WO2020209752A1 - Эмульсия перфторуглеродных соединений и способ её получения - Google Patents

Эмульсия перфторуглеродных соединений и способ её получения Download PDF

Info

Publication number
WO2020209752A1
WO2020209752A1 PCT/RU2019/000960 RU2019000960W WO2020209752A1 WO 2020209752 A1 WO2020209752 A1 WO 2020209752A1 RU 2019000960 W RU2019000960 W RU 2019000960W WO 2020209752 A1 WO2020209752 A1 WO 2020209752A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
emulsion
blood
emulsion according
perfluorocarbon
phospholipids
Prior art date
Application number
PCT/RU2019/000960
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ирина Николаевна Кузнецова
Константин СИНЧИХИН
Надежда Олеговна КУЗНЕЦОВА
Original Assignee
Ирина Николаевна Кузнецова
Константин СИНЧИХИН
Надежда Олеговна КУЗНЕЦОВА
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ирина Николаевна Кузнецова, Константин СИНЧИХИН, Надежда Олеговна КУЗНЕЦОВА filed Critical Ирина Николаевна Кузнецова
Publication of WO2020209752A1 publication Critical patent/WO2020209752A1/ru

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/02Halogenated hydrocarbons
    • A61K31/025Halogenated hydrocarbons carbocyclic
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13Amines
    • A61K31/131Amines acyclic
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10Dispersions; Emulsions
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock

Definitions

  • the invention relates to the field of medical biophysics and in particular to drugs for use in complex infusion therapy in the treatment of hypoxic conditions, as well as as a means that changes (affects) the functional state of various biological systems of the body (blood cells, plasma and other organs).
  • PPTPA PAF-3 - perfluorotripropylamine
  • Cy is the volumetric content of the fluorocarbon phase in PFC emulsions
  • the phospholipids (PL) used for its preparation ensured the possibility of storing the preparation in a cold state — 1-4 ° C.
  • Perftoran can only be stored frozen. Its oxygen capacity is 3 times less than for Oxygenate. Perftoran was approved for clinical use in Russia in 1996. The drug received positive feedback from clinicians. At the same time, the doses of Perftoran used for various forms of diseases are rather arbitrary, in the range of 1-10 ml / kg and, as a rule, are not sufficiently substantiated. Studies of the drug Perftoran according to GMP rules have not been carried out in our country.
  • the stability in vitro is the preservation of physicochemical parameters describing the state of the emulsion during storage
  • the stability in vivo is the preservation of the individuality of particles during circulation in the blood stream, which is important for their performance of the gas transport function.
  • the penetration of emulsion particles into the vascular bed is considered as a stress effect.
  • the purpose of the present invention is to substantiate theoretically and experimentally the composition of the preparation and the method of its preparation, and also to increase its shelf life. Important is also check the reproducibility of the technological process for obtaining emulsions of the claimed composition.
  • the objective of the present invention is to improve the quality of the emulsion by reducing the pharmacological load on the body and thereby increasing the safety of the drug, as well as increasing the stability of the emulsion of the claimed composition up to 2 years of storage in an unfrozen state (at least).
  • PFC drugs Another feature of PFC drugs is their foreignness. We are not talking about toxicity, which is assessed in experiments on animals and which depends on the quality characteristics of the drug, primarily on the degree of dispersion of the drug. These are PFC particles that are not metabolized in the body and which, by definition, as foreign, should irritate other body systems. First of all, blood. In the vascular bed, particles simply cannot exist independently of the blood cells.
  • the real conditions for the use of PFC emulsions in the clinic involves the joint circulation of PFC particles with a sufficiently large number of erythrocytes. Therefore, the functional activity of emulsions should be considered in connection with the gas-transporting properties of blood, which is not quite the generally accepted point of view.
  • the process of gas delivery by blood is determined by "microkinetics", i.e. diffusion rate of O2 molecules from erythrocytes to tissues and CO2 molecules in the opposite direction. This process is shown schematically in Fig. thirteen].
  • the particles are on the way of diffusion of O2 and CO2 molecules from erythrocytes to tissues and, theoretically, can influence this process.
  • PFC particles occupy a certain volume on the way of diffusion flows of O and CO2 during joint circulation with erythrocytes.
  • they can change the conditions for the delivery of gases by the blood: accelerate or slow down the diffusion of gases from oxygen from red blood cells to tissues and carbon dioxide in the opposite direction.
  • the presence of an emulsion in the blood stream should affect the rates of oxygenation and deoxygenation of erythrocytes.
  • the reason for this phenomenon is due to the increased solubility of blood gases in the fluorocarbon phase of the emulsion and an increase in the coefficient of mass transfer of O2 particles [2], since the thickness of the surfactant shell around the particles does not prevent the free passage of gases through the particles. It should be noted that the rate of oxygenation under simulated conditions (in the installation) is ⁇ 100 times less than in the body. Therefore, the rate of oxygenation in vivo can be higher than that obtained under in vitro conditions.
  • the existing criteria for choosing the composition of the drug are based on assessing their effectiveness and harmlessness in animal experiments. Which is fair, but not enough, since the particles have their own volume and can affect their own blood structure.
  • PFC particles are not digested by enzyme systems and are foreign to the body.
  • PFC emulsions prolong the life of animals due to their gas transport function.
  • changes in various biological systems of the body are observed. Detailed results of studies of these changes in the replacement of blood with emulsions of perfluorocarbons are given in the monograph [5].
  • the effectiveness of PFC emulsions is determined by the duration of the circulation of particles in the vascular bed.
  • Example 2 Influence of emulsions of perfluorocarbons on the induced aggregation of platelets [6].
  • the nature of the effect of PFC emulsions on the aggregation activity of donor blood platelets was judged using the Born photometric method. The method is based on continuous recording of changes in light transmission of a stirred and thermostated suspension. The process of platelet aggregation in the blood plasma of healthy individuals was recorded on a Solar AP 2110 aggregometer with software for recording the results. The following parameters were used to assess the platelet aggregation function: L - latency (sec), V - aggregation rate at the 30th second (% / min), MA - maximum amplitude (%).
  • the addition of the PFC emulsion at a final concentration of 4% caused an increase in platelet activity, which was characterized by an increase in the maximum amplitude, reaction rate, degree of disaggregation, and the time to reach the maximum amplitude.
  • concentration of the emulsion 10%
  • a gradual inhibition of the platelet aggregation process was observed: a decrease in the rate and maximum amplitude, a decrease in the percentage of platelet disaggregation.
  • the inhibition processes progressed - the rate of aggregation and the percentage of disaggregation decreased compared to the initial level.
  • the latent period of aggregation did not depend on the concentration of the emulsion in the sample.
  • the studied PFC / PL emulsions have a dose-dependent effect on the complex process of induced aggregation of donor blood platelets when the emulsion content in the sample is ⁇ 20 vol%.
  • the main result is that the obtained emulsions are not an inducer of normal platelet aggregation.
  • Example 3 The effect of emulsions of perfluorocarbons on erythrocytes and neutrophilic granulocytes [7]
  • the number of echinocytes in the blood sample gradually increased with the increase in the content of the emulsion in the blood (table 2).
  • the absence of visible hemolysis of erythrocytes remained in the concentration range from 100: 1 to 10: 5.
  • Free hemoglobin in plasma in this case ranges from 0.926 g / l to 3.42 g / l, respectively, in contrast to the maximum permissible values (no more than 0.1 g / l).
  • An increase in the HCT test at blood / emulsion ratios ⁇ 10/2 can be regarded as a natural reaction of neutrophils to a foreign agent - PFC particles.
  • PFC particles are absorbed by neutrophils as an external stimulus.
  • the activation of neutrophils in this case is the result of phagocytosis.
  • activated neutrophils retain the ability to phagocytosis (tested on a microbial culture of Staphylococcus aureus).
  • the MDA values in the specified range of the emulsion content in the blood sample do not exceed the initial values of this parameter.
  • the ambiguity of the relationships between the changes in the morphofunctional properties of blood corpuscles under the influence of different concentrations of the PFC emulsion indicates the complexity of the processes of interaction between blood and emulsion. This is primarily due to a change in the connections between the structural elements of the blood itself. This complex picture can be reflected in such a macroparameter as blood rheology: a change in its rheological parameters under the influence of an emulsion.
  • the degree of this effect depends on the dose of the emulsion in the blood sample.
  • the optimal content (volume) of the emulsion in the blood sample has been selected: the optimal volume of the emulsion in the blood / emulsion mixture is ⁇ 20% of the total volume of the blood / emulsion mixture. According to the biophysical experiment, the content of the emulsion in the blood should not exceed 10%.
  • the objective of the present invention is to improve the quality of the claimed emulsion PFC / FL and increase its stability.
  • quality means the minimum undesirable effect of the emulsion on the biological systems of the body, and in particular on the blood. In general terms, this requirement means the biocompatibility of the emulsion with the biological environment. Due to the ambiguity and ambiguity of the concept of "biocompatibility", the quality of the emulsion must be tested using the concept of the structure of the emulsion, since the preservation of the structure of particles when entering the vascular bed ensures that the PFC emulsions perform the gas transport function. Control over the strength of the structure includes the determination of the following parameters [2]:
  • Emulsion code AT or AT 300 emulsion.
  • the emulsion technology is based on the general principle of dispersing liquid PFCs in an aqueous solution of an emulsifying component using a high pressure homogenizer.
  • the Prototype (author I. N. Kuznetsova) reflects specific examples of the implementation of the production of PFC / FL emulsions, the components of which both in the Prototype and in the Application do not fundamentally differ (from the declared composition of emulsions). Therefore, we set a new task. Show the reliability of using the claimed technological stages of the production of emulsions of the same composition.
  • Example 5 On the reproducibility of parameters characterizing the quality of emulsions from batch to batch, as well as their stability during storage G 101. Emulsions were obtained in accordance with the claimed method. Table 6 shows the composition and physicochemical parameters of 17 series of emulsions, table 7 - the particle size of the fractionated parts of the same series.
  • the content of the fluorocarbon phase was 5.2 ⁇ 0.4.
  • the relative viscosity (relative to water) of the studied series of AT emulsions was in the range 1, 24 - 1, 62 and in all cases did not exceed the plasma viscosity (1.57 - 1.75).
  • the acidity of the studied AT emulsions was close to the physiological norm - the pH was in the range of 7.10 - 7.4, the fluorine ion content did not exceed the range of 10 - 40 ⁇ M.
  • the particle size from series to series fluctuated within narrow limits (0.11-0.16 ⁇ m) and did not change when the emulsion was diluted with water, as an additional stress effect.
  • the emulsions were practically monodisperse, since when studying the width of the particle size distribution, no particles with a diameter of more than 0.2 ⁇ m were found in them. Moreover, the nature of the particle size distribution remained after a year of storage at + 4 ° C (table 7).
  • Table 7 Values of the wave exponent (n) and the average particle diameter (a), characterizing the width of the particle size distribution for PFC / PL emulsions of different shelf life.
  • Figure 4 shows the values of the interaction coefficient (Kt) of various series of AT emulsions with blood serum. It can be seen that the values of this parameter from series to series were in a rather narrow interval (1, 5-3.0). Moreover, this interval practically did not change with an increase in the shelf life of emulsions up to 1 year (Figure 5).
  • the values of the parameter K t indirectly characterize the surface properties of particles - the preservation or change of their "microstructure".
  • Example 6 On the compatibility of the PFC / FL emulsion with various blood substitutes with blood serum [11].
  • Table 9 shows the results of determining the average particle diameter in the original emulsions and after mixing them with various infusion media.
  • Table 10 shows the results of determining the width of the particle size distribution in the same mixtures.
  • the average particle diameter did not change when mixing the AT emulsion with blood substitutes.
  • the addition of blood serum to the 2-component mixture also did not change this parameter (Table 11).
  • Table 12 Width of particle size distribution for a mixture of emulsions with blood substitutes and blood serum.
  • Figure 6 shows the Kx values for the initial emulsion in comparison with the values of this parameter for 2- and 3-component mixtures.
  • the addition of the investigated colloidal CG did not affect the surface properties. particles, since the interaction coefficients Kt for two-component media practically did not change.
  • the presence of serum in the 3-component mixture did not lead to an increase in Kt.
  • a similar dynamics of changes in Kt was observed in the case of saline solution.
  • the viscosity of the mixture was determined by the initial values of the viscosity of the components: it increased or decreased depending on the viscosity of the added blood substitute.
  • the introduction of whey into a 2-component mixture led, as a rule, to a decrease in viscosity, which was an additional confirmation of the inconsistency of the previously stated assumption about the possible aggregation of particles in this case.
  • Example 7.06 Increasing the shelf life of the obtained PFC / FL emulsions to 2 years of storage at a temperature of ⁇ + 4 ° C.
  • the average particle diameter was in the range of 0.10-0.15 ⁇ m and did not change when the emulsions were diluted with water.
  • the values of the average particle diameter for the upper and middle fractions of native and water-diluted emulsions during fractionation were 0.12-0.13 ⁇ m.
  • the average particle diameter was slightly higher, 0.14-015 ⁇ m (Fig. 7)
  • Comparison of the experimental and calculated values of turbidity (t) for the studied native and water-diluted emulsions (Fig. 8) showed their good agreement for the entire observation period (p> 0.05).
  • the main physicochemical parameters of emulsions remained within the acceptable range for physiological blood values: the pH values were within 7, 0-7, 2.
  • the relative viscosity (relative to water) did not exceed the plasma viscosity ⁇ 1, 7 and was 1, 45-1, 49, which corresponded to the retention of the particle size and structure.
  • the results of bacteriological control showed that all tested series of PFC / PL emulsions are sterile after 5 and 23 months of storage.
  • the strength of the structure is so significant that the addition of blood substitutes to the emulsion (model conditions: exposure stress upon entering the vascular bed) did not affect the quality parameters of the emulsions (example 6). This circumstance testifies to the compatibility of emulsions with blood substitutes.
  • the present invention provides a scientific rationale for the composition and method of obtaining a PFC emulsion.
  • the content of the invention is a systematic approach when considering the nature of the claimed emulsion as a basis for blood substitute.
  • PFC particles occupying a certain volume on the way of oxygen molecules from erythrocytes to tissues and carbon dioxide in the opposite direction, accelerate this process of gas diffusion. This fundamental process has been proven in a device that simulates blood circulation in the body.
  • Fig. 1 Illustration of the biophysical process of the delivery of O and CO2 by blood during the joint circulation of PFC particles and erythrocytes.
  • Fig. 2 Dependence of the rate of oxygenation da / dt on the degree of oxygenation a with slow (a) and rapidly decarboxylated blood (b) with the addition of saline (1), emulsion (2) and pure emulsifier (3).
  • Fig. 3 Dependences of the rate of deoxygenation da / dt on the degree of oxygenation a with fast (a) and slowly decarboxylated blood (b) with the addition of saline (1), emulsion (2).
  • 6-Parameters K t for mixtures of an emulsion with blood substitutes and blood serum The content of polyoxidine (POA), polyoxyfumarin (POF) and refortan (Ref) is 10%, the content of NaCl is 50%. In all cases, the serum content is 10%.
  • Fig. 7 Changes in particle sizes of different fractions of the obtained series of PFC / PL emulsions: solid line - middle fraction, dotted line - upper fraction, dotted - lower fraction.
  • the middle and top fractions are statistically indistinguishable at all storage times.
  • Figure 8 Changes in the turbidity of the obtained series of PFC / PL emulsions during storage.
  • the solid line is the experimentally found values, the dotted line is the calculated values.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Эмульсия содержит перфторуглеродное соединение перфтордекалин и перфторуглеродную добавку и фосфолипиды в виде липосом(везикул), приготовленных гомогенизацией под давлением в водно-солевой среде. Перфторуглеродная добавка представляет собой смесь перфторированных продуктов перфтороктилбромида и перфтортрипропиламина, а липосомы (везикулы) содержат природные масла в качестве адъюванта. Способ получения эмульсии включает получение липосом (везикул) гомогенизацией под давлением 60-120 атм в водно-солевой среде с последующей тепловой стерилизацией, гомогенизацию под давлением указанных перфтоуглеродных соединений в липосомальной форме (везикулах) фосфолипидов и тепловую стерилизацию готовой эмульсии. Эмульсия предназначена для улучшения доставки кислорода кровью при лечении гипоксических состояний, сохранения изолированных перфузируемых органов и тканей. В соответствие с настоящим изобретением увеличена стабильность эмульсии при сохранении структуры частиц, что обеспечивает улучшение ее качества и сохранение биосовместимости с биологической средой (кровью, плазмой, сывороткой и кровезаменителями). Срок хранения эмульсии в незамороженном виде при +4°С составляет не менее 23 месяцев при сохранении ее структуры.

Description

Эмульсия перфторуглеродных соединений и способ её получения
Создание инфузионных сред, обладающих газотранспортными свойствами, является актуальной задачей медико-биологической науки. Изобретение относится к области медицинской биофизики и в частности к лекарственным средствам для применения в комплексной инфузионной терапии при лечении гипоксических состояний, а также в качестве средства, изменяющего (влияющего) на функциональное состояние различных биологических систем организма (клеток крови, плазмы и других органов).
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ ИЗМЕРЕНИЙ И ТЕРМИНОВ.
ПАВ — поверхностно-активное вещество
П-268, F-268 — проксанол 268, плюроник-268
ПФД — перфтордекалин
ПФОБ — перфтороктилбромид
ПФТПА -перфтортрипропиламин
ПФС, ПФУ — перфторуглероды, перфторированные соединения
ПФТБА — перфтортрибутиламин
ПФТПА (ПАФ-3) — перфтортрипропиламин
СФЛ — фосфолипиды сои
ФЛ — фосфолипиды
ЯФЛ — фосфолипиды яичного желтка
п — волновой экспонент
Су — объемное содержание фторуглеродной фазы в эмульсиях ПФУ
(мл/дл)
а — средний диаметр частиц
l — длина волны
КЕ — кислородная ёмкость
МКИ: А 61 К 9/00
А 61 К 31/02 Два свойства ПФУ определили их выбор в качестве основы инфузионной среды, способной транспортировать газы крови: химическая инертность и способность растворять большие объёмы газов.
За сравнительно небольшой срок проблема прошла несколько этапов: от выбора объекта исследований (ПФУ, эмульгаторы) и решения ряда технологических вопросов получения эмульсий ПФУ до создания эмульсионных препаратов и их изучения в эксперименте и клинике.
Создаваемые препараты Флюозол-ДА (1978 г. Япония), Перфторан (1984 г. Россия) сохраняли свои свойства при хранении в замороженном состоянии. Их изучали на исходно однотипных моделях: обменное замещение крови у животных, перфузия изолированных органов, кровопотеря разной степени тяжести. Общим для этого этапа является доказательство способности ПФУ препаратов доставлять растворенный в них Ог тканям. Было получено подтверждение их газотранспортной функции. Однако доля переносимого эмульсиями Ог была мала по сравнению с количеством Ог, транспортируемого кровью. В препарате Оксигент (2003 г. США) была достигнута высокая кислородная емкость за счёт увеличения концентрации фторуглеродной фазы. Используемые для его получения фосфолипиды (ФЛ) обеспечили возможность хранения препарата в охлаждённом состоянии— 1-4° С. Препарат прошёл все необходимые стадии изучения в опытах на животных. Однако результаты клинических испытаний препарата Оксигент (2005 г. - третья стадия по правилам GMP) не выявили его преимуществ по сравнению с контрольными данными, т.е. теоретическое представление об определяющей роли абсолютного количества О2 , транспортируемого эмульсиями в живом организме (их кислородной ёмкости), не подтвердилось.
Препарат Перфторан может храниться только в замороженном состоянии. Его кислородная ёмкость в 3 раза меньше чем для Оксигента. Перфторан разрешён к клиническому применению в России в 1996 г. Препарат получил положительные отзывы клиницистов. Вместе с тем, используемые дозы Перфторана при различных формах заболеваний довольно произвольны, находятся в интервалах 1-10 мл/кг и, как правило, недостаточно обоснованы. Исследования препарата Перфторан по правилам GMP у нас в стране не проводились.
В Патенте РФ Ns 2 259 819 [1], который является прототипом настоящего изобретения, (Кузнецова И.Н. - автор и патентовладелец ), рассмотрены свойства перфторуглеродных соединений, затронуты основные принципы получения эмульсий ПФУ, проведён анализ других патентов, которые мы рассматривали как аналоги. Характерным для рассмотренных патентов является стремление увеличить КЕ эмульсий за счёт увеличения содержания фторуглеродной фазы в этих средах. Это обстоятельство приводит к увеличению фармакологической нагрузки на живой организм, поскольку ПФУ не подвергаются метаболизму, задерживаются в органах, вызывая изменение их функции, и только спустя определённое время покидают организм. Чем больше доза препарата и его КЕ, тем дольше препарат задерживается в органах.
Сложилась ситуация неопределённости: нужна ли повышенная кислородная ёмкость, какова должна быть доза препарата, каков должен быть состав, как влияет замораживание и размораживание на препарат, насколько ФЛ обеспечивают стабильность препарата и др.
Ранее нами в Патенте РФ ЛЬ 2 259 819, который мы взяли за прототип, основное внимание было уделено методологическим вопросам оценки стабильности эмульсий ПФУ [1]. Во вступительной части изобретения (сс. 1 20) описаны следующие моменты.
Рассмотрены основные коллоидно-химические и технологические вопросы получения и стабилизации эмульсий на основе перфторуглеродов (ПФУ). Сделан акцент на том, что эмульсии, полученные с использованием водорастворимого эмульгатора типа сополимер окиси этилена и окиси пропилена (проксанол, плюроник и др), должны храниться в замороженном состоянии и конечная лекарственная форма препаратов данного типа не выдерживает тепловую стерилизацию. Выделены два аспекта стабильности эмульсий ПФУ. Во-первых, стабильность in vitro сохранение физико-химических параметров, описывающих состояние эмульсии при хранении, во- вторых, стабильность in vivo - сохранение индивидуальности частиц при циркуляции в токе крови, важное для выполнения ими газотранспортной функции. Попадание частиц эмульсии в сосудистое русло рассматривается как стресс-воздействие. Подчеркнута значимость строения поверхностного слоя ПАВ вокруг частиц при их циркуляции в сосудистом русле, т.е. его прочность, важная для стабильности частиц in vivo. Эти вопросы и методические подходы, их решения были разработаны нами ранее [2]. В силу наличия однотипных побочных реакций у пациентов при введении разных препаратов (Флюозол, Оксигент, Перфторан) остается актуальным вопрос более углублённого тестирования качества разрабатываемых эмульсионных препаратов на этапах: обоснование состава и разработки способа их получения с учётом углублённого понимания механизма их действия.
Цель настоящего изобретения обосновать теоретически и экспериментально состав препарата и способ его получения, также увеличить срок его хранения. Важным является так же проверить воспроизводимость технологического процесса получения эмульсий заявленного состава.
Задачей настоящего изобретения является улучшение качества эмульсии за счёт снижения фармакологической нагрузки на организм и тем самым увеличение безопасности препарата, а также увеличение стабильности эмульсии заявленного состава до 2-х лет хранения в незамороженном состоянии (не менее).
Особенности функциональной активности ПФУ эмульсий в живом организме. Способность к доставке газов частицами при совместной циркуляции с эритроцитами определяется временем их пребывания в сосудистом русле. В этом заключается основное отличие от других препаратов, когда ставится задача найти формулу вещества для попадания его в соответствующую мишень - основной механизм такого действия «ключ/замок».
Другая особенность ПФУ препаратов-их чужеродность. Речь идёт не о токсичности, которую оценивают в опытах на животных и которая зависит от характеристик качества препарата, в первую очередь от степени дисперсности препарата. Речь идёт о частицах ПФУ, которые не метаболизируют в организме и которые по определению, как чужеродные, должны оказывать раздражающее действие на другие системы организма. В первую очередь на кровь. В сосудистом русле частицы просто не могут существовать независимо от форменных элементов крови.
В связи с этим возникает важный вопрос, как совместить два противоположных и неразрывно связанных свойства ( транспорт газов и чужеродность) при выборе состава и технологии получения наиболее эффективного ПФУ препарата. Следствием сказанного прогресс в создании новых ПФУ препаратов связан во- первых, с развитием и углублённым пониманием механизмов их действия, т.е. как проявляется их функциональная активность в живом организме; во- вторых, с пониманием и развитием общебиологических закономерностей влияния чужеродных ( не подвергающихся метаболизму) частиц ПФУ на живой организм при внутривенном введении.
Как достичь компромисс между двумя противоположными свойствами ПФУ при создании новых препаратов ?. С одной стороны - активация метаболизма за счёт доставки кислорода клеткам, с другой стороны - угнетение функции ряда важных систем из-за чужеродности по отношению к целостному организму частиц ПФУ. Эти вопросы в столь явном виде в различных литературных источниках не поднимались и не рассматривались.
Особенности механизма газотранспортной функции смешанной системы кровь/эмульсия ПФУ (теория и эксперимент). В самом начале создания инфузионных сред, содержащих ПФУ, сложилось теоретическое представление об определяющей роли абсолютного количества О2, транспортируемого эмульсиями в живом организме - их кислородной ёмкости (КЕ). До настоящего времени принят подход сопоставлять газотранспортные свойства эмульсий ПФУ и крови, который основывается на количественном сравнении особенностей кривых диссоциации О2 этих сред. Содержание кислорода в эмульсиях ПФУ пропорционально его парциальному давлению, поскольку химическая связь «ПФУ<->газ» отсутствует. Это линейная зависимость. Для крови это сигмоидная кривая, отражающая кооперативное взаимодействие гемоглобина с Ог. Названные зависимости отражают содержание кислорода, которое определяют в опытах in vitro. И не касаются условий доставки кислорода в условиях in vivo.
Реальные условия применения эмульсий ПФУ в клинике предполагает совместную циркуляцию частиц ПФУ с достаточно большим количеством эритроцитов. Поэтому функциональную активность эмульсий необходимо рассматривать в связи с газотранспортными свойствами крови, что не вполне является общепринятой точкой зрения. Процесс доставки газов кровью определяется «микрокинетикой», т.е. скоростью диффузии молекул Ог от эритроцитов к тканям и молекул СОг в противоположном направлении. Схематически этот процесс представлен на рис. 1. [3]. Частицы находятся на пути диффузии молекул Ог и СО2 от эритроцитов к тканям и, теоретически, могут оказывать влияние на этот процесс.
Пример 1. Влияние эмульсий перфторуглеродов на скорость оксигенации и деоксигенации крови [4]
Частицы ПФУ занимают определённый объём на пути диффузионных потоков Ог и СО2 при совместной циркуляции с эритроцитами. Теоретически они могут изменить условия доставки газов кровью: ускорить или замедлить диффузию газов от кислорода от эритроцитов к тканям и углекислоты в противоположном направлении. В этом случае присутствие эмульсии в токе крови должно сказаться на скоростях оксигенации и деоксигенации эритроцитов. Экспериментально этот процесс был изучен нами на установке, моделирующей циркуляцию крови при гемодилюции в присутствии эмульсии (Гт= 25— 30%, Cv~=T% по объёму, а ~= 010 мкм). В физическом эксперименте установлен феномен увеличения скоростей оксигенации и деоксигенации эритроцитов при их совместной циркуляции с частицами ПФУ (рис. 2 и рис. 3). То есть доказан эффект изменения условий транспорта кислорода эритроцитами в присутствии небольшого объёма эмульсии ПФУ: присутствие эмульсии в водной среде увеличивает скорость диффузии молекул 02. Вследствие этого и был установлен феномен увеличения скоростей оксигенации и деоксигенации эритроцитов.
Причина этого явления обусловлена повышенной растворимостью газов крови во фторуглеродной фазе эмульсии и увеличением коэффициента массопереноса Ог частицами [2] , поскольку толщина оболочки ПАВ вокруг частиц не препятствует возможности свободного прохождения газов через частицы. Следует отметить, что скорость оксигенации в моделируемых условиях (в установке) в ~100 раз меньше, чем в организме. Поэтому скорость оксигенации in vivo может быть больше, чем полученная в условиях in vitro.
О чужеродности эмульсий перфторуглеродов и их влиянии на организм
Согласно требованиям Фармакопеи существующие критерии выбора состава препарата основываются на оценке их эффективности и безвредности в опытах на животных. Что справедливо , но недостаточно, поскольку частицы имеют собственный объём и могут влиять на собственную структуру крови. Кроме того, в силу химической инертности ПФУ частицы ПФУ не перевариваются ферментными системами и являются чужеродными для организма. В различных острых опытах на животных было установлено, что эмульсии ПФУ продлевают жизнь животных за счёт их газотранспортной функции. Однако при внутривенном введении этих сред наблюдаются изменения различных биологических систем организма. Подробные результаты исследований этих изменений при замещении крови эмульсиями перфторуглеродов приведены в монографии [5]. Авторы наблюдали: изменение клеточного состава крови, снижение числа эритроцитов, сдвиг формулы для лейкоцитов, изменение клеточного состава костного мозга и активности ряда ферментных систем. С увеличением срока наблюдений ( не менее 2-х недель или месяца) за экспериментальными животными это раздражающее действие снижалось по причине компенсаторных реакций, характерных для живого организма.
Причиной этих изменений является чужеродность частиц. Термин «чужеродность» редко применяется применительно к частицам ПФУ. Речь идёт не об их токсичности. В настоящее время качество ПФУ для целей биологии и медицины достигло высокого уровня. ЛД50 составляет не менее 5-10 г/кг. В данном случае при изучении качества разрабатываемого ПФУ препарата до тестирования на животных необходимо проверить его влияние на кровь in vitro. Выполнение этого условия позволяет уточнить, точнее проверить, биосовместимость новой инфузионной среды с кровью, т.е. с сохранением биологических свойств форменных элементов крови при достаточно длительной циркуляции с эмульсионным препаратом. Здесь действует фактор, который отличает эмульсии ПФУ от других препаратов: эффективность эмульсий ПФУ, как средства, как препарата, доставляющего кислород тканям, определяется продолжительностью времени циркуляции частиц в сосудистом русле.
Наши расчёты показали, что при внутривенном введении 10 % (по объему) эмульсии ПФУ в дозе ~ 5-ь 10 мл/кг число частиц в мм3 на несколько порядков превышает число клеток в том же объёме крови [3]. Клетки крови в сосудистом русле двигаются как бы в окружении мелких ПФУ частиц, которые могут (или должны) оказывать влияние на специфическую активность форменных элементов крови. Закономерности этого влияния условиях in vivo могут быть нивелированы (или изменены) за счёт компенсаторных реакций живого организма. Постановка эксперимента in vitro, позволяет изучить непосредственное воздействие ПФУ препарата на клетки крови в строго определённых условиях (концентрация ингредиентов, постоянство температурного режима и времени инкубации в термостате и др).
С учётом этого обстоятельства в опытах in vitro было изучено влияние стабильной эмульсии заданно состава на морфофункциональное состояние клеток крови: эритроцитов, нейтрофилов, тромбоцитов. В отдельных опытах была проверена стабильность применяемых эмульсий (сохранение размера и поверхностных свойств частиц). Состав приведён в таблице 5, код исследуемых ПФУ эмульсии АТ или АТ-300. По физико- химическим параметрам эмульсии ПФУ отвечали медико-биологическим требованиям, предъявляемым к этим средам.
Пример 2. Влияние эмульсий перфторуглеродов на индуцируемую агрегацию тромбоцитов [6].
О характере влияния эмульсий ПФУ на агрегационную активность тромбоцитов донорской крови судили, используя фотометрический метод Борна. Метод основан на непрерывной регистрации изменения светопропускания перемешиваемой и термостатируемой суспензии. Запись процесса агрегации тромбоцитов в плазме крови здоровых лиц проводили на агрегометре Solar АР 2110 с программным обеспечением для регистрации результатов. Использовали следующие параметры для оценки агрегационной функции тромбоцитов: L - латентный период (сек), V - скорость агрегации на 30-й секунде (%/мин), МА - максимальная амплитуда (%).
По результатам изучения влияния эмульсии ПФУ на светопропускание богатой тромбоцитами плазмы сделано заключение, что исследуемые эмульсии не являются индуктором агрегации тромбоцитов. В случае АДФ-индуцированного процесса агрегации тромбоцитов выявлено разнонаправленное влияние эмульсии ПФУ на агрегационную активность тромбоцитов в зависимости от используемой дозы Таблица 1.
Добавление эмульсии ПФУ в конечной концентрации 4% вызывало повышение активности тромбоцитов, что характеризовалось увеличением максимальной амплитуды, скорости реакции, степени дезагрегации и времени достижения максимальной амплитуды. При увеличении концентрации эмульсии до 10 % наблюдали постепенное торможение процесса агрегации тромбоцитов: падение скорости и максимальной амплитуды, уменьшение процента дезагрегации тромбоцитов. При достижении конечной концентрации 15% процессы торможения прогрессировали - скорость агрегации и процент дезагрегации снижались по сравнению с исходным уровнем. Латентный период агрегации не зависел от концентрации эмульсии в образце.
Таблица 1 Влияние дозы эмульсии ПФУ на параметры АДФ-индуцированной агрегации в плазме с повышенной активностью тромбоцитов
Figure imgf000010_0001
Интересно отметить, что в одной из плазм с исходно повышенной агрегационной активностью тромбоцитов (кровь пациента, не донорская кровь; двуволновая агрегационная кривая) добавление эмульсии в концентрации 4% не приводило к дополнительной активации тромбоцитов, а оказывало скорее «нормализующий» эффект - исчезала вторая волна агрегации тромбоцитов. Увеличение концентрации эмульсии до 10, и затем до 15 % приводило к снижению интенсивности процесса агрегации почти до нормальных величин.
Таким образом, исследуемые эмульсии ПФУ/ФЛ оказывают дозозависимое влияние на сложный процесс индуцируемой агрегации тромбоцитов донорской крови при содержание эмульсии в пробе < 20 об.%. Главный результат - полученные эмульсии не являются индуктором агрегации нормальных тромбоцитов. Пример 3. Влияние эмульсий перфторуглеродов на эритроциты и нейтрофильные гранулоциты [7]
Оценка влияния эмульсии АТ-300 на состояние мембраны эритроцитов осуществлялась путем подсчета эхиноцитов (недискоидной формы клеток) в мазке крови (на 1000 эритроцитов) после 60-минутной инкубации при 37°С. -Гемолиз эритроцитов оценивали в соответствии с инструкцией, принятой в Службе крови. Функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов оценивалась по их способности восстанавливать краситель «нитросиний тетразолий» в НСТ-тесте. В параллельных опытах оценивали перекисное окисление липидов (ПОЛ) по содержанию малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови.
Количество эхиноцитов в пробе крови постепенно увеличивалось с увеличением содержания эмульсии в крови (таблица 2). Отсутствие видимого гемолиза эритроцитов сохранялось в диапазоне концентраций от 100:1 до 10:5. И только в условиях запредельно высокой концентрации эмульсии (1 :1 и 1 :2) появляется видимый массивный гемолиз («лаковая кровь»). Свободный гемоглобин в плазме при этом колеблется от 0,926 г/л до 3,42 г/л - соответственно, в отличие от предельно допустимых величин (не более 0,1 г/л).
Таблица 2. Влияние эмульсии ПФУ/ФЛ на состояние мембраны эритроцитов«т vitro»
Figure imgf000011_0001
Учитывая взаимосвязь процессов активации кислородзависимого метаболизма нейтрофилов с перекисным окислением липидов (ПОЛ), была проведена сравнительная оценка активности этих процессов под влиянием эмульсии АТ-300 в различных концентрациях «in vitro». (Табл.З) Таблица 3. Значения HCT-теста и МДА при различных соотношениях кровь/эмульсия
Figure imgf000012_0001
Увеличение HCT - теста при соотношениях кровь /эмульсия < 10/2 можно расценивать как закономерную реакцию нейтрофилов на чужеродный агент- частицы ПФУ. Частицы ПФУ как внешний раздражитель поглощаются нейтрофилами. И активация нейтрофилов в данном случае является результатом фагоцитоза. Однако, при этом активированные нейтрофилы сохраняют способность к фагоцитозу (проверено на микробной культуре золотистого стафилококка). Величины МДА в указанном диапазоне содержания эмульсии в пробе крови не превышают исходных значений этого параметра. Увеличение относительного содержания эмульсии в пробе крови приводит к подавлению естественного процесса активации нейтрофилов, а также к возрастанию воздействия частиц ПФУ на мембрану разных клеток. Об этом свидетельствует увеличение содержания МДА, который является тестом на перекисное окисление липидов мембраны клеток.
Таким образом, результаты изучения морфофункциональных характеристик эритроцитов и нейтрофильных гранулоцитов при взаимодействии их с эмульсией АТ-300 в различных концентрациях «in vitro» позволяют выбрать наиболее благоприятный диапазон соотношения кровь/эмульсия- = 10/2 ( не более), т.е. низкие значения содержания эмульсии в крови < 20 % являются предпочтительными.
Неоднозначность связей между изменениями морфофункциональных свойств форменных элементов крови под влиянием различной концентрации эмульсии ПФУ свидетельствует о сложности процессов взаимодействия крови с эмульсией. В первую очередь это связано с изменением связей между структурными элементами собственно крови. Эта сложная картина может найти отражение в таком макропараметре как реология крови: изменении её реологических параметров под влиянием эмульсии.
Пример 4. Влияние эмульсий перфторуглеродов на реологические параметры крови
\п Исследования проводили в модельных условиях гемодилюции крови Гт=25, Эмульсию ПФД/ПФТБА (соотношение 7/3) получали методом гомогенизации при давлении 300-500 атм согласно разработанным методам. Использовали эмульгатор - проксанол - 4%, содержание фторуглеродной фазы составляло- 8,6 об%, средний диаметр частиц - 0,12±0,03. Из экспериментальных данных находили предел текучести параметр, отражающий начало течения исследуемой среды, и вычисляли коэффициент агрегации А- -показатель характеризующий способность красных клеток крови образовывать агрегаты
[9]·
Получены результаты, согласно которым степень агрегации эритроцитов зависит от содержания эмульсии в пробе крови (таблица 4): при содержании эмульсии в пределах ~ 1- 2 об.% наблюдаются низкие значения коэффициента агрегации. С увеличением содержания фторуглеродной фазы эмульсии отмечено возрастание А. Это обстоятельство свидетельствовало об образовании новых структур, обусловленных дополнительным взаимодействием частиц ПФУ и эритроцитов в смеси кровь/эмульсия (таблица 4).
Таблица 4. Коэффициенты агрегации эритроцитов А [8] в крови и смесях {кровь/эмульгатор}, {кровь / эмульсия / эмульгатор} при различном содержании фторуглеродной фазы (С )
Figure imgf000013_0001
Таким образом, только низкое содержание частиц эмульсии в пробе крови (< 10 об.%) оказывает дезагрегирующее действие на эритроциты: низкие значения параметра А, сопоставимые с действием эмульгатора, который не содержит собственной объёмной ПФУ субстанции.
Об оптимизации состава нового кислородпереносящего кровезаменителя.
Полученные нами результаты (примеры 1-5) служат основанием для пересмотра существующей точки зрения о необходимости иметь высокую кислородную ёмкости разрабатываемого ПФУ препарата. Во-первых, в физическом эксперименте показано, что при совместной циркуляции небольшого объёма эмульсии ~ 1 об% (сравнительно с количеством эритроцитов гематокрит ~ 25- ЗО %) происходит увеличение скоростей оксигенации и деоксигенации эритроцитов. Этот факт доказывает, что эмульсия в небольшом объёме в токе крови увеличивает скорость диффузии кислорода от эритроцитов в ткани (пример 1). Во -вторых, в биологических и биофизическом тестах (примеры 2-4) подтверждён факт влияния эмульсии на морфо-функциональное состояние клеток крови (тромбоциты, эритроциты, нейтрофилы). Причём, степень этого влияния зависит от дозы эмульсии в пробе крови. Выбрано оптимальное содержание (объём) эмульсии в пробе крови: оптимальный объём эмульсии в смеси кровь /эмульсия составляет ~ 20 % от общего объёма смеси кровь/эмульсия. По данным биофизического эксперимента содержание эмульсии в крови не должно превышать 10%. Эти результаты свидетельствуют о целесообразности снижения концентрации фторуглеродной фазы в эмульсии, т.е. снижении её кислородной ёмкости.
Задачей настоящего изобретения является улучшение качества заявляемой эмульсии ПФУ/ФЛ и увеличение её стабильности. Понятие «качество» подразумевает минимальное нежелательное воздействие эмульсии на биологические системы организма и в частности на кровь. В обобщённом виде это требование означает биосовместимость эмульсии с биологической средой. В силу неопред ел нности и многозначности понятия «биосовместимость» качество эмульсии необходимо тестировать, используя представление о структуре эмульсии, поскольку сохранение структуры частиц при попадании в сосудистое русло обеспечивает эмульсиям ПФУ выполнение газотранспортной функции. Контроль за прочностью структуры включает определение следующих параметров [2]:
-Размер и распределение частиц по размерам. (Это общепринятый подход. Используют различные методы и приборы. В наших опытах использован метод спектра мутности). -Однородность природы частиц в эмульсии, которая связана с особенностью природы ПФУ жидкостей: ПФУ практически не растворимы в воде и являются плохими растворителями для большого числа веществ (в том числе и для ФЛ). Вследствие этого в эмульсии могут присутствовать два типа частиц: частицы с прочной связью ФЛ с фторуглеродным ядром частиц и свободные или липосомальные ФЛ. Однородность природы частиц характеризуетя совпадением (в пределах погрешности измерений) экспериментальных и расчётных значений мутности: хЭКСп и Храсч·).
-Сохранение поверхностных свойств частиц в определённом интервале значений Кх (индекса взаимодействия с модифицированной сывороткой крови). Наблюдение за комплексом названных параметров характеризует сохранение (или изменение) целостности структуры частиц. Этот разработанный нами подход [2] использован в Прототипе [1].
Таблица 5. Составы эмульсий согласно Заявке на изобретение
Figure imgf000015_0001
* С v-co держание фторуглеродной фазы (об.%). Код эмульсии : эмульсия АТ или АТ 300. ПМ- подсолнечной масло; СМ-Масло сои; КМ-касторовое масло.
Технология получения эмульсии базируется на общем принципе диспергирования жидких ПФУ в водном растворе эмульгирующего компонента при использовании гомогенизатора высокого давления. В Прототипе (автор Кузнецова И.Н.) отражены конкретные примеры реализации получения эмульсий ПФУ/ФЛ, компоненты которых и в Прототипе и в Заявке не имеют принципиального отличия (от заявленного состава эмульсий). Поэтому нами была поставлена новая задача. Показать надёжность использования заявляемых технологических этапов наработки эмульсий одного состава. Для этого необходимо было во-первых, проверить экспериментально воспроизводимость значений комплекса параметров качества нарабатываемых эмульсий от серии к серии, а также их сохранность в течение заявленного срока хранения при ~ + 4° С. Во- вторых, изучить совместимость эмульсий с различными кровезаменителями. Это связано с тем, что эмульсии ПФУ не обладают гемодинамическим действием. Поэтому на практике при лечении гипоксических (критических) состояний их используют совместно с кровезаменителями. Третья задача, изучить возможность увеличения срока хранения полученных эмульсий до двух лет хранения при сохранении их качества, т.е. целостности структуры.
В качестве тестируемого объекта был выбран состав эмульсии, в которой Cv составляет 5 об.% (N°3 в таблице 5, Код эмульсия АТ или АТ 300).
Пример 5. О воспроизводимости параметров .характеризующих качество эмульсий от серии к серии , а также их стабильности при хранении Г 101. Эмульсии получали в соответствии с заявленным способом. В таблице 6 приведён состав и физико-химические параметры 17 серий эмульсий, в таблице 7- размер частиц фракционированных частей тех же серий.
Содержание фторуглеродной фазы составляло 5,2 ±0,4 .Относительная вязкость (относительно воды) изученных серий эмульсий АТ находилась в интервале 1 ,24 - 1 ,62 и во всех случаях не превышали вязкости плазмы (1,57 - 1,75). Кислотность исследованных эмульсий АТ была близкой к физиологической норме - pH находился в пределах 7,10 - 7,4, содержание фтор иона не превышало пределов 10 - 40 мкМ.
Таблица 6. Состав и основные физико-химические параметры эмульсий ПФУ-ФЛ Г 101
Figure imgf000016_0001
Размер частиц от серии к серии колебался в узких пределах (0,11-0,16 мкм) и не менялся при разведении эмульсии водой, как дополнительное стресс-воздействие. Эмульсии были практически монодисперсны, поскольку при изучении ширины распределения частиц по размерам в них не обнаружено частиц диаметром более 0,2 мкм. Причём характер распределения частиц по размерам сохранялся спустя год хранения при +4° С (таблица 7).
Таблица 7. Величины волнового экспонента ( п ) и среднего диаметра частиц (а), характеризующие ширину распределения частиц по размерам для эмульсий ПФУ/ФЛ разных сроков хранения.
Figure imgf000017_0001
На рисунке 4 приведены величины коэффициента взаимодействия (Kt) различных серий эмульсий АТ с сывороткой крови. Видно, что значения этого параметра от серии к серии находились в достаточно узком интервале (1, 5-3,0). Причем этот интервал практически не менялся с увеличением срока хранения эмульсий до 1 года (рисунок 5).
Получено совпадение значений экспериментальных и расчетных значений мутности, что свидетельствует об однородности природы частиц в эмульсиях АТ (таблица 8).
Значения параметра Kt косвенным образом характеризуют поверхностные свойства частиц - сохранение или изменение их «микроструктуры». Узкий интервал колебаний Kt для каждой серии при хранении и сопоставимые значения изменений этого параметра от серии к серии свидетельствовали о стандартности поверхностных свойств частиц и о сохранении их «микроструктуры».
Таким образом, доказана воспроизводимость физико-химических параметров различных серий получаемых эмульсий фиксированного состава, а также их стабильность в течение года хранения в незамороженном состоянии. Общий КОД всех серий эмульсий обозначен как АТ или АТ-300, поскольку в пределах погрешности измерений все серии не отличаются друг от друга.
Таблица 8. Экспериментальные и расчетные значения мутности (t ) для нативных и разведенных водой эмульсий ПФУ/ФЛ разных сроков хранения.
Figure imgf000018_0001
Пример 6 . О совместимости эмульсии ПФУ/ФЛ с различными кровезаменителями сывороткой крови [11].
В клинической практике часто используют различные кровезаменители. В результате происходит разведение крови (гемодилюция). Значение гематокрита уменьшается до '25- 35 %, что приводит к значительному снижению скорости диффузии кислорода от эритроцитов к клеткам. В этих условиях важно было показать, что частицы сохраняют свою корпускулярную природу (структуру) в модельных условиях « эмульсия† кровезаменитель» и «эмульсия+кровезаменитель+ плазма крови». Таблица 9. Величины среднего диаметра частиц исходных эмульсий АТ и в смеси их с кровезаменителями
Figure imgf000019_0001
ТаблицаЮ. Ширина распределения частиц по размерам исходных эмульсий АТ и в смеси их с кровезаменителями
Figure imgf000019_0002
В таблице 9 приведены результаты определения среднего диаметра частиц в исходных эмульсиях и после их смешения с различными инфузионными средами. В таблице 10 - результаты определения ширины распределения частиц по размерам в тех же смесях.
Средний диаметр частиц не менялся при смешении эмульсии АТ с кровезаменителями. Добавление сыворотки крови к 2-х компонентной смеси также не вызывало изменения этого параметра (таблица 11). Не отмечено изменение ширины распределения частиц по размерам (таблица 12) и не обнаружено появление крупных частиц при фракционировании эмульсий в сочетании с кровезаменителями и сывороткой крови.
Таблица 11. Размер частиц эмульсий ПФУ/ФЛ в смеси с кровезаменителями и сывороткой крови
Figure imgf000020_0001
Таблица 12 Ширина распределения частиц по размерам для смеси эмульсий с кровезаменителями и сывороткой крови.
Figure imgf000020_0002
На рисунке 6 представлены величины Кх для исходной эмульсии в сравнении со значениями этого параметра для 2-х и 3-х компонентных смесей. Добавление исследованных коллоидных КЗ не оказывало влияния на поверхностные свойства частиц, поскольку коэффициенты взаимодействия Kt для 2-х компонентных сред практически не менялись. Наличие сыворотки в 3-х компонентной смеси не приводило к увеличению Kt. Аналогичная динамика изменения Kt отмечена в случае солевого физиологического раствора.
При добавлении к эмульсии коллоидных КЗ вязкость смеси определялась исходными значениями вязкости компонентов: увеличивалась или уменьшалась в зависимости от вязкости добавляемого кровезаменителя. Введение сыворотки в 2-х компонентную смесь приводило, как правило, к снижению вязкости, что являлось дополнительным подтверждением несостоятельности высказанного ранее предположения о возможной агрегации частиц в данном случае.
Таким образом, добавление к эмульсии АТ разного типа кровезаменителей и сыворотки крови (модельные условия) не влияло существенным образом на изменение физико-химических параметров этих сред. Это обстоятельство свидетельствовало о сохранении качества эмульсии АТ в смесях «эмульсия + КЗ» и «эмульсия+КЗ+ сыворотка крови», т.е. о совместимости эмульсии АТ с инфузионными средами.
Пример 7.06 увеличении срока хранения полученных эмульсий ПФУ/ФЛ до 2-х лет хранения при температуре ~ + 4° С.
Были получены новые эмульсии идентичного состава эмульсии АТ-4 серии. (Состав см. пример 6). Для оценки полученных результатов о стабильности полученных эмульсий длительных сроков хранения и о воспроизводимости технологического процесса использовали статистические методы (описательный, дисперсионный, регрессионный анализы). Статистический анализ и графическое отображения полученных результатов проводили с использованием функций открытого статистического пакета «R» fhttp://cran.r- proiect.org). Эти исследования проведены А.Ю. Лянгузовым с использованием оборудования ресурсного центра «Обсерватория экологической безопасности» Научного парка СПбГУ.
В течении всего срока хранения эмульсий средний диаметр частиц находился в пределах 0,10-0,15 мкм и не менялся при разведении эмульсий водой. Значения среднего диаметра частиц для верхней и средней фракций нативной и разведённой водой эмульсий при фракционировании составляли 0,12-0,13 мкм. Для нижней фракции средний диаметр частиц был несколько выше, 0,14-015 мкм (рис.7) Сопоставление экспериментальных и расчётных значений мутности (t) для изученных нативных и разведённых водой эмульсий (рис. 8) показало их хорошее совпадение для всего срока наблюдений (р>0,05). Эти результаты свидетельствуют о сохранении однородности природы частиц ПФУ/ФЛ, что обусловлено прочностью связи эмульгатора (ФЛ) с фторуглеродным ядром частиц.
Подтверждением этого положения служат данные о поверхностных свойствах частиц. Результаты дисперсионного анализа показали, что статистически значимых изменений величин индексов взаимодействия эмульсий с сывороткой крови, а также экспериментальных и расчётных значений мутности (t) не обнаружено, р>0,05. Среднее значение Kt за период наблюдений равно 2,45±0,1 1. Величины указанных индексов находятся в установленных нами ранее пределах (1,5- З,0) (пример 6, Фиг. 4 и 5).
Сохранение параметров Кх и экспериментальных и расчётных значений мутности (х) во все сроки хранения эмульсий соответствует данным о стабильности ФЛ, находящихся в поверхностном слое вокруг эмульгированных частиц, поскольку уровень малонового диальдегида спустя год хранения не отличался ( в пределах погрешности определений) от исходных значений этого параметра [10].
Основные физико-химические параметры эмульсий (макропараметры) оставались в пределах, допустимых для физиологических значений крови: значения pH находились в пределах 7, 0-7, 2. Относительная вязкость (относительно воды) не превышала вязкости плазмы ~1 ,7 и составляла 1 ,45—1 ,49, что соответствовало сохранению размера и структуры частиц. Результаты бактериологического контроля показали, что все испытанные серии эмульсий ПФУ/ФЛ после 5 и 23 месяцев хранения стерильны.
Таким образом, изучение комплекса параметров, характеризующих качество эмульсий ПФУ/ФЛ, заявленного состава, показало воспроизводимость физико-химических параметров от серии к серии, а также их сохранение при хранении в незамороженном состоянии в течение 1-1,5 лет (первый этап, пример 5). В дальнейшем в другой группе наработанных эмульсий была подтверждена воспроизводимость изучаемых параметров и срок хранения увеличен до двух лет (второй этап, пример 7). Эти результаты свидетельствуют о прочности структуры частиц при хранении в незамороженном состоянии в течение 2-х лет.
Прочность структуры настолько значима, что добавление к эмульсии кровезаменителей (модельные условия: стресс воздействия при попадании в сосудистое русло) не сказывалось на параметрах качества эмульсий (пример 6). Это обстоятельство свидетельствует о совместимости эмульсий с кровезаменптелями.
Статистический анализ полученных результатов показал, что полученные эмульсии ПФУ/ФЛ в течение ~ двух лет хранения при +4 °С сохраняют следующие физико-химиче- ские параметры: средний диаметр и распределение частиц по размерам, однородность природы эмульгированных частиц, корпускулярную структуру частиц (или структуру двухслойного шара; интервал для Kt = 1- З). Эти результаты свидетельствуют о прочности оболочки эмульгатора (структурно-механического барьера) вокруг частиц in vitro (пример 8). Мы не встретили работ, в которых был бы достигнут подобный уровень стабильности эмульсий ПФУ/ФЛ.
В заключение следует сказать о следующих преимуществах заявленного изобретения перед прототипом и аналогами.
В настоящем изобретении дано научное обоснование состава и способа получения эмульсии ПФУ. Содержанием изобретения является системный подход при рассмотрении природы заявленной эмульсии как основы кровезаменителя. Во-первых, рассмотрен механизм газо-транспортной функции эмульсии при совместной циркуляции частиц ПФУ с кровью. Частицы ПФУ, занимая определённый объём на пути молекул кислорода от эритроцитов к тканям и углекислоты в противоположном направлении, ускоряют этот процесс диффузии газов. Этот фундаментальный процесс доказан на установке, моделирующей циркуляцию крови в организме. Во-вторых, основываясь на расчётных результатах о числе частиц в единице объёма крови при внутривенном введении в организм пациента ~10 мл на кг массы тела эмульсии (10 об %) показано, что все клетки крови движутся в сосудистом русле в окружении нано частиц ПФУ. Это обстоятельство может и должно оказать влияние на их функциональное состояние. В третьих, изучение влияния заявленной эмульсии на морфофункциональное состояние клеток крови (тромбоциты, эритроциты, нейтрофилы) in vitro позволило высказать предположение практического характера об оптимальном соотношении эмульсии и крови in vivo: объём вводимой эмульсии не должен превышать ~ 20 % от объёма крови.
Решающее значение для практического применения эмульсии ПФУ/ФЛ имеют также сведения о сроках хранения этой среды в течение двух лет в незамороженном состоянии, а также воспроизводимость технологических режимов наработки эмульсий, доказанные на большом экспериментальном материале.
Изобретение иллюстрируется на прилагаемых фигурах:
Фиг.1 - Иллюстрация биофизического процесса доставки Ог и СО2 кровью при совместной циркуляции ПФУ частиц и эритроцитов.
Фиг.2- Зависимоси скорости оксигенации da/dt от степени оксигенации а при медленно (а) и быстродекарбоксилированной крови (б) при добавлении физраствора (1), эмульсии (2) и чистого эмульгатора (3) .
Фиг.З- Зависимости скорости деоксигенации da/dt от степени оксигенации а при быстро (а) и медленно декарбоксилированной крови (б) при добавлении физраствора ( 1 ), эмульсии (2).
Фиг.4- Индексы взаимодействия (Kt) различных серий эмульсии АТ с модифицированной сывороткой крови. По оси абсцисс- номера серий; по оси ординат-величины Кф.
Фиг.5-3начения индексов взаимодействия с сывороткой крови (Kt) для тех же серий эмульсий ПФУ/ФЛ разных сроков хранения в незамороженном состоянии. По оси абсцисс- срок хранения (месяц); по оси ординат-величины Кх.
Фиг.6-Параметры К t для смесей эмульсии с кровезаменителями и сывороткой крови. Содержание полиоксидина (ПОК), полиоксифумарина (ПОФ) и рефортана (Реф) 10%, содержание NaCl 50%. Во всех случаях содержание сыворотки крови 10%.
Фиг.7- Изменение размеров частиц разных фракций полученных серий эмульсии ПФУ/ФЛ: сплошная линия - средняя фракция, пунктир - верхняя фракция, точечная - нижняя фрак- ция. А - нативная эмульсия, Б - разведение 1 :1. Средняя и верхняя фракции статистически неотличимы во все сроки хранения.
Фиг.8- Изменение мутности полученных серий эмульсии ПФУ/ФЛ в течение хранения. А - нативная эмульсия; Б - разбавленная 1 : 1 эмульсия. Сплошная линия - экспериментально найденные значения, пунктир-расчетные значения.
Цель и задача изобретения сравнительно с прототипом и аналогами выполнены.
Источники информации
1. Патент РФ 2 259 819 кл.7А61 К 31/02, 9/107, А 61 Р 7/00
2. И.Н. Кузнецова, Автореф. дис. док. биол. наук «Функциональная активность и стабильность эмульсий перфторуглеродов», С.-Петербург 1999 г., 38 с. 3. И.Н. Кузнецова//Перфторорганические соединения в биологии и медицине. Пущино, 2001. -с. 70-76.
4.Журнал физической химии 1993, т.67, N° 3, с. 591-594.
5. А.М. Голубев и др. Реакции биологических систем при замещении крови эмульсиями перфторуглеродов.-М.: ТЕИС, 1993 г. 137 с.
5. Вести службы крови. - 2009. - N° 3, - С. 25-30.
6. Вести. службы крови. - 2009. - N«2. - С. 23-26.
7. Биофизика, 2001,т. 46, No 4, с. 761-764.
8. Physiol. Rev. 1969. V. 49, N<> 4, P.863
9.Химико-фармацевтический журнал 2012, т. 46, o 2, с.52-56.
10. Химико-фармацевтический журнал 2013, t.47,N°6, С. 25-29.

Claims

Формула изобретения
1. Эмульсия перфторуглеродных соединении медико-биологического назначения, содержащая быстровыводящийся основной компонент перфтордекалин, смешанную перфторуглеродную добавку и фосфолипиды, отличающуюся тем, что содержит фосфолипиды в липосомальной форме (везикул, липосом), приготовленной под давлением 60-120 атм в водно-солевой среде, а перфторуглеродная добавка представляет собой смесь перфтороктилбромида и перфтортрипропиламина в оптимальном соотношении.
2. Эмульсия по п. 1., отличающаяся тем, что она содержит 1-10 об.% перфторуглеродных соединений.
3. Эмульсия по п.1 , отличающаяся тем, что соотношение компонентов в смешанной перфторуглеродной добавке перфтороктилбромид/ перфтортрипропиламин составляет 1 : 1 -3:2.
4. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что соотношение перфтордекалина и перфтоуглеродной добавки составляет 1 :1.
5. Эмульсия по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит липосомальные структуры фосфолипидов (липосомы, везикулы) в водно-солевой среде количестве 5-10 вес. % от содержания перфторуглеродной фазы эмульсии.
6. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что липосомальные структуры фосфолипидов содержат фосфолипиды яичного желтка, или фосфолипиды сои, или их смесь
7. Эмульсия по п.1 , отличающаяся тем, что липосомальные структуры ( липосомы, везикулы) содержат адъювант в виде растительного масла в количестве 5 - 10% от суммарного количества содержания фосфолипидов.
8. Эмульсия по п.7, отличающаяся тем, что адьювантом является соевое масло.
9. Эмульсия по п.7, отличающаяся тем, что адьювантом является подсолнечное масло масло.
10. Эмульсия по п.7, отличающаяся тем, что адьювантом является касторовое масло.
1 1. Эмульсия по п.7, отличающаяся тем, что адьювантом является смесь растительных масел , выбранных из группы, включающей соевое, подсолнечное и касторовое масла, взятых в эффективном соотношении.
12. Эмульсия по п. 1, отличающиеся тем, что водно-солевая среда содержит натриевые соли фосфатов и моносахарид манитол в воде для инъекций.
13. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что концентрация компонентов в водно-солевой среде создаёт осмотическое давление в диапазоне 80- 260 мосмолей на литр.
14. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что средний диаметр частиц не превышает 0,15- 0,20 мкм при сохранении прочности структуры частиц.
15. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что срок её хранения в незамороженном состоянии при +4° С составляет не менее 21 -23 месяца.
16. Способ получения эмульсии перфторуглеродов, охарактеризованной в любом из пунктов 1-16, включающий получение липосомальной формы фосфолипидов (везикул, липосом) гомогенизацией под давлением в пределах 60- 120 атм в водно-солевой среде с последующей тепловой стерилизацией, гомогенизацию под давлением указанных перфторуглеродных соединений в липосомальной форме фосфолипидов и тепловую стерилизацию готовой эмульсии.
17.Способ получения эмульсии по п.16, отличающийся тем, что перфторуглеродные соединения гомогенизируют в липосомальной форме фосфолипидов под давлением 250- 650 атмосфер.
18. Способ получения эмульсии по п.16, отличающийся тем, что липосомальная форма фосфолипидов (везикул) стерилизуется в интервале температур 60-95 0 С.
19. Способ получения эмульсии по п.16, отличающийся тем, что эмульсия пефторуглеродных соединений стерилизуется в атмосфере инертного газа при температуре 95-100 °С.
PCT/RU2019/000960 2019-04-12 2019-12-17 Эмульсия перфторуглеродных соединений и способ её получения WO2020209752A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019111180A RU2745290C2 (ru) 2019-04-12 2019-04-12 Эмульсия перфторуглеродных соединений медико-биологического назначения и способ её получения
RU2019111180 2019-04-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020209752A1 true WO2020209752A1 (ru) 2020-10-15

Family

ID=72750495

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2019/000960 WO2020209752A1 (ru) 2019-04-12 2019-12-17 Эмульсия перфторуглеродных соединений и способ её получения

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2745290C2 (ru)
WO (1) WO2020209752A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113101269A (zh) * 2021-04-15 2021-07-13 四川大学华西医院 一种基于纳米脂质体的递送系统、制备方法及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4126873A1 (de) * 1991-08-14 1993-02-18 Fresenius Ag Parenteral verabreichbare, hitzesterilisierbare o/w-fluorkohlenstoffemulsion und verfahren zu ihrer herstellung
RU2162692C1 (ru) * 1999-06-24 2001-02-10 Воробьев Сергей Иванович Состав на основе эмульсии перфторорганических соединений для медико-биологических целей
RU2259819C1 (ru) * 2004-03-01 2005-09-10 Кузнецова Ирина Николаевна Эмульсия перфторорганических соединений медицинского назначения и способ её получения
US20140066522A1 (en) * 2009-04-15 2014-03-06 Oxygen Biotherapeutics, Inc. Emulsions of perfluorocarbons
US8685441B2 (en) * 1998-01-14 2014-04-01 Lantheus Medical Imaging, Inc. Preparation of a lipid blend and a phospholipid suspension containing the lipid blend

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5835485B2 (ja) * 1976-02-03 1983-08-03 株式会社ミドリ十字 酸素運搬輸液
FR2679150A1 (fr) * 1991-07-17 1993-01-22 Atta Preparations comprenant un fluorocarbure ou compose hautement fluore et un compose organique lipophile-fluorophile, et leurs utilisations.
RU2088217C1 (ru) * 1993-05-07 1997-08-27 Институт биофизики клетки РАН Эмульсия перфторорганических соединений с газотранспортными свойствами
US7083572B2 (en) * 1993-11-30 2006-08-01 Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc. Therapeutic delivery systems
RU2071765C1 (ru) * 1994-07-14 1997-01-20 Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Способ получения липосом
RU2096031C1 (ru) * 1996-09-19 1997-11-20 Акционерное общество "НИЗАР" Средство для профилактики и лечения воспалительных заболеваний тканей пародонта
RU2102972C1 (ru) * 1997-03-17 1998-01-27 Акционерное общество "НИЗАР" Водная эмульсия перфторуглеродов
RU2200582C2 (ru) * 2001-04-02 2003-03-20 Воробьев Сергей Иванович Способ стерилизации перфторуглеродных кровезаменителей и различных сред на основе перфторуглеродных эмульсий
RU2199311C2 (ru) * 2001-04-26 2003-02-27 Воробьев Сергей Иванович Состав перфторуглеродного кровезаменителя на основе эмульсии перфторорганических соединений для медико-биологических целей
RU2200544C1 (ru) * 2001-06-29 2003-03-20 Воробьев Сергей Иванович Способ получения стерильных перфторуглеродных эмульсий для искусственных перфторуглеродных кровезаменителей
RU2253440C1 (ru) * 2004-03-31 2005-06-10 Открытое Акционерное Общество "Фаберлик" Средство для устранения нарушений нейрогенной и эндокринной регуляции системы капиллярного кровотока
RU2275897C1 (ru) * 2004-09-28 2006-05-10 Открытое Акционерное Общество "Фаберлик" Эмульсия перфторуглеродов для косметических и/или дерматологических препаратов
RU106528U1 (ru) * 2010-12-29 2011-07-20 Закрытое акционерное общество "Биннофарм" Клеточный имплантат для восстановления дефектов кожного покрова

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4126873A1 (de) * 1991-08-14 1993-02-18 Fresenius Ag Parenteral verabreichbare, hitzesterilisierbare o/w-fluorkohlenstoffemulsion und verfahren zu ihrer herstellung
US8685441B2 (en) * 1998-01-14 2014-04-01 Lantheus Medical Imaging, Inc. Preparation of a lipid blend and a phospholipid suspension containing the lipid blend
RU2162692C1 (ru) * 1999-06-24 2001-02-10 Воробьев Сергей Иванович Состав на основе эмульсии перфторорганических соединений для медико-биологических целей
RU2259819C1 (ru) * 2004-03-01 2005-09-10 Кузнецова Ирина Николаевна Эмульсия перфторорганических соединений медицинского назначения и способ её получения
US20140066522A1 (en) * 2009-04-15 2014-03-06 Oxygen Biotherapeutics, Inc. Emulsions of perfluorocarbons

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113101269A (zh) * 2021-04-15 2021-07-13 四川大学华西医院 一种基于纳米脂质体的递送系统、制备方法及应用
CN113101269B (zh) * 2021-04-15 2022-04-29 四川大学华西医院 一种基于纳米脂质体的递送系统、制备方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
RU2019111180A (ru) 2020-10-12
RU2019111180A3 (ru) 2020-10-12
RU2745290C2 (ru) 2021-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR940002658B1 (ko) 고불화 유기 화합물의 유탁액
Krafft et al. The design and engineering of oxygen-delivering fluorocarbon emulsions
Matsuki et al. Blood oxygenation using microbubble suspensions
CN1192155A (zh) 通过监测氧合状态有助血液稀释
KR20100118104A (ko) 소생액
DK152256B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af en stabil bloderstatning
Goodin et al. A perfluorochemical emulsion for prehospital resuscitation of experimental hemorrhagic shock: a prospective, randomized, controlled study
RU2259819C1 (ru) Эмульсия перфторорганических соединений медицинского назначения и способ её получения
Torres et al. Effects of perfluorocarbon emulsions on microvascular blood flow and oxygen transport in a model of severe arterial gas embolism
Vorob’ev First-and second-generation perfluorocarbon emulsions
CN101448485B (zh) 用于血液替代品和其他治疗用途的优化的氟碳乳剂
RU2745290C2 (ru) Эмульсия перфторуглеродных соединений медико-биологического назначения и способ её получения
WO2013044186A1 (en) Compositions and methods for molecular imaging of oxygen metabolism
Verdin-Vasquez et al. Use of perftoran emulsion to decrease allogeneic blood transfusion in cardiac surgery: clinical trial
JPS58502204A (ja) 合成全血およびその製造方法
RU2070033C1 (ru) Способ получения перфторуглеродных эмульсий для медицинских целей
Kuznetsova et al. The Effect of Perfluorocarbon Nanoparticles on Blood As a Cellular System
RU2200544C1 (ru) Способ получения стерильных перфторуглеродных эмульсий для искусственных перфторуглеродных кровезаменителей
US5262442A (en) Process for rapid thawing and storage of frozen fluorocarbon emulsion, and resultant product
US20210283071A1 (en) Preparation of a single-surfactant microemulsion
Moolman Oxygen carriers for a novel bio-artificial liver support system
RU2329788C2 (ru) Перфторуглеродно-жировые эмульсии с газотранспортными и энергетическими свойствами для медицинского назначения: состав, способ получения и средство для лечения
LEVINE et al. Perfluorochemical emulsions: potential clinical uses and new developments
RU2308939C2 (ru) Способ получения синтетических перфторуглеродных кровезаменителей и других сред на основе перфторуглеродных эмульсий
RU2307647C2 (ru) Способ получения синтетических перфторуглеродных кровезамещающих составов и других сред на основе перфторуглеродных эмульсий

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19924307

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19924307

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 04/05/2022)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19924307

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1