WO2020165883A2 - 신규의 실리카 합성 펩타이드 및 이를 이용한 실리카 입자 합성방법 - Google Patents

신규의 실리카 합성 펩타이드 및 이를 이용한 실리카 입자 합성방법 Download PDF

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WO2020165883A2
WO2020165883A2 PCT/IB2020/051518 IB2020051518W WO2020165883A2 WO 2020165883 A2 WO2020165883 A2 WO 2020165883A2 IB 2020051518 W IB2020051518 W IB 2020051518W WO 2020165883 A2 WO2020165883 A2 WO 2020165883A2
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ferritin
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silica particles
protein
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백승필
기미란
콰미 윙엔티
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고려대학교 세종산학협력단
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    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P3/00—Preparation of elements or inorganic compounds except carbon dioxide

Definitions

  • the present invention relates to a novel silica synthesis peptide and a method for synthesizing silica using the same.
  • silica can be covalently bonded with certain chemical species, a new hybrid material (organic/inorganic complex) ) As a material that is important for synthesis and is biocompatible, it has excellent properties that can compensate for the shortcomings of each individual material.
  • the industrial production process of silica requires high temperature, strong acid or strong base conditions, and is a problem of generating environmentally harmful by-products. There is-.
  • ferritin is a major uneven storage protein in the body
  • the ferritin molecule which exists in a variety of living organisms, is a spherical macromolecule with a molecular weight of about 450 kDa in which 24 groups of 18 22 nod monomers are bound, and has the form of a core shell with an empty space inside the protein.
  • These structural features can be applied to various fields. For example, it is possible to transport various metal ions, isotopes, and drug delivery materials by using the inner space of ferritin, and by connecting a ligand of a specific function to the N _ terminal of each monomer of ferritin. It is possible to manufacture target-oriented imaging lipoids and drug delivery systems, and also, using the structural characteristics of ferritin itself, it can be used as a template to create regular nanostructures.
  • Peptide is developed, and the protein in which the silica-forming peptide and ferritin are fused.
  • Peptides and bio-siliki particles that are produced as monodisperse particles and can be size-controlled are to provide a method of manufacturing D-.
  • the present invention uses the above novel silica synthesis peptide and silica precursor.
  • composition for synthesis of silica containing - Provides a composition for synthesis of silica containing -.
  • the present invention uses the above novel silica synthesis peptide and silica precursor.
  • It provides a method for synthesizing silica including a step of reacting, and the reaction can be carried out under conditions of room temperature and/or pressure, and can be carried out under conditions of pH 5-8.
  • the present invention is the new silica synthesis peptide and ferritin (ferritin) or
  • It provides a fusion protein to which a virus capsid protein is bound.
  • the silica particle is a silica-coated structure in the core-shell structure, the surface formed by the ferritin, or viral capsid protein Can have
  • the present invention (1) the step of decomposing the fusion protein into a monomer under acidic conditions; (2) a short step for producing a core-shell structure by inducing the binding of the ferritin or virus capsid subunit of the monomer under weak basic conditions]; And (3) reacting the structure with the silica precursor; It provides a method for producing silica particles.
  • the step (1) is a vaginal and ferritin protein.
  • the mixing ratio affects the particle size of the final product, silica particles, and When the size of silica particles is large, the ratio of fused protein is increased, and when the size is small, the ratio of ferritin protein is increased.
  • step (1) above can be carried out under pH 2-3 conditions.
  • step (2) above can be performed under the conditions of pH 7-9, and bar 3 ⁇ 4'may be water 3 ⁇ 4 under pH 8 aqueous solution,
  • the step (3) may be performed in a solution containing glycerol, preferably in a solution containing 50% glycerol, D-.
  • the present invention provides a silica particle manufactured by the above method.
  • the silica particles of the present invention are used as drug delivery carriers by carrying a drug inside.
  • the loading of the drug can be carried out by adjusting the pH of a solution in which the reagent for preparing the core-shell structure and the monomer of the fusion protein are mixed with a base in step (2) to prepare a core-shell structure. .
  • the silica particles of the present invention can be used as a drug delivery vehicle by loading a drug on its surface.
  • the loading of the drug is performed by reacting the silica particles prepared after step (3) with the drug to the surface of the silica particles.
  • the silica particles of the present invention independently deposit drugs on the inside and on the surface.
  • the drugs loaded on the surface and inside may be the same or different from each other.
  • the drug is a compound, peptide, protein, imaging
  • It may be one or more selected from the group consisting of an imaging agent, a gene construct, a gene construct, and a combination thereof.
  • the silica precursor is tetraethyl
  • the present invention is (a) the Kps gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3 or
  • a recombinant expression vector comprising a Kpt gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4 and a gene encoding ferritin or a viral capsid protein; (B) Dean “Gye,” which manufactures a transformant by introducing the expression vector into a host cell; And (c) the step of culturing the blood transducer; and a silica-forming peptide comprising 2020/165883 ? €1/162020/051518
  • the above method comprises crushing the transformant after step (c) and removing fragments of the transformant through centrifugation, and mixing the obtained soluble fraction with a nickel resin to obtain nickel. It can provide a high-purity fusion protein by additionally including a purification step to coax the fusion protein bound to the resin.
  • each of the 24 subunits of ferritin gathers spherical ferritin protein.
  • biosilica nanoparticles that can be sized can be manufactured in monodisperse form by controlling the concentration of glycerol , and a new method of producing biosilica particles that can be applied to the design of various biohybrid nanomaterials Can be provided.
  • Figure 2 is the adsorption isotherm of the peptide to the nickel resin [(Wu 6x018.(6)( )
  • FIG. 5 is a schematic diagram of a ferritin-based silica particle control method (example 3 ⁇ 4)
  • Figure 6 is a sol-gel in the presence of 50% glycerol using a chimera 3 ⁇ 4 as a template
  • Figure 7 shows the silica formed according to the presence or absence of 50% glycerol during the silica formation reaction
  • Fig. 8 is a comparison of the amount bound to the silica particles, and £1 is the comparison of the amount by eluting the 0 show adsorbed on each silica particle through an agarose gel (0.7%) electrophoresis.
  • It is a representative diagram (lane 1: Si0 2 /Kps-Fn, lane 2: Si0 2 /Kpt-Fn, lane 3: Si0 2 /Kpsl:5, example 4: Si0 2 /Kptl:5, lane 5: commercial SiO 2 (170 nm X lane 6: commercial Si0 2 (310 nm), lane 7: free DNA (500 ng)),
  • b shows the result of quantification by measuring the amount of DNA eluted from the silica particles with Image!
  • Figure 9 shows the release pattern of Dox supported on Kps6:6 Fii and Si0 2 /Kps6:6Fn in pH.
  • 10 is a view showing the emission pattern of raRFP fixed on the surface of Kpi6:6 (Dox) according to the passage of time of Dox.
  • the present inventors developed a new silica-synthetic fabtide and biotechnology using it.
  • the present invention was completed by studying various ways of using silica.
  • Kpt peptides were selected, and Kps and Kpi peptides were referred to as R5 peptides to confirm the ability to synthesize silica. It was confirmed that silica can be actively synthesized under the conditions of room temperature, normal pressure, and pH 5 to 8 for both Kpt.
  • Kps and Kpt peptides can be used alone, but they can impart silica-forming ability to proteins through fusion with enzymes or functional proteins. However, fusion of muUi-tags for the expression of recombinant proteins affects protein structure and expression. It is a single combination tag that can be enjoyed.
  • Kps and Kpt are expected to be able to bind to nickel resin for purification because six histidine residues in the sequence exist as a repeating sequence.As a result of confirming this, it was found that they have a high affinity for Kps and Kpt mononickel resins. Example 1-2).
  • each monomer of ferritin forms a sphere-shaped ferritin protein with 24 groups.
  • the 24 monomers of ferritin protein gather to form a core-shell structure.
  • the present inventors prepared a fusion protein (SFP-Fn) in which a ferritin protein that forms a core-cell structure was combined with the Kps or Kpt, and after purification using nickel resin, the fusion protein was Decomposed into monomers and neutralized again 2020/165883 ? €1/162020/051518
  • the structure manufactured using: can be referred to as chimeric ferritin, and the core-cell structure and chimeric ferritin can be mixed.
  • the present inventors produced silica particles by mixing the core/shell structure of the fusion protein with the silica precursor, and the silica particles are a structure in which silica is coated on the surface of the structure composed of the fusion protein. ,It was confirmed that the size of the silica particles is affected by the ability to form silica of the fusion protein bound to the fusion protein. This is why the ferritin is positioned on the surface of the core/shell structure. It is expected that the size of the silica and tickle can be adjusted according to the performance.
  • chimera ferritin was produced at different ratios of 8-11 ⁇ 23 ⁇ 4 -13 ⁇ 4 and 13 ⁇ 4 subunits, and silica particles were produced to effectively control the size of silica particles (Example 3-1). Meanwhile, in the present specification, And chimera ferritin produced by mixing 13 ⁇ 4 is classified according to the mixing ratio and is clearly -.
  • the chimeric ferritin obtained by mixing Na3 ⁇ 4 and!3 ⁇ 4 in a molar ratio of 1 to 5 and reconstituted is named as My 11 and!
  • the chimeric ferritin obtained by mixing 3 ⁇ 4 at a molar ratio of 1 to 5 and reconstituted was named 1 ⁇ 1:5.
  • [54] 8-13 ⁇ 4 forms larger silica nanoparticles than the inner 11, and smaller silica particles. It can be seen that biosilica with a large surface area of silver can be produced. Therefore, the present inventors confirmed the adsorption ability of 1 ⁇ 2, [Ma-!3 ⁇ 4 and 1 ⁇ 4 of chimera as a template).
  • novel silica particles of the present invention are superior to those of commercially available silica particles.
  • the present inventors carry a drug inside the core/shell structure
  • a drug was mixed to form a core-shell structure of the fusion protein, and the drug was carried inside the shell structure to produce silica particles.
  • Silica particles carrying the drug The drug was rapidly released under acidic conditions, and it was confirmed that the drug was released slowly at 11 near neutral (Example 6).
  • the drug delivery system of the present invention may additionally include a pharmaceutically acceptable carrier, and the silica complex of the drug delivery system may contain a pharmaceutically active ingredient in a core-cell structure.
  • the pharmaceutically acceptable carriers include carriers and vehicles commonly used in the pharmaceutical field, specifically ion exchange resins, alumina, and aluminum.
  • Stearate, lecithin, serum protein eg, human serum albumin
  • buffers eg, various phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids
  • water salts or electrolytes (eg , Protamine sulfate,
  • the drug delivery system of the present invention may include a lubricant, wetting agent, emulsifier, suspending agent, or boson agent in addition to the above ingredients.
  • the vector is not limited to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing DNA in a suitable host. Therefore, the vector is not limited thereto.
  • the plasmid can be a fulsmid, a phage particle, or simply a latent genome insert. Once transformed into a suitable host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be incorporated into the genome itself. Since it is the most commonly used form of the current vector and is used in specific examples of the present invention, the plasmid" and "vector" in the specification of the present invention
  • vector (vector)” is sometimes used interchangeably. However, the present invention includes other forms of vectors that have equivalent functionality as known or known in the art.
  • the term "recombinant expression vector” is a recombinant carrier into which a fragment of a heterogeneous DNA is inserted, and generally refers to a fragment of a double-stranded DNA.
  • the heterologous DNA is in a host cell. Not found naturally
  • DNA refers to heterologous DNA.
  • the expression vector can replicate independently of the host chromosomal DNA, and several copies of the vector and its inserted (heterologous) DNA can be generated.
  • the vector may include a promoter that is operatively linked to the gene to be cloned.
  • promoter promotes the expression of the gene to be transfected, and the promoter is required for transcription.
  • basal element it may contain more enhancers that can be used to promote and regulate expression.
  • transformation means that DNA is introduced as a host so that DNA becomes reproducible as an extrachromosomal factor or by completion of chromosomal integration. Any method of introducing nucleic acids into organisms, cells, tissues or organs is included, and, as known in the art, appropriate standard techniques can be selected and performed according to the host cell.
  • Electric shock gene transfer method (eleciroporaiion), prototypic fusion, calcium phosphate (CaP0 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, agitation using silicon carbide fiber, agrobacteria-mediated transformation, PEG, dextran sulfate, lipofectamine, etc. Including, but not limited to age.
  • prokaryotic host cells such as Streptomyces, Pseudomonas X Proteus mirabilis or Staphylococcus, but are not limited to, and fungi (e.g., Aspergillus Rus (Aspergillus)), yeast (for example, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae),
  • fungi e.g., Aspergillus Rus (Aspergillus)
  • yeast for example, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae
  • Inferior eukaryotic cells such as Sdiizosaccharomyces and Neurospora crassa
  • cells derived from higher eukaryotes including insect cells, plant cells, and mammals, can be used as host cells. .
  • SFP (R5, Kps, Kpt) was prepared at a concentration of 10 mg I mL each to de-eun water, and 1M TMOS (Tetrameliiyi oithosilicate) was added to the final concentration ImM before reaction and W minutes.
  • Silicic acid a silica precursor, was prepared.
  • silica precipitation 1 M of TMOS 10 and 10 L of SFP were hydrolyzed in 80 ml of a silica precipitation buffer (acetate buffer pH 5.0 and potassium phosphate buffer pH 6, 7 or 8.0).
  • the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes to react.
  • the precipitated silica particles were separated by centrifugation and washed three times with deionized water.
  • the silica-forming ability of the peptides depending on the pH was obtained by using the molybdenum blue method. It was quantified by the quantitative method.
  • PCR was performed with F3 and R-Fn and cloned from Kps-Fn and Kp (pGEM-T Easy vector (Promega Co, Madison, W), a T-vector obtained from the -Fn gene).
  • Restriction enzyme Ndel / Xhol cut the Kps-Fn or Kpt-Fn gene fragment from the sub-cloned T. vector, and pET-Kps-Fn, pET-Kpt- using the pET42b vector treated with the same restriction enzyme.
  • An Fn expression vector was prepared and introduced into E. coli RL21 (DE3) to produce a Kps-Fn or Kpt-Fn producing strain. All inserted DNA base sequences were subjected to automated DNA sequencing (Cosmo Genetech Co, Seoul). Confirmed by,
  • the expression vector is introduced into E. coli BL2 ⁇ £ 3) kanamycin (25 ⁇ / 3 ⁇ 4 £) epoch should a monovalent cell absorbance at 37 ⁇ by culturing in a liquid culture medium, 0 6 ⁇ 0.8 (600 001 After growing until it reaches about absorbance), ]1 ( ⁇ is added so that the final concentration is 0.1111. Then, the strain into which the expression vector was introduced is cultured overnight at 20° (::) to induce protein expression. , Kps-Fi! or: !3 ⁇ 4) The strain with 11 expression vectors introduced was cultured at 37° (: for 4 hours to induce the expression of 8-3 ⁇ 4 or 1 case 3 ⁇ 4).
  • each of the above strains is recovered by centrifugation and then crushed by ultrasonic treatment. After centrifugation for 30 minutes at 13,000 p. Only the II fraction was recovered. The soluble fraction was treated at 60°C for 10 minutes, and the precipitated proteins were centrifuged under the same conditions to dilute the final soluble fraction.
  • Silicic acid was prepared by adding to ImM. 40 «g/ml ferritin in potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing various concentrations of glycerol (0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%)
  • the mixture to which protein and lOmM silicic acid were added was subjected to shaking reaction at room temperature for 2 hours, and Fn particles encapsulated in silica were obtained by centrifugation, and washed several times with distilled water.
  • step 12 2% ammonium molybdate tetrahydrate, 5% oxalic acid, and 10() 111 ⁇ 1 ascorbic acid were sequentially added 50 each. Finally, the absorbance of the 200 1 solution was measured at phage ⁇ 700 Ah» Had-. A solution of sodium metasilicate non-hydrate was used to create a 3 ⁇ 4 standard curve.
  • the nitrogen adsorption isotherm is 2020 0 / ⁇ , ⁇ ) was measured at 77.
  • the specific surface area of the manufactured sample was
  • the mixture was shaken at room temperature for 2 hours, and the silica particles were removed from the binding buffer by centrifugation.
  • the addition of 20 of purified water on the silica particles for dissolution, and then shaking conditions were not 30 weight-incubated in the (200] 13 ⁇ 411).
  • the concentration in water was determined by quantifying the intensity of the stained DNA band by gel electrophoresis with a 1110 ⁇ 1 program.
  • mRFP protein was used as a model molecule, and a pre-prepared Kpt6:6 (Dox) solution was added to 50 containing mRFP and 20 mM hydrolyzed TMOS. It was added to the mM sodium phosphate buffer.
  • Dox The molar ratio of mRFP to Kpt6:6 (Dox) is from 10 to H to 1 to 1:!.
  • mRFP was captured in a silicified shell of Kpt6:6 (Dox) (Si0 2 (mRFP)/Kpt6:6 (Dox)). Unreacted mRFP and TMOS were carried out using an Amicon Ultra-0.5 device (YM100). Using a PBS (pH 7,4) according to the manufacturer's instructions, it was removed by filtration over five sides.
  • the amount of Dox released into the supernatant was monitored at 550 nm using a UV / visible microplate reader (Infinite M200 NanoQuant; TECAN)-when determining the amount of Dox released into the supernatant by visible light.
  • the Dox concentration emitted from the sample was monitored at 550 nm.
  • the amount of Dox detected at each point was calculated as the cumulative amount over time.
  • Histidine exhibits a strong interaction with metal ions immobilized on the matrix by forming a coordination bond between the electron donor group on the histidine imidazole ring and the transition metal (nickel or cobalt) immobilized on the resin.
  • Example 3 Ferritin-based silica particle size and dispersion degree control
  • Example 4 surface analysis of ferritin-based silica particles
  • silica particles with a diameter of 170 nra (aqueous suspension solution) and 310 nm (dry silica) of Bangs Laboratories Inc (Indiana, USA) were used to compare the adsorption capacity of 700 bp DNA under high concentration of potassium.
  • aqueous suspension solution aqueous suspension solution
  • 310 nm dry silica
  • bio-silica particles of smaller size can be made, and as the size increases, the surface area increases.
  • the biosilica particles developed in the present invention showed superior DNA adsorption performance than commercially available silica particles.
  • Silica particles based on the above two results, can be used as a dual drug delivery vehicle in which two kinds of branches _ are loaded into different compartments and released at different rates.

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Abstract

본 발명은 실리카 합성 펩타이드 및 이를 이용한 실리카 입자 합성방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 페리틴의 각 서브유닛 24개가 모여 구형의 페리틴 단백질을 형성하고 이 구조가 산에서는 해체되었다가 pH를 다시 중성으로 맞추면 페리틴 단백질의 24개 서브유닛이 다시 모이는 성질을 이용하여 페리틴 아미노말단에 실리카 형성 펩타이드가 융합된 페리틴과 (Kps-Fn/Kpt-Fn)과 그렇지 않은 페리틴 (Fn)을 일정 비율로 섞어 바이오 실리카 형성 펩타이드 밀도를 조절함으로써 실리카 나노 입자의 크기를 제어할 수 있는 신규한 실리카 합성 펩타이드를 제공한다. 본 발명에 따르면, 크기 조절이 가능한 바이오 실리카 나노입자를, 글리세롤의 농도 조절을 통해 단분산 형태로 제조할 수 있는바, 다양한 바이오 하이브리드 나노 물질의 디자인에 적용할 수 있는 새로운 바이오 실리카 입자의 생성 방법을 제공할 수 있다.

Description

2020/165883 1^(:1^2020/051518
1
명세서
발명의 명칭:신규의실리카합성펩타이드및이를이용한실리카 입자합성방법
기술분야
[1 ] 본발명은신규의실리카합성펩타이드및이를이용한실리카합성방법등에 관한것이다.
四
배경기술
[3] 산업화이후한정된육상가용자원의소비급증에따른육상자원소재의
고갈로인한새로운유용자원개발이국가적미래를위한중요이슈가되고 있다·.따라서미국,유럽 일본등의선진국들은신규원천소재개발및확보에 국가역량을집중시키고있다.여기에더하여환경오염으로인한지구온난화및 기후변화등은인류의생존을위협하는요인으로작용하고있어경제성장과 환경보호를동시에추구하는새로운패러다임이대두되고있다.
[4] 환경친화적인생물학적생산방법을통해신소재를생산화는방법은원천
기술의확보뿐아니라친환경산업으로인한국가적인저탄소녹색성장의 견인차역할을할기술로기대된디-.특히,실리카는특정화학종들과공유 결합이가능하기때문에새로운하이브리드소재 (유기··무기복합체)합성에 중요하고 또한，생체적합한소재로서각개별소재의단점을보완할수있는 우수한특성을가지고있다.현제실리카의공업적생산공정은고온,강산또는 강염기조건이요구되고환경적으로유해한부산물생성의문제점이있디-.
[5] 그러나상온상압에서실리카를형성할수있는효소및펩타이드가
발견됨으로써생물학적생산방법을통한바이오실리카복합소제개발에대한 관심이증대되고있다.
[6] 한편，페리틴은생체내주요철저장단백질로서포유류에서세균류에
이르기까지다양한생명체에존재한디 페리틴분자는 18 22노 의단량체 24게가결합된약 450 kDa분자량을지닌구형의거대분자이면서단백질내부 공간이비어 있는코어셀 (core shell)형태를띠고있디-.이러한구조적특징은 다양한분야에응용될수있는데，예를들어페리틴의내부공간을이용해 다양한금속이온,동위원소，약물전달소재를운반할수있으며페리틴각 단량체의 N_말단부분에특정기능의 리간드를연결하여표적지향적인영상 지단및약물전달체를제조할수있디-,또한페리틴자체의구조적특성을이용, 주형으로사용하여규칙적인나노구조체를만들수있다.
[7] 전술한기슬적배경하에서본발명자들은입자의크기를조절할수있는
바이오실리카입자제조기술에대해연구하던중,신규실리카형성
펩타이드를개발하고，상기실리카형성펩타이드와페리틴이융합된단백질을 9
이용할경우실리카나노입자의크기를효과적으로제어할수있음을확인하고 본발명을완성하였디-。
[8]
발명의상세한설명
기술적과제
[9] 본발명이이루고자하는기술적과저 i는실리카를합성할수있는신규
펩타이드및이를이용하여단분산입자로생성되며,크기조절이가능한바이오 실리키·입자를제조하는방법을제공하는것이디-.
[10] 또한，본발명에서는상기펩타이드에 의해제조된실리카기반복합체의전지-, 화학，약학등의다양한산업분야에서의용도를제공하는것이다.
[11] 그러나본발명이이루고자하는기술적과제는이상에서언급한과제에
제한되지않으며，언급되지않은또다른과제들은아래의기재로부터당해 기술분야의통상의기술자에게명확하게이해될수있을것이다.
[12]
과제해결수단
[13] 본발명은싱끼 과제를해결하기위하여，서열번호 1또는서열번호 2의
아미노산서열을포함하는신규의실리카합성펩타이드 (silica forming peptide: SFP)를제공한디-.
[14] 또한,본발명은상기신규의실리카합성 펩타이드와실리카전구체를
포함하는실리카합성용조성물을제공한다-.
[15] 또한，본발명은상기신규의실리카합성펩타이드와실리카전구체를
반응시키는단계를포함하는실리카합성방법을제공하며，상기반응은상온 및/또는상압조건하에서수행될수있고， pH 5-8조건하에서수행될수있다.
[16] 또한，본발명은상기신규의실리카합성펩타이드와페리틴 (ferritin)또는
바이러스캡시드단백질이결합된융합단백질을제공한다.
[17] 또한，본발·명은상기융합단백질과실리카전구체를포함하는실리카파티클 합성용조성물을제공하며 ,상기실리카파티클은상기페리틴또는바이러스 캡시드단백질에의해형성된코어쉘구조체표면에실리카가코팅된구조를 가질수있다.
[18] 또한,본발명은 (1)상기융합단백질을산성조건하에서단량체로분해하는 단계; (2)약염기조건하에서상기단량체의페리틴또는바이러스캡시드 서브유닛 (subunk)의결합을유도하여코어-쉘구조체를제조하는단겨] ;및 (3) 상기구조체와실리카전구체를반응시키는단계;를포함하는실리카파티클 제조방법을제공한다.
[19] 본발명의일구현예로서 ,상기 (1)단계는 질과페리틴단백질을
혼합하여수행될수있으며，그혼합비율은
Figure imgf000004_0001
있다,상기혼합비율은 최종산물인실리카파티클의입자크기에영향을미치며，제조하고자하는 실리카파티클의크기가큰경우융합단백질의비율을높이고，그크기가작은 경우페리틴단백질의비율을높인다.
[20] 본빌「명의다른구현예로서 ,상기 (1)단계는 pH 2-3조건하에서수행될수
있으며，
Figure imgf000005_0001
직하게는 pH 2수·용액하에서수행될수있다.
[21 ] 본발쟁의또다른구현예로서 ,상기 (2)단계는 pH 7~9조건하에서수행될수 있으며，바 ¾ '직하게는 pH 8수용액하에서수 ¾될수있다,
[22] 본발명의또다른구현예로서,상기 (3)단계는글리세롤이포함된용액내에서 수행될수있으며,바람직하게는 50%글리세롤이포함된용액내에서수행될수 있,디-.
[23] 또한、본발명은상기방법으로제조된실리카파티클을제공한다.
[24] 한편,본발명의실리카파티클은내부에약물을담지하여약물전달체로
이용될수있으며，상기약물의담지는상기 (2)단계에서코어-쉘구조체의 제조시약물과융합단백질의단량체가혼합된용액의 pH를염기로조절하여 코어·.쉘구조체를제조함으로써수행될수있다.
[25] 또한,본발명의실리카파티클은그표면에약물을로딩하여약물전달체로 이용될수있다.상기약물의로딩은상기 (3)단계이후에제조된실리카 파티클과약물을반응시켜실리카파티클의표면과약물의 결합을
유도함으로써수행될수있다.
[26] 한편,본발명의실리카파티클은내부와표면에각각독립적으로약물을
로딩하여이중약물전달시스템으로이용될수있고,상기파티클표면에 결합된약물과내부에담지된약물의방출패턴과로딩되는약물을고려하여 표면과내부에각각로딩되는약물은서로동일하거나상이할수있디-.
[27] 본발명의일구현예로서 ,상기약물은화합물，펩타이드，단백질，이미징
제제 (imaging agent),유전자구、성물 (gene construct),및이들의조합으로이루어진 군으로부터선택되는 1종이상일수있다.
[28] 본발명의다른구현예로서 ,상기실리카전구체는테트라에틸
오르토실리케이트，테트라메틸오르토실리케이트,메틸트리에톡시실란,에틸 트리에톡시실란，페닐트리에톡시실란,디메틸디메톡시실란，디메틸
디에톡시실란,에틸트리에톡시실란，트리메틸에톡시실란,
트리아미노프로필트리에특시실란，티타니아테트라이소프로폭사이드., 티타니움옥시셀페이트,티타니움비스암모니움락테이토디하이드록사이드-， 티타니움디이소프로폭사이드비스아세틸아세토네이트및테트라에틸 게르마늄으로이루어진군으로부터선택된하나이상일수있다.
[29] 또한，본발명은 (가)서열번호 3의염기서열로이루어진 Kps유전자또는
서열번호 4의염기서열로이루어진 Kpt유전자와페리틴 (ferritin)또는바이러스 캡시드단백질을암호화하는유전자를포함하는재조합발현벡터를제조하는 단계; (나)상기발현벡터를숙주세포에도입하여형질전환체를제조하는딘「계; 및 (다)상기혈질전환체를배양하는단계;를포함하는실리카형성펩타이드와 2020/165883 ?€1/162020/051518
4
페리틴의융합단백질제조방법을제공한다.
[30] 본발명의일구현예로서,상기방법은（다）단계이후에상기형질전환체를 파쇄하고 원심분리를통해형질전환체의 파편을제가하여획득된가용성 분획물을니켈수지와혼합하여니켈수지에결합된융합단백질을수늑하는 정제단계를추가로포함하여고순도의융합단백질을제공할수있디-,
[31]
발명의효과
[32] 본발명에서는페리틴의각서브유닛 24개가모여구형의페리틴단백질을
형성하고이구조가산에서는해체되었다가 를다시중성으로맞추면페리틴 단백질의 24개서브유닛이다시모이는성질을이용하여페리틴아미노말단에 실리카형성펩타이드가융합된페리틴과（1¾）!5-1¾/ 1 - 1¾）과그렇지않은페리틴 0¾）을일정비율로섞어바이오실리카형성펩타이드밀도를조절함으로써 실리카나노입자의크기를제어할수있는신규한실리카합성펩타이드를 제공한다.
[33] 본발명에따르면 크기조절이가능한바이오실리카나노입자·를,글리세롤의 농도조절을통해단분산형태로제조할수있는바，다양한바이오하이브리드 나노물질의디자인에적용할수있는새로운바이오실리카입자의생성방법을 제공할수있다.
[34]
도면의간단한설명
[35 ] 도 1욘· 에따른실리카형성펩타이
Figure imgf000006_0001
실리카침전활성을 비교확인한도면이다.
[36] 도 2는니켈수지에대한펩타이드의흡착등온선이다 [（서 6x018.（6） （ ）
Figure imgf000006_0003
도면이다.
[39] 도 5는페리틴기반의실리카파티클（예¾）제어방법의모식도이디-,
[40] 도 6은주형으로키메라 ¾을사용하여 50%글리세롤의존재하에졸-·겔
공정으로부터유도된실리카입자에대해 200개이상의 입자의통계분석을 통해얻어진입자크기히스토그램결과를나타낸것이다.
[41] 도 7은실리카형성반응시 50%글리세롤첨가유무에따른，형성된실리카
Figure imgf000006_0002
50%글리세롤첨가， ± ¾02/1（排-¾ 50%글리세롤첨기-）,스케일바: 5001·,
[42] 도 8은실리카입자에결합한 양을비교한것으로, £1는아가로즈겔（0.7 %） 전기영동을통해각실리카입자에흡착되었던 0 쇼를용출시켜그양을비교한 대표도이며 (레인 1 : Si02/Kps-Fn,레인 2: Si02/Kpt-Fn,레인 3: Si02/Kpsl:5,례인 4: Si02/Kptl:5,레인 5:상업용 SiO2 (170nmX레인 6:상업용 Si02 (310nm),레인 7: 유리 DNA (500ng)), b는실리카입자로부터용출된 DNA의양을 Image! 소프트웨어로측정하여정량화한결과를나타낸다 (T <0.01 , Si02/Kpsl:5대 Si02 /Kps-Fn. **P <0.01, Si02/Kptl:5대 Si02/Kpt-Fn. #P <0.001, Si02/Kpsl:5대상업용 실리키-. UP <0.001, Si02/Kpti:5대상업용실리카·).
[43] 도 9는 Kps6:6 Fii및 Si02/Kps6:6Fn에담지된 Dox의방출패턴을 pH에
따라확인한도면이디-,
[44] 도 10은 Kpi6:6(Dox)의표면에고정된 raRFP의· Dox의시간의흐름에따른방출 패턴을확인한도면이다.
[45]
발명의실시를위한최선의형태
[46] 본발명자들은새로운실리카합성팹타이드의개발과이를이용한바이오
실리카의다양한이용방법에대해예의연구하여본발명을완성하였다.
[47] 본발명자들은새로운실리카합성탭타이드를발글하기위하여 Kps서열
(KPSHHHHHTGAN; US20060172282AI; DOI:
htps://doi.org/10.1166/jnn.2002,074)#기초로단백질데이터베이스 Blast검색에 의해 Kpt펩타이드를선별하였고， Kps와 Kpi펩타이드를 R5펩타이드를 reference로하여실리카합성능력을확인한결과， Kps및 Kpt모두상온,상압， pH 5내지 8조건하에서활발하게실리카를합성할수있음을확인하였다.해양 미생물 Ruegeria pomeroyi DSS-3 (이전 Silicibacter pomeroyi)의 -f 단백질 (NCBI RefSeq : WP_011046633.1)에존재하는서열 (KPTHHHHHHDG)로이루어진 Kpt 펩타이드는 pH 5, 6,및 8조건하에서 R5및 Kps보다우수한실리카형성능을 나타내었디- (실시예 M ).
[48] Kps및 Kpt펩타이드는단독으로도사용될수있지만효소나기능성단백질과 융합을통해단백질에실리카형성능력을부여할수있다、그러나재조합 단백질의발현을위해 muUi-tag의융합은단백질구조및발현에영향을즐수 있어단일결합 tag이다기성을갖는다면더가치및유용성이증가하게된디-.
Kps및 Kpt는서열중히스티딘잔기 6개가반복서열로존재하기때문에정제를 위한니켈수지에결합가능할것으로예상되었고이를확인한결과， Kps및 Kpt 모누니켈수지에대해높은친화력을가짐을알수있었디- (실시예 1-2).
[49] 한편，페리틴의각단량체는 24개가모여구형의페리틴단백질을형성하고이 구조가산에서는해체되었다가 pH를다시중성으로맞추면페리틴단백질의 24개단량체가다시모여코어-쉘구조체를형성하는성질을갖는다.
[50] 이에，본발명자들은상기 Kps또는 Kpt에코어-셀구조체를형성하는페리틴 단백질을결합한융합단백질 (SFP-Fn)을제조하고이를니켈수지를이용하여 정제한후상기융합단백질은산성조건하에서단량체로분해하고다시중성 2020/165883 ?€1/162020/051518
6 또는염기성조건하에서결합을유도하여획득된구조체의형태를관찰한결과，
Figure imgf000008_0001
결합된페리틴단백질의기능에영향을미치지않고니켈수지를 이용한정제에친화성태그로효과적으로기능함을확인할수있었다（실시예 2）,
[51] 본발명에서상기 : 를이용하여제조된구조체는키메라페리틴이라고 할수있으며 ,상기코어-셀구조체와키메라페리틴은혼용될수있다.
[52] 또한，본발명자들은상기융합단백질의코어··쉘구조체와실리카전구체를 혼합하여실리키·파티클을제조하였으며,상기실리카파티클은상기융합 단백질로이루어진구조체의표면에실리카가코팅된구조로서 ,실리카 파티클의크기는융합단백질에결합된 꾸의실리카형성능에영향을받음을 확인하였다.이에상기페리틴에의한코어··쉘구조체표면에위치한
Figure imgf000008_0002
성능에따라실리카과티클의크기를조절할수있을것으로예상하고
8-1½¾ -1¾및 1¾서브유닛의비율을달리하여키메라페리틴을제작하고 실리카파티클을제조하여실리카파티클의크기를효과적으로조절할수 있음을확인하였다（실시예 3-1）.한편，본명세서에서
Figure imgf000008_0003
및 1¾을 혼합하여제작한키메라페리틴은그혼합비율에따라구분하여명명한디-. 예를들어 나¾와!¾을 1대 5의몰비로섞은후재구성하여얻은키메라 페리틴은 로명명하고 내11와! ¾을 1대 5의몰비로섞은후재구성하여 얻은키메라페리틴은 1^1:5로명명하였디-.
[53] 또한,본발명자들은제조된실리카파티클은서로뭉치는현상이
확인되었으나,이는실리카전구체와반응시 50%글리세롤을첨가하여방지할 수있음을확인하였다（실시예 3-2）.
[54] 8-1¾은 내11보다크기가큰실리카나노파티클을형성하고,보다작은 실리카파티클을형성하는
Figure imgf000008_0004
은표면적이넓은바이오실리카를제조할수 있음을알수있다.이에,본발명자들은 ½， [마 - !¾및키메라 1¾을주형으로 제조된실리카나노입자에 £）■흡착능을확인한결과동량의바이오
실리카에서크기가작을수록 DNA흡착능이우수함을확인하였고.본발명의 신규한 로제조된실리카파티클은시판되는실리카파티클보다우수한
[） 흡착능을나타내었다（실시예 5）.
[55] 또한,본발명자들은상기코어··쉘구조체내부에약물을담지하여실리카
파티클을제조함으로써약물전달체로제공할수있음을확인하기위하여,상기 융합단백질의코어-쉘구조체형성시약물을혼합하여쉘구조내부에약물을 담지하고실리카파티클을제조하였다.약물을담지한실리카파티클은산성 조건하에서빠르게약물을방출하였고，중성부근의｛）11에서서서히 약물을 방출함을확인할수있었디 _（실시예 6）.
[56] 또한,본발명자들은상기코.어··쉘구조체내부와실리카코팅막에약물을각 각담지하여 2중약물전달체로제공할수있음을확인하기위하여，상기 융합단백질의코어-쉘구조체형성시약물을혼합하여웰구조내부에약물을 담지하고실리카파티클을형성하는과정에다른약물을첨가하여페리틴코어 주위에실리카가침전되면서주위에존재하는약물을함께실리카에 고정화시켜약물이담지된실리카파티클을제조하였다.페리틴내부코어와 외부실리카셀에약물을담지한이중약물전달시스템은외부약물이내부 약물에비해빠르게방출됨을확인할수있었다 (실시예 7).
[57]
[58] 본발명의약물전달체는약제학적으로허용가능한담체를추가로포함할수 있으며，상기약물전달체의실리카복합체는코어-셀구조로내부에약제학적 활성성분을내포할수도있다.
[59] 상기약제학적으로허용가능한담체는의약분야에서통상사용되는담체및 비히클을포함하며，구체적으로이온교환수지，알루미나，알루미늄
스테아레이트，레시틴,혈청단백질 (예，사람혈청알부민)，완충물질 (예，각종 인산염，글리신，소르브산，칼륨소르베이트,포화식물성지방산의부분적인 글리세라이드혼합물)，물,염또는전해질 (예,프로타민설페이트，
인산수소이나트륨,인산수소캄룸，염화나트륨및아연염)，교질성실리카， 마그네슘트리실리케이트，폴리비닐피를리돈,셀룰로즈계기질,폴리에틸렌 글리콜,나트륨카르복시메틸셀룰로즈,폴리아릴레이트，왁스，폴리에틸렌 글리콜또는양모지등을포함하나이에제한되지않는다.
[60] 또한,본발명의약물전달체는상기성분들이외에윤활제,습윤제·유화제, 현탁제,또는보손제능을주가로포함할수있다,
[61 ] 본발명의구체적인실시예에서 백터 (vector)”는적합한숙주내에서 DNA를 발현시킬수있는적합한조절서열에작동가능하게연결된 DNA서열을 함유하는 DNA제조물이라면이에제한되는것은아니다.따라서，벡터는 쓸라스미드,파지입자，또는간단하게잠제적게놈삽입물일수있다.적당한 숙주로형질전환되면,벡터는숙주게놈과무관하게복제하고기능할수있거나， 또는일부경우에게놈그자체에통합될수있다.플라스미드가현재벡터의 가장통상적으로사용되는형태이고,본발명의구체적인실시예에서이용하고 있는형태이므로，본발명의명세서에서 플라스미드 (plasmid)"및 "백터
(vector)”는때로상호교환적으로사용된다.그러나，본발명은당업계에알려진 또는알려지계되는바와동등한기능을갖는벡터의다른형태를포함한다.
[62] 또한,본명세서에 "재조합발현벡터’’는통상이종의 DNA의단편이삽입된 재조합캐리어 (recombinant carrier)로서일반적으로이중가닥의 DNA의단편을 의미한다.여기서 ,이종 DNA는숙주세포에서천연적으로발견되지않는
DNA인이형 DNA를의미한다.발현벡터는일단숙주세포내에 있으면숙주 염색체 DNA와무관하게복제할수있으며벡터의 수개의카피및그의삽입된 (이종) DNA가생성될수있디-.
[63] 상기벡터는클로닝되는유전자와직-동가능하게연결된 (operatively linked) 프로모터를포함할수있으며,본명세서에서“프로모터”는형질주입하고자 하는유전자의발현을촉진시키는것으로서상기프로모터에는전사에필요한 기본인자 (Basal element)뿐만아니라,발현의촉진및조절에사용될수있는 인핸서 (enhancer)가더포함될수있다.
[64] 또한,본명세서에서 "형질전환”또는“형질주입”은 DNA를숙주로도입하여 DNA가염색체외인자로서또는염색체통합완성에의해복제가능하게되는 것을의미한디-,상기형질전환은핵산을유기체,세포,조직또는기관에 도입하는어떤방법도포함되며，당분야에서공지된바와같이숙주세포에따라 적합한표준기술을선택하여수행할수있다.이런방법에는
전기충격유전자전달법 (eleciroporaiion),원형질융합,인산칼슘 (CaP04)침전， 염화칼슘 (CaCl2)침전,실리콘카바이드섬유이용한교반，아그로박테리아 매개된형질전환, PEG,덱스트란설페이트,리포펙타민등이포함되나이로 제한되지않는다.
[65] 또한，숙주에따라서단백질의발현량과수식등이다르게나타나므로,목적에 가장적합한숙주세포를선택하여시·용할수있다.숙주세포로는
대장균 (Escherichia coli),바실러스서브틸리스 (Bacillus subtilis),
스트렙토마이세스 (Strepiomyces),슈도모나스 (PseudomonasX프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis)또는스타필로코쿠스 (Staphylococcus)와같은원핵 숙주세포가있으나이로제한되는것은아니다,또한，진균 (예를들어， 아스페르길러스 (Aspergillus)),효모 (예를들어，피치아파스토리스 (Pichia pastoris),사카로마이세스세르비시애 (Saccharomyces cerevisiae),
쉬조사카로마세스 (Sdiizosaccharomyces)，뉴로스포라크라시- (Neurospora crassa))등과같은하등진핵세포，곤충세포,식물세포,포유동물등을포함하는 고등진핵생물유래의세포를숙주세포로사용할수있다.
[66]
[67] 본발명은다양한변환을가할수있고여러가지실시예를가질수있는바， 이하특정실시예들을도면에예시하고상세한설명에상세하게설명하고자 한다.그러나,이는본발명을특정한실시형태에대해한정하려는것이아니며， 본발명의사상및기술범위에포함되는모든변환，균등물내지대체물을 포함하는것으로이해되어야한다.본발명을설명함에있어서관련된공지 기술에대한구체적인설명이본발명의요지를흐릴수있다고판단되는경우 그.상세한설명을생략한다.
[68]
발명의실시를위한형태
[69] [실험방법]
[70] 1.실리키·형성펩타이드 (Si!ica forming peptide: SFP)
[71] 1-1. SFP의준비
[72] 실험에이용된 SFP는하기표 1과같다. Kpt는 Kps서열을기초로 Blast단백질 데이터베이스검색을통해선별하였다. [73] [표 1]
Figure imgf000011_0001
[74] l:2JiE£완 .실권.칸..1성.효..： S.il.
[75] 탈-이은수에 SFP (R5, Kps, Kpt)를각각 10 mg I mL의농도로제조하고, 1M의 TMOS(Tetrameliiyi oithosilicate)를·반응· W분전에 HC1을최종농도 ImM이 되도록첨가하여실리카전구체 silicic acid을제조하였디 실리카침전을위해 80 M.L의실리카침전반응용완충제 (아세테이트완충제 pH 5.0및칼륨포스페이트 완충제 pH 6, 7또는 8.0)에가수분해된 1 M의 TMOS 10 및 SFP 10 L를 첨가한후혼합물을실온에서 5분동안교반하여반응시켰디 침전된실리카 입자를원심분리로분리한다음탈이은수로 3회세척히-였다, pH에따른 펩타이드의실리카형성능은몰리브덴블루법을이용한실리카정량법으로 정량하였다.
[76]
[77] 1-3.니렘수지어]대하 SFP의히화성획-이
[78] PBS에녹인 10 mg/mL의펩타이드와 100 L를니켈수지를 30분간상온에서 교반하여혼합하고원심분리하여 (i4000xg, 5분)니켈수지와결합되지않은 펩타이드를회수하였다.상청액샘플중펩티드의양을 pierce Quantitative Fluorometric Peptide assay (Thermo Fisher Scientific, IL, USA)를이용하여 즉정하고,하기 Langmuir흡착등온선식 1에따라흡착용량 (q)과 Kd값을 계산하였디-.
[79] [식 1]
[80] q = (q· x Ceq) / (Kd + Ceq)
[81]
[82] 2.Fn단백질및 SFP-Fn융합단백질의제조
[83] 2-1.밤현백터및형짐저환체저！조
[84] 인간의중쇄페리틴 (human Ferritin heavy chain: Fn)유전자는 plJC57-Fn OPT (GenScript USA Inc.)를주형으로 PCR을수행하여준비하였다. PCR수행을위한 정방향/역방향프라이머의구체적인정보는하기표 2와같다.이어서 ,상기 PCR 산물로확보된 Fn유전자를 pET-42b백터에삽입하여 pET-Fn플라스미드를 제조하고대장균시스템（1 21（1：恨3））에도입하여형질전환체를제작하였다.
[85] [표 2]
Figure imgf000012_0001
[86] Kps-Fn및 Kpt-Fn을제조하기위하여 , pUC57-Fn OPT플라스미드를주형으로 하여 3게의 Kps또는 Kpi서열을 Fn의아미노말단에도입하：기위한각유전자에 대한전방향프라이머 3개（FI, F2및 F3-K：ps또는 -KpO를제작하였다（표 3） :미과 R Fn으로첫 PCR을수행후그산물을다시주형으로 F2와 R-Fn으로 PCR을 수행하고그산물을다시주형으로하여마지막 F3와 R-Fn으로 PCR을수행하여 Kps-Fn및 Kp（-Fn유전자를얻은푸 T-벡터인 pGEM-T Easy vector（Promega Co , Madison, W】）에서브클로닝하였디-.제한효소 Ndel / Xhol:으로상기서브 클로닝된 T··벡터로부터 Kps-Fn또는 Kpt-Fn유전자단편을절단하고,같은제한 효소로처리된 pET42b벡터를이용하여 pET-Kps-Fn, pET-Kpt-Fn을발현벡터를 제조하고이를대장균 RL21（DE3）에도입하여 Kps-Fn또는 Kpt-Fn생산균주를 제작하였디·.삽입된모든 DNA염기서열은자동화된 DNA시퀀싱（Cosmo Genetech Co , Seoul）에의해확인하였다,
[87] [표 3]
Figure imgf000012_0002
[88] 2-2.다백겉의밤혀
[89] 1¾， ¾또는 Kpt Fn발현벡터가도입된대장균 BL2ί £3）을카나마이신 （25能/ ¾£）이포함된 1 액체배양액에배양하여 37ᄋ 에서균체흡광도가’ 0 6~0.8 （600001흡광도）정도에이를때까지성장시킨후,최종농도가 0.1111 이되도록 ]1 （｝를첨가하였디-.이어서, 발현백터가도입된균주는 20。（::에서밤새 배양하여단백질발현을유도하고， Kps-Fi!또는： !¾）내11발현벡터가도입된 균주는 37。（：에서 4시간배양하여 8-¾또는 1예¾의발현을유도하였디-. 다음으로상기각균주를원심분리로회수후초음파처리로파쇄하고.， 4ᄋ（：에서 13000피이으로 30분간원심분리하여불용성균체파편을제거한후가용성 I I 분획만을회수하였다.상기가용성분획은 60°C에서 10분간처리하여침전된 단백질들을같은조건으로원심분리하여최종가용성분획을희수하였다.
[9이
[91] 2-3.다배짐의 정저 I
[92] - Fn단백질의정제 :왕산 ¾모늄짐전， phenyl- sheparose column chrom atograph y 및 Q-sepharose column chromatography의해정제하였다.
[93] - Kps-Fn및 Kpt-Fn단백질의정제:니켈수지를이용하여고순도로정제하였다.
[94] -최종적으로，용출된분획을투석을통해 50mM Tris-HCL 300mM Nad및 i % 수크로스 (pH 8.0)로완충액을교환하였다.각단백질농도는 Bradford분석시약 (Thermo Fisher Scientific)을사용하여즉정하였다.
[95]
[96] 3.키메라페리틴단백질의제조
[97j Fn과 Kps/Kpt-Fn단백질을다양한몰비율로혼합한혼합용액 (Kps-Fn 2rad대
Fn 10 mol의비율로융합된경우 Kps 2: 10로표현，같은방법으로 Kpt-Fn 2mol대 Fn 10 mol의비율로융합된경우 Kpt 2: 10)에 1M HC1을첨가하여 pH를 2.0으로 조정하여 20분동안페리틴을단량체로분해하고다시 1 M NaOH를첨가하여 pH를 8.0로조절하여 24개단량체페리틴이합체된키메라 Fn단백질을재구성 하였다. HC1및 NaOH의첨가로발생된염은 4OC에서완충용액 (50mM Tris-HCl, 300mM NaCl, pH B.O(TBS)및 1 %수크로즈로)으로 24시간동안투석하여 제거하었다、이어서，투석후 Aniicon Ultra TOOK원심여과액장치로여과·하여 단량체및막대형올리고머를제거하고，크기구배크로마토그라피를이용하여 구형의 Fn단백걸만을수득하였다.상기획득된 Fn단백질은이하규화반응의 주형으로사용하였다,모든단백질은사용전에 4OC에서단백질안정성을 유지하기위해 1 %수크로오스를함유하는 TBS완충액에저장하였다.
Figure imgf000013_0001
[101] 1M의 TMOSiTetraniethy] oriliosiUcate)를반웅 10분전에 HC1을최종농도
ImM이되도록첨가하여규산을제조하였다.다양한농도의글리세롤 (0 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %)을함유하는인산칼륨완충액 (pH 8.0)에 40«g/ ml 페리틴단백질및 lOmM규산을첨가한혼합물을실온에서 2시간동안진탕 반응시키고,원심분리에의해실리카로캡슐화된 Fn입자를수득하고，증류수로 수회세척하였다.
[102]
[loss 生요. jjm트 im j:
[104] 실리카캡슐화된 Fn입자를 1M NaOH에용해시키고 95 °C에서 5분동안
인큐베이션하였디-,희석된시료총 20 jxL를 1 M HC1 20 L와증류수 10 L가 들어있는 96 -웰플레이트의각웰에첨가하여 pH값을중화시켰다.후속 2020/165883 ?€1/162020/051518
12 단계에서， 2 %암모늄몰리브데이트테트라하이드레이트， 5 %옥살산및 10() 111^1아스코르빈산을각각 50 씩순차적으로첨가하였다.마지막으로 200 ¹ 용액의흡광도를파징· 700아»에서측정하였디-.메타규산나트륨비수화물의 용액을 ¾표준곡선을생성하기위해사용하였디-.
[105]
[106] 파티큼의표며특성
[107] 전물을증류수로세척하고,에탄올로희석하고 실리카웨이퍼상에 하였다,스캐닝전자현미경 (804)이미지는 2 의가속전압으로
Figure imgf000014_0001
0에서촬영되었다.샘플은이온스퍼터시스템 (1¾요베시030)을 사용하여아르곤대기에서
Figure imgf000014_0002
관찰직전에백금으로코팅되었다.
[108] 또한,실리카파티클의다공성및표면적측정을위하여, 내 1^ 2: 1이
Kpt - ¥\\, ]&마 2: 10에의해형성된 100
Figure imgf000014_0003
수행하였다.질소흡착등온선은
Figure imgf000014_0005
2020
Figure imgf000014_0004
0/\, \)을 사용하여 77 에서측정되었다.제조된샘플의비표면적은
Figure imgf000014_0006
사용하여질소흡착데이터에의해 결정되었다.
[109]
[110] 4-4.심리카파·티큼의 DNA휴착및용.
[111] (최종농도 60 ¾/ )와실리카입자 (최종농도 100 를섞은후
혼합물을실온에서 2시간동안진탕반응시키고실리카입자를원심분리에 의해결합완충액으로부터제거하였다. 용출을위해실리카입자에 20 의 정제수를첨가한다음,진탕조건 (200]1¾11)하에 30분동·안배양하였다.원심 분리후,실리카입자를연속적으로세척하여
Figure imgf000014_0007
켰다. 물에서의 농도는겔전기영동에서염색된 DNA밴드의세기를 1110^1 프로그램으로정량화하여결정되었다,
[112]
Figure imgf000014_0008
첨가하여 5분간반응시킨후· 1 N 8£1011를첨가하여반응용액의 를 8로 조절하여하룻동안냉장챔버에서교반반응시켰다.원심분리를통해침전물을 제거후,상청액을투석막에넣고페리틴내부에담지되지않은 [)0>[를 제거하였다. 33(«를담지한페리틴샘플 (: 1切86:6(0(«))에최종농도가 40% 되도록빈 이을첨가하고최종 11 03농도는 100 :조건에서 2시간동안 실리카형성반응을시킨후형성된실리카를침전시켜최종산물 (8102 / 86:6(!)0>0)을회수하였다.실리카반응을수행하지않은독소담지키메라 페리틴 86:6(1)0幻과실리카로캡슐화된 ¾0/^36:6(1)0幻로부터방출된 !)(¾양을비교하였디-, [ 1 15] 각 ImL샘플은투석막 ( 10K MWCO, Pierce)에넣은후투석막은· 10 niL의 완충액 (인산-시트레이트완충액, pH5.5와 pH7.4)이들어있는 50 mL튜브에 넣은후 37OC의항온에서 150 rpm으로진탕반응시켰다、상기 Dox방출량확인 시마다투석막밖의완충액을회수하고새완충액으로교환하였다,샘플로부터 방출된 Dox농도는상응하는완충용액에서의 Dox표준곡선과비교하여형광 마이크로플레이트판독기 (M85 / XInfinite F200 NanoQuant; TECAN)를사용하여 결정되었다、각시점에검출된 Dox양은시간에따른누적양으로계산하였디-.
[116】
[1 17] 4-6.이중약물저담시스텐
[118] 이중약물전달시스템의적용가능성을확인하기위해, mRFP단백질을모델 분자로사용하였디-,미리제조된 Kpt6:6 (Dox)용액을 mRFP및 20 mM의가수 분해된 TMOS를함유하는 50 mM인산나트륨완충액에첨가하였다 [mRFP대 Kpt6:6 (Dox)의몰비는 10대 H서 1대 1까지 :！. 24시간동안교반하여 mRFP를 Kpt6:6 (Dox)의규화된쉘에포획하였다 (Si02(mRFP)/Kpt6:6(Dox)).미반응 mRFP및 TMOS는 Amicon Ultra-0.5장치 (YM100)를사용하여제조사의지시에 따라 PBS (pH 7,4)로 5변에걸쳐한의여과에의해제거되었디-,
[119] Si02(mRFP)/K；pt6:6(Dox)로부터의 mRFP및 Dox의방출프로파일은 8일동안 매일 14,000 x g에서원심분리하여수득하였디-。침전물을 I mL의 PBS에재 분산시켰디 상청액중의 mRFP또는 Dox의양은형광마이크로플레이트리더 (Infinite F200 NanoQuant; TECAN)를사용하여각각 A590 / Xem 635 nm및 Aex 485 / X535 nm에서모니터링되었다.완충액중의 mRFP및 Dox의농도는각분자에 대한표준곡선에따라결정되었다、가시광선으로상등액으로방출된 Dox양을 즉정할때는 UV / visible microplate reader (Infinite M200 NanoQuant; TECAN)-· 사용하여 550 nm에서모니터링하였다.샘플로부터방출된 Dox농도는상응하는 완충용액에서의 Dox표준곡선과비교하여형광마이크로플레이트판독기 分 485 / X를사용하여결정되었다.각시점에검출된 Dox양은시간에따른 누적양으로계산하였디-,
[120]
[121] [실험결과]
[122] 실시예 1.실리카형성핍타이드의특성확인
[123] 丄丄.
Figure imgf000015_0001
[124] 상기표 1에 3종 SFP (R5, Kps, Kpt)각각을실리카전구체 (TMOS)와혼합한 용액의 pH를달리하여각펩타이드의실리카형성능을확인한결과， 3종 펩타이드모두 pH 7및 8에서높은실리카침전을나타냈다 . R5펩타이드는 Kps 및 Kpt와비교하여 pH 7.0에서가장높은활성을나타냈디-,그러나, pH 6.0에서 거의실리카를침전시키지못하였고， pH 5.0에서완전히활성이없었다. Kpt 펩타이드는 pH 5, 6및 8에서 R5및 Kps보:다더큰실리카형성능력을
나타냈디 _ (도 1), [125]
[126] 1 -2.니켈수지의 SFP흠착용량및히화력확? 1
[127] 히스티딘은히스티딘이미다졸고리상의 전자공여체그룹과수지에고정화된 전이금속（니켈또는코발트）사이의 배위결합을형성함으로써 매트릭스상에 고정된금속이온과강한상호작용을나타낸다. Kps, Kpt,및 6xHis펩타이드의 니켈수지에 대한결합능의 능력을조사하였다.
[128] Langmuir등온선을사용한 Ni-수지에대한펩타이드흡착파라미터 비교
결과를하기 표 4에 나타내었고，그등온선은도 2와같다,
[129] [표 4]
Figure imgf000016_0002
친화력이 보다더높은것으로나타났다. 6x018펩타이드- ¾값은 52.3하·로 펩타이드가 6x1:118와니켈수지에 대한유사한친화력을보여주었디·.
[131 ]
[132] 실시예 2.페리틴기반의실리카파티클형성 확인
[133] 페리틴의 아미노말단에도입된邪1?는페리틴구조표면에 노출된형태로
대장균에서발현되었디-,故5-1¾은황산암모늄으로침전시킨후소수성수지인 지를
[134]
Figure imgf000016_0003
닛이 모인 480 1<1）£1의 이상의 단백질을형성하는것을확인하였으나요5-1¾은그러한 페리틴구조를형성하지못한것으로나타났다（도 3.4）.즉 묘5서열이휴먼 페리틴의자가조립을방해하는것으로보인다, 1¾«와 ]¾）1:는 ]15에비해 이-미노산서열이짧으며，실리카를형성할수있고,또한정제도용이하게 때문에 ]¾5에 비해융합단백질제작에유용함을보였다.
Figure imgf000016_0001
Kps-Fi!, 竹!의 이미지（도 36）또한융합단백질과페리틴구조가동일함을나타내어 펩타이드가페리틴구조형성에 영향을주지 않음을확인하였디-, [135]
[136] 실시예 3,페리틴기반의실리카파티클입자크기및분산정도조절
[137] 3-1.：[¾과、¾平-!¾의비읍에따른크기조점
[138] : 이 에비해실리카형성능력이높은것과형성된실리카파티클 크기도큰것을확인하였다（도 4）.이를 해실리카형성능력과실리카파티클 크기에비례관계가존재할것으로가정 고 抑가융합되지않은페리틴은 실리카형성능이없고，페리틴표면에
Figure imgf000017_0001
밀도를달리하여실리카형성능을 조절함으로써실리카피·티클의사이즈조절이가능할것으로가정하여，도 5의 모식도와같이 8[꾸밀도에따른실리카파티클사이즈조절전략을수립하였다.
[139] 구체적으로,
Figure imgf000017_0002
1:5（2:10）로각각변경함으로써크기가다른바이오실리카입자（100 - 500 미고）를얻을수있었다（표 5,도 6）.
[14이 [표기
Figure imgf000017_0006
[141] *이론적으로 ¾키메라케이지의표면에존재하는펩타이드의수
[142】
[143] 3-2.바유계의금리세름농도에따른분산정도조점
[144] 실리카입자들은서로뭉쳐있는형태이니-
Figure imgf000017_0003
첨가하여반응시뭉침현상을방지하고 분산된실리카입자를얻을수있었다·（도 7）.
[145]
[146] 실시예 4,페리틴기반의실리카파티클의표면분석
[147] 실리카파티클의다공성과표면적을측정한결과는표 6에나타내었다.질소 흡착등온선분석은 ¾02/ 8-1¾및 ¾0:2/ 82:10의표면적이각각 403.18및 492.09 임을보여주었다, ¾02/하82:10의평균기공크기는 3.02 이며 , 이는 ¾02/1<^-1½의평균기공크기（약 2.65미 11）보다컸다.더작은크기의 바이오실리카나노파티클은더큰표면적을가짐을확인하였고이러한 특징으로인해생체분자들이결합시더큰부착표면을제공할수있을것이다. &02保:마-]¾및 ¾02/ 比10의표면적은각각 468 38및 537.68 으로 8102
/ ]¾3 ¾
Figure imgf000017_0004
에비해표면적이더큰것으로나타났디-, ¾（）2/¾；마2:10 의평균기공크기는 2.90 고이며 , ¾0/1¾）내]!1의평균기공크기는약 2.74 11111보.다약가증가하였다.
Figure imgf000017_0005
결합력을나타낸것으로판단된디、비교를위해시판하는비다공성 310 며«크기의실리카파티클에대한비교분석결과표면적은 2,30미2 ,평균 기공크기는 69아표로나타났으며 ,비다공성입자이므로입자사이의 공극으로 판단된다.
[148] [표 6]
Figure imgf000018_0001
[149] 실시예 5.폐리틴기반의실리카파티클의 DNA흡착및용출확인
[: 150] Kps-Fn, Kpt-Fn및키메라 Fn을주형으로사용하여합성된실리카니-노
입자뿐만이·니라 Bangs Laboratories Inc (Indiana, USA)의직경 170nra (수성 현틱_액)및 310nm (건식실리카)의판매되고있는실리카입자를이용하여 고농도칼륨하에서 700 bp크기의 DNA에대한흡착력을비교하였다.그결과, 키메라템플릿상의 Kps또는 K:pi의표면밀도가낮으면더작은크기의바이오 실리카입자를만들수있으며크기가작을수록표면적이증가함으로 DNA 흡착성능비교를통해표면적증가의 이점을확인하였다 (도 8) .본발명에서 개발된바이오실리카입자는시판되는실리카입자보다우수한 DNA흡착 성능을보였다.
[151 i
[152] 실시예 6.약물이딤·지된페리틴기반의실리카파티클의약물방출
[153] pH 5.5에서는 Dox방출량이증가하였고실리카코팅에의한차이는없었다-. 이는페리틴내부에담지된약물의방출이산에의해촉진되며실리카코팅은 pH에의한약물방출을방해하지않음을의미한다.
[154] pH 7.4에서는 Dox방출량이감소하였고,또한실리카코팅에의해빙-출속도가 보다감소됨을확인하였디、이는확산에의해서만약물방출이조절되기때문에 실리카코팅에의해확산속도가느려지는것으로판단된다.그러나시간이 지나면서약물방출속도가서서히증가하는데，이는실리카가분해되어실리카 코팅에의한약물방출저해가감소되기때문인것임을알수있다 (도 9),
[155]
[156i 실시예 7,이중약물전달시스템기반의실리카파티클의약물방출
[157] Si02/Kps6:6(Dox)제조와동일한방법으로제조된 Kpt6:6(Dox)의표면에 mRFP 분자의 in situ고정에의해이중약물전달시스템을시연하였다.카고분자 모델로서모노머 RFP (mRFP)를사용하고 Kpt6:6(Dox)에의해형성된실리카와 함께침전시켰디-. 2020/165883 ?€1/162020/051518
17
[158]
Figure imgf000019_0001
실리카파티클은，위의두가지결과에기초하여,두종류의분지 _가다른구획에 적제되고다른속도로방출될수있는이중약물전달체로사용될수있다.
[159]
[16이 이상으로본발명내용의특정한부분을상세히기술하였는바,당업계의 통상의지식을가진자에게있어서，이러한구체적기술은단지바람직한실시 양태일뿐이며，이에의해본발명의범위가제한되는것이아닌점은명백할 것이디、따라서본발명의실질적인범위는첨부된청구항들과그것들의 등가물에의하여정의된다고할것이다.

Claims

2020/165883 1^(:1^2020/051518
18
청구범위
［청구항 1］ 서열번호 1의아미노산서열을갖는펩타이드및서열번호 2의아미노산 서열을갖는펩타이드로이루어진군으로부터선택되는 1종이상의 펩타이드와실리카전구체를포함하는,실리카합성용조성물.
［청구항 2］ 제 1항에 있어서，
상기실리카전구체는테트라에틸오르토실리케이트,테트라메틸 오르토실리케이트，메틸트리에톡시실란，에틸트리에톡시실란，페닐 트리에톡시실란,디메릴디메톡시실란,디메릴디에톡시실란,트리 메틸에톡시실란,트리아미노프로필트리에톡시실란,티타니아 테트라이소프로폭사이드，티타니움옥시셀페이트,
티타니움비스암모니움락테이토디하이드록사이드,티타니음
디이소프로폭사이드비스아세릴아세토네이트및테트라에틸
게르마늄으로이루어진군으로부터선택된하나이상인것을특징으로 하는，실리카합성용조성물,
［청구항 3］ 서열번호 1의아미노산서열을갖는펩타이드및서열번호 2의아미노산 서열을갖는펩타이드로이루어진군으로부터선택되는 1종이상의 펩타이드와실리카전구체를반·웅시키는단계를포함하는실리카합성 방법.
［청구항 4］ 저 13항에 있어서,
상기반응은상온및상압의조건에서
Figure imgf000020_0001
5-8의수용액하에서수행되는 것을특징으로하는,실리카합성방법 .
［청구항기 서열번호 1또는서열번호 2의아미노산서열을포함하는펩타이드;및 페리틴(1¾出 11)및바이러스캡시드단백질로이루어진군으로부터 선택된하나이상을포함하는융합단백질,
［청구항 6］ 저ᅵ5항의융합단백질및실리카전구체를포함하는실리카파티클합성용 조성물.
［청구항 7］ (1)제 5항의융합단백질을산성조건에서단량체로분해하는단계;
(2)상기 단량체를약염기조건에서코어-쉘구조체로결합시키는단계; 및
(3)상기구조체에실리카전구체를혼합하여반응시키는단계;를 포함하는실리카파티클제조방법 .
［청구항 8］ 제 7항에 있어서,
상기 (1)단계는융합단백질과페리틴단백질을혼합하여수행되
Figure imgf000020_0002
특징으로하는,실리카파티클제조방법.
［청구항 9］ 제 8항에 있어서，
상기융합단백질과페리틴단백질은 1:1~5의비율로혼합되는 특징으로하는,실리카파티클제조방법 . [청구항 10] 제 7항에 있어서,
상기 (1)단계는 pH 2〜 3조건하에서수행되는것을특징으로하는, 실리키-파티클제조방법 .
[청구항 11] 제 7항에 있어서,
상기 (2)단계는 : pH 1-9조건히-에서수행되는것을특징으로하는, 실리카파티클제조방법.
[청구항 12] 제 7항에 있어서，
상기 (2)단계는하기의知)내지 (c)단계를포함하는것을특징으로하는, 실리카파티클저 i조방법:
(a)상기단량체와약물을혼합하는단계 ;
(b)약염기조건에서상기단량체를코어-쉘구조체로결합시켜약물이 담지된구조체를제조하는단계;및
(c)구조체내부에담지되지않은약물과구조체를형성하지않은 단량체를제거하여약물이담지된구조체를분리하는단계.
[청구항 13] 제 7항에 있어서，
상가 (3)단계는글리세롤이포함된용액내에서수행되는것을특징으로 하는，실리카파티클제조방법 .
[청구항 14] 제 7항에 있어서，
상기방법은 (3)단계이후에제조된실리카파티클을약물에담지하여 파티클표면에약물을결합시키는단계를추가로포함하는것을 특징으로하는，실리카파티클제조방법 .
[청구항 15] 제 7항내지제 15항중어느한항의방법으로제조된실리카피-티클. [청구항 16] (가)서열번호 12의염기서열로이루어진 Kps유전자또는서열번호 13의 염기서열로이루어진 Kpt유전자와페리틴 (ferritin)을암호화하는 유전자를포함하는재조합발현벡터를제조하는단계;
(나)상기발현벡터를숙주세포에도입하여형질전환체를제조하는 단계;및
(다)상기혈질전환체를배양하는단계;를포함하는실리카형성 펩타이드와페리틴의융합단백질제조방법.
[청구항 17] 제 16항에 있어서,
상기방법은 (다)단계이후에상기형질전환체를파쇄하고，원심분리를 통해형질전환체의파편을제가하여획득된가용성분획물을니켈 수지와혼합하여니켈수지에결합된융합단백질을수득하는단계를 주가로포함하는것을특징으로하는，융합단백질제조방법.
PCT/IB2020/051518 2019-02-15 2020-02-24 신규의 실리카 합성 펩타이드 및 이를 이용한 실리카 입자 합성방법 WO2020165883A2 (ko)

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