WO2021004326A1 - 高通量的化合物库构建和筛选方法以及反应装置 - Google Patents

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卡尔·巴里 夏普利斯
孟根屹
郭太杰
马天成
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Definitions

  • Triazole is an important five-membered nitrogen heterocyclic compound, involved in a wide range of industrial applications, such as agrochemicals, corrosion inhibitors, dyes, fluorescent brighteners, and biologically active agents.
  • Azide functional groups are extremely important and widely used in organic synthesis. However, because these compounds have high energy, they have great safety hazards during synthesis, storage, and transportation, which makes synthesis and use difficult.
  • the methods for synthesizing azides currently available to civilization are very limited. Most of the alkyl, acyl, and sulfonyl azides are obtained by nucleophilic substitution reaction, using NaN 3 to replace the leaving functional group in a polar solvent. This method requires For separation and purification, the synthesis efficiency is not high, resulting in the need for cumbersome post-processing for further activity screening.
  • step (b0) m different amines respectively located in m reaction chambers are used to react with FSO 2 N 3 to obtain different RN 3 .
  • the solvent is an ether solvent, a mixed solvent of a sulfoxide solvent and water, or a mixed solvent of an ether solvent, a nitrile solvent and water.
  • the step (1) includes the steps:
  • heterocyclic group means a group consisting of 2 to 14 carbon atoms and 1 to 6 heteroatoms selected from nitrogen, phosphorus, oxygen and sulfur Stable 3- to 20-membered non-aromatic cyclic group.
  • the heterocyclic group may be a monocyclic, bicyclic, tricyclic or more ring system, which may include a fused ring system, a bridged ring system or a spiro ring system; in the heterocyclic group
  • the nitrogen, carbon, or sulfur atoms of may be optionally oxidized; the nitrogen atom may be optionally quaternized; and the heterocyclic group may be partially or fully saturated.
  • the heterocyclic group can be connected to the rest of the molecule via a carbon atom or a heteroatom and through a single bond.
  • one or more rings may be aryl or heteroaryl as defined below, provided that the point of attachment to the rest of the molecule is a non-aromatic ring atom.
  • a CuAAC-based synthesis reaction is used to realize chemical connection between two molecules, thereby constructing a compound library with high throughput.
  • the azide compound as a 1,3-dipolarizing reagent can also be prepared by reacting an amine fragment with a fluorosulfonyl azide.
  • An exemplary reaction formula is as follows:
  • 1128 different primary amine compounds (including primary alkyl amines, primary aryl amines, and primary aromatic heterocyclic amines) were prepared into a solution with a concentration of about 100 mM, the solvent was dimethyl sulfoxide, and the volume was about 1 ml , And stored in a 1.2 ml 96-well microplate.
  • 1128 corresponding azide compounds were obtained by this method.
  • the 1128 azide compound solutions were distributed in 12 96-well microplates (microplate numbers 1-7 and 10-14).
  • the 96 separately stored primary amines mentioned in Example 2 (part of the primary amines have poor solubility) were reacted by the same method in this example to obtain 96 soluble azide compound solutions and transferred to a new piece of 96-well microtiter plate (see the 8th plate of the azide library for details).
  • a compound library containing a total of 1224 azide solutions with different structures was built.

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Abstract

本发明提供了高通量的化合物库构建和筛选方法以及反应装置。具体地，本发明的方法包括：(a)提供一反应器，所述的反应器包括n个各自独立并可寻址的反应腔室；(b)在所述的n个反应腔室中，进行m个各自独立的合成反应，从而构建获得一化合物库；以及(c)在进行了所述合成反应的反应腔室中，进行活性测试。在本发明中，可以在同一反应体系中，完成化合物的制备以及筛选过程，由于本发明的反应均为几乎定量生成产物，因此产物无需分离即直接可用于酶学乃至细胞学的活性测试实验。

Description

高通量的化合物库构建和筛选方法以及反应装置 技术领域
本发明涉及化学和生物领域，具体地，涉及高通量的化合物库构建和筛选方法以及反应装置。
背景技术
三氮唑是重要的五元氮杂环化合物，涉及广泛的工业应用，例如农用化学品，腐蚀抑制剂，染料，荧光增白剂，以及生物活性剂等。叠氮类官能团在有机合成中有着极为重要和广泛的用途，但是由于该类化合物都具有很高的能量，在合成，储存，运输过程中都有很大的安全隐患，导致合成和使用不易。人类目前掌握的合成叠氮类化合物的方法很有限，其中烷基，酰基，磺酰基叠氮大部分使用亲核取代反应，使用NaN 3在极性溶剂中取代离去性官能团获得，该方法需要进行分离纯化，合成效率不高，导致在用于进一步的活性筛选时需要进行繁琐的后处理。
在药物和农用化学品的开发中，为了寻找生理活性物质(如先导化合物)，人们已经对商用化合物库和通过组合合成法产生的化合物库进行了筛选。然而，在用作药物的化合物的合成中，分离和纯化要花费大量时间，要找到可用做药物的先导化合物也比较困难。组合化学产生的化合物库是许多化合物的混合物，产物结构难以控制。此外，为了建立化合物库，在合成化合物及其衍生物的过程中们需要鉴别化合物的结构，这样才能确定适合对化合物进行改性的方法，以及探寻合成衍生物的反应条件。由此带来的不利结果是，合成化合物需要花费大量时间。
因此，需要开发一种简便、高效、高通量的合成化合物库并进行活性筛选的方法。
发明内容
本发明提供了一种简便、高效、高通量的合成化合物库并进行活性筛选的方法。
本发明第一方面，提供一种用于高通量化合物库构建和筛选的方法，包括：
(a)提供一反应器，所述的反应器包括n个反应腔室，其中所述反应腔室是各自独立并可寻址的，并且所述n个反应腔室构成可寻址的反应腔室阵列；
(b)在所述的n个反应腔室中，进行m个各自独立的合成反应，并在各个进行合成反应的反应腔室中各自获得合成产物，从而构建获得一化合物库；
其中，所述的合成反应包括以下步骤：
(b1)在一个反应腔室中，在惰性溶剂中，用1,3-偶极环化试剂与含有末端不饱和键的反应底物进行1,3-偶极环加成反应，从而形成含有1,3-偶极环的反应产物；
以及(c)任选地，在进行了所述合成反应的反应腔室中，分别加入活性测试试剂， 从而进行活性测试，从而对各个合成产物进行活性筛选；
其中，n为≥10的正整数，m为≤n且m≥10的正整数。
在另一优选例中，在步骤(c)中，在加入所述活性测试试剂后，进行孵育，使得所述的活性测试试剂与各个合成反应进行反应或接触。
在另一优选例中，所述的反应器包括阵列反应器。
在另一优选例中，n为20-50000，较佳地36-10000，更佳地48-5000，最佳地96-2500。
在另一优选例中，所述的1,3-偶极环化试剂为R-N 3，式中，R为与叠氮基团相连的分子部分(moiety)或片段。
在另一优选例中，在二个或多个反应腔室进行相同的合成反应。
在另一优选例中，在各个反应腔室中进行不同的合成反应。
在另一优选例中，所述的合成反应中，使用分别位于m个反应腔室中的m种1,3-偶极环化试剂，分别与同种含有末端不饱和键的反应底物进行反应。
在另一优选例中，所述的“末端不饱和键”指位于末端的末端原子(氢原子除外)与其相邻的次末端原子(氢原子除外)存在双键或三键。
在另一优选例中，所述的端原子和次末端原子各自独立地选自下组：C、N、或其组合。
在另一优选例中，所述的“末端不饱和键”选自下组：C＝C、C≡C、C≡N、或其组合。
在另一优选例中，所述的反应腔室为微型或小型的反应腔室。
在另一优选例中，所述的反应腔室体积各自独立地为5μL-5000μL。
在另一优选例中，所述的反应腔室的体积为10-2000μL，更佳地20μL-1500μL。
在另一优选例中，在单个所述反应腔室中，进行所述合成反应的反应体系的体积≤2ml，较佳地≤1ml，更佳地≤0.6ml。
在另一优选例中，在单个所述反应腔室中，进行所述合成反应的反应体系的体积为5-2000μL，较佳地10-1000μL，更佳地20-600μL。
在另一优选例中，所述的活性测试试剂选自下组：小分子化合物、蛋白、核酸、细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述活性测试试剂包括酶活性测试试剂组合物、或细胞活性测试试剂组合物。
在另一优选例中，所述的活性测试试剂为具有生理活性的化合物，较佳地选自下组：酶抑制剂、配体/受体结合抑制剂、血管新生抑制剂、细胞粘附抑制剂、基因表达抑制剂和类生长因子活性物质。
在另一优选例中，所述的酶抑制剂选自下组：酪氨酸酶抑制剂、环氧和酶抑制剂、端粒酶抑制剂、基质金属蛋白抑制剂、前列腺素D合成抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、胆碱酯酶抑制剂、病毒蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂，或其组合。
在另一优选例中，所述的蛋白包括：抗体、配体、抗原、或其组合。
在另一优选例中，所述的步骤(c)中包括步骤：检测各个反应腔室，从而分别得到各个腔室中的活性测试结果。
在另一优选例中，所述的步骤(b)和(c)之间，不包括对反应产物进行分离或纯化的步骤。
在另一优选例中，在步骤(b)(例如步骤(b1))结束后，不经分离，直接应用于步骤(c)进行后续的活性测试。
在另一优选例中，所述的步骤(b)中，所述的1,3-偶极环加成反应的反应式选自下组：
Figure PCTCN2020099034-appb-000001
式中，R、R'、R”和R”'各自独立地为R 1或
Figure PCTCN2020099034-appb-000002
而所述的R 1和R 2各自独立地为底物片段。
在另一优选例中，所述的步骤(b)中，所述的1,3-偶极环加成反应的反应式如下：
Figure PCTCN2020099034-appb-000003
其中，R、R”各自独立地为R 1或
Figure PCTCN2020099034-appb-000004
所述的R 1和R 2各自独立地为底物片段。
在另一优选例中，所述的R 1和R 2为所述反应底物中除了末端不饱和键的分子 部分(moiety)之外的其余分子部分。
在另一优选例中，所述的R 1和R 2各自独立地为药物活性片段。
在另一优选例中，所述的R 1和R 2各自独立地为取代或未取代的选自下组基团：烷基、环烷基、杂烷基、杂环基、链烯基、环烯基、炔基、芳基、芳杂基、磺酰基、或其组合。
在另一优选例中，所述的R 1和R 2各自独立地选自下组：取代或未取代的C 1-C 12烷基、取代或未取代的3-12元杂烷基、取代或未取代的5-16元杂芳基、取代或未取代的C 6-C 18芳基、取代或未取代的3-20元杂环基、取代或未取代的的C 3-C 12环烷基；其中，所述的取代指基团中的一个或多个氢原子被取代基Ra所取代，且所述的Ra选自下组：卤素、取代或未取代的C 1-C 6烷基、取代或未取代的C 2-C 6烯基、取代或未取代的C 2-C 6炔基、取代或未取代的C 3-C 12环烷基、氧代(即＝O)、Rf-SO 2-、＝NRf、-CN、羟基、-ORf、NRdRe、取代或未取代的C 1-C 6胺基、取代或未取代的-(C 1-C 6亚烷基)-NH-(C 1-C 6亚烷基)、羧基、取代或未取代的C 6-C 10芳基、取代或未取代的具有1-3个杂原子的5-12元杂芳基、取代或未取代的具有1-4个杂原子的5-12元杂环基,所述的取代基选自下组：卤素、羟基、羧基、氰基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷胺基；
Rd、Re、Rf各自独立地选自下组：H、取代或未取代的C 1-C 6烷基、取代或未取代的C 3-C 10环烷基、取代或未取代的C 6-C 10芳基、取代或未取代的具有1-3个杂原子的5-12元杂芳基、取代或未取代的具有1-4个杂原子的5-12元杂环基；
所述Ra、Rd、Re、Rf的“取代”是指被选自下组的一个或多个(例如2个、3个、4个等)取代基所取代：卤素、-CH 2Cl、-CHCl 2、-CCl 3、-CH 2F、-CHF 2、-CF 3、-O(CH 2) xO(CH 2) yCH 3、氧代、-CN、羟基、氨基、取代胺基、羧基、-NHAc、未取代或被一个或多个选自下组的取代基取代的选自下组的基团：C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 6-C 10芳基、C 3-C 8环烷基、卤代的C 6-C 10芳基、具有1-3个选自N、S和O的杂原子的5-10元杂芳基、具有1-3个选自N、S和O的杂原子的5-10元杂环基；
x为1、2、3、4、5或6；
y为0、1、2、3、4、5或6；
上述各式中，任一所述杂原子各自独立地选自下组：N、S和O。
在另一优选例中，任一反应底物和反应产物或其中的各基团或原子均符合的化合物的价态的相关规则(例如C最高为4价，N最高价态为5价)。
在另一优选例中，所述的反应底物和反应产物为有机化合物。
在另一优选例中，所述的R-NH 2为未保护的游离胺或酸保护的胺的盐。
在另一优选例中，所述的1,3-偶极环加成反应为利用点击化学反应原理进行模块化的合成。
在另一优选例中，所述的1,3-偶极环化试剂是原位制备的(in situ)或添加至所述反应腔室。
在另一优选例中，所述的步骤(b)中，在步骤(b1)之前，还包括：
(b0)在惰性溶剂中，碱存在下，用胺片段(优选为R-NH 2)与FSO 2N 3进行反应，从而制得1,3-偶极环化试剂；
Figure PCTCN2020099034-appb-000005
其中，R为与叠氮基团相连的分子部分(moiety)或片段。
在另一优选例中，所述步骤(b0)是在或不在所述反应腔室中进行的。
在另一优选例中，在所述步骤(b0)中，使用分别位于m个反应腔室中的m种不同的胺，分别与FSO 2N 3进行反应，从而获得不同的R-N 3。
在另一优选例中，所述的R-NH 2与FSO 2N 3的摩尔比优选为约1:2至2:1，如约1:1。
在另一优选例中，所述的碱与FSO 2N 3的摩尔比为约10：1至2:1，较佳地为约4:1。
在另一优选例中，在所述步骤(b0)中，所述叠氮化合物制备反应均可在0℃～60℃，较佳地25℃～30℃下进行。
在另一优选例中，在步骤(b0)中制备所述的叠氮化合物R-N 3，不经分离，直接用于后续的1,3-偶极环加成反应。
在另一优选例中，在步骤(b)(包括步骤(b0)和/或步骤(b1))中，所述的惰性溶剂选自下组：水、腈类溶剂、醇类溶剂、芳烃类溶剂、卤代烷烃类溶剂、二氧化硫、烷烃类溶剂、酯类溶剂、酮类溶剂、醚类溶剂、亚砜类溶剂、酰胺类溶剂和N-甲基吡咯烷酮，或其组合。
在另一优选例中，所述的腈类溶剂为乙腈。
在另一优选例中，所述的醇类溶剂选自下组：甲醇、乙醇、叔丁醇，或其组合。
在另一优选例中，所述的芳烃类溶剂选自下组：苯、甲苯、三氟甲苯、氟苯，或其组合。
在另一优选例中，所述的卤代烷烃类溶剂选自下组：二氯甲烷、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷，或其组合。
在另一优选例中，所述的烷烃类溶剂选自下组：石油醚30-60、石油醚60-90、正己烷，或其组合。
在另一优选例中，所述的酯类溶剂为乙酸乙酯。
在另一优选例中，所述的酮类溶剂为丙酮。
在另一优选例中，所述的醚类溶剂选自下组：甲基叔丁基醚、1,4-二氧六环、乙醚、四氢呋喃，或其组合。
在另一优选例中，所述的亚砜类溶剂为二甲基亚砜。
在另一优选例中，所述的酰胺类溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
在另一优选例中，所述的溶剂为醚类溶剂、亚砜类溶剂与水的混合溶剂，或者醚类溶剂、腈类溶剂与水的混合溶剂。
在另一优选例中，所述的溶剂为甲基叔丁基醚、二甲基亚砜与水的混合溶剂，或者甲基叔丁基醚、乙腈与水的混合溶剂。
在另一优选例中，当所述的溶剂为醚类溶剂、亚砜类溶剂与水的混合溶剂时，所述的醚类溶剂、亚砜类溶剂与水的体积比为2-7:10-20:0.8-1.2；优选为5:15:1。
在另一优选例中，当所述的溶剂为醚类溶剂、腈类溶剂与水的混合溶剂时，所述的醚类溶剂、腈类溶剂与水的混合溶剂的体积比为15-25:0.8-1.2:15-25；优选为20:1:20。
在另一优选例中，在步骤(b)(包括步骤(b0)和/或步骤(b1))中，所述的碱为无机碱和/或有机碱。
在另一优选例中，所述的碱为无机碱时，所述的无机碱为碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾和磷酸钾中的一种或多种。
在另一优选例中，所述的碱为有机碱时，所述的有机碱为三乙胺、N，N-二异丙基乙胺、吡咯、吡啶、4-二甲氨基吡啶、醋酸钠、醋酸钾、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯和四甲基乙二胺中的一种或多种。
在另一优选例中，所述方法还包括：
将所述反应底物、反应产物、和活性测试的数据，基于所述反应腔室的可寻址的地址进行关联，从而获得一个可寻址的数据集。
本发明第二方面，提供一种高通量的可寻址的反应装置，所述的装置包括：
(i)一反应模块，所述反应模块用于进行1,3-偶极环加成反应；并且所述反应模块包括至少一个反应器，所述的反应器包括n个反应腔室，其中所述反应腔室是各自独立并可寻址的，并且所述n个反应腔室构成可寻址的反应腔室阵列，所述反应腔室用于进行所述的1,3-偶极环加成反应，从而在反应腔室中形成合成产物；
其中，n为≥10的正整数，m为≤n且m≥10的正整数；
以及(ii)任选的活性测试模块，所述活性测试模块用于对所述反应腔室中形成的合成产物在原位进行活性测试，从而获得活性测试数据。
在在另一优选例中，所述的反应器包括m种反应试剂，其分别位于m个反应腔室中；其中，所述的反应试剂为1,3-偶极环化试剂或其胺前体(即胺片段)。
在另一优选例中，所述的装置还包括(iii)自动移液模块，所述自动移液模块用于将反应试剂和/或活性测试试剂添加至预定的各个可寻址的反应腔室中。
在另一优选例中，所述的装置还包括：(iv)一处理器，所述处理器用于控制所述的反应模块、活性测试模块、和自动移液模块中的一个或多个模块。
在另一优选例中，所述的处理器还用于将所述反应底物、反应产物、和活性测试的数据，基于所述反应腔室的可寻址的地址进行关联，从而获得一个可寻址的数据集，并发送或存储所述的数据集。
在另一优选例中，所述的反应器选自下组：微孔板、阵列PE管、阵列试管、阵列反应瓶、或其组合。
在另一优选例中，所述的反应器为阵列反应器。
本发明第三方面，提供一种化合物库的构建方法，包括步骤：
(1)使用第二方面所述的高通量的可寻址的反应装置，进行所述化合物库的构建。
在另一优选例中，在步骤(1)中包括步骤：
(1a)当反应试剂为胺片段时，将FSO 2N 3分别与各个反应腔室中的胺片段化合物进行反应，制备得到1,3-偶极环化试剂，从而获得由1,3-偶极环化试剂构成的第一化合物库；和
(1b)任选地，在所述反应腔室中，使含有末端不饱和键的反应底物分别与所述的1,3-偶极环化试剂进行反应，形成1,3-偶极环化合物，从而获得由所述1,3-偶极环化合物构成的第二化合物库。
在另一优选例中，所述方法还包括：
(2)对所述第二化合物库中的1,3-偶极环化合物，在所述反应腔室中原位进行活性测试。
本发明第四方面，提供一种第二方面所述的高通量的可寻址的反应装置的用途，用于选自下组的一个或多个用途：
a)同时合成不同化合物；
b)高通量(HTS)随机筛选具有生理活性的化合物；
c)药物或农业化学品的寻找；和
d)药物、或农用化学品的先导化合物的寻找。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了由伯胺化合物库制备1224个叠氮化合物库和1224个三氮唑化合物库。
图2a-f显示了伯胺化合物库制备叠氮化合物库的示例性的UPLC色谱。
图3a-f显示了叠氮化合物库进行铜催化叠氮端炔(4a)环加成反应(CuAAC)的示例性的UPLC色谱。
[根据细则26改正30.07.2020]　
图4a-i显示了伯胺化合物库通过与铜催化叠氮端炔(4a)环加成反应(CuAAC)直接得到1,2,3-三氮唑化合物库的示例性的UPLC色谱。
[根据细则26改正30.07.2020]　
图5a-d显示了伯胺化合物库通过重氮转移与铜催化叠氮端炔(4b)环加成反应(CuAAC)直接得到1,2,3-三氮唑化合物库的示例性的UPLC色谱。
图6显示了本发明一个实施例中，对一个药物分子高通量构建了含840个化合物的化合物库，并进行活性筛选。
具体实施方式
通过广泛而深入的研究，本发明人首次开发了一种高通量化合物库构建和筛选方法以及用于所述方法的装置。在本发明方法中，首次采用各自独立并可寻址的多个反应腔室所构成可寻址的反应腔室阵列，在各个反应腔室中独立地进行特定的合成反应，从而高通量地制得大量不同的结构明确的反应产物，并由此获得高通量的化合物库。出乎意料地，实验表明，含所述的反应产物的可寻址的反应腔室阵列(或相应的化合物库)，可以在不必进行分离和纯化的情况下，就直接在原位进行后续的化合物活性测定，从而极大地提高了化合物库构建和筛选效率。在此基础上完成了本发明。
在一优选例中，本发明人采用可寻址的反应腔室阵列，高通量地合成上千种不同的1,3-偶极环化试剂(作为叠氮化合物库，或第一化合物库)，随后高通量地合成了上千种不同的1,3-偶极环反应产物(作为三氮唑衍生物库，或第二化合物库)。通过对本发明化合物库进行原位活性筛选，极大地加速药物先导化合物的发现，提高了筛选速度，缩短了新型抑制剂的开发研究周期(可从数年缩短至数周或数日)。
术语
本发明所用“反应腔室”为能够进行化学反应的各种装置，包括但不限于：微孔板的微孔，PE管、试管、反应瓶等。
可在参考文献(包括Carey and Sundberg"ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY4TH ED."Vols.A(2000)and B(2001),Plenum Press,New York)中找到对标准化学术语的定义。除非另有说明，否则采用本领域技术范围内的常规方法，如质谱、NMR、 IR和UV/VIS光谱法和药理学方法。除非提出具体定义，否则本文在分析化学、有机合成化学以及药物和药物化学的有关描述中采用的术语是本领域已知的。例如，可利用厂商对试剂盒的使用说明，或者按照本领域公知的方式或本发明的说明来实施反应和进行纯化。通常可根据本说明书中引用和讨论的多个概要性和较具体的文献中的描述，按照本领域熟知的常规方法实施上述技术和方法。在本说明书中，可由本领域技术人员选择基团及其取代基以提供稳定的结构部分和化合物。
当通过从左向右书写的常规化学式描述取代基时，该取代基也同样包括从右向左书写结构式时所得到的在化学上等同的取代基。举例而言，-CH 2O-等同于-OCH 2-。
本文所用的章节标题仅用于组织文章的目的，而不应被解释为对所述主题的限制。本申请中引用的所有文献或文献部分包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、操作手册和论文，均通过引用方式整体并入本文。
在本文中定义的某些化学基团前面通过简化符号来表示该基团中存在的碳原子总数。例如，C1-C6烷基是指具有总共1至6个碳原子的如下文所定义的烷基。简化符号中的碳原子总数不包括可能存在于所述基团的取代基中的碳。
除前述以外，当用于本申请的说明书及权利要求书中时，除非另外特别指明，否则以下术语具有如下所示的含义。
在本申请中，术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
“羟基”是指-OH。
“羰基”是指-C(＝O)-。
“氰基”是指-CN。
“氨基”是指-NH 2。
“取代的氨基”是指被一个或两个如下文所定义的烷基、烷基羰基、芳烷基、杂芳烷基取代的氨基，例如，单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰氨基、芳烷基氨基、杂芳烷基氨基。
“羧基”是指-COOH。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分(例如用在卤素取代的烷基等基团中)，术语“烷基”是指完全饱和的直链或支链的烃链基，仅由碳原子和氢原子组成、具有例如1至12个(优选为1至8个，更优选为1至6个)碳原子，且通过单键与分子的其余部分连接，例如包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、辛基、壬基和癸基等。环烷基的实例包括单环烷基或多环烷基如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基。
“亚烷基”单独使用或在复合词例如任选取代的亚烷基中使用表示与以上定义的“烷基”一样的基团，只是另一个氢被除去以形成二价基团。应理解任选的取代基可以连接在亚烷基链上或形成亚烷基链的一部分。
“烯基”单独使用或在复合词如“任选取代的烯基”中使用表示从直链、支链或环状烯烃形成的基团，包括以上定义的乙烯化单、二或多不饱和烷基或环烷基，优选C2-6烯基。烯基的实例包括乙烯基、烯丙基、1-甲基乙烯基、丁烯基、异丁烯基、3-甲基-2丁烯基、1-戊烯基、环戊烯基、1-甲基-环戊烯基、1-己烯基、3-己烯基、环己烯基、1-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、环辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、1-癸烯基、3-癸烯基、1,3-丁二烯基、1,4-戊二烯基、1,3环戊二烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、1,3环己二烯基、1,4-环己二烯基、1,3-环庚二烯基、1,3,5-环庚三烯基和1,3,5,7-环辛四烯基。
“炔基”单独使用或在复合词如“任选取代的炔基”中使用表示从直链、支链或单、二或多环状炔烃形成的基团，优选C2-6炔基。炔基的实例包括乙炔基、1-丙炔基、1-和2-丁炔基、2-甲基-2-丙炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、10-十一炔基、4-乙基-l-辛炔-3-基、7-十二炔基、9-十二炔基、10-十二炔基、3-甲基-1-十二炔-3-基、2-十三炔基、11-十三炔基、3-十四炔基、7-十六炔基、3-十八炔基等。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，术语“杂烷基”意指由2至14个碳原子以及1至6个选自氮、磷、氧和硫的杂原子组成的完全饱和的直链或支链的烃链基。其杂烷基中的氮、碳或硫原子可任选地被氧化；氮原子可任选地被季铵化。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，术语“杂环基”意指由2至14个碳原子以及1至6个选自氮、磷、氧和硫的杂原子组成的稳定的3元至20元非芳香族环状基团。除非本说明书中另外特别指明，否则杂环基可以为单环、双环、三环或更多环的环体系，其可包括稠合环体系、桥环体系或螺环体系；其杂环基中的氮、碳或硫原子可任选地被氧化；氮原子可任选地被季铵化；且杂环基可为部分或完全饱和。杂环基可以经由碳原子或者杂原子并通过单键与分子其余部分连接。在包含稠环的杂环基中，一个或多个环可以是下文所定义的芳基或杂芳基，条件是与分子其余部分的连接点为非芳香族环原子。就本发明的目的而言，杂环基优选为包含1至3个选自氮、氧和硫的杂原子的稳定的4元至11元非芳香性单环、双环、桥环或螺环基团，更优选为包含1至3个选自氮、氧和硫的杂原子的稳定的4元至8元非芳香性单环、双环、桥环或螺环基团。杂环基的实例包括但不限于：吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基、高哌嗪基、哌啶基、硫代吗啉基、2,7-二氮杂-螺[3.5]壬烷-7-基、2-氧杂-6-氮杂-螺[3.3]庚烷-6-基、2,5-二氮杂-双环[2.2.1]庚烷-2-基、氮杂环丁烷基、吡喃基、四氢吡喃基、噻喃基、四氢呋喃基、噁嗪基、二氧环戊基、四氢异喹啉基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、喹嗪基、噻唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、二氢吲哚基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、吡咯烷基、吡唑烷基、邻苯二甲酰亚氨基等。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，术语“芳基”意指具有6至18个 碳原子(优选具有6至10个碳原子)的共轭烃环体系基团。就本发明的目的而言，芳基可以为单环、双环、三环或更多环的环体系，还可以与上文所定义的环烷基或杂环基稠合，条件是芳基经由芳香环上的原子通过单键与分子的其余部分连接。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、蒽基、菲基、芴基、2,3-二氢-1H-异吲哚基、2-苯并噁唑啉酮、2H-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮-7-基等。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，术语“杂芳基”意指环内具有1至15个碳原子(优选具有1至10个碳原子)和1至6个选自氮、氧和硫的杂原子的5元至16元共轭环系基团。除非本说明书中另外特别指明，否则杂芳基可为单环、双环、三环或更多环的环体系，还可以与上文所定义的环烷基或杂环基稠合，条件是杂芳基经由芳香环上的原子通过单键与分子的其余部分连接。杂芳基中的氮、碳或硫原子可任选地被氧化；氮原子可任选地被季铵化。就本发明的目的而言，杂芳基优选为包含1至5个选自氮、氧和硫的杂原子的稳定的5元至12元芳香性基团，更优选为包含1至4个选自氮、氧和硫的杂原子的稳定的5元至10元芳香性基团或者包含1至3个选自氮、氧和硫的杂原子的5元至6元芳香性基团。杂芳基的实例包括但不限于噻吩基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、噁唑基、噁二唑基、异噁唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、吲哚基、呋喃基、吡咯基、三唑基、四唑基、三嗪基、吲嗪基、异吲哚基、吲唑基、异吲唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、二氮萘基、萘啶基、喹噁啉基、蝶啶基、咔唑基、咔啉基、菲啶基、菲咯啉基、吖啶基、吩嗪基、异噻唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、噁三唑基、噌啉基、喹唑啉基、苯硫基、中氮茚基、邻二氮杂菲基、异噁唑基、吩噁嗪基、吩噻嗪基、4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩基、萘并吡啶基、[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪、[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪、[1,2,4]三唑并[4,3-c]嘧啶、[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶、咪唑并[1,2-a]吡啶、咪唑并[1,2-b]哒嗪、咪唑并[1,2-a]吡嗪等。
在本申请中，“任选地”或“取代或未取代”表示随后描述的事件或状况可能发生也可能不发生，且该描述同时包括该事件或状况发生和不发生的情况。例如，“任选地被取代的芳基”表示芳基被取代或未被取代，且该描述同时包括被取代的芳基与未被取代的芳基。本发明权利要求书和说明书部分所述的“任选地”的取代基选自烷基、烯基、炔基、卤素、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、氰基、硝基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环烃基、任选取代的杂环烃基。
本文所用术语“底物片段”是指反应底物中除了参与特定反应的某一官能团(如不饱和键)之外的其余分子部分。
本文所用术语“部分”、“结构部分”、“化学部分”、“基团”、“化学基团”是指分子中的特定片段或官能团。化学部分通常被认为是嵌入或附加到分子上的化学实体。
化合物库构建及其应用
在本发明的一个优选例中，采用基于CuAAC的合成反应，来实现两个分子之间实现化学连接，从而高通量地构建化合物库。
由于本发明的方法的简便性和高效性，使得重氮转移即使在小型实验室也可具备一定工业实用性，例如，在获得1000中伯胺的情况下，一个人可以在2周内构建一个浓度为0.1mol/L的1000个伯胺化合物库，可以在一天内将该1000个伯胺化合物实现叠氮化，从而构建一个1000个叠氮化合物库，该1000个叠氮化合物可与末端炔基化合物反应，例如，100个末端炔基化合物，可以得到100,000个三氮唑化合物，其可直接用于后续的活性筛选。与组合化学产生的常规化合物库相比，本发明构建的化合物库在每个反应器中主要含有一种化合物，而不是许多化合物的混合物，并且易于控制。
库中的化合物的结构可用任何已知的结构分析方法，如质谱、串联质谱、紫外/可见光吸收光谱、质子核磁共振谱，C 13核磁共振谱、红外吸收光谱和X射线衍射晶体光谱，或者他们的组合。
本发明提供了一种高通量化合物库构建和筛选方法，可以一次性同时大批量合成不同化合物，所构建的化合物库，可用于高通量(HTS)随机筛选、药物或农业化学品的寻找、药物、或农用化学品的先导化合物的寻找等。
例如，为了得到具有生理活性的化合物，可利用该化合物库进行各种筛选。具有生理活性的化合物的例子包括但不限于酶抑制剂、配体/受体结合抑制剂、血管新生抑制剂、细胞粘附抑制剂、基因表达抑制剂和类生长因子活性物质。酶抑制剂的例子包括酪氨酸酶抑制剂、环氧和酶抑制剂、端粒酶抑制剂、基质金属蛋白抑制剂、前列腺素D合成抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、胆碱酯酶抑制剂、病毒蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂。受体的例子包含肾上腺素受体、组胺受体、白三烯受体和阿片受体。
1,3-偶极环试剂
本发明中，通过1,3-偶极化试剂，对于末端具有不饱和键的底物片段进行1,3-偶极环化反应，得到含有1,3-偶极环结构的化合物，例如：三氮唑化合物。其示例性反应路线如下式所示：
Figure PCTCN2020099034-appb-000007
式中，R、R'、R”和R”'各自独立地为R 1或
Figure PCTCN2020099034-appb-000008
所述的R 1和R 2各自独立地为底物片段。
在本发明中，所述的R 1和R 2为所述反应底物中除了末端不饱和键的分子部分(moiety)之外的其余分子部分。
优选地，所述的R 1和R 2各自独立地为来自药物分子的药物活性片段。
在本发明中，对于R、R'、R”和R”'或相应的R 1和R 2没有特别限制，可以是各种合适的有机基团；典型地，代表性的R 1和R 2包括C、H、O、N、S、F、Cl等元素形成的有机基团，例如由取代或未取代的选自下组基团所构成的分子部分(moiety)：烷基、环烷基、杂烷基、杂环基、链烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、磺酰基、或其组合。
虽然本发明举出了示例性的R、R'、R”和R”'基，但应理解，在本发明方法下，任何带有叠氮结构的化合物皆可作为本发明的1,3-偶极环化试剂来使用，用于与末端存在不饱和基团(如烯基、炔基、环烯基、氰基等)的底物反应，得到含有氮杂环的化合物。
一类特别优选的底物为本领域已知的药物分子(例如厄洛替尼分子)，或者被不饱和基团修饰的已知药物分子。在优选的实施方式中，该修饰可以通过本领域已知方法，采用反合成分析法得到修饰路线，例如，采用本领域已知的偶联反应进行不饱和基团的修饰(如Suzuki反应等)。
1,3-偶极环化试剂(叠氮化合物)
本发明中，作为1,3-偶极化试剂的叠氮化合物还可以通过胺片段与氟磺酰叠氮反应从而制备得到。示例性的反应式如下：
Figure PCTCN2020099034-appb-000009
其中取代基R可以是所有取代或未取代的烷基、环烷基、杂烷基、杂环基、链烯基、环烯基、炔基、芳基、芳杂基、磺酰基、或其组合。示例性的R定义参见上述R、R'、R”和R”'的定义。
虽然本发明举出了示例性的R基，但应理解，在本发明方法下，任何带有伯胺结构的底物皆可作为本发明的胺片段使用，用于构建作为1,3-偶极环化试剂的叠氮化合物。应理解，由于自然界存在丰富的伯胺化合物，因此，该方法可以采用任何现有的伯胺片段进行，也可以采用后续开发的任意伯胺片段。
本发明的主要优点包括：
1.反应简单高效，可快速大规模合成成百上千或更多的结构明确的化合物，从而获得可寻址的化合物库。
2.可快速构建1,3-偶极环化试剂化合物库和1,3-偶极环试剂化合物库。
3.与组合化学产生的常规化合物库相比，本发明构建的化合物库在每个反应器中主要含有一种化合物，而不是含多种反应产物的混合物，并且易于控制。
4.本发明的高通量化合物库构建与筛选方法，由于化学计量的试剂几乎定量的因此，可以将其应用于基于片段的药物发现。
5.本发明的高通量化合物库构建与筛选方法可直接应用于活性研究，甚至直接进行表型筛选，这是先前的组合化学所不能实现的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
氟磺酰叠氮(FSO 2N 3)的制备
Figure PCTCN2020099034-appb-000010
在冰浴下，叠氮化钠水溶液(0.25M，20ml；含有5mmol NaN 3)与甲基叔丁基醚(20ml)混合体系中，加入1-(氟磺酰基)-2,3-二甲基-1H-咪唑三氟甲磺酸盐的乙腈溶液(6mmol,1ml MeCN)。反应体系在冰浴下搅拌10分钟，随后将反应液在室温下(25℃)静置5分钟。去除反应体系中的水相，得到的有机相即为氟磺酰叠氮(FSO 2N 3)溶液，收率为92％(通过 19F NMR确定，相对于所用叠氮化钠的摩尔数；在甲基叔丁基醚(MTBE)中，产物化学位移为+61.5ppm，定量可使用已知量的
Figure PCTCN2020099034-appb-000011
为内标(δ+36.7ppm)，通过产物与内标在氟谱中信号的积分比计算得到反应体系中产物总量，从而计算出反应产率)。GC-MS(tR):1.69min；EI-MS (m/z):125[M] +(GC-MS(EI)谱用Agilent 7890A GC System和Agilent 5975C Inert MSD system测定，方法：T 0＝40℃,t＝10min,ramp＝20℃/min；T 1＝200℃,t＝10min)。向该氟磺酰叠氮(FSO 2N 3)溶液加入二甲基亚砜(DMSO，约20ml)，所得溶液可直接用于伯胺化合物的重氮转移反应(见实施例3)。
实施例2伯胺化合物库制备
将1128个不同的伯胺化合物(包括烷基伯胺、芳基伯胺和芳杂环基伯胺)分别配置成浓度为约100mM的溶液，溶剂为二甲基亚砜，体积约1毫升左右，并储存在1.2毫升规格的96孔微孔板中。
当伯胺化合物为芳基伯胺或芳杂环基伯胺，且化合物中含有n个可以被转化为叠氮的伯胺官能团时，在1.5毫升离心管中将0.10/n mmol伯胺溶于1.0毫升二甲基亚砜中，然后转移至其对应的微孔板的对应位置的孔中。
当伯胺化合物为烷基伯胺与盐酸、甲磺酸、酒石酸、对甲苯磺酸或氢溴酸中和得到的铵盐，且化合物中含有n个可以被转化为叠氮的伯胺官能团时，在1.5毫升离心管中将0.10/n mmol伯胺溶于1.0毫升二甲基亚砜中，然后转移至其对应的微孔板的对应位置的孔中。
当伯胺化合物为游离的烷基伯胺，且化合物中含有n个可以被转化为叠氮的伯胺官能团时，在1.5毫升离心管中将0.10/n mmol伯胺溶于1.0毫升100/n mM甲磺酸溶液(溶剂为二甲基亚砜)中；如果化合物中含有两个或更多的游离碱性官能团(伯胺、仲胺、叔胺、胍等)，则甲磺酸溶液的浓度提升至200/n mM。随后将该配置的伯胺溶液转移至其对应的微孔板的对应位置的孔中。
在二甲基亚砜中溶解度较差的伯胺也可以通过重氮转移制备叠氮化合物，且这些叠氮产物绝大多数可以溶于二甲亚砜中以溶液形式归入叠氮化合物库。但是这些溶解度较差的伯胺不能以溶液形式储存于伯胺化合物库中。除以上提及以溶液形式储存于微孔板中的1128个伯胺化合物库(分布于12块96孔微孔板)，另有96个伯胺(其中一部分溶解度较差)被选为重氮转移的底物。由此，构建得到含1224个结构不同的伯胺库，其用于后续的制备叠氮化合物库(图1)。
实施例3叠氮化合物库制备
Figure PCTCN2020099034-appb-000012
将实施例1方法制备的氟磺酰叠氮溶液(溶剂为甲基叔丁基醚，通过 19F NMR测量约400mM浓度，约40ml)使用二甲基亚砜(40ml)稀释，获得氟磺酰叠氮溶液(通过 19F NMR测量约200mM浓度，80ml，溶剂为二甲亚砜/甲基叔丁基醚1:1)。
使用96孔移液器，将实施例2中制备的伯胺化合物库中的一块96孔板每一个 孔中的伯胺溶液(100mM，溶剂为二甲基亚砜；取出200μl，含20μmol伯胺)转移至一块空的1.2ml规格的96孔微孔板中。向每一个孔中加入碳酸氢钾水溶液(3.0M,26.7μl,含80μmol碳酸氢钾)和上述稀释过的氟磺酰叠氮溶液(200mM,100μl,含20μmol氟磺酰叠氮)。加入额外的二甲基亚砜(73μl)使总体积约为400μl。将微孔板密封并放入摇床中，30℃下以800rpm摇晃1小时。摇晃完毕后，该微孔板中每一个孔都以接近定量产率得到对应的叠氮化合物的50mM浓度的溶液(溶剂体系约为二甲基亚砜/甲基叔丁基醚3:1)。微孔板中每一个孔中的反应液使用UPLC-MS检测。示例性的UPLC色谱如图2a-f所示。
实施例2中的1128个伯胺的化合物库通过该方法得到了1128个对应的叠氮化合物。该1128个叠氮化合物溶液分布在12块96孔微孔板中(微孔板编号1-7及10-14)。实施例2中提及的96个单独存放的伯胺(其中部分伯胺溶解度较差)通过该实施例中的同样方法，反应得到了96个可溶的叠氮化合物溶液并转移至一块新的96孔微孔板中(详见叠氮库第8块板)。由此建成一个包含共1224个不同结构的叠氮溶液的化合物库。
将该1224个不同结构的叠氮溶液的化合物库，分布于13块96孔微孔板中。该叠氮化合物库的微孔板可以封膜储存于冰箱冷藏温度(4℃)，稳定至少6个月；该化合物库可以无需分离，直接使用进行反应。
叠氮化合物库的结构及其在微孔板中的位置如下，且其对应的伯胺化合物库(第8块板除外)及三氮唑化合物库位置保持不变。
Figure PCTCN2020099034-appb-000013
Figure PCTCN2020099034-appb-000014
Figure PCTCN2020099034-appb-000015
Figure PCTCN2020099034-appb-000016
Figure PCTCN2020099034-appb-000017
Figure PCTCN2020099034-appb-000018
Figure PCTCN2020099034-appb-000019
Figure PCTCN2020099034-appb-000020
Figure PCTCN2020099034-appb-000021
Figure PCTCN2020099034-appb-000022
Figure PCTCN2020099034-appb-000023
Figure PCTCN2020099034-appb-000024
Figure PCTCN2020099034-appb-000025
实施例4使用叠氮化合物库进行铜催化叠氮端炔环加成反应(CuAAC)
Figure PCTCN2020099034-appb-000026
将抗坏血酸钠(2.48g,12.5mmol)，磷酸氢二钠(7.0g,49.3mmol)和柠檬酸(4.87g,25.4mmol)混合，加入蒸馏水溶解至100毫升水溶液，得到抗坏血酸钠/磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲溶液，pH值约为5.
从实施例2中所获得的叠氮化合物库第8块板中，每一个孔中取出溶液(100μl，约50mM浓度，含约5μmol叠氮)转移至一块新的350微升规格96孔板中。向每一个孔中依次加入上述抗坏血酸/磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲溶液(40μl)，封膜后30℃下800rpm速度摇晃15分钟。撕去封膜，每一个孔中加入3-乙酰胺基苯乙炔溶液(化合物4a，100mM，溶剂为二甲基亚砜；47.5μl，含4.75μmol 3-乙酰氨基苯乙炔)和硫酸铜/THPTA水溶液(硫酸铜与THPTA浓度各为20mM，12.5μl，0.25μmol)。将微孔板封膜后在40℃下以800rpm速度搅拌6小时。反应结束后，将板内混合液一一对应转移至一块空的1.2毫升规格96孔板，每一个孔加入甲醇(400μl)和乙腈(400μl)稀释后，生成的1,2,3-三氮唑产物使用UPLC-MS进行检测。
示例性的1,2,3-三氮唑产物的UPLC色谱图如3a-f所示。
实施例5使用伯胺化合物库通过重氮转移与铜催化叠氮端炔环加成反应(CuAAC)直接得到1,2,3-三氮唑化合物库。
Figure PCTCN2020099034-appb-000027
将实施例2中制备的1128个伯胺化合物库(即实施例2中第1-7及第10-14块板中叠氮化合物所对应的伯胺化合物结构)中每个96孔板中每一孔取出50μl(100mM，溶剂为二甲基亚砜，含5μmol伯胺)转移至新的96孔板中对应位置。随后在这些新的含伯胺溶液的板中向每个孔依次加入碳酸氢钾水溶液(3.0M，6.7μl，含20μmol碳酸氢钾)、氟磺酰叠氮溶液(参照实施例1，稀释至溶剂体系为二甲亚砜/甲基叔丁基醚1：1；200mM，25μl，含5μmol氟磺酰叠氮)和二甲基亚砜(18μl)，使总体积为约100μl。将96孔板封膜在30℃下以800rpm转速摇晃1小时。
将抗坏血酸钠(2.48g,12.5mmol)，磷酸氢二钠(7.0g,49.3mmol)和柠檬酸(4.87g, 25.4mmol)混合，加入蒸馏水溶解至100毫升水溶液，得到抗坏血酸钠/磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲溶液，pH值约为5.
上述摇晃1小时后的96孔板撕去封膜，加入上述配置的抗坏血酸钠/磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲溶液(40μl)，封膜在30℃下以800rpm转速摇晃15分钟。撕去封膜后每一个孔中加入3-乙酰胺基苯乙炔溶液(化合物4a，100mM，溶剂为二甲基亚砜；47.5μl，含4.75μmol 3-乙酰氨基苯乙炔)和硫酸铜/THPTA水溶液(硫酸铜与THPTA浓度各为20mM，12.5μl，0.25μmol)。将微孔板再次封膜后在40℃下以800rpm速度搅拌6小时。反应结束后，将板内混合液一一对应转移至一块空的1.2毫升规格96孔板，每一个孔加入甲醇(400μl)和乙腈(400μl)稀释后，生成的1,2,3-三氮唑产物使用UPLC-MS进行检测。
示例性的UPLC色谱检测结果如图4a-i所示。
实施例6使用伯胺化合物库通过重氮转移与铜催化叠氮端炔环加成反应(CuAAC)直接得到1,2,3-三氮唑化合物库。
Figure PCTCN2020099034-appb-000028
将实施例2中制备的1128个伯胺化合物库(即实施例2中第1-7及第10-14块板中叠氮化合物所对应的伯胺化合物结构)中的第2板中每一孔取出50μl(100mM，溶剂为二甲基亚砜，含5μmol伯胺)转移至新的96孔板中对应位置。随后在这些新的含伯胺溶液的板中向每个孔依次加入碳酸氢钾水溶液(3.0M，6.7μl，含20μmol碳酸氢钾)、氟磺酰叠氮溶液(参照实施例1，稀释至溶剂体系为二甲亚砜/甲基叔丁基醚1：1；200mM，25μl，含5μmol氟磺酰叠氮)和二甲基亚砜(18μl)，使总体积为约100μl。将96孔板封膜在30℃下以800rpm转速摇晃1小时。
将抗坏血酸钠(2.48g,12.5mmol)，磷酸氢二钠(7.0g,49.3mmol)和柠檬酸(4.87g,25.4mmol)混合，加入蒸馏水溶解至100毫升水溶液，得到抗坏血酸钠/磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲溶液，pH值约为5.
上述摇晃1小时后的96孔板撕去封膜，加入上述配置的抗坏血酸钠/磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲溶液(40μl)，封膜在30℃下以800rpm转速摇晃15分钟。撕去封膜后每一个孔中加入4-(4-戊炔酰胺基)苯基氟磺酸酯溶液(化合物4b，100mM，溶剂为二甲基亚砜；47.5μl，含4.75μmol 3-乙酰氨基苯乙炔)和硫酸铜/THPTA水溶液(硫酸铜与THPTA浓度各为20mM，12.5μl，0.25μmol)。将微孔板再次封膜后在40℃下以800rpm速度搅拌6小时。反应结束后，将板内混合液一一对应转移至一块空 的1.2毫升规格96孔板，每一个孔加入甲醇(400μl)和乙腈(400μl)稀释后，生成的1,2,3-三氮唑产物使用UPLC-MS进行检测。
示例性的UPLC色谱检测结果如图5a-d所示。
对于实施例1-6的制备的叠氮化合物库和三氮唑化合物库的相应各个化合物，进行分析，结果汇总如下(图1)：
(a)对其在Reaxys数据库中进行检索，618个叠氮化合物是现有已知的，606个叠氮化合物是新的。
(b)在1224个可寻址的反应中，656种反应产物(约54％)的反应转化率＞90％；333种反应产物(约27％)的反应转化率为70-90％；144种反应产物的反应转化率为30-70％；17种反应产物的反应转化率＜30％；74种反应产物的UPLC色谱检测峰与3-乙酰胺基苯乙炔的峰重合，无法计算转化率。
上述结果表明,几乎所有的可寻址的反应均获得了相应的预期反应产物，其中有至少989个(989/1224＝80.8％)可寻址反应的转化率达到了70％以上，因此可以完全满足了后续生物活性测试的相关要求。
在反应腔室中进行的1224个可寻址反应中生成的部分化合物的鉴定结果见图3、图4和图5。
综上，出乎意料地，通过本发明方法，可在各个反应腔室中独立地进行特定的合成反应，从而高效且高通量地制得大量不同的结构明确的反应产物，并由此获得高通量的化合物库。因此，含所述的反应产物的可寻址的反应腔室阵列(或相应的化合物库)，可以在不必进行分离和纯化的情况下，就直接在原位进行后续的化合物活性测定。
实施例7 840个厄洛替尼(Erlotinib)衍生物库的构建
Figure PCTCN2020099034-appb-000029
总反应通式如上所示，操作步骤如下：
(1)向96孔板中每孔加入37μL DMSO，13μL H 2O，10μL叠氮砌块的DMSO溶液(50mM)与20μL厄洛替尼的DMSO溶液(25mM)，混合均匀。
(2)向96孔板中每孔加入5μL硫酸铜水溶液(5mM)，5μL三[(1-(3-羟丙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)]甲基]胺水溶液(5mM)与10μL抗坏血酸钠水溶液(250mM)，室温下摇床震荡反应12小时。
共9块96孔板，840个样品(终浓度：5mM，终体积：100μL)。UPLC-MS随 机跟踪部分样品显示，大部分样品转化率在70％以上，直接用于MTT法筛选。
MTT法筛选840个Erlotinib衍生物，操作步骤：
(1)A549(肺癌)细胞贴壁过夜：取对数生长期的细胞，消化处理后计数，以每孔5000个细胞铺96孔板过夜。
(2)加药：用完全培养液稀释化合物浓度至10μM，吸弃上清液，以每孔100μL体积给药处理24小时。
(3)加MTT：每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，培养4小时。
(4)测吸光度值：吸弃上清，每孔加DMSO 150μL，摇床阵摇10分钟，使结晶充分溶解。酶标仪测溶液570nm处吸光度。
按以下方式计算相对存活率：指Erlotinib衍生物处理细胞的存活率与阳性化合物(Erlotinib)处理细胞的存活率之比，其中相对存活率越低，表示化合物活性越好。
实验结果：
结果如图6所示：从840个化合物中，在A549细胞上初筛得到活性高于Erlotinib的化合物(相对存活率<1)共265个，其中活性较好的化合物(相对存活率<0.5)共19个。
从多个96孔的阵列反应器选出的对于各可寻址的反应腔室的示例性部分活性优于或略优于的阳性化合物(Erlotinib)的化合物列于下表1和表2中：
表1高通量化合物库的部分化合物结构和生物活性(相对存活率＝0.5～1)
Figure PCTCN2020099034-appb-000030
Figure PCTCN2020099034-appb-000031
Figure PCTCN2020099034-appb-000032
Figure PCTCN2020099034-appb-000033
表2高通量化合物库的部分化合物结构和生物活性(相对存活率>1)
Figure PCTCN2020099034-appb-000034
Figure PCTCN2020099034-appb-000035
结果显示，本发明的方法可以在同一反应体系(或反应腔室)中，完成化合物的制备以及筛选过程，由于两步反应均为几乎定量生成产物，因此产物无需分离即可用于酶学乃至细胞学测试实验，在化合物高通量合成及筛选领域具有重要的应用价值。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

  1. 一种用于高通量化合物库构建和筛选的方法，其特征在于，包括：
    (a)提供一反应器，所述的反应器包括n个反应腔室，其中所述反应腔室是各自独立并可寻址的，并且所述n个反应腔室构成可寻址的反应腔室阵列；
    (b)在所述的n个反应腔室中，进行m个各自独立的合成反应，并在各个进行合成反应的反应腔室中各自获得合成产物，从而构建获得一化合物库；
    其中，所述的合成反应包括以下步骤：
    (b1)在一个反应腔室中，在惰性溶剂中，用1,3-偶极环化试剂与含有末端不饱和键的反应底物进行1,3-偶极环加成反应，从而形成含有1,3-偶极环的反应产物；
    以及(c)任选地，在进行了所述合成反应的反应腔室中，分别加入活性测试试剂，从而进行活性测试，从而对各个合成产物进行活性筛选；
    其中，n为≥10的正整数，m为≤n且m≥10的正整数。
  2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应腔室体积各自独立地为5μL-5000μL。
  3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的活性测试试剂选自下组：小分子化合物、蛋白、核酸、细胞、或其组合。
  4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(c)中包括步骤：检测各个反应腔室，从而分别得到各个腔室中的活性测试结果。
  5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)中，所述的1,3-偶极环加成反应的反应式选自下组：
    Figure PCTCN2020099034-appb-100001
    式中，R、R'、R”和R”'各自独立地为R 1或
    Figure PCTCN2020099034-appb-100002
    而所述的R 1和R 2各自独立地为底物片段。
  6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)中，所述的1,3-偶极环加成反应的反应式如下：
    Figure PCTCN2020099034-appb-100003
    其中，R、R”各自独立地为R 1或
    Figure PCTCN2020099034-appb-100004
    所述的R 1和R 2各自独立地为底物片段。
  7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)中，在步骤(b1)之前，还包括：
    (b0)在惰性溶剂中，碱存在下，用胺片段(优选为R-NH 2)与FSO 2N 3进行反应，从而制得1,3-偶极环化试剂；
    Figure PCTCN2020099034-appb-100005
    其中，R为与叠氮基团相连的分子部分(moiety)或片段。
  8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
    将所述反应底物、反应产物、和活性测试的数据，基于所述反应腔室的可寻址的地址进行关联，从而获得一个可寻址的数据集。
  9. 一种高通量的可寻址的反应装置，其特征在于，所述的装置包括：
    (i)一反应模块，所述反应模块用于进行1,3-偶极环加成反应；并且所述反应模块包括至少一个反应器，所述的反应器包括n个反应腔室，其中所述反应腔室是各自独立并可寻址的，并且所述n个反应腔室构成可寻址的反应腔室阵列，所述反应腔室用于进行所述的1,3-偶极环加成反应，从而在反应腔室中形成合成产物；
    其中，n为≥10的正整数，m为≤n且m≥10的正整数；
    以及(ii)任选的活性测试模块，所述活性测试模块用于对所述反应腔室中形成的合成产物在原位进行活性测试，从而获得活性测试数据。
  10. 如权利要求9所述的装置，其特征在于，所述的反应器选自下组：微孔板、阵列PE管、阵列试管、阵列反应瓶、或其组合。
  11. 一种化合物库的构建方法，其特征在于，包括步骤：
    (1)使用权利要求9所述的高通量的可寻址的反应装置，进行所述化合物库的构建。
  12. 一种权利要求9所述的高通量的可寻址的反应装置的用途，其特征在于，用于选自下组的一个或多个用途：
    a)同时合成不同化合物；
    b)高通量(HTS)随机筛选具有生理活性的化合物；
    c)药物或农业化学品的寻找；和
    d)药物、或农用化学品的先导化合物的寻找。
PCT/CN2020/099034 2019-07-05 2020-06-29 高通量的化合物库构建和筛选方法以及反应装置 WO2021004326A1 (zh)

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