WO2020159159A2 - 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 - Google Patents

리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of lysosomal storage disease, and specifically to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of lysosomal storage disease comprising graphene quantum dots as an active ingredient.
  • Lysosomal storage disorder is a disease caused by the accumulation of abnormal substrates in lysosomes by abnormal metabolism. Lysosomal storage disorders are, for example, Nemanpic disease type A, type B and C, Gauche disease type II, Fabry disease, gangliosidosis, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, Kra Byeongjeung, dysentery white matter, such as nutrition.
  • Goche's disease known as the most common lysosomal storage disease, is the accumulation of the glycolipid glucocerebroside (also known as glucosylceramide), pain, severe neurological complications, swelling of the lymph nodes and adjacent joints, bloating of the abdomen, Symptoms of browning of the skin, anemia, low platelet counts and yellow fat deposits on the sclera.
  • Niemann-Pick's disease is a congenital autosomal recessive lysosomal accumulation disease in which sphingomyelin accumulates in lysosomes in cells, such as macrophages and neurons, neurodegeneration, enlargement of the liver and spleen, difficulty in breathing, etc. The symptoms of.
  • lysosomal storage diseases The cause of this lysosomal storage disease is unknown, but the cause is still unknown 100%, it is known that the major factor is the deficiency of a single enzyme required for metabolism of lipids, glycogen, glycoproteins or mucopolysaccharides.
  • Goche's disease is due to a deficiency of glucocerebrosidase
  • Nimanpick disease is due to a deficiency of acidic sphingomyelinase.
  • the defective enzymes are different in various diseases known as lysosomal storage diseases, it was not easy to find a treatment method generally applicable to lysosomal storage diseases.
  • the present invention aims to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of lysosomal storage diseases.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of lysosomal storage disease comprising graphene quantum dots as an active ingredient.
  • the lysosomal storage disease may be caused by a substrate accumulated in the lysosomal.
  • the graphene quantum dot may bind to a substrate that is not metabolized to suppress accumulation in the lysosome of the substrate or decompose the already accumulated substrate.
  • the graphene quantum dot may be a nano-sized fragment of graphene oxide or reduced oxide graphene.
  • the graphene quantum dot may include an oxygen atom-containing functional group selected from the group consisting of a carboxyl group, a ketone group, an aldehyde group, a hydroxyl group, and an epoxy group as a terminal functional group.
  • the graphene quantum dots may be 1 to 20 nm in length.
  • the lysosomal storage disease is Pompe disease, Goche's disease, Fabry disease, G M1 -ganglioside accumulation, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, Niemannpick disease, Krabe disease, Faber disease, Dystrophic leukodystrophy, Hurler-Scheier syndrome, Hunter's disease, San Philip's syndrome A, San Philip's syndrome B, San Philip's syndrome C, San Philip's syndrome D, Morquio's disease A, Morquio's disease B, It may be one or more diseases selected from the group consisting of Maroto-Rami syndrome, Sly's disease, alpha-mannosidosis, beta-mannosidosis, fucosid accumulation, sialidosis and Schindler-Kanza disease.
  • the lysosomal storage disease may be Niemann-Pick disease.
  • the composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating lysosomal storage disease, comprising administering a pharmaceutical composition containing graphene quantum dots as an active ingredient to an individual.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising graphene quantum dots as an active ingredient, for preventing or treating lysosomal storage diseases.
  • the present invention provides the use of graphene quantum dots for preparing a drug used for the prevention or treatment of lysosomal storage diseases.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention including graphene quantum dots, binds to substrates that are not metabolized using negative charges generated on the surface of graphene quantum dots to inhibit the substrate from accumulating in lysosomes or to decompose already accumulated substrates By showing the effect, it is possible to prevent or treat lysosomal storage diseases.
  • 5 is a result of improving the division ability by applying graphene quantum dots in human-derived cells.
  • Figure 11 is a graph comparing the size of the quantum dots and nano-graphene oxide.
  • Figure 12 is a graph comparing the size of the quantum dots and nano-graphene oxide.
  • the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of lysosomal storage disease of the present invention includes graphene quantum dots as an active ingredient.
  • graphene means that a plurality of carbon atoms are covalently linked to each other to form a polycyclic aromatic molecule, wherein the carbon atoms linked to the covalent bond are 6-membered rings as basic repeating units. Formed, it is also possible to further include a 5-membered ring and/or a 7-membered ring.
  • graphene quantum dots refers to graphene oxide or nano-sized fragments of reduced graphene oxide.
  • graphene oxide is also referred to as graphene oxides and may be abbreviated as "GOs".
  • the graphene may include a structure in which a functional group containing an oxygen atom such as a carboxyl group, a hydroxyl group, or an epoxy group is bonded, but is not limited thereto.
  • reduced graphene oxide refers to graphene oxide having a reduced oxygen atom ratio through a reduction process, and may be abbreviated as "rGQDs".
  • nano-oxidized graphene may be abbreviated as “nano-GOs” as nano-scale graphene oxide having an average diameter of 15 nm or more and an average height of 5 nm or more.
  • the surface of the graphene quantum dots according to the present invention exhibits a negative charge.
  • the graphene quantum dot according to the present invention may include an oxygen atom-containing functional group selected from the group consisting of a carboxyl group, a ketone group, an aldehyde group, a hydroxyl group, and an epoxy group as a terminal functional group.
  • a carboxyl group exhibiting a negative charge may be included as a main functional group.
  • graphene quantum dots can bind to substrates that are not metabolized using negative charges generated on the surface of the quantum dots, thereby inhibiting the accumulation in the lysosome of the substrate or decomposing the already accumulated substrate.
  • graphene quantum dots are not metabolized using the negative charges generated on the surface of the quantum dots, and by combining with the substrate accumulated in the form of an insoluble substrate, the characteristic of the insoluble substrate is changed to water-soluble and the graphene quantum dots exit the lysosome in a state in which the substrate is bound.
  • it also leads to the degradation of already accumulated substrates.
  • Lysosomal storage disorder in the present invention refers to a disease caused by the accumulation of substrates such as lipids, glycogen, glycoproteins, and mucopolysaccharides in lysosomes due to abnormal metabolism.
  • substrates such as lipids, glycogen, glycoproteins, and mucopolysaccharides in lysosomes due to abnormal metabolism.
  • Pompe disease Goche's disease, Fabry disease, G M1 -ganglioside accumulation, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, niemann-pick disease, Krabbe disease, Faber disease, dystrophic dystrophy, Russ-Scheier Syndrome, Hunter's Disease, San Phillippo Syndrome A, San Philip Po Syndrome B, San Philip Po Syndrome C, San Philip Po Syndrome D, Morquio Disease A, Morquio Disease B, Maroto-Rami Syndrome, Sli Disease, alpha-mannosidosis, beta-mannosidosis, fucoside accumulation, sialidosis, and Schindler-Kanzagi disease
  • Lysosomal Storage Disorder is a disease caused by the accumulation of substrate in the lysosome of cells due to a defect in lysosomal function, specifically, a single enzyme required for metabolism of lipids, glycogen, glycoproteins, or mucopolysaccharides. Can. Or it may be a disease caused by the accumulation of substrate in the lysosome due to disruption of the material transport system due to an abnormality of a gene related to the transport system of the intracellular material.
  • the present inventors have shown that regardless of the cause of substrate accumulation, as a result of earnest research efforts to develop a therapeutic agent capable of treating symptoms related to lysosomal accumulation, it is possible to prevent or treat lysosomal storage diseases by decomposing substrates that are not metabolized using graphene quantum dots. Confirmed.
  • the present invention is based on this.
  • the lysosomal storage disease may be Niemann-Pick disease.
  • Niemann-Pick's disease is a congenital autosomal recessive lysosomal storage disease characterized by excess sphingomyelin accumulation in lysosomes of cells, such as macrophages and neurons, impairing normal cell function.
  • Type A Neimanpic disease is due to the deficiency of acidic sphingomyelins and is a rapidly progressive neurodegenerative disease that typically leads to death at ages 2 to 3.
  • Type B Nemanpic disease causes enlargement of the liver and spleen, and shortness of breath, and is generally a lighter form leading to death in early adulthood.
  • Neimanpic disease is associated with acidic sphingomyelin (ASM) deficiency and are collectively referred to as Neimanpic disease or ASM deficiency (ASMD).
  • ASM acidic sphingomyelin
  • ASMD ASM deficiency
  • Nympic disease type C the protein product of the major mutated gene NPC1 is not an enzyme and serves to transport large water-insoluble molecules through cells as a transporter in the endosome-lysosome system.
  • the protein encoded by the NPC2 gene is a small cholesterol-binding protein present in the lysosomal lumen.
  • mutations in the NPC1 and NPC2 genes disrupt the transport system of intracellular material, causing accumulation of cholesterol and glycolipids in lysosomes.
  • the graphene quantum dots of the present invention can easily pass through the blood vessel-brain-barrier (BBB) by exhibiting a small size of nanoscale.
  • the graphene quantum dots according to the present invention may have an average length of about 1 nm to 20 nm.
  • it may be 1 nm to 10 nm, more preferably 1 nm to 5 nm, and most preferably 1.5 nm to 4 nm, but is not limited thereto.
  • the height is preferably 0.5 nm to 5 nm, more preferably 0.5 nm to 3 nm, most preferably 1.5 nm to 2.5 nm, but is not limited thereto.
  • the graphene quantum dot according to the present invention can be usefully used as a therapeutic agent for lysosomal storage disease.
  • a GQD Graphene Quantum Dot
  • motility is measured.
  • FIG. 1 the survival analysis of Purkinje cells in the cerebellum of the nimanpic disease-inducing model by applying graphene quantum dots
  • FIG. 2 the survival of Purkinje cells was increased in the group administered with GQD
  • pharmaceutical composition means a composition administered for a specific purpose.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes graphene quantum dots and treats or prevents lysosomal storage diseases, and can be formulated by including a compound and a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient involved therein. have.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention comprises 0.1 to 50% by weight of the active ingredient of the present invention relative to the total weight of the composition.
  • Examples of the carrier, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, and methylcellulose. , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is formulated as an oral dosage form such as powder, granule, tablet, capsule, suspension, emulsion, syrup, aerosol, external preparation, suppository, or sterile injectable solution according to a conventional method to be prepared as a pharmaceutical preparation. It can be formulated, in general, in the case of formulation, it may be prepared by using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, etc., which are usually used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations include at least one excipient in the pharmaceutical composition, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin. It can be prepared by mixing the back. In addition, lubricants such as magnesium stearate and talc may be used in addition to simple excipients.
  • Liquid preparations for oral use include suspending agents, intravenous solutions, emulsions, syrups, etc.In addition to the commonly used simple diluents, water and liquid paraffin, various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, are included. Can.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories, and the like.
  • Non-aqueous solvents, suspending agents may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • injectable esters such as ethyl oleate.
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, and glycerogelatin may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically) according to the desired method, specifically parenterally administered, and the dosage
  • the range varies depending on the patient's age, gender, weight, health status, diet, administration time, administration method, excretion rate and disease severity.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention is about 0.1 to 100 mg/kg, preferably 1 to 30 mg/kg, and can be divided and administered once to several times a day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include at least one active ingredient exhibiting the same or similar medicinal effect in addition to the graphene quantum dots according to the present invention.
  • prevention refers to all actions of inhibiting or delaying the onset of lysosomal storage diseases by the administration of graphene quantum dots according to the present invention.
  • treatment means all actions in which symptoms of lysosomal storage disease are improved or advantageously changed by administration of graphene quantum dots according to the present invention.
  • inhibitor means to prevent, reduce symptoms, or treat lysosomal storage diseases by administering graphene quantum dots according to the present invention.
  • the present invention provides a health functional food composition for the prevention or improvement of lysosomal storage disease, which includes graphene quantum dots as an active ingredient.
  • the term “improvement” means any action that at least reduces the parameters associated with the condition being treated, such as the severity of symptoms.
  • the health functional food composition according to the present invention may be added as an active ingredient to food or used with other foods or food ingredients, and may be suitably used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined according to its purpose of use (for prevention or improvement).
  • the health functional food composition is characterized by being formulated as one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, powders, capsules, and liquid formulations, including one or more of carriers, diluents, excipients, and additives.
  • Foods that can be added to the composition of the present invention include various foods, powders, granules, tablets, capsules, syrups, drinks, gums, teas, vitamin complexes, and health functional foods.
  • Additives that may be further included in the present invention include natural carbohydrates, flavoring agents, nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents (synthetic flavoring agents, natural flavoring agents, etc.), colorants, fillers, pactic acid and salts thereof, Alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, antioxidants, glycerin, alcohol, carbonic acid, and one or more components selected from the group consisting of flesh can be used.
  • Examples of the natural carbohydrates described above include monosaccharides, such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, etc.; And polysaccharides, for example, conventional sugars such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • As the flavoring agent natural flavoring agents (taumatine, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizine, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.
  • composition according to the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring and neutralizing agents, pactic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, and protection It may contain sex colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonic acid used in carbonated beverages, and the like.
  • flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring and neutralizing agents, pactic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, and protection It may contain sex colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonic acid used in carbonated beverages, and the like.
  • the present invention provides a method for preventing or treating lysosomal storage disease, comprising administering a pharmaceutical composition containing graphene quantum dots as an active ingredient to an individual.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising graphene quantum dots as an active ingredient, for preventing or treating lysosomal storage diseases.
  • the present invention provides the use of graphene quantum dots for preparing a drug used for the prevention or treatment of lysosomal storage diseases.
  • “individual” refers to a subject to which the graphene quantum dots of the present invention can be administered
  • the pharmaceutical composition of the present invention refers to mammals such as rats, mice, dogs, cats, horses, cows, and humans. It can be administered by a variety of routes to the subject, but is not limited thereto.
  • “administration” means providing a subject composition of the present invention to an individual in any suitable way.
  • GQD was produced using a thermo-oxidative cutting technique using carbon fiber as a raw material (FIG. 10).
  • the cerebellum of Nemanpic disease-causing rats was stained using immunoccytochemistry (ICC), and Calbindin is a protein specifically expressed in Purkinje cells in the cerebellum, and antibodies of this protein can be used to stain Purkinje cells.
  • ICC immunoccytochemistry
  • the ICC-stained Purkinje cells were observed using a method of labeling an antibody that recognizes the calbindin protein specifically expressed in Purkinje cells using an immunostaining method, and the number of cells was ImageJ software (version 1.46r, US National Institute) of Health, Bethesda, MD, USA), and the results are shown in FIG. 2.
  • iNSC induced neural stem cells
  • the dividing ability can be defined as the degree of expression of neurofilament expressed in differentiated neurons, but not expressed in neural stem cells.
  • Cells were fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) PBS solution for 15 minutes at room temperature and permeablilized by treatment with 0.25% Triton X-100 (Sigma) for 10 minutes. The immobilized cells were incubated with blocking solution (5% normal goat serum) for 1 hour at room temperature and incubated overnight with primary antibody at 4°C.
  • PFA paraformaldehyde
  • the cells were then incubated with a secondary antibody labeled with Alexa Fluor 594 (Invitrogen), and DAPI (Sigma) staining was performed for 5 minutes to stain the nuclei. Images were collected under a confocal microscope (confocal microscope, Eclipse TE200, Nikon, Japan). Expression was quantified using ImageJ software (version 1.46r, US National Institute of Health, Bethesda, MD, USA).
  • GQD-biotin was produced to be traced by attaching biotin to GQD (FIG. 8).
  • the paraffin of the paraffin slide was deparaffinized and blocked with PBS containing 5% normal chlorine serum. Sections were incubated overnight with biotin-primary antibody, followed by incubation with enzyme-linked secondary antibody and DAPI staining. Images were collected with a confocal microscope (confocal microscope, Eclipse TE200, Nikon, Japan).
  • Pristine graphene oxides were synthesized through an improved Hummer's method.
  • distilled water solution (3 mg/ml) of the obtained GOs is vigorously sonicated for 3 hours (tipsonicated) and vacuumed with a cellulose nitrate membrane filter (0.45 ⁇ m, GE Healthcare) -Filtered.
  • 300 mesh lacey carbon coated copper grids (Ted Pella, Inc.) were adsorbed with a solution (10 ⁇ g/ml) for dispersing the sample prepared according to the preparation example for 30 minutes. Prior to imaging the grid was washed with a few drops of distilled water and dried thoroughly in a desiccator. The prepared sample was analyzed with a high resolution-transmission electron microscope (HR-TEM, JEM-3010, JEOL Ltd.), and images were collected with a Gatan digital camera (MSC-794) coupled to a microscope. .
  • HR-TEM high resolution-transmission electron microscope
  • JEM-3010 JEM-3010, JEOL Ltd.
  • the average length of Nano-GO was measured to be 28.5 ⁇ 9.7 nm using a transmission electron microscopy (TEM) image, while GQD was measured to be 2.8 ⁇ 1.0 nm (FIG. 11).
  • TEM transmission electron microscopy
  • the average height of Nano-GO was measured to be 7.1 ⁇ 1.8 nm, while the GQD was measured to be 1.4 ⁇ 0.5 nm (FIG. 12).
  • Nano-GO and GQD are used in vivo.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention includes graphene quantum dots, and binds to substrates that are not metabolized using negative charges generated on the surface of graphene quantum dots, thereby inhibiting the substrate from accumulating in lysosomes or decomposing the already accumulated substrate. It is expected to be useful for preventing or treating lysosomal storage diseases.

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Abstract

본 발명은 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 그래핀 양자점을 포함함으로써, 니만픽병을 포함하는 다양한 리소좀 축적 질환에 대하여 우수한 약효를 나타낼 수 있는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물
본 발명은 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 2019년 01월 30일에 출원된 한국특허출원 제10-2019-0011642호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
리소좀 내에 기질이 비정상적 대사에 의해 축적되어 초래되는 질병이 리소좀 축적 질환(Lysosomal Storage Disorder, LSD)이다. 리소좀 축적 질환은 축적되는 기질로 인해 나타나는 증상에 따라 예를 들어 니만픽병 A형, B형 및 C형, 고셰병 II형, 파브리병, 강글리오시드증, 테이-삭스병, 샌드호프병, 크라베병, 이염성백질이영양증 등으로 나타난다.
예를 들어, 가장 흔한 리소좀 축적 질환으로 알려진 고셰병은 당지질인 글루코세레브로시드(또는 글루코실세라미드라고도 알려짐)가 축적되는 것으로, 통증, 심한 신경학적 합병증, 림프절 및 인접 관절의 종창, 복부 팽만, 피부의 갈색화, 빈혈, 낮은 혈소판 수치 및 공막 상의 황색 지방 침착의 증상을 나타낸다. 또한, 니만픽병(Niemann-Pick's disease)은 세포, 예컨대 대식세포 및 뉴런 내의 리소좀에 스핑고미엘린(sphingomyelin)이 축적되는 선천성 상염색체 열성 리소좀 축적 질환으로, 신경퇴행, 간과 비장의 확대, 호흡 곤란 등의 증상을 나타낸다.
이러한 리소좀 축적 질환의 발병원인은 그 원인이 아직까지도 100 퍼센트 밝혀지지는 않았지만, 지질, 글리코겐, 당단백질 또는 뮤코다당의 대사에 필요한 단일 효소의 결핍이 주요 요인인 것으로 알려져 있다. 예를 들어 고셰병은 글루코세레브로시다아제의 결핍에 기인하고, 니만픽병은 산성 스핑고미엘리나아제의 결핍에 기인한다. 이와 같이 리소좀 축적 질환으로 알려진 다양한 질환들에서 결함 효소가 각기 상이하므로, 리소좀 축적 질환에 일반적으로 적용할 수 있는 치료법을 찾는 것은 쉽지 않았다.
이에, 리소좀 축적과 관련된 증상을 치료하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있으나, 리소좀 축적 질환에 공통적으로 예방 또는 치료 효과를 나타내는 치료제는 아직까지 개발되지 않은 실정이다.
본 발명은 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 리소좀 축적 질환은 리소좀 내에 축적된 기질에 의해 유발되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 그래핀 양자점은 대사되지 못한 기질에 결합하여 기질의 리소좀 내 축적을 억제하거나 이미 축적된 기질을 분해할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 그래핀 양자점은 산화 그래핀 또는 환원 산화 그래핀의 나노-크기 단편일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 그래핀 양자점은 말단 작용기로 카르복실기, 케톤기, 알데하이드기, 히드록시기 및 에폭시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 산소 원자 함유 작용기를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 그래핀 양자점은 길이가 1 내지 20 nm일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 리소좀 축적 질환은 폼피병, 고셰병, 파브리병, G M1-강글리오시드 축적증, 테이-삭스병, 샌드호프병, 니만픽병, 크라베병, 파버병, 이염성백질이영양증, 후를러-샤이에 증후군, 헌터병, 산필립포 증후군 A, 산필립포 증후군 B, 산필립포 증후군 C, 산필립포 증후군 D, 모르퀴오병 A, 모르퀴오병 B, 마로토-라미증후군, 슬라이병, 알파-만노시도시스, 베타-만노시도시스, 푸코시드축적증, 시알리도시스 및 쉰들러-칸자기병으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 리소좀 축적 질환은 니만픽병일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 제조하기 위한 그래핀 양자점의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 그래핀 양자점을 포함하여, 그래핀 양자점 표면에 생성된 음전하를 이용하여 대사되지 못한 기질들에 결합하여 기질이 리소좀 내에 축적되는 것을 억제하거나 이미 축적된 기질을 분해하는 효과를 나타냄으로써 리소좀 축적 질환을 예방하거나 치료할 수 있다.
도 1은 니만픽 질환 유발 모델의 그래핀 양자점 적용에 의한 운동성 분석 결과이다.
도 2는 니만픽 질환 유발 모델의 소뇌에서 그래핀 양자점 적용에 의한 Purkinje 세포의 생존 분석 결과이다.
도 3은 Purkinje 세포 내의 그래핀 양자점 적용에 의한 콜레스테롤 침착 완화 결과이다.
도 4는 인체유래 세포에서 그래핀 양자점 적용에 의한 콜레스테롤 침착 완화 결과이다.
도 5는 인체유래 세포에서 그래핀 양자점 적용에 의한 분열능 개선 결과이다.
도 6은 인체유래 세포에서 그래핀 양자점 적용에 의한 분화능 개선 결과이다.
도 7은 그래핀 양자점의 BBB 투과 결과이다.
도 8은 그래핀 양자점에 비오틴을 부착하는 반응도이다.
도 9는 그래핀 양자점의 BBB 투과 결과이다.
도 10은 그래핀 양자점 제조 반응을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 11은 그래핀 양자점과 나노그래핀옥사이드의 사이즈를 비교한 것이다.
도 12는 그래핀 양자점과 나노그래핀옥사이드의 사이즈를 비교한 것이다.
도 13은 그래핀 양자점과 나노그래핀옥사이드의 Raman spectroscopy의 측정 결과이다.
본 발명의 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물은 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함한다.
본원 명세서 전체에서, "그래핀"이라는 용어는 복수개의 탄소 원자들이 서로 공유 결합으로 연결되어 폴리시클릭 방향족 분자를 형성한 것을 의미하는 것으로서, 상기 공유 결합으로 연결된 탄소 원자들은 기본 반복 단위로서 6 원환을 형성하나, 5 원환 및/또는 7 원환을 더 포함하는 것도 가능하다.
본원 명세서 전체에서, "그래핀 양자점 (graphene quantum dots, GQDs)"이라는 용어는 산화 그래핀 또는 환원 산화 그래핀의 나노-크기 단편을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "산화 그래핀"이라는 용어는 그래핀 옥사이드 (graphene oxides)라고도 불리우고, "GOs"로 약칭될 수 있다. 구체적으로, 그래핀 상에 카르복실기, 히드록시기, 또는 에폭시기 등의 산소 원자를 함유하는 작용기가 결합된 구조를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원 명세서 전체에서, "환원 산화 그래핀"이라는 용어는 환원 과정을 거쳐 산소 원자 비율이 줄어든 산화 그래핀을 의미하는 것으로서, "rGQDs"로 약칭될 수 있다.
본원 명세서 전체에서, "나노 산화 그래핀"이라는 용어는 평균 직경이 15 nm 이상이고 평균 높이가 5 nm 이상인 나노 스케일의 산화 그래핀으로서 "nano-GOs"로 약칭될 수 있다.
본 발명에 따른 그래핀 양자점은 표면이 음전하를 나타낸다. 구체적으로, 본 발명에 따른 그래핀 양자점은 말단 작용기로 카르복실기, 케톤기, 알데하이드기, 히드록시기 및 에폭시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 산소 원자 함유 작용기를 포함할 수 있다. 특히, 음전하를 나타내는 카르복실기를 주요 작용기로 포함할 수 있다.
본 발명에서, 그래핀 양자점은 양자점 표면에 생성된 음전하를 이용하여 대사되지 못한 기질들에 결합하여 기질의 리소좀 내 축적을 억제하거나 이미 축적된 기질을 분해할 수 있다. 구체적으로 그래핀 양자점은 양자점 표면에 생성된 음전하를 이용해 대사되지 못하고 불용성 기질 형태로 축적된 기질과 결합함으로써 불용성 기질의 특징을 수용성으로 변화시키고 기질을 결합한 상태로 그래핀 양자점이 리소좀을 빠져나감으로써 리소좀 내 기질의 축적을 억제할 뿐만 아니라 이미 축적된 기질의 분해를 유도한다.
본 발명에서 리소좀 축적 질환(Lysosomal Storage Disorder, LSD)은 비정상적 대사에 의해 리소좀 내에 지질, 글리코겐, 당단백질, 뮤코다당 등의 기질이 축적됨으로써 발생하는 질환을 의미한다. 구체적으로 폼피병, 고셰병, 파브리병, G M1-강글리오시드 축적증, 테이-삭스병, 샌드호프병, 니만픽병(niemann-pick), 크라베병, 파버병, 이염성백질이영양증, 후를러-샤이에 증후군, 헌터병, 산필립포 증후군 A, 산필립포 증후군 B, 산필립포 증후군 C, 산필립포 증후군 D, 모르퀴오병 A, 모르퀴오병 B, 마로토-라미증후군, 슬라이병, 알파-만노시도시스, 베타-만노시도시스, 푸코시드축적증, 시알리도시스 및 쉰들러-칸자기병으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
리소좀 내에 기질이 축적되는 원인은 여러 가지일 수 있다. 주로 리소좀 축적 질환(Lysosomal Storage Disorder, LSD)은 리소좀 기능의 결함, 구체적으로 지질, 글리코겐, 당단백질 또는 뮤코다당의 대사에 필요한 단일 효소의 결핍에 의해 세포의 리소좀 내에 기질이 축적됨으로써 발생하는 질환일 수 있다. 또는 세포 내 물질의 수송 시스템에 관련된 유전자의 이상으로 인해 물질 수송 시스템이 붕괴되어 리소좀 내에 기질이 축적됨으로써 발생하는 질환일 수 있다.
본 발명자들은 기질 축적의 원인에 상관없이 리소좀 축적과 관련된 증상을 치료할 수 있는 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과 그래핀 양자점을 이용하여 대사되지 못한 기질들을 분해함으로써 리소좀 축적 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다. 본 발명은 이에 기초한 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 리소좀 축적 질환은 니만픽병일 수 있다. 니만픽병(Niemann-Pick's disease)은 세포, 예컨대 대식세포 및 뉴런의 리소좀에서의 스핑고미엘린 과잉 축적을 특징으로 하는 선천성 상염색체 열성 리소좀 축적 질환으로서, 정상 세포 기능을 손상시킨다. A형 니만픽병은 산성 스핑고미엘린아제의 결핍으로 인한 것이며 빠른 진행형의 신경퇴행성 질환으로, 전형적으로 2세 내지 3세에 죽음에 이르는 질환이다. B형 니만픽병은 간과 비장의 확대, 및 호흡 곤란을 야기하며 일반적으로 성인 초기에 사망에 이르는 보다 가벼운 형태이다. 이러한 두 가지 형태의 니만픽병은 모두 산성 스핑고미엘린아제(ASM) 결핍과 연관되며 통틀어 니만픽병 또는 ASM 결핍증(ASMD)으로 지칭된다. 니만픽병의 다른 타입, 예를 들어 C형은 ASM 유전자에서 돌연변이를 수반하지 않고 ASM의 기능에 직접적인 원인이 있지 않으며, NPC1 및 NPC2 유전자에서의 돌연변이의 결과이다. 니만픽병 C형에서, 주요 돌연변이된 유전자 NPC1의 단백질 생성물은 효소가 아니며 엔도솜-리소좀 시스템에서 트랜스포터로서 세포를 통해 대형 수-불용성 분자를 옮기는 역할을 한다. 또한 NPC2 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 리소좀 루멘에 존재하는 소형 콜레스테롤-결합 단백질이다. 따라서, NPC1 및 NPC2 유전자의 돌연변이는 세포 내 물질의 수송 시스템을 붕괴시켜 리소좀 내에 콜레스테롤과 글리코리피드의 축적을 일으킨다.
본 발명의 그래핀 양자점은 나노 스케일의 작은 크기를 나타냄으로써 혈관-뇌-장벽(BBB)을 쉽게 통과할 수 있다.
이를 위해, 본 발명에 따른 그래핀 양자점은 평균 길이가 약 1 nm 내지 20 nm 일 수 있다. 바람직하게는, 1 nm 내지 10 nm, 보다 바람직하게는 1 nm 내지 5 nm, 가장 바람직하게는 1.5 nm 내지 4 nm 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 높이는 바람직하게는 0.5 nm 내지 5 nm, 보다 바람직하게는 0.5 nm 내지 3 nm, 가장 바람직하게는 1.5 nm 내지 2.5 nm 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 GQD의 혈관-뇌-장벽(Blood-Brain-Barrier, BBB) 통과 실험에서, GO과 GQD의 투과율을 측정했을 때 GQD의 투과율이 현저히 올라가 있음을 확인했다(도 7). 또한, 그래핀 양자점의 체외 ( In vivo) 혈관-뇌-장벽 투과성 실험에서, GQD-biotin을 쥐의 복부에 주입 후 실험이 완료된 쥐의 소뇌에 biotin-antibody를 처치했을 때, GQD-biotin을 처치한 쥐의 소뇌에 GQD를 검출할 수 있었다(도 9).
더불어, 본 발명의 그래핀 양자점은 체내에 축적되는 문제점도 발견되지 않았다.
따라서, 본 발명에 따른 그래핀 양자점은 리소좀 축적 질환의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른, 그래핀 양자점의 적용에 의한 니만픽 질환 유발 모델의 운동성을 분석한 실험에서, 니만픽 질환 유발 쥐에 GQD(Graphene Quantum Dot)를 복강 내로 주사하고, 운동성을 측정했을 때 GQD를 복강으로 넣어준 군에서 운동성의 회복을 관찰할 수 있었다(도 1). 또한, 그래핀 양자점 적용에 의한 니만픽 질환 유발 모델의 소뇌에서 Purkinje 세포의 생존 분석을 실험한 결과, GQD를 투여한 군에서 Purkinje 세포의 생존이 증가했음을 알 수 있었다(도 2). 또한, Purkinje 세포 내의 콜레스테롤 침착 완화 효과를 분석한 결과, 니만픽 질환 유발 쥐의 Purkinje 세포에서 (con) 콜레스테롤이 침착되는데 반해 GQD 투여 군에서 침착증상이 완화되는 것을 관찰할 수 있었다(도 3). 또한, 유도신경줄기세포(iNSC)를 이용한 인체사용 가부를 검증한 실험에서, 니만픽 환자 유래 섬유아세포(fibroblast)를 이용해 유도신경줄기세포(induced Neural Stem Cell; iNSC)를 생산한 뒤 신경세포에 GQD의 효과를 검정한 결과, 환자유래 iNSC에서 콜레스테롤이 침착되는 현상을 관찰할 수 있었고 같은 그래핀 유래 물질인 GO(Graphene Oxide)에 비해 탁월한 효과를 보임을 관찰했다(도 4). 또한, 인체유래 세포에서 분열능을 측정한 실험에서, 니만픽 환자유래 iNSC에서 세포의 분열이 현저하게 떨어져 있음을 확인하고 GQD를 적용한 경우 분열능이 회복하는 것을 관찰했고(도 5), 니만픽 환자유래 iNSC에서 뉴런세포로의 분화가 현저하게 떨어져 있음을 확인하고 GQD를 적용한 경우 분화능이 회복하고, GO에 비해 확연히 향상된 분화능을 보임을 관찰했다(도 6).
본 발명에서 "약학적 조성물"이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학적 조성물은 그래핀 양자점을 포함하고 리소좀 축적 질환을 치료하거나 예방하는 것이며, 이에 관여하는 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하여 제제화 할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 유효성분을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 예를 들면 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 의약 제제로 제조되기 위해 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 제형으로 제제화될 수 있는데, 일반적으로, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있고, 구체적으로 비경구 투여될 수 있으며, 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 일일 투여량은 약 0.1 내지 100 mg/㎏이고, 바람직하게는 1 내지 30 mg/㎏이며, 하루 일회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명에 따른 그래핀 양자점 외에 동일 또는 유사한 약효를 나타내는 유효성분을 1종 이상 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 "예방(prevention)"이란 본 발명에 따른 그래핀 양자점 투여에 의해 리소좀 축적 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 “치료(treatment)”란 본 발명에 따른 그래핀 양자점 투여에 의해 리소좀 축적 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 “억제(inhibition)”란 본 발명에 따른 그래핀 양자점 투여에 의해 리소좀 축적 질환을 미연에 방지하는 것, 증상을 경감시키는 것, 또는 치료하는 것을 포함하는 의미이다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은, 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물에 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다. 상기 본 발명에 더 포함될 수 있는 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제(합성 풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알코올, 탄산화제, 및 과육으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 제조하기 위한 그래핀 양자점의 용도를 제공한다.
본 발명에서 “개체(individual)”란 본 발명의 그래핀 양자점이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 개, 고양이, 말, 소, 인간 등의 포유동물을 포함하는 대상에 다양한 경로로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
이하, 하기 실시예 및 실험예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 그래핀 양자점(Graphene Quantom Dot, GQD)의 제조
카본파이버(Carbon Fiber)를 원재료로 하여 Thermo-oxidative cutting 기술을 이용해 GQD를 생성하였다(도 10).
구체적으로, 카본파이버를 황산과 질산을 3:1 비율로 섞은 용액에 넣은 후 80℃에서 24 시간 동안 가열하였다(thermo-oxidation process). 반응이 완료된 후, 투석 과정, 진공 여과 등을 통해 정제하여 Rotovap으로 최종적인 파우더 형태의 GQDs를 수득하였다. 이렇게 만들어진 GQDs는 구조적으로 매우 다양한 사이즈(약 1 nm 내지 약 20 nm)를 가진 나노 크기 입자의 형태로 수득되었다.
실험예 1. 그래핀 양자점의 적용에 의한 니만픽 질환 유발 모델의 운동성 분석
그래핀 양자점의 리소좀 축적 질환의 치료효과를 분석하기 위해 니만픽 질환 유발 쥐에 상기 실시예 1에서 제조한 GQD를 2주 내지 8주 동안 1주일에 한번 300 μg을 복강 내로 주사하였다. 니만픽 유발 쥐는 니반픽질환에서 가장 핵심으로 작용하는 NPC1 단백질의 돌연변이를 모사하기 위해 쥐에서 NPC1 유전자를 녹아웃 해서 질환을 유발했으며 Jackson laboratories 에서 구입했다.
4주, 5주 동안 쥐의 운동성을 예비로 측정하여 180초를 Rota-rod 위에서 버틴 개체만 선별해 본 실험에 이용하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 6주 (1), 7주 (2), 8주 (3)에 운동성을 측정했을 때 GQD를 복강으로 넣어준 군에서 운동성의 회복을 관찰할 수 있었다.
실험예 2. 그래핀 양자점 적용에 의한 니만픽 질환 유발 모델의 소뇌에서 Purkinje 세포의 생존 분석
니만픽 질환 유발 쥐의 소뇌를 ICC(immunocytochemistry)를 이용해 염색하였으며, Calbindin은 소뇌에서 Purkinje 세포에서 특이적으로 발현하는 단백질인데 이 단백질의 항체를 이용해 Purkinje 세포를 염색할 수 있다.
상기 ICC로 염색한 Purkinje 세포를 면역염색법을 이용해 Purkinje 세포에서 특이적으로 발현하는 calbindin 단백질을 인지하는 항체를 표지하는 방법을 이용하여 관찰하고, 세포의 개수는 ImageJ 소프트웨어(version 1.46r, US National Institute of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 정량화하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, GQD를 투여한 군에서 Purkinje 세포의 생존이 증가하였음을 관찰하였다.
실험예 3. Purkinje 세포 내의 콜레스테롤 침착 완화 효과 분석
Purkinje 세포 내 콜레스테롤 침착 정도를 확인하기 위하여, Filipin을 이용하여 콜레스테롤을 염색하고, calbindin 항체를 이용한 ICC 동시염색을 통해 Purkinje 세포의 세포질에 콜레스테롤 침착을 관찰하였다. 구체적으로, 세포를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde; PFA) PBS 용액에 실온에서 15분 동안 고정하고, 0.25% Triton X-100(Sigma)으로 10분 동안 처리하여 Filipin과 함께 상온에서 1시간 인큐베이션 한 후 DAPI(Sigma) 염색을 5분 동안 수행하여 핵을 염색하였다. Filipin의 침착은 공초점 현미경(confocal microscope, Eclipse TE200, Nikon, Japan)을 이용해 형광발현을 관찰하고 발현은 ImageJ 소프트웨어(version 1.46r, US National Institute of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 정량화하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 니만픽 질환 유발 쥐의 Purkinje 세포에서 (con) 콜레스테롤이 침착되는데 반해 GQD 투여 군에서 침착증상이 완화되는 것을 확인하였다.
실험예 4. 유도신경줄기세포(iNSC)를 이용한 인체사용 가부 검증
4-1. 인체유래 세포에서 콜레스테롤 침착 분석
Coriell institute에서 구입한 니만픽 환자유래 섬유아세포(fibroblast-GM03123)를 이용해 유도신경줄기세포(induced Neural Stem Cell; iNSC)를 생산한 뒤 신경세포에 GQD의 효과를 검정했다.
구체적으로, 실험예 3과 동일하게 Filipin 염색을 통해 콜레스테롤의 침착을 관찰하고 공초점 현미경(confocal microscope, Eclipse TE200, Nikon, Japan)을 이용해 형광발현을 관찰하고 발현은 ImageJ 소프트웨어(version 1.46r, US National Institute of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 정량화하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 니만픽 환자유래 iNSC에서 콜레스테롤이 침착되는 현상이 관찰되는 반면, GQD 처리군은 같은 그래핀 유래 물질인 GO(Graphene Oxide) 처리군에 비해 탁월한 효과를 보임을 확인하였다.
4-2. 인체유래 세포에서 분열능 측정
(1) 니만픽 환자유래 iNSC에서 세포의 분열이 현저하게 떨어져 있음을 확인하고 GQD를 적용한 경우 분열능이 회복하는 것을 관찰했다(도 5). 분열능은 신경줄기세포에서 발현하지 않지만 분화된 신경세포에서 발현하는 neurofilament의 발현 정도로 정의 할 수 있다. 세포를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde; PFA) PBS 용액에 실온에서 15분 동안 고정하고, 0.25% Triton X-100(Sigma)으로 10분 동안 처리하여 투과성을 높였다(permeablilized). 고정된 세포는 차단 용액(blocking solution, 5% 정상염 소혈청(normal goat serum))과 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고 일차 항체와 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 이후 세포를 Alexa Fluor 594(Invitrogen)로 표지된 이차 항체와 인큐베이션하고, DAPI(Sigma) 염색을 5분 동안 수행하여 핵을 염색하였다. 이미지는 공초점 현미경(confocal microscope, Eclipse TE200, Nikon, Japan)으로 수집하였다. 발현은 ImageJ 소프트웨어(version 1.46r, US National Institute of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 정량화하였다.
(2) 니만픽 환자유래 iNSC에서 뉴런세포로의 분화가 현저하게 떨어져 있음을 확인하고 GQD를 적용한 경우 분화능이 회복하는 것을 관찰했다. 마찬가지로 GO에 비해 확연히 향상된 분화능을 보임을 확인하였다(도 6).
실험예 5. GQD의 혈관-뇌-장벽(Blood-Brain-Barrier, BBB) 통과
5-1. 시험관 내 ( In vitro ) 혈관-뇌-장벽 assay
BMEC (brain microvascular endothelial cells)과 astrocyte을 이용해 trans well system을 이용한 in vitro BBB assay를 제작할 수 있었고 TEER (Transepithelial electrical resistance)을 측정해 이 assay가 BBB를 모방하고 있음을 보여줬다. 이 실험에서 GO과 GQD의 투과율을 측정했을 때 GQD의 투과율이 현저히 올라가 있음을 확인하였다(도 7).
5-2. 그래핀 양자점의 체외 ( In vivo ) 혈관-뇌-장벽 투과성
GQD에 biotin을 달아 추적할 수 있는 GQD-biotin을 제작했다(도 8).
전 조직 면역염색(whole tissue immunohistochemistry)을 위하여, 파라핀 슬라이드의 파라핀을 제거하고(deparaffinized), 5% 정상염소혈청 함유 PBS로 차단하였다. 단편(sections)을 biotin-일차 항체와 밤새도록 인큐베이션한 후, enzyme-linked 2차 항체와 인큐베이션하고, DAPI 염색하였다. 이미지는 공초점 현미경(confocal microscope, Eclipse TE200, Nikon, Japan)으로 수집하였다.
GQD-biotin을 쥐의 복부에 주입 후 실험이 완료된 쥐의 소뇌에 biotin-antibody를 처치했을 때, 도 9에 나타낸 바와 같이 GQD-biotin을 처치한 쥐의 소뇌에서 GQD를 검출할 수 있었다(도 9에서 화살표로 표시, CB: cerebellum(소뇌), BS: brain stem(뇌간)).
실험예 6. GQD의 생성과 Nano-GO의 차별성
6-1. Nano-GO의 수득
개선된 허머방법(Hummer's method)을 통해 오염되지 않은(pristine) 산화그래핀(graphene oxides; GOs)을 합성하였다. 나노크기의 GOs를 제조하기 위하여, 수득한 GOs의 증류수 용액(3 mg/ml)을 3시간 동안 격렬히 초음파 처리하고(tipsonicated) 질산셀룰로오스 막 필터(cellulose nitrate membrane filter, 0.45 μm, GE Healthcare)로 진공-여과하였다.
6-2. TEM 사진을 이용한 GQD와 Nano-GO의 길이 차이
300 메쉬 레이스형 탄소(lacey carbon)가 코팅된 구리 격자(copper grids)(Ted Pella, Inc.)에 상기 제조예에 따라 준비한 시료를 분산시킨 용액(10 μg/ml)을 30분 동안 흡착시켰다. 이미징에 앞서 상기 격자를 수 방울의 증류수로 세척하고 데시케이터에서 완전히 건조시켰다. 이와 같이 준비한 시료를 고해상도 투과전자현미경(high resolution-transmission electron microscope; HR-TEM, JEM- 3010, JEOL Ltd.)으로 분석하고, 현미경에 결합시킨 Gatan 디지털 카메라(MSC-794) 로 이미지를 수집하였다.
그 결과, Transmission electron microscopy (TEM) 이미지를 이용해 Nano-GO의 평균 길이는 28.5 ± 9.7 nm 로 측정된 반면 GQD는 2.8 ± 1.0 nm으로 측정 되었다(도 11).
6-3. AFM 사진을 이용한 두 물질의 높이 차이
Atomic force microscopy (AFM)를 이용해 두 물질의 높이 차이를 측정했을 때 Nano-GO의 평균 높이는 7.1 ± 1.8 nm 로 측정된 반면 GQD는 1.4 ± 0.5 nm 으로 측정되었다(도 12).
6-4. Raman spectroscopy의 측정 결과
Raman spectroscopy의 측정 결과 Nano-GO와 GQD 둘 다 graphene-based material의 특징인 D와 G band (1360 and 1600 cm - 1)가 측정되었다. Nano-GO의 경우 밀도 있고 넓은 D band를 보이는데 이는 결함 부위(defect site)를 함유하기 때문이다(도 13).
이런 차이점으로 인해 Nano-GO와 GQD가 생체에 사용할 경우 다른 결과가 나타남을 예상할 수 있다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 그래핀 양자점을 포함하여, 그래핀 양자점 표면에 생성된 음전하를 이용하여 대사되지 못한 기질들에 결합하여 기질이 리소좀 내에 축적되는 것을 억제하거나 이미 축적된 기질을 분해함으로써 리소좀 축적 질환을 예방하거나 치료하는데 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Claims (12)

  1. 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 리소좀 축적 질환은 리소좀 내에 축적된 기질에 의해 유발되는 것인, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 그래핀 양자점은 대사되지 못한 기질에 결합하여 기질의 리소좀 내 축적을 억제하거나 이미 축적된 기질을 분해하는 것인, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 그래핀 양자점은 산화 그래핀 또는 환원 산화 그래핀의 나노-크기 단편인, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 그래핀 양자점은 말단 작용기로 카르복실기, 케톤기, 알데하이드기, 히드록시기 및 에폭시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 산소 원자 함유 작용기를 포함하는 것인, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 그래핀 양자점은 길이가 1 내지 20 nm인, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 리소좀 축적 질환은 폼피병, 고셰병, 파브리병, G M1-강글리오시드 축적증, 테이-삭스병, 샌드호프병, 니만픽병, 크라베병, 파버병, 이염성백질이영양증, 후를러-샤이에 증후군, 헌터병, 산필립포 증후군 A, 산필립포 증후군 B, 산필립포 증후군 C, 산필립포 증후군 D, 모르퀴오병 A, 모르퀴오병 B, 마로토-라미증후군, 슬라이병, 알파-만노시도시스, 베타-만노시도시스, 푸코시드축적증, 시알리도시스 및 쉰들러-칸자기병으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환인, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 리소좀 축적 질환은 니만픽병인, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  10. 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료방법.
  11. 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료 용도.
  12. 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 제조하기 위한 그래핀 양자점의 용도.
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