WO2021059002A1 - Un método para la determinación de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen erbb2 en muestras de tejido tumoral y adn tumoral circulante y kit de diagnóstico asociado - Google Patents

Un método para la determinación de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen erbb2 en muestras de tejido tumoral y adn tumoral circulante y kit de diagnóstico asociado Download PDF

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Andrés Felipe CARDONA ZORRILLA
July Katherine RODRIGUEZ ARIZA
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the insertion of 12 base pairs in exon 20 of the erbb2 gene in samples of tumor tissue and circulating tumor DNA and an associated diagnostic kit.
  • the present invention relates to the expression of genes from profiles of tissue samples that present cancer cells, more specifically the present invention provides a method for determining the insertion of 12 base pairs in exon 20 of the ERBB2 gene in samples of tumor tissue and circulating tumor DNA.
  • the method basically consists of the following, a method to monitor gene expression in a biological sample, comprising: (A) providing an i polynucleotide complementary to an intronic RNA sequence within a target gene, wherein the expression of said intronic RNA sequence is correlated with the expression of an exonic mRNA sequence within the gene; (B) hybridization of said polynucleotide to said intronic RNA sequence to form a Polynucleotide-RNA-intron complex; and (C) detection of the polynucleotide-intronic RNA complex.
  • a method for predicting the probability that a subject will respond to treatment with an EGFR inhibitor comprises determining the level of expression of one or more prognostic RNA transcripts or their products of expression in a biological sample comprising cancer cells obtained from said patient, wherein the prognostic transcript is the transcript of one or more genes selected from the group consisting of: hCRA a; LAMC2; B2M; STAT5B; LMYC; CKAP4; TAGLN; Furin; DHFR; CCND3; TITF1; FUS; FLT 1; TIMP2; RASSF1; WISP1; VEGFC; GPX2; CTSH; AKAP12; APC; RPL19; IGFBP6; Bak CyclinGI; Hepsinl; MMP2; XIAP; MUC1; STMY3; PDGFRb; GSTp; p53R2; DPYD; IGFBP3; MMP9; R
  • the ERBB2 - receptor tyrosine kinase 2- gene encodes a 185 kDa glycoprotein with tyrosine kinase activity in its intracytosolic domain, it is the epidermal growth factor receptor (EGF).
  • EGF epidermal growth factor receptor
  • This gene is located on the long arm (q) of chromosome 17 at position 12, its molecular location is from base 39,688,084 to 39,728,662 on chromosome 17.
  • an insertion called as A775YVMA corresponding to a 12 base pair insertion that alters the reading frame in exon 20 of the ERBB2 gene ( Figure 2) Figure 2. Sequence of 12 base pairs of the insertion in exon 20 of the ERBB2 gene
  • This figure shows the wild-type sequence and the mutated sequence in exon 20 of the ERBB2 gene; in the image the fragment of exon 20 of the ERRB2 gene without the inserted 12 base pair sequence (wild-type sequence) is indicated by the orange arrow; in image B the sequence of 12 base pairs (ATACGTGATGGC) inserted in the exon 20 fragment of the ERRB2 gene (mutated sequence) is indicated with the green box.
  • the ddPCR assay it is necessary for the ddPCR assay to include a positive control, for this purpose a double-stranded DNA sequence verified by sequencing known as gBlock was designed and synthesized in a commercial house. Below, the positive control sequence used in the ddPCR assay
  • Figure 6 Design of gBlock with the mutant sequence as a positive control of the ddPCR assay for the detection of the A775YVMA insert.
  • This image shows the 449 base pair fragment of the gBlock synthesized as a positive control for the detection assay of the A775YVMA insert by ddPCR.
  • the Droplet Digital polymerase Chain reaction (ddPCR) technique is a technique with high precision that quantifies nucleic acid molecules encapsulated in drops, this under the general basis of distributing the sample randomly in a high number of partitions, so containing zero, one, or a few molecules of the target DNA; subsequently the partitions are subjected to an amplification reaction in a thermal cycler.
  • the number of copies of the target DNA is determined based on the proportion of positive partitions (those where there was amplification), classified as such, based on their level of fluorescence and using a mathematical arrangement that considers the volume of the partition entity and the Poisson distribution.
  • This validated method is capable of detecting the presence of 0.2% mutated DNA in an unknown number of copies of non-mutated DNA, with a sensitivity of 99%.
  • This method is performed in three steps: droplet generation, a ddPCR assay with hydrolysis or EvaGreen probes, and reading and analysis of results.
  • the analyzed DNA sample is partitioned into 20,000 drops, subsequently a PCR reaction is carried out on each of the drops simultaneously and once the PCR reaction is completed, the intensity of the intensity is read. fluorescence in each of the drops. Then the concentration of the number of droplets with mutant DNA sequences is calculated.
  • This assay is designed to determine the A775YVMA insertion in exon 20 of the ERBB2 gene described above in tumor DNA samples extracted from paraffin embedded tissue (FFPE) or a liquid biopsy.
  • FFPE paraffin embedded tissue
  • the tumor DNA quantification is carried out in the following spectrophotometry equipment (table 3) Table 3.
  • FFPE tissue embedded in paraffin
  • the tumor DNA samples extracted from FFPE be brought to a concentration of 10 ng / pL and the tumor DNA samples extracted from liquid biopsies are used in a minimum concentration of 0.2 ng / pL.
  • the process for preparing the mixture is described below:
  • Reagent 1 Rx and 2 and 2 and 2 and 2 controls controls) controls) controls) controls
  • Dispense 70mI of droplet generating oil with a multichannel pipette is an oil that is capable of encapsulating reagents and DNA samples previously amplified by PCR as indicated in the following figure:
  • the droplets must be generated for their subsequent reading and data analysis; after which the drops will be generated and can be determined through a quadrant reference system, where in quadrant A the blue drops that had positive amplification for the mutation (insertion) appear; Quadrant B shows orange droplets that have both mutation and wild-type sequence magnification; Quadrant C shows drops that did not have any amplification; and quadrant D shows droplets with amplification of the wild-type sequence, as shown in the following figure;
  • Figure 8 shows a 2D plot of a positive case for the presence of the mutant allele of the insertion of 12 base pairs in exon 20 of the ERBB2 gene.
  • figure 9 a negative case is observed for the presence of the mutant allele of the insertion of 12 base pairs in exon 20 of the ERBB2 gene.
  • Figure 9 Sample case with the presence of mutant alleles of the 12 bp insertion in exon 20 of the ERBB2 gene.

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Abstract

La presente invención se relaciona con un método para la detección de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2 en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante y un kit de diagnóstico asociado. A través de la expresión de genes de perfiles de muestras de tejido que presentan células cancerosas se proporciona un método para la determinación de dicha inserción en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante.

Description

UN MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA INSERCIÓN DE 12 PARES DE BASES EN EL EXÓN 20 DEL GEN ERBB2 EN MUESTRAS DE TEJIDO TUMORAL Y ADN TUMORAL CIRCULANTE Y KIT DE DIAGNÓSTICO ASOCIADO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con un método para la determinación de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen erbb2 en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante y un kit de diagnóstico asociado.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a la expresión de genes de perfiles de muestras de tejido que presentan células cancerosas, más específicamente la presente invención proporciona un método para la determinación de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2 en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante.
Aunque la biología molecular y la bioquímica modernas han revelado cientos de genes cuyas actividades influyen en el comportamiento de las células tumorales, el estado de su diferenciación y su sensibilidad o resistencia a ciertos medicamentos terapéuticos, el estado de estos genes no ha sido explotado con el propósito de tomar decisiones clínicas habituales sobre tratamientos farmacológicos.
En el documento EP1597391 , en donde a través del empleo de ARN intrónico se realiza un control de la expresión génica. Se indican métodos de perfiles de expresión génica utilizando ARN intrónico, cuya expresión se correlaciona con la expresión del ARN exónico correspondiente, y métodos de diagnóstico y pronóstico basados en los resultados de dichos estudios de expresión génica. El método básicamente consiste en lo siguiente, un método para monitorear la expresión génica en una muestra biológica, que comprende: (A) proporcionar un i polinucleótido complementario a Una secuencia de ARN intrónico dentro de un gen diana, en donde la expresión de dicha secuencia de ARN intrónico Se correlaciona con la expresión de una secuencia de ARNm exónico dentro del gen; (B) hibridación de dicho polinucleótido a dicha secuencia de ARN intrónico para formar un complejo de Polinucleótido-ARN-intrónico; y (C) detección del complejo de polinucleótido-ARN intrónico.
En el documento WO/2004/11 1273 se presenta un método para predecir la probabilidad de que un sujeto responda al tratamiento con un inhibidor de EGFR, que comprende determinar el nivel de expresión de uno o más transcritos de ARN de pronóstico o sus productos de expresión en una muestra biológica que comprende células cancerosas obtenidas de dicho paciente, en donde el transcrito de pronóstico es la transcripción de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en: hCRA a; LAMC2; B2M; STAT5B; LMYC; CKAP4; TAGLN; Furin; DHFR; CCND3; TITF1 ; FUS; FLT 1 ; TIMP2; RASSF1 ; WISP1 ; VEGFC; GPX2; CTSH; AKAP12; APC; RPL19; IGFBP6; Bak CyclinGI; Hepsinl; MMP2; XIAP; MUC1 ; STMY3; PDGFRb; GSTp; p53R2; DPYD; IGFBP3; MMP9; RRM; KRT17; PDGFRa; EPHX1 ; E2F1 ; HNF3A; mGSTI; STAT3; IGF1 R; EGFR; cdc25A; RPLPO; YB-1 ; CKAP4; Kitlng; HER2; Surfact A; BTC; PGK1 ; MTA1 ; FOLR1 ; Claudin 4; EMP1 en donde (a) para cada unidad de expresión incrementada de uno o más de hCRA a; LAMC2; STAT5B; CKAP4; TAGLN; Furin; FUS; FLT1 ; TIMP2; RASSF1 ; WISP1 ; VEGFC; GPX2; AKAP12; RPL19; IGFBP6; MMP2; STMY3; PDGFRb; GSTp; IGFBP3; MMP9; KRT17; PDGFRa; IGF1 R; cdc25A; RPLPO; YB-1 ; CKAP4, EMP1 o el producto de expresión correspondiente, se espera que dicho sujeto tenga una menor probabilidad de respuesta al tratamiento con un inhibidor de EGFR, y (b) para cada unidad de expresión incrementada de uno o más de B2M; LMYC; DHFR; CCND3; TITF1 ; CTSH; APC; Bak CyclinGI; Hepsinl; XIAP; MUC1 ; p53R2; DPYD; RRM; EPHX1 ; E2F1 ; HNF3A; mGSTI; STAT3; EGFR; Kitlng; HER2; Surfact A; BTC; PGK1 ; MTA1 ; FOLR1 ; Claudina 4, o el producto de expresión correspondiente, se espera que dicho sujeto tenga una mayor probabilidad de respuesta al tratamiento con un inhibidor de EGFR.. No obstante, lo anterior mostrado por el estado de la técnica, persiste la necesidad de mejorar los marcadores de expresión genética con el propósito de tomar decisiones clínicas habituales sobre tratamientos farmacológicos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
A continuación, se describirá en detalle el método para la determinación de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2 en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante y kit de diagnóstico asociado.
El gen ERBB2 - receptor tirosina quinasa 2-, con localización cromosómica 17q12 (figura 1), codifica una glicoproteína de 185 kDa con actividad tirosina quinasa en su dominio intracitosólico, se trata del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF).
Figura 1. Localización cromosómica del gen ERBB2
Figure imgf000004_0001
Este gen se encuentra localizado en el brazo largo (q) del cromosoma 17 en la posición 12, su localización molecular está desde la base 39,688,084 a la 39,728,662 en el cromosoma 17. En el exón 20 de este gen se han descrito una inserción denominada como A775YVMA que corresponden a una inserción de 12 pares de bases que altera el marco de lectura en el exón 20 del gen ERBB2 (figura 2) Figura 2. Secuencia de 12 pares de bases de la inserción en el exón 20 del gen ERBB2
Figure imgf000005_0001
En esta figura se muestra la secuencia silvestre y secuencia mutada en el exón 20 del gen ERBB2; en la imagen se señala con la flecha naranja el fragmento del exón 20 del gen ERRB2 sin la secuencia de 12 pares de bases insertada (secuencia silvestre); en la imagen B se señala con el recuadro verde la secuencia de 12 pares de bases (ATACGTGATGGC) insertada en el fragmento del exón 20 del gen ERRB2 (secuencia mutada).
Para llevar a cabo la detección de la inserción de 12 pares de bases en el exón del gen ERBB2 es necesario realizar el diseño correspondiente de cebadores y sondas que hacen parte del método de la presente invención.
Tabla 1. Secuencia de los cebadores hacia adelante y hacia atrás para el ensayo de detección de la inserción A775YVMA
Figure imgf000005_0002
De esta manera, el producto esperado tras el proceso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) corresponde a (figura 3):
Figura 3. Producto de 216 pares de bases como producto de PCR e inserción de 12 pares de bases en este producto
Figure imgf000006_0001
En esta imagen se puede observar un fragmento del exón 20 del gen ERBB2 donde se alinean los cebadores hacia adelante y hacia atrás diseñados para el proceso PCR digital. En color azul la secuencia a la que se alinea el cebador hacia adelante y en color verde la secuencia a la que se alinea el cebador hacia atrás. En color rojo se encuentra la secuencia de 12 pares de bases que se inserta en el exón 20 del gen ERBB2.
Una vez amplificado el producto de PCR de 216 pares de bases, es necesario el empleo de sondas que se encuentren marcadas con un elemento halógeno para que detecten dentro de un número desconocido de copias de ADN si hay alelos mutantes dentro de la muestra analizada. A continuación, se describe este diseño:
Tabla 2. Secuencia de los cebadores hacia adelante y hacia atrás para el ensayo de ddPCR para la detección de la inserción A775YVMA con las secuencias de las sondas para la detección de los alelos silvestres y mutados
Figure imgf000007_0002
Figura 4. Diseño de sonda marcada con HEX que detecta el alelo silvestre en el exón 20 del gen ERBB2
Figure imgf000007_0001
En esta imagen se puede observar en color morado y rojo la secuencia de la sonda que se une a la secuencia silvestre en el exón 20 del gen ERBB2. Figura 5. Diseño de sonda marcada con FAM que detecta el alelo mutante en el exón 20 del gen ERBB2
Figure imgf000008_0001
En esta imagen se puede observar en color morado y rojo la secuencia de la sonda que se une a la secuencia mutante en el exón 20 del gen ERBB2.
Asimismo, es necesario para el ensayo de ddPCR incluir un control positivo, para este fin se diseñó y se sintetizó en una casa comercial una secuencia de ADN de doble cadena verificada por secuenciación conocida como gBlock. A continuación, la secuencia de control positivo usada en el ensayo de ddPCR
Figura 6. Diseño de gBlock con la secuencia mutante como control positivo del ensayo de ddPCR para la detección de la inserción A775YVMA
Figure imgf000008_0002
En esta imagen se observa el fragmento de 449 pares de bases del gBlock sintetizado como control positivo para el ensayo de detección de la inserción A775YVMA por ddPCR.
La técnica de Droplet Digital polymerase Chain reaction (ddPCR), es una técnica con una alta precisión que cuantifica moléculas de ácidos nucleicos encapsuladas en gotas, esto bajo el fundamento general de distribuir la muestra de forma aleatoria en un número elevado de particiones, de manera que contengan cero, una, o unas cuantas moléculas del ADN objetivo; posteriormente las particiones son sometidas a una reacción de amplificación en un termociclador. El número de copias del ADN objetivo se determina en función de la proporción de particiones positivas (aquellas donde hubo amplificación), clasificadas como tal, en función de su nivel de fluorescencia y utilizando un arreglo matemático que considera el volumen de la entidad de partición y la distribución de Poisson. Este método validado es capaz de detectar en un número desconocido de copias de ADN no mutado la presencia del 0,2% de ADN mutado, con una sensibilidad del 99%.
Este método se realiza en tres pasos: generación de gotas, un ensayo de ddPCR con sondas de hidrólisis o EvaGreen y la lectura y análisis de resultados. En la primera parte del proceso la muestra de ADN analizada es particionada dentro de 20.000 gotas, posteriormente se realiza una reacción de PCR en cada una de las gotas simultáneamente y una vez culminada la reacción de PCR, se realiza la lectura de la intensidad de la fluorescencia en cada una de las gotas. Luego se calcula la concentración del número de gotas con secuencias de ADN mutantes.
Para llevar a cabo el ensayo de detección de la inserción descrita, se debe seguir el procedimiento descrito más abajo.
Se inicia con la elección de la muestra a analizar, seguido de la extracción del ADN de la muestra objeto de análisis y la cuantificación del ADN obtenido posterior al proceso de extracción. Una vez determinada la cantidad de ADN obtenida para análisis, se realiza en ensayo de ddPCR y se finaliza con la lectura y análisis de datos.
Este ensayo está diseñado para determinar la inserción A775YVMA en el exón 20 del gen ERBB2 descrita anteriormente en muestras de ADN tumoral extraídas de tejido embebido en parafina (FFPE) o una biopsia liquida.
La cuantificación del ADN tumoral se realiza en los siguientes equipos de espectrofotometría (tabla 3) Tabla 3. Equipos de espectrofotometría para la cuantificación de ADN tumoral en dos tipos de muestras: tejido embebido en parafina (FFPE) y biopsia liquida
Figure imgf000010_0001
Antes de dar inicio de la preparación de la mezcla para el ensayo de ddPCR, es necesario que las muestras de ADN tumoral extraídas de FFPE sean llevadas a una concentración de 10 ng/pL y las muestras de ADN tumoral extraídas de biopsias liquida se usen en una concentración mínima de 0.2 ng/pL. A continuación, se describe el proceso de preparación de la mezcla:
1. Dejar a temperatura ambiente los siguientes reactivos (almacenados a - 20°C o 4°C) durante 20 minutos
Reactivo Almacenamiento ddPCR mezcla -20°C Cebadores hacia -20°C Adelante y hacia atrás gBlock control positivo -20°C Hindlll-Hf -20°C
Sondas silvestre y
4°C mutante
2. Preparación de reactivos a. cebadores: agregar 9pl de oligos y 41 pl de agua b. Sondas: agregar 2,5pl de sondas y 47,5pl de agua c. Enzima Hindlll: agregar 3pl de enzima y 17pl de solución amortiguadora de pH
3. Preparar mezcla, para 1 muestra (Rx): Agregar 12pl de mezcla, 1 ,2pl de cada sonda, 2,4pl de cada cebador y 1 ,2pl de enzima Hindlll. De acuerdo a la siguiente información, es posible preparar la mezcla para más de una muestra:
3 Rx 4 Rx 5 Rx 6 Rx
(1 muestra (2 muestras (3 muestras (4 muestras
Reactivo 1 Rx y 2 y 2 y 2 y 2 controles) controles) controles) controles)
Mezcla No
12mI 36mI 48mI 60mI 72mI
UTP
Sonda
EBBR2 1 ,2mI 3,6mI 4,8mI 6mI 7,2mI
Mutada
Sonda
EBBR2 1 ,2mI 3,6mI 4,8mI 6mI 7,2mI
Silvestre
Cebador hacia
2,4mI 7,2mI 9,6mI 12mI 14,4mI adelante EBBR2 1 OmM Cebador hacia atrás 2,4mI 7,2mI 9,6mI 12mI 14,4mI
EBBR2 1 OmM
Enzima
1 ,2mI 3,6mI 4,8mI 6mI 7, 2mI
Hindlll
Volumen total
20,4mI 61 ,2mI 81,6mI 102mI 122,4mI del mezcla . Agregar 20,4mI de esta mezcla en tubos de PCR . Agregar 3,6mI de muestra en cada tubo . Agregar 3,6mI de gBlock en concentración 0,05fg/pl como control positivo . Agregar 3, 6mI de agua. . Agitar y centrifugar. 9. Poner un cartucho dentro de la base, cada cartucho tiene capacidad para 8 reacciones
10. Dispensar 20mI de la mezcla preparado en cada pozo del cartucho junto con las muestras a analizar
11. Dispensar 70mI de aceite generador de gotas con pipeta multicanal, el aceite generador de gotas es gotas es un aceite que es capaz de encapsular reactivos y muestras de DNA previamente amplificados por PCR tal como lo indica la siguiente figura:
Figura 7. Diagrama de cartucho de ddPCR para ubicación de las muestras y el aceite generador de gotas
Figure imgf000012_0001
12. Tapar el cartucho con un elástico sellador y ponerlo dentro del equipo generador de gotas.
13. Una vez generadas las gotas, remover el elástico sellador.
14. Tomar una pipeta multicanal y graduarla a 40mI
15. Dispensar 40mI de la columna de gotas del cartucho en la placa manteniendo la pipeta multicanal en un ángulo de aproximadamente 95° a una velocidad constante
16. Tapar la placa y llevarla al equipo sellador. 17. Realizar una reacción en cadena de la polimerasa, las siguientes son las condiciones de PCR:
Figure imgf000013_0001
Una vez concluida el proceso de PCR para la obtención del producto que amplifica el fragmento de interés, se debe realizar la generación de las gotas, para la posterior lectura de las mismas y el análisis de los datos; después de lo cual se generarán las gotas y se podrá determinar a través de un sistema de referencia de cuadrantes, donde en el cuadrante A aparecen las gotas azules que tuvieron amplificación positiva para la mutación (inserción); el cuadrante B muestra gotas naranjas que tienen tanto ampliación de la mutación como de la secuencia silvestre; el cuadrante C muestra gotas que no tuvieron ninguna amplificación; y el cuadrante D muestra gotas con amplificación de la secuencia silvestre, tal como se muestra en la siguiente figura;
Figura 8. Diagrama en dos dimensiones en donde se encuentran las gotas generadas por la técnica de ddPCR
Figure imgf000014_0001
En la figura 8, se observa un diagrama 2D plot de un caso positivo para la presencia del alelo mutante de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2. Por otra parte, en la figura 9, se observa un caso negativo para la presencia del alelo mutante de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2.
Figura 9. Caso de muestra con presencia de alelos mutantes de la inserción de 12 bp en el exón 20 del gen ERBB2.
POSITIVO para inserción de 12bp en el exón 20 del gen ERBB2
Figure imgf000015_0001
En esta imagen (2D) se observan los 4 racimos de gotas de las muestras a. gotas que no contienen ADN (círculos grises); b. gotas que contienen solo ADN no mutado (círculos verdes); c. gotas que contienen solo ADN mutado (círculos azules); y d. gotas que contiene ADN mutado y no mutado (círculos naranjas).
Se observa la presencia de ADN mutado en la muestra analizada. Figura 10. Caso de muestra con ausencia de alelos mutantes de la inserción de 12 bp en el exón 20 del gen ERBB2
NEGATIVO para inserción de 12bp en el exón 20 del gen ERBB2
Figure imgf000016_0001
En esta imagen (2D) se observan los 4 clusters de droplets de las muestras a. droplets que no contienen ADN (círculos grises); b. droplets que contienen solo ADN no mutado (círculos verdes); c. droplets que contienen solo ADN mutado (círculos azules); y d. droplets que contiene ADN mutado y no mutado (círculos naranjas). No se observa la presencia de ADN mutado en la muestra analizada.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método para la determinación de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2 en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante caracterizado porque comprende: a) Preparar una muestra de ADN tumoral extraída de tejido embebido en parafina (FFPE) y ADN tumoral circulante. b) Llevar la muestra del paso a) a una concentración en donde la muestra de ADN tumoral es llevada a una concentración de 10ng/pL a 20 ng/pL y la muestra de ADN tumoral circulante es llevada a una concentración de 0.2 ng/pL a 1.0 ng/pL. c) Preparar cebadores hacia adelante y cebadores reversos a una temperatura de -20 grados Celsius. d) Preparar un control positivo de bloques a -20 grados Celsius. e) Preparar sondas a 4 grados Celsius. f) Realizar una mezcla de los cebadores de la etapa c) a una concentración del doble de la concentración inicial con las sondas de la etapa d) y agregar una enzima tipo Hindlll hasta una concentración de 20000 unidades /mi y un agente generador de gotas. g) Generar una pluralidad de muestras en forma de gotas con la mezcla de la etapa f) h) Realizar una reacción en cadena de la polimerasa con la pluralidad de muestras en forma de gotas de la etapa f) a una temperatura de entre 4 y 95 grados Celsius en un rango de tiempo de entre 30 segundos y 600 segundos y entre 1 y 40 ciclos. i) Determinar la ampliación positiva para la mutación.
2. El método para la determinación de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2 en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante de la reivindicación 1 caracterizado porque dicha muestra de ADN tumoral es extraída de tejido embebido en parafina (FFPE) o de una biopsia liquida.
3. El método para la determinación de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2 en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante de la reivindicación 1 caracterizado porque en la etapa c) los cebadores hacia adelante y hacia tras se encuentran en una cantidad entre 2.4 mI y 14,4 mI cada uno.
4. El método para la determinación de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2 en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante de la reivindicación 1 caracterizado porque la sonda de la etapa e) es del tipo silvestre y mutante y se encuentran en una concentración de 18 hasta 20 nanomolar.
5. El método para la determinación de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2 en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante de la reivindicación 1 caracterizado porque en la etapa i), la ampliación positiva para la inserción presenta un sistema de contraste que permite determinar la inserción de los 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2 en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante.
6. Un Kit de diagnóstico para la determinación de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2 en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante caracterizado porque comprende: a) Cebadores hacia adelante (5’-3’) y cebadores reversos (3’-5’). b) Un control positivo de bloques. c) Un conjunto de sonda silvestre y mutante.
7. El Kit de diagnóstico para la determinación de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2 en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante de la reivindicación 6 caracterizado porque el cebador hacia adelante (5’-3’) presenta la secuencia GCTGTGGTTTGTGATGGTTG.
8. El Kit de diagnóstico para la determinación de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2 en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante de la reivindicación 6 caracterizado porque el cebador hacia atrás (3’-5’) presenta la secuencia TGGTCTAAGAGGCAGCCATA.
9. El Kit de diagnóstico para la determinación de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2 en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante de la reivindicación 6 caracterizado porque la sonda silvestre presenta la secuencia CCAGGAAGCATACGTGATGGCT.
10. El Kit de diagnóstico para la determinación de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2 en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante de la reivindicación 6 caracterizado porque la sonda mutante presenta la secuencia AGCATACGTGATGGCATACGTGATGGCT.
11. El Kit de diagnóstico para la determinación de la inserción de 12 pares de bases en el exón 20 del gen ERBB2 en muestras de tejido tumoral y ADN tumoral circulante de la reivindicación 6 caracterizado porque el control positivo de bloques es una secuencia de ADN de doble cadena verificada por secuenciación.
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