WO2020246271A1 - 神経機能調節剤 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a neurological function regulator containing a specific malvidin glycoside as an active ingredient.
- anthocyanins which are active ingredients derived from natural products.
- the physiological activity of anthocyanins varies depending on not only the structure of aglycone but also the type and number of sugar chains, such as visual impairment improving action, antioxidant action, vascular strengthening action, anti-inflammatory action, and antitumor action.
- malvidin-3,5-diglucoside is said to have a cell death inhibitory effect on cell death via ultraviolet rays or active oxygen generated by ultraviolet rays, and a skin external preparation has been reported as a specific example. (Patent Document 1).
- Malvidin-3,5-diglucoside can be obtained as a plant-derived component (biological resource-derived component), and is therefore considered to be safe and suitable for daily or continuous ingestion. It is desirable to find new properties of malvidin-3,5-diglucoside and apply it in the medical field based on the properties.
- malvidin-3,5-diglucoside is effective in protecting nerve cells and exerts a nerve function-regulating action through the protection. It came to be completed.
- a neurological function regulator containing malvidin-3,5-diglucoside as an active ingredient.
- the nerve function regulator refers to an agent having a nerve function regulating action
- the nerve function regulating action refers to an action related to prevention of deterioration of nerve function, maintenance of the status quo, recovery, improvement, and prevention.
- Malvidin-3,5-diglucoside is represented by the following formula (1).
- Malvidin-3,5-diglucoside may be in the form of having a counter anion, and examples thereof include chloride.
- the above-mentioned nerve function regulators that exert a nerve function regulating action through protection of nerve cells are provided, and further, protection of nerve cells includes suppression of nerve cell death by amyloid ⁇ protein.
- the above-mentioned neuronal function regulators are provided.
- the above-mentioned neural function regulator containing delphinidin-3-glucoside is provided.
- the above-mentioned neural function regulator for oral use is provided.
- a pharmaceutical composition containing the above-mentioned nerve function regulator is provided.
- a food composition containing the above-mentioned neurofunctional regulator is provided, and further, a functional food, a nutritional supplement, a health supplement, a nutritionally fortified food, a food with a functional claim, and a special use food.
- a food composition for specified health use or a food with a nutritional function which is the above-mentioned food composition.
- a method for regulating nerve function which comprises ingesting the above-mentioned nerve function regulator to an administration subject.
- a nerve function regulator that is effective in protecting nerve cells and exerts a nerve function regulating action through the protection is provided, and a pharmaceutical composition and a food composition containing the nerve function regulator are also provided. Things are provided.
- the present invention relates to a neurological function regulator containing malvidin-3,5-diglucoside as an active ingredient.
- Malvidin-3,5-diglucoside also called Malvin, is a type of naturally occurring anthocyanin and is a major pigment in the genus Malva silvestris, Primula and Rhododendron. Are known.
- malvidin-3,5-diglucoside derived from these plants can be used, but the biological resource containing any malvidin-3,5-diglucoside is not limited thereto. Derived ones can be used.
- Malvidin-3,5-diglucoside may be separated from biological resources, or may be used as it is without separation. For example, malvidin-3,5-diglucoside may be supplied as an extract from biological resources.
- malvidin-3,5-diglucoside derived from biological resources examples include malvidin-3,5-diglucoside derived from grapes.
- the grapes are preferably of the genus Grapevine (Vitis), and from the viewpoint of the content of malvidin-3,5-diglucoside, European grapes (Vitis Vinifera), Crimson glory vines (Vitis Coignetea), Sankakuzuru (Vitis flexuosa) and hybrids thereof are preferable.
- Crimson glory, Sankakuzuru, Crimson glory and European grape hybrids or Sankakuzuru and European grape hybrids are more preferred.
- malvidin-3,5-diglucoside can be contained in grape skin, ground grape skin or an extract from grape skin can be used as a source of malvidin-3,5-diglucoside.
- the extraction method is not particularly limited, and examples thereof include a method of extracting using an organic solvent.
- Anthocyanins other than malvidin-3,5-diglucoside (eg, malvidin-3-glucoside, malvidin-3-glucoside, malvidin-3-kumaroyl glucoside, malvidin-3-kumaroyl glucoside-5-glucoside) that can be contained in grape skin ) Can be obtained at the same time as and efficiently with malvidin-3,5-diglucoside, and these can be used as a neurofunction regulator containing malvidin-3,5-diglucoside. It is preferable to use a thing.
- malvidin-3,5-diglucoside As a source of malvidin-3,5-diglucoside, commercially available grape powder or grape concentrate may be used.
- Malvidin-3,5-diglucoside can be a chemically synthesized product, but from the viewpoint of safety, those derived from biological resources are preferable.
- the neural function regulator of the present invention contains malvidin-3,5-diglucoside as an active ingredient, but may contain other ingredients.
- malvidin-3,5-diglucoside for example, delphinidin-3-glucoside, malvidin-3-glucoside, malvidin-3-kumaroyl glucoside, malbisin-3-kumaroyl glucoside-5-glucoside
- anthocyanins other than malvidin-3,5-diglucoside for example, delphinidin-3-glucoside, malvidin-3-glucoside, malvidin-3-kumaroyl glucoside, malbisin-3-kumaroyl glucoside-5-glucoside
- the nerve function regulator of the present invention exerts a nerve function regulation function through protection of nerve cells, it is effective for neurodegenerative diseases associated with nerve cell damage and decrease in the number of nerve cells, and various symptoms, among others. Highly effective against anti-aging. In the examples described later, suppression and improvement of the decrease in spatial learning memory were observed in the aging-promoting model mouse in which amyloid ⁇ protein was accumulated, which is considered to be caused by oxidative stress caused by amyloid ⁇ protein and amyloid ⁇ protein. It is effective for neurodegenerative diseases and various symptoms.
- the neurofunctional regulator of the present invention can be used for the purpose of improving or preventing neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and depression.
- the nerve function regulator of the present invention can be used for the purpose of anti-stress and anti-fatigue. Furthermore, the nerve function regulator of the present invention can be used for the purpose of recovering or improving nerve functions such as learning ability, memory ability, and reflex reaction ability.
- the neural function regulator of the present invention can be an agent for anti-aging, anti-stress, anti-fatigue, recovery / improvement of learning ability, recovery / improvement of memory ability, recovery / improvement of reflex reaction ability.
- the nerve function regulator of the present invention can also be administered to a healthy person.
- administering method Mammals can be mentioned as administration targets of the neurological function regulator of the present invention, and examples thereof include humans, domestic animals (horses, cows, pigs, etc.), pet animals (dogs, cats, etc.), experimental (test) animals (mice, etc.). Rats and the like), preferably humans.
- the dose of the neurological function regulator of the present invention can be appropriately set in consideration of the administration target, age, body weight, symptoms and the like.
- the dose of malvidin-3,5-diglucoside may be 0.008 mg / day or more and 4 mg / day or less per 1 kg of the body weight of the administration subject (human).
- the dose is preferably 0.04 mg / day or more, more preferably 0.08 mg / day or more, and preferably 1.6 mg / day or less, more preferably 0.8 mg / day or less.
- the administration target is other than human, it can be set by appropriately increasing or decreasing the above range.
- the administration may be once a day or may be divided into a plurality of doses.
- the administration period can be appropriately set in consideration of the administration target, age, body weight, symptoms and the like, but continuous use is preferable.
- the present invention relates to a method for regulating nerve function, which comprises ingesting the above-mentioned nerve function regulator to an administration subject.
- humans can be excluded from the administration target, and the method can exclude medical practice.
- the present invention also relates to a pharmaceutical composition containing the above-mentioned neural function regulator.
- the pharmaceutical composition can be a drug or a quasi drug.
- compositions can include pharmaceutically acceptable ingredients such as carriers, excipients (eg, lactose, sucrose, dextrin, hydroxypropyl cellulose, polyvinylpyrrolidone), disintegrants, buffers, emulsifiers, etc.
- Suspensions, stabilizers, preservatives, preservatives, solvents eg, organic solvents such as water, saline, ethanol
- solvents eg, organic solvents such as water, saline, ethanol
- It can also contain pharmacological components having other pharmacological activities.
- the pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally, and is preferably orally administered.
- oral administration examples thereof include powders, tablets, coating agents, sugar-coated tablets, soft capsules or hard capsules, liquid preparations, emulsions, and suspensions.
- parenteral administration examples include suppositories, injections, infusions, ointments, creams and gels.
- the administration method such as the target disease and symptom can be set in the same manner as the above-mentioned neural function regulator.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for regulating nerve function, and is used for anti-aging, anti-stress, anti-fatigue, recovery / improvement of learning ability, recovery / improvement of memory, and recovery / improvement of reflex reaction ability.
- Pharmaceutical compositions can be mentioned.
- a food composition containing the above-mentioned nerve function regulator is provided.
- the food composition can be a functional food, a nutritional supplement, a health supplement, a nutritionally enriched food, a food with a functional claim, a special purpose food, a food for specified health use or a food with a nutritional function.
- Food compositions can include ingredients that are acceptable in the manufacture of foods, such as carriers, excipients (eg, lactose, sucrose, dextrin, hydroxypropyl cellulose, polyvinylpyrrolidone), disintegrants, buffers, etc.
- excipients eg, lactose, sucrose, dextrin, hydroxypropyl cellulose, polyvinylpyrrolidone
- disintegrants e.g, hydroxypropyl cellulose, polyvinylpyrrolidone
- examples include emulsifiers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, solvents (eg, organic solvents such as water, saline, ethanol).
- solvents eg, organic solvents such as water, saline, ethanol.
- Foods can also contain proteins, sugars, lipids, vitamins, minerals, organic acids, organic bases, flavors and the like.
- the form of the food composition is not particularly limited, and examples thereof include solids, liquids, mixtures, suspensions, pastes, gels, powders, and capsules, which can be beverages, confectionery, seasonings, prepared foods, and processed foods.
- the food composition may be a supplement.
- the administration method such as the target disease and symptom can be set in the same manner as the above-mentioned neural function regulator.
- the food composition of the present invention can be used as a food composition for regulating nerve function, and is used for anti-aging, anti-stress, anti-fatigue, recovery / improvement of learning ability, recovery / improvement of memory ability, recovery / improvement of reflex reaction ability. Examples include food compositions.
- Example preparation> In each experiment, the following were used as malvidin-3,5-diglucoside.
- Sample 5 The above single product (M3, 5G) is dissolved in ultrapure water (Milli-Q (registered trademark) water) so that the concentration of the single product (M3, 5G) in the obtained solution becomes 651 ⁇ g / mL. It was adjusted and used for animal experiments.
- Sample 6 The above extract is dissolved in ultrapure water (Milli-Q (registered trademark) water), and the concentration of the extract powder in the obtained solution is adjusted to 7.5 mg / mL for animal experiments. Used for. The concentration of malvidin-3,5-diglucoside in the solution is 651 ⁇ g / mL (calculated with chloride).
- Example 1 Cell survival experiment> The following experiments confirmed the inhibitory effect of malvidin-3,5-diglucoside on neuronal cell death.
- SH-SY5Y cells neuroon model cells, ATCC
- the cell culture medium is a mixture of F12 / DMEM medium (manufactured by Gibco), 1% non-essential amino acids (manufactured by Gibco), 15% FBS (manufactured by Bio West), and 1% penicillin / streptomycin (manufactured by Lonza).
- F12 / DMEM medium manufactured by Gibco
- non-essential amino acids manufactured by Gibco
- FBS manufactured by Bio West
- penicillin / streptomycin manufactured by Lonza
- Relative cell viability was calculated in the same manner as above, except that sample 2 was used instead of sample 1 (“A ⁇ + M) in FIG. 1).
- Relative cell viability was calculated in the same manner as above, except that sample 3 was used instead of sample 1 (“A ⁇ + M3G” in FIG. 1).
- Example 2 Gene expression experiment> The following experiments analyzed the mechanism of the inhibitory effect of malvidin-3,5-diglucoside on neuronal cell death.
- SH-SY5Y cells were seeded in a 100 mm cell dish (manufactured by BD Biocoat) at a concentration of 3.7 ⁇ 10 5 cells / mL at a concentration of 10 mL / dish for 24 hours under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
- the cell culture medium is a mixture of F12 / DMEM medium (manufactured by Gibco), 1% non-essential amino acids (manufactured by Gibco), 15% FBS (manufactured by Bio West), and 1% penicillin / streptomycin (manufactured by Lonza).
- F12 / DMEM medium manufactured by Gibco
- 1% non-essential amino acids manufactured by Gibco
- FBS manufactured by Bio West
- penicillin / streptomycin manufactured by Lonza
- RNA extraction was performed using ISOGEN reagent (manufactured by Nippon Gene) according to the protocol recommended by Nippon Gene (URL: https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/tds).
- the real-time PCR method was performed using a reagent kit for TaqMan Real-Time PCR (manufactured by Thermo Fisher Scientific) according to the protocol recommended by Thermo Fisher Scientific (URL: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets). /LSG/manuals/4304449#TaqManPCRMM#UG.pdf).
- MAP2K4 (Mightogen Activated Protein Kinase 4)
- MAPK14 (Mightogen Activated Protein Kinase 14)
- MAPK8 (Mightogen Activated Protein Kinase 8)
- PI3KCA phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit ⁇ )
- AKT1 (AKT serine / threonine kinase 1)
- PARP1 Poly (ADP-ribose) polymerase 1)
- CASP3 (Caspase-3)
- genes are genes involved in the stress response MAPK pathway. It is known that it is activated by various environmental stress stimuli such as ultraviolet rays, radiation, oxidative stress, and heat shock, and induces cell death (apoptosis) in stressed cells. It is known that this signaling pathway is also activated by amyloid ⁇ and plays a central role in the control of neurodegenerative diseases. There is a signal pathway from a series of mitogen-activated protein kinases to PI3KCA and AKT1 and a signal pathway from a series of mitogen-activated protein kinases to CASP3 and PARP1, the former involved in mitochondrial activity and the latter involved in apoptosis. To do.
- the above gene expression was analyzed in the same manner as above, except that the mixture was mixed, the mixture was added at 10 ⁇ L / dish, the mixture was cultured for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 , and RNA was extracted. ("A ⁇ + M3,5G" in FIGS. 2 to 8).
- malvidin-3,5-diglucoside has an effect of lowering the expression of CASP3, and it is suggested that this increase in expression due to amyloid ⁇ protein treatment is reduced, and that apoptosis is suppressed through this.
- malvidin in cells treated with amyloid ⁇ protein, as shown in “A ⁇ + M” in the figure, malvidin also increased the expression of MAP2K4, MAPK14, MAPK8, PI3KCA, AKT1, and PARP1 and decreased the expression of CASP3.
- malvidin-3-glucoside also increased the expression of MAP2K4, MAPK14, PI3KCA, AKT1, and PARP1, but malvidin-3,5-diglucoside was found to be MAP2K4, PI3KCA.
- AKT1 expression increased and CASP3 expression decreased, showing the highest activity among them. It can be seen that the highest activity is in the order of malvidin-3,5-diglucoside, malvidin, and malvidin-3-glucoside.
- ATP production amount measurement experiment The amount of ATP produced in nerve cells was measured by the following experiments, and the promotion of energy metabolism by malvidin-3,5-diglucoside was confirmed.
- the cell culture medium is a mixture of F12 / DMEM medium (manufactured by Gibco), 1% non-essential amino acids (manufactured by Gibco), 15% FBS (manufactured by Bio West), and 1% penicillin / streptomycin (manufactured by Lonza). Was used. After 24 hours, the culture medium was completely removed with an ejector, 100 ⁇ L / well of Opti-MEM (manufactured by Gibco) medium was added, and the cells were cultured for 6, 12 and 24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2. did.
- ATP test reagent (“cellular” ATP test reagent, manufactured by Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) was added, mixed, and reacted at room temperature in the dark for 10 minutes. Then, 150 ⁇ L of a mixed solution of the cell solution and the ATP measurement reagent was transferred to a white well plate (manufactured by BD FALCON, 96 wells) using a micropipette. Then, using a microplate reader (manufactured by Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.), the amount of luminescence after a lapse of a predetermined time was measured, and the amount of ATP produced was calculated (“control” in FIG. 9).
- ATP test reagent (“cellular” ATP test reagent, manufactured by Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) was added, mixed, and reacted at room temperature in the dark for 10 minutes. Then, 150 ⁇ L of a mixed solution of the cell solution and the ATP
- Example 4 Reactive oxygen species measurement experiment> By the following experiments, the amount of reactive oxygen species in nerve cells was measured, and the reduction of oxidative stress by malvidin-3,5-diglucoside was confirmed.
- well plates (BD Biocoat, Inc., well number 96) to each well of a (model cells of neuronal cells, ATCC Co.) SH-SY5Y cells at a concentration of 2 ⁇ 10 5 cells / mL, 100 [mu] L / Well clan seeds were cultivated for 24 hours under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
- the cell culture medium is a mixture of F12 / DMEM medium (manufactured by Gibco), 1% non-essential amino acids (manufactured by Gibco), 15% FBS (manufactured by Bio West), and 1% penicillin / streptomycin (manufactured by Lonza).
- F12 / DMEM medium manufactured by Gibco
- 1% non-essential amino acids manufactured by Gibco
- FBS manufactured by Bio West
- penicillin / streptomycin manufactured by Lonza
- the culture medium was completely removed with an ejector, and 20X DCFH-DA (reagent included in the measurement kit) was mixed (diluted 20-fold) with the medium of Opti-MEM (manufactured by Gibco), and 100 ⁇ L / well was added. , 37 ° C., 5% CO 2 for 1 hour.
- the Opti-MEM (manufactured by Gibco) and 20X DCFH-DA (reagent included in the measurement kit) mixed medium was completely removed by an aspirator, and 100 ⁇ L / well of the Opti-MEM (manufactured by Gibco) medium was added.
- the cells were cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for hours.
- Opti-MEM manufactured by Gibco
- 20X DCFH-DA reagent included in the measurement kit
- the mixed medium was completely removed by an aspirator, and sample 1 and amyloid ⁇ protein (Beta-Amyloid 1-) were completely removed.
- 42, AnaSpec was mixed with Opti-MEM (Gibco) to a final concentration of 12.56 ⁇ M and 5 ⁇ M, respectively, and the mixture was added at 100 ⁇ L / well for 1 hour at 37 ° C. and 5% CO 2 .
- the amount of active oxygen species was determined in the same manner as above except that the cells were cultured under the conditions (“A ⁇ + M3,5G” in FIG. 10).
- Opti-MEM manufactured by Gibco
- 20X DCFH-DA reagent included in the measurement kit
- the mixed medium was completely removed with an aspirator, and sample 2 and amyloid ⁇ protein (Beta-Amyloid 1-) were removed.
- 42, AnaSpec was mixed with Opti-MEM (Gibco) to a final concentration of 12.56 ⁇ M and 5 ⁇ M, respectively, and the mixture was added at 100 ⁇ L / well for 1 hour at 37 ° C. and 5% CO 2 .
- the amount of reactive oxygen species was determined in the same manner as above except that the cells were cultured under the conditions (“A ⁇ + extract” in FIG. 10).
- Example 5 Animal experiment> The following experiments confirmed the effect of malvidin-3,5-diglucoside on improving learning and memory ability in animals.
- mice used in the animal experiments and the administration contents are as follows. Breeding conditions other than the administration content are common to all groups.
- Single product (M3,5G) administration (SAMP8) group Sample 5 was administered in an amount such that the daily dose was 2.17 mg of malvidin-3,5-diglucoside per 1 kg of mouse body weight, and the aging-accelerated mice (SAMP8) (Japan). Obtained from SLC Co., Ltd. 16 weeks old, body weight 28-30 g) 10 animals were orally administered for 30 days. (In FIGS.
- Extract administration (SAMP8) group Sample 4 was administered at a daily dose of 25 mg of extract powder per 1 kg of mouse body weight (malvidin-3,5-diglucoside 2.17 mg in sample 6) in an aging-promoting mouse (SAMP8). ) (16 weeks old, body weight 28-30 g) were orally administered to 10 animals for 30 days. (In FIGS.
- the contents of the animal experiment are as follows.
- the Morris water maze test (platform test, probe test) was performed on the mice in each group from the day after the end of oral administration.
- a Morris water maze a pool with a diameter of 120 cm and a depth of 45 cm was prepared.
- a transparent platform was installed under the surface of the pool, and four marks were installed at equal intervals on the inner wall of the pool.
- the platform test evaluates spatial learning memory using the time it takes for the mouse to reach the platform by relying on visual stimuli such as landmarks.
- the arrival time was shortened in the normal aging mice (water administration), whereas the arrival time was not shortened in the aging-promoting mice (water administration).
- the arrival time was shortened to the same extent as in the normal aging mice (water administration).
- the aging-accelerated mice to which the extract was administered showed a greater reduction in the arrival time.
- the probe test evaluates the memory retention ability of mice based on the number of times they crossed the place where the platform was installed and the length of stay at the place. As shown in FIGS. 12 and 13, the aging-accelerated mice (water administration) had significantly fewer crossings and a significantly shorter stay time than the normal aging mice (water administration). In the aging-accelerated mice to which the extract was administered, the number of crossings and the residence time were observed to be similar to those of the normal aging mice (water administration). Compared with the aging-accelerated mice to which malvidin-3,5-diglucoside was administered, the aging-accelerated mice to which the extract was administered crossed more frequently and stayed longer.
- malvidin-3,5-diglucoside improves the learning and memory ability of animals, and it is suggested that a high improvement effect can be obtained especially when the extract is administered.
- the nerve function regulator of the present invention is effective in protecting nerve cells and exerts a nerve function regulating action through the protection, and improves neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and depression. Prevention can be expected, and development as foods and pharmaceuticals such as health supplements and expansion of related markets are expected. Since the neurological function regulator of the present invention contains malvidin-3,5-diglucoside, which is a naturally occurring component, as an active ingredient, it is considered to be safe and suitable for daily or continuous ingestion. As described above, the present invention has high industrial usefulness.
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Abstract
本発明は、神経細胞保護に有効であり、当該保護を介して神経機能調節作用を発揮する神経機能調節剤を提供する。本発明は、マルビジン－３，５－ジグルコシドを有効成分として含有する神経機能調節剤、この神経機能調節剤を含有する医薬組成物及びこの神経機能調節剤を含有する食品組成物である。
Description
本発明は、特定のマルビジン配糖体を有効成分として含有する神経機能調節剤に関する。
近年、天然物由来の活性成分のアントシアニンについて、研究が盛んに進められている。アントシアニンの生理活性は、アグリコンの構造のみならず、糖鎖の種類・数によって、視覚障害改善作用、抗酸化作用、血管強化作用、抗炎症作用、抗腫瘍作用など、様々である。アントシアニンのうち、マルビジン－３，５－ジグルコシドについては、紫外線、あるいは紫外線により発生する活性酸素を介した細胞死に対し、細胞死抑制効果を有するとされ、具体例として皮膚外用剤が報告されている（特許文献１）。
マルビジン－３，５－ジグルコシドは、植物由来の成分（生物資源由来成分）として得ることができるため、安全であり、日常的又は継続的な摂取に適していると考えられる。マルビジン－３，５－ジグルコシドについて、新たな特性を見出し、当該特性に基づき、医療等の分野で応用を図ることが望ましい。
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、マルビジン－３，５－ジグルコシドが、神経細胞の保護に有効であり、当該保護を介して神経機能調節作用を発揮することを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明によれば、マルビジン－３，５－ジグルコシドを有効成分として含有する神経機能調節剤が提供される。
神経機能調節剤は、神経機能調節作用を有する剤をいい、神経機能調節作用は、神経機能の悪化防止、現状維持、回復、改善、予防に関連する作用をいうものとする。
マルビジン－３，５－ジグルコシドは、下記式（１）で表わされる。
マルビジン－３，５－ジグルコシドは、カウンターアニオンを有した形態であってもよく、例えばクロリドが挙げられる。
神経機能調節剤は、神経機能調節作用を有する剤をいい、神経機能調節作用は、神経機能の悪化防止、現状維持、回復、改善、予防に関連する作用をいうものとする。
マルビジン－３，５－ジグルコシドは、下記式（１）で表わされる。
本発明によれば、神経細胞の保護を介して神経機能調節作用を発揮する、上記の神経機能調節剤が提供され、さらに、神経細胞の保護が、アミロイドβタンパク質による神経細胞死の抑制を含む、上記の神経機能調節剤が提供される。
本発明によれば、デルフィニジン－３－グルコシドを含有する、上記の神経機能調節剤が提供される。
本発明によれば、経口用である、上記の神経機能調節剤が提供される。
また、本発明によれば、上記の神経機能調節剤を含有する医薬組成物が提供される。
また、本発明によれば、上記の神経機能調節剤を含有する食品組成物が提供され、さらに、機能性食品、栄養補助食品、健康補助食品、栄養強化食品、機能性表示食品、特別用途食品、特定保健用食品又は栄養機能食品である、上記食品組成物が提供される。
また、本発明によれば、上記の神経機能調節剤を、投与対象に摂取させることを含む、神経機能を調節する方法が提供される。
本発明によれば、神経細胞保護に有効であり、当該保護を介して神経機能調節作用を発揮する神経機能調節剤が提供され、また、当該神経機能調節剤を含有する医薬組成物及び食品組成物が提供される。
以下、本発明を詳細に説明する。
＜神経機能調節剤＞
本発明はマルビジン－３，５－ジグルコシドを有効成分として含有する神経機能調節剤に関する。
本発明はマルビジン－３，５－ジグルコシドを有効成分として含有する神経機能調節剤に関する。
（原料）
マルビジン－３，５－ジグルコシドは、マルビン（Ｍａｌｖｉｎ）とも称され、天然に存在するアントシアニンの一種であり、アオイ属（Ｍａｌｖａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、サクラソウ属（Ｐｒｉｍｕｌａ）及びツツジ属（Ｒｈｏｄｏｅｎｄｒｏｎ）の主要な色素として知られている。本発明の神経機能調節剤においては、これらの植物由来のマルビジン－３，５－ジグルコシドを使用することができるが、これらに限定されず、任意のマルビジン－３，５－ジグルコシドを含有する生物資源由来のものを使用することができる。マルビジン－３，５－ジグルコシドは、生物資源から分離したものであってもよいが、分離せずにそのまま使用してもよい。例えば、生物資源からの抽出物としてマルビジン－３，５－ジグルコシドを供給してもよい。
マルビジン－３，５－ジグルコシドは、マルビン（Ｍａｌｖｉｎ）とも称され、天然に存在するアントシアニンの一種であり、アオイ属（Ｍａｌｖａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、サクラソウ属（Ｐｒｉｍｕｌａ）及びツツジ属（Ｒｈｏｄｏｅｎｄｒｏｎ）の主要な色素として知られている。本発明の神経機能調節剤においては、これらの植物由来のマルビジン－３，５－ジグルコシドを使用することができるが、これらに限定されず、任意のマルビジン－３，５－ジグルコシドを含有する生物資源由来のものを使用することができる。マルビジン－３，５－ジグルコシドは、生物資源から分離したものであってもよいが、分離せずにそのまま使用してもよい。例えば、生物資源からの抽出物としてマルビジン－３，５－ジグルコシドを供給してもよい。
生物資源由来のマルビジン－３，５－ジグルコシドとしては、ブドウ由来のマルビジン－３，５－ジグルコシドが挙げられる。ブドウは、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）が好ましく、マルビジン－３，５－ジグルコシドの含有量の点から、ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉs Ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ヤマブドウ（Ｖｉｔｉｓ Ｃｏｉｇｎｅｔｉａｅ）、サンカクヅル（Ｖｉｔｉｓ ｆｌｅｘｕｏｓａ）及びこれらの交配種が好ましく、ヤマブドウ、サンカクヅル、ヤマブドウとヨーロッパブドウの交配種又はサンカクヅルとヨーロッパブドウの交配種がより好ましい。
マルビジン－３，５－ジグルコシドは、ブドウの果皮に含まれ得るので、ブドウ果皮をすり潰したもの、又はブドウ果皮からの抽出物を、マルビジン－３，５－ジグルコシドの供給源とすることができる。抽出方法は特に限定されず、有機溶媒を用いて抽出する方法が挙げられる。ブドウ果皮に含まれ得るマルビジン－３，５－ジグルコシド以外のアントシアニン（例えば、デルフィニジン－３－グルコシド、マルビジン－３－グルコシド、マルビシン－３－クマロイルグルコシド、マルビシン－３－クマロイルグルコシド－５－グルコシド）を、マルビジン－３，５－ジグルコシドと同時に、かつ効率的に取得して、これらをマルビジン－３，５－ジグルコシドと一緒に含む神経機能調節剤とすることができる点から、ブドウ果皮の抽出物を使用することが好ましい。
マルビジン－３，５－ジグルコシドの供給源として、市販のブドウ粉末、ブドウの濃縮液を使用してもよい。
マルビジン－３，５－ジグルコシドは、化学合成品であることもできるが、安全性の点から、生物資源由来のものが好ましい。
（作用）
本発明者らによって、マルビジン－３，５－ジグルコシドは、神経細胞の保護に有効であることが見出された。ここで、神経細胞の保護は、神経細胞死の抑制を含み、抑制とともに、神経細胞の増殖がみられてもよい。神経細胞の保護のメカニズムは明らかではないが、後述する実施例の結果によれば、抗酸化性とエネルギー代謝促進作用の両方がメカニズムとして示唆される。
本発明者らによって、マルビジン－３，５－ジグルコシドは、神経細胞の保護に有効であることが見出された。ここで、神経細胞の保護は、神経細胞死の抑制を含み、抑制とともに、神経細胞の増殖がみられてもよい。神経細胞の保護のメカニズムは明らかではないが、後述する実施例の結果によれば、抗酸化性とエネルギー代謝促進作用の両方がメカニズムとして示唆される。
本発明の神経機能調節剤は、マルビジン－３，５－ジグルコシドを有効成分として含有するものであるが、その他の成分を含んでいてもよい。例えば、マルビジン－３，５－ジグルコシド以外のアントシアニン（例えば、デルフィニジン－３－グルコシド、マルビジン－３－グルコシド、マルビシン－３－クマロイルグルコシド、マルビシン－３－クマロイルグルコシド－５－グルコシド）が挙げられる。
（疾患及び症状等）
本発明の神経機能調節剤は、神経細胞の保護を通して神経機能調節機能を発揮するため、神経細胞の損傷や神経細胞数の減少に関連する神経変性疾患や、種々の症状に有効であり、中でも抗老化に対する有効性が高い。後述する実施例では、アミロイドβタンパク質を蓄積させた老化促進モデルマウスにおいて、空間学習記憶の低下の抑制及び改善が認められており、アミロイドβタンパク質及びアミロイドβタンパク質による酸化ストレス等が原因と考えられる神経変性疾患や、種々の症状に有効である。
具体的には、本発明の神経機能調節剤は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病等の神経変性疾患等の改善、予防を目的として使用することができる。
また、本発明の神経機能調節剤は、抗ストレス、抗疲労を目的として使用することができる。
さらに、本発明の神経機能調節剤は、学習能力、記憶力、反射反応能力等の神経機能の回復、向上を目的として使用することができる。
本発明の神経機能調節剤は、抗老化、抗ストレス、抗疲労、学習能力回復・向上、記憶力回復・向上、反射反応能力回復・向上用の剤であることができる。
本発明の神経機能調節剤は、健常人に投与することもできる。
本発明の神経機能調節剤は、神経細胞の保護を通して神経機能調節機能を発揮するため、神経細胞の損傷や神経細胞数の減少に関連する神経変性疾患や、種々の症状に有効であり、中でも抗老化に対する有効性が高い。後述する実施例では、アミロイドβタンパク質を蓄積させた老化促進モデルマウスにおいて、空間学習記憶の低下の抑制及び改善が認められており、アミロイドβタンパク質及びアミロイドβタンパク質による酸化ストレス等が原因と考えられる神経変性疾患や、種々の症状に有効である。
具体的には、本発明の神経機能調節剤は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病等の神経変性疾患等の改善、予防を目的として使用することができる。
また、本発明の神経機能調節剤は、抗ストレス、抗疲労を目的として使用することができる。
さらに、本発明の神経機能調節剤は、学習能力、記憶力、反射反応能力等の神経機能の回復、向上を目的として使用することができる。
本発明の神経機能調節剤は、抗老化、抗ストレス、抗疲労、学習能力回復・向上、記憶力回復・向上、反射反応能力回復・向上用の剤であることができる。
本発明の神経機能調節剤は、健常人に投与することもできる。
（投与方法）
本発明の神経機能調節剤の投与対象としては、哺乳動物が挙げられ、例えば、ヒト、家畜（ウマ、ウシ、ブタ等）、愛玩動物（イヌ、ネコ等）、実験（試験）動物（マウス、ラット等）であり、好ましくはヒトである。
本発明の神経機能調節剤の投与量は、投与対象、年齢、体重、症状等を考慮して、適宜設定することができる。例えば、マルビジン－３，５－ジグルコシドの投与量で、投与対象（ヒト）の体重１ｋｇ当たり、０．００８ｍｇ／日以上、４ｍｇ／日以下が挙げられる。投与量は、好ましくは０．０４ｍｇ／日以上、より好ましくは０．０８ｍｇ／日以上であり、また、好ましくは１．６ｍｇ／日以下、より好ましくは０．８ｍｇ／日以下である。投与対象がヒト以外の場合、上記範囲を適宜、増減することにより設定することができる。投与は、１日に１回の投与であっても、複数回に分けた投与であってもよい。投与期間は、投与対象、年齢、体重、症状等を考慮して、適宜設定することができるが、継続的な使用が好ましい。
本発明の神経機能調節剤の投与対象としては、哺乳動物が挙げられ、例えば、ヒト、家畜（ウマ、ウシ、ブタ等）、愛玩動物（イヌ、ネコ等）、実験（試験）動物（マウス、ラット等）であり、好ましくはヒトである。
本発明の神経機能調節剤の投与量は、投与対象、年齢、体重、症状等を考慮して、適宜設定することができる。例えば、マルビジン－３，５－ジグルコシドの投与量で、投与対象（ヒト）の体重１ｋｇ当たり、０．００８ｍｇ／日以上、４ｍｇ／日以下が挙げられる。投与量は、好ましくは０．０４ｍｇ／日以上、より好ましくは０．０８ｍｇ／日以上であり、また、好ましくは１．６ｍｇ／日以下、より好ましくは０．８ｍｇ／日以下である。投与対象がヒト以外の場合、上記範囲を適宜、増減することにより設定することができる。投与は、１日に１回の投与であっても、複数回に分けた投与であってもよい。投与期間は、投与対象、年齢、体重、症状等を考慮して、適宜設定することができるが、継続的な使用が好ましい。
（神経機能を調節する方法）
本発明は、上記神経機能調節剤を、投与対象に摂取させることを含む、神経機能を調節する方法に関する。この方法においては、投与対象からヒトを除くことができ、また、方法は、医療行為を除くものとすることができる。
本発明は、上記神経機能調節剤を、投与対象に摂取させることを含む、神経機能を調節する方法に関する。この方法においては、投与対象からヒトを除くことができ、また、方法は、医療行為を除くものとすることができる。
＜医薬組成物＞
本発明はまた、上記神経機能調節剤を含有する医薬組成物に関する。医薬組成物は、医薬品又は医薬部外品であることができる。
本発明はまた、上記神経機能調節剤を含有する医薬組成物に関する。医薬組成物は、医薬品又は医薬部外品であることができる。
医薬組成物は、製薬上許容される成分を含むことができ、例えば、担体、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン）、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、溶剤（例えば、水、食塩水、エタノール等の有機溶媒）が挙げられる。他の薬理活性を有する薬理成分を含むこともできる。
医薬組成物は、経口投与用であっても、非経口投与であってもよく、好ましくは、経口投与である。経口投与の場合、散剤、錠剤、コーティング剤、糖衣錠、ソフトカプセル又はハードカプセル、液剤、乳濁剤、懸濁剤の形態が挙げられる。非経口投与の場合、坐剤、注射剤、輸液、軟膏、クリーム、ゲル剤の形態が挙げられる。
対象となる疾患及び症状等、投与方法（投与対象、投与量、期間）は、上記神経機能調節剤と同様に設定することができる。本発明の医薬組成物は、神経機能調節用医薬組成物として使用することができ、抗老化、抗ストレス、抗疲労、学習能力回復・向上、記憶力回復・向上、反射反応能力回復・向上用の医薬組成物が挙げられる。
＜食品組成物＞
本発明によれば、上記神経機能調節剤を含有する食品組成物が提供される。食品組成物は、機能性食品、栄養補助食品、健康補助食品、栄養強化食品、機能性表示食品、特別用途食品、特定保健用食品又は栄養機能食品であることができる。
本発明によれば、上記神経機能調節剤を含有する食品組成物が提供される。食品組成物は、機能性食品、栄養補助食品、健康補助食品、栄養強化食品、機能性表示食品、特別用途食品、特定保健用食品又は栄養機能食品であることができる。
食品組成物は、食品の製造で許容される成分を含むことができ、例えば、担体、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン）、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、溶剤（例えば、水、食塩水、エタノール等の有機溶媒）が挙げられる。食品は、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、有機酸、有機塩基、香料等を含むこともできる。
食品組成物の形態は、特に限定されず、固体、液体、混合物、懸濁液、ペースト、ゲル、粉末、カプセルが挙げられ、飲料、菓子、調味料、惣菜、加工食品とすることができる。食品組成物は、サプリメントであってもよい。
対象となる疾患及び症状等、投与方法（投与対象、期間）は、上記神経機能調節剤と同様に設定することができる。本発明の食品組成物は、神経機能調節用食品組成物として使用することができ、抗老化、抗ストレス、抗疲労、学習能力回復・向上、記憶力回復・向上、反射反応能力回復・向上用の食品組成物が挙げられる。
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって制限されない。
＜試料の調製＞
各実験では、マルビジン－３，５－ジグルコシドとして、以下を用いた。
単品（Ｍ３，５Ｇ） ：マルビジン－３，５－ジグルコシドクロリド（富士フィルム和光純薬株式会社製）
単品（Ｍ） ：マルビジンクロリド（富士フィルム和光純薬社製）
単品（Ｍ３Ｇ） ：マルビジン－３－グルコシドクロリド（富士フィルム和光純薬社製）
抽出物：マルビジン－３，５－ジグルコシドを含むブドウ果皮抽出物
各実験では、マルビジン－３，５－ジグルコシドとして、以下を用いた。
単品（Ｍ３，５Ｇ） ：マルビジン－３，５－ジグルコシドクロリド（富士フィルム和光純薬株式会社製）
単品（Ｍ） ：マルビジンクロリド（富士フィルム和光純薬社製）
単品（Ｍ３Ｇ） ：マルビジン－３－グルコシドクロリド（富士フィルム和光純薬社製）
抽出物：マルビジン－３，５－ジグルコシドを含むブドウ果皮抽出物
上記抽出物の調製方法は、以下のとおりである。
ブドウ（品種名：富士の夢（行者の水（サンカクヅル）とメルロー（ヨーロッパブドウ）の交配種））の果実を圧搾して果汁を除いた後の果皮を、ステンレス製の網かごの上に互いが触れ合わないように置いて、乾燥機を用いて７０℃の温風をあててブドウ果皮乾燥物を得た。得られたブドウ果皮乾燥物６ｇに、２％ギ酸メタノール水（メタノール：超純水：ギ酸＝７０：２８：２（ｖ／ｖ／ｖ））４０ｍＬを加え、１２時間、室温遮光条件下で撹拌（３６０ｒｐｍ）した。抽出溶液を、濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製 定量濾紙Ｎｏ．５Ａ、１１０mm）を用いて濾過し、濾過した抽出溶液を濃縮及び凍結乾燥してブドウ果皮抽出物の粉末３ｇを得た。
得られたブドウ果皮抽出物の粉末をメタノールに溶解し、高速液体クロマトグラフィー－質量分析（ＨＰＬＣ／ＭＳ）を行い、抽出物粉末１ｇに対して、マルビジン－３，５－ジグルコシド８６．８ｍｇ、デルフィニジン－３－グルコシド４９．２ｍｇ、マルビジン-３－グルコシド２．６ｍｇ、マルビシン－３－クマロイルグルコシド１２．６ｍｇ、マルビシン－３－クマロイルグルコシド－５－グルコシド５１．５ｍｇが含まれていることを確認した。成分の同定及び定量は、ＬＣ－ＭＳ分析のライブラリーで確認するとともに、標準品の測定値との対比により行った。
ブドウ（品種名：富士の夢（行者の水（サンカクヅル）とメルロー（ヨーロッパブドウ）の交配種））の果実を圧搾して果汁を除いた後の果皮を、ステンレス製の網かごの上に互いが触れ合わないように置いて、乾燥機を用いて７０℃の温風をあててブドウ果皮乾燥物を得た。得られたブドウ果皮乾燥物６ｇに、２％ギ酸メタノール水（メタノール：超純水：ギ酸＝７０：２８：２（ｖ／ｖ／ｖ））４０ｍＬを加え、１２時間、室温遮光条件下で撹拌（３６０ｒｐｍ）した。抽出溶液を、濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製 定量濾紙Ｎｏ．５Ａ、１１０mm）を用いて濾過し、濾過した抽出溶液を濃縮及び凍結乾燥してブドウ果皮抽出物の粉末３ｇを得た。
得られたブドウ果皮抽出物の粉末をメタノールに溶解し、高速液体クロマトグラフィー－質量分析（ＨＰＬＣ／ＭＳ）を行い、抽出物粉末１ｇに対して、マルビジン－３，５－ジグルコシド８６．８ｍｇ、デルフィニジン－３－グルコシド４９．２ｍｇ、マルビジン-３－グルコシド２．６ｍｇ、マルビシン－３－クマロイルグルコシド１２．６ｍｇ、マルビシン－３－クマロイルグルコシド－５－グルコシド５１．５ｍｇが含まれていることを確認した。成分の同定及び定量は、ＬＣ－ＭＳ分析のライブラリーで確認するとともに、標準品の測定値との対比により行った。
上記単品及び上記抽出物を用いて、以下の試料１～６を調製した。試料１～４は、後述する細胞生存実験、遺伝子発現実験、ＡＴＰ産生量測定実験及び活性酸素種量測定実験に用い、試料５及び６は、後述する動物実験に用いた。
試料１：上記単品（Ｍ３，５Ｇ）を７０％エタノール溶液（エタノール：水＝７０：３０（ｖ／ｖ））に溶解し、得られた溶液中の単品（Ｍ３，５Ｇ）の濃度が１２．５６μＭになるように調整し、各実験に用いた。
試料２：上記単品（Ｍ）を７０％エタノール溶液（エタノール：水＝７０：３０（ｖ／ｖ））に溶解し、得られた溶液中の単品（Ｍ）の濃度が１２．５６μＭになるように調整し、各実験に用いた。
試料３：上記単品（Ｍ３Ｇ）を７０％エタノール溶液（エタノール：水＝７０：３０（ｖ／ｖ））に溶解し、得られた溶液中の単品（Ｍ３Ｇ）の濃度が１２．５６μＭになるように調整し、各実験に用いた。
試料４：上記抽出物を７０％エタノール溶液（エタノール：水＝７０：３０（ｖ／ｖ））に溶解し、得られた溶液中の抽出物粉末の濃度が１００μｇ／ｍＬになるように調整し、各実験に用いた。マルビジン－３，５－ジグルコシドの濃度にすると１２．５６μＭである（クロリドで計算）。
試料５：上記単品（Ｍ３，５Ｇ）を超純水（Milli-Ｑ（登録商標）水）に溶解し、得られた溶液中の単品（Ｍ３，５Ｇ）の濃度が６５１μｇ／ｍＬになるように調整し、動物実験に用いた。
試料６：上記抽出物を超純水（Milli-Ｑ（登録商標）水）に溶解し、得られた溶液中の抽出物粉末の濃度が７．５ｍｇ／ｍＬになるように調整し、動物実験に用いた。溶液中のマルビジン－３，５－ジグルコシドの濃度は６５１μｇ／ｍＬとなる（クロリドで計算）。
試料１：上記単品（Ｍ３，５Ｇ）を７０％エタノール溶液（エタノール：水＝７０：３０（ｖ／ｖ））に溶解し、得られた溶液中の単品（Ｍ３，５Ｇ）の濃度が１２．５６μＭになるように調整し、各実験に用いた。
試料２：上記単品（Ｍ）を７０％エタノール溶液（エタノール：水＝７０：３０（ｖ／ｖ））に溶解し、得られた溶液中の単品（Ｍ）の濃度が１２．５６μＭになるように調整し、各実験に用いた。
試料３：上記単品（Ｍ３Ｇ）を７０％エタノール溶液（エタノール：水＝７０：３０（ｖ／ｖ））に溶解し、得られた溶液中の単品（Ｍ３Ｇ）の濃度が１２．５６μＭになるように調整し、各実験に用いた。
試料４：上記抽出物を７０％エタノール溶液（エタノール：水＝７０：３０（ｖ／ｖ））に溶解し、得られた溶液中の抽出物粉末の濃度が１００μｇ／ｍＬになるように調整し、各実験に用いた。マルビジン－３，５－ジグルコシドの濃度にすると１２．５６μＭである（クロリドで計算）。
試料５：上記単品（Ｍ３，５Ｇ）を超純水（Milli-Ｑ（登録商標）水）に溶解し、得られた溶液中の単品（Ｍ３，５Ｇ）の濃度が６５１μｇ／ｍＬになるように調整し、動物実験に用いた。
試料６：上記抽出物を超純水（Milli-Ｑ（登録商標）水）に溶解し、得られた溶液中の抽出物粉末の濃度が７．５ｍｇ／ｍＬになるように調整し、動物実験に用いた。溶液中のマルビジン－３，５－ジグルコシドの濃度は６５１μｇ／ｍＬとなる（クロリドで計算）。
＜実施例１：細胞生存実験＞
以下の実験により、マルビジン－３，５－ジグルコシドの神経細胞死の抑制作用を確認した。
以下の実験により、マルビジン－３，５－ジグルコシドの神経細胞死の抑制作用を確認した。
ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ社製、ウェル数９６）の各ウェルに、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（神経細胞のモデル細胞、ＡＴＣＣ社製）を２×１０5セル／ｍＬの濃度で、１００μＬ／ウェル藩種し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。細胞培養培地は、Ｆ１２／ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社製）、１５％ＦＢＳ（Ｂｉｏ Ｗｅｓｔ社製）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ社製）を混合したものを用いた。
２４時間後、培養培地をアスピレーターにより完全に除去し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）の培地を１００μＬ／ウェル添加し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
その後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭをアスピレーターにより完全に除去し、ＭＴＴ試薬（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド、５ｍｇ／ｍＬ）をＯｐｔｉ－ＭＥＭに混合（ＭＴＴ試薬：Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ＝１：１０）したものを、１１０μＬ／ウェル添加し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。次いで、１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液を、１００μＬ／ウェル添加し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
その後、マイクロプレートリーダー（大日本住友製薬社製）を用いて、５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＭＴＴホルマザン産出量を求め、相対細胞生存率を算出した（図１中、「対照」）。
２４時間後、培養培地をアスピレーターにより完全に除去し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）の培地を１００μＬ／ウェル添加し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
その後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭをアスピレーターにより完全に除去し、ＭＴＴ試薬（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド、５ｍｇ／ｍＬ）をＯｐｔｉ－ＭＥＭに混合（ＭＴＴ試薬：Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ＝１：１０）したものを、１１０μＬ／ウェル添加し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。次いで、１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液を、１００μＬ／ウェル添加し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
その後、マイクロプレートリーダー（大日本住友製薬社製）を用いて、５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＭＴＴホルマザン産出量を求め、相対細胞生存率を算出した（図１中、「対照」）。
ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ社製、ウェル数９６）へのＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞播種２４時間後、培養培地をアスピレーターにより完全に除去し、アミロイドβタンパク質（Ｂｅｔａ－Ａｍｙｌｏｉｄ １－４２、ＡｎａＳｐｅｃ社製）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）に最終濃度１５μＭとなるよう混合し、混合物を１００μＬ／ウェル添加し、７２時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養し、細胞死を誘導したこと以外は、上記と同様にして、ＭＴＴホルマザン産出量を求め、相対細胞生存率を算出した（図１中、「Ａβ」）。
ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ社製、ウェル数９６）へのＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞播種２４時間後、培養培地をアスピレーターにより完全に除去し、試料１をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）に最終濃度１２．５６μMとなるよう混合し、混合物を９０μＬ／ウェル添加し、１０分間放置し、次いでアミロイドβタンパク質（Ｂｅｔａ－Ａｍｙｌｏｉｄ １－４２、ＡｎａＳｐｅｃ社製）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）に濃度１５０μＭとなるよう混合し、混合物を１０μＬ／ウェル添加し、７２時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養し、細胞死を誘導したこと以外は、上記と同様にして、ＭＴＴホルマザン産出量を求め、相対細胞生存率を算出した（図１中、「Ａβ＋Ｍ３，５Ｇ」）。
試料１に代えて試料２を用いた他は、上記と同様にして、相対細胞生存率を算出した（図１中、「Ａβ＋Ｍ）。
試料１に代えて試料３を用いた他は、上記と同様にして、相対細胞生存率を算出した（図１中、「Ａβ＋Ｍ３Ｇ」）。
ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ社製、ウェル数９６）へのＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞播種２４時間後、培養培地をアスピレーターにより完全に除去し、試料４をＯｐｔｉ－ＭＥＭに最終濃度２００μｇ／mＬとなるよう混合し、混合物を９０μＬ／ウェル添加し、１０分間放置し、次いでアミロイドβタンパク質（Ｂｅｔａ－Ａｍｙｌｏｉｄ １－４２、ＡｎａＳｐｅｃ社製）をＯｐｔｉ－ＭＥＭに濃度１５０μＭとなるよう混合し、混合物を１０μＬ／ウェル添加し、７２時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養し、細胞死を誘導したこと以外は、上記と同様にして、ＭＴＴホルマザン産出量を求め、相対細胞生存率を算出した（図１中、「Ａβ＋抽出物」）。
結果を図１に示す。
図中の「対照」と「Ａβ」を比較すると、前者に対し後者の相対細胞生存率は顕著に低く、アミロイドβタンパク質による処理によって細胞死が誘導されていることがわかった。
図中の「Ａβ＋Ｍ３，５Ｇ」を見ると、相対細胞生存率は、「Ａβ」よりも有意に高く、アミロイドβタンパク質による細胞死が、マルビジン－３，５－ジグルコシドにより、抑制されることがわかった。細胞死の抑制は、図中の「Ａβ＋Ｍ」に示されるとおり、マルビジンについても確認されたが、図中の「Ａβ＋Ｍ３Ｇ」に示されるとおり、マルビジン－３－グルコシドについては確認されなかった。
図中の「Ａβ＋抽出物」を見ると、相対細胞生存率は、「Ａβ」よりも有意に高く、「対照」と同程度であり、マルビジン－３，５－ジグルコシドを抽出物として用いると、高い抑制作用が得られることがわかった。「Ａβ＋抽出物」の相対細胞生存率の高さから、マルビジン－３，５－ジグルコシドが細胞死の抑制作用のみならず、細胞の増殖作用も有する可能性が示唆される。
図中の「対照」と「Ａβ」を比較すると、前者に対し後者の相対細胞生存率は顕著に低く、アミロイドβタンパク質による処理によって細胞死が誘導されていることがわかった。
図中の「Ａβ＋Ｍ３，５Ｇ」を見ると、相対細胞生存率は、「Ａβ」よりも有意に高く、アミロイドβタンパク質による細胞死が、マルビジン－３，５－ジグルコシドにより、抑制されることがわかった。細胞死の抑制は、図中の「Ａβ＋Ｍ」に示されるとおり、マルビジンについても確認されたが、図中の「Ａβ＋Ｍ３Ｇ」に示されるとおり、マルビジン－３－グルコシドについては確認されなかった。
図中の「Ａβ＋抽出物」を見ると、相対細胞生存率は、「Ａβ」よりも有意に高く、「対照」と同程度であり、マルビジン－３，５－ジグルコシドを抽出物として用いると、高い抑制作用が得られることがわかった。「Ａβ＋抽出物」の相対細胞生存率の高さから、マルビジン－３，５－ジグルコシドが細胞死の抑制作用のみならず、細胞の増殖作用も有する可能性が示唆される。
＜実施例２：遺伝子発現実験＞
以下の実験により、マルビジン－３，５－ジグルコシドの神経細胞死の抑制作用のメカニズムを解析した。
以下の実験により、マルビジン－３，５－ジグルコシドの神経細胞死の抑制作用のメカニズムを解析した。
１００ｍｍ細胞ディッシュ（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ社製）に、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を３．７×１０5セル／ｍＬの濃度で、１０ｍＬ／ディッシュで藩種し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。細胞培養培地は、Ｆ１２／ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社製）、１５％ＦＢＳ（Ｂｉｏ Ｗｅｓｔ社製）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ社製）を混合したものを用いた。２４時間後、培養培地をアスピレーターにより完全に除去し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）の培地を１０ｍＬ／ディッシュ添加し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。その後、培養細胞から、ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、下記の遺伝子発現について解析を行った（図２～８中、「対照」）。
なお、ＲＮＡ抽出に関しては、ＩＳＯＧＥＮ試薬（ニッポンジーン社製）を用いて、ニッポンジーン社推奨プロトコールに準じてＲＮＡ抽出を行なった（URL: https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/tds/tds#isogen-rna-dna-protein.pdf参照）。またリアルタイムＰＣＲ法に関してはＴａｑＭａｎ Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ用試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社推奨プロトコールに準じて行なった（URL: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/4304449#TaqManPCRMM#UG.pdf参照）。
なお、ＲＮＡ抽出に関しては、ＩＳＯＧＥＮ試薬（ニッポンジーン社製）を用いて、ニッポンジーン社推奨プロトコールに準じてＲＮＡ抽出を行なった（URL: https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/tds/tds#isogen-rna-dna-protein.pdf参照）。またリアルタイムＰＣＲ法に関してはＴａｑＭａｎ Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ用試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社推奨プロトコールに準じて行なった（URL: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/4304449#TaqManPCRMM#UG.pdf参照）。
ＭＡＰ２Ｋ４（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ４）
ＭＡＰＫ１４（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４）
ＭＡＰＫ８（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ８）
ＰＩ３ＫＣＡ（ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスホスフェート３－キナーゼ 触媒サブユニットα）
ＡＫＴ１（ＡＫＴセリン／スレオニンキナーゼ１）
ＰＡＲＰ１（ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ１）
ＣＡＳＰ３（カスパーゼ－３）
ＭＡＰＫ１４（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４）
ＭＡＰＫ８（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ８）
ＰＩ３ＫＣＡ（ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスホスフェート３－キナーゼ 触媒サブユニットα）
ＡＫＴ１（ＡＫＴセリン／スレオニンキナーゼ１）
ＰＡＲＰ１（ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ１）
ＣＡＳＰ３（カスパーゼ－３）
これらの遺伝子は、ストレス応答ＭＡＰＫ経路に関与する遺伝子である。紫外線や放射線、酸化ストレス、熱ショックなどの様々な環境ストレス刺激によって活性化され、ストレスを被った細胞に細胞死（アポトーシス）を誘導することが知られている。このシグナル経路はアミロイドβによっても活性化され、神経変性疾患の制御に中心的な役割を果たしていることが知られている。一連のマイトジェン活性化プロテインキナーゼから、ＰＩ３ＫＣＡ及びＡＫＴ１へのシグナル経路と、一連のマイトジェン活性化プロテインキナーゼから、ＣＡＳＰ３及びＰＡＲＰ１へのシグナル経路があり、前者はミトコンドリア活性に関与し、後者はアポトーシスに関与する。
１００ｍｍ細胞ディッシュ（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ社製）へのＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞播種２４時間後、培養培地をアスピレーターにより完全に除去し、アミロイドβタンパク質（Ｂｅｔａ－Ａｍｙｌｏｉｄ １－４２、ＡｎａＳｐｅｃ社製）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）に最終濃度５μＭとなるよう混合し、混合物を１０ｍＬ／ディッシュ添加し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養し、ＲＮＡを抽出したこと以外は、上記と同様にして、上記の遺伝子発現について解析を行った（図２～８中、「Ａβ」）。
１００ｍｍ細胞ディッシュ（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ社製）へのＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞播種２４時間後、培養培地をアスピレーターにより完全に除去し、試料１をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）に最終濃度１２．５６μＭとなるよう混合し、混合物を９，９９０μＬ／ディッシュ添加し、１０分間放置し、次いでアミロイドβタンパク質（Ｂｅｔａ－Ａｍｙｌｏｉｄ １－４２、ＡｎａＳｐｅｃ社製）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）に最終濃度５μＭとなるよう混合し、混合物を１０μＬ／ディッシュ添加し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養し、ＲＮＡ抽出を行なったこと以外は、上記と同様にして、上記の遺伝子発現について解析を行った（図２～８中、「Ａβ＋Ｍ３，５Ｇ」）。
試料１に代えて試料２を用いた他は、上記と同様にして、上記の遺伝子発現について解析を行った（図２～８中、「Ａβ＋Ｍ」）。
試料１に代えて試料３を用いた他は、上記と同様にして、上記の遺伝子発現について解析を行った（図２～８中、「Ａβ＋Ｍ３Ｇ」）。
１００ｍｍ細胞ディッシュ（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ社製）へのＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞播種２４時間後、培養培地をアスピレーターにより完全に除去し、試料１をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）に混合し、１０ｍＬ／ディッシュ添加し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養し、ＲＮＡ抽出を行なったこと以外は、上記と同様にして、上記の遺伝子発現について解析を行った（図２～８中、「Ｍ３，５Ｇ」）。
結果を図２～８に示す。
図中の「Ａβ」では、「対照」に比べて、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰＫ１４、ＭＡＰＫ８、ＰＩ３ＫＣＡ、ＡＫＴ１及びＰＡＲＰ１の発現が有意に低下し、ＣＡＳＰ３の発現が有意に増加していた。
一方、図中の「Ｍ３，５Ｇ」では、「対照」に比べて、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰＫ１４、ＭＡＰＫ８、ＰＩ３ＫＣＡ及びＡＫＴ１の発現が有意に増加し、ＣＡＳＰ３の発現が有意に低下し、ＰＡＲＰ１は発現が同程度であった。
さらに、図中の「Ａβ＋Ｍ３，５Ｇ」では、「Ａβ」に比べて、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰＫ１４、ＭＡＰＫ８、ＰＩ３ＫＣＡ、ＡＫＴ１及びＰＡＲＰ１の発現は有意に高く、また、ＣＡＳＰ３の発現は有意に低かった。また、「対照」に比べても、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰＫ８、ＰＩ３ＫＣＡ、ＡＫＴ１の発現は高く、ＣＡＳＰ３の発現は有意に低かった。
マルビジン－３，５－ジグルコシドは、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰＫ１４、ＭＡＰＫ８、ＰＩ３ＫＣＡ及びＡＫＴ１の発現を増強させる作用を有し、アミロイドβタンパク質処理によるこれらの発現低下を回復させ、これを介したミトコンドリア活性の上昇によるエネルギー代謝促進に寄与していることが示唆される。
また、マルビジン－３，５－ジグルコシドは、ＣＡＳＰ３の発現を低下させる作用を有し、アミロイドβタンパク質処理によるこの発現増加を低減し、これを介してアポトーシスを抑制していることが示唆される。
一方、アミロイドβタンパク質処理の細胞においては、図中の「Ａβ＋Ｍ」に示されるとおり、マルビジンによっても、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰＫ１４、ＭＡＰＫ８、ＰＩ３ＫＣＡ、ＡＫＴ１、ＰＡＲＰ１の発現の増加、ＣＡＳＰ３の発現の低下が見られ、また、「Ａβ＋Ｍ３Ｇ」に示されるとおり、マルビジン－３－グルコシドによっても、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰＫ１４、ＰＩ３ＫＣＡ，ＡＫＴ１、ＰＡＲＰ１の発現の増加が見られたが、マルビジン－３，５－ジグルコシドは、ＭＡＰ２Ｋ４、ＰＩ３ＫＣＡ、ＡＫＴ１の発現の増加、ＣＡＳＰ３の発現の低下において、これらの中で最も高い活性を示した。活性の高さは、マルビジン－３，５－ジグルコシド、マルビジン、マルビジン－３－グルコシドの順であることがわかる。
図中の「Ａβ」では、「対照」に比べて、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰＫ１４、ＭＡＰＫ８、ＰＩ３ＫＣＡ、ＡＫＴ１及びＰＡＲＰ１の発現が有意に低下し、ＣＡＳＰ３の発現が有意に増加していた。
一方、図中の「Ｍ３，５Ｇ」では、「対照」に比べて、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰＫ１４、ＭＡＰＫ８、ＰＩ３ＫＣＡ及びＡＫＴ１の発現が有意に増加し、ＣＡＳＰ３の発現が有意に低下し、ＰＡＲＰ１は発現が同程度であった。
さらに、図中の「Ａβ＋Ｍ３，５Ｇ」では、「Ａβ」に比べて、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰＫ１４、ＭＡＰＫ８、ＰＩ３ＫＣＡ、ＡＫＴ１及びＰＡＲＰ１の発現は有意に高く、また、ＣＡＳＰ３の発現は有意に低かった。また、「対照」に比べても、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰＫ８、ＰＩ３ＫＣＡ、ＡＫＴ１の発現は高く、ＣＡＳＰ３の発現は有意に低かった。
マルビジン－３，５－ジグルコシドは、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰＫ１４、ＭＡＰＫ８、ＰＩ３ＫＣＡ及びＡＫＴ１の発現を増強させる作用を有し、アミロイドβタンパク質処理によるこれらの発現低下を回復させ、これを介したミトコンドリア活性の上昇によるエネルギー代謝促進に寄与していることが示唆される。
また、マルビジン－３，５－ジグルコシドは、ＣＡＳＰ３の発現を低下させる作用を有し、アミロイドβタンパク質処理によるこの発現増加を低減し、これを介してアポトーシスを抑制していることが示唆される。
一方、アミロイドβタンパク質処理の細胞においては、図中の「Ａβ＋Ｍ」に示されるとおり、マルビジンによっても、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰＫ１４、ＭＡＰＫ８、ＰＩ３ＫＣＡ、ＡＫＴ１、ＰＡＲＰ１の発現の増加、ＣＡＳＰ３の発現の低下が見られ、また、「Ａβ＋Ｍ３Ｇ」に示されるとおり、マルビジン－３－グルコシドによっても、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰＫ１４、ＰＩ３ＫＣＡ，ＡＫＴ１、ＰＡＲＰ１の発現の増加が見られたが、マルビジン－３，５－ジグルコシドは、ＭＡＰ２Ｋ４、ＰＩ３ＫＣＡ、ＡＫＴ１の発現の増加、ＣＡＳＰ３の発現の低下において、これらの中で最も高い活性を示した。活性の高さは、マルビジン－３，５－ジグルコシド、マルビジン、マルビジン－３－グルコシドの順であることがわかる。
＜実施例３：ＡＴＰ産生量測定実験＞
以下の実験により、神経細胞におけるＡＴＰ産生量を測定し、マルビジン－３，５－ジグルコシドによるエネルギー代謝促進を確認した。
以下の実験により、神経細胞におけるＡＴＰ産生量を測定し、マルビジン－３，５－ジグルコシドによるエネルギー代謝促進を確認した。
具体的には、ＡＴＰ測定試薬（『細胞の』ＡＴＰ測定試薬、東洋ビーネット社製）を用いて、東洋ビーネット社推奨のプロトコール（URL: https://search.cosmobio.co.jp/cosmo#search#p/search#gate2/docs/TIC#/CA10.20131125.pdf）に準じて、ＡＴＰ産生量を求めた（図９中、「対照」）。
具体的には、ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ社製、ウェル数９６）の各ウェルに、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（神経細胞のモデル細胞、ＡＴＣＣ社製）を２×１０5セル／ｍＬの濃度で、１００μＬ／ウェル藩種し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。細胞培養培地は、Ｆ１２／ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社製）、１５％ＦＢＳ（Ｂｉｏ Ｗｅｓｔ社製）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ社製）を混合したものを用いた。
２４時間後、培養培地をアスピレーターにより完全に除去し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）の培地を１００μＬ／ウェル添加し、６、１２及び２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。各処理時間後、ＡＴＰ測定試薬（『細胞の』ＡＴＰ測定試薬、東洋インキ社製）を１００μＬ／ウェル添加し、混合を行い、１０分間、暗所室温で反応させた。次いで、細胞溶液とＡＴＰ測定試薬の混合溶液１５０μＬを白色のウェルプレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製、ウェル数９６）にマイクロピペットを用いて移した。その後、マイクロプレートリーダー（大日本住友製薬社製）を用いて、所定時間経過後の発光量を測定し、ＡＴＰ産生量を算出した（図９中、「対照」）。
具体的には、ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ社製、ウェル数９６）の各ウェルに、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（神経細胞のモデル細胞、ＡＴＣＣ社製）を２×１０5セル／ｍＬの濃度で、１００μＬ／ウェル藩種し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。細胞培養培地は、Ｆ１２／ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社製）、１５％ＦＢＳ（Ｂｉｏ Ｗｅｓｔ社製）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ社製）を混合したものを用いた。
２４時間後、培養培地をアスピレーターにより完全に除去し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）の培地を１００μＬ／ウェル添加し、６、１２及び２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。各処理時間後、ＡＴＰ測定試薬（『細胞の』ＡＴＰ測定試薬、東洋インキ社製）を１００μＬ／ウェル添加し、混合を行い、１０分間、暗所室温で反応させた。次いで、細胞溶液とＡＴＰ測定試薬の混合溶液１５０μＬを白色のウェルプレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製、ウェル数９６）にマイクロピペットを用いて移した。その後、マイクロプレートリーダー（大日本住友製薬社製）を用いて、所定時間経過後の発光量を測定し、ＡＴＰ産生量を算出した（図９中、「対照」）。
ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ社製、ウェル数９６）へのＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞播種２４時間後、培養培地をアスピレーターにより完全に除去し、試料１をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）に最終濃度１２．５６μＭとなるよう混合し、１００μＬ／ウェル添加したこと以外は、上記と同様にして、ＡＴＰ産生量を求めた（図９中、「Ｍ３，５Ｇ」）。
ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ社製、ウェル数９６）へのＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞播種２４時間後、培養培地をアスピレーターにより完全に除去し、試料２をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）に２００μｇ／ｍＬとなるよう混合し、１００μＬ／ウェル添加したこと以外は、上記と同様にして、ＡＴＰ産生量を求めた（図９中、「抽出物」）。
ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ社製、ウェル数９６）へのＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞播種２４時間後、培養培地をアスピレーターにより完全に除去し、試料２をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）に２００μｇ／ｍＬとなるよう混合し、１００μＬ／ウェル添加したこと以外は、上記と同様にして、ＡＴＰ産生量を求めた（図９中、「抽出物」）。
結果を図９に示す。
図中の「Ｍ３，５Ｇ」、「抽出物」のいずれも「対照」に比べて、ＡＴＰ産生量が増加していた。マルビジン－３，５－ジグルコシドによるミトコンドリア活性の上昇によるエネルギー代謝促進が示唆される。
図中の「Ｍ３，５Ｇ」、「抽出物」のいずれも「対照」に比べて、ＡＴＰ産生量が増加していた。マルビジン－３，５－ジグルコシドによるミトコンドリア活性の上昇によるエネルギー代謝促進が示唆される。
＜実施例４：活性酸素種量測定実験＞
以下の実験により、神経細胞における活性酸素種量を測定し、マルビジン－３，５－ジグルコシドによる酸化ストレス低下を確認した。
以下の実験により、神経細胞における活性酸素種量を測定し、マルビジン－３，５－ジグルコシドによる酸化ストレス低下を確認した。
具体的には、ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ（商標） Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＯＳ測定アッセイキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｋ．社製）を用いて、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｋ．社の推奨プロトコール（URL: https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/STA-342-ROS-assay-kit.pdf）に準じて活性酸素種量を求めた（図１０中、「対照」）。
具体的には、ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ社製、ウェル数９６）の各ウェルに、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（神経細胞のモデル細胞、ＡＴＣＣ社）を２×１０5セル／ｍＬの濃度で、１００μＬ／ウェル藩種し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。細胞培養培地は、Ｆ１２／ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社製）、１５％ＦＢＳ（Ｂｉｏ Ｗｅｓｔ社製）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ社製）を混合したものを用いた。
２４時間後、培養培地をアスピレーターにより完全に除去し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）の培地に２０Ｘ ＤＣＦＨ－ＤＡ（測定キットに含まれる試薬）を混合（２０倍希釈）し１００μＬ／ウェル添加し、1時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。その後Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）及び２０Ｘ ＤＣＦＨ－ＤＡ（測定キットに含まれる試薬）混合培地をアスピレーターにより完全に除去し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）の培地を１００μＬ／ウェル添加し、１時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。その後、２Ｘ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（測定キットに含まれる試薬）を１００μＬ／ウェル添加し、混合を行い、１０分間、暗所室温の条件下で反応させた。次いで、各ウェル中の溶液１５０μＬを別のウェルプレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製、ウェル数９６）にマイクロピペットを用いて移した。その後、マイクロプレートリーダー（大日本住友製薬社製）を用いて、４８０ｎｍ／５３０ｎｍにおける蛍光量を測定し、相対ＲＯＳ産生量を算出した（図１０中、「対照」）。
具体的には、ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ社製、ウェル数９６）の各ウェルに、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（神経細胞のモデル細胞、ＡＴＣＣ社）を２×１０5セル／ｍＬの濃度で、１００μＬ／ウェル藩種し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。細胞培養培地は、Ｆ１２／ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社製）、１５％ＦＢＳ（Ｂｉｏ Ｗｅｓｔ社製）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ社製）を混合したものを用いた。
２４時間後、培養培地をアスピレーターにより完全に除去し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）の培地に２０Ｘ ＤＣＦＨ－ＤＡ（測定キットに含まれる試薬）を混合（２０倍希釈）し１００μＬ／ウェル添加し、1時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。その後Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）及び２０Ｘ ＤＣＦＨ－ＤＡ（測定キットに含まれる試薬）混合培地をアスピレーターにより完全に除去し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）の培地を１００μＬ／ウェル添加し、１時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。その後、２Ｘ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（測定キットに含まれる試薬）を１００μＬ／ウェル添加し、混合を行い、１０分間、暗所室温の条件下で反応させた。次いで、各ウェル中の溶液１５０μＬを別のウェルプレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製、ウェル数９６）にマイクロピペットを用いて移した。その後、マイクロプレートリーダー（大日本住友製薬社製）を用いて、４８０ｎｍ／５３０ｎｍにおける蛍光量を測定し、相対ＲＯＳ産生量を算出した（図１０中、「対照」）。
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）及び２０Ｘ ＤＣＦＨ－ＤＡ（測定キットに含まれる試薬）混合培地処理１時間後、混合培地をアスピレーターにより完全に除去し、アミロイドβタンパク質（Ｂｅｔａ－Ａｍｙｌｏｉｄ １－４２、ＡｎａＳｐｅｃ社製）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）に最終濃度５μＭとなるよう混合し、混合物を１００μＬ／ウェル添加し、1時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養したこと以外は、上記と同様にして、活性酸素種量を求めた（図１０中、「Ａβ」）。
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）及び２０Ｘ ＤＣＦＨ－ＤＡ（測定キットに含まれる試薬）混合培地処理1時間後、混合培地をアスピレーターにより完全に除去し、試料１及びアミロイドβタンパク質（Ｂｅｔａ－Ａｍｙｌｏｉｄ １－４２、ＡｎａＳｐｅｃ社製）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）に最終濃度がそれぞれ１２．５６μＭ及び５μＭとなるよう混合し、混合物を１００μＬ／ウェル添加し、1時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養したこと以外は、上記と同様にして、活性酸素種量を求めた（図１０中、「Ａβ＋Ｍ３，５Ｇ」）。
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）及び２０Ｘ ＤＣＦＨ－ＤＡ（測定キットに含まれる試薬）混合培地処理1時間後、混合培地をアスピレーターにより完全に除去し、試料２及びアミロイドβタンパク質（Ｂｅｔａ－Ａｍｙｌｏｉｄ １－４２、ＡｎａＳｐｅｃ社製）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）に最終濃度がそれぞれ１２．５６μＭ及び５μＭとなるよう混合し、混合物を１００μＬ／ウェル添加し、1時間、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養したこと以外は、上記と同様にして、活性酸素種量を求めた（図１０中、「Ａβ＋抽出物」）。
結果を図１０に示す。
「Ａβ」において、「対照」と比較し、有意なＲＯＳ産生量の増加が確認された。このことから「Ａβ」による酸化ストレスの増加が示唆される。一方、「Ａβ＋Ｍ３，５Ｇ」及び「Ａβ＋抽出物」において、「Ａβ」と比較して有意なＲＯＳ産生量の減少が確認され、かつ「対照」と比較して有意差が認められなかったことから、単品（Ｍ３，５Ｇ）及び抽出物処理により、Ａβが誘導する酸化ストレスを対照（酸化ストレスを受けていない状態）まで軽減することが示唆される。
「Ａβ」において、「対照」と比較し、有意なＲＯＳ産生量の増加が確認された。このことから「Ａβ」による酸化ストレスの増加が示唆される。一方、「Ａβ＋Ｍ３，５Ｇ」及び「Ａβ＋抽出物」において、「Ａβ」と比較して有意なＲＯＳ産生量の減少が確認され、かつ「対照」と比較して有意差が認められなかったことから、単品（Ｍ３，５Ｇ）及び抽出物処理により、Ａβが誘導する酸化ストレスを対照（酸化ストレスを受けていない状態）まで軽減することが示唆される。
＜実施例５：動物実験＞
以下の実験により、マルビジン－３，５－ジグルコシドの動物における学習記憶能力の改善作用を確認した。
以下の実験により、マルビジン－３，５－ジグルコシドの動物における学習記憶能力の改善作用を確認した。
動物実験において使用したマウス及び投与内容は、以下のとおりである。投与内容以外の飼育条件は、全部の群で共通である。
単品（Ｍ３，５Ｇ）投与（ＳＡＭＰ８）群：試料５を、１日当たりの投与量が、マウス体重１ｋｇ当たりマルビジン－３，５－ジグルコシド２．１７ｍｇとなる量で、老化促進マウス（ＳＡＭＰ８）（日本エスエルシー社より入手。１６週齢、体重２８～３０ｇ）１０匹に、３０日間経口投与した。（図１１～１３中、「老化促進マウス＋単品（Ｍ３，５Ｇ）
マウス体重１ｋｇ当たりマルビジン－３，５－ジグルコシド２．１７ｍｇのヒト等価用量は、ヒト体重１ｋｇ当たりマルビジン－３，５－ジグルコシド０．１８ｍｇに相当する。
抽出物投与（ＳＡＭＰ８）群：試料４を、１日当たりの投与量が、マウス体重１ｋｇ当たり抽出物粉末２５ｍｇ（試料６中のマルビジン－３，５－ジグルコシド２．１７ｍｇ）で、老化促進マウス（ＳＡＭＰ８）（１６週齢、体重２８～３０ｇ）１０匹に、３０日間経口投与した。（図１１～１３中、「老化促進マウス＋抽出物）
水投与（ＳＡＭＰ８）群：単品（Ｍ３，５Ｇ）投与群又は抽出物投与群で試料５又は試料６として投与したのとほぼ同量の飲料水を、老化促進マウス（ＳＡＭＰ８）（日本エスエルシー社より入手。１６週齢、体重２８～３０ｇ）１０匹に、３０日間経口投与した。（図１１～１３中、「老化促進マウス）
水投与（ＳＡＭＲ１）群：単品（Ｍ３，５Ｇ）投与群又は抽出物投与群で試料５又は試料６として投与したのとほぼ同量の飲料水を、正常老化マウス（ＳＡＭＲ１）（日本エスエルシー社より入手。１６週齢、体重２８．５～３４ｇ）１０匹に、３０日間経口投与した。（図１１～１３中、「正常老化マウス）
単品（Ｍ３，５Ｇ）投与（ＳＡＭＰ８）群：試料５を、１日当たりの投与量が、マウス体重１ｋｇ当たりマルビジン－３，５－ジグルコシド２．１７ｍｇとなる量で、老化促進マウス（ＳＡＭＰ８）（日本エスエルシー社より入手。１６週齢、体重２８～３０ｇ）１０匹に、３０日間経口投与した。（図１１～１３中、「老化促進マウス＋単品（Ｍ３，５Ｇ）
マウス体重１ｋｇ当たりマルビジン－３，５－ジグルコシド２．１７ｍｇのヒト等価用量は、ヒト体重１ｋｇ当たりマルビジン－３，５－ジグルコシド０．１８ｍｇに相当する。
抽出物投与（ＳＡＭＰ８）群：試料４を、１日当たりの投与量が、マウス体重１ｋｇ当たり抽出物粉末２５ｍｇ（試料６中のマルビジン－３，５－ジグルコシド２．１７ｍｇ）で、老化促進マウス（ＳＡＭＰ８）（１６週齢、体重２８～３０ｇ）１０匹に、３０日間経口投与した。（図１１～１３中、「老化促進マウス＋抽出物）
水投与（ＳＡＭＰ８）群：単品（Ｍ３，５Ｇ）投与群又は抽出物投与群で試料５又は試料６として投与したのとほぼ同量の飲料水を、老化促進マウス（ＳＡＭＰ８）（日本エスエルシー社より入手。１６週齢、体重２８～３０ｇ）１０匹に、３０日間経口投与した。（図１１～１３中、「老化促進マウス）
水投与（ＳＡＭＲ１）群：単品（Ｍ３，５Ｇ）投与群又は抽出物投与群で試料５又は試料６として投与したのとほぼ同量の飲料水を、正常老化マウス（ＳＡＭＲ１）（日本エスエルシー社より入手。１６週齢、体重２８．５～３４ｇ）１０匹に、３０日間経口投与した。（図１１～１３中、「正常老化マウス）
動物実験の内容は、以下のとおりである。
各群のマウスについて、経口投与終了の翌日より、モリス水迷路試験（プラットフォームテスト、プローブテスト）を行った。モリス水迷路として、直径１２０ｃｍ、深さ４５ｃｍのプールを用意した。プールの水面下に透明の台（プラットフォーム）を設置し、プールの内壁に等間隔で４カ所目印を設置したものを用いた。
各群のマウスについて、経口投与終了の翌日より、モリス水迷路試験（プラットフォームテスト、プローブテスト）を行った。モリス水迷路として、直径１２０ｃｍ、深さ４５ｃｍのプールを用意した。プールの水面下に透明の台（プラットフォーム）を設置し、プールの内壁に等間隔で４カ所目印を設置したものを用いた。
プラットフォームテスト：
マウスをプール内に投入し、マウスがプラットフォームに到達するまでにかかる時間を測定した。その際、制限時間を６０秒とし、到達できない場合は６０秒とした。到達後マウスは１５秒間、プラットフォーム上に置かれた。各群の各マウスについて、この実験を１日１回、７日間続けて行った。結果を図１１に示す。
マウスをプール内に投入し、マウスがプラットフォームに到達するまでにかかる時間を測定した。その際、制限時間を６０秒とし、到達できない場合は６０秒とした。到達後マウスは１５秒間、プラットフォーム上に置かれた。各群の各マウスについて、この実験を１日１回、７日間続けて行った。結果を図１１に示す。
プローブテスト：
試験最終日に、プラットフォームを取り除き、同様にマウスをプールに投入し、６０秒の間に、マウスが、プラットフォームが設置されていた場所を横切った回数及び同場所に滞在していた時間を測定した。結果を図１２及び１３に示す。
試験最終日に、プラットフォームを取り除き、同様にマウスをプールに投入し、６０秒の間に、マウスが、プラットフォームが設置されていた場所を横切った回数及び同場所に滞在していた時間を測定した。結果を図１２及び１３に示す。
プラットフォームテストは、マウスが目印等の視覚刺激を頼りにプラットフォームに到達するまでにかかる時間を指標として空間学習記憶を評価するものである。図１１に示されるように、正常老化マウス（水投与）については、到達時間が短縮していったのに対し、老化促進マウス（水投与）については、到達時間の短縮は見られなかった。抽出物を投与した老化促進マウスでは、正常老化マウス（水投与）と同程度の到達時間の短縮が見られた。マルビジン－３，５－ジグルコシドを投与した老化促進マウスと比べた場合、抽出物を投与した老化促進マウスの方が、到達時間の短縮幅は大きかった。
プローブテストは、プラットフォームが設置されていた場所を横切った回数及び同場所の滞在時間により、マウスの記憶保持能力を評価するものである。図１２及び１３に示されるように、老化促進マウス（水投与）は、正常老化マウス（水投与）に比べて、横切った回数が有意に少なく、また、滞在時間が有意に短かった。抽出物を投与した老化促進マウスでは、正常老化マウス（水投与）と同程度の横切った回数及び滞在時間が観察された。マルビジン－３，５－ジグルコシドを投与した老化促進マウスと比べた場合、抽出物を投与した老化促進マウスの方が、横切った回数が多く、また、滞在時間は長かった。
上記より、マルビジン－３，５－ジグルコシドの投与による、動物の学習記憶能力の改善が確認され、特に抽出物投与の場合に高い改善効果が得られることが示唆される。
本発明の神経機能調節剤は、神経細胞保護に有効であり、当該保護を介して神経機能調節作用を発揮するものであり、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病等の神経変性疾患等の改善、予防が期待でき、健康サプリメント等の食品、医薬品としての展開や関連市場の拡大が期待される。本発明の神経機能調節剤は、天然に存在する成分であるマルビジン－３，５－ジグルコシドを有効成分とするので、安全であり、日常的又は継続的な摂取に適していると考えられる。このように、本発明は、産業上の有用性が高い。
Claims (9)
- マルビジン－３，５－ジグルコシドを有効成分として含有する神経機能調節剤。
- 神経細胞の保護を介して神経機能調節作用を発揮する、請求項１に記載の神経機能調節剤。
- 前記神経細胞の保護が、アミロイドβタンパク質による神経細胞死の抑制を含む、請求項２に記載の神経機能調節剤。
- デルフィニジン－３－グルコシドを含有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の神経機能調節剤。
- 経口用である、請求項１～４のいずれか一項に記載の神経機能調節剤。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の神経機能調節剤を含有する医薬組成物。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の神経機能調節剤を含有する食品組成物。
- 機能性食品、栄養補助食品、健康補助食品、栄養強化食品、機能性表示食品、特別用途食品、特定保健用食品又は栄養機能食品である、請求項７に記載の食品組成物。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の神経機能調節剤を、投与対象に摂取させることを含む、神経機能を調節する方法。
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