WO2020197021A1 - 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법 - Google Patents

염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method of manufacturing a nano diagnostic agent capable of selectively staining inflammatory abnormal tissue or tumor tissue. More specifically, by using the microenvironment of abnormally formed tissue, by specifically or selectively staining the tumor tissue, the manufacture of a nano-based diagnostic preparation carrying a dyeing material that can clarify the distinction from normal tissue It's about how.
  • Cells repeat division and growth according to the cell cycle. If, for some reason, the mechanism of inhibition of cell division is insufficient or does not function, the cells continue to divide and grow. As a result, it forms a mass of cells that are excessively proliferated compared to normal, which is called a tumor.
  • These tumors are tissues formed by excessive proliferation of cells within a short period of time, and the density between cells is lower than that of normal normal tissues.
  • the present invention is to provide a method of manufacturing a nano-based diagnostic agent that can improve the efficiency of searching for diseased areas by precisely classifying normal and abnormal tissues by being delivered through direct penetration and absorption through the micropores of the tumor. The purpose.
  • the object is to form a first mixture by mixing polysorbate 80, soybean oil, and a water-insoluble dyeing material; Mixing the first mixture and the triple block copolymer and heating to form a second mixture; Cooling the second mixture to form a nano-platform solid; Mixing a solvent with the nano-platform solid to form a third mixture; Removing impurities from the third mixture; And lyophilizing the third mixture from which the impurities have been removed to form a nanocomposite.
  • the method of producing a nano-diagnostic agent capable of selectively staining inflammatory abnormal tissues or tumor tissues.
  • the water-insoluble dyeing material is one dyeing material selected from the group consisting of curcumin, fluorescein isothiocyanate (FITC), Nile red, Ce6 (Chlorin e6), and PpIX (Protoporphyrin IX). .
  • the water-insoluble dyeing material is a non-aqueous dyeing material complex obtained through ionic bonding by dissolving and mixing the first cationic dyeing material and the second anionic dyeing material in a solvent.
  • the first dyeing material is indigo carmine, methylene blue, indocyanine green, toluidine blue, and rhodamine B It is a dyeing material selected from the group consisting of.
  • the second dyeing material is one dyeing material selected from the group consisting of indocyanine green and methylene blue.
  • the heating temperature in the step of forming the second mixture is 55 °C to 65 °C.
  • the cooling temperature in the step of forming the nano-platform solid is 0 °C to 10 °C.
  • the solvent is tertiary distilled water.
  • the inner core of the micelle structure contains polysorbate 80 and soybean oil in which a water-insoluble dyeing material is dissolved
  • the outer shell of the micelle structure is an aqueous solution Including a triple block copolymer for forming uniform particles without aggregation due to precipitation of components contained in the inner core, and the average diameter of the nanocomposite is 1 nm to 100 nm of inflammatory abnormal tissue or tumor tissue
  • a nano diagnostic agent capable of selective staining.
  • the diagnostic agent solution is obtained by dispersing the above-described diagnostic agent in an injection solution or a buffer solution.
  • a nano-sized diagnostic formulation for loading an active ingredient prepared by a simple method based on a polymer melt phase transition phenomenon without using an organic solvent or an aqueous solution at all is provided. can do.
  • a nano-sized diagnostic formulation for loading an active ingredient having an ultrafine particle size in an aqueous solution may be provided by mounting a non-water-soluble dyeing material.
  • a nano-diagnostic preparation for loading an active ingredient having one or more spectroscopic properties according to the characteristics of the non-water-soluble dyeing material.
  • the manufacturing method of the nano-diagnostic formulation when the dyeing material is administered intravenously, a larger amount of the dyeing material is selectively delivered to the tumor over time, and the tumor is stained.
  • a nano-sized diagnostic formulation for loading an active ingredient having excellent tumor diagnostic functionality.
  • the manufacturing method of the nano-diagnostic formulation when topically applied to the tumor and washed, a larger amount of the staining material is delivered to the tumor compared to other organs, and the tumor is stained. It is possible to provide a nano-sized diagnostic formulation for loading an active ingredient having a tumor diagnostic function.
  • a nano-diagnostic formulation when topically evenly applied and washed to normal tissues, abnormal tissues deformed by inflammation, and tumors, a larger amount of It is possible to provide a nano-sized diagnostic preparation for loading an active ingredient having a function of diagnosing or distinguishing the staining material by being absorbed and permeated to the modified abnormal tissue and tumor tissue, and staining the abnormal tissue and tumor tissue.
  • a nano-diagnostic preparation for loading an active ingredient capable of loading a plurality of dyeing substances.
  • FIG. 1 is a flowchart illustrating a method of manufacturing a diagnostic agent capable of selectively staining inflammatory abnormal tissue or tumor tissue according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a method of forming a diagnostic formulation equipped with a non-water-soluble dyeing material or a non-water-soluble complex according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a method of forming a non-water-soluble complex obtained by dissolving two water-soluble dyeing materials in an aqueous solution according to an embodiment of the present invention and combining dyeing materials ionized with cation and anion through ionic bonding to be.
  • FIG. 4 is a diagram showing (A) a diagnostic formulation equipped with a non-water-soluble complex in which dyeing materials ionized with cations and anions are ionic bonded to each other according to an embodiment of the present invention, and (B) a diagnosis with a non-soluble dyeing material It is an image showing a state stably dispersed in an aqueous solution of a formulation.
  • FIG. 5 is a diagnostic formulation and (B) a non-water-soluble dyeing material equipped with a non-water-soluble complex in which (A) cation and anion-ionized dyeing materials are ionically bonded to each other dispersed in an aqueous solution according to an embodiment of the present invention. It is a graph of the absorbance obtained by measuring using an ultraviolet-visible ray spectroscopy for this mounted diagnostic formulation.
  • FIG. 6 is a particle analyzer to check the particle stability according to the FBS content after dissolving the diagnostic formulation loaded with the dyeing material according to an embodiment of the present invention in a buffer solution (pH 7.4) containing various concentrations of FBS. It is a graph of the results observed by each.
  • FIG. 7 is a graph showing a result of observing the degree of toxicity for each time period after treating various cells with a nano-based material that does not contain a dyeing substance dispersed in a cell culture medium according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is an image obtained by measuring the degree of inflow into the cells by time using a fluorescence microscope after a diagnostic agent loaded with a dyeing substance dispersed in a cell culture medium according to an embodiment of the present invention is treated on various tumor cells.
  • 9 is a real-time body distribution and degree of accumulation in a tumor after intravenous administration of a nano-based labeling formulation loaded with a dyeing substance dispersed in water for injection according to an embodiment of the present invention to a tumor-induced mouse model implanted with tumor cells Is an image measured with near-infrared fluorescence equipment.
  • FIG. 10 is a diagram illustrating the main organs of each mouse obtained 48 hours after intravenous administration of a diagnostic formulation containing a dyeing substance dispersed in water for injection according to an embodiment of the present invention to a tumor-induced mouse model implanted with tumor cells. This is an image obtained by measuring the accumulation of dyeing substances in a near-infrared fluorescence device.
  • FIG. 11 is a diagram showing the degree of penetration and absorption of the substance after directly applying and washing a diagnostic preparation loaded with a dyeing substance dispersed in water for injection according to an embodiment of the present invention to a tumor-induced mouse model tumor implanted with tumor cells. This is an image measured with a fluorescence device.
  • FIG. 13 is an image measured through a fluorescence microscope after processing a substance in a three-dimensional cultured cell in order to confirm the tissue permeation mechanism of a diagnostic preparation loaded with a dyeing substance dispersed in water for injection according to an embodiment of the present invention to be.
  • FIG. 14 shows a diagnostic formulation containing non-soluble curcumin dispersed in water for injection according to an embodiment of the present invention, directly applied to and washed on a tumor spontaneously formed in the large intestine by inducing inflammation, and then measured with a near-infrared fluorescence device. It is an image.
  • FIG. 15 is a diagram illustrating a diagnostic formulation loaded with Nile red, a non-water-soluble dyeing substance dispersed in water for injection, according to an embodiment of the present invention, after directly applying and washing a tumor spontaneously formed in the large intestine due to inflammation This is an image measured with near-infrared fluorescence equipment.
  • FIG. 16 is a near-infrared fluorescence after directly applying and washing a diagnostic formulation loaded with a non-aqueous complex by ionic bonds dispersed in water for injection according to an embodiment of the present invention to a tumor spontaneously formed in the large intestine by inducing inflammation. This is an image measured by the equipment.
  • first and second used in the present specification do not imply an order, but are used to distinguish two components, and thus do not limit the two components.
  • first mixture refers to a mixture comprising mixing elements presented before each term appears, and in order to distinguish the three mixtures, "first” , The terms “second” and “third” are used.
  • nano as used herein may mean a size in a nanometer (nm) unit, for example, it may mean a size of 1 to 1,000 nm, but is not limited thereto.
  • nanocomposite in the present specification may mean a composite having an average size in a nanometer (nm) unit, for example, may mean a composite having an average size of 1 to 1,000nm, but limited thereto It does not become.
  • FIG. 1 is a flow chart of a method of manufacturing a diagnostic agent capable of selectively staining inflammatory abnormal tissues or tumor tissues according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a method of forming a diagnostic formulation equipped with a non-water-soluble dyeing substance or a non-water-soluble complex according to an embodiment of the present invention.
  • first, polysorbate 80, soybean oil, and a water-insoluble dyeing material are mixed to form a first mixture (S10).
  • the present invention is characterized by constituting a formulation using polysorbate 80 and soybean oil, which have not been used in the prior art, through which, as described later, a fine particle of 1 nm to 100 nm. Nanocomposites can be provided.
  • Polysorbate 80 has both hydrophilic and hydrophobic properties, so it is widely used as a surfactant when used in pharmaceuticals or cosmetics, and dissolves a stabilizer or non-water-soluble active ingredient that helps to stably disperse particles in the emulsification process. It also has a characteristic as a solubilizing agent.
  • soybean oil has a water-insoluble property that does not mix with water at all, and has a characteristic of being mounted inside the particles through a hydrophobic bond with a non-water-soluble active ingredient in the emulsification process.
  • the water-insoluble dyeing material is a material that generates an intrinsic absorption wavelength from a short wavelength to a long wavelength, or various materials capable of generating fluorescence by a specific light. In the present invention, it can be classified as a single material or a composite material.
  • a single substance selected from the group consisting of curcumin, FITC (fluorescein isothiocyanate), Nile red, Ce6 (Chlorin e6), and PpIX (Protoporphyrin IX). It can be a single dyeing material.
  • Curcumin is known as a natural substance that is helpful in anti-inflammatory, antioxidant, anti-cancer, and blood circulation improvement, and spectroscopically, it has a characteristic absorbance of 340 to 534 nm.
  • Nile red is used as a non-water-soluble dyeing material for staining cells or tissues, and spectroscopically, the maximum excitation wavelength is 549 nm and the emission maximum is 628 nm.
  • the water-insoluble complex dyeing material may be a non-aqueous dyeing material complex obtained through ionic bonding by dissolving and mixing the first cationic dyeing material and the second anionic dyeing material in a solvent.
  • the first dyeing material and the second dyeing material do not indicate a specific order, and are terms used to refer to different kinds of dyeing materials.
  • the first dyeing material is a water-soluble material, a dyeing material having cationic (basic) properties in an aqueous solution
  • the second dyeing material is a water-soluble material, dyeing material having anionic (acidic) properties in an aqueous solution.
  • the first dyeing material is not limited thereto, but in one example, indigo carmine, methylene blue, indocyanine green, toluidine blue, and rhodamine B ( It contains a dyeing material selected from the group consisting of Rhodamine B).
  • the second dyeing material is not limited thereto, but in one example is one dyeing material selected from the group consisting of Indocyanine Green and Methylene Blue.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a method of forming a non-water-soluble complex obtained by dissolving two water-soluble dyeing materials in an aqueous solution according to an embodiment of the present invention and combining dyeing materials ionized with cation and anion through ionic bonding to be. As shown in FIG. 3, for example, after dissolving a first dyeing material in a solvent and dissolving a second dyeing material in a solvent, the two solutions are mixed to form a complex.
  • dyeing substances that are ionized in an aqueous solution and have a cation or anion characteristic are ionic bonded to each other to prepare a complex that has been changed to a water-insoluble property.
  • polysorbate 80 and soybean oil are preferably mixed in a weight ratio of 99:1 to 60:40, and polysorbate 80 and 100 parts by weight of the total soybean oil
  • the water-insoluble dyeing material is preferably contained in an amount of 0.01 to 0.1 parts by weight.
  • Such a mixing ratio is an example of a mixing ratio capable of exhibiting the above-described effects intended by the present invention.
  • the first mixture is a solution in which polysorbate 80, soybean oil, and water-insoluble dyeing material are mixed, and has a transparent and uniform characteristic without feeling of foreign substances.
  • the triple block copolymer is a copolymer in which a hydrophilic group and a hydrophobic group are bonded, and poloxamer 188 is preferable.
  • Poloxamer is a polymer of Poly(oxyethylene)-poly(oxypropylene)-poly(oxyethylene)[POE-POP-POE]. Poloxamer is solid at room temperature, soluble in water and ethanol, and poloxamer solution is liquid at low temperature, but viscosity increases as temperature increases, and sol-gel thixotropy according to temperature in case of high concentration. And does not damage the mucous membranes.
  • Polaxamer 68, 127, 188, 237, 338, and 407, etc. are commercially available.
  • poloxamer 188 refers to a poloxamer having a molecular weight of about 8350 as a compound of Formula 1 in which b is 30 and the sum of a and c is about 75.
  • a hydrophilic group is to impart the functionality to uniformly and stably disperse without agglomeration of substances and active ingredients for a long period of time in an aqueous solution state, and increase body circulation when administered to blood vessels. It is essential to impart important functionality to the desired disease site.
  • a hydrophilic group is introduced so that it can be permeated and absorbed into cells or tissues rather than a preparation administered through blood vessels, and particles having an ultrafine nano size (8 nm to 10 nm) are stably and uniformly dispersed in an aqueous solution. It is a feather to give a function.
  • the introduction of a hydrophobic group is an essential element in order to mount a non-water-soluble active ingredient (various drugs or dyeing substances) having the same physical properties in the nano-platform core.
  • the heating temperature is 55°C to 65°C. If the heating temperature is less than 55°C, the melting point is lower than the melting point of the triblock copolymer, so that it cannot be mixed with the first mixture. If it exceeds 65°C, the triblock copolymer and the active ingredient are decomposed. have.
  • the second mixture is a mixture of polysorbate 80, soybean oil, and a water-insoluble dyeing material in which a triblock copolymer is added, which is also transparent and uniform.
  • the cooling temperature is preferably 0°C to 10°C.
  • the second mixture is gradually cooled and crystallization of the particles is also lowered, thereby reducing the uniformity of the particle size.
  • nano-platform solid The meaning of nano may mean a size of 1 to 1,000 nm, as described above.
  • the nano-platform may be a carrier or vehicle on which the above-described water-insoluble dyeing material can be mounted. This may include a delivery system such as a drug or a contrast agent that can be applied in the technical field to which the present invention belongs.
  • the nano-platform solid is mixed with a solvent to form a third mixture (S40).
  • the solvent is tertiary distilled water.
  • This solvent is characterized by dissolving nano-platform solids and being uniformly and stably dispersed without causing a foreign body sensation mostly due to the aggregation of active ingredients or substances contained together.
  • One of the characteristics of the present invention is that an organic solvent is not used.
  • an organic solvent is used, the form of the formulation containing the active ingredient is disintegrated and cannot be used.
  • the step of removing the organic solvent must be included, and there is a possibility of inducing toxicity in the body due to the residual of the used solvent.
  • the third mixture has a transparent and uniform character.
  • impurities are removed from the third mixture (S50).
  • a method of removing impurities is not particularly limited, and any method may be applied as long as it is a method applied in the technical field to which the present invention belongs.
  • impurities may be removed with a 0.2 ⁇ m to 1.2 ⁇ m filter, a 0.5 ⁇ m to 1.1 ⁇ m filter, a 0.6 ⁇ m to 1.0 ⁇ m filter, a 0.7 ⁇ m to 0.9 ⁇ m filter, and a 0.8 ⁇ m filter.
  • Freeze-drying is a method of removing moisture. After freezing an object, the ambient air pressure is lowered to control the solid state water to sublimate into gas.
  • the specifics of lyophilization are not presented, it is obvious that the lyophilization method applicable in the technical field to which the present invention belongs can be applied.
  • the nanocomposite has the characteristic color of the active ingredient and maintains the characteristic spectroscopically.
  • Another embodiment of the present invention is made of such a nanocomposite, specifically, includes an organic light emitting dye and a nanoplatform for mounting thereof, 1nm to 100nm, preferably 1nm to 90nm, preferably 1nm to 80nm, preferably Preferably 1 nm to 70 nm, preferably 1 nm to 60 nm, preferably 1 nm to 50 nm, preferably 1 nm to 40 nm, preferably 1 nm to 30 nm, preferably 1 nm to 20 nm, preferably 3 nm to 15 nm, preferably Can provide a diagnostic agent capable of selectively staining inflammatory abnormal tissues or tumor tissues having an average diameter of 5 nm to 12 nm, preferably 7 nm to 10 nm, and most preferably 8 nm to 9 nm.
  • the present invention controls the average diameter of the nanocomposite to ultrafine particles, thereby providing a nanoplatform optimized for a direct coating method that could not be implemented in a nano-sized carrier described in some conventional documents.
  • the diagnostic agent does not have a nano size, it is an important factor to have an average diameter in the above-described range because the penetration and absorption rate into the tissue is not high. Because of the above-described size, it is possible to distinguish the tumor by being absorbed and penetrated more by the tumor tissue than in the general tissue.
  • the essential condition of the material to be mounted on the nano platform must have a non-water-soluble property, as described above, and the non-water-soluble effective material is hardly soluble unless an organic solvent such as ethanol, methanol, acetone and DMSO is used. .
  • an organic solvent such as ethanol, methanol, acetone and DMSO is used.
  • tertiary distilled water it is not mixed at all and is uneven because it floats or sinks.
  • another embodiment of the present invention may provide a diagnostic agent solution in which the above-described diagnostic agent is dispersed in an injection solution or a buffer solution.
  • the diagnostic agent solution has a uniform and transparent character.
  • nano-based diagnostic agent capable of being selectively delivered to only non-normal tissues or tumors deformed by inflammation and staining.
  • the diagnostic agent is applied entirely regardless of the specific area where the disease has occurred, and washed with physiological saline, the penetration and absorption rate of the labeling agent is higher in abnormal tissues and tumor tissues deformed by inflammation compared to normal normal tissues. Because it is possible, precise staining (diagnosis) of diseased areas is possible.
  • the diagnostic agent injection water, buffer solution, distilled water, etc.
  • a solution suitable for the purpose injection water, buffer solution, distilled water, etc.
  • 0.5% to 1.3% NaCl solution preferably 0.6% to 1.2% NaCl solution, preferably 0.7% to 1.1% NaCl solution, preferably 0.8% to 1.0% NaCl solution, most preferably 0.9% NaCl solution
  • 2% to 8% glucose solution preferably 3% to 7% glucose solution, preferably 4% to 6% glucose solution, most preferably 5% glucose solution may be used.
  • 0.1 g of methylene blue and 0.1 g of indocyanine green were each completely dissolved in 20 mL of tertiary distilled water at room temperature, and then indocyanine green aqueous solution was added while stirring the methylene blue aqueous solution, followed by centrifugation. A complex was formed, and the unreacted solution of the supernatant was removed excluding the formation precipitated in the lower layer, and then re-dispersed and centrifuged repeatedly with fresh tertiary distilled water to wash the unreacted material contained in the precipitate. Thereafter, freeze-drying was performed to prepare a water-insoluble methylene blue/indocyanine green dyeing material complex for tissue staining.
  • the diagnostic preparation loaded with the dyeing material thus prepared was easily dissolved in an aqueous solution to measure the average particle size, and the measurement result confirmed that it had a diameter of about 10 nm.
  • each diagnostic agent was stably dispersed in the aqueous solution.
  • the diagnostic preparation loaded with the dyeing substance should basically be uniformly dispersed in an aqueous solution, and should be maintained without significantly changing the particle size for a certain period of time.
  • plasma fetal bovine serum, FBS
  • FBS fetal bovine serum
  • the diagnostic agent loaded with the staining material could be introduced into the cell within a short time, and furthermore, it was confirmed that it was delivered to not only the cytoplasm but also the cell nucleus despite a short period of time.
  • Experimental Example 8 Evaluation of tumor accumulation (targeting) and distribution behavior in the body of a diagnostic agent loaded with a dye in a tumor-induced animal model
  • the diagnostic agent loaded with the dyeing material to be provided through the present invention must be effectively accumulated in the tumor tissue, and the delivery to the normal tissue is low, so that side effects caused by the material are minimized.
  • SCC-7 squamous cell carcinoma tumor cell-line (1x10 ⁇ 6 cells/head) was implanted subcutaneously in the thigh of a rat, and about 10 days later, a 150mm ⁇ 3 well-formed group was tested. Used. Then, the diagnostic agent prepared in Experimental Example 1 was administered through the tail vein of the tumor-causing animal model, and after systemic circulation, the accumulation of tumors over time (targeting) and the final analysis and evaluation were completed.
  • the accumulated degree of the included nano-based preparation was confirmed through real-time fluorescence analysis equipment (IVIS Spectrum In Vivo Imaging System, PerkinElmer) and ex vivo fluorescence analysis equipment (KODAK Image Station 4000MM Digital Imaging System, Bruker BioSpin), respectively, and the results Is shown in Figs. 9 and 10, respectively.
  • the diagnostic formulation loaded with the dyeing material according to the present invention can diagnose tumors and distinguish them from normal tissues by simply applying them to tissues as well as diagnosing tumors through an intravenous administration method. .
  • the morphology of the tissue before/after treatment with the diagnostic agent was confirmed at 40, 100, 500, and 1000 magnifications, respectively, and the results are shown in FIG. 12.
  • the tissue before tumor formation, the tissue has micropores, but the tissues are dense and the tissue walls between the pores are wide, whereas when the tumor is formed, many large pores were observed, and the tissue walls were compared with normal. It was confirmed that it was formed narrowly.
  • a diagnostic agent loaded with a dyeing material was applied to a tumor tissue having large pores and a narrow tissue wall, it was observed that it was adsorbed and covered not only inside the pores but also on the tissue wall.
  • the nano-based formulation of the present invention can be absorbed and adsorbed due to structural variation due to tumor formation compared to normal tissue.
  • tissue morphological structure we tried to evaluate not only the absorption mechanism of the nano-based preparation, but also the absorption mechanism at the level of living cells.
  • 5x10 ⁇ 4/well Caco-2 cells were cultured in three dimensions using 24-well plate-sized trans-wells (BD Biosciences), and the absorption mechanism was confirmed by processing nano-based diagnostic agents. The results are shown in FIG. 13.
  • the diagnostic formulation provided with the dyeing material provided in the present invention is a para-cellular pathway, a mechanism by which the material is absorbed through tight junctions due to the morphological difference and small particle size of the tumor tissue deformed by inflammation. It was confirmed that tumor tissue can be effectively diagnosed.
  • Experimental Example 11 Evaluating the diversity of technology by loading various substances in a diagnostic formulation for tumor tissue diagnosis through a method of direct application to the tumor
  • a diagnostic formulation loaded with each dyeing material having various wavelengths and properties was processed, and fluorescence changes expressed in the tissue were observed using a fluorescent imaging device (IVIS Spectrum In Vivo Imaging System, PerkinElmer).
  • IVIS Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer
  • FIGS. 14 to 16 it was confirmed that the inflammatory abnormal tissue and the colon tumor tissue formed by induction of inflammation were effectively stained without depending on the properties of the material mounted in the nano-based formulation.
  • the diagnostic preparation with the dyeing material prepared according to the present invention provides a simple application method as well as diagnosis through the existing intravenous administration method for tumors formed through cell transplantation, inflammatory abnormal tissues, and tumor tissues formed by induction of inflammation. It was confirmed that dyeing is possible effectively.

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Abstract

본 발명은 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 나노 진단 제제의 제조 방법은 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 대두 오일(soybean oil) 및 비수용성 염색 물질을 혼합하여, 제 1 혼합물을 형성하는 단계; 제 1 혼합물과 삼중 블록 공중합체를 혼합한 후 가열하여, 제 2 혼합물을 형성하는 단계; 상기 제 2 혼합물을 냉각하여, 나노 플랫폼 고형물을 형성하는 단계; 상기 나노 플랫폼 고형물에 용매를 혼합하여, 제 3 혼합물을 형성하는 단계; 상기 제 3 혼합물로부터 불순물을 제거하는 단계; 및 상기 불순물이 제거된 제 3 혼합물을 동결건조하여, 나노 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이에 의하여, 종양의 미세 기공을 통해 직접 투과 및 흡수를 통해 전달되어 정상 조직과 비정상 조직을 정밀하게 구분하여, 질환 부위의 탐색 효율성을 높일 수 있다.

Description

염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법
본 발명은 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 비정상적으로 형성된 조직의 미세 환경을 이용하여, 종양 조직을 특이적 또는 선택적으로 염색함으로써, 정상 조직과의 구분을 명확하게 할 수 있는 염색 물질이 담지된 나노 기반의 진단 제제의 제조 방법에 관한 것이다.
세포는 세포주기에 따라서 분열과 생장을 반복하는데 모종의 이유로 세포분열의 억제 기작이 불충분하거나 또는 기능하지 않게 되면 계속해서 분열과 생장을 반복하게 된다. 이 결과 정상에 비해 과도하게 증식된 세포덩어리를 이루게 되는데 이를 종양이라고 한다. 이러한 종양은 짧은 시간 내에 세포의 과다 증식으로 의하여 형성된 조직으로서, 일반 정상 조직에 비해 세포 간 치밀도가 떨어진다.
최근들어 나노기술과 바이오기술이 융합된 나노바이오 기술 의료분야의 폭발적 증가로, 이러한 종양을 진단하거나 또는 치료가 가능한 기능성 나노입자체가 각광받고 있다.
그러나, 종래 보고된 기술들은 일반적으로 종양세포에서 특이적으로 발현되는 수용체를 타겟팅하거나, 종양 주변의 낮은 pH를 검출하거나, 또는 종양 부위에 과다분포되어 있는 특정 효소를 타겟으로 하여 조영제를 제조한 것이며, 종양의 미세 기공을 통해 직접 투과 및 흡수를 통해 전달되어 정상 조직과 비정상 조직을 정밀하게 구분하여, 질환 부위의 탐색 효율성을 높일 수 있는 나노 기반의 진단 제제에 관한 연구는 보고된 바 없다.
따라서 본 발명은 종양의 미세 기공을 통해 직접 투과 및 흡수를 통해 전달되어 정상 조직과 비정상 조직을 정밀하게 구분하여, 질환 부위의 탐색 효율성을 높일 수 있는 나노 기반의 진단 제제의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적은, 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 대두 오일(soybean oil) 및 비수용성 염색 물질을 혼합하여, 제 1 혼합물을 형성하는 단계; 제 1 혼합물과 삼중 블록 공중합체를 혼합한 후 가열하여, 제 2 혼합물을 형성하는 단계; 상기 제 2 혼합물을 냉각하여, 나노 플랫폼 고형물을 형성하는 단계; 상기 나노 플랫폼 고형물에 용매를 혼합하여, 제 3 혼합물을 형성하는 단계; 상기 제 3 혼합물로부터 불순물을 제거하는 단계; 및 상기 불순물이 제거된 제 3 혼합물을 동결건조하여, 나노 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법에 의해 달성된다.
일 실시예에서, 상기 비수용성 염색 물질은, 커큐민(curcumin), FITC(fluorescein isothiocyanate), 나일 레드 (Nile red), Ce6 (Chlorin e6) 및 PpIX (Protoporphyrin IX)이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질이다.
일 실시예에서, 상기 비수용성 염색 물질은 양이온성 제 1 염색 물질과 음이온성 제 2 염색 물질을 용매에 각각 용해한 후 혼합하여, 이온 결합을 통해 수득된 비수용성 염색 물질 복합체이다.
일 실시예에서, 상기 제 1 염색 물질은 인디고 카민(indigo carmine), 메틸렌 블루(Methylene Blue), 인도시아닌그린(Indocyanine green), 톨로이딘 블루(Toluidine Blue) 및 로다민 B(Rhodamine B)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질이다.
일 실시예에서, 상기 제 2 염색 물질은 인도시아닌 그린(Indocyanine Green) 및 메틸렌 블루(Methylene Blue)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질이다.
일 실시예에서, 상기 제 2 혼합물을 형성하는 단계에서 가열 온도는 55℃ 내지 65℃이다.
일 실시예에서, 상기 나노 플랫폼 고형물을 형성하는 단계에서 냉각 온도는 0℃ 내지 10℃이다.
일 실시예에서, 상기 용매는 3차 증류수이다.
한편, 마이셀 구조의 나노 복합체로서, 상기 마이셀 구조의 내부 코어는 비수용성 염색 물질이 용해된 폴리소르베이트 80(polysorbate 80) 및 대두 오일(soybean oil)을 포함하고, 상기 마이셀 구조의 외부 쉘은 수용액에서 상기 내부 코어에 포함된 성분의 석출로 인한 응집없이, 균일한 입자를 형성하기 위한 삼중 블록 공중합체를 포함하며, 상기 나노 복합체의 평균 직경은 1 nm 내지 100 nm인 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제에 의해서도 상기 목적은 달성된다.
본 발명의 또 다른 실시예인 진단 제제 용액은 전술한 진단 제제가 주사 용액 또는 완충 용액에 분산된 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 나노 진단 제제의 제조 방법에 의하면, 유기용매 또는 수용액을 전혀 사용하지 않고, 고분자 용융 상전이 현상을 기반의 단순 방법으로 제조되는 유효성분 탑재용 나노 크기의 진단 제제를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 나노 진단 제제의 제조 방법에 의하면, 비 수용성 염색 물질이 탑재되어 수용액에서 초미립크기를 가지는 유효성분 탑재용 나노 크기의 진단 제제를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 나노 진단 제제의 제조 방법에 의하면, 비 수용성 염색 물질의 특징에 따라 하나 또는 하나 이상의 분광학적 특성을 가지는 유효성분 탑재용 나노 크기의 진단 제제를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 나노 진단 제제의 제조 방법에 의하면, 염색 물질을 정맥으로 투여한 경우, 시간이 지남에 따라 종양에 선택적으로 더 많은 양의 염색 물질을 종양에 전달하고, 종양을 염색하여, 우수한 종양 진단 기능성을 가지는 유효성분 탑재용 나노 크기의 진단 제제를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 나노 진단 제제의 제조 방법에 의하면, 종양에 국소적으로 도포를 하고 세척하면, 다른 장기에 비해 더 많은 양의 염색 물질을 종양에 전달하고, 종양을 염색하여, 우수한 종양 진단 기능성을 가지는 유효성분 탑재용 나노 크기의 진단 제제를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 나노 진단 제제의 제조 방법에 의하면, 정상 조직, 염증에 의해 변형된 비 정상적인 조직 및 종양에 국소적으로 골고루 도포하고 세척하는 경우, 일반 정상 조직에 비해 더 많은 양의 염색 물질이 변형된 비정상 조직과 종양 조직에 흡수 및 투과되어, 비정상 조직과 종양조직을 염색하여, 이를 진단 또는 구분할 수 있는 기능을 가지는 유효성분 탑재용 나노 크기의 진단 제제를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 나노 진단 제제의 제조 방법에 의하면, 복수의 염색 물질을 탑재할 수 있는 유효성분 탑재용 나노 크기의 진단 제제를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 진단 제제의 제조 방법에 관한 플로우 차트이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 비 수용성의 염색 물질 또는 비 수용성의 복합체가 탑재된 진단 제제를 형성하는 방법에 대한 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 수용성의 두 염색 물질을 각각 수용액에 용해하여 수득한 양이온과 음이온으로 이온화된 염색 물질들을 이온 결합을 통해 결합시킨 비 수용성의 복합체를 형성하는 방법에 대한 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) 양이온과 음이온으로 이온화된 염색 물질들을 서로 이온 결합으로 결합시킨 비 수용성의 복합체가 탑재된 진단 제제와 (B) 비 수용성 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 수용액에 안정하게 분산된 상태를 나타낸 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 수용액에 분산된 (A) 양이온과 음이온으로 이온화된 염색 물질들을 서로 이온 결합으로 결합시킨 비 수용성의 복합체가 탑재된 진단 제제와 (B) 비 수용성 염색 물질이 탑재된 진단 제제에 대하여, 자외선-가시광선 분광기를 이용한 측정하여 수득한 흡광도에 대한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 다양한 농도의 FBS가 포함된 완충 용액(pH 7.4)에서 용해한 후, FBS 함량에 따른 입자 안정성을 확인하기 위해 입자분석기로 시간대 별로 관찰한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양액에 분산된 염색 물질이 포함되어 있지 않은 나노 기반 물질을 다양한 세포에 처리한 후, 시간대 별로 독성 정도를 관찰한 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양액에 분산된 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 다양한 종양세포에 처리한 후, 세포 내로의 유입 정도를 형광현미경을 이용하여 시간대 별로 측정한 이미지이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 주사 용수에 분산된 염색 물질이 탑재된 나노 기반 표지 제제를 종양 세포가 이식된 종양 유발 마우스 모델에 정맥 투여한 후, 실시간 체내 분포도와 종양으로의 축적 정도를 근적외선 형광 장비로 측정한 이미지이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 주사 용수에 분산된 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 종양 세포가 이식된 종양 유발 마우스 모델에 정맥 투여한 후, 48시간 후 얻은 각 마우스의 주요 적출된 장기에서 염색 물질의 축적 정도를 근적외선 형광 장비로 측정한 이미지이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 주사 용수에 분산된 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 종양 세포가 이식된 종양 유발 마우스 모델 종양에 직접 도포 및 세척한 후, 물질의 투과 및 흡수 정도를 근적외선 형광 장비로 측정한 이미지이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 주사 용수에 분산된 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 종양에 직접 도포 및 세척 (A) 전과 (B) 후를 전자 현미경을 통해 측정한 이미지이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 주사 용수에 분산된 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 조직 투과 기전을 확인하기 위해, 3차원 배양된 세포에서 물질을 처리한 후 형광 현미경을 통해 측정한 이미지이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 주사 용수에 분산된 비 수용성 커큐민(Curcumin)이 탑재된 진단 제제를 염증 유발에 의해 대장에 자발적으로 형성된 종양에 직접 도포 및 세척한 후 근적외선 형광 장비로 측정한 이미지이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 주사 용수에 분산된 비 수용성 염색 물질인 나일 레드(Nile red)가 탑재된 진단 제제를 염증 유발에 의해 대장에 자발적으로 형성된 종양에 직접 도포 및 세척한 후 근적외선 형광 장비로 측정한 이미지이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 주사 용수에 분산된 이온 결합에 의해 비 수용화된 복합체가 탑재된 진단 제제를 염증 유발에 의해 대장에 자발적으로 형성된 종양에 직접 도포 및 세척한 후 근적외선 형광 장비로 측정한 이미지이다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 구성요소 등이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 구성요소 등이 존재하지 않거나 부가될 수 없음을 의미하는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 "제1" 및 "제2"의 용어는 순서를 의미하는 것이 아니라, 두 구성요소를 구분하기 위하여 사용된 것이기 때문에, 두 구성요소를 한정하는 것이 아니다. 특히, "제 1 혼합물", "제 2 혼합물" 및 "제 3 혼합물" 각각은 각 용어가 출현하기 전에 제시된 혼합요소를 포함한 혼합물을 의미하는 것으로서, 3가지 혼합물을 구분하기 위하여, "제 1", "제 2" 및 "제 3"이란 용어를 사용한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "나노"는 나노 미터(nm) 단위의 크기를 의미할 수 있고, 예를 들어, 1 내지 1,000nm의 크기를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 용어 "나노 복합체"는 나노 미터(nm) 단위의 평균 크기를 갖는 복합체를 의미할 수 있고, 예를 들어, 1 내지 1,000nm의 평균 크기을 갖는 복합체를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 진단 제제의 제조 방법을 설명하며, 첨부된 도면은 예시적인 것으로, 본 발명의 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 진단 제제의 제조 방법의 범위가 첨부된 도면에 의해 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예인 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 진단 제제의 제조 방법에 관한 플로우 차트이다. 또한, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 비 수용성의 염색 물질 또는 비 수용성의 복합체가 탑재된 진단 제제를 형성하는 방법에 대한 모식도이다.
도 1 및 도 2에 도시한 바와 같이, 먼저 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 대두 오일(soybean oil) 및 비수용성 염색 물질을 혼합하여, 제 1 혼합물을 형성한다(S10).
본 발명은 특히, 종래에 사용되지 않았던 폴리소르베이트 80 (polysorbate 80) 과 대두 오일(soybean oil)을 사용하여 제제를 구성하는 것을 특징으로 하며, 이를 통하여, 후술하는 바와 같이, 1nm 내지 100nm의 미세 나노 복합체를 제공할 수 있다.
폴리소르베이트 80는 친수성과 소수성을 모두 가지고 있어, 의약품 또는 화장품에 사용시 계면활성제로 많이 활용되고 있으며, 유화공정에서 입자가 안정하게 분산될 수 있도록 도움을 주는 안정화제 또는 비 수용성의 유효 성분을 용해시키는 용해제로써의 특징도 갖는다. 또한, 대두 오일은 물과 전혀 섞이지 않는 비수용성의 성질을 가지고 있으며 유화공정에서 비 수용성 유효성분과 서로 소수성 결합을 통해 입자 내부에 탑재되도록 하는 특징을 갖는다.
일 실시예에서, 비수용성 염색 물질은 단파장부터 장파장까지 고유의 흡광 파장을 발생하는 물질 또는 특정 빛에 의해 형광을 발생시킬 수 있는 다양한 물질들이다. 본 발명에서는 단일 물질이거나 복합 물질로 구분할 수 있다.
단일 물질인 경우, 여기에 한정되는 것은 아니지만, 일 예시로서, 커큐민(curcumin), FITC(fluorescein isothiocyanate), 나일 레드 (Nile red), Ce6 (Chlorin e6) 및 PpIX (Protoporphyrin IX)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질일 수 있다.
커큐민은 항염증, 항산화, 항암, 혈액순환 개선에 도움이 되는 천연물질로 알려져 있고, 분광학적으로 340~534nm 의 고유 흡광도의 특징을 갖는다. 나일 레드는 세포나 조직을 염색하는 비 수용성의 염색 물질로 사용되고 있고, 분광학적으로 최대 여기 파장 (excitation maximum)은 549nm 이고 최대 방사 파장 (emission maximum)은 628nm 의 특징을 갖는다.
다른 실시예에서, 비수용성의 복합물 염색 물질은 양이온성 제 1 염색 물질과 음이온성 제 2 염색 물질을 용매에 각각 용해한 후 혼합하여, 이온 결합을 통해 수득된 비수용성 염색 물질 복합체일 수 있다.
여기서, 제 1 염색 물질과 제 2 염색 물질은 전술한 바와 같이 특별히 순서를 나타내는 것은 아니며, 이종의 염색 물질을 지칭하기 위하여 사용된 용어이다. 제 1 염색 물질은 수용성 물질로서, 수용액에서 양이온성(염기성)의 특성을 가지는 염색 물질이고, 제 2 염색 물질은 수용성 물질로서, 수용액에서 음이온성(산성)의 특성을 가지는 염색 물질이다.
제 1 염색 물질은 이에 한정되는 것은 아니지만, 일 예시에서 인디고 카민(indigo carmine), 메틸렌 블루(Methylene Blue), 인도시아닌 그린(Indocyanine Green), 톨로이딘 블루(Toluidine Blue) 및 로다민 B(Rhodamine B)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질을 포함한다.
제 2 염색 물질은 이에 한정되는 것은 아니지만, 일 예시에서 인도시아닌 그린(Indocyanine Green) 및 메틸렌 블루(Methylene Blue)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 수용성의 두 염색 물질을 각각 수용액에 용해하여 수득한 양이온과 음이온으로 이온화된 염색 물질들을 이온 결합을 통해 결합시킨 비 수용성의 복합체를 형성하는 방법에 대한 모식도이다. 도 3에 도시한 바와 같이, 예를 들어, 제 1 염색 물질을 용매에 용해하고, 제 2 염색 물질을 용매에 용해한 후, 두 용액을 혼합하여, 복합체를 형성한다. 또한, 복합체의 형성으로 하층에 침전된 형성물을 제외한 상층액의 미 반응 용액을 제거한 다음, 신선한 3차 증류수로 재분산과 원심 분리를 반복 수행하여, 침전물에 포함된 미 반응물을 세척한다. 이 후, 동결 건조를 수행하여 염색 물질 복합체를 수득한다.
즉, 본래 수용성 성질을 가지고 있었지만, 수용액 내에서 이온화되어 양이온 또는 음이온의 특성을 가지는 염색 물질들을 서로 이온 결합으로 결합시켜 비수용성 성질로 바뀐 복합체를 제조하는 것이다.
또한, 일 예시에서, 폴리소르베이트 80(polysorbate 80)과 대두 오일(soybean oil)은 중량비로 99:1 내지 60:40로 혼합되는 것이 바람직하고, 폴리소르베이트 80 및 대두 오일 전체 100 중량부 대비 비수용성 염색 물질은 0.01 내지 0.1 중량부로 포함되는 것이 바람직하다. 이러한 혼합비율는, 본 발명이 의도하는 전술한 효과를 발휘할 수 있는 혼합비의 일 예시이다.
이를 통하여, 제 1 혼합물을 형성할 수 있다. 제 1 혼합물은 전술한 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 대두 오일(soybean oil) 및 비수용성 염색 물질이 혼합된 용액으로서, 이물감이 없이 투명하고 균일한 특징을 갖는다.
그리고, 제 1 혼합물과 삼중 블록 공중합체를 혼합한 후 가열하여, 제 2 혼합물을 형성한다(S20).
여기서, 삼중 블록 공중합체는 친수성 그룹과 소수성 그룹이 결합된 공중합체이며, 폴락사머 188인 것이 바람직하다. 폴록사머(Poloxamer)는 Poly(oxyethylene)-poly(oxypropylene)-poly(oxyethylene)[POE-POP-POE]의 중합체이다. 폴락사머는 실온에서 고체이고, 물과 에탄올에 용해성이며, 폴록사머 용액은 낮은 온도에서는 액상이나 온도가 올라가면 점도가 올라가고 농도가 높은 경우 온도에 따른 졸(sol)-겔(gel)의 요변성을 나타내고 점막세포막을 손상하지 않는다. 폴락사머 68, 127, 188, 237, 338, 및 407 등이 시판되고 있다. 예를 들어 폴락사머 188이란 b가 30이고 a 및 c의 합이 약 75인 화학식 1의 화합물로서 분자량은 약 8350인 폴락사머를 의미한다.
일반적으로, 친수성 그룹의 도입은 수용액 상태에서 오랜 시간 동안 물질과 유효 성분의 응집없이 균일하고 안정하게 분산되도록 하는 기능성을 부여하기 위한 것이며, 추가로 혈관에 투여시 체 순환성 (body circulation) 을 높여 원하는 질환 부위로 전달하는 중요한 기능성을 부여하기 위해 필수적이다. 그러나 본 발명은 혈관으로 투여하는 제제 보다는 세포나 조직에 투과 및 흡수될 수 있도록, 친수성 그룹이 도입되는 것으로, 수용액에서 초 미립 나노 크기(8nm 내지 10nm)를 갖는 입자가 안정하고 균일하게 분산되도록 하는 기능을 부여하기 위한 깃이다. 그리고, 소수성 그룹의 도입은 같은 물리적 성질을 가지고 있는 비 수용성의 유효 성분(다양한 약물 또는 염색 물질)을 나노 플랫폼 내부(core)에 탑재하기 위해 필수적인 요소이다.
또한, 가열 온도는 55℃ 내지 65℃인 것이 바람직하다. 가열 온도가 55℃도 미만인 경우에는 삼중 블록 공중합체의 용융점보다 낮아 용융이 되지 않아 제 1 혼합물과 섞이지 못하는 문제점이 있고, 65℃를 초과하는 경우에는 삼중 블록 공중합체와 유효 성분이 분해되는 문제점이 있다.
이를 통하여, 제 2 혼합물을 형성할 수 있다. 제 2 혼합물은 전술한 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 대두 오일(soybean oil) 및 비수용성 염색 물질이 혼합된 용액에 삼중 블록 공중합체를 투입한 것으로, 이 역시 투명하고 균일한 특징을 갖는다.
그리고, 제 2 혼합물을 냉각하여, 나노 플랫폼 고형물을 형성한다(S30).
여기서, 냉각 온도는 0℃ 내지 10℃인 것이 바람직하다. 냉각 온도가 10℃를 초과하는 경우에는 제 2 혼합물이 서서히 냉각되어 입자의 결정화도 낮아져 입자 크기의 균일성이 낮아지는 문제점이 있다.
이를 통하여, 나노 플랫폼 고형물을 형성할 수 있다. 나노란 의미는 전술한 바와 같이, 1 내지 1,000nm의 크기를 의미할 수 있다. 나노 플랫폼은 전술한 비수용성 염색 물질이 탑재할 수 있는 전달체 또는 비히클(vehicle)이 될 수 있다. 이는 본 발명이 속한 기술 분야에서 적용될 수 있는 약물 또는 조영제 등의 전달체를 포함할 수 있다.
그리고, 나노 플랫폼 고형물을 용매에 혼합하여, 제 3 혼합물을 형성한다(S40).
여기서, 용매는 3차 증류수이다. 이 용매는 나노 플랫폼 고형물이 용해되며, 유효 성분이나 함께 포함된 물질들이 응집되어 대부분 이물감이 발생되지 않고 균일하고 안정하게 분산되는 특징을 갖는다.
본 발명에서는 유기 용매를 이용하지 않는 것이 특징 중 하나이다. 유기 용매를 사용할 경우 유효성분이 탑재된 제제의 형태가 붕괴되어 사용할 수 없게 된다. 또한, 붕괴가 발생하지 않더라도, 유기용매를 제거해야하는 단계가 필수로 포함되어야 하고 혹시 사용된 용매의 잔류에 따른 체내 독성 유발의 가능성이 있다.
3차 증류수를 사용할 경우 제조 과정에서의 용매에 의한 독성 유발의 가능성이 전혀 없기 때문에, 생체 친화성이 높으며, 리포좀이나 고분자 기반의 나노 플랫폼을 제조하기 위해 많이 활용되고 있는 기존의 유기용매를 사용하는 방법(자기조립 유화 공정(self-assembly emulsification)과 차별성이 있다.
이를 통하여, 제 3 혼합물을 형성할 수 있다. 제 3 혼합물은 투명하고 균일한 특징을 갖는다.
그리고, 제 3 혼합물로부터 불순물을 제거한다(S50). 불순물을 제거하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속한 기술분야에서 적용되는 방법이라면 어떠한 방법도 적용될 수 있다. 예를 들어, 0.2㎛ 내지 1.2㎛ 필터, 0.5㎛ 내지 1.1㎛ 필터, 0.6㎛ 내지 1.0㎛ 필터, 0.7㎛ 내지 0.9㎛ 필터, 0.8㎛ 필터로 불순물을 제거할 수 있다.
그리고, 불순물이 제거된 제 3 혼합물을 동결건조하여, 나노 복합체를 형성한다(S60).
동결건조는 수분을 제거하는 방법으로서, 물체를 얼린 다음에 주위의 기압을 낮춰서 고체 상태의 물이 기체로　승화하도록 제어하는 방법이다. 여기서, 동결건조의 구체적을 제시하지 않았으나, 본 발명이 속한 기술 분야에서 적용가능한 동결건조 방법을 적용할 수 있음은 자명하다.
이를 통하여, 고체 형태의 나노 복합체를 형성할 수 있다. 나노 복합체는 유효 성분 고유의 색상을 가지고 있고 분광학적 고유 특성을 유지하는 특징을 갖는다.
본 발명의 다른 실시예는 이러한 나노 복합체로 이루어지며, 구체적으로, 유기 발광 염료 및 이의 탑재를 위한 나노플랫폼을 포함하며, 1nm 내지 100nm, 바람직하게는 1nm 내지 90nm, 바람직하게는 1nm 내지 80nm, 바람직하게는 1nm 내지 70nm, 바람직하게는 1nm 내지 60nm, 바람직하게는 1nm 내지 50nm, 바람직하게는 1nm 내지 40nm, 바람직하게는 1nm 내지 30nm, 바람직하게는 1nm 내지 20nm, 바람직하게는 3nm 내지 15nm, 바람직하게는 5nm 내지 12nm, 바람직하게는 7nm 내지 10nm, 가장 바람직하게는 8nm 내지 9nm의 평균 직경을 갖는 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 진단 제제를 제공할 수 있다.
전술한 바와 같이, 나노 복합체의 평균 직경이 지나치게 큰 경우, 예를 들어 100nm를 초과하는 경우에는 종양 등의 조직에서의 직접 흡수가 어려워 본 발명이 의도하는 도포방식에 적용될 수 없다. 즉, 본 발명은 전술한 바와 같이, 나노 복합체의 평균 직경을 초미립으로 제어하여, 종래의 일부 문헌에 기재된 나노 크기의 전달체에서 구현할 수 없었던 직접 도포 방식에 최적화된 나노플랫폼을 제공할 수 있다.
진단 제제 물질이 나노 크기를 가지지 못할 경우, 조직 내로 투과 및 흡수율이 높지 않기 때문에, 전술한 범위의 평균 직경을 갖는 것은 중요한 요소이다. 전술한 크기를 통하여, 때문에 일반 조직에 비해 종양 조직에 더 많이 흡수 및 투과되어 종양을 구분할 수 있다.
또한, 나노 플랫폼에 탑재되는 물질의 필수 조건은 앞서 전술한 바와 같이, 비 수용성의 성질을 가지고 있어야 하며, 비 수용성 유효 물질은 에탄올, 메탄올, 아세톤 및 DMSO 등의 유기 용매를 사용하지 않으면 거의 녹지 않는다. 또한 3차 증류수에서는 전혀 섞이지 못하고 부유하거나 가라앉기 때문에 불균일하다.
또한, 본 발명의 다른 실시예는 전술한 진단 제제가 주사 용액 또는 완충 용액에 분산된 진단 제제 용액을 제공할 수 있다. 진단 제제 용액은 균일하고 투명한 특징을 갖는다.
이를 통하여, 염증에 의해 변형된 비 정상조직 또는 종양에만 선택적으로 전달되어 염색이 가능한 나노 기반의 진단 제제를 제공할 수 있다.
또한, 진단 제제를 질환이 발생된 특정 부위와 무관하게 전체적으로 도포하고, 생리 식염수로 세척하면 일반 정상 조직에 비해 염증에 의해 변형된 비정상 조직 및 종양 조직에 표지 제제의 투과 및 흡수율이 높아 선택적 염색이 가능하여 질환 부위의 정밀 염색(진단)이 가능하다.
또한, 진단 제제를 목적에 맞는 용액(주사 용수, 완충 용액, 증류수 등)에 균일하게 분산시킨 후 혈관을 통해 투여하거나 종양 조직에 직접 도포를 함으로써, 일반 정상 조직과 종양 조직을 정밀하게 구분할 수 있다.
여기서, 주사 용수의 일 예시로서, 0.5% 내지 1.3%의 NaCl 용액, 바람직하게는 0.6% 내지 1.2%의 NaCl 용액, 바람직하게는 0.7% 내지 1.1%의 NaCl 용액, 바람직하게는 0.8% 내지 1.0%의 NaCl 용액, 가장 바람직하게는 0.9%의 NaCl 용액을 사용할 수 있다. 또한, 2% 내지 8%의 glucose 용액, 바람직하게는 3% 내지 7%의 glucose 용액, 바람직하게는 4% 내지 6%의 glucose 용액, 가장 바람직하게는 5%의 glucose 용액을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세히 설명한다.
실험예 1. 수용성의 메틸렌 블루(methylene blue)와 인도시아닌 그린(indocyanine green)의 이온쌍결합(이온 결합)을 이용한 비수용성 염색 물질 복합체의 제조
상온에서 20mL의 3차 증류수에 0.1g의 메틸렌 블루와 0.1g의 인도시아닌 그린을 각각 완전히 용해시킨 다음, 메틸렌 블루 수용액을 교반 상태에서 인도시아닌 그린 수용액을 첨가한 후 원심 분리를 수행하였다. 복합체가 형성되었으며, 하층에 침전된 형성물을 제외한 상층액의 미 반응 용액을 제거한 다음, 신선한 3차 증류수로 재 분산과 원심 분리를 반복 수행하여, 침전물에 포함된 미 반응물을 세척하였다. 그 후, 동결 건조를 수행하여, 조직 염색을 위한 비수용성의 메틸렌 블루/인도시아닌 그린 염색 물질 복합체를 제조하였다.
실험예 2. 고분자 용융 상전이 현상을 이용한 비 수용성 염색 물질이 탑재된 나노 기반 표지 제제의 제조
고분자의 용융 상전이 현상을 이용하여 비 수용성 염색 물질이 탑재된 나노 기반 표지 제제를 제조하기 위해, 실험예 1에서 제조된 0.01g의 비수용성 염색 물질을 0.6g 에 해당되는 soybean oil 과 Tween 80 을 첨가한 후 균일하고 투명한 상태가 되도록 상온에서 충분히 교반하였다. 그 다음, 0.4g의 F68 을 첨가하고 60℃로 가열한 상태에서 균일하고 투명한 용액이 제조되도록 충분히 교반하여 혼합하고, 냉각시켜 고체 형태로 제조하였다. 제조된 고형물을 3차 증류수에 녹이고 0.8㎛ 필터로 여과시켜, 나노 기반 진단 제제에 탑재되지 못한 비수용성의 응집된 염색 물질을 제거하였다. 또한, 추후 진행될 실험 예정에 따라 0.2㎛ 여과 멸균도 진행하였으며, 여과된 용액은 동결 건조를 진행하여 최종적으로 안정하게 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 얻었다.
이렇게 제조된 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 수용액에서 쉽게 용해되어 평균 입자 크기를 측정하였으며, 그 측정 결과 약 10nm의 직경을 갖는 것을 확인하였다.
상기 동일한 방식으로 수용성 염색 물질들의 이온쌍 결합(이온 결합)을 이용한 비 수용성 복합체 뿐만 아니라, 물질 고유의 수용액에서의 용해도가 비 수용성인 커큐민 (curcumin)과 나일 레드 (Nile red) 등을 사용하여 나노 제제에 탑재를 통해 범용성을 확인하였다. 그 결과, 비 수용성의 염색 물질 복합체 뿐만 아니라, 다양한 비 수용성 염색 물질도 나노 제제 내에 탑재가 가능함을 확인하였고, 수용액에서 분산도 잘 되기 때문에 특정 물질만 탑재되지 않고 다양한 물질이 탑재될 수 있어 범용성이 높음을 확인하였다.
실험예 3. 염색 물질이 탑재된 진단 제제가 수용액에 안정하게 분산되는지 확인
본 발명의 염색 물질이 탑재된 진단 제제가 수용액 등에 안정하게 분산되는지 확인하기 위하여, 실험예 1과 2에서 제조된 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 순수 유효 물질과 이를 포함한 진단 제제가 수용액에 분산된 상태의 이미지를 도 3에 나타내었다.
도 3에 도시한 바와 같이, 각각의 진단 제제가 수용액 내에 안정하게 분산되었음을 확인하였다.
실험예 4. 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 분광학적 특성 분석
염색 물질이 탑재된 진단 제제는 외부에서 물질 고유 파장에 맞는 광원에 의해서 활성화되어야 하므로 분광학적 특성이 유지되는지가 중요하다. 따라서 실험예 1 및 2에서 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 3차 증류수에 분산 한 후 자외선-가시광선 분광기를 이용하여 흡광도를 확인하였으며, 도 5에 나타내었다.
도 5(A) 및(B)에 도시한 바와 같이, 진단 제제 내에 탑재된 염색 물질의 종류에 따라서 고유 흡수 파장이 잘 유지됨을 확인하였다.
실험예 5. 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 혈장이 포함된 안정성 평가
염색 물질이 탑재된 진단 제제는 기본적으로 수용액에 균일하게 잘 분산되어야 하고, 일정 시간 동안 입자 크기 크게 변화하지 않고 유지되어야 한다. 또한, 체내에 전달할 경우에는 투여 경로에 따라 혈장에 접촉할 가능성이 높아 혈장(fetal bovine serum, FBS)이 존재하는 환경에서도 입자 크기가 유지되는 것이 전달하고자 하는 물질의 체내 안정성 확보를 위해 추가적으로 고려되어야 한다.
따라서 다양한 농도의 혈장이 포함된 전해질 용액(Phosphate buffered saline, PBS, pH7.4)에 실험예 1에서 제조된 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 분산한 후, 입도분석기를 이용하여 입자 크기가 변화되는지 확인하였고, 그 측정 결과는 도 6에 나타내었다. 도 6에 도시한 바와 같이, 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 다양한 혈장이 포함된 전해질 용액에서 입자 크기가 크게 증가되지 않고, 초기 입자 크기가 잘 유지되어 수용액 내 안정성이 확보되었음을 확인하였다.
실험예 6. 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 다양한 세포에서 독성 평가
염색 물질이 탑재된 진단 제제는 치료 기능성이 없고 단순 세포 또는 조직을 염색하기 위한 기능성을 가지고 있기 때문에 낮은 독성을 가지고 있는 것이 중요하다. 실험예 1에서 제조된 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 세포 수준에서 독성을 평가하기 위해 정상세포(NIH3T3)와 다양한 종양 세포(AGS, CT-26 및 HT-29)에서 다양한 농도와 처리 시간에 따른 변화를 확인하였고, 그 측정 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 도시한 바와 같이, 다양한 농도와 세포 처리 시간에서 저 독성을 가지는 것을 확인하였다.
실험예 7. 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 종양 세포내 유입 거동 평가
다양한 종양 세포 (AGS, CT-26 및 HT-29)를 사용하여 실험예 1에서 제조된 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 세포 내로 유입 거동을 평가하기 위해, 일정 시간 동안 처리 후에 형광 현미경을 사용하여 영상을 얻었고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 도시한 바와 같이, 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 단 시간 안에 세포 내로 유입이 가능함을 확인하였고, 더욱이, 짧은 시간임에도 불구하고 세포질 뿐만 아니라 세포핵까지 전달이 되는 것을 확인하였다.
실험예 8. 종양 유발 동물 모델에서 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 종양 축적성(표적성) 및 체내 분포 거동 평가
본 발명을 통해 제공하고자 하는 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 종양 조직에 효과적으로 축적이 되어야 하고, 정상조직으로의 전달은 낮아 물질에 의한 부작용을 최소화하고자 한다. 종양 유발 동물 모델은 SCC-7 (squamous cell carcinoma) tumor cell-line (1x10^6개/head)을 쥐의 허벅지 피하에 이식하고 약 10일 후에 150mm^3 크기의 종양이 잘 형성된 그룹을 실험에 사용하였다. 그 다음 종양 유발 동물 모델의 꼬리 정맥을 통해 실험예 1에서 제조된 진단 제제를 투여하고 전신 순환 후 시간에 따른 종양의 축적성(표적성)과 최종 분석 평가 종료 후 주요 장기를 적출하고 염색 물질이 포함된 나노 기반 제제의 축적된 정도를 각각 실시간 형광 분석 장비(IVIS Spectrum In Vivo Imaging System, PerkinElmer)와 ex vivo 형광 분석 장비(KODAK Image Station 4000MM Digital Imaging System, Bruker BioSpin)를 통해 확인하였고, 그 결과를 도 9과 도 10에 각각 나타내었다.
도 9에 도시한 바와 같이, 종양 유발 동물 모델의 꼬리 정맥을 통해 투여된 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 전신 순환을 거쳐 종양으로 빠른 시간 내에 축적되는 것을 확인하였다.
또한, 도 10에 도시한 바와 같이, 평가 종료 후 적출된 주요 장기에서 일반 정상 장기에는 거의 축적되지 않고 종양에 많이 축적되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 신장에서도 물질이 검출이 되었는데, 이것은 투여된 염색 물질이 탑재된 진단 제제가 신장을 통해 제거되는 것을 확인함으로써, 체내에 불필요하게 축적되어 부작용을 발생시킬 문제점을 가지고 있는 않는다는 것을 알 수 있어, 전술한 기본 조건이 충족 가능함을 확인하였다.
실험예 9. 종양 유발 동물 모델의 종양에 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 직접 도포를 통한 조직 염색 가능성 평가
종래의 국내외 나노 기반의 플랫폼을 이용한 진단 또는 진단/치료 관련 연구들에서는 의약품 개발을 목표로 이해하고 있기 때문에, 체내 전달 경로를 크게 경구, 비 경구로 진행하고 있고, 대부분의 경우 경구 흡수율이 거의 없거나 매우 낮아 보다 효율적인 비 경구 투여 방식을 선호하고 있다. 그러나 본 발명에서 제공하는 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 기존 방식에 제한적으로 적용되는 것은 아니기 때문에, 사용자 편의성을 높이기 위해 직접 도포 방식도 함께 가능성을 평가하고자 하며 추후에 물질의 사용방법에 도포 방식을 추가로 포함하고자 한다.
이러한 특성을 확인하기 위하여, 동물의 꼬리 정맥을 통해 투여된 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 종양 축적성 및 주요 장기 분포도 등의 평가 뿐만 아니라, 물질을 직접 도포했을 때에도 종양에 투과 및 흡수되어 종양 조직을 염색할 수 있는지 가능성을 평가하였다.
종양 유발 동물 모델에 형성된 종양의 피하를 제거하고, 그 위에 실험예 2에서 제조된 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 도포하고 2~3회 정도로 3차 증류수를 사용하여 세척한 후 형광 영상장비(IVIS Spectrum In Vivo Imaging System, PerkinElmer)를 사용하여 조직에서 발현되는 형광 변화를 도 11에 나타내었다.
도 11에 도시한 바와 같이, 메틸렌 블루/인도시아닌 그린 형광 물질 복합체가 탑재된 나노 기반 표지 제제가 물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 형광 발현량이 현저 높음을 확인하였다. 이를 통하여, 본 발명에 따른 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 정맥 투여 방법을 통한 종양의 진단 뿐만 아니라, 단순히 조직에 도포하는 것 만으로도 충분이 종양을 진단하여 정상 조직과의 구분이 가능하다는 것을 확인하였다.
실험예 10. 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 종양 조직 내 흡수 기전 평가
염색 물질이 탑재된 진단 제제의 종양 조직으로의 흡수 기전을 알아보기 위해, 먼저 종양의 구조적 변화를 확인해 보았다.
FE-SEM(JSM-6700F, JEOL Ltd, Japan)을 이용하여 진단 제제가 처리되기 전/후의 조직의 형태를 40, 100, 500, 1000 배율로 각각 확인하였고, 그 결과는 도 12에 나타내었다. 도 12에 도시한 바와 같이, 종양이 생성되기 전에는 조직이 미세 기공이 존재하지만 조밀하고 기공 사이의 조직 벽들이 넓은 반면, 종양이 형성될 경우에는 많은 큰 기공들이 관찰되었고 조직 벽들은 정상과 비교해도 확실히 좁게 형성되었음이 확인하였다. 큰 기공들과 좁은 조직 벽을 갖는 종양 조직에 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 도포할 경우 기공 내부 뿐만 아니라, 조직 벽에도 흡착되어 덮고 있는 형태가 관찰되었다. 조직 형태학적인 관점에서 실험 결과를 고려할 때 정상 조직에 비해 종양 형성에 따른 구조적 변이로 인해 본 발명의 나노 기반 제제가 흡수 및 흡착 될 수 있음을 확인하였다.
또한, 조직 형태학적 구조 측면에서 나노 기반 제제의 흡수 기전 뿐만 아니라, 살아있는 세포수준에서 흡수 기전을 평가하고자 하였다. 평가를 위해 5x10^4/well 의 Caco-2 cells 을 24-well plate 크기의 trans-wells (BD Biosciences)을 사용하여 세포를 3차원 배양하고 나노 기반의 진단 제제를 처리하여 흡수 기전을 확인하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 도시한 바와 같이, 어떠한 물질도 처리하지 않은 대조 군의 세포에서 auto-fluorescence 가 나타나지만, 나노 기반의 진단 제제를 처리한 그룹에 비해 상당히 낮으며, 나노 기반의 진단 제제를 처리한 경우 그물망 형태로 강한 형광이 발현되는 것을 확인하였다. tight junction 의 action 을 염색할 수 있는 FITC-phalloidin marker 를 사용하여 염색된 영상과 나노 기반의 진단 제제에 의해 염색된 영상을 겹쳐보니 일치하는 것으로 보아 본 발명에서 제공된 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 tight junction 을 통해 흡수 가능한 것으로 확인되었다.
이러한 결과를 토대로 정리하면, 본 발명에서 제공된 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 염증에 의해 변형된 종양 조직의 형태학적 차이와 작은 입자 크기로 인해 tight junction 을 통해 물질이 흡수되는 기전인 para-cellular pathway 를 통해 종양 조직을 효과적으로 진단 가능하다는 것을 확인하였다.
실험예 11. 종양에 직접 도포 방법을 통해 종양 조직 진단을 위해 진단 제제에 다양한 물질을 탑재함으로써 기술의 다양성 평가
종양이 염색될 경우 특정 염색 물질의 성질에 의존하지 않고 다양한 파장을 가지는 물질이 가능할 경우 여러 원하는 파장을 선별하여 염색이 가능하기 때문에 실험예 1에서 제조된 커큐민(curcumin, λ = 340~534nm)과 메틸렌 블루/인도시아닌 그린 형광 물질 복합체(λex = 700, 805nm) 뿐만 아니라, 광 역학적 치료제로 사용되는 Chlorin e6 (Ce6, λex = 408nm)를 나노 기반 제제에 탑재한 후 염증성 대장암 유발 동물 모델에 직접 도포하여 종양 진단이 가능한지 평가하였다.
Azoxymethane (AOM)/Dextran sulfate sodium (DSS)를 이용한 염증성 대장암 유발 동물 모델을 위한 실험을 실시하였으며, 5 내지 6 주령 C57BL/6 mice 에 AOM 10mg/kg 을 생리 식염수(또는 PBS (pH 7.4))에 용해하여 복강 (Intraperitoneal injection)에 5ml/kg 용량으로 투여하였고, AOM 투여 후 1 주일이 된 시점에 2 w/v. % Dextran sulfate sodium (DSS, Sigma, USA)을 음수에 용해시켜 1 주일간 투여하였다. 그리고 2 주일간의 휴식기를 가진 후, 2% DSS를 1 주간 음수로 투여한 다음 다시 2 주간의 휴식기를 가지는 방법으로 실시하였으며, 동물의 대장에 염증성 종양이 형성될 수 있도록 총 12 주 정도 기간 동안 사육을 한 후 실험을 진행하였다.
염증성 대장 종양 조직에 다양한 파장과 성질을 가지는 각각의 염색 물질을 탑재한 진단 제제를 처리하고, 형광 영상장비(IVIS Spectrum In Vivo Imaging System, PerkinElmer)를 사용하여 조직에서 발현되는 형광 변화를 도 14 내지 도 16에 각각 나타내었다. 도 14 내지 도 16 각각에 도시한 바와 같이, 나노 기반 제제 내에 탑재된 물질의 특성에 의존하지 않고, 염증성 비 정상 조직과 염증 유발에 의해 형성된 대장 종양 조직을 효과적으로 염색이 되는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 본 발명에 따라 제조된 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 세포 이식을 통해 형성된 종양, 염증성 비 정상 조직 및 염증 유발에 의해 형성된 종양 조직을 기존 정맥 투여 방식을 통한 진단 뿐만 아니라 단순 도포 방식을 통해 효과적으로 염색이 가능함을 확인하였다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (10)

  1. 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 대두 오일(soybean oil) 및 비수용성 염색 물질을 혼합하여, 제 1 혼합물을 형성하는 단계;
    제 1 혼합물과 삼중 블록 공중합체를 혼합한 후 가열하여, 제 2 혼합물을 형성하는 단계;
    상기 제 2 혼합물을 냉각하여, 나노 플랫폼 고형물을 형성하는 단계;
    상기 나노 플랫폼 고형물에 용매를 혼합하여, 제 3 혼합물을 형성하는 단계;
    상기 제 3 혼합물로부터 불순물을 제거하는 단계; 및
    상기 불순물이 제거된 제 3 혼합물을 동결건조하여, 나노 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 비수용성 염색 물질은 커큐민(curcumin), FITC(fluorescein isothiocyanate), 나일 레드 (Nile red), Ce6 (Chlorin e6) 및 PpIX (Protoporphyrin IX)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질인, 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 비수용성 염색 물질은 양이온성 제 1 염색 물질과 음이온성 제 2 염색 물질을 용매에 각각 용해한 후 혼합하여, 이온 결합을 통해 수득된 비수용성 염색 물질 복합체인, 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제 1 염색 물질은 인디고 카민(indigo carmine), 메틸렌 블루(Methylene Blue), 인도시아닌그린(Indocyanine green), 톨로이딘 블루(Toluidine Blue) 및 로다민 B(Rhodamine B)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질인, 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 제 2 염색 물질은 인도시아닌 그린(Indocyanine Green) 및 메틸렌 블루(Methylene Blue)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질인, 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제 2 혼합물을 형성하는 단계에서 가열 온도는 55℃ 내지 65℃인, 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 나노 플랫폼 고형물을 형성하는 단계에서 냉각 온도는 0℃ 내지 10℃인, 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 용매는 3차 증류수인, 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법.
  9. 마이셀 구조의 나노 복합체로서,
    상기 마이셀 구조의 내부 코어는 비수용성 염색 물질이 용해된 폴리소르베이트 80(polysorbate 80) 및 대두 오일(soybean oil)을 포함하고,
    상기 마이셀 구조의 외부 쉘은 수용액에서 상기 내부 코어에 포함된 성분의 석출로 인한 응집없이, 균일한 입자를 형성하기 위한 삼중 블록 공중합체를 포함하며,
    상기 나노 복합체의 평균 직경은 1nm 내지 100nm인 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제.
  10. 제9항의 진단 제제가 주사 용액 또는 완충 용액에 분산된 진단 제제 용액.
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