WO2020230990A1

WO2020230990A1 - 세포외 소포를 고농도로 배양하기 위한 세포 배양배지 및 상기 세포 배양배지를 이용한 세포외 소포 고 함유 조건화 배양액의 제조방법

Info

Publication number: WO2020230990A1
Application number: PCT/KR2020/003126
Authority: WO
Inventors: 김준호; 유가은; 이정선; 장송선
Original assignee: 주식회사 바이오솔루션
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2020-03-05
Publication date: 2020-11-19
Also published as: US20210269766A1; KR102132457B1; JP2022531582A

Abstract

본 발명은 락토페린(lactoferrin)을 포함하는 세포외 소포(extracellular vesicles)를 고농도로 배양하기 위한 세포 배양배지; 세포를 상기 세포 배양배지에서 배양하는 것을 포함하는 세포외 소포를 고농도로 함유하는 조건화 배양액(conditioned medium)의 제조방법; 및 세포외 소포를 고농도로 함유하는 조건화 배양액을 제조하는데 사용하기 위한 락토페린의 용도에 관한 것이다.

Description

세포외 소포를 고농도로 배양하기 위한 세포 배양배지 및 상기 세포 배양배지를 이용한 세포외 소포 고 함유 조건화 배양액의 제조방법

세포 분비 물질 중 "세포외 소포(extracellular vesicles)"가 최근 주목을 받고 있다. 세포외 소포는 세포에서 배출되는 세포 모사 전달체로 크기가 30 nm 내지 2 μm (2,000 nm)인 작은 구형의 물체이다. 세포외 소포는 세포에서 배출되는 다양한 소포(vesicle)을 지칭하는 명칭으로, 주요 분류는 "엑소좀(exosome)" 및 "마이크로베지클(microvesicle)"이다. 세포외 소포의 종류는 소포들을 기능과 유래에 따라 학자별로 다르게 이름을 명명하여 엑토좀(Ectosome), 마이크로파티클(Microparticle), 탈레로좀(Tolerosomes), 프로스타토좀(Prostatosomes), 카디오좀(Cardiosomes), 벡소좀(Vexosomes) 등 다양한 이름으로 불리지만, 결국은 생성원리별로 크게 엔도좀 내강 내포(Endosome intraluminal vesicle) 유래의 엑소좀과 세포 막(Plasma membrane) 유래의 마이크로베지클 두 가지로 명명되는 것이 적절하다고 보고된다(Nat Rev Drug Discov. 2013 May;12(5):347-57). 이들의 주요 특징으로는 세포 유래 지질 이중층(lipid bilayer)으로 감싸여져 막 단백질을 가지고 있고 내부에는 세포 조절 단백질을 함유하고 있다.

세포외 소포 분야가 최근에 들어서야 활성화된 이유 중 하나는 세포외 소포의 작은 크기로 인해 그 외 분비 단백질과의 분리가 어려운 점과 배양액 내 세포외 소포의 낮은 함유율로 그 효과를 확인하기 어려운 점이 있었기 때문이다. 현재는 세포외 소포를 분리하는 기술을 확보하여(Biomed Res Int. 2018 Jan 30;2018:8545347) 그 효력 확인 및 임상 진행중이다(J Extracell Vesicles. (2015)31;4:30087).

하지만 세포 분비 물질 중 낮은 함유율을 가진 세포외 소포는 일반적인 세포 배양배지로 세포를 배양해 획득한 일반 조건화 배양액만에서 세포외 소포의 특이적인 효력을 확인하기 어렵고, 조건화 배양액에서 세포 외 소포를 분리하여 활용하더라도 세포외 소포의 절대량 부족으로 한계점을 가진다.

현재 세포가 더 많은 세포외 소포를 배출하도록 하여 조건화 배양액 내 세포외 소포의 함유율을 높이는 연구가 진행중이다. 기본적으로는 동일 공간에 많은 세포를 키워 세포가 분비하는 분비물 전체 농도를 높이는 방법이 사용된다 (Sci Rep. 2018 Jan 19;8(1):1171). 그러나 이 방법도 세포외 소포만의 비율을 높이는 방법이 아니기에 원인을 해결한 방법이 아니며, 분비 량을 높이는 데에 한계점을 가지며 비용적인 측면에 있어서 문제가 있다.

그렇기에 세포가 특이적으로 세포외 소포를 배출하는 방법이 필요하다. 즉, 세포에서 배출되는 세포외 소포만이 특이적으로 높아지는 방식이라면, 배양액내 세포외 소포 함유율이 높아지고 절대량 또한 높아질 것이다.

단일 세포 당 배출하는 세포외 소포 생산능을 향상시키기 위한 기술 개발의 핵심은 세포 배양배지에 인체 독성 물질이 함유되지 않고, 고비용/비효율적인 작업이 요구되지 않아야 한다는 점이다. 또한 사용된 물질이 세포외 소포 기능에 부정적인 영향을 미치지 않아야 하고, 나아가 세포외 소포의 기능을 향상시킬 수 있다면 더욱 효용성이 높은 방법이 될 것이다.

이에, 본 발명은 위와 같은 조건을 모두 만족하는 세포외 소포를 고농도로 배양하기 위한 세포 배양배지 개발 및 세포외 소포를 고농도로 함유하는 배양액의 제조 방법을 제공하는 것을 그 기술적 과제로 한다.

본 발명자들은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 연구하였으며, 그 결과 락토페린(lactoferrin)이란 단백질이 위와 같은 조건을 모두 만족하면서 세포외 소포의 생성량을 높이는데 매우 효과적이라는 사실을 발견하였다. 나아가, 본 발명자들은 락토페린에 추가로 칼슘을 첨가할 경우 락토페린에 의한 세포외 소포의 생산능을 더욱 극대화할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명자들은 락토페린이 단일 세포 당 생성하는 세포외 소포 배출량을 증가시키는 효과를 토대로 고농도 엑소좀을 함유하는 조건화 배양액이 자발적으로 형성됨을 확인하였다. 또한 락토페린을 첨가한 세포 배양배지의 제조가 가능하고 고농도 조건화 배양액을 만들 수 있음을 발견하였다.

따라서 본 발명은 락토페린(lactoferrin)을 포함하는 세포외 소포(extracellular vesicles)를 고농도로 배양하기 위한 세포 배양배지를 제공한다.

또한 본 발명은 세포를 상기 세포 배양배지에서 배양하는 것을 포함하는 세포외 소포를 고농도로 함유하는 조건화 배양액(conditioned medium)의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 세포외 소포를 고농도로 함유하는 조건화 배양액을 제조하는데 사용하기 위한 락토페린의 용도를 제공한다.

본 발명의 락토페린을 포함하는 세포외 소포를 고농도로 배양할 수 있는 세포 배양배지는 인체 독성이 없는 락토페린의 사용으로 안전성을 가지며 효율적으로 세포외 소포 생성량을 증대시킬 수 있다.

도 1은 무첨가배지에 락토페린을 농도별로 조합하였을 때 조건화 배양액 내 세포외 소포의 생성률을 CD81으로 확인하고 세포사멸소포(apoptotic vesicle)의 생성율을 Calnexin으로 확인한 ELISA결과이다.

도 2은 무첨가배지에 트랜스페린을 농도별로 조합하였을 때 조건화 배양액 내 세포외 소포의 생성률을 CD81으로 확인하고 세포사멸소포의 생성율을 Calnexin 으로 확인한 ELISA결과이다.

도 3은 무첨가배지에 혈청대체제, 락토페린, 칼슘을 조합하였을 때, 조건화 배양액 내 세포 내 칼슘 농도의 변화를 확인한 결과이다.

도 4는 무첨가배지에 혈청대체제, 락토페린, 칼슘을 조합하였을 때 조건화 배양액 내 생성된 세포외 소포의 개수를 나노입자 추적 분석기로 측정한 개수 결과이다.

도 5는 무첨가배지에 혈청대체제, 락토페린, 칼슘을 조합하였을 때 조건화 배양액내 생성된 세포외 소포의 크기를 나노입자 추적 분석기로 확인한 결과이다.

도 6은 무첨가배지 단독, 혈청대체제 단독, 또는 혈청대체제+락토페린+칼슘을 조합하였을 때, 조건화 배양액 내 동일 세포가 생성한 세포사멸소포의 상대량을 보여주는 Calnexin ELISA 결과이다.

도 7은 무첨가배지 단독, 혈청대체제 단독, 또는 혈청대체제+락토페린+칼슘을 조합하였을 때, 조건화 배양액 내 동일 세포가 생성한 세포외 소포 상대량을 보여주는 CD9 ELISA 결과이다.

본 발명자들은 세포 수용체에 결합하여 세포외 소포 생성량을 높이는데 락토페린이 효과적이란 점을 발견하였다. 나아가, 본 발명자들은 락토페린을 필수적으로 포함하고, 락토페린의 칼슘 전달 능력을 높이기 위해 임의로 칼슘을 더 포함하는 세포외 소포의 생성을 위한 세포 배양배지를 제작하였고, 상기 배양배지를 세포 배양 시에 사용하면 세포가 배출하는 세포외 소포의 생성능이 급격히 증가됨을 확인하였다.

본 발명의 세포 배양배지 및 이를 사용한 세포의 배양방법은 인체 독성이 없는 락토페린 단백질과 칼슘 이온의 조합 사용으로 안전성을 가지며 효율적으로 세포외 소포 생성량을 증대시킬 수 있다.

본 발명은 락토페린(lactoferrin)을 포함하는 세포외 소포(extracellular vesicles)를 고농도로 배양하기 위한 세포 배양배지에 관한 것이다.

또한 본 발명은 세포를 상기 세포 배양배지에서 배양하는 것을 포함하는 세포외 소포를 고농도로 함유하는 조건화 배양액(conditioned medium)의 제조방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 세포외 소포를 고농도로 함유하는 조건화 배양액을 제조하는데 사용하기 위한 락토페린의 용도에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "세포외 소포"는 세포에서 배출되는 다양한 소포(vesicle)을 지칭하는 명칭으로, "엑소좀(Exosome)" 및 "마이크로베지클(microvesicle)"을 포괄하는 의미이다. 나아가, 용어 "세포외 소포"는 엑토좀(Ectosome), 마이크로파티클(Microparticle), 탈레로좀(Tolerosomes), 프로스타토좀(Prostatosomes), 카디오좀(Cardiosomes) 및 벡소좀(Vexosomes)을 포괄하는 의미로 사용되기도 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "세포 배양배지(cell culture medium)"는 세포를 배양하기 전 배지를 말하며, "조건화 배양액(conditioned medium)"은 세포를 배양한 후 수득한 배양액(배지)를 말한다.

일 구체예에서, 락토페린은 0.1 μg/ml 내지 1 mg/ml의 농도로 세포 배양배지에 첨가될 수 있다. 일 구체예에서, 락토페린은 Holo-lactoferrin, Apo-lactoferin 및 Pis-lactoferrin으로 구성된 그룹 중에서 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 락토페린은 합성에 의한 것이거나 추출에 의해 수득된 것일 수 있으며, 사람 또는 사람 외의 동물 유래를 모두 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 조건화 배양액(conditioned medium)의 제조방법에 의해 수득된 조건화 배양액 내 세포외 소포의 개수는 1.0 × 10⁸/ml 내지 1.0 × 10¹¹/ml의 범위일 수 있으며, 구체적으로는 1.0 × 10⁹/ml 내지 1.0 × 10¹¹/ml의 범위일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 세포 배양배지는 칼슘을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명자들은 락토페린과 함께 조합되는 칼슘의 농도 조절을 통해 락토페린에 의한 세포외 소포 생산능을 더욱 극대화할 수 있음을 확인하였다. 일 구체예에서, 상기 칼슘은 칼슘 이온(Ca²⁺)의 형태로 첨가될 수 있으며, 상기 칼슘 이온의 공급원은 칼슘 이온 공급이 가능한 모든 염을 포함한다.

일 구체예에서, 칼슘은 0.2 μM 내지 10 mM의 농도로 세포 배양배지에 첨가될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 세포 배양배지는 세포 배양 중 특정 한 시점으로 정해지지 않고 반복적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 세포 배양배지 또는 조건화 배양액의 제조방법은, 기존 세포 배양시 사용되는 배지, 예를 들어, 혈청대체제가 포함된 배지 등과 조합될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 세포 배양배지 및 조건화 배양액의 제조방법은 무첨가배지(basal media), 혈청대체제(serum replacement) 및 혈청(serum)으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 물질을 추가로 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 세포 배양배지는 무첨가배지(basal media), 혈청대체제(serum replacement) 및 혈청(serum)으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 "혈청대체제"는 무혈청 배지를 제작하기 위한 혈청을 대체하는 조성 물질을 지칭한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 락토페린, 칼슘이온 및 혈청대체제의 조합이 세포의 세포외 소포 생산능을 가장 극대화할 수 있다.

혈청대체제에 포함된 트랜스페린(Transferrin)은 세포 내 칼슘의 농도를 높여 세포외 소포의 생성을 높이는 것으로 알려져 있다(J Biol Chem. 2003 May 30;278(22):20083-90). 락토페린은 트렌스페린 패밀리로 트렌스페린과 서열이 60% 정도 일치한다. 따라서 락토페린은 구조적인 부분이나 철 이온과 결합하는 능력과 같은 대표적인 기능적 특색이 트렌스페린과 유사하다. 그러나 락토페린은 트렌스페린과 다른 등전점을 가지고 있어 표면 양성 전하의 정도가 다르기에 이온 결합 능력이 다르며, 패밀리들이 결합하는 수용체도 다르다(Biochem Cell Biol. 2002;80(1):27-34). 후술하는 실시예에서는, 이러한 차이점을 보이는 락토페린과 트렌스페린이 세포외 소포의 생성량에 미치는 영향을 효소 결합 면역 침강 분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용하여 확인하였으며 세포외 소포 마커인 CD81과 세포사멸소포(apoptotic vesicle)의 생성 정도를 표시인자인 칼넥신(calnexin)으로 관찰하였다. 그 결과 트렌스페린의 세포외 소포 생성 효과는 락토페린에 비해 높지 않은 것이 관찰되었다. 락토페린의 경우 특이적인 이온 결합 차이 및 세포 수용체에 결합하는 능력을 토대로 혈청대체제를 능가하여 세포 내 칼슘 농도를 크게 높여주고 세포외 소포의 생성량을 증가시키는 것이 관찰되었다.

후술하는 실시예에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따라 락토페린을 첨가한 세포 배양배지가 세포외 소포의 개수를 증가시키는 원리는, 세포의 증식 또는 사멸 물질의 증가에 따른 결과가 아닌, 세포 내부의 칼슘 농도를 높임에 따른 세포의 직접적인 세포외 소포 생성능의 증가에 의한 것이다(PHYSIOLOGY 20: 22-27, 2005; 10.1152 ). 또한 락토페린이 세포의 수용체인 GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)에 결합하여 세포 내부로 이동하는 과정은 인간을 포함한 동물의 모든 세포에 적용되는 일반적인 현상이다(GAPDH: Biological Properties and Diversity, ISBN 978-94-007-4716-6). 그렇기에 락토페린을 첨가한 세포 배양배지로 고농도 엑소좀 함유 조건화 배양액을 제조하는 것은 인간을 포함한 동물의 모든 종류의 세포에 적용가능한 범용적 방법이다.

일 구체예에서, 본 발명의 세포 배양배지 및 조건화 배양액의 제조방법에 있어서 사용되는 세포는 인간 또는 동물 유래의 모든 종류의 세포일 수 있다.

본 발명의 조건화 배양액의 제조방법을 통해 세포외 소포를 고농도로 함유하는 조건화 배양액을 손쉽게 제조할 수 있다. 또한 본 발명의 세포 배양배지의 사용에 의해 세포외 소포를 고농도로 함유하는 세포 배양액을 손쉽게 제조할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "세포외 소포의 고농도"란 세포를 배양하여 수득한 배양액 내 세포외 소포의 개수가 적어도 1.0 × 10⁸/ml 내지 1.0 × 10¹¹/ml의 범위인 경우를 지칭한다.

이와 같은 방법으로 수득되는 조건화 배양액 또는 세포 배양액은 세포외 소포를 고농도로 함유하는바, 화장품 및 치료제의 원료 물질로 광범위하고 편리하게 활용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 락토페린을 이용한 세포외 소포의 생성량 증대

락토페린(Lactoferrin, LF)은 트렌스페린(Transferrin, Tf) 패밀리로 트렌스페린과 서열이 60% 정도 일치한다. 따라서 구조적인 부분이나 철 이온과 결합하는 능력과 같은 대표적인 기능적 특색이 트렌스페린과 유사하다. 반면, 락토페린은 트렌스페린과 다른 등전점을 가지고 있어 표면 양성 전하의 정도가 다르기에 이온 결합 능력이 다르며, 패밀리들이 결합하는 수용체도 다르다(Biochem Cell Biol. 2002;80(1):27-34). 이러한 차이점을 보이는 락토페린과 트렌스페린이 세포외 소포의 생성량에 미치는 영향을 효소 결합 면역 침강 분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용하여 확인하였으며 세포외 소포 마커인 CD81과 세포사멸소포(apoptotic vesicle)의 생성 정도를 표시인자인 칼넥신(calnexin)으로 관찰하였다.

구체적으로 평판 배양접시(48-well plate)에 사람의 지방 유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cell)를 24시간 동안 배양하였다. 24시간 뒤, 기본 배지에 락토페린(lactoferrin, aspira scientific, USA) 또는 트렌스페린(transferrin, sigma, USA)을 최종 농도가 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500, 1000 ㎍/㎖가 되도록 물과 혼합하여 25㎕씩 접종하였다. 음성 대조군에는 물 25 ㎕를 접종하였다. 처리 후, 5%의 CO₂를 공급하는 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양 후 각 배양액을 얻고 죽은 세포를 제거하기 위하여 1,500g에서 10분 동안 원심분리 하였다.

CD81 엘라이자 키트(CD81 ELISA kit, Mybiosource, USA)와 칼넥신 엘라이자 키트(Calnexin ELISA kit, Mybiosource, USA)를 사용하여 CD81과 칼넥신을 측정하였으며 구체적인 방법은 다음과 같다. 코팅된 96웰 플레이트(96 well plate)에 상기 수득한 배양액과 정량물질(standard)를 각각 100 ㎕씩 넣은 후 1 - 2시간 동안 37℃에서 반응하였다. 그 후, 정량물질과 배양액을 제거하고 첫번째 항체(detection antibody)를 넣어 37℃에서 반응하였다. 1시간 후, 워시버퍼(wash buffer)로 3회 세척하고 두번째 항체(HRP antibody)를 넣어 반응하였고 0.5 - 1시간이 지나 다시 세척하였다. 최종적으로 기질(substrate)과 스톱 버퍼(stop buffer)를 넣어 엘라이자 리더기(ELISA reader, Molecular devices, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였고 음성대조군을 기준으로 계산한 비율을 도 1(락토페린, lactoferrin)과 도 2(트렌스페린, transferrin)에 나타냈다. CD81에 대한 결과값은 검은색 막대로 표현하였고, 칼넥신의 결과값은 흰 막대로 나타냈다.

도 1에 나타난 바와 같이, 락토페린은 특정 농도에서 세포가 배출하는 세포외 소포의 생성량을 증가시킬 수 있음이 확인되었다. 세포외 소포 표시인자인 CD81은 5 μg/ml, 10 μg/ml 및 50 μg/ml의 락토페린 농도에서 비처리 (0 μg/ml) 그룹과 비교해 작게는 1.5배(50 μg/ml의 락토페린의 경우), 크게는 5배(5 μg/ml의 락토페린의 경우)까지 증가됨을 확인하였다. 상대적으로 세포사멸소포의 표시인자 calnexin은 락토페린 농도 별로 큰 차이는 없었다. 결론적으로 락토페린은 사용된 농도 범위에서 세포외 소포의 두 가지 분류인 엑소좀 및 마이크로베지클의 생성량을 특이적으로 높이는 단백질로 확인되었다.

한편, 동일한 농도 조건이였던 트랜스페린의 경우는 락토페린의 CD81 증가량과 비교해 의미있는 변화 차이가 보이지 않았다(도 2). 이는 락토페린이 특이적으로 세포가 배출하는 세포외 소포 생성 증가에 효과적인 물질임을 확인해주는 것이다.

실시예 2: 락토페린/칼슘 조성물에 의한 세포 내 칼슘 레벨의 증가

세포 내 증가하는 칼슘의 농도 증가는 세포외 소포의 생성 증가와 직접적인 관련이 있다. 세포 내 칼슘의 증가는 세포 막 단백질의 비대칭성을 대칭적으로 전환하여 균형을 유지하던 막을 무너뜨린다(Physiology (Bethesda) 2005 Feb;20:22-7). 또한 세포 내 칼슘 농도의 증가는 엔도좀(endosome)내에 소포(Intraluminal vesicle)의 생성을 높이는 것으로도 알려져 있다.

혈청대체제는 트랜스페린 외에 많은 영양성분을 통해 세포 대사를 활성화시키기에 세포외 소포를 생성하는 배양액에는 혈청대체제가 포함되어야 유리하다. 한편, 혈청대체제에 포함된 트랜스페린은 세포 내 칼슘의 농도를 높여 세포외 소포의 생성을 높이는 것으로 알려져 있으나(J Biol Chem. 2003 May 30;278(22):20083-90), 트렌스페린의 세포외 소포 생성 효과는 상기 실시예 1의 결과에서 확인되는 바와 같이 락토페린에 비해 높지 않다.

반면, 락토페린의 경우 특이적인 이온 결합 차이 및 세포 수용체에 결합하는 능력을 토대로 혈청대체제를 능가하여 세포 내 칼슘 농도를 크게 높여주고 세포외 소포의 생성을 더욱 높일 가능성을 가지기에 아래와 같은 실험이 설계되었다.

락토페린의 농도에 따른 세포 내 칼슘 레벨을 측정하기 위하여 칼슘 비색 측정 키트(calcium colorimetric assay kit, biovision, USA)를 사용하였다. 칼슘 비색 측정 키트는 0-cresolphthalein과 칼슘이 반응하여 나타내는 색을 측정하는 원리를 이용하여 칼슘의 농도를 측정한다.

사람의 지방 유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cell)를 4일간 배양하였다. 배양액을 제거하고 인산 완충 용액으로 세척 후, 혈청대체제가 포함된 배지에 칼슘 및 락토페린(lactoferrin, aspira scientific, USA)을 농도 별(2, 5, 10, 25, 50, 100 ㎍/㎖)로 혼합하여 세포에 처리하였다. 이와 함께 혈청대체제+칼슘만을 조합한 군과 락토페린 10 ㎍/㎖만 처리한 군, 혈청대체제만 처리한 군, 및 아무것도 첨가하지 않은 무첨가배지 군도 함께 실험 진행하였다. 48시간 후, 세포를 인산 완충 용액으로 세척하고 1X 트립신-이디티에이(0.05% trypsin, 0.53 mM EDTA, welgene, Korea) 용액으로 세포를 배양 접시에서 분리하였다.

자동세포계수기(nucleocounter NC-250, chemometec, USA)로 각 군별 세포 개수를 측정하고 같은 수의 세포를 칼슘 어세이 버퍼(calcium assay buffer, biovision, USA)에 녹였다. 이어서 칼슘 비색 측정 키트를 이용하여 실험을 진행하였다. 96웰 플레이트(96well-plate)에 웰 당 50 ㎕의 샘플 또는 정량의 칼슘과 크로모제닉 리에이전트(chromogenic reagent, 0-cresolphthalein) 90 ㎕, 60 ㎕의 칼슘 어세이 버퍼(calcium assay buffer)를 넣고 빛을 차단하여 5분 동안 반응시켰다. 이어서 575 nm에서 흡광도를 측정하였고 상대적인 증가량을 보여주기 위해 무첨가배지에 중간엽 줄기세포를 배양하였을 경우를 100%로 설정해 놓았다.

도 3에 나타난 바와 같이, 락토페린/칼슘 조성물이 혈청대체제와 조합되어 세포 내 칼슘 농도을 현저하게 증가시키는 것을 확인하였다. 무첨가배지에 혈청대체제 만을 넣었을 경우 일부 예측된 것처럼 약 150%의 칼슘 농도가 증가하는 현상을 확인하였다. 하지만 더 많은 칼슘을 공급해 주었을 경우에도 혈청대체제에 의한 세포 내 칼슘 농도는 더 이상 증가하지 않았다 (Tukey's test, p > 0.05). 반면, 칼슘과 함께 2 μg/ml의 락토페린을 추가로 공급해 주었을 때, 세포 내 칼슘 농도가 혈청대체제에 비해 더욱 증가하였고, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 25 μg/ml의 농도에서 가장 높은 세포 내 칼슘 농도를 보여주었다. 전체적으로 락토페린 5, 10, 25 μg/ml과 칼슘 조성물이 무첨가배지와 비교해 유의미하게 세포 내 칼슘 농도를 증가시킬 수 있음을 확인하였다 (Tukey's test, p < 0.05).

상기 결과로부터, 락토페린/칼슘 조성물이 세포 내 칼슘 농도를 증가시키고, 상기 조성물은 혈청대체제와 조합되어 세포외 소포의 생성량을 더욱 증가시킬 수 있는 가능성이 있음을 알 수 있었다. 또한 락토페린/칼슘 조성물이 세포 내 칼슘 농도의 증가라는 세포외 소포 생성의 범용적 원리를 통해 세포외 소포 생성량을 증가시킴을 확인함으로써, 락토페린이 적용가능한 세포의 범위가 위 실험에 사용된 지방 유래 중간엽 줄기세포뿐만 아니라 모든 종류의 세포에 적용가능하다는 점을 알 수 있었다.

전체 그룹내의 차이가 존재함을 one-way ANOVA를 수행하여 확인하였으며, 개별적인 평균들 간의 차이는 Tukey's test를 활용하여 분석되었다. 그룹 간의 통계적의 명확성은 * = (p < 0.05), N.S = (p >0.05) 로 그래프에 표시하였다. 상기 통계는 Prism software version 5를 이용하여 분석되었다.

실시예 3: 락토페린/칼슘 조성물에 의한 세포외 소포 생성의 증가

락토페린의 농도에 따른 배양액 내의 세포외 소포 개수의 변화와 크기 변화 유무를 관찰하기 위하여 나노입자추적분석(Nanoparticle tracking analysis, NTA)의 방법을 진행하였다.

사람의 지방 유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cell)를 2일간 배양하였다. 락토페린 5 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml의 농도를 각각 칼슘과 조합해 준 후 혈청대체제에 조합하여 무첨가배지에 섞어 교체해 주었다. 그 외 혈청대체제가 무첨가배지(alpha-MEM)에 포함된 군과 무첨가배지만을 넣은 군도 비교해 실험하였다. 48시간 뒤, 배양액을 수거하여 1500g에서 10분 동안 원심분리한 후 배양액에 있는 세포외 소포의 개수와 크기를 나노입자추적분석기(Nanoparticle tracking analysis, NTA, Nanosight NS300, Malvern, UK)로 측정하여 도 4와 도 5에 나타내었다.

도 4는 배양액 ml 당 포함된 세포외 소포의 수를 그래프로 나타낸 것으로, 세포외 소포의 상대적 개수를 무첨가배지(100%)를 기준으로 계산하여 각각의 그래프 상단에 나타냈다. 도 4에 나타나 바와 같이, 나노 입자 측정 장비로 배지 안에 포함된 세포외 소포의 개수를 확인해본 결과 무첨가배지에서는 세포외 소포가 평균 1.1 × 10⁸ 개/ml로 확인되었고, 혈청대체제 처리군에서는 약 5.6 × 10⁸ 개/ml 정도로 확인된 바, 세포외 소포가 4.5 × 10⁸ 개/ml 증가되었다. 한편, 락토페린 5 μg/ml+칼슘 조성물을 혈청대체제에 추가한 처리군에서는 세포외 소포의 생성량이 약 16.1 × 10⁸ 개/ml로 확인된 바, 약 14 × 10⁸ 개/ml가 늘어나, 무첨가배지 대비 1450% 증가되었다. 락토페린 10 μg/ml+칼슘 조성물에서는 세포외 소포의 생성량이 약 17 × 10⁸개/ml로서, 무첨가배지 대비 1590% 증가되었다.

위와 같은 결과는 락토페린+칼슘 조성물이 혈청대체제와의 조합을 통해 생성량을 농도에 비례하여 증가시킬 수 있음을 나타낸다.

한편, 도 5에 나타난 바와 같이, 무첨가배지 처리군, 혈청대체제 처리군, 및 락토페린 (5 or 10 μg/ml) + 칼슘 조성물 처리군에서 세포외 소포는 120 ~ 140 nm 크기 범위로 존재함을 확인하였다. 크기 측정 시 사용된 세포외 소포의 이미지는 그래프 우측에 도시되어 있다.

실시예 4: 락토페린/칼슘 조성물에 의한 세포외 소포의 증가가 세포의 세포외 소포 생성능 증가에 의한 것임을 확인

혈청대체제는 트렌스페린의 의해 세포외 소포 생성에 영향을 주기도 하지만 영양 공급으로 인한 활발한 대사가 세포의 증식을 높이고 이로 인해 세포외 소포의 생성이 증가되는 점이 크다. 락토페린+칼슘 조성물이 세포의 증식 또는 사멸 물질의 증가가 아닌 세포 당 발현하는 세포외 소포 생성능을 명백히 증가시키는 것임을 증명하기 위한 실험을 준비하였다.

락토페린과 칼슘의 조합에 의한 세포외 소포 생성능의 변화를 관찰하기 위하여 세포외 소포의 마커인 CD9과 세포사멸소포(apoptotic vesicle)의 마커인 칼넥신(calnexin)을 효소 결합 면역 침강 분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)으로 확인하였다.

사람의 지방 유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cell)에 무첨가배지(alpha-MEM), 혈청대체제가 포함된 배지, 혈청대체제+락토페린 10 ㎍/㎖+칼슘이 첨가된 배지를 처리하였다. 48시간 뒤, 배양액을 1500g에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액으로 CD9 엘라이자(Exoquant overall exosome capture and quantification assay kit, biovision, USA)와 칼넥신 엘라이자(Calnexin ELISA kit, Mybiosource, USA)를 진행하였다.

CD9의 엘라이자의 구체적인 방법은 다음과 같다. 코팅된 96웰 플레이트(96well plate)에 각각 정량물질(standard)과 얻은 배양액을 100 ㎕씩 넣은 후 20시간 동안 37℃에서 반응하였다. 그 후, 정량물질과 배양액을 제거하고 3번 세척한 뒤, 첫번째 항체(detection antibody)를 넣어 37℃에서 반응하였다. 2시간 뒤, 워시버퍼(washing buffer)로 3번 세척하고 두번째 항체(HRP antibody)를 넣어 반응하였고 1시간이 지나 다시 세척하였다. 최종적으로 기질(substrate)과 스톱 버퍼(stop buffer)를 넣어 엘라이자 리더기(ELISA reader, Molecular devices, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

측정한 칼넥신과 CD9의 값은 배양액을 얻을 당시 세포에서 측정한 증식도 (MTT assay)로 나누어 주었다. 상기의 MTT 어세이 방법은 다음과 같다. 배지를 제거한 후, 세포를 인산 완충 용액으로 3회 세척하였다. 처리 농도가 0.5 ㎎/㎖이 되도록 MTT 시약을 배지에 희석한 뒤 처리하고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 최종적으로 인산 완충 용액으로 세척한 뒤, 500 ㎕의 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol) 용액에서 30분 교반하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 사멸 표시인자의 결과는 무첨가배지를 100%로 하여 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 생성된 세포외 소포에서 세포 사멸인자는 특이적으로 과발현하지 않았다. 전체적으로 무첨가배지, 혈청대체제가 포함된 배지, 혈청대체제+락토페린+칼슘 조성물이 포함된 배지에서 칼넥신(calnexin)의 발현도가 유사함을 확인할 수 있었다. (One-way ANOVA, F (2, 3) = 1.797, p > 0.05).

하지만 세포외 소포의 표시인자인 CD9은 락토페린+칼슘 조성물에서 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 무첨가배지를 100%로 하여 도 7에서 나타낸 바와 같이, 혈청대체제를 포함한 배지의 경우 세포 당 CD9의 발현이 무첨가배지에 비해 크게 증가하지 못하였기에 혈청대체제의 효과는 세포 당 생성하는 세포외 소포의 양이 증가하기 보다는 세포의 개수가 증가하면서 세포외 소포 생성이 덩달아 증가하는 것으로 확인되었다 (Tukey's test, p > 0.05).

반면, 락토페린+칼슘 조성물을 혈청대체제와 함께 사용한 배지 경우는 세포 당 발현하는 CD9이 무첨가배지에 비해 1463% 증가하면서 실시예 3에서 살펴본 세포외 소포 증가 비율(1590%)과 유사한 결과값을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 락토페린+칼슘 조성물이 단일 세포가 생성하는 세포외 소포의 생성능을 높였음을 증명한 명확한 결과이다 (Tukey's test, p < 0.05). 또한 락토페린+ 칼슘 조성물이 사용된 농도 범위에서 세포외 소포의 두 가지 분류인 엑소좀 및 마이크로베지클의 생성량을 특이적으로 높이는 조성물로 확인되었다.

전체 그룹 내의 차이가 존재함을 one-way ANOVA를 수행하여 확인하였으며, 개별적인 평균들 간의 차이는 Tukey's test를 활용하여 분석되었다. 그룹 간의 통계적의 명확성은 * = (p < 0.05), N.S = (p > 0.05) 로 그래프에 표시하였다. 상기 통계는 Prism software version 5를 이용하여 분석되었다.

Claims

락토페린(lactoferrin)을 포함하는 세포외 소포(extracellular vesicles)를 고농도로 배양하기 위한 세포 배양배지.
제1항에 있어서, 락토페린이 0.1 μg/ml 내지 1 mg/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 세포 배양배지.
제1항에 있어서, 락토페린이 Holo-lactoferrin, Apo-lactoferin 및 pis-lactoferrin으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양배지.
제1항에 있어서, 칼슘이 추가로 첨가되는 것을 특징으로 하는 세포 배양배지.
제4항에 있어서, 칼슘이 0.2 μM 내지 10 mM의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 세포 배양배지.
제1항에 있어서, 무첨가배지(basal media), 혈청대체제(serum replacement) 및 혈청(serum)으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 물질이 추가로 첨가되는 것을 특징으로 하는 세포 배양배지.
제1항에 있어서, 사람 혹은 동물 유래의 세포에 적용되는 것을 특징으로 하는 세포 배양배지.
세포를 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 세포 배양배지에서 배양하는 것을 포함하는, 세포외 소포를 고농도로 함유하는 조건화 배양액 (conditioned medium)의 제조방법.
제8항에 있어서, 조건화 배양액 내 세포외 소포의 개수가 1.0 × 10⁸/ml 내지 1.0 × 10¹¹/ml의 범위인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제8항에 있어서, 세포 배양배지의 사용이 세포 배양 중 특정 한 시점으로 정해지지 않고 반복적으로 사용되는 것을 특징으로 하는 제조방법.