WO2020204075A1 - 薬剤感受性測定方法、及び、薬剤感受性測定装置 - Google Patents

薬剤感受性測定方法、及び、薬剤感受性測定装置 Download PDF

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WO2020204075A1
WO2020204075A1 PCT/JP2020/015037 JP2020015037W WO2020204075A1 WO 2020204075 A1 WO2020204075 A1 WO 2020204075A1 JP 2020015037 W JP2020015037 W JP 2020015037W WO 2020204075 A1 WO2020204075 A1 WO 2020204075A1
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WO
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microorganism
drug
electrode
test solution
drug susceptibility
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PCT/JP2020/015037
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章玄 岡本
アレクシ グイヨネ
ディビア ナラダス
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国立研究開発法人物質・材料研究機構
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material

Definitions

  • the present invention relates to a drug susceptibility measuring method and a drug susceptibility measuring device.
  • Patent Document 1 describes, as a method for measuring the drug sensitivity of a microorganism, "a second solution containing a microorganism to be measured and a first solution containing a predetermined drug, and a second solution containing the microorganism to be measured and not containing the drug. It is a method of measuring drug sensitivity by detecting the amount of dissolved oxygen in the oxygen electrodes (1a) and (2a), respectively, and the output signals from both oxygen electrodes (1a) and (2a) are first. It is collected at a second time interval during the predetermined time of the above, and each output signal from each oxygen electrode (1a) (2a) is mobile-averaged using a predetermined number of output signals before and after the oxygen electrode (1a) and (2a), and is mobile-averaged.
  • a method for measuring drug susceptibility which comprises calculating the time differential value of each output signal and measuring the drug susceptibility using both time differential values.
  • the drug sensitivity to a microorganism can be measured, but the drug sensitivity measured by the above measuring method may not necessarily reflect the drug sensitivity when the microorganism is present in a living body.
  • the present inventors have found that.
  • a drug susceptibility measuring method comprising a step of administering a drug into the test solution and obtaining information for determining the sensitivity of the microorganism to the drug by a change in an electrochemical response obtained from the electrode.
  • the above-mentioned microorganism has at least one function selected from the group consisting of a function of directly taking in electrons from an extracellular solid and a function of directly donating electrons to an extracellular solid, and is capable of electron transfer inside and outside the cell.
  • [5] The drug susceptibility measuring method according to any one of [1] to [4], wherein the change in the response is a change in the current value per unit time.
  • [6] Culturing in a container containing a test solution containing a microorganism and a medium, an adhesion culture section having at least two electrodes arranged in the container so as to come into contact with the test solution, and the adhesion culture section.
  • a drug susceptibility measuring device comprising a measuring unit for measuring an electrochemical response obtained from the electrode when a drug is administered to the microorganism.
  • An adhesion culture section electrically connected to at least two electrodes arranged in contact with the test solution in a container containing a test solution containing a microorganism and a medium.
  • a drug susceptibility measuring device comprising a measuring unit for measuring an electrochemical response obtained from the electrode when a drug is administered to a microorganism cultured in the adherent culture unit.
  • the test solution containing the microorganism and the medium is contained in a container capable of containing the test solution and having at least two electrodes arranged so as to be in contact with the contained test solution.
  • Information for determining the susceptibility of the microorganism to the drug is obtained from the adhesion culture of the microorganism on the electrode and the administration of the drug in the test solution, and the change in the electrochemical response obtained from the electrode.
  • the microorganism has at least one function selected from the group consisting of a function of directly taking up electrons from an extracellular solid and a function of directly donating electrons to an extracellular solid, and is capable of electron transfer inside and outside the cell.
  • the drug susceptibility measuring method according to [8] or [9] which is a specific microorganism.
  • the drug susceptibility measuring method according to [10] wherein the electron transfer is performed by fermentation and metabolism.
  • a plurality of test solutions containing a microorganism and a medium are contained in a plurality of wells capable of containing the test solution and having at least two electrodes arranged so as to be in contact with the contained test solution.
  • the drug of the microorganism is administered for each well.
  • a method for measuring drug susceptibility which comprises obtaining information for determining susceptibility to.
  • the present invention can provide a drug susceptibility measuring method and a drug susceptibility measuring device capable of accurately measuring drug susceptibility even when a target microorganism forms a biofilm.
  • microorganisms are adhered and cultured on the electrodes of an electrochemical cell having a medium and two or more electrodes arranged so as to be in contact with the medium.
  • culture step By administering the drug to at least one of the steps (hereinafter, also referred to as “culture step”), the medium, and the group consisting of the microorganisms, and changing the electrochemical response obtained from the electrodes.
  • a drug susceptibility measuring method comprising a step of obtaining information for determining the susceptibility of the microorganism to the drug (hereinafter, also referred to as a “drug administration step”).
  • the present inventors have continued to diligently investigate the reason why the drug sensitivity measured by the method described in Patent Document 1 may not reflect the drug sensitivity of the target microorganism in vivo.
  • microorganisms adhere to and fix tissues in the living body to form an extracellular matrix (biofilm) composed of polysaccharides, proteins, etc., and when they are present in the biofilm, they are sensitive to drugs.
  • the cause is a change (typically a decrease in sensitivity). That is, in the conventional method such as the method described in Patent Document 1, a drug is administered to a microorganism in a state of being suspended in a solution or reversibly attached, and its influence is evaluated. It was thought that there was a problem like this.
  • the present inventors have clarified that the energy metabolism reaction of a microorganism such as mutans in a biofilm can be detected by electron transfer inside and outside the cell and inside and outside the biofilm, and the present invention was inspired by this. completed.
  • microorganisms are adhered and cultured on electrodes, the energy metabolism of the microorganisms is detected as an electrochemical response, and a drug is administered thereto to obtain changes in the electrochemical response.
  • One of the features is to evaluate the drug sensitivity of the above microorganisms.
  • FIG. 1 is a diagram showing the flow of the drug susceptibility measurement method.
  • microorganisms are adhered and cultured on the electrodes of an electrochemical cell having a test solution containing a microorganism and a medium and two or more electrodes arranged so as to be in contact with the test solution.
  • S01 a step of administering a drug into the test solution and obtaining information for determining the susceptibility of the microorganism to the drug by the change in the electrochemical response obtained from the electrode.
  • the culturing step is a step of adhering and culturing microorganisms on the electrodes of an electrochemical cell having a test solution containing a microorganism and a medium and two or more electrodes arranged so as to be in contact with the test solution. is there. According to this step, the microorganism to be measured for drug sensitivity can be cultivated and the measurement can be prepared.
  • FIG. 2 is a schematic view showing an embodiment of a measuring device that can be used in the above step.
  • the electrochemical cell 11 has a working electrode 12, a counter electrode 13, a reference electrode 14, and a test solution 16 housed in a container 15. Each electrode is arranged so as to be in contact with the test solution 16. Each electrode is electrically connected to the control device 17.
  • the control device 17 is configured so that the current value between the electrodes and the potential difference can be measured and adjusted, whereby the potential of the medium can be controlled.
  • the control device 17 can typically use a potencio / galvanostat (P / G stat).
  • the electrochemical cell 11 has three electrodes, but the electrochemical cell used in this method is not limited to the above, and may have at least two electrodes.
  • the electrode potential is measured more accurately by using one or more as reference electrodes and controlling the reference electrode so that no current flows through the control device 17. , And / or can be controlled, which is preferable. If the amount of current between the electrodes required to set the potential is known in advance, the potential can be controlled even if the electrochemical cell does not have a reference electrode.
  • the measuring device has a working electrode 12, a counter electrode 13, and a reference electrode 14, but the measuring device is not limited to the above. For example, it may have another reference electrode instead of the counter electrode.
  • the material of the electrode is not particularly limited, and a known electrode material can be used.
  • the electrode material include carbon, gold, platinum, silver, molybdenum, cobalt, nickel, palladium, ruthenium and the like, and may be indium tin oxide and the like, and a known material for the electrode is used. Can be done.
  • the shape and the like are not particularly limited, and electrodes known for electrochemical measurement cells can be used.
  • the area of the electrode in contact with the test solution is preferably 1 cm 2 or less in that even a smaller amount of the test solution (specifically, 0.001 to 5 ml) can be detected with favorable sensitivity.
  • a known reference electrode can be used, for example, a silver / silver chloride electrode or the like can be used.
  • the counter electrode the same material as each of the above electrodes can be used.
  • the container 15 is not particularly limited, and a known container can be used.
  • the container is preferably made of an insulating material, for example, a thermoplastic resin such as polyetherimide (PEI), polyethylene terephthalate (PET), and polyethylene (PE), and a thermosetting resin such as a polyimide resin and an epoxy resin. It is made of insulating materials such as resin, glass, ceramics and paper.
  • the size of the container is not particularly limited, but can be appropriately selected depending on the amount of the sample solution to be used, and the volume is preferably about 0.001 to 100 ml.
  • the container may be airtightly configured. If the container is airtight, more favorable measurements may be possible.
  • the method for forming the container airtightly is not particularly limited, and a known method can be applied. For example, a method of using a container with a lid having a container and a lid portion covering the opening of the container, a method of covering the container with a gas barrier sheet or the like, and the like can be mentioned.
  • Test solution contains microorganisms and a medium.
  • the medium is not particularly limited, and a known medium for culturing microorganisms can be used.
  • the medium may be a liquid or a solid, but a liquid is preferable and water is not particularly limited as the liquid in that it is excellent in handleability and more excellent effects of the present invention can be obtained. It is preferable to contain it.
  • Other components that the medium may contain include, for example, redox substances, electrolytes, nutrient source compounds and the like.
  • the redox substance is preferably a substance that reversibly causes a redox reaction between the working electrode and the counter electrode and does not inhibit the growth of microorganisms. Examples of such a component include iron ions.
  • the redox substance has an electron transfer function and is typically an electron transfer substance.
  • iron ions may be coordinated with a chelating agent in that it exists more stably in the medium.
  • the chelating agent include diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetraethylenetriamine (TET), ethylenediamine (EDA), diethylenetriamine (DETA), citric acid, oxalic acid, crown ether, and nitrilotetraacetic acid.
  • DTPA diethylenetriaminepentaacetic acid
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • TET tetraethylenetriamine
  • EDA ethylenediamine
  • DETA diethylenetriamine
  • quinone compounds such as potassium ferrocyanide, anthraquinone disul, and sodium honate; methyl viologen; and the like can be used. These substances are also reversibly changed into oxidants and reductions by the redox reaction.
  • the content of the redox substance in the medium is not particularly limited, but is generally preferably 0.001 to 100 mmol / L.
  • the medium may contain one kind of redox substance alone or two or more kinds. When the medium contains two or more kinds of redox substances, the total content thereof is preferably within the above numerical range.
  • the electrolyte is not particularly limited, and a known electrolyte can be used.
  • Examples of the electrolyte include sodium chloride, potassium chloride and the like.
  • the nutrient source medium preferably contains a nutrient source necessary for the growth of microorganisms, and examples of such components include sodium lactate, KH 2 PO 4 , NH 4 Cl, MgCl 2 , and casamino acid. Can be mentioned.
  • the microorganism contained in the microbial test solution is a microorganism for which the drug sensitivity is measured, and the type thereof is not particularly limited.
  • the test solution may contain one type of microorganism or two or more types.
  • the test solution e.g., Streptococcus mutans, and Streptococcus, such as Streptococcus sanguinis (Streptococcus); Porphyromonas gingivalis Porphyromonas such (Porphyromonas); Aggregatibacter Agri Gay tee genus such actinomycetemcomitans (Aggregatibacter); Geobacter metallireducens , Geobacter sulfurreducens, Geobacter lovleyi and the like Geo (geo) bacter genus; Shewanella oneidensis MR-1 and the like Shewanella genus; Bacteria such as Aggregatibacterus, such as Aggregatibacter, and other bacteria of the genus Aggregate
  • Pantoea Pantoea, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Salmonella, Serratia, Tatumella, Trabulsiella, Xenorhabdus, Yersinia, Yokenera
  • Pantoea Pantoea, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Salmonella, Serratia, Tatumella, Trabulsiella, Xenorhabdus, Yersinia, Yokenera
  • Examples include the genus, Haemophilus, and other chlamydia.
  • fungi examples include yeast-like fungi such as Cryptococcus and Candida, and filamentous fungi such as Aspergillus.
  • the culture solution may contain one type of the specific microorganism alone, or may contain two or more types.
  • FIG. 3 is a functional block diagram of the measuring device.
  • the adhesion culture unit 21 composed of a container capable of accommodating the test solution, a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode is arranged on the substrate via the substrate arranged in the control device 17. It is electrically connected to the control unit 22.
  • the adjusting unit 23 is controlled by the control unit 22 to adjust the potential and the current between the electrodes of the adhesion culture unit 21. Further, the electrochemical response (current value and potential) is measured by the measuring unit 24 controlled by the control unit 22.
  • the control unit 22 is a processor.
  • the control unit 22 includes a central processing unit (CPU), a microprocessor, a processor core, a multiprocessor, an ASIC (application-specific integrated circuit), an FPGA (field programmable gate array), and the like, but is limited to the above. Not done.
  • the control unit 22 reads a program stored in the storage unit 25, controls the adjustment unit 23, the measurement unit 24, and the storage unit 25 according to this program, and executes a predetermined arithmetic process. In addition, the control unit 22 can appropriately write and read the calculation result according to the program in the storage unit 25.
  • the storage function of the storage unit 25 is realized by a non-volatile memory such as an HDD (hard disk drive) and an SSD (solid state drive). Further, the storage unit 25 may have a function as a memory for writing or reading the progress of the arithmetic processing by the control unit 22.
  • the memory function of the storage unit is realized by volatile memory such as RAM (random access memory) and DRAM (dynamic random access memory).
  • the potential of the working electrode is adjusted, and the conditions are controlled so that electrons can be received, the metabolic reaction of the microorganism can be detected by the current value of the working electrode. ..
  • FIG. 4 is an explanatory diagram of the metabolic reaction of microorganisms adherently cultured on the working electrode 12.
  • the microorganism 31 attached to the working electrode 12 forms a biofilm 33 and emits electrons to the working electrode 12 via the protein 32 present in the outer cell membrane. By detecting this electron transfer as a current value, the metabolic reaction of the microorganism 31 in the biofilm can be detected.
  • one cell of the microorganism 31 is described in the biofilm 33 in FIG. 3, the above is a schematic view, and in the biofilm 33, a colony containing the microorganism 31 is generally formed. Has been done.
  • electrons are transferred from the microorganism 31 to the working electrode 12, but depending on the type of the microorganism 31 and the conditions of the electrode, electron transfer from the working electrode 12 to the working electrode 31 occurs due to a metabolic reaction. In some cases, the above may be detected.
  • FIG. 4 shows a form in which electrons are transferred directly to the electrode, which is an extracellular solid.
  • microorganisms move between the electrode via the electron transport chain 41 and 42. Reactions in the form of donating and receiving electrons can also be detected.
  • the electron transport chain 41 and 42 include riboflavin and the like.
  • the microorganisms selected from the group consisting of a function of directly taking in electrons from an extracellular solid and a function of directly donating electrons to an extracellular solid in that it has a more excellent effect of the present invention. It is preferable that the microorganism has the above-mentioned function and is capable of electron transfer inside and outside the cell.
  • Such specific microorganisms are not particularly limited, and examples thereof include iron-reducing bacteria and iron-oxidizing bacteria. More specifically, Geobacter metallireducens, Geobacter sulfurreducens, Geobacter lovleyi like GEO (Geo) Bakuta - genus; Shewanella oneidensis MR-1, etc.
  • the above electron transfer is carried out by fermentation metabolism.
  • Microorganisms particularly bacteria are generally known to decompose organic matter to obtain energy through the metabolic reactions of "respiration” and "fermentation".
  • electrons reducing power
  • these electrons are passed to extracellular substances to obtain energy, whereas in fermentation, the transfer of electrons to the outside of the cell is in principle.
  • bacteria having the above-mentioned electron transfer function do not ferment.
  • bacteria having the above functions can perform electron transfer by fermentation. It is presumed that the electron transfer due to fermentation transfers surplus electrons in the cell to the electrode as compared with the electron transfer due to respiration.
  • the metabolism of a target bacterium can be controlled according to the purpose by adjusting the potential difference between the electrodes. For example, it is preferable in that it can be controlled to be closer to the environment in the living body and to make fermentation more predominant, and that the susceptibility of the drug to pathogenic bacteria can be evaluated more accurately.
  • the adhesion culture performed in this step is preferably a step of forming a biofilm on the electrode by the target microorganism.
  • the present inventors have clarified that the above-mentioned microorganisms may form a biofilm in the body and exert pathogenicity inside the biofilm.
  • the method for forming the biofilm on the electrode is not particularly limited, and a known culture method can be used, and the formation state of the biofilm is such that the obtained electrochemical response (for example, the obtained current value is in a steady state). It can be detected by
  • the drug administration step is a step of administering a drug into a test solution and obtaining information for determining the sensitivity of the microorganism to the drug based on a change in the electrochemical response obtained from the electrode.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram showing the electrochemical response of the working electrode from the culture step already described to the subsequent drug administration step.
  • the horizontal axis represents time and the vertical axis represents the current value of the working electrode.
  • the microorganism is added to the electrochemical cell (T1).
  • the method of adding the microorganism to the electrochemical cell is not particularly limited, and examples thereof include a method of preliminarily culturing the microorganism using a liquid medium and adding the culture solution obtained above to the medium of the electrochemical cell.
  • Microorganisms added to the electrochemical cell grow in a suspended state or a reversible adherent state. At this time, the current value of the working electrode gradually increases. Next, when a certain period of time elapses, the current value of the working electrode becomes substantially constant and the change becomes small (the region indicated by "P1" in FIG. 6). This indicates that the microorganism adhered to the working electrode and fixed to form a colony, and then formed a biofilm composed of polysaccharides, proteins, etc. to maintain homeostasis. Conceivable.
  • the drug administration step it is preferable to carry out the drug administration step when it is in the above-mentioned "P1" region. That is, it is preferable to administer the drug when the electrochemical response becomes substantially constant with respect to time. By doing so, the drug sensitivity in the state where the microorganism forms a biofilm can be measured more accurately.
  • the method of administering the drug into the test solution is not particularly limited, but the drug is directly administered to the test solution, or the drug is previously dissolved or dispersed in another medium, and the obtained solution or dispersion is used.
  • a method of administering the solution into the test solution can be mentioned.
  • Whether the drug is administered and the administered drug affects the activity of the microorganism can be typically evaluated from the tendency of the change in the current value after T2.
  • the current value hardly changes, and becomes (B).
  • the response is that the current value increases (A) or the current value decreases (C).
  • the method for obtaining information for determining the susceptibility of a microorganism to a drug from the change in the electrochemical response is not particularly limited, but for example, the amount of change in the current value, the first derivative of time, and the second derivative of time.
  • Information such as the value, the maximum (minimum) current value, the time required to reach the maximum (minimum) current value, and how the current value rises may be extracted.
  • Relative drug susceptibility can be determined, for example, by comparing the above information between different drugs (eg, control drugs).
  • the information for determining the susceptibility of a microorganism to a drug may be a combination of the above measurement result and the measurement result by another method.
  • the measurement result by another method include the result of fluorescently labeling the viable bacteria in the medium and observing with a microscope.
  • the drug susceptibility measuring apparatus has at least two electrodes and electricity arranged in contact with the test solution in a container containing a test solution containing a microorganism and a medium.
  • FIG. 7 is a block diagram of the measuring device according to the embodiment
  • FIG. 8 is a hardware configuration diagram of the measuring device.
  • the measuring device 70 shown in FIG. 7 includes an adhesion culture unit 71, a control unit 72, an adjusting unit 73, a measuring unit 74, a storage unit 75, a display device 76a, and an input device 76b. ..
  • the user can start, end, view the result, and the like by operating the input device 76b according to the content displayed on the display device 76a.
  • the adhesion culture unit 71 is configured to be electrically connectable to the working electrode WE (77), the reference electrode RE (78), and the counter electrode CE (79) arranged in the container 80.
  • the container 80 can contain a test solution containing a microorganism and a medium, so that the working electrode WE (77), the reference electrode RE (78), and the counter electrode CE (79) come into contact with the test solution. Have been placed.
  • the electrode-equipped container 81 has a working electrode 77, a reference electrode 78, and a counter electrode 79, but the electrode-equipped container 81 used in the measuring device according to the present embodiment is not limited to the above. It suffices to have two or more electrodes.
  • the measuring unit 74 is electrically connected to the adhesion culture unit 71 and is controlled by the control unit 72 to control the working electrode 77, the reference electrode 78, and the counter electrode 79, and the electrochemical response of the test solution. Can be measured. Further, the adjusting unit 73 is controlled by the control unit 72 to adjust the potential and the current between the electrodes of the adhesion culture unit 71.
  • the control unit 72 has a processor 72a and a storage device 72b, and the adjustment unit 73 has a program stored in the storage device 72b and the processor 72a. It corresponds. Further, the measurement unit 74 is controlled by the control unit 72.
  • the adhesion culture unit 71 has a terminal that can be connected to the electrode of the container with electrodes 80, and the container 80 with electrodes and the adhesion culture unit 71 are electrically connected at the time of measurement.
  • the container 80 with electrodes is configured to be detachable from the adhesion culture unit 71, and may be used by replacing each sample solution with a new container 80 with electrodes.
  • the processor 72a includes a central processing unit (CPU), a microprocessor, a processor core, a multiprocessor, an ASIC (application-specific integrated circuit), an FPGA (field programmable gate array), and a GPU (Graphics Processing Unit). , Not limited to the above.
  • the processor 72a can read a program stored in the storage device 72b, control each unit according to the program, and perform a predetermined arithmetic process. In addition, the processor 72a can appropriately write and read the calculation result according to the program into the storage device 72b.
  • the storage function of the storage device 72b is realized by a non-volatile memory such as an HDD (hard disk drive) and an SSD (solid state drive). Further, the storage device 72b may have a function as a memory for writing or reading the progress of arithmetic processing by the processor 72a.
  • the memory function of the storage device 72b is realized by a volatile memory such as a RAM (random access memory) or a DRAM (dynamic random access memory).
  • the processor 72a and the storage device 72b constitute a computer.
  • the display device 76a, the input device 76b, and the control unit 72 may be tablet terminals. The tablet terminal may be wiredly connected to the measuring unit 74 and the adherent culture unit 71, or may be configured to be able to communicate with each other by short-range wireless communication.
  • the container 80 with electrodes can be replaced for each test solution, contamination between sample solutions can be prevented, and drug sensitivity can be measured more accurately.
  • ⁇ Drug susceptibility measurement method (second embodiment)>
  • a test solution containing a microorganism and a medium is capable of containing the test solution and is arranged so as to be in contact with the contained test solution.
  • Containment in a container having two electrodes accommodation step
  • adherent culture of the microorganism on the electrode adherent culture step
  • administration of a drug in the test solution and electricity obtained from the electrode.
  • It is a drug susceptibility measuring method comprising obtaining information for determining the susceptibility of the microorganism to the drug by a change in chemical response (drug administration step).
  • FIG. 9 is a flow chart of a method for measuring drug susceptibility according to the present embodiment.
  • a test solution containing the microorganism and the medium for which the drug sensitivity is to be measured is prepared, and the test solution is contained in the electrode-equipped container 80 (accommodation step; S901).
  • the test solution may be stored by a user operation, or may be performed by an automatic dispensing device or the like.
  • Each electrode of the electrode-equipped container 80 containing the test solution is electrically connected to the adhesion culture unit 71.
  • the components of the medium, the target microorganisms, and the like have already been described.
  • the microorganisms are adherently cultured on the electrodes (culture step; S902).
  • Microorganisms in the test solution contained in the container grow in a suspended state or a reversible adherent state. After that, it adheres to an electrode (for example, a working electrode) and is fixed to form a colony, and further, a biofilm is formed to maintain homeostasis.
  • the method of adherent culture is not particularly limited, and a known method can be used. For example, a method of maintaining the potential difference between the electrodes at a predetermined value can be mentioned. Whether or not the adherent culture is progressing can be confirmed by the electrochemical response of the test solution or the like, as described above.
  • the drug is administered into the test solution, and information for determining the susceptibility of the microorganism to the drug can be obtained from the change in the electrochemical response obtained from the electrode (drug administration step; S903).
  • drug administration step; S903 The above information has already been described with reference to FIG. 6 and the like.
  • the measuring device is in contact with the test solution for each of a plurality of wells arranged in a two-dimensional array in which the test solution containing the microorganism and the medium is contained. It was obtained from the adherent culture section electrically connected to each of the two or more electrodes arranged in the well, and the electrodes obtained when the drug was administered to the microorganisms cultured in the adherent culture section. It is a drug susceptibility measuring device having a measuring unit for measuring an electrochemical response.
  • FIG. 10 is a block diagram of the measuring device 90 according to the embodiment
  • FIG. 11 is a hardware configuration diagram of the measuring device.
  • the measuring device 90 shown in FIG. 10 includes an adhesion culture unit 91, a control unit 92, an adjusting unit 93, a measuring unit 94, a storage unit 95, a display device 96a, and an input device 96b. ..
  • the user can start, end, view the result, and the like by operating the input device 96b according to the content displayed on the display device 96a.
  • the adherent culture unit 91 is configured to be electrically connectable to the multi-well plate 120 with electrodes, and is electrically connected at the time of measurement.
  • the multi-well plate 120 with electrodes has 96 wells 100-1 to 100-96 capable of accommodating the test solution.
  • Wells 100-1 to 100-96 have a working electrode WE (97-1 to 97-96), a reference electrode RE (98-1 to 98-96), and a counter electrode CE (99-1) at the bottom thereof. It has ⁇ 99-96) respectively, and is arranged so as to come into contact with the test solution contained in each well.
  • the adhesion culture unit 91 includes a working electrode WE (97-1 to 97-96), a reference electrode RE (98-1 to 98-96), and a counter electrode CE (99) arranged in the multi-well plate 120 with an electrode. -1 to 99-96) and each well can be electrically connected.
  • the container 80 with an electrode has a working electrode 77, a reference electrode 78, and a counter electrode 79, but the container 80 with an electrode used in the measuring device according to the present embodiment is not limited to the above.
  • Each well may have two or more electrodes.
  • the measuring unit 94 is electrically connected to the adhesion culture unit 91 and controlled by the control unit 92, and the working electrodes 97-1 to 97-96, the reference electrodes 98-1 to 98-96, and the counter electrode 99-1.
  • the electrochemical response of the test solution of wells 100-1 to 100-96 can be measured for each well by controlling from 99 to 96.
  • the adjusting unit 93 is controlled by the control unit 92 to adjust the potential and the current between the electrodes of the adhesion culture unit 91.
  • the control unit 92 includes the processor 92a and the storage device 92b, and the adjustment unit 93 includes the program stored in the storage device 92b and the processor 92a. It corresponds. Further, the measurement unit 94 is controlled by the control unit 92.
  • the adhesion culture unit 91 has terminals that can be individually connected to each electrode of the electrode-attached multi-well plate 120, and the electrode-attached multi-well plate 120 and the adhesion culture unit 91 are electrically connected at the time of measurement.
  • the multi-well plate 120 with electrodes is configured to be detachable from the adhesion culture unit 91, and may be used by replacing each sample solution with a new multi-well plate 120 with electrodes. Specific examples of each hardware are the same as those already described.
  • FIG. 12 is an exploded perspective view of the multi-well plate with electrodes
  • FIG. 13 is a plan view of the multi-well plate with electrodes.
  • the multi-well plate 120 with electrodes is composed of a plate top 121 and a plate bottom 128.
  • the plate upper portion 121 is composed of a wall 126 having an upper base material 122, an outer wall 123, an upper surface 124 (see FIG. 13), and an inner surface 125.
  • the plate upper portion 121 of the multi-well plate 120 has a cylindrical through hole H, and the side surface of the through hole H is defined by the inner surface 125 of the wall 126.
  • the plate top 121 is combined with the plate top 121 with a plate bottom 128 defining wells 127.
  • the plate bottom 128 has a lower substrate 129, a working electrode 130, a counter electrode 131, and a reference electrode 132 arranged on the lower substrate 129, and is combined with the plate upper 121 to form a through hole H.
  • One opening is closed, resulting in the definition of a cylindrical well 127 with an opening at the top.
  • the multi-well plate 120 with electrodes is configured as a multi-well plate having 96 wells, but the number of wells contained in the multi-well plate used in this apparatus is not limited to the above, and for example, 1 piece and 6 wells. It may be 24 pieces, 96 pieces, 384 pieces, 1536 pieces, 6144 pieces, 9600 pieces, or the like.
  • the volume of each well is preferably in the range of 10 nL to 10 mL.
  • the well 127 has a wall 126 having an inner surface 125, a working electrode 130, a counter electrode 131, and a reference electrode 132.
  • the inner surface 125 of the wall 126 defines the cylindrical volume.
  • the sample solution is contained in this cylindrical portion.
  • the counter electrode 131 extends at the bottom of this cylindrical volume into an annular region between the inner surface 125 and the circular working electrode 130.
  • FIG. 14 is an enlarged plan view of the well and a view showing the back surface thereof.
  • the working electrode 130, the counter electrode 131, and the reference electrode 132 have wirings 141, 142, and 143 on the back surface corresponding to the working electrode, the counter electrode, and the reference electrode, respectively, by means of via holes provided at the bottom of the plate in the well.
  • Each wiring on the back surface has connection terminals 144, 145, and 146.
  • the adhesion culture unit 91 has a terminal corresponding to each connection terminal of the electrodes arranged for each well on a one-to-one basis, and is connected to the adhesion culture unit 91 by the above terminal to perform electrochemical measurement for each well. it can.
  • the material of the plate is not particularly limited, but resins such as polyethylene, cellulose acetate, polycarbonate, polypropylene, polyester, polyimide, and polystyrene are preferable.
  • the material of the electrode, wiring, and connection terminal is not particularly limited, but platinum, gold, ITO (indium tin oxide), carbon, a conductive polymer, and the like can be used.
  • the measuring device can measure using a multi-well plate with electrodes having a plurality of wells, the drug susceptibility of many microorganisms can be measured more easily.
  • drug sensitivity under many conditions type of drug, amount of addition, etc. can be measured more easily.
  • ⁇ Drug susceptibility measurement method (third embodiment)>
  • a plurality of test solutions containing a microorganism and a medium are arranged so as to be capable of accommodating the test solution and in contact with the contained test solution.
  • Each of the wells has at least two electrodes, the microorganism is adherently cultured on the electrode, and the drug is administered into the test solution, and the electrochemical response obtained from the electrode is obtained.
  • It is a drug susceptibility measuring method having information for determining the susceptibility of the microorganism to the drug for each well by the change of the above.
  • FIG. 15 is a flow chart of the drug susceptibility measuring method according to the present embodiment.
  • a plurality of test solutions containing the microorganism and the medium for which the drug sensitivity is to be measured are prepared, and the test solutions are contained in each well of the multi-well plate 120 with electrodes (accommodation step; S1501).
  • the test solution may be stored by a user operation, or may be performed by an automatic dispensing device or the like.
  • Each electrode of the multi-well plate 120 with an electrode containing the test solution is electrically connected to the adhesion culture unit 91.
  • the components of the medium, the target microorganisms, and the like have already been described.
  • microorganisms are adhered and cultured on the electrode for each well (culture step; S902).
  • Microorganisms in the test solution contained in the container grow in a suspended state or a reversible adherent state. After that, it adheres to an electrode (for example, a working electrode) and is fixed to form a colony, and further, a biofilm is formed to maintain homeostasis.
  • the method of adherent culture is not particularly limited, and a known method can be used. For example, a method of maintaining the potential difference between the electrodes at a predetermined value can be mentioned. Whether or not the adherent culture is progressing can be confirmed by the electrochemical response of the test solution or the like, as described above.
  • the drug is then administered into the test solution, and changes in the electrochemical response obtained from the electrodes provide information for each well to determine the susceptibility of the microorganism to the drug (drug administration step; S903).
  • drug administration step; S903 The above information has already been described with reference to FIG. 6 and the like.
  • Streptococcus mutans UA159 was anaerobically grown in the above medium at 37 ° C. for 24 hours. Next, the grown bacteria were collected, centrifuged at 2000 g for 10 minutes, and washed twice.
  • a bioreactor (corresponding to an electrochemical cell) in which an ITO-made working electrode, a reference electrode (Ag / AgCl in saturated KCl), and a platinum counter electrode are arranged at the bottom and silicone.
  • a bioreactor composed of sheets was prepared. The bioreactor was then filled with 4.5 mL of the medium, 200 ⁇ L or 100 ⁇ L of 250 mM glucose was mixed with the medium and air was removed by N 2 bubbling for 15 minutes.
  • FIG. 16 shows the time course of the current detected using the bioreactor adjusted as described above.
  • the horizontal axis represents time (h) and the vertical axis represents current value ( ⁇ A). From FIG. 16, the current value initially increased (up to 15-20 hours) and then became substantially constant ( ⁇ 145 hours). The above corresponds to the culture step.
  • Example 2 Using a bioreactor prepared in the same manner as in Example 1, S. cerevisiae was used. The susceptibility of mutans to ampicillin was investigated. Ampicillin is known to suppress bacterial growth by inhibiting cell wall formation. For ampicillin, a stock solution of ampicillin sodium 0.1 g / L was prepared from ampicillin sodium powder (Wako 016-23301), and 80 ⁇ L of the above stock solution was added to the bioreactor at a final concentration of about 1.6 ⁇ g / mL. The results are shown in FIG.
  • Example 3 Using a bioreactor prepared in the same manner as in Example 2, S. cerevisiae was used. The susceptibility of mutans to triclosan was investigated. Triclosan was used at 0.03 mmol / L, ie 8.67 ⁇ g / mL. First, a mother liquor was prepared by dissolving 8.67 mg of triclosan in 10 mL of a 10% aqueous methanol solution. Next, 5 ⁇ L of the above mother liquor was added to the bioreactor (at the time indicated by the arrow on the left side in FIG. 18) so as to have a final concentration of 0.003 mmol / L, and the reaction for 3 hours was observed. Next, 45 ⁇ L of the above mother liquor was added to the bioreactor (arrow on the right side in FIG. 18) so as to have a final concentration of 0.03 mmol / L. The results are shown in FIG.
  • Electrochemical cell 12 77, 130: Working electrode 13, 79, 131: Counter electrode 14, 78, 132: Reference electrode 15, 76: Container 16: Test solution 17: Control device 20, 70, 90: Measuring device 21, 71, 91: Adhesion culture unit 22, 72, 92: Control unit 23, 73, 93: Adjustment unit 24, 74, 94: Measurement unit 25, 75, 95: Storage unit 80: Container 81: Container with electrode 120 : Multi-well plate with electrode 121: Plate upper part 122: Upper base material 123: Outer wall 124: Upper surface 125: Inner surface 126: Wall 127: Well 128: Plate bottom 129: Lower substrate 141, 142, 143: Wiring 144, 145, 146: Connection terminal

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Abstract

【課題】　対象とする微生物がバイオフィルムを形成した状態であっても、薬剤感受性を正確に測定できる、薬剤感受性測定方法を提供する。　【解決手段】　微生物と媒体とを含有する試験液と、上記試験液に接触するように配置された２つ以上の電極と、を有する電気化学セルの上記電極上において上記微生物を付着培養する工程と、上記試験液中に薬剤を投与し、上記電極から得られる電気化学的な応答の変化によって上記微生物の上記薬剤に対する感受性を判断するための情報を得る工程と、を有する薬剤感受性測定方法。　

Description

薬剤感受性測定方法、及び、薬剤感受性測定装置
　本発明は、薬剤感受性測定方法、及び、薬剤感受性測定装置に関する。
　特許文献１には、微生物の薬剤感受性を測定する方法として、「測定対象微生物および所定の薬剤を含む第１溶液中の溶存酸素量、および測定対象微生物を含むとともに、薬剤を含まない第２溶液中の溶存酸素量を、それぞれ酸素電極（１ａ）（２ａ）を用いて検出することにより薬剤感受性を測定する方法であって、両酸素電極（１ａ）（２ａ）からの出力信号を、第１の所定時間の間、第２の時間間隔で収集し、各酸素電極（１ａ）（２ａ）からの各出力信号を、その前後の所定個数の出力信号を用いて移動平均化し、移動平均化された各出力信号の時間微分値を算出し、この両時間微分値を用いて薬剤感受性を測定することを特徴とする薬剤感受性測定方法。」が記載されている。
特開２００１－２５８５９２号公報
　特許文献１に記載された方法によれば、微生物に対する薬剤感受性を測定できるものの、上記測定方法により測定される薬剤感受性は、微生物が生体内に存在する場合における薬剤感受性を必ずしも反映しない場合があることを、本発明者らは知見している。
　そこで、本発明は、対象とする微生物がバイオフィルムを形成した状態であっても、薬剤感受性を正確に測定できる、薬剤感受性測定方法の提供を課題とする。また、本発明は、薬剤感受性測定装置を提供することも課題とする。
　本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。
　［１］　微生物と媒体とを含有する試験液と、上記試験液に接触するように配置された２つ以上の電極と、を有する電気化学セルの上記電極上において微生物を付着培養する工程と、上記試験液中に薬剤を投与し、上記電極から得られる電気化学的な応答の変化によって上記微生物の上記薬剤に対する感受性を判断するための情報を得る工程と、を有する薬剤感受性測定方法。
　［２］　上記付着培養する工程が、上記微生物により上記電極上にバイオフィルムを形成させる工程である、［１］に記載の薬剤感受性測定方法。
　［３］　上記微生物は、細胞外固体から直接電子を取り込む機能、及び、細胞外固体へと直接電子を与える機能からなる群より選択される少なくとも一方の機能を有する、細胞内外で電子移動が可能な特定微生物である、［１］又は［２］に記載の薬剤感受性測定方法。
　［４］　上記電子移動は、発酵代謝により行われる［３］に記載の薬剤感受性測定方法。
　［５］　上記応答の変化が、単位時間当たりの電流値の変化である［１］～［４］のいずれかに記載の薬剤感受性測定方法。
［６］　微生物と媒体を含有する試験液収容可能な容器、及び、上記試験液に接触するように上記容器内に配置された少なくとも２つの電極を有する付着培養部と、上記付着培養部において培養された微生物に対して薬剤を投与した際に上記電極から得られた電気化学的な応答を測定する測定部と、を有する薬剤感受性測定装置。
　[７]　微生物と媒体とを含有する試験液が収容される容器内に、前記試験液と接触するように配置された、少なくとも２つの電極と電気的に接続される、付着培養部と、
　上記付着培養部において培養された微生物に対して薬剤を投与した際に上記電極から得られた電気化学的な応答を測定する測定部と、を有する薬剤感受性測定装置。
　[８]　微生物と媒体とを含有する試験液を、上記試験液を収容可能であって、収容された上記試験液と接するよう配置された少なくとも２つの電極を有する容器に収容することと、上記電極上で上記微生物を付着培養することと、上記試験液中に薬剤を投与し、上記電極から得られる電気化学的な応答の変化によって上記微生物の上記薬剤に対する感受性を判断するための情報を得ることと、を有する薬剤感受性測定方法。
　[９]　上記付着培養が、上記微生物により上記電極上にバイオフィルムを形成させる工程である、[８]に記載の薬剤感受性測定方法。
　[１０]　上記微生物は、細胞外固体から直接電子を取り込む機能、及び、細胞外固体へと直接電子を与える機能からなる群より選択される少なくとも一方の機能を有する、細胞内外で電子移動が可能な特定微生物である、[８]又は[９]に記載の薬剤感受性測定方法。
　[１１]　上記電子移動は、発酵代謝により行われる[１０]に記載の薬剤感受性測定方法。
　[１２]　上記応答の変化が、単位時間当たりの電流値の変化である[８]～[１１]のいずれかに記載の薬剤感受性測定方法。
　[１３]　微生物と媒体とを含有する試験液が収容される二次元アレイ状に配置された複数のウェルごとに、上記試験液と接触するように上記ウェル内に配置された２つ以上の電極のそれぞれと電気的に接続される、付着培養部と、上記付着培養部において培養された微生物に対して薬剤を投与した際に上記電極から得られた電気化学的な応答を測定する測定部と、を有する薬剤感受性測定装置。
　[１４]　微生物と媒体とを含有する複数の試験液を、上記試験液を収容可能であって、収容された上記試験液と接するよう配置された少なくとも２つの電極を有する複数のウェルにそれぞれ収容することと、上記電極上で上記微生物を付着培養することと、上記試験液中に薬剤を投与し、上記電極から得られる電気化学的な応答の変化によって、上記ウェルごとに上記微生物の上記薬剤に対する感受性を判断するための情報を得ることと、を有する薬剤感受性測定方法。
　本発明によれば、本発明は、対象とする微生物がバイオフィルムを形成した状態であっても、薬剤感受性を正確に測定できる、薬剤感受性測定方法、及び、薬剤感受性測定装置を提供できる。
本薬剤感受性測定方法のフローを表す図である。 培養工程において使用可能な測定装置の第１の実施形態を表す模式図である。 測定装置の機能ブロック図である。 作用電極上で付着培養された微生物の代謝反応の説明図である。 微生物が電子伝達物質を介して電極との間で電子を授受する形態の反応の説明図である。 培養工程から、それに続く薬剤投与工程における作用電極の電気化学的応答を示す説明図である。 本発明の第２の実施形態に係る測定装置のブロック図である。 本発明の第２の実施形態に係る測定装置のハードウェア構成図である。 本発明の第２の実施形態に係る薬剤感受性測定方法のフロー図である。 本発明の第３の実施形態に係る測定装置のブロック図である。 本発明の第３の実施形態に係る測定装置のハードウェア構成図である。 電極付きマルチウェルプレートの分解斜視図である。 電極付きマルチウェルプレートの平面図である。 電極付きマルチウェルプレートにおけるウェルの拡大平面図と、その裏面を表す図である。 本発明の第３の実施形態に係る薬剤感受性測定方法のフロー図である。 バイオリアクターを用いて検出された電流の経時変化である。 バイオリアクターを用いて検出された電流の経時変化である。 バイオリアクターを用いて検出された電流の経時変化である。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
　なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
［薬剤感受性測定方法（第１の実施形態）］
　本発明の第１の実施形態に係る薬剤感受性測定方法は、媒体と、上記媒体と接触するように配置された２つ以上の電極と、を有する電気化学セルの上記電極上において微生物を付着培養する工程（以下、「培養工程」ともいう。）と、上記媒体、及び、上記微生物からなる群より選択される少なくとも一方に薬剤を投与し、上記電極から得られる電気化学的な応答の変化によって上記微生物の上記薬剤に対する感受性を判断するための情報を得る工程（以下、「薬剤投与工程」ともいう。）と、を有する薬剤感受性測定方法である。
　本発明者らは、特許文献１に記載された方法により測定される薬剤感受性が、生体内における対象微生物の薬剤感受性を反映しない場合がある原因について鋭意検討を続けてきた。その結果、微生物が生体内の組織等に付着して固定し、多糖類、及び、タンパク質等からなる細胞外マトリクス（バイオフィルム）を形成し、そのバイオフィルム内に存在する場合、薬剤に対する感受性が変化する（典型的には、感受性が低下する）ことにその原因があることを見出した。
　すなわち、特許文献１に記載された方法等の従来の方法では、溶液中に浮遊、又は、可逆的に付着した状態の微生物に対して薬剤を投与し、その影響を評価しているため、上記の様な問題があると考えられた。
　一方で、バイオフィルムを形成した状態の微生物の代謝反応の変化をバイオフィルム外から計測することは従来困難と考えられてきた。
　これに対し、本発明者らは、バイオフィルムの内部に存在する微生物のエネルギー産生メカニズム（代謝反応）、特に嫌気条件下での発酵メカニズムに着目した。そこで、口腔内でバイオフィルムを形成する病原性微生物として知られるＳ．ｍｕｔａｎｓを例に、バイオフィルム内部における微生物の代謝反応の変化を検出する方法を検討してきた。
　その結果、バイオフィルム内部に微生物が存在する場合、上記微生物の代謝によって、バイオフィルム内外、及び、微生物細胞の内外において電子移動が起こることがあることを実験的に突き止めた。
　より具体的には、Ｓ．ｍｕｔａｎｓがバイオフィルム内で糖を代謝すると、乳酸、酢酸、及び、ギ酸等の有機酸、水素、並びに、二酸化炭素等が産生され、バイオフィルム内のｐＨが低下し、還元環境となる。
　このような還元条件下では、ＮＡＤＨの酸化によるＮＡＤ＋の再生が起こりにくくなるため、発酵によるエネルギー産生の最大化が妨げられる。
　このとき、Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、細胞表面に存在するタンパク質を介して、細胞外へと電子を排出して、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋の比を制御しているものと推測される。更に、細胞内外、及び、バイオフィルム内外の電子移動にリボフラビンが寄与していることも本発明者らは実験的に確かめている。
　Ｓ．ｍｕｔａｎｓのような微生物のバイオフィルム内でのエネルギー代謝反応が、細胞内外、及び、バイオフィルム内外の電子移動により検出できることが本発明者らによって初めて明らかにされ、これにより着想を得て本発明は完成された。
　本薬剤感受性測定方法は、電極上で微生物を付着培養し、上記微生物のエネルギー代謝等を電気化学的応答として検出し、ここに薬剤を投与することで、上記電気化学的応答の変化をもとに上記微生物の薬剤感受性を評価する点に特徴の一つがある。
　図１は、本薬剤感受性測定方法のフローを表す図である。本薬剤感受性測定方法は、微生物と媒体とを含有する試験液と、上記試験液に接触するように配置された２つ以上の電極と、を有する電気化学セルの上記電極上において微生物を付着培養する工程（Ｓ０１）と、上記試験液中に薬剤を投与し、上記電極から得られる電気化学的な応答の変化によって上記微生物の上記薬剤に対する感受性を判断するための情報を得る工程（Ｓ０２）と、を有する薬剤感受性測定方法である。以下では、本方法の各工程について詳述する。
〔培養工程〕
　培養工程は、微生物と媒体とを含有する試験液と、上記試験液と接触するように配置された２つ以上の電極と、を有する電気化学セルの上記電極上において微生物を付着培養する工程である。本工程によれば、薬剤感受性を測定する対象となる微生物を培養し、測定の準備を行うことができる。
＜測定装置（第１の実施形態）＞
　図２は、上記工程において使用可能な測定装置の一実施形態を表す模式図である。図２において電気化学セル１１は、作用電極１２、対電極１３、及び、参照電極１４と、容器１５に収容された試験液１６と、を有している。各電極は試験液１６と接するように配置されている。各電極は、制御装置１７と電気的に接続されている。制御装置１７は、各電極の間の電流値、及び、電位差のそれぞれの測定、及び、調整が可能なよう構成されており、これによって媒体の電位を制御することができる。制御装置１７は典型的には、ポテンシオ／ガルバノスタット（Ｐ／Ｇスタット）が使用できる。
　図２において、電気化学セル１１は３つの電極を有しているが、本方法に使用される電気化学セルとしては上記に制限されず、少なくとも２つの電極を有していればよい。
　電気化学セル１１が３つの電極を有している場合、１つ以上を参照電極とし、制御装置１７により上記参照電極には電流が流れないように制御することによって、電極電位をより正確に測定、及び／又は、制御することができるため、好ましい。なお、電位を設定するために必要な電極の間の電流量が予め分かっている場合には、電気化学セルが参照電極を有さなくても、電位の制御が可能である。
（電極）
　上記測定装置は、作用電極１２、対電極１３、及び、参照電極１４を有しているが、測定装置としては上記に制限されない。例えば、対電極に代えて、別の参照電極を有していてもよい。
　電極の材料としては特に制限されず、公知の電極材料を用いることができる。電極材料としては、例えば、炭素、金、白金、銀、モリブデン、コバルト、ニッケル、パラジウム、及び、ルテニウム等が挙げられ、酸化インジウムスズ等であってもよく、電極用として公知の材料を用いることができる。
　また、形状等についても特に制限されず、電気化学測定セル用として公知の電極が使用できる。なかでも、より少ない量の試験液（具体的には、０．００１～５ｍｌ）でも好感度に検出できる点で、試験液に接する電極の面積として１ｃｍ２以下であることが好ましい。
　なお、参照電極としては、公知の参照電極を使用でき、例えば、銀／塩化銀電極等が使用可能である。また、対電極としては、上記の各電極と同様の材料を使用できる。
（容器）
　容器１５としては特に制限されず、公知の容器が使用できる。容器は絶縁性材料で構成されることが好ましく、例えば、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、及び、ポリエチレン（ＰＥ）等の熱可塑性樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂等の熱硬化性樹脂、ガラス、セラミック、紙のような絶縁性材料で形成される。容器の大きさとしては特に制限されないが、使用する試料溶液の量に応じて適宜選択可能であり、０．００１～１００ｍｌ程度の容量であることが好ましい。
　また、容器は気密に構成されていてもよい。容器が気密に構成されている場合、より好感度な測定が可能となる場合がある。容器を気密に構成する方法としては特に制限されず、公知の方法が適用できる。例えば、容器と、容器の開口部を覆う蓋部とを有する蓋つき容器を用いる方法、及び、容器をガスバリアシート等で被う方法等が挙げられる。
（試験液）
　試験液は、微生物と媒体とを含有する。媒体としては特に制限されず、微生物の培養用として公知の媒体を用いることができる。媒体は液体であってもよいし、固体であってもよいが、取り扱い性により優れ、より優れた本発明の効果が得られる点で、液体が好ましく、液体としては特に制限されないが、水を含有することが好ましい。
　媒体が含有してもよい他の成分としては、例えば、酸化還元物質、電解質、及び、栄養源化合物等が挙げられる。
・酸化還元物質
　酸化還元物質は、作用電極、及び、対電極との間で可逆的に酸化還元反応を生じる物質であり、かつ、微生物の生育を阻害しない物質が好ましい。このような成分としては、例えば、鉄イオンが挙げられる。酸化還元物質は、電子伝達機能を有し、典型的には電子伝達物質である。
　酸化還元物質としては、媒体中でより安定的に存在する点で、鉄イオンをキレート剤に配位させて用いてもよい。キレート剤としては、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメル、及び、エデト酸トリエンチン等が挙げられる。
　また、鉄イオン以外にも、フェロシアン化カリウム、アントラキノンジスル及び、ホン酸ナトリウム等のキノン化合物；メチルビオロゲン；等を用いることができる。これらの物質も酸化還元反応により、酸化体と還元体に可逆的に変化する。
　媒体中にける酸化還元物質の含有量としては特に制限されないが、一般に０．００１～１００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
　なお、媒体は、酸化還元物質の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。媒体が、２種以上の酸化還元物質を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
・電解質
　電解質としては特に制限されず、公知の電解質が使用可能である。電解質としては、例えば、塩化ナトリウム、及び、塩化カリウム等が挙げられる。
・栄養源
　媒体は、微生物の生育に必要な栄養源を含有することが好ましい、このような成分としては例えば、乳酸ナトリウム、ＫＨ２ＰＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、ＭｇＣｌ２、及び、カザミノ酸等が挙げられる。
・微生物
　試験液が含有する微生物は薬剤感受性の測定を行う対象となる微生物であり、その種類としては特に制限されない。また、試験液が含有する微生物は１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。
　試験液としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ、及び、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓ等の連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ等のポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）；Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ等のアグリゲイティバクター属（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ）；Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ　ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ　ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ　ｌｏｖｌｅｙｉ等のゲオ（ジオ）バクタ―属菌；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ　ＭＲ－１等のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ属菌；デスルフォビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ　）属菌；Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ等のＡｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ（アシドチオバシラス）属菌；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ菌等のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属菌；等の細菌が挙げられる。
　また、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂｕｄｖｉｃｉａ属、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ属、Ｃｅｄｅｃｅａ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒａ属、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ属、Ｌｅｍｉｎｏｒｅｌｌａ属、Ｍｏｅｌｌｅｒｅｌｌａ属、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ属、Ｏｂｅｓｕｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、Ｐｒａｇｉａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ属、Ｒａｈｎｅｌｌａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｔａｔｕｍｅｌｌａ属、Ｔｒａｂｕｌｓｉｅｌｌａ属、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｙｏｋｅｎｅｌｌａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、その他クラミジア等が挙げられる。
　真菌類としては、例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属等の酵母様真菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属等の糸状菌等が挙げられる。
　なお、培養液は、特定微生物の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。
（機能）
　図３は、上記測定装置の機能ブロック図である。測定装置２０において、試験液を収容可能な容器、作用電極、対電極、及び、参照電極から構成される付着培養部２１は、制御装置１７内に配置された基板を介して、基板上に配置された制御部２２と電気的に接続されている。
　調整部２３は、制御部２２により制御され、付着培養部２１の各電極間の電位、及び、電流を調整する。また、電気化学的な応答（電流値、及び、電位）は、制御部２２に制御された測定部２４によって測定される。
　制御部２２はプロセッサである。例えば、制御部２２は、中央演算装置（ＣＰＵ）、マイクロプロセッサ、プロセッサコア、マルチプロセッサ、ＡＳＩＣ（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｃｉｒｃｕｉｔ）、及び、ＦＰＧＡ（ｆｉｅｌｄ　ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　ｇａｔｅ　ａｒｒａｙ）等が挙げられるが、上記に限定されない。
　制御部２２は、記憶部２５に記憶されているプログラムを読み出し、このプログラムに従って、調整部２３、測定部２４、及び、記憶部２５を制御し、並びに、所定の演算処理を実施する。
　また、制御部２２は、プログラムに従った演算結果を、記憶部２５に適宜書き込んだり読み出したりすることができる。
　記憶部２５のストレージ機能は、例えばＨＤＤ（ハードディスクドライブ）及びＳＳＤ（ソリッドステートドライブ）といった不揮発性メモリによって実現される。また、記憶部２５は、制御部２２による演算処理の途中経過等を書き込む又は読み出すためのメモリとしての機能を有していてもよい。記憶部のメモリ機能は，ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリー）やＤＲＡＭ（ダイナミックランダムアクセスメモリー）といった揮発性メモリにより実現される。
　上記付着培養部で測定対象となる微生物を培養し、作用電極の電位を調整し、電子を受け取ることが可能な条件に制御すると、作用電極の電流値によって微生物の代謝反応を検出することができる。
　図４は、作用電極１２上で付着培養された微生物の代謝反応の説明図である。作用電極１２上に付着した微生物３１は、バイオフィルム３３を形成し、細胞外膜に存在するタンパク質３２を介して作用電極１２へと電子を放出する。この電子移動を電流値として検出することにより、バイオフィルム内における微生物３１の代謝反応を検出することができる。
　なお、図３においてはバイオフィルム３３内に、微生物３１の細胞が１つ記載されているが、上記は模式図であり、バイオフィルム３３内では、一般的には、微生物３１を含むコロニーが形成されている。
　また、図４においては、微生物３１から作用電極１２に電子が移動しているが、微生物３１の種類、及び、電極の条件によっては、代謝反応によって作用電極１２から微生物３１への電子移動が起きることもあり、上記を検出する形態であってもよい。
　また、図４は細胞外固体である電極に直接電子移動する形態であるが、本方法は、図５に示したとおり、微生物が電子伝達物質４１、及び、４２を介して電極との間で電子を授受する形態の反応も検出可能である。なお電子伝達物質４１、及び、４２としては例えば、リボフラビン等が挙げられる。
　なかでも、より優れた本発明の効果を有する点で、微生物としては、細胞外固体から直接電子を取り込む機能、及び、細胞外固体へと直接電子を与える機能からなる群より選択される少なくとも一方の機能を有する、細胞内外で電子移動が可能な特定微生物であることが好ましい。
　このような特定微生物としては特に制限されないが、例えば、鉄還元細菌、及び、鉄酸化細菌等が挙げられる。より具体的には、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ　ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ　ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ　ｌｏｖｌｅｙｉ等のゲオ（ジオ）バクタ―属菌；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ　ＭＲ－１等のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ属菌；デスルフォビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ　）属菌；Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ等のＡｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ（アシドチオバシラス）属菌；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ菌等のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属菌；等が挙げられる。
　また、上記電子移動が発酵代謝により行われることもより好ましい。微生物（特に細菌）は一般的に、「呼吸」と「発酵」という代謝反応によって有機物を分解してエネルギーを得ることが知られている。有機物を分解する際に、電子（還元力）が生じ、呼吸代謝では、この電子を細胞外の物質に渡してエネルギーを得ているのに対し、発酵では細胞外への電子の移動は原則としてなく、これまで、上記の電子移動の機能を有する菌は発酵は行わないと考えられてきた。
　しかし、本発明者らの検討により、上記の機能を有する菌、特に病原性細菌が発酵による電子移動を行うことができることを見出した。発酵による電子移動は、呼吸による電子移動と比較して、細胞内における余剰の電子を電極に渡すものであると推測される。
　上記の微生物は、生体内においても同様の代謝を行っていると考えられる。本発明の実施形態に係る薬剤感受性測定方法は、電極間の電位差等を調整することで、対象となる菌（特に病原性細菌）の代謝を目的に応じて制御できる。例えば、生体内の環境に近づけ、より発酵を優勢にする制御が可能な点で、病原性細菌に対する薬剤の感受性をより正確に評価できる点で好ましい。
　また、本工程において行われる付着培養は、対象とする微生物により電極上にバイオフィルムを形成する工程であることが好ましい。上記微生物は、体内においてバイオフィルムを形成し、その内部にて病原性を発揮することがあることを本発明者らは明らかにしている。
　電極上にバイオフィルムが形成させる方法としては特に制限されず、公知の培養方法を使用可能であり、バイオフィルムの形成状況は、得られる電気化学的な応答（例えば、得られる電流値が定常状態となること）により検知できる。
〔薬剤投与工程〕
　薬剤投与工程は、試験液中に薬剤を投与し、上記電極から得られる電気化学的な応答の変化によって上記微生物の上記薬剤に対する感受性を判断するための情報を得る工程である。
　図６は、すでに説明した培養工程から、それに続く薬剤投与工程における作用電極の電気化学的応答を示す説明図である。
　図６において、横軸は、時間、縦軸は作用電極の電流値を示している。
　すでに説明した培養工程において、電気化学セルに微生物が加えられる（Ｔ１）。電気化学セルに微生物を加える方法としては特に制限されないが、液体培地を用いて微生物を予備的に培養し、上記により得られた培養液を電気化学セルの媒体に添加する方法等が挙げられる。
　電気化学セルに添加された微生物は浮遊状態、又は、可逆的な付着状態で、増殖する。このとき、作用電極の電流値は漸増する。
　次に、一定時間が経過すると、作用電極の電流値が略一定となり変化が小さくなる（図６中、「Ｐ１」で示した領域）。これは、微生物が作用電極に付着して固定し、コロニーを形成し、その後、多糖類、及び、タンパク質等から構成されるバイオフィルム形成して恒常性を保った形態となったことを示すと考えられる。
　薬剤投与工程は、上記「Ｐ１」の領域にある際に実施することが好ましい。すなわち、電気化学的な応答が時間に対して略一定となった際に薬剤を投与することが好ましい。このようにすることで、微生物がバイオフィルムを形成した状態における薬剤感受性をより正確に測定することができる。
　薬剤を試験液中に投与する方法としては特に制限されないが、試験液に薬剤を直接投与するか、又は、薬剤を予め他の媒体に溶解、又は、分散し、得られた溶液、又は、分散液を試験液中に投与する方法が挙げられる。
　薬剤が投与され、投与された薬剤が微生物の活性に影響を与えるかは、典型的には、Ｔ２後の電流値の変化の傾向から評価することができる。
　投与された薬剤が微生物の活性に与える影響が小さい場合、電流値はほとんど変化せず、（Ｂ）となる。一方で、投与された薬剤が微生物の活性に何らかの影響を与える場合、応答は電流値が増加する（Ａ）、又は、電流値が低下する（Ｃ）となる。
　上記電気化学的な応答の変化から、微生物の薬剤に対する感受性を判断するための情報を得る方法としては特に制限されないが、例えば、電流値の変化量、時間の一階微分値、時間の二階微分値、最大（最小）電流値、最大（最小）電流値に至るまでの時間、及び、電流値の立ち上がり方等の情報を抽出すればよい。上記の情報を例えば、異なる薬剤（例えば、対照とする薬剤）の間で比較すれば、相対的な薬剤感受性を判断することができる。
　なかでも、より正確な結果が得られる点で、応答の変化を単位時間当たりの電流値の変化として、微生物の薬剤に対する感受性を判断するための情報を得ることが好ましい。
　また、微生物の薬剤に対する感受性を判断するための情報は上記測定結果と他の方法による測定結果とを組み合わせたものであってもよい。他の方法による測定結果としては、例えば、媒体中の生菌を蛍光標識して顕微鏡で観察した結果等が挙げられる。
[測定装置（第２の実施形態）]
　本発明の第２の実施形態に係る薬剤感受性測定装置は、微生物と媒体とを含有する試験液が収容される容器に、前記試験液と接触するように配置された、少なくとも２つの電極と電気的に接続される、付着培養部と、上記付着培養部において培養された微生物に対して薬剤を投与した際に上記電極から得られた電気化学的な応答を測定する測定部と、を有する薬剤感受性測定装置である。
　図７は、上記実施形態に係る測定装置のブロック図であり、図８は上記測定装置のハードウェア構成図である。
　図７に示す測定装置７０は、付着培養部７１と、制御部７２と、調整部７３と、測定部７４と、記憶部７５と、表示装置７６ａと、入力装置７６ｂと、で構成されている。ユーザーは、表示装置７６ａに表示される内容に従って入力装置７６ｂを操作することによって、薬剤感受性測定の開始、終了、及び、結果の閲覧等ができる。
　付着培養部７１は、容器８０に配置された作用電極ＷＥ（７７）、参照電極ＲＥ（７８）、及び、対電極ＣＥ（７９）と電気的に接続可能に構成されている。容器８０には微生物と媒体とを含有する試験液が収容可能であり、作用電極ＷＥ（７７）、参照電極ＲＥ（７８）、及び、対電極ＣＥ（７９）は上記試験液と接触するように配置されている。
　なお、電極付き容器８１は、作用電極７７と、参照電極７８と、対電極７９とを有しているが、本実施形態に係る測定装置に用いる電極付き容器８１としては上記に制限されず、２つ以上の電極を有していればよい。
　測定部７４は、付着培養部７１と電気的に接続され、制御部７２により制御され、作用電極７７と、参照電極７８と、対電極７９とを制御して、試験液の電気化学的な応答を測定できる。
　また、調整部７３は、制御部７２により制御され、付着培養部７１の各電極間の電位、及び、電流を調整する。
　図８のハードウェア構成図に示したとおり、制御部７２は、プロセッサ７２ａ、及び、記憶装置７２ｂとを有しており、調整部７３は、記憶装置７２ｂに格納されたプログラムと、プロセッサ７２ａに対応している。また、測定部７４は、制御部７２により制御される。付着培養部７１は、電極付き容器８０が有する電極と接続可能な端子を有し、電極付き容器８０と付着培養部７１とは測定時には電気的に接続される。電極付き容器８０は、付着培養部７１と着脱可能に構成されており、試料液ごとに新たな電極付き容器８０に取り替えて使用してもよい。
　プロセッサ７２ａは、中央演算装置（ＣＰＵ）、マイクロプロセッサ、プロセッサコア、マルチプロセッサ、ＡＳＩＣ（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｃｉｒｃｕｉｔ）、ＦＰＧＡ（ｆｉｅｌｄ　ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　ｇａｔｅ　ａｒｒａｙ）、及び、ＧＰＵ（Ｇｒａｐｈｉｃｓ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）等が挙げられるが、上記に限定されない。
　プロセッサ７２ａは、記憶装置７２ｂに記憶されているプログラムを読み出し、このプログラムに従って、各部を制御し、また、所定の演算処理を実施することができる。
　また、プロセッサ７２ａは、プログラムに従った演算結果を、記憶装置７２ｂに適宜書き込んだり読み出したりすることができる。
　記憶装置７２ｂのストレージ機能は、例えばＨＤＤ（ハードディスクドライブ）及びＳＳＤ（ソリッドステートドライブ）といった不揮発性メモリによって実現される。また、記憶装置７２ｂは、プロセッサ７２ａによる演算処理の途中経過等を書き込む又は読み出すためのメモリとしての機能を有していてもよい。記憶装置７２ｂのメモリ機能は、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリー）やＤＲＡＭ（ダイナミックランダムアクセスメモリー）といった揮発性メモリにより実現される。典型的には、プロセッサ７２ａ、及び、記憶装置７２ｂはコンピュータを構成している。
　なお、表示装置７６ａ、入力装置７６ｂ、及び、制御部７２は、タブレット端末であってもよい。タブレット端末は測定部７４、付着培養部７１と有線接続されていてもよいし、近距離無線通信によって相互に通信可能に構成されていてもよい。
　上記測定装置７０によれば、電極付き容器８０を試験液ごとに交換することができるため、試料液間のコンタミネーションを防止することができ、より正確に薬剤感受性を測定することができる。
＜薬剤感受性測定方法（第２の実施形態）＞
　本発明の第２の実施形態に係る薬剤感受性測定方法は、微生物と媒体とを含有する試験液を、上記試験液を収容可能であって、収容された上記試験液と接するよう配置された少なくとも２つの電極を有する容器に収容することと（収容工程）、上記電極上で上記微生物を付着培養することと（付着培養工程）、上記試験液中に薬剤を投与し、上記電極から得られる電気化学的な応答の変化によって上記微生物の上記薬剤に対する感受性を判断するための情報を得ること（薬剤投与工程）と、を有する薬剤感受性測定方法である。
　図９は本実施形態に係る薬剤感受性の測定方法のフロー図である。まず、薬剤感受性を測定する対象となる微生物と媒体とを含有する試験液が準備され、上記試験液が電極付き容器８０に収容される（収容工程；Ｓ９０１）。試験液の収容はユーザー操作によって行われてもよく、自動分注装置等によって行われてもよい。試験液が収容された電極付き容器８０の各電極は付着培養部７１と電気的に接続される。
　なお、媒体の成分、及び、対象となる微生物等についてはすでに説明したとおりである。
　次に、電極上において微生物が付着培養される（培養工程；Ｓ９０２）。容器に収容された試験液中の微生物は浮遊状態、又は、可逆的な付着状態で増殖する。その後、電極（例えば、作用電極）に付着して固定し、コロニーを形成し、更に、バイオフィルムを形成して恒常性を保った形態となる。付着培養の方法としては特に制限されず公知の方法が使用できる。例えば、電極間の電位差を所定の値に保持する方法等が挙げられる。付着培養が進んでいるか否かは、すでに説明したとおり、試験液の電気化学的応答等により確認できる。
　次に、試験液中に薬剤が投与され、電極から得られる電気化学的な応答の変化によって、微生物の薬剤に対する感受性を判断するための情報を得ることができる（薬剤投与工程；Ｓ９０３）。上記情報については図６等によってすでに説明したとおりである。
[測定装置（第３の実施形態）]
　本発明の第３のの実施形態に係る測定装置は、微生物と媒体とを含有する試験液が収容される二次元アレイ状に配置された複数のウェルごとに、上記試験液と接触するように上記ウェル内に配置された２つ以上の電極のそれぞれと電気的に接続される付着培養部と、上記付着培養部において培養された微生物に対して薬剤を投与した際に上記電極から得られた電気化学的な応答を測定する測定部と、を有する薬剤感受性測定装置である。
　図１０は、上記実施形態に係る測定装置９０のブロック図であり、図１１は上記測定装置のハードウェア構成図である。
　図１０に示す測定装置９０は、付着培養部９１と、制御部９２と、調整部９３と、測定部９４と、記憶部９５と、表示装置９６ａと、入力装置９６ｂと、で構成されている。ユーザーは、表示装置９６ａに表示される内容に従って入力装置９６ｂを操作することによって、薬剤感受性測定の開始、終了、及び、結果の閲覧等ができる。
　付着培養部９１は、電極付きマルチウェルプレート１２０と電気的に接続可能に構成され、測定時には電気的に接続される。電極付きマルチウェルプレート１２０は、試験液を収容可能な９６個のウェル１００－１～ウェル１００－９６を有している。ウェル１００－１～ウェル１００－９６は、その底部に、作用電極ＷＥ（９７－１～９７－９６）、参照電極ＲＥ（９８－１～９８－９６）、及び、対電極ＣＥ（９９－１～９９－９６）をそれぞれ有しており、ウェルごとに収容される試験液と接触するように配置されている。
　付着培養部９１は、電極付きマルチウェルプレート１２０内に配置された作用電極ＷＥ（９７－１～９７－９６）、参照電極ＲＥ（９８－１～９８－９６）、及び、対電極ＣＥ（９９－１～９９－９６）とウェルごとに電気的に接続可能に構成されている。
　なお、電極付き容器８０は、作用電極７７と、参照電極７８と、対電極７９とを有しているが、本実施形態に係る測定装置に用いる電極付き容器８０としては上記に制限されず、各ウェルに２つ以上の電極を有していればよい。
　測定部９４は、付着培養部９１と電気的に接続され、制御部９２により制御され、作用電極９７－１～９７－９６と、参照電極９８－１～９８－９６と、対電極９９－１～９９－９６とを制御して、ウェル１００－１～１００－９６の試験液の電気化学的な応答をウェル毎に測定できる。
　また、調整部９３は、制御部９２により制御され、付着培養部９１の各電極間の電位、及び、電流を調整する。
　図１１のハードウェア構成図に示したとおり、制御部９２は、プロセッサ９２ａ、及び、記憶装置９２ｂとを有しており、調整部９３は、記憶装置９２ｂに格納されたプログラムと、プロセッサ９２ａに対応している。また、測定部９４は、制御部９２により制御される。付着培養部９１は、電極付きマルチウェルプレート１２０が有する各電極と個別に接続可能な端子を有し、電極付きマルチウェルプレート１２０と付着培養部９１とは測定時には電気的に接続される。電極付きマルチウェルプレート１２０は、付着培養部９１と着脱可能に構成されており、試料液ごとに新たな電極付きマルチウェルプレート１２０に取り替えて使用してもよい。なお、各ハードウェアの具体例はすでに説明したのと同様である。
　図１２は、電極付きマルチウェルプレートの分解斜視図であり、図１３は、電極付きマルチウェルプレートの平面図である。電極付きマルチウェルプレート１２０は、プレート上部１２１と、プレート底部１２８とから構成されている。
　プレート上部１２１は、上部基材１２２、外壁１２３、上部表面１２４(図１３参照）、内面１２５を有する壁１２６によって構成されている。マルチウェルプレート１２０のプレート上部１２１は円筒状の貫通孔Ｈを有し、貫通孔Ｈの側面は壁１２６の内面１２５で画定される。プレート上部１２１は、プレート上部１２１とともにウェル１２７を画定するプレート底部１２８と組み合わされている。
　プレート底部１２８は、下部基板１２９と、下部基板１２９上に配置された作用電極１３０、対電極１３１、及び、参照電極１３２とを有しており、プレート上部１２１と組み合わされることで、貫通孔Ｈの一方の開口が塞がれ、その結果、上部に開口を有する円筒状のウェル１２７が画定される。
　電極付きマルチウェルプレート１２０は、９６個のウェルを有するマルチウェルプレートとして構成されているが、本装置に用いられるマルチウェルプレートが有するウェルの個数は上記に制限されず、例えば、１個、６個、２４個、９６個、３８４個、１５３６個、６１４４個、及び、９６００個等であってもよい。また、各ウェルの体積は、１０ｎＬ～１０ｍＬの範囲であることが好ましい。
　図１３に示したとおり、ウェル１２７は、内面１２５を有する壁１２６、作用電極１３０、対電極１３１、及び、参照電極１３２を有する。図１２に示すように、壁１２６の内面１２５によって円筒形の体積が画定される。この円筒形の部分に試料溶液が収容される。対電極１３１は、この円筒形体積の底部で、内面１２５と円形の作用電極１３０との間の環状の領域内に延びている。
　図１４は、ウェルの拡大平面図と、その裏面を示す図である。作用電極１３０、対電極１３１、及び、参照電極１３２は、ウェル内のプレート底部に設けられたビアホールによって、作用電極、対電極、及び、参照電極のそれぞれに対応する裏面の配線１４１、１４２、１４３とそれぞれ接続されており、裏面の各配線は、接続端子１４４、１４５、１４６を有している。
　付着培養部９１は、ウェルごとに配置された電極のそれぞれの接続端子と一対一で対応する端子を有しており、上記端子により付着培養部９１と接続され、ウェル毎の電気化学測定を実施できる。
　プレートの材料としては特に制限されないが、ポリエチレン、セルロースアセテート、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリイミド、及び、ポリスチレン等の樹脂が好ましい。
　電極、配線、及び、接続端子の材料としては特に制限されないが、白金、金、ＩＴＯ（酸化インジウムスズ）、炭素、及び、導電性高分子等を用いることができる。
　本実施形態に係る測定装置は、複数のウェルを有する電極付きマルチウェルプレートを用いて測定できるため、多くの微生物の薬剤感受性をより簡便に測定することができる。また、多くの条件（薬剤の種類、及び、添加量等）における薬剤感受性をより簡便に測定することもできる。
＜薬剤感受性測定方法（第３の実施形態）＞
　本発明の第３の実施形態に係る薬剤感受性測定方法は、微生物と媒体とを含有する複数の試験液を、上記試験液を収容可能であって、収容された上記試験液と接するよう配置された少なくとも２つの電極を有する複数のウェルにそれぞれ収容することと、上記電極上で上記微生物を付着培養することと、上記試験液中に薬剤を投与し、上記電極から得られる電気化学的な応答の変化によって、上記ウェルごとに上記微生物の上記薬剤に対する感受性を判断するための情報を得ることと、を有する薬剤感受性測定方法である。
　図１５は、本実施形態に係る薬剤感受性測定方法のフロー図である。まず、薬剤感受性を測定する対象となる微生物と媒体とを含有する試験液が複数準備され、上記試験液が電極付きマルチウェルプレート１２０の各ウェルにそれぞれ収容される（収容工程；Ｓ１５０１）。試験液の収容はユーザー操作によって行われてもよく、自動分注装置等によって行われてもよい。試験液が収容された電極付きマルチウェルプレート１２０の各電極は付着培養部９１と電気的に接続される。
　なお、媒体の成分、及び、対象となる微生物等についてはすでに説明したとおりである。
　次に、各ウェルごとに電極上において微生物が付着培養される（培養工程；Ｓ９０２）。容器に収容された試験液中の微生物は浮遊状態、又は、可逆的な付着状態で増殖する。その後、電極（例えば、作用電極）に付着して固定し、コロニーを形成し、更に、バイオフィルムを形成して恒常性を保った形態となる。付着培養の方法としては特に制限されず公知の方法が使用できる。例えば、電極間の電位差を所定の値に保持する方法等が挙げられる。付着培養が進んでいるか否かは、すでに説明したとおり、試験液の電気化学的応答等により確認できる。
　次に、試験液中に薬剤が投与され、電極から得られる電気化学的な応答の変化によって、各ウェルごとに微生物の薬剤に対する感受性を判断するための情報を得ることができる（薬剤投与工程；Ｓ９０３）。上記情報については図６等によってすでに説明したとおりである。
　以下に実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す実施例により限定的に解釈されるべきものではない。
・培地組成（１リットル中）
ＮａＨＣＯ３：　２．５ｇ
ＣａＣｌ２　＋２Ｈ２Ｏ：　０．０８ｇ
ＮＨ４Ｃｌ：　１ｇ
ＭｇＣｌ２　６Ｈ２Ｏ：　０．２ｇ
ＮａＣｌ：　１０ｇ
ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）：　１．２ｇ
Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ：　０．５ｇ
［実施例１］
　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ　ＵＡ１５９を上記培地中、３７℃で２４時間嫌気的に増殖させた。次に、増殖させた細菌を回収し、２０００ｇで１０分間、遠心分離し２回洗浄した。
　次に、底部にＩＴＯ製の作用電極、中央に参照電極（飽和ＫＣｌ中のＡｇ／ＡｇＣｌ）、及び、白金製の対電極を配置したバイオリアクター（電気化学セルに対応する）であって、シリコーンシートで気密に構成されたバイオリアクターを準備した。
　次に、４．５ｍＬの上記培地をバイオリアクターに満たし、２００μＬ、又は、１００μＬのグルコース２５０ｍＭを上記培地と混合し、１５分間Ｎ２バブリングすることによって空気を除去した。
　作用電極上に０．２Ｖを連続的に印加し、得られた電流をいわゆるクロノアンペロメトリー測定として記録するように、作用電極、参照電極、及び、対電極をポテンシオスタット（ｒｅｆ）に接続し、バイオリアクターを３７℃でインキュベートした。
　次に、記録された電流を安定化させた後、上記培地中で洗浄したＳ．ｍｕｔａｎｓを０．１　ＯＤｕｎｉｔ（ＯＤはＯｐｔｉｃａｌ　Ｄｅｎｓｉｔｙの略語である。λ＝６００ｎｍ）の終濃度で上記バイオリアクターに添加した。
　図１６には、上記の様にして調整したバイオリアクターを用いて検出された電流の経時変化を示した。図１６において、横軸は時間（ｈ）を表し、縦軸は電流値（μＡ）を示している。図１６から、電流値は、当初（１５～２０時間まで）増大し、その後、略一定となった（～１４５時間）。なお、上記は培養工程に対応する。
　図１６に戻り、次に、培養開始６日経過後、終濃度２０％のエタノールを添加（図１６中の矢印の時点）したところ、電流値はベースラインまで下降した。上記の結果から、所定の濃度のエタノールがバイオフィルムを形成した状態のＳ．ｍｕｔａｎｓの活性に影響を与える（本実施例においては死滅したと考えらえる）ことが確認された。すなわち、上記は本発明の測定方法における薬剤投与工程に対応する。
［実施例２］
　実施例１と同様の方法により調整したバイオリアクターを用いて、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのアンピシリンに対する感受性を調べた。アンピシリンは、細胞壁形成を阻害することによって細菌の増殖を抑制することが知られている。
　アンピシリンは、アンピシリンナトリウム粉末（Ｗａｋｏ　０１６－２３３０１）からアンピシリンナトリウム０．１ｇ／Ｌの母液を調製し、上記母液の８０μＬをバイオリアクターに約１．６μｇ／ｍＬの終濃度で加えた。結果は図１７に示した。
　図１７の結果から、アンピシリンを添加（図１７中の矢印の時点）したところ、電流値が経時的に低下することがわかった。しかし、実施例２の条件（添加量等）では電流値がベースラインまでは低下しないこともわかった。
　本発明者らは顕微鏡（共焦点顕微鏡）観察によって、アンピシリン添加後の培養液中にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ　ＵＡ１５９の生菌が存在していることを確認しており、本方法によれば、薬剤感受性の定量評価も可能であることがわかった。
［実施例３］
　実施例２と同様の方法により調整したバイオリアクターを用いて、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのトリクロサンに対する感受性を調べた。トリクロサンは０．０３ｍｍｏｌ／Ｌ、すなわち８．６７μｇ／ｍＬで使用された。まず、１０％メタノール水溶液１０ｍＬにトリクロサン８．６７ｍｇを溶解させ母液を調製した。次に、０．００３ｍｍｏｌ／Ｌの終濃度となるよう、上記母液の５μＬをバイオリアクターに添加（図１８中、左側の矢印の時点）し、３時間の反応を観察した。次に、０．０３ｍｍｏｌ／Ｌの終濃度となるよう、上記母液の４５μＬをバイオリアクターに添加（図１８中、右側の矢印）した。結果は図１８に示した。
　図１８の結果から、トリクロサンを添加したことで、電流値が低下することがわかった。また、実施例２の結果と比較すると、実施例３ではベースライン付近まで電流値が低下していることがわかった。トリクロサンは、アンピシリンと異なる機序（解糖作用の阻害）により細菌類に影響することが知られている。上記の結果から、本発明の薬剤感受性測定方法によれば、電気化学的な応答、
具体的には図１６～１８で示した応答の違いによって、薬剤の作用機序等に由来する感受性の差を評価するための情報が得られることがわかった。
１１：電気化学セル
１２、７７、１３０：作用電極
１３、７９、１３１：対電極
１４、７８、１３２：参照電極
１５、７６：容器
１６：試験液
１７：制御装置
２０、７０、９０：測定装置
２１、７１、９１：付着培養部
２２、７２、９２：制御部
２３、７３、９３：調整部
２４、７４、９４：測定部
２５、７５、９５：記憶部
８０：容器
８１：電極付き容器
１２０：電極付きマルチウェルプレート
１２１：プレート上部
１２２：上部基材
１２３：外壁
１２４：上部表面
１２５：内面
１２６：壁
１２７：ウェル
１２８：プレート底部
１２９：下部基板
１４１、１４２、１４３：配線
１４４、１４５、１４６：接続端子

Claims (14)

  1. 　微生物と媒体とを含有する試験液と、前記試験液に接触するように配置された２つ以上の電極と、を有する電気化学セルの前記電極上において前記微生物を付着培養する工程と、
    　前記試験液中に薬剤を投与し、前記電極から得られる電気化学的な応答の変化によって前記微生物の前記薬剤に対する感受性を判断するための情報を得る工程と、を有する薬剤感受性測定方法。
  2. 　前記付着培養する工程が、前記微生物により前記電極上にバイオフィルムを形成させる工程である、請求項１に記載の薬剤感受性測定方法。
  3. 　前記微生物は、細胞外固体から直接電子を取り込む機能、及び、細胞外固体へと直接電子を与える機能からなる群より選択される少なくとも一方の機能を有する、細胞内外で電子移動が可能な特定微生物である、請求項１又は２に記載の薬剤感受性測定方法。
  4. 　前記電子移動は、発酵代謝により行われる請求項３に記載の薬剤感受性測定方法。
  5. 　前記応答の変化が、単位時間当たりの電流値の変化である請求項１～４のいずれか１項に記載の薬剤感受性測定方法。
  6. 　微生物と媒体とを含有する試験液を収容可能な容器、及び、前記試験液に接触するように前記容器内に配置された少なくとも２つの電極を有する付着培養部と、
    　前記付着培養部において培養された微生物に対して薬剤を投与した際に前記電極から得られた電気化学的な応答を測定する測定部と、を有する薬剤感受性測定装置。
  7. 　微生物と媒体とを含有する試験液が収容される容器内に、前記試験液と接触するように配置された、少なくとも２つの電極と電気的に接続される、付着培養部と、
    　前記付着培養部において培養された微生物に対して薬剤を投与した際に前記電極から得られた電気化学的な応答を測定する測定部と、を有する薬剤感受性測定装置。
  8. 　微生物と媒体とを含有する試験液を、
    　前記試験液を収容可能であって、収容された前記試験液と接するよう配置された少なくとも２つの電極を有する容器に収容することと、
    　前記電極上で前記微生物を付着培養することと、
    　前記試験液中に薬剤を投与し、前記電極から得られる電気化学的な応答の変化によって前記微生物の前記薬剤に対する感受性を判断するための情報を得ることと、を有する薬剤感受性測定方法。
  9. 　前記付着培養が、前記微生物により前記電極上にバイオフィルムを形成させる工程である、請求項８に記載の薬剤感受性測定方法。
  10. 　前記微生物は、細胞外固体から直接電子を取り込む機能、及び、細胞外固体へと直接電子を与える機能からなる群より選択される少なくとも一方の機能を有する、細胞内外で電子移動が可能な特定微生物である、請求項８又は９に記載の薬剤感受性測定方法。
  11. 　前記電子移動は、発酵代謝により行われる請求項１０に記載の薬剤感受性測定方法。
  12. 　前記応答の変化が、単位時間当たりの電流値の変化である請求項８～１１のいずれか１項に記載の薬剤感受性測定方法。
  13. 　微生物と媒体とを含有する試験液が収容される二次元アレイ状に配置された複数のウェルごとに、前記試験液と接触するように前記ウェル内に配置された２つ以上の電極のそれぞれと電気的に接続される、付着培養部と、
    　前記付着培養部において培養された微生物に対して薬剤を投与した際に前記電極から得られた電気化学的な応答を測定する測定部と、を有する薬剤感受性測定装置。
  14. 　微生物と媒体とを含有する複数の試験液を、
    　前記複数の試験液をそれぞれ収容可能であって、収容された前記複数の試験液と接するよう配置された少なくとも２つの電極を有する複数のウェルにそれぞれ収容することと、
    　前記電極上で前記微生物を付着培養することと、
    　前記複数の試験液中に薬剤を投与し、前記電極から得られる電気化学的な応答の変化によって、前記複数のウェルのそれぞれについて前記微生物の前記薬剤に対する感受性を判断するための情報を得ることと、を有する薬剤感受性測定方法。
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