WO2020111223A1 - 乳房炎の原因菌の検出方法 - Google Patents

乳房炎の原因菌の検出方法 Download PDF

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浩志 前花
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    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/70—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in livestock or poultry

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting bacteria that cause mastitis in milk.
  • the milk of livestock represented by cows, sheep and goats is not aseptic, and some microorganisms may be mixed due to the disease or environment.
  • many diseases are often excreted in milk in diseases caused by infection of the breast with microorganisms.
  • a typical livestock disease caused by microbial infection is mastitis.
  • Mastitis is inflammation of the ductal system and mammary gland tissue, and is mainly caused by the invasion and colonization of microorganisms in the breast and proliferation. Mastitis affects many animals, and bovine mastitis, especially in dairy cows, is said to affect 15-40% of all dairy cows, and is one of the extremely important diseases for dairy farmers.
  • dairy cows suffer from mastitis, the synthetic function of milk is impaired, resulting in a decrease in milk production and, in some cases, cessation of milk production as well as a large economic loss such as treatment costs and a milk price penalty due to reduced milk quality.
  • the labor burden on dairy farmers will also increase, such as milking individual mastitis-affected cells to prevent infection.
  • Mastitis is caused by the infection of various microorganisms.
  • a culture method is widely used as a method for detecting causative bacteria from milk.
  • the culturing method takes several days to obtain a result and is not suitable for rapid identification of the causative bacteria, there is a strong demand for a technique capable of promptly diagnosing the causative bacteria of mastitis at a dairy farm.
  • the identification method by the antigen-antibody reaction using an antibody against a component specific to the causative bacterium can determine the result in several tens of minutes, so it is widely used at home and in consultation rooms as a quick and simple test method.
  • Patent Document 1 The immunochromatographic method has also been known by the present inventors as a method for detecting a substance in milk of livestock (Patent Documents 2 to 3).
  • Patent Documents 2 to 3 it is general that the final judgment of infectious disease diagnosis is made by the above-mentioned culture method.
  • the culture method In the diagnosis of infectious diseases by the culture method, it is determined to be positive when detecting the bacteria that are present in milk for the diagnosis and treatment of mastitis, especially the causative bacteria of environmental mastitis such as Escherichia coli, Klebsiella, streptococcus, and CNS. In some cases, the result was negative even if it was performed, and the reliability of the determination result is not necessarily high. It is considered that such a problem may occur even when the immunochromatography method is used.
  • the purpose of the present invention is to investigate the cause of the decrease in reliability when detecting causative bacteria of environmental mastitis such as Escherichia coli, Klebsiella, streptococcus, and CNS, and to provide a highly reliable detection means.
  • Another object of the present invention is to provide a highly reliable detection means by an immunochromatography method capable of quicker determination than a culture method, and a diagnostic kit using the detection means.
  • the present inventors collected mastitis milk and normal milk, and quantitatively analyzed the amount of bacteria present in the milk, thereby ensuring the reliability of contaminating bacteria and the cause of mastitis.
  • the amount of bacteria at the boundary of the bacteria is found, set as a cut-off value, and further, when the causative bacteria are detected by immunochromatography for diagnosing mastitis, the amount of bacteria at the boundary is set as a detection limit.
  • the detection performance of the causative bacteria was controlled.
  • the present invention has been completed by developing an immunochromatographic method that detects only the causative bacteria of mastitis without detecting contaminating bacteria from the environment. That is, the present invention provides the following.
  • a method for detecting a causative bacterium of environmental mastitis in livestock which is selected from the group consisting of coliforms, streptococci, and coagulase-negative staphylococci: The number of causative bacteria in the milk of the subject livestock was previously determined based on the distribution of the amount of the causative bacteria in the milk from the unaffected group and the distribution of the amount of the causative bacteria in the milk from the affected group.
  • the immunological test method is an immunochromatographic method using an antibody (particle-labeled antibody) labeled with colloidal gold particles of 0.6/cm 2 or more and 3.5/cm 2 or less Cause of environmental mastitis in livestock How to detect fungi.
  • the determination value is 370 cfu/ml or more and 1600 cfu/ml or less.
  • the causative bacterium is any one selected from the group consisting of Escherichia coli, staphylococcus, and Klebsiella.
  • An antibody (particle-labeled antibody) labeled with a colloidal gold particle having a retention amount of 0.6/cm 2 or more and 3.5/cm 2 or less is connected to the retained first portion and downstream of the first portion, and
  • An immunochromatographic device comprising a second portion on which a second antibody against a specific substance is immobilized.
  • the immunochromatographic device wherein the determination value of the causative bacterium is 370 cfu/ml or more and 1600 cfu/ml or less.
  • the retained amount of the colloidal gold particles is 370 cfu/determined in advance based on the distribution of the number of causative bacteria in milk from the non-diseased group and the distribution of the number of causative bacteria in milk from the diseased group. 6.
  • a kit for diagnosing mastitis of livestock due to environmental causative bacteria which comprises the immunochromatographic device according to any one of 5 to 7.
  • a method for detecting a causative bacterium of environmental mastitis in livestock which comprises: The number of causative bacteria in the milk of the subject livestock was previously determined based on the distribution of the amount of the causative bacteria in the milk from the unaffected group and the distribution of the amount of the causative bacteria in the milk from the affected group.
  • a method comprising the step of determining whether or not it is equal to or greater than a determination value.
  • the causative bacterium is any one selected from the group consisting of Escherichia coli, streptococcus, and coagulase-negative staphylococcus.
  • a particle-labeled antibody that is a first antibody against a specific substance derived from an environmental causative bacterium of livestock mastitis is a causative bacterium in milk derived from an unaffected group.
  • the first part held in an amount with a predetermined judgment value as the lower limit value, and connected to the downstream of the first part.
  • an immunochromatographic device comprising a second portion on which a second antibody against a specific substance is immobilized.
  • the causative bacterium is any one selected from the group consisting of Escherichia coli, streptococcus, and coagulase-negative staphylococci
  • the particle-labeled antibody is a gold colloid particle-labeled antibody
  • the gold colloid particle-labeled antibody is 12.
  • the immunochromatographic device according to 11 which is maintained at 0.6/cm 2 or more and 3.5/cm 2 or less in a device for performing an immunochromatographic method.
  • a kit for diagnosing mastitis of livestock due to environmental causative bacteria which comprises the immunochromatographic device according to 10 or 11.
  • the influence of contaminating bacteria from the environment is suppressed, and the causative bacteria of mastitis can be quickly and simply and It can be detected on the spot.
  • the causative bacterium can be quickly identified before the disease gets worse, and an appropriate treatment policy such as selection of an appropriate antibiotic and measures to prevent the spread of infection can be determined early.
  • the column of “1.0E+00” represents the number of samples in which the number of bacteria was 1.0 ⁇ 10 0 cfu/ml or more and less than 1.0 ⁇ 10 1 cfu/ml. The same applies to the other columns.
  • the cross-sectional schematic diagram of the test piece of the immunochromatographic apparatus used in the Example is shown.
  • the column of “1.0E+00” represents the number of samples in which the number of bacteria was 1.0 ⁇ 10 0 cfu/ml or more and less than 1.0 ⁇ 10 1 cfu/ml. The same applies to the other columns.
  • the present invention relates to a method for diagnosing mastitis in livestock due to environmental causative bacteria.
  • the method of the present invention in advance, the determination value is determined based on the distribution of the amount of the causative bacteria in the milk from the non-diseased group, and the distribution of the amount of the causative bacteria in the milk from the diseased group.
  • the method includes a step of determining whether or not the number of environmentally-causing bacteria in the milk of livestock is equal to or more than the determination value.
  • the present invention is for detecting the causative bacteria of environmental mastitis.
  • the causative bacteria of mastitis can be roughly classified into infectious and environmental ones.
  • Environmental (mastitis) causative bacteria include coliform bacteria, environmental staphylococci (staphylococci other than Staphylococcus aureus), environmental streptococci (streptococci other than non-milky streptococci) Be done.
  • the coliform group includes Escherichia coli, Klebsiella spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp. and Proteus spp.
  • Klebsiella spp. includes Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca.
  • the environmental Staphylococcus spp includes CNS (Coagulase Negative Staphylococcus, coagulase-negative Staphylococcus).
  • the CNS includes Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus epidermidis and the like.
  • staphylococcus is used to mean any one of environmental Staphylococcus spp.
  • Examples of the environmental Streptococcus include Streptococcus uberis, Streptpcoccus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equinus, Streptococcus canis, Streptococcus bovis, Streptococcus porcinus, Streptococcus pluranimalium, Streptococcococus, Strreptococcocococcus, parapetris, Strreptococcococcus parauberis, Strreptococcocococcus parauberis.
  • the present invention is particularly suitable for Escherichia coli or Staphylococcus.
  • a predetermined determination value is used when detecting the causative bacteria of mastitis.
  • the judgment value is a value that divides a group affected by mastitis (affected group) and a group not affected by mastitis (non-affected group).
  • the cutoff value is set from the test value distribution of the patient group affected by a specific disease and the test value distribution of the non-patient group.
  • the determination value referred to in the invention may be referred to as a cutoff value.
  • the determination value of the present invention is obtained based on the distribution of the amount of the causative bacteria in milk from the non-diseased group and the distribution of the amount of causative bacteria in the milk from the affected group. Specifically, taking the case of a cow with mastitis due to Escherichia coli as an example, the judgment value can be calculated as follows: A plurality of milk samples obtained from a group that developed mastitis due to Escherichia coli (mastitis group) and a plurality of milk samples obtained from a group that did not develop mastitis (normal group) were each subjected to a culture method. Determine the amount of bacteria.
  • ROC analysis is an analysis method that uses a ROC curve (Receiver Operating Characteristic curve), and is generally used to search for an appropriate cutoff value for a certain inspection value.
  • ROC curve Receiveiver Operating Characteristic curve
  • a curve (POC curve) corresponding to the change in the cutoff value can be drawn by connecting a line with the false positive rate on the horizontal axis and the sensitivity on the vertical axis.
  • the cutoff value that gives the upper left point of the curve (the point closest to (0, 1) on the graph. Ideally, the false positive rate is 0 and the sensitivity is 1) is the most effective point for separating positive and negative.
  • an appropriate cutoff value can be searched for a certain inspection value.
  • the sensitivity is the probability of correctly determining what should be determined to be positive, and is expressed as the number of true positives/the total number of truly positive subjects (that is, the number of true positives + the number of false negatives). To be done. Specificity is the probability of correctly determining what should be judged as negative, and is expressed as the number of true negatives/total number of subjects that are truly negative (that is, the number of true negatives + the number of false positives). It As the determination value in the present invention, the value obtained as the most effective cutoff value by such ROC analysis can be adopted.
  • the determination value of the amount of bacteria in the milk sample in the case of environmental mastitis is a value of 300 cfu/ml or more and 3000 cfu/ml or less, regardless of the causative bacteria. It is possible to set the value to 370 cfu/ml or more and 1600 cfu/ml or less.
  • the causative bacterium is a bacterium of the coliform group, for example, Escherichia coli
  • the value is preferably 660 cfu/ml or more and 1360 cfu/ml or less, and more preferably 700 cfu/ml or more and 900 cfu/ml or less.
  • the causative bacterium is an environmental staphylococcus, for example, staphylococcus
  • the value is 375 cfu/ml or more and 1595 cfu/ml or less, and further preferably the value is 875 cfu/ml or more and 1145 cfu/ml or less. ..
  • the determination value can be determined for each bacterial species, or may be determined for each environment in which a sample is collected.
  • the judgment value thus obtained can be used as the lower limit of detection (lower limit of the number of detectable bacteria) when designing a specific detection means such as an immunochromatographic device described later. This is because by setting the lower limit of detection, a positive/negative determination can be made immediately depending on whether or not it is detected by the device.
  • the distribution of the amount detected in milk from the non-diseased group, and the determination value determined based on the distribution of the amount of causative bacteria in the milk from the affected group As a result, it is possible to eliminate the influence of bacteria that are mixed in from the environment. In this way, there has never been a detecting means optimized in consideration of the influence of the environment, and this is the first proposal by the present application.
  • the method using the judgment value of the present invention can be carried out as a method for detecting a causative bacterium of environmental mastitis in livestock, and as a method for diagnosing environmental mastitis in livestock. These methods may include the step of collecting milk from the livestock.
  • the method using the judgment value of the present invention can also be carried out by various immunological methods using an antibody whose antigen is a specific substance derived from the causative bacterium. Examples of the immunological measurement method include immunochromatographic method, agglutination method, enzyme immunoassay method (ELISA method), radioimmunoassay method (RIA method), and fluorescence immunoassay method (FIA method). However, the present invention is not limited to these. When the immunochromatography method is used, it can be typically carried out as follows.
  • the antigen-antibody reaction uses a sandwich assay using "a labeled first antibody against a specific substance" retained in the first part and "a second antibody against the specific substance” immobilized on the second part. It can be detected by the method. Alternatively, the antigen-antibody reaction may be detected by a competitive method using a labeled specific substance retained in the first portion and an antibody against the specific substance immobilized in the second portion. However, in the present invention, a sandwich assay method is preferable because it has high detection sensitivity and a positive antibody detection line appears.
  • An immunochromatography device is for detecting a specific substance in milk by immunochromatography or for diagnosing mastitis in livestock.
  • the immunochromatographic device is specifically, for example, a labeled first antibody against the specific substance or a first portion holding the labeled specific substance, and is connected downstream of the first portion, and A second part to which the second antibody against the specific substance is immobilized, and a third part which is linked upstream of the first part or the second part and has a void capable of removing milk fat globule in the milk.
  • An apparatus including a test piece having As a specific configuration of the test piece, the test piece whose schematic cross-sectional view is shown in FIG. 3 can be mentioned. In FIG.
  • the fat globules removing member (third part) 7 is located downstream of the sample addition filter member 4 and downstream of the labeled antibody-impregnated member (first part) 1 and at the chromatographic development membrane carrier (first part). 2 part) 2 is installed upstream.
  • the second antibody against the specific substance is immobilized on the second portion, and the supplementary site 3 (test line) for capturing the specific substance bound to the labeled first antibody is provided on the device.
  • a supplementary site 8 (control line) for supplementing the substance to be used as a control is provided to confirm that the reaction has proceeded normally.
  • the immunochromatographic device can be manufactured by a known method using commercially available materials.
  • the material used for the first part is not particularly limited as long as it can perform immunochromatography, but is preferably a fiber matrix such as a cellulose derivative, filter paper, glass fiber, cloth or cotton.
  • the material used for the second part is not particularly limited as long as it can perform immunochromatography, but is preferably nitrocellulose, mixed nitrocellulose ester, polyvinylidene fluoride, nylon or the like.
  • the material used for the third part preferably has voids capable of removing milk fat globules with a diameter of 1 to 10 ⁇ m contained in milk.
  • the third part needs to be arranged on the upstream side of the second part where the sample solution is made of a porous membrane having a pore size of several tens to several hundreds of nm, and is the position where the sample solution can first come into contact with and pass through. It is preferably arranged on the upstream side of the first portion.
  • the voids included in the third portion may be of a size that can separate milk fat globules, and the retention particle size is preferably 0.1 to 10 ⁇ m, more preferably 1 to 3.5 ⁇ m.
  • the material is not particularly limited as long as it has voids in the above range, but is preferably a fiber matrix such as a cellulose derivative, filter paper, glass fiber, cloth or cotton.
  • Retained particle size is the particle size of milk fat globules that have a particle size equal to or greater than that size and are retained in the third part without being able to pass through the voids, and the average pore size of the voids in the third part.
  • Substantially corresponds to, but 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, particularly preferably 90% of milk fat globules having a particle size of the size or more. % Or more, most preferably 98% or more, cannot pass through the voids and are retained in the third portion.
  • the proportion of retained milk fat globule can be measured by a method well known to those skilled in the art.
  • GF/B provided by GE Healthcare Bioscience Co., Ltd. has a retention particle size (a particle diameter with a retention efficiency of 98%.
  • the retention particle size in the present specification means the retention particle size unless otherwise specified. However, it is possible to confirm the above particle size by a method well known to those skilled in the art.
  • the third portion may be used only a material having a specific retention particle size, may be used by gradually laminating the retention particle size from large to small in order to increase the separation efficiency of milk fat globules. .. It is a preferred embodiment of the present invention when the third portion is composed of two or more members having voids capable of removing milk fat globules of different particle sizes, respectively, and the third portion is arranged downstream. It is a further preferred embodiment of the present invention, in which it is constituted by a member and a second member arranged upstream, and the retained particle size of the second member is larger than the retained particle size of the first member.
  • the retained particle size of the first member arranged downstream is 1.0 to 2.0 ⁇ m
  • the retained particle size of the second member arranged upstream is It is preferably 3.0 to 3.5 ⁇ m.
  • Milk containing milk fat globule with high concentration and wide particle size distribution preferably in order to detect a specific substance with high sensitivity from undiluted milk after milking, the third part is a member having a small particle size and a holding particle. It is preferably configured by combining with a member having a large size.
  • the first portion holds a labeled first antibody against a specific substance or a labeled specific substance.
  • the specific substance can be detected by the sandwich assay method.
  • the specific substance can be detected by the competitive method.
  • the detection sensitivity is high, and since the sandwich assay method in which a positive antibody detection line appears is preferable, the first portion retains the labeled first antibody against the specific substance. Is preferred.
  • first antibody against the specific substance When holding the labeled first antibody against a specific substance in the first part, use two types of antibodies, a first antibody against the specific substance and a second antibody against the specific substance.
  • the first antibody and the second antibody are antibodies capable of binding to the specific substance at the same time so that the specific substance can be detected by a sandwich assay method, and the first antibody recognizes the specific substance.
  • the epitope of the specific substance is preferably different from the epitope of the specific substance recognized by the second antibody.
  • the first antibody or specific substance retained in the first portion is labeled in order to obtain a detectable signal.
  • the label used in the present invention include colored particles, enzymes, radioisotopes and the like, but it is preferable to use colored particles that can be detected by visual observation without requiring special equipment.
  • colored particles include, but are not limited to, fine metal particles such as gold and platinum, non-metal particles, and latex particles.
  • the colored particles may have any size as long as they can be transported downstream through the voids of the test piece, but preferably have a diameter of 1 nm to 10 ⁇ m.
  • the thickness is more preferably 5 nm to 1 ⁇ m, still more preferably 10 nm to 100 nm.
  • the detection limit of immunochromatography can be adjusted by changing the particle concentration.
  • the particle concentration can be measured based on the maximum absorbance at 500 to 600 nm. Then, it can be obtained by impregnating the base material with the base material and drying.
  • Suitable materials for the conjugate pad include, but are not limited to, paper, cellulose blends, nitrocellulose, polyesters, acrylonitrile copolymers, glass fibers or nonwoven fibers such as rayon. A glass fiber pad is preferably used.
  • the particle concentration is preferably 0.1/cm 2 or more, more preferably 0.3/cm 2 or more, still more preferably 0.6, as the maximum absorbance value from the viewpoint of maintaining reactivity in a sample. /Cm 2 or more is desirable. From the viewpoint of liquid flow of immunochromatography and visibility on nitrocellulose, it is preferably 10/cm 2 or less, more preferably 5/cm 2 or less, and further preferably 4/cm 2 or less. ..
  • the above-mentioned test piece may be used as it is as an immunochromatographic device, or may be housed in a case to be an immunochromatographic device.
  • the amount of milk used as a sample when the amount of milk used as a sample is large, it is preferable to directly dip one end of the test piece in the sample contained in the container before use.
  • the amount of milk used as a sample when the amount of milk used as a sample is small, it is preferable to measure a predetermined amount with a pipette or the like and drop it onto a test piece for use.
  • the shape of the case in the latter case may be any shape as long as it can accommodate the test piece.
  • the material of the case may be any material, and polypropylene and polycarbonate are preferred.
  • the immunochromatographic apparatus of the present invention comprises a container, for example, a microtube, and an additive solution, for example, an additive solution containing a lytic enzyme or a surfactant for lysing bacteria to elute the ribosomal proteins L7/L12 into the solution. It can also be provided as a kit.
  • the kit provided by the present invention is for detecting a specific substance in milk or for diagnosing mastitis in livestock.
  • the specific substance can be any substance as long as it can be measured by the immunological method.
  • it is a component of bacteria or a substance secreted by bacteria. More preferably, it is a bacterial L7/L12 ribosomal protein.
  • the L7/L12 ribosomal protein has high detection sensitivity because it exists in multiple copies in cells.
  • an antibody capable of distinguishing a specific bacterium that causes mastitis from other bacteria by species or genus can be actually obtained by the known method described below.
  • the type of bacteria is not particularly limited and may be either Gram-positive bacteria or Gram-negative bacteria.
  • examples thereof include, but are not limited to, staphylococci (bacteria belonging to Staphylococcus), preferably Gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus, or bacteria belonging to Escherichia coli or Klebsiella. ..
  • the above antibody can be prepared by the method described in WO00/06603.
  • the bacterial ribosomal protein L7/L12 can be prepared by using the full-length protein of bacterial ribosomal protein L7/L12 or a partial peptide thereof as an antigen, but it is preferable to prepare the full-length protein as an antigen.
  • This partial peptide or full-length protein as it is, or after cross-linking with a carrier protein, is inoculated into an animal with an adjuvant if necessary, and the serum is collected to collect an antibody (polyclonal antibody) that recognizes L7/L12 ribosomal protein. Serum can be obtained.
  • the antibody may be purified from the antiserum and used.
  • the animals to be inoculated are sheep, horses, goats, rabbits, mice, rats and the like, and sheep and rabbits are particularly preferable for producing polyclonal antibodies.
  • the antibody it is more preferable to apply a monoclonal antibody obtained by a known method for producing hybridoma cells, and in this case, mouse is preferable.
  • the monoclonal antibody a monoclonal antibody that reacts with a specific bacterial ribosomal protein L7/L12 that causes mastitis, and does not react with a specific bacterial ribosomal protein L7/L12 that causes mastitis other than the specific bacteria. Screening can be useful for diagnosing whether or not an infectious disease caused by the bacterium is involved.
  • Antibodies react with specific bacterial components that cause mastitis or substances secreted by the bacteria, but do not react with components of bacterial components that cause mastitis other than the specific bacteria or substances secreted by the bacteria Any monoclonal antibody can be used even if it recognizes an antigen other than the ribosomal proteins L7/L12 as an antigen.
  • the monoclonal antibody it is preferable to use a monoclonal antibody in which the antigen-antibody reaction is not inhibited by contaminants other than the specific substance contained in the milk.
  • milk contains a large amount of proteins such as casein, which may inhibit the reaction between a specific substance and a monoclonal antibody.
  • a monoclonal antibody against a specific substance is produced by a conventional method, it may be preferable to appropriately select and use a monoclonal antibody whose antigen-antibody reaction is not inhibited by casein or the like, or a monoclonal antibody which has little influence on the antigen-antibody reaction. is there.
  • Such a monoclonal antibody after producing a monoclonal antibody which specifically reacts with an antigen according to a usual method, it is examined whether or not the antigen-antibody reaction is inhibited in the presence of contaminants such as casein, It can be easily obtained by selecting a monoclonal antibody that is not substantially inhibited by the reaction.
  • the first antibody or specific substance retained in the first portion is labeled.
  • the label used in the present invention include colored particles, enzymes, radioisotopes and the like, but it is preferable to use colored particles that can be detected by visual observation without requiring special equipment.
  • colored particles include, but are not limited to, fine metal particles such as gold and platinum, non-metal particles, and latex particles.
  • the colored particles may have any size as long as they can be transported downstream through the voids of the test piece, but preferably have a diameter of 1 nm to 10 ⁇ m.
  • the thickness is more preferably 5 nm to 1 ⁇ m, and further preferably 10 nm to 100 nm.
  • a preferred example of the colored particles is colloidal gold particles.
  • an immunochromatography device designed such that the above-mentioned predetermined judgment value becomes the detection limit of the device is used.
  • a gold colloid particle-labeled antibody is used as the labeled first antibody retained by the labeled antibody-impregnating member (first portion).
  • the detection limit can be adjusted by the amount of the gold colloid particle-labeled antibody retained (hereinafter, simply referred to as “gold colloid retained amount”). The detection limit can be lowered by increasing the gold colloid holding amount, and the detection limit can be raised by decreasing the gold colloid holding amount.
  • the amount of colloidal gold retained in the labeled antibody-impregnated member of the immunochromatography device can be represented by Amax/cm 2 .
  • the labeled antibody-impregnated member holding the gold colloid in the device is cut out and added to a tube containing 0.2 ml of water or a buffer solution to elute the gold colloid.
  • the maximum absorbance A max at 500 to 600 nm, for example, 540 nm is measured using a cell having an optical path length of 1 cm. The obtained measured value is divided by the area of the glass fiber used for elution to calculate the value of Amax/cm 2 .
  • the amount of gold colloid retained in the labeled antibody-impregnated member of the immunochromatographic apparatus can be, for example, 0.3 or more and 6.0 or less as the value of A540 max/cm 2 , and 0.6 or more and 3.8 or less. It can be set to the following, preferably 0.8 or more and 3.5 or less, more preferably 1.0 or more and 3.0 or less, or 1.0 or more and 2.0 or less, and further preferably 1.5 or more and 2.5 or less. It is considered that such a judgment value can be preferably used when the causative bacterium is coliform bacteria or staphylococcus, and can be more preferably used when the causative bacterium is Escherichia coli.
  • sample lysis When the causative bacterium is detected in the present invention, when using an immunological method in which a specific substance derived from the causative bacterium is used as an antigen, it is necessary to lyse the microbial cell with high efficiency and release the antigen in the microbial cell outside the microbial cell. There is. However, when milk is used as a sample, lysis is often not sufficiently performed by the conventional techniques due to the effects of proteins such as casein and milk fat globules that are contained in large amounts in milk. Therefore, if necessary, a lysing agent containing an enzyme or a surfactant can be used.
  • the content of the lytic enzyme in the lytic agent (when using a plurality of lytic enzymes, refers to the content as the total amount of lytic enzymes) is not particularly limited as long as an effective lytic rate for detection is secured.
  • the surfactant either a nonionic surfactant, an anionic surfactant, or a combination thereof can be used, and if necessary, a cationic surfactant or a benign surfactant is used. You can also
  • any of ester ether type, ester type, and ether type can be preferably used, and more specifically, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether, fatty acid sorbitan ester, Examples thereof include alkyl polyglucoside, fatty acid diethanolamide, alkyl monoglyceryl ether, and polysorbates (fatty acid sorbitan ester in which ethylene oxide is condensed for several tens of minutes), but are not particularly limited.
  • polysorbates more particularly polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate, polyoxyethylene (60) sorbitan monostearate, polyoxyethylene (65) sorbitan tristearate, and polyoxyethylene (65) sorbitan tristearate.
  • any of carboxylic acid salt, sulfonic acid salt, sulfuric acid ester salt and the like can be preferably used. More specific examples include alkyl ether carboxylates, linear alkylbenzene sulfonates (LAS), ⁇ -olefin sulfonates (AOS), dialkyl sulfosuccinates, formaldehyde condensates of naphthalene sulfonates, alkyl sulfates.
  • AS salts
  • AES polyoxyethylene alkyl sulfate ester salts
  • phosphoric acid ester salts such as higher alcohols and their ethylene oxide adducts.
  • N-acylglutamates such as coconut fatty acid monoglyceride sodium monosulfate, sodium laurylsulfoacetate, and sodium N-palmitoylglutamate, sodium N-methyl-N-acylalanine, and sodium ⁇ -olefinsulfonate.
  • any of an amine salt type and a quaternary ammonium salt type can be preferably used, and more specific examples include distearyldimethylammonium chloride, benzalkonium chloride and hexadecyltrimethylammonium chloride. Bromide, hexadecyl trimethyl ammonium bromide, myristyl trimethyl ammonium bromide, etc. can be mentioned.
  • amphoteric surfactant examples include amino acid type (alkylamino fatty acid salt), betaine type (alkylbetaine), amine oxide type (alkylamine oxide), but are not particularly limited. More specific examples include dimethylammoniopropane sulfonate, dodecyldimethylammonioobileate, betaine laurate, and amidopropyl betaine.
  • More specific examples include n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, n-Decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, n-Dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, n-Hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, N- Dodecyl-N,N-(dimethylammonio)butyrate.
  • the lysing agent may contain a buffering agent for the purpose of improving reactivity.
  • the buffer material is not particularly limited, and examples thereof include Good's buffer solution, Tris buffer solution, phosphate buffer solution, acetate buffer solution, borate buffer solution and the like.
  • the pH of the buffer solution is not particularly limited, but is, for example, in the range of pH 4 to 10, preferably in the range of pH 6 to 9.
  • components other than the lytic enzyme and the surfactant are substances having an effect of promoting lysis or an effect of suppressing non-specific reaction.
  • substances having an effect of promoting lysis include glutaraldehyde, halogen compounds, chlorhexidine, alcohols (eg, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-1-).
  • alcohols eg, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-1-).
  • the lower limit value of the final concentration when mixed with milk refers to the concentration as the total amount.
  • the concentration can be 0.1 mM or more, preferably 1 mM or more, and more preferably 1 mM or more.
  • the upper limit of the final concentration when mixed with milk can be 500 mM or less, preferably 200 mM or less, and more preferably 100 mM or less.
  • Chelating agents include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and its salts, glycol ether diaminetetraacetic acid (EGTA) and its salts, polyphosphoric acid and its salts, and metaphosphoric acid and its salts.
  • the lower limit of the final concentration when mixed with milk (when using a plurality of chelating agents, refers to the concentration as the total amount of chelating agents; the upper limit is the same) can be 0.001 mM or more, and preferably It can be 0.01 mM or more, and more preferably 0.1 mM or more.
  • the upper limit of the final concentration when mixed with milk can be 100 mM or less, preferably 10 mM or less, and more preferably 5 mM or less, from the viewpoint of inhibiting inhibition of the antigen-antibody reaction.
  • salts, proteins, polymer compounds, antibacterial agents, etc. can be used as additives.
  • globulin which is not involved in the reaction with the antigen can be added.
  • the ⁇ -globulin may be derived from mammals such as mouse, rabbit, cow, pig, horse, sheep and goat, birds such as chicken and animal species such as human and is not particularly limited.
  • the ⁇ -globulin concentration is not particularly limited, but from the viewpoint of suppressing false positives, the final concentration during the reaction is 0.01 ⁇ g/ml or more, preferably 0.1 ⁇ g/ml or more, more preferably 1 ⁇ g/ml or more.
  • it can be 10 mg/ml or less, preferably 5 mg/ml or less, and more preferably 1 mg/ml or less from the viewpoint of not inhibiting the antigen-antibody reaction of the subject.
  • Such conditions of final concentration are particularly suitable for immunochromatography.
  • the mixing ratio of milk and lysing agent is not particularly limited as long as the final concentration of the lysing enzyme and the like can be appropriately maintained and a sufficient lysis rate can be secured. If a relatively small amount of lysing agent is used in the milk, the milk will not be diluted. Therefore, it can be expected that bacterial cells can be detected with higher sensitivity. When a relatively large amount of lysing agent is used for milk, it is expected that the effects of fat globules and proteins in milk will be reduced, and that bacterial cells can be detected in a shorter time.
  • the other conditions are Can be, for example, 5% or more, preferably 10% or more, more preferably 20% or more, and further preferably 30% or more.
  • the upper limit of the milk content can be 100% by using the lysing agent solidified by means such as drying.
  • the ratio of milk can be 90% or less, 80% or less, 70% or less, 60% or less, or 50% or less regardless of other conditions. The upper limit may be determined in consideration of ease of mixing, stability of the lysing agent as a solution, and the like.
  • the treatment temperature and time for lysis are not particularly limited as long as the lytic enzyme used can exert its activity, and usually room temperature may be used.
  • a person skilled in the art can appropriately design the necessary time after mixing the lysing agent in consideration of the lysing rate.
  • E. coli culture positive samples samples obtained from a group of cows that developed mastitis (a group diagnosed by a veterinarian and confirmed clinical symptoms such as milk abnormalities, abnormal breasts, systemic symptoms) and mastitis developed The samples were divided into samples obtained from a group of normal dairy cows and the amount of bacteria obtained from the culture was compared.
  • the amount of E. coli in milk was determined as follows. Milk was serially diluted as needed, 10 ul to 1 ml was seeded on a blood agar medium or a culture film, and cultured overnight at 37°C. The number of colonies formed was counted and the amount of E. coli in milk was calculated. The amount of bacteria in milk in the following experiments was measured by this method unless otherwise stated.
  • FIG. 1 shows the number of samples with respect to the amount of E. coli in the mastitis group and the normal group. It was found that Escherichia coli was detected in milk with a bacterial load of 10 0 to 10 3 (cfu/ml) even in normal cows not affected by mastitis. Since a large amount of E. coli is present in the environment of feces and litter, it is easily mixed from the environment during milking and often detected by culture. On the other hand, in milk suffering from Escherichia coli mastitis, E. coli was detected at a number of 10 3 to 10 9 (cfu/ml) in the milk, and the distribution of the number of bacteria was significantly different from that of the normal group. I found out that
  • ROC analysis was performed on the normal and mastitis groups in order to calculate the number of milk bacteria (cutoff value) at the boundary between the normal group and the mastitis group.
  • ⁇ Sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value were calculated by ROC analysis by changing the amount of bacteria in milk of the normal group and the mastitis group.
  • the ROC curve is shown in the upper part of Fig. 2.
  • the range is 660 to 1360 (cfu/ ml) (Fig. 2, bottom).
  • the statistical software StatFlex (Artec Co., Ltd.) was used for the calculation.
  • the immunochromatographic device can be manufactured as follows. A sectional view of the immunochromatographic apparatus is shown in FIG.
  • Impregnation member for gold colloid particle labeling antibody Mix 9 ml of gold colloid solution (particle size 60 nm) manufactured by BB International with 0.1 M potassium phosphate pH 7.0 and add 1 ml of monoclonal antibody-1 (100 ⁇ g/ml) to label with gold colloid particles. In addition, this was allowed to stand at room temperature for 10 minutes to bind this antibody to the gold colloid particle surface. Then, a 10% aqueous solution of bovine serum albumin (BSA) was added so that the final concentration in the gold colloid particle solution was 1%, the remaining surface of the gold colloid particles was blocked with BSA, and the monoclonal antibody labeled with gold colloid particles was used.
  • BSA bovine serum albumin
  • An antibody-1 (hereinafter referred to as "gold colloid particle-labeled antibody”) solution is prepared. This solution is centrifuged (7600 ⁇ rpm, 15 minutes) to precipitate the gold colloid particle-labeled antibody, and the supernatant is removed to obtain the gold colloid particle-labeled antibody. This gold colloid particle-labeled antibody is suspended in a 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7) containing 0.25% BSA, 2.5% sucrose, and 35 mM NaCl to obtain a gold colloid labeled antibody solution.
  • Tris-HCl buffer pH 7
  • a nitrocellulose membrane having a capture site width of 25 mm and a length of 300 mm of a complex of an antigen and a colloidal gold particle-labeled antibody is prepared as a membrane carrier 2 (second portion) for chromatographic development of a chromatographic medium.
  • a solution containing the monoclonal antibody-2 (1.5 mg/ml) was applied in a line at 1 ⁇ l/cm at a position 10 mm from the end of the chromatographic development start side of this chromatographic development membrane carrier 2, and Was dried at 50° C., then soaked in 0.5% sucrose solution for 30 minutes and dried overnight at room temperature. It is used as the capture site 3 of the complex of the ribosomal protein L7/L12 antigen and the colloidal gold-labeled antibody.
  • a 25 mm GF/DVA (GE) member serving as a member for adding a sample and a member for removing fat globules (third part) Healthcare Bioscience: Glass fiber, thickness 776 ⁇ m, retention particle size 3.5 ⁇ m filter member 4), and 20mm GF/AVA (GE Healthcare Bioscience: Glass fiber, thickness 299 ⁇ m, retention particle size) Prepare a 1.7 ⁇ m filter member 7). Further, a filter paper is prepared as the absorbing member 5.
  • GE 25 mm GF/DVA
  • these members were attached to the base material 6 (thickness 254 ⁇ m, made of polystyrene and provided with an adhesive material for attaching the members) in the order shown in FIG. 3, and then cut into a width of 5 mm, and immunochromatographic Build the device.
  • the immunochromatographic apparatus under the conditions 1 to 5 was obtained by changing the amount of gold colloid retained.
  • the detection limits are shown in the table below. It was found that the detection limit can be adjusted according to the amount of gold colloid retained.
  • the retained amount of gold colloid was determined as follows. Cut out the glass fiber, which is the impregnating member, add it to a microtube containing water or buffer solution 0.2 ml distilled water, stir and mix using a vortex mixer to elute the gold colloid and obtain the maximum absorbance Amax at 540 nm. It was measured. The size of the glass fiber was measured, and the value of Amax/cm 2 was calculated as the gold colloid retention amount.
  • Example 1 Diagnosis of cattle affected by mastitis due to Escherichia coli
  • Evaluation was performed using a milk sample collected at a dairy farm using an immunochromatographic apparatus under conditions 1 to 5. The number of coliform bacteria contained in the sample milk is shown in the table below.
  • Example 2 Examination of cutoff value and diagnosis of cattle with mastitis due to staphylococcus
  • the ROC curve is shown in the upper part of Fig. 5.
  • the range is 375-1595 (cfu/ml).
  • the range is 875 to 1145 (cfu/ml) when the bacterial count in milk is used as the judgment value for the normal group and the mastitis group. Became.
  • Escherichia coli which is an environmental bacterium
  • Staphylococcus aureus that causes infectious mastitis it is considered as an infection if the bacterium is detected, so the detection limit of the immunochromatography device is improved (that is, The lower the bacterial count is set, the higher the clinical sensitivity will be.
  • the present invention can be used for appropriate diagnosis of mastitis.

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Abstract

本発明は、大腸菌、クレブシエラ、レンサ球菌、CNSなどの環境性乳房炎の原因菌を検出する場合の信頼性低下の原因を究明し、信頼性の高い検出手段を提供することを目的とする。また、培養法よりも迅速判定が可能なイムノクロマトグラフ法による信頼性の高い検出手段、それを用いた診断キットを提供することを目的とする。本発明は、家畜の環境性乳房炎の原因菌を検出する方法であって：被検体家畜の乳汁中の原因菌の数が、予め、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布に基づき定めた判定値以上であるか否かを判定する免疫学的検査法による工程を含み、かつ、免疫学的検査法が、０．６／ｃｍ２以上３．５／ｃｍ２以下の金コロイド粒子で標識された抗体（粒子標識抗体）を用いるイムノクロマトグラフ法である、方法を提供する。

Description

乳房炎の原因菌の検出方法
　本発明は、乳汁中から乳房炎の原因となる菌を検出する方法に関するものである。
　牛、羊、ヤギに代表される家畜の乳汁は無菌的なものではなく、疾患や環境が原因で何らかの微生物が混入している場合がある。特に乳房への微生物の感染による疾患ではしばしば乳汁中に多くの微生物を排菌することが知られている。微生物の感染が原因で引き起こされる代表的な家畜の疾患に乳房炎がある。
　乳房炎とは、乳管系、乳腺組織の炎症であり、主に微生物が乳房内に侵入・定着し、増殖することによって引き起こされる。乳房炎は多くの動物が罹患するが、特に乳牛における牛乳房炎は乳牛全体の15～40％が罹患すると言われ、酪農家にとって極めて重要な疾患の一つである。乳牛が乳房炎に罹患すると、乳汁の合成機能が阻害され、泌乳量の減少や場合によっては泌乳の停止が起こるだけでなく、治療費や、乳質低下による乳価のペナルティーなど多大な経済的損失を酪農家に与える。さらには、伝染防止のために乳房炎罹患分房を個別に搾乳するなど、酪農家にかかる労働負担も増加する。
　乳房炎は様々な微生物の感染によって引き起こされる。乳汁からの原因菌の検出方法としては培養法が広く用いられている。しかしながら、培養法は結果が得られるのに数日間を要し迅速な原因菌特定には適さないため、乳房炎の原因菌を酪農現場で迅速に診断できる技術が強く求められている。
　一方、原因菌に特異的な成分に対する抗体を用いる抗原抗体反応による同定法、特にイムノクロマトグラフ法は数十分で結果を判定できるため、迅速・簡便な検査方法として家庭や診察室等で広く用いられている（例えば特許文献１）。イムノクロマトグラフ法は、本発明者らにより、家畜の乳汁中の物質を検出するための方法としても知られるようになっている（特許文献２～３）。しかしながら当分野では、感染症診断の最終判断は上記の培養法で行われることが一般的である。
特開2016-31353号公報 国際公開WO2013/186885 特開2012-122921号公報
　培養法による感染症診断においては、乳房炎の診断・治療ために乳汁中に存在する細菌、特に大腸菌、クレブシエラ、レンサ球菌、CNSなどの環境性乳房炎の原因菌を検出する際、陽性と判定された場合でも実際は陰性であったというケースが散見され、判定結果の信頼性が必ずしも高くないという問題が生じている。そして、このような問題は、イムノクロマトグラフ法を用いた場合であっても生じうると考えられる。
　本発明は大腸菌、クレブシエラ、レンサ球菌、CNSなどの環境性乳房炎の原因菌を検出する場合の信頼性低下の原因を究明し、信頼性の高い検出手段を提供することを目的とする。
　本発明はまた、培養法よりも迅速判定が可能なイムノクロマトグラフ法による信頼性の高い検出手段、それを用いた診断キットを提供することを目的とする。
　前述した培養法の信頼性が低いという課題の要因について様々な検討を行ったところ、この信頼性の低い傾向が原因菌の濃度が低い場合により発現しやすいことに着目した。そこで、信頼性の低下は、採材した検体中に原因菌と環境からの混入菌が存在するためと推定した。即ち、乳腺組織から排菌された乳房炎の原因菌以外に、糞便や敷料等の環境中から乳房内に混入した細菌を検出していることが信頼性の低下の要因ではないかと推定した。しかしながら、原因菌と混入菌との関係において境界が存在するか否かは確認されておらず、また、境界の存在を前提に検討するには多様な検出限界を有する感度の診断キットを準備する必要がある。
　そこで本発明者らは、鋭意検討した結果、乳房炎乳汁および正常乳汁を採材し、乳汁中に存在する細菌量を定量的に解析することで、信頼性を確保できる混入菌と乳房炎原因菌の境界の菌量を見出し、カットオフ値と設定し、さらに、乳房炎を診断するために原因菌をイムノクロマトグラフ法により検出するにあたり、該境界の菌量を検出限界とするようにイムノクロマトグラフの構成部材である金コロイドの保持量を限定することで上記カットオフ値に対応させて、原因菌の検出性能を制御せしめた。その結果、環境中からの混入菌は検出せずに、乳房炎の原因菌のみを検出するイムノクロマトグラフ法を開発し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］　大腸菌群、レンサ球菌属菌、およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌からなる群より選択されるいずれかの家畜の環境性乳房炎の原因菌を検出する方法であって：
　被検体家畜の乳汁中の原因菌の数が、予め、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布に基づき定めた判定値以上であるか否かを判定する免疫学的検査法による工程を含み、かつ、
　免疫学的検査法が、０．６／ｃｍ2以上３．５／ｃｍ2以下の金コロイド粒子で標識された抗体（粒子標識抗体）を用いるイムノクロマトグラフ法である
家畜の環境性乳房炎の原因菌を検出する方法。
［２］　判定値が３７０ｃｆｕ／ｍｌ以上１６００ｃｆｕ／ｍｌ以下である、１に記載の方法。
［３］　原因菌が、大腸菌、ブドウ球菌、およびクレブシエラ属菌からなる群より選択されるいずれかである、１または２に記載の方法。
［４］　被検体家畜が、臨床型の乳房炎に罹患している家畜である、１から３のいずれか１項に記載の方法。
［５］　大腸菌群、レンサ球菌属菌、およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌からなる群より選択されるいずれかの家畜の乳房炎の環境性の原因菌に由来する特定物質に対する第一の抗体であって、
　保持量０．６／ｃｍ2以上３．５／ｃｍ2以下の金コロイド粒子で標識された抗体（粒子標識抗体）が、保持された第１部分、および
　第１部分の下流に連結され、かつ特定物質に対する第二の抗体が固定化された第２部分を備える、イムノクロマトグラフ装置。
［６］　原因菌の判定値が３７０ｃｆｕ／ｍｌ以上１６００ｃｆｕ／ｍｌ以下である、５に記載のイムノクロマトグラフ装置。
［７］　該金コロイド粒子の保持量が、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の数の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の数の分布に基づき予め定めた３７０ｃｆｕ／ｍｌ以上１６００ｃｆｕ／ｍｌ以下の判定値を下限値とする保持量である、５に記載のイムノクロマトグラフ装置。
［８］　５～７のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフ装置を含む、環境性の原因菌による家畜の乳房炎を診断するための、キット。
　また、本発明は以下を提供する。
［１］　家畜の環境性乳房炎の原因菌を検出する方法であって：
　被検体家畜の乳汁中の原因菌の数が、予め、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布に基づき定めた判定値以上であるか否かを判定する工程を含む、方法。
［２］　原因菌が、大腸菌群、レンサ球菌属菌、およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌からなる群より選択されるいずれかである、１に記載の方法。
［３］　原因菌が、大腸菌、およびクレブシエラ属菌からなる群より選択されるいずれかである、１または２に記載の方法。
［４］　判定値が３７０ｃｆｕ／ｍｌ以上１６００ｃｆｕ／ｍｌ以下である、１から３のいずれか１項に記載の方法。
［５］　判定が、原因菌に由来する特定物質を抗原とする抗体を用いる免疫学的検査法により行われる、１から４のいずれか１項に記載の方法。
［６］　免疫学的検査法が、粒子で標識された抗体（粒子標識抗体）を用いるイムノクロマトグラフ法である、５に記載の方法。
［７］　粒子標識抗体を、判定値を検出下限値とする量で用いる、６に記載の方法。
［８］　粒子標識抗体が、金コロイド粒子標識抗体である、６または７に記載の方法。
［９］　金コロイド粒子標識抗体が、イムノクロマトグラフ法を実施するための装置において０．６／ｃｍ2以上３．５／ｃｍ2以下で用いられる、８に記載の方法。
［１０］　被検体家畜が、臨床型の乳房炎に罹患している家畜である、１から９のいずれか１項に記載の方法。
［１１］　家畜の乳房炎の環境性の原因菌に由来する特定物質に対する第一の抗体であって粒子で標識された抗体（粒子標識抗体）が、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の数の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の数の分布に基づき予め定めた判定値を下限値とする量で保持された第１部分、および
　第１部分の下流に連結され、かつ特定物質に対する第二の抗体が固定化された第２部分を備える、イムノクロマトグラフ装置。
［１２］　原因菌が大腸菌群、レンサ球菌属菌、およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌からなる群より選択されるいずれかであり、粒子標識抗体が金コロイド粒子標識抗体であり、金コロイド粒子標識抗体が、イムノクロマトグラフ法を実施するための装置において０．６／ｃｍ2以上３．５／ｃｍ2以下で保持された、１１に記載のイムノクロマトグラフ装置。
［１３］　１０または１１に記載のイムノクロマトグラフ装置を含む、環境性の原因菌による家畜の乳房炎を診断するための、キット。
　本発明によれば、混入菌の影響を抑制しうる方法、またはそのための装置（例えば、イムノクロマトグラフ装置）により、環境からの混入菌の影響を抑制し、乳房炎の原因菌を迅速・簡便かつその場で検出することができる。病状の更なる悪化の前に迅速に原因菌を特定し、適切な抗生物質の選択などの的確な治療方針や、感染拡大防止のための措置を早期に決定することができる。
正常牛群（左）と乳房炎群（右）における乳汁中の大腸菌数。なお、１．０Ｅ＋００」のカラムは、菌数が１．０×１０0ｃｆｕ／ｍｌ以上１．０×１０1ｃｆｕ／ｍｌ未満であったサンプル数を表す。他のカラムについても同様である。 原因菌が大腸菌である場合について、乳房炎ROC曲線（上）と、乳房炎について求めた、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率を示したグラフ（下）。 実施例で用いたイムノクロマトグラフ装置の試験片の断面模式図を示す。 正常牛群（左）と乳房炎群（右）における乳汁中のブドウ球菌数。なお、１．０Ｅ＋００」のカラムは、菌数が１．０×１０0ｃｆｕ／ｍｌ以上１．０×１０1ｃｆｕ／ｍｌ未満であったサンプル数を表す。他のカラムについても同様である。 原因菌がブドウ球菌である場合について、乳房炎ROC曲線（上）と、乳房炎について求めた、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率を示したグラフ（下）。 臨床型乳房炎を引き起こした牛個体の乳汁中の黄色ブドウ球菌の菌数。
　本発明は、環境性の原因菌による家畜の乳房炎を診断する方法に関する。本発明の方法は、予め、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布に基づき判定値を定めておき、被検体家畜の乳汁中の環境性の原因菌の数が、その判定値以上であるか否かを判定する工程を含む。
[検出対象]
　本発明は、環境性乳房炎の原因菌を検出するためのものである。乳房炎の原因菌は、伝染性のものと環境性のものとに大別できる。環境性（乳房炎の）原因菌には、大腸菌群、環境性ブドウ球菌属菌（黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌）、環境性レンサ球菌属菌（無乳性レンサ球菌以外の連鎖球菌）が含まれる。大腸菌群には、大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ（Klebsiella）属菌、サイトロバクター（Citrobacter）属菌、エンテロバクター（Enterobacter）属菌およびプロテウス（Proteus）属菌が含まれる。クレブシエラ属菌には、Klebsiella pneumoniaeおよびKlebsiella oxytocaが含まれる。環境性ブドウ球菌属菌には、CNS（Coagulase Negative Staphylococcus、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌）が含まれる。CNSには、Staphylococcus intermedius、Staphylococcus hyicus、Staphylococcus xylosus、Staphylococcus epidermidis（表皮ブドウ球菌）等が含まれる。なお、本明細書で単に「ブドウ球菌」というときは、環境性ブドウ球菌属菌のうちのいずれかの菌の意味で用いている。環境性レンサ球菌属菌としては、Streptococcus uberis、Streptpcoccus agalactiae、Streptococcus dysgalactiae、Streptococcus equinus、Streptococcus canis、Streptococcus bovis、Streptococcus porcinus、Streptococcus pluranimalium、Streptococccus parauberis、Streptococcus mutans、Streptococcus acidominimusが含まれる。本発明は特に、大腸菌、またはブドウ球菌に好適である。
[判定値]
　本発明においては、乳房炎の原因菌の検出に際し、予め定めた判定値が使用される。判定値は、乳房炎に罹患した群（罹患群）と乳房炎に罹患していない群（非罹患群）とを分ける値である。一般に、定量的検査において陽性、陰性を分ける値をカットオフ値といい、カットオフ値は特定の疾患に罹患した患者群の検査値分布と非患者群の検査値分布から設定されるが、本発明でいう判定値は、カットオフ値と称してもよい。
　本発明の判定値は、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布に基づき求められたものである。具体的には、大腸菌による乳房炎の牛の場合を例に説明すると、判定値は次のように求めることができる：
　大腸菌による乳房炎を発症した群（乳房炎群）から得られた複数の乳汁サンプルと、乳房炎を発症していない群（正常群）から得られた複数の乳汁サンプルとについて、培養法により各々の菌量を求める。このとき、環境性の原因菌である大腸菌は元来、糞便や敷料の環境中に多数存在しているため、搾乳中に環境中から混入しやすく、サンプル中に検出されることがしばしば起こる。そのため、正常群から得られたサンプルにおいても、ある程度の頻度である程度の菌量が検出される。得られたそれぞれの菌量の分布に基づき、正常群と乳房炎群とを分ける乳汁中の菌量を判定値とすることができる。有効な判定値を設定するためには、ROC解析を実施するとよい。
　ROC解析とは、ROC 曲線（Receiver Operating Characteristic 曲線）を用いた解析方法であり、一般に、ある検査値について適切なカットオフ値を検索するのに使われている。詳細には、１つのスクリーニング方法について陽性・陰性のカットオフ値を最小値から最大値まで段階的に変えると、偽陽性率（= 1－特異度）も感度も0 から1 まで変わる。偽陽性率を横軸に、感度を縦軸にとって線で結ぶと、カットオフ値の変化に対応する曲線（POC曲線）を引くことができる。曲線の最も左上の点（グラフ上の（0, 1）に最も近い点。理想は偽陽性率0 で感度1）を与えるカットオフ値が、陽性・陰性を分けるポイントとして最も有効性が高いと判断されるため、ある検査値について適切なカットオフ値を検索できる。なお、感度は、陽性と判定されるべきものを正しく陽性と判定する確率をいい、真陽性の数／本当に陽性である対象の合計数（すなわち、真陽性の数＋偽陰性の数）で表される。特異度は、陰性と判定されるべきものを正しく陰性と判定する確率をいい、真陰性の数／本当に陰性である対象の合計数（すなわち、真陰性の数＋偽陽性の数）で表される。本発明における判定値は、このようなROC解析により、最も有効性が高いカットオフ値として求めた値を採用することができる。
　本発明者らの検討によると、環境性乳房炎の場合の乳汁中サンプル中の菌量の判定値は、原因菌がいずれの場合であっても、３００ｃｆｕ／ｍｌ以上３０００ｃｆｕ／ｍｌ以下の値とすることができ、３７０ｃｆｕ／ｍｌ以上１６００ｃｆｕ／ｍｌ以下の値とすることが好ましい。原因菌が大腸菌群の菌、例えば大腸菌である場合、６６０ｃｆｕ／ｍｌ以上１３６０ｃｆｕ／ｍｌ以下の値とすることがより好ましく、７００ｃｆｕ／ｍｌ以上９００ｃｆｕ／ｍｌ以下の値とすることがさらに好ましい。原因菌が環境性ブドウ球菌属菌、例えばブドウ球菌である場合、３７５ｃｆｕ／ｍｌ以上１５９５ｃｆｕ／ｍｌ以下の値とすることがより好ましく、８７５ｃｆｕ／ｍｌ以上１１４５ｃｆｕ／ｍｌ以下の値とすることがさらに好ましい。本発明において、判定値は菌種毎に定めることができ、またサンプルを採取する環境毎に定めてもよい。
　このようにして求めた判定値は、後述するイムノクロマトグラフ装置などの具体的な検出手段の設計に際しては、検出下限（検出可能な菌数の下限値）とすることができる。検出下限とすることにより、その装置で検出されたか否かにより、陽性・陰性の判定が直ちにできるからである。
　本発明においては、環境性乳房炎の診断に際し、非罹患群に由来する乳汁中において検出される量の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布に基づき定めた判定値を用いるため、環境から混入する菌の影響を排除することができる。このように環境の影響を考慮して最適化された検出手段はこれまでになく、本願が初めて提案するものである。
[免疫学的方法、イムノクロマトグラフ法、イムノクロマトグラフ装置]
　本発明の判定値を用いる方法は、家畜の環境性乳房炎の原因菌を検出する方法として実施することができ、また、家畜の環境性乳房炎の診断方法として実施することができる。これらの方法は、家畜から乳汁を採取する工程を含んでもよい。本発明の判定値を用いる方法はまた、原因菌に由来する特定物質を抗原とする抗体を用いる各種の免疫学的方法により実施することができる。免疫学的測定方法としては、例えば、イムノクロマトグラフグラフ法、凝集反応法、酵素免疫測定法（ELISA法）、放射能免疫測定法（RIA法）、または蛍光免疫測定法（FIA法）などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。イムノクロマトグラフ法を用いる場合、典型的には、次のように実施することができる。
　抗原抗体反応は、第1部分に保持されている「特定物質に対する標識された第一の抗体」と、第2部分に固定化された「特定物質に対する第二の抗体」を用いて、サンドイッチアッセイ法により検出することができる。あるいは抗原抗体反応は、第1部分に保持されている標識された特定物質と、第2部分に固定化された特定物質に対する抗体を用いて競合法にて検出してもよい。但し、本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法が好ましい。
　イムノクロマトグラフ装置は、イムノクロマトグラフ法によって乳汁中の特定物質を検出するためのもの、または家畜の乳房炎を診断するためのものである。イムノクロマトグラフ装置は、具体的には、例えば、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む装置である。具体的な試験片の構成としては、図3に断面模式図を示した試験片が挙げられる。図3においては、脂肪球除去用部材（第3部分）7は、試料添加用のフィルター部材4の下流、かつ標識抗体含浸部材（第1部分）1の下流、かつクロマト展開用膜担体（第2部分）2の上流に設置されている。また図3においては、第2部分には特定物質に対する第二の抗体が固定化され、標識された第一の抗体が結合した特定物質を補足する補足部位3（テストライン）と、装置上で反応が正常に進んだことを確認するための、対照となる物質を補足する補足部位8（コントロールライン）を備えている。
　イムノクロマトグラフ装置は公知の方法にて市販の材料を用いて作製することができる。
　第1部分に使用する材料は、イムノクロマトグラフを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、セルロース誘導体等の繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等である。
　第2部分に使用する材料は、イムノクロマトグラフを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、ニトロセルロース、混合ニトロセルロースエステル、ポリビニリデンフロライド、ナイロン等である。
　第3部分に使用する材料は、乳汁中に含まれる直径1～10数μmの乳脂肪球を除去できる空隙を有していることが好ましい。第3部分は、試料溶液が孔径数10～数100nmの多孔性のメンブレンからなる上記第2部分の上流側に配置されている必要があり、試料溶液が最初に接触・通過できる位置である、上記第1部分の上流側に配置されていることが好ましい。
　第3部分が有する空隙は乳脂肪球を分離できる大きさであればよく、保持粒子サイズは好ましくは0.1から10μmであり、より好ましくは1から3.5μmである。材料は上記の範囲の空隙を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはセルロース誘導体等繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等である。保持粒子サイズとは、そのサイズ以上の粒子サイズを有する乳脂肪球が空隙を通過できずに第3部分に保持される乳脂肪球の粒子サイズのことであり、第3部分の空隙の平均ポアサイズに実質的に対応しているが、そのサイズ以上の粒子サイズを有する乳脂肪球の50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、特に好ましくは90％以上、最も好ましくは98％以上が空隙を通過できずに第3部分に保持される。保持される乳脂肪球の割合は当業者に周知の方法で測定することができる。例えば、GEヘルスケアバイオサイエンス社から提供されているGF/Bは保持粒子サイズ（保持効率98％の粒子直径のこと。本明細書で保持粒子サイズというときは、特に記載した場合を除き、この意味である。）が1.0μmであることが同製品カタログにおいて明らかにされているが、当業者に周知の方法で上記の粒子サイズを確認することが可能である。
　上記第3部分は、特定の保持粒子サイズを有する材料のみを用いてもよく、乳脂肪球の分離効率を高めるために保持粒子サイズが大きいものから小さいものを段階的に張り合わせて用いてもよい。上記第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材により構成される場合は本発明の好ましい態様であり、第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい場合は本発明のさらに好ましい態様である。第3部分を2種の部材により構成する場合には、下流に配置された第一の部材の保持粒子サイズが1.0～2.0μmであり、上流に配置された第二の部材の保持粒子サイズが3.0～3.5μmであることが好ましい。高濃度で広い粒径分布を有する乳脂肪球を含む乳汁、好ましくは搾乳後の未希釈の乳汁から特定物質を高感度に検出するためは、第3部分を保持粒子サイズの小さな部材と保持粒子サイズの大きな部材との組み合わせにより構成することが好ましい。
　上記第1部分には、特定物質に対する標識された第一の抗体、または標識された特定物質が保持されている。第1部分に、特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている場合には、サンドイッチアッセイ法により特定物質を検出することができる。また、第1部分に標識された特定物質が保持されている場合には、競合法により特定物質を検出することができる。本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法の方が好ましいことから、第1部分には、特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されていることが好ましい。
　第1部分に特定物質に対する標識された第一の抗体を保持させる場合には、特定物質に対する第一の抗体と、特定物質に対する第二の抗体の、2種類の抗体を用いる。サンドイッチアッセイ法により特定物質を検出することができるように、上記第一の抗体と上記第二の抗体は、当該特定物質に同時に結合できることができる抗体であり、上記第一の抗体が認識する当該特定物質のエピトープは、上記第二の抗体が認識する当該特定物質のエピトープとは異なることが好ましい。
　本発明において、検出可能な信号を得るために、第1部分に保持される第一の抗体または特定物質は標識されている。本発明で用いる標識としては、着色粒子、酵素、ラジオアイソトープなどが挙げられるが、特殊な設備不要で目視によって検出可能な着色粒子を使用することが好ましい。着色粒子としては、金や白金などの金属微粒子、非金属粒子、ラテックス粒子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。着色粒子は、試験片の空隙内を通って下流に輸送されることができるサイズであればいかなるサイズでもよいが、直径が1nmから10μmが好ましい。より好ましくは、5nmから1μmであり、さらに好ましくは10nmから100nmである。
　また、この粒子濃度を変更させることによりイムノクロマトの検出下限を調整することが可能である。粒子濃度は５００～６００ｎｍにおける最大吸光度をもとに測定することができる。その後、粒子を基材に含侵させ乾燥することにより得ることができる。該コンジュゲートパッドに適した材料として、紙、セルロース混合物、ニトロセルロース、ポリエステル、アクリロニトリルコポリマー、ガラス繊維（グラスファイバー）またはレーヨンのような不織繊維が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、グラスファイバー製パッドが用いられる。
　粒子濃度は最大吸光度の値として、検体中での反応性を保持できる点から０．１／ｃｍ2以上であることが望ましく、より好ましくは０．３／ｃｍ2以上、さらに好ましくは０．６／ｃｍ2以上であることが望ましい。また、イムノクロマトの液流れやニトロセルロース上の視認性の点から、１０／ｃｍ2以下であることが望ましく、より好ましくは５／ｃｍ2以下、さらに好ましくは4／ｃｍ2以下であることが望ましい。
　本発明においては、上述した試験片をそのまま使用してイムノクロマトグラフ装置としてもよいし、ケースに収納して、イムノクロマトグラフ装置としてもよい。前者の場合は、試料となる乳汁の量が多い場合に、容器に入った試料に直接試験片の一端を浸して使用することが好ましい。また、後者の場合は、試料となる乳汁の量が少ない場合に、ピペット等で所定量を計量して試験片に滴下して使用することが好ましい。後者の場合のケースの形状は、試験片を収納できればいかなる形状でもよい。ケースの材料はいかなる材料でもよく、ポリプロピレンやポリカーボネートなどが好ましいものとしてあげられる。
　本発明のイムノクロマトグラフ装置は、容器、たとえばマイクロチューブ、および添加液、例えば細菌を溶菌させてリボゾームタンパク質L7/L12を溶液内に溶出させるための、溶菌酵素または界面活性剤を含む添加液を組合せたキットとして提供することもできる。本発明により提供されるキットは、乳汁中の特定物質を検出するためのものであり、または家畜の乳房炎を診断するためのものである。
[特定物質、特定物質を抗原とする抗体]
　本発明の方法を、原因菌に由来する特定物質を抗原とする抗体を用いる免疫学的方法により実施する場合、特定物質は、免疫学的方法で測定できる物質であれば何れでも可能であるが、細菌の成分または細菌が分泌する物質であることが好ましい。さらに好ましくは、細菌のL7/L12リボゾームタンパク質である。L7/L12リボソームタンパク質は、細胞内に多コピー存在するために検出感度が高い。また、以下に記載の公知の方法により、乳房炎の原因となる特定の細菌を他の細菌と種または属で識別可能な抗体を実際に取得可能である。細菌の種類は特に限定されず、グラム陽性菌またはグラム陰性菌のいずれであってもよい。例えば、ブドウ球菌（スタフィロコッカス属に属する細菌）、好ましくは黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌、または大腸菌やクレブシエラ属に属する細菌などを例示することができるが、これらに限定されることはない。
　上記の抗体は、国際公開第00/06603号パンフレットに記載の方法で作製することができる。細菌リボゾームタンパク質L7/L12を抗原とする場合は、細菌リボゾームタンパク質L7/L12の全長タンパク質あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作製することができるが、全長タンパク質を抗原として作製することが好ましい。この部分ペプチドあるいは全長タンパク質をそのまま、またはキャリアタンパク質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでL7/L12リボソームタンパク質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、抗体としてはハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法により取得したモノクローナル抗体を適用することがより好ましいが、この場合はマウスが好ましい。当該モノクローナル抗体として、乳房炎の原因となる特定の細菌のリボゾームタンパク質L7/L12と反応し、前記特定の細菌以外の乳房炎の原因となる細菌のリボゾームタンパク質L7/L12とは反応しないモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、当該細菌による感染症にかかっているかどうかの診断に役立てることが可能となる。
　抗体が乳房炎の原因となる特定の細菌の成分または該細菌が分泌する物質と反応し、前記特定の細菌以外の乳房炎の原因となる細菌の成分または該細菌が分泌する物質とは反応しないモノクローナル抗体であれば、リボゾームタンパク質L7/L12以外を抗原として認識する抗体であっても使用することができる。
　また、モノクローナル抗体としては、乳汁中に含まれる特定物質以外の夾雑物により抗原抗体反応が阻害されないモノクローナル抗体を用いることが好ましい。例えば、乳汁中にはカゼインなどのタンパク質が大量に含まれており、特定物質とモノクローナル抗体との反応を阻害する場合がある。特定物質に対するモノクローナル抗体を常法により製造するにあたり、例えばカゼインなどにより抗原抗体反応が阻害を受けないモノクローナル抗体や、抗原抗体反応への影響が少ないモノクローナル抗体を適宜選択して用いることが好ましい場合がある。このようなモノクローナル抗体は、通常の方法に従って抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を製造した後に、カゼインなどの夾雑物の存在下で抗原抗体反応が阻害されるか否かを調べて、実質的に反応の阻害を受けないモノクローナル抗体を選択することにより容易に取得することができる。
[第一の抗体の標識、金コロイド粒子]
　本発明において、検出可能な信号を得るために、第１部分に保持される第一の抗体又は特定物質は標識されている。本発明で用いる標識としては、着色粒子、酵素、ラジオアイソトープなどが挙げられるが、特殊な設備不要で目視によって検出可能な着色粒子を使用することが好ましい。着色粒子としては、金や白金などの金属微粒子、非金属粒子、ラテックス粒子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。着色粒子は、試験片の空隙内を通って下流に輸送されることができるサイズであればいかなるサイズでもよいが、直径が１ｎｍから１０μｍが好ましい。より好ましくは、５ｎｍから１μｍであり、さらに好ましくは１０ｎｍから１００ｎｍである。着色粒子の好ましい例は、金コロイド粒子である。
　本発明の好ましい態様においては、上述した予め定めた判定値が装置の検出限界となるように設計されたイムノクロマトグラフ装置が用いられる。このとき、標識抗体含侵部材（第1部分）に保持される標識された第一の抗体としては金コロイド粒子標識抗体が使用される。この場合、検出限界は、金コロイド粒子標識抗体の保持量（以下、単に「金コロイド保持量」ということもある。）によって調整することができる。金コロイド保持量を多くすることにより、検出限界をより低くでき、金コロイド保持量を少なくすることにより、検出限界をより高くできる。
　イムノクロマトグラフ装置の標識抗体含侵部材に含まれる金コロイド保持量はAmax／cm2で表すことができる。具体的には、装置中の金コロイドが保持された標識抗体含侵部材をを切り出し、水または緩衝溶液0.2mlが入ったチューブに添加することにより、金コロイドを溶出する。得られた溶液について、光路長1cmのセルを用いて、500～600nm、例えば540nmにおける最大吸光度Amaxを測定する。得られた測定値は、溶出に用いたグラスファイバーの面積で除すことにより、Amax／cm2の値が算出される。
　本発明者らの検討によると、イムノクロマトグラフ装置の標識抗体含侵部材に含まれる金コロイド保持量は、A540 max／cm2の値として、例えば0.3以上6.0以下とすることができ、0.6以上3.8以下とすることができ、0.8以上3.5以下とすることが好ましく、1.0以上3.0以下または1.0以上2.0以下とすることがより好ましく、1.5以上2.5以下とすることがさらに好ましい。このような判定値は、原因菌が大腸菌群またはブドウ球菌である場合に好ましく用いることができ、また原因菌が大腸菌である場合に、より好ましく用いることができると考えられる。
[サンプルの溶菌]
　本発明において原因菌を検出するに際し、原因菌に由来する特定物質を抗原とする免疫学的方法を用いる場合、菌体を高効率に溶菌し、菌体内の抗原を菌体外に放出させる必要がある。しかしながら、乳汁を検体として用いた場合、乳汁中に多量に含まれるカゼインなどのタンパク質や乳脂肪球などの影響により従来技術では溶菌が十分に行われないことが多い。そのため必要に応じて、酵素や界面活性剤を含む溶菌剤を用いることができる。
溶菌剤
　溶菌剤に含まれる酵素としては、リゾチーム、リゾスタフィン、ラビアーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼなどが挙げられる。溶菌剤中での溶菌酵素の含量（複数の溶菌酵素を用いる場合は、溶菌酵素総量としての含量を指す。）は、検出のために有効な溶菌率が確保される限り、特に限定されない。
　界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、のいずれかもしくはその組み合わせを用いることができ、必要に応じて陽イオン性界面活性剤、良性界面活性剤、を用いることもできる。
　非イオン性界面活性剤としては、エステルエーテル型、エステル型、エーテル型のいずれも好適に用いることができ、より具体的にはポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテル、ポリソルベート類（脂肪酸ソルビタンエステルにエチレンオキシドが数十分子縮合したもの）などがあげられるが、特に限定されない。特に好ましい例の一つは、ポリソルベート類、より特定すると、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン(60)ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン(65)ソルビタントリステアレート、およびポリオキシエチレン(80)ソルビタンモノオレエート等、ならびにポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、より特定するとポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル等である。
　陰イオン性界面活性剤としては、カルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、その他のいずれも好適に用いることができる。より具体的な例として、アルキルエーテルカルボン酸塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（LAS）、α－オレフィンスルホン酸塩（AOS）、ジアルキルスルホコハク酸塩、ナフタレンスルホン酸塩のホルムアルデヒド縮合物、アルキル硫酸エステル塩（AS）、高級アルコールにエチレンオキシドを付加して硫酸化したポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩（AES）、高級アルコールやそのエチレンオキシド付加物などのリン酸エステル塩等をあげることができる。さらに具体的な例として、ドデシル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸ナトリウム、N-ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、N-ミリストイルザルコシン酸ナトリウム等のN-アシルザルコシン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水素添加ココナッツ脂肪酸モノグリセリドモノ硫酸ナトリウム、ラウリルスルホ酢酸ナトリウム、N-パルミトイルグルタミン酸ナトリウム等のN-アシルグルタミン酸塩、N-メチル-N-アシルアラニンナトリウム、α-オレフィンスルホン酸ナトリウムをあげることができる。
　陽イオン界面活性剤としては、アミン塩型、第４級アンモニウム塩型のいずれも好適に用いることができ、より具体的な例として、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド等をあげることができる。
　両性界面活性剤としては、アミノ酸系（アルキルアミノ脂肪酸塩）、ベタイン系 （アルキルベタイン）、アミンオキシド系（アルキルアミンオキシド）等があげられるが、特に限定されない。より特定された例としては、ジメチルアンモニオプロパンスルホネイト、ドデシルジメチルアンモニオブチレイト、ラウリル酸ベタイン、およびアミドプロピルベタインがあげられる。より具体的な例としては、n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、N-Dodecyl-N,N-(dimethylammonio)butyrateがあげられる。
　溶菌剤には反応性を向上するなどの目的で、緩衝剤を含んでいてもよい。前記緩衝材としては特に制限されず、例えば、グッド系緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。前記緩衝液のｐＨは、特に限定されないが、例えば、ｐＨ４～１０の範囲であり、好ましくは、ｐＨ６～９の範囲である。
　溶菌酵素および界面活性剤以外に、意図した効果を著しく損なわない限り、一種またはそれ以上の他の成分を含むことができる。溶菌酵素および界面活性剤以外の成分の好ましい例は、溶菌を促進する効果あるいは非特異反応を抑制する効果を有する物質である。
　溶菌を促進する効果を有する物質としては、グルタルアルデヒド、ハロゲン化合物、クロルヘキシジン、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、２－メチル－１－プロパノール、２－メチル－２－プロパノール）、フェノール、過酸化水素、アクリノール、グアニジンおよびその塩、キレート剤、有機酸（例えば、デカン酸）およびその塩、多価アルコール類（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、グリセリン、モノカプリリン）、ならびに２－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンおよびチオフェノールなどの還元剤をあげることができるが、これらに限定されない。
　例えばグアニジンおよびその塩（例えば、グアニジンチオシアン酸塩）のいずれかを用いる場合、乳汁と混合した場合の終濃度の下限値（複数種類を用いる場合は、総量としての濃度を指す。上限値についても同じ。）は、0.1mM以上とすることができ、好ましくは1mM以上とすることができ、より好ましくは1mM以上とすることができる。いずれの場合も、乳汁と混合した場合の終濃度の上限値は、500mM以下とすることができ、好ましくは200mM以下とすることができ、より好ましくは100mM以下とすることができる。
　キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）およびその塩、グリコールエーテルジアミン四酢酸（EGTA）およびその塩、ポリリン酸およびその塩、並びにメタリン酸およびその塩が挙げられる。乳汁と混合した場合の終濃度の下限値（複数のキレート剤を用いる場合は、キレート剤総量としての濃度を指す。上限値についても同じ。）は、0.001mM以上とすることができ、好ましくは0.01mM以上とすることができ、より好ましくは0.1mM以上とすることができる。いずれの場合も乳汁と混合した場合の終濃度の上限値は、抗原抗体反応の阻害抑制の観点から、100mM以下とすることができ、好ましくは10mM以下とすることができ、より好ましくは5mM以下とすることができる。
　さらに添加剤としては、塩やタンパク質、高分子化合物、抗菌剤などを用いることも可能である。
　前記タンパク質としては、特に用いる抗体と黄色ブドウ球菌が保有するプロテインＡとの反応を防ぐために、抗原との反応に関与しないグロブリンを添加することができる。γ－グロブリンとしては、例えば、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、ヒト等の動物種由来のものでもよく、特に制限されない。
γ－グロブリン濃度は、特に限定されないが、偽陽性を抑制するという観点からは、反応時の終濃度として、0.01μg/ml以上、好ましくは0.1μg/ml以上、より好ましくは1μg/ml以上とすることができ、またいずれの場合も、対象の抗原抗体反応を阻害しないという観点から、10mg/ml以下、好ましくは5mg/ml以下、より好ましくは1mg/ml以下とすることができる。このような終濃度の条件は、イムノクロマトグラフ法に特に適する。
溶菌条件
　乳汁と溶菌剤との混合比は、溶菌酵素等の終濃度が適切に維持され、十分な溶菌率が確保できる限り、特に限定されない。乳汁に対して比較的少量の溶菌剤を用いる場合は、乳汁が希釈されない。したがって、より高い感度で菌体を検出できると期待できる。また乳汁に対して比較的大量の溶菌剤を用いる場合は、乳汁中の脂肪球やタンパク質による影響が減じられ、より短時間で菌体を検出できると期待できる。乳汁と溶菌剤との混合物における乳汁の割合（乳汁／（乳汁＋溶菌剤）×100）は、高いほど検出感度を上げることができるとの観点からは、他の条件がいずれの場合であっても、例えば5％以上とすることができ、10％以上とすることが好ましく、20％以上とすることがより好ましく、30％以上とすることがさらに好ましい。上限値は、他の条件がいずれの場合であっても、乾燥等の手段によって固形化した溶菌剤を用いることにより、乳汁の割合を100％とすることができる。また、他の条件がいずれの場合であっても、乳汁の割合は90％以下とすることができ、80％以下、70％以下、60％以下、または50％以下とすることができる。上限値は、混合の容易さ、溶菌剤の溶液としての安定性等を考慮して決定してもよい。
　溶菌のための処理温度および時間は、用いる溶菌酵素が活性を発揮できる温度であれば特に限定されず、通常、室温でよい。溶菌剤混合後の必要な時間は、当業者であれば、溶菌率を考慮して、適宜設計することができる。
[カットオフ値の検討] 
　大腸菌培養陽性サンプルについて、乳房炎を発症した乳牛群（獣医師が診断し、乳汁異常、乳房異常、全身症状などの臨床症状を確認した個体群）から得られたサンプルと乳房炎を発症していない正常乳牛群から得られたサンプルに分け、培養から得られた菌量を比較した。なお、乳汁中の大腸菌量は以下のように求めた。乳汁を必要に応じ段階希釈し、10ul～1mlを血液寒天培地または培養フィルムに播種し、37℃にて終夜培養を行った。生じたコロニー数を計数し、乳汁中の大腸菌量を算出した。以下の実験での乳汁中の細菌の量は、特に記載した場合を除き、この方法で測定した。
　乳房炎群および正常群における大腸菌量に対するサンプル数を表記した図１を示す。乳房炎に罹患していない正常牛においても、乳汁中から100～103 (cfu/ml)の菌量で大腸菌が検出されていることが分かった。大腸菌は糞便や敷料の環境中に多数存在しているため、搾乳中に環境中から混入しやすく、培養により検出されることがしばしばおこる。一方、大腸菌性乳房炎に罹患した乳汁では乳汁中から103～109 (cfu/ml)の菌数で大腸菌が検出されており、正常群の菌数とは菌数の分布が大きく異なっていることが分かった。
　正常群と乳房炎群の境界の乳汁中菌数（カットオフ値）を算出するために、これら正常分と乳房炎群の乳汁中菌数に対してROC解析を実施した。
　正常群および乳房炎群の乳汁中の菌量を変化させ、ROC解析により感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率を算出した。
　感度＝判定値に基づく陽性／真陽性
　特異度＝判定値に基づく陰性／真陰性
　陽性的中率＝真陽性／判定値に基づく陽性
　陰性的中率＝真陰性／判定値に基づく陰性
　ROC曲線を図２の上段に示した。感度、特異度、陽性的中率および陰性的中率がいずれも90％以上を示す乳汁中の菌量を正常群および乳房炎群の判定値とする場合、その範囲は660～1360 (cfu/ml)となった（図２、下段）。なお、計算には統計ソフトStatFlex(株式会社アーテック)を使用した。
[リボゾームタンパク質L7/L12抗体の作製]
　国際公開WO00/06603号パンフレットの実施例に記載の方法に準じて、L7/L12リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。以下の実験で用いるモノクローナル抗体として、上記L7/L12リボゾームタンパク質の別のサイトに同時に結合しうる2種の組合せを選択した。
[イムノクロマトグラフ装置の作製]
　イムノクロマトグラフ装置は以下のように作製できる。イムノクロマトグラフ装置断面図を図３に示す。
金コロイド粒子標識抗体の含浸部材
　BBInternational社製金コロイド溶液(粒径60nm) 9mlに0.1M リン酸カリウム pH7.0を混合し、金コロイド粒子で標識するモノクローナル抗体-1(100μg/ml)を1ml加え、室温で10分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた。その後、金コロイド粒子溶液における最終濃度が1%となるようにウシ血清アルブミン（BSA）10%水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をBSAでブロッキングして、金コロイド粒子により標識したモノクローナル抗体-1（以下、「金コロイド粒子標識抗体」と記す）溶液を調製する。この溶液を遠心分離（7600×rpm、15分間）して金コロイド粒子標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド粒子標識抗体を得る。この金コロイド粒子標識抗体を0.25%BSA、2.5%スクロース、35mM NaClを含有する20mMトリス塩酸緩衝液（pH7）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得る。
　濃度を調整した抗体溶液を帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド粒子標識抗体溶液を含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材1（第1部分）とする。
抗原および金コロイド粒子標識抗体との複合体の捕捉部位
　幅25mm、長さ300mmのニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体2（第2部分）として用意する。モノクローナル抗体-2（1.5mg/ml）が含有されてなる溶液を、このクロマト展開用膜担体2におけるクロマト展開開始点側の末端から10mmの位置に1μl/cmでライン状に塗布して、これを50℃で乾燥し、その後、0.5％スクロース溶液に30分浸し、一晩室温で乾燥させた。リボソームタンパク質 L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位3とする。
イムノクロマトグラフ装置の作製
　上記標識抗体含浸部材1、上記クロマト展開用膜担体2の他に、試料添加用部材と脂肪球除去用部材（第3部分）とを兼ねる部材として25mmのGF/DVA（GEヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み776μm、保持粒子サイズ3.5μmのフィルター部材4）、および20mmのGF/AVA（GEヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み299μm、保持粒子サイズ1.7μmのフィルター部材7）を用意する。さらに、吸収用部材5として濾紙を用意する。そして、これらの部材を図3に示した順に基材6（厚さ254μm、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたもの）に貼り合せた後、5mm幅に切断し、イムノクロマトグラフ装置を作製する。
[イムノクロマト装置における検出限界の調整]
　金コロイド保持量を変更して製造することにより条件1～5のイムノクロマトグラフ装置を得た。
　培養菌を段階希釈してスパイクした乳汁を検体として、条件1～5の各イムノクロマトグラフ装置で検出した。具体的には、マイクロチューブに溶菌処理液（終濃度1％　TritonX-100、0.3%　Ｎ－ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、2.2 mg/mlリゾチーム、0.1M　MOPSO  pH7.5）0.5mlと乳汁0.3mlを分取し、30分間静置した。同混合溶液にイムノクロマトグラフ装置を浸漬して、室温で30分静置して展開後、上記補足部位3で補足されたリボソームタンパク質L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉の有無を、捕捉量に比例して増減する赤紫色のラインの有無として目視により確認した。
　その検出限界を下表に示す。金コロイドの保持量に従って、検出限界を調整できることがわかった。なお、金コロイドの保持量は以下のように求めた。含侵部材であるグラスファイバーを切り出し、水または緩衝溶液0.2ml蒸留水の入ったマイクロチューブに添加し、ボルテックスミキサーを用いて撹拌混合することにより、金コロイドを溶出し、540nmにおける最大吸光度Amaxを測定した。グラスファイバーのサイズを測定し、Amax／cm2の値を算出して、金コロイド保持量とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
[実施例１：大腸菌による乳房炎に罹患した牛の診断]
　条件1～5のイムノクロマトグラフ装置を用いて、酪農場で採材された乳汁検体を用いて評価した。検体の乳汁中に含まれる大腸菌群の菌数を下表に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　下表に示したように、条件2から4の場合では感度および特異度ともに80%を超え、乳房炎を適切に診断できていることが分かった。一方で検出限界の低い条件1の場合では、環境からのコンタミによる大腸菌をも検出してしまい、非発症牛での偽陽性を生じる結果となり特異度が低下する結果であった。一方で、検出限界の高い条件5を用いた場合、特異度は良いが、大腸菌の保菌量の少ない陽性牛からの検体で検出することができず、臨床感度が低い結果となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
[実施例２：ブドウ球菌による乳房炎罹患牛についてのカットオフ値の検討、および診断]
　酪農場より臨床型乳房炎を引き起こした個体について乳汁中のブドウ球菌の菌数を評価したところ、図４のようになった。
　上述の大腸菌の場合と同様に、ROC解析を実施し、また、正常群および乳房炎群の乳汁中の菌量を変化させ、ROC解析により感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率を算出した。
　ROC曲線を図５の上段に示した。感度、特異度、陽性的中率および陰性的中率がすべて50％以上になる乳汁中の菌量を正常群および乳房炎群の判定値とする場合、その範囲は375～1595 (cfu/ml)であった（図５、下段）。感度、特異度、陽性的中率および陰性的中率がすべて55％になる乳汁中の菌量を正常群および乳房炎群の判定値とする場合、その範囲は875～1145(cfu/ml)となった。
[参考例１：黄色ブドウ球菌による乳房炎罹患牛検査]
　酪農場より臨床型乳房炎を引き起こした個体について乳汁中の黄色ブドウ球菌の菌数を評価したところ、図６のようになった。
　環境性細菌である大腸菌とは異なり、伝染性乳房炎を引き起こす黄色ブドウ球菌の場合は、細菌が検出されれば感染とみなすため、イムノクロマトグラフ装置の検出限界を向上するほど（すなわち、検出限界となる菌数を低く設定するほど）臨床感度が高められることになる。
　本発明は、乳房炎の適切な診断のために利用することができる。
１．標識抗体含浸部材
２．展開用膜担体
３．補足部位（テストライン）
４．フィルター部材
５．吸収用部材
６．基材
７．フィルター部材
８．補足部位（コントロールライン）

Claims (8)

  1. 　大腸菌群、レンサ球菌属菌、およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌からなる群より選択されるいずれかの家畜の環境性乳房炎の原因菌を検出する方法であって：
    　被検体家畜の乳汁中の原因菌の数が、予め、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の量の分布に基づき定めた判定値以上であるか否かを判定する免疫学的検査法による工程を含み、かつ、
    　免疫学的検査法が、０．６／ｃｍ2以上３．５／ｃｍ2以下の金コロイド粒子で標識された抗体（粒子標識抗体）を用いるイムノクロマトグラフ法である
    家畜の環境性乳房炎の原因菌を検出する方法。
  2. 　判定値が３７０ｃｆｕ／ｍｌ以上１６００ｃｆｕ／ｍｌ以下である、請求項１に記載の方法。
  3. 　原因菌が、大腸菌、ブドウ球菌、およびクレブシエラ属菌からなる群より選択されるいずれかである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　被検体家畜が、臨床型の乳房炎に罹患している家畜である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　大腸菌群、レンサ球菌属菌、およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌からなる群より選択されるいずれかの家畜の乳房炎の環境性の原因菌に由来する特定物質に対する第一の抗体であって、
    　保持量０．６／ｃｍ2以上３．５／ｃｍ2以下の金コロイド粒子で標識された抗体（粒子標識抗体）が、保持された第１部分、および
    　第１部分の下流に連結され、かつ特定物質に対する第二の抗体が固定化された第２部分を備える、イムノクロマトグラフ装置。
  6. 　原因菌の判定値が３７０ｃｆｕ／ｍｌ以上１６００ｃｆｕ／ｍｌ以下である、請求項５に記載のイムノクロマトグラフ装置。
  7. 　該金コロイド粒子の保持量が、非罹患群に由来する乳汁中の原因菌の数の分布、および罹患群に由来する乳汁中の原因菌の数の分布に基づき予め定めた３７０ｃｆｕ／ｍｌ以上１６００ｃｆｕ／ｍｌ以下の判定値を下限値とする保持量である、請求項５に記載のイムノクロマトグラフ装置。
  8. 　請求項５～７のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフ装置を含む、環境性の原因菌による家畜の乳房炎を診断するための、キット。
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