WO2020166762A1 - 소변을 이용하여 검출 가능한 바이오 전자센서 - Google Patents

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WO2020166762A1
WO2020166762A1 PCT/KR2019/006304 KR2019006304W WO2020166762A1 WO 2020166762 A1 WO2020166762 A1 WO 2020166762A1 KR 2019006304 W KR2019006304 W KR 2019006304W WO 2020166762 A1 WO2020166762 A1 WO 2020166762A1
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WO
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urine
electrode
enzyme layer
enzyme
metal electrode
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PCT/KR2019/006304
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Inventor
이민호
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(주)비텍
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/145—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue
    • A61B5/1486—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue using enzyme electrodes, e.g. with immobilised oxidase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B10/00—Other methods or instruments for diagnosis, e.g. instruments for taking a cell sample, for biopsy, for vaccination diagnosis; Sex determination; Ovulation-period determination; Throat striking implements
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B10/00—Other methods or instruments for diagnosis, e.g. instruments for taking a cell sample, for biopsy, for vaccination diagnosis; Sex determination; Ovulation-period determination; Throat striking implements
    • A61B10/0045—Devices for taking samples of body liquids
    • A61B10/007—Devices for taking samples of body liquids for taking urine samples
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B2562/00—Details of sensors; Constructional details of sensor housings or probes; Accessories for sensors
    • A61B2562/12—Manufacturing methods specially adapted for producing sensors for in-vivo measurements

Definitions

  • the present invention is a bio-electronic sensor using urine that can be quantitatively analyzed through an electrochemical analysis method using urine to relieve the inconvenience of blood collection, a bio-electronic sensor that measures sugar using urine, and a ketone body using urine. It relates to a bioelectronic sensor that measures.
  • Diabetes is a disease characterized by high blood sugar due to abnormal insulin action, and the number of diabetic patients in Korea is on the rise recently and is one of the chronic diseases. Diabetes patients are not only difficult to cure, but also a typical disease that causes acute complications or complications related to damage to human tissues. Diabetes patients need constant blood sugar management to prevent various complications, and the amount of glucose should be measured periodically. In particular, when hypoglycemia occurs, cardiovascular disease occurs due to shock or decreased consciousness in severe cases, which can lead to death. This requires considerable attention even in daily life.
  • Blood glucose levels that indicate blood glucose information can be largely classified into invasive and colorimetric methods.
  • the invasive method consists of a blood sugar device, a test strip on which blood is placed, and a blood collection device used to collect blood. In general, a small amount of blood is collected from the capillaries of the fingertips, and blood is buried on the test strip for measurement.
  • the test strip is a method of detecting blood sugar by placing an enzyme that reacts with blood sugar in the blood to cause an electrochemical reaction.
  • the colorimetric method uses a urine strip, and the blood sugar can be determined by the color that changes after urine is buried on a urine strip.
  • ketone bodies are used in cells other than liver and red blood cells as a fuel to replace glucose by breaking down fat when glucose cannot be used as energy or when the glucose concentration in the body is extremely reduced.
  • the invasive blood sugar device can be used for a long time, but since the test strip and the blood collection device are disposable, diabetics suffer from economic difficulties in managing blood sugar.
  • the blood sampler used at this time measures blood sugar by collecting blood from a part of the body with a tool such as a small lancet. Blood collection is a pain for the patient, and there is a risk of infection medically.
  • the colorimetric method using a urine strip is difficult to qualitatively and quantitatively represent the color change due to inaccuracies such as pretreatment, color development time, urine amount and reaction time.
  • bioelectronics that can quantitatively measure urine sugar and ketone bodies using an electrochemical analysis method to measure urine sugar and ketone bodies without pain of blood collection, and to compensate for inaccuracy and difficulty in quantitative analysis of urine strips. Research on the sensor is needed.
  • An object of the present invention is to provide a bioelectronic sensor using urine. More specifically, it is to provide a sensor capable of quantitative measurement by an electrochemical method by generating an electrode part using an enzyme.
  • Another object of the present invention is to provide a bioelectronic sensor capable of measuring sugar using urine.
  • it relates to quantitative measurement of glucose components in urine, and provides a sensor that measures glucose multiple times without affecting interfering substances contained other than glucose components in urine.
  • Another object of the present invention is to provide a bioelectronic sensor capable of measuring ketone bodies using urine.
  • it relates to quantitative measurement of ketone bodies in urine, and provides a sensor that measures multiple times by using a ketone body as one sensor without affecting interfering substances contained other than the ketone body component in urine.
  • a bioelectronic sensor using urine includes a substrate; An electrode portion disposed on the substrate; And a connection part for applying current and voltage to the electrode part, wherein the electrode part comprises: an electrode layer including a metal electrode attached to the substrate; A first enzyme layer fixed on the electrode layer; And a second enzyme layer fixed on the first enzyme layer.
  • the substrate is a printed circuit board (PCB).
  • PCB printed circuit board
  • the metal electrode is composed of a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode.
  • the metal electrode includes platinum (Pt), gold (Au), cadmium (Cd), silver (Ag), lead (Pb), and nickel (Ni).
  • the bioelectronic sensor using urine can be measured by an electrochemical method.
  • a bioelectronic sensor for measuring sugar using urine includes: a substrate; An electrode portion disposed on the substrate; And a connection part for applying current and voltage to the electrode part, wherein the electrode part comprises: an electrode layer including a metal electrode attached to the substrate; A first enzyme layer fixed on the electrode layer; And a second enzyme layer immobilized on the first enzyme layer, wherein the first enzyme layer includes glucose oxidase, and the second enzyme layer includes ascorbate oxidase.
  • the substrate is a PCB.
  • the metal electrode is composed of a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode.
  • the metal electrode includes platinum (Pt), gold (Au), cadmium (Cd), silver (Ag), lead (Pb), and nickel (Ni).
  • the bioelectronic sensor for measuring sugar using urine can be measured by an electrochemical method.
  • a method of manufacturing a bioelectronic sensor for measuring sugar using urine includes: preparing a substrate; Preparing a metal electrode; Attaching a metal electrode on the substrate; Fixing a first enzyme layer on the metal electrode; Drying the first enzyme layer; Fixing a second enzyme layer on the first enzyme layer; And drying the second enzyme layer, wherein the first enzyme layer contains glucose oxidase, and the second enzyme layer contains ascorbate oxidase.
  • the substrate is a PCB.
  • the metal electrode is composed of a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode.
  • the metal electrode includes platinum (Pt), gold (Au), cadmium (Cd), silver (Ag), lead (Pb), and nickel (Ni).
  • Fixing the first enzyme layer on the metal electrode includes coating a mixed solution containing glucose oxidase and GA (Glutaldehyde) on the metal electrode.
  • Drying the first enzyme layer includes a step of including a drying time of 30 minutes or more at a temperature of 35°C to 40°C.
  • the step of fixing the second enzyme layer on the metal electrode includes coating a mixed solution containing ascorbate oxidase and GA on the first enzyme layer.
  • Drying the second enzyme layer includes a step of including a drying time of 30 minutes or more at a temperature of 35°C to 40°C.
  • a bio-electronic sensor for measuring ketone bodies using urine includes: a substrate; An electrode portion disposed on the substrate; And a connection part for applying current and voltage to the electrode part, wherein the electrode part comprises: an electrode layer including a metal electrode attached to the substrate; A first enzyme layer fixed on the electrode layer; And a second enzyme layer immobilized on the first enzyme layer, wherein the first enzyme layer includes an enzyme HBDH (D-beta-hydroxybutyrate dehydrogenase) and a coenzyme NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide), and the second The enzyme layer contains the enzyme HBDH and the coenzyme NADH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide).
  • the substrate is a PCB.
  • the metal electrode is composed of a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode.
  • the metal electrode includes platinum (Pt), gold (Au), cadmium (Cd), silver (Ag), lead (Pb), and nickel (Ni).
  • the bioelectronic sensor for measuring ketone bodies using urine can be measured by an electrochemical method
  • a method of manufacturing a bioelectronic sensor for measuring ketone bodies using urine includes: preparing a substrate; Preparing a metal electrode; Attaching a metal electrode on the substrate; Fixing a first enzyme layer on the metal electrode; Drying the first enzyme layer; Fixing a second enzyme layer on the first enzyme layer; And drying the second enzyme layer, wherein the first enzyme layer includes the enzyme HBDH and the coenzyme NAD, and the second enzyme layer includes the enzyme HBDH and the coenzyme NADH.
  • the substrate is a PCB.
  • the metal electrode is composed of a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode.
  • the metal electrode includes platinum (Pt), gold (Au), cadmium (Cd), silver (Ag), lead (Pb), and nickel (Ni).
  • the step of fixing the first enzyme layer includes coating a mixed solution containing the enzyme HBDH, coenzymes NAD, and GA on the metal electrode.
  • Drying the first enzyme layer includes a step of including a drying time of 30 minutes or more at a temperature of 35°C to 40°C.
  • the step of fixing the second enzyme layer includes coating a mixed solution containing the enzyme HBDH, coenzymes NADH, and GA on the first enzyme layer.
  • Drying the second enzyme layer includes a step of including a drying time of 30 minutes or more at a temperature of 35°C to 40°C.
  • the present invention provides a bioelectronic sensor using urine, so that it can be measured simply using urine without pain of blood collection compared to the prior art, and it is possible to measure multiple times without affecting interfering substances included in addition to glucose and ketone components in urine.
  • FIG. 1 is a diagram schematically illustrating the structure of a bioelectronic sensor using urine of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a metal electrode of an electrode part of a bioelectronic sensor using urine of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram schematically illustrating the structure of an electrode part of a bioelectronic sensor measuring sugar using urine of the present invention.
  • FIG. 4 is a flow chart of a method of manufacturing a bio-electronic sensor for measuring sugar and a bio-electronic sensor for measuring a ketone body using urine of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram schematically illustrating the structure of an electrode part of a bioelectronic sensor measuring ketone bodies using urine of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing a result of measuring glucose by concentration using a bioelectronic sensor measuring sugar using urine of the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram showing a result of the effect of an interfering substance of an electrode using a bioelectronic sensor measuring sugar using urine of the present invention.
  • FIG. 8 is a view showing the result of the change in current flow according to the ACAC (Acetoacetate) concentration using the bioelectronic sensor for measuring ketone bodies using urine of the present invention.
  • FIG. 9 is a view showing the result of comparing the correlation between the current and ACAC concentration measured using the bioelectronic sensor for measuring ketone bodies using urine of the present invention.
  • a bioelectronic sensor using urine includes: a substrate; An electrode portion disposed on the substrate; And a connection part for applying current and voltage to the electrode part, wherein the electrode part comprises: an electrode layer including a metal electrode attached to the substrate; A first enzyme layer fixed on the electrode layer; And a second enzyme layer immobilized on the first enzyme layer.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the structure of a bioelectronic sensor using urine of the present invention.
  • the substrate of the bioelectronic sensor using urine is a PCB, and another substrate capable of passing current may be used.
  • FIG. 2 shows a schematic view of a metal electrode of an electrode part of a bioelectronic sensor using urine of the present invention.
  • the metal electrode is composed of a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode, and the metal electrode is platinum (Pt), gold (Au), cadmium (Cd), silver (Ag), lead (Pb), nickel ( In general, a material containing Ni) and capable of flowing electric current and exchanging electrons with molecules can be used, and platinum (Pt) is preferred.
  • the bioelectronic sensor using urine can be measured by an electrochemical method.
  • a bioelectronic sensor for measuring sugar using urine includes: a substrate; An electrode portion disposed on the substrate; And a connection part for applying current and voltage to the electrode part, wherein the electrode part comprises: an electrode layer including a metal electrode attached to the substrate; A first enzyme layer fixed on the electrode layer; And a second enzyme layer immobilized on the first enzyme layer, wherein the first enzyme layer includes glucose oxidase, and the second enzyme layer includes ascorbate oxidase.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a structure of an electrode part of a bioelectronic sensor that measures sugar using urine.
  • the substrate is a PCB, and another substrate capable of passing current may be used.
  • the metal electrode consists of a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode, and the metal electrode contains platinum (Pt), gold (Au), cadmium (Cd), silver (Ag), lead (Pb), and nickel (Ni).
  • platinum (Pt) is preferred.
  • the electrode part two layers of enzyme multilayers are created on the electrode layer, so that sugar can be measured using urine without being disturbed by interfering substances in urine.
  • glucose oxidase was used as an example to measure glucose, which is urine glucose.
  • glucose oxidase in urine reacts with glucose oxidase to become gluconic acid and release electrons.
  • Glucose can be detected by measuring the emitted electrons with an electrode.
  • the second enzyme layer includes uric acid, ascorbic acid, and acetaminophen, which are representative interfering substances in urine.
  • ascorbate oxidase is used as an example. Was used.
  • ascorbic acid is oxidized to dehydroascorbic acid by ascorbate oxidase, which cannot be oxidized on the electrode surface, and electrode activation is lost, so that glucose reaction is not disturbed.
  • a glucose oxidase layer on an electrode having a simple structure and an ascorbate oxidase layer on the glucose oxidase layer are prepared to measure sugar using urine, and an electrode that does not react with interfering substances can be prepared.
  • the bioelectronic sensor for measuring sugar using urine can be measured by an electrochemical method.
  • a method of manufacturing a bioelectronic sensor for measuring sugar using urine includes: preparing a substrate; Preparing a metal electrode; Attaching a metal electrode on the substrate; Fixing a first enzyme layer on the metal electrode; Drying the first enzyme layer; Fixing a second enzyme layer on the first enzyme layer; And drying the second enzyme layer, wherein the first enzyme layer contains glucose oxidase, and the second enzyme layer contains ascorbate oxidase.
  • Figure 4 shows a flow chart of a method of manufacturing a bio-electronic sensor for measuring sugar using urine and a bio-electronic sensor for measuring a ketone body using urine of the present invention.
  • preparing a substrate (S310), preparing a metal electrode (S320), attaching a metal electrode on the substrate (S330), fixing a first enzyme layer on the metal electrode Step (S340), drying the first enzyme layer (S350), fixing a second enzyme layer on the first enzyme layer (S360), and drying the second enzyme layer (S370) Includes.
  • step S 310 a substrate is prepared.
  • the substrate is a PCB, and another substrate capable of passing current may be used.
  • a metal electrode is prepared.
  • the metal electrode consists of a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode.
  • the working electrode is circular and its diameter is about 1.3mm, and the counter electrode and the reference electrode each surround the working electrode. There are no restrictions on the shape and size of the working electrode, counter electrode, and reference electrode.
  • the metal electrode includes platinum (Pt), gold (Au), cadmium (Cd), silver (Ag), lead (Pb), nickel (Ni), and generally allows current to flow and provides electron exchange with molecules. Materials that can be received are available, and platinum (Pt) is preferred.
  • step S 310 and step S 320 are irrelevant to each other and may be performed at the same time.
  • step S330 a metal electrode is attached to the substrate.
  • the first enzyme layer is fixed on the metal electrode.
  • the first enzyme layer used glucose oxidase as an example for measuring glucose, which is urine glucose in urine. Glucose in urine reacts with glucose oxidase to become gluconic acid and release electrons. Glucose can be detected by measuring the emitted electrons with an electrode.
  • Glucose oxidase and GA were mixed to fix the metal electrode and the first enzyme layer.
  • the mixture is coated on a metal electrode.
  • step S 350 the first enzyme layer is dried. Dry sufficiently for 30 minutes or more at a temperature of 35°C to 40°C.
  • the second enzyme layer is fixed on the first enzyme layer.
  • the second enzyme layer is a layer for filtering uric acid, ascorbic acid, acetaminophen, etc., which are representative interfering substances in urine, and ascorbate oxidase is used as an example.
  • ascorbic acid is oxidized to dihydrohascorbic acid by ascorbate oxidase, which cannot be oxidized on the electrode surface, and electrode activation is lost, so that glucose reaction is not disturbed.
  • Ascorbate oxidase and GA were mixed to fix the first and second enzyme layers. The mixture is coated on the first enzyme layer.
  • step S370 the second enzyme layer is dried. Dry sufficiently for 30 minutes or more at a temperature of 35°C to 40°C.
  • a bio-electronic sensor for measuring ketone bodies using urine includes: a substrate; An electrode portion disposed on the substrate; And a connection part for applying current and voltage to the electrode part, wherein the electrode part comprises: an electrode layer including a metal electrode attached to the substrate; A first enzyme layer fixed on the electrode layer; And a second enzyme layer immobilized on the first enzyme layer, wherein the first enzyme layer includes enzymes HBDH and coenzyme NAD, and the second enzyme layer includes enzymes HBDH and coenzyme NADH.
  • FIG. 5 shows a schematic diagram of the structure of an electrode part of a bioelectronic sensor for measuring ketone bodies using urine of the present invention.
  • the substrate is a PCB, and another substrate capable of passing current may be used.
  • the metal electrode consists of a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode, and the metal electrode contains platinum (Pt), gold (Au), cadmium (Cd), silver (Ag), lead (Pb), and nickel (Ni).
  • platinum (Pt) is preferred.
  • the electrode part two layers of enzyme multilayers are created on the electrode layer, so that sugar can be measured using urine without being disturbed by interfering substances in urine.
  • Ketone bodies in urination exist in the form of ACAC.
  • ACAC combines with the coenzyme NADH and the enzyme HBDH to produce 3HB and NAD + .
  • the reaction formula for the reaction is shown in Reaction Scheme 2 below.
  • a layer of enzyme HBDH and coenzyme NAD on a simple structure electrode, and a layer of enzyme HBDH and coenzyme NADH on the enzyme HBDH and coenzyme NAD layer can be used to measure ketone bodies using urine. Can be produced.
  • the bioelectronic sensor that measures ketone bodies using urine can be measured by an electrochemical method.
  • a method of manufacturing a bioelectronic sensor for measuring ketone bodies using urine includes: preparing a substrate; Preparing a metal electrode; Attaching a metal electrode on the substrate; Fixing a first enzyme layer on the metal electrode; Drying the first enzyme layer; Fixing a second enzyme layer on the first enzyme layer; And drying the second enzyme layer, wherein the first enzyme layer includes the enzyme HBDH and the coenzyme NAD, and the second enzyme layer includes the enzyme HBDH and the coenzyme NADH.
  • Figure 4 shows a flow chart of a method of manufacturing a bio-electronic sensor for measuring sugar using urine and a bio-electronic sensor for measuring a ketone body using urine of the present invention.
  • preparing a substrate (S310), preparing a metal electrode (S320), attaching a metal electrode on the substrate (S330), fixing a first enzyme layer on the metal electrode Step (S340), drying the first enzyme layer (S350), fixing a second enzyme layer on the first enzyme layer (S360), and drying the second enzyme layer (S370) Includes.
  • preparing a substrate (S310), preparing a metal electrode (S320), attaching a metal electrode on the substrate (S330), fixing a first enzyme layer on the metal electrode Step (S340), drying the first enzyme layer (S350), fixing a second enzyme layer on the first enzyme layer (S360), and drying the second enzyme layer (S370) Includes.
  • step S 310 a substrate is prepared.
  • the substrate is a PCB, and another substrate capable of passing current may be used.
  • a metal electrode is prepared.
  • the metal electrode consists of a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode.
  • the working electrode is circular and its diameter is about 1.3mm, and the counter electrode and the reference electrode each surround the working electrode. There are no restrictions on the shape and size of the working electrode, counter electrode, and reference electrode.
  • the metal electrode includes platinum (Pt), gold (Au), cadmium (Cd), silver (Ag), lead (Pb), nickel (Ni), and generally allows current to flow and provides electron exchange with molecules. Materials that can be received are available, and platinum (Pt) is preferred.
  • step S 310 and step S 320 are irrelevant to each other and may be performed at the same time.
  • step S330 a metal electrode is attached to the substrate.
  • the first enzyme layer is fixed on the metal electrode.
  • the first enzyme layer used the enzyme HBDH and the coenzyme NAD as an example for measuring ACAC, which is a ketone in urine.
  • ACAC is decomposed into 3HD and NAD + and reacts with the first enzyme layer to form ACAC and its product H + .
  • the ketone body can be quantitatively measured.
  • Enzymes HBDH, coenzymes NAD and GA are mixed to fix the metal electrode and the first enzyme layer.
  • the mixture is coated on a metal electrode.
  • step S 350 the first enzyme layer is dried. Dry sufficiently for 30 minutes or more at a temperature of 35°C to 40°C.
  • the second enzyme layer is fixed on the first enzyme layer.
  • the second enzyme layer is a layer that degrades ACAC, a ketone in urine, and as an example, the enzymes HBDH and the coenzyme NADH were used.
  • ACAC meets the enzyme HBDH and the coenzyme NADH, ACAC is decomposed into 3HB and NAD + .
  • Enzymes HBDH and coenzymes NADH and GA are mixed to immobilize the first and second enzyme layers.
  • the mixture is coated on the first enzyme layer.
  • step S370 the second enzyme layer is dried. Dry sufficiently for 30 minutes or more at a temperature of 35°C to 40°C.
  • Bio-electronic sensor that measures sugar using urine
  • each chip On each chip, three Pt electrodes are fabricated on a 6-inch quartz wafer using a common semiconductor manufacturing process. Each chip consists of a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode. Each chip is connected by wire wires on a custom PCB board.
  • the surface of the Pt electrode is washed with acetone solvent, isopropanol, and ethyl alcohol to remove dirt, organic substances, and inorganic substances present on the surface before the enzyme layer is coated. After washing the surface of the Pt electrode, the enzyme layer is immobilized on the surface.
  • the chip is washed with oxygen plasma to prepare a Pt-GOx (Pt-glucose oxidase) electrode, and then treated with GA and bovine serum albumin (BSA) to form cross-links with enzymes.
  • Pt-GOx Pt-glucose oxidase
  • BSA bovine serum albumin
  • Glucose oxidase 5mg/mL in PBS
  • GA solution 0.5% GA in DW and 56.25mg/mL BSA in PBS
  • the mixed glucose oxidase and GA solution was coated on the Pt electrode.
  • the coated first enzyme layer crystallizes within 5 minutes. Leave it to stand for 30 minutes or more in an oven at 35°C to 40°C.
  • ascorbate oxidase (1 mg/mL in PBS) was dissolved in a GA solution (0.5% GA in DW and 56.25 mg/mL BSA in PBS). Let it. The mixed ascorbate oxidase and GA solution were coated on the Pt electrode. The coated second enzyme layer crystallizes within 5 minutes. Leave it to stand for 30 minutes or more in an oven at 35°C to 40°C.
  • FIG. 6 is a diagram showing a result of measuring glucose by concentration using a bio-electronic sensor measuring sugar using urine of the present invention.
  • FIG. 7 shows a diagram showing the result of the effect of an interfering substance of an electrode using a bioelectronic sensor measuring sugar using urine of the present invention.
  • the current values of the mixture of the interfering substance and the glucose concentration of 250 mg/dl and the Pt-GOx-AOx electrodes of glucose 250 mg/dl are similar. This means that the Pt-GOx-AOx electrode blocks interfering substances and only measures the concentration of glucose.
  • Each chip consists of a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode. Each chip is connected by wire wires on a custom PCB board.
  • the surface of the electrode is washed with acetone solvent, isopropanol and ethyl alcohol to remove dirt, organic and inorganic substances present on the surface before the enzyme layer is coated. After washing the electrode surface, the enzyme layer is immobilized on the surface.
  • a mixed solution of the enzyme HBDH and the coenzyme NAD is prepared to prepare a mixed layer of the enzyme HBDH and the coenzyme NAD on the electrode.
  • NAD was prepared at a concentration of 0.32mg/mL in PBS and diluted to the same volume.
  • An enzyme mixture solution was prepared by mixing the same volume of BSA (5.7mg/mL in PBS) with the diluted solution.
  • the enzyme mixture solution and GA solution (0.5% GA in DW) were diluted to the same volume and coated on the Pt electrode.
  • the coated first enzyme layer crystallizes within 5 minutes. Leave it to stand for 30 minutes or more in an oven at 35°C to 40°C.
  • a mixed solution of the enzyme HBDH and the coenzyme NADH was prepared to prepare a mixed layer of the enzyme HBDH and the coenzyme NADH as the second enzyme layer on the prepared Pt-NAD+HBDH electrode.
  • HBDH 0.02mg/mL in PBS and NADH 0.32mg/mL in PBS were prepared and diluted to the same volume.
  • An enzyme mixture solution was prepared by mixing the same volume of BSA (5.7mg/mL in PBS) with the diluted solution.
  • the enzyme mixture solution and GA solution (0.5% GA in DW) are diluted to the same volume and coated on the Pt-NAD+HBDH electrode.
  • the coated second enzyme layer crystallizes within 5 minutes. Let stand for 30 minutes or longer in an oven at 35°C-40°C
  • FIG. 8 is a view showing the result of the amount of change in the current flow according to the ACAC concentration using the bioelectronic sensor for measuring ketone bodies using urine of the present invention.
  • the current value increases for each concentration, and it can be seen that the %CV value is in the range of 1% to 6% as a result of each measurement three times according to the concentration.
  • ACAC concentration 0mg/dl, 6.25mg/dl, 12.5mg on Pt-NAD+HBDH-NADH+HBDH electrode designed to compare the correlation between ACAC concentration and current measured in Pt-NAD+HBDH-NADH+HBDH electrode
  • the concentration of each ACAC sample was compared using the formula.
  • FIG. 9 is a view showing the result of comparing the correlation between the current and ACAC concentration measured using the bio-electronic sensor for measuring ketone bodies using urine of the present invention.
  • a value of the current-concentration ratio R2 of the converted Pt-NAD+HBDH-NADH+HBDH electrode can be very close to 1. This means that the Pt-NAD+HBDH-NADH+HBDH electrode blocks interfering substances and only measures the concentration of H + .

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Abstract

기판; 상기 기판 상에 배치된 전극부; 및 상기 전극부에 전류 및 전압을 인가하는 연결부를 포함하고, 상기 전극부는, 상기 기판 상에 부착된 금속 전극을 포함하는 전극 층; 상기 전극층 상에 고정된 제1효소 층; 및 상기 제1효소 층 상에 고정된 제2효소 층을 포함하는 소변을 이용한 바이오 전자센서와 이를 포함하는 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서 및 소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서에 관한 것이다.

Description

소변을 이용하여 검출 가능한 바이오 전자센서
본 발명은 혈액 채취의 불편함을 해소하기 위해 소변을 이용하여 전기화학분석방법을 통해 정량분석이 가능한 소변을 이용한 바이오 전자센서, 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서 및 소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서에 관한 것이다.
당뇨병은 인슐린 작용 이상 등으로 인해 혈당이 높은 것을 특징으로 하는 질환으로서, 최근 우리나라의 당뇨병 환자는 증가 추세에 있으며, 만성질환 중 하나이다. 당뇨병 환자는 완치가 어려울 뿐 아니라 급성 합병증 또는 인체 조직의 손상과 관련된 합병증을 유발하는 대표적인 질환이다. 당뇨병 환자들은 여러 합병증을 예방하기 위해서 꾸준한 혈당관리가 필요하며, 포도당의 양을 주기적으로 측정해야 한다. 특히, 저혈당이 발생하면 심한 경우 쇼크나 의식 저하 등으로 인해 심혈관 질환이 발생하며, 이로 인해 사망까지 이를 수 있다. 이에 일상생활에서도 상당한 주의가 필요하다.
혈당정보를 나타내 주는 혈당기는 크게 침습적 방식과 비색방식으로 분류할 수 있다. 침습적 방식은 혈당기기, 혈액을 올려놓는 검사지, 혈액을 채취할 때 쓰이는 채혈기로 구성되어 있으며 일반적으로 손가락 끝 모세혈관에서 적은 양의 혈액을 채취하여 검사지에 혈액을 묻혀 측정을 하는 방법이다. 검사지는 혈액 내 혈당과 반응하는 효소를 두어 전기화학적 반응을 일으켜서 혈당을 검출하는 방식이다. 비색 방식은 뇨 스트립을 이용한 방식으로 소변을 소변 스트립지에 묻히고 나서 변화하는 색깔로 혈당을 알 수 있다.
또한 고혈당증, 소변 내 케톤 존재, 대사성 산증의 원인과 함께 주로 인슐린의 결핍과 글루카곤 수치의 증가로 나타나는 급성 합병증으로써 당뇨성 케톤산증을 가진 환자가 증가 추세에 있다. 뇨 성분 중 케톤체는 포도당을 에너지로 사용하지 못하거나 체내 포도당 농도가 극단적으로 감소할 때, 지방을 분해하여 포도당을 대체하는 연료로서 간과 적혈구 이외의 세포에서 사용된다. 본 발명을 통한 소변을 이용한 바이오 전자센서를 통하여 체내 지방연소 정도를 확인함으로써 포도당 흡수 및 당뇨 가능성에 대한 관리를 하고, 당뇨질환자는 포도당 흡수 불균형에 따른 지방 사용으로 인한 케톤 량을 확인할 수 있다. 즉, 다양한 질병이나 임상 상태에서 보고되고 있는 케톤에 대한 정량 검사를 수행하기 위한 전기화학분석법을 통한 바이오 전자센서를 제조할 수 있다.
종래의 혈당 기기 중 침습적 방식의 혈당기는 오래 사용할 수 있으나, 검사지와 채혈기는 일회용이므로 당뇨병 환자들이 혈당관리를 하는데 경제적으로 어려움을 겪고 있다. 또한 이때 사용되는 채혈기는 작은 란셋(Lancet)과 같은 도구로 신체의 일부에서 혈액을 채취하여 혈당을 측정한다. 채혈은 환자의 고통이 수바노디고 의학적으로도 감염의 위험이 있다. 또한 뇨 스트립을 이용한 비색방식은 전처리, 발색시간, 소변의 양 및 반응 시간 등의 부정확성으로 인하여 색의 변화를 정성적으로 나타내며 정량적으로 나타내기 어렵다.
따라서, 채혈의 고통 없이 소변을 이용하여 뇨당 및 케톤체를 측정하고, 뇨 스트립의 부정확성 및 정량적인 분석이 어렵다는 것을 보완하기 위해서 전기화학분석방법을 이용하여 뇨당 및 케톤체를 정량적으로 측정할 수 있는 바이오 전자센서에 관한 연구가 필요하다.
본 발명의 일 목적은 소변을 이용한 바이오 전자센서를 제공하는 것이다. 보다 자세하게는, 효소을 이용한 전극부를 생성하여 전기화학적 방식에 의한 정량 측정할 수 있는 센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 소변을 이용하여 당을 측정할 수 있는 바이오 전자센서를 제공하는 것이다. 보다 자세하게는 소변의 포도당 성분 정량 측정에 관한 것이며, 소변 속 포도당 성분 이외에 포함되어 있는 방해물질에 대한 영향 없이 포도당을 다회 측정하는 센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 소변을 이용하여 케톤체를 측정할 수 있는 바이오 전자센서를 제공하는 것이다. 보다 자세하게는, 소변 내 케톤체의 정량 측정에 관한 것이며, 소변 속 케톤체 성분 이외에 포함되어 있는 방해물질에 대한 영향 없이 케톤체를 하나의 센서로 이용하여 다회 측정하는 센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 소변을 이용한 바이오 전자센서는 기판; 상기 기판 상에 배치된 전극부; 및 상기 전극부에 전류 및 전압을 인가하는 연결부를 포함하고, 상기 전극부는, 상기 기판 상에 부착된 금속 전극을 포함하는 전극 층; 상기 전극층 상에 고정된 제1효소 층; 및 상기 제1효소 층 상에 고정된 제2효소 층을 포함하는 구조로 이루어진다.
상기 기판은 PCB(Printed circuit board)이다.
상기 금속 전극은 Working electrode, Counter electrode, Reference electrode로 구성된다.
상기 금속 전극은 백금(Pt), 금(Au), 카드뮴(Cd), 은(Ag), 납(Pb), 니켈(Ni)을 포함한다.
상기 소변을 이용한 바이오 전자센서는 전기화학적 방식에 의해 측정가능하다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서는, 기판; 상기 기판 상에 배치된 전극부; 및 상기 전극부에 전류 및 전압을 인가하는 연결부를 포함하고, 상기 전극부는, 상기 기판 상에 부착된 금속 전극을 포함하는 전극 층; 상기 전극층 상에 고정된 제1효소 층; 및 상기 제1효소 층 상에 고정된 제2효소 층을 포함하고, 상기 제1효소 층은 글루코스 산화효소를 포함하며, 상기 제2효소 층은 아스코르베이트 산화효소를 포함하는 구조로 이루어진다.
상기 기판은 PCB이다.
상기 금속 전극은 Working electrode, Counter electrode, Reference electrode로 구성된다.,
상기 금속 전극은 백금(Pt), 금(Au), 카드뮴(Cd), 은(Ag), 납(Pb), 니켈(Ni)을 포함한다.
상기 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서는 전기화학적 방식으로 측정가능하다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법은, 기판을 준비하는 단계; 금속 전극을 준비하는 단계; 상기 기판 상에 금속 전극을 부착하는 단계; 상기 금속 전극 상에 제1효소 층을 고정하는 단계; 상기 제1효소 층을 건조하는 단계; 상기 제1효소 층 위에 제2효소 층을 고정하는 단계; 및 상기 제2효소 층을 건조하는 단계를 포함하고, 상기 제1효소 층은 글루코스 산화효소를 포함하며, 상기 제2효소 층은 아스코르베이트 산화효소를 포함한다.
상기 기판은 PCB이다.,
상기 금속 전극은 Working electrode, Counter electrode, Reference electrode로 구성된다
상기 금속 전극은 백금(Pt), 금(Au), 카드뮴(Cd), 은(Ag), 납(Pb), 니켈(Ni)을 포함한다.
상기 금속 전극 상에 제1효소 층을 고정하는 단계는, 글루코스 산화효소와 GA(Glutaldehyde)를 포함하는 혼합용액을 상기 금속 전극 상에 코팅하는 단계를 포함한다.
상기 제1효소 층을 건조하는 단계는, 35℃ 내지 40℃의 온도에서 30분 이상의 건조시간을 포함하는 단계를 포함한다.
상기 금속 전극 상에 제2효소 층을 고정하는 단계는, 아스코르베이트 산화효소와 GA를 포함하는 혼합 용액을 상기 제1효소 층 상에 코팅하는 단계를 포함한다.
상기 제2효소 층을 건조하는 단계는, 35℃ 내지 40℃의 온도에서 30분 이상의 건조시간을 포함하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서는, 기판; 상기 기판 상에 배치된 전극부; 및 상기 전극부에 전류 및 전압을 인가하는 연결부를 포함하고, 상기 전극부는, 상기 기판 상에 부착된 금속 전극을 포함하는 전극 층; 상기 전극층 상에 고정된 제1효소 층; 및 상기 제1효소 층 상에 고정된 제2효소 층을 포함하고, 상기 제1효소 층은 효소 HBDH(D-beta-hydroxybutyrate dehydrogenase) 및 보조효소 NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)를 포함하며, 상기 제2효소 층은 효소 HBDH 및 보조효소 NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)를 포함한다.
상기 기판은 PCB이다.
상기 금속 전극은 Working electrode, Counter electrode, Reference electrode로 구성된다.
상기 금속 전극은 백금(Pt), 금(Au), 카드뮴(Cd), 은(Ag), 납(Pb), 니켈(Ni)을 포함한다,
상기 소변을 이용하여 케톤체을 측정하는 바이오 전자센서는 전기화학적 방식으로 측정가능하다,
본 발명의 다른 실시예에 따른 소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법은, 기판을 준비하는 단계; 금속 전극을 준비하는 단계; 상기 기판 상에 금속 전극을 부착하는 단계; 상기 금속 전극 상에 제1효소 층을 고정하는 단계; 상기 제1효소 층을 건조하는 단계; 상기 제1효소 층 상에 제2효소 층을 고정하는 단계; 및 상기 제2효소 층을 건조하는 단계를 포함하고, 상기 제1효소 층은 효소 HBDH 및 보조효소 NAD를 포함하며, 상기 제2효소 층은 효소 HBDH 및 보조효소 NADH를 포함한다.
상기 기판은 PCB이다.
상기 금속 전극은 Working electrode, Counter electrode, Reference electrode로 구성된다.
상기 금속 전극은 백금(Pt), 금(Au), 카드뮴(Cd), 은(Ag), 납(Pb), 니켈(Ni)을 포함한다.
상기 제1효소 층을 고정하는 단계는, 효소 HBDH와 보조효소 NAD와 GA를 포함하는 혼합용액을 상기 금속 전극 상에 코팅하는 단계를 포함한다.
상기 제1효소 층을 건조하는 단계는, 35℃ 내지 40℃의 온도에서 30분 이상의 건조시간을 포함하는 단계를 포함한다.
상기 제2효소 층을 고정하는 단계는, 효소 HBDH와 보조효소 NADH와 GA를 포함하는 혼합용액을 상기 제1효소 층 상에 코팅하는 단계를 포함한다.
상기 제2효소 층을 건조하는 단계는, 35℃ 내지 40℃의 온도에서 30분 이상의 건조시간을 포함하는 단계를 포함한다.
본 발명은 소변을 이용한 바이오 전자센서를 제공함으로써, 종래 기술 대비 채혈의 고통 없이 소변을 이용하여 간단하게 측정가능하며 소변 속 포도당, 케톤체 성분 이외에 포함되어 있는 방해물질에 대한 영향 없이 다회 측정 가능하다.
또한 전기화학적 분석 방법을 통한 정량 분석이 가능함으로써 종래 기술 대비 정확한 측정이 가능하다.
도 1은 본 발명의 소변을 이용한 바이오 전자센서의 구조를 도식화한 도면이다.
도 2는 본 발명의 소변을 이용한 바이오 전자센서의 전극부의 금속 전극을 도식화한 도면이다.
도 3은 본 발명의 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서의 전극부의 구조를 도식화한 도면이다.
도 4는 본 발명의 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서 및 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서를 제작하는 방법의 순서도이다.
도 5는 본 발명의 소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서의 전극부의 구조를 도식화한 도면이다.
도 6은 본 발명의 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서를 이용하여 글루코스를 농도별로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서를 이용하여 전극의 방해 물질의 영향의 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서를 이용하여 ACAC(Acetoacetate) 농도에 따른 전류 흐름의 변화량의 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서를 이용하여 측정된 전류와 ACAC 농도의 상관성을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 소변을 이용한 바이오 전자센서는, 기판; 상기 기판 상에 배치된 전극부; 및 상기 전극부에 전류 및 전압을 인가하는 연결부를 포함하고, 상기 전극부는, 상기 기판 상에 부착된 금속 전극을 포함하는 전극 층; 상기 전극층 상에 고정된 제1효소 층; 및 상기 제1효소 층 상에 고정된 제2효소 층을 포함한다.
도 1은 본 발명의 소변을 이용한 바이오 전자센서의 구조를 도식화한 도면을 도시한다.
도 1에 따르면, 소변을 이용한 바이오 전자센서의 기판은 PCB이며 전류를 흘려줄 수 있는 또 다른 기판을 사용해도 무방하다.
도 2는 본 발명의 소변을 이용한 바이오 전자센서의 전극부의 금속 전극을 도식화한 도면을 도시한다.
도 2에 따르면, 금속 전극은 Working electrode, Counter electrode, Reference electrode로 구성되며 상기 금속 전극은 백금(Pt), 금(Au), 카드뮴(Cd), 은(Ag), 납(Pb), 니켈(Ni)을 포함하며 일반적으로 전류를 흐르게 하고 분자들과의 전자교환을 주고 받는 것이 가능한 재질이 사용가능하며, 백금(Pt)이 바람직하다.
상기 소변을 이용한 바이오 전자센서는 전기화학적 방식으로 측정가능하다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서는, 기판; 상기 기판 상에 배치된 전극부; 및 상기 전극부에 전류 및 전압을 인가하는 연결부를 포함하고, 상기 전극부는, 상기 기판 상에 부착된 금속 전극을 포함하는 전극 층; 상기 전극층 상에 고정된 제1효소 층; 및 상기 제1효소 층 상에 고정된 제2효소 층을 포함하고, 상기 제1효소 층은 글루코스 산화효소를 포함하며, 상기 제2효소 층은 아스코르베이트 산화효소를 포함한다.
도 3은 본 발명의 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서의 전극부의 구조를 도식화한 도면을 도시한다.
도 3에 따르면, 기판은 PCB이며 전류를 흘려줄 수 있는 또 다른 기판을 사용해도 무방하다.
금속 전극은 Working electrode, Counter electrode, Reference electrode로 구성되며 상기 금속 전극은 백금(Pt), 금(Au), 카드뮴(Cd), 은(Ag), 납(Pb), 니켈(Ni)을 포함하며 일반적으로 전류를 흐르게 하고 분자들과의 전자교환을 주고 받는 것이 가능한 재질이 사용가능하며, 백금(Pt)이 바람직하다.
전극부에는 전극 층 상에 2층의 효소 멀티레이어를 생성하여 소변에서 방해물질의 방해를 받지 않고 소변을 이용하여 당을 측정할 수 있다.
제1효소 층에는 소변에 있는 뇨당인 글루코스를 측정하기 위해 일 실시예로서 글루코스 산화효소를 이용하였다. 소변 속 글루코스는 글루코스 산화효소와 반응하여 글루코닉 산(gluconic acid)이 되고 전자를 방출하게 된다. 상기 방출된 전자를 전극으로 측정하여 글루코스를 검출할 수 있다.
상기 반응은 하기 반응식 1로 표현될 수 있다,
[반응식 1]
Figure PCTKR2019006304-appb-I000001
제2효소 층에는 소변 속에 있는 대표적인 방해 물질인 요산(uric acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 아세트아미노펜(acetaminophen) 등이 있는데, 이를 걸러주기 위한 층으로 일 실시예로서 아스코르베이트 산화효소를 이용하였다. 특히 아스코르브산은 아스코르베이트 산화효소에 의해 디하이드로하스코르브 산(dehydroascorbic acid)로 산화되는데 이는 전극 표면에서 산화될 수 없고 전극 활성화가 없어지게 되어 글루코스 반응을 방해하지 않게 된다.
간단한 구조의 전극 상에 글루코스 산화효소 층, 상기 글루코스 산화효소층 상에 아스코르베이트 산화효소 층을 제작하여 소변을 이용하여 당을 측정가능하며 방해물질에서는 반응하지 않는 전극을 제작할 수 있다.
상기 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서는 전기화학적 방식으로 측정가능하다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법은, 기판을 준비하는 단계; 금속 전극을 준비하는 단계; 상기 기판 상에 금속 전극을 부착하는 단계; 상기 금속 전극 상에 제1효소 층을 고정하는 단계; 상기 제1효소 층을 건조하는 단계; 상기 제1효소 층 상에 제2효소 층을 고정하는 단계; 및 상기 제2효소 층을 건조하는 단계를 포함하고, 상기 제1효소 층은 글루코스 산화효소를 포함하며, 상기 제2효소 층은 아스코르베이트 산화효소를 포함한다.
도 4는 본 발명의 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서 및 소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서를 제작하는 방법의 순서도를 도시한다,
도 4에 따르면, 기판을 준비하는 단계(S310), 금속 전극을 준비하는 단계(S320), 상기 기판 상에 금속 전극을 부착하는 단계(S330), 상기 금속 전극 상에 제1효소 층을 고정하는 단계(S340), 상기 제1효소 층을 건조하는 단계(S350), 상기 제1효소 층 상에 제2효소 층을 고정하는 단계(S360), 및 상기 제2효소 층을 건조하는 단계(S370)를 포함한다.
S 310 단계에서는 기판을 준비한다. 이때 기판은 PCB이며 전류를 흘려줄 수 있는 또 다른 기판을 사용해도 무방하다.
S 320 단계에서는 금속 전극을 준비한다. 금속 전극은 Working electrode, Counter electrode, Reference electrode로 구성된다. Working electrode는 원형이며 그 지름이 1.3mm 정도이며 각각 Counter electrode, Reference electrode가 Working electrode를 감싸고 있다. Working electrode, Counter electrode, Reference electrode의 모양과 크기에 대한 제한은 없다.
상기 금속 전극은 백금(Pt), 금(Au), 카드뮴(Cd), 은(Ag), 납(Pb), 니켈(Ni)을 포함하며 일반적으로 전류를 흐르게 하고 분자들과의 전자교환을 주고 받는 것이 가능한 재질이 사용가능하며, 백금(Pt)이 바람직하다.
한편, S 310 단계 및 S 320 단계는 서로 선후 관계가 무관하며 동시에 이루어져도 무방하다.
S 330 단계에서는 상기 기판 상에 금속 전극을 부착한다.
S 340 단계에서는 상기 금속 전극 상에 제1효소 층을 고정한다. 제1효소 층은 소변에 있는 뇨당인 글루코스를 측정하기 위한 일 실시예로서 글루코스 산화효소를 이용하였다. 소변 속 글루코스는 글루코스 산화효소와 반응하여 글루코닉 산이 되고 전자를 방출하게 된다. 상기 방출된 전자를 전극으로 측정하여 글루코스를 검출할 수 있다.
금속 전극과 제1효소 층을 고정시키기 위해 글루코스 산화효소와 GA를 혼합하였다. 상기 혼합물을 금속 전극 상에 코팅한다.
S 350 단계에서는 상기 제1효소 층을 건조한다. 35℃ 내지 40℃의 온도에서 30분 이상 충분히 건조한다.
S 360 단계에서는 제1효소 층 상에 제2효소 층을 고정한다. 제2효소 층은 소변 속에 있는 대표적인 방해 물질인 요산, 아스코르브산, 아세트아미노펜 등을 걸러주기 위한 층으로 일 실시예로서 아스코르베이트 산화효소를 이용한다. 특히 아스코르브산은 아스코르베이트 산화효소에 의해 디하이드로하스코르브 산으로 산화되는데 이는 전극 표면에서 산화될 수 없고 전극 활성화가 없어지게 되어 글루코스 반응을 방해하지 않게 된다.
제1효소 층과 제2효소 층을 고정시키기 위해 아스코르베이트 산화효소와 GA를 혼합하였다. 상기 혼합물을 제1효소 층 상에 코팅한다.
S 370 단계에서는 상기 제2효소 층을 건조한다. 35℃ 내지 40℃의 온도에서 30분 이상 충분히 건조한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서는, 기판; 상기 기판 상에 배치된 전극부; 및 상기 전극부에 전류 및 전압을 인가하는 연결부를 포함하고, 상기 전극부는, 상기 기판 상에 부착된 금속 전극을 포함하는 전극 층; 상기 전극층 상에 고정된 제1효소 층; 및 상기 제1효소 층 상에 고정된 제2효소 층을 포함하고, 상기 제1효소 층은 효소 HBDH 및 보조효소 NAD를 포함하며, 상기 제2효소 층은 효소 HBDH 및 보조효소 NADH를 포함한다.
도 5는 본 발명의 소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서의 전극부의 구조를 도식화한 도면을 도시한다.
도 5에 따르면, 기판은 PCB이며 전류를 흘려줄 수 있는 또 다른 기판을 사용해도 무방하다.
금속 전극은 Working electrode, Counter electrode, Reference electrode로 구성되며 상기 금속 전극은 백금(Pt), 금(Au), 카드뮴(Cd), 은(Ag), 납(Pb), 니켈(Ni)을 포함하며 일반적으로 전류를 흐르게 하고 분자들과의 전자교환을 주고 받는 것이 가능한 재질이 사용가능하며, 백금(Pt)이 바람직하다.
전극부에는 전극 층 위에 2층의 효소 멀티레이어를 생성하여 소변에서 방해물질의 방해를 받지 않고 소변을 이용하여 당을 측정할 수 있다.
배뇨 속의 케톤체는 ACAC의 형태로 존재한다. 소변이 먼저 닿게 되는 제2효소 층에서 ACAC는 보조효소 NADH와 효소 HBDH와 결합하여 3HB와 NAD+를 생성한다. 상기 반응에 대한 반응식을 하기 반응식 2로 나타내었다.
[반응식 2]
Figure PCTKR2019006304-appb-I000002
제1효소 층은 상기에서 만들어진 3HB와 NAD+와 효소 HBDH가 결합하여 다시 ACAC를 형성하고 이에 산물인 H+가 형성된다. 형성된 H+를 전극에서 측정할 수 있다. 상기 반응에 대한 반응식을 하기 반응식 3로 나타내었다.
[반응식 3]
Figure PCTKR2019006304-appb-I000003
간단한 구조의 전극 상에 효소 HBDH와 보조효소 NAD 층, 상기 효소 HBDH와 보조효소 NAD 층 상에 효소 HBDH와 보조효소 NADH 층을 제작하여 소변을 이용하여 케톤체를 측정가능하며 방해물질에서는 반응하지 않는 전극을 제작할 수 있다.
상기 소변을 이용하여 케톤체을 측정하는 바이오 전자센서는 전기화학적 방식으로 측정가능하다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법은, 기판을 준비하는 단계; 금속 전극을 준비하는 단계; 상기 기판 상에 금속 전극을 부착하는 단계; 상기 금속 전극 상에 제1효소 층을 고정하는 단계; 상기 제1효소 층을 건조하는 단계; 상기 제1효소 층 상에 제2효소 층을 고정하는 단계; 및 상기 제2효소 층을 건조하는 단계를 포함하고, 상기 제1효소 층은 효소 HBDH 및 보조효소 NAD를 포함하며, 상기 제2효소 층은 효소 HBDH 및 보조효소 NADH를 포함한다.
도 4는 본 발명의 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서 및 소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서를 제작하는 방법의 순서도를 도시한다,
도 4에 따르면, 기판을 준비하는 단계(S310), 금속 전극을 준비하는 단계(S320), 상기 기판 상에 금속 전극을 부착하는 단계(S330), 상기 금속 전극 상에 제1효소 층을 고정하는 단계(S340), 상기 제1효소 층을 건조하는 단계(S350), 상기 제1효소 층 상에 제2효소 층을 고정하는 단계(S360), 및 상기 제2효소 층을 건조하는 단계(S370)를 포함한다.
도 4에 따르면, 기판을 준비하는 단계(S310), 금속 전극을 준비하는 단계(S320), 상기 기판 상에 금속 전극을 부착하는 단계(S330), 상기 금속 전극 상에 제1효소 층을 고정하는 단계(S340), 상기 제1효소 층을 건조하는 단계(S350), 상기 제1효소 층 상에 제2효소 층을 고정하는 단계(S360), 및 상기 제2효소 층을 건조하는 단계(S370)를 포함한다.
S 310 단계에서는 기판을 준비한다. 이때 기판은 PCB이며 전류를 흘려줄 수 있는 또 다른 기판을 사용해도 무방하다.
S 320 단계에서는 금속 전극을 준비한다. 금속 전극은 Working electrode, Counter electrode, Reference electrode로 구성된다. Working electrode는 원형이며 그 지름이 1.3mm 정도이며 각각 Counter electrode, Reference electrode가 Working electrode를 감싸고 있다. Working electrode, Counter electrode, Reference electrode의 모양과 크기에 대한 제한은 없다.
상기 금속 전극은 백금(Pt), 금(Au), 카드뮴(Cd), 은(Ag), 납(Pb), 니켈(Ni)을 포함하며 일반적으로 전류를 흐르게 하고 분자들과의 전자교환을 주고 받는 것이 가능한 재질이 사용가능하며, 백금(Pt)이 바람직하다.
한편, S 310 단계 및 S 320 단계는 서로 선후 관계가 무관하며 동시에 이루어져도 무방하다.
S 330 단계에서는 상기 기판 상에 금속 전극을 부착한다.
S 340 단계에서는 상기 금속 전극 상에 제1효소 층을 고정한다. 제1효소 층은 소변에 있는 케톤체인 ACAC를 측정하기 위한 일 실시예로서 효소 HBDH와 보조효소 NAD를 이용하였다. 제 2효소 층에서 ACAC는 3HD와 NAD+로 분해되고 제1효소 층과 반응하여 ACAC와 이의 산물인 H+를 형성하게 된다. 상기 H+를 전극으로 측정하여 케톤체를 정량 측정할 수 있다.
금속 전극과 제1효소 층을 고정시키기 위해 효소 HBDH와 보조효소 NAD와 GA를 혼합한다.
상기 혼합물을 금속 전극 상에 코팅한다.
S 350 단계에서는 상기 제1효소 층을 건조한다. 35℃ 내지 40℃의 온도에서 30분 이상 충분히 건조한다.
S 360 단계에서는 제1효소 층 상에 제2효소 층을 고정한다. 제2효소 층은 소변에 있는 케톤체인 ACAC를 분해하는 층으로 일 실시예로서 효소 HBDH와 보조효소 NADH를 이용하였다. ACAC와 효소 HBDH와 보조효소 NADH가 만나면 ACAC는 3HB와 NAD+로 분해된다.
제1효소 층과 제2효소 층을 고정시키기 위해 효소 HBDH와 보조효소 NADH와 GA를 혼합한다.
상기 혼합물을 제1효소 층 상에 코팅한다.
S 370 단계에서는 상기 제2효소 층을 건조한다. 35℃ 내지 40℃의 온도에서 30분 이상 충분히 건조한다.
실시 예1
소변을 이용한 당을 측정하는 바이오 전자센서
각각의 칩 상에 세 개의 Pt 전극이 보편적인 반도체 제조공정이 이용된 6인치 쿼츠 웨이퍼 상에 제조된다. 각각의 칩은 Working electrode, counter electrode, reference electrode로 구성된다. 각각의 칩은 맞춤형 PCB기판 상에 와이어 전선에 의해 연결된다. Pt전극의 표면은 효소 층이 코팅되기 전에 표면에 존재하는 오물, 유기물질, 및 무기물질을 제거하기 위해 아세톤 용매, 이소프로판올 및 에틸 알콜로 세척한다. Pt전극 표면을 세척한 후 표면에 효소 층을 고정화 한다.
먼저 Pt-GOx(Pt-glucose oxidase) 전극을 제조하기 위해 상기 칩을 산소 플라즈마로 세척하고 효소와 가교결합을 형성시키기 위해 GA와 BSA(bovine serum albumin)으로 처리한다. 글루코스 산화효소(5mg/mL in PBS)를 GA 용액(0.5% GA in DW 그리고 56.25mg/mL BSA in PBS)에 용해시킨다. 혼합된 글루코스 산화효소와 GA 용액을 Pt전극 상에 코팅한다. 코팅된 제1 효소 층은 5분이내에 결정화된다. 35℃ 내지 40℃의 오븐에서 30분 이상 정치 시킨다.
상기 제조된 Pt-GOx 전극 상에 AOx(ascorbate oxidase) 층을 제조하기 위해 아스코베이트 산화효소(1mg/mL in PBS)를 GA 용액(0.5% GA in DW 그리고 56.25mg/mL BSA in PBS)에 용해시킨다. 혼합된 아스코베이트 산화효소와 GA 용액을 Pt전극 상에 코팅한다. 코팅된 제2 효소 층은 5분이내에 결정화된다. 35℃ 내지 40℃의 오븐에서 30분 이상 정치 시킨다.
글루코스 농도에 따른 전류 측정
*상기 제조된 Pt-GOx-AOx 전극과 글루코스의 농도에 따른 반응 여부를 알아보기 위해 각 글루코스 농도 0mg/dl, 31.25mg/dl, 62.5mg/dl, 125mg/dl, 250mg/dl, 500mg/dl, 1000mg/dl, 2000mg/dl에서 포텐셜을 -0.2V 내지 -0.8V로 인가하여 cyclic voltammetry로 분석하였다.
도 6은 본 발명의 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서를 이용하여 글루코스를 농도별로 측정한 결과를 나타낸 도면을 도시한다.
도 6에 따르면, 모든 글루코스 농도에 따라 전류값이 증가함을 확인함으로써 효소멀티층이 글루코스 농도에 따라 반응함을 알 수 있다. 또한 글루코스 농도 250mg/dl에서 10회 반복 테스트 한 결과 SD(standard deviation)는 3.2×10-7이며, CV(coefficient of variation)은 4%이다.
Pt-GOx-AOx 전극의 방해물질의 영향도 측정
방해물질(요산, 아스코르브산, 아세트아미노펜)을 이용하여 포텐셜을 -0.2V 내지 -0.8V로 인가하여 cyclic viltammetry로 분석하였다.
도 7은 본 발명의 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서를 이용하여 전극의 방해 물질의 영향의 결과를 나타낸 도면을 도시한다.
도 7에 따르면, 방해물질과 글루코스 농도 250mg/dl의 혼합물과 글루코스 250mg/dl의 각각 Pt-GOx-AOx 전극의 전류값은 유사하다. 이는 Pt-GOx-AOx 전극은 방해물질을 차단하며 글루코스의 농도의 값만 측정한다는 것을 의미한다.
실시 예2
소변을 이용한 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서
각각의 칩 상에 세 개의 백금 전극이 보편적인 반도체 제조공정이 이용된 6인치 쿼츠 웨이퍼 상에 제조된다. 각각의 칩은 Working electrode, counter electrode, reference electrode로 구성된다. 각각의 칩은 맞춤형 PCB기판 상에 와이어 전선에 의해 연결된다. 전극의 표면은 효소 층이 코팅되기 전에 표면에 존재하는 오물, 유기물질, 및 무기물질을 제거하기 위해 아세톤 용매, 이소프로판올 및 에틸 알콜로 세척한다. 전극 표면을 세척한 후 표면에 효소 층을 고정화 한다.
먼저 전극 상에 제1효소 층인 효소 HBDH와 보조효소 NAD의 혼합층을 제조하기 위해 효소 HBDH와 보조효소 NAD의 혼합용액을 제조한다. HBDH 0.02mg/mL in PBS, NAD 0.32mg/mL in PBS의 농도로 제조하여 동일한 부피로 희석시킨다. 상기 희석액과 동일한 부피의 BSA(5.7mg/mL in PBS)를 혼합하여 효소혼합용액을 제조한다. 상기 효소혼합용액과 GA 용액(0.5% GA in DW)을 동일한 부피로 희석후 Pt전극 상에 코팅한다. 코팅된 제1효소 층은 5분이내에 결정화된다. 35℃ 내지 40℃의 오븐에서 30분 이상 정치 시킨다.
상기 제조된 Pt-NAD+HBDH 전극 상에 제2 효소 층인 효소 HBDH와 보조효소 NADH의 혼합층을 제조하기 위해 효소 HBDH와 보조효소 NADH의 혼합용액을 제조한다. HBDH 0.02mg/mL in PBS, NADH 0.32mg/mL in PBS의 농도로 제조하여 동일한 부피로 희석시킨다. 상기 희석액과 동일한 부피의 BSA(5.7mg/mL in PBS)를 혼합하여 효소혼합용액을 제조한다. 상기 효소혼합용액과 GA 용액(0.5% GA in DW)을 동일한 부피로 희석후 Pt-NAD+HBDH 전극 상에 코팅한다. 코팅된 제2효소 층은 5분이내에 결정화된다. 35℃ 내지 40℃의 오븐에서 30분 이상 정치 시킨다
ACAC 농도에 따른 전류 측정
Pt-NAD+HBDH-NADH+HBDH 전극의 재현성을 평가하기 위해 ACAC의 농도 0mg/dl, 6.25mg/dl, 12.5mg/dl, 25mg/dl, 50mg/dl, 100mg/dl을 80μL씩 도포 후 각 농도별 3회 cyclic voltammetry를 측정하였다. 생성물인 3HB의 검출 포텐셜인 0.073V에서 각각의 전류 값을 비교한다.
도 8은 본 발명의 소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서를 이용하여 ACAC 농도에 따른 전류 흐름의 변화량의 결과를 나타낸 도면을 도시한다.
도 8에 따르면, 전류값은 각각의 농도별로 증가함을 확인할 수 있으며, 농도에 따른 각 3회 측정 결과 %CV값이 1% 내지 6%대인 것을 확인할 수 있다.
Pt-NAD+HBDH-NADH+HBDH 전극으로 측정된 전류와 ACAC의 상관성 비교
Pt-NAD+HBDH-NADH+HBDH 전극에서 측정된 전류와 ACAC 농도의 상관성을 비교하기 위해 제작된 Pt-NAD+HBDH-NADH+HBDH 전극 상에 ACAC 농도 0mg/dl, 6.25mg/dl, 12.5mg/dl, 25mg/dl, 50mg/dl, 100mg/dl을 80μL씩 도포 후 cyclic voltammetary를 측정하여 포텐셜 0.073V에서의 전류값을 구한 뒤, Pt-NAD+HBDH-NADH+HBDH 전극의 전류-농도 환산공식을 이용하여 각 ACAC 시료 농도와 비교하였다.
도 9는 본 발명의 소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서를 이용하여 측정된 전류와 ACAC 농도의 상관성을 비교한 결과를 나타낸 도면을 도시한다.
도 9에 따르면, 환산한 Pt-NAD+HBDH-NADH+HBDH 전극의 전류-농도의 비 R2의 값이 1에 매우 가까운 값을 얻을 수 있다. 이는 Pt-NAD+HBDH-NADH+HBDH 전극은 방해물질을 차단하며 H+의 농도의 값만 측정한다는 것을 의미한다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (31)

  1. 기판;
    상기 기판 상에 배치된 전극부; 및
    상기 전극부에 전류 및 전압을 인가하는 연결부를 포함하고,
    상기 전극부는,
    상기 기판 상에 부착된 금속 전극을 포함하는 전극 층;
    상기 전극층 상에 고정된 제1효소 층; 및
    상기 제1효소 층 상에 고정된 제2효소 층을 포함하는,
    소변을 이용한 바이오 전자센서.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 기판은 PCB(Printed circuit board)인,
    소변을 이용한 바이오 전자센서.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 금속 전극은 Working electrode, Counter electrode, Reference electrode로 구성된,
    소변을 이용한 바이오 전자센서.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 금속 전극은 백금(Pt), 금(Au), 카드뮴(Cd), 은(Ag), 납(Pb), 니켈(Ni)을 포함하는,
    소변을 이용하는 바이오 전자센서.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 소변을 이용한 바이오 전자센서는 전기화학적 방식으로 측정가능한
    소변을 이용한 바이오 전자센서.
  6. 기판;
    상기 기판 상에 배치된 전극부; 및
    상기 전극부에 전류 및 전압을 인가하는 연결부를 포함하고,
    상기 전극부는,
    상기 기판 상에 부착된 금속 전극을 포함하는 전극 층;
    상기 전극층 상에 고정된 제1효소 층; 및
    상기 제1효소 층 상에 고정된 제2효소 층을 포함하고,
    상기 제1효소 층은 글루코스 산화효소를 포함하며,
    상기 제2효소 층은 아스코르베이트 산화효소를 포함하는,
    소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 기판은 PCB인,
    소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 금속 전극은 Working electrode, Counter electrode, Reference electrode로 구성된,
    소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 금속 전극은 백금(Pt), 금(Au), 카드뮴(Cd), 은(Ag), 납(Pb), 니켈(Ni)을 포함하는,
    소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서.
  10. 제 6항에 있어서,
    상기 소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서는 전기화학적 방식으로 측정가능한
    소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서.
  11. 기판을 준비하는 단계;
    금속 전극을 준비하는 단계;
    상기 기판 상에 금속 전극을 부착하는 단계;
    상기 금속 전극 상에 제1효소 층을 고정하는 단계;
    상기 제1효소 층을 건조하는 단계;
    상기 제1효소 층 상에 제2효소 층을 고정하는 단계; 및
    상기 제2효소 층을 건조하는 단계를 포함하고,
    상기 제1효소 층은 글루코스 산화효소를 포함하며,
    상기 제2효소 층은 아스코르베이트 산화효소를 포함하는,
    소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 기판은 PCB인,
    소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 금속 전극은 Working electrode, Counter electrode, Reference electrode로 구성된,
    소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 금속 전극은 백금(Pt), 금(Au), 카드뮴(Cd), 은(Ag), 납(Pb), 니켈(Ni)을 포함하는,
    소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 금속 전극 상에 제1효소 층을 고정하는 단계는,
    글루코스 산화효소와 GA(Glutaraldehyde)를 포함하는 혼합용액을 상기 금속 전극 상에 코팅하는 단계를 포함하는,
    소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 제1효소 층을 건조하는 단계는,
    35℃ 내지 40℃의 온도에서 30분 이상의 건조시간을 포함하는 단계를 포함하는,
    소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법.
  17. 제11항에 있어서,
    상기 금속 전극 상에 제2효소 층을 고정하는 단계는,
    아스코르베이트 산화효소와 GA를 포함하는 혼합 용액을 상기 제1효소 층 상에 코팅하는 단계를 포함하는,
    소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 제2효소 층을 건조하는 단계는,
    35℃ 내지 40℃의 온도에서 30분 이상의 건조시간을 포함하는 단계를 포함하는,
    소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법.
  19. 기판;
    상기 기판 상에 배치된 전극부; 및
    상기 전극부에 전류 및 전압을 인가하는 연결부를 포함하고,
    상기 전극부는,
    상기 기판 상에 부착된 금속 전극을 포함하는 전극 층;
    상기 전극층 상에 고정된 제1효소 층; 및
    상기 제1효소 층 상에 고정된 제2효소 층을 포함하고,
    상기 제1효소 층은 효소 HBDH(D-beta-hydroxybutyrate dehydrogenase) 및 보조효소 NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)를 포함하며,
    상기 제2효소 층은 효소 HBDH 및 보조효소 NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)를 포함하는,
    소변을 이용하여 케톤체을 측정하는 바이오 전자센서.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 기판은 PCB인,
    소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 금속 전극은 Working electrode, Counter electrode, Reference electrode로 구성된,
    소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서.
  22. 제19항에 있어서,
    상기 금속 전극은 백금(Pt), 금(Au), 카드뮴(Cd), 은(Ag), 납(Pb), 니켈(Ni)을 포함하는,
    소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서.
  23. 제19항에 있어서,
    상기 소변을 이용하여 케톤체을 측정하는 바이오 전자센서는 전기화학적 방식으로 측정가능한,
    소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 센서.
  24. 기판을 준비하는 단계;
    금속 전극을 준비하는 단계;
    상기 기판 상에 금속 전극을 부착하는 단계;
    상기 금속 전극 상에 제1효소 층을 고정하는 단계;
    상기 제1효소 층을 건조하는 단계;
    상기 제1효소 층 상에 제2효소 층을 고정하는 단계; 및
    상기 제2효소 층을 건조하는 단계를 포함하고,
    상기 제1효소 층은 효소 HBDH 및 보조효소 NAD를 포함하며,
    상기 제2효소 층은 효소 HBDH 및 보조효소 NADH를 포함하는,
    소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 기판은 PCB인,
    소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 금속 전극은 Working electrode, Counter electrode, Reference electrode로 구성된,
    소변을 이용하여 당을 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법.
  27. 제24항에 있어서,
    상기 금속 전극은 백금(Pt), 금(Au), 카드뮴(Cd), 은(Ag), 납(Pb), 니켈(Ni)을 포함하는,
    소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법.
  28. 제24항에 있어서,
    상기 제1효소 층을 고정하는 단계는,
    효소 HBDH(D-beta-hydroxybutyrate dehydrogenase)와 보조효소 NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)와 GA를 포함하는 혼합용액을 상기 금속 전극 위에 코팅하는 단계를 포함하는,
    소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법.
  29. 제24항에 있어서,
    상기 제1효소 층을 건조하는 단계는,
    35℃ 내지 40℃의 온도에서 30분 이상의 건조시간을 포함하는 단계를 포함하는,
    소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법.
  30. 제24항에 있어서,
    상기 제2효소 층을 고정하는 단계는,
    효소 HBDH(D-beta-hydroxybutyrate dehydrogenase)와 보조효소 NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)와 GA를 포함하는 혼합용액을 상기 제1효소 층 위에 코팅하는 단계를 포함하는,
    소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법.
  31. 제24항에 있어서,
    상기 제2효소 층을 건조하는 단계는,
    35℃ 내지 40℃의 온도에서 30분 이상의 건조시간을 포함하는 단계를 포함하는,
    소변을 이용하여 케톤체를 측정하는 바이오 전자센서를 제조하는 방법.
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