においては、フラボン Ｃ－配糖体の生合成経路の１つとして図１に示される経路が知られている。当該経路では、Ｆ２Ｈ、ＣＧＴ、及びＦＤＨの作用を介して、フラボン Ｃ－配糖体が産生される。
　このような合成経路においては、フラボン モノ－Ｃ－配糖体の他に、ビセニン－２（アピゲニン６，８－ジ－Ｃ－グルコシド）などのフラボン ジ－Ｃ－配糖体も合成されるが、発明者らは、このたび、赤みの原因がフラボン ジ－Ｃ－配糖体にあり、デルフィニジン型アントシアニンとのコピグメント効果はフラボン モノ－Ｃ－配糖体の方が、フラボン ジ－Ｃ－配糖体よりも高いという驚くべき知見を見出した。均一的かつ安定的に、青系花色を有する形質転換植物を作出するためには、フラボン ジ－Ｃ－配糖体の蓄積を極力減らし、フラボン モノ－Ｃ－配糖体のみを花弁中に有意に蓄積させる必要がある。フラボン モノ－Ｃ－配糖体は、典型的には、フラボン ６－Ｃ－グルコシド、又はフラボン ８－Ｃ－グルコシドであり、好適には、フラボン ６－Ｃ－グルコシドである。このようなフラボン モノ－Ｃ－配糖体としては、例えば、アピゲニン ６－Ｃ－グルコシド（イソビテキシン）、ルテオリン ６－Ｃ－グルコシド（イソオリエンチン）、トリセチン ６－Ｃ－グルコシド、アピゲニン ８－Ｃ－グルコシド（ビテキシン）、ルテオリン ８－Ｃ－グルコシド（オリエンチン）、トリセチン ８－Ｃ－グルコシド又はそれらの誘導体が挙げられる。
　植物の細胞内において、フラボン Ｃ－配糖体の蓄積は、上記合成経路における必須遺伝子（すなわち、Ｆ２Ｈ遺伝子、ＣＧＴ遺伝子、及びＦＤＨ遺伝子）又はそれらのホモログを含むベクターで宿主植物を形質転換することによって達成できる。そして、ＣＧＴ遺伝子として、ソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログ、特に、翻訳増強配列としてシロイヌナズナＡＤＨ遺伝子由来非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）（配列番号１５）又はシロイヌナズナＨＳＰＲＯ遺伝子由来非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）（配列番号１３）を付与したソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログを用いることにより、フラボン ジ－Ｃ－配糖体と比較して、フラボン モノ－Ｃ－配糖体を花弁中に有意に蓄積させることが可能となる。
　前記ソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログは、以下のポリヌクレオチド：
　（１－ａ）配列番号１１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（１－ｂ）配列番号１１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（１－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド；
　（１－ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（１－ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（１－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（１－ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（１－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
　前記Ｆ２Ｈ遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはカンゾウ由来のＦ２Ｈ遺伝子又はそのホモログであり、以下のポリヌクレオチド：
　（２－ａ）配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（２－ｂ）配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（２－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド；
　（２－ｃ）配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（２－ｄ）配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（２－ｅ）配列番号６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（２－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
　前記ＦＤＨ遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはミヤコグサ由来のＦＤＨ遺伝子又はそのホモログであり、以下のポリヌクレオチド：
　（３－ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（３－ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（３－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド；
　（３－ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（３－ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（３－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（３－ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（３－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
　植物の細胞内におけるデルフィニジン型アントシアニンの蓄積は、フラボノイドＦ３’５’水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素（ＭＴ）遺伝子又はそのホモログを宿主植物に組み込むことによって達成できる（特許文献３）。したがって、上述のフラボン モノ－Ｃ－配糖体の合成経路における必須遺伝子又はそれらのホモログに加えて、Ｆ３’５’Ｈ遺伝子又はそのホモログ、及びＭＴ遺伝子又はそのホモログをさらに含むベクターで宿主植物を形質転換することによって、デルフィニジン型アントシアニンとフラボン モノ－Ｃ－配糖体を宿主植物の細胞内で共存させることができる。
　Ｆ３’５’Ｈ遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはカンパニュラ由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子又はそのホモログであり、
　（４－ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（４－ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（４－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド；
　（４－ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（４－ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（４－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（４－ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（４－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
　ＭＴ遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはトレニア由来のＭＴ遺伝子又はそのホモログであり、
　（５－ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（５－ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（５－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド；
　（５－ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（５－ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（５－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（５－ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（５－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
　前記ＭＴ遺伝子又はそのホモログには、翻訳増強配列としてシロイヌナズナＡＤＨ遺伝子由来非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）（配列番号１５）又はシロイヌナズナＨＳＰＲＯ遺伝子由来非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）（配列番号１３）を付加することができる。
　本明細書中、用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
　本明細書中、用語「ストリンジェント条件」とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと、ゲノムＤＮＡとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）は増加する。さらに、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。したがって、用語「ストリンジェント条件」とは、各塩基配列間の「同一性」の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上であるような、高い同一性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリダイズするような条件を意味する。「ストリンジェント条件」としては、例えば、温度６０℃～６８℃において、ナトリウム濃度１５０～９００ｍＭ、好ましくは６００～９００ｍＭ、ｐＨ６～８であるような条件を挙げることができ、具体例としては、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ　ＮａＣｌ、７５ｍＭ　クエン酸三ナトリウム）、１％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液５０％ホルムアルデヒド、及び４２℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ　ＮａＣｌ、１．５ｍＭ　クエン酸三ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、及び５５℃の条件で洗浄を行うものを挙げることができる。
　ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。このようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば、植物由来のもの、植物由来以外のものであってもよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであっても化学合成したＤＮＡでもよい。
　本明細書中、「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１～２０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
　また、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法、例えば、ホスホアミダイド法等により化学的に合成する方法、植物の核酸試料を鋳型とし、目的とする遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いる核酸増幅法などによって得ることができる。
　本明細書中、用語「同一性」とは、ポリペプチド配列（又はアミノ酸配列）あるいはポリヌクレオチド配列（又は塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものであり、「同一性」は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の同一性を測定する方法は数多く知られており、用語「同一性」は、当業者には周知である（例えば、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．（Ｅｄ．），Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９８８）；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．（Ｅｄ．），Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９９３）；Ｇｒｉｆｉｎ，Ａ．Ｍ．＆Ｇｒｉｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．（Ｅｄ．），Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ：Ｐａｒｔ　Ｉ，Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ，（１９９４）；ｖｏｎ　Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９８７）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．＆　Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．（Ｅｄ．），Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ，Ｍ－Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９９１）等参照）。
　また、本明細書に記載される「同一性」の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の同一性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒアプリケーション（バージョン９．５　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて算出される数値である。本発明において、各ポリヌクレオチド配列間又はアミノ酸配列間の「同一性」の程度は、例えば、約９０％以上、好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９７％以上、最も好ましくは約９８％以上である。
　本発明のポリヌクレオチド（核酸、遺伝子）は、着目のタンパク質を「コードする」ものである。ここで、「コードする」とは、着目のタンパク質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、着目のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者の意味を含んでいる。
　生来の塩基配列を有する遺伝子は、例えば、ＤＮＡシークエンサーによる解析によって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡは生来の塩基配列を有するＤＮＡを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば、修飾したいＤＮＡ断片を生来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得て、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特定変異誘発やＰＣＲ法を実施し、所望の修飾したＤＮＡ断片を得る。その後、この変異を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
　あるいは短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば、目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば、全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
　また、得られたポリヌクレオチドを大腸菌及び酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定することにより、得られたポリヌクレオチドが所望の活性を有するタンパク質をコードすることを確認することができる。
　本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む（組換え）ベクター、特に発現ベクター、さらに該ベクターによって形質転換された植物にも関する。
　また、本発明のベクターは、それらを導入する宿主植物の種類に依存して発現制御領域、例えば、プロモーター、ターミネーター、複製起点などを含有する。植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター、３５Ｓプロモーターのエンハンサー領域を２つ連結したＥｌ2３５Ｓプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、ｍａｃ－１プロモーター等が挙げられる。また、組織特異的な遺伝子発現のためには、その組織で特異的に発現する遺伝子のプロモーターを用いることができる。
　ベクターの作製は、制限酵素、リガーゼなどを用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主植物の形質転換も常法に従って行うことができる。
　現在の技術水準の下では、植物にポリヌクレオチドを導入し、そのポリヌクレオチドを構成的又は組織特異的に発現させる技術を利用することができる。植物へのＤＮＡの導入は、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。
　本発明中、宿主に用いることができる植物は、特に制限されないが、バラ科バラ属、キク科キク属、ナデシコ科ナデシコ属（カーネーションなど）、ユリ科ユリ属の植物を用いることができ、特に好ましくはバラ科バラ属の栽培バラ（学名：Ｒｏｓａ　ｈｙｂｒｉｄａ）である。なお本明細書で使用する用語「バラ植物」とは、分類学上の位置づけではバラ科バラ属の栽培バラ（学名：Ｒｏｓａ　ｈｙｂｒｉｄａ）のことをいう。バラは、樹形と花の大きさにより主にハイブリッド・ティー系、フロリバンダ系、ポリアンサ系などに分けられるが、いずれの系統でも花弁に含まれる主要な色素（アントシアニン）はシアニジン型とペラルゴニジン型の２種類のみである。本発明において宿主に用いられるバラ植物の種類については特に制限されず、これらの品種や系統に好適に用いることができる。例えば、宿主として用いることができるバラ品種としては、オーシャンソング、ノブレス、リタ・パフューメラ、クールウォーター、フェイム、トップレス、ピーチアヴァランチェなどが挙げられる。
　本発明により、均一的かつ安定的に、青系花色を有する形質転換植物、好ましくは、バラ科バラ属、キク科キク属、又はナデシコ科ナデシコ属（カーネーションなど）、特に好ましくはバラ植物を作出することができる。得られた形質転換植物は、ＲＨＳカラーチャートでＢｌｕｅグループもしくはＶｉｏｌｅｔ－Ｂｌｕｅグループ、かつ／又はＣＩＥＬ*ａ*ｂ*表色系の色相角度で３３９．７°～２７０．０°、好適には３１５°以下の花色を示す。
　さらに、本発明は、上記で得られた形質転換植物又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、それらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞、あるいは切り花から作成された加工品（特に切花加工品）にも関する。ここで、切花加工品としては、当該切花を用いた押し花、プリザードフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。
　以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。
［実施例１：アントシアニン（マルビン）に対するフラボン Ｃ－配糖体のコピグメント効果のシミュレーション］
　アントシアニン（マルビン）に対するフラボン Ｃ－配糖体のコピグメント効果のシミユレーションを行うため、マルビン及びフラボン Ｃ－配糖体を調整した。本実験に用いたマルビン（マルビジン３，５－ジグルコシド）及びフラボン Ｃ－配糖体（ビテキシン（アピゲニン ８－Ｃ－グルコシド）、イソビテキシン（アピゲニン ６－Ｃ－グルコシド）、オリエンチン（ルテオリン ８－Ｃ－グルコシド）、イソオリエンチン（ルテオリン ６－Ｃ－グルコシド）、ビセニン－２（アピゲニン６，８－ジ－Ｃ－グルコシド））はナカライテスク株式会社より購入した。
　このようにして入手したマルビンに対して各フラボン Ｃ－配糖体（ビテキシン、イソビテキシン、オリエンチン、イソオリエンチン、ビセニン－２）を、ｐＨ５．０の緩衝液中、５当量のモル濃度比で添加し、吸収スペクトルを測定した。マルビンの濃度は０．５ｍＭとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　フラボン Ｃ－配糖体の添加により、マルビン水溶液の吸光度は増大し、いずれのフラボン Ｃ－配糖体を添加した場合でもマルビン単独の場合に比べて吸収極大（λｍａｘ）は長波長側へシフトした。またその効果は、イソビテキシン＞イソオリエンチン＞オリエンチン＞ビテキシン＞ビセニン－２の順で吸収極大が長波長側へシフトすることが確認できた。さらに色相角度についても同様に、イソビテキシン＞イソオリエンチン＞オリエンチン＞ビテキシン＞ビセニン－２の順で小さくなることが確認できた。以上のことから、コピグメント効果はフラボン モノ－Ｃ－配糖体の方が、フラボン ジ－Ｃ－配糖体よりも高いことが判明した。さらに、フラボン モノ－Ｃ－配糖体のうち特に、フラボン ６－Ｃ－配糖体のコピグメント効果が高いことが判明した。
［実施例２：バラ品種「オーシャンソング」へのカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子とトレニア由来ＭＴ遺伝子、カンゾウ由来Ｆ２Ｈ遺伝子、イネ由来コドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサ由来ＦＤＨ遺伝子の導入］
　ｐＳＰＢ６４８６は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、以下の５つの発現カセットが含まれている。
（１）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１）とＤ８ターミネーター
（２）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとトレニア由来ＭＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号３）とＮＯＳターミネーター
（３）３５Ｓプロモーターとカンゾウ由来Ｆ２Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号５）とシソ由来ＡＴターミネーター
（４）３５Ｓプロモーターとイネ由来コドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号７）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（５）３５Ｓプロモーターとミヤコグサ由来ＦＤＨ完全長ｃＤＮＡ（配列番号９）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
　本プラスミドは植物においてはカンパニュラのＦ３’５’Ｈ遺伝子とトレニアのＭＴ遺伝子、カンゾウのＦ２Ｈ遺伝子、イネのコドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサのＦＤＨ遺伝子を構成的に発現する。
　このようにして作製したｐＳＰＢ６４８６を青色系バラ品種「オーシャンソング」へ導入し、計２７個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、２６個体でマルビジンの蓄積を確認でき、マルビジン含有率は最高７４．５％（平均５７．０％）であった。さらに、フラボン Ｃ－配糖体としてイソビテキシン（アピゲニン ６－Ｃ－グルコシド）、ビテキシン（アピゲニン ８－Ｃ－グルコシド）、イソオリエンチン（ルテオリン ６－Ｃ－グルコシド）、オリエンチン（ルテオリン ８－Ｃ－グルコシド）、ビセニン－２（アピゲニン ６，８－Ｃ－ジグルコシド）の同定・定量を行った。マルビジンが検出できたすべての個体でフラボン Ｃ－配糖体が検出でき、主成分としてはフラボン ジ－Ｃ－配糖体であるビセニン－２が検出された。生成量はビセニン－２＞イソビテキシン＞ビテキシン＞イソオリエンチン＞オリエンチンの順で多く、総量は最高で花弁新鮮重量１ｇあたり１．５６３ｍｇであった。また、フラボン Ｃ－配糖体の総量はマルビジンに対して約１０倍以上の生成量であった。
　代表的な形質転換体の分析値を下表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 宿主：オーシャンソング
Ｄｅｌ：デルフィニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｔ：ペチュニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン、Ｍａｌ：マルビジン
Ｍ：ミリセチン、Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｔｒｉ：トリセチン、Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、Ｖｉｃ２：ビセニン－２、ＶＸ：ビテキシン、ＩＶＸ：イソビテキシン、Ｏｒｉ：オリエンチン、Ｉｏｒｉ：イソオリエンチン
Ｍａｌ（％）：総アントシアニジン中のマルビジンの割合
［実施例３：バラ品種「オーシャンソング」へのカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子とトレニア由来ＭＴ遺伝子、カンゾウ由来Ｆ２Ｈ遺伝子、ソバ由来コドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサ由来ＦＤＨ遺伝子の導入］
　ｐＳＰＢ７４７３は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、以下の５つの発現カセットが含まれている。
（１）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１）とＤ８ターミネーター
（２）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとトレニア由来ＭＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号３）（５’位側にシロイヌナズナＨＳＰＲＯ遺伝子由来５’－ＵＴＲ（配列番号１３）を付加）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（３）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとカンゾウ由来Ｆ２Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号５）とシソ由来ＡＴターミネーター
（４）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとソバ由来コドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１１）（５’位側にシロイヌナズナＨＳＰＲＯ遺伝子由来５’－ＵＴＲ（配列番号１３）を付加）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（５）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとミヤコグサ由来ＦＤＨ完全長ｃＤＮＡ（配列番号９）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
　本プラスミドは植物においてはカンパニュラのＦ３’５’Ｈ遺伝子とトレニアのＭＴ遺伝子、カンゾウのＦ２Ｈ遺伝子、ソバのコドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサのＦＤＨ遺伝子を構成的に発現する。
　このようにして作製したｐＳＰＢ７４７３を青色系バラ品種「オーシャンソング」へ導入し、計３５個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、２１個体でマルビジンの蓄積を確認でき、マルビジン含有率は最高２０．８％（平均９．１％）であった。さらに、フラボン Ｃ－配糖体としてイソビテキシン（アピゲニン ６－Ｃ－グルコシド）、ビテキシン（アピゲニン ８－Ｃ－グルコシド）、イソオリエンチン（ルテオリン ６－Ｃ－グルコシド）、オリエンチン（ルテオリン ８－Ｃ－グルコシド）、ビセニン－２（アピゲニン ６，８－Ｃ－ジグルコシド）の同定・定量を行った。マルビジンが検出できたすべての個体でフラボン Ｃ－配糖体が検出でき、主成分としてフラボン ６－Ｃ－配糖体であるイソビテキシンが検出された。生成量はイソビテキシン＞ビテキシン＞ビセニン－２＞イソオリエンチン＞オリエンチンの順で多く、総量は最高で花弁新鮮重量１ｇあたり７．４１８ｍｇと、非常に高い含有量であった。実施例２で示したＯＳ／６４８６系統に比べて、ほとんどの個体でフラボン Ｃ－配糖体の総量が花弁新鮮重量１ｇあたり３ｍｇ以上と高い含有量を示し、デルフィニジンに対して約１００倍以上の生成量であった。
　代表的な形質転換体の分析値を下表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 宿主：オーシャンソング
Ｄｅｌ：デルフィニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｔ：ペチュニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン、Ｍａｌ：マルビジン
Ｍ：ミリセチン、Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｔｒｉ：トリセチン、Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、Ｖｉｃ２：ビセニン－２、ＶＸ：ビテキシン、ＩＶＸ：イソビテキシン、Ｏｒｉ：オリエンチン、Ｉｏｒｉ：イソオリエンチン
Ｍａｌ（％）：総アントシアニジン中のマルビジンの割合
［実施例４：バラ品種「オーシャンソング」へのカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子とトレニア由来ＭＴ遺伝子、カンゾウ由来Ｆ２Ｈ遺伝子、ソバ由来ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサ由来ＦＤＨ遺伝子の導入］
　ｐＳＰＢ７４７２は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、以下の５つの発現カセットが含まれている。
（１）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１）とＤ８ターミネーター
（２）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとトレニア由来ＭＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号３）（５’位側にシロイヌナズナＨＳＰＲＯ遺伝子由来５’－ＵＴＲ（配列番号１３）を付加）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（３）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとカンゾウ由来Ｆ２Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号５）とシソ由来ＡＴターミネーター
（４）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとソバ由来ＣＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１４）（５’位側にシロイヌナズナＨＳＰＲＯ遺伝子由来５’－ＵＴＲ（配列番号１３）を付加）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（５）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとミヤコグサ由来ＦＤＨ完全長ｃＤＮＡ（配列番号９）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
　本プラスミドは植物においてはカンパニュラのＦ３’５’Ｈ遺伝子とトレニアのＭＴ遺伝子、カンゾウのＦ２Ｈ遺伝子、ソバのＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサのＦＤＨ遺伝子を構成的に発現する。
　このようにして作製したｐＳＰＢ７４７２を青色系バラ品種「オーシャンソング」へ導入し、計３３個体の形質転換体を得た。次に、フラボン Ｃ－配糖体としてイソビテキシン（アピゲニン ６－Ｃ－グルコシド）、ビテキシン（アピゲニン ８－Ｃ－グルコシド）、イソオリエンチン（ルテオリン ６－Ｃ－グルコシド）、オリエンチン（ルテオリン ８－Ｃ－グルコシド）、ビセニン－２（アピゲニン ６，８－Ｃ－ジグルコシド）を、アントシアニジンとしてデルフィニジン、シアニジン、ペチュニジン、ペラルゴニジン、マルビジンの同定・定量を行った。その結果、１１個体でフラボン Ｃ－配糖体及びマルビジンの蓄積を確認できた。フラボン Ｃ－配糖体の平均含有量は花弁新鮮重量１ｇあたり３．７５ｍｇであり、主成分としてフラボン ６－Ｃ－配糖体であるイソビテキシンが検出された。また、マルビジンの含有率は最高１５．６％（平均８．８％）であった。
　以上のように、花弁新鮮重量１ｇあたりのフラボン Ｃ－配糖体の平均含有量は実施例３で示したＯＳ／７４７３系統の方が４．１９ｍｇと高かった。つまり、オリジナルのソバ由来ＣＧＴ遺伝子よりもコドンを改変したＣＧＴ遺伝子の方がより効率的にフラボン Ｃ－配糖体を生成できることが示された。
　代表的な形質転換体の分析値を下表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 宿主：オーシャンソング
Ｄｅｌ：デルフィニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｔ：ペチュニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン、Ｍａｌ：マルビジン
Ｍ：ミリセチン、Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｔｒｉ：トリセチン、Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、Ｖｉｃ２：ビセニン－２、ＶＸ：ビテキシン、ＩＶＸ：イソビテキシン、Ｏｒｉ：オリエンチン、Ｉｏｒｉ：イソオリエンチン
Ｍａｌ（％）：総アントシアニジン中のマルビジンの割合
［実施例５：バラ品種「オーシャンソング」へのカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子とトレニア由来ＭＴ遺伝子、カンゾウ由来Ｆ２Ｈ遺伝子、ソバ由来ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサ由来ＦＤＨ遺伝子の導入］
　ｐＳＰＢ７８０８は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、以下の５つの発現カセットが含まれている。
（１）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１）とＤ８ターミネーター
（２）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとトレニア由来ＭＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号３）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（３）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとカンゾウ由来Ｆ２Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号５）とシソ由来ＡＴターミネーター
（４）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとソバ由来ＣＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１４）（５’位側にシロイヌナズナ アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）遺伝子由来５’－ＵＴＲ（配列番号１５）を付加）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（５）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとミヤコグサ由来ＦＤＨ完全長ｃＤＮＡ（配列番号９）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
　本プラスミドは植物においてはカンパニュラのＦ３’５’Ｈ遺伝子とトレニアのＭＴ遺伝子、カンゾウのＦ２Ｈ遺伝子、ソバのＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサのＦＤＨ遺伝子を構成的に発現する。
　このようにして作製したｐＳＰＢ７８０８を青色系バラ品種「オーシャンソング」へ導入し、計６５個体の形質転換体を得た。次に、フラボン Ｃ－配糖体としてイソビテキシン（アピゲニン ６－Ｃ－グルコシド）、ビテキシン（アピゲニン ８－Ｃ－グルコシド）、イソオリエンチン（ルテオリン ６－Ｃ－グルコシド）、オリエンチン（ルテオリン ８－Ｃ－グルコシド）、ビセニン－２（アピゲニン ６，８－Ｃ－ジグルコシド）を、アントシアニジンとしてデルフィニジン、シアニジン、ペチュニジン、ペラルゴニジン、マルビジンの同定・定量を行った。その結果、３２個体でフラボン Ｃ－配糖体及びマルビジンの蓄積を確認できた。フラボン Ｃ－配糖体の平均含有量は花弁新鮮重量１ｇあたり３．００ｍｇであり、主成分としてフラボン ６－Ｃ－配糖体であるイソビテキシンが検出された。また、マルビジンの含有率は最高６９．２％（平均４３．９％）であった。
　代表的な形質転換体の分析値を下表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 宿主：オーシャンソング
Ｄｅｌ：デルフィニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｔ：ペチュニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン、Ｍａｌ：マルビジン
Ｍ：ミリセチン、Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｔｒｉ：トリセチン、Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、Ｖｉｃ２：ビセニン－２、ＶＸ：ビテキシン、ＩＶＸ：イソビテキシン、Ｏｒｉ：オリエンチン、Ｉｏｒｉ：イソオリエンチン
Ｍａｌ（％）：総アントシアニジン中のマルビジンの割合
［実施例６：バラ品種「オーシャンソング」へのカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子とトレニア由来ＭＴ遺伝子、カンゾウ由来Ｆ２Ｈ遺伝子、ソバ由来コドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサ由来ＦＤＨ遺伝子の導入］
ｐＳＰＢ７８０９は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、以下の５つの発現カセットが含まれている。
（１）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１）とＤ８ターミネーター
（２）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとトレニア由来ＭＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号３）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（３）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとカンゾウ由来Ｆ２Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号５）とシソ由来ＡＴターミネーター
（４）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとソバ由来コドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１１）（５’位側にシロイヌナズナ アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）遺伝子由来５’－ＵＴＲ（配列番号１５）を付加）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（５）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとミヤコグサ由来ＦＤＨ完全長ｃＤＮＡ（配列番号９）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
　本プラスミドは植物においてはカンパニュラのＦ３’５’Ｈ遺伝子とトレニアのＭＴ遺伝子、カンゾウのＦ２Ｈ遺伝子、ソバのコドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサのＦＤＨ遺伝子を構成的に発現する。
　このようにして作製したｐＳＰＢ７８０９を青色系バラ品種「オーシャンソング」へ導入し、計１４３個体の形質転換体を得た。次に、フラボン Ｃ－配糖体としてイソビテキシン（アピゲニン ６－Ｃ－グルコシド）、ビテキシン（アピゲニン ８－Ｃ－グルコシド）、イソオリエンチン（ルテオリン ６－Ｃ－グルコシド）、オリエンチン（ルテオリン ８－Ｃ－グルコシド）、ビセニン－２（アピゲニン ６，８－Ｃ－ジグルコシド）を、アントシアニジンとしてデルフィニジン、シアニジン、ペチュニジン、ペラルゴニジン、マルビジンの同定・定量を行った。その結果、５８個体でフラボン Ｃ－配糖体の蓄積を確認できた。フラボン Ｃ－配糖体の平均含有量は花弁新鮮重量１ｇあたり３．２４ｍｇであり、主成分としてフラボン ６－Ｃ－配糖体であるイソビテキシンが検出された。また、マルビジンの含有率は最高８０．３％（平均４６．６％）であった。
　以上のように、花弁新鮮重量１ｇあたりのフラボン Ｃ－配糖体の平均含有量は本実施例で示したＯＳ／７８０９系統の方が高かった。よって、実施例３及び４で得られた結果と同様に、オリジナルのソバ由来ＣＧＴ遺伝子よりもコドンを改変したＣＧＴ遺伝子の方がより効率的にフラボン Ｃ－配糖体を生成できることが示された。
　代表的な形質転換体の分析値を下表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 宿主：オーシャンソング
Ｄｅｌ：デルフィニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｔ：ペチュニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン、Ｍａｌ：マルビジン
Ｍ：ミリセチン、Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｔｒｉ：トリセチン、Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、Ｖｉｃ２：ビセニン－２、ＶＸ：ビテキシン、ＩＶＸ：イソビテキシン、Ｏｒｉ：オリエンチン、Ｉｏｒｉ：イソオリエンチン
Ｍａｌ（％）：総アントシアニジン中のマルビジンの割合
［実施例７：フラボン Ｃ－配糖体を含むバラの花色の評価］
　実施例２及び３において作出された形質転換体（バラ品種「オーシャンソング」を宿主とする）について、それぞれの花弁の色彩について分光測色計ＣＭ－２０２２（ミノルタ株式会社）を用いて１０度視野、Ｄ６５光源で測定し、色彩管理ソフトＳｐｅｃｔｒａＭａｇｉｃＴＭ（ミノルタ株式会社）により解析を行った。
　色相角度の平均値の比較ではＣＧＴ遺伝子がソバ由来（実施例３）のバラとイネ由来（実施例２）のバラの間で花弁の色相角度に違いは認められなかった。しかしながら、個体別にみるとソバ由来ＣＧＴ遺伝子を導入したバラでは色相角度が３１５°以下を示した個体が多く、中でも２９４．５°を示す、これまでで最も青く変化した個体を取得した。以上の結果から、ソバ由来のＣＧＴ遺伝子を利用することにより、フラボン Ｃ－配糖体の生成量、特にモノ－Ｃ－配糖体の生成量が有意に増加し、これがアントシアニンとの共存により花弁の色彩が青く変化することが確認された。
　結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008

Claims (19)

  1. 　ソバ由来Ｃ－配糖化酵素（ＣＧＴ）遺伝子又はそのホモログであって、
    　前記ソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログが、
    　（１－ａ）配列番号１１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　（１－ｂ）配列番号１１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（１－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド、
    からなる群から選択される、ソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログ。
  2. 　シロイヌナズナＡＤＨ遺伝子由来非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）（配列番号１５）又はシロイヌナズナＨＳＰＲＯ遺伝子由来非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）（配列番号１３）が付加されている、請求項１に記載のソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログ。
  3. 　ソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログを含むベクターであって、
    　前記ソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログが、
    　（１－ａ）配列番号１１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　（１－ｂ）配列番号１１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（１－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド；
    　（１－ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（１－ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（１－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（１－ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（１－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    からなる群から選択される、ベクター。
  4. 　前記ソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログにシロイヌナズナＡＤＨ遺伝子由来非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）（配列番号１５）又はシロイヌナズナＨＳＰＲＯ遺伝子由来非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）（配列番号１３）が付加されている、請求項３に記載のベクター。
  5. 　フラバノン ２-水酸化酵素（Ｆ２Ｈ）遺伝子又はそのホモログ、及び脱水酵素（ＦＤＨ）遺伝子又はそのホモログをさらに含む、請求項３又は４に記載のベクター。
  6. 　前記Ｆ２Ｈ遺伝子又はそのホモログが、
    　（２－ａ）配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　（２－ｂ）配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（２－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド；
    　（２－ｃ）配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（２－ｄ）配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（２－ｅ）配列番号６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（２－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
    　前記ＦＤＨ遺伝子又はそのホモログが、
    　（３－ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　（３－ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（３－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド；
    　（３－ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（３－ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（３－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（３－ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（３－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、請求項５に記載のベクター。
  7. 　フラボノイドＦ３’５’水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素（ＭＴ）遺伝子又はそのホモログをさらに含む、請求項３～６のいずれか１項に記載のベクター。
  8. 　前記Ｆ３’５’Ｈ遺伝子又はそのホモログが、
    　（４－ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　（４－ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（４－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド；
    　（４－ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（４－ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（４－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（４－ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（４－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
    　前記ＭＴ遺伝子又はそのホモログが、
    　（５－ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　（５－ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（５－ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するポリヌクレオチド；
    　（５－ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（５－ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（５－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（５－ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（５－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、請求項７に記載のベクター。
  9. 　請求項１又は２に記載のソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログ、あるいは請求項３～８のいずれか１項に記載のベクターを含む形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
  10. 　前記植物がバラ、キク、カーネーション又はユリから選択される、請求項９に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
  11. 　前記植物がバラである、請求項１０に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
  12. 　請求項９～１１のいずれか１項に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代の栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
  13. 　請求項９～１１のいずれか１項に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、又は該切り花から作成された加工品。
  14. 　青系花色を有する形質転換植物を作出するための方法であって、ソバ由来Ｃ－配糖化酵素（ＣＧＴ）遺伝子又はそのホモログを宿主植物に導入することにより、デルフィニジン型アントシアニンとフラボン モノ－Ｃ－配糖体を植物の細胞内で共存させる工程を含む、方法。
  15. 　前記フラボン モノ－Ｃ－配糖体が、アピゲニン ６－Ｃ－グルコシド、ルテオリン ６－Ｃ－グルコシド、トリセチン ６－Ｃ－グルコシド、アピゲニン ８－Ｃ－グルコシド、ルテオリン ８－Ｃ－グルコシド、トリセチン ８－Ｃ－グルコシド又はそれらの誘導体である、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記デルフィニジン型アントシアニンが、マルビジン、デルフィニジン、ペチュニジン及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項１４又は１５に記載の方法。
  17. 　請求項１又は２に記載のソバ由来ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログ、あるいは請求項３～８のいずれか１項に記載のベクターを宿主植物の細胞内に導入する工程を含む、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 　前記植物がバラ、キク、カーネーション又はユリから選択される、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 　前記植物がバラである、請求項１８に記載の方法。
PCT/JP2020/036451 2019-10-01 2020-09-25 ソバ由来ｃ－配糖化酵素遺伝子及びその使用 WO2021065749A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA3149161A CA3149161A1 (en) 2019-10-01 2020-09-25 Buckwheat-derived c-glycosyltransferase gene and utilization thereof
CN202080068986.XA CN114450404A (zh) 2019-10-01 2020-09-25 来自荞麦的c-糖苷化酶基因及其应用
EP20872757.8A EP4039804A4 (en) 2019-10-01 2020-09-25 BUCKWHEAT C-GLYCOSYL TRANSFERASE GENE AND USE THEREOF
JP2021551206A JPWO2021065749A1 (ja) 2019-10-01 2020-09-25
US17/765,692 US20230220357A1 (en) 2019-10-01 2020-09-25 Buckwheat-derived c-glycosyltransferase gene and utilization thereof
CONC2022/0002050A CO2022002050A2 (es) 2019-10-01 2022-02-25 Gen c-glucosiltransferasa derivado del trigo sarraceno y su uso.

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019181693 2019-10-01
JP2019-181693 2019-10-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021065749A1 true WO2021065749A1 (ja) 2021-04-08

Family

ID=75336530

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/036451 WO2021065749A1 (ja) 2019-10-01 2020-09-25 ソバ由来ｃ－配糖化酵素遺伝子及びその使用

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230220357A1 (ja)
EP (1) EP4039804A4 (ja)
JP (1) JPWO2021065749A1 (ja)
CN (1) CN114450404A (ja)
CA (1) CA3149161A1 (ja)
CO (1) CO2022002050A2 (ja)
WO (1) WO2021065749A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112813084B (zh) * 2021-02-26 2022-07-19 云南农业大学 一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因及应用
CN112961870B (zh) * 2021-02-26 2022-08-16 云南农业大学 一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT2基因及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000279182A (ja) 1999-01-29 2000-10-10 Suntory Ltd フラボン合成酵素をコードする遺伝子
WO2008156206A1 (ja) 2007-06-20 2008-12-24 International Flower Developments Proprietary Limited フラボン及びマルビジンを含むバラ及びその生産方法
JP2014140376A (ja) * 2007-03-15 2014-08-07 Ishihara Sangyo Kaisha Ltd ツユクサのフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子
WO2017169699A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 青系花色を有する植物及びその作出方法
WO2019069946A1 (ja) 2017-10-03 2019-04-11 サントリーホールディングス株式会社 青系花色を有する形質転換植物及びその作出方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000279182A (ja) 1999-01-29 2000-10-10 Suntory Ltd フラボン合成酵素をコードする遺伝子
JP2014140376A (ja) * 2007-03-15 2014-08-07 Ishihara Sangyo Kaisha Ltd ツユクサのフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子
WO2008156206A1 (ja) 2007-06-20 2008-12-24 International Flower Developments Proprietary Limited フラボン及びマルビジンを含むバラ及びその生産方法
WO2017169699A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 青系花色を有する植物及びその作出方法
WO2019069946A1 (ja) 2017-10-03 2019-04-11 サントリーホールディングス株式会社 青系花色を有する形質転換植物及びその作出方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Biocomputing: Informatics and Genome Projects", 1993, ACADEMIC PRESS
"Computational Molecular Biology", 1988, OXFORD UNIVERSITY PRESS
"Computer Analysis of Sequence Data: Part I", 1994, HUMAN PRESS
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
"Sequence Analysis Primer", 1991, M-STOCKTON PRESS
NAGATOMO, Y. ET AL.: "Purification, molecular cloning and functional characterization of flavonoid C-glucosyltransferases from Fagopyrum esculentum M. (buckwheat) cotyledon", THE PLANT JOURNAL, vol. 80, 2014, pages 437 - 448, XP055813956 *
PHYTOCHEMISTRY REVIEWS, vol. 5, pages 283 - 291
PROG. CHEM. ORG. NATL. PROD., vol. 52
See also references of EP4039804A4
VON HEINJE, G.: "Sequence Analysis in Molecular Biology", 1987, ACADEMIC PRESS

Also Published As

Publication number Publication date
CA3149161A1 (en) 2021-04-08
JPWO2021065749A1 (ja) 2021-04-08
EP4039804A4 (en) 2024-01-24
CO2022002050A2 (es) 2022-04-08
US20230220357A1 (en) 2023-07-13
CN114450404A (zh) 2022-05-06
EP4039804A1 (en) 2022-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7246314B2 (ja) 青系花色を有する形質転換植物及びその作出方法
KR101317130B1 (ko) 안토시아닌의 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소를 코드하는 유전자를 사용하는 안토시아닌 색소의 안정화 및 청색화 방법
JP6782450B2 (ja) 青系花色を有するキクの作出方法
KR102028625B1 (ko) 신규 당 전이 효소 유전자 및 그의 사용
WO2021065749A1 (ja) ソバ由来ｃ－配糖化酵素遺伝子及びその使用
EP2163619A1 (en) Rose containing flavone and malvidin, and method for production thereof
US9365836B2 (en) Glycosyltransferase gene and use thereof
CA2947540C (en) Nemophila menziesii glycosyltransferease gene and use thereof
EP2159283A1 (en) Rose containing flavone, and method for production thereof
WO2020203940A1 (ja) フラボン７－ｏ－メチル基転移酵素遺伝子及びその使用
EP4249597A1 (en) Flavone 4'-o-methyltransferase gene and use for same
Saritha Isolation and characterisation of cDNA encoding dihydroflavonol 4-reductase gene from Orchid Dendrobium variety Sonia17
Snyman Identification and expression analysis of flavonoid biosynthetic genes in the genus Clivia

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20872757

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021551206

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3149161

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022108039

Country of ref document: RU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020872757

Country of ref document: EP

Effective date: 20220502