WO2021060380A1 - 肝細胞の可塑性誘導法 - Google Patents

肝細胞の可塑性誘導法 Download PDF

Info

Publication number
WO2021060380A1
WO2021060380A1 PCT/JP2020/036043 JP2020036043W WO2021060380A1 WO 2021060380 A1 WO2021060380 A1 WO 2021060380A1 JP 2020036043 W JP2020036043 W JP 2020036043W WO 2021060380 A1 WO2021060380 A1 WO 2021060380A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hepatocytes
cells
cell
hepatic progenitor
progenitor cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/036043
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
英樹 谷口
運中 聶
允文 鄭
Original Assignee
公立大学法人横浜市立大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公立大学法人横浜市立大学 filed Critical 公立大学法人横浜市立大学
Priority to JP2021548992A priority Critical patent/JPWO2021060380A1/ja
Priority to US17/762,908 priority patent/US20230039816A1/en
Publication of WO2021060380A1 publication Critical patent/WO2021060380A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/407—Liver; Hepatocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0672—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells; Oval cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/065—Modulators of histone acetylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing plasticity of hepatocytes.
  • Non-Patent Document 1 Approximately 70% of liver tissue is hepatocytes.
  • Hepatology.64 (6): 2244-6 (2016) (Non-Patent Document 2)). That is, it has been found that when liver damage occurs in mice, mature hepatocytes are converted into proliferative hepatocyte progenitor cells and repair deficient hepatocytes and bile duct cells (Cell Stem Cell.15 (3): 340-9 (2014) (Non-Patent Document 3); Cell Stem Cell.15 (5): 605-18 (2014) (Non-Patent Document 4); Cell.
  • Non-Patent Document 5 157,1324-38 (2014) (Non-Patent Document 5) ); Genes Dev.27 (7): 719-24 (2013) (Non-Patent Document 6)).
  • similar hepatic progenitor cells have been detected during human liver cirrhosis (Cell Stem Cell.23 (1): 114-22 (2016) (Non-Patent Document 7)).
  • liver regeneration capacity is associated with the aging status of hepatocytes, and liver transplants from older donors have also been shown to have significantly worse engraftment rates (J Hepatol.70 (4): 745- 58 (2019) (Non-Patent Document 8); J Hepatol.57 (2): 288-96 (2012) (Non-Patent Document 9)).
  • Non-Patent Document 11 Cell Research.29,8-22, 2019 (Non-Patent Document 12); J Hepatol.70 (1): 97-107, 2019 (Non-Patent Document 13)) .
  • proliferative ability but also pluripotency capable of differentiating into human hepatocytes and bile duct cells could not be maintained, and induction of hepatic progenitor cells based on plasticity control for human hepatocytes could not be realized. ..
  • the prior art has the following drawbacks. 1.
  • the method for inducing hepatic progenitor cells from rodent-derived hepatocytes cannot be applied to human cells.
  • Hepatic progenitor cells induced by conventional methods do not have high proliferative ability and pluripotency.
  • 3. There is no technology to control the plasticity and aging of human hepatocytes.
  • the present invention aims to overcome these drawbacks.
  • the present inventors have found a novel method for inducing iPS cell-derived hepatocytes, and succeeded in producing hepatocytes capable of maintaining liver function for a long period of time while gradually accumulating aging markers and characteristics.
  • the present inventors have newly discovered that, unlike rodent-derived hepatocytes, the plasticity of human hepatocytes is regulated by the FGF2-MAPK-EZH2 axis. That is, by increasing the transcriptional activity of EZH2 by adding FGF2, it is possible to convert human hepatocytes into hepatic progenitor cells having proliferative and pluripotent ability (ambiguity capable of differentiating into hepatocytes and bile duct cells). While possible, we have found that this plasticity is impaired in aged hepatocytes.
  • HDAC histone deacetylase
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a method for producing hepatocytes which comprises differentiating endoderm cells into hepatocytes in the presence of FGF family members, HGF, IL6 family members and dexamethasone.
  • Members of the FGF family are FGF2, FGF1, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22.
  • the method according to (1) which is at least one selected from the group consisting of FGF23 and FGF23.
  • a member of the IL6 family is at least one selected from the group consisting of oncostatin, IL-11, IL-27, IL-35, IL-39, LIF, CT-1, CNTF and CLCF1 ().
  • the hepatocyte according to (6) which has a function as a hepatocyte other than the ability to secrete albumin for 12 days or more and can survive.
  • At least one function as a hepatocyte other than albumin secretory ability is selected from the group consisting of drug-metabolizing ability, uptake and excretion of indocyanine green, glycogen storage, uptake of low-density lipoprotein and gene expression.
  • the hepatocyte according to any one of (6) to (8) which exhibits the characteristics of aging.
  • the characteristics of aging are increased cell volume, expression of aging-related genes, increased inflammatory response, DNA damage, increased intracellular reactive oxygen species levels, increased levels of cellular senescence-related ⁇ -galactosidase, epigenetic changes, etc.
  • a method for producing hepatic progenitor cells which comprises culturing hepatocytes in the presence of members of the FGF family.
  • FGF2 Members of the FGF family are FGF2, FGF1, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22.
  • the method according to (12) or (13), wherein the agent that causes histone hyperacetylation is a histone deacetylase inhibitor.
  • Histone deacetylase inhibitors include Trichostatin A, Tacedinaline (CI-994), M344, ITSA-1, Sodium valproate, Sodium 4-phenylbutuyrate, Sodium Butyrate (NaB), valproic acid (VPA), Abexinostat ( PCI-24781), Belinostat (PXD101), Citarinostat (ACY-241), Dacinostat (LAQ824), Depudecin, Domatinostat (4SC-202), Droxinostat, Entinostat (MS-275, SNDX-275), Fimepinostat (CUDC-907) , Givinostat (ITF2357), Mocetinostat (MGCD0103), Nexturastat A, Panobinostat (LBH-589, NVP-LBH589), Pracinostat (SB939), Quisinostat (JNJ-26481585) 2HCl, Resminostat, Ricolinostat (ACY-1215), Tucidinostat
  • Hepatocytes are cells differentiated from pluripotent stem cells, cells subcultured from cells differentiated from pluripotent stem cells, primary cultured cells isolated from living tissue, and primary isolated from living tissue.
  • Alpha-fetoprotein (AFP) -negative hepatic progenitor cells prepared by the method according to any one of (11) to (17) and having proliferative ability and bidirectional differentiation ability into hepatocytes / bile duct epithelial cells. ..
  • AFP Alpha-fetoprotein
  • Histone deacetylase inhibitors include Trichostatin A, Tacedinaline (CI-994), M344, ITSA-1, Sodium valproate, Sodium 4-phenylbutuyrate, Sodium Butyrate (NaB), valproic acid (VPA), Abexinostat ( PCI-24781), Belinostat (PXD101), Citarinostat (ACY-241), Dacinostat (LAQ824), Depudecin, Domatinostat (4SC-202), Droxinostat, Entinostat (MS-275, SNDX-275), Fimepinostat (CUDC-907) , Givinostat (ITF2357), Mocetinostat (MGCD0103), Nexturastat A, Panobinostat (LBH-589, NVP-LBH589), Pracinostat (SB939), Quisinostat (JNJ-26481585) 2HCl, Resminostat, Ricolinostat (ACY-1215), Tucidinostat
  • Histone deacetylase inhibitors include Trichostatin A, Tacedinaline (CI-994), M344, ITSA-1, Sodium valproate, Sodium 4-phenylbutuyrate, Sodium Butyrate (NaB), valproic acid (VPA), Abexinostat ( PCI-24781), Belinostat (PXD101), Citarinostat (ACY-241), Dacinostat (LAQ824), Depudecin, Domatinostat (4SC-202), Droxinostat, Entinostat (MS-275, SNDX-275), Fimepinostat (CUDC-907) , Givinostat (ITF2357), Mocetinostat (MGCD0103), Nexturastat A, Panobinostat (LBH-589, NVP-LBH589), Pracinostat (SB939), Quisinostat (JNJ-26481585) 2HCl, Resminostat, Ricolinostat (ACY-1215), Tucidinostat
  • At least one cell selected from the group consisting of the hepatocytes described in (6), the hepatic progenitor cells described in (18), and the cells induced to differentiate from the hepatic progenitor cells described in (18) was used as a non-human animal.
  • At least one cell selected from the group consisting of the hepatocytes according to (6), the hepatic progenitor cells according to (18) and the cells induced to differentiate from the hepatic progenitor cells according to (18) is non-hepatic insufficiency.
  • the method for producing a chimeric animal which comprises transplanting into a human animal.
  • composition for transplantation, which comprises at least one cell selected from the group consisting of the hepatocytes according to (6), the hepatic progenitor cells according to (18) and the cells induced to differentiate from the hepatic progenitor cells according to (18).
  • Composition (9)
  • a kit for a medium in the differentiation induction which comprises instructions for use in the medium used in the differentiation induction.
  • a method for promoting liver regeneration which comprises administering to a subject a drug that causes histone hyperacetylation in a pharmaceutically effective amount.
  • hepatocytes serving as an aging model were obtained.
  • Hepatocytes live progenitor cells
  • hepatocytes whose plasticity has been induced can be differentiated into hepatocytes and bile duct cells.
  • the present invention makes it possible to induce plasticity in aged hepatocytes as well.
  • hepatocytes derived from human induced pluripotent stem cells.
  • A Schematic diagram of hepatocyte differentiation, maturation and aging by a new strategy based on hiPSC-Hep.
  • B Q-PCR analysis of lineage-related gene expression during differentiation from hiPSC to hepatocytes: OCT4 and NANOG (pluripotent cells), SOX17 and FOXA2 (endoderm), TBX3 and TTR (hepatocytes), and A1AT and ALB (hepatocytes).
  • C Immunofluorescent staining of ALB, AFP, CK19, A1AT, HNF4A and KI67.
  • N-Hep hepatocytes derived from human induced pluripotent stem cells produced by the present inventors by the method described in Examples
  • D22 22nd
  • D72 72nd
  • E Transcriptome analysis is D22-Hep (hepatocytes induced to differentiate from hiPSC and subcultured after 22 days in all steps.
  • D72-Hep induced differentiation from hiPSC, subcultured, hepatocytes after 52 days in all steps
  • D72-Hep induced differentiation from hiPSC
  • 1-1A corresponding to "Young Hepatocyte”
  • D72-Hep induced differentiation from hiPSC
  • Hepatocytes subcultured after 72 days in all steps showing upregulation of some genes in (corresponding to "Old Hepatocyte” in Figure 1-1A); gene names displayed in large dots: Intracellular ROS (upper image, red) and SA- ⁇ -gal staining (lower image, green) in N-Hep of aging-related genes (F) D32 to D72 (G) D22 to D72 N-Hep Quantification of the percentage of intracellular ROS positive cells in.
  • C The medium displayed in step II.
  • A Three-dimensional graphic of gene expression clustering among D22-Hep, D72-Hep, young PHH (2 months old, 2M-PHH) and elderly PHH (78 years old, 78Y-PHH) by principal component analysis Provide an expression.
  • B By KEGG pathway analysis, genes whose expression increases with aging were compared between D72-Hep, 78Y-PHH and D22-Hep and 2M-PHH, respectively.
  • C By KEGG pathway analysis, genes whose expression decreases with aging were compared between D72-Hep, 78Y-PHH and D22-Hep and 2M-PHH, respectively.
  • FGF2 enhances D22-Hep-induced proliferation.
  • BM is 10 ng SFD medium containing / mL EGF and 20 ng / mL HGF (described in WO2016093222);
  • BM + SMs is a BM medium containing 10 ⁇ M Y-27632, 0.5 ⁇ M A83-01 and 3 ⁇ M CHIR99021 in the BM medium.
  • D Q-PCR measurement of cell cycle-related gene expression in cells before culture (D0) and 6 days after culture in RM. These time points are shown in the figure as RM-D0 and RM-D6, respectively.
  • E Immunofluorescent staining of KI67 and HNF4A on cells of RM-D0 and RM-D6 groups.
  • the MAPK-EZH2 axis activated by FGF2 promotes the induction of hepatocyte plasticity.
  • D Induction of hepatocyte proliferation using RM from D22-Hep derived from different hiPSC clones.
  • E Immunofluorescence analysis of AFP on hiPSC-hepatoblasts (HB) and proliferative hepatocytes (D22-pHC).
  • F Elisa-based analysis of AFP secretion from HB and D22-pHC.
  • G STRING interaction network of enriched genes in D22-pHC compared to D22-Hep.
  • H Q-PCR analysis of EZH2 expression in cells reprogrammed in D22-Hep, BM + SMs, and cells reprogrammed in RM.
  • (L) Number of cells on day 4 of D22-pHC cultured in RM, RM ⁇ FGF2 and RM + DNZep (0.1 ⁇ M); values were normalized to the number of cells on day 1.
  • (M) D22-pHC extended growth period curve (P0 to P20). These results were obtained from pHCs derived from 5 different hiPSCs (TKDA). And the phase difference image of pHC at passage number 20.
  • (N) A typical karyotype image of D22-pHC (TKDA) at passage number 18. D22-pHC, which has dichotomy, differentiates into hepatocytes and bile duct cells.
  • C D22-Hep, D22-pHC, D22-pHC-Hep (P1) (passage 1 D22-pHC-derived hepatocytes), D22-pHC-Hep (P10) (passage 10 D22-pHC-derived hepatocytes) And ELISA-based analysis of ALB secretion from D22-pHC-Hep (P20) (passage 20 pHC-derived hepatocytes).
  • D Immunofluorescence analysis of ALB, E-CAD and ZO-1 in D22-pHC-Hep.
  • E Ammonia excretion in D22-pHC-Hep (P1), D22-pHC-Hep (P20) and D22-Hep; Cell-free (NC) group is a negative control.
  • F Above: Schedule of differentiation of D22-pHC into bile duct cells. Bottom: Macroscopic image of D22-pHC-derived bile duct cells (D22-pHC-Cho) (left) and macroscopic image of one bile duct cell cyst (right).
  • G Q-PCR measurement of SOX9, HNF6, GGT and CFTR expression in D22-pHC and D22-pHC-Cho.
  • HDM consisted of SFD containing 10 ng / mL FGF2, 20 ng / mL HGF, 10 ng / mL OSM, 100 nM dexamethasone and 10 mM nicotinamide.
  • C Image of hepatocytes (D22-pHC-Hep) differentiated from D22-pHC derived from multiple donor hiPSC clones.
  • D Q-PCR analysis of ALB, A1AT, CYP2C9 and CYP2C19 expression in hepatocytes differentiated from D22-pHC (P1, P10 and P20) and P5 clonal D22-pHC (C1) with different passage numbers.
  • E Analysis of ICG uptake and excretion in D22-pHC-Hep (green), detection of glycogen storage by periodic acid shift staining (purple), and inspection of low density lipoprotein uptake using DiI-ac-LDL ( Red).
  • FIG. 1 Time-lapse imaging analysis of bile duct cell cyst formation. Arrowhead: One D22-pHC created a ring-like structure.
  • G Macroscopic image of bile duct cells (D22-pHC-Cho) derived from D22-pHC derived from multiple donor hiPSC clones.
  • H Q-PCR analysis of SOX9, GGT and CFTR expression in bile duct cells differentiated from D22-pHC (P1, P10 and P20) and P5 clonal D22-pHC (C1) with different passage numbers.
  • I Transmission electron microscope images of tight junctions (blue arrowheads) (top) and polytopes (red arrowheads) (bottom) in bile duct cells.
  • FIG. 1 A representative image of the active export of fluorescent bile acid CLF from the cyst lumen and the loading of FITC (fluorescein isothiocyanate) as a control. Aging-related histone hypoacetylation interferes with induced stem cell proliferation.
  • A Schematic analysis of plasticity associated with N-Hep aging.
  • B Image based on Hoechst staining of proliferative cells obtained from N-Hep after culturing in RM for 6 days.
  • C Quantification of cells obtained from N-Hep after culturing in RM for 6 days; data were normalized to the number of cells in D1.
  • acetyl-CoA synthesis-related genes ACLY, PDHB, ACSS2 and CPT1A
  • D22-Hep, D52-Hep, and D72-Hep was evaluated by Q-PCR.
  • E Analysis of intracellular acetyl-CoA levels in D22-Hep and D52-Hep.
  • F Analysis based on fluorescence activation cell sorting of the amounts of H3K9ac, H3K18ac and H3K27ac in D22-Hep, D32-Hep, D52-Hep and D62-Hep.
  • H Correlation of H3K9ac (left), H3K18ac (middle) and H3K27ac (right) levels with the aging-induced growth rate of N-Hep.
  • H Sodium butyrate (NaB), valproic acid (VPA), trany, histone demethylase inhibitor, RG108 (DNA methyltransferase inhibitor) or BIX01294 (BIX, histone methyltransferase inhibitor)
  • RG108 DNA methyltransferase inhibitor
  • BIX01294 BIX, histone methyltransferase inhibitor
  • Histone hypoacetylation impairs the induction of plasticity in aging hepatocytes.
  • KEGG pathway analysis of genes ( ⁇ 0.5 times) commonly down-regulated in D52-Hep and D72-Hep compared to (D) D22-Hep.
  • E FACS-based analysis of H3K9ac, H3K18ac, H3K27ac, H3K14ac and H3K56ac in D22-Hep.
  • F Comparison of H3K9ac, H3K18ac and H3K27ac levels in D22-Hep and D52-Hep.
  • G Quantification of median fluorescence intensity (MFI) of H3K9ac, H3K18ac and H3K27ac in aging N-Hep.
  • D Macroscopic image of D52-pHC-derived bile duct cells (D52-pHC-Cho, left), and macroscopic image of one bile duct cell cyst (right).
  • E Q-PCR analysis of ALB, A1AT, CYP2C9 and CYP2C19 expression in D52-pHC and D52-pHC-Hep.
  • HDACi HDAC inhibitor
  • C Phase difference images of PHH cultured in RM + NaB at D1 and D6.
  • D PHH-induced proliferation quantification incubated in medium consisting of RM or RM + NaB: Data were normalized for each cell number in D1.
  • E Microarray analysis of mRNA expression of cell cycle-related genes in PHH and PHH-pHC.
  • FIG. 1 Immunofluorescent staining of KI67, HNF4A, SOX9, ALB and CK19 on PHH-pHC. See also Figure 5-2. Characteristics of PHH plasticity (related to Figure 5-1).
  • A Quantification of improvement in PHH-pHC proliferation by NaB and FGF2 in inducing plasticity of 2M-PHH and 39Y-PHH on a plate coated with laminin 511. The numbers were normalized by the number of cells in each RM + NaB group.
  • B Comparison of liver function characteristics between PHH and PHH-pHC.
  • C Image of 2M-PHH-pHC passage on plates coated with different matrices.
  • E Q-PCR analysis of ALB, A1AT, CYP2C9 and CYP2C19 expression in PHH-pHC and PHH-pHC-Hep.
  • F Immunostaining of ALB in PHH-pHC-Hep.
  • G Elisa-based assay of ALB secretion during hepatocyte differentiation from PHH-pHC to PHH-pHC-Hep.
  • H Macroscopic image of PHH-pHC-derived bile duct cells (PHH-pHC-Cho, top) and macroscopic image of one bile duct cell cyst (bottom).
  • (B) Elisa-based analysis of hA1AT secretion in PHH-Tx and PHH-pHC-Tx mice 4 weeks after transplantation.
  • (C) Elisa-based analysis of hFerritin secretion in PHH-Tx and PHH-pHC-Tx mice 4 weeks after transplantation.
  • (D) Immunofluorescence assay of hALB, hNUMA and hCK19 in the liver of PHH-Tx and PHH-pHC-Tx mice 4 weeks after transplantation.
  • Engraftment of PHH-pHC in a mouse model of liver injury (related to Figure 6-1).
  • A Elisa-based assay of AFP secretion at 4 weeks post-transplantation in PHH Tx and PHH-pHC Tx mice.
  • B Amplification curve of human ALB in PHH Tx mouse and PHH-pHC Tx mouse. It was determined by PCR based on human-specific markers.
  • Non-Tx Mouse transplanted with PBS only; NTC: Control without template (no template control).
  • C Comparison of ALB + engraftment 4 weeks after transplantation in 78Y-PHH Tx mice and 78Y-pHC Tx mice.
  • B Macroscopic image of mouse liver 21 days after feeding the CDE diet.
  • C Hematoxylin and eosin staining of mouse liver 21 days after feeding the CDE diet.
  • E, F Immunofluorescent staining (E) and quantification (F) of Ki67 in liver sections of CDE-fed mice.
  • the present invention comprises differentiating endometrial cells into hepatocytes in the presence of FGF family members, HGF, IL6 family members and dexamethasone.
  • a method for producing cells is provided.
  • the method of the present invention is a simple method for producing hepatocytes, which can differentiate endoderm cells into hepatocytes in one step.
  • Fibroblast growth factors is a type of growth factor and is involved in angiogenesis, wound healing, and embryogenesis.
  • the members of the FGF family include FGF2, FGF1, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21. , FGF22, FGF23, and combinations thereof can be exemplified, and FGF2 is preferable.
  • Hepatocyte Growth Factor was discovered as a substance that promotes the growth of hepatocytes in the blood of rats in which a part of the liver was excised, and was purified as a factor that strongly promotes the growth of primary cultured hepatocytes. It is a cytokine and is a promising candidate for hepatocyte growth factor that supports the vigorous regenerative power of the liver. HGF is a large growth factor, and HGF mRNA is a single-stranded precursor of 728 amino acid residues translated as Pro HGF (94 kD), which has no biological activity.
  • HGF Hepatocyte Growth Factor
  • HGF activator HGF activator
  • XIa coagulation factor
  • u-PA urokinase
  • matliptase ⁇ chain
  • ⁇ -chain ⁇ chain
  • HGF activator HGFA
  • XIa coagulation factor
  • u-PA urokinase
  • matliptase ⁇ chain
  • Mature (active) HGF having a heterodimer structure in which 62 kD) and ⁇ chain (34 kD) are disulfide-bonded.
  • HGF promotes the proliferation of primary cultured rat hepatocytes, and promotes the proliferation of not only hepatocytes but also various epithelial cells, endothelial cells, and some mesenchymal cells.
  • tissue / organ regeneration and protection such as cell proliferation promotion, cell dispersion / cell motility promotion, anti-apoptosis (cell death), morphogenesis induction (cavity formation, etc.), angiogenesis, antifibrotic action and immune response regulatory action It has a versatile physiological activity that bears the burden of.
  • the HGF receptor is a product of the protooncogene c-met and has tyrosine kinase activity, and various biological actions of HGF are exerted via c-Met.
  • HGF-producing cells are mainly produced and secreted from mesenchymal cells such as fibroblasts, fat-containing cells, neutrophils, macrophages, and vascular endothelial cells, and act paraclinically on normal epithelial cells or cancer cells. ing. On the other hand, it has also been reported that cancer cells also produce HGF and have an autoclinic effect that activates their own c-MET.
  • the cells that produce HGF in the liver are hepatic sinusoid stellates and sinusoidal endothelial cells.
  • HGF expression increases not only in the injured liver but also in distant organs such as the lungs and kidneys due to various acute injuries such as partial hepatectomy, hepatitis, and hepatic ischemia. Increases blood HGF levels.
  • administration of antibodies that neutralize the activity of HGF to rats and mice that have caused liver injury leads to significant spread of liver injury and hepatic regeneration failure.
  • Similar results have been observed in other organ injuries, and HGF is an endogenous factor responsible for the regeneration and protection of various tissues and organs, including the liver, kidneys, lungs, cardiovascular system, and nervous system. It has been revealed.
  • HGF production in cultured cells is induced by PKC activators, PKA activators, cAMP-elevating drugs, various growth factors, inflammatory cytokines (IL-1, TNF- ⁇ , etc.), TGF- ⁇ , glucocorticoids, etc. , Active vitamin D, retinoic acid, etc.
  • serum and plasma HGF quantitative ELISA kits have been used to predict hepatitis fulminantization.
  • Interleukin-6 is a lectin produced by cells such as T cells and macrophages, and is one of the cytokines that control humoral immunity.
  • the members of the IL6 family include oncostatin (OSM), IL-6, IL-11, IL-27, IL-35, IL-39, LIF, CT-1, CNTF, CLCF1, and theirs. Combinations and the like can be exemplified, and oncostatin is preferable.
  • Dexamethasone is a synthetic corticosteroid that exhibits anti-inflammatory effects by the same mechanism as natural glucocorticoids and is used for acute inflammation, chronic inflammation, autoimmune diseases, allergic diseases, etc.
  • Endodermal cells are cells that express endoderm markers and can differentiate into various endoderm cells (lung, liver, pancreas, stomach, small intestine, large intestine, etc.).
  • endoderm markers include SOX17, FOXA2, CXCR4, EpCAM, C-KIT, and CER1
  • examples of endoderm cells include cells such as lung, liver, pancreas, stomach, small intestine, and large intestine. can do.
  • Endodermal cells can be induced to differentiate from pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells). Methods for differentiating iPS cells into endoderm cells are described in Examples below. That is, using a medium consisting of RPMI 1640, 1% B27, 50 ng / mL WNT3A and 100 ng / mL activin A, the cells were cultured on a plate coated with GFR Matrigel or laminin 511 for 7 days, and the hiPSC clone was endoderm. Differentiated into cells. On day 0, 10 ⁇ M Y-27632 was added, and from day 1 to day 0.5 mM NaB was added. This method can be modified as appropriate.
  • the endoderm cells may be those collected from a living body.
  • Endoplasmic cells may be of human origin, but are not limited to humans, and mammals such as mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, pigs, cats, dogs, sheep, cows, horses, goats, and monkeys. It may be of animal origin.
  • Hepatocytes can be differentiated by culturing endoderm cells in a medium containing FGF family members, HGF, IL6 family members, and dexamethasone.
  • basal medium SFD medium (described in WO2016093222), DMEM / F12, DMEM, IMDM, RPMI1640, Williams' Medium E, etc. can be used, and FGF family members, HGF, IL6 family members, and dexamethasone can be used as the basal medium. Should be added.
  • the concentrations of FGF family members, HGF, IL6 family members and dexamethasone in the medium may be adjusted as appropriate.
  • the concentration of FGF2 is usually preferably 0.01 to 1000 ng / mL, preferably 0.1 to 100 ng / mL, and more preferably 0.1 to 100 ng / mL. It is 1 to 50 ng / mL.
  • the concentration of HGF is usually preferably 1 to 1000 ng / mL, preferably 5 to 100 ng / mL, and more preferably 5 to 50 ng / mL.
  • the concentration of OSM is usually preferably 1 to 1000 ng / mL, preferably 5 to 100 ng / mL, more preferably. Is 10 to 50 ng / mL.
  • the concentration of dexamethasone is usually preferably 1 to 1000000 nM, preferably 10 to 10000 nM, and more preferably 50 to 500 nM.
  • Nicotinamide may be added to the medium.
  • concentration of nicotinamide in the medium is usually preferably 0.01 to 1000 mM, preferably 0.1 to 100 mM, and more preferably 1 to 10 mM. Nicotinamide should be added after the 8th day of culture.
  • the medium may be a serum-containing medium or a serum-free medium, but in the examples described later, a serum-free medium was used.
  • endoderm cells are seeded on a gel and cultured.
  • the gel used is not particularly limited, but GFR Matrigel (manufactured by Corning) or the like can be used.
  • Endodermal cells may be cultured on a container coated with a main component of tissue basement membrane such as laminin.
  • the temperature at the time of culturing is not particularly limited, but is preferably 30 to 40 ° C, more preferably 37 ° C.
  • the culture period is not particularly limited, but is preferably 1 to 150 days, more preferably 1 to 90 days.
  • liver-specific genes and liver function may be examined, and hepatocyte-like cell morphology may be observed.
  • hepatocyte-specific genes include TBX3 and TTR, DLK, CK19, EPCAM (hepatocyte), and A1AT, ALB, G6PC, ASGR1, TAT, TDO2, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4 and CYP7A1 (hepatocyte). can do.
  • the cells in the process of differentiation from endoderm cells to hepatocytes, in the early stage of differentiation (for example, on the 5th day of differentiation), the cells are in the hepatoblastic state, and when the culture is continued, the liver function Came to express. Liver function will be described later.
  • pluripotent stem cells can be induced into hepatocytes by a simple method.
  • the hepatocytes produced by the method of the present invention can retain the function as hepatocytes for a long period of time and survive, and can realize long-term culture of hepatocytes and imitation of the aging process in vitro.
  • Hepatocytes produced by the method of the present invention are 12 days or more, 15 days or more, 17 days or more, 22 days or more, 26 days or more, 31 days or more, 32 days or more, 42 days or more, 52 days or more, 72 days. As described above, it can survive with a function as hepatocytes in a monolayer culture in vitro for a period of 82 days or more, 90 days or more, 100 days or more or more.
  • the upper limit of the survival period of the hepatocytes produced by the method of the present invention having a function as hepatocytes is not particularly limited. The present inventors have observed that hepatocytes produced by the method of the present invention have the ability to secrete albumin for 82 days and are viable.
  • hepatocytes produced by the method of the present invention as hepatocytes include, for example, albumin secretion ability, drug metabolism ability, indocyanine green (ICG) uptake and excretion, glycogen storage, and low density lipoprotein uptake. , Gene expression, etc.
  • the hepatocytes produced by the method of the present invention can survive for 12 days or more with the ability to secrete albumin, and further have a function as hepatocytes other than the ability to secrete albumin for 12 days or more. Can survive.
  • Albumin secretory capacity can be measured by a commercially available albumin ELISA quantitative set.
  • Drug metabolism can be measured with a commercially available Cytochrome P450-related assay kit.
  • ICG uptake and excretion can be examined by seeding cells in a medium supplemented with ICG, incubating for an appropriate time, and then observing under a microscope.
  • Glycogen storage can be examined by detecting glycogen using periodic acid-Schiff (PAS) staining.
  • PAS periodic acid-Schiff
  • Incorporation of low-density lipoprotein can be examined by incubating the cells with Dil-Ac-LDL and Hoechst 33342 standard dilutions, washing the cells with PBS, and analyzing the photographs using a fluorescence microscope.
  • the gene expression test can be performed as follows. Isolate total RNA using the PureLink TM RNA Mini Kit. RNA ( ⁇ 2 ⁇ g) is used as a template for synthesizing single-stranded cDNA using the high-performance cDNA reverse transcription kit according to the manufacturer's instructions. Perform Q-PCR using cDNA as well as specific primers and probes from the universal probe library.
  • Hepatocytes produced by the method of the present invention can exhibit the characteristics of aging. Aging is characterized by increased cell volume, expression of aging-related genes, increased inflammatory response, DNA damage, increased levels of intracellular reactive oxygen species, increased levels of cellular senescence-related ⁇ -galactosidase, epigenetic changes, and telomeres. Shortening of length, decreased mitochondrial function, abnormal metabolism, low responsiveness to growth factors, etc. can be exemplified.
  • the cell volume can be examined by incubating the cells with Hoechst 33342 standard dilution solution, washing the cells with PBS, and analyzing the photographs using a fluorescence microscope.
  • aging-related genes include CCL2, CDNK2A, CST1, CXCL1, GDF15, ID1, LIMCH1, LMO2, MAP2, MMP24, MYC, RCAN2, S100A8, S100A9, SERPINE1, TGFB1, and the expression of aging-related genes. Can be measured using a commercially available SurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K (Agilent Technologies).
  • the inflammatory response can be exemplified by an increase in intracellular inflammation-related factors, and the inflammatory response can be measured using a commercially available SurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K (Agilent Technologies).
  • DNA damage can be measured using a commercially available SurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K (Agilent Technologies).
  • the intracellular reactive oxygen species level can be measured by adding a reagent such as CellROX TM Deep Red Reagent (Thermo Fisher Scientific) to the cells and then observing the cells under a microscope or counting the number of fluorescent cells.
  • a reagent such as CellROX TM Deep Red Reagent (Thermo Fisher Scientific)
  • Cellular senescence-related ⁇ -galactosidase levels can be measured using the ⁇ -galactosidase detection kit (Dojindo).
  • Epigenetic changes can be measured using a commercially available Acetyl-Histone H3 Antibody Sampler kit (CST).
  • CST Acetyl-Histone H3 Antibody Sampler kit
  • telomere length can be measured using a commercially available telomere length qPCR kit (ScienCell Research Laboratories).
  • the production of ATP phosphorylation of ADP
  • the decrease in mitochondrial function means that the genes related to ATP production decrease. It can be confirmed by measuring using Human Gene Expression 8x60K (Agilent Technologies).
  • metabolic abnormalities include metabolic abnormalities of organic acids, amino acids, uric acid cycles, sugars, fatty acids, lysosomes, lipoproteins, nucleic acids, membrane-carrying proteins, etc.
  • Metabolic abnormalities include changes in metabolism-related gene expression. This can be confirmed by measuring using a commercially available SurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K (Agilent Technologies).
  • the hepatocytes produced by the method of the present invention are different from the source of living body-derived hepatocytes.
  • the hepatocytes produced by the method of the present invention have liver-specific genes (ALB, G6PC, ASGR1, TAT, TDO2, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4 and CYP7A1). Expression, ALB secretion, and CYP3A4 activity are significantly up-regulated.
  • Hepatocytes induced by the conventional method cannot be cultured in vitro for 30 days or more, and hepatocytes produced by the method of the present invention can be cultured in vitro for 50 days or more, and the aging process of hepatocytes can be reproduced.
  • hepatocytes prepared by the method of the present invention were induced by a conventional method.
  • An example of up-regulated numerical values compared to hepatocytes is described below.
  • Conventional method A Si-Tayeb, K., Noto, FK, Nagaoka, M., Li, J., Battle, MA, Duris, C., North, PE, Dalton, S., and Duncan, SA (2010) Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology 51, 297-305.
  • Conventional method B Kajiwara, M., Aoi, T., Okita, K., Takahashi, R., Inoue, H., Takayama, N., Endo, H., Eto, K., Toguchida, J., Uemoto , S., et al. (2012).
  • Liver-specific gene measurement method Q-PCR (see Examples below)
  • Measurement method of ALB secretion Measured by ELISA (see Examples below)
  • Measurement method of CYP3A4 activity Measurement was performed by a commercially available P450-Glo TM CYP3A4 Assay kit (Promega, V8801).
  • the hepatocytes produced by the method of the present invention have 10 times or more, preferably 15 times or more, more preferably 19 times or more, G6PC for ALB. 100 times or more, preferably 500 times or more, more preferably 1000 times or more, ASGR1 2 times or more, preferably 3 times or more, more preferably 4 times or more, 10 times or more for TAT Above, preferably 20 times or more, more preferably 25 times or more, for TDO2 10 times or more, preferably 15 times or more, more preferably 17 times or more, for CYP2C9 2 times or more, preferably , 4 times or more, more preferably 6 times or more, for CYP2C19 2 times or more, preferably 3 times or more, more preferably 4 times or more, for CYP3A4 2 times or more, preferably 4 times or more , More preferably, 5 times or more, for CYP7A1, 3 times or more, preferably 5 times or more,
  • the hepatocytes produced by the method of the present invention are twice or more, preferably three times or more, more preferably 4 times or more, as compared with the hepatocytes induced by the conventional method A. Can rise more than double.
  • the hepatocytes produced by the method of the present invention have CYP3A4 activity, but the hepatocytes induced by the conventional method A do not have CYP3A4 activity detected.
  • the hepatocytes produced by the method of the present invention are twice or more, preferably 4 times or more, more preferably 5 times or more, G6PC for ALB. 20 times or more, preferably 25 times or more, more preferably 29 times or more, ASGR1 is about the same, TAT is 30 times or more, preferably 40 times or more, more preferably 50 times or more.
  • TDO2 is 2 times or more, preferably 4 times or more, more preferably 5 times or more
  • CYP2C9 is about the same
  • CYP2C19 is 1.2 times or more, preferably 1.5 times or more, more preferably. 2 times or more, CYP3A4 3 times or more, preferably 5 times or more, more preferably 8 times or more, CYP7A1 2 times or more, preferably 4 times or more, more preferably 5 times or more
  • Expression can be elevated.
  • the hepatocytes produced by the method of the present invention are 1.2 times or more, preferably 1.5 times or more, more preferably 2 times or more, as compared with the hepatocytes induced by the conventional method B. Can rise more than double.
  • the hepatocytes produced by the method of the present invention are 30 times or more, preferably 40 times or more, more preferably 47 times or more, as compared with the hepatocytes induced by the conventional method B. Can rise more than double.
  • Hepatocytes produced by the method of the present invention (N-Hep on the 22nd day of culture in Examples described later), hepatocytes induced by the conventional method A, and hepatocytes induced by the conventional method B are of liver-specific genes.
  • An example of measured values of expression, ALB secretion, and CYP3A4 activity is described below.
  • N-Hep Hepatocytes produced by the method of the present invention (N-Hep on day 22 of culture in Examples described below)
  • Human hepatocytes Bioreclamation IVT IVT-F00995-P-AKB (donor is female, age 39 years) Each cell in the table is not passaged.
  • Liver-specific gene measurement method Q-PCR (see Examples below)
  • Measurement method of ALB secretion Measured by ELISA (see Examples below)
  • Measurement method of CYP3A4 activity Measured by a commercially available P450-Glo TM CYP3A4 Assay kit (Promega, V8801).
  • the expression level of hepatocytes produced by the method of the present invention is 3 or more, preferably 5 or more, more preferably 9 or more for ALB, and 0.05 or more for G6PC, as measured by Q-PCR.
  • ASGR1 is 0.05 or more, preferably 0.1 or more, more preferably 0.16 or more
  • TAT is 0.00001 or more, preferably 0.00005 or more.
  • CYP2C19 is 0.00005 or more, preferably 0.0001 or more, more preferably 0.0006 or more, and CYP3A4 is 0.00001 or more, preferably 0.00005 or more, more preferably 0.00009 or more, and CYP7A1.
  • the hepatocytes produced by the method of the present invention have an ALB secretion quantified by ELISA of 2 ⁇ g / ml / 24h / 1 million or more, preferably 4 ⁇ g / ml / 24h / 1 million or more, more preferably 5 It can be ⁇ g / ml / 24h / 1 million or more.
  • the hepatocytes produced by the method of the present invention have a CYP3A4 activity of 50000 RLU / 4h / ml / million cells or more, preferably 100000 RLU, as measured by a commercially available P450-Glo TM CYP3A4 Assay kit (Promega, V8801). It can be 4h / ml / million cells or more, more preferably 200,000 RLU / 4h / ml / million cells or more.
  • the present invention provides a method for producing hepatic progenitor cells, which comprises culturing hepatocytes in the presence of members of the FGF family. provide.
  • the members of the FGF family include FGF2, FGF1, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21. , FGF22, FGF23 and the like can be exemplified, and FGF2 is preferable.
  • Hepatocytes or hepatocytes used to induce pHC or plasticity may be any hepatocytes that express liver-specific genes and exhibit liver function, and hepatocytes are hepatocytes differentiated from pluripotent stem cells, pluripotent. Either subcultured cells of hepatocytes differentiated from stem cells, primary cultured hepatocytes isolated from living tissue, cells subcultured primary cultured hepatocytes isolated from living tissue, or a combination thereof. You may.
  • pluripotent stem cells examples include ES cells and iPS cells.
  • hepatocytes differentiated from pluripotent stem cells include the hepatocytes described in 1 above, that is, hepatocytes induced to differentiate from endoblasts in the presence of FGF family members, HGF, IL6 family members and dexamethasone. Can be exemplified.
  • endometrial cells were seeded on a plate coated with GFR Matrigel or Laminin 511 using a nicotine amide-free hepatocyte differentiation medium (HDM), and the medium was used from the 8th to the 10th day. The cells were replaced with HDM daily, and from the 11th day, the medium was replaced every 2 days to induce differentiation into hepatocytes.
  • HDM nicotine amide-free hepatocyte differentiation medium
  • This HDM consisted of SFD containing 10 ng / mL FGF2, 20 ng / mL HGF, 10 ng / mL OSM, 100 nM dexamethasone and 10 mM nicotinamide. This method can be modified as appropriate.
  • hepatocytes are seeded on a plate coated with GFR Matrigel or Laminin 511 using HDM containing nicotine amide, and the medium is changed every two days. Should be subcultured.
  • This HDM consisted of SFD containing 10 ng / mL FGF2, 20 ng / mL HGF, 10 ng / mL OSM, 100 nM dexamethasone and 10 mM nicotinamide. This method can be modified as appropriate.
  • the number of hepatocyte passages is usually 1 to 5 times, preferably 1 to 4 times, more preferably. Is 1 to 3 times, and the number of hepatocyte culture days is usually 1 to 100 days, preferably 1 to 80 days, and more preferably 5 to 60 days.
  • the hepatocyte may be a primary cultured hepatocyte isolated from a living tissue or a subcultured cell thereof.
  • primary human hepatocytes derived from donors aged 2 months, ages 39 and 78 years were used.
  • To culture or subculture primary human hepatocytes seed the primary human hepatocytes on a plate coated with GFR Matrigel or Laminin 511 using human hepatocyte culture medium and change the medium every two days.
  • the primary human hepatocytes may be cultured or subcultured. There are two types of human hepatocyte culture medium.
  • the human age is usually 0 to 120 years, preferably 0 to 120 years. Is 0 to 100 years, more preferably 0 to 80 years.
  • the number of passages of cultured cells is usually 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and the number of days for culturing cells is usually 1 to 30 days. Yes, preferably 1 to 20 days, more preferably 1 to 10 days.
  • Hepatocytes are hepatocytes differentiated from pluripotent stem cells, cells subcultured from hepatocytes differentiated from pluripotent stem cells, primary cultured hepatocytes isolated from living tissue, and primary isolated from living tissue. It may be a combination of cells subcultured from cultured hepatocytes.
  • Hepatocytes may be of human origin, but are not limited to humans, but mammals such as mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, pigs, cats, dogs, sheep, cows, horses, goats, and monkeys. It may be derived from.
  • hepatic progenitor cells By culturing hepatocytes in a medium containing members of the FGF family, hepatic progenitor cells can be induced (hereinafter, may be referred to as "reprogramming").
  • basal medium SFD medium (described in WO2016093222), DMEM / F12, DMEM, IMDM, RPMI1640, Williams' Medium E) and the like can be used, and members of the FGF family may be added to the basal medium.
  • the concentration of FGF family members in the medium may be adjusted as appropriate.
  • the concentration of FGF2 is usually preferably 0.01 to 1000 ng / mL, preferably 0.1 to 100 ng / mL, and more preferably 0.1 to 100 ng / mL. It is 1 to 50 ng / mL.
  • EGF, HGF, ROCK inhibitor, ALK4, ALK5, ALK7 selective inhibitor (TGF- ⁇ receptor inhibitor), GSK-3 ⁇ inhibitor may be added to the medium.
  • Epidermal Growth Factor is a 6045 Da protein consisting of 53 amino acid residues and three intramolecular disulfide bonds, and binds as a ligand to the epidermal growth factor receptor (EGFR) present on the cell surface. It plays an important role in the regulation of cell growth and proliferation.
  • the concentration of EGF in the medium is usually preferably 0.1 to 1000 ng / mL, preferably 1 to 100 ng / mL, and more preferably 1 to 50 ng / mL.
  • HGF was mentioned above.
  • the concentration of HGF is usually preferably 1 to 1000 ng / mL, preferably 5 to 100 ng / mL, and more preferably 5 to 50 ng / mL.
  • Rho-associated protein kinase is a serine-threonine protein kinase identified as a target protein for the low-molecular-weight GTP-binding protein Rho, and ROCK inhibitors include Y-27632, AT13148, Fasudil, and Hydroxyfasudil. , GSK269962A, GSK180736A, GSK429286A, KD025, Netarsudil, RKI-1447, Thiazovivin, Y-39983 and the like can be exemplified.
  • the concentration of Y-27632 is usually preferably 1 to 1000 ⁇ M, preferably 1 to 100 ⁇ M, and more preferably 1 to 50. It is ⁇ M.
  • ALK4, ALK5, ALK7 are TGF- ⁇ 1 activin receptor-like kinases (ALK), and as selective inhibitors (TGF- ⁇ receptor inhibitors) of ALK4, ALK5, ALK7, A83-01, DMH1, GW788388 , Galunisertib, K02288, LDN-193189, LDN-212854, LDN-214117, LY2109761, LY364947, ML347, SB431542, SB505124, SB525334, SD-208, RepSox, Vactosertib and the like.
  • ALK4, ALK5, ALK7 are TGF- ⁇ 1 activin receptor-like kinases (ALK), and as selective inhibitors (TGF- ⁇ receptor inhibitors) of ALK4, ALK5, ALK7, A83-01, DMH1, GW788388 , Galunisertib, K02288, LDN-193189, LDN-212854, LDN-214117, LY2109761, LY3649
  • the concentration of A83-01 is usually preferably 0.01 to 100 ⁇ M, preferably 0.01 to 100 ⁇ M. It is 0.1 to 10 ⁇ M, more preferably 0.1 to 5 ⁇ M.
  • GSK3 ⁇ is a serine threonine protein kinase, and as GSK-3 ⁇ inhibitors, CHIR99021, 1-Azakenpaullone, 2-D08, AR-A014418, AZD1080, AZD2858, Bikinin, BIO, BIO-acetoxime, CHIR-98014, IM- 12, Indirubin, LY2090314, SB216763, SB415286, Tideglusib, TDZD-8, TWS119 and the like can be exemplified.
  • the concentration of CHIR99021 is usually preferably 0.01-100 ⁇ M, preferably 0.01-20 ⁇ M, more preferably 0.1-20 ⁇ M. is there.
  • the medium may be a serum-containing medium or a serum-free medium, but in the examples described later, a serum-free medium was used.
  • hepatocytes are seeded on a gel and cultured.
  • the gel used is not particularly limited, but GFR Matrigel (manufactured by Corning) or the like can be used.
  • Hepatocytes may be cultured on a container coated with a main component of tissue basement membrane such as laminin.
  • the temperature at the time of culturing is not particularly limited, but is preferably 30 to 40 ° C, more preferably 37 ° C.
  • the culture period is not particularly limited, but it is preferably 4 to 15 days, and more preferably 5 to 10 days.
  • the hepatic progenitor cells derived from hepatocytes by the method of the present invention are proliferative and capable of differentiating, for example, proliferative and bidirectionally differentiating into hepatocytes / bile duct epithelial cells.
  • the hepatic progenitor cells of the present invention have high cell cycle gene expression (positive), high hepatic stem / progenitor cell-related gene expression (positive), low hepatic function-related gene expression (negative), HNF4A, SOX9 and It shows positive staining for CK19, but is not stained for ALB and AFP (see Examples below).
  • Hepatic progenitor cells can be subcultured by seeding on Matrigel or laminin coating using a medium containing members of the FGF family and replacing the cells with a medium containing no ROCK inhibitor at an appropriate time.
  • the proliferative potential of hepatic progenitor cells can be examined by calculating the cell population doubling time as described in Examples described later. Hepatic progenitor cells can have a high proliferative capacity with a cell population doubling time of 14 to 36 hours.
  • the hepatic progenitor cells derived from hepatocytes by the method of the present invention can differentiate into hepatocytes, bile duct cells and the like.
  • hepatic differentiation medium As the liver differentiation medium, HDM (described in 1 above) can be used. Vitamin A metabolites (eg, retinoic acid (RA)) may be added to the liver differentiation medium at the appropriate time and for the appropriate period.
  • Vitamin A metabolites eg, retinoic acid (RA)
  • RA retinoic acid
  • the medium was replaced with RA-containing HDM for 8 days and then with RA-free HDM for the next 7 days. The medium was changed every 2 days. The total hepatocyte differentiation period was 15 days. This method can be modified as appropriate.
  • Hepatocytes differentiated from hepatic progenitor cells may exhibit functional genes (eg, AAT, CTP2C9, CYP2C19, etc.) expression and increased ALB secretion.
  • hepatocytes differentiated from hepatic progenitor cells form tight junctions between their cells and acquire ammonia excretion and liver function (ICG uptake and excretion, glycogen storage, and low density lipoprotein uptake). sell.
  • the hepatic progenitor cells should be cultured in a bile duct cell differentiation medium (CDM) (see Francis et al., 2004; Sampaziotis et al., 2015; Sampaziotis et al., 2017. That).
  • CDM bile duct cell differentiation medium
  • hepatic progenitor cells mixed with GFR-Matrigel were seeded as mount drops on untreated 24-well plates and incubated at 37 ° C for 30 minutes in a 5% CO2 incubator. Next, the wells were filled with a bile duct cell differentiation medium (CDM).
  • This CDM is 10 ng / mL EGF, 20 ng / mL HGF, 50 ng / mL WNT3A, 100 ng / mL R-Spondin-1, 50 ng / mL FGF10, 3 ⁇ M RA, 10 ⁇ M Y-27632 and 10 ⁇ M. It consisted of SFD containing forskolin. The medium was changed every 3 days. This method can be modified as appropriate. Bile duct cells differentiated from hepatic progenitor cells can develop into cystic structures via ring-shaped structures. According to Q-PCR analysis, this cystic structure may feature up-regulated transcription of bile duct cell characteristic genes (Fig. 3-1G and 3-2H).
  • Bile duct cells of these cysts may be positive for CK19, F-ACTIN, and SOX9 staining and negative for AFP, ALB, and HNF4A staining.
  • these cysts may have the characteristics of mature bile ducts, including lumens with apical and lateral floor cell membranes, microvilli, primary cilia on the apical membrane, tight junctions and polytopes.
  • These bile duct cells may have bile duct function: 1) transport of rhodamine 123 into the lumen and 2) specifically excrete bile acids from the lumen.
  • the present invention comprises inducing differentiation of hepatocyte obtained by a method for producing hepatocyte progenitor cell into hepatocyte, which comprises culturing hepatocyte in the presence of a member of the FGF family.
  • a method for producing the above is provided.
  • the present invention also comprises inducing differentiation of hepatocyte obtained by a method for producing hepatocyte progenitor cell into bile duct cell, which comprises culturing hepatocyte in the presence of a member of the FGF family.
  • a method for producing the above is also provided.
  • the present invention also provides a medium containing FGF10, retinoic acid and forskolin for inducing differentiation of the hepatic progenitor cells into bile duct cells.
  • the medium of the present invention may contain other components contained in the above-mentioned intrahepatic cell differentiation medium (CDM). Furthermore, the present invention uses an agent containing FGF10, retinoic acid and forskolin for use in a medium used to induce differentiation of the hepatic progenitor cells into bile duct cells; and the agent used for the induction of differentiation. Also provided is a kit for the medium in the differentiation induction, which includes instructions for use in the medium to be used. The agent containing FGF10, retinoic acid and forskolin may contain other components contained in the above-mentioned Bile Duct Cell Differentiation Medium (CDM).
  • CDM Bile Duct Cell Differentiation Medium
  • Liver progenitor cells derived from hepatocytes by the method of the present invention can proliferate over a long period of time, for example, can be passaged at least 20 times or more. Therefore, according to the present invention, hepatocytes and bile duct cells can be mass-produced.
  • the present invention provides a method for producing hepatic progenitor cells, which comprises culturing hepatocytes in the presence of members of the FGF family and agents that result in histone hyperacetylation.
  • Hepatocytes can be suppressed in aging and induced to be plastic by drugs that cause histone hyperacetylation.
  • hepatocyte plasticity refers to the ability to convert hepatocytes into proliferative hepatic progenitor cells that have the ability to differentiate into both hepatocytes and bile duct cells. By improving the plasticity of hepatocytes, the responsiveness of hepatocytes to induction of proliferation is increased.
  • the present invention provides a method for suppressing aging of hepatocytes by an agent that causes histone hyperacetylation.
  • the present invention provides a hepatocyte anti-aging agent (anti-aging agent) containing an agent that causes histone hyperacetylation as an active ingredient.
  • the anti-aging agent of the present invention can be applied to both in vitro (cultured cells) and in vivo (cells in vivo).
  • Hepatocyte aging can be confirmed by decreased cell proliferation, decreased function as hepatocytes, upregulation of aging-related genes, expression of aging-related markers, and the like. In addition, it can be confirmed by increased cell volume, increased inflammatory response, DNA damage, epigenetic changes, shortened telomere length, decreased mitochondrial function, metabolic abnormalities, low responsiveness to growth factors, etc. ..
  • Cell proliferation can be examined by calculating the cell population doubling time.
  • aging-related markers include intracellular reactive oxygen species levels and cell senescence-related ⁇ -galactosidase levels, and these measurement methods are described in 1 above.
  • the present invention also provides a method of increasing the plasticity of hepatocytes by an agent that causes histone hyperacetylation.
  • the present invention provides an agent that increases the plasticity of hepatocytes, which comprises an agent that causes histone hyperacetylation as an active ingredient. Due to the increased plasticity, hepatic progenitor cells can also be induced from aged hepatocytes derived from pluripotent stem cells and hepatocytes derived from the elderly. In addition, the increased plasticity can enhance the responsiveness of hepatocytes to induction of proliferation.
  • the agent of the present invention can be a regeneration inducer that brings about an improvement in the regenerative ability of senescent cells. The agent of the present invention can promote liver regeneration in the elderly. In addition, the agent of the present invention enables successful transplantation therapy using grafts and cells derived from elderly donors.
  • the agent of the present invention can be applied to both in vitro (cultured cells) and in vivo (cells in vivo).
  • FGF family Drugs that cause histone hyperacetylation should be used in combination with members of the FGF family.
  • Members of the FGF family include FGF2, FGF1, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23. , Or a combination thereof and the like can be exemplified, and FGF2 is preferable.
  • agents that cause histone hyperacetylation include histone deacetylase inhibitors, and examples of histone deacetylase inhibitors include Trichostatin A, Tacedinaline (CI-994), M344, ITSA-1, and Sodium.
  • valproate Sodium 4-phenylbutuyrate, Sodium Butyrate (NaB), valproic acid (VPA), Abexinostat (PCI-24781), Belinostat (PXD101), Citarinostat (ACY-241), Dacinostat (LAQ824), Depudecin, Domatinostat (4SC) ), Droxinostat, Entinostat (MS-275, SNDX-275), Fimepinostat (CUDC-907), Givinostat (ITF2357), Mocetonistt (MGCD0103), Nexturastat A, Panobinostat (LBH-589, NVP-LBH589), Pracinostat (SB) , Quisinostat (JNJ-26481585) 2
  • the target hepatocyte for suppressing aging or increasing plasticity by a drug that causes histone hyperacetylation is preferably, but is not limited to, aged hepatocyte.
  • Hepatocytes are hepatocytes differentiated from pluripotent stem cells, cells subcultured from hepatocytes differentiated from pluripotent stem cells, primary cultured hepatocytes isolated from living tissue, and primary isolated from living tissue.
  • the cultured hepatocytes may be subcultured cells or a combination thereof.
  • hepatocytes are hepatocytes differentiated from pluripotent stem cells
  • aged hepatocytes are, for example, 50 days after induction of differentiation from pluripotent stem cells (eg, iPSC) (22 days later). Hepatocytes that have undergone the above subculture.
  • hepatocytes are cells in which hepatocytes differentiated from pluripotent stem cells are subcultured
  • aged hepatocytes are, for example, subcultured for 25 days or more from pluripotent stem cells (for example, iPSC). It is a cell in which hepatocytes that have undergone the above passage have been subcultured at least once.
  • aged hepatocytes are, for example, hepatocytes isolated from human tissues aged 65 years or older in the case of humans.
  • hepatocytes are cells subcultured from primary cultured hepatocytes isolated from living tissue, "aged hepatocytes" are, for example, in the case of humans, hepatocytes cultured for 20 days or more after isolation. Is.
  • Hepatocytes may be of human origin, but are not limited to humans, but mammals such as mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, pigs, cats, dogs, sheep, cows, horses, goats, and monkeys. It may be derived from.
  • aging By culturing hepatocytes in a medium containing a drug that causes histone hyperacetylation, aging can be suppressed and plasticity can be increased.
  • the medium it is preferable to use the medium described in 2 (the medium used for induction (reprogramming) from hepatocytes to hepatic progenitor cells). That is, as the basal medium, SFD medium (described in WO2016093222), (DMEM / F12, DMEM, IMDM, RPMI1640, Williams' Medium E) and the like can be used, and members of the FGF family may be added to the basal medium.
  • SFD medium described in WO2016093222
  • DMEM / F12, DMEM, IMDM, RPMI1640, Williams' Medium E members of the FGF family may be added to the basal medium.
  • the concentration of FGF family members in the medium may be adjusted as appropriate.
  • the concentration of FGF2 is usually preferably 0.01 to 1000 ng / mL, preferably 0.1 to 100 ng / mL, and more preferably 0.1 to 100 ng / mL. It is 1 to 50 ng / mL.
  • the medium may be a serum-containing medium or a serum-free medium, but in the examples described later, a serum-free medium was used.
  • hepatocytes are seeded on a gel and cultured.
  • the gel used is not particularly limited, but GFR Matrigel (manufactured by Corning) or the like can be used.
  • Hepatocytes may be cultured on a container coated with a main component of tissue basement membrane such as laminin.
  • the temperature at the time of culturing is not particularly limited, but is preferably 30 to 40 ° C, more preferably 37 ° C.
  • the culture period is not particularly limited, but it is preferably 4 to 15 days, and more preferably 5 to 10 days.
  • the present invention enables mass production of hepatocytes and bile duct cells from pluripotent stem cells (eg, iPS cells, etc.).
  • pluripotent stem cells eg, iPS cells, etc.
  • the human hepatocytes and the like created by the method of the present invention can be applied to industrial applications such as drug metabolism tests, hepatotoxicity tests, and hepatitis virus infection tests in vitro.
  • the human hepatocytes and the like created by the method of the present invention include the following. 1.
  • Hepatocytes produced by a method for producing hepatocytes which comprises differentiating endometrial cells into hepatocytes in the presence of FGF family members, HGF, IL6 family members and dexamethasone.
  • Alphafet protein which is produced by a method for producing hepatic progenitor cells, which involves culturing hepatocytes in the presence of members of the FGF family, and has a proliferative ability and a bidirectional differentiation ability into hepatocytes and biliary epithelial cells.
  • AFP Negative hepatocytes. Cells induced to differentiate from 3.2 hepatic progenitor cells (eg, hepatocytes, bile duct cells).
  • the human hepatocytes and the like created by the method of the present invention can be used in regenerative medicine as the main component of the composition for transplantation.
  • the hepatocyte transplantation site may be any site as long as it can be transplanted, and examples thereof include intracranial, mesenteric, liver, spleen, kidney, subcapsular, and portal vein.
  • the number of hepatocytes per 1 cm 2 of transplantation site is preferably 100,000 to 100000000, preferably 1000000 to 50000000, and more preferably 1000000 to 10000000.
  • EGF, HGF, ROCK inhibitor, TGF- ⁇ receptor inhibitor, GSK-3 ⁇ inhibitor, etc. may be used.
  • the composition for transplantation may contain an agent (described above) that increases the plasticity of hepatocytes.
  • human hepatocytes and the like created by the method of the present invention can be transplanted into non-human animals to produce chimeric animals.
  • Non-human animals eg, mice
  • Non-human animals eg, mice
  • drug metabolism tests and safety tests of drug discovery compounds can be performed.
  • Non-human animals should have liver failure. Liver failure can be induced by administration of ganciclovir.
  • the transplanted hepatic progenitor cells can proliferate and / or differentiate in the non-human animal.
  • liver regeneration in non-human animals is promoted.
  • non-human animals include mice and rats.
  • the site of transplantation and the number of hepatocytes used for transplantation may be the same as in the case of transplantation into humans.
  • the present invention provides a liver regeneration-promoting agent containing a drug that causes histone hyperacetylation as an active ingredient.
  • the present invention provides a method of promoting liver regeneration, which comprises administering to a subject a pharmaceutically effective amount of a drug that results in histone hyperacetylation.
  • the agents that cause histone hyperacetylation have been described above. Drugs that result in histone hyperacetylation can promote the regeneration of liver damage.
  • Liver disorders are viral hepatitis (due to hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis D virus, hepatitis E virus infection), alcoholic hepatitis, autoimmune hepatitis, primary liver cirrhosis. , Drug-induced hepatitis, fatty liver (alcoholic, non-alcoholic), surgical liver resection, traumatic liver damage, aging, liver fibrosis, liver damage associated with obesity, etc. Drugs that result in histone hyperacetylation can be used as pharmaceuticals in the treatment and / or prevention of these diseases and disorders.
  • the agent that results in histone hyperacetylation may be in the form of salts or solvates.
  • a drug that causes histone hyperacetylation can be administered to a subject (human or animal) as a pharmaceutical preparation (for example, injection, capsule, tablet, powder, granule, etc.) in which a drug that causes histone hyperacetylation is formulated by a conventional method.
  • the amount of active ingredient is about 10 to 100,000 mg / kg (body weight) per day, preferably about 100 to 10000 mg / kg per day.
  • the dose of (body weight) may be administered orally or parenterally (for example, nasal, rectal, transdermal, subcutaneous, intravenous, intramuscular, etc.) in one or several divided doses. The number of times can be appropriately changed depending on the symptoms, age, administration method and the like.
  • a drug other than NaB that causes histone hyperacetylation when used, it is preferable to use it at a dose that has the same effect as NaB at the above dose.
  • a carrier such as distilled water or physiological saline
  • a carrier such as distilled water or physiological saline
  • a carrier such as distilled water or physiological saline
  • a carrier such as distilled water or physiological saline
  • a carrier such as distilled water or physiological saline
  • the content of the active ingredient in the formulation can vary from 1 to 99% by weight.
  • a disintegrant such as sodium hydrogen carbonate or sodium alginate.
  • the content of the active ingredient in the formulation can vary from 1 to 99% by weight.
  • liver transplantation from the elderly is usually less regenerative.
  • Hepatocyte plasticity plays a crucial role in liver regeneration and declines with aging.
  • the underlying principle underlying this decline is unclear.
  • hepatocytes hiPSC-Hep
  • hiPSC-Hep hepatocytes
  • FGF2-MAPK-EZH2 FGF2-MAPK-EZH2
  • impaired plasticity of aging hepatocytes was strongly correlated with histone hypoacetylation.
  • histone deacetylase significantly improved the plasticity of aged hiPSC-Hep and primary human hepatocytes. And this effect increased the reproliferative capacity of aged primary human hepatocytes in the liver injury model. Therefore, histone hypoacetylation associated with aging impairs hepatocyte plasticity, and histone acetylation can be a therapeutic target for improving liver regeneration in the elderly.
  • liver regeneration is a unique phenomenon in which the liver regenerates new tissue and replaces it with lost parts (dead cell masses, tissues). Because of this phenomenon, the liver appears to be a non-aging organ (Timchenko, 2009).
  • clinical reports show that aging is a major risk factor for liver disease, including non-alcoholic fatty liver disease, alcoholic liver disease and hepatitis C (Kim et al., 2015), and aging.
  • Liver transplantation from a person results in poor survival and overall poor results compared to transplantation from a young donor (Durand et al., 2019; Germani et al., 2012). These facts indicate that aging can weaken the regenerative capacity of the liver.
  • Hepatocytes occupy 70% or more of the liver mass. And the accumulated evidence suggests that hepatocyte plasticity plays a crucial role in maintaining liver regeneration (Kopp et al. ,; Li et al., 2016).
  • Series trace experiments in mice have shown that in response to liver injury, hepatocytes can convert to progenitor-like cells to replace lost stem and bile duct cells (Tarlow et al., 2014). Yanger et al., 2014; Yanger et al., 2013).
  • progenitor cell-like cells were also detected in cirrhotic human liver (Deng et a., 2018).
  • hepatocytes In order to elucidate these intrinsic relationships, an ideal series of experimental samples of hepatocytes must have the same origin. That is, it is necessary to collect from the same human individual at different ages. However, it is difficult to obtain such hepatocytes from the same donor. Over the past decade, extensive progress has been made in inducing differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with the aim of applying them to regenerative medicine and disease modeling (Stadtfeld and Hochedlinger, 2010; Study et al., 2015). , Some laboratories have adopted methods that allow the use of hiPSCs to model neurodegenerative diseases associated with aging (Miller et al., 2013; Vera et al, 2016).
  • hiPSCs human induced pluripotent stem cells
  • hiPSC-derived hepatocytes that can effectively reproduce the biological aging process have not been reported to date. This is partly due to the extremely rapid denaturation of hiPSC-Hep (Nie et al., 2018).
  • hiPSC-Hep hiPSC-derived hepatocytes
  • HDACi histone deacetylase inhibitors
  • hiPSC-Hep Compared to the hiPSC-Hep (K-Hep and ST-Hep) (Kajiwara et al, 2012; Si-Tayeb et al., 2010) obtained by conventional protocols, these newly created hiPSC-Hep ( N-Hep) is characterized by enhanced expression of liver-specific genes as well as ALB secretion (Figs. 1-2H and 1-2I). Therefore, this study provides a simple and convenient protocol for creating hiPSC-Hep with improved liver function.
  • N-Hep retained cell morphology and liver function for extended periods of time ( Figures 1-1 D and 1-2). J). That is, until day 72 of cell culture, we observed the formation of multinucleated cells with reduced ALB secretion ( Figures 1-1 D and 1-2 J). On day 82 (D82), N-Hep lost its hepatocyte morphology and showed a high proportion of apoptotic cells (Fig. 1-2 K). On the other hand, we noticed that the cell volume of N-Hep increased during culture.
  • N-Hep Essential Functions of FGF2 in Inducing Plasticity in Human Hepatocytes
  • BM + SMs basal medium
  • roche hepatocytes containing the previously described small molecule cocktails. Can be) (Katsuda et al., 2017).
  • liver progenitor cells proliferative hepatocytes
  • pHC proliferative hepatocytes
  • D22-pHC showed higher transcription of liver-stem / progenitor cell-related genes (Fig. 2-1 F) and down-regulation of liver function-related genes (Fig. 2-1 G).
  • D22-pHC showed positive staining for HNF4A, SOX9 and CK19, but not for ALB and AFP (Fig. 2-1 H, 2-2 E and 2-2 F).
  • PD0325901 and LY294002 To determine how FGF2 induces hepatocyte proliferation, we incubated cells with PD0325901 and LY294002 to block the MAPK and PI3K signaling pathways, respectively. These are signaling cascades downstream of FGF2 and are involved in cell proliferation (Goetz and Mohammadi, 2013). Notably, PD0325901, not LY294002, suppressed FGF2-mediated cell proliferation in a dose-dependent manner (Fig. 2-1I). Combining transcriptome analysis and protein-protein interaction network analysis (Jensen et al., 2009), we found that EZH2 is present in the central node of all up-regulated genes in the cell cycle. We found that the gene cluster and the gene cluster for epithelial-mesenchymal transition were linked (Fig.
  • RM-treated cells showed a clear upregulation of EZH2 transcription suppressed by PD0325901 ( Figures 2-1J and 2-2H).
  • DZNep 3-deazaneplanosin A hydrochloride
  • D22-pHC dichotomy Next, we evaluated the dichotomy of pHC. To induce hepatocyte differentiation, we cultured D22-pHC in a newly developed HDM. After 15 days, the differentiated cells showed restricted ALB production and atypical morphology ( Figures 3-2 A and B). To enhance the differentiation process, we HDM by adding retinoic acid (RA; Figure 3-1 A), a vitamin A metatransformer that mediates liver development and regeneration (Negishi et al., 2010). was finally obtained with significant improvement in ALB production and typical hepatocyte morphology (Fig. 3-2 AC). D22-pHC-derived hepatocytes (D22-pHC-Hep) showed a clear increase in functional gene expression as well as ALB secretion.
  • RA retinoic acid
  • D22-Hep formed tight junctions between its cells and acquired ammonia excretion and liver function (ICG uptake and excretion, glycogen storage, and low density lipoprotein uptake) ( Figure 3-). 1 D, E and 3-2 E).
  • Fig. 3-1H transmission electron microscopy reveals the characteristics of mature bile ducts of these cysts, including lumens with apical and lateral floor cell membranes, microvilli, primary cilia on the apical membrane, tight junctions and polyvesicles. It was shown to have (Fig. 3-1 I and 3-2 I).
  • bile duct cells also had bile duct function: 1) Transport of Rhodamine 123 into the lumen; this function was blocked by verapamil, an inhibitor of the multidrug-resistant protein 1 transporter (Fig. 3-). 1 J and K), and 2) Bile acid is specifically excreted from the lumen (Fig. 3-2 J). Therefore, these data showed that D22-Hep (young N-Hep) had sufficient plasticity to allow the induction of a proliferative state with dichotomy.
  • Acetyl-CoA is also a key node linking metabolomics to epigenetics as an acetyl source for histone acetylation (Sebastian and Mostoslavsky, 2017). Therefore, we see changes in histone acetylation due to aging. Was analyzed quantitatively. Notably, the aging N-Hep showed a decreasing trend of H3 histone acetylation at the respective Lys residues of H3K9, H3K18 and H3K27 (Fig. 4-1 F and 4-2 EG). .. On the other hand, these three histone modifications by acetylation were clearly correlated with their induced pHC proliferative capacity (Fig. 4-1 G). These findings suggest that metabolic defects associated with aging are associated with histone hypoacetylation, which may impair hepatocyte plasticity (Fig. 4-2 H).
  • HDACi histone deacetylase inhibitors
  • Trany histone demethylase inhibitor
  • RG108 DNA methyltransferase inhibitor
  • BIX01294 It was not detected by stimulation with BIX, histone methyltransferase inhibitor), etc.
  • Fig. 4-1 H and I Furthermore, while D52-pHC (pHC derived from D52-Hep) acquired the ability to continuously proliferate and differentiate into hepatocytes and bile duct cells, stimulation with HDACi improved the plasticity of D52-Hep. It was clear (Fig. 4-3 BF).
  • FGF2-activated EZH2 transcription plays a decisive role in the proliferation of proliferative hepatocytes (pH C) (Fig. 2-1 I, J and 2-). 2 GJ).
  • transcription of activated EZH2 was much lower in the reprogrammed D52-Hep (D52-pHC) than in the reprogrammed D22-Hep (D22-pHC) (Fig. 4-3).
  • stimulation with HDACi enhances EZH2 transcription and promotes the proliferation of D52-pHC induced from D52-Hep (Fig. 4-1K and 4-3H), and D52-pHC becomes D52-Hep.
  • mice transplanted with 78Y-PHH or 78Y-pHC tested positive for human ALB (hALB), human A1AT (hA1AT) and human ferritin (hFerritin) assays, but in human AFP. Few were positive, on the other hand (hAFP; Figure 6-1 AC and 6-2 A).
  • hALB production in the 78Y-pHC graft was much higher than that in the 78Y-PHH graft (Fig. 6-1G). Since a significant decrease in liver function gene expression was observed during the induction of plasticity (Fig. 5-2B and 6-2E), we investigated whether the transplanted PHH-pHC matured in vivo. Twelve weeks after transplantation, Q-PCR with human gene-specific primers showed that transplanted PHH-pHC showed significant recovery in expression of liver function genes (particularly CYP450 enzymes) and down-regulation of CK19. (Fig. 6-2E).
  • HDAC inhibitors improve the induction of pHCs in older models.
  • HDAC inhibitors could improve the induction of hepatic progenitor cells in older models.
  • Young and aged mice were fed a choline-deficient, ethionine-supplemented (CDE) diet for 21 days to induce hepatic progenitor cells in mice.
  • CDE choline-deficient, ethionine-supplemented
  • Detection of GOT and GPT showed that chronic liver damage occurred in young and aged mice, and that the liver of the mouse model exhibited features of non-alcoholic fatty liver disease (Fig. 6-3 AC).
  • the survival rate of the older model was only 60%, revealing that the induction of Ki67-positive and Epcam-positive cells in the older model was significantly lower than that in the younger model, which in the mouse liver.
  • liver aging is a normal physiological process in which hepatocytes gradually lose the function and plasticity required for homeostasis (Timchenko, 2009).
  • the development of strategies for liver disease associated with aging and for improving liver regeneration in the elderly has been hampered by a lack of understanding of the mechanisms by which aging controls hepatocellular plasticity.
  • hiPSC differentiation induction technology we created young and aged hepatocytes with the same genetic background. This preparation helped us to show that histone hypoacetylation associated with aging impairs hepatocyte plasticity.
  • up-regulation of histone acetylation can significantly improve the plasticity of aged hepatocytes.
  • pHC From aged PHH (from a 78-year-old donor). And in the liver injury model, this pHC showed greater reproliferative capacity than that of the original aging PHH.
  • aging PHH grafts Compared to young PHH grafts in our liver injury model, aging PHH grafts produced lower amounts of human liver protein, thus recreating the differences in clinical outcome between young and aging grafts. Notably, the upregulation of histone acetylation significantly promoted the proliferation of aging PHH. And aging PHH showed a significant improvement in regenerative ability. This suggests that transplantation of aged-derived grafts (which effectively activates or promotes hepatocyte-specific proliferative potential) must improve graft survival and clinical outcome. ..
  • the aging process is always characterized by dynamic changes and epigenetic alterations in the metabolic process (Peleg et al., 2016; Ren et al., 2017), but how these changes regulate cell function. It remains a mystery in the field of liver research (Horvath et al., 2014; Sato et al., 2017).
  • hepatocyte senescence has been found to be associated with reduced metabolic function, which affects the regulation of acetyl-CoA-mediated histone acetylation, thereby causing damage to hepatocyte plasticity.
  • EZH2 transcription activated by FGF2 is required to induce plasticity in human hepatocytes, and an EZH2 enhancer in aged hepatocytes. It has been found that hypoacetylation of these cells impairs the plasticity of those cells.
  • calorie restriction can reverse the decline in aging dependence on histone acetylation and activate cell cycle gene transcription (Sato et al.). , 2017) Until this study was completed, there was no suitable method for enhancing histone acetylation by improving cell metabolism in a culture dish.
  • aging In addition to jeopardizing homeostasis and controlling liver regeneration, aging also plays a crucial role in the development of liver disease (Kim et al., 2015). Decreased mitochondrial function during aging has been reported to increase vulnerability to injury (Kim et al., 2015), and aging is an unfavorable outcome of alcoholic hepatitis, and a prophecy of fibrosis progression in hepatitis C. (Forrest et al., 2005; Poynard et al., 2001). In this study, we demonstrated that hiPSC-Hep can reproduce the aging process of the liver.
  • hiPSC-Hep tends to express genes that promote angiogenesis and fibrosis (Fig. 1-2M), aging and liver. It suggests that hiPSC-Hep may be useful for revealing the deep link between fibrosis and for developing effective therapeutic strategies for aging-related liver disease.
  • cAMP stimulates the secretory and proliferative capacity of the rat intrahepatic biliary epithelium through changes in the PKA / Src / MEK / ERK1 / 2 pathway. Journal of hepatology 41, 528-537. Fry, M., Silber, J., Loeb, LA, and Martin, GM (1984).
  • Liver retransplantation Liver transplantation official publication of the American Association for the Study of Liver Diseases and the International Liver Transplantation Society 13, 227-233. Vera, E., Bosco, N., and Studer, L. (2016). Generating Late-Onset Human iPSC-Based Disease Models by Inducing Neuronal Age-Related Phenotypes through Telomerase Manipulation. Cell reports 17, 1184-1192. Yanger, K., Knigin, D., Zong, Y., Maggs, L., Gu, G., Akiyama, H., Pikarsky, E., and Stanger, BZ (2014).
  • Adult hepatocytes are generated by self- duplication rather than stem cell differentiation.
  • PHH culture The cryopreserved PHH was thawed according to the manufacturer's instructions.
  • PHH was placed on a type I collagen-coated culture dish at a density of 1x10 5 cells / cm 2 , 5% FBS, 1 ⁇ M dexamethasone, 100 IU / mL penicillin (Thermo Fisher Scientific), Cultured using Williams E medium containing 100 ⁇ g / mL Streptomycin (Thermo Fisher Scientific), 4 ⁇ g / mL Human Recombinant Insulin (Sigma), 2 mM GlutaMAX TM (Thermo Fisher Scientific) and 15 mM HEPES (Sigma). ..
  • TK-NOG mice Adult mouse 7-9 week old TK-NOG mice were used in this study (Hasegawa et al., 2011).
  • ganciclovir 50 mg / kg, Mitsubishi Tanabe Pharma
  • mice were housed in a specific pathogen-free animal facility with controlled temperature and light (12-hour light / dark cycle) and bred according to Yokohama City University guidelines for laboratory animal use. All experimental procedures were approved by the Clinical Research Review Committee of the Animal Experiment Center, Yokohama City University School of Medicine (No. 075).
  • Step I endoderm differentiation
  • HiPSC clones were differentiated into endoderm cells for 7 days on plates coated with GFR Matrigel or laminin 511 using medium consisting of RPMI 1640, 1% B27, 50 ng / mL WNT3A and 100 ng / mL activin A. ..
  • 10 ⁇ M Y-27632 was added, and from day 1 to day 3 0.5 mM NaB was added. The medium was changed daily.
  • Step II (Differentiation and maturation into hepatocytes ) HiPSC endoderm cells were isolated from the plate using 0.05% trypsin / EDTA (Gibco). Plates coated with GFR Matrigel or Laminin 511 were then reseeded at a density of 1.5-2 x 10 5 cells / cm 2 using nicotinamide-free liver differentiation medium (HDM). From day 8 to day 10, medium was changed daily to HDM. From the 11th day, the medium was changed every 2 days.
  • HDM nicotinamide-free liver differentiation medium
  • This HDM consisted of SFD containing 10 ng / mL FGF2, 20 ng / mL HGF, 10 ng / mL OSM, 100 nM dexamethasone and 10 mM nicotinamide.
  • the control hiPSC-Hep was differentiated according to the published protocol with minor modifications (Kajiwara et al., 2012; Si-Tayeb et al., 2010).
  • proliferative Hepatocytes were harvested with 0.05% trypsin / EDTA and coated with GFR-Matrigel or Laminin 511. Was seeded with RM at a density of 1 x 10 4 cells / cm 2. On days 1 and 3, the medium was replaced with Y-27632-free RM.
  • Time-lapse of hepatocyte proliferation induced from one cell D22-Hep was seeded on a plate coated with GFR-Matrigel (with RM) at a density of 500 cells / cm 2. After incubation for 4 hours, phase contrast imaging was performed using a BZ9000 all-in-one fluorescence microscope (Keyence) and images were obtained every 24 hours.
  • Cell Counting Kit-8 Assay The Cell Counting Kit-8 was used to determine cell viability on the indicated date according to the instructions for use.
  • pHC cell population doubling time pHC was seeded at a density of 5000 cells / cm 2 on a plate coated with GFR-Matrigel. After incubation for 4 hours, the medium was replaced with fresh medium and the number of adherent cells was counted by using Incell analyzer 2000 in combination with Hoechst 33342 staining. Cell counts were also counted at: 24 hours, 48 hours and 72 hours. The cell population doubling time was calculated using GraphPad Prism according to the number of cells at each time point.
  • Hepatocyte differentiation from pHC begins at the time of about 90% confluence.
  • the medium was replaced with HDM containing 3 ⁇ M RA for 8 days and then with HDM without RA for the next 7 days.
  • the medium was changed every 2 days.
  • the total hepatocyte differentiation period was 15 days.
  • Bile duct cell differentiation from pHC pHC obtained by inducing plasticity during passage or at some point during aging was suspended in RM at a density of 1 x 10 6 cells / mL.
  • a total of 5,000 pHCs mixed with 50 ⁇ L GFR-Matrigel were seeded as mount drops on untreated 24-well plates and incubated at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 30 minutes.
  • the wells were then filled with 700 ⁇ L of Bile Duct Cell Differentiation Medium (CDM).
  • CDM Bile Duct Cell Differentiation Medium
  • This CDM is 10 ng / mL EGF, 20 ng / mL HGF, 50 ng / mL WNT3A, 100 ng / mL R-Spondin-1, 50 ng / mL FGF10, 3 ⁇ M RA, 10 ⁇ M Y-27632 and 10 ⁇ M. It consisted of SFD containing forskolin. Medium was changed every 3 days and the relevant analysis was performed on day 10.
  • Detection of intracellular senescence-related ⁇ -galactosidase and ROS CellROX TM Deep Red Reagent was used to detect the activity of senescence-related ⁇ -galactosidase (SA- ⁇ -Gal) using a cell senescence detection and quantification kit, and according to the manufacturer's instructions. Intracellular ROS was analyzed using. Photographs were taken using a Leica TCS SP5 confocal microscope (Leica).
  • Acetyl-CoA Assay Cells were isolated from the plate using a cell lysis buffer to determine acetyl-CoA levels in hiPSC-Hep. Acetyl-CoA concentration was measured using the Acetyl-Coenzyme A Assay Kit according to the manufacturer's instructions. The resulting values were normalized using the corresponding protein concentrations.
  • Indocyanine green uptake and excretion Indocyanine green (ICG) dry powder (Daiichi Sankyo) (10 mg) was dissolved in 10 mL of hepatocyte culture medium to obtain 1 mg / mL stock solution. Cells were suspended or seeded and incubated with ICG for 4 hours at 37 ° C. in a humidified incubator with a CO2 concentration of 5%. The cells were then washed 3 times with phosphate buffered saline (PBS) and incubated in fresh HCM (hepatocyte culture medium BulletKit TM HCM TM ) for an additional 2 hours to measure ICG excretion. Images were taken using a BZ9000 all-in-one fluorescence microscope.
  • ICG Indocyanine green
  • Periodic acid-Schiff staining and low-density lipoprotein uptake Glycogen was detected using periodic acid-Schiff (PAS) staining as directed by the manufacturer. That is, the cells were washed with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes at room temperature. After washing with PBS, cells were oxidized in 0.5% periodic acid solution for 7 minutes, washed with PBS and incubated in Schiff's reagent for 15 minutes. After three 2-minute incubations in sulfite water, cells were washed with PBS and visualized with a BZ9000 all-in-one fluorescence microscope.
  • PBS periodic acid-Schiff
  • Rhodamine 123 transport assays and coryl-lysyl-fluorescein (CLF) transport assays were performed according to previously described methods (Sampaziotis et al., 2015).
  • Rhodamine 123 transport assay bile duct cells were incubated at 37 ° C. for 30 minutes in the presence or absence of 10 ⁇ M verapamil. The cells were then incubated with 100 ⁇ M Rhodamine 123 at 37 ° C. for 5 minutes and washed 3 times with IMDM. Fresh CDM was added and incubated at 37 ° C for an additional 40 minutes.
  • bile duct cells were loaded with 5 ⁇ M CLF or 5 ⁇ M FITC at 37 ° C. for 30 minutes, then the cells were washed 3 times with IMDM. Fresh CDM was added and incubated at 37 ° C for an additional 10 minutes. Photographs were taken using a Leica TCS SP5 confocal microscope.
  • Flow Cytometry Antibodies used for flow cytometry are as follows: PE-mouse anti-human CXCR4, BV421 mouse anti-human CD117, APC mouse anti-human EpCAM, rabbit anti-H3K9ac, rabbit anti-H3K14ac, rabbit anti-H3K18ac, rabbit anti H3K27ac, Rabbit Anti-H3K56ac, and Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) Alexa Fluor 647. Cells were captured by the MoFlo Astrios system (Beckman Coulter).
  • Chromatin immunoprecipitation combined with quantitative PCR
  • the procedure performed was in accordance with the manufacturer's instructions. That is, 3 x 10 6 cells were crosslinked in 1% formaldehyde for 10 minutes and in 1 x glycine for 5 minutes at room temperature, recovered by scraping, centrifuged, and resuspended in lysis buffer. DNA was digested to a length of approximately 150-900 bp fragments by micrococcal nuclease. A bioruptor carboxylator (Cosmo bio) was used to disrupt the nuclear envelope and release DNA fragments. Samples were immunoprecipitated overnight at 4 ° C.
  • ALT serum alanine aminotransferase
  • AST aspartate aminotransferase
  • RNA Isolation and Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Total RNA was isolated using the PureLink TM RNA Mini Kit. RNA ( ⁇ 2 ⁇ g) was used as a template for synthesizing single-stranded cDNA using the high-performance cDNA reverse transcription kit according to the manufacturer's instructions. Q-PCR was performed using cDNA and specific primers and probes from the universal probe library. The primers and probes used in this study are listed in the table below. All data were calculated by the ⁇ CT method using ⁇ -ACTB (Thermo Fisher Scientific) as a normalized control.
  • ⁇ -ACTB Thermo Fisher Scientific
  • Liver tissue samples were embedded in OCT (optimal cutting temperature) compound (Sakura Finetech Japan), 5 ⁇ m sections were prepared, and placed on MAS-GP type A coat slides (Matsunami glass). Mounted.
  • OCT optical cutting temperature
  • sections or cultured cells were fixed in 4% paraformaldehyde solution dissolved in PBS for 10 minutes, washed 3 times with PBS, and dissolved in PBS containing 0.3% Triton X-100, 10% ECL. It was blocked for 30 minutes using a prime blocking agent and then washed 3 times with PBS. The sections or cells were then incubated overnight at 4 ° C. with the primary antibody in blocking buffer.
  • Sections or cells were washed 3 times with PBS and incubated with fluorescently labeled secondary antibody for an additional 60 minutes at room temperature. Finally, the sections or cells were washed 3 times with PBS and covered with a mounting solution containing DAPI. Fluorescence was detected using a Zeiss Axio Imager M1 microscope (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany). Antibodies used for immunofluorescence staining are as follows: rabbit anti-human AFP (1: 100), goat anti-human ALB (1: 100), mouse anti-human CK19 (1:50), rabbit anti-human A1AT (1).
  • RNA for gene expression profiling was hybridized using SurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K (Agilent Technologies) according to the manufacturer's instructions. The data was normalized using GeneSpring.
  • the present invention can be used for mass production of hepatocytes and bile duct cells.
  • the human hepatocytes and the like created by the present invention can be used for drug metabolism tests, hepatotoxicity tests, hepatitis virus infection tests, regenerative medicine, bioartificial liver, etc. in vitro.
  • a chimeric animal in which human hepatocytes are replaced with human hepatocytes created by the present invention can be produced, and by using this chimeric animal, drug metabolism tests and safety tests of drug discovery compounds become possible.
  • liver regeneration can be promoted by using a drug that causes histone hyperacetylation.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

従来技術の欠点を克服できる肝前駆細胞の誘導法及び肝前駆細胞を提供すること。肝細胞の可塑性や老化を制御する。FGFファミリーのメンバー、HGF、IL6ファミリーのメンバー及びデキサメタゾンの存在下で、内胚葉細胞を肝細胞に分化させることを含む、肝細胞の作製方法。前記の方法により作製され、90日以上肝細胞としての機能を持って、生存できる肝細胞。FGFファミリーのメンバーの存在下で、肝細胞を培養することを含む、肝前駆細胞の作製方法。前記の方法により作製され、増殖能と肝細胞・胆管上皮細胞への二方向の分化能を持つ、アルファフェトプロテイン（AFP）陰性の肝前駆細胞。前記の肝前駆細胞を肝細胞に分化誘導することを含む、肝細胞の作製方法。前記の肝前駆細胞を胆管細胞に分化誘導することを含む、胆管細胞の作製方法。ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤により、肝細胞の老化を抑制する方法。ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を有効成分として含む、肝細胞の老化抑制剤。ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤により、肝細胞の可塑性を増大させる方法。ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を有効成分として含む、肝細胞の可塑性を増大させる剤。前記の肝細胞、前記の肝前駆細胞及び前記の肝前駆細胞から分化誘導された細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞を非ヒト動物に移植することを含む、キメラ動物の作製方法。前記の肝細胞、前記の肝前駆細胞及び前記の肝前駆細胞から分化誘導された細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞を含む、移植用組成物。前記肝前駆細胞を胆管細胞に分化誘導するために使用される培地に使用するための、FGF10、レチノイン酸およびフォルスコリンを含有する剤；および該剤を該分化誘導に使用される培地に使用することの説明書；を含む、該分化誘導における培地用キット。前記肝前駆細胞を胆管細胞に分化誘導するための、FGF10、レチノイン酸およびフォルスコリンを含有する培地。ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を有効成分として含む、肝再生促進剤。

Description

肝細胞の可塑性誘導法
　本発明は、肝細胞の可塑性誘導法に関する。
　肝臓組織の約70%は肝細胞である。肝細胞の可塑性は、肝再生能力を維持するための大事な役割を果している(Nat Cell Biol.18(3):238-45(2016)（非特許文献１）; Hepatology.64(6):2244-6 (2016)（非特許文献２)）。すなわち、マウスにおいて肝障害が生じると成熟肝細胞は増殖性のある肝前駆細胞に転換し、欠損した肝細胞や胆管細胞を修復することが判明している(Cell Stem Cell.15(3):340-9(2014)（非特許文献３）; Cell Stem Cell.15(5):605-18(2014)（非特許文献４）; Cell. 157,1324-38(2014)（非特許文献５）; Genes Dev.27(7):719-24(2013)（非特許文献６）)。また、ヒトの肝硬変時においても同様の肝前駆細胞は検出されている(Cell Stem Cell.23(1):114-22(2018)（非特許文献７）)。さらに、肝臓再生能力は肝細胞の老化状態と関連があり、高齢ドナー由来の肝移植片は、その生着率が顕著に悪いことも示されている(J Hepatol.70(4):745-58 (2019)（非特許文献８）; J Hepatol.57(2):288-96 (2012)（非特許文献９）)。
　T. Ochiyaらは、in vitroにおいてマウスおよびラット肝細胞に対して小分子化合物（YAC, Y-27632, A83-01, CHIR99021）を作用させることにより、成熟肝細胞から増殖能を有する肝前駆細胞を誘導し、20継代以上の培養が可能であることを示している（Cell Stem Cell. 20(1):41-55 (2017)（非特許文献１０））。その後、多くの研究グループがこの培養技術をヒト肝細胞に応用することを試みた。しかしながら、ヒト肝細胞と齧歯動物由来肝細胞の性質の違いは大きく、ヒト肝前駆細胞の誘導を試みても3継代以上の培養は不可能であった（Cell Stem Cell. 23(6):806-819,2018（非特許文献１１）; Cell Research.29,8-22, 2019（非特許文献１２）; J Hepatol.70(1):97-107,2019（非特許文献１３））。また、増殖性のみならず、ヒト肝細胞と胆管細胞へ分化しうる多分化能も維持できておらず、ヒト肝細胞を対象とした可塑性制御に基づく肝前駆細胞の誘導は実現できていなかった。
Nat Cell Biol.18(3):238-45(2016) Hepatology.64(6):2244-6 (2016) Cell Stem Cell.15(3):340-9(2014) Cell Stem Cell.15(5):605-18(2014) Cell. 157,1324-38(2014) Genes Dev.27(7):719-24(2013) Cell Stem Cell.23(1):114-22(2018) J Hepatol.70(4):745-58 (2019) J Hepatol.57(2):288-96 (2012) Cell Stem Cell. 20(1):41-55 (2017) Cell Stem Cell. 23(6):806-819,2018 Cell Research.29,8-22, 2019 J Hepatol.70(1):97-107,2019
　従来技術には以下の欠点がある。
１．齧歯動物由来肝細胞からの肝前駆細胞の誘導方法は、ヒト細胞へ応用することができない。
２．従来法で誘導した肝前駆細胞には、高い増殖能と多分化能がない。
３．ヒト肝細胞の可塑性や老化の制御技術がない。
　本発明は、これらの欠点を克服することを目的とする。
　本発明者らは、iPS細胞由来肝細胞の新規誘導法を見出し、老化マーカーと特徴を徐々に蓄積しながら肝機能を長期にわたって維持できる肝細胞を作製することに成功した。
　また、本発明者らは、齧歯動物由来肝細胞と違い、ヒト肝細胞の可塑性はFGF2-MAPK-EZH2軸によって調節されていることを新たに発見した。すなわち、FGF2添加によりEZH2の転写活性を上昇させることにより、ヒト肝細胞から増殖能・多分化能（肝細胞と胆管細胞へ分化しうる両能性）を有した肝前駆細胞に転換することが可能である一方、老化した肝細胞においては、この可塑性は障害されていることを見出した。
　さらに、本発明者らは、ヒストンアセチル化の低下がこの老化細胞における可塑性獲得の阻害要因であることを明らかにした。そして、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）を選択的に阻害することより、ヒトiPS細胞由来の老化したヒト肝細胞や高齢者（78歳）由来の初代ヒト肝細胞においても可塑性を改善することが可能であることを見出した。これらの老化細胞から人為的に誘導した肝前駆細胞は、生体外培養系において２０回以上の継代培養が可能であり、肝細胞の大量製造への応用が可能である。
　本発明の要旨は以下の通りである。
（１）FGFファミリーのメンバー、HGF、IL6ファミリーのメンバー及びデキサメタゾンの存在下で、内胚葉細胞を肝細胞に分化させることを含む、肝細胞の作製方法。
（２）FGFファミリーのメンバーが、FGF2、FGF1、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22及びFGF23からなる群より選択される少なくとも１つである（１）記載の方法。
（３）IL6ファミリーのメンバーが、オンコスタチン、IL-11、IL-27、IL-35、IL-39、LIF、CT-1、CNTF及びCLCF1からなる群より選択される少なくとも１つである（１）又は（２）に記載の方法。
（４）内胚葉細胞が多能性幹細胞から分化した細胞である（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）内胚葉細胞がヒト由来である（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）（１）～（５）のいずれかに記載の方法により作製され、生体外の単層培養で12日以上アルブミンの分泌能を維持し、生存できる肝細胞。
（７）12日以上アルブミンの分泌能以外の肝細胞としての機能も持って、生存できる（６）記載の肝細胞。
（８）アルブミンの分泌能以外の肝細胞としての機能が、薬物代謝能、インドシアニングリーンの取込みおよび排出、グリコーゲン貯蔵、低密度リポタンパク質の取込み及び遺伝子発現からなる群より選択される少なくとも１つである（７）記載の肝細胞。
（９）老化の特徴を示す（６）～（８）のいずれかに記載の肝細胞。
（１０）老化の特徴が、細胞容量の増大、老化関連遺伝子の発現、炎症性応答の増大、DNA損傷、細胞内活性酸素種レベルの増大、細胞老化関連βガラクトシダーゼレベルの増大、エピジェネティック変化、テロメアの長さの短小化及びミトコンドリア機能の低下からなる群より選択される少なくとも１つである（９）記載の肝細胞。
（１１）FGFファミリーのメンバーの存在下で、肝細胞を培養することを含む、肝前駆細胞の作製方法。
（１２）FGFファミリーのメンバー及びヒストン高アセチル化をもたらす薬剤の存在下で、肝細胞を培養することを含む（１１）記載の方法。
（１３）FGFファミリーのメンバーが、FGF2、FGF1、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22及びFGF23からなる群より選択される少なくとも１つである（１１）又は（１２）記載の方法。
（１４）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である（１２）又は（１３）記載の方法。
（１５）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、Trichostatin A、Tacedinaline (CI-994)、M344、ITSA-1、Sodium valproate、Sodium 4-phenylbutuyrate、Sodium Butyrate (NaB)、valproic acid (VPA)、Abexinostat (PCI-24781)、Belinostat(PXD101)、Citarinostat (ACY-241)、Dacinostat (LAQ824)、Depudecin、Domatinostat (4SC-202)、Droxinostat、Entinostat (MS-275, SNDX-275)、Fimepinostat (CUDC-907)、Givinostat (ITF2357)、Mocetinostat (MGCD0103)、Nexturastat A、Panobinostat (LBH-589,NVP-LBH589)、Pracinostat (SB939)、Quisinostat (JNJ-26481585) 2HCl、Resminostat、Ricolinostat (ACY-1215)、Tucidinostat (Chidamide)、Vorinostat (SAHA)、ACY-738、Apicidin、AR-42、BG45、BML-210、BRD73954、CAY10603、CUDC-101、Curcumin、Depudecin、H1388、HC Toxin、HPOB、LMK-235、MC1568、Oxamflatin、(-)-Parthenolide、PCI-34051、RG2833 (RGFP109)、RGFP966、Romidepsin (FK228, Depsipeptide)、Santacruzamate A (CAY10683)、Scriptaid、SKLB-23bb、Splitomicin、Suberoyl bis-hydroxamic acid、Tasquinimod、TH34、Tinostamustine(EDO-S101)、TMP195、TMP269、Tubacin及びTubastatin Aからなる群より選択される少なくとも１つである（１２）～（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）肝細胞が、多能性幹細胞から分化した細胞、多能性幹細胞から分化した細胞を継代培養した細胞、生体組織から単離された初代培養細胞、生体組織から単離された初代培養細胞を継代培養した細胞又はそれらの組み合わせである（１１）～（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）肝細胞がヒト由来である（１１）～（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）（１１）～（１７）のいずれかに記載の方法により作製され、増殖能と肝細胞・胆管上皮細胞への二方向の分化能を持つ、アルファフェトプロテイン（AFP）陰性の肝前駆細胞。
（１９）肝細胞及び／又は胆管細胞への分化が可能である（１８）記載の肝前駆細胞。
（２０）（１８）又は（１９）記載の肝前駆細胞を肝細胞に分化誘導することを含む、肝細胞の作製方法。
（２１）（１８）又は（１９）記載の肝前駆細胞を胆管細胞に分化誘導することを含む、胆管細胞の作製方法。
（２２）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤により、肝細胞の老化を抑制する方法。
（２３）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤をFGFファミリーのメンバーと組み合わせて用いる、（２２）記載の方法。
（２４）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を有効成分として含む、肝細胞の老化抑制剤。
（２５）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である（２４）記載の剤。
（２６）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、Trichostatin A、Tacedinaline (CI-994)、M344、ITSA-1、Sodium valproate、Sodium 4-phenylbutuyrate、Sodium Butyrate (NaB)、valproic acid (VPA)、Abexinostat (PCI-24781)、Belinostat(PXD101)、Citarinostat (ACY-241)、Dacinostat (LAQ824)、Depudecin、Domatinostat (4SC-202)、Droxinostat、Entinostat (MS-275, SNDX-275)、Fimepinostat (CUDC-907)、Givinostat (ITF2357)、Mocetinostat (MGCD0103)、Nexturastat A、Panobinostat (LBH-589,NVP-LBH589)、Pracinostat (SB939)、Quisinostat (JNJ-26481585) 2HCl、Resminostat、Ricolinostat (ACY-1215)、Tucidinostat (Chidamide)、Vorinostat (SAHA)、ACY-738、Apicidin、AR-42、BG45、BML-210、BRD73954、CAY10603、CUDC-101、Curcumin、Depudecin、H1388、HC Toxin、HPOB、LMK-235、MC1568、Oxamflatin、(-)-Parthenolide、PCI-34051、RG2833 (RGFP109)、RGFP966、Romidepsin (FK228, Depsipeptide)、Santacruzamate A (CAY10683)、Scriptaid、SKLB-23bb、Splitomicin、Suberoyl bis-hydroxamic acid、Tasquinimod、TH34、Tinostamustine(EDO-S101)、TMP195、TMP269、Tubacin及びTubastatin Aからなる群より選択される少なくとも１つである（２５）記載の剤。
（２７）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤がFGFファミリーのメンバーと組み合わせて用いられる、（２４）～（２６）のいずれかに記載の剤。
（２８）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤により、肝細胞の可塑性を増大させる方法。
（２９）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤をFGFファミリーのメンバーと組み合わせて用いる、（２８）記載の方法。
（３０）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を有効成分として含む、肝細胞の可塑性を増大させる剤。
（３１）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である（３０）記載の剤。
（３２）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、Trichostatin A、Tacedinaline (CI-994)、M344、ITSA-1、Sodium valproate、Sodium 4-phenylbutuyrate、Sodium Butyrate (NaB)、valproic acid (VPA)、Abexinostat (PCI-24781)、Belinostat(PXD101)、Citarinostat (ACY-241)、Dacinostat (LAQ824)、Depudecin、Domatinostat (4SC-202)、Droxinostat、Entinostat (MS-275, SNDX-275)、Fimepinostat (CUDC-907)、Givinostat (ITF2357)、Mocetinostat (MGCD0103)、Nexturastat A、Panobinostat (LBH-589,NVP-LBH589)、Pracinostat (SB939)、Quisinostat (JNJ-26481585) 2HCl、Resminostat、Ricolinostat (ACY-1215)、Tucidinostat (Chidamide)、Vorinostat (SAHA)、ACY-738、Apicidin、AR-42、BG45、BML-210、BRD73954、CAY10603、CUDC-101、Curcumin、Depudecin、H1388、HC Toxin、HPOB、LMK-235、MC1568、Oxamflatin、(-)-Parthenolide、PCI-34051、RG2833 (RGFP109)、RGFP966、Romidepsin (FK228, Depsipeptide)、Santacruzamate A (CAY10683)、Scriptaid、SKLB-23bb、Splitomicin、Suberoyl bis-hydroxamic acid、Tasquinimod、TH34、Tinostamustine(EDO-S101)、TMP195、TMP269、Tubacin及びTubastatin Aからなる群より選択される少なくとも１つである（３１）記載の剤。
（３３）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤がFGFファミリーのメンバーと組み合わせて用いられる、（３０）～（３２）のいずれかに記載の剤。
（３４）（６）記載の肝細胞、（１８）記載の肝前駆細胞及び（１８）記載の肝前駆細胞から分化誘導された細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞を非ヒト動物に移植することを含む、キメラ動物の作製方法。
（３５）（６）記載の肝細胞、（１８）記載の肝前駆細胞及び（１８）記載の肝前駆細胞から分化誘導された細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞を肝不全の非ヒト動物に移植することを含む、（３４）記載のキメラ動物の作製方法。
（３６）移植された肝前駆細胞が増殖及び/又は分化する、（３４）又は（３５）記載のキメラ動物の作製方法。
（３７）肝再生が促進する、（３４）～（３６）のいずれかに記載のキメラ動物の作製方法。
（３８）（６）記載の肝細胞、（１８）記載の肝前駆細胞及び（１８）記載の肝前駆細胞から分化誘導された細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞を含む、移植用組成物。
（３９）（１８）又は（１９）記載の肝前駆細胞を胆管細胞に分化誘導するために使用される培地に使用するための、FGF10、レチノイン酸およびフォルスコリンを含有する剤；および該剤を該分化誘導に使用される培地に使用することの説明書；を含む、該分化誘導における培地用キット。
（４０）（１８）又は（１９）記載の肝前駆細胞を胆管細胞に分化誘導するための、FGF10、レチノイン酸およびフォルスコリンを含有する培地。
（４１）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を有効成分として含む、肝再生促進剤。
（４２）ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を医薬的に有効な量で被験者に投与することを含む、肝再生を促進する方法。
　本発明により、老化モデルとなる肝細胞が得られた。
　本発明により、肝細胞に可塑性を誘導することが可能となった。可塑性が誘導された肝細胞（肝前駆細胞）は、肝細胞や胆管細胞に分化させることができる。
　本発明により、老化した肝細胞にも可塑性を誘導することが可能となった
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2019‐177843の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
ヒト人工多能性幹細胞に由来する肝細胞(hiPSC-Hep)を手段とする老化過程の再現。(A) hiPSC-Hepに基づいた新しい戦略による肝細胞への分化、成熟および老化の略図。(B) hiPSCから肝細胞へ分化する間の系列関連遺伝子発現のQ-PCR解析: OCT4 および NANOG (多能性細胞)、SOX17 および FOXA2 (内胚葉)、TBX3 および TTR (肝芽細胞)、ならびに A1AT および ALB (肝細胞)。(C) ALB、AFP、CK19、A1AT、HNF4Aおよび KI67の免疫蛍光染色。(D) 22日(D22)から72日（D72）までのN-Hep（実施例に記載の方法により本発明者らが作製したヒト人工多能性幹細胞に由来する肝細胞）からのALB分泌の、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)に基づく解析(E) トランスクリプトーム解析は、D22-Hep (hiPSCより分化誘導し、継代培養した、全工程で22日経過後の肝細胞であり、図1-1Aにおける「Young Hepatocyte」に相当)および D52-Hep(hiPSCより分化誘導し、継代培養した、全工程で52日経過後の肝細胞)と比較したD72-Hep(hiPSCより分化誘導し、継代培養した、全工程で72日経過後の肝細胞であり、図1-1Aにおける「Old Hepatocyte」に相当)におけるいくつかの遺伝子のアップレギュレーションを示す;大きい点で遺伝子名を表示したもの: 老化関連遺伝子(F) D32 から D72のN-Hep における細胞内 ROS (上段の画像、赤) および SA-β-gal 染色 (下段の画像、緑)の画像(G) D22 から D72のN-Hepにおける細胞内ROS陽性細胞の百分率の数量化。(H) D22 から D72のN-HepにおけるSA-β-gal陽性細胞 の数量化。図1-2と図1-3も参照されたい。 hiPSC-Hepを創出するための2工程プロトコールの開発、hiPSC-Hepの機能の特徴および老化に伴う変化（図1-1に関連）。(A) hiPSC からの2工程肝細胞分化の模式図(B) hiPSC由来胚体内胚葉におけるCXCR4、CD117および EpCAMの発現を示す代表的なフローサイトメトリー特性(C) 工程IIにおいて、表示した培地を用いて分化させた系列におけるALB発現のQ-PCR 解析：“Δ”は“含まない”を意味する; SFD: 無血清限定培地; 6FM：6個の選択された因子を含むSFD；OSM:オンコスタチンM；DEX: デキサメタゾン。(D) 工程IIにおいて、表示した培地を用いて培養した系列におけるALB分泌のELISAに基づくアッセイ。(E) 多重ドナー由来hiPSCクローンからの肝細胞分化の間のALB分泌のELISAに基づくダイナミックアッセイ(F) ALB（赤)、E-カドヘリン(E-CAD) (緑)および zona occludens 1 (ZO-1) (緑)を用いたN-Hepの免疫染色。(G) N-Hep におけるインドシアニングリーン(ICG)取込みおよび排出の分析 (緑)、過ヨウ素酸シッフ染色によるグリコーゲン貯蔵の検出（紫）、およびDil標識アセチルLDL(Dil-Ac-LDL)を用いた低密度リポタンパク質取込みの検査（赤）。(H) N-Hep、K-HepおよびST-Hep（以下に示す従来のプロトコールによって得られるそれぞれのhiPSC-Hepであり、名前の頭文字を用いてK-Hep、ST-Hepと表示した。Kajiwara et al, 2012; Si-Tayeb et al., 2010）における肝関連遺伝子発現のQ-PCR 解析。(I) N-Hep、K-Hep、ST-HepおよびPHHからのALB分泌のELISAに基づくアッセイ。(J) D52-Hep、D62-HepおよびD72-Hepの細胞形態; 四角の枠：多核細胞。(K) D82-Hep の細胞形態(左) および LIVE/DEAD 染色 (右)；白い矢じり：多核細胞。(L) D22からD72におけるN-Hepの平均細胞サイズの数量化。(M) D72-Hepにおける富化された(enriched)パスウェイおよび分子機能に関する遺伝子オントロジー解析。 In vitroとin vivoの肝細胞老化プロセスの比較。(A) 主成分分析により、D22-Hep、D72-Hep、若年者PHH（2か月齢、2M－PHH）および高齢者PHH（78歳、78Y－PHH）の間で遺伝子発現クラスタリングの3次元グラフィック表現を提供する。(B) KEGGパスウェイ分析により、老化と伴に発現が上昇する遺伝子を、D72-Hep、78Y－PHH 及びD22-Hepと2M－PHH 間でそれぞれ比較した。(C) KEGGパスウェイ分析により、老化と伴に発現が減少する遺伝子を、D72-Hep、78Y－PHH 及びD22-Hepと2M－PHH 間でそれぞれ比較した。 FGF2 はD22-Hep中に誘導された増殖を強化する。(A) D22-Hepにおける可塑性の特徴づけの模式的概要。(B) BM、BM + SMs、BM+ FGF2 (F)、またはBM + SMs + F (後者はリプログラミング培地; RM)で培養されたD22-Hepの位相差像（D1 および D6)BMは10 ng/mL EGFおよび 20 ng/mL HGFを含有するSFD培地（WO2016093222に記載）である;　BM＋SMsはBM培地に10 μM Y-27632、0.5 μM A83-01および 3 μM CHIR99021を含有するBM培地である。(C)可塑性誘導6日後の細胞数の数量化；数値はD1の細胞数に対して正規化した。(D)培養前(D0)およびRM中で培養6日後の細胞における細胞周期関連遺伝子の発現のQ-PCR 測定。これらの時点は、図中にそれぞれRM-D0および RM-D6と示している。(E) RM-D0 および RM-D6群の細胞上のKI67 および HNF4A の免疫蛍光染色。 (F) D22-Hep および D22-pHC（実施例に記載の方法により本発明者らが誘導した肝前駆細胞）における肝前駆細胞／幹細胞関連遺伝子であるHNF4A、EpCAM、C-MET、TBX3  および LGR5の発現のQ-PCR 測定。(G) D22-HepおよびD22-pHCにおける肝機能遺伝子であるALB、 A1AT、 TTR、 および RBP4の発現のQ-PCR 解析。(H) D22-pHC の HNF4A、 SOX9、 CK19、 および ALBに対する免疫染色。(I) RMプラスDMSO、PD0325901 (PD、1 μM) または LY2940002  (LY、10 μM) で6日間処理した後の細胞形態の解析；およびRMプラスDMSO、 PD0325901 (0.01、 0.03、0.1、または 1 μM)、または LY290002 (10 μM)中で6日間インキュベートした後の細胞数の数量化; 数値はD1の細胞数に対して正規化した。(J) EZH2 の転写を、指示された条件下でQ-PCR によって測定した。(K) FGF2-MAPK-EZH2 軸がいかにして肝細胞増殖を促進するかを例証する図。図2-2も参照されたい。 FGF2によって活性化されたMAPK-EZH2 軸は、肝細胞の可塑性誘導を促進する。(図2-1に関連)(A) BM+SMs および BM+SMs+F中で継代培養しリプログラミングされた細胞の増殖能のCell Counting Kit-8に基づく解析、および BM+SMs 中で継代培養した細胞の4日目の位相差像。(B) BM+SMsをFGF2 (0、0.1、1または10 ng/ml)で6日間処理した後の細胞数；数値は1日目の細胞数に対して正規化した。(C) 単一細胞レベルにおける誘導された幹細胞増殖のタイムラプスイメージング解析。(D) 異なるhiPSCクローンに由来するD22-HepからのRMを用いた肝細胞増殖の誘導。(E) hiPSC-肝芽細胞 (HB) および増殖性肝細胞 (D22-pHC)上のAFPの免疫蛍光分析。(F) HB およびD22-pHCからのAFP分泌のELISAに基づく解析。(G) D22-Hepと比較した、D22-pHC における豊富化された遺伝子のSTRING 相互作用ネットワーク。(H) D22-Hep、BM+SMs中でリプログラミングされた細胞、およびRM中でリプログラミングされた細胞におけるEZH2発現のQ-PCR解析。(I) DMSOまたは 3-デアザネプラノシンA塩酸塩(DZNep)(0.1 μM) を含むRM中における6日目の細胞数の数量化；数値は1日目の細胞数に対して正規化した。(J) DMSOまたは DZNep (0.1 μM) を含むRM中で培養した細胞における6日目のEZH2発現のQ-PCR解析。(K) RM、RMΔFGF2 (RMからFGF2 を除去) および RM+ DNZep (0.1 μM) に再播種したD22-pHCの4日目における位相差像。(L) RM、RMΔFGF2および RM+ DNZep (0.1 μM) 中で培養したD22-pHCの4日目における細胞数；数値は1日目の細胞数に対して正規化した。 (M) D22-pHCの延長された増殖期間曲線 (P0からP20まで)。これらの結果は、5つの異なるhiPSC（TKDA）に由来するpHCから得た。および継代数20におけるpHCの位相差像。(N) 継代数18におけるD22-pHC(TKDA)の代表的な核型像。 二分化能を有するD22-pHCは肝細胞と胆管細胞に分化する。(A) 上：D22-pHCの肝分化のスケジュール。下：D22-pHC(左) および D22-pHC-由来肝細胞 (D22-pHC-Hep、右)の位相差像(B) D22-Hep、D22-pHCおよび D22-pHC-HepにおけるALB、A1AT、CYP2C9 および CYP2C19の発現のQ-PCR解析。(C) D22-Hep、D22-pHC、D22-pHC-Hep（P1） (継代数1 D22-pHC由来肝細胞)、D22-pHC-Hep（P10） (継代数10 D22－pHC由来肝細胞)および D22-pHC-Hep（P20） (継代数20 pHC由来肝細胞)からのALB分泌のELISAに基づく解析。(D) D22-pHC-Hep中のALB、E-CAD および ZO-1の免疫蛍光分析。(E) D22-pHC-Hep（P1）、D22-pHC-Hep（P20）および D22-Hepにおけるアンモニア排出； 無細胞 (NC) 群は陰性対照。(F) 上：D22-pHCの胆管細胞への分化のスケジュール。下： D22-pHC由来胆管細胞 (D22-pHC-Cho)の巨視的像 (左) および1個の胆管細胞シストの巨視的像 (右)。(G) D22-pHCおよび D22-pHC-ChoにおけるSOX9、HNF6、GGTおよび CFTR発現のQ-PCR 測定。(H) D22-pHC-ChoにおけるCK19、ALB、AFP、F-ACTIN、HNF4Aおよび SOX9の免疫蛍光染色。(I) 胆管細胞シストの透過型電子顕微鏡像：管腔、頂端(赤の矢じり) および側底部(青の矢じり)の細胞膜、および微絨毛(黒の矢じり)を備えたD22-pHC-Choシストの統合された構造； 一次繊毛の部分縦断図(赤の矢印)および軸方向断面(青の矢印)。(J) ベラパミルの不存在下および存在下におけるD22-pHC-Cho シストの管腔内におけるローダミン123蓄積の代表的画像。(K) 上記（J）の画像中の白線に沿った蛍光強度の計算。図3-2も参照されたい。 D22-pHC由来肝細胞および胆管細胞の特徴づけ（図3-1に関連）。(A) HDM および HDM+RA 中でそれぞれ15日間培養したD22-pHCの位相差像。(B) 肝細胞分化中にHDM および HDM+RA に分泌されたALBのELISAに基づくダイナミックアッセイ。HDMは、10 ng/mL FGF2、20 ng/mL HGF、10 ng/mL OSM、100 nM デキサメタゾンおよび 10 mM ニコチンアミドを含有するSFDから成っていた。(C) 多重ドナーhiPSCクローン由来D22-pHCから分化した肝細胞（D22-pHC-Hep）の像。(D) 継代数の異なるD22-pHC(P1、P10および P20)ならびにP5のクローン性D22-pHC (C1)から分化した肝細胞におけるALB、A1AT、CYP2C9 および CYP2C19発現のQ-PCR 解析。(E) D22-pHC-HepにおけるICG 取込みおよび排出 の分析(緑)、過ヨウ素酸シッフ染色によるグリコーゲン貯蔵の検出（紫）、およびDiI-ac-LDLを用いた低密度リポタンパク質取込みの検査（赤）。(F) 胆管細胞シスト形成のタイムラプスイメージング解析。矢じり：1個のD22-pHCがリング状構造体を創出した。(G) 多重ドナーhiPSCクローン由来D22-pHCに由来する胆管細胞(D22-pHC-Cho)の巨視的像。(H) 継代数の異なるD22-pHC(P1、P10および P20)ならびにP5のクローン性D22-pHC (C1)から分化した胆管細胞におけるSOX9、 GGT および CFTR 発現のQ-PCR解析。(I) 胆管細胞におけるタイトジャンクション (青い矢じり)(上) および多胞体(赤い矢じり) (下) の透過型電子顕微鏡像。(J) シスト管腔からの蛍光胆汁酸CLFの活発な搬出、および 対照としてのFITC (フルオレセインイソチオシアネート) 負荷の代表的像。 老化関連ヒストン低アセチル化は、誘導された幹細胞増殖を妨げる。(A) N-Hepの老化と結びついた可塑性の模式的解析。(B) RMで6日間培養後にN-Hepから得た増殖性細胞のヘキスト染色に基づく像。 (C) RMで6日間培養後にN-Hepから得た細胞の数量化；データはD1の細胞数に対して正規化した。(D) アセチルCoA合成関連遺伝子（ACLY、PDHB、ACSS2とCPT1A）のD22-Hep、D52-Hep、 および D72-Hepにおける発現をQ-PCRによって評価した。(E) D22-Hepおよび D52-Hepにおける細胞内アセチルCoAレベルの解析。(F) D22-Hep、D32-Hep、D52-Hepおよび D62-HepにおけるH3K9ac、 H3K18acおよび H3K27acの量の蛍光活性化セルソーティングに基づく解析。(G) H3K9ac (左)、H3K18ac (中) および H3K27ac (右)のレベルの、N-Hepの老化に伴う誘導された増殖速度との相関。(H) 酪酸ナトリウム (NaB)、バルプロ酸(VPA)、トラニルシプロミン（Trany, ヒストン脱メチル化酵素阻害剤）、RG108 (DNA メチルトランスフェラーゼ阻害剤)または BIX01294 (BIX、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤) を D8に添加してRM中で培養したD52-Hepに由来するリプログラミングされた細胞のヘキスト染色に基づくイメージ解析。RM単独で培養した群を対照(Con)とした。(I) NaB、VPA、Trany、RG108またはBIX添加後の増殖速度の倍数変化の数量化。(J) RM (Con)またはRM+NaB (NaBをD8に添加)中で培養されたD52-Hep由来のリプログラミングされた細胞におけるHNF4A (赤) および KI67 (緑)の免疫蛍光アッセイ；HNF4A+KI67+ 細胞の百分率は、右側のグラフに示す。(K) RM (Con)、RM + NaB (NaB)またはRM + VPA (VPA)中で培養されたD52-Hep由来のリプログラミングされた細胞におけるEZH2 発現のQ-PCR解析。(L) D22-Hepおよび D52-HepにおけるEZH2エンハンサー内部でのアセチル化ヒストン結合の、4つのプライマー対(Pr)を手段とするクロマチン免疫沈降およびPCR解析（ChIP-PCR）検出。(M) D62-Hep、D72-Hepおよび D82-Hepにおける肝細胞可塑性誘導のNaB（D8に添加）による促進の数量化：全てのデータは、対応するRM単独群に対して正規化した。RM+NaB 条件でD82-Hepに由来するリプログラミングされた細胞におけるHNF4A (赤) および KI67 (緑)の免疫蛍光染色。図 4-2 および 4-3も参照されたい。 ヒストン低アセチル化は、老化肝細胞における可塑性誘導を損なう。（図4-1に関連）(A) リプログラミングされたD52-Hepの６日目におけるHNF4A (赤) および KI67 (緑)の免疫蛍光分析。(B) リプログラミングされたD82-Hepの６日目におけるHNF4A (赤) および KI67 (緑)の免疫蛍光分析。(C) ベン図(Venn diagram)は、D22-Hepと比較して、D52-Hep および D72-Hepにおけるダウンレギュレーションされた遺伝子(< 0.5倍)の合計数と共通数を示す。  (D) D22-Hepと比較して、D52-Hep および D72-Hepにおいて共通にダウンレギュレーションされた遺伝子(< 0.5倍)のKEGGパスウェイ解析。(E) D22-HepにおけるH3K9ac、 H3K18ac、 H3K27ac、 H3K14acおよび H3K56acのFACSに基づく解析。(F) D22-Hep および D52-Hep におけるH3K9ac、H3K18acおよび H3K27acレベルの比較。(G) 老化中のN-HepにおけるH3K9ac、H3K18acおよび H3K27acの蛍光強度中央値 (MFI)の数量化。(H) 老化hiPSC-Hepにおいてヒストン低アセチル化によって媒介される肝細胞可塑性誘導の悪化の模式的例証。 HDACインヒビターはD52-Hepの可塑性を改善する。（図4-1に関連）(A) 左: NaB (0、0.125、0.25または0.5 mM)を含有するRM 中でD52-Hepからリプログラミングされた細胞の8日目のヘキスト染色に基づくイメージ解析。右：NaB (0、0.125、0.25または0.5 mM)を含有するRMにおける改善されたD52-pHCの細胞増殖の数量化。全ての数値は、NaB=0 群の数値に対して正規化した。(B) D52-pHCの延長された増殖期間曲線(P0 からP10まで)。(C) D52-pHC (左) および D52-pHC由来肝細胞(D52-pHC-Hep、右)の位相差像。(D) D52-pHC-由来胆管細胞の巨視的像(D52-pHC-Cho、左)、および 1個の胆管細胞シストの巨視的像(右)。(E) D52-pHCおよび D52-pHC-Hep におけるALB、A1AT、CYP2C9 および CYP2C19 発現のQ-PCR解析。(F) D52-pHCおよび D52-pHC-Cho におけるSOX9、 HNF6、CFTRおよびGGT 発現のQ-PCR解析。(G) RM処理の前(RM-D0) および後(RM-D6) におけるD22-Hep および D52-HepにおけるEZH2転写の解析。(H) DNZepの存在下または不存在下でRM+NaB (NaB) および RM+VPA (VPA)中でD52-Hepからリプログラミングされた細胞の像：8日目に細胞数をカウントし、1日目の細胞数に対して正規化した。(I) D52-Hep および D52-pHC におけるH3K9ac、H3K18ac および H3K27acレベルのFACSに基づく解析。(J) EZH2プロモーターにおけるヒストンアセチル化結合部位のENCODEデータセットからの解析；GH07J148882 および GH07J148940は最もスコアが高かった2つのEZH2エンハンサーである。(K) 老化した肝細胞の肝細胞可塑性を改善するHDAC インヒビター(HDACi) の模式的図である。 PHHからのpHC形成の誘導。初代ヒト肝細胞（月齢2か月(2M-PHH)、年齢39歳 (39Y-PHH)および 78 歳 (78Y-PHH)のドナー由来のPHH）におけるH3K9ac、H3K18acおよび H3K27acの蛍光活性化セルソーティングに基づく解析。(B) PHHs、N-Hepsおよび pHCsにおけるH3K9ac、H3K18ac および H3K27acの蛍光強度の中央値の数量化。　(C) RM + NaB中で培養したPHHのD1 および D6における位相差像。(D) RMまたは RM + NaBからなる培地でインキュベートしたPHHに誘導された増殖の数量化：データは、D1における各細胞数に対して正規化した。(E) PHHおよび PHH-pHCにおける細胞周期関連遺伝子のmRNA 発現のマイクロアレイ解析。(F) PHHおよび PHH-pHCにおける肝前駆細胞マーカーのmRNA 発現のマイクロアレイ解析。(G) PHH-pHC上のKI67、HNF4A、SOX9、ALB および CK19の免疫蛍光染色。図 5-2も参照されたい。 PHH可塑性の特徴（図5-1に関連）。(A) ラミニン511をコーティングしたプレート上で2M-PHH および 39Y-PHH の可塑性を誘導するにあたり、NaB および FGF2によるPHH-pHCの増殖性改善の定量化。数値は、各RM+NaB群の細胞数によって正規化した。(B) PHHおよび PHH-pHCの間における肝機能特性の比較。(C) 異なるマトリックスをコーティングしたプレート上における2M-PHH-pHCの継代の像。(D) PHH-pHC (左) およびPHH-pHC由来肝細胞の位相差像。(E) PHH-pHCおよび PHH-pHC-Hep におけるALB、A1AT、CYP2C9 および CYP2C19 発現のQ-PCR 解析。(F) PHH-pHC-Hep におけるALBの免疫染色。(G) PHH-pHCからPHH-pHC-Hepへの肝細胞分化の間におけるALB分泌のELISAに基づくアッセイ。(H) PHH-pHC由来胆管細胞の巨視的像(PHH-pHC-Cho、上) および1個の胆管細胞シストの巨視的像 (下)。(I) PHH-pHC および PHH-pHC-Cho における CK19、 SOX9、 HNF6、 CFTR、 AQP1およびSSTR2 発現のQ-PCR 解析。数値はPHH-pHCにおける遺伝子発現に対して正規化した。(J) PHH-pHC-Choのシスト管腔からのCLFの活発な搬出、および 対照としてのFITC負荷の代表的像。蛍光強度は、左側画像内の白線矢印に沿って計算した。 肝傷害マウスモデルにおけるPHH-pHCの生着。(A) 移植後4週目のPHH-Txマウスおよび PHH-pHC-TxマウスにおけるhALB分泌のELISAに基づく解析。(B) 移植後4週目のPHH-Txマウスおよび PHH-pHC-TxマウスにおけるhA1AT分泌のELISAに基づく解析。(C) 移植後4週目のPHH-Txマウスおよび PHH-pHC-TxマウスにおけるhFerritin分泌のELISAに基づく解析。(D) 移植後4週目のPHH-Txマウスおよび PHH-pHC-Txマウスの肝臓におけるhALB、hNUMAおよび hCK19の免疫蛍光アッセイ。(E) 移植後4週目のPHH-Txマウスおよび PHH-pHC-Txマウスの肝臓における生着サイズの数量化。（キャプションの１、２～４、５～９、１０～はクラスターにおける細胞数を示す。）(F) 移植後4週目のPHH-Txマウスおよび PHH-pHC-Txマウスの肝臓におけるhALB+hCK19+ および hALB+hCK19- 生着の数量化。(G) 移植後の78Y-PHH-Txマウスおよび 78Y-pHC-TxマウスにおけるヒトALB分泌のELISAに基づく動態解析（１群につき、n=3）。(H) 移植後12週目の78Y-pHC-Txマウスの肝臓におけるヒトALB、CYP3A4および ZO-1の免疫蛍光アッセイ。 肝傷害マウスモデルにおけるPHH-pHCの生着（図6-1に関連）。(A) PHH Tx マウス および PHH-pHC Txマウスにおける移植後4週目のAFP分泌のELISAに基づくアッセイ。(B) PHH Tx マウス および PHH-pHC Tx マウスにおけるヒトALBの増幅曲線。ヒト特異的マーカーに基づくPCRにより求めた。Non-Tx: PBSのみを移植されたマウス；NTC: テンプレート無の対照（no template control）。(C) 78Y-PHH Tx マウスおよび 78Y-pHC Txマウスにおける移植後4週目のALB+ 生着の比較。(D) 移植後4週目のPHH Tx マウス および PHH-pHC Tx マウスにおけるALB および KI67の免疫蛍光分析。(E) 移植後12週目におけるPHH-pHCの成熟のヒト特異的マーカーに基づくQ-PCR 解析。(F) 移植後12週目のPHH-pHC TxマウスにおけるhALB、hNuMA、hA1AT、 hCK8/18. hKI67 およびhAFPの免疫蛍光分析。 HDAC阻害剤は高齢モデルにおいてpHCsの誘導を改善する。(A) コリン欠乏、エチオニン補充（CDE）食を給餌した21日後の若いマウス（n=6）、高齢マウス（高齢、n = 4）、およびNaB処理を施した高齢マウス（高齢+NaB、n=6）におけるGOTおよびGPTの検出。(B) CDE食を給餌した21日後のマウス肝臓の肉眼画像。(C) CDE食を給餌した21日後のマウス肝臓のヘマトキシリン、エオシン染色。(D) CDE食を給餌したマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。 (E、F) CDE給餌したマウスの肝臓切片におけるKi67の免疫蛍光染色（E）および定量（F）。(G、H) CDE給餌したマウスの肝臓切片におけるEpcam（上皮細胞接着因子）の免疫蛍光染色（G）および定量（H）。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．肝細胞の新規な誘導法及び肝細胞老化モデルの作製
　本発明は、FGFファミリーのメンバー、HGF、IL6ファミリーのメンバー及びデキサメタゾンの存在下で、内胚葉細胞を肝細胞に分化させることを含む、肝細胞の作製方法を提供する。本発明の方法は、１工程で内胚葉細胞を肝細胞に分化させることができる、簡便な肝細胞の作製方法である。
　線維芽細胞増殖因子（Fibroblast growth factors、FGF）は、成長因子の一種で、血管新生、創傷治癒、胚発生に関係する。本発明において、FGFファミリーのメンバーとしては、FGF2、FGF1、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、及びそれらの組み合わせなどを例示することができ、FGF2が好ましい。
　肝細胞増殖因子（Hepatocyte Growth Factor、HGF）は、肝臓の一部を切除したラットの血液中で肝細胞の増殖を促す物質として発見され、初代培養肝細胞の増殖を強く促進する因子として精製されたサイトカインであり、肝臓の旺盛な再生力を支える肝再生因子の有力な候補である。HGFは増殖因子としては大きく、HGF mRNAは生物活性を有しないPro HGF(94kD)として翻訳される728アミノ酸残基の1本鎖前駆体であるが、N末端シグナルペプチドの除去、細胞外への分泌を経て、HGFアクチベーター(HGFA)、凝固因子(XIa)、ウロキナーゼ（u-PA）、マトリプターゼなどのプロテアーゼによりArg-Val間で特異的な切断(プロセッシング)を受けた後、α鎖(62kD)およびβ鎖(34kD)がジスルフィド結合したヘテロダイマーの構造をもつMature(活性型)HGFとして産生される。HGFは初代培養ラット肝細胞の増殖を促進し、肝細胞のみならず様々な上皮系細胞、内皮細胞、一部の間葉系細胞の増殖も促進する。また、細胞増殖促進、細胞分散・細胞運動促進、抗アポトーシス（細胞死）、形態形成誘導（管腔形成など）、血管新生、抗線維化作用および免疫応答調節作用など組織・臓器の再生と保護を担う多才な生理活性を有している。HGFの受容体はがん原遺伝子c-metの産物でチロシンキナーゼ活性をもち、HGFの多様な生物作用はc-Metを介して発揮される。肝再生時には肝DNA合成誘導に先行して肝、脾、肺のHGF遺伝子発現の増加並びに血中、肝中HGFレベルの上昇が認められ、抗HGF抗体の投与により肝再生が抑制される。HGFの産生細胞が、主に線維芽細胞、脂肪含有細胞、好中球、マクロファージ、血管内皮細胞などの間葉系の細胞より産生、分泌され、正常上皮細胞あるいは癌細胞にパラクリン的に作用している。一方、癌細胞もHGFを産生し、自身のc-METを活性化させるオートクリン作用も報告されている。肝臓内でHGFを産生する細胞として報告されているのは、肝類洞の星細胞および類洞内皮細胞である。肝臓の再生を例にすると、部分肝切除、肝炎、肝虚血など様々な急性傷害にともない、傷害を受けた肝臓に加え遠隔の肺や腎臓など無傷の臓器においてもHGFの発現が高まり、これにより血中HGFレベルが上昇する。事実、肝傷害を引き起こしたラットやマウスにHGFの活性を中和する抗体を投与すると、肝傷害の著しい拡大と肝再生不全に陥る。同様の結果は他の臓器傷害でも認められており、HGFは肝臓、腎臓、肺、心・血管系、神経系などを含む様々な組織・臓器の再生・保護を担う内因性因子であることが明らかにされている。培養細胞におけるHGF産生は、PKC活性化薬、PKA活性化薬、cAMP上昇薬、種々の増殖因子、炎症性サイトカイン（IL-1やTNF-α等）などにより誘導され、TGF-β、グルココルチコイド、活性型ビタミンD、レチノイン酸などによって抑制される。様々な細胞に対する強力な増殖促進作用を利用してHGFを肝硬変や慢性腎不全、肺線維症、心筋梗塞、閉塞性動脈硬化症など各種難治性臓器疾患の治療薬として応用できる可能性を示す報告が多数なされている。また、血清および血漿HGF定量ELISAキットは肝炎劇症化の予知のために用いられている。
　インターロイキン-6（Interleukin-6、IL-6）はT細胞やマクロファージ等の細胞により産生されるレクチンであり、液性免疫を制御するサイトカインの一つである。本発明において、IL6ファミリーのメンバーとしては、オンコスタチン（OSM）、IL-6、IL-11、IL-27、IL-35、IL-39、LIF、CT-1、CNTF、CLCF1、およびそれらの組み合わせなどを例示することができ、オンコスタチンが好ましい。
　デキサメタゾンは、合成副腎皮質ホルモン剤で、天然の糖質コルチコイドと同じ機序により抗炎症作用を発現し、急性炎症、慢性炎症、自己免疫疾患、アレルギー性疾患などに使用される。
　内胚葉細胞は、内胚葉マーカーを発現し、各種内胚葉系細胞（肺、肝臓、 膵臓、胃、小腸や大腸などの細胞への分化が可能な細胞である。
　内胚葉マーカーとしては、SOX17、FOXA2、CXCR4、EpCAM、C-KIT、CER1などを例示することができ、内胚葉系細胞としては、肺、肝臓、 膵臓、胃、小腸や大腸などの細胞を例示することができる。
　内胚葉細胞は、多能性幹細胞から分化誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（Embryonic stem cells、ES細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells、iPS細胞）などを例示することができる。iPS細胞から内胚葉細胞に分化する方法は、後述の実施例に記載されている。すなわち、RPMI 1640、1% B27、50 ng/mL WNT3Aおよび100 ng/mL アクチビンAからなる培地を用いて、GFR マトリゲルまたはラミニン 511でコーティングしたプレート上で、7日間培養し、hiPSC クローンを内胚葉細胞に分化させた。0日目に10 μM Y-27632を添加し、1日目から3日目まで0.5 mM NaB を添加した。この方法は適宜改変しうる。
　また、内胚葉細胞は、生体から採取したものであってもよい。
　内胚葉細胞は、ヒト由来であるとよいが、ヒトに限定されるわけではなく、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ、サルなどの哺乳動物に由来するものであってもよい。
　FGFファミリーのメンバー、HGF、IL6ファミリーのメンバー及びデキサメタゾンを含む培地で内胚葉細胞を培養することにより、肝細胞に分化させることができる。
　基礎培地としては、SFD培地（WO2016093222に記載）、DMEM/F12、DMEM、IMDM、RPMI1640、Williams' Medium Eなどを用いることができ、基礎培地にFGFファミリーのメンバー、HGF、IL6ファミリーのメンバー及びデキサメタゾンを添加するとよい。
　培地中におけるFGFファミリーのメンバー、HGF、IL6ファミリーのメンバー及びデキサメタゾンの濃度は、適宜調整すればよい。例えば、FGFファミリーのメンバーとして、FGF2を使用する場合には、FGF2の濃度は、通常、0.01～1000 ng/mLであるとよく、好ましくは、0.1～100 ng/mLであり、より好ましくは、１～50 ng/mLである。HGFの濃度は、通常、１～1000 ng/mLであるとよく、好ましくは、5～100 ng/mLであり、より好ましくは、5～50 ng/mLである。IL6ファミリーのメンバーとして、オンコスタチン（OSM）を使用する場合には、OSMの濃度は、通常、1～1000 ng/mLであるとよく、好ましくは、5～100 ng/mLであり、より好ましくは、10～50 ng/mLである。デキサメタゾンの濃度は、通常、1～1000000 nMであるとよく、好ましくは、10～10000 nMであり、より好ましくは、50～500 nMである。
　培地には、ニコチンアミドを添加してもよい。培地中のニコチンアミドの濃度は、通常、0.01～1000 mMであるとよく、好ましくは、0.1～100 mMであり、より好ましくは、1～10 mMである。ニコチンアミドは、培養８日目以降に添加するとよい。
　培地は、血清含有培地であっても、無血清培地であってもよいが、後述の実施例では、無血清培地とした。
　内胚葉細胞は、ゲル上に播種して培養を行うことが好ましい。使用するゲルは特に限定されないが、GFR Matrigel（Corning社製）などを使用することができる。
　内胚葉細胞は、ラミニンのような組織基底膜の主成分でコーティングされた容器の上で培養されてもよい。
　培養時の温度は特に限定されないが、３０～４０℃とするのが好ましく、３７℃とするのがより好ましい。
　培養期間は特に限定されないが、１～150日とするのが好ましく、1～90日とするのがより好ましい。
　内胚葉細胞が肝細胞に分化したことを確認するには、肝特異的遺伝子の発現や肝機能を調べたり、肝細胞様の細胞形態観察を行えばよい。肝細胞特異的遺伝子としては、TBX3 および TTR, DLK, CK19, EPCAM (肝芽細胞)、ならびに A1AT、ALB、G6PC、ASGR1、TAT、TDO2、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4 およびCYP7A1 (肝細胞)などを例示することができる。後述の実施例では、内胚葉細胞から肝細胞への分化の進行過程において、分化の初期の段階（例えば、分化５日目）では、肝芽細胞状態にあり、さらに培養を続けると、肝機能を発現するようになった。肝機能については後述する。
　本発明により、簡便な方法で多能性幹細胞から肝細胞へ誘導することができる。
　本発明の方法により作製された肝細胞は、長時間にわたって、肝細胞としての機能を保持して、生存することができ、生体外で肝細胞の長期培養や老化プロセスの模倣を実現しうる。
　本発明の方法により作製された肝細胞は、12日以上、15日以上、17日以上、22日以上、26日以上、31日以上、32日以上、42日以上、52日以上、72日以上、82日以上、90日以上、100日以上あるいはそれ以上の期間、生体外の単層培養で肝細胞としての機能を持って、生存しうる。本発明の方法により作製された肝細胞が、肝細胞としての機能を持って、生存しうる期間の上限は、特に限定されない。本発明者らは、本発明の方法により作製された肝細胞が、82日間アルブミンの分泌能を持って、生存可能であることを観察している。
　本発明の方法により作製された肝細胞が保持する肝細胞としての機能は、例えば、アルブミン分泌能、薬物代謝能、インドシアニングリーン(ICG)の取込みおよび排出、グリコーゲン貯蔵、低密度リポタンパク質の取込み、遺伝子発現などである。本発明の一実施態様において、本発明の方法により作製された肝細胞は、12日以上アルブミンの分泌能をもって、生存でき、さらに、12日以上アルブミンの分泌能以外の肝細胞としての機能も持って、生存できる。
　アルブミン分泌能は、市販のアルブミンELISA定量セットにより測定することができる。
　薬物代謝能は、市販のCytochrome P450関連アッセイキットにより測定することができる。
　ICGの取込みおよび排出は、ICGを添加した培地に細胞を播種し、適当な時間インキュベートした後に、顕微鏡観察をすることにより、調べることができる。
　グリコーゲン貯蔵は、過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色を用いてグリコーゲンを検出することにより調べることができる。
　低密度リポタンパク質の取込みは、Dil-Ac-LDL およびヘキスト 33342 標準希釈溶液と共に細胞をインキュベートした後、細胞をPBSで洗浄し、蛍光顕微鏡を用いて写真を解析することにより調べることができる。
　遺伝子発現検査は、以下のようにして行うことができる。PureLinkTM RNA Mini Kitを用いて全RNAを単離する。高性能cDNA逆転写キットを製造業者の指示に従って用いて1本鎖cDNAを合成するためのテンプレートとしてRNA (< 2 μg) を用いる。cDNA ならびに特異的プライマーおよびユニバーサルプローブライブラリーのプローブを用いてQ-PCR を実施する。
　本発明の方法により作製された肝細胞は、老化の特徴を示しうる。老化の特徴としては、細胞容量の増大、老化関連遺伝子の発現、炎症性応答の増大、DNA損傷、細胞内活性酸素種レベルの増大、細胞老化関連βガラクトシダーゼレベルの増大、エピジェネティック変化、テロメアの長さの短小化、ミトコンドリア機能の低下、代謝異常、増殖因子への低い応答性などを例示することができる。
　細胞容量は、ヘキスト 33342 標準希釈溶液と共に細胞をインキュベートした後、細胞をPBSで洗浄し、蛍光顕微鏡を用いて写真を解析することにより調べることができる。
　老化関連遺伝子としては、CCL2、CDNK2A、CST1、CXCL1、GDF15、ID1、LIMCH1、LMO2、MAP2、MMP24、MYC、RCAN2、S100A8、S100A9、SERPINE1, TGFB1などを例示することができ、老化関連遺伝子の発現は、市販のSurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K (Agilent Technologies)を用いて測定することができる。
　炎症性応答としては、細胞内の炎症関連の因子が上昇することを例示することができ、炎症性応答は、市販のSurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K (Agilent Technologies)を用いて測定することができる。
　DNA損傷は、市販のSurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K (Agilent Technologies)を用いて測定することができる。
　細胞内活性酸素種レベルは、CellROXTM Deep Red Reagent（Thermo Fisher Scientific）などの試薬を細胞に添加した後、顕微鏡で観察したり、蛍光を発する細胞の数をカウントすることにより測定できる。
　細胞老化関連βガラクトシダーゼレベルは、β-galactosidase検出キット(Dojindo)を用いて測定することができる。
　エピジェネティック変化は、市販のAcetyl-Histone H3 Antibody Samplerキット（CST）を用いて測定することができる。
　テロメアの長さは、市販のテロメア長qPCRキット（ScienCell Research Laboratories）を用いて測定することができる。
　ミトコンドリア機能としては、電子伝達系による酸化的リン酸化によるATPの産生（ADPのリン酸化）を例示することができ、ミトコンドリア機能の低下は、ATP産生関連の遺伝子が減少することを市販のSurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K (Agilent Technologies)を用いて測定することにより確認できる。
　代謝異常としては、有機酸、アミノ酸、尿酸サイクル、糖質、脂肪酸、リソゾーム、リポタンパク、核酸、膜担送タンパクなどの代謝異常など例示することができ、代謝異常は、代謝関連遺伝子発現が変化することを市販のSurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K (Agilent Technologies) を用いて測定することにより確認できる。
　増殖因子への低い応答性は、増殖因子を加え、数日間培養し、ヘキスト 33342 標準希釈溶液と共に細胞をインキュベートした後、細胞をPBSで洗浄し、蛍光顕微鏡を用いて撮影した写真を解析することにより調べることができる。
　本発明の方法により作製された肝細胞は、生体由来の肝細胞のソースとは異なる。また、従来法で誘導された肝細胞と比較して、本発明の方法により作製された肝細胞は、肝特異的遺伝子（ALB, G6PC, ASGR1, TAT, TDO2, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4およびCYP7A1）の発現、ALBの分泌、CYP3A4の活性が大幅にアップレギュレートされている。従来法で誘導された肝細胞は30日以上in vitroで培養できず、本発明の方法により作製された肝細胞は、50日以上in vitroで培養でき、肝細胞の老化プロセスを再現できる。
　「肝特異的遺伝子の発現、ALBの分泌、CYP3A4の活性」について、本発明の方法により作製された肝細胞（後述の実施例の培養22日目のN-Hep）が、従来法で誘導された肝細胞と比較して、アップレギュレートされている数値の一例を以下に記載する。

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001


Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002


Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003

従来法A:　Si-Tayeb, K., Noto, F.K., Nagaoka, M., Li, J., Battle, M.A., Duris, C., North, P.E., Dalton, S., and Duncan, S.A. (2010). Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology 51, 297-305.
従来法B:　 Kajiwara, M., Aoi, T., Okita, K., Takahashi, R., Inoue, H., Takayama, N., Endo, H., Eto, K., Toguchida, J., Uemoto, S., et al. (2012). Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 12538-12543.
表中の各細胞は継代していない。
肝特異的遺伝子の測定法：Q-PCR（後述の実施例参照）
ALB分泌の測定法：ELISAで測定（後述の実施例参照）
CYP3A4活性の測定法：市販のP450-GloTM CYP3A4 Assayキット（Promega, V8801）により測定した。
　従来法Aで誘導された肝細胞と比較した場合、本発明の方法により作製された肝細胞は、ALBについては、10倍以上、好ましくは、15倍以上、より好ましくは、19倍以上、G6PCについては、100倍以上、好ましくは、500倍以上、より好ましくは1000倍以上、ASGR1については、2倍以上、好ましくは、3倍以上、より好ましくは、4倍以上、TATについては、10倍以上、好ましくは、20倍以上、より好ましくは、25倍以上、TDO2については、10倍以上、好ましくは、15倍以上、より好ましくは、17倍以上、CYP2C9については、2倍以上、好ましくは、4倍以上、より好ましくは、6倍以上、CYP2C19については、2倍以上、好ましくは、3倍以上、より好ましくは、4倍以上、CYP3A4については、2倍以上、好ましくは、4倍以上、より好ましくは、5倍以上、CYP7A1については、3倍以上、好ましくは、5倍以上、より好ましくは、8倍以上、発現が上昇しうる。
　また、ALBの分泌については、本発明の方法により作製された肝細胞は、従来法Aで誘導された肝細胞と比較して、2倍以上、好ましくは、3倍以上、より好ましくは、4倍以上上昇しうる。
　さらに、本発明の方法により作製された肝細胞はCYP3A4の活性を有するが、従来法Aで誘導された肝細胞はCYP3A4の活性が検出されない。
　従来法Bで誘導された肝細胞と比較した場合、本発明の方法により作製された肝細胞は、ALBについては、2倍以上、好ましくは、4倍以上、より好ましくは、5倍以上、G6PCについては、20倍以上、好ましくは、25倍以上、より好ましくは29倍以上、ASGR1については、同程度、TATについては、30倍以上、好ましくは、40倍以上、より好ましくは、50倍以上、TDO2については、2倍以上、好ましくは、4倍以上、より好ましくは、5倍以上、CYP2C9については、同程度、CYP2C19については、1.2倍以上、好ましくは、1.5倍以上、より好ましくは、2倍以上、CYP3A4については、3倍以上、好ましくは、5倍以上、より好ましくは、8倍以上、CYP7A1については、2倍以上、好ましくは、4倍以上、より好ましくは、5倍以上、発現が上昇しうる。
　また、ALBの分泌については、本発明の方法により作製された肝細胞は、従来法Bで誘導された肝細胞と比較して、1.2倍以上、好ましくは、1.5倍以上、より好ましくは、2倍以上上昇しうる。
　さらに、CYP3A4の活性については、本発明の方法により作製された肝細胞は、従来法Bで誘導された肝細胞と比較して、30倍以上、好ましくは、40倍以上、より好ましくは、47倍以上上昇しうる。
　本発明の方法により作製された肝細胞（後述の実施例の培養22日目のN-Hep）、従来法Aで誘導した肝細胞及び従来法Bで誘導した肝細胞について、肝特異的遺伝子の発現、ALBの分泌、CYP3A4の活性の測定値の一例を以下に記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005


Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006

N-Hep：本発明の方法により作製された肝細胞（後述の実施例の培養22日目のN-Hep）
ヒト肝細胞：BioreclamationIVTのIVT-F00995-P-AKB（ドナーは女性、年齢39歳）
表中の各細胞は継代していない。
肝特異的遺伝子の測定法：Q-PCR（後述の実施例参照）
ALB分泌の測定法：ELISAで測定（後述の実施例参照）
CYP3A4活性の測定法：市販のP450-GloTM CYP3A4 Assayキット（Promega, V8801）により測定。
　本発明の方法により作製された肝細胞は、Q-PCRで測定した発現量が、ALBについては、3以上、好ましくは、5以上、より好ましくは、9以上であり、G6PCについては、0.05以上、好ましくは、0.1以上、より好ましくは、0.14以上であり、 ASGR1については、0.05以上、好ましくは、0.1以上、より好ましくは、0.16以上であり、TATについては、0.00001以上、好ましくは、0.00005以上、より好ましくは、0.0001以上であり、TDO2については、0.01以上、好ましくは、0.05以上、より好ましくは、0.1以上であり、CYP2C9については、0.05以上、好ましくは、0.01以上、より好ましくは、0.02以上であり、CYP2C19については、0.00005以上、好ましくは、0.0001以上、より好ましくは、0.0006以上であり、CYP3A4については、0.00001以上、好ましくは、0.00005以上、より好ましくは、0.00009以上であり、CYP7A1については、0.00001以上、好ましくは、0.00005以上、より好ましくは、0.00007以上でありうる。
　本発明の方法により作製された肝細胞は、ELISAで定量したALB分泌が、2 μg/ml/24h/1 million以上、好ましくは、4 μg/ml/24h/1 million以上、より好ましくは、5 μg/ml/24h/1 million以上でありうる。
　本発明の方法により作製された肝細胞は、市販のP450-GloTM CYP3A4 Assayキット（Promega, V8801）により測定した、CYP3A4活性が、50000 RLU/4h/ml/million cells以上、好ましくは、100000 RLU/4h/ml/million cells以上、より好ましくは、200000 RLU/4h/ml/million cells以上でありうる。
２．肝前駆細胞の誘導、肝前駆細胞から肝細胞や胆管細胞への分化誘導
　また、本発明は、FGFファミリーのメンバーの存在下で、肝細胞を培養することを含む、肝前駆細胞の作製方法を提供する。
　本発明において、FGFファミリーのメンバーとしては、FGF2、FGF1、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23などを例示することができ、FGF2が好ましい。
　肝前駆細胞もしくはpHCもしくは可塑性の誘導に用いる肝細胞は、肝特異的遺伝子を発現し、肝機能を示すものであればよく、肝細胞は、多能性幹細胞から分化した肝細胞、多能性幹細胞から分化した肝細胞を継代培養した細胞、生体組織から単離された初代培養肝細胞、生体組織から単離された初代培養肝細胞を継代培養した細胞又はそれらの組み合わせのいずれであってもよい。
　多能性幹細胞としては、ES細胞、iPS細胞などを例示することができる。
　多能性幹細胞から分化した肝細胞としては、上述の１に記載の肝細胞、すなわち、FGFファミリーのメンバー、HGF、IL6ファミリーのメンバー及びデキサメタゾンの存在下で、内胚葉細胞から分化誘導した肝細胞を例示することができる。後述の実施例では、GFR マトリゲルまたはラミニン 511でコーティングしたプレートに、ニコチンアミドを含まない肝分化培地(HDM)を用いて、内胚葉細胞を播種し、8日目から10日目まで、培地を毎日HDMに交換し、11日目からは、培地を2日ごとに交換して、肝細胞に分化誘導した。このHDMは、10 ng/mL FGF2、20 ng/mL HGF、10 ng/mL OSM、100 nM デキサメタゾンおよび 10 mM ニコチンアミドを含有するSFDから成っていた。この方法は適宜改変しうる。この肝細胞を継代培養するには、GFR マトリゲルまたはラミニン 511でコーティングしたプレートに、ニコチンアミドを含有するHDMを用いて、肝細胞を播種し、培地を2日ごとに交換して、肝細胞を継代培養するとよい。このHDMは、10 ng/mL FGF2、20 ng/mL HGF、10 ng/mL OSM、100 nM デキサメタゾンおよび 10 mM ニコチンアミドを含有するSFDから成っていた。この方法は適宜改変しうる。
　多能性幹細胞から分化した肝細胞を用いて肝前駆細胞を誘導する場合には、肝細胞の継代数は、通常、１～5回であり、好ましくは、1～4回であり、より好ましくは、1～3回であり、肝細胞の培養日数は、通常、１～100日であり、好ましくは、1～80日であり、より好ましくは、5～60日である。
　肝細胞は、生体組織から単離された初代培養肝細胞、それを継代培養した細胞であってもよい。後述の実施例では、月齢2か月、年齢39歳及び78歳のドナー由来の初代ヒト肝細胞を用いた。初代ヒト肝細胞を培養または継代培養するには、GFR マトリゲルまたはラミニン 511でコーティングしたプレートに、ヒト肝細胞培養培地を用いて、初代ヒト肝細胞を播種し、培地を2日ごとに交換して、初代ヒト肝細胞を培養または継代培養するとよい。ヒト肝細胞培養培地は二種類ある。一つはHDM、10 ng/mL FGF2、20 ng/mL HGF、10 ng/mL OSM、100 nM デキサメタゾンおよび 10 mM ニコチンアミドを含有するSFDから成っていた。もう一つは5% FBS、 1μM デキサメタゾン、 4μg/mLヒト組換えインスリン、2mMグルタマックスおよび 15mM HEPESを含有するWilliams E mediumから成っていた。この方法は適宜改変しうる。
　ヒトの生体組織から単離された初代培養細胞、それを継代培養した細胞、それらの組み合わせから肝前駆細胞を誘導する場合には、ヒトの年齢は、通常、0～120歳であり、好ましくは、0～100歳であり、より好ましくは、0～80歳である。ヒト以外の動物の生体組織から単離された初代培養細胞、それを継代培養した細胞、それらの組み合わせを用いる場合には、ヒトの場合から適切な週齢、月齢、年齢を推定することができる。培養細胞の継代数は、通常、１～5回であり、好ましくは、1～4回であり、より好ましくは、1～3回であり、細胞の培養日数は、通常、１～30日であり、好ましくは、1～20日であり、より好ましくは、1～10日である。
　肝細胞は、多能性幹細胞から分化した肝細胞、多能性幹細胞から分化した肝細胞を継代培養した細胞、生体組織から単離された初代培養肝細胞、生体組織から単離された初代培養肝細胞を継代培養した細胞の組み合わせであってもよい。
　肝細胞は、ヒト由来であるとよいが、ヒトに限定されるわけではなく、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ、サルなどの哺乳動物に由来するものであってもよい。
　FGFファミリーのメンバーを含む培地で肝細胞を培養することにより、肝前駆細胞を誘導する（以下、「リプログラミングする」ということもある。）ことができる。
　基礎培地としては、SFD培地（WO2016093222に記載）、DMEM/F12、DMEM、IMDM、RPMI1640、Williams' Medium E）などを用いることができ、基礎培地にFGFファミリーのメンバーを添加するとよい。
　培地中におけるFGFファミリーのメンバーの濃度は、適宜調整すればよい。例えば、FGFファミリーのメンバーとして、FGF2を使用する場合には、FGF2の濃度は、通常、0.01～1000 ng/mLであるとよく、好ましくは、0.1～100 ng/mLであり、より好ましくは、1～50 ng/mLである。
　培地には、EGF、HGF、ROCK阻害剤、ALK4, ALK5, ALK7の選択的阻害剤（TGF-β受容体阻害剤）、GSK-3β阻害剤を添加してもよい。
　上皮成長因子（Epidermal Growth Factor; EGF）は53アミノ酸残基及び3つの分子内ジスルフィド結合から成る6045 Daのタンパク質であり、細胞表面に存在する上皮成長因子受容体 (EGFR) にリガンドとして結合し、細胞の成長と増殖の調節に重要な役割をする。培地中のEGFの濃度は、通常、0.1～1000 ng/mLであるとよく、好ましくは、1～100 ng/mLであり、より好ましくは、1～50 ng/mLである。
　HGFについては上述した。HGFの濃度は、通常、1～1000 ng/mLであるとよく、好ましくは、5～100 ng/mLであり、より好ましくは、5～50 ng/mLである。
　Rhoキナーゼ（Rho-associated protein kinase：ROCK）は低分子量GTP結合蛋白Rhoの標的蛋白質として同定されたセリン-スレオニン蛋白リン酸化酵素であり、ROCK阻害剤としては、Y-27632、AT13148、Fasudil、Hydroxyfasudil、GSK269962A、GSK180736A、GSK429286A、KD025、Netarsudil、RKI-1447、Thiazovivin、Y-39983などを例示することができる。ROCK阻害剤として、Y-27632を使用する場合には、Y-27632の濃度は、通常、1～1000 μMであるとよく、好ましくは、1～100 μMであり、より好ましくは、1～50 μMである。
　ALK4, ALK5, ALK7は、TGF-β1 アクチビン受容体様キナーゼ（ALK）であり、ALK4, ALK5, ALK7の選択的阻害剤（TGF-β受容体阻害剤）としては、A83-01、DMH1、GW788388、Galunisertib、K02288、LDN-193189、LDN-212854、LDN-214117、LY2109761、LY364947、ML347、SB431542、SB505124、SB525334、SD-208、RepSox、Vactosertibなどを例示することができる。ALK4, ALK5, ALK7の選択的阻害剤（TGF-β阻害剤）として、A83-01を使用する場合には、A83-01の濃度は、通常、0.01～100 μMであるとよく、好ましくは、0.1～10 μMであり、より好ましくは、0.1～5 μMである。
　GSK3βは、セリンスレオニンタンパク質キナーゼであり、GSK-3β阻害剤としては、CHIR99021、1-Azakenpaullone、2-D08、AR-A014418、AZD1080、AZD2858、Bikinin、BIO、BIO-acetoxime、CHIR-98014、IM-12、Indirubin、LY2090314、SB216763、SB415286、Tideglusib、TDZD-8、TWS119などを例示することができる。GSK-3β阻害剤として、CHIR99021を使用する場合には、CHIR99021の濃度は、通常、0.01～100 μMであるとよく、好ましくは、0.01～20 μMであり、より好ましくは、0.1～20 μMである。
　培地は、血清含有培地であっても、無血清培地であってもよいが、後述の実施例では、無血清培地とした。
　肝細胞は、ゲル上に播種して培養を行うことが好ましい。使用するゲルは特に限定されないが、GFR Matrigel（Corning社製）などを使用することができる。
　肝細胞は、ラミニンのような組織基底膜の主成分でコーティングされた容器の上で培養されてもよい。
　培養時の温度は特に限定されないが、３０～４０℃とするのが好ましく、３７℃とするのがより好ましい。
　培養期間は特に限定されないが、4～15日とするのが好ましく、5～10日とするのがより好ましい。
　本発明の方法により、肝細胞から誘導された肝前駆細胞は、増殖性があり、かつ分化能を有し、例えば、増殖能と肝細胞・胆管上皮細胞への二方向の分化能を持つ、アルファフェトプロテイン（AFP）陰性の肝前駆細胞である。
　本発明の肝前駆細胞は、細胞周期遺伝子の発現が高い（陽性）、肝幹／前駆細胞関連遺伝子の発現が高い（陽性）、肝機能関連遺伝子の発現が低い（陰性）、HNF4A、SOX9および CK19 に対して陽性染色を示すが、ALBおよびAFPに対しては染色されなかったなどの特徴を有する（後述の実施例参照）。
　肝前駆細胞は、マトリゲル又はラミニンコーティング上に、FGFファミリーのメンバーを含む培地を用いて、播種し、適当な時期に、ROCK阻害剤不含の培地に交換することにより、継代培養できる。
　肝前駆細胞の増殖性は、後述の実施例に記載のように、細胞集団倍加時間を計算することにより調べることができる。肝前駆細胞は、細胞集団倍加時間が14時間～36時間という高い増殖能を持ちうる。
　本発明の方法により、肝細胞から誘導された肝前駆細胞は、肝細胞、胆管細胞などへ分化しうる。
　肝前駆細胞を肝細胞に分化させるには、肝分化培地で培養するとよい。肝分化培地としては、HDM（１で上述）を用いることができる。肝分化培地には、適当な時期に、適当な期間、ビタミンA代謝物（例えば、レチノイン酸（RA））を添加するとよい。後述の実施例では、培地は8日間、RA を含有するHDM に交換し、次の7日間はRAを含まないHDM に交換した。培地は2日ごとに交換した。全肝細胞分化期間は15日であった。この方法は適宜改変しうる。肝前駆細胞から分化した肝細胞は、機能遺伝子（例えば、AAT、CTP2C9、CYP2C19など）の発現、ALB分泌の増大を示しうる。さらに、肝前駆細胞から分化した肝細胞は、自らの細胞間で密着結合を形成し、アンモニア排出能および肝機能（ICGの取込みおよび排出、グリコーゲン貯蔵、および低密度リポタンパク質の取込み）を獲得しうる。
　肝前駆細胞を胆管細胞へ分化させるには、肝前駆細胞を胆管細胞分化培地（CDM）で培養するとよい（Francis et al., 2004; Sampaziotis et al., 2015; Sampaziotis et al., 2017を参照のこと）。後述の実施例では、GFR-マトリゲルと混合した肝前駆細胞を未処理の24-ウエルプレートにマウントドロップ(mount drop)として播種し、37 ℃で5% CO2 インキュベーター内で 30分間インキュベートした。次に、胆管細胞分化培地 (CDM) をウエルに満たした。このCDM は、10 ng/mL EGF、20 ng/mL HGF、50 ng/mL WNT3A、100 ng/mL R-スポンジン-1、 50 ng/mL FGF10、3 μM RA、10 μM Y-27632 および 10 μM フォルスコリンを含有するSFDから成っていた。培地は3日ごとに交換した。この方法は適宜改変しうる。肝前駆細胞から分化した胆管細胞は、リング状の構造体を経て、シスト（cyst）構造体に発達しうる。Q-PCR 解析によると、このシスト構造体は胆管細胞特性遺伝子のアップレギュレーションされた転写を特色としうる（図3-1 Gおよび3-2 H)。これらのシストの胆管細胞は、CK19、 F-ACTIN、 および SOX9染色が陽性であり、AFP、 ALBおよびHNF4A染色が陰性でありうる。さらに、これらのシストは成熟した胆管の特徴（頂端および側底部の細胞膜を備えた管腔、微絨毛、頂端膜上の一次繊毛、密着結合および多胞体を含む）を有しうる。これらの胆管細胞は胆管機能を有しうる：１）管腔へのローダミン123の輸送および２）管腔からの胆汁酸を特異的に排出。
　よって、本発明は、FGFファミリーのメンバーの存在下で、肝細胞を培養することを含む、肝前駆細胞の作製方法により得られた肝前駆細胞を肝細胞に分化誘導することを含む、肝細胞の作製方法を提供する。また、本発明は、FGFファミリーのメンバーの存在下で、肝細胞を培養することを含む、肝前駆細胞の作製方法により得られた肝前駆細胞を胆管細胞に分化誘導することを含む、胆管細胞の作製方法も提供する。また、本発明は、前記肝前駆細胞を胆管細胞に分化誘導するための、FGF10、レチノイン酸およびフォルスコリンを含有する培地も提供する。本発明の培地は、上記の胆管細胞分化培地(CDM)に含まれる他の成分を含んでもよい。さらに、本発明は、前記肝前駆細胞を胆管細胞に分化誘導するために使用される培地に使用するための、FGF10、レチノイン酸およびフォルスコリンを含有する剤；および該剤を該分化誘導に使用される培地に使用することの説明書；を含む、該分化誘導における培地用キットも提供する。FGF10、レチノイン酸およびフォルスコリンを含有する剤は、上記の胆管細胞分化培地(CDM)に含まれる他の成分を含んでもよい。
　本発明の方法により、肝細胞から誘導された肝前駆細胞は、長期にわたり、増殖可能であり、例えば、少なくとも20回以上の継代が可能である。よって、本発明により、肝細胞や胆管細胞の大量製造が可能となる。
３．老化肝細胞の可塑性改善
　上述の２において、FGFファミリーのメンバーを含む培地に、さらに、ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を添加することにより、老化した肝細胞の可塑性を改善し、肝前駆細胞を誘導することできる。
　本発明は、FGFファミリーのメンバー及びヒストン高アセチル化をもたらす薬剤の存在下で、肝細胞を培養することを含む、肝前駆細胞の作製方法を提供する。
　肝細胞は、ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤により、老化が抑制され、可塑性が誘導されうる。本明細書において、肝細胞の可塑性とは、肝細胞から肝細胞や胆管細胞へ両方分化能力を持つ増殖性肝前駆細胞へ転換する能力をいう。肝細胞の可塑性が改善することにより、肝細胞の増殖誘導への応答性が増す。
　よって、本発明は、ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤により、肝細胞の老化を抑制する方法を提供する。別の観点から見ると、本発明は、ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を有効成分として含む、肝細胞の老化抑制剤（アンチエイジング薬）を提供する。本発明の老化抑制剤は、in vitro（培養細胞）及びin vivo（生体内の細胞）のいずれにおいても適用できる。
　肝細胞の老化は、細胞増殖の低下、肝細胞としての機能の低下、老化関連遺伝子のアップレギュレーション、老化関連マーカーの発現などにより、確認することができる。その他、細胞容量の増大、炎症性応答の増大、DNA損傷、エピジェネティック変化、テロメアの長さの短小化、ミトコンドリア機能の低下、代謝異常、増殖因子への低い応答性などにより確認することもできる。
　細胞増殖は、細胞集団倍加時間を計算することにより調べることができる。
　肝細胞としての機能とその測定法については、１で上述した。
　老化関連遺伝子の機能とその測定法についても、１で上述した。
　老化関連マーカーとしては、細胞内活性酸素種レベル、細胞老化関連βガラクトシダーゼレベルを例示することができ、これらの測定法については、１で上述した。
　細胞容量の増大、炎症性応答の増大、DNA損傷、エピジェネティック変化、テロメアの長さの短小化、ミトコンドリア機能の低下、代謝異常、増殖因子への低い応答性の測定法についても、１で上述した。
　肝細胞の老化の抑制は、上記のマーカーや事象を測定することにより、確認することができる。
　また、本発明は、ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤により、肝細胞の可塑性を増大させる方法も提供する。別の観点から見ると、本発明は、ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を有効成分として含む、肝細胞の可塑性を増大させる剤を提供する。可塑性が増大することにより、多能性幹細胞由来の老化した肝細胞や高齢者由来の肝細胞からも、肝前駆細胞を誘導することができる。また、可塑性が増大することにより、肝細胞の増殖誘導への応答性を高めることができる。本発明の剤は、老化細胞の再生能力の改善をもたらす再生誘導剤でありうる。本発明の剤により、高齢者の肝再生を促進することができる。また、本発明の剤により、高齢ドナー由来のグラフトや細胞を用いた移植治療を成功に導くことが可能となる。本発明の剤は、in vitro（培養細胞）及びin vivo（生体内の細胞）のいずれにおいても適用できる。
　ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤は、FGFファミリーのメンバーと組み合わせて用いるとよい。FGFファミリーのメンバーとしては、FGF2、FGF1、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、又はそれらの組み合わせなどを例示することができ、FGF2が好ましい。
　ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤としては、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を挙げることができ、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としては、Trichostatin A、Tacedinaline (CI-994)、M344、ITSA-1、Sodium valproate、Sodium 4-phenylbutuyrate、Sodium Butyrate (NaB)、valproic acid (VPA)、Abexinostat (PCI-24781)、Belinostat(PXD101)、Citarinostat (ACY-241)、Dacinostat (LAQ824)、Depudecin、Domatinostat (4SC-202)、Droxinostat、Entinostat (MS-275, SNDX-275)、Fimepinostat (CUDC-907)、Givinostat (ITF2357)、Mocetinostat (MGCD0103)、Nexturastat A、Panobinostat (LBH-589,NVP-LBH589)、Pracinostat (SB939)、Quisinostat (JNJ-26481585) 2HCl、Resminostat、Ricolinostat (ACY-1215)、Tucidinostat (Chidamide)、Vorinostat (SAHA)、ACY-738、Apicidin、AR-42、BG45、BML-210、BRD73954、CAY10603、CUDC-101、Curcumin、Depudecin、H1388、HC Toxin、HPOB、LMK-235、MC1568、Oxamflatin、(-)-Parthenolide、PCI-34051、RG2833 (RGFP109)、RGFP966、Romidepsin (FK228, Depsipeptide)、Santacruzamate A (CAY10683)、Scriptaid、SKLB-23bb、Splitomicin、Suberoyl bis-hydroxamic acid、Tasquinimod、TH34、Tinostamustine(EDO-S101)、TMP195、TMP269、Tubacin、Tubastatin A及びそれらの組み合わせを例示することができる。
　ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤により、老化を抑制したり、可塑性を増大させる対象となる肝細胞は、老化した肝細胞であることが好ましいが、それに限定されるものではない。肝細胞は、多能性幹細胞から分化した肝細胞、多能性幹細胞から分化した肝細胞を継代培養した細胞、生体組織から単離された初代培養肝細胞、生体組織から単離された初代培養肝細胞を継代培養した細胞又はそれらの組み合わせのいずれであってもよい。
　肝細胞が多能性幹細胞から分化した肝細胞である場合、「老化した肝細胞」とは、例えば、多能性幹細胞（例えば、iPSC）から分化誘導後（22日後）、全工程で50日以上の継代培養を経た肝細胞である。
　肝細胞が多能性幹細胞から分化した肝細胞を継代培養した細胞である場合、「老化した肝細胞」とは、例えば、多能性幹細胞（例えば、iPSC）より２５日以上の継代培養を経た肝細胞を1回以上継代培養した細胞である。
　肝細胞が肝組織から単離された初代培養細胞である場合、「老化した肝細胞」とは、例えば、ヒトの場合、年齢が65歳以上のヒトの組織から単離した肝細胞である。
　肝細胞が生体組織から単離された初代培養肝細胞を継代培養した細胞である場合、「老化した肝細胞」とは、例えば、ヒトの場合、単離後20日以上培養した肝細胞などである。
　肝細胞は、ヒト由来であるとよいが、ヒトに限定されるわけではなく、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ、サルなどの哺乳動物に由来するものであってもよい。
　ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を含む培地で肝細胞を培養することにより、老化を抑制したり、可塑性を増大させることができる。
　培地としては、２で上述した培地（肝細胞から肝前駆細胞への誘導（リプログラミング）に用いた培地）を用いるとよい。すなわち、基礎培地としては、SFD培地（WO2016093222に記載）、（DMEM/F12、DMEM、IMDM、RPMI1640、Williams' Medium E）などを用いることができ、基礎培地にFGFファミリーのメンバーを添加するとよい。
　培地中におけるFGFファミリーのメンバーの濃度は、適宜調整すればよい。例えば、FGFファミリーのメンバーとして、FGF2を使用する場合には、FGF2の濃度は、通常、0.01～1000 ng/mLであるとよく、好ましくは、0.1～100 ng/mLであり、より好ましくは、1～50 ng/mLである。
　培地に添加してもよい他の成分やその濃度についても、２で上述した通りである。
　培地は、血清含有培地であっても、無血清培地であってもよいが、後述の実施例では、無血清培地とした。
　肝細胞は、ゲル上に播種して培養を行うことが好ましい。使用するゲルは特に限定されないが、GFR Matrigel（Corning社製）などを使用することができる。
　肝細胞は、ラミニンのような組織基底膜の主成分でコーティングされた容器の上で培養されてもよい。
　培養時の温度は特に限定されないが、３０～４０℃とするのが好ましく、３７℃とするのがより好ましい。
　培養期間は特に限定されないが、4～15日とするのが好ましく、5～10日とするのがより好ましい。
４．応用
　本発明により、多能性幹細胞（例えば、iPS細胞等）からの肝細胞や胆管細胞の大量製造が可能となる。
　本発明の方法により創出したヒト肝細胞等は、in vitro における薬物代謝試験・肝毒性試験・肝炎ウイルス感染試験等の産業用途に応用可能である。
　本発明の方法により創出したヒト肝細胞等としては、以下のものを含む。
１．FGFファミリーのメンバー、HGF、IL6ファミリーのメンバー及びデキサメタゾンの存在下で、内胚葉細胞を肝細胞に分化させることを含む、肝細胞の作製方法により作製された肝細胞。
２．FGFファミリーのメンバーの存在下で、肝細胞を培養することを含む、肝前駆細胞の作製方法により作製され、増殖能と肝細胞・胆管上皮細胞への二方向の分化能を持つ、アルファフェトプロテイン（AFP）陰性の肝前駆細胞。
３．２の肝前駆細胞から分化誘導された細胞（例えば、肝細胞、胆管細胞）。
　本発明の方法により創出したヒト肝細胞等は、移植用組成物の主成分として、再生医療に利用することができる。肝細胞の移植部位は、移植可能であればどの部位であってもよいが、頭蓋内、腸間膜、肝臓、脾臓、腎臓、腎被膜下、門脈上などを例示することができる。１回の移植につき、肝細胞の数は、移植部位1 cm2あたり、100000～100000000個であるとよく、1000000～50000000個が好ましく、1000000～10000000個がより好ましい。移植にあたっては、EGF、HGF、ROCK阻害剤、TGF-β受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤などを用いるとよい。移植用組成物は、肝細胞の可塑性を増大させる剤（上述）を含んでもよい。
　また、本発明の方法により創出したヒト肝細胞等を用いて、人工肝臓を製造することもできる。
　さらに、本発明の方法により創出したヒト肝細胞等を非ヒト動物に移植して、キメラ動物を作製することができる。細胞を移植した非ヒト動物（例えば、マウス）は、移植した細胞の由来生物種（例えば、ヒト）の生理機能を模倣しうる。この動物を用いて、創薬化合物の薬物代謝試験や安全性試験などを行うことができる。非ヒト動物は、肝不全であるとよい。肝不全は、ガンシクロビルを投与することにより、誘導することができる。非ヒト動物に肝前駆細胞を移植した場合には、非ヒト動物内で、移植された肝前駆細胞が増殖及び／又は分化しうる。本発明の方法により作製された肝細胞を移植することにより、非ヒト動物の肝再生が促進する。非ヒト動物としては、マウス、ラットなどを例示することができる。移植の部位や移植に用いる肝細胞の数は、ヒトへの移植の場合と同様とすればよい。
　さらにまた、本発明により、ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を用いて、肝再生を促進することが可能となる。本発明は、ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を有効成分として含む、肝再生促進剤を提供する。本発明は、ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を医薬的に有効な量で被験者に投与することを含む、肝再生を促進する方法を提供する。ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤については上述した。
　ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤は、肝障害を起こした肝臓の再生を促進することができる。肝障害は、ウイルス性肝炎（A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルスの感染によるもの）、アルコール性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性肝硬変、薬剤性肝炎、脂肪肝（アルコール性、非アルコール性）、外科手術による肝臓の切除、外傷による肝臓の損傷、老化、肝線維症、肥満にともなう肝障害などによりもたらされうる。ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤は、医薬として、これらの疾患や障害の治療及び/又は予防に用いることができる。
　ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤は、塩や溶媒和物の形態であってもよい。
　ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を常法により製剤化した医薬製剤（例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤など）として、被験者（ヒト又は動物）に投与することができる。例えば、ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤がNaBである場合、有効成分の量に換算して、１日あたり約　10　～　100000　 mg/kg（体重）、好ましくは１日あたり約　100　～　10000　 mg/kg（体重）の投与量で、１回または数回に分けて経口又は非経口（例えば、経鼻、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内など）投与するとよいが、その投与量や投与回数は、症状、年齢、投与方法などにより適宜変更しうる。NaB以外のヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を用いる場合は、上記投与量のNaBと同等の効果を奏する投与量で用いるとよい。注射剤に製剤化する場合には、蒸留水、生理食塩水などの担体を用いるとよく、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤に製剤化する場合には、デンプン、乳糖、白糖、炭酸カルシウムなどの賦形剤、デンプンのり液、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤など、デンプン、寒天、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤などを用いるとよい。製剤中の有効成分の含有率は、１～９９重量％の間で変動させることができる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの形態をとる場合には、有効成分を５～８０重量％含有させるのが好ましく、注射剤の場合には、有効成分を１～１０重量％含有させるのが好ましい。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例１〕
ヒストンの低アセチル化は、老化に伴いヒト肝細胞の可塑性を損なう。
　我々の結果は、高齢者からの肝移植を臨床においてより有用にするであろう：通常、高齢者の肝組織及び肝細胞は再生能が低い。我々は、ヒト人工多能性幹細胞から肝細胞をいかにして容易に得るかを見出した。これらの肝細胞は、培養皿のなかで肝臓の老化を再現し、そして我々は、肝可塑性(増殖誘導への応答性)が老化と結びついたヒストン低アセチル化によって損なわれることを見出した。ヒストンアセチル化の促進は、肝傷害モデルにおいて、老化した肝細胞の可塑性を改善し、またそれらの再生能を増大させた。
要約
　肝細胞可塑性は、肝再生において重大な役割を果たし、そして老化とともに低下していく。しかし、この低下の基礎をなす根本的原理は不明である。ここで我々は、その基礎となる作用機構を解明するため、ヒト人工多能性幹細胞に由来する肝細胞(hiPSC-Hep)を用いた研究戦略を考案し、長期にわたるhiPSC-Hepの継代培養において老化に関連する特徴の変化、および老化に関連する遺伝子セットの発現情報を蓄積した。さらに、我々は、ヒト肝細胞可塑性はFGF2-MAPK-EZH2によって制御され、老化とともに徐々に低下することを同定した。注目すべきことに、老化肝細胞の損なわれた可塑性は、ヒストン低アセチル化と強く相関していた。ヒストン脱アセチル化酵素の選択的抑制は、老化したhiPSC-Hepおよび初代ヒト肝細胞の可塑性を著しく改善した。そしてこの効果は、肝傷害モデルにおいて老化した初代ヒト肝細胞の再増殖能を増大させた。したがって、老化と結びついたヒストン低アセチル化は肝細胞可塑性を損ない、そしてヒストンアセチル化は、高齢者における肝再生能の改善のための治療ターゲットとなりうる。
序論
　肝再生は、肝臓に新しい組織を再生させて失われた部分（死滅した細胞塊、組織）と置換させる独特の現象である。この現象のゆえに、肝臓は老化しない器官のように思われる（Timchenko, 2009）。しかし、臨床報告書は、老化が非アルコール性脂肪肝疾患、アルコール性肝疾患およびＣ型肝炎を含む肝疾病の主要リスク因子であることを示しており（Kim et al., 2015）、そして高齢者からの肝移植は、若いドナーからの移植に較べて、悪い生存率および全般的に悪い結果をもたらす(Durand et al., 2019; Germani et al., 2012)。これらのことは、老化が肝臓の再生能を弱めうることを示している。実際、老化と結びついた肝再生の低下は、半世紀前に研究者らが部分肝切除後の老化ラット肝臓において増殖応答がかなり低下していることに気付いた時に発見された（Bucher et al., 1964）。この現象は、他の齧歯動物モデルにおいても確認され（Fry et al., 1984; Lakova et al., 2003）、そして再生の悪化と連結しうる、老化と結びついたいくつかの変化（例: 代謝異常、エピジェネティック変化、増殖因子への低い応答性、およびテロメアの長さの短小化）が見出された（Aikata et al., 2000; Sato et al., 2017; Sawada, 1989; Timchenko, 2009）。しかし、老化が肝再生の悪化にどのように寄与するのか、また高齢者におけるこの再生能をいかにして改善するかは、特にヒトの場合、未だに不明である。
　肝細胞は肝質量の70％以上を占める。そして、集積された証拠は、肝細胞可塑性が肝再生能の維持において重大な役割を果たすことを示唆している(Kopp et al.,; Li et al., 2016)。マウスにおける系列トレース実験は、肝傷害に応答して、肝細胞は増殖性の前駆細胞様細胞に転換して失われた幹細胞および胆管細胞と置換しうることを示した（Tarlow et al., 2014; Yanger et al., 2014; Yanger et al., 2013）。このような前駆細胞様細胞は、硬変ヒト肝臓においても検出された（Deng et a., 2018）。したがって、老化と肝細胞可塑性の間の内因性の関連を調べる研究は、ヒト肝再生における老化の役割を理解する助けになるであろう。ヒトを対象としたトレース実験の限界により、我々はヒト肝細胞の可塑性が培養皿の中で果たしてモデル化できるかどうか疑問に思った。最近、いくつかのグループが、初代ヒト肝細胞（PHH）を再増殖能を備えた増殖状態に誘導できることを報告したが（Fu et al., 2019; Kim et al., 2019; Zhang et al., 2018）、これらの増殖性PHHは制限された二分化能分化を有するのみである。さらに、現在入手可能なPHHは、複雑で信頼できない外因子をもつ肝疾患を有する死体または患者の肝組織に由来するもののみである。そのような外因子は、老化と肝細胞可塑性の間の有益な関連を発見するための、上記PHHの使用を困難にする。
　これらの内因性の関連を解明するため、肝細胞の理想的な一連の実験用試料は、同一起源をもつ必要がある。すなわち、同一のヒト個体から異なる年齢で採取する必要がある。しかし、同一ドナーからのそのような肝細胞を得ることは困難である。過去10年間に、再生医療および疾患モデル作製への応用を目指して、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)の分化誘導において広範な進展があり(Stadtfeld and Hochedlinger, 2010; Studer et al., 2015)、いくつかのラボでは、老化と結びついた神経変性疾患をモデル化するためにhiPSCの使用を可能とする方法が採用された(Miller et al., 2013; Vera et al, 2016）。不運なことに、生物学的老化過程を効果的に再現できるhiPSC由来肝細胞(hiPSC-Hep)は、今日まで報告されていない。これは、部分的には、hiPSC-Hepの極めて迅速な変性のためである（Nie et al., 2018）。本論文で、我々は、老化マーカーと特徴を徐々に蓄積しながら肝機能を長期にわたって維持できるhiPSC-Hepを創出するための単純で便利な方法を確立した。我々は、hiPSC-Hepの可塑性が老化と結びついたヒストン低アセチル化によって有意に低下することに気付いた。さらに、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDACi)を用いた処理は、老化したhiPSC-HepおよびPHHの可塑性を明らかに増大させ、この効果は肝損傷マウスモデルにおいて老化したPHHの再生能を顕著に改善した。
結果
改善された機能を有するhiPSC-Hepの簡便な創出
  HiPSC-Hepを用いて肝臓老化モデルを作製するため、我々はhiPSC由来肝オルガノイド形成の際の経験に頼ることにより、hiPSC-Hep創出のための2段階法を開発した(Nie et al., 2018) (図1-1Aおよび図1-2A)。第1段階では、hiPSCを高度に純粋な内胚葉細胞集団に効率的に分化させた(図1-1Bおよび1-2B)。第2段階では、我々は、スクリーニングした肝増殖および分化因子を含有する肝分化培地(HDM)を用いて、内胚葉細胞を誘導して直接肝細胞に分化させ、そしてこれらの系列がALB発現を有する肝細胞に成熟することを見出した（図1-2Cおよび1-2D）。
　内胚葉細胞から肝細胞への分化の間、これらの系列は肝細胞に特徴的な形質の変化、およびアルブミン(ALB)分泌の増加を伴う成熟を常に示した(Si-Tayeb et al., 2010) (図1-1 A-Cおよび1-2 E）。内胚葉細胞の分化5日後に、これらの系列は初期肝臓運命遺伝子(early hepatic-fate genes)発現の迅速な増大および内胚葉関連遺伝子発現の急速な低下を示した(図1-2B)。免疫染色は、これらの細胞がAFP、CK19、HNF4Aおよび KI67の積極的発現およびALBの控えめな分泌を有する胚芽細胞状態にあることを明らかにした（図1-1 Cおよび1-2 E）。さらに10日間インキュベートした後、これらの系列はALB発現細胞に成熟し(図1-1 Bおよび1-1 C)、タイトジャンクション構成タンパク質であるE-カドヘリン(E-CAD)および zona occludens 1 (ZO-1; 図1-2 F)の発現；ならびにICGの取込みおよび排出、グリコーゲン貯蔵、および低密度リポタンパク質の取込み等の肝機能（図1-2 G）を示す。従来のプロトコールによって得られるhiPSC-Hep (K-HepおよびST-Hep）(Kajiwara et al, 2012; Si-Tayeb et al., 2010) と比較して、これらの新たに創出されたhiPSC-Hep(N-Hep)は、肝特異的遺伝子の増強された発現ならびにALB分泌によって特徴づけられる（図1-2 Hおよび1-2 I）。したがって、本研究は、改善された肝機能を有するhiPSC-Hepを創出するための単純で便利なプロトコールを提供する。
肝老化過程の自発的再現　
　以前に報告されたhiPSC-Hep(Nie et al., 2018)の迅速な変性と対照的に、N-Hepは長時間にわたって細胞形態および肝機能を保持した（図1-1 Dおよび1-2 J）。すなわち、細胞培養の72日目まで、我々はALB分泌の低下を伴った多核細胞の形成を観察した（図1-1 Dおよび1-2 J）。82日目(D82)に、N-Hepはその肝細胞形態を喪失し、高比率のアポトーシス細胞を示した（図1-2 K）。その一方で、我々は培養中にN-Hepの細胞容量が増大していくことに気付いた。これは、細胞老化の際に頻繁に観察される現象である（Neurohr et al., 2019）(図1-2 L)。N-Hepが老化のプロセスを経ているのかどうか試験するため、我々はトランスクリプトーム解析を実施してD22-Hep (hiPSCより22日後に発生した肝細胞)、D52-HepおよびD72-Hepを比較し、老化関連遺伝子がD72-Hepにおいて豊富に発現されていることを見出した（図1-1 E）。ジーンオントロジー解析は、老化に関連した肝変化 (Kim et al., 2015) (炎症性応答の増大およびDNA損傷を含む)もまた、D72-Hepにおいて高められていることを示した(図1-2 M)。さらに、細胞内活性酸素種(ROS)および細胞老化関連βガラクトシダーゼ(SA-β-gal)のレベルが(これらは老化の細胞性特徴の２つである)、D22からD72へと徐々に増大していた（図1-1 F-H）。これらの結果は、長期培養中におけるN-Hepの自発的老化を示していた。
　次に、このN-Hepの老化プロセスがin vivoでの肝細胞の老化プロセスを再現できるのではないかと考えた。D22-Hep、D72-Hep、若いPHH（2months, 2M-PHH）、および高齢者のPHH（78 years, 78Y-PHH）の間の転写の違いを比較することにより、主成分分析は、D22-Hepの遺伝子シグネチャは2M-PHHの遺伝子シグネチャと類似しており、D72-Hepの遺伝子シグネチャは78Y-PHHの遺伝子シグネチャに非常に近いということを示した（図1-3 A）。さらに、KEGGパスウェイ解析では、in vitro老化プロセスにおいて発現が増加する35のシグナル経路がin vivo老化プロセスにおいても同様に発現が上昇すること、そしてin vitro老化プロセスにおいて発現が低下する35のシグナル経路もまたin vivo老化プロセスにおいて発現が減少することを明らかにした（図1-3 BとC）。これらの結果は、N-Hepの老化プロセスがin vivoでの肝細胞の老化プロセスを表現（代替する）する可能性があることを示唆している。
ヒト肝細胞の可塑性誘導におけるFGF2の必須機能
　次に、我々は、N-Hepは肝細胞がin vivoで有するのと同じ可塑性を有するかどうかを試験した。N-Hepはin vivoにおいて、二分化能分化を有しつつ増殖するよう誘導することができる（図2-1 A）。肝細胞増殖を誘導するため、我々は若いN-Hep (D22-Hep)を、以前に記載された小分子カクテルを含有する基礎培地(BM+SMs) (齧歯動物肝細胞の増殖を誘導することができる)（Katsuda et al., 2017）を用いて培養した。6日後、リプログラミングされた細胞は、リプログラミングされた齧歯動物の肝細胞に見られる継続的増殖能を獲得しなかったが（Katsuda et al., 2017）(図2-2 A）、我々は細胞増殖を観察した（図2-1 BおよびC）。これらのデータは、齧歯動物肝細胞とヒト肝細胞の間の固有の差異が、可塑性誘導の結果に重大な影響を及ぼすのかもしれないことを示していた。我々は以前に、FGF2が肝細胞の分化および成熟を促進する重大な因子であること（図2-2 CおよびD）、そして肝ホメオスタシスおよび再生における重要なサイトカインとしても知られている(Steiling et al., 2003）ことを確認した。我々は、培地へのFGF2の添加によって、誘導される増殖能が大幅に向上することを見出した（図2-1 B、2Cおよび2-2 B）。注目すべきことに、FGF2によってリプログラミングされた細胞は、BM+SMsと呼ばれる上記培地中で、FGF2を添加された場合に、継続的に増殖する能力を獲得した。このFGF2を添加した培地を我々はリプログラミング培地（RM）と称した(図2-2 A)。定量的PCR（Q-PCR）解析は、これらのリプログラミングされた細胞が細胞周期遺伝子の増強された転写を特色とすることを明らかにした（図2-1 D）。また、免疫蛍光分析は、増殖性細胞がまだ肝細胞系列に属していることを示した。なぜなら、それらの細胞はKI67およびHNF4Aの両方に対して陽性であったからである(図2-1 E)。それゆえ、我々はこれらのリプログラミングされた細胞（肝前駆細胞）を増殖性肝細胞(pHC)と名付けた。タイムラプス撮影は、他のhiPSC-Hepと同様に、pHCが単一の肝細胞から得られうることを示唆した(図2-2 CおよびD)。D22-Hepと比較して、D22-pHCは肝-幹／前駆細胞-関連遺伝子の高い転写（図2-1 F）および肝機能関連遺伝子のダウンレギュレーション(図2-1 G)を示した。さらに、D22-pHCはHNF4A、SOX9および CK19 に対して陽性染色を示したが、ALB および AFPに対しては染色されなかった(図2-1 H, 2-2 Eおよび 2-2 F)。
　FGF2がいかにして肝細胞増殖の誘導を引き起こすかを決定するため、我々は細胞をPD0325901 および LY294002 と共にインキュベートし、MAPK および PI3K シグナル伝達経路をそれぞれブロックした。これらは、FGF2の下流にあるシグナル伝達カスケードであり、細胞増殖に関与している (Goetz and Mohammadi, 2013)。注目すべきことに、LY294002ではなく PD0325901が、FGF2媒介細胞増殖を用量依存的に抑制した（図2-1 I)。トランスクリプトーム解析およびタンパク質-タンパク質相互作用ネットワーク解析(Jensen et al., 2009)を組み合わせて、我々は EZH2 が全てのアップレギュレーションされた遺伝子の中央ノード(central node)に存在して、細胞周期の遺伝子クラスターと上皮-間葉移行の遺伝子クラスターを連結していることを見出した(図2-2 G)。さらに、RMで処理した細胞は、PD0325901によって抑制されたEZH2 転写の明らかなアップレギュレーションを示した（図2-1 J および2-2 H)。特異的インヒビターである3-デアザネプラノシンA塩酸塩(DZNep)を用いてEZH2 機能を無効にすることにより、我々はEZH2転写規模が僅かに変化しただけで、誘導される細胞増殖の重大な減弱を検出した（図2-2 IおよびJ）。これは、FGF2-MAPK 軸によって活性化されるEZH2 は、ヒト肝細胞の誘導増殖に強く関与していることを示している。さらに、機能喪失および獲得実験は、FGF2-EZH2 軸がpHCの増殖能の維持（細胞集団倍加時間19.86 ± 0.70 hr）に不可欠であることを示唆した(図2-2 KおよびL)。長期にわたる増殖は、これらのD22-pHCが、その形態、増殖速度および核型に明白な変化を示すことなく、少なくとも20回継代可能であることを示した（図2-2 MおよびN）。このように、我々はFGF2-MAPK-EZH2 軸によって制御されているN-Hepの細胞増殖を成功裏に誘導した (図2-1 K)。
D22-pHCの二分化能分化
　次に、我々はpHCの二分化能分化を評価した。肝細胞分化を誘導するため、我々はD22-pHCを新たに開発したHDM中で培養した。15日後、分化した細胞は制限されたALB産生および非定型の形態を示した (図3-2 AおよびB)。分化過程を強化するため、我々は肝発達(development)と再生を媒介するビタミンA代謝物である(Negishi et al., 2010)レチノイン酸(RA; 図3-1 A)を添加することによりHDMを改変し、最終的にALB産生および典型的肝細胞形態における重大な改善を得た（図3-2 A-C）。D22-pHC由来肝細胞 (D22-pHC-Hep) は、機能遺伝子の発現ならびにALB分泌の明らかな増大を示した。それらは元のD22-Hepのそれらと等価であった (図3-1 B, Cおよび3-2 D)。さらに、D22-pHC-Hep は自らの細胞間で密着結合を形成し、アンモニア排出能および肝機能（ICGの取込みおよび排出、グリコーゲン貯蔵、および低密度リポタンパク質の取込み）を獲得した(図3-1 D, E および3-2 E)。
　胆管細胞への分化を誘導するため、我々は胆管発生および分化の方法 (Francis et al., 2004; Sampaziotis et al., 2015; Sampaziotis et al., 2017)を採用し、図3-1 Fに示す胆管細胞への分化法を確立した。2日間のインキュベーション後、1個のD22-pHCはリング状の構造体に成長し、次に10日以内に徐々にシスト（cyst）構造体に発達していった (図3-1 F, 3-2 FおよびG)。Q-PCR 解析によると、このシスト構造体は胆管細胞特性遺伝子のアップレギュレーションされた転写を特色としていた（図3-1 Gおよび3-2 H)。次に、これらのシストの胆管細胞運命を、CK19、 F-ACTIN、 および SOX9染色の陽性結果ならびにAFP、 ALBおよびHNF4A染色の陰性結果によって確認した（図3-1 H）。さらに、透過型電子顕微鏡観察は、これらのシストが成熟した胆管の特徴（頂端および側底部の細胞膜を備えた管腔、微絨毛、頂端膜上の一次繊毛、密着結合および多胞体を含む）を有することを示した（図3-1 Iおよび3-2 I)。また、これらの胆管細胞は胆管機能を有していた：１）管腔へのローダミン123の輸送；この機能は、多剤耐性タンパク質１トランスポーターのインヒビターであるベラパミルによってブロックされた（図3-1 JおよびK)、および２）管腔からの胆汁酸を特異的に排出（図3-2 J)。それゆえ、これらのデータは、D22-Hep (若いN-Hep)が、二分化能を備えた増殖状態の誘導を可能とする十分な可塑性を有することを示していた。
老化過程における肝細胞可塑性の低下
　老化と肝細胞可塑性の間の内在性の関連を調べるため、我々は新たに開発したRMを用いて、老化過程においてN-Hepの可塑性を誘導した（図4-1 A）。６日後、我々は、D22-HepからD82-Hepへと老化が進む間に、誘導されたpHCの細胞増殖の急激な低下を観察した（図4-1 BおよびC）。D22-Hepにおいて大量に誘導されたpHCの増殖と比較して、同一手順を用いたにもかかわらず、リプログラミングされたD52-Hepでは、ほんのわずかの増殖性肝細胞（D52-pHC）コロニーが検出されたのみであり(図4-1 Bおよび4-2 A)、そしてD62-、D72- およびD82-Hepでは増殖性細胞／コロニーは殆ど誘導されなかった(図4-1 Bおよび4-2 B)。次に、我々は、トランスクリプト―ム解析および京都遺伝子ゲノム百科事典(KEGG)パスウェイ解析を実施して、老化中におけるN-Hepの変化を調べた。驚くべきことに、老化しつつあるN-Hepは、脂肪酸、グルコースおよびアミノ酸の代謝経路の衰弱によって特徴づけられ(図4-2 CおよびD)、これら代謝経路の中心的中間体であるアセチルコエンザイムA（CoA)の重大なダウンレギュレーションを示した（図4-1 DおよびE）。アセチル-CoAはまた、ヒストンアセチル化のアセチル源として、メタボロミクスをエピジェネティックスに結び付けるキーノード(key node重要な結び目)でもある(Sebastian and Mostoslavsky, 2017). 従って、我々は老化によるヒストンアセチル化の変化を定量的に解析した。注目すべきことに、老化しつつあるN-Hepでは、H3K9、H3K18および H3K27のそれぞれのLys残基におけるH3ヒストンのアセチル化の低下傾向を示した（図4-1 Fおよび4-2 E-G)。他方、アセチル化によるこれら3種類のヒストン修飾は、それらの誘導されたpHCの増殖能と明確に相関していた（図4-1 G）。これらの所見は、老化と結びついた代謝欠陥がヒストン低アセチル化と結びついていることを示唆し、これが肝細胞可塑性を損なっているのかもしれない（図4-2 H）。
老化したN-Hepの可塑性のHDACiによるアップレギュレーション
　次に、ヒストン低アセチル化が老化に伴う肝細胞可塑性の低下を引き起こすかどうかを調べるため、我々はD52-Hepを誘導過程で酪酸ナトリウム (NaB) または バルプロ酸(VPA)（両者ともヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（HDACi）である）で刺激し、各HDACiがD52-Hepから誘導されたpHCの増殖を顕著に促進することを見出した（図4-1 H, Iおよび4-3 A)。免疫染色は、１つのHDACiによる刺激がHNF4+KI67+ 細胞の割合（%）を有意に高めたことを示した (図4-1 J)。また一方で、上記のような促進は、他の種類のエピジェネティック・レギュレーターまたはインヒビター、例えばトラニルシプロミン（Trany, ヒストン脱メチル化酵素阻害剤）、RG108 (DNA メチルトランスフェラーゼ阻害剤)、およびBIX01294 (BIX, ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤)等を用いた刺激では検出されなかった（図4-1 HおよびI）。さらに、D52-pHC(D52-Hep由来 pHC)が継続的に増殖して肝細胞および胆管細胞に分化する能力を獲得したのに対し、HDACiによる刺激はD52-Hepの可塑性を向上させたことが明らかであった(図4-3 B-F)。
　上記実験の１つにおいて、我々はFGF2によって活性化されたEZH2転写が、増殖性肝細胞（pHC）の増殖において決定的な役割を果たすことを見出した（図2-1 I, Jおよび 2-2 G-J)。他方、活性化されたEZH2の転写は、リプログラミングされたD52-Hep（D52-pHC）においては、リプログラミングされたD22-Hep（D22-pHC）におけるよりもはるかに低かった（図4-3 G)。また一方で、HDACiによる刺激はEZH2 転写を高め、D52-Hepから誘導されたD52-pHCの増殖を促進し（図4-1 Kおよび4-3 H)、 そして D52-pHCはD52-Hepと比較してより大きいヒストンアセチル化を示した(図4-3 I)。これらのデータは、ヒストン低アセチル化がEZH2転写の調節に関与しているかもしれないことを示唆した。EZH2プロモーターを研究するために、網羅的ウェブツール(https://www.genecards.org) および ENCODE データセット(Consortium, 2012)を用いて比較解析を行なったところ、我々は最高スコアを有する２つのEZH2 エンハンサー（GH07J148882 および GH07J148940）がアセチル化ヒストンの結合部位であることを見出した（図4-3 J）。さらに、抗-H3K9ac, 抗-H3K18acおよび抗-H3K27ac 抗体に基づくクロマチン免疫沈降およびPCR解析（ChIP-PCR）によれば、D52-Hepはアセチル化ヒストンのGH07J148882（これは転写開始部位に近い）への結合が有意に低下していることを示した（図4-1 Lおよび4-3 J)。これらのデータは、ヒストン低アセチル化がEZH2転写の不十分な活性化をもたらし、そしてこの問題が老化した肝細胞における可塑性の誘導を妨げることを暗示していた。さらに、HDACi による刺激は、D62-Hep、D72-Hepおよび D82-Hepから誘導されたそれぞれのpHCの増殖を強化した（図4-1 M)。これらの結果は、ヒストン低アセチル化によって媒介されるEZH2転写の不活性化が、老化肝細胞の可塑性を損なうこと、そしてこの可塑性はHDACiによって効果的に回復されうることを例証した(図4-3 K)。
PHHの可塑性誘導
　次に、我々は、N-Hepにおいて明らかになった作用機構がPHHにおける作用機構と一致するかどうかを試験した。月齢2か月(2M-PHH)、年齢39歳 (39Y-PHH)および 78 歳 (78Y-PHH)のドナー由来のPHHにおけるヒストンのアセチル化を解析することにより、我々はH3K9ac, H3K18acおよび H3K27acの量も老化とともに低下することに気付いた（図5-1 A）。N-Hepと比較すると、2M-PHHのアセチル化レベルはD52-Hepのそれに近かった。そして、39Y-PHHおよび 78Y-PHHのアセチル化レベルは、D62-Hepのそれよりも低かった(図5-1 B)。実際、pHHにおける老化と結びついた低アセチル化は、可塑性誘導の衰弱をも伴っていた。他方、NaB (HDACi)による刺激は、可塑性誘導効率を有意に増大させた（図5-1 C, 5Dおよび5-2 A)。元のPHHとのトランスクリプト―ム比較によれば、PHH由来のpHC(PHH-pHC)においては、細胞周期関連および幹／前駆細胞関連特性遺伝子の発現レベルの上昇および肝機能特性遺伝子の発現レベルの低下を示した(図5-1 E, Fおよび5-2 B)。免疫蛍光分析は、49.8% (2M-pHC)、 32.9% (39Y-pHC)および12.2% (78Y-pHC) の PHH-pHCは、HNF4Aおよび KI67の発現について両方とも陽性であることを示し、そしてPHH-pHCの殆どは HNF4A、SOX9および CK19を発現していた (図5-1 G)。さらに、PHH-pHCはラミニン511をコーティングした培養皿で増殖能を示し（図5-2 C) 、そして肝細胞および胆管細胞に分化する二分化能分化を示した (図5-2 D-J)。これらの結果は、N-Hepの老化過程と同様、PHHの老化過程もまた肝細胞可塑性を損なうヒストン低アセチル化に関連していることを示した。これらの所見は、ヒト肝老化に関する研究のための細胞源としてのN-Hepの有用性を確認した。
老化PHHの可塑性誘導後におけるpHCのin vivo再増殖
次に、我々は老化したPHH-pHCの肝臓内における再増殖性を、ガンシクロビル誘導肝不全後のTK-NOGマウスを用いて評価した (Hasegawa et al., 2011)。移植4週間後に、78Y-PHHまたは 78Y-pHCを移植したマウスは、ヒト ALB (hALB)、ヒト A1AT (hA1AT)およびヒトフェリチン(hFerritin)のアッセイで検査結果が陽性であったが、ヒトAFPに対して陽性であったものは殆どいなかった(hAFP; 図6-1 A-C及び6-2 A)。
移植片2M-PHH と 78Y-PHHの間のhALB、hA1ATおよび hFerritinの大きなギャップとは対照的に、78Y-pHC 移植片と2M-pHC移植片との間には殆どギャップは見られず、78Y-PHHにおける対応レベルよりもはるかに高く、寧ろ若い初代肝細胞に匹敵しうる産生を示した(図6-1 A-C)。また、hALBについては遺伝子発現レベルの詳細な確認をQ-PCRにより行なった（図6-2 B)。さらに、免疫蛍光分析は78Y-pHC移植片が、78Y-PHH移植片よりも多数のhALB+グラフトならびにクラスター（クラスターあたりの細胞数＞５）をもたらしたことを示唆した（図6-1 D, Eおよび6-2 C)。注目すべきことに、78Y-pHC移植片群における50％以上のhALB+グラフトはCK19を発現した。そしてこの割合（％）は、78Y-PHH移植片群におけるそれよりもはるかに高かった（図6-1 D およびF)。さらに、我々は78Y-pHC移植片においてALB+KI67+ クラスターをいくつか検出したが、78Y-PHH 移植片においては全く検出されなかった (図6-2 D)。
　さらに、78Y-pHC移植片におけるhALB産生は78Y-PHH 移植片のhALB産生よりもはるかに高かった (図 6-1 G)。可塑性誘導中に肝機能遺伝子発現の重大な低下がみられたので（図5-2 Bおよび6-2 E)、我々は移植されたPHH-pHCがin vivoで成熟したかどうかを調べた。移植後12週目に、ヒト遺伝子特異的プライマーを用いたQ-PCRによると、移植されたPHH-pHCは肝機能遺伝子（特にCYP450酵素）の発現における大幅な回復およびCK19のダウンレギュレーションを示した(図6-2 E)。免疫蛍光分析において、PHH-pHC移植片はhALB, CYP3A4, hNuMA, hA1ATおよび hCK8/18の発現について陽性の結果を示し、hCK19 および hAFPは殆ど発現しなかった（図6-1 H および6-2 F)。ZO-1染色の陽性結果は、PHH-pHCが毛細胆管の形成および双極性肝細胞配置を特色とする肝組織に成熟したことを示していた（図6-1 H）。これらの結果は、老化したPHHを用いて実施した可塑性誘導が再増殖能を顕著に高め、そして移植後に成熟し充分な肝機能を発揮しうることを意味していた。
HDAC阻害剤は高齢モデルにおけるpHCsの誘導を改善する。
　最後に、HDAC阻害剤が高齢モデルにおける肝前駆細胞の誘導を改善できるかどうかを調べた。 マウスで肝前駆細胞を誘導するために、21日間、コリン欠乏、エチオニン補充（CDE）食を若年および高齢のマウスに与えました。GOTおよびGPTの検出は、慢性肝障害が若年および高齢マウスで発生したことを示し、またマウスモデルの肝臓は非アルコール性脂肪性肝疾患の特徴を呈すること示した(図６－３ A-C)。 さらに、高齢モデルの生存率はわずか60％であり、高齢モデルでのKi67陽性細胞とEpcam陽性細胞の誘導は若いモデルのそれよりも有意に低いことを明らかにし、それらのことはマウス肝臓での肝前駆細胞の誘導も老化と伴に損なわれていることを示唆している(図６－３ D-H)。NaB処理により、誘導されたKi67陽性かつEpcam陽性のポピュレーション（細胞集団）は高齢モデルで有意に増加し、高齢モデルの生存率もまた改善された (図６－３ D-H)。
考察
　肝老化は、肝細胞がホメオスタシスに必要な機能と可塑性を徐々に失っていく正常な生理学的過程である (Timchenko, 2009)。老化と結びついた肝疾患に対する、そして高齢者における肝再生能の改善を目指す、戦略の開発は、老化が肝細胞可塑性を制御する作用機構の理解欠如によって妨げられてきた。hiPSCの分化誘導技術を適用することにより、我々は同一の遺伝子的背景を有する若い肝細胞および老化した肝細胞を創出した。この準備は、我々が、老化と結びついたヒストン低アセチル化は肝細胞可塑性を損なうことを明らかにするのを助けた。他方、ヒストンアセチル化のアップレギュレーションは、老化した肝細胞の可塑性を有意に改善しうる。この仮定に基づいて、我々は老化したPHH(78歳のドナー由来)から成功裏にpHCを得た。そして肝損傷モデルにおいて、このpHCは元の老化PHHが有していたものよりも大きな再増殖能を示した。
　肝移植のドナー不足のゆえに、高齢ドナー由来のグラフトの使用がより必要になりつつあり、ウエイティングリストと関係づけられた死亡率を低下させる助けになる。しかし、老化肝細胞の最初の乏しい再生能は、移植の失敗および悪い結果を導きうる(Bernal and Wendon, 2013; Durand et al., 2019; Uemura et al., 2007)。累積した証拠は、高齢者に由来するグラフト中の肝細胞は増殖応答が低く、この不利な点が肝再生を損なうことを示している(Ono et al., 2011;　Schmucker and Sanchez, 2011)。我々の肝傷害モデルにおける若いPHHの移植と比較して、老化PHH移植片はより少ない量のヒト肝臓タンパク質を産生し、このように若いグラフトと老化グラフトの間の臨床結果における相違を再現した。注目すべきことに、ヒストンアセチル化のアップレギュレーションは老化PHHの増殖を顕著に促進した。そして老化PHHは再生能の大幅な改善を示した。このことは、高齢者由来グラフト（肝細胞に固有の増殖能を効果的に活性化または促進してある）の移植は、グラフトの生存および臨床結果を改善するに違いないことを示唆している。
　老化過程は、常に代謝過程における動的な変化およびエピジェネティックな改変によって特徴づけられるが (Peleg et al., 2016; Ren et al., 2017)、これらの変化がいかにして細胞機能を制御するのかは、肝臓研究の分野では謎のままである(Horvath et al., 2014; Sato et al., 2017)。本論文において、我々は、老化、肝細胞可塑性、代謝およびエピジェネティックな改変の間の深い関係を明らかにした。特に、肝細胞老化は代謝機能の低下を伴うことが判明し、これはアセチル-CoAを介したヒストンアセチル化の制御に影響を及ぼし、それによって肝細胞可塑性の損傷を引き起こす。齧歯動物の肝細胞と対照的に (Katsuda et al., 2017)、 FGF2によって活性化されるEZH2 転写は、ヒト肝細胞の可塑性を誘導するのに必要であり、そして老化肝細胞におけるEZH2エンハンサーの低アセチル化はそれらの細胞の可塑性を損なうことが見出された。数人の研究者は、老化したマウス肝臓において、カロリー制限がヒストンアセチル化における老化依存性の低下を逆転させ、細胞周期遺伝子の転写を活性化することができると気付いたが(Sato et al., 2017)、本研究が成されるまで、培養皿の中で細胞代謝を改善することによりヒストンのアセチル化を増強する適切な方法は存在しなかった。ヒストンアセチル化と脱アセチル化の可逆性を考慮して、我々はHDACsの抑制が老化肝細胞の可塑性を大幅に改善しうることを見出し、さらにヒストン低アセチル化による老化肝細胞の可塑性の制御を確認し、老化肝細胞の可塑性を改善するための実行可能な戦略を提案した。
　ホメオスタシスを危うくし、また肝再生を制御することに加えて、老化は肝疾患の発生においても重大な役割を果たす(Kim et al., 2015)。老化におけるミトコンドリア機能の低下は損傷への脆弱性を高めることが報告されており(Kim et al., 2015)、そして老化はアルコール性肝炎の好ましくない成り行き、およびC型肝炎における繊維症進行の預言者であると考えられる(Forrest et al., 2005; Poynard et al., 2001)。本研究において、我々は、hiPSC-Hepが肝臓の老化過程を再現できることを立証した。また一方で、我々のバイオインフォーマティクス解析は、老化したhiPSC-Hepは血管新生および繊維形成を促進する遺伝子を発現する傾向があることを示しており(図1-2 M)、老化と肝線維症の間の深い繋がりを明らかにするため、および老化関連肝疾患の効果的な治療戦略を開発するためにhiPSC-Hepが有用であろうことを示唆している。
　結論として、我々は培養皿の中で肝細胞の老化過程を再現し、肝細胞可塑性が老化と結びついたヒストン低アセチル化によって損なわれることを見出した。さらに、ヒストンアセチル化の促進は、老化した肝細胞の可塑性を改善し、肝損傷モデルにおいてそれらの細胞の再増殖能を強化し、それによって高齢者において肝再生を促進するための有望な治療戦略を示す。
参照文献
Aikata, H., Takaishi, H., Kawakami, Y., Takahashi, S., Kitamoto, M., Nakanishi, T., Nakamura, Y., Shimamoto, F., Kajiyama, G., and Ide, T. (2000). Telomere reduction in human liver tissues with age and chronic inflammation. Experimental cell research 256, 578-582.
Bernal, W., and Wendon, J. (2013). Acute liver failure. The New England journal of medicine 369, 2525-2534.
Bucher, N.L., Swaffield, M.N., and Ditroia, J.F. (1964). The Influence of Age Upon the
Incorporation of Thymidine-2-C14 into the DNA of Regenerating Rat Liver. Cancer research 24, 509-512.
Consortium, E.P. (2012). An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature 489, 57-74.
Deng, X., Zhang, X., Li, W., Feng, R.X., Li, L., Yi, G.R., Zhang, X.N., Yin, C., Yu, H.Y., Zhang, J.P., et al. (2018). Chronic Liver Injury Induces Conversion of Biliary Epithelial Cells into Hepatocytes. Cell stem cell 23, 114-122 e113.
Durand, F., Levitsky, J., Cauchy, F., Gilgenkrantz, H., Soubrane, O., and Francoz, C. (2019). Age and liver transplantation. Journal of hepatology 70, 745-758.
Forrest, E.H., Evans, C.D., Stewart, S., Phillips, M., Oo, Y.H., McAvoy, N.C., Fisher, N.C., Singhal, S., Brind, A., Haydon, G., et al. (2005). Analysis of factors predictive of mortality in alcoholic hepatitis and derivation and validation of the Glasgow alcoholic hepatitis score. Gut 54, 1174-1179.
Francis, H., Glaser, S., Ueno, Y., Lesage, G., Marucci, L., Benedetti, A., Taffetani, S., Marzioni, M., Alvaro, D., Venter, J., et al. (2004). cAMP stimulates the secretory and proliferative capacity of the rat intrahepatic biliary epithelium through changes in the PKA/Src/MEK/ERK1/2 pathway. Journal of hepatology 41, 528-537.
Fry, M., Silber, J., Loeb, L.A., and Martin, G.M. (1984). Delayed and reduced cell replication and diminishing levels of DNA polymerase-alpha in regenerating liver of aging mice. Journal of cellular physiology 118, 225-232.
Fu, G.B., Huang, W.J., Zeng, M., Zhou, X., Wu, H.P., Liu, C.C., Wu, H., Weng, J., Zhang, H.D., Cai, Y.C., et al. (2019). Expansion and differentiation of human hepatocyte-derived liver progenitorlike cells and their use for the study of hepatotropic pathogens. Cell research 29, 8-22.
Germani, G., Theocharidou, E., Adam, R., Karam, V., Wendon, J., O'Grady, J., Burra, P., Senzolo, M., Mirza, D., Castaing, D., et al. (2012). Liver transplantation for acute liver failure in Europe: outcomes over 20 years from the ELTR database. Journal of hepatology 57, 288-296.
Goetz, R., and Mohammadi, M. (2013). Exploring mechanisms of FGF signalling through the lens of structural biology. Nature reviews Molecular cell biology 14, 166-180.
Hasegawa, M., Kawai, K., Mitsui, T., Taniguchi, K., Monnai, M., Wakui, M., Ito, M., Suematsu, M., Peltz, G., Nakamura, M., et al. (2011). The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and biophysical research communications 405, 405-410.
Horvath, S., Erhart, W., Brosch, M., Ammerpohl, O., von Schonfels, W., Ahrens, M., Heits, N., Bell, J.T., Tsai, P.C., Spector, T.D., et al. (2014). Obesity accelerates epigenetic aging of human liver. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111, 15538-15543.
Iakova, P., Awad, S.S., and Timchenko, N.A. (2003). Aging reduces proliferative capacities of liver by switching pathways of C/EBPalpha growth arrest. Cell 113, 495-506.
Jensen, L.J., Kuhn, M., Stark, M., Chaffron, S., Creevey, C., Muller, J., Doerks, T., Julien, P., Roth, A., Simonovic, M., et al. (2009). STRING 8--a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic acids research 37, D412-416.
Kajiwara, M., Aoi, T., Okita, K., Takahashi, R., Inoue, H., Takayama, N., Endo, H., Eto, K., Toguchida, J., Uemoto, S., et al. (2012). Donor-dependent variations in hepatic differentiation from humaninduced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 12538-12543.
Katsuda, T., Kawamata, M., Hagiwara, K., Takahashi, R.U., Yamamoto, Y., Camargo, F.D., and Ochiya, T. (2017). Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell stem cell 20, 41-55.
Kim, I.H., Kisseleva, T., and Brenner, D.A. (2015). Aging and liver disease. Current opinion in gastroenterology 31, 184-191.
Kim, Y., Kang, K., Lee, S.B., Seo, D., Yoon, S., Kim, S.J., Jang, K., Jung, Y.K., Lee, K.G., Factor, V.M., et al. (2019). Small molecule-mediated reprogramming of human hepatocytes into bipotent progenitor cells. Journal of hepatology 70, 97-107.
Kopp, J.L., Grompe, M., and Sander, M. (2016). Stem cells versus plasticity in liver and pancreas regeneration. Nature cell biology 18, 238-245.
Li, D., Li, W., and Hui, L. (2016). Hybrid hepatocyte: A newly identified player for regeneration in hepatic injuries. Hepatology 64, 2244-2246.
Miller, J.D., Ganat, Y.M., Kishinevsky, S., Bowman, R.L., Liu, B., Tu, E.Y., Mandal, P.K., Vera, E., Shim, J.W., Kriks, S., et al. (2013). Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell 13, 691-705.
Negishi, T., Nagai, Y., Asaoka, Y., Ohno, M., Namae, M., Mitani, H., Sasaki, T., Shimizu, N., Terai, S., Sakaida, I., et al. (2010). Retinoic acid signaling positively regulates liver specification by inducing wnt2bb gene expression in medaka. Hepatology 51, 1037-1045.
Neurohr, G.E., Terry, R.L., Lengefeld, J., Bonney, M., Brittingham, G.P., Moretto, F., Miettinen, T.P., Vaites, L.P., Soares, L.M., Paulo, J.A., et al. (2019). Excessive Cell Growth Causes Cytoplasm Dilution And Contributes to Senescence. Cell 176, 1083-1097 e1018.
Nie, Y.Z., Zheng, Y.W., Miyakawa, K., Murata, S., Zhang, R.R., Sekine, K., Ueno, Y., Takebe, T., Wakita, T., Ryo, A., et al. (2018). Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine 35, 114-123.
Ono, Y., Kawachi, S., Hayashida, T., Wakui, M., Tanabe, M., Itano, O., Obara, H., Shinoda, M., Hibi, T., Oshima, G., et al. (2011). The influence of donor age on liver regeneration and hepatic progenitor cell populations. Surgery 150, 154-161.
Peleg, S., Feller, C., Ladurner, A.G., and Imhof, A. (2016). The Metabolic Impact on Histone Acetylation and Transcription in Ageing. Trends in biochemical sciences 41, 700-711.
Poynard, T., Ratziu, V., Charlotte, F., Goodman, Z., McHutchison, J., and Albrecht, J. (2001).
Rates and risk factors of liver fibrosis progression in patients with chronic hepatitis c. Journal of hepatology 34, 730-739.
Ren, R., Ocampo, A., Liu, G.H., and Izpisua Belmonte, J.C. (2017). Regulation of Stem Cell Aging by Metabolism and Epigenetics. Cell metabolism 26, 460-474.
Sampaziotis, F., de Brito, M.C., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., Soares, F.A.C., Schrumpf, E., Melum, E., Karlsen, T.H., Bradley, J.A., et al. (2015). Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nature biotechnology 33, 845-852.
Sampaziotis, F., Justin, A.W., Tysoe, O.C., Sawiak, S., Godfrey, E.M., Upponi, S.S., Gieseck, R.L., 3rd, de Brito, M.C., Berntsen, N.L., Gomez-Vazquez, M.J., et al. (2017). Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature medicine 23, 954-963.
Sato, S., Solanas, G., Peixoto, F.O., Bee, L., Symeonidi, A., Schmidt, M.S., Brenner, C., Masri, S., Benitah, S.A., and Sassone-Corsi, P. (2017). Circadian Reprogramming in the Liver Identifies Metabolic Pathways of Aging. Cell 170, 664-677 e611.
Sawada, N. (1989). Hepatocytes from old rats retain responsiveness of c-myc expression to EGF in primary culture but do not enter S phase. Experimental cell research 181, 584-588.
Schmucker, D.L., and Sanchez, H. (2011). Liver regeneration and aging: a current perspective. Current gerontology and geriatrics research 2011, 526379.
Sebastian, C., and Mostoslavsky, R. (2017). The Various Metabolic Sources of Histone
Acetylation. Trends in endocrinology and metabolism: TEM 28, 85-87.
Si-Tayeb, K., Noto, F.K., Nagaoka, M., Li, J., Battle, M.A., Duris, C., North, P.E., Dalton, S., and Duncan, S.A. (2010). Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology 51, 297-305.
Stadtfeld, M., and Hochedlinger, K. (2010). Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes & development 24, 2239-2263.
Steiling, H., Wustefeld, T., Bugnon, P., Brauchle, M., Fassler, R., Teupser, D., Thiery, J., Gordon, J.I., Trautwein, C., and Werner, S. (2003). Fibroblast growth factor receptor signalling is crucial for liver homeostasis and regeneration. Oncogene 22, 4380-4388.
Studer, L., Vera, E., and Cornacchia, D. (2015). Programming and Reprogramming Cellular Age in the Era of Induced Pluripotency. Cell stem cell 16, 591-600.
Tarlow, B.D., Pelz, C., Naugler, W.E., Wakefield, L., Wilson, E.M., Finegold, M.J., and Grompe, M. (2014). Bipotential adult liver progenitors are derived from chronically injured mature hepatocytes. Cell stem cell 15, 605-618.
Timchenko, N.A. (2009). Aging and liver regeneration. Trends in endocrinology and metabolism: TEM 20, 171-176.
Uemura, T., Randall, H.B., Sanchez, E.Q., Ikegami, T., Narasimhan, G., McKenna, G.J., Chinnakotla, S., Levy, M.F., Goldstein, R.M., and Klintmalm, G.B. (2007). Liver retransplantation for primary nonfunction: analysis of a 20-year single-center experience. Liver transplantation : official publication of the American Association for the Study of Liver Diseases and the International Liver Transplantation Society 13, 227-233.
Vera, E., Bosco, N., and Studer, L. (2016). Generating Late-Onset Human iPSC-Based Disease Models by Inducing Neuronal Age-Related Phenotypes through Telomerase Manipulation. Cell reports 17, 1184-1192.
Yanger, K., Knigin, D., Zong, Y., Maggs, L., Gu, G., Akiyama, H., Pikarsky, E., and Stanger, B.Z. (2014). Adult hepatocytes are generated by self-duplication rather than stem cell differentiation. Cell stem cell 15, 340-349.
Yanger, K., Zong, Y., Maggs, L.R., Shapira, S.N., Maddipati, R., Aiello, N.M., Thung, S.N., Wells, R.G., Greenbaum, L.E., and Stanger, B.Z. (2013). Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration. Genes & development 27, 719-724.
Zhang, K., Zhang, L., Liu, W., Ma, X., Cen, J., Sun, Z., Wang, C., Feng, S., Zhang, Z., Yue, L., et al. (2018). In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell stem cell 23, 806-819 e804.
KEY RESOURCES TABLE
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
実験モデルおよび被験者の詳細
hiPSC 培養
　TkDA3 hiPSC クローンは、成長因子類を少なくした (GFR) マトリゲル (マトリゲル: RPMI1640 培地 = 1:30)をコーティングした培養皿上で、mTeSR1 培地中で維持した。1383D2、1383D6、M66および YCU#7 hiPSC クローンは、ラミニン511（ラミニン511: PBS = 1:150)をコーティングした培養皿上で、StemFit AK02N培地中で維持した。全ての細胞は、CO2濃度5％の加湿インキュベーター内で37℃で維持した。
PHH 培養
　凍結保存したPHHを製造業者の指示に従って解凍した。陽性対照実験のためには、PHHはＩ型コラーゲンをコーティングした培養皿上で、1x105細胞／cm2の密度で、5% FBS、1 μM デキサメタゾン、100 IU/mLペニシリン (Thermo Fisher Scientific)、100 μg/mL ストレプトマイシン (Thermo Fisher Scientific), 4 μg/mL ヒト組換えインスリン(Sigma)、2 mM GlutaMAXTM (Thermo Fisher Scientific)および 15 mM HEPES (Sigma)を含有するWilliams E培地を用いて培養した。24時間後、ALB解析のためPHHの上清を回収した。可塑性誘導実験のためには、ラミニン511をコーティングした培養皿に、10 ng/mL FGF2、10 ng/mL EGF、20 ng/mL HGF、10 μM Y-27632、0.5 μM A83-01、3 μM CHIR99021および 0.25 mM NaBを含有する無血清分化培地(SFD)(Nie et al., 2018a)を用いて、PHHを1x104細胞／cm2の密度で播種した。培養0日目に5% FBS を用いて細胞接着を向上させた。24時間後に培地を新鮮な培地と交換し、その後は2日ごとに交換した。
マウス
　成体7-9 週齢 TK-NOG マウスをこの研究に用いた (Hasegawa et al., 2011)。肝傷害を誘導するため、TK-NOG レシピエントの腹腔内にガンシクロビル (50 mg/kg、田辺三菱製薬)を、移植の5日前および7日前の2回投与した。マウスは温度および光をコントロールした（12時間の明／暗サイクル）、特定病原体フリーの動物用施設に収容し、実験動物の使用のための横浜市立大学指針に従って飼育した。全ての実験手順は、横浜市立大学医学部動物実験センター臨床研究審査委員会によって承認された（No. 075）。
方法の詳細
hiPSC-Hep への分化
　以下の2工程を用いてhiPSCからhiPSC-Hepへの分化を行なった。
工程I（内胚葉分化）
　RPMI 1640、1% B27、50 ng/mL WNT3Aおよび100 ng/mL アクチビンAからなる培地を用いて、GFR マトリゲルまたはラミニン 511でコーティングしたプレート上で、7日間hiPSC クローンを内胚葉細胞に分化させた。０日目に10 μM Y-27632を添加し、1日目から3日目まで0.5 mM NaB を添加した。培地は毎日交換した。
工程II（肝細胞への分化および成熟）
　0.05%トリプシン/EDTA (Gibco) を用いてhiPSC内胚葉細胞をプレートから分離した。そして、GFR マトリゲルまたはラミニン 511でコーティングしたプレートに、ニコチンアミドを含まない肝分化培地(HDM)を用いて、1.5-2 x 105細胞／cm2の密度で再度播種した。8日目から10日目まで、培地を毎日HDMに交換した。11日目からは、培地を2日ごとに交換した。このHDMは、10 ng/mL FGF2、20 ng/mL HGF、10 ng/mL OSM、100 nM デキサメタゾンおよび 10 mM ニコチンアミドを含有するSFDから成っていた。対照のhiPSC-Hepは、刊行されたプロトコールにマイナーな改変を加えたものに従って分化させた(Kajiwara et al., 2012; Si-Tayeb et al., 2010)。
増殖性肝細胞（pHC）の誘導
　0.05%トリプシン/EDTA を用いて、新たに創出したhiPSC-Hepをある老化時点において回収し、GFR マトリゲルまたはラミニン511でコーティングしたプレートに、5,000 細胞/cm2 の密度で、10 ng/mL FGF2、10 ng/mL EGF、20 ng/mL HGF、10 μM Y-27632、0.5 μM A83-01および 3 μM CHIR99021を含有するSFDからなるリプログラミング培地 (RM)を用いて播種した。培地は1日目、3日目および5日目に交換した。PI3K および MAPK シグナル伝達経路をブロックするため、10 μM LY29002 および一定量のPD0325902 (0.01 μM～1 μM)をそれぞれRMに添加した。EZH2の機能をブロックするため、0.1 μM DZNep をRMに添加した。エピジェネティックな改変を制御するため、0.25 mM NaB, 0.5 mM VPA, 10 μM Trany, 0.5 μM RG108 および 0.5 μM BIX をRMに添加した。細胞数は、ヘキスト33342染色（Invitrogen）と合わせてIncell analyzer 2000 (GE Healthcare) を用いることにより解析した。
増殖性肝細胞（pHC）の継代培養
　誘導6日目から8日目に、0.05%トリプシン/EDTAを用いて増殖性肝細胞 (pHC) を回収し、GFR-マトリゲルまたはラミニン511をコーティングしたプレートにRMを用いて1 x 104 細胞/cm2 の密度で播種した。１日目および3日目に、培地をY-27632不含RMと交換した。
1個の細胞から誘導した肝細胞増殖のタイムラプストレーシング
　GFR-マトリゲルをコーティングしたプレート（RMを有する）にD22-Hepを500 細胞/cm2 の密度で播種した。4時間インキュベートした後、BZ9000 オールインワン蛍光顕微鏡 (Keyence)を用いて位相差像撮影を実施し、24時間ごとに像を取得した。
Cell Counting Kit-8 アッセイ
　使用説明書に従ってCell Counting Kit-8を用いて、指示した日における細胞生存率を決定した。
細胞増殖曲線の描出
　約90%コンフルエンスの時点でpHCを継代し、各継代ごとに全細胞数を決定した。増殖率＝（全細胞数）／（播種細胞数）
pHCの増殖率を測定し、細胞増殖曲線を計算した。
細胞集団倍加時間の計算
　GFR-マトリゲルをコーティングしたプレートにpHCを5000 細胞/cm2 の密度で播種した。4時間インキュベートした後、培地を新鮮な培地と交換し、ヘキスト33342染色と合わせてIncell analyzer 2000を用いることにより付着細胞数をカウントした。細胞数は以下の時点でもカウントした：24時間、48時間および72時間。細胞集団倍加時間は、各時点の細胞数にしたがってGraphPad Prismを用いて計算した。
pHCからの肝細胞分化
　約90%コンフルエンスの時点からpHCの肝細胞分化を始める。培地は8日間、3 μM RA を含有するHDM に交換し、次の7日間はRAを含まないHDM に交換した。培地は2日ごとに交換した。全肝細胞分化期間は15日であった。
pHCからの胆管細胞分化
　継代途中の、もしくは老化過程におけるある時点に可塑性を誘導して得たpHCを1 x 106 細胞/mLの密度でRMに懸濁した。50 μL のGFR-マトリゲルと混合した合計5,000個の pHCを未処理の24-ウエルプレートにマウントドロップ(mount drop)として播種し、37 ℃で5% CO2 インキュベーター内で 30分間インキュベートした。次に、 700 μL の胆管細胞分化培地 (CDM) をウエルに満たした。このCDM は、10 ng/mL EGF、20 ng/mL HGF、50 ng/mL WNT3A、100 ng/mL R-スポンジン-1、 50 ng/mL FGF10、3 μM RA、10 μM Y-27632 および 10 μM フォルスコリンを含有するSFDから成っていた。培地は3日ごとに交換し、関連する解析を10日目に実施した。
ヒトALB、A1AT、フェリチンおよびAFPのアッセイ
　ヒトアルブミンELISA定量セット、ヒトアルファ-1-アンチトリプシンELISA定量セット、ヒトフェリチンELISA定量セットおよびヒトAFP ELISA定量セットをそれぞれ製造業者の指示に従って使用して、ヒトALB、A1AT、フェリチンおよびAFPを測定した。サンプルは10倍から5000倍の範囲で希釈し、標準曲線の線形範囲におさまる値を得た。
細胞内老化関連β-ガラクトシダーゼおよびROSの検出
　細胞老化検出および数量化キットを用いて老化関連β-ガラクトシダーゼ（SA-β-Gal) の活性を検出し、また製造業者の指示に従ってCellROXTM Deep Red Reagentを用いて細胞内ROSを解析した。写真は、Leica TCS SP5 共焦点顕微鏡(Leica)を用いて撮った。
アセチル-CoA アッセイ
　hiPSC-Hepにおけるアセチル-CoA レベルを決定するため、細胞溶解バッファーを用いてプレートから細胞を分離した。アセチルコエンザイムA アッセイキットを製造業者の指示に従って使用して、アセチル-CoA 濃度を測定した。対応するタンパク質濃度を用いて、得られた数値を正規化した。
インドシアニングリーンの取込みおよび排出
　インドシアニングリーン (ICG) ドライ粉末 (第一三共) (10 mg) を10 mLの肝細胞培養培地に溶解し、1 mg/mLの原液を得た。 細胞を懸濁状態でまたは播種して、ICGと共に4時間 37℃で、CO2濃度5%の加湿インキュベーター内でインキュベートした。次に細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)で3回洗浄し、新鮮なHCM（肝細胞培養培地BulletKitTM HCMTM）中でさらに2時間インキュベートしてICG排出を測定した。画像はBZ9000オールインワン蛍光顕微鏡を用いて撮影した。
過ヨウ素酸シッフ染色および低密度リポタンパク質取込み
　製造業者の指示に従って過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色を用いてグリコーゲンを検出した。すなわち、細胞をPBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドを用いて15分間室温で固定した。PBSで洗浄後、細胞を0.5%過ヨウ素酸溶液中で7分間酸化し、PBSで洗浄し、そしてシフ試薬中で15分間インキュベートした。亜硫酸水中で各２分間のインキュベーションを3回実施した後、細胞をPBSで洗浄し、BZ9000オールインワン蛍光顕微鏡により可視化した。
低密度リポタンパク質取込み解析のため、5 μg/mL Dil-Ac-LDL および 50 μL のヘキスト 33342 標準希釈溶液と共に細胞を37℃で2時間インキュベートした。次に、細胞をPBSで洗浄した。BZ9000オールインワン蛍光顕微鏡を用いて写真を解析した。
ローダミン123およびコリル-リシル-フルオレセインの輸送アッセイ
　ローダミン123 輸送アッセイおよびコリル-リシル-フルオレセイン(CLF)輸送アッセイを以前に記述された方法に従って実施した (Sampaziotis et al., 2015)。ローダミン123輸送アッセイのためには、胆管細胞を10 μMベラパミルの存在下または不存在下で37℃で30分間インキュベートした。次に、細胞を100 μM ローダミン123と共に37℃で5分間インキュベートし、IMDMで3回洗浄した。新鮮なCDMを添加して37℃でさらに40分間インキュベートした。CLF輸送アッセイのためには、5 μM CLF または 5 μM FITCを胆管細胞に30分間37℃で負荷し、次に細胞をIMDMで3回洗浄した。新鮮なCDMを添加し、37℃でさらに10分間インキュベートした。Leica TCS SP5 共焦点顕微鏡を用いて写真を撮った。
透過型電子顕微鏡観察
　胆管細胞シストの透過型電子顕微鏡観察による解析を以前に記述された方法に従って実施した (Nie et al., 2018a)。すなわち、前固定された胆管細胞シストを後固定し、脱水し、新鮮な100%樹脂中に包埋した。次に、70 nmの超薄型切片を切り出し、2%ウラニル酢酸で染色した。次に、切片を蒸留水で洗浄し、Lead stain solutionで染色した。JEM-1400Plus 顕微鏡 (JEOL)のもとでグリッド(grids)を観察し、VELETAカメラ (Olympus)を用いてデジタルイメージを取得した。
フローサイトメトリー
　フローサイトメトリーに用いた抗体は以下の通りである：PE-マウス抗ヒト CXCR4、BV421 マウス抗ヒトCD117、APC マウス抗ヒト EpCAM、ウサギ抗 H3K9ac、ウサギ抗H3K14ac、ウサギ抗H3K18ac、ウサギ抗H3K27ac、ウサギ抗H3K56ac、およびヤギ抗ウサギIgG (H+L) Alexa Fluor 647。細胞は、MoFlo Astrios システム (Beckman Coulter) により捕捉された。
定量的PCRと組み合わせたクロマチン免疫沈降 (ChIP) 
　実施した手順は製造業者の指示に従ったものであった。すなわち、3 × 106細胞を1%ホルムアルデヒド中で10分間、そして1 x グリシン中で5分間、室温で架橋し、スクレイピングにより回収し、遠心にかけ、さらに溶解バッファー中に再懸濁した。小球菌ヌクレアーゼによってDNAを約150 - 900 bp 断片の長さに消化した。Bioruptor ultrasonicator (Cosmo bio)を用いて核膜を破壊し、DNA断片を放出した。ウサギ抗ヒトH3K9ac、ウサギ抗ヒト H3K18acおよび ウサギ抗ヒト H3K27acを含む抗体カクテルを用いて、サンプルを一晩4℃で免疫沈降させた。30 μL のプロテインG磁性ビーズを製造業者の指示に従って用いて、免疫複合体を捕獲した。DNAは、プロテイナーゼＫを用いて65℃で2時間消化することにより回収した。スピンカラムを用いて、上記DNAを精製した。次に、下記の表に示すプライマーを用いたqPCRのためにChIPおよびインプットを用いた。
EZH2 エンハンサーのための ChIP-PCR プライマーおよびプローブのリスト
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 Pr1のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号１及び２
Pr2のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号３及び４
Pr3のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号５及び６
Pr4のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号７及び８
プローブのメーカー名と製品番号を以下にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011

移植
2回のガンシクロビル注射の後、製造業者の指示に従ってDRI-CHEM (富士フィルム)を用いて血清アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT) およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST) を検出した。合計 1x106個のPHHまたは PHH-pHCをTK-NOGレシピエントの脾臓内に移植した。2週間ごとに血清を採取し、12週目にマウスを屠殺した。
RNA 単離および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (Q-PCR)
PureLinkTM RNA Mini Kitを用いて全RNAを単離した。高性能cDNA逆転写キットを製造業者の指示に従って用いて1本鎖cDNAを合成するためのテンプレートとしてRNA (< 2 μg) を用いた。cDNA ならびに特異的プライマーおよびユニバーサルプローブライブラリーのプローブを用いてQ-PCR を実施した。本研究に用いたプライマーおよびプローブを下記の表にリストした。全てのデータは、正規化対照としてβ-ACTB　(Thermo Fisher Scientific)を用いるΔΔCT 法により計算した。
ヒト遺伝子のための定量的Q-PCRプライマーおよびブローブのリスト
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
OCT4のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号９及び１０
NANOGのLeft primer及びRight primerの配列：配列番号１１及び１２
SOX17のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号１３及び１４
FOXA2のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号１５及び１６
TBX3のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号１７及び１８
TTRのLeft primer及びRight primerの配列：配列番号１９及び２０
A1ATのLeft primer及びRight primerの配列：配列番号２１及び２２
ALBのLeft primer及びRight primerの配列：配列番号２３及び２４
TDO2のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号２５及び２６
G6PCのLeft primer及びRight primerの配列：配列番号２７及び２８
ASGR1のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号２９及び３０
HNF4AのLeft primer及びRight primerの配列：配列番号３１及び３２
TATのLeft primer及びRight primerの配列：配列番号３３及び３４
CYP2C9のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号３５及び３６
CYP2C19のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号３７及び３８
CYP3A4のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号３９及び４０
CYP7A1のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号４１及び４２
MKI67のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号４３及び４４
PCNAのLeft primer及びRight primerの配列：配列番号４５及び４６
CCNB1のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号４７及び４８
CCND1のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号４９及び５０
CCNE1のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号５１及び５２
CDC20のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号５３及び５４
EZH2のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号５５及び５６
EpCAMのLeft primer及びRight primerの配列：配列番号５７及び５８
C-METのLeft primer及びRight primerの配列：配列番号５９及び６０
LGR5のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号６１及び６２
RBP4のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号６３及び６４
SOX9のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号６５及び６６
HNF6のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号６７及び６８
GGTのLeft primer及びRight primerの配列：配列番号６９及び７０
CFTRのLeft primer及びRight primerの配列：配列番号７１及び７２
AQP1のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号７３及び７４
SSTR2のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号７５及び７６
ACLYのLeft primer及びRight primerの配列：配列番号７７及び７８
PDHBのLeft primer及びRight primerの配列：配列番号７９及び８０
ACSS2のLeft primer及びRight primerの配列：配列番号８１及び８２
CPT1AのLeft primer及びRight primerの配列：配列番号８３及び８４
プローブのメーカー名と製品番号を以下にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
組織学的検査および免疫蛍光染色
　肝組織サンプルをO.C.T. (optimal cutting temperature)コンパウンド (サクラファインテックジャパン)中に包埋し、5 μm 切片を調製し、MAS-GP type A コートスライド (松波硝子)にマウントした。免疫蛍光染色のため、切片または培養細胞をPBSに溶解した4%パラホルムアルデヒド溶液中で10分間固定し、PBSで3回洗浄し、0.3% Triton X-100を含有するPBSに溶解した10% ECL prime blocking agentを用いて30分間ブロックし、さらにPBSで3回洗浄した。次に、切片または細胞をブロッキングバッファー中で一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。切片または細胞をPBSで3回洗浄し、蛍光標識二次抗体と共にさらに60分間室温でインキュベートした。最後に、切片または細胞をPBSで3回洗浄し、DAPIを含有するマウンティング溶液で覆った。Zeiss Axio Imager M1 顕微鏡 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, ドイツ)を用いて蛍光を検出した。免疫蛍光染色に用いた抗体は以下の通りである：ウサギ抗ヒトAFP (1:100)、ヤギ抗ヒトALB (1:100)、マウス抗ヒトCK19 (1:50)、ウサギ抗ヒト A1AT (1:100)、ニワトリ抗ヒトA1AT (1:100)、マウス抗ヒトKI67 (1:50)、ヤギ抗ヒトHNF4A (1:100)、マウス抗ZO1 (1:100)、マウス抗ヒトE-カドヘリン (1:100)、マウス抗ヒトSOX9 (1:100)、 F-ACTIN (1:100)、マウス抗ヒト CK8/18 (1:100)、マウス抗ヒトNuMA (1:100)、ロバ抗マウスIgG (H+L) Alexa Fluor 488 (1:500)、ロバ抗ウサギIgG(H+L) Alexa Fluor 488 (1:500)、ロバ抗ヤギ IgG (H+L) Alexa Fluor 555 (1:500)、ヤギ抗モルモットIgG (H+L) Alexa Fluor 555 (1:500) およびヤギ抗ニワトリIgY (H+L) Alexa Fluor 488 (1:500)。
マイクロアレイおよびデータ解析
　hiPSC由来肝細胞 (D22-Hep、D52-Hep、D72-Hepおよび D22-pHC)、PHH(2M-PHH および78Y-PHH) および PHH-pHC(2M-pHCおよび78Y-pHC)から、PureLinkTM RNA Mini Kitを用いて全 RNA を調製した。SurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K (Agilent Technologies)を製造業者の指示に従って用いて、遺伝子発現プロファイリングのためのRNAをハイブリダイゼーションさせた。データはGeneSpringを用いて正規化した。DAVID Bioinformatics Resources 6.8 (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp) (Huang da et al., 2009) を用いて、遺伝子オントロジーエンリッチメント解析およびKEGG パスウェイ解析を実施した。STRING 相互作用ネットワークはSTRING 9.05 (http://string905.embl.de/) (Franceschini et al., 2013)を用いて解析した。
統計
　数値は平均値±標準偏差(SD)として示した。統計的有意差は、2群を比較する場合はマン・ホイットニーのU検定を用いて評価し、3群以上を比較する場合は一元配置分散解析（one-way ANOVA）およびボンフェローニの多重比較検定を用いて評価した。p < 0.05 を統計的に有意と考えた。統計解析はGraphPad Prismを用いて実施した。
データおよびソフトウエアの利用可能性
データリソース
本論文中で報告したマイクロアレイデータの登録番号は、GEO: GSE131806である。
References
Franceschini, A., Szklarczyk, D., Frankild, S., Kuhn, M., Simonovic, M., Roth, A., Lin, J., Minguez, P., Bork, P., von Mering, C., et al. (2013). STRING v9.1: protein-protein interaction networks, with increased coverage and integration. Nucleic acids research 41, D808-815.
Hasegawa, M., Kawai, K., Mitsui, T., Taniguchi, K., Monnai, M., Wakui, M., Ito, M., Suematsu, M., Peltz, G., Nakamura, M., et al. (2011). The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and biophysical research communications 405, 405-410.
Huang da, W., Sherman, B.T., and Lempicki, R.A. (2009). Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature protocols 4, 44-57.
Kajiwara, M., Aoi, T., Okita, K., Takahashi, R., Inoue, H., Takayama, N., Endo, H., Eto, K., Toguchida, J., Uemoto, S., et al. (2012). Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 12538-12543.
Nie, Y.Z., Zheng, Y.W., Miyakawa, K., Murata, S., Zhang, R.R., Sekine, K., Ueno, Y., Takebe, T., Wakita, T., Ryo, A., et al. (2018a). Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine 35, 114-123.
Nie, Y.Z., Zheng, Y.W., Ogawa, M., Miyagi, E., and Taniguchi, H. (2018b). Human liver
organoids generated with single donor-derived multiple cells rescue mice from acute liver failure. Stem cell research & therapy 9, 5.
Sampaziotis, F., de Brito, M.C., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., Soares, F.A.C., Schrumpf, E., Melum, E., Karlsen, T.H., Bradley, J.A., et al. (2015). Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nature biotechnology 33, 845-852.
Si-Tayeb, K., Noto, F.K., Nagaoka, M., Li, J., Battle, M.A., Duris, C., North, P.E., Dalton, S., and Duncan, S.A. (2010). Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology 51, 297-305.
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　本発明は、肝細胞や胆管細胞の大量製造に利用できる。本発明により創出されたヒト肝細胞等は、in vitro における薬物代謝試験・肝毒性試験・肝炎ウイルス感染試験、あるいは再生医療やバイオ人工肝臓等に利用できる。本発明により創出されたヒト肝細胞等を用いてヒト肝細胞に置換したキメラ動物が作製でき、このキメラ動物を用いることで、創薬化合物の薬物代謝試験や安全性試験が可能となる。また、本発明により、ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を用いて、肝再生を促進することができる。

Claims (42)

  1. FGFファミリーのメンバー、HGF、IL6ファミリーのメンバー及びデキサメタゾンの存在下で、内胚葉細胞を肝細胞に分化させることを含む、肝細胞の作製方法。
  2. FGFファミリーのメンバーが、FGF2、FGF1、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22及びFGF23からなる群より選択される少なくとも１つである請求項１記載の方法。
  3. IL6ファミリーのメンバーが、オンコスタチン、IL-6、IL-11、IL-27、IL-35、IL-39、LIF、CT-1、CNTF及びCLCF1からなる群より選択される少なくとも１つである請求項１又は２に記載の方法。
  4. 内胚葉細胞が多能性幹細胞から分化した細胞である請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 内胚葉細胞がヒト由来である請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 請求項１～５のいずれかに記載の方法により作製され、生体外の単層培養で12日以上アルブミンの分泌能を維持し、生存できる肝細胞。
  7. 12日以上アルブミンの分泌能以外の肝細胞としての機能も持って、生存できる請求項６記載の肝細胞。
  8. アルブミンの分泌能以外の肝細胞としての機能が、薬物代謝能、インドシアニングリーンの取込みおよび排出、グリコーゲン貯蔵、低密度リポタンパク質の取込み及び遺伝子発現からなる群より選択される少なくとも１つである請求項７記載の肝細胞。
  9. 老化の特徴を示す請求項６～８のいずれかに記載の肝細胞。
  10. 老化の特徴が、細胞容量の増大、老化関連遺伝子の発現、炎症性応答の増大、DNA損傷、細胞内活性酸素種レベルの増大、細胞老化関連βガラクトシダーゼレベルの増大、エピジェネティック変化、テロメアの長さの短小化及びミトコンドリア機能の低下からなる群より選択される少なくとも１つである請求項９記載の肝細胞。
  11. FGFファミリーのメンバーの存在下で、肝細胞を培養することを含む、肝前駆細胞の作製方法。
  12. FGFファミリーのメンバー及びヒストン高アセチル化をもたらす薬剤の存在下で、肝細胞を培養することを含む請求項１１記載の方法。
  13. FGFファミリーのメンバーが、FGF2、FGF1、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22及びFGF23からなる群より選択される少なくとも１つである請求項１１又は１２記載の方法。
  14. ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である請求項１２又は１３記載の方法。
  15. ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、Trichostatin A、Tacedinaline (CI-994)、M344、ITSA-1、Sodium valproate、Sodium 4-phenylbutuyrate、Sodium Butyrate (NaB)、valproic acid (VPA)、Abexinostat (PCI-24781)、Belinostat(PXD101)、Citarinostat (ACY-241)、Dacinostat (LAQ824)、Depudecin、Domatinostat (4SC-202)、Droxinostat、Entinostat (MS-275, SNDX-275)、Fimepinostat (CUDC-907)、Givinostat (ITF2357)、Mocetinostat (MGCD0103)、Nexturastat A、Panobinostat (LBH-589,NVP-LBH589)、Pracinostat (SB939)、Quisinostat (JNJ-26481585) 2HCl、Resminostat、Ricolinostat (ACY-1215)、Tucidinostat (Chidamide)、Vorinostat (SAHA)、ACY-738、Apicidin、AR-42、BG45、BML-210、BRD73954、CAY10603、CUDC-101、Curcumin、Depudecin、H1388、HC Toxin、HPOB、LMK-235、MC1568、Oxamflatin、(-)-Parthenolide、PCI-34051、RG2833 (RGFP109)、RGFP966、Romidepsin (FK228, Depsipeptide)、Santacruzamate A (CAY10683)、Scriptaid、SKLB-23bb、Splitomicin、Suberoyl bis-hydroxamic acid、Tasquinimod、TH34、Tinostamustine(EDO-S101)、TMP195、TMP269、Tubacin及びTubastatin Aからなる群より選択される少なくとも１つである請求項１２～１４のいずれかに記載の方法。
  16. 肝細胞が、多能性幹細胞から分化した細胞、多能性幹細胞から分化した細胞を継代培養した細胞、生体組織から単離された初代培養細胞、生体組織から単離された初代培養細胞を継代培養した細胞又はそれらの組み合わせである請求項１１～１５のいずれかに記載の方法。
  17. 肝細胞がヒト由来である請求項１１～１６のいずれかに記載の方法。
  18. 請求項１１～１７のいずれかに記載の方法により作製され、増殖能と肝細胞・胆管上皮細胞への二方向の分化能を持つ、アルファフェトプロテイン（AFP）陰性の肝前駆細胞。
  19. 肝細胞及び／又は胆管細胞への分化が可能である請求項１８記載の肝前駆細胞。
  20. 請求項１８又は１９記載の肝前駆細胞を肝細胞に分化誘導することを含む、肝細胞の作製方法。
  21. 請求項１８又は１９記載の肝前駆細胞を胆管細胞に分化誘導することを含む、胆管細胞の作製方法。
  22. ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤により、肝細胞の老化を抑制する方法。
  23. ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤をFGFファミリーのメンバーと組み合わせて用いる、請求項２２記載の方法。
  24. ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を有効成分として含む、肝細胞の老化抑制剤。
  25. ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である請求項２４記載の剤。
  26. ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、Trichostatin A、Tacedinaline (CI-994)、M344、ITSA-1、Sodium valproate、Sodium 4-phenylbutuyrate、Sodium Butyrate (NaB)、valproic acid (VPA)、Abexinostat (PCI-24781)、Belinostat(PXD101)、Citarinostat (ACY-241)、Dacinostat (LAQ824)、Depudecin、Domatinostat (4SC-202)、Droxinostat、Entinostat (MS-275, SNDX-275)、Fimepinostat (CUDC-907)、Givinostat (ITF2357)、Mocetinostat (MGCD0103)、Nexturastat A、Panobinostat (LBH-589,NVP-LBH589)、Pracinostat (SB939)、Quisinostat (JNJ-26481585) 2HCl、Resminostat、Ricolinostat (ACY-1215)、Tucidinostat (Chidamide)、Vorinostat (SAHA)、ACY-738、Apicidin、AR-42、BG45、BML-210、BRD73954、CAY10603、CUDC-101、Curcumin、Depudecin、H1388、HC Toxin、HPOB、LMK-235、MC1568、Oxamflatin、(-)-Parthenolide、PCI-34051、RG2833 (RGFP109)、RGFP966、Romidepsin (FK228, Depsipeptide)、Santacruzamate A (CAY10683)、Scriptaid、SKLB-23bb、Splitomicin、Suberoyl bis-hydroxamic acid、Tasquinimod、TH34、Tinostamustine(EDO-S101)、TMP195、TMP269、Tubacin及びTubastatin Aからなる群より選択される少なくとも１つである請求項２５記載の剤。
  27. ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤がFGFファミリーのメンバーと組み合わせて用いられる、請求項２４～２６のいずれかに記載の剤。
  28. ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤により、肝細胞の可塑性を増大させる方法。
  29. ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤をFGFファミリーのメンバーと組み合わせて用いる、請求項２８記載の方法。
  30. ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を有効成分として含む、肝細胞の可塑性を増大させる剤。
  31. ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤がヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である請求項３０記載の剤。
  32. ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、Trichostatin A、Tacedinaline (CI-994)、M344、ITSA-1、Sodium valproate、Sodium 4-phenylbutuyrate、Sodium Butyrate (NaB)、valproic acid (VPA)、Abexinostat (PCI-24781)、Belinostat(PXD101)、Citarinostat (ACY-241)、Dacinostat (LAQ824)、Depudecin、Domatinostat (4SC-202)、Droxinostat、Entinostat (MS-275, SNDX-275)、Fimepinostat (CUDC-907)、Givinostat (ITF2357)、Mocetinostat (MGCD0103)、Nexturastat A、Panobinostat (LBH-589,NVP-LBH589)、Pracinostat (SB939)、Quisinostat (JNJ-26481585) 2HCl、Resminostat、Ricolinostat (ACY-1215)、Tucidinostat (Chidamide)、Vorinostat (SAHA)、ACY-738、Apicidin、AR-42、BG45、BML-210、BRD73954、CAY10603、CUDC-101、Curcumin、Depudecin、H1388、HC Toxin、HPOB、LMK-235、MC1568、Oxamflatin、(-)-Parthenolide、PCI-34051、RG2833 (RGFP109)、RGFP966、Romidepsin (FK228, Depsipeptide)、Santacruzamate A (CAY10683)、Scriptaid、SKLB-23bb、Splitomicin、Suberoyl bis-hydroxamic acid、Tasquinimod、TH34、Tinostamustine(EDO-S101)、TMP195、TMP269、Tubacin及びTubastatin Aからなる群より選択される少なくとも１つである請求項３１記載の剤。
  33. ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤がFGFファミリーのメンバーと組み合わせて用いられる、請求項３０～３２のいずれかに記載の剤。
  34. 請求項６記載の肝細胞、請求項１８記載の肝前駆細胞及び請求項１８記載の肝前駆細胞から分化誘導された細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞を非ヒト動物に移植することを含む、キメラ動物の作製方法。
  35. 請求項６記載の肝細胞、請求項１８記載の肝前駆細胞及び請求項１８記載の肝前駆細胞から分化誘導された細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞を肝不全の非ヒト動物に移植することを含む、請求項３４記載のキメラ動物の作製方法。
  36. 移植された肝前駆細胞が増殖及び/又は分化する、請求項３４又は３５記載のキメラ動物の作製方法。
  37. 肝再生が促進する、請求項３４～３６のいずれかに記載のキメラ動物の作製方法。
  38. 請求項６記載の肝細胞、請求項１８記載の肝前駆細胞及び請求項１８記載の肝前駆細胞から分化誘導された細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞を含む、移植用組成物。
  39. 請求項１８又は１９記載の肝前駆細胞を胆管細胞に分化誘導するために使用される培地に使用するための、FGF10、レチノイン酸およびフォルスコリンを含有する剤；および該剤を該分化誘導に使用される培地に使用することの説明書；を含む、該分化誘導における培地用キット。
  40. 請求項１８又は１９記載の肝前駆細胞を胆管細胞に分化誘導するための、FGF10、レチノイン酸およびフォルスコリンを含有する培地。
  41. ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を有効成分として含む、肝再生促進剤。
  42. ヒストン高アセチル化をもたらす薬剤を医薬的に有効な量で被験者に投与することを含む、肝再生を促進する方法。
PCT/JP2020/036043 2019-09-27 2020-09-24 肝細胞の可塑性誘導法 WO2021060380A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021548992A JPWO2021060380A1 (ja) 2019-09-27 2020-09-24
US17/762,908 US20230039816A1 (en) 2019-09-27 2020-09-24 Method for inducing hepatocyte plasticity

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019177843 2019-09-27
JP2019-177843 2019-09-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021060380A1 true WO2021060380A1 (ja) 2021-04-01

Family

ID=75167026

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/036043 WO2021060380A1 (ja) 2019-09-27 2020-09-24 肝細胞の可塑性誘導法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230039816A1 (ja)
JP (1) JPWO2021060380A1 (ja)
WO (1) WO2021060380A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114395523B (zh) * 2021-12-24 2024-01-30 华南理工大学 一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017216342A1 (en) * 2016-06-16 2017-12-21 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Method for preparing induced hepatic progenitor cells
JP2018524980A (ja) * 2015-06-22 2018-09-06 ケンブリッジ・エンタープライズ・リミテッドＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ インビトロにおける胆管細胞の生成

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018524980A (ja) * 2015-06-22 2018-09-06 ケンブリッジ・エンタープライズ・リミテッドＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ インビトロにおける胆管細胞の生成
WO2017216342A1 (en) * 2016-06-16 2017-12-21 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Method for preparing induced hepatic progenitor cells

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BANAS, A. ET AL.: "Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure", JOURNAL OF GASTROENTEROLOGY AND HEPATOLOGY, vol. 24, 2009, pages 70 - 77, XP055338968, DOI: 10.1111/j.1440-1746.2008.05496.x *
NAKAMURA, NAOKO ET AL.: "Parameters of stem cell-derived functional hepatocytes", ORGAN BIOLOGY, vol. 21, no. 1, 10 April 2014 (2014-04-10), pages 33 - 41, XP055809401 *
SAMPAZIOTIS, F. ET AL.: "Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into functional cholagiocyte-like cells", NAT. PROTOC., vol. 12, no. 4, 2017, pages 814 - 827, XP055534582, DOI: 10.1038/nprot.2017.011 *
SHIRAI, AYUMI ET AL.: "Analysis of hepatocyte characteristics and examination of hepatocyte differentiation potential of primary cultured cells derived from human egg membrane tissue, abstract CD", BIOCHEMIE, 2008 *
VAN BEZOOIJEN, C. F. A. ET AL.: "Albumin synthesis by liver parenchymal cells isolated from young, adult and old rats", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 71, no. 2, 1976, pages 513 - 519, XP024772003, DOI: 10.1016/0006-291X(76)90817-2 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2021060380A1 (ja) 2021-04-01
US20230039816A1 (en) 2023-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11725184B2 (en) Culture method for organoids
JP7208870B2 (ja) 多能性幹細胞から肝細胞及び胆管細胞を作製する方法
Miyajima et al. Stem/progenitor cells in liver development, homeostasis, regeneration, and reprogramming
KR102245909B1 (ko) 간 오르가노이드, 그의 용도 및 이를 수득하기 위한 배양 방법
Al‐Khawaga et al. Pathways governing development of stem cell‐derived pancreatic β cells: lessons from embryogenesis
AU2019390669B2 (en) Hepatocyte expansion methods
ES2767062T3 (es) Métodos y composiciones para producir células similares a hepatocitos
JP7399955B2 (ja) インビトロで肝細胞を増殖・培養する方法及び応用
WO2021060380A1 (ja) 肝細胞の可塑性誘導法
Cervantes-Alvarez et al. Current strategies to generate mature human induced pluripotent stem cells derived cholangiocytes and future applications
Pan et al. Synergistic modulation of signaling pathways to expand and maintain the bipotency of human hepatoblasts
KR20180130625A (ko) 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물
Inagaki et al. Generation of mesothelial progenitor‐like cells from mouse‐induced pluripotent stem cells
Heo et al. LIGHT (TNFSF14) promotes the differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into functional hepatocyte-like cells
Oliva-Vilarnau Mechanistic Analyses of Hepatocyte Plasticity
Bird Liver regeneration by hepatic progenitor cells
Dzierzak et al. Stem cell researchers find their niche
Ang et al. Accelerated human liver progenitor generation from pluripotent stem cells by inhibiting formation of unwanted lineages
Yucel Metabolic Regulation of Muscle Stem Cell Histone Acetylation Landscape During Regeneration
Limbert Mesenchymal stem cells for the cell-based therapy of type 1 diabetes: An experimental approach
Sangan Reprogramming of Hepatic and Pancreatic Cells

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20868077

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021548992

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20868077

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1