KR20220034819A - 고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법 및 반응 장치 - Google Patents

고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법 및 반응 장치 Download PDF

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지아지아 동
칼 배리 샤프레스
전이 멍
타이지에 구오
티안청 마
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상하이 인스티튜트 오브 오가닉 케미스트리, 차이니즈 아카데미 오브 사이언시스
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Abstract

본 발명은 고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법 및 반응 장치를 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 방법은 (a) n개의 각각 독립적이고 주소 지정 가능한 반응 챔버가 포함되는 반응기를 제공하는 단계; (b) 상기 n개의 반응 챔버에서, m개의 각각 독립적인 합성 반응을 수행하여, 화합물 라이브러리를 구축하고 획득하는 단계; 및 (c) 상기 합성 반응이 수행된 반응 챔버에서, 활성 테스트를 수행하는 단계를 포함한다. 본 발명에서, 동일한 반응 시스템에서 화합물의 제조 및 스크리닝 과정을 완성할 수 있고, 본 발명의 반응은 모두 거의 정량으로 생성물을 생성하므로, 생성물은 분리될 필요 없이 효소학 내지 세포학의 활성 테스트 실험에 직접 사용될 수 있다.

Description

고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법 및 반응 장치
본 발명은 화학 및 생물 분야에 관한 것으로, 구체적으로, 고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법 및 반응 장치에 관한 것이다.
트리아졸은 농업용 화학품, 부식 억제제, 염료, 형광 증백제 및 생물학적 활성제와 같은 광범위한 산업 응용 분야에 관여하는 중요한 5원 질소 헤테로고리 화합물이다. 아지드 관능기는 유기 합성에서 매우 중요하고 널리 사용되지만, 이러한 화합물은 모두 에너지가 높기 때문에 합성, 저장 및 운송 과정에서 모두 안전 위험이 있어 합성 및 사용이 어렵다. 현재 인류가 이용할 수 있는 아지드의 합성 방법은 매우 제한적이며, 그중에서 대부분의 알킬, 아실, 설포닐 아지드는 친핵성 치환 반응에 의해, 극성 용매에서 NaN3을 사용하여 이탈하는 관능기를 치환하여 획득되며, 상기 방법은 분리 및 정제가 필요하고, 합성 효율이 높지 않아 추가 활성 스크리닝 시 번거로운 후처리가 필요하다.
약물 및 농업용 화학품의 개발에서, 생리적 활성 물질(예를 들어, 리드 화합물)을 찾기 위해, 사람들은 상업용 화합물 라이브러리 및 조합 합성법에 의해 생성된 화합물 라이브러리를 이미 스크리닝하였다. 그러나, 약물로 사용되는 화합물의 합성에서는 분리 및 정제에 많은 시간이 소요되고 약물로 사용할 수 있는 리드 화합물을 찾기가 어렵다. 조합 화학에 의해 생성된 화합물 라이브러리는 많은 화합물의 혼합물이며 생성물 구조는 제어하기 어렵다. 또한, 화합물 라이브러리를 구축하기 위해서는 화합물 및 그 유도체를 합성하는 과정에서 화합물의 구조를 감정하여야만 화합물을 개질하는 적절한 방법을 결정하고 유도체 합성을 위한 반응 조건을 탐색할 수 있다. 이로써 초래되는 불리한 결과는, 화합물을 합성하는데 많은 시간이 소요되는 것이다.
따라서, 간단하고 효율적이며 고처리량의 합성 화합물 라이브러리 및 활성 스크리닝을 수행하는 방법을 개발할 필요가 있다.
본 발명은 간편하고 효율적이며 고처리량의 합성 화합물 라이브러리 및 활성 스크리닝을 수행하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제1 양태에서,
(a) 반응기를 제공하되, 상기 반응기는 n개의 반응 챔버를 포함하고, 여기서 상기 반응 챔버는 각각 독립적이며 주소 지정 가능하고, 상기 n개의 반응 챔버는 주소 지정 가능한 반응 챔버 어레이를 구성하는 단계;
(b) 상기 n개의 반응 챔버에서, m개의 각각 독립적인 합성 반응을 수행하고, 각각의 합성 반응이 수행되는 반응 챔버에서 각각 합성 생성물을 획득하여, 화합물 라이브러리를 구축하고 획득하는 단계; 및
(c) 선택적으로, 상기 합성 반응이 수행된 반응 챔버에, 각각 활성 테스트 시약을 추가하여, 활성 테스트를 수행하고, 각각의 합성 생성물에 대해 활성 스크리닝을 수행하는 단계를 포함하며;
단계(b)에서, 상기 합성 반응은,
(b1) 하나의 반응 챔버에서, 비활성 용매에서, 1,3-쌍극자 고리화 시약 및 말단 불포화 결합을 함유하는 반응 기질을 사용하여 1,3-쌍극자 고리 첨가 반응을 수행하여, 1,3-쌍극자 고리가 함유되는 반응 생성물을 형성하는 단계를 포함하고;
여기서, n은 ≥10의 양의 정수이고, m은 ≤n이며, m≥10의 양의 정수인 고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법을 제공한다.
다른 바람직한 예에서, 단계(c)에서, 상기 활성 테스트 시약을 추가한 후, 상기 활성 테스트 시약이 각각의 합성 반응과 반응하거나 접촉하도록 배양한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 반응기는 어레이 반응기를 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, n은 20-50000이고, 비교적 바람직하게 36-10000이며, 보다 바람직하게 48-5000이고, 가장 바람직하게 96-2500이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 1,3-쌍극자 고리화 시약은 R-N3이고, 상기 식에서, R는 아지드 기와 연결되는 분자 부분(moiety) 또는 단편이다.
또 다른 바람직한 예에서, 두 개 이상의 반응 챔버에서 동일한 합성 반응을 한다.
또 다른 바람직한 예에서, 각각의 반응 챔버에서 상이한 합성 반응을 한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 합성 반응에서, 각각 m개의 반응 챔버에 위치하는 m 가지의 1,3-쌍극자 고리화 시약을 사용하여, 말단 불포화 결합을 함유하는 동종 반응 기질과 각각 반응시킨다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 "말단 불포화 결합”은 말단에 위치하는 말단 원자(수소 원자 제외) 및 이와 인접한 2차 말단 원자(수소 원자 제외)에 이중 결합 또는 삼중 결합이 존재하는 것을 의미한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 말단 원자 및 2차 말단 원자는 각각 독립적으로 C, N, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 "말단 불포화 결합”은 C＝C, C≡C, C≡N, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 반응 챔버는 마이크로형 또는 소형의 반응 챔버이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 반응 챔버의 부피는 각각 독립적으로 5 μL-5000 μL이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 반응 챔버의 부피는 10-2000 μL이고, 보다 바람직하게 20 μL-1500 μL이다.
또 다른 바람직한 예에서, 하나의 상기 반응 챔버에서, 상기 합성 반응을 수행하는 반응 시스템의 부피는 ≤2 ml이고, 비교적 바람직하게 ≤ 1ml이며, 보다 바람직하게 ≤ 0.6ml이다.
또 다른 바람직한 예에서, 하나의 상기 반응 챔버에서, 상기 합성 반응을 수행하는 반응 시스템의 부피는 5-2000 μL이고, 비교적 바람직하게 10-1000 μL이며, 보다 바람직하게 20-600 μL이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 활성 테스트 시약은 소분자 화합물, 단백질, 핵산, 세포, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 활성 테스트 시약은 효소 활성 테스트 시약 조성물 또는 세포 활성 테스트 시약 조성물을 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 활성 테스트 시약은 생리적 활성을 갖는 화합물이고, 비교적 바람직하게 효소 억제제, 리간드/수용체 결합 억제제, 혈관신생 억제제, 세포 접착 억제제, 유전자 발현 억제제 및 성장 인자 유사 활성물질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 효소 억제제는 티로시나제(Tyrosinase) 억제제, 시클로옥시게나아제 억제제, 텔로머라제(telomerase) 억제제, 기질 금속 단백질 억제제, 프로스타글란딘D(prostaglandin D) 합성 억제제, 포스포디에스테라제(phosphodiesterase) 억제제, 콜린에스테라제(cholinesterase) 억제제, 바이러스성 프로테아제 억제제, 역전사 효소 억제제, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질은 항체, 리간드, 항원, 또는 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 단계(c)는 각각의 반응 챔버를 검출하여, 각각의 챔버 중의 활성 테스트 결과를 각각 얻는 단계를 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 단계(b)와 (c) 사이에는, 반응 생성물을 분리하거나 정제하는 단계가 포함되지 않는다.
또 다른 바람직한 예에서, 단계(b)(예를 들어 단계(b1))가 종료된 후, 분리하지 않고, 직접 단계(c)에 응용하여 후속적인 활성 테스트를 수행한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 단계(b)에서, 상기 1,3-쌍극자 고리 첨가 반응의 반응식은,
Figure pct00001
로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 식에서, R, R', R'' 및 R'''는 각각 독립적으로 R1 또는
Figure pct00002
이며, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 기질 단편이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 단계(b)에서, 상기 1,3-쌍극자 고리 첨가 반응의 반응식은 하기와 같다.
Figure pct00003
상기 식에서, R, R''는 각각 독립적으로 R1 또는
Figure pct00004
이고; 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 기질 단편이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 R1 및 R2는 상기 반응 기질 중 말단 불포화 결합의 분자 부분(moiety)을 제외한 나머지 분자 부분이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 약물 활성 단편이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 알킬, 시클로알킬, 헤테로알킬, 헤테로시클릭, 알케닐, 시클로알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 술포닐, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 또는 비치환된 기이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C12알킬, 치환 또는 비치환된 3-12원 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 5-16원 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C6-C18아릴, 치환 또는 비치환된 3-20원 헤테로시클릭, 치환 또는 비치환된 C3-C12시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서, 상기 치환은 기 중의 하나 이상의 수소 원자가 치환기 Ra에 의해 치환되는 것을 의미하며, 상기 Ra는 할로겐, 치환 또는 비치환된 C1-C6알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C6알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C6알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C12시클로알킬, 옥소(즉 =O), Rf-SO2-, =NRf, -CN, 히드록실, -ORf, NRdRe, 치환 또는 비치환된 C1-C6아민기, 치환 또는 비치환된 -(C1-C6알킬렌)-NH-(C1-C6알킬렌), 카르복실, 치환 또는 비치환된 C6-C10아릴, 1~3개의 헤테로 원자를 갖는 치환 또는 비치환된 5-12원 헤테로아릴, 1~4개의 헤테로 원자를 갖는 치환 또는 비치환된 5-12원 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 치환기는 할로겐, 히드록실, 카르복실, 시아노, C1-C6알콕시, C1-C6 알킬아미노로 이루어진 군으로부터 선택되며;
Rd, Re, Rf는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 C1-C6알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C10시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C6-C10아릴, 1~3개의 헤테로 원자를 갖는 치환 또는 비치환된 5-12원 헤테로아릴, 1~4개의 헤테로 원자를 갖는 치환 또는 비치환된 5-12원 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
상기 Ra, Rd, Re, Rf의 "치환”은 할로겐, -CH2Cl, -CHCl2, -CCl3, -CH2F, -CHF2, -CF3, -O(CH2)xO(CH2)yCH3, 옥소, -CN, 히드록실, 아미노, 치환 아민기, 카르복실, -NHAc, 비치환 또는 하나이상의 치환기에 의해 치환된C1-C6알킬, C1-C6알콕시, C6-C10아릴, C3-C8시클로알킬, 할로겐화 C6-C10 아릴, N, S 및 O로부터 선택되는 1~3개의 헤테로 원자를 갖는 5-10원 헤테로아릴, N, S 및 O로부터 선택되는 1~3개의 헤테로 원자를 갖는 5-10원 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어 2 개, 3 개, 4 개 등) 치환기에 의해 치환되는 것을 의미하며;
X는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
Y는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며;
상기 각 식에서, 임의의 상기 헤테로 원자는 각각 독립적으로 N, S 및 O로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 임의의 반응 기질 및 반응 생성물 또는 그 중의 각 기 또는 원자는 모두 화합물의 원자가 상태의 관련 규칙(예를 들어 C는 최고로 4가이고, N의 최고 원자가 상태는 5가임)에 부합된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 반응 기질 및 반응 생성물은 유기 화합물이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 R-NH2는 보호되지 않은 유리 아민 또는 산 보호된 아민염이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 1,3-쌍극자 고리 첨가 반응은 클릭 화학 반응 원리를 이용한 모듈화 합성이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 1,3-쌍극자 고리화 시약은 원위치에서 제조되거나(in situ) 상기 반응 챔버에 첨가된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 단계(b)에서, 단계(b1) 이전에,
(b0) 비활성 용매에서, 염기 존재하에, 아민 단편(바람직하게 R-NH2)과 FSO2N3을 반응시켜, 1,3-쌍극자 고리화 시약을 제조하는 단계를 더 포함하고;
Figure pct00005
상기 식에서, R는 아지드 기와 연결되는 분자 부분(moiety) 또는 단편이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 단계(b0)는 상기 반응 챔버에서 수행되거나 수행되지 않는다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 단계(b0)에서, 각각 m개의 반응 챔버에 위치하는 m 가지의 상이한 아민을 사용하여, 각각 FSO2N3과 반응시켜, 상이한 R-N3을 획득한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 R-NH2와 FSO2N3의 몰비는 바람직하게 약 1:2 내지 2:1이고, 예를 들어 약 1:1이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 염기와 FSO2N3의 몰비는 약 10：1 내지 2:1이고, 비교적 바람직하게 약 4:1이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 단계(b0)에서, 상기 아지드 화합물 제조 반응은 모두 0 ℃~60 ℃의 온도에서, 비교적 바람직하게 25 ℃~30 ℃의 온도에서 진행될 수 있다.
또 다른 바람직한 예에서, 단계(b0) 중 상기 아지드 화합물 R-N3의 제조에 있어서, 분리하지 않고, 후속의 1,3-쌍극자 고리 첨가 반응에 직접 사용된다.
또 다른 바람직한 예에서, 단계(b)(단계(b0) 및/또는 단계(b1)을 포함함)에서, 상기 비활성 용매는 물, 니트릴 용매, 알콜 용매, 방향족 용매, 할로겐화 알칸 용매, 이산화황, 알칸 용매, 에스테르 용매, 케톤 용매, 에테르 용매, 술폭시드 용매, 아미드 용매 및 N-메틸피롤리돈, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 니트릴 용매는 아세토니트릴이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 알콜 용매는 메탄올, 에탄올, t-부탄올, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 방향족 용매는 벤젠, 톨루엔, 트리플루오로톨루엔, 플루오로벤젠, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 할로겐화 알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 알칸 용매는 석유 에테르 30-60, 석유 에테르 60-90, N-헥산, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 에스테르 용매는 에틸 아세테이트이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 케톤 용매는 아세톤이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 에테르 용매는 메틸 t-부틸 에테르, 1,4-디옥산, 에테르, 테트라히드로푸란, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 술폭시드 용매는 디메틸술폭시드이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 아미드 용매는 N,N-디메틸포름아미드이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 용매는 에테르 용매, 술폭시드 용매와 물의 혼합 용매이거나 에테르 용매, 니트릴 용매와 물의 혼합 용매이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 용매는 메틸 t-부틸 에테르, 디메틸술폭시드와 물의 혼합 용매이거나 메틸 t-부틸 에테르, 아세토니트릴과 물의 혼합 용매이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 용매가 에테르 용매, 술폭시드 용매와 물의 혼합 용매일 경우, 상기 에테르 용매, 술폭시드 용매와 물의 부피비는 2-7:10-20:0.8-1.2이고; 바람직하게 5:15:1이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 용매가 에테르 용매, 니트릴 용매와 물의 혼합 용매일 경우, 상기 에테르 용매, 니트릴 용매와 물의 혼합 용매의 부피비는 15-25:0.8-1.2:15-25이고; 바람직하게 20:1:20이다.
또 다른 바람직한 예에서, 단계(b)(단계(b0) 및/또는 단계(b1)을 포함함)에서, 상기 염기는 무기 염기 및/또는 유기 염기이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 염기가 무기 염기일 경우, 상기 무기 염기는 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산세슘, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 중탄산나트륨, 중탄산칼륨 및 인산칼륨 중 하나 이상이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 염기가 유기 염기일 경우, 상기 유기 염기는 트리에틸아민, N, N-디이소프로필에틸아민, 피롤, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 나트륨메톡시드, 나트륨에톡시드, 칼륨 t-부톡시드, 1,8-디아자비시클로운데크-7-엔 및 테트라메틸에틸렌디아민 중 하나 이상이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 방법은,
상기 반응 기질, 반응 생성물 및 활성 테스트의 데이터에 대해, 상기 반응 챔버의 주소 지정 가능한 주소를 기반으로 상호 연관시켜, 하나의 주소 지정 가능한 데이터 집합을 획득하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 제2 양태에서,
반응 모듈 및 활성 테스트 모듈을 포함하는 고처리량의 주소 지정 가능한 반응 장치를 제공하고,
(i) 반응 모듈에 있어서, 상기 반응 모듈은 1,3-쌍극자 고리 첨가 반응을 수행하고; 적어도 하나의 반응기를 포함하며, 상기 반응기는 n개의 반응 챔버를 포함하고, 상기 반응 챔버는 각각 독립되며 주소 지정 가능하고, 상기 n개의 반응 챔버는 주소 지정 가능한 반응 챔버 어레이를 구성하며, 상기 반응 챔버는 상기 1,3-쌍극자 고리 첨가 반응을 수행하여, 반응 챔버에서 합성 생성물을 형성하고
여기서, n은 ≥10의 양의 정수이고, m은 ≤n이며, m≥10의 양의 정수이고;
(ii) 선택적인 활성 테스트 모듈에 있어서, 상기 활성 테스트 모듈은 상기 반응 챔버에서 형성되는 합성 생성물에 대해 원 위치에서 활성 테스트를 수행하여, 활성 테스트 데이터를 획득한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 반응기는 m 가지의 반응 시약을 포함하고, 이는 각각 m개의 반응 챔버에 위치하며; 여기서 상기 반응 시약은 1,3-쌍극자 고리화 시약 또는 이의 아민 전구체(즉 아민 단편)이다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 장치는, (iii) 반응 시약 및/또는 활성 테스트 시약을 소정의 각각의 주소 지정 가능한 반응 챔버에 첨가하기 위한 자동 피펫 모듈을 더 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 장치는, (iv) 상기 반응 모듈, 활성 테스트 모듈 및 자동 피펫 모듈 중 하나 이상의 모듈을 제어하는 프로세서를 더 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 프로세서는 또한 상기 반응 기질, 반응 생성물 및 활성 테스트의 데이터에 대해, 상기 반응 챔버의 주소 지정 가능한 주소를 기반으로 상호 연관시켜, 하나의 주소 지정 가능한 데이터 집합을 획득하고, 상기 데이터 집합을 전송하거나 저장한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 반응기는 마이크로 웰 플레이트, 어레이 PE 튜브, 어레이 시험관, 어레이 반응 플라스크, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 반응기는 어레이 반응기이다.
본 발명의 제3 양태에서,
(1) 제2 양태에 따른 고처리량의 주소 지정 가능한 반응 장치를 사용하여, 상기 화합물 라이브러리를 구축하는 단계를 포함하는 화합물 라이브러리의 구축 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 예에서, 단계(1)은,
(1a) 반응 시약이 아민 단편일 경우, FSO2N3을 각각의 반응 챔버 중의 아민 단편 화합물과 각각 반응시켜, 1,3-쌍극자 고리화 시약을 제조하여, 1,3-쌍극자 고리화 시약에 의해 구성되는 제1 화합물 라이브러리를 획득하는 단계; 및
(1b) 선택적으로, 상기 반응 챔버에서, 말단 불포화 결합을 함유하는 반응 기질이 상기 1,3-쌍극자 고리화 시약과 각각 반응하도록 하여, 1,3-쌍극자 고리 화합물을 형성하여, 상기 1,3-쌍극자 고리 화합물에 의해 구성되는 제2 화합물 라이브러리를 획득하는 단계를 포함한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 방법은,
(2) 상기 제2 화합물 라이브러리 중의 1,3-쌍극자 고리 화합물에 대해, 상기 반응 챔버 중 원위치에서 활성 테스트를 수행하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 제4 양태에서,
a) 상이한 화합물을 동시에 합성;
b) 생리적 활성이 구비되는 화합물을 고처리량(HTS) 랜덤으로 스크리닝;
c) 약물 또는 농업 화학품의 발견; 및
d) 약물 또는 농업용 화학품의 리드 화합물의 발견;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용도에 사용되는 제2 양태에 따른 고처리량의 주소 지정 가능한 반응 장치의 용도를 제공한다.
이해해야 할 것은, 본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상술한 기술특징 및 아래(예를 들어 실시예)에서 구체적으로 설명되는 각 기술특징은 서로 조합되어, 새로운 또는 바람직한 기술적 해결수단을 구성할 수 있다. 편폭의 제한으로, 여기서 더 이상 일일이 설명하지 않는다.
도 1은 1차 아민 화합물 라이브러리에 의해 1224개의 아지드 화합물 라이브러리 및 1224개의 트리아졸 화합물 라이브러리를 제조하는 것을 나타낸다.
도 2a-f는 1차 아민 화합물 라이브러리가 아지드 화합물 라이브러리를 제조하는 예시적인 UPLC크로마토그래피를 나타낸다.
도 3a-f는 아지드 화합물 라이브러리가 구리 촉매 아지드 말단 알킨(4a) 고리 첨가반응(CuAAC)을 수행하는 예시적인 UPLC크로마토그래피를 나타낸다.
도 4a-i는 1차 아민 화합물 라이브러리와 구리 촉매 아지드 말단 알킨(4a)의 고리 첨가반응(CuAAC)을 통해 1,2,3-트리아졸 화합물 라이브러리를 직접 얻는 예시적인 UPLC크로마토그래피를 나타낸다.
도 5a-d는 1차 아민 화합물 라이브러리가 디아조늄 전이 및 구리 촉매 아지드 말단 알킨(4b) 고리 첨가반응(CuAAC)을 통해 1,2,3-트리아졸 화합물 라이브러리를 직접 얻는 예시적인 UPLC크로마토그래피를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서, 하나의 약물 분자에 대해 840개의 화합물이 함유되는 화합물 라이브러리를 고처리량으로 구축하고, 활성 스크리닝을 수행하는 것을 나타낸다.
광범위하고 심층적인 연구를 통해, 본 발명자는 고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법 및 상기 방법에 사용되는 장치를 최초로 개발하였다. 본 발명의 방법에서, 처음으로 각각 독립적이고 주소 지정 가능한 복수의 반응 챔버로 구성되는 주소 지정 가능한 반응 챔버 어레이를 사용하며, 각각의 반응 챔버에서 특정 합성 반응을 독립적으로 수행하여, 고처리량으로 많은 상이한 구조가 명확한 반응 생성물을 제조함으로써, 고처리량의 화합물 라이브러리를 획득한다. 예기치 않게, 실험 결과 상기 반응 생성물을 포함하는 주소 지정 가능한 반응 챔버 어레이(또는 대응되는 화합물 라이브러리)는, 분리 및 정제하지 않고도 직접 원 위치에서 후속의 화합물 활성 테스트를 수행할 수 있어, 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 효율을 크게 향상시킨다. 본 발명은 이에 기초하여 완성되었다.
바람직한 일 예에서, 본 발명자는 주소 지정 가능한 반응 챔버 어레이를 사용하여, 수천 가지의 상이한 1,3-쌍극자 고리화 시약(아지드 화합물 라이브러리 또는 제1 화합물 라이브러리로 사용됨)을 고처리량으로 합성한 다음, 수천 가지의 상이한 1,3-쌍극자 고리 반응 생성물(트리아졸 유도체 라이브러리 또는 제2 화합물 라이브러리로 사용됨)을 고처리량으로 합성한다. 본 발명의 화합물 라이브러리에 대한 원위치 활성 스크리닝을 통해, 약물 리드 화합물의 발견을 크게 가속화하고, 스크리닝 속도를 향상시키며, 새로운 억제제의 개발 및 연구 주기를 단축한다(몇 년에서 몇 주 또는 며칠로 단축 가능).
용어
본 발명에서 사용되는 "반응 챔버”는 화학 반응을 수행할 수 있는 다양한 장치이고, 마이크로 웰 플레이트의 마이크로 웰, PE 튜브, 시험관, 반응 플라스크 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
참고 문헌(Carey and Sundberg "ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4TH ED." Vols. A (2000) and B (2001), Plenum Press, New York 포함)에서 표준 화학 용어의 정의를 찾을 수 있다. 다른 설명이 없는 한, 질량 분석법, NMR, IR 및 UV/VIS분광법과 같은 본 분야의 기술 범위 내의 통상적인 방법 및 약리학적 방법을 사용한다. 구체적 정의가 제시되지 않는 한, 본문에서 화학, 유기 합성 화학 및 약물과 약물 화학을 분석하는 관련 설명에 사용되는 용어는 본 분야에서 주지된 것이다. 예를 들어, 키트 사용에 대한 제조자의 사용 설명을 이용하거나, 본 분야에 공지된 방식 또는 본 발명의 설명에 따라 반응을 실행하거나 정제를 수행할 수 있다. 일반적으로 본 명세서에 인용되고 논의되는 복수의 요약 및 비교적 구체적인 문헌의 설명에 따라, 본 기술분야의 통상의 일반 방법으로 상술한 기술 및 방법을 수행할 수 있다. 본 명세서에서, 기 및 그 치환기는 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택되어 안정적인 구조 부분 및 화합물을 제공할 수 있다.
치환기를 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰는 통상적인 화학식으로 설명할 경우, 마친가지로 상기 치환기는 오른쪽에서 왼쪽으로 구조식을 기재할 경우 얻어지는 화학적으로 동등한 치환기를 포함한다. 예를 들어, -CH2O-와 -OCH2-는 동등하다.
본문에 사용되는 장절 제목은 문장을 구성하기 위한 목적으로만 사용되고, 상술한 주제에 대한 제한으로 해석되어서는 안된다. 본 발명에 인용되는 모든 문헌 또는 문헌 부분은 특허, 특허 출원, 문장, 서적, 작동 매뉴얼 및 논문을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 모두 참조로서 본문에 인용된다.
본문에서 정의되는 일부 화학 기 앞에 단순화된 기호를 통해 상기 기의 탄소 원자 총수를 나타낸다. 예를 들어, C1-C6알킬은 총 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 아래에서 정의되는 바와 같은 알킬기를 의미한다. 단순화된 기호 중의 탄소 원자 총수는 상기 기의 치환기에 존재할 수 있는 탄소를 포함하지 않는다.
전술한 것을 제외하고, 본 발명의 명세서 및 청구범위에 사용될 경우, 별도로 명시되지 않는 한, 아래의 용어는 하기와 같은 의미를 갖는다.
본 발명에서, 용어 "할로겐”은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미한다.
“히드록실”은 -OH를 의미한다.
“카르보닐”은 -C(=O)-를 의미한다.
“시아노”는 -CN를 의미한다.
“아미노”는 -NH2를 의미한다.
“치환된 아미노”는 하나 또는 두개의 아래에서 정의되는 바와 같은 알킬, 알킬카르보닐, 아르알킬, 헤테로아르알킬에 의해 치환된, 예를 들어 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 알킬아미도, 아르알킬아미노, 헤테로아르알킬아미노와 같은 아미노를 의미한다.
“카르복실”은 -COOH를 의미한다.
본 발명에서, 기 또는 다른 기의 일부분(예를 들어 할로겐 치환에 사용되는 알킬 등 기에서)으로서, 용어 "알킬”은 탄소 원자 및 수소 원자만으로 구성되는 완전히 포화된 직쇄 또는 분지쇄의 히드로카빌을 의미하고, 예를 들어1개 내지 12개의(바람직하게 1개 내지 8 개, 더 바람직하게 1개 내지 6 개) 탄소 원자를 가지며, 단일 결합을 통해 분자의 나머지 부분과 연결되고, 예를 들어 메틸, 에틸, N-프로필, 이소프로필, N-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, N-펜틸, 2-메틸부틸, 2,2-디메틸프로필, N-헥실, 헵틸, 2-메틸헥실, 3-메틸헥실, 옥틸, 노닐 및 데실 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 시클로알킬의 구현예는 모노시클릭알킬 또는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 시클로노닐, 시클로데실과 같은 폴리시클릭알킬을 포함한다.
독립적으로 또는 선택적으로 치환된 알킬렌과 같은 복합어로 사용되는 "알킬렌”은 위에서 정의되는 "알킬”과 동일한 기를 나타내고, 다만 다른 한 수소가 제거되어 2가 기를 형성한다. 임의의 치환기는 알킬렌 사슬에 연결되거나 알킬렌 사슬의 일부분을 형성할 수 있음을 이해해야 한다.
독립적으로 또는 "선택적으로 치환된 알케닐”과 같은 복합어로 사용되는 "알케닐”은 직쇄, 분지쇄 또는 고리형 올레핀으로 형성되는 기를 나타내고, 위에서 정의되는 비닐 모노머, 이불포화 또는 다중불포화 알킬 또는 시클로알킬을 포함하며, 바람직하게는 C2-6알케닐이다. 알케닐의 구현예는 비닐, 알릴, 1-메틸비닐, 부테닐, 이소부테닐, 3-메틸-2-부테닐, 1-펜테닐, 시클로펜테닐, 1-메틸-시클로펜테닐, 1-헥세닐, 3-헥세닐, 시클로헥세닐, 1-헵테닐, 3-헵테닐, 1-옥테닐, 시클로옥테닐, 1-노네닐, 2-노네닐, 3-노네닐, 1-데세닐, 3-데세닐, 1,3-부타디에닐, 1,4-펜타디에닐, 1,3-시클로펜타디에닐, 1,3-헥사디에닐, 1,4-헥사디에닐, 1,3-시클로헥사디에닐, 1,4-시클로헥사디에닐, 1,3-시클로헵타디에닐, 1,3,5-시클로헵타트리에닐 및 1,3,5,7-시클로옥타테트라에닐을 포함한다.
독립적으로 또는 "선택적으로 치환된 알키닐”과 같은 복합어로 사용되는 "알키닐”은 직쇄, 분지쇄 또는 단일, 이중 또는 다중 고리형 알킨으로 형성되는 기를 나타내고, 바람직하게는 C2-6알키닐이다. 알키닐의 구현예는 에티닐, 1-프로피닐, 1- 및 2-부티닐, 2-메틸-2-프로피닐, 2-펜티닐, 3-펜티닐, 4-펜티닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐, 4-헥시닐, 5-헥시닐, 10-운데시닐, 4-에틸-l-옥틴-3-일, 7-도데시닐, 9-도데시닐, 10-도데시닐, 3-메틸-1-도데신-3-일, 2-트리데시닐, 11-트리데시닐, 3-테트라데시닐, 7-헥사데시닐, 3-옥타데시닐 등을 포함한다.
본 발명에서, 기 또는 다른 기의 일부분으로서, 용어 "헤테로알킬”은 2개 내지 14개의 탄소 원자 및 질소, 인, 산소 및 황으로부터 선택된 1개 내지 6개의 헤테로 원자로 구성되는 완전히 포화된 직쇄 또는 분지쇄의 히드로카빌을 의미한다. 헤테로알킬 중의 질소, 탄소 또는 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고; 질소 원자는 선택적으로 4차 암모늄화될 수 있다 .
본 발명에서, 기 또는 다른 기의 일부분으로서, 용어 "헤테로시클릭”은 2개 내지 14개의 탄소 원자 및 질소, 인, 산소 및 황으로부터 선택된 1개 내지 6개의 헤테로 원자로 구성되는 안정적인 3원 내지 20원 비방향족 고리형 기를 의미한다. 본 명세서에 별도의 지시가 없는 한, 헤테로시클릭은 단일 고리, 이중 고리, 삼중 고리 또는 그 이상의 고리 시스템일 수 있고, 응축 고리 시스템, 브리지 고리 시스템 또는 스피로 고리 시스템을 포함할 수 있으며; 헤테로시클릭 중의 질소, 탄소 또는 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고; 질소 원자는 선택적으로 4차 암모늄화될 수 있으며; 헤테로시클릭은 부분적 또는 완전히 포화될 수 있다. 헤테로시클릭은 탄소 원자 또는 헤테로 원자에 의해 단일 결합을 통해 분자의 나머지 부분과 연결될 수 있다. 응축 고리가 포함되는 헤테로시클릭에서, 분자 나머지 부분과의 연결점이 비방향족 고리 원자인 경우 하나 이상의 고리는 아래에서 정의되는 아릴 또는 헤테로아릴일 수 있다. 본 발명의 목적에 있어서, 헤테로시클릭은 바람직하게 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1개 내지 3개의 헤테로 원자의 안정적인 4원 내지 11원 비방향족 단일 고리, 이중 고리, 브리지 고리 또는 스피로 고리 기를 포함하고, 더 바람직하게 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1개 내지 3개의 헤테로 원자의 안정적인 4원 내지 8원 비방향족 단일 고리, 이중 고리, 브리지 고리 또는 스피로 고리 기를 포함한다. 헤테로시클릭의 구현예는 피롤리디닐, 모르폴리닐, 피페라지닐, 호모피페라지닐, 피페리디닐, 티오모르폴리닐, 2,7-디아자-스피로[3.5]노난-7-일, 2-옥사-6-아자-스피로[3.3]헵탄-6-일, 2,5-디아자-비시클로[2.2.1]헵탄-2-일, 아제티디닐, 피라닐, 테트라히드로피라닐, 티오피라닐, 테트라히드로푸라닐, 옥사지닐, 디옥소펜틸, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 데카히드로이소퀴놀리닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 퀴나지닐, 티아졸리딘, 이소티아졸리딘, 이속사졸리딘, 디히드로인돌릴, 옥타히드로인돌릴, 옥타히드로이소인돌릴, 피롤리디닐, 피라졸리딘, 프탈이미드 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 기 또는 다른 기의 일부분으로서, 용어 "아릴”은 6개 내지 18개의 탄소 원자를 갖는(바람직하게 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는) 공액 탄화수소 고리 시스템 기를 의미한다. 본 발명의 목적에 있어서, 아릴은 단일 고리, 이중 고리, 삼중 고리 또는 그 이상의 고리 시스템일 수 있고, 아릴이 방향족 고리의 원자에 의해 단일 결합을 통해 분자의 나머지 부분과 연결될 경우 위에서 정의되는 시클로알킬 또는 헤테로시클릭과 응착될 수도 있다. 아릴의 구현예는 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 페난트릴, 플루오레닐, 2,3-디히드로-1H-이소인돌릴, 2-벤조속사졸리논, 2H-1,4-벤조옥사진-3(4H)-케토-7-일 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 기 또는 다른 기의 일부분으로서, 용어 "헤테로아릴”은 고리 내에 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1개 내지 15개의 탄소 원자(바람직하게 1개 내지 10개의 탄소 원자) 및 1개 내지 6개의 헤테로 원자의 5원 내지 16원 공액 고리 시스템 기가 구비되는 것을 의미한다. 본 명세서에 별도의 지시가 없는 한, 헤테로아릴은 단일 고리, 이중 고리, 삼중 고리 또는 그 이상의 고리 시스템일 수 있고, 헤테로아릴이 방향족 고리의 원자에 의해 단일 결합을 통해 분자의 나머지 부분과 연결될 경우 위에서 정의되는 시클로알킬 또는 헤테로시클릭과 응착될 수도 있다. 헤테로아릴 중의 질소, 탄소 또는 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고; 질소 원자는 선택적으로 4차 암모늄화될 수 있다. 본 발명의 목적에 있어서, 헤테로아릴은 바람직하게 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1개 내지 5개의 헤테로 원자의 안정적인 5원 내지 12원 방향족 기를 포함하고, 더 바람직하게 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1개 내지 4개의 헤테로 원자의 안정적인 5원 내지 10원 방향족 기 또는 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1개 내지 3개의 헤테로 원자의 5 내지 6원 방향족 기를 포함한다. 헤테로아릴의 구현예는 티에닐, 이미다졸릴, 피라졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 이소옥사졸릴, 피리딜, 피리미딜, 피라지닐, 피라다지닐, 벤즈아미다졸릴, 벤조피라졸릴, 인돌릴, 푸릴, 피롤릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 트리아지닐, 인다지닐, 이소인돌릴, 인다졸릴, 이소인다졸릴, 퓨리닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 디아조나프틸, 나프티리디닐, 퀴녹살리닐, 프테리디닐, 카르바졸릴, 카르볼린, 페난트리디닐, 페난트롤리닐, 아크리디닐, 페나지닐, 이소티아졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조티에닐, 옥사트리아졸릴, 신놀린, 퀴나졸리닐, 티오페닐, 인돌리지닐, 페난트롤린, 이소옥사졸릴, 페녹사지닐, 페노티아지닐, 4,5,6,7-테트라히드로벤조[b]티에닐, 나프토피리딜, [1,2,4]트리아졸로[4,3-b]피리다진, [1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피라진, [1,2,4]트리아졸로[4,3-c]피리미딘, [1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피리딘, 이미다조[1,2-a]피리딘, 이미다조[1,2-b]피리다진, 이미다조[1,2-a]피라진 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, "선택적으로” 또는 "치환 또는 비치환”은 뒤이어 설명되는 사건이나 상황이 발생할 수도 있고 발생하지 않을 수도 있는 것을 나타내고, 상기 설명은 상기 사건이나 상황이 발생하지 않는 경우도 동시에 포함한다. 예를 들어, "선택적으로 치환된 아릴”은 아릴이 치환되거나 치환되지 않는 것을 나타내고, 상기 설명은 치환된 아릴 및 치환되지 않은 아릴을 동시에 포함한다. 본 발명의 청구범위 및 명세서 부분에 따른 "선택적인” 치환기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 할로알킬, 할로알케닐, 할로알키닐, 시아노, 니트로, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 시클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬로부터 선택된다.
본문에서 사용되는 용어 "기질 단편”은 반응 기질 중 특정 반응에 참여한 일부 관능기(예를 들어 불포화 결합)를 제외한 나머지 분자 부분을 의미한다 .
본문에서 사용되는 용어 "부분”, “구조 부분”, “화학 부분”, “기”, “화학 기”는 분자 중의 특정 단편 또는 관능기를 의미한다. 화학 부분은 일반적으로 분자에 내장되거나 부가되는 화학 물질을 의미한다.
화합물 라이브러리의 구축 및 그 적용
본 발명의 바람직한 일 예에서, CuAAC에 기반하는 합성 반응을 사용하여, 두개의 분자 사이의 화학적 연결을 구현함으로써, 고처리량으로 구축 화합물 라이브러리를 구축한다.
본 발명의 방법의 간편성 및 효율성으로 인해, 디아조늄 전이가 소형 실험실에서도 일정한 산업적 실용성을 구비하도록 하고, 예를 들어, 1000개의 1차 아민을 얻는 경우, 1인이 2주 내에 0.1 mol/L 농도의 1000개의 1차 아민 화합물 라이브러리를 구축할 수 있고, 상기 1000개의 1차 아민 화합물을 1일 내에 아지드화할 수 있어 1000개의 아지드 화합물 라이브러리를 구축할 수 있으며, 상기 1000개의 아지드 화합물은 말단 알키닐 화합물과 반응할 수 있고, 예를 들어 100개의 말단 알키닐 화합물은 100,000개의 트리아졸 화합물을 얻어 후속의 활성 스크리닝에 직접 사용할 수 있다. 조합 화학에 의해 생성된 통상적인 화합물 라이브러리에 비해, 본 발명에서 구축되는 화합물 라이브러리는 각각의 반응기에 많은 화합물의 혼합물이 아닌 주로 하나의 화합물을 함유하고 또한 제어하기 쉽다.
라이브러리 중의 화합물 구조는 질량 분석법, 탠덤 질량 분석법, 자외선/가시광선 흡수 스펙트럼, 양성자 핵 자기 공명 분광법, C13핵 자기 분광법, 적외선 흡수 스펙트럼 및 X선 회절 결정 스펙트럼, 또는 이들의 조합과 같은 임의의 공지된 구조 분석 방법을 사용할 수 있다.
본 발명은, 한 번에 상이한 화합물을 대량으로 합성할 수 있고, 구축되는 화합물 라이브러리가 고처리량(HTS) 랜덤 스크리닝, 약물 또는 농업 화학품의 발견, 약물 또는 농업용 화학품의 리드 화합물의 발견 등에 사용 가능한 고처리량의 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법을 제공한다.
예를 들어, 생리적 활성을 갖는 화합물을 얻기 위해, 상기 화합물 라이브러리를 이용하여 다양한 스크리닝을 수행할 수 있다. 생리적 활성을 갖는 화합물의 예로는 효소 억제제, 리간드/수용체 결합 억제제, 혈관신생 억제제, 세포 접착 억제제, 유전자 발현 억제제 및 성장 인자 유사 활성 물질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 효소 억제제의 예로는 티로시나제 억제제, 시클로옥시게나아제 억제제, 텔로머레이스 억제제, 기질 금속 단백질 억제제, 프로스타글란딘D 합성 억제제, 포스포디에스테라제 억제제, 콜린에스테라제 억제제, 바이러스성 프로테아제 억제제 및 역전사 효소 억제제를 포함한다. 수용체의 예로는 아드레날린 수용체, 히스타민 수용체, 류코트리엔 수용체 및 오피오이드 수용체를 포함한다.
1,3-쌍극자 고리 시약
본 발명에서, 1,3-쌍극자화 시약을 통해, 말단에 불포화 결합이 구비되는 기질 단편에 대해 1,3-쌍극자 고리 첨가 반응을 수행하여, 트리아졸 화합물과 같은 1,3-쌍극자 고리 구조가 함유되는 화합물을 얻는다. 그 예시적 반응 경로는 하기 식과 같다.
Figure pct00006
상기 식에서, R, R', R'' 및 R'''는 각각 독립적으로 R1 또는
Figure pct00007
이고; 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 기질 단편이다.
본 발명에서, 상기 R1 및 R2는 상기 반응 기질 중 말단 불포화 결합의 분자 부분(moiety)을 제외한 나머지 분자 부분이다.
바람직하게, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 약물 분자로부터의 약물 활성 단편이다.
본 발명에서, R, R', R'' 및 R''' 또는 대응되는 R1 및 R2에 대해 특별한 제한이 없고, 다양한 적합한 유기 기일 수 있으며; 전형적으로, 대표적인 R1 및 R2는 C, H, O, N, S, F, Cl 등 원소로 형성되는 유기 기를 포함하고, 예를 들어 알킬, 시클로알킬, 헤테로알킬, 헤테로시클릭, 알케닐, 시클로알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 술포닐, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 또는 비치환된 기로 구성되는 분자 부분(moiety)이다.
비록 본 발명에서 예시적인 R, R', R'' 및 R'''기를 예로 들었지만, 본 발명의 방법 하에서, 아지드 구조를 갖는 임의의 화합물은 모두 본 발명의 1,3-쌍극자 고리화 시약으로 사용 가능하여, 말단에 불포화 기가 존재하는(예를 들어 알케닐, 알키닐, 시클로알케닐, 시아노 등) 기질과 반응하여, 질소 헤테로고리가 함유되는 화합물을 얻을 수 있음을 이해해야 한다.
특별히 바람직한 기질은 본 분야에서 공지된 약물 분자(예를 들어 에를로티닙 분자), 또는 불포화 기에 의해 수식된 주지의 약물 분자이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 수식은 본 분야에서 공지된 방법을 통해, 역합성 분석법을 사용하여 수식 경로를 얻을 수 있고, 예를 들어, 본 분야에서 공지된 커플링 반응을 사용하여 불포화 기의 수식(예를 들어 Suzuki 반응 등)을 수행할 수 있다.
1,3-쌍극자 고리화 시약(아지드 화합물)
본 발명에서, 1,3-쌍극자화 시약으로서 아지드 화합물은 아민 단편을 통해 플루오로설포닐아지드와 반응하여 제조될 수도 있다. 예시적인 반응식은 하기와 같다.
Figure pct00008
상기 식에서 치환기 R은 모든 치환 또는 비치환된 알킬, 시클로알킬, 헤테로알킬, 헤테로시클릭, 알케닐, 시클로알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 술포닐, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예시적으로 R의 정의는 상술한 R, R', R'' 및 R'''의 정의를 참조한다.
비록 본 발명에서 예시적인 R기를 예로 들었지만, 본 발명의 방법 하에서, 1차 아민 구조를 갖는 임의의 기질은 모두 본 발명의 아민 단편으로 사용 가능하여, 1,3-쌍극자 고리화 시약으로서의 아지드 화합물을 구축할 수 있음을 이해해야 한다. 자연계에 풍부한 1차 아민 화합물이 존재하기에, 상기 방법은 임의의 종래의 1차 아민 단편을 사용할 수 있고, 후속 개발되는 임의의 1차 아민 단편을 사용할 수도 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 주요 장점은 다음을 포함한다.
1． 반응이 간단하고 효율적이며, 대규모의 명확한 구조를 갖는 수백 수천 이상의 화합물을 신속하게 합성하여, 주소 지정 가능한 화합물 라이브러리를 획득할 수 있다.
2. 1,3-쌍극자 고리화 시약 화합물 라이브러리 및 1,3-쌍극자 고리 시약 화합물 라이브러리를 신속하게 구축할 수 있다.
3. 조합 화학으로 생성된 통상적인 화합물 라이브러리에 비해, 본 발명에서 구축되는 화합물 라이브러리는 각각의 반응기에 다양한 반응 생성물의 혼합물이 아닌 주로 하나의 화합물을 함유하고 또한 제어하기 쉽다.
4. 본 발명의 고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법은, 화학 계량에 의한 시약이 거의 정량이므로, 단편에 기반하는 약물을 발견하는데 적용할 수 있다.
5. 본 발명의 고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법은, 종래의 조합 화학으로는 달성할 수 없었던 활성 연구에 직접 응용될 수 있고, 심지어 표현형 스크리닝을 직접 수행할 수 있다.
아래에 구체적인 실시예를 참조하여, 본 발명을 더 상세히 설명한다. 이해해야 할 것은, 이러한 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다. 아래의 실시예에 구체적인 조건이 표기되지 않은 실험 방법은 일반적으로 통상적인 조건에 따르거나, 제조 업체가 권장하는 조건에 따른다. 다른 설명이 없는 한, 백분율 및 부수는 중량 기준으로 계산된다.
실시예 1 플루오로설포닐아지드(FSO 2 N 3 )의 제조
Figure pct00009
얼음욕에서, 아지드화나트륨 용액(0.25 M, 20 ml; 5 mmol NaN3 함유) 및 메틸 t-부틸에테르(20 ml) 혼합 시스템에, 1-(플루오로술포닐)-2,3-디메틸- 1H-이미다졸 트리플레이트의 아세토니트릴 용액(6 mmol, 1 ml MeCN)을 첨가한다. 반응 시스템을 얼음욕에서 10분간 교반한 후, 반응액을 실온(25 ℃)에서 5분간 정치시킨다. 반응 시스템 중의 수상을 제거하여 얻은 유기상은 즉 플루오로설포닐아지드(FSO2N3) 용액이며, 수율은 92%이다(19F NMR을 통해 아지드화 나트륨에 대응되는 몰수를 결정하고; 메틸 t-부틸에테르(MTBE)에서, 생성물 화학적 변위는 +61.5 ppm이며, 정량은 기지량의
Figure pct00010
를 내부 표준(δ+36.7 ppm)으로 사용할 수 있고, 불소 스펙트럼에서 생성물 및 내부 표준의 신호 적분비를 통해 반응 시스템 중 생성물의 총량을 산출하여, 반응 수율을 산출한다). GC-MS (tR): 1.69 min; EI-MS (m/z): 125 [M]+(GC-MS (EI) 스펙트럼 Agilent 7890A GC System 및 Agilent 5975C Inert MSD system 측정, 방법：T0 = 40 ℃, t = 10 min, ramp = 20 ℃/min; T1 = 200 ℃, t = 10 min). 상기플루오로설포닐아지드(FSO2N3) 용액에 디메틸술폭시드(DMSO, 약 20 ml)를 추가하고, 얻은 용액은 1차 아민 화합물의 디아조늄 전이 반응에 직접 사용할 수 있다(실시예 3 참조).
실시예 2 1차 아민 화합물 라이브러리 제조
1128개의 상이한 1차 아민 화합물(알킬1차 아민, 아릴1차 아민 및 방향족 헤테로시클릭1차 아민을 포함)을 각각 약 100 mM 농도의 용액으로 각각 배합하고, 용매는 디메틸술폭시드이며, 부피는 약 1 ml 정도이고, 1.2 ml 규격의 96웰 마이크로 웰 플레이트에 저장한다.
1차 아민 화합물이 아릴1차 아민 또는 방향족 헤테로시클릭1차 아민이고, 화합물에 아지드로 전환될 수 있는 n개의 1차 아민 관능기가 함유될 경우, 1.5 ml원심 분리 튜브에서 0.10/n mmol 1차 아민을 1.0 ml의 디메틸술폭시드에 용해시킨 다음, 이에 대응되는 마이크로 웰 플레이트의 대응 위치의 웰로 전이한다.
1차 아민 화합물이 알킬1차 아민을 염산, 메탄술폰산, 타르타르산, P-톨루엔술폰산 또는 브롬화수소산과 중화하여 얻은 암모늄염이고, 화합물에 아지드로 전환될 수 있는 n개의 1차 아민 관능기가 함유될 경우, 1.5 ml원심 분리 튜브에서 0.10/n mmol 1차 아민을 1.0 ml의 디메틸술폭시드에 용해시킨 다음, 이에 대응되는 마이크로 웰 플레이트의 대응 위치의 웰로 전이한다.
1차 아민 화합물이 유리된 알킬1차 아민이고, 화합물에 아지드로 전환될 수 있는 n개의 1차 아민 관능기가 함유될 경우, 1.5 ml 원심 분리 튜브에서 0.10/n mmol 1차 아민을 1.0 ml 100/n mM 메탄술폰산 용액에 용해시키며(용매는 디메틸술폭시드); 만약 화합물에 두 개 이상의 유리 염기성 관능기(1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 구아니딘 등)가 포함되면, 메탄술폰산 용액의 농도는 200/n mM으로 향상된다. 뒤이어 상기 배합된 1차 아민 용액을 이에 대응되는 마이크로 웰 플레이트의 대응 위치의 웰로 전이한다.
디메틸술폭시드에서 용해도가 비교적 낮은 1차 아민도 디아조늄 전이를 통해 아지드 화합물을 제조할 수 있고, 이러한 아지드 생성물의 대부분은 디메틸술폭시드에 용해되어 아지드 화합물 라이브러리에 용액 형태로 분류될 수 있다. 그러나 이러한 용해도가 비교적 낮은 1차 아민은 1차 아민 화합물 라이브러리에 용액의 형태로 저장될 수 없다. 위에서 언급된 용액의 형태로 마이크로 웰 플레이트에 저장되는 1128개의 1차 아민 화합물 라이브러리(12개의 96웰 마이크로 웰 플레이트에 분포됨)를 제외하고도, 다른 96개의 1차 아민(그 중 일부는 용해도가 비교적 낮음)은 디아조늄 전이 기질로 선택된다. 이로써, 1224개의 상이한 구조가 함유되는1차 아민 라이브러리를 구축하여 얻고, 후속의 아지드 화합물 라이브러리의 제조에 사용한다(도 1).
실시예 3 아지드 화합물 라이브러리 제조
Figure pct00011
실시예 1의 방법으로 제조된 플루오로설포닐아지드 용액(용매는 메틸 t-부틸에테르이고, 19F NMR을 통해 측정한 농도는 약 400 mM, 약40 ml임)을 디메틸술폭시드(40 ml)로 희석하여, 플루오로설포닐아지드 용액(19F NMR을 통해 측정한 농도는 약 200 mM, 80 ml이며, 용매는 디메틸술폭시드 /메틸t-부틸에테르1:1임)을 획득한다.
96웰 피펫을 사용하여, 실시예 2에서 제조되는 1차 아민 화합물 라이브러리 중 하나의 96웰 플레이트의 각 웰 중의 1차 아민 용액(100 mM, 용매는 디메틸술폭시드이고; 200 μl 취하며, 20 μmol 1차 아민이 함유됨)을 하나의 빈 1.2 ml 규격의 96웰 마이크로 웰 플레이트에 전이한다. 각 웰에 중탄산칼륨 수용액(3.0 M, 26.7μl, 80 μmol 중탄산칼륨이 포함됨) 및 상기 희석된 플루오로설포닐아지드 용액(200 mM, 100 μl, 20 μmol 플루오로설포닐아지드가 함유됨)을 추가한다. 별도의 디메틸술폭시드(73 μl)를 추가하여 총 부피가 약 400 μl이 되도록 한다. 마이크로 웰 플레이트를 밀봉하고 쉐이크 테이블에 넣고, 30 ℃의 온도에서 800 rpm으로 1시간 동안 쉐이킹한다. 쉐이킹 완료 후, 상기 마이크로 웰 플레이트의 각 웰은 모두 정량 수율에 근접하게 대응되는 아지드 화합물의 50 mM농도의 용액(용매 시스템은 약 디메틸술폭시드/메틸 t-부틸에테르 3:1임)을 얻는다. 마이크로 웰 플레이트의 각 웰 중의 반응액은 UPLC-MS를 사용하여 검출한다. 예시적인 UPLC크로마토그래피는 도 2a-f에 도시된 바와 같다.
실시예 2 중의 1128개의 1차 아민 화합물 라이브러리는 상기 방법을 통해 1128개의 대응되는 아지드 화합물을 얻었다. 상기1128개의 아지드 화합물 용액은 12개의 96웰 마이크로 웰 플레이트(마이크로 웰 플레이트 번호1-7 및 10-14)에 분포된다. 실시예 2에서 언급되는 96개의 독립적으로 보존되는 1차 아민(그 중 1차 아민의 일부는 용해도가 비교적 낮음)은 상기 실시예 중의 동일한 방법으로 반응하여 96개의 가용성 아지드 화합물 용액을 얻고 하나의 새로운 96웰 마이크로 웰 플레이트에 전이된다(아지드 라이브러리 제8 플레이트 참조바람). 이로써 하나의 총 1224개의 상이한 구조가 함유되는 하나의 아지드 용액의 화합물 라이브러리를 구축한다.
상기 1224개의 상이한 구조의 아지드 용액의 화합물 라이브러리를, 13개의 96웰 마이크로 웰 플레이트에 분포한다. 상기 아지드 화합물 라이브러리의 마이크로 웰 플레이트는 밀봉되어 냉장 온도(4 ℃)의 냉장고에 저장될 수 있고, 적어도 6 개월 동안 안정시키며; 상기 화합물 라이브러리는 분리 없이 직접 반응에 사용될 수 있다.
아지드 화합물 라이브러리의 구조 및 마이크로 웰 플레이트에서의 위치는 하기와 같고, 이에 대응되는 1차 아민 화합물 라이브러리(제8 플레이트 제외) 및 트리아졸 화합물 라이브러리 위치는 그대로 유지된다.
Figure pct00012
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Figure pct00024
실시예 4 아지드 화합물 라이브러리를 사용하여 구리 촉매 아지드 말단 알킨 고리 첨가 반응(CuAAC)을 수행
Figure pct00025
아스코르브산나트륨(2.48 g, 12.5 mmol), 디소듐포스페이트(7.0 g, 49.3 mmol) 및 시트르산(4.87 g, 25.4 mmol)을 혼합하고, 증류수를 추가하여 100 ml 수용액으로 용해시켜, 아스코르브산나트륨/디소듐포스페이트/시트르산 완충 용액을 얻으며, pH 값은 약 5이다.
실시예 2에서 획득한 아지드 화합물 라이브러리 제8 플레이트에서, 각 웰에서 용액(100 μl, 약 50 mM 농도, 약 5 μmol 아지드 함유)을 취하여 하나의 새로운 350 μl 규격의 96웰 플레이트에 전이한다. 각 웰에 상기 아스코르브산/디소듐포스페이트/시트르산 완충 용액(40 μl)을 순차적으로 추가하고, 밀봉 후 30 ℃의 온도에서 800 rpm 속도로 15분간 쉐이킹한다. 밀봉 필름을 떼어내고, 각 웰에 3-아세트아미도페닐아세틸렌 용액(화합물4a, 100 mM, 용매는 디메틸술폭시드이고; 47.5 μl, 4.75 μmol 3-아세트아미도페닐아세틸렌 함유) 및 황산구리/THPTA수용액(황산구리 및 THPTA의 농도는 각각 20 mM, 12.5 μl, 0.25 μmol임)을 추가한다. 마이크로 웰 플레이트를 밀봉 후 40 ℃의 온도에서 800 rpm 속도로 6 시간 동안 교반한다. 반응이 종료된 후, 플레이트 내의 혼합액을 하나의 빈 1.2ml 규격의 96웰 플레이트에 하나씩 대응되게 전이하고, 각 웰에 메탄올(400 μl) 및 아세토니트릴(400 μl)를 추가하여 희석한 후, 생성되는 1,2,3-트리아졸생성물은 UPLC-MS로 검출한다.
예시적인 1,2,3-트리아졸생성물의 UPLC 크로마토그래피는 도 3a-f에 도시된 바와 같다.
실시예 5 1차 아민 화합물 라이브러리를 사용하여 디아조늄 전이 및 구리 촉매 아지드 말단 알킨고리 첨가 반응(CuAAC)을 통해 직접 1,2,3-트리아졸 화합물 라이브러리를 얻는다.
Figure pct00026
실시예 2에서 제조되는 1128개의 1차 아민 화합물 라이브러리(즉 실시예 2의 제1-7및 제10-14 플레이트의 아지드 화합물에 대응되는 1차 아민 화합물 구조) 중 각각의 96웰 플레이트의 각 웰에서 50 μl(100 mM, 용매는 디메틸술폭시드이고, 5 μmol 1차 아민이 함유됨)를 취하여 새로운 96웰 플레이트의 대응되는 위치에 전이한다. 뒤이어 이러한 새로운 1차 아민 용액이 함유되는 플레이트에서 각 웰에 중탄산칼륨 수용액(3.0 M, 6.7 μl, 20 μmol중탄산칼륨 함유), 플루오로설포닐아지드 용액(실시예 1을 참조하여, 디메틸술폭시드/메틸 t-부틸에테르 1：1; 200 mM, 25 μl, 5 μmol 플루오로설포닐아지드가 함유된 용매 시스템으로 희석함) 및 디메틸술폭시드(18 μl)를 순차적으로 추가하여, 총 부피가 약 100 μl이 되도록 한다. 96웰 플레이트를 30 ℃의 온도에서 밀봉하고 800 rpm 회전 속도로 1 시간 동안 쉐이킹한다.
아스코르브산나트륨(2.48 g, 12.5 mmol), 디소듐포스페이트(7.0 g, 49.3 mmol) 및 시트르산(4.87 g, 25.4 mmol)을 혼합하고, 증류수를 추가하여 100ml 수용액으로 희석하여, 아스코르브산나트륨/디소듐포스페이트/시트르산완충 용액을 얻으며, pH 값은 약 5이다.
상기 1시간 동안 쉐이킹한 96웰 플레이트의 밀봉 필름을 떼어내고, 상기 배합된 아스코르브산나트륨/디소듐포스페이트/시트르산 완충 용액(40 μl)을 추가하며, 30 ℃의 온도에서 밀봉하고 800 rpm 회전 속도로 15 분간 쉐이킹한다. 밀봉 필름을 떼어낸 후 각 웰에 3-아세트아미도페닐아세틸렌 용액(화합물4a, 100 mM, 용매는 디메틸술폭시드이고; 47.5 μl, 4.75 μmol 3-아세트아미도페닐아세틸렌이 함유됨) 및 황산구리/THPTA수용액(황산구리 및 THPTA의 농도는 각각 20 mM, 12.5 μl, 0.25 μmol임)을 추가한다. 마이크로 웰 플레이트를 다시 밀봉한 후 40 ℃의 온도에서 800 rpm 속도로 6 시간 동안 교반한다. 반응이 종료된 후, 플레이트 내의 혼합액을 하나의 빈 1.2ml 규격의 96웰 플레이트에 하나씩 대응되게 전이하고, 각 웰에 메탄올(400 μl) 및 아세토니트릴(400 μl)을 추가하여 희석한 후, 생성되는 1,2,3-트리아졸 생성물은 UPLC-MS로 검출한다.
예시적인 UPLC 크로마토그래피 검출 결과는 도 4a-i에 도시된 바와 같다.
실시예 6 1차 아민 화합물 라이브러리를 사용하여 디아조늄 전이 및 구리 촉매 아지드 말단 알킨 고리 첨가 반응(CuAAC)을 통해 직접 1,2,3-트리아졸 화합물 라이브러리를 얻는다.
Figure pct00027
실시예 2에서 제조되는 1128개의 1차 아민 화합물 라이브러리(즉 실시예 2의 제1-7 및 제10-14 플레이트의 아지드 화합물에 대응되는 1차 아민 화합물 구조) 중 제2 플레이트의 각 웰에서 50 μl(100 mM, 용매는 디메틸술폭시드이고, 5 μmol 1차 아민이 함유됨)를 취하여 새로운 96웰 플레이트의 대응되는 위치에 전이한다. 뒤이어 이러한 새로운 1차 아민 용액이 함유되는 플레이트에서 각 웰에 중탄산칼륨 수용액(3.0 M, 6.7 μl, 20 μmol 탄산칼륨 함유), 플루오로설포닐아지드 용액(실시예 1을 참조하여, 디메틸술폭시드/메틸 t-부틸에테르 1：1; 200 mM, 25 μl, 5 μmol플루오로설포닐아지드가 함유되는 용매 시스템으로 희석함) 및 디메틸술폭시드(18 μl)를 순차적으로 추가하여, 총 부피가 약 100 μl이 되도록 한다. 96웰 플레이트를 30 ℃의 온도에서 밀봉하고 800 rpm 회전 속도로 1 시간 동안 쉐이킹한다.
아스코르브산나트륨(2.48 g, 12.5 mmol), 디소듐포스페이트(7.0 g, 49.3 mmol) 및 시트르산(4.87 g, 25.4 mmol)을 혼합하고, 증류수를 추가하여 100ml 수용액으로 용해하여, 아스코르브산나트륨/디소듐포스페이트/시트르산 완충 용액을 얻으며, pH 값은 약 5이다.
상기 1시간 동안 쉐이킹한 96웰 플레이트의 밀봉 필름을 떼어내고, 상기 배합된 아스코르브산나트륨/디소듐포스페이트/시트르산 완충 용액(40 μl)을 추가하며, 30 ℃의 온도에서 밀봉하고 800 rpm 회전 속도로 15 분간 쉐이킹한다. 밀봉 필름을 떼어낸 후 각 웰에 4-(4-펜티아미도)페닐 플루오로술포네이트 용액(화합물4b, 100 mM, 용매는 디메틸술폭시드이고; 47.5 μl, 4.75 μmol 3-아세트아미도페닐아세틸렌이 함유됨) 및 황산구리/THPTA수용액(황산구리 및 THPTA의 농도는 각각 20 mM, 12.5 μl, 0.25 μmol임)을 추가한다. 마이크로 웰 플레이트를 다시 밀봉한 후 40 ℃의 온도에서 800 rpm 속도로 6 시간 동안 교반한다. 반응이 종료된 후, 플레이트 내의 혼합액을 하나의 빈 1.2ml 규격의 96웰 플레이트에 하나씩 대응되게 전이하고, 각 웰에 메탄올(400 μl) 및 아세토니트릴(400 μl)을 추가하여 희석한 후, 생성되는 1,2,3-트리아졸 생성물은 UPLC-MS로 검출한다.
예시적인 UPLC크로마토그래피 검출 결과는 도 5a-d에 도시된 바와 같다.
실시예 1-6에서 제조되는 아지드 화합물 라이브러리 및 트리아졸 화합물 라이브러리에 대응되는 각각의 화합물에 대해 분석하고, 결과는 하기와 같이 요약된다 (도 1).
(a) Reaxys 데이터베이스에서의 검색에 의하면, 618개의 아지드 화합물은 종래에 기지된 것이고, 606개의 아지드 화합물은 새로운 것이다.
(b) 1224개의 주소 지정 가능한 반응에서, 656 가지 반응 생성물(약 54%)의 반응 전환율은 ＞90%이고; 333 가지 반응 생성물(약 27%)의 반응 전환율은 70-90%이며; 144 가지 반응 생성물의 반응 전환율은 30-70%이고; 17 가지 반응 생성물의 반응 전환율은 ＜30%이며; 74 가지 반응 생성물의 UPLC크로마토그래피 검출 피크는 3-아세트아미도페닐아세틸렌의 피크와 오버랩되어, 전환율을 산출할 수 없다.
상술한 결과는 거의 모든 주소 지정 가능한 반응이 모두 대응되는 예상 반응 생성물을 얻었음을 나타내고, 여기서 적어도 989개의(989/1224=80.8%) 주소 지정 가능한 반응의 전환율이 70% 이상이므로, 후속의 생물 활성 테스트의 관련 요구를 완전히 만족할 수 있다.
반응 챔버에서 수행되는 1224개의 주소 지정 가능한 반응에서 생성되는 일부 화합물의 감정 결과는 도 3, 도 4 및 도 5를 참조한다.
종합하면, 예상 밖으로, 본 발명의 방법을 통해, 각각의 반응 챔버에서 특정한 합성 반응을 독립적으로 수행하여, 효율적이고 고처리량으로 대량의 상이한 구조가 명확한 반응 생성물을 제조하고, 고처리량의 화합물 라이브러리를 획득할 수 있다. 따라서, 상기 반응 생성물이 함유되는 주소 지정 가능한 반응 챔버 어레이(또는 대응되는 화합물 라이브러리)는, 분리 및 정제 없이, 직접 원 위치에서 후속의 화합물 활성 테스트를 수행할 수 있다.
실시예 7 840개의 에를로티닙(Erlotinib) 유도체 라이브러리의 구축
Figure pct00028
총 반응식은 위에 도시된 바와 같고, 조작 단계는 하기와 같다.
(1) 96웰 플레이트의 각 웰에 37 μL DMSO, 13 μL H2O, 10 μL아지드 블록 DMSO용액(50 mM) 및 20 μL에를로티닙 DMSO용액(25 mM)을 추가하고, 균일하게 혼합한다.
(2) 96웰 플레이트의 각 웰에 5 μL황산구리수용액(5 mM), 5 μL트리스[(1-(3-히드록시프로필)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)]메틸]아민 수용액(5 mM) 및 10 μL아스코르브산나트륨 수용액(250 mM)을 추가하고, 실온 쉐이크 테이블에서 12 시간 동안 쉐이킹 반응한다.
총 9개의 96웰 플레이트, 840개의 샘플(최종 농도：5 mM, 최종 부피：100 μL)이다. UPLC-MS는 일부 샘플을 랜덤으로 트래킹하여 표시하고, 대부분 샘플의 전환율은 70% 이상이며, MTT법 스크리닝에 직접 사용된다.
MTT 법으로 840개의 Erlotinib 유도체를 스크리닝하고, 조작 단계는 하기와 같다.
(1) A549(폐암) 세포가 하룻밤 동안 벽에 부착되는 단계: 대수 생장기의 세포를 취하여, 소화 처리 후 수를 통계하며, 웰당 5000개의 세포를 96웰 플레이트에 펼쳐 하룻밤을 지낸다.
(2) 투여 단계: 완전 배양액으로 화합물 농도를 10 μM까지 희석하고, 상청액을 흡인하여 폐기하며, 웰당100 μL 부피로 24 시간 동안 투여 처리한다.
(3) MTT 추가 단계: 각 웰에 20 μL MTT(5mg/mL)를 추가하고, 4 시간 동안 배양한다.
(4) 흡광도 값 측정 단계: 상청액을 흡인하여 폐기하고, 각 웰에 DMSO 150 μL를 추가하며, 쉐이크 테이블에서 10 분간 쉐이킹하여, 결정이 충분히 용해되도록 한다. 마이크로 플레이트 리더로 용액의 570 nm 위치의 흡광도를 측정한다.
하기의 방식으로 상대 생존율을 산출하는 단계: Erlotinib유도체 처리 세포의 생존율을 양성 화합물(Erlotinib) 처리 세포의 생존율과 비교하면, 상대 생존율이 낮을 수록, 화합물 활성이 더 우수하다는 것을 나타낸다.
실험 결과：
결과는 도 6에 도시된 바와 같다. 840개의 화합물에서, A549세포에서 Erlotinib보다 활성이 높은 총 265개의 화합물(상대생존율<1)을 초보적으로 스크리닝하여 얻고, 활성이 비교적 우수한 화합물(상대생존율<0.5)은 총 19 개이다.
복수의 96웰의 어레이 반응기로부터 선택되는 각 주소 지정 가능한 반응 챔버에 대한 예시적 부분 활성이 우수하거나 비교적 우수한 양성 화합물(Erlotinib)의 화합물은 아래 표 1 및 표 2에 나열된다.
[표 1]
고처리량 화합물 라이브러리의 부분 화합물 구조 및 생물 활성 (상대 생존율=0.5 ~ 1)
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
[표 2]
고처리량 화합물 라이브러리의 부분 화합물 구조 및 생물 활성 (상대 생존율>1)
Figure pct00033
Figure pct00034
결과, 본 발명의 방법은 동일한 반응 시스템(또는 반응 챔버)에서, 화합물의 제조 및 스크리닝 과정을 완성할 수 있고, 2단계 반응은 모두 거의 정량으로 생성물을 생성하므로, 생성물은 분리할 필요 없이 즉 효소학 내지 세포학 테스트 실험에 사용될 수 있어, 화합물 고처리량 합성 및 스크리닝 분야에서 중요한 응용 가치를 갖는다.
본 발명에서 언급되는 모든 문헌은 본 발명에 참조로서 인용되고, 각각의 문헌이 독립적으로 인용되어 참조되는 바와 같다. 이 밖에 이해해야 할 것은, 본 발명의 상술한 내용을 열독한 후, 본 기술분야의 기술자는 본 발명에 대해 다양한 변경 또는 보정을 수행할 수 있고, 이러한 등가 형태는 마찬가지로 본 발명의 첨부된 청구범위에 의해 한정되는 범위에 포함된다.

Claims (12)

  1. (a) 반응기를 제공하는 단계로서, 상기 반응기가 n개의 반응 챔버를 포함하고, 상기 반응 챔버가 각각 독립적이고 주소 지정 가능(addressable)하고, 상기 n개의 반응 챔버가 주소 지정 가능한 반응 챔버 어레이(array of reaction chamber)를 구성하는 단계;
    (b) 상기 n개의 반응 챔버에서, m개의 각각 독립적인 합성 반응을 수행하고, 합성 반응이 수행되는 각각의 반응 챔버에서 각각의 합성 생성물을 획득하여, 화합물 라이브러리를 구축하고 획득하는 단계로서,
    상기 합성 반응이
    (b1) 하나의 반응 챔버에서, 비활성 용매 중 1,3-쌍극자 고리화 시약 및 말단 불포화 결합을 함유하는 반응 기질을 사용하여 1,3-쌍극자 고리 첨가 반응을 수행하여, 1,3-쌍극자 고리가 함유된 반응 생성물을 형성하는 단계
    를 포함하는, 단계; 및
    (c) 임의적으로, 상기 합성 반응이 수행된 반응 챔버에 각각 활성 테스트 시약을 첨가하여 활성 테스트를 수행하고, 각각의 합성 생성물에 대해 활성 스크리닝(screening)을 수행하는 단계
    를 포함하는, 고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법으로서, n이 10 이상의 양의 정수이고, m이 n 이하의 양의 정수이고, m이 10 이상의 양의 정수인, 고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 각각의 반응 챔버의 부피가 독립적으로 5 μL 내지 5000 μL인, 고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 활성 테스트 시약이 소분자 화합물, 단백질, 핵산, 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계(c)가 각각의 반응 챔버를 검출하여, 각각의 반응 챔버 중의 활성 테스트 결과를 얻는 단계를 포함하는, 고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계(b)에서, 상기 1,3-쌍극자 고리 첨가 반응의 반응식이
    Figure pct00035

    로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 식에서, R, R', R'' 및 R'''이 각각 독립적으로 R1 또는
    Figure pct00036
    이고, 상기 R1 및 R2가 각각 독립적으로 기질 단편인, 고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 단계(b)에서, 상기 1,3-쌍극자 고리 첨가 반응의 반응식이
    Figure pct00037

    이고,
    상기 식에서, R 및 R''이 각각 독립적으로 R1 또는
    Figure pct00038
    이고, 상기 R1 및 R2가 각각 독립적으로 기질 단편인, 고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단계(b)에서, 단계(b1) 이전에,
    (b0) 비활성 용매에서, 염기 존재하에, 아민 단편(바람직하게 R-NH2)과 FSO2N3을 반응시켜, 1,3-쌍극자 고리화 시약을 제조하는
    Figure pct00039

    반응식의 단계를 추가로 포함하고,
    상기 식에서, R이 아지드 기(group)와 연결되는 분자 부분(moiety) 또는 단편인, 고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 반응 기질, 반응 생성물 및 활성 테스트의 데이터에 대해, 상기 반응 챔버의 주소 지정 가능한 주소를 기반으로 상호 연관시켜, 주소 지정 가능한 데이터 집합을 획득하는 단계를 추가로 포함하는 고처리량 화합물 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법.
  9. (i) 1,3-쌍극자 고리 첨가 반응을 수행하고 하나 이상의 반응기를 포함하는 반응 모듈로서, 상기 반응기가 n개의 반응 챔버를 포함하고, 상기 반응 챔버가 각각 독립적이고 주소 지정 가능하고, 상기 n개의 반응 챔버가 주소 지정 가능한 반응 챔버 어레이를 구성하고, 상기 반응 챔버가 상기 1,3-쌍극자 고리 첨가 반응의 수행에 사용되어, 반응 챔버에서 합성 생성물을 형성하되, n이 10 이상의 양의 정수이고, m이 n 이하의 양의 정수이고, m이 10 이상의 양의 정수인, 반응 모듈; 및
    (ii) 임의적으로, 상기 반응 챔버에서 형성되는 합성 생성물에 대해 원 위치에서 활성 테스트를 수행하여, 활성 테스트의 데이터를 획득하기 위한 활성 테스트 모듈
    을 포함하는, 고처리량의 주소 지정 가능한 반응 장치.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 반응기가 마이크로플레이트, PE 튜브의 어레이, 시험관의 어레이, 반응 플라스크의 어레이 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 고처리량의 주소 지정 가능한 반응 장치
  11. (1) 제9항에 따른 고처리량의 주소 지정 가능한 반응 장치를 사용하여, 화합물 라이브러리를 구축하는 단계
    를 포함하는, 화합물 라이브러리의 구축 방법.
  12. 제9항에 따른 고처리량의 주소 지정 가능한 반응 장치의 용도로서,
    상기 고처리량의 주소 지정 가능한 반응 장치가
    (a) 상이한 화합물을 동시에 합성하는 용도;
    (b) 생리적 활성 화합물의 고처리량(HTS) 랜덤(random) 스크리닝의 용도;
    (c) 약물 또는 농업 화학품의 검색의 용도; 및
    (d) 약물 또는 농업용 화학품의 선도(leading) 화합물의 검색의 용도
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용도에 사용되는, 용도.
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