WO2020260831A1 - Procédé de production de la rubisco à partir d'une biomasse végétale - Google Patents

Procédé de production de la rubisco à partir d'une biomasse végétale Download PDF

Info

Publication number
WO2020260831A1
WO2020260831A1 PCT/FR2020/051110 FR2020051110W WO2020260831A1 WO 2020260831 A1 WO2020260831 A1 WO 2020260831A1 FR 2020051110 W FR2020051110 W FR 2020051110W WO 2020260831 A1 WO2020260831 A1 WO 2020260831A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
rubisco
carried out
juice
solution
dehydration
Prior art date
Application number
PCT/FR2020/051110
Other languages
English (en)
Inventor
Syrine KERFAI
Bernard REBOUL
Sandrine Alfenore
Jacqueline RESENDE DE AZEVEDO
Maria Aurora Fernandez
Stephane Mathe
Maria Angelica USTA
Maria-Ines RE
Manon MONTANER
Original Assignee
Institut National Des Sciences Appliquees De Toulouse
Centre National De La Recherche Scientifique
Institut National De La Recherche Agronomique
Ecole National Superieure Des Mines D'albi-Carmaux
Ovalie Innovation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National Des Sciences Appliquees De Toulouse, Centre National De La Recherche Scientifique, Institut National De La Recherche Agronomique, Ecole National Superieure Des Mines D'albi-Carmaux, Ovalie Innovation filed Critical Institut National Des Sciences Appliquees De Toulouse
Priority to EP20747040.2A priority Critical patent/EP3989731A1/fr
Publication of WO2020260831A1 publication Critical patent/WO2020260831A1/fr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/14—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from leguminous or other vegetable seeds; from press-cake or oil-bearing seeds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01039—Ribulose-bisphosphate carboxylase (4.1.1.39)

Definitions

  • the present invention relates to a process for producing ribulose-l, 5-biphosphate carboxylase-oxygenase, also called Rubisco, from a plant biomass.
  • Rubisco is a plant enzyme involved in the Calvin cycle and more particularly in the binding of carbon dioxide.
  • Rubisco located in chloroplasts, is one of the most abundant proteins in plant biomass and even the most abundant on earth. This enzyme is involved in the process of photosynthesis and carries two enzymatic activities: i) a carboxylase activity during which Rubisco fixes a CO2 on D-ribulose-l, 5-diphosphate to form two molecules of 3-phospho-D -glycerate, and ii) oxygenase activity during which Rubisco binds an O 2 molecule to D-ribulose-1,5-diphosphate to form 3-phospho-D-glycerate and 2-phosphoglycolate.
  • Rubisco is also renowned for its nutritional qualities and is low allergenic. Indeed, Rubisco contains an amino-gram equivalent to that of milk or egg proteins, which places it advantageously in front of other proteins of plant origin. In addition, various studies have highlighted the functional properties of Rubisco such as its emulsifying, foaming and gelling power, which, associated with good solubility, has aroused a strong interest in its use in new applications with high added value. .
  • patent application FR 2 819 685 describes a process for treating the green juice resulting from the pressing of a leaf material rich in proteins such as alfalfa, in order to recover therefrom products having a strong interest in food, in particular for humans.
  • This process comprises a) a separation step to obtain, on the one hand, a brown juice rich in proteins
  • cytoplasmic and, on the other hand, a fraction rich in particular in proteins, pigments, vitamins, insolubles and trace elements, then b) drying this fraction resulting from step a) to obtain a product rich in particular in proteins, vitamins and trace elements. elements.
  • this process it is then possible to subject the brown juice to a separation on resin in order to recover a decolored juice rich in proteins and a polyphenolic extract.
  • This process comprises a very large number of steps and is complex to implement. In addition, it does not allow access to pure Rubisco. Indeed, the juice obtained contains a mixture of different proteins, and polyphenols.
  • a liquid juice is obtained containing the Rubisco which is then subjected to a heat treatment at a temperature of 50 to 80 ° C to cause the coagulation of the protein which is then recovered, by for example by centrifugation or decantation of the juice, and filtration.
  • This process does not necessarily lead to pure Rubisco as the squeezed juice may contain other proteins.
  • the coagulation stage leads to the denaturation of the protein (s) present in the liquid juice, which can alter their functional properties.
  • the inventors have therefore set themselves the goal of providing a process for the production and purification of Rubisco which is both simple and economical to implement, transposable to an industrial scale, to lead to the production, with high yields, of a purified Rubisco whose functional properties are not altered.
  • the subject of the present invention is therefore a process for the production of purified Rubisco from plant biomass, said process comprising, in this order, at least the following stages:
  • step 2) a step of reconstituting a vegetable juice from the powder obtained in step 1), to lead to a reconstituted vegetable juice
  • step 3 a step of centrifugation of the reconstituted vegetable juice obtained above in step 2), to lead to a centrifuged juice and to a centrifugation pellet,
  • step 4) of chromatographic retention is carried out in a fixed bed or in an expanded bed or in a fluidized bed, in a chromatography column containing an ion exchange resin chosen from anionic hydrophilic resins containing functional groups chosen from tertiary amines and quaternary ammoniums, said resins comprising i) either a matrix of at least one crosslinked polymer, ii) or a composite matrix of silicon oxide and of at least one polyacrylic polymer.
  • an ion exchange resin chosen from anionic hydrophilic resins containing functional groups chosen from tertiary amines and quaternary ammoniums
  • the term “purified Rubisco” is understood to mean a Rubisco free from other macromolecules (analysis by SEC HPLC at 280 nm) but which may nevertheless be in the form of a mixture with compounds such as salts, water or other small molecules. In general, these small molecules are less than 1 kDa in size and cannot be called proteins. These small molecules ensure the stability and / or solubility of Rubisco. These other compounds represent from 1 to 5% by maximum mass relative to the total mass of Rubisco + other compounds. Thus, according to the invention, a purified Rubisco is a 95-99% pure Rubisco.
  • the anionic hydrophilic resins which can be used according to the process in accordance with the present invention may have variable pore diameters but preferably have a diameter sufficient to allow good diffusion of the Rubisco throughout the resin during chromatographic retention step 4). .
  • the pore diameter of the anionic hydrophilic resins is preferably between 20 and 100 nm approximately, and even more
  • the resins comprising a crosslinked polymer matrix are chosen from resins in which said crosslinked polymer is a polysaccharide, in particular a galactose polymer, very particularly agarose (or agar-agar ) or branched polymer of dextrose (glucose), most particularly dextran.
  • a galactose polymer very particularly agarose (or agar-agar ) or branched polymer of dextrose (glucose), most particularly dextran.
  • this type of resin makes it possible to lead to yields of purified Rubisco of the order of 20 to 40 g / L of resin used.
  • the resins mentioned in points a) and c) are very particularly preferred, these leading to yields of purified Rubisco of the order of 7 to 9 g, respectively of 4 to 6 g, of purified Rubisco. / L of resin used.
  • All the leafy plants producing Rubisco can be used as plant biomass according to the process of the invention.
  • the plant biomass used to obtain the green juice from step 1) can in particular come from a plant cultivated specifically to produce Rubisco, such as a fodder plant such as alfalfa, clover, ryegrass, sorghum forage, etc ...; a vegetable plant such as cabbage, spinach, salad; the tobacco ; a succulent plant; and more generally all plants having a high leaf / plant ratio.
  • alfalfa is very particularly preferred.
  • the process according to the invention opens, in this case, other outlets for the agricultural sectors.
  • Plant biomass can also be a co-product of an industry or a green waste. In this case, the process according to the invention allows material recovery from sectors already in place or makes it possible to develop new sectors (for example the recovery of grass clippings which can be recovered and constitute plant biomass).
  • the plant biomass containing Rubisco is preferably fresh biomass.
  • the biomass used in step 1) has just been collected or picked.
  • coarse pre-grinding may be useful before pressing.
  • Pressing is usually done in a screw press that operates continuously. At the end of the pressing, a vegetable juice is obtained which is a complex solution containing Rubisco and other compounds such as many polysaccharides and a solid residue (pressing cake) which can be upgraded, for example, by methanization or be used for animal feed.
  • the pH of the vegetable juice resulting from the pressing can be adjusted between 6.5 and 7.5 if necessary in order to ensure better stability of the Rubisco during the following steps of the process.
  • Dehydration step 1) can be carried out at a temperature ranging from 58 to 200 ° C approximately, preferably ranging from 60 to 150 ° C approximately, and particularly preferably ranging from 65 to 130 ° C approximately.
  • step 1) of dehydration is carried out at a temperature less than or equal to 140 ° C, and even more preferably at a temperature less than or equal to 120 ° C.
  • the total duration of dehydration step 1) is less than approximately 20 seconds.
  • Step 1) of dehydration of the vegetable juice can in particular be carried out by a process of drying by atomization, lyophilization or evapoconcentration.
  • step 1) of dehydration is carried out by spray drying.
  • This process consists in carrying out a nebulization or dispersion (also called atomization) of the vegetable juice in liquid droplets which are brought into contact with a current of hot air which provides the energy necessary for the evaporation and transport of the solvent.
  • a nebulization or dispersion also called atomization
  • a large number of non-independent parameters influence the properties of the dry powder, in particular, variables related to the drying process and variables related to the formulation or to the
  • composition of the liquid charge is a composition of the liquid charge.
  • step 1) of dehydration is carried out by spray drying at an inlet temperature into the atomizer (first temperature) ranging from 110 to less than approximately 200 ° C, from particularly preferably at an inlet temperature ranging from 120 to 150 ° C approximately, and more particularly preferably at an inlet temperature ranging from 120 to 130 ° C approximately; followed by spray drying at an atomizer outlet temperature (second temperature) ranging from approximately 58 to 95 ° C, particularly preferably at a second temperature ranging from approximately 60 to 75 ° C, and more particularly preferred at a second temperature ranging from 65 to 75 ° C approximately.
  • first temperature inlet temperature into the atomizer
  • the duration of exposure to the inlet temperature is less than or equal to 2 seconds and the total duration of the dehydration step.
  • dehydration is less than about 15 seconds. Even more preferably, the exposure time to the input temperature varies from l / 10th of a second to 1 second and the total duration of the dehydration step is less than approximately 12 seconds.
  • the process can for example be carried out in a laboratory atomizer-dryer such as the device sold under the trade name Mini Büchi Spray-Dryer B-290 by the company Büchi or in a pilot atomizer dryer sold under the trade name Niro Minor SD 2 by the company GEA.
  • the dryer can have an inlet temperature corresponding to the first temperature as defined in the invention, and an outlet temperature corresponding to the second temperature as defined in 'invention.
  • step 1) of dehydration carried out under the conditions mentioned above guarantees the stability of the Rubisco and facilitates storage by reducing the volume. It is thus possible to store the dried juices to overcome the periods of harvesting plant biomass and better distribute the production of Rubisco throughout the year.
  • this dehydration step 1) has a positive effect on the progress of the subsequent chromatographic retention step 4). It is also possible to mix powders from different juices (different batches, different plant origin, etc.).
  • Step 2) of reconstituting a vegetable juice can be carried out by adding water or a solution making it possible to adjust the pH or the salinity of the juice if necessary.
  • the volume of water or solution added to the powder (dehydrated vegetable juice) during step 2) is preferably equal to the volume of the vegetable juice resulting from the pressing of the vegetable biomass before its dehydration.
  • Step 3 of centrifugation of the reconstituted vegetable juice is
  • the duration of centrifugation step 3) can vary from approximately 15 to 25 minutes.
  • Centrifugation step 3 is preferably carried out at a
  • step 3 a centrifuged green juice is obtained which contains very few particles and a centrifugation pellet which can itself also be upgraded, for example, by methanization or be used for animal feed.
  • step 3) of centrifugation makes it possible to eliminate the fine particles present in suspension in the reconstituted liquid vegetable juice which will then be used in step 4) of chromatographic retention.
  • the method may further comprise, before performing step 1) of
  • a step of prior centrifugation of the vegetable juice resulting from the pressing of a vegetable biomass containing Rubisco is preferably carried out under the same conditions as those defined above for step 3) to lead to a previously centrifuged juice which is then used in step 1) of
  • chromatographic retention step 4 comprises, in this order, the following sub-steps:
  • Sub-step 4a) allows the preparation of the ion exchange resin before its use in the chromatography column.
  • the buffer solution used during this sub-step 4a) is preferably a phosphate buffer solution having a pH of approximately 6.0 ⁇ 0.2.
  • the resin is preferably equilibrated with said buffer used for the washes.
  • the buffer serving for equilibration can for example be introduced into the chromatography column with a feed rate of approximately 10 mL / min.
  • the duration of the sub-step 4a) of rinsing and equilibration of the resin is preferably at least one hour.
  • the purpose of the fixing sub-step 4b) (also called the loading step) is to fix the molecule of interest, here Rubisco, on the resin. This step also results in the binding of other molecules present in the centrifuged vegetable juice (in particular of proteins other than Rubisco, of polysaccharides, of polyphenols, etc.).
  • Sub-step 4b) is preferably carried out at a pH of between 6.0 and 8.0 ⁇ 0.2, and even more preferably between 6.0 and 7.5 ⁇ 0.2.
  • the supply of the column with the centrifuged vegetable juice can be carried out in ascending or descending mode.
  • the flow can be controlled, for example using a peristaltic pump or a diaphragm pump.
  • the feed rate can vary from approximately 80 mL / min to approximately 200 mL / min.
  • the superficial feed rate preferably varies from 0.2 cm / min to approximately 2 cm / min.
  • Sub-step 4b) leads to the recovery of a vegetable juice depleted in Rubisco, which is eliminated or upgraded according to its protein content, the Rubisco remaining fixed on the ion exchange resin.
  • the washing sub-step 4c) makes it possible to remove from the column the remains of the centrifuged vegetable juice.
  • the elution step 5 using a saline solution, makes it possible to recover the Rubisco fixed on the resin, then, once the Rubisco is recovered, to clean the resin for a new later use.
  • This elution step 5) is preferably carried out using a saline solution (ion Na, K, Br, sulfate, Mg, etc.), and in particular a solution of NaCl, for example at 0.5 mol / L, which allows all of the Rubisco fixed on the resin to be eluted.
  • a saline solution ion Na, K, Br, sulfate, Mg, etc.
  • NaCl for example at 0.5 mol / L, which allows all of the Rubisco fixed on the resin to be eluted.
  • isoelectric of the Rubisco can also be used.
  • a gradient or steps of concentration can also be used.
  • the surface speed of the saline solution preferably varies from 0.1 to 1.5 cm / min approximately and even more
  • conditioning step 6) makes it possible to lower the salt content of the Rubisco saline solution obtained at the end of elution step 5) and, if necessary, to modify the nature of the salt (by example replacing sodium with potassium in order to make it more compatible with certain uses such as in the case of a diet low in sodium).
  • Stage 6) of conditioning also allows post-purification of the solution. Indeed, at the end of this step, a saline solution (low salinity: of the order of 20 to 100 mM) of purified Rubisco is obtained, as well as a saline solution containing impurities.
  • conditioning step 6) can be carried out by size exclusion chromatography or by ultrafiltration in mode.
  • step 6) of conditioning is carried out by ultrafiltration in diafiltration mode using a replacement solution for the elution solution (for example a 50 mM or 100 mM phosphate buffer).
  • a replacement solution for the elution solution for example a 50 mM or 100 mM phosphate buffer.
  • This ultrafiltration technique is preferred to size exclusion chromatography because it is easy to transpose to an industrial scale and also makes it possible to concentrate the purified Rubisco solution.
  • Ultrafiltration in diafiltration mode can in particular be carried out in stirred cells (Amicon® for example) using a polyethersulfone (PES) membrane having a cutting diameter of 300 kDa and at a working pressure of 0.5 to 1, Approx. 1 bar, or using tangential filtration cartridges.
  • the purified Rubisco solution has a salt concentration of 3 to 7 g / L, and even more preferably of approximately 4 to 6 g / L. This solution can be used directly or it can be stored.
  • the method according to the present invention then preferably comprises an additional step 7) of dehydration of said solution.
  • This dehydration step 7) is preferably carried out by spray drying at an outlet temperature ranging from 65 to 75 ° C. This step 7) can therefore be carried out under the same conditions as those applied during step 1 and as described above.
  • a purified Rubisco powder is then obtained, with a water content between 4 and 10% by mass, preferably between 4% and 6%, which can be stored more easily.
  • step 1) of spray-drying the vegetable juice makes it possible to obtain a dried vegetable juice which keeps very well over a long period, which makes it possible to make the flow of vegetable juice usable in the process independent from that of biomass , the latter being seasonal and highly variable, in particular because of climatic conditions,
  • animal feed production channels for example concentrated extracts of alfalfa
  • the process (materials and chemicals) can be compatible with the food, cosmetic or pharmaceutical fields.
  • FIG. 1 shows photos of fresh alfalfa juice (Figure la) and spray dried alfalfa juice ( Figure lb).
  • FIG. 2 shows a diagram of a separation device
  • FIG. 3 represents the elution curve of Rubisco isolated in step 5) of example 1.
  • concentration of Rubisco in the fraction collected (in g / L) depends on the elution volume (in L).
  • t R is the retention time of the protein on the column, characteristic of the affinity of the protein by the support.
  • FIG. 4 represents a diagram of the ultrafiltration device used during step 6) for conditioning the Rubisco saline solution prepared in Example 1.
  • FIG. 5 represents the chromatograms obtained by HPCL-SEC of the initial Rubisco solution before ultrafiltration, of the first sample of the permeate and of the retentate obtained at the end of the ultrafiltration for the experiment of step 6) of Example 1 .
  • FIG. 6 represents the elution curves of Rubisco on a column containing a Q Sepharose ® Fast Flow resin (FIG. 6a), a column containing a Capto Q Impress ® resin (figure 6b) or a column containing an ANX Sepharose ® 4 Fast Flow resin (figure 6c).
  • a purified Rubisco solution was prepared from a plant biomass derived from a dark green spring alfalfa with short, thin stems, without flowers, and a high leaf / stem ratio.
  • alfalfa vegetable juice was prepared as follows.
  • the fresh alfalfa (leaves and stems) was pre-crushed using an electric grinder with an automatic drive cutting system (AXT 25 TC, Bosch) in order to reduce the size of the stems to a length of approximately 5 to 10 cm.
  • AXT 25 TC automatic drive cutting system
  • the pre-crushed alfalfa was then pressed using a screw press manufactured by FEMAG Industries, with a maximum capacity of 100 kg / h.
  • the press is made up of three main bodies: the feed hopper, the screw, and the outlet fitted with a shutter.
  • An electrical box is used to adjust the operating parameters and a container is used to collect the juices produced.
  • the set is made of stainless steel.
  • the adjustable operating frequency (15 to 60 Hz) determines the speed of rotation of the screw.
  • the pre-crushed alfalfa was weighed (79.6 kg) and then introduced into the press through the feed hopper.
  • the frequency of rotation of the screw was set at 25 Hz (ie 12 revolutions / min.).
  • the alfalfa vegetable juice obtained above was then dried by a spray drying process using a Niro Minor SD2 spray dryer from the company GEA with a capacity of 4 L / h at a speed of treatment of 1 L / h.
  • the atomization conditions were set to have an inlet temperature of 120 ° C and an outlet temperature of 70 ⁇ 1 ° C.
  • the dried alfalfa vegetable juice (Figure la) (powder with a residual water content of 6% by mass, Figure lb) was stored at -20 ° C.
  • the powder of dehydrated alfalfa vegetable juice obtained above in the previous step was used to obtain a reconstituted alfalfa vegetable juice by adding a sodium carbonate solution in order to adjust its pH to 7 , 5, respecting the dry matter content determined in the starting juice, ie 7.2 ⁇ 0.3%.
  • the reconstituted alfalfa vegetable juice obtained above in the previous step was then centrifuged at a speed of 6000 revolutions / min for 20 minutes at a temperature of 4 ° C.
  • the centrifuged juice thus obtained had a pH of 7.5.
  • the Rubisco concentration of the juice thus obtained was determined by HPLC SEC, with a Shodex KW-804 column, exclusion limit 10 6 Da and UV-Vis detector at 280 nm.
  • the mobile phase is a phosphate buffer solution at pH 6.8 and at a flow rate of 1 mL / min. Data acquisition as well that the results are processed by the UNICORN 5.1® software (Cityva).
  • the Rubisco concentration of this juice was 4.1 g / L.
  • the conductivity of the juice was 12.1 mS / cm.
  • the centrifuged juice thus obtained was then used in the next chromatographic retention step.
  • the chromatographic retention was carried out using the ANX Sepharose® 4 Fast Flow resin manufactured by the company Cityva on the chromatographic separation device shown in FIG. 2 attached.
  • This device 1 comprises a chromatography column 2 sold under the trade name Resolute FM 40 by the company Pal I, with an internal diameter of 140 mm containing the resin 3 and said column 2 being equipped with an adapter (not shown) allowing to adjust the height of the bed of resin 3 during the filling of column 2.
  • Column 2 is supplied in ascending (or possibly descending) mode using pumps 4 and 4 '(membrane pump 4 for the feeding of the reconstituted vegetable juice centrifuged and peristaltic pump 4 'for feeding other solutions).
  • the device 1 also comprises a first reservoir 5 containing
  • Valves 9 and 9 ' are arranged downstream of the two reservoirs 5 and 7 and upstream of the pumps 4 and 4'.
  • the valves 9 and 9 ' make it possible to successively introduce into column 2 the equilibration solution 6a, the centrifuged vegetable juice to be treated 8, the washing water 6b and the eluting saline solution 6c.
  • Valves 10 and 10 'located respectively downstream of pumps 4 and 4' and upstream of column 2 make it possible, if necessary, to isolate column 2. At the outlet of column 2, the fractions are collected at the using a fraction collector 11.
  • Table 1 summarizes the main characteristics of the fixed bed, the operating conditions and the parameters of the chromatographic separation device 1 used.
  • column 2 was washed with demineralized water, until the conductivity of the water at the outlet of the column 2 is very weak and stable.
  • a saline solution of elution 6c consisting of a sodium chloride solution of concentration 0.5 mol / L, was used to proceed with the elution of the Rubisco fixed on the resin 3.
  • the elution step was carried out using 6000 mL of this sodium chloride solution, and with a flow rate of 32.3 mL / min, which corresponds to a surface speed of 0.21 cm / min.
  • the total elution time was 186 minutes.
  • the Rubisco elution curve is given in Figure 3 attached.
  • the concentration of Rubisco in the fraction collected (in g / L) is a function of the elution volume (in L).
  • the concentration of Rubisco in the eluting solution is determined by HPLC SEC.
  • t R is the chromatographic retention time.
  • the conditioning of the Rubisco saline solution obtained above in the previous step was carried out by ultrafiltration in diafiltration mode using an Amicon ® 8400 stirred cell (Merck-Millipore) with a volume of 400 mL , said cell being equipped with a polyethersulfone (PES) membrane, compatible with the production of drinking water, with a cutting diameter of 300 kD (cutoff threshold), said membrane being sold under the reference PBMK by the company Merck-Millipore.
  • the area of the membrane was 41.8 cm 2 .
  • the operating mode of Amicon® cells is a frontal flow mode (perpendicular to the membrane), which thanks to the
  • agitation mechanism seeks to approximate the conditions of a
  • This device 12 comprises a pressurized tank 13 with a capacity of 5 L (Sartorius, France) containing the solution of
  • a valve 16 makes it possible to adjust the pressure of the compressed air 15, the latter being measured using a manometer 17 located downstream of the valve 16.
  • the mass of the permeate 18 at the outlet of the cell 14 is measured over time and monitored by an electronic balance 19 (Sartorius 1500S, France), connected to a data acquisition system 20.
  • the filtration cell 14 is composed of a support 14a which maintains the membrane (not
  • the Rubisco saline solution was pre-filtered using a 0.45 ⁇ m filter.
  • the system was filled with water ultra-pure thanks to the pressurized reservoir 13, and a high pressure (at least 0.1 bar in addition to the transmembrane pressure which will be applied) was maintained for 10 minutes in order to compact the membrane and to properly moisten the pores.
  • the initial Rubisco content of the saline solution was first measured by size exclusion chromatography (HPLC-SEC) using an ATKA Purifier high pressure chromatograph (Cityva), with a KW- column. 804 (Shodex) and Unicom 5.1 data acquisition software.
  • the initial Rubisco content of the saline solution was 16.5 g / L.
  • the filtration cell 14 was completely filled with the Rubisco saline solution obtained above in the previous step.
  • a volume of 4 L of 50 mmol / L phosphate buffer solution at pH 7.5 was placed in the pressurized tank 13. Once the assembly was carried out, the filtration cell 14 was stirred at 1200 revolutions / min and a 0.7 bar pressure was applied to the filtration device using the valve 16 making it possible to adjust the pressure of the compressed air 15. This pressure was kept constant throughout the ultrafiltration step.
  • the mass of permeate 18 recovered was monitored by the data acquisition system 20 throughout the duration of the ultrafiltration.
  • the concentration of purified Rubisco in the retentate was 15.4 g / L, which corresponds to a very low loss rate of 6.4%.
  • the absorbance at 280 nm is a function of the volume (mL).
  • the curve in long and broken lines (highest curve)
  • the curve in short and broken lines corresponds to the first sample of the permeate and the curve in solid line corresponds to the retentate.
  • the ultrafiltration step makes it possible not only to condition the Rubisco saline solution obtained above in the previous step with the aim of replacing NaCl with a phosphate buffer, but also to carry out a post-purification of Rubisco (disappearance of the peaks located between 11 and 15 mL on the chromatograph corresponding to the retentate compared to the two other curves corresponding respectively to the initial Rubisco solution before ultrafiltration and to the first sample of the permeate.
  • a solution of Rubisco purified from a plant biomass obtained from alfalfa was also prepared according to the various stages as detailed above in Example 1, but replacing the ANX Sepharose® 4 Fast resin.
  • Flow used in Example 1 by the anionic resins Q Sepharose® Fast Flow and Capto Q Impress® sold by the company Cityva, which can also be used according to the process of the invention.
  • the column used was an XK type column 16/20 having an internal diameter of 16 mm (Cityva).
  • the preparation was also carried out using the ANX Sepharose® 4 Fast Flow resin used in Example 1.
  • Co is the initial concentration of Rubisco in the centrifuged reconstituted alfalfa juice.
  • Example 3 Charging the Rubisco with ion exchanging resins of various matrices
  • the column used was an XK 16/20 type column having an internal diameter of 16 mm (Cityva).
  • Co is the initial concentration of Rubisco in the centrifuged alfalfa juice.
  • Example 4 Dehydration step 1): Atomization of alfalfa water at different inlet temperatures of the atomizer
  • the juices were stored as they were produced in a refrigerated tank at 4 ° C until the end of production. The juices were then transferred into flasks and then stored at 4 ° C. until the moment of drying (between 1 and 3 days). As can be seen in Table 9 above, the two juices produced had very similar characteristics, knowing that there is a natural variability linked to the raw material. Spray drying tests were then carried out.
  • the equipment used for the tests is a Niro Minor SD2 atomiser-dryer from GEA with a capacity of 4 L / h.
  • second temperature of step 1 of dehydration.
  • the obtained powder was stored at -20 ° C.
  • the powder obtained after drying was reconstituted in ultra pure water, at a dry matter content value equal to that of the juice before atomization (see Table 9).
  • the reconstituted juice was then centrifuged at 6000 rpm. at 4 ° C for 20 min. and analyzed by HPLC-SEC at 280 nm, under the same conditions as those of Example 1, in order to determine its Rubisco concentration.
  • the effect of atomization temperature on the concentration of Rubisco in the reconstituted juice was studied.
  • Table 11 below presents a summary of the results obtained by material balance in terms of mass of juice and mass of Rubisco obtained after atomization, relative to the quantities which were treated.
  • inlet temperature of the atomizer is less than 200 ° C, and even more preferably less than 140 ° C. a very particularly suitable temperature is 120 ° C as in Examples 1 and 2 above.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention est relative à un procédé de production de la ribulose-1,5-biphosphate carboxylase-oxygénase, également dénommée Rubisco, à partir d'une biomasse végétale, ledit procédé comportant notamment une étape de séparation chromatographique de la Rubisco sur une résine échangeuse d'ions.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION DE LA RUBISCO A PARTIR D’UNE BIOMASSE VÉGÉTALE
La présente invention est relative à un procédé de production de la ribulose-l,5-biphosphate carboxylase-oxygénase, également dénommée Rubisco, à partir d'une biomasse végétale.
La Rubisco est une enzyme végétale impliquée dans le cycle de Calvin et plus particulièrement dans la fixation du dioxyde de carbone. La Rubisco, située dans les chloroplastes, est une protéine parmi les plus abondantes dans la biomasse végétale et même la plus abondante sur terre. Cette enzyme est impliquée dans le processus de photosynthèse et porte deux activités enzymatiques : i) une activité carboxylase au cours de laquelle la Rubisco fixe un CO2 sur le D-ribulose-l,5-diphosphate pour former deux molécules de 3- phospho-D-glycérate, et ii) une activité oxygénase au cours de laquelle la Rubisco fixe une molécule d'02 sur le D-ribulose-l,5-diphosphate pour former du 3-phospho-D-glycérate et du 2-phosphoglycolate. Elle est ainsi présente dans la plupart des organismes autotrophes qu'il s'agisse des procaryotes ou d'organismes plus développés comme les algues ou les plantes supérieures. Chez les eucaryotes, la Rubisco est située dans les chloroplastes, organite présent dans le cytoplasme des organismes photosynthétiques et qui contient la chlorophylle et d'autres molécules nécessaires à la fonction
photosynthétique.
En plus de son importance du point de vue biologique, la Rubisco est aussi réputée pour ses qualités nutritionnelles et est peu allergène. En effet, la Rubisco contient un amino-gramme équivalent à celui des protéines du lait ou de l'œuf, ce qui la positionne avantageusement devant les autres protéines d'origine végétale. De plus, différentes études ont mis en évidence les propriétés fonctionnelles de la Rubisco telles que son pouvoir émulsifiant, moussant et gélifiant, ce qui, associé à une bonne solubilité, a éveillé un fort intérêt pour son usage dans de nouvelles applications à haute valeur ajoutée.
Dans ce contexte, la mise en place de procédés permettant la séparation et la purification de la Rubisco représente un enjeu économique et sociétal évident. Comme pour la plupart des protéines, les diverses
méthodologies proposées jusqu'à présent ont permis l'obtention de produits de différentes qualités en fonction principalement du degré de pureté attendu pour les applications envisagées.
Ainsi, la demande de brevet FR 2 819 685 décrit un procédé pour traiter le jus vert issus du pressage d'une matière foliaire riche en protéines telle que la luzerne, pour en récupérer des produits ayant un fort intérêt en alimentation, notamment humaine. Ce procédé comprend a) une étape de séparation pour obtenir, d'une part, un jus brun riche en protéines
cytoplasmiques et, d'autre part, une fraction riche notamment en protéines, pigments, vitamines, insolubles et oligoéléments, puis b) séchage de cette fraction issue de l'étape a) pour obtenir un produit riche notamment en protéines, vitamines et oligo-éléments. Selon ce procédé, il est ensuite possible de soumettre le jus brun à une séparation sur résine afin de récupérer un jus décoloré riche en protéines et un extrait polyphénolique. Ce procédé comprend de très nombreuses étapes et est complexe à mettre en œuvre. De plus, il ne permet pas d'accéder à de la Rubisco pure. En effet, le jus obtenu contient un mélange de différentes protéines, et des polyphénols.
La demande internationale WO 2011/078671 décrit un procédé pour isoler de la Rubisco dépourvue de chlorophylle à partir d'un matériel végétal comprenant des cellules végétales intactes renfermant de la Rubisco et de la chlorophylle, consistant à provoquer la lyse du matériel végétal par exemple par pressage mécanique afin de libérer la Rubisco et la chlorophylle contenues dans les cellules végétales, puis après séparation du jus liquide et du gâteau de pressage, à mettre en contact le jus liquide avec du charbon actif pour adsorber la chlorophylle. Après élimination du charbon actif sur lequel est adsorbé la chlorophylle, on obtient un jus liquide contenant la Rubisco qui est ensuite soumis à un traitement thermique à une température de 50 à 80°C pour provoquer la coagulation de la protéine qui est ensuite récupérée, par exemple par centrifugation ou décantation du jus, et filtration. Ce procédé ne conduit pas nécessairement à de la Rubisco pure dans la mesure où le jus pressé peut renfermer d'autres protéines. Par ailleurs, l'étape de coagulation conduit à la dénaturation de la ou des protéines présentes dans le jus liquide, ce qui peut altérer leurs propriétés fonctionnelles.
La demande internationale WO 2012/150421 décrit un procédé de préparation d'un extrait protéique de luzerne à partir des feuilles de la luzerne, comprenant une étape préalable de défibrage des feuilles de luzerne fraîche dans une extrudeuse, et une étape d'hydrolyse enzymatique. L'extrait de luzerne ainsi obtenu présente une teneur en protéines supérieure à 50 % en poids de matière de l'extrait, une teneur en chlorophylle inférieure à 10 % de sa teneur initiale dans la luzerne, exprimée en poids de matière de l'extrait, et une teneur en saponines et en phytates inférieure à 10 % de leur teneur initiale dans la luzerne, exprimée en poids de matière de l'extrait. Ainsi encore, le procédé proposé ne permet pas d'accéder à de la Rubisco pure. De plus, l'utilisation d'une étape d'hydrolyse enzymatique peut entraîner des modifications de la structure des protéines et donc en altérer les propriétés fonctionnelles.
Enfin, il a également déjà été proposé un procédé de
séparation/purification de la Rubisco par chromatographie échangeuse d'ions sur résine à partir d'un jus de luzerne (Thèse de Syrine Kerfai, mars 2011, INSA Toulouse, « Etude d'un procédé chromatographique d'échange d'ions pour la séparation de la ribulose 1,5-biphosphate carboxylase oxygénase (Rubisco) dans le cade de la valorisation d'un sous-produit agricole »). Selon ce procédé, un jus issu du pressage de feuilles de luzerne est déshydraté, puis reconstitué avec de l'eau et centrifugé avant d'être mis en contact avec une résine anionique se présentant sous la forme d'une matrice composite comprenant de l'oxyde de Zr et un polymère d'acrylate et ayant comme ligand une amine quaternaire (Résine Q Hyper Z ® commercialisée par la société Pal I) . La chromatographie a été réalisée en lit fixe et en lit expansé. Ce procédé implique l'utilisation d'une résine dont la compatibilité chimique et économique avec le secteur alimentaire n'est pas satisfaisante.
A ce jour, il n'existe donc toujours aucun procédé qui permettrait la production de la Rubisco à une échelle industrielle et malgré ses propriétés fonctionnelles, cette protéine n'a jamais été utilisée dans les marchés ciblés faute d'une filière de production adaptée et rentable.
Les inventeurs se sont donc donnés pour but de pourvoir à un procédé de production et de purification de la Rubisco qui soit à la fois simple et économique à mettre en œuvre, transposable à l'échelle industrielle, pour conduire à l'obtention, avec de forts rendements, d'une Rubisco purifiée et dont les propriétés fonctionnelles ne sont pas altérées.
Ces buts sont atteints par le procédé qui fait l'objet de la présente invention et qui va être décrit ci-après.
La présente invention a donc pour objet un procédé de production de Rubisco purifiée à partir d'une biomasse végétale, ledit procédé comprenant, dans cet ordre, au moins les étapes suivantes :
1) une étape de déshydratation d'un jus végétal issu du pressage d'une biomasse végétale contenant de la Rubisco, pour obtenir une poudre dudit jus végétal déshydraté,
2) une étape de reconstitution d'un jus végétal à partir de la poudre obtenue à l'étape 1), pour conduire à un jus végétal reconstitué,
3) une étape de centrifugation du jus végétal reconstitué obtenu ci-dessus à l'étape 2), pour conduire à un jus centrifugé et à un culot de centrifugation,
4) une étape de rétention chromatographique de la Rubisco contenue dans le jus centrifugé obtenu ci-dessus à l'étape 3), sur une résine échangeuse d'ions,
5) une étape d'élution de la Rubisco fixée sur la résine à l'aide d'une solution saline, pour obtenir une solution saline comprenant de la Rubisco,
6) une étape de conditionnement de la solution saline de Rubisco obtenue ci- dessus à l'étape 5) à l'aide d'une solution de conditionnement, pour conduire à une solution de Rubisco purifiée,
ledit procédé étant caractérisé en ce que :
- l'étape 1) de déshydratation est réalisée à une température inférieure ou égale à 200°C environ,
- l'étape 4) de rétention chromatographique est réalisée en lit fixe ou en lit expansé ou en lit fluidisé, dans une colonne de chromatographie contenant une résine échangeuse d'ions choisie parmi les résines hydrophiles anioniques contenant des groupements fonctionnels choisis parmi les amines tertiaires et les ammoniums quaternaires, lesdites résines comportant i) soit une matrice d'au moins un polymère réticulé, ii) soit une matrice composite d'oxyde de silicium et d'au moins un polymère polyacrylique.
Selon l'invention, on entend par Rubisco purifiée, une Rubisco libre d'autres macromolécules (analyse par HPLC SEC à 280 nm) mais pouvant se présenter néanmoins sous la forme d'un mélange avec des composés tels que des sels, de l'eau ou d'autres petites molécules. En général, ces petites molécules ont une taille inférieure à 1 kDa et ne peuvent être qualifiées de protéines. Ces petites molécules assurent la stabilité et/ou la solubilité de la Rubisco. Ces autres composés représentent de 1 à 5 % en masse maximum par rapport à la masse totale Rubisco + autres composés. Ainsi, selon l'invention, une Rubisco purifiée est une Rubisco pure à 95-99%.
Les résines hydrophiles anioniques utilisables selon le procédé conforme à la présente invention peuvent avoir des diamètres de pores variables mais ont préférentiellement un diamètre suffisant pour permettre la bonne diffusion de la Rubisco dans l'ensemble de la résine pendant l'étape 4) de rétention chromatographique.
Le diamètre des pores des résines hydrophiles anioniques est de préférence compris entre 20 et 100 nm environ, et encore plus
préférentiellement entre 50 et 100 nm environ, bornes incluses.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, les résines comportant une matrice de polymère réticulé sont choisies parmi les résines dans lesquelles ledit polymère réticulé est un polysaccharide, en particulier un polymère de galactose, tout particulièrement l'agarose (ou agar-agar) ou polymère ramifié de dextrose (glucose), tout particulièrement le dextrane. En effet, ce type de résine permet de conduire à des rendements en Rubisco purifiée de l'ordre de 20 à 40 g / L de résine utilisée. A titre d'exemples de telles résines, on peut notamment citer :
a) les résines d'agarose anioniques faibles et faiblement réticulées (taux de réticulation d'environ 4 %) comportant des fonctions amines tertiaires diéthylaminopropyle, telles qu'en particulier la résine ANX Sepharose® 4 Fast Flow fabriquée par la société Cityva (anciennement GE Healthcare),
b) les résines d'agarose anioniques fortes et faiblement réticulées (taux de réticulation d'environ 4 à 6 %) comportant des fonctions ammonium
quaternaire, telles qu'en particulier la résine Q Sepharose® Fast Flow fabriquée par la société Cityva,
c) les résines d'agarose anioniques fortes et fortement réticulées (taux de réticulation d'environ 6 à 7 %) comportant des fonctions ammonium
quaternaire, telles qu'en particulier la résine Capto Q Impress ® fabriquée par la société Cityva, et
d) les résines d'agarose et de dextrane anioniques fortes et fortement réticulées (taux de réticulation d'environ 6 à 7 %) comportant des fonctions ammonium quaternaire, telles qu'en particulier la résine Capto Q ® et la résine Streamline Q XL , toutes deux fabriquées par la société Cityva .
Parmi de telles résines, les résines mentionnées aux points a) et c) sont tout particulièrement préférées, celles-ci conduisant à des rendements en Rubisco purifiée de l'ordre de 7 à 9 g, respectivement de 4 à 6 g, de Rubisco purifiée / L de résine utilisée.
Parmi les résines à matrice composite d'oxyde de silicium et d'au moins un polymère polyacrylique, on peut notamment mentionner la résine vendue sous la dénomination commerciale Q Ceramic Hyper D ® par la société Pall.
Toutes les plantes à feuilles produisant de la Rubisco sont utilisables à titre de biomasse végétale selon le procédé de l'invention. La biomasse végétale utilisée pour obtenir le jus vert de l'étape 1) peut en particulier être issue d'une plante cultivée spécifiquement pour produire de la Rubisco telle qu'une plante fourragère comme la luzerne, le trèfle, le ray grass, le sorgho fourrager, etc... ; une plante potagère telle que le choux, l'épinard, la salade ; le tabac ; une plante grasse ; et plus généralement toutes plantes ayant un rapport feuilles/plante élevé. Parmi de telles plantes, la luzerne est tout particulièrement préférée. Le procédé conforme à l'invention ouvre, dans ce cas, d'autres débouchés pour les filières agricoles. La biomasse végétale peut également être un co-produit d'une industrie ou un déchet vert. Dans ce cas, le procédé conforme à l'invention permet une valorisation matière de filières déjà en place ou permet de développer de nouvelles filières (par exemple la valorisation des tontes de gazon qui peuvent être récupérées et constituer la biomasse végétale).
La biomasse végétale contenant de la Rubisco est de préférence de la biomasse fraîche. En d'autres termes, la biomasse utilisée dans l'étape 1) vient d'être ramassée ou cueillie.
Selon la nature de la biomasse végétale mise en œuvre, un pré broyage grossier peut être utile avant le pressage.
Le pressage est généralement effectué dans une presse à vis qui fonctionnent en continu. A la fin du pressage, on obtient un jus végétal qui est une solution complexe contenant de la Rubisco et d'autres composés tels que de nombreux polysaccharides et un résidu solide (tourteau de pressage) qui peut être valorisé, par exemple, par méthanisation ou être utilisé pour l'alimentation animale.
Juste avant la réalisation de l'étape 1), le pH du jus végétal issu du pressage peut être ajusté entre 6,5 et 7,5 si nécessaire afin d'assurer une meilleure stabilité de la Rubisco pendant les étapes suivantes du procédé.
L'étape 1) de déshydratation peut être effectuée à une température allant de 58 à 200°C environ, de préférence allant de 60 à 150°C environ, et de façon particulièrement préférée allant de 65 à 130°C environ.
Selon une forme de réalisation particulièrement préférée, l'étape 1) de déshydratation est effectuée à une température inférieure ou égale à 140°C, et encore plus préférentiellement à une température inférieure ou égale à 120°C.
Selon l'invention, la durée totale de l'étape 1) de déshydratation est inférieure à 20 secondes environ. L'étape 1) de déshydratation du jus végétal peut notamment être réalisée par un procédé de séchage par atomisation, lyophilisation ou évapoconcentration.
Selon une forme de réalisation préférée de la présente invention, l'étape 1) de déshydratation est réalisée par séchage par atomisation. Ce procédé consiste en réaliser une nébulisation ou dispersion (aussi appelée atomisation) du jus végétal en gouttelettes liquides qui sont mises en contact avec un courant d'air chaud qui apporte l'énergie nécessaire à l'évaporation et au transport du solvant. Un grand nombre de paramètres non indépendants influencent les propriétés de la poudre sèche, en particulier, des variables liées au procédé de séchage et des variables liées à la formulation ou à la
composition de la charge liquide.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'étape 1) de déshydratation est réalisée par séchage par atomisation à une température d'entrée dans l'atomiseur (première température) allant de 110 à moins de 200°C environ, de façon particulièrement préférée à une température d'entrée allant de 120 à 150°C environ, et de façon plus particulièrement préférée à une température d'entrée allant de 120 à 130°C environ ; suivi d'un séchage par atomisation à une température de sortie de l'atomiseur (deuxième température) allant de 58 à 95°C environ, de façon particulièrement préférée à une deuxième température allant de 60 à 75°C environ, et de façon plus particulièrement préférée à une deuxième température allant de 65 à 75°C environ. Cette forme de réalisation peut permettre d'éviter la dégradation des protéines formées telles que la Rubisco, et ainsi de préserver l'état natif de la Rubisco (notamment ses propriétés enzymatiques) et ses propriétés
fonctionnelles. De préférence, et lorsque l'étape 1) de déshydratation est réalisée par atomisation, la durée d'exposition à la température d'entrée est inférieure ou égale à 2 secondes et la durée totale de l'étape de
déshydratation est inférieure à 15 secondes environ. De façon encore plus préférentielle, la durée d'exposition à la température d'entrée varie de l/10ème de seconde à 1 seconde et la durée totale de l'étape de déshydratation est inférieure à 12 secondes environ. Lorsqu'un séchage par atomisation est effectué lors de l'étape 1), le procédé peut par exemple être réalisé dans un sécheur-atomiseur de laboratoire tel que le dispositif vendu sous la dénomination commerciale Mini Büchi Spray-Dryer B-290 par la société Büchi ou dans un sécheur-atomiseur pilote vendu sous la dénomination commerciale Niro Minor SD 2 par la société GEA.
Selon une forme de réalisation préférée du procédé de l'invention, le sécheur peut avoir une température d'entrée correspondant à la première température telle que définie dans l'invention, et une température de sortie correspondant à la deuxième température telle que définie dans l'invention.
Selon l'invention, l'étape 1) de déshydratation réalisée dans les conditions mentionnées ci-dessus garantie la stabilité de la Rubisco et facilite la conservation en réduisant le volume. Il est ainsi possible de stocker les jus séchés pour s'affranchir des périodes de récoltes de la biomasse végétale et mieux répartir tout au long de l'année la production de la Rubisco. De plus, cette étape 1) de déshydratation a un effet positif sur le déroulement de l'étape 4) ultérieure de rétention chromatographique. Il est aussi possible de mélanger des poudres issues de jus différents (différents lots, origine végétale différente...).
L'étape 2) de reconstitution d'un jus végétal peut être réalisée par ajout d'eau ou d'une solution permettant d'ajuster le pH ou la salinité du jus si besoin. Le volume d'eau ou de solution ajouté à la poudre (jus végétal déshydraté) lors de l'étape 2) est de préférence égal au volume du jus végétal issu du pressage de la biomasse végétale avant sa déshydratation.
L'étape 3) de centrifugation du jus végétal reconstitué est de
préférence réalisée à une vitesse de 4000 à 6000 tours/min, et encore plus particulièrement à 6000 tours/min.
La durée de l'étape 3) de centrifugation peut varier de 15 à 25 minutes environ.
L'étape 3) de centrifugation est de préférence réalisée à une
température de 1 à 4 °C environ. A la fin de l'étape 3) de centrifugation, on obtient un jus vert centrifugé qui contient très peu de particules et un culot de centrifugation qui peut être lui aussi valorisé, par exemple, par méthanisation ou être utilisé pour l'alimentation animale. Ainsi, l'étape 3) de centrifugation permet d'éliminer les fines particules présentes en suspension dans le jus végétal liquide reconstitué qui va ensuite être engagé dans l'étape 4) de rétention chromatographique.
Selon une forme de réalisation particulière de l'invention, le procédé peut comprendre en outre, avant la réalisation de l'étape 1) de
déshydratation, une étape de centrifugation préalable du jus végétal issu du pressage d'une biomasse végétale contenant de la Rubisco. Dans ce cas, ladite étape de centrifugation préalable est de préférence réalisée dans les mêmes conditions que celles définies ci-dessus pour l'étape 3) pour conduire à un jus préalablement centrifugé qui est ensuite engagé dans l'étape 1) de
déshydratation.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'étape 4) de rétention chromatographique comprend, dans cet ordre, les sous-étapes suivantes :
- une sous-étape 4a) de rinçage et d'équilibration de la résine échangeuse d'ions, à l'aide d'une solution tampon ayant un pH de 6 à 8,
- une sous-étape 4b) de fixation de la Rubisco contenue dans le jus végétal centrifugé, sur la résine présente dans la colonne de chromatographie, et
- une sous-étape 4c) de lavage de la colonne par de l'eau déminéralisée.
La sous-étape 4a) permet la préparation de la résine échangeuse d'ions avant son utilisation dans la colonne de chromatographie. La solution tampon utilisée lors de cette sous-étape 4a) est de préférence une solution de tampon phosphate ayant pH d'environ 6,0 ± 0,2. Lors de cette sous-étape 4a), la résine est de préférence équilibrée avec ledit tampon utilisé pour les lavages. De préférence, le tampon servant à l'équilibration peut par exemple être introduit dans la colonne de chromatographie avec un débit d'alimentation d'environ 10 mL/min. La durée de la sous-étape 4a) de rinçage et d'équilibration de la résine est de préférence d'au moins une heure.
La sous-étape 4b) de fixation (également appelée étape de charge) a pour objectif la fixation de la molécule d'intérêt, ici la Rubisco, sur la résine. Cette étape entraîne également la fixation d'autres molécules présentes dans le jus végétal centrifugé (notamment de protéines autres que la Rubisco, de polysaccharides, de polyphénols, etc...).
La sous-étape 4b) est de préférence réalisée à un pH compris entre 6,0 et 8,0 ± 0,2, et encore plus préférentiellement entre 6,0 et 7,5 ± 0,2.
Lors de la sous-étape 4b), l'alimentation de la colonne avec le jus végétal centrifugé peut être effectuée en mode ascendant ou descendant. Le débit peut être contrôlé, par exemple à l'aide d'une pompe péristaltique ou d'une pompe à membrane. Le débit d'alimentation peut varier de 80 mL/min à 200 mL/min environ. La vitesse superficielle d'alimentation varie de préférence de 0,2 cm/min à 2 cm/min environ.
La sous-étape 4b) conduit à la récupération d'un jus végétal appauvri en Rubisco, qui est éliminé ou valorisé selon sa teneur en protéine, la Rubisco restant fixée sur la résine échangeuse d'ions.
Une fois la sous-étape 4b) terminée, la sous-étape 4c) de lavage permet d'éliminer de la colonne les restes du jus végétal centrifugé.
L'étape d'élution 5) à l'aide d'une solution saline, permet de récupérer la Rubisco fixée sur la résine, puis, une fois que la Rubisco est récupérée, de nettoyer la résine pour une nouvelle utilisation ultérieure.
Cette étape d'élution 5) est de préférence réalisée à l'aide d'une solution saline (ion Na, K, Br, sulfate, Mg, etc...), et en particulier d'une solution de NaCI, par exemple à 0,5 mol/L, qui permet d'éluer la totalité de la Rubisco fixée sur la résine. D'autres solutions, de force ionique et/ou pH adéquats, en particulier des solutions ayant un pH inférieur au point
isoélectrique de la Rubisco, peuvent aussi être utilisées. L'utilisation, ensuite, d'une solution saline plus concentrée que la précédente, par exemple d'une solution de NaCI à 1 mol/L, permet de forcer l'élution d'autres molécules présentes sur la résine et nécessitant une force ionique plus importante pour les éliminer et permettre ainsi la réutilisation ultérieure de la colonne. Un gradient ou des paliers de concentration peuvent également être utilisés.
Lors de l'étape 5) d'élution, la vitesse superficielle de la solution saline varie de préférence de 0,1 à 1,5 cm/min environ et encore plus
préférentiellement de 0,5 à 1,5 cm/min environ.
Il n'est pas possible d'obtenir une solution de Rubisco pure dans l'eau car la présence de sel est indispensable pour solubiliser la Rubisco. Cependant, l'étape 6) de conditionnement permet d'abaisser la teneur en sel de la solution saline de Rubisco obtenue à l'issue de l'étape 5) d'élution et, si nécessaire, de modifier la nature du sel (par exemple remplacer le sodium par du potassium afin de le rendre plus compatible avec certains usages comme en cas de régime alimentaire pauvre en sodium). L'étape 6) de conditionnement permet également une post-purification de la solution. En effet, à la fin de cette étape, on obtient une solution saline (faible salinité : de l'ordre 20 à 100 mM) de Rubisco purifiée, ainsi qu'une solution saline contenant des impuretés.
Selon l'invention, l'étape 6) de conditionnement peut être réalisée par chromatographie d'exclusion de taille ou par ultrafiltration en mode
diafiltration. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'étape 6) de conditionnement est réalisée par ultrafiltration en mode diafiltration en utilisant une solution de remplacement de la solution d'élution (par exemple un tampon phosphate 50 mM ou 100 mM). Cette technique d'ultrafiltration est préférée à la chromatographie d'exclusion de taille car elle est facile à transposer à l'échelle industrielle et permet également de concentrer la solution de Rubisco purifiée.
L'ultrafiltration en mode diafiltration peut en particulier être réalisée en cellules agitées (Amicon® par exemple) en utilisant une membrane en polyéthersulfone (PES) ayant un diamètre de coupe de 300 kDa et à une pression de travail de 0,5 à 1,1 bars environ, ou bien à l'aide de cartouches de filtration tangentielle. A la fin de l'étape 6) de conditionnement, la solution de Rubisco purifiée présente une concentration en sel de 3 à 7 g/L, et encore plus préférentiellement de 4 à 6 g/L environ. Cette solution peut être utilisée directement ou bien être stockée.
Lorsque la solution de Rubisco purifiée doit être stockée, le procédé conforme à la présente invention comprend alors de préférence une étape 7) supplémentaire de déshydratation de ladite solution.
Cette étape 7) de déshydratation est de préférence réalisée par séchage par atomisation à une température de sortie allant de 65 à 75°C. Cette étape 7) peut donc être réalisée dans les mêmes conditions que celles appliquées lors de l'étape 1 et telles que décrites précédemment.
On obtient alors une poudre de Rubisco purifiée, avec une teneur en eau entre 4 et 10% en masse, préférablement entre 4% et 6%, qui peut être conservée plus aisément.
Ainsi le procédé conforme à l'invention et tel que décrit précédemment présentent les avantages suivants :
- il permet d'accéder à plusieurs grades de Rubisco purifiée, soit sous forme solide (poudre), soit sous forme d'une solution avec une concentration et une salinité contrôlées,
- il est réalisé en conditions douces, sans ajout de produits chimiques toxiques ou agressifs et n'entraine pas (ou pratiquement pas) d'altération thermique et/ou chimique de la Rubisco,
- il comprend peu d'étapes et met en œuvre peu de réactifs,
- il permet l'utilisation de biomasses variées selon leur période de
production/récolte,
- l'étape 1) de séchage par atomisation du jus végétal permet d'obtenir un jus végétal séché qui se conserve très bien sur une longue période ce qui permet de rendre indépendant le flux de jus végétal utilisable dans le procédé de celui de la biomasse, ce dernier étant saisonnier et fortement variable, notamment à cause des conditions climatiques,
- il met en œuvre des produits courants de faibles coûts avec une production de sous-produits pouvant en outre être valorisés (méthanisation, alimentation animale),
- il peut s'insérer dans des filières de production d'aliments pour les animaux (par exemple extraits concentrés de luzerne),
- il est possible de faire fonctionner le procédé en continu en utilisant deux ou plusieurs colonnes de chromatographie,
- le procédé (matériaux et produits chimiques) peut être compatible avec les domaines alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique.
Brève description des dessins
Les dessins annexés illustrent l'invention :
[Fig. 1] représente des photos du jus de luzerne frais (figure la) et du jus de luzerne séché par séchage par atomisation (figure lb).
[Fig. 2] représente un schéma d'un dispositif de séparation
chromatographique utilisable selon les étapes 4) et 5) du procédé conforme à l'invention.
[Fig. 3] représente la courbe d'élution de la Rubisco isolée à l'étape 5) de l'exemple 1. Sur cette figure, la concentration de la Rubisco dans la fraction collectée (en g/L) est fonction du volume d'élution (en L). Sur cette figure, tR est le temps de rétention de la protéine sur la colonne, caractéristique de l'affinité de la protéine par le support.
[Fig. 4] représente un schéma du dispositif d'ultrafiltration utilisé lors de l'étape 6) de conditionnement de la solution saline de Rubisco préparée dans l'exemple 1.
[Fig. 5] représente les chromatogrammes obtenus par HPCL-SEC de la solution initiale de Rubisco avant ultrafiltration, du premier prélèvement du perméat et du rétentat obtenu à la fin de l'ultrafiltration pour l'expérience de l'étape 6) de l'exemple 1.
[Fig. 6] représente les courbes d'élution de la Rubisco sur une colonne contenant une résine Q Sepharose ® Fast Flow (figure 6a), une colonne contenant une résine Capto Q Impress ® (figure 6b) ou une colonne contenant une résine ANX Sepharose ® 4 Fast Flow (figure 6c).
EXEMPLES
Exemple 1 : Production de Rubisco purifiée à partir de luzerne selon le procédé conforme à l'invention
Dans cet exemple, on a préparé une solution de Rubisco purifiée à partir d'une biomasse végétale issue d'une luzerne de printemps de couleur vert foncé comportant des tiges courtes et fines, sans fleurs, et un ratio feuilles/tiges élevé.
Préalablement à la réalisation de l'étape 1) de déshydratation, un jus végétal de luzerne a été préparé de la façon suivante.
La luzerne fraîche (feuilles et tiges) a été pré-broyée à l'aide d'un broyeur électrique avec un système de coupe à entraînement automatique (AXT 25 TC, Bosch) afin de réduire la taille des tiges à une longueur d'environ 5 à 10 cm.
La luzerne pré-broyée a ensuite été pressée à l'aide d'une presse à vis fabriquée par FEMAG Industries, d'une capacité maximale de 100 kg/h. La presse est constituée de trois corps principaux : la trémie d'alimentation, la vis, et la sortie munie d'un obturateur. Un boîtier électrique permet de régler les paramètres de fonctionnement et un bac permet la collecte des jus produits. L'ensemble est construit en acier inoxydable. La fréquence réglable de fonctionnement (de 15 à 60 Hz) détermine la vitesse de rotation de la vis.
Pour ce faire, la luzerne pré-broyée a été pesée (79,6 kg) puis introduite dans la presse par la trémie d'alimentation. La fréquence de rotation de la vis a été réglée à 25 Hz (soit 12 tours/min.).
Une fois la presse montée en pression, le liquide s'écoule dans la trémie de récupération du jus et un tourteau est formé en sortie, au niveau de l'obturateur. Le jus végétal de luzerne ainsi obtenu (41,8 kg ; rendement de production du jus : 52 %) a ensuite été stocké à 4°C immédiatement après pressage. Les caractéristiques du jus végétal de luzerne sont données ci-après :
- pH : 5,8 ± 0,1
- Conductivité : 8,4 ± 0,2 mS/cm
- Teneur en matière sèche : 7,2 ± 0,3 %
- Masse volumique 1025 à 1050 kg/m3
lj Etape de déshydratation par séchage par atomisation
Le jus végétal de luzerne obtenu ci-dessus a ensuite été séché par un procédé de séchage par atomisation à l'aide d'un sécheur-atomiseur Niro Minor SD2 de la société GEA d'une capacité de 4 L/h à une vitesse de traitement de 1 L/h. les conditions d'atomisation ont été fixées pour avoir une température d'entrée de 120°C et une température de sortie de 70 ± 1°C. Après atomisation, le jus végétal de luzerne (Figure la) séché (poudre avec une teneur en eau résiduelle de 6% en masse, Figure lb) a été conservé à - 20°C.
2) Etape de reconstitution du ius végétal de luzerne
Après atomisation, la poudre de jus végétal de luzerne déshydraté obtenu ci-dessus à l'étape précédente, a été utilisée pour obtenir un jus végétal de luzerne reconstitué par ajout d'une solution de carbonate de sodium afin d'ajuster son pH à 7,5, en respectant la teneur en matière sèche déterminée dans le jus de départ, soit 7,2 ± 0,3 %.
3) Etape de centrifugation du ius végétal de luzerne
Le jus végétal de luzerne reconstitué obtenu ci-dessus à l'étape précédente a ensuite été centrifugé à une vitesse de 6000 tours/min pendant 20 minutes à une température de 4°C.
Le jus centrifugé ainsi obtenu présentait un pH de 7,5.
La concentration en Rubisco du jus ainsi obtenu a été déterminée par HPLC SEC, avec une colonne Shodex KW-804, de limite d'exclusion 106 Da et détecteur UV-Vis à 280 nm. La phase mobile est une solution tampon phosphate à pH 6,8 et à un débit de 1 mL/min. L'acquisition de données ainsi que le traitement des résultats est effectué par le logiciel UNICORN 5.1® (Cityva). La concentration en Rubisco de ce jus était de 4,1 g/L.
La conductivité du jus était de 12,1 mS/cm.
Le jus centrifugé ainsi obtenu a ensuite été engagé dans l'étape suivante de rétention chromatographique.
4j Etape de rétention chromatoqraphique de la Rubisco
La rétention chromatographique a été réalisée en utilisant la résine ANX Sepharose® 4 Fast Flow fabriquée par la société Cityva sur le dispositif de séparation chromatographique représenté sur la figure 2 annexée. Ce dispositif 1 comprend une colonne de chromatographie 2 vendue sous la dénomination commerciale Resolute FM 40 par la société Pal I, d'un diamètre interne de 140 mm contenant la résine 3 et ladite colonne 2 étant équipée d'un adaptateur (non représenté) permettant d'ajuster la hauteur du lit de la résine 3 durant le remplissage de la colonne 2. La colonne 2 est alimentée en mode ascendant (ou éventuellement descendant) à l'aide des pompes 4 et 4' (pompe à membrane 4 pour l'alimentation du jus végétal reconstitué centrifugé et pompe péristaltique 4' pour l'alimentation d'autres solutions). Le dispositif 1 comprend également un premier réservoir 5 contenant
successivement un liquide 6, à savoir la solution d'équilibration 6a, l'eau de lavage 6b et la solution saline d'élution 6c, ainsi qu'un second réservoir 7 contenant le jus végétal centrifugé à traiter 8. Des vannes 9 et 9' sont disposées en aval des deux réservoirs 5 et 7 et en amont des pompes 4 et 4'. Les vannes 9 et 9' permettent d'introduire successivement dans la colonne 2 la solution d'équilibration 6a, le jus végétal centrifugé à traiter 8, l'eau de lavage 6b et la solution saline d'élution 6c. Des vannes 10 et 10' situées respectivement en aval des pompes 4 et 4' et en amont de la colonne 2 permettent d'assurer si besoin l'isolement de la colonne 2. En sortie de colonne 2, les fractions sont collectées à l'aide d'un collecteur de fractions 11.
Sur cette figure, le sens de circulation des liquides est indiqué par les flèches présentes sur les traits reliant les différents éléments du dispositif 1 sauf pour le lavage qui a lieu en flux descendant. La colonne 2 a été remplie par la résine 3 ANX Sepharose® 4 Fast Flow sur une hauteur de 15 cm environ.
Le tableau 1 ci-après résume les principales caractéristiques du lit fixe, les conditions opératoires et les paramètres du dispositif 1 de séparation chromatographique utilisé.
[Tableau 1 ]
Figure imgf000020_0001
La colonne 2 a d'abord été alimentée par une solution d'équilibrage 6a constituée d'une solution tampon phosphate à 100 mM et de pH 7,5. Le débit d'alimentation a été réglé à 166 mL/min à l'aide de la pompe à membrane 4, soit une vitesse superficielle de 1,08 cm/min.
La colonne 2 a ensuite été alimentée par le jus végétal de luzerne centrifugé à traiter 8 obtenu ci-dessus à l'étape précédente (28,55 L). Le débit d'alimentation a été réglé à 107,8 mL/min à l'aide de la pompe à membrane 4, soit une vitesse superficielle de 0,7 cm/min.
Une fois l'étape d'alimentation de la colonne 2 par le jus de luzerne centrifugé 8 terminée, la colonne 2 a été lavée par de l'eau déminéralisée, jusqu'à ce que la conductivité de l'eau à la sortie de la colonne 2 soit très faible et stable.
51 Etape d'élution de la Rubisco fixée sur la résine
Une solution saline d'élution 6c, constituée par une solution de chlorure de sodium de concentration 0,5 mol/L, a été utilisée pour procéder à l'élution de la Rubisco fixée sur la résine 3. L'étape d'élution a été réalisée en utilisant 6000 mL de cette solution de chlorure de sodium, et avec un débit de 32,3 mL/min, ce qui correspond à une vitesse superficielle de 0,21 cm/min. Le temps total d'élution a été de 186 minutes.
2000 mL d'une solution saline de Rubisco ont ainsi été récupérés.
La courbe d'élution de la Rubisco est donnée par la figure 3 annexée. Sur cette figure, la concentration de la Rubisco dans la fraction collectée (en g/L) est fonction du volume d'élution (en L). La concentration de Rubisco dans la solution d'élution est déterminée par HPLC SEC. Sur cette figure, tR est le temps de rétention chromatographique.
Le tableau 2 ci-après résume les résultats de charge et d'élution de la Rubisco.
[Tableau 2]
Figure imgf000021_0001
La colonne 2 a ensuite été nettoyée avec des solutions successives de chlorure de sodium de concentration de 1 et 2 mol/L, d'hydroxyde de sodium à 1 mol/L, d'acide acétique à 1 mol/L et d'éthanol à 70% (v/v).
61 Etape de conditionnement de la solution saline de Rubisco
Le conditionnement de la solution saline de Rubisco obtenue ci-dessus à l'étape précédente a été réalisé par ultrafiltration en mode diafiltration à l'aide d'une cellule Amicon ® 8400 à agitation (Merck-Millipore) d'un volume de 400 mL, ladite cellule étant équipée d'une membrane en polyéthersulfone (PES), compatible avec la production d'eau potable, de diamètre de coupe de 300 kD (seuil de coupure), ladite membrane étant vendue sous la référence PBMK par la société Merck-Millipore. La surface de la membrane était de 41,8 cm2.
Le mode de fonctionnement des cellules Amicon® est un mode d'écoulement frontal (perpendiculaire à la membrane), qui grâce au
mécanisme d'agitation, cherche à se rapprocher des conditions d'un
écoulement tangentiel.
Le dispositif d'ultrafiltration utilisé dans cette étape est représenté sur la figure 4 annexée. Ce dispositif 12 comprend un réservoir pressurisé 13 d'une capacité de 5 L (Sartorius, France) contenant la solution de
conditionnement et qui connecte la cellule Amicon® 8400 14 à un circuit d'air comprimé 15 et qui permet d'appliquer des pressions transmembranaires constantes. Une vanne 16 permet d'ajuster la pression de l'air comprimé 15, celle-ci étant mesurée à l'aide d'un manomètre 17 situé en aval de la vanne 16. La masse du perméat 18 en sortie de la cellule 14 est mesurée au cours du temps et suivie par une balance électronique 19 (Sartorius 1500S, France), connectée à un système d'acquisition de données 20. La cellule de filtration 14 est composée d'un support 14a qui maintient la membrane (non
représentée), de pièces raccordement (non représentées), d'un réservoir 14b contenant la solution saline de Rubisco à filtrer, d'un couvercle 14c
permettant l'entrée de la solution de conditionnement provenant du réservoir pressurisé 13 et d'un agitateur magnétique 14d. L'agitation (non représenté) minimise la formation d'une couche de polarisation et la dénaturation de la protéine éventuellement accumulée par cisaillement.
Avant l'étape d'ultrafiltration, la solution saline de Rubisco a été pré filtrée à l'aide d'un filtre de 0,45 pm.
Avant utilisation de la membrane de filtration, celle-ci a été rincée à l'eau et laissée dans l'eau pendant une nuit à une température de 4°C afin d'éliminer les restes de produits chimiques dans lesquels elle a été
conditionnée et d'humidifier les pores. Après installation de la membrane de filtration dans la cellule de filtration 14, le système a été rempli avec de l'eau ultra-pure grâce au réservoir pressurisé 13, et une forte pression (au moins 0,1 bar en plus de la pression transmembranaire qui va être appliquée) a été maintenue pendant 10 minutes afin de compacter la membrane et de bien humidifier les pores.
La teneur en Rubisco initiale de la solution saline a tout d'abord été mesurée par chromatographie d'exclusion de taille (HPLC-SEC) à l'aide d'un Chromatographe à haute pression ATKA Purifier (Cityva), avec une colonne KW-804 (Shodex) et un logiciel d'acquisition de données Unicom 5.1.
La teneur en Rubisco initiale de la solution saline était de 16,5 g/L.
Cette analyse permet également de connaître le profil
chromatographique global de la solution saline de Rubisco obtenue ci-dessus à l'étape précédente, caractérisé par la présence d'autres pics associés aux composés que l'on souhaite éliminer. Une comparaison des profils
chromatographiques de la solution saline de Rubisco avant sa filtration et des prélèvements de perméat, réalisés pendant l'étape d'ultrafiltration, a permis de suivre l'expérience et de vérifier la sélectivité de la membrane.
La cellule de filtration 14 a été complètement remplie par la solution saline de Rubisco obtenue ci-dessus à l'étape précédente. Un volume de 4 L de solution tampon phosphate 50 mmol/L à pH 7,5 a été placée dans le réservoir pressurisé 13. Une fois le montage effectué, la cellule de filtration 14 a été mise sous agitation à 1200 tours/min et une pression de 0,7 bar a été appliquée au dispositif de filtration à l'aide de la vanne 16 permettant d'ajuster la pression de l'air comprimé 15. Cette pression a été maintenue constante pendant toute l'étape d'ultrafiltration.
La masse de perméat 18 récupérée a été suivie par le système d'acquisition des données 20 durant toute la durée de l'ultrafiltration.
Une fraction de 0,5 mL du perméat a été prélevée au tout début de l'ultrafiltration, puis toutes les heures afin d'être analysée par HPLC-SEC.
L'ultrafiltration a été arrêtée lorsque l'analyse des prélèvements du perméat a indiqué qu'il n'y avait plus d'espèces extraites dans le perméat. La solution de Rubisco purifiée conditionnée contenue dans le réservoir 14b (rétentat) a été récupérée et une petite fraction a été utilisée pour analyse. La conservation de la solution de Rubisco purifiée conditionnée a été faite à une température de 4°C.
La concentration en Rubisco purifiée dans le rétentat était de 15,4 g/L, ce qui correspond à un taux de perte très faible de 6,4 %.
Les chromatogrammes obtenus par HPCL-SEC de la solution initiale de Rubisco avant ultrafiltration, du premier prélèvement du perméat et du rétentat obtenu à la fin de la filtration sont donnés sur la figure 5 annexée.
Sur cette figure, l'absorbance à 280 nm (en mAU) est fonction du volume (mL). La courbe en traits longs et discontinus (courbe la plus haute)
correspond à la solution initiale de Rubisco avant ultrafiltration, la courbe en traits courts et discontinus correspond au premier prélèvement du perméat et la courbe en trait continu correspond au rétentat.
Ces résultats montrent que l'étape d'ultrafiltration permet non seulement de conditionner la solution saline de Rubisco obtenue ci-dessus à l'étape précédente dans le but de remplacer NaCI par un tampon phosphate, mais également d'effectuer une post-purification de la Rubisco (disparition des pics situés entre 11 et 15 mL sur le chromatographe correspondant au rétentat par rapport aux deux autres courbes correspondant respectivement à la solution initiale de Rubisco avant ultrafiltration et au premier prélèvement du perméat.
Exemple 2 : Production de Rubisco purifiée à partir de luzerne selon le procédé conforme à l'invention
Dans cet exemple, on a également préparé une solution de Rubisco purifiée à partir d'une biomasse végétale issue de la luzerne selon les différentes étapes telles que détaillées ci-dessus à l'exemple 1, mais en remplaçant la résine ANX Sepharose® 4 Fast Flow utilisée à l'exemple 1, par les résines anioniques Q Sepharose ® Fast Flow et Capto Q Impress ® vendues par la société Cityva, également utilisables selon le procédé de l'invention. Dans cet exemple, la colonne utilisée était une colonne de type XK 16/20 ayant un diamètre interne de 16 mm (Cityva). A titre comparatif, on a également effectué la préparation en utilisant la résine ANX Sepharose® 4 Fast Flow utilisée à l'exemple 1.
Les conditions opératoires utilisées durant l'étape d'équilibration de la colonne de chromatographie sont données dans le Tableau 3 ci-après.
[Tableau 3]
Figure imgf000025_0001
Dans ce tableau Co est la concentration initiale en Rubisco dans le jus de luzerne reconstitué centrifugé.
Les conditions utilisées pour l'étape d'élution sont données dans le tableau 4 ci-après.
[Tableau 4]
Figure imgf000025_0002
Les courbes d'élution pour chacune de ces trois résines sont données par la figure 6 annexée : figure 6a pour la résine Q Sepharose ® Fast Flow figure 6b pour la résine Capto Q Impress ® et figure 6c pour la résine ANX Sepharose ® 4 Fast Flow. Sur ces figures, la concentration en Rubisco des éluats (en g/L) est fonction du volume d'éluant passé (ml_) sur les résines en colonne.
L'ensemble des résultats expérimentaux obtenus pour chacune de ces trois résines est résumé dans le tableau 5 ci-dessous.
[Tableau 5]
Figure imgf000026_0001
L'ensemble de ces résultats montre que les résines Q Sepharose ®
Fast Flow et Capto Q Impress ® permettent, au même titre que la résine ANX Sepharose ® 4 Fast Flow, de préparer une solution de Rubisco purifiée avec de bons rendements.
Exemple 3 : Charge de la Rubisco avec des résines d'échanae d'ions de matrices diverses
Pour cet exemple, des expériences ont été réalisées afin de vérifier la rétention de la Rubisco sur des résines constituées par différents types de matrice. Le tableau 6 résume les principales caractéristiques des résines testées. rTableau 61
Figure imgf000027_0001
Dans cet exemple, la colonne utilisée était une colonne de type XK 16/20 ayant un diamètre interne de 16 mm (Cityva).
Les conditions opératoires utilisées durant l'étape d'équilibration de la colonne de chromatographie sont données dans le Tableau 7 ci-après :
rTableau 71
Figure imgf000027_0002
Dans ce tableau Co est la concentration initiale en Rubisco dans le jus de luzerne centrifugé.
L'ensemble des résultats expérimentaux obtenus durant la charge, c'est-à-dire en termes de rétention de la Rubisco pour ces deux résines, est résumé dans le tableau 8 ci-dessous : rTableau 81
Figure imgf000028_0001
Exemple 4 : Etape 1) de déshydration : Atomisation du lus de luzerne à différentes températures d'entrée de l'atomiseur
Dans cet exemple, on a testé l'effet de la température d'entrée d'un atomiseur utilisé pour réaliser l'étape 1) de déshydratation de jus de luzerne sur sa teneur en Rubisco.
Les tests ont été réalisés sur deux lots de jus de luzerne obtenus par pressage dans une presse mono-vis. Le tableau 9 ci-dessous résume les résultats de la production de jus, en termes de bilans de matière, ainsi que la caractérisation des jus.
TTableau 91
Figure imgf000028_0002
Les jus ont été stockés au fur et à mesure de leur production dans un tank réfrigéré à 4°C jusqu'à la fin de la production. Les jus ont ensuite été transférés dans des flacons puis stockés à 4°C jusqu'au moment du séchage (entre 1 et 3 jours). Comme il peut être observé dans le Tableau 9 ci-dessus, les deux jus produits présentaient des caractéristiques très proches, en sachant qu'il existe une variabilité naturelle liée à la matière première. Des essais de séchage par atomisation ont ensuite été réalisés.
L'équipement utilisé pour les essais est un sécheur-atomiseur Niro Minor SD2 de la société GEA d'une capacité de 4 L/h.
Les conditions opératoires étudiées ont été les températures d'entrée (première température de l'étape 1) de déshydratation) et de sortie
(deuxième température de l'étape 1) de déshydratation). Trois essais ont été réalisés à 3 températures d'entrée différentes à savoir 140°C, 160°C et 200°C, alors que la température de sortie a été fixée à 70°C pour tous les essais.
Le tableau 10 ci-dessous présente un résumé des conditions
opératoires mises en œuvre pour l'ensemble des essais, ainsi que les valeurs de concentrations de Rubisco et de masses de jus traités.
TTableau 101
Figure imgf000029_0001
Dans ce tableau, la masse sèche alimentée calculée a été déterminée à partir du pourcentage de matières sèches (% MS) du jus (voir Tableau 9).
Après atomisation, la poudre obtenue a été stockée à -20°C.
Pour chaque essai, la poudre obtenue après séchage a été reconstituée dans de l'eau ultra pure, à une valeur de teneur en matière sèche égale à celle du jus avant atomisation (voir Tableau 9). Le jus reconstitué a ensuite été centrifugé à 6000 tours/min. à 4°C pendant 20 min. et analysé par HPLC-SEC à 280 nm, et ce dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1, afin de déterminer sa concentration en Rubisco. L'effet de la température d'atomisation sur la concentration de la Rubisco dans le jus reconstitué a été étudié. Le tableau 11 ci-dessous présente un résumé des résultats obtenus par bilan de matière en termes de masse de jus et de masse de Rubisco obtenues après atomisation, par rapport aux quantités qui ont été traitées. Afin de pouvoir estimer les pertes de masse de Rubisco, il faut tenir compte du volume de jus pouvant être reconstitué à la même teneur en matière sèche que le jus avant atomisation, ainsi que de sa concentration en Rubisco. La masse de Rubisco présente dans le jus
reconstitué a été comparée à la masse de Rubisco présente dans le jus alimenté à l'atomiseur.
TTableau 111
Figure imgf000030_0001
(a) : Pertes en termes de masse sèche obtenue en prenant comme référence la masse sèche calculée selon les % MS du jus (voir Tableau 10).
(b) : Jus reconstitué à une teneur en matière sèche équivalente à celle du jus avant atomisation (voir Tableau 9).
Les résultats présentés dans le tableau 11 montrent que pour la température d'entrée la plus élevée, les pertes liées à la masse de poudre de jus végétal déshydraté obtenue sont d'environ 41 %, alors que pour la température la plus faible (140°C), ces pertes sont de l'ordre de 13 % seulement. Pour une température intermédiaire (160°C), les pertes de matière sèche sont de 17,2%. De plus, les valeurs de concentration de Rubisco des jus reconstitués sont, pour toutes les expériences, inférieures à celles des jus avant atomisation, pour des teneurs en matière sèche équivalentes. Cette différence qui semble être due à une dégradation de la Rubisco durant l'atomisation est d'autant plus importante que la température à l'entrée de l'atomiseur est élevée. Ceci se reflète sur le bilan de matière en termes de masse de Rubisco, donnant des pertes nettement plus importantes (78%) pour l'essai réalisé à 200°C que celles obtenues avec l'essai à 140°C
(d'environ 30%). Ainsi, ces essais montrent que lorsque l'étape 1) de déshydratation est réalisée par atomisation, il est préférable que la
température d'entrée de l'atomiseur soit inférieure à 200°C, et encore plus préférentiellement inférieure à 140°C. une température tout particulièrement appropriée est 120°C comme dans les exemples 1 et 2 ci-dessus.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Procédé de production de Rubisco purifiée à partir d'une biomasse végétale, ledit procédé comprenant, dans cet ordre, au moins les étapes suivantes:
1) une étape de déshydratation d'un jus végétal issu du pressage d'une biomasse végétale contenant de la Rubisco, pour obtenir une poudre dudit jus végétal déshydraté,
2) une étape de reconstitution d'un jus végétal à partir de la poudre obtenue ci-dessus à l'étape 1), pour conduire à un jus végétal reconstitué,
3) une étape de centrifugation du jus végétal reconstitué obtenu ci- dessus à l'étape 2), pour conduire à un jus centrifugé et à un culot de centrifugation,
4) une étape de rétention chromatographique de la Rubisco contenue dans le jus centrifugé obtenu ci-dessus à l'étape 3), sur une résine échangeuse d'ions,
5) une étape d'élution de la Rubisco fixée sur la résine à l'aide d'une solution saline, pour obtenir une solution saline comprenant de la Rubisco,
6) une étape de conditionnement de la solution saline de Rubisco obtenue ci-dessus à l'étape 5) à l'aide d'une solution de
conditionnement, pour conduire à une solution de Rubisco purifiée, ledit procédé étant caractérisé en ce que :
- l'étape 1) de déshydratation est réalisée à une température inférieure ou égale à 200°C,
- l'étape 4) de rétention chromatographique est réalisée en lit fixe ou en lit expansé ou en lit fluidisé, dans une colonne de chromatographie contenant une résine échangeuse d'ions choisie parmi les résines hydrophiles anioniques contenant des groupements fonctionnels choisis parmi les amines tertiaires et les ammoniums quaternaires, lesdites résines comportant i) soit une matrice d'au moins un polymère réticulé, ii) soit une matrice composite d'oxyde de silicium et d'au moins un polymère polyacrylique.
[Revendication 2] Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les résines comportant une matrice de polymère réticulé sont choisies parmi les résines dans lesquelles ledit polymère réticulé est un polysaccharide.
[Revendication 3] Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit polysaccharide est un polymère de galactose ou un polymère ramifié de dextrose.
[Revendication 4] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la résine échangeuse d'ions est choisies parmi :
a) les résines d'agarose anioniques faibles et faiblement réticulées comportant des fonctions amines tertiaires diéthylaminopropyle, b) les résines d'agarose anioniques fortes et faiblement réticulées comportant des fonctions ammonium quaternaire,
c) les résines d'agarose anioniques fortes et fortement réticulées comportant des fonctions ammonium quaternaire, et
d) les résines d'agarose et de dextrane anioniques fortes et fortement réticulées comportant des fonctions ammonium quaternaire.
[Revendication 5] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la biomasse végétale est issue d'une plante choisie parmi les plantes fourragères les plantes potagères et les plantes grasses.
[Revendication 6] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape 1) de déshydratation du jus végétal est réalisée par séchage par atomisation.
[Revendication 7] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape 1 ) de déshydratation est effectuée à une température inférieure ou égale à 140°C.
[Revendication 8] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la durée totale de l’étape 1 ) de déshydratation est inférieure à 20 secondes.
[Revendication 9] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape 2) de reconstitution d'un jus végétal est réalisée par ajout d'eau ou d'une solution permettant d'ajuster le pH ou la salinité du jus.
[Revendication 10] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape 3) de centrifugation du jus végétal reconstitué est réalisée à une vitesse de 4000 à 6000
tours/min.
[Revendication 11] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, avant la réalisation de l'étape 1) de déshydratation, une étape de centrifugation préalable du jus végétal issu du pressage d'une biomasse végétale contenant de la Rubisco.
[Revendication 12] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape 4) de rétention
chromatographique comprend, dans cet ordre, les sous-étapes suivantes :
- une sous-étape 4a) de rinçage et d'équilibration de la résine échangeuse d'ions, à l'aide d'un tampon ayant un pH de 6 à 8,
- une sous-étape 4b) de fixation de la Rubisco contenue dans le jus végétal centrifugé, sur la résine présente dans la colonne de
chromatographie, et
- une sous-étape 4c) de lavage de la colonne par de l'eau
déminéralisée.
[Revendication 13] Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la sous-étape 4b) est réalisée à un pH compris entre 6,0 et 8,0 ± 0,2.
[Revendication 14] Procédé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que la sous-étape 4b) est réalisée en mode ascendant ou descendant, avec une vitesse superficielle d'alimentation de 0,2 cm/min à 2 cm/min.
[Revendication 15] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape 5) d'élution est réalisée à l'aide d'une solution saline ou d'une solution ayant un pH inférieur au point isoélectrique de la Rubisco.
[Revendication 16] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape 6) de conditionnement est réalisée par chromatographie d'exclusion de taille ou par ultrafiltration en mode diafiltration.
[Revendication 17] Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que l'étape 6) de conditionnement est réalisée par ultrafiltration en mode diafiltration en utilisant une solution de remplacement de la solution d'élution.
[Revendication 18] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, une étape 7) supplémentaire de déshydratation de la solution de Rubisco purifiée.
[Revendication 19] Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'étape 7) de déshydratation est réalisée par séchage par
atomisation à une température de sortie allant de 65 à 75°C.
PCT/FR2020/051110 2019-06-27 2020-06-25 Procédé de production de la rubisco à partir d'une biomasse végétale WO2020260831A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20747040.2A EP3989731A1 (fr) 2019-06-27 2020-06-25 Procédé de production de la rubisco à partir d'une biomasse végétale

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1907012A FR3097723B1 (fr) 2019-06-27 2019-06-27 Procédé de production de la rubisco à partir d’une biomasse végétale
FRFR1907012 2019-06-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020260831A1 true WO2020260831A1 (fr) 2020-12-30

Family

ID=68343051

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2020/051110 WO2020260831A1 (fr) 2019-06-27 2020-06-25 Procédé de production de la rubisco à partir d'une biomasse végétale

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP3989731A1 (fr)
FR (1) FR3097723B1 (fr)
WO (1) WO2020260831A1 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022195035A3 (fr) * 2021-03-17 2022-11-24 Instituto Superior De Agronomia Procédé d'obtention d'une préparation de rubisco purifiée à partir d'une substance photosynthétique

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2819685A1 (fr) 2001-01-23 2002-07-26 Viridis Procede pour traiter le jus vert issu du pressage d'une matiere foliaire riche en proteines telle que la luzerne
WO2011078671A1 (fr) 2009-12-22 2011-06-30 Nizo Food Research B.V. Procédé d'isolement d'une préparation de rubisco déchlorophyllée à partir d'une substance végétale
WO2012150421A1 (fr) 2011-05-04 2012-11-08 Valagro Carbone Renouvelable Poitou-Charentes Prodede d'obtention d'un extrait proteique de luzerne et de co-produits valorisables

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2819685A1 (fr) 2001-01-23 2002-07-26 Viridis Procede pour traiter le jus vert issu du pressage d'une matiere foliaire riche en proteines telle que la luzerne
WO2011078671A1 (fr) 2009-12-22 2011-06-30 Nizo Food Research B.V. Procédé d'isolement d'une préparation de rubisco déchlorophyllée à partir d'une substance végétale
WO2012150421A1 (fr) 2011-05-04 2012-11-08 Valagro Carbone Renouvelable Poitou-Charentes Prodede d'obtention d'un extrait proteique de luzerne et de co-produits valorisables

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DOUILLARD & DE MATHAN: "Leaf protein for food use: postential of RUBISCO", 1 January 1994, NEW AND DEVELOPING SOURCES OF FOOD PROTEINS, CHAPMAN & HALL, UK, PAGE(S) 307 - 342, ISBN: 978-0-412-58420-6, XP008162476 *
KOBBI SABRINE ET AL: "Purification and Recovery of RuBisCO Protein from Alfalfa Green Juice: Antioxidative Properties of Generated Protein Hydrolysate", WASTE AND BIOMASS VALORIZATION, SPRINGER NETHERLANDS, NL, vol. 8, no. 2, 24 May 2016 (2016-05-24), pages 493 - 504, XP036155471, ISSN: 1877-2641, [retrieved on 20160524], DOI: 10.1007/S12649-016-9589-Y *
SYRINE KERFAI: "Etude d'un procédé chromatographique d'échange d'ions pour la séparation de la ribulose 1,5-biphosphate carboxylase oxygénase (Rubisco) dans le cade de la valorisation d'un sous-produit agricole", March 2011, INSA TOULOUSE
SYRINE KERFAI: "Etude d'un procédé chromatographique d'échange d'ions pour la séparation de la Ribulose 1,5-Biphosphate Carboxylase Oxygénase (RuBisCO) dans le cadre de la valorisation d'un sous produit agricole", DOCTORAT DE L'UNIVERSITE DE TOULOUSE, 18 March 2011 (2011-03-18), XP055651537, Retrieved from the Internet <URL:https://www.theses.fr/2011ISAT0014.pdf> [retrieved on 20191210], DOI: 10.4414/bms.2018.17115 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022195035A3 (fr) * 2021-03-17 2022-11-24 Instituto Superior De Agronomia Procédé d'obtention d'une préparation de rubisco purifiée à partir d'une substance photosynthétique

Also Published As

Publication number Publication date
FR3097723A1 (fr) 2021-01-01
EP3989731A1 (fr) 2022-05-04
FR3097723B1 (fr) 2021-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3300610B1 (fr) Procede de fractionnement des solubles de pois
EP1400537B1 (fr) Extraction des composants de la farine de pois
JP2016005455A (ja) ゼイン組成物
CN105324040A (zh) 烟草衍生的蛋白质组合物
EP2414379B1 (fr) Procédé d&#39;obtention d&#39;une préparation de béta-amylases a partir des fractions solubles de plantes amidonnières
EP1074262B1 (fr) Extrait d&#39;algues Laminaria, procédé de préparation et compositions cosmétiques ou pharmaceutiques le contenant
Marson et al. Serial fractionation of spent brewer's yeast protein hydrolysate by ultrafiltration: A peptide-rich product with low RNA content
WO2020260831A1 (fr) Procédé de production de la rubisco à partir d&#39;une biomasse végétale
CN105924498B (zh) 一种具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法
EP1297116B1 (fr) Procede d&#39;isolement et de purification d&#39;une proteine
CN107594541A (zh) 一种制备苦瓜多肽蛋白的膜分离纯化技术工艺、苦瓜多肽蛋白提取物及其应用
EP4045542B1 (fr) Corn steep soluble
EP2920160B1 (fr) Procede d&#39;obtention de polyphenols a partir d&#39;une matiere premiere vegetale en contenant
EP2451825A1 (fr) Utilisation d&#39;un coproduit issu d&#39;un procede d&#39;extraction du lysozyme a partir de blanc d&#39;oeuf, pour l&#39;obtention d&#39;au moins une proteine basique de blanc d&#39;oeuf
EP3233076A1 (fr) Procede d&#39;obtention d&#39;une composition enrichie en dihydroquercetine ou en tanins
WO2024088564A1 (fr) Fraction hydrosoluble de plantes limpide
EP3924462A1 (fr) Procede d&#39;obtention d&#39;une solution aqueuse enrichie en pigment bleu
JP5927833B2 (ja) 植物からポリアミン組成物を製造する方法
JP2009183276A (ja) 酵素活性を有する米糠浸出物、該米糠浸出物により得られる生成物、及びこれらの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20747040

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2020747040

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020747040

Country of ref document: EP

Effective date: 20220127