WO2020139014A2 - 외래 단백질을 발현하는 미생물, 및 그의 용도 - Google Patents

외래 단백질을 발현하는 미생물, 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2020139014A2
WO2020139014A2 PCT/KR2019/018596 KR2019018596W WO2020139014A2 WO 2020139014 A2 WO2020139014 A2 WO 2020139014A2 KR 2019018596 W KR2019018596 W KR 2019018596W WO 2020139014 A2 WO2020139014 A2 WO 2020139014A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
vip
composition
promoter
microorganism
lactobacillus
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/018596
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2020139014A3 (ko
WO2020139014A9 (ko
Inventor
송지윤
노현진
정이레
김영현
조승기
Original Assignee
(주)메디톡스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)메디톡스 filed Critical (주)메디톡스
Priority to CN202410485843.9A priority Critical patent/CN118562694A/zh
Priority to US17/287,162 priority patent/US20220111009A1/en
Priority to AU2019416605A priority patent/AU2019416605B2/en
Priority to JP2021538015A priority patent/JP7280366B2/ja
Priority to EP19902868.9A priority patent/EP3858995A4/en
Priority to CN201980086881.4A priority patent/CN113348241B/zh
Priority to CA3118272A priority patent/CA3118272A1/en
Publication of WO2020139014A2 publication Critical patent/WO2020139014A2/ko
Publication of WO2020139014A3 publication Critical patent/WO2020139014A3/ko
Publication of WO2020139014A9 publication Critical patent/WO2020139014A9/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57563—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/2235—Secretins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/2278—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides (e.g. Exendin)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/32—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the health of the digestive tract
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism expressing a VIP gene, a composition for use in preventing or treating a disease causing damage to the gastrointestinal tract containing the microorganism, and a method for preventing or treating a disease causing damage to the gastrointestinal tract.
  • Vasoactive intestinal peptide is a peptide hormone that is vasoactive in the intestine.
  • VIP is a peptide with a 28 amino acid residue belonging to the ligand of the glucagon/secretin superfamily, the class II G protein-binding receptor.
  • VIP vasoactive intestinal peptide
  • the active form of the VIP polypeptide is to lower blood pressure, increase vasodilation of the vascular wall, relax smooth muscles in the respiratory system and gastrointestinal tissue (relax), reduce the Th1 response, as well as promote the immune response through the promotion of Th2 It functions to reduce, control the innate and acquired immune responses, or promote the secretion of electrolytes in the intestines.
  • VIP has been found to be active as a neurotransmitter in the central nervous system and in communication with lymphocytes.
  • VIPs The bioactivity of VIPs is delivered through three known receptors: VIP 1 R, VIP 2 R, and PAC 1 R. These receptors are known to cause cAMP enrichment as well as the production of intracellular calcium. Like VIP, their affinity for secretin depends on the amino acid sequence of the subtype and ligand. Human natural VIPs have a short half-life of about 2 minutes in the bloodstream.
  • U.S. Patent 9,561,262 discloses a method for use in treating hypertension in a patient, comprising administering a VIP and an anti-hypertensive agent to the patient.
  • US 2016-0045557 A1 is a probiotic strain for improving the intestinal nervous system and discloses lactobacilli and bifidus strains that increase VIP levels, but these strains include epithelial cells and enteric neuronal cells. As a strain screened in a containing co-culture model, it is not a genetically recombined strain.
  • CN 10875360 A discloses a multifunctional complex microecological agent nano-selenium-recombinant expression VIP-lactococcus lactis and a method for producing the same, lactococcus lactis to express the antibacterial peptide VIP, and a nisin-inducible promoter And USP45 signal sequence using NICE ® expression system, and disclosed as an animal feed additive.
  • One aspect provides a recombinant microorganism comprising genetic modification that increases expression of the gene encoding the VIP.
  • Another aspect provides a composition for use in preventing or treating a disease that causes damage to the gastrointestinal tract in a person comprising the microorganism.
  • Another aspect provides a kit for use in preventing or treating a disease that causes damage to the gastrointestinal tract comprising the microorganism and TNF-alpha blocker.
  • Another aspect provides a method of preventing or treating a disease that causes damage to the gastrointestinal tract.
  • VIP or “VIP protein” or “VIP polypeptide” refer to a biologically active polypeptide having one or more of the biological activities as described herein.
  • VIPs referred to herein include variants that mimic the function of natural VIPs. Such variants include those having an increased half-life than natural VIPs and having bioactivity equal to or greater than that of natural VIPs.
  • VIPs of the present invention include, but are not limited to, human VIP, recombinant human VIP, rat VIP and/or recombinant mouse VIP.
  • the VIP is 50% or more, 60% or more, 70% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more, or 100% of the sequence identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 It may have.
  • the VIP may have amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, and 9, respectively.
  • the VIP of SEQ ID NO: 2 is a human-derived natural VIP.
  • VIPs with amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, and 9 are human derived natural VIP variants VIP1, VIP2, VIP3, VIP4, VIP5, VIP6, VIP7, and VIP8.
  • VIP polypeptide as used herein can be isolated from a variety of sources, such as human tissue or other sources, or can be produced by recombinant or synthetic methods.
  • VIP polypeptide also includes variants of the VIP polypeptide.
  • the VIP of the present invention can be modified in a way to form a chimeric molecule comprising a VIP fused to another heterologous polypeptide or amino acid sequence.
  • One aspect provides a recombinant microorganism comprising genetic modification that increases expression of the gene encoding the VIP.
  • the microorganism may include a genetic modification that increases the expression of VIP.
  • the genetic modification may be to increase the number of copies of the gene encoding VIP. Increasing the copy number may be due to introduction of foreign genes into microorganisms.
  • the introduction may be by transformation, transduction, transfection or electroporation.
  • the introduced foreign gene may be present integrated with or without integration into the genome of the host cell.
  • the microorganism may include a foreign gene encoding VIP.
  • the gene may be operably linked to a regulatory sequence that regulates its expression.
  • the regulatory sequence may be a promoter, operator, terminator, or nucleotide sequence encoding a signal peptide.
  • the promoter may be a constitutive promoter.
  • the promoter may have a transcription initiation efficiency in lactic acid bacteria equal to or greater than a conventional promoter, for example, the P11 promoter.
  • the promoter can also be an inducible promoter.
  • the inducible promoter may be, for example, a Nisin inducible promoter.
  • the promoter may be PR4 from Lactobacillus paracasei .
  • the PR4 promoter may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the PR4 promoter is disclosed in international publication WO 2019/132231A1, filed internationally on January 1, 2018, and the contents of the international application are incorporated by reference herein in its entirety.
  • the ability to secrete extracellularly may be greater than that of a conventional signal peptide, for example, USP45 signal peptide.
  • the signal peptide may be from SP4 derived from Lactobacillus paracasei .
  • the SP4 may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the SP4 is disclosed in international publication WO 2019/132231A1, filed internationally on January 1, 2018, and the contents of the international application are incorporated by reference herein in its entirety.
  • the microorganism may secrete VIP out of the cell.
  • the microorganism may be bacteria.
  • the bacteria can be Gram positive bacteria or Gram negative bacteria.
  • the Gram-positive bacteria may be lactic acid bacteria.
  • the lactic acid bacteria are Lactobacillus , Lactococcus , bifidobacteria , Streptococcus , Leuconostoc , Weissella , Pediococcus , or Entero It may be of the genus Enterococcus .
  • the lactic acid bacteria Lactobacillus paracasei , Lactobacillus brevis , Lactobacillus plantarum Or it may be Lactoccocus lactis .
  • the lactic acid bacteria may be Lactobacillus plantarum LMT1-9 (KCTC 13421BP), Lactobacillus paracasei LMT1-21 (KCTC 13422BP), or Lactobacillus brevis LMT1-46 (KCTC 13423BP).
  • compositions for use in preventing or treating a disease that causes damage to the gastrointestinal tract comprising the aforementioned microorganisms.
  • the disease may cause gastrointestinal inflammation.
  • the disease may be one or more selected from the group consisting of inflammatory bowel disease (IBD), and colitis.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • colitis may be ulcerative colitis, or Crohn's disease.
  • the composition may include a pharmaceutically or food-acceptable carrier, excipient or diluent.
  • the pharmaceutically or food acceptable carrier may be any standard such as phosphate buffered saline solution, 5% aqueous solution of dextrose and emulsions (e.g. oil/water or water/oil emulsions).
  • excipients include adjuvants, binders, fillers, diluents, disintegrants, emulsifiers, wetting agents, lubricants, lubricants, sweeteners, flavors and colorants.
  • the preferred pharmaceutical or food carrier depends on the intended mode of administration of the active agent. Typical modes of administration include intestinal (eg, oral) administration.
  • the composition may be in unit dosage form.
  • the composition may have an oral dosage form.
  • the composition may be a food or pharmaceutical composition.
  • the composition may include a dry matter of the microorganism.
  • the composition may include a
  • pharmaceutically acceptable or acceptable for food indicates that it does not substantially cause adverse reactions when administered to an individual.
  • the side effects can be toxic, allergic, or immune.
  • kits for use in preventing or treating a disease that causes damage to the gastrointestinal tract including the above-mentioned recombinant microorganism and drugs to treat other diseases of the gastrointestinal tract.
  • the recombinant microorganism is as described above.
  • the recombinant microorganism may be in the form of the composition described above.
  • the kit may include instructions for instructing the use of recombinant microorganisms and other drugs to treat diseases of the gastrointestinal tract to prevent or treat diseases that cause damage to the gastrointestinal tract.
  • the drug for treating the other diseases of the gastrointestinal tract is any drug that treats diseases of the gastrointestinal tract, for example, inflammatory bowel disease.
  • Drugs for treating diseases of the gastrointestinal tract may include the following drugs:
  • methotrexate methotrexate, cyclophosphamide, MX-68, atiprimod dihydrochloride, BMS-188667, CKD-461, rimexolone, cyclosporine, tacrolimus, gusperimus, azathiopurine, antilymphocyte serum, freeze-dried sulfonated normal immunoglobulin, erythropoietin, colony stimulating, colony stimulating factor
  • TNF-alpha-receptor IgG-Fc fusion protein etanercept
  • infliximab adalimumab
  • certolizumab pegol certolizumab pegol
  • golimumab golimumab
  • PASSTNF- ⁇ soluble TNF- ⁇ receptor
  • TNF- ⁇ binding protein anti-TNF- ⁇ antibody
  • CDP571 etc.
  • natalizumab vedolizumab, AJM300, TRK-170, E-6007, etc.
  • NSAIDs non-steroidal anti-inflammatory drugs
  • alcofenac alcofenac, aceclofenac, sulindac, tolmetin, etodolac, fenoprofen, thiaprofenic acid, meclofenamic acid, meloxicam, tenoxicam, lornoxicam, nabumeton, acetaminophen, phenacetin, ethenzamide, sulpyrine, antipyrine, migrenin, aspirin, mefenamic acid, , loxoprofen sodium, phenylbutazone, indomethacin, ibuprofen, ketoprofen, naproxen, oxaprozin, flurbiprofen, fenbufen, pranoprofen, floctafenine, piroxicam, tenoxicam, epirizole, tiaramide hydrochloride, zaltoprofen, gabexate mesylate, colchica,
  • Salicylic acid derivatives eg, celecoxib, aspirin
  • etoricoxib etoricoxib
  • valdecoxib etoricoxib
  • diclofenac sodium indomethacin
  • loxoprofen e.g., aminoprofen
  • chemokine inhibitors may be included.
  • differentiation cluster (CD) inhibitors interleukins
  • RIP kinase inhibitors interleukins
  • smad7 inhibitors MadCAM inhibitors, and the like.
  • Another aspect provides a method of preventing or treating a disease causing damage to the gastrointestinal tract, comprising administering to the individual an amount of the microorganism effective to prevent or treat the disease causing damage to the gastrointestinal tract.
  • the method may further comprise the step of administering to the individual a TNF-alpha blocker in an amount effective to prevent or treat diseases that cause damage to the gastrointestinal tract.
  • the step of administering the TNF-alpha blocker to the subject may be performed simultaneously, before, or after the step of administering the microorganism to the subject.
  • the TNF-alpha blocker may be administered in the same or a different route than the route in which the microorganism is administered.
  • the TNF-alpha blocker may be administered orally or parenterally.
  • the parenteral may be an injection such as a blood vessel injection, an intraperitoneal injection, or a subcutaneous injection.
  • the TNF-alpha blocker may be administered intraperitoneally, and the microorganism may be administered orally.
  • the TNF-alpha blocker may be administered intraorally after the microorganism is orally administered.
  • the TNF-alpha blocker may be administered in an amount of 5 mg to 100 mg, 5 mg to 50 mg, 5 mg to 40 mg, 10 mg to 50 mg, or 20 mg to 50 mg per dose.
  • the disease may cause gastrointestinal inflammation.
  • the diseases include inflammatory intestinal disease, autoimmune disease, damage to the gastrointestinal tract due to radiation or graft versus host disease (GVHD), inflammatory bowel disease : IBD), and colitis, including chronic colitis.
  • GVHD graft versus host disease
  • IBD inflammatory bowel disease
  • colitis including chronic colitis.
  • the inflammatory bowel disease may be ulcerative colitis, or Crohn's disease.
  • the “administering or administration” refers to a composition comprising the microorganism, a composition comprising the microorganism, or a therapeutic agent in the physiological system (individual or in vivo, in vitro, or ex vivo cells, tissues and organs). Represents the act of giving therapeutic treatment. Accordingly, in the above method, the microorganism may be in the form of the above-described composition.
  • An acceptable route for administration to the human body may be the mouth or mucous membranes (eg, intestinal mucosa, oral mucosa or bukal).
  • the administration can be administered in combination with an additional therapeutic agent.
  • the combination administration includes either simultaneous or continuous order.
  • treatment refers to prophylactic treatment or therapeutic treatment.
  • treatment refers to administration of a microorganism or composition to a subject for therapeutic or prophylactic purposes.
  • “Therapeutic” treatment is treatment administered to an individual who exhibits pathological signs or symptoms to reduce or eliminate signs or symptoms. Signs or symptoms can be biochemical, cellular, histological, functional or physical, subjective or objective.
  • “Prophylactic” treatment is a treatment administered to an individual that exhibits no signs of the disease or exhibits only the initial signs of the disease to reduce the risk of pathology.
  • the microorganisms or compositions described herein can be provided as a prophylactic treatment to reduce the likelihood of pathology or, if so, to minimize the severity of the pathology.
  • terapéuticaally effective amount refers to an amount sufficient to fulfill the stated purpose.
  • the effective amount can be determined experimentally.
  • the effective amount can be determined, for example, depending on the degree to which the microorganism secretes VIP out of the cell. For example, for a person who has a body weight of 60 kg, it may be the number of microorganisms capable of secreting 0.01 to 300 mg, or 0.5 to 100 mg of VIP per day.
  • the individual may be a mammal.
  • the mammal can be a human, horse, pig, cow, dog, cat, monkey, chimpanzee, sheep, or goat.
  • the subject can be a human.
  • the individual may be a mammal rather than a human.
  • Recombinant microorganisms according to one aspect can produce and secrete VIP.
  • compositions or kits according to other aspects can be used for use in preventing or treating diseases that cause damage to the gastrointestinal tract.
  • a disease causing damage to the gastrointestinal tract can be effectively prevented or treated.
  • 1 is a diagram showing the configuration of the pMT447 vector.
  • FIG. 2 is a view showing Western blot results for culture supernatants of L. plantarum LMT1-9, L. paracasei LMT1-21, and L. brevis LMT1-46 strains transformed with pMT447 vector.
  • FIG. 3 is a diagram showing the therapeutic efficacy of VIP derived from L. plantarum LMT1-9 transgenic strain in a mouse enteritis model induced by DSS with a DAI score.
  • FIG. 4 is a diagram showing the therapeutic efficacy of VIP derived from L. paracasei LMT1-21 transgenic strain in a mouse enteropathy model induced by DSS with a DAI score.
  • FIG. 5 is a diagram showing the therapeutic efficacy of VIP derived from L. brevis LMT1-46 transgenic strain in a mouse enteritis model induced by DSS with a DAI score.
  • Figure 6 is a diagram showing the therapeutic efficacy of the transformed strain-derived VIP in a mouse enteritis model induced by DSS with a DAI AUC score.
  • FIG. 7 is a histopathological diagram showing the therapeutic efficacy of a VIP derived from a transformed strain in a mouse enteropathy model induced by DSS.
  • Figure 8 is a diagram showing the combined therapeutic efficacy of VIP and etanercept (Enbrel, Pfizer Korea) derived from LAB transgenic strain in DSS-induced mouse enteritis model as a DAI score.
  • FIG. 9 is a diagram showing the combined therapeutic efficacy of VIP and Enbrel derived from LAB transforming strain in a DSS-induced mouse enteritis model with a DAI AUC score.
  • FIG. 10 is a diagram showing the combined therapeutic efficacy of VIP and Enbrel derived from LAB transforming strain in DSS-induced mouse enteritis model as histopathological results.
  • Example 1 Lactobacillus cell expressing VIP gene and its IBD cure effect
  • the VIP gene was introduced into lactic acid bacteria cells, and it was confirmed that the gene was expressed and the product was secreted out of the cell.
  • the lactic acid bacteria cells transformed with the VIP gene were administered orally to the individual to see if they were effective in treating IBD, and the symptoms were improved.
  • a human VIP variant having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was used.
  • the VIP variant is a 4 amino acid residue substituted in a natural VIP of a human having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and has an increased half-life in human blood flow.
  • the VIP gene composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 was synthesized and used by Macrogen (Korea).
  • the synthesized VIP gene fragment and Lactic Acid Bacteria (LAB)-E. coli shuttle vector pMT54-PR4-SP4 (SEQ ID NO: 13) were cleaved by contact in the presence of SalI and XhoI restriction enzymes, respectively.
  • the purified gene fragments and vectors in the reaction solution are purified using a gel purification kit (GeneAll), followed by incubation of the digested gene fragments and vectors in the presence of an alkaline phosphatase to dephosphorylation, thereby dephosphorylated truncated VIP gene fragments And a truncated pMT54-PR4-SP4 vector was obtained.
  • GeneAll a gel purification kit
  • the prepared vector DNA 1ul and VIP gene DNA 3ul, T4 DNA ligase (Takara) 0.5ul, buffer solution 1ul and distilled water 5.5ul were mixed in a test tube to make a total volume of 10ul, followed by incubation at 16°C for 12 hours for VIP gene The DNA and the vector fragment were ligated to obtain a vector containing the VIP gene.
  • This vector was transformed into E. coli Top10 Competent Cells using the method of Sambrook et al. (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn, 1989).
  • the transformed E. coli was streaked and incubated on a LB (Luria-Bertani)-agar containing plate containing 10 ug/ml of chloramphenicol. As a result, the colonies formed were selected and cultured, and the vector was isolated from the culture.
  • This vector was named pMT447.
  • the VIP gene is operably linked to the PR4 promoter and the signal peptide sequence of SP4. Therefore, cells transformed with the pMT447 vector express the VIP gene with high efficiency and secrete it extracellularly.
  • the promoter is the PR4 promoter sequence of SEQ ID NO: 10
  • SP represents the nucleotide sequence encoding the SP4 secretion signal sequence of SEQ ID NO: 11 (SEQ ID NO: 12)
  • VIP encodes the human VIP variant of SEQ ID NO: 1.
  • HA and 6xHis represent human influenza hemagglutinin tags and nucleotide sequences encoding 6 histidines for the detection, isolation, and purification of proteins.
  • E.coli ori, Rep, and CM represent E. coli origin of replication, lactic acid bacteria origin of replication, and chloramphenicol resistance marker genes, respectively.
  • the recombinant vector pPM447 vector prepared in Section 1 was introduced into Lactobacillus plantarum LMT1-9 (KCTC 13421BP), Lactobacillus paracasei LMT1-21 (KCTC 13422BP), and Lactobacillus brevis LMT1-46 (KCTC 13423BP), respectively, and secreted VIP proteins.
  • KCTC 13421BP Lactobacillus plantarum LMT1-9
  • KCTC 13422BP Lactobacillus paracasei LMT1-21
  • KCTC 13423BP Lactobacillus brevis LMT1-46
  • MRS ice -cold electroporation solution
  • EPS ice -cold electroporation solution
  • MRS De Man, Rogosa and Sharpe agar media.
  • Each strain into which the pMT447 vector thus obtained was introduced was incubated for 16 hours at 37°C in MRS liquid medium.
  • the culture was inoculated to 3% (v/v)% in MRS liquid medium, and then incubated at the same temperature for 8 hours.
  • 1 ml of culture was centrifuged at 7,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was taken.
  • 100 ⁇ l of trichloroacetic acid was added to 1 ml of the supernatant, and the mixture was left at 4° C. for 1 hour to concentrate the culture components.
  • the VIP gene is operably linked to a hemagglutinin (HA) gene on its 3'end side, so that it is expressed in the HA tagged state.
  • FIG. 2 is a view showing Western blot results for culture supernatants of L. plantarum LMT1-9, L. paracasei LMT1-21, and L. brevis LMT1-46 strains transformed with pMT447 vector.
  • lanes 2, 3, and 4 represent L. plantarum LMT1-9, L. paracasei LMT1-21, and L. brevis LMT1-46, respectively, transformed with the pMT447 vector
  • lane 1 represents a standard protein ladder. Shows.
  • the transformed strain effectively secreted hVIP variants.
  • DSS Dextran Sulfate Sodium Salt
  • the transformed strain was primary cultured at 37°C for 24 hours in a flask containing 10 ml MRS medium containing 10 ug/ml chloramphenicol. The next day, the cultured strain was inoculated with 300 to 600 ml of MRS CM medium so that the OD 600 was 0.01, followed by secondary culture under the same conditions as the primary culture. After about 16 to 18 hours, when the OD 600 of the culture reaches 2 to 3, the culture is centrifuged at 7,000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant, and the cells are suspended in 1xPBS to be administered at 1x10 9 cfu once per animal. . This cell-containing PBS solution was administered to the subject orally (1x10 9 cfu once per horse) and negatively administered once a day for a total of 16 days.
  • mice 8 to 10 week old male Balb/c mice (20 to 25 g, 10 animals in each group) (ORIENTBIO) were used as experimental animals.
  • the initial strain administration day was set to Day-7, and DSS was diluted to 2 (v/v)% in sterile water and supplied to all groups except the PBS group as negative numbers from 0 to 6 days. Mice intentionally consume negative water, but usually within 6 ml per day. Mice were sacrificed on day 9.
  • the survival rate of the mice was checked at intervals of 2 days, and the DAI score was calculated by examining the weight, bristles of the hair, the degree of movement of the animals, and diarrhea.
  • DAI Disease activity index
  • FIG. 3 is a diagram showing the therapeutic efficacy of VIP derived from L. plantarum LMT1-9 transgenic strain in a mouse enteritis model induced by DSS with a DAI score.
  • 1-9 VIP represents a strain in which pMT447 was transformed into L. plantarum LMT1-9.
  • the 1-9 vector represents a strain in which a control vector (parent vector without a VIP gene) was transformed into L. plantarum LMT1-9.
  • FIG. 4 is a diagram showing the therapeutic efficacy of VIP derived from L. paracasei LMT1-21 transgenic strain in a mouse enteropathy model induced by DSS with a DAI score.
  • 1-21 VIP represents a strain in which pMT447 was transformed into L. paracasei LMT1-21.
  • the 1-21 vector represents a strain in which a control vector (parent vector without VIP gene) was transformed in L. paracasei LMT1-21.
  • FIG. 5 is a diagram showing the therapeutic efficacy of VIP derived from L. brevis LMT1-46 transgenic strain in a mouse enteritis model induced by DSS with a DAI score.
  • 1-46 VIP represents a strain in which pMT447 was transformed into L. brevis LMT1-46.
  • the 1-46 vector represents a strain in which a control vector (parent vector without a VIP gene) was transformed into L. brevis LMT1-46.
  • CyA stands for cyclosporinA and was used as a positive control for the experiment.
  • PBS is a control group treated with DSS without treating bacteria. Normal represents a group that did not process any fungi and DSS.
  • Figure 6 is a diagram showing the therapeutic efficacy of the transformed strain-derived VIP in a mouse enteritis model induced by DSS with a DAI AUC score. The description of each strain and chemical is mentioned above and DAI AUC represents the area under the curve of DAI SCORE until Day 8.
  • Lactobacillus strain transformed to express VIP had a therapeutic effect in the enteritis model induced by DSS.
  • FIG. 7 is a histopathological diagram showing the therapeutic efficacy of a VIP derived from a transformed strain in a mouse enteropathy model induced by DSS.
  • Normal, PBS, LMT1-9 vector, LMT1-9 VIP, LMT1-46 vector, LMT1-46 VIP, LMT1-21 vector, and LMT1-21 VIP are as described in FIGS. 1 to 6.
  • mice treated with the Lactobacillus strain expressing VIP had therapeutic efficacy compared to the control Became.
  • the histopathological examination of the large intestine was performed through a microscope in a DSS-induced enteropathic mouse model, and the infiltration of mononuclear cells, mucosal damage, etc. were most severe in the DSS group.
  • the LMT 1-9 vector, LMT 1-21 vector, and LMT 1-46 vector administration groups did not show a significant improvement effect on the condition.
  • the LMT 1-9 VIP, 1-21 VIP, and LMT1-46 VIP groups histological damage and inflammatory infiltration lesions tended to decrease. This can be seen that the Lactobacillus strain expressing VIP has an effect of alleviating and protecting inflammation in a mouse model of inflammatory bowel disease induced by DSS.
  • FIG. 8 is a diagram showing the combined therapeutic efficacy of VIP and etanercept (Enbrel, Pfizer Korea) derived from LAB transgenic strain in DSS-induced mouse enteritis model as a DAI score.
  • Normal is a group that has not processed anything.
  • PBS is a group treated only with DSS.
  • Enbrel is a group that handled DSS and Enbrel.
  • 1-46 VIP is a group fed a strain transformed with pMT447 in L. brevis LMT1-46 in DSS-induced mice.
  • 1-46 VIP + enbrel is a group treated with L. brevis LMT1-46 pMT447 transformed strain and enbrel in DSS-induced mice.
  • the survival rate or DAI score was confirmed after oral administration of the transformed strain to a mouse enteritis model induced by DSS.
  • the transformed strain was first cultured for 1 day in 10 ml of MRS medium containing 10 ug/ml chloramphenicol, and the cultured strain was inoculated to 300 to 600 ml of MRS CM medium so that the OD 600 was 0.01. When the OD 600 of the culture medium became 2 to 3 after 16 to 18 hours, strains were collected according to the total number of mice administered and the number of feedings.
  • the culture supernatant was removed by centrifugation at 7,000 rpm for 10 minutes, and the recovered strain was suspended in 1x PBS to be administered at 1x10 9 cfu once per horse.
  • the strain was administered once a day, for a total of 16 days.
  • the treatment efficacy experiment was started by setting the initial strain administration day to Day-7, and DSS was diluted to 2(v/v)% in sterile water and supplied to all groups except PBS group as negative numbers from 0 to 6 days. . Mice were euthanized on day 9. After DSS treatment, the survival rate was checked every 2 days, and the DAI score was calculated by checking the weight, hair bristles, animal movement, and diarrhea.
  • the group for evaluating the efficacy of combination administration with etanercept was administered intraperitoneally (IP) at 0, 2, 4, and 6 days at 10 mg/kg.
  • FIG. 9 is a diagram showing the combined therapeutic efficacy of VIP and Enbrel derived from LAB transforming strain in a DSS-induced mouse enteritis model with a DAI AUC score. The description of each strain and chemical is described above and DAI AUC represents the area under the curve of DAI SCORE until Day 8.
  • Enbrel used in this experiment is an exemplary drug for treating inflammatory bowel disease, and other drugs for treating inflammatory bowel disease may be used in combination with VIPs derived from LAB transforming strains.
  • FIG. 10 is a diagram showing the combined therapeutic efficacy of VIP and Enbrel derived from LAB transforming strain in DSS-induced mouse enteritis model as histopathological results.
  • Normal, PBS, Enbrel, LMT1-46 VIP, and LMT1-46 VIP+Enbrel are as described in FIG. 9.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)

Abstract

VIP 유전자를 발현하는 미생물, 그 미생물을 포함하는 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 조성물, 키트, 및 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

Description

외래 단백질을 발현하는 미생물, 및 그의 용도
VIP 유전자를 발현하는 미생물, 그 미생물을 포함하는 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 조성물, 키트, 및 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
혈관 작동성 장 펩티드(vasoactive intestinal peptide: VIP)는 장에서 혈관 작동성인 펩티드 호르몬이다. VIP는 글루카곤/세크레틴 수퍼패밀리, 클라스 II G 단백질-결합 수용체의 리간드에 속하는 28 아미노산 잔기를 갖는 펩티드이다.
사람에서, 사람 게놈 상의 염색체 6의 q25 영역은 길이가 170 아미노산인 세크레틴 패밀리 멤버를 코딩한다. 길이 170 아미노산의 이 멤버는 번역 후 잘려져 혈관 작동성 장 펩티드(VIP)를 형성한다. VIP 폴리펩티드의 활성 형태는 혈압을 낮추는 것, 혈관벽의 확장(vasodilation)을 증가시키는 것, 호흡기 계통 및 위장관 조직에서 평활근을 이완시키는 것(relax), Th1 반응의 감소뿐만 아니라 Th2의 촉진을 통하여 면역 반응을 감소시키는 것, 선천적 및 획득 면역 반응을 조절하는 것, 또는 내장에서 전해질의 분비를 촉진하는 것의 기능을 한다. 또한, VIP는 신경전달 물질로서 중추 신경계에서 및 림프구와의 소통에서 활성적인 것이 밝혀졌다. VIP의 생물활성은 알려진 3가지 수용체를 통하여 전달된다: VIP1R, VIP2R, 및 PAC1R. 이들 수용체들은 세포내 칼슘의 생산뿐만 아니라 cAMP 농축을 야기하는 것으로 알려져 있다. VIP와 같이 세크레틴에 대한 이들의 친화도는 서브타입과 리간드의 아미노산 서열에 따라 달라진다. 사람 천연 VIP는 혈류에서 약 2분의 반감기를 가지고 있어서, 짧은 반감기를 가지고 있다.
미국특허 9,561,262는 VIP 및 항-고혈압제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 고혈압을 치료하는데 사용하기 위한 방법을 개시하고 있다.
US 2016-0045557 A1은 장 신경계 개선용 프로바이오틱 균주로서, VIP 수준을 증가시키는 락토바실리 및 비피더스 균주를 개시하고 있으나, 이들 균주는 상피세포(epithelial cell) 및　장신경　세포(enteric neuronal　cell)를 포함하는　공배양(co-culture) 모델에서 스크리닝된 균주로서, 유전자 재조합된 균주가 아니다.
CN 10875360 A는 다기능성 복합 미소생태학적 제제 나노-셀레늄-재조합 발현 VIP-락토코커스 락티스 및 그의 제조방법을 개시하고 있는바, 항균성 펩티드 VIP를 발현하기 위해 락토코커스 락티스, 및 니신 유도성 프로모터와 USP45 신호 서열을 사용하는 NICE® 발현 시스템을 사용하며, 동물 사료 첨가제로서의 용도를 개시하고 있다.
종래 기술에 의하더라도 VIP 유전자를 발현하는 미생물 및 그를 염증성 장 질환을 치료하는데 사용하는 것에 대한 요구가 있다.
일 양상은 VIP를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 것인 재조합 미생물을 제공한다.
다른 양상은 상기 미생물을 포함하는 사람에서 위장관(gastrointestinal tract)의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 미생물 및 TNF-알파 차단제를 포함하는 위장관(gastrointestinal tract)의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다.
다른 양상은 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 있어서, 용어 "VIP" 또는 "VIP 단백질" 또는 "VIP 폴리펩티드"는 본원에 기술된 바와 같은 생물학적 활성 중 하나 이상을 갖는 생물학적 활성 폴리펩티드를 지칭한다. 본 명세서에 언급된 VIP는 천연 VIP의 기능을 흉내내는 변이체를 포함한다. 상기 변이체는 천연 VIP 보다 증가된 반감기를 갖고 천연 VIP에 비하여 동등 이상의 생물활성을 갖는 것을 포함한다.
본 발명의 VIP는 인간 VIP, 재조합 인간 VIP, 쥐 VIP 및/또는 재조합 마우스 VIP를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 상기 VIP는 서열번호 1의 아미노산 서열과 50 % 이상, 60 % 이상, 70 % 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열을 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 VIP는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9의 아미노산 서열을 각각 갖는 것일 수 있다. 서열번호 2의 VIP는 사람 유래 천연 VIP이다. 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9의 아미노산 서열을 갖는 VIP는 사람 유래 천연 VIP 변이체 VIP1, VIP2, VIP3, VIP4, VIP5, VIP6, VIP7, 및 VIP8이다.
본원에서 사용된 상기 VIP 폴리펩티드는 인간 조직 또는 다른 공급원과 같은 다양한 공급원으로부터 단리되거나 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 용어 "VIP 폴리펩티드"는 또한 VIP 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 본 발명의 VIP는 또 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 VIP를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.
일 양상은 VIP를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 것인 재조합 미생물을 제공한다.
상기 미생물은 VIP의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 VIP를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. 상기 카피 수를 증가시키는 것은 외래 유전자의 미생물로의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 도입은 형질전환, 형질도입, 형질 감염 또는 전기천공에 의한 것일 수 있다. 도입된 상기 외래 유전자는 숙주 세포의 게놈에 통합되거나 통합되지 않고 존재하는 것일 수 있다.
상기 미생물은 VIP를 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 유전자는 그의 발현을 조절하는 조절 서열과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 조절 서열은 프로모터, 오퍼레이터, 터미네이터, 또는 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 프로모터는 구성적 프로모터(constitutive promoter)일 수 있다. 상기 프로모터는 유산균에서 전사 개시 효율이 종래의 프로모터 예를 들면, P11 프로모터와 같거나 그보다 큰 것일 수 있다. 상기 프로모터는 또한 유도성 프로모터일 수 있다. 상기 유도성 프로모터는 예컨대, 니신 유도성 프로모터(Nisin inducible promoter)일 수 있다. 상기 프로모터는 Lactobacillus paracasei 유래의 PR4일 수 있다. 상기 PR4 프로모터는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 PR4 프로모터는 2018.11.8일자로 국제출원된 국제공개 WO 2019/132231A1에 개시되어 있는 것으로서, 상기 국제출원의 내용은 그 전체로 본 명세서에서 원용에 의하여 포함된다. 상기 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 외래 단백질 유전자와 인 프레임으로 연결되는 경우, 세포 외로 분비시키는 능력이 종래의 신호 펩티드, 예를 들면, USP45 신호 펩티드보다 큰 것일 수 있다. 상기 신호 펩티드는 Lactobacillus paracasei 유래의 SP4의 것일 수 있다. 상기 SP4는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 SP4는 2018.11.8일자로 국제출원된 국제공개 WO 2019/132231A1에 개시되어 있는 것으로서, 상기 국제출원의 내용은 그 전체로 본 명세서에서 원용에 의하여 포함된다. 상기 미생물은 VIP를 세포 외로 분비시키는 것일 수 있다.
상기 미생물은 박테리아일 수 있다. 상기 박테리아는 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아일 수 있다. 상기 그람 양성 박테리아는 유산균일 수 있다. 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 비피도박테리아(bifidobacteria), 스트렙토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 와이셀라(Weissella), 페디오코커스(Pediococcus), 또는 엔테로코커스(Enterococcus) 속에 속하는 것일 수 있다. 상기 유산균은 Lactobacillus paracasei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum 또는 Lactoccocus lactis인 것일 수 있다. 상기 유산균은 Lactobacillus plantarum LMT1-9 (KCTC 13421BP), Lactobacillus paracasei LMT1-21 (KCTC 13422BP), 또는 Lactobacillus brevis LMT1-46 (KCTC 13423BP)일 수 있다.
다른 양상은 상기한 미생물을 포함하는 위장관(gastrointestinal tract)의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 질환은 위장관 염증을 야기하는 것일 수 있다. 상기 질환은 염증성 장질환(IBD), 및 대장염(colitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 또는 크론병(Crohn's disease)인 것일 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 또는 식품적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 또는 식품적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 염수 용액(phosphate buffered saline solution), 덱스트로스의 5 % 수용액 및 에멀젼 (예를 들어, 오일/물 또는 물/오일 에멀젼)과 같은 임의의 표준 약제학적 또는 식품적 담체를 의미한다. 부형제의 비제한적인 예는 보조제, 결합제, 충전제, 희석제, 붕해제, 유화제, 습윤제, 윤활제, 활택제, 감미제, 향료 및 착색제를 포함한다. 바람직한 약학적 또는 식품적 담체는 활성제의 의도된 투여 방식에 의존한다. 전형적인 투여 방식은 장내 (예를 들어, 경구) 투여를 포함한다. 상기 조성물은 단일 투여 제형(unit dosage form)일 수 있다. 상기 조성물은 경구 투여 제형을 가질 수 있다. 상기 조성물은 식품 또는 의약 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 상기 미생물의 건조물을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 상기 미생물의 배지를 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "약학적으로 또는 식품적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable or acceptable for food)"은 개체에 투여되었을 때 부작용(adverse reactions)을 실질적으로 일으키지 않는 것을 나타낸다. 상기 부작용은 독성, 알레르기, 또는 면역반응일 수 있다.
다른 양상은 상기한 재조합 미생물 및 다른 위장관의 손상 질환을 치료하는 약물을 포함하는 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 상기 재조합 미생물에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 재조합 미생물은 상기한 조성물의 형태일 수 있다. 상기 키트는 재조합 미생물 및 다른 위장관의 손상 질환을 치료하는 약물을 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하도록 지시하는 지침서를 포함할 수 있다.
상기 다른 위장관의 손상 질환을 치료하는 약물은 위장관의 손상 질환, 예를 들면 염증성 장 질환을 치료하는 약물이면 어느 것이나 포함된다. 위장관의 손상 질환을 치료하는 약물은 하기 약물을 포함할 수 있다:
(i) 스테로이드성 항 염증제
dexamethasone, hexestrol, methimazole, betamethasone, triamcinolone, triamcinolone acetonide, fluocinonide, fluocinolone acetonide, predonisolone, methylpredonisolone, cortisone acetate, hydrocortisone, fluorometholone, beclomethasone dipropionate, estriol, paramethasone acetate, fludrocortisone acetate, clobetasol propionate, diflorasone acetate, dexamethasone propionate, difluprednate, betamethasone dipropionate, budesonide, diflucortolone valerate, amcinonide, halcinonide, mometasone furoate, hydrocortisone butyrate propionate, flumetasone pivalate, clobetasone butyrate, dexametasone acetate 등.
(ii) 5-아미노살리실산
sulfasalazine, mesalazine, olsalazine, balsalazide 등.
(iii) 면역조절제(immunomodulator) 또는 면역 억제제(immunosuppressant)
methotrexate, cyclophosphamide, MX-68, atiprimod dihydrochloride, BMS-188667, CKD-461, rimexolone, cyclosporine, tacrolimus, gusperimus, azathiopurine, antilymphocyte serum, freeze-dried sulfonated normal immunoglobulin, erythropoietin, colony stimulating factor, interleukin, interferon 등.
(iv) JAK 저해제
tofacitinib, ruxolitinib 등.
(v) TNF 저해제
재조합 TNF-알파-수용체 IgG-Fc 융합 단백질(etanercept), infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, golimumab, PASSTNF-α, soluble TNF-α receptor, TNF-α binding protein, anti-TNF-α antibody, CDP571 등.
(vi) 인테그린 저해제
natalizumab, vedolizumab, AJM300, TRK-170, E-6007 등.
(vii) 인터류킨-12/23 저해제
ustekinumab, briakinumab (anti-interleukin-12/23 antibody) 등.
(viii) 비-스테로이드성 항염증제(NSAID)
(a) 고전적 NSAID
alcofenac, aceclofenac, sulindac, tolmetin, etodolac, fenoprofen, thiaprofenic acid, meclofenamic acid, meloxicam, tenoxicam, lornoxicam, nabumeton, acetaminophen, phenacetin, ethenzamide, sulpyrine, antipyrine, migrenin, aspirin, mefenamic acid, flufenamic acid, diclofenac sodium, ketophenylbutazone, loxoprofen sodium, phenylbutazone, indomethacin, ibuprofen, ketoprofen, naproxen, oxaprozin, flurbiprofen, fenbufen, pranoprofen, floctafenine, piroxicam, tenoxicam, epirizole, tiaramide hydrochloride, zaltoprofen, gabexate mesylate, camostat mesylate, ulinastatin, colchicine, probenecid, sulfinpyrazone, bucolome, benzbromarone, allopurinol, sodium aurothiomalate, hyaluronate sodium, sodium salicylate, salicylic acid, atropine, scopolamine, levorphanol, oxymorphone 또는 그의 염 등.
(b) 시클로옥시게나제 저해제 (COX-1 선택적 저해제, COX-2 선택적 저해제 등)
살리실산 유도체 (예, celecoxib, aspirin), etoricoxib, valdecoxib, diclofenac sodium, indomethacin, loxoprofen 등.
(c) 니트릭옥시드-방출 NSAID (nitric oxide-releasing NSAIDs).
그 밖에도, 케모카인 저해제, 분화클러스터(CD) 저해제, 인터루킨, RIP 키나제 저해제, smad7 저해제, MadCAM 저해제 등을 포함할 수 있다.
다른 양상은 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하기에 유효한 양의 상기 미생물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하기에 유효한 양의 TNF-알파 차단제를 개체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 TNF-알파 차단제를 개체에게 투여하는 단계는 상기 미생물을 개체에게 투여하는 단계와 동시, 전, 또는 후에 수행하는 것일 수 있다. 상기 TNF-알파 차단제는 상기 미생물이 투여되는 경로와 동일 또는 다른 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 TNF-알파 차단제는 경구 또는 비경구로 투여되는 것일 수 있다. 상기 비경구는 혈관 주사, 복강, 또는 피하 주사와 같은 주사일 수 있다. 예를 들면, 상기 TNF-알파 차단제는 복강 내로 투여되고, 상기 미생물은 경구로 투여되는 것일 수 있다. 상기 TNF-알파 차단제는 상기 미생물이 경구로 투여된 후, 복강 내로 투여되는 것일 수 있다. 상기 TNF-알파 차단제는 1회 투여 당 5mg 내지 100mg, 5mg 내지 50mg, 5mg 내지 40mg, 10mg 내지 50mg, 또는 20mg 내지 50mg의 양으로 투여되는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 질환은 위장관 염증을 야기하는 것일 수 있다. 상기 질환은 염증성 내장 질환(inflammatory intestinal disease), 자가면역질환(autoimmune disease), 방사선(radiation)에 의한 위장관의 손상 또는 이식편대숙주 질환(graft versus host disease: GVHD), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease: IBD), 및 만성 대장염을 포함한 대장염(colitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 또는 크론병(Crohn's disease)일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 상기 "투여(administering 또는 administration)"는 상기 미생물을 생리적 시스템(개체 또는 인 비보, 인 비트로, 또는 엑스 비보 세포, 조직 및 기관)에 상기 미생물, 그를 포함하는 조성물, 또는 치료적 처치(therapeutic treatment)를 주는 행위를 나타낸다. 따라서, 상기 방법에서, 상기 미생물은 상기한 조성물의 형태일 수 있다. 사람 몸에 투여하는 수용가능한 경로(route)는 입, 또는 점막(예, 장내 점막, 경구 점막 또는 부칼)일 수 있다. 상기 투여는 추가의 치료적 작용제(therapeutic agent)와 조합으로 투여될 수 있다. 상기 조합 투여는 동시 및 연속 중 어느 순서도 포함한다.
본 명세서에 있어서, 용어 "치료(treatment)"는 예방적 치료(prophylactic treatment) 또는 치료적 치료(therapeutic treatment)를 나타낸다. 특정 실시 양태에서, "치료"는 치료 또는 예방 목적을 위해 미생물 또는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 나타낸다.
"치료적(therapeutic)" 치료는 징후(signs) 또는 증상(symptoms)을 감소시키거나 제거하기 위한 병리학적 징후 또는 증상을 나타내는 개체에게 투여하는 치료이다. 징후 또는 증상은 생화학적, 세포성, 조직학적, 기능적 또는 물리적, 주관적 또는 객관적일 수 있다.
"예방적(prophylactic)" 치료는 병리(pathology) 발생 위험을 줄이기 위해 질병의 징후를 나타내지 않거나 질병의 초기 징후만을 나타내는 개체에게 투여하는 치료이다. 본 명세서 기재된 미생물 또는 조성물은 병리 발생의 가능성(likelihood)을 줄이거나, 발생되었다면 상기 병리의 심각성을 최소화하기 위하여 예방적 치료로서 제공될 수 있다.
본 명세서에 있어서, "치료적 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양을 나타낸다. 유효한 양은 실험적으로 결정될 수 있다. 유효한 양은 예를 들면, 상기 미생물이 VIP를 세포 외로 분비하는 정도에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 60kg 체중을 갖는 사람에 대하여, 1일 0.01 내지 300 mg, 또는 0.5 내지 100 mg의 VIP를 분비할 수 있는 상기 미생물의 수일 수 있다. 예를 들면, 개체에 대하여 개체 당 1회 투여당 1x107 내지 1x1011cfu, 1x107 내지 1x1010cfu, 1x108 내지 1x1011cfu, 1x108 내지 1x1010cfu, 2.5x108 내지 7.5x109cfu, 5.0x108 내지 5.0x109cfu, 7.5x108 내지 2.5x109cfu, 또는 약 1x109cfu로 투여되는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 말, 돼지, 소, 개, 고양이, 원숭이, 침팬지, 양, 또는 염소일 수 있다. 상기 개체는 사람일 수 있다. 상기 개체는 사람이 아닌 포유동물일 수 있다.
일 양상에 따른 재조합 미생물은 VIP를 생산 및 분비할 수 있다.
다른 양상에 따른 조성물 또는 키트는 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 의하면, 위장관의 손상을 야기하는 질환을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 pMT447 벡터의 구성을 나타낸 도면이다.
도 2는 pMT447 벡터로 형질전환된 L. plantarum LMT1-9, L. paracasei LMT1-21, 및 L. brevis LMT1-46 균주의 배양 상등액에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 L. plantarum LMT1-9 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 DAI 스코어로 나타낸 도면이다.
도 4는 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 L. paracasei LMT1-21 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 DAI 스코어로 나타낸 도면이다.
도 5는 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 L. brevis LMT1-46 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 DAI 스코어로 나타낸 도면이다.
도 6은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 DAI AUC 스코어로 나타낸 도면이다.
도 7은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 조직병리학적으로 나타낸 도면이다.
도 8은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 LAB 형질전환 균주 유래 VIP와 에타너셉트(etanercept) (Enbrel, 한국화이자제약)의 병용 치료효능을 DAI 스코어로 나타낸 도면이다.
도 9는 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 LAB 형질전환 균주 유래 VIP와 엔브렐의 병용 치료효능을 DAI AUC 스코어로 나타낸 도면이다.
도 10은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 LAB 형질전환 균주 유래 VIP와 엔브렐의 병용 치료효능을 조직병리학적 결과로 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: VIP 유전자를 발현하는 유산균 세포 및 그의 IBD 치료 효과
본 실시예에서는 VIP 유전자를 유산균 세포에 도입하고, 상기 유전자가 발현되어 그 산물이 세포 외로 분비되는 것을 확인하였다. 또한, 상기 VIP 유전자로 형질전환된 유산균 세포가 IBD 치료에 효과가 있는지를 개체에 경구로 투여하고, 그 증상 개선을 확인하였다. VIP는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 사람 VIP 변이체를 사용하였다. 상기 VIP 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 사람의 천연 VIP에서 4개 아미노산 잔기가 치환된 것으로서, 사람 혈류에서 증가된 반감기를 갖는 것이다.
1. VIP 유전자를 포함하는 벡터 제작
서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 VIP 유전자는 마크로젠사(한국)에서 DNA를 합성하여 사용하였다. 합성된 VIP 유전자 절편과 유산균(Lactic Acid Bacteria: LAB)-대장균 셔틀 벡터 pMT54-PR4-SP4(서열번호 13)를 각각 SalI 및 XhoI 제한효소의 존재하에서 접촉시켜 절단하였다. 반응액 중 절단된 유전자 단편 및 벡터를 gel purification kit(GeneAll 사)를 이용하여 정제한 후, 절단된 유전자 단편 및 벡터를 알칼리 포스파타제의 존재하에서 인큐베이션하여 탈인산화하여, 탈인산화된 절단된 VIP 유전자 단편 및 절단된 pMT54-PR4-SP4 벡터를 얻었다.
이렇게 준비한 벡터 DNA 1ul 및 VIP 유전자 DNA 3ul와 T4 DNA 리가제 (Takara) 0.5ul, 완충용액 1ul 및 증류수 5.5ul를 테스트 튜브 중에서 혼합하여 총 부피를 10ul로 한 후 16℃에서 12시간 인큐베이션하여 VIP 유전자 DNA과 벡터 단편을 연결하여, VIP 유전자를 포함하는 벡터를 얻었다. 이 벡터를 삼브룩 등의 방법 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn, 1989)을 사용하여 대장균 Top10 컴페턴트 균주(TOP10 Competent Cells)에 형질전환시켰다.
형질전환된 대장균을 클로람페니콜 10ug/ml이 포함된 LB(Luria-Bertani)-아가 함유 플레이트에 도말하고 인큐베이션하였다. 그 결과, 형성된 콜로니를 선발하고 배양하고 그 배양물로부터 상기 벡터를 분리하였다. 이 벡터를 pMT447이라고 명명하였다. pMT447 벡터는 VIP 유전자가 PR4 프로모터와 SP4의 신호 펩티드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 따라서, pMT447 벡터에 의하여 형질전환된 세포는 VIP 유전자를 높은 효율로 발현시키고, 세포 외로 분비한다.
도 1은 pMT447 벡터의 구성을 나타낸 도면이다. 도 1에서, promoter는 서열번호 10의 PR4 프로모터 서열이며, SP는 서열번호 11의 SP4 분비 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 12)을 나타내고, VIP는 서열번호 1의 사람 VIP 변이체를 코딩하는 유전자(서열번호 14)를 나타낸다. HA 및 6xHis는 사람 인플루엔자 헤마글루티닌(human influenza hemagglutinin) 태그와 6개 히스티딘을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로서, 단백질의 검출, 분리, 및 정제를 위한 것이다. E.coli ori, Rep, 및 CM는 각각 대장균 복제 원점, 유산균 복제원점(replication origin), 및 클로람페니콜 내성 마커 유전자를 나타낸다.
2. 재조합 벡터를 유산균 세포에 도입
1절에서 제작된 재조합 벡터 pPM447 벡터를 Lactobacillus plantarum LMT1-9(KCTC 13421BP), Lactobacillus paracasei LMT1-21(KCTC 13422BP), 및 Lactobacillus brevis LMT1-46(KCTC 13423BP)에 각각 도입하고, VIP 단백질이 분비되는지를 확인하였다.
상기 각 균주를 50mL의 MRS 배지(Difco Co., USA) 함유 플라스크 중에서 OD600이 0.5가 될 때까지 배양한 후 4℃, 7,000rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 세포 펠렛을 25mL 냉 EPS(ice-cold electroporation solution)(1mM K2HPO4, 1mM KH2PO4, pH 7.4, 1mM MgCl2, 및 0.5 M 수크로스 함유)로 2회 세척하였다. MRS는 De Man, Rogosa 및 Sharpe agar 배지라고도 한다.
세척 후 1ml 냉 EPS에 세포를 재현탁하고 전기천공법에 사용될 컴피턴트 세포를 제조하고 -80℃ 저온 냉동고(deep freezer)에 보관하였다. 컴피턴트 세포 40μl와 각 벡터 DNA (1μg/μl) 1μl를 큐벳에 넣고 5분 동안 얼음에 방치하였다. 25μF, 8kV/cm, 400 ohms 조건에서 전기펄스를 준 후, 즉시 1ml MRS 액체 배지에 첨가하고 37℃에서 1시간 배양하였다. 그 후, 배양된 세포를 10μg/ml 클로람페니콜이 포함된 MRS 배지('MRS-CM'이라고도 함)에 도말하고 48시간 37℃에서 배양하였다.
이렇게 얻어진 pMT447 벡터가 도입된 각 균주를 MRS 액체 배지에서 37℃, 16시간 정치 배양하였다. 배양물을 MRS 액체 배지에 3(v/v)%가 되도록 접종한 후 8시간 동일한 온도에서 정치 배양하였다. 배양물 1ml를 7,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 취하였다. 상등액 1ml에 트리클로로아세트산 100μl를 첨가하고 4℃에서 1시간 정치하여, 배양 성분을 농축하였다. 반응물을 4℃, 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 펠렛을 1ml 찬 아세톤으로 1회 세척하고, 상온에서 10분 동안 말린 후 Tris-HCl 버퍼(pH 8.8) 100μl로 용출하였다.
용출액에 4x 로딩 버퍼(Thermo), 및 10x 환원제(Thermo)를 첨가한 후 SDS-PAGE 겔에서 전기영동하였다. 상기 겔을 Trans blot semi-dry cell (bio-rad)를 이용하여 니트로셀룰로오스 막에 전달하여, 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 구체적으로, 상기 막을 1% 탈지우유(skim milk) 함유 TBST 버퍼로 1시간 차단하고 항-HA 항체(Santa cruz)를 상온에서 2시간 반응시킨 후 TBST로 5분씩 3번 세척 후 ECL로 검출하였다. pMT447 벡터에서, VIP 유전자는 그의 3' 말단 측에 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 유전자와 작동가능하게 연결되어 있어서, HA 태그된 상태로 발현된다.
도 2는 pMT447 벡터로 형질전환된 L. plantarum LMT1-9, L. paracasei LMT1-21, 및 L. brevis LMT1-46 균주의 배양 상등액에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도면이다. 도 2에서, 2, 3, 및 4 레인은 pMT447 벡터로 형질전환된 L. plantarum LMT1-9, L. paracasei LMT1-21, 및 L. brevis LMT1-46을 각각 나타내고, 1 레인은 표준 단백질 래더를 나타낸다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 형질전환 균주는 hVIP 변이체를 효과적으로 분비하였다.
3. VIP를 분비하는 유산균의 DSS 유도된 모델에서 IBD에 대한 효능
2절에 기술된 상기 형질전환된 L. plantarum LMT1-9, L. paracasei LMT1-21, 및 L. brevis LMT1-46을 덱스트란 술페이트 소듐염(Dextran Sulfate Sodium Salt: DSS)으로 유도된 생쥐 장염(colitis) 모델에 경구 투여한 후, 생쥐의 생존율과 질병활성 지수(disease activity index: DAI) 점수를 확인하여, 상기 균주에 의한 장 염증 치료 효과를 평가하였다.
(1) 재조합 미생물 단독 투여
구체적으로, 상기 형질전환된 균주를 10ug/ml 클로람페니콜이 포함된 10ml MRS 배지 함유 플라스크에서 24시간 37℃에서 1차 정치 배양하였다. 다음날, 배양된 균주를 300 내지 600ml의 MRS CM 배지에 OD600이 0.01이 되도록 접종하고, 1차 배양과 동일한 조건에서 2차 배양하였다. 약 16 내지 18시간 후 배양물의 OD600이 2 내지 3이 되면 배양물을 7,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고, 세포를 마리당 1회 1x109 cfu로 투여할 수 있도록 1xPBS에 부유시켰다. 이 세포 함유 PBS 용액을 개체에 경구 투여(마리당 1 회 1x109 cfu) 및 음수 투여를 병행하여 1일 1회, 총 16일 동안 수행하였다.
먼저, 실험동물로는 8 내지 10주령 수컷 Balb/c mice (20 내지 25g, 각군 10마리)(ORIENTBIO 사)가 사용되었다. 최초 균주 투여일을 Day-7일로 설정하고, DSS는 멸균 수 중에 2(v/v)%로 희석하여 0일부터 6일에 음수로서 PBS군을 제외한 모든 군에 공급하였다. 마우스는 자의적으로 음수를 섭취하나 일반적으로 하루에 6ml 이내를 섭취한다. 9일에 마우스를 희생시켰다.
DSS 투여한 후 2일 간격으로 마우스 생존율을 확인하였고, 체중, 털의 곤두섬, 동물의 움직임 정도, 및 설사 여부를 검사하여 DAI 점수를 산정하였다.
질환 활성지수(Disease activity index: DAI) 점수 부여(scoring)는 Ameho, Gut 1997; 41:487~493와 Wallace, Gastroenterology 1989; 96: 29~36을 참고하였다. 그 결과를 도 3 내지 도 6에 나타내었다.
도 3은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 L. plantarum LMT1-9 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 DAI 스코어로 나타낸 도면이다. 도 3에서 1-9 VIP는 L. plantarum LMT1-9에 pMT447이 형질전환된 균주를 나타낸다. 1-9 vector는 L. plantarum LMT1-9에 대조군 벡터 (VIP 유전자가 없는 모벡터)가 형질전환된 균주를 나타낸다.
도 4는 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 L. paracasei LMT1-21 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 DAI 스코어로 나타낸 도면이다. 도 4에서 1-21 VIP는 L. paracasei LMT1-21에 pMT447이 형질전환된 균주를 나타낸다. 1-21 vector는 L. paracasei LMT1-21에 대조군 벡터 (VIP 유전자가 없는 모벡터)가 형질전환된 균주를 나타낸다.
도 5는 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 L. brevis LMT1-46 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 DAI 스코어로 나타낸 도면이다. 도 5에서 1-46 VIP는 L. brevis LMT1-46에 pMT447이 형질전환된 균주를 나타낸다. 1-46 vector는 L. brevis LMT1-46에 대조군 벡터(VIP 유전자가 없는 모벡터)가 형질전환된 균주를 나타낸다.
도 3 내지 5에서, CyA는 cyclosporinA의 약자로 실험의 양성 대조군으로 사용하였다. PBS는 균을 처리하지 않고 DSS만 처리한 대조군 그룹이다. Normal은 균과 DSS 어떤 것도 처리하지 않은 그룹을 나타낸다.
도 6은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 DAI AUC 스코어로 나타낸 도면이다. 각각의 균주 및 화학물질에 대한 설명은 위에 언급되었으며 DAI AUC는 8일차까지 DAI SCORE의 곡선하 면적(area under the curve)을 나타낸다.
도 3 내지 6에 나타낸 바와 같이, VIP를 발현시키도록 형질전환된 Lactobacillus 균주는 DSS로 유도한 장염증 모델에서 치료 효과가 있었다.
도 7은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 조직병리학적으로 나타낸 도면이다. 도 7에서, Normal, PBS, LMT1-9 vector, LMT1-9 VIP, LMT1-46 vector, LMT1-46 VIP, LMT1-21 vector, 및 LMT1-21 VIP는 도 1 내지 6에서 설명한 바와 같다.
도 7에 나타낸 바와 같이, DSS로 유도한 장염증 마우스 모델에서 현미경을 통하여 대장의 조직병리학적 검사를 수행하였는바, VIP를 발현하는 Lactobacillus 균주를 투여한 마우스는 대조군에 비하여 치료 효능이 있는 것이 확인되었다.
구체적으로, 도 7에 나타낸 바와 같이, DSS로 유도한 장염증 마우스 모델에서 현미경을 통하여 대장의 조직병리학적 검사를 수행하였는바, 단핵 세포의 침윤, 점막 손상 등이 DSS 군에서 가장 심각하게 나타났으며, LMT 1-9 vector, LMT 1-21 vector, 및 LMT 1-46 vector 투여군은 병증에 대한 큰 개선 효과를 보이지 못했다. 반면, LMT 1-9 VIP, 1-21 VIP, 및 LMT1-46 VIP 투여군에서는 조직학적 손상 및 염증성 침윤의 병변이 감소되는 경향을 나타냈다. 이는 VIP를 발현하는 Lactobacillus 균주가 DSS로 유도된 염증성 장 질환 마우스 모델에 있어서 염증 완화 및 보호 효능이 있는 것으로 볼 수 있다.
(2) 재조합 미생물 및 TNF -알파 차단제의 병용 투여 효과
도 8은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 LAB 형질전환 균주 유래 VIP와 에타너셉트(etanercept) (Enbrel, 한국화이자제약)의 병용 치료효능을 DAI 스코어로 나타낸 도면이다. 도 8에서, Normal은 어떤 것도 처리하지 않은 그룹이다. PBS는 DSS만 처리 한 그룹이다. Enbrel은 DSS와 엔브렐을 처리한 그룹이다. 1-46 VIP는 DSS로 유도한 마우스에 L. brevis LMT1-46에 pMT447이 형질전환된 균주를 급여한 그룹이다. 1-46 VIP + enbrel은 DSS 유도한 마우스에 L. brevis LMT1-46에 pMT447이 형질전환된 균주와 엔브렐을 함께 처리한 그룹이다.
도 8은 아래와 같은 과정에 의하여 얻어진 결과이다. 형질전환 균주 유래 VIP 단백질 치료효능을 평가하기 위하여, 형질전환 균주를 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에 경구 투여시킨 후 생존율 또는 DAI 점수를 확인하였다. 형질전환 균주를 10ug/ml 클로람페니콜이 포함된 10ml의 MRS 배지에서 하루 동안 1차 배양한 후, 배양한 균주를 300 내지 600ml의 MRS CM 배지에 OD600이 0.01이 되도록 접종하였다. 16 내지 18시간 뒤 배양액의 OD600이 2 내지 3이 되면 총 투여 마우스 개체 수와 급여횟수에 맞춰 균주를 회수하였다. 7,000rpm에서 10분간 원심분리하여 배양 상등액을 제거하고 회수된 균주는 마리당 1회 1x109 cfu로 투여할 수 있도록 1x PBS에 부유시켰다. 균주 투여는 1일 1회, 총 16일간 시행되었다.
최초 균주 투여일을 Day-7일로 설정하여 치료효능 실험이 시작되었으며, DSS는 멸균 수 중에 2(v/v)%로 희석하여 0일부터 6일에 음수로서 PBS군을 제외한 모든 군에 공급하였다. 9일에 마우스를 안락사하였다. DSS 처리 후 2일 간격으로 생존율을 확인하였으며 체중, 털의 곤두섬, 동물의 움직임 정도, 설사 여부를 체크하여 DAI 점수를 산정하였다. 또한 에타너셉트(TNF blocker; Enbrel)와의 병용 투여 효능을 평가하기 위한 그룹에는 엔브렐을 10mg/kg으로 0, 2, 4, 및 6일에 복막내(IP) 투여하였다.
도 9는 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 LAB 형질전환 균주 유래 VIP와 엔브렐의 병용 치료효능을 DAI AUC 스코어로 나타낸 도면이다. 각각의 균주 및 화학물질에 대한 설명은 위에 기재되었으며 DAI AUC는 8일차까지 DAI SCORE의 곡선하 면적을 나타낸다.
도 8 및 9에 나타낸 바와 같이, VIP를 발현하는 균주와 엔브렐을 병용투여 하였을 때 균주 또는 엔브렐만 처리한 그룹보다 DAI 스코어가 감소하였다.
본 실험에서 사용된 엔브렐은 염증성 장 질환을 치료하기 위한 예시적인 약물이며, 그외 염증성 장 질환을 치료하는 약물이 LAB 형질전환 균주 유래 VIP와 조합하여 사용될 수 있다.
(3) 조직병리학( histopathology ) 실험 방법
실험동물을 실험 9일째 안락사한 뒤 2 cm 간격의 결장 원위부 두 부분을 0.5 cm 씩 적출하고 10% 포르말린 용액에 고정한 뒤 파라핀 포매하였다. 포매된 조직은 미크로톰(microtome)으로 5㎛ 간격으로 잘라서 슬라이드를 제작한 다음 H&E 염색을 하였다. 염색된 조직에 대해 Erben 등, Int J Clin Exp Pathol 2014;7(8):4557-4576의 평가법을 참고하여 조직의 심각도를 평가하였으며, 각 샘플당 임의의 3 또는 4개 이상의 부위에 대해 평가하였다.
평가 방법을 간략히 기술하면, 장 상피세포의 손상과 염증세포의 침윤 정도에 대해 구분하여 평가하였고 각 부분의 점수를 합산하여 0 내지 8점으로 결과를 나타내었다.
먼저, 염증세포의 침윤 정도는 하기 기준에 따라 평가하였다:
0=정상(normal),
1=경도-움 기저 주의 침윤)(mild-infiltrate around crypt basis),
2=중등도-점막근육판까지 침윤(moderate-infiltrate reaching to L. muscularis mucosae),
3=현저한-점막근육판까지 광범위 침윤 및 상기 점막의 두꺼워짐(marked -extensive infiltration reaching the muscularis mucosae and thickening of the mucosa),
4=심각-상기 점막하의 침윤(severe-infiltration of the L. submucosa).
또한, 상피세포의 손상 정도는 다음 기준에 따라 평가하였다:
0=정상, 1=초점 까짐-술잔세포의 상실(focal erosions-loss of goblet cells),
2=까짐-넓은 영역에서 술잔세포의 상실,
3=까지/궤양화-움(초점)의 상실(erosion/ulceration-loss of crypts (focal)),
4=연장된 궤양화-과립화 조직, 넓은 영역에서 움의 상실(extended ulceration-granulation tissue, loss of crypts in large areas).
도 10은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 LAB 형질전환 균주 유래 VIP와 엔브렐의 병용 치료효능을 조직병리학적 결과로 나타낸 도면이다. 도 10에서, Normal, PBS, Enbrel, LMT1-46 VIP, 및 LMT1-46 VIP+Enbrel은 도 9에서 설명한 바와 같다.
도 10에 나타낸 바와 같이, VIP를 발현하는 균주와 엔브렐을 병용투여 하였을 때 균주 또는 엔브렐만 처리한 그룹보다 치료 효능이 향상되었다.
구체적으로, 도 10에 나타낸 바와 같이, DSS로 유도한 장염증 마우스 모델에서 현미경을 통하여 대장의 조직병리학적 검사를 수행하였는바, 단핵 세포의 침윤, 점막 손상 등이 DSS 군에서 가장 심각하게 나타났으며, Enbrel 단독 투여군은 병증에 대한 큰 개선 효과를 보이지 못했다. 반면, LMT1-46 VIP 단독 투여 및 LMT 1-46 VIP & Enbrel 병용 투여군에서는 양성 대조군으로 사용된 CyA 투여군과 같이 조직학적 손상 및 염증성 침윤의 병변이 감소되는 경향을 나타냈다. 이는 VIP를 발현하는 Lactobacillus 균주가 DSS로 유도된 염증성 장 질환 마우스 모델에 있어서 염증 완화 및 보호 효능이 있는 것으로 볼 수 있다.
Figure PCTKR2019018596-appb-I000001
Figure PCTKR2019018596-appb-I000002
Figure PCTKR2019018596-appb-I000003

Claims (22)

  1. 프로모터, 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 혈관작동성 장 펩티드(VIP)를 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 미생물로서, Lactobacillus 속인 것인 재조합 미생물.
  2. 청구항 1에 있어서, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus brevis, 또는 Lactobacillus plantarum인 것인 미생물.
  3. 구성적 프로모터(constitutive promoter), 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 혈관작동성 장 펩티드(VIP)를 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 미생물로서, 유산균인 것인 재조합 미생물.
  4. 청구항 3에 있어서, 구성적 프로모터가 서열번호 10의 프로모터인 것인, 재조합 미생물.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 유산균은 Lactobacillus 속, 또는 Lactococcus 속인 것인 미생물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 유산균은 Lactobacillus paracasei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, 또는 Lactococcus lactis인 것인 미생물.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터와 상기 외래 유전자 사이에 작동가능하게 연결되어 있는 신호 서열을 추가로 포함하는 것인 미생물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 신호 서열은 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 신호 펩티드를 코딩하는 것인 미생물.
  9. 프로모터, 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 혈관작동성 장 펩티드(VIP)를 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 미생물로서, 유산균인 것인 재조합 미생물을 포함하는, 사람에서 위장관(gastrointestinal tract)의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 질환은 위장관 염증을 야기하는 것인 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 질환은 염증성 장질환(IBD), 및 대장염(colitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 또는 크론병(Crohn's disease)인 것인 조성물.
  13. 청구항 9에 있어서, 경구 투여 제형인 것인 조성물.
  14. 청구항 9에 있어서, 상기 유산균은 Lactobacillus 속, 또는 Lactococcus 속인 것인 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 유산균은 Lactobacillus paracasei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, 또는 Lactococcus lactis인 것인 조성물.
  16. 청구항 9 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터인 것인 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 구성적 프로모터는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 조성물.
  18. 청구항 9 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터와 외래 유전자 사이에 작동가능하게 연결되어 있는 신호 서열을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 신호 서열은 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 신호 펩티드를 코딩하는 것인 조성물.
  20. 청구항 9 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 위장관의 손상 질환을 치료하는 다른 치료 약물을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 치료 약물은 스테로이드성 항 염증제, 5-아미노살리실산, 면역 조절제, JAK 저해제, TNF 저해제, 인테그린 저해제, 인터루킨 저해제, 케모카인 저해제, 분화클러스터(CD) 저해제, 인터루킨, RIP 키나제 저해제, smad7 저해제, MadCAM 저해제 및 비-스테로이드성 항염증제(NSAID)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 비-스테로이드성 항염증제는 고전적 NSAID, 시클로옥시게나제 저해제, 또는 니트릭옥시드-방출 NSAID인 것인 조성물.
PCT/KR2019/018596 2018-12-28 2019-12-27 외래 단백질을 발현하는 미생물, 및 그의 용도 WO2020139014A2 (ko)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410485843.9A CN118562694A (zh) 2018-12-28 2019-12-27 表达外源蛋白的微生物及其用途
US17/287,162 US20220111009A1 (en) 2018-12-28 2019-12-27 Exogenous protein-expressing microorganism and use thereof
AU2019416605A AU2019416605B2 (en) 2018-12-28 2019-12-27 Exogenous protein-expressing microorganism and use thereof
JP2021538015A JP7280366B2 (ja) 2018-12-28 2019-12-27 外来タンパク質を発現する微生物、及びその用途
EP19902868.9A EP3858995A4 (en) 2018-12-28 2019-12-27 MICROORGANISM EXPRESSING EXOGENOUS PROTEIN AND USE THEREOF
CN201980086881.4A CN113348241B (zh) 2018-12-28 2019-12-27 表达外源蛋白的微生物及其用途
CA3118272A CA3118272A1 (en) 2018-12-28 2019-12-27 Exogenous protein-expressing microorganism and use thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180173063A KR102238519B1 (ko) 2018-12-28 2018-12-28 외래 단백질을 발현하는 미생물, 및 그의 용도
KR10-2018-0173063 2018-12-28

Publications (3)

Publication Number Publication Date
WO2020139014A2 true WO2020139014A2 (ko) 2020-07-02
WO2020139014A3 WO2020139014A3 (ko) 2021-04-22
WO2020139014A9 WO2020139014A9 (ko) 2021-06-03

Family

ID=71126655

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2019/018596 WO2020139014A2 (ko) 2018-12-28 2019-12-27 외래 단백질을 발현하는 미생물, 및 그의 용도

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220111009A1 (ko)
EP (1) EP3858995A4 (ko)
JP (1) JP7280366B2 (ko)
KR (1) KR102238519B1 (ko)
CN (2) CN118562694A (ko)
AU (1) AU2019416605B2 (ko)
CA (1) CA3118272A1 (ko)
WO (1) WO2020139014A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021195703A1 (en) * 2020-03-31 2021-10-07 Servatus Ltd Combination therapy for inflammatory bowel disease

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000236873A (ja) 1998-12-25 2000-09-05 Yakult Honsha Co Ltd 細胞外マトリックス結合性を有する乳酸菌、該乳酸菌の作出方法、及びそれを含有する医薬製剤
JP2002154976A (ja) 2000-11-22 2002-05-28 Sanpo Kk 慢性疾患の予防、改善及び／又は治療剤並びに健康食品
JP2006262724A (ja) * 2005-03-22 2006-10-05 Kobe Univ タンパク質高発現乳酸菌
ES2595729T3 (es) 2007-01-12 2017-01-03 Intrexon Actobiotics Nv Promotores de Lactococcus y usos de los mismos
KR100972843B1 (ko) 2007-03-22 2010-07-28 주식회사 바이오리더스 신규 항시적 고발현 프로모터 및 그 용도
EP2273998A2 (en) 2008-04-04 2011-01-19 Farallone Holdings Bv Methods and materials for gastrointestinal delivery of pathogen/toxin binding agents
EP2424885B1 (en) * 2009-04-28 2016-03-23 Vanderbilt University Compositions and methods for the treatment of disorders involving epithelial cell apoptosis
WO2011020091A1 (en) * 2009-08-14 2011-02-17 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Modified vasoactive intestinal peptides
WO2011148219A1 (en) * 2010-05-28 2011-12-01 Compagnie Gervais Danone Probiotic strains for use in improving the enteric nervous system
WO2014096901A1 (en) * 2012-12-18 2014-06-26 Compagnie Gervais Danone Strain of bifidobacterium animalis ssp. animalis
CA2905435A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Synergy Pharmaceuticals Inc. Compositions useful for the treatment of gastrointestinal disorders
KR101992345B1 (ko) * 2017-12-29 2019-09-27 (주)메디톡스 프로모터 폴리뉴클레오티드, 신호 폴리펩티드 및 그의 용도
CN108753670A (zh) * 2018-05-28 2018-11-06 西北工业大学 多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌及制备方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021195703A1 (en) * 2020-03-31 2021-10-07 Servatus Ltd Combination therapy for inflammatory bowel disease

Also Published As

Publication number Publication date
KR102238519B9 (ko) 2023-09-07
CN118562694A (zh) 2024-08-30
JP7280366B2 (ja) 2023-05-23
KR102238519B1 (ko) 2021-04-13
JP2022516113A (ja) 2022-02-24
EP3858995A2 (en) 2021-08-04
US20220111009A1 (en) 2022-04-14
KR20200083816A (ko) 2020-07-09
WO2020139014A3 (ko) 2021-04-22
CN113348241A (zh) 2021-09-03
AU2019416605A1 (en) 2021-05-27
CA3118272A1 (en) 2020-07-02
WO2020139014A9 (ko) 2021-06-03
CN113348241B (zh) 2024-05-10
AU2019416605B2 (en) 2023-03-02
EP3858995A4 (en) 2022-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11549118B2 (en) Genetically modified bacteria stably expressing IL-10 and insulin
WO2019212293A1 (en) Extracellular vesicles derived from recombinant microorganism including polynucleotide encoding target protein and use thereof
WO2020139014A2 (ko) 외래 단백질을 발현하는 미생물, 및 그의 용도
CA2971933A1 (en) Method of culturing segmented filamentous bacteria in vitro
WO2021215717A1 (ko) 혈관 작동성 장 펩티드를 발현하는 미생물, 및 그의 용도
JP2004514451A (ja) マイコバクテリア感染に対する防御
WO2010147684A1 (en) Compositions for and methods of activating guanylyl cyclase c
CN114761028A (zh) 乳糜泻的治疗
WO2021086085A1 (ko) 종양 표적화 살모넬라 갈리나룸 균주 및 이의 용도
KR102635553B1 (ko) 외래 단백질을 발현하는 미생물, 및 그의 용도
US9050320B2 (en) Method for inducing lymphoid tissue and modulating intestinal homeostasis
KR102527954B1 (ko) 외래 단백질을 발현하는 미생물, 및 그의 용도
WO2017158108A1 (en) Listeriolysin s or related peptides as antibacterials
Remaut et al. Clinical potential of Lactococcus lactis mediated delivery of human interleukin-10 and trefoil factors
WO2024059139A2 (en) Engineered probiotics expressing anti-inflammatory molecules
WO2023012327A1 (en) New method to treat autoimmune diseases

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19902868

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3118272

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019902868

Country of ref document: EP

Effective date: 20210426

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019416605

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20191227

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021538015

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE