WO2020109382A1 - Verfahren, oberfläche und kit zur detektion von analyten - Google Patents

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WO2020109382A1
WO2020109382A1 PCT/EP2019/082741 EP2019082741W WO2020109382A1 WO 2020109382 A1 WO2020109382 A1 WO 2020109382A1 EP 2019082741 W EP2019082741 W EP 2019082741W WO 2020109382 A1 WO2020109382 A1 WO 2020109382A1
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Steve RETTKE
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Technische Universitaet Dresden
Universitaet Leipzig
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Technische Universitaet Dresden
Universitaet Leipzig
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    • G01N2430/20—Herbicides, e.g. DDT

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of analytes.
  • the invention relates to a method for the detection of low molecular weight analytes.
  • the detection of contaminants with pesticides in food is carried out according to the multi-method DFG S19, whereby various extraction steps take place for sample preparation and the analysis is subsequently carried out using LC-MS or GC-MS.
  • CN102207495A discloses a method for determining the glyphosate content in soil samples by means of HPLC.
  • W020081 18899 A1 also discloses a method for the detection of glyphosate by means of LC / GC coupled MS. Alternatively, detection methods using bioluminescence (WO2010104861 A1) and ELISA (W02000014538A1) are also described.
  • WO2018057647 A1 describes an assay for a biochip in which pesticides can be detected on a sensor platform. The detection is based on the amplification of corresponding nucleic acids, which leads to significantly long analysis times.
  • US 2005/0 1 18 665 A1 discloses a method for determining an enzymatic reaction, wherein at least one protein and at least one substance are immobilized on a solid support at a distance sufficient for an enzymatic reaction and incubated under conditions for an enzymatic reaction .
  • the substance is preferably a known substrate for an investigated enzymatic reaction and the protein is examined for an enzymatic activity.
  • US 2006/0 073 490 A1 discloses an enzyme-based device for measuring environmental samples.
  • the device comprises an immobilized enzyme, preferably enclosed in a polymer matrix; an element that carries environmental samples to the immobilized enzyme, the environmental samples optionally containing an enzyme-inhibiting target molecule, an element that carries an enzyme substrate and optionally a pH-sensitive dye to the immobilized enzyme, and at least one sensor that determines the enzyme activity .
  • WO 2003/008 453 A1 discloses a method for immobilizing polypeptides by producing a fusion polypeptide with an adhesion polypeptide, in particular with hydrophobin, on solid surfaces, preferably on hydrophobic surfaces.
  • WO 03/008453 A1 describes the use of the hydrophobic infusion polypeptides, inter alia, for biosensor surfaces.
  • DE 10 201 1 089 241 B3 discloses a method for coating a substrate with a hydrophobin balance and a substrate with a hydrophobin balance coating. Furthermore, DE 10 201 1 089 241 B3 discloses a substrate coated with a hydrophobin fusion protein.
  • US 2006/0 253 923 A1 discloses a method for producing herbicide-tolerant, in particular glyphosate-tolerant, crop plants by DNA shuffling, in particular a nucleic acid coding for a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase; a library with recombinant nucleic acid obtained by a method for producing herbicide-selective crop plants by DNA shuffling with a nucleic acid coding for a herbicide-tolerant protein. Furthermore, US 2006/0 253 923 A1 describes the malachite green detection of the EPSPS activity.
  • the object of the invention is therefore to provide a method for the detection of analytes which can overcome the disadvantages in the prior art.
  • analyte binding partner having an affinity for interaction with an analyte to be detected
  • analyte binding partner is inhibited by interaction with the analyte, contacting the analyte binding partner with a substrate, the substrate being converted into a product by the analyte binding partner,
  • analyte is glyphosate
  • analyte binding partner comprises a protein domain, having the enzymatic activity of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase.
  • Low molecular weight analytes are understood to mean substances or molecules with a molecular weight of ⁇ 800 g / mol.
  • the analyte binding partner is contacted in parallel with the analyte and the substrate.
  • the analyte binding partner is a protein or peptide having an enzymatic activity.
  • a substrate is understood to mean at least one substance which is converted by a protein domain of the analyte binding partner which has an enzymatic activity for converting the substrate to the product.
  • the substrate also comprises two or more substances which are converted by the protein domain of the analyte binding partner, which has an enzymatic activity for converting the substrate to the product.
  • the substrate comprises shikimate 3-phosphate and phosphoenol pyruvate.
  • the analyte binding partner has the enzymatic activity of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS, EC 2.5.1.19).
  • the EPSPS catalyzes the conversion of shikimate-3-phosphate and phosphoenolpyruvate to 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate, whereby inorganic phosphate is released.
  • the use of the EPSPS can be used advantageously for the detection of glyphosate, since this inhibits the EPSPS and thus the detection of the presence of glyphosate in the sample to be examined takes place via the reduced enzymatic activity.
  • the analyte binding partner has the enzymatic activity of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from E. coli (https://www.uniprot.org/uniprot/P0A6D3).
  • the analyte binding partner preferably comprises SEQ ID No. 1.
  • the analyte binding partner is designed as a fusion protein.
  • the fusion protein has, for example, different protein domains which have different functionalities.
  • the analyte binding partner comprises a protein domain, which has an enzymatic activity for converting the substrate to the product.
  • the substrate can be converted to the product by the protein domain with enzymatic activity, the product or a by-product of the catalyzed reaction subsequently being detectable.
  • the analyte binding partner comprises a protein domain selected from hydrophobins, ECM proteins, S-layer proteins, peptide linkers, and protein tags. This enables directional immobilization to the surface, at least one protein domain mediating the linkage and a further protein domain having further functionality.
  • the analyte binding partner preferably has a hydrophobin domain.
  • the analyte binding partner has a hydrophobin domain and a protein domain having an enzymatic activity for converting the substrate to the product.
  • the analyte binding partner has a hydrophobin domain Ccg2 from Neurospora (N.) crassa.
  • the analyte binding partner preferably has the SEQ. ID. No. 5 on.
  • the analyte binding partner is a fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain.
  • the hydrophobin domain enables the analyte binding partner to be immobilized on the surface.
  • the fusion protein has SEQ ID No. 6 on.
  • the analyte binding partner is immobilized on the surface in a mixture with hydrophobins, the mixture of the analyte binding partner with the hydrophobin in the range from 1: 2 to 1:10, preferably between 1: 3 to 1: 8, particularly preferably around 1 : 5 lies.
  • the stated mixing ratios relate to the substance quantity concentrations.
  • a mixture of the fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain (SEQ ID No. 6) and the hydrophobin domain Ccg2 from Neurospora (N. ) crassa (SEQ ID No. 5) in a ratio of 1: 2 to 1:10, preferably between 1: 3 to 1: 8, particularly preferably around 1: 5, very particularly preferably 1: 5.
  • the analyte binding partner is inhibited by interaction with the analyte.
  • the analyte binding partner has an enzymatic activity which is inhibited by the interaction with the analyte.
  • the inhibition can be competitive or non-competitive. Interaction with the analyte thus at least reduces or slows down the conversion of the substrate to the product.
  • the analyte is glyphosate.
  • Glyphosate N- (phosphonomethyl) glycine
  • Glyphosate is a non-selective leaf herbicide (broad spectrum or total herbicide) with a systemic effect that is absorbed by any green parts of plants.
  • Glyphosate is used in agriculture against single and double germ weeds in arable, wine and fruit growing, in the cultivation of ornamental plants, on meadows, pastures and lawns as well as in the forest. The leaves absorb glyphosate by diffusion and in the plant glyphosate is distributed over the phloem.
  • Glyphosate works by blocking the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), which is required for the synthesis of the aromatic amino acids phenylalanine, tryptophan and tyrosine via the shikimate route in plants, as in most microorganisms. Due to the similarity of the glyphosate with phosphoenolpyruvate, it can occupy its binding site in the enzyme, whereby the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) is inhibited.
  • the product is quantified by optical detection.
  • the possibility of optical detection enables simple quantification of the analyte.
  • the optical detection is preferably carried out using a dye which allows simple optical detection.
  • the product is quantified photometrically. This enables simple quantification.
  • the quantification is preferably carried out by correlation with a standard or a sample without analyte.
  • the product is quantified using a malachite green assay.
  • the phosphate content is determined using a malachite green assay.
  • EPSPS 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
  • the inorganic phosphate formed in the reaction can be determined by detection using a malachite green assay and can thus be used as a measure of the inhibition of the EPSPS.
  • the surface on which the analyte binding partner is immobilized is formed as a particle.
  • the surface is preferably designed as a hydrogel particle. This enables the analyte to be detected in solution. This is advantageous, for example, if a photometric determination is to be carried out.
  • the invention also relates to a surface having an analyte binding partner, the analyte binding partner being a fusion protein having a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain.
  • the surface is essentially planar.
  • the surface can be a glass or plastic molded body such. B. a slide, coverslip, silicon wafer or the like.
  • the surface is designed as a 96-well plate.
  • the surface is designed as a particle.
  • the analyte binding partner is designed as a fusion protein.
  • the fusion protein has, for example, different protein domains which have different functionalities.
  • the analyte binding partner comprises a protein domain, which has an enzymatic activity for converting the substrate to the product.
  • the substrate can be converted to the product by the protein domain with enzymatic activity, the product or a by-product of the catalyzed reaction subsequently being detectable.
  • the analyte binding partner comprises a protein domain selected from hydrophobins, ECM proteins, S-layer proteins, peptide linkers and protein tags. This enables directional immobilization to the surface, at least one protein domain mediating the linkage and a further protein domain having further functionality.
  • the analyte binding partner preferably has a hydrophobin domain.
  • the analyte binding partner has a hydrophobin domain Ccg2 from Neurospora (N.) crassa.
  • the analyte binding partner preferably has the SEQ. ID. No. 5 on.
  • the analyte binding partner is a fusion protein having a hydrophobin domain and at least one protein domain, having an enzymatic activity for converting the substrate to the product.
  • the analyte binding partner is a fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain.
  • the hydrophobin domain enables the analyte binding partner to be immobilized on the surface.
  • the fusion protein has SEQ ID No. 6 on.
  • the analyte binding partner is immobilized on the surface in a mixture with hydrophobins, the mixture of the analyte binding partner with the hydrophobin in the range from 1: 2 to 1:10, preferably between 1: 3 to 1: 8, particularly preferably around 1 : 5 lies.
  • a mixture of the fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain (SEQ ID No. 6) and the hydrophobin domain Ccg2 from Neurospora (N. ) crassa (SEQ ID No. 5) in a ratio of 1: 2 to 1:10, preferred between 1: 3 to 1: 8, particularly preferably around 1: 5, very particularly preferably 1: 5.
  • the ratio to glyphosate can additionally be set in a very targeted manner and thus enables detection of glyphosate over a wide concentration range.
  • the invention also relates to a kit for the detection of analytes comprising an analyte binding partner having an enzymatic activity for converting a substrate, the analyte binding partner being a fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain, and also a Hydrophobin.
  • the analyte binding partners and the hydrophobin contained in the kit are advantageously mixed for immobilization in a ratio of 1: 2 to 1:10, preferably 1: 3 to 1: 8, particularly preferably in a ratio of 1: 5, and immobilized on a surface.
  • the hydrophobin stabilizes the surface while the analyte binding partner is designed to interact with the analyte.
  • the kit comprises a fusion protein with SEQ ID No. 6 and a hydrophobin with SEQ ID No. 5.
  • the invention also relates to the use of the method according to the invention and the kit according to the invention for the detection of analytes, in particular glyphosate.
  • glyphosate is detected in water, food, soil, drinking and waste water samples, preferably in aqueous solutions.
  • Fig. 6 Measurement of the specificity of the EcEPSPS-functionalized polystyrene surface (1 mM Ccg2_GS_EcEPSPS: 5mM Ccg2) using a malachite green assay using photometry at a wavelength of 630 nm depending on the pesticide concentration (0 to 5 mM). The results were normalized to Samples without pesticide (0 mM).
  • AMPA a-Amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid
  • B glufosinate
  • C chlorpyrifos
  • D chemical structures.
  • Fig. 1 The principle of the detection method is shown in Fig. 1. It is based on the malachite green assay, which is used for the general detection of inorganic phosphate (Pi) (Baykov et al. 1988). Phosphate must first be removed from the solution to be analyzed using a phosphate-binding substance. Then the analyte, together with the required substrates shikimate-3-phosphate (S3P) and phosphoenolpyruvate (PEP), is placed on a prepared surface, for example a 96-well plate (coated with a mixture of hydrophobin Ccg2 (SEQ ID No. 4) and given the fusion protein Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No.
  • the malachite green working solution (mixture of malachite green, ammonium molybdate and sulfuric acid (Baykov et al. 1988)) is then added to detect the Pi formed in the reaction and incubated for 20 minutes in the dark.
  • the amount of glyphosate present in the analyte solution can then be determined by measuring the absorption at 630 nm and comparing it with a control / standard.
  • the malachite green assay is a well-known method for the detection of inorganic phosphate. It is based on the complexation of inorganic phosphate (Pi) with molybdate. In the presence of malachite green, this complexation leads to a shift in the absorption maximum to approx. 630 nm. Accordingly, a high absorption at 630 nm indicates a high concentration of Pi. This occurs during the reaction of the EPSPS with its substrates phosphoenolpyruvate (PEP) and shikimate-3-phosphate (S3P). Accordingly, the malachite green assay can be used to demonstrate the activity of the EPSPS. Glyphosate inhibits EPSPS because it competes with PEP for binding in the active enzyme center. The more glyphosate in the surrounding medium, the lower the EPSPS activity.
  • PEP phosphoenolpyruvate
  • S3P shikimate-3-phosphate
  • the EcEPSPS can be coupled to suspended hydrogel microparticles in a function-preserving manner (production by emulsion and radical precipitation polymerization of polyethylene glycol diacrylamide with subsequent radical grafting of acrylic acid monomers to introduce the carboxyl groups, average radius 20 pm). This means that larger surfaces can be generated with immobilized EcEPSPS in smaller analyte solutions and thus higher sensitivities can be achieved.
  • Embodiment 1 Detection of glyphosate by means of a functionalized surface and malachite green assay
  • the hydrophobin without EcEPSPS was required for the surface.
  • the gene sequence (SEQ ID No. 2) was accordingly transferred into the vector pET28b without the linker and the EcEPSPS sequence.
  • the vectors modified in this way were transferred into the E. coli expression strain SHuffle T7 Express lysY (New England Biolabs, USA) after complete sequencing of the introduced sequences.
  • This expression strain is advantageous for the expression of the hydrophobins, since it additionally codes for a disulfide bridge isomerase, which favors the correct formation of the disulfide bridges of the hydrophobins. These play an essential role in the correct folding of the protein.
  • Protein expression was increased by adding 1 mM isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside (IPTG). co // - cells that were in the exponential growth phase started. After induction, the cells were incubated for an additional 4 hours at 30 ° C and 180 revolutions per minute. The cells were then pelleted and washed so that they could then be used for protein purification. The cleaning method used depends on the solubility of the proteins.
  • the soluble fusion proteins (Ccg2_GS_EcEPSPS, SEQ ID No. 6) were purified using nickel affinity chromatography under native conditions according to the manufacturer's instructions, while the insoluble hydrophobins were purified using denaturing nickel affinity chromatography according to the manufacturer's instructions.
  • the hydrophobins were concentrated by ultrafiltration before dialysis; this was not necessary for the fusion proteins.
  • the 96-well plates were functionalized by pipetting on the corresponding protein solution and then incubating for 30 minutes. The supernatant was then removed, incubated again for 5 minutes and the wells were then washed thoroughly with dialysis buffer in order to remove non-specifically bound protein.
  • the surface was overlaid with dialysis buffer and could then be used for the malachite green assay.
  • the two different protein variants were required in order to be able to set an optimal ratio between the fusion protein (binds glyphosate) and hydrophobin (to stabilize the surface). For this, the protein variants were mixed in different ratios and the surfaces were functionalized.
  • the malachite green assay was then performed.
  • the malachite green assay is a detection method for inorganic phosphate.
  • the developed surface offers a decisive advantage over dissolved protein.
  • the surface is significantly more sensitive to glyphosate than dissolved protein (compare FIGS. 3 and 4).
  • the sensitivity to glyphosate can additionally be set in a very targeted manner and thus enables detection of glyphosate over a wide concentration range.
  • phosphate must be removed from the analysis solution before performing the malachite green assay. This can be achieved by using commercially available phosphate binders or by an iron chloride solution (Fig. 5).
  • Embodiment 2 Specificity of the detection of glyphosate by means of a functionalized surface and malachite green assay
  • Glyphosate is an organophosphonate pesticide.
  • Another organophosphonate pesticide (glufosinate), an organophosphate pesticide, is used to determine the specificity of the detection (Chlorpyrifos) and the main breakdown product of glyphosate, a-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid (AMPA), tested (Fig. 6). None of the three substances tested showed an influence on the enzymatic activity of the EcEPSPS in a concentration range between 0 mM and 5 mM (FIGS. 6A to C).
  • the assay according to the invention thus offers a highly specific detection system for glyphosate.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Kit zur Detektion von Analyten, insbesondere von niedermolekularen Analyten. Erfindungsgemäß wird dabei ein einfaches Verfahren zur Detektion von niedermolekularen Analyten bereitgestellt, bei dem die zu detektierenden Analyten als Kompetitoren für immobilisierte Enzyme agieren. Durch die Inhibierung kann über den reduzierten Substratumsatz auf die Analytkonzentration geschlossen werden. Insbesondere wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Detektion von Glyphosat bereitgestellt.

Description

Verfahren, Oberfläche und Kit zur Detektion von Analyten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Analyten. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Detektion von niedermolekularen Analyten.
Der Nachweis von niedermolekularen Analyten gestaltet sich aktuell aufwändig. Insbesondere der Nachweis von Pflanzenschutzmitteln in Trinkwasser und Bodenproben und deren gesundheitliche Auswirkungen sind aktuell von hohem Interesse. Problematisch erscheint dabei vor allem die Verunreinigung von Nahrungsmitteln inklusive Trinkwasser mit Glyphosat.
Die Detektion von Verunreinigungen mit Pflanzenschutzmitteln in Lebensmitteln erfolgt nach der Multimethode DFG S19, wobei zur Probenvorbereitung verschiedene Extraktionsschritte erfolgen und nachfolgend die Analyse mittels LC-MS oder GC-MS erfolgt.
Im Stand der Technik sind zudem verschiedene Verfahren zur Bestimmung von Glyphosat bekannt.
So offenbart die CN102207495A ein Verfahren zur Bestimmung des Glyphosat-Gehalts in Bodenproben mittels HPLC.
Auch die W020081 18899 A1 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von Glyphosat mittels LC/GC gekoppeltem MS. Alternativ werden auch Nachweismethoden mittels Biolumineszenz (WO2010104861 A1 ) und ELISA (W02000014538A1 ) beschrieben.
Die WO2018057647 A1 beschreibt einen Assay für einen Biochip, bei dem Pestizide auf einer Sensorplattform detektiert werden können. Der Nachweis basiert dabei auf der Amplifikation von korrespondierenden Nukleinsäuren, was zu deutlich langen Analysezeiten führt.
US 2005 / 0 1 18 665 A1 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung einer enzymatischen Reaktion, wobei mindestens ein Protein und mindestens eine Substanz auf einem festen Träger in einem Abstand, ausreichend für eine enzymatische Reaktion, immobilisiert werden und unter Bedingungen für eine enzymatische Reaktion inkubiert werden. Bevorzugt ist die Substanz ein bekanntes Substrat für eine untersuchte enzymatische Reaktion und das Protein wird auf eine enzymatische Aktivität untersucht. US 2006 / 0 073 490 A1 offenbart eine Enzym-basierte Vorrichtung zur Messung von Umweltproben. Die Vorrichtung umfasst ein immobilisiertes Enzym, bevorzugt eingeschlossen in eine Polymermatrix; ein Element, welches Umweltproben zu dem immobilisierten Enzym befördert, wobei die Umweltproben optional ein enzym-inhibierendes Zielmolekül enthalten, ein Element, welches ein Enzymsubstrat und optional einen pH-sensitiven Farbstoff zu dem immobilisierten Enzym befördert, und mindestens einen Sensor, der die Enzymaktivität bestimmt.
WO 2003 / 008 453 A1 offenbart ein Verfahren zur Immobilisierung von Polypeptiden durch die Herstellung eines Fusionspolypeptids mit einem Adhäsionspolypeptid, insbesondere mit Hydrophobin, auf festen Oberflächen, bevorzugt auf hydrophoben Oberflächen. WO 03/008453 A1 beschreibt die Verwendung der Hydrophobinfusionspolypeptide unter anderem für Biosensoroberflächen.
DE 10 201 1 089 241 B3 offenbart ein Verfahren zur Beschichtung eines Substrats mit einer Hydrophobinbilage und ein Substrat mit einer Hydrophobinbilagenbeschichtung. Weiterhin offenbart DE 10 201 1 089 241 B3 ein mit einem Hydrophobinfusionsprotein beschichtetes Substrat.
US 2006 / 0 253 923 A1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung Herbizid-toleranter, insbesondere Glyphosat-toleranter, Kulturpflanzen durch DNA-Shuffling, insbesondere einer Nukleinsäure kodierend für eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase; eine Bibliothek mit rekombinanten Nukleinsäure erhalten durch ein Verfahren zur Herstellung Herbizid-selektiver Kulturpflanzen durch DNA-Shuffling mit einer Nukleinsäure kodierend für ein Protein mit Herbizidtoleranz. Weiterhin beschreibt US 2006 / 0 253 923 A1 den Malachitgrün-Nachweis der EPSPS-Aktivität.
Der Nachweis entsprechender niedermolekularer Analyten ist bisher experimentell aufwändig und nicht geeignet um Vor-Ort-Analyse zu ermöglichen.
Es besteht daher ein Bedürfnis eine Nachweismethode anzugeben, die einen einfachen Nachweis niedermolekularer Analyten vor Ort ermöglicht.
Die Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Detektion von Analyten anzugeben, das die Nachteile im Stand der Technik überwinden kann.
Die Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben. Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Detektion von Analyten in einer Probe vorgeschlagen, umfassend die Schritte:
Bereitstellen einer Oberfläche mit einem immobilisierten Analytbindungspartner, wobei der Analytbindungspartner eine Affinität zur Interaktion mit einem zu detektierenden Analyten aufweist,
Kontaktieren des Analytbindungspartners mit einer Probe enthaltend den Analyten, wobei der Analyt mit dem Analytbindungspartner interagiert,
wobei der Analytbindungspartner durch Interaktion mit dem Analyten gehemmt wird, Kontaktieren des Analytbindungspartners mit einem Substrat, wobei das Substrat durch den Analytbindungspartner zu einem Produkt umgesetzt wird,
Quantifizierung des Produkts und
Korrelation des quantifizierten Produkts mit einer Referenzprobe,
wobei der Analyt Glyphosat ist,
wobei der Analytbindungspartner eine Proteindomäne umfasst, aufweisend die enzymatische Aktivität des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase.
Unter niedermolekularen Analyten werden Stoffe oder Moleküle mit einer Molmasse von <800 g/mol verstanden.
In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt eine parallele Kontaktierung des Analytbindungspartners mit dem Analyten und dem Substrat.
Erfindungsgemäß ist der Analytbindungspartner ein Protein oder Peptid aufweisend eine enzymatische Aktivität.
Unter einem Substrat wird im Sinne der Erfindung zumindest ein Stoff verstanden, der von einer Proteindomäne des Analytbindungspartners, welche eine enzymatische Aktivität zur Umsetzung des Substrats zu dem Produkt aufweist, umgesetzt wird. In Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Substrat auch zwei oder mehr Stoffe, welche von der Proteindomäne des Analytbindungspartners, welche eine enzymatische Aktivität zur Umsetzung des Substrats zu dem Produkt aufweist, umgesetzt werden. In Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Substrat Shikimat-3-phosphat und Phosphoenolpyruvat. Erfindungsgemäß weist der Analytbindungspartner die enzymatische Aktivität des Enzyms 5- Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS, EC 2.5.1.19) auf. Die EPSPS katalysiert dabei die Umsetzung von Shikimat-3-phosphat und Phosphoenolpyruvat zu 5- Enolpyruvylshikimat-3-phosphat, wobei anorganisches Phosphat freigesetzt wird. Die Verwendung der EPSPS kann dabei vorteilhaft für den Nachweis von Glyphosat genutzt werden, da dieses die EPSPS inhibiert und somit über die verminderte enzymatische Aktivität der Nachweis für das Vorhandensein von Glyphosat in der zu untersuchenden Probe erfolgt. In Ausführungsformen der Erfindung weist der Analytbindungspartner die enzymatische Aktivität des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase aus E. coli (https://www.uniprot.org/uniprot/P0A6D3) auf. Bevorzugt umfasst der Analytbindungspartner die SEQ ID No. 1.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner als Fusionsprotein ausgebildet. Dabei weist das Fusionsprotein beispielsweise verschiedene Proteindomänen auf, welche unterschiedliche Funktionalitäten aufweisen.
In Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, aufweisend eine enzymatische Aktivität zur Umsetzung des Substrats zu dem Produkt. Durch die Proteindomäne mit enzymatischer Aktivität kann das Substrat zu dem Produkt umgesetzt werden, wobei das Produkt oder ein Nebenprodukt der katalysierten Reaktion nachfolgend detektiert werden kann.
In Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, ausgewählt aus Hydrophobinen, ECM-Proteinen, S-Layer-Proteinen, Peptidlinkern, und Protein- Tags. Dadurch wird eine gerichtete Immobilisierung an die Oberfläche ermöglicht, wobei zumindest eine Proteindomäne die Anbindung vermittelt und eine weitere Proteindomäne eine weitere Funktionalität aufweist. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin- Domäne auf. In Ausführungsformen der Erfindung weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne und eine Proteindomäne aufweisend eine enzymatische Aktivität zur Umsetzung des Substrats zu dem Produkt auf.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa auf. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner die SEQ. ID. No. 5 auf. In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase- Domäne. Dabei ermöglicht die Hydrophobin-Domäne die Immobilisierung des Analytbindungspartners auf der Oberfläche. In Ausführungsformen der Erfindung weist das Fusionsprotein die SEQ ID No. 6 auf.
In Ausführungsformen der Erfindung wird der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydrophobin im Bereich von 1 :2 bis 1 :10, bevorzugt zwischen 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt um 1 :5 liegt. Die angegebenen Mischungsverhältnisse beziehen sich im Sinne der vorliegenden Erfindung auf die Stoffmengenkonzentrationen.
In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt zur Immobilisierung des Analytbindungspartners eine Mischung aus dem Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5- Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne (SEQ ID No. 6) und der Hydrophobin- Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa (SEQ ID No. 5) im Verhältnis 1 :2 bis 1 : 10, bevorzugt zwischen 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt um 1 :5, ganz besonders bevorzugt 1 :5.
Erfindungsgemäß wird der Analytbindungspartner durch Interaktion mit dem Analyten gehemmt. Dabei weist der Analytbindungspartner eine enzymatische Aktivität auf, welche durch die Interaktion mit dem Analyten gehemmt wird. Die Hemmung kann dabei kompetitiv oder nicht kompetitiv erfolgen. Durch Interaktion mit dem Analyten wird somit die Umsetzung des Substrats zum Produkt zumindest vermindert oder verlangsamt.
Erfindungsgemäß ist der Analyt Glyphosat. Glyphosat (N-(Phosphonomethyl)glycin) ist ein nicht selektives Blattherbizid (Breitband- oder Totalherbizid) mit systemischer Wirkung, das über jegliche grünen Pflanzenteile aufgenommen wird. Glyphosat wird in der Landwirtschaft gegen einkeim- und zweikeimblättrige Unkräuter im Acker-, Wein- und Obstbau, beim Anbau von Zierpflanzen, auf Wiesen, Weiden und Rasenflächen sowie im Forst verwendet. Die Blätter nehmen Glyphosat durch Diffusion auf und in der Pflanze wird Glyphosat über das Phloem verteilt. Glyphosat wirkt über die Blockade des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat- Synthase (EPSPS), das zur Synthese der aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin über den Shikimatweg in Pflanzen, wie auch in den meisten Mikroorganismen, benötigt wird. Durch die Ähnlichkeit des Glyphosats mit Phosphoenolpyruvat kann es dessen Bindestelle im Enzym besetzten, wodurch das Enzym 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat- Synthase (EPSPS) gehemmt wird. In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Quantifizierung des Produkts durch optische Detektion. Durch die Möglichkeit der optischen Detektion ist eine einfache Quantifizierung des Analyten möglich. Bevorzugt erfolgt die optische Detektion über einen Farbstoff, der eine einfache optische Detektion erlaubt.
In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Quantifizierung des Produkts photometrisch. Dadurch ist eine einfache Quantifizierung möglich. Vorzugsweise erfolgt die Quantifizierung durch Korrelation mit einem Standard oder einer Probe ohne Analyten.
In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Quantifizierung des Produkts mit einem Malachitgrün-Assay. Dabei wird der Gehalt an Phosphat mittels Malachitgrün-Assay ermittelt. So wird bei der Hemmung der 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) durch Glyphosat die Reaktion mit Phosphoenolpyruvat gehemmt, sodass eine Umsetzung zu 5- Enolpyruvylshikimat-3-phosphat und Phosphat nicht oder nur verlangsamt erfolgt. Durch den Nachweis mittels Malachitgrün-Assay kann das in der Reaktion gebildete anorganische Phosphat bestimmt werden und somit als Maß für die Inhibierung der EPSPS genutzt werden.
In Ausführungsformen der Erfindung ist die Oberfläche an der die Immobilisierung des Analytbindungspartners erfolgt als Partikel ausgebildet. Bevorzugt ist die Oberfläche als Hydrogelpartikel ausgebildet. Dadurch kann der Nachweis des Analyten in Lösung erfolgen. Dies ist beispielsweise vorteilhaft, wenn eine photometrische Bestimmung erfolgen soll.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Oberfläche aufweisend einen Analytbindungspartner, wobei der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne ist.
In Ausführungsformen der Erfindung ist die Oberfläche im Wesentlichen planar ausgebildet. Beispielsweise kann die Oberfläche ein Glas- oder Kunststoffformkörper sein z. B. ein Objektträger, Deckgläschen, Siliziumwafer oder ähnliches. In Ausführungsformen der Erfindung ist die Oberfläche als 96-Well-Platte ausgebildet. In Ausführungsformen der Erfindung ist die Oberfläche als Partikel ausgebildet.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner als Fusionsprotein ausgebildet. Dabei weist das Fusionsprotein beispielsweise verschiedene Proteindomänen auf, welche unterschiedliche Funktionalitäten aufweisen. In Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, aufweisend eine enzymatische Aktivität zur Umsetzung des Substrats zu dem Produkt. Durch die Proteindomäne mit enzymatischer Aktivität kann das Substrat zu dem Produkt umgesetzt werden, wobei das Produkt oder ein Nebenprodukt der katalysierten Reaktion nachfolgend detektiert werden kann.
In Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, ausgewählt aus Hydrophobinen, ECM-Proteinen, S-Layer-Proteinen, Peptidlinkern und Protein- Tags. Dadurch wird eine gerichtete Immobilisierung an die Oberfläche ermöglicht, wobei zumindest eine Proteindomäne die Anbindung vermittelt und eine weitere Proteindomäne eine weitere Funktionalität aufweist. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin- Domäne auf.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa auf. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner die SEQ. ID. No. 5 auf.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und zumindest eine Proteindomäne, aufweisend eine enzymatische Aktivität zur Umsetzung des Substrats zu dem Produkt.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase- Domäne. Dabei ermöglicht die Hydrophobin-Domäne die Immobilisierung des Analytbindungspartners auf der Oberfläche. In Ausführungsformen der Erfindung weist das Fusionsprotein die SEQ ID No. 6 auf.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydrophobin im Bereich von 1 :2 bis 1 :10, bevorzugt zwischen 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt um 1 :5 liegt.
In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt zur Immobilisierung des Analytbindungspartners eine Mischung aus dem Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5- Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne (SEQ ID No. 6) und der Hydrophobin- Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa (SEQ ID No. 5) im Verhältnis 1 :2 bis 1 :10, bevorzugt zwischen 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt um 1 :5, ganz besonders bevorzugt 1 :5. Durch Variation des Verhältnisses von Fusionsprotein und Hydrophobin auf der Oberfläche kann zusätzlich die Sensitivität gegenüber Glyphosat sehr gezielt eingestellt werden und ermöglicht damit einen Nachweis von Glyphosat über einen weiten Konzentrationsbereich.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit zur Detektion von Analyten umfassend einen Analytbindungspartner aufweisend eine enzymatische Aktivität zur Umsetzung eines Substrats, wobei der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne ist, sowie ein Hydrophobin. Die im Kit enthaltenen Analytbindungspartner sowie das Hydrophobin werden vorteilhaft zur Immobilisierung im Verhältnis 1 :2 bis 1 :10, bevorzugt 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt im Verhältnis 1 :5 gemischt und auf einer Oberfläche immobilisiert. Dabei stabilisiert das Hydrophobin die Oberfläche während der Analytbindungspartner zur Interaktion mit dem Analyten ausgebildet ist.
In Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Kit ein Fusionsprotein mit der SEQ ID No. 6 sowie ein Hydrophobin mit der SEQ ID No. 5.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Kits zur Detektion von Analyten, insbesondere Glyphosat. In Ausführungsformen erfolgt die Detektion von Glyphosat in Gewässer-, Lebensmittel-, Boden-, Trink- und Abwasserproben, bevorzugt in wässrigen Lösungen.
Zur Realisierung der Erfindung ist es auch zweckmäßig, die vorbeschriebenen Ausführungsformen und Merkmale der Ansprüche zu kombinieren.
Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den nachfolgenden schematischen Zeichnungen und Ausführungsbeispielen, anhand derer die Erfindung beispielhaft näher erläutert werden soll, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.
Dabei zeigt:
Fig. 1 : die schematische Darstellung des Assays, beruhend auf dem Nachweis von anorganischem Phosphat,
Fig. 2: die Aktivitätsmessung mittels Malachitgrün-Assay bei unterschiedlichen Belegungsdichten, Fig. 3: die Glyphosat-abhängige Hemmung der EcEPSPS auf der Oberfläche (1 mM Ccg2_GS_EcEPSPS : 5mM Ccg2) mittels Malachitgrün-Assay,
Fig. 4: im Vergleich dazu, die Glyphosat-abhängige Hemmung von 1 mM EcEPSPS in Lösung mittels Malachitgrün-Assay,
Fig. 5: die Entfernung verschiedener Phosphatkonzentrationen aus Lösung mittels zweier verschiedener Phosphat-bindenden Substanzen,
Fig. 6: Messung der Spezifität der EcEPSPS-funktionalisierten Polystyrol-Oberfläche (1 mM Ccg2_GS_EcEPSPS : 5mM Ccg2) mittels Malachitgrün-Assay mittels Photometrie bei einer Wellenlänge von 630 nm in Abhängigkeit der Pestizidkonzentration (0 bis 5 mM) Die Ergebnisse wurden normalisiert auf die Proben ohne Pestizid (0 mM). (A) a-Amino-3- hydroxy-5-methylisoxazol-4-propionsäure (AMPA), (B) Glufosinat, (C) Chlorpyrifos, (D) chemische Strukturen.
Das Prinzip der Nachweismethode ist in Fig. 1 gezeigt. Es beruht auf dem Malachitgrün-Assay, welcher zum allgemeinen Nachweis von anorganischem Phosphat (Pi) eingesetzt wird (Baykov et al. 1988). Aus der zu analysierenden Lösung muss zunächst Phosphat mit Hilfe einer Phosphat-bindenden Substanz entfernt werden. Anschließend wird der Analyt, gemeinsam mit den benötigten Substraten Shikimat-3-phosphat (S3P) und Phosphoenolpyruvat (PEP) auf eine vorbereitete Oberfläche, beispielsweise eine 96-well-Platte (beschichtet mit Mischung aus Hydrophobin Ccg2 (SEQ ID No. 4) und dem Fusionsprotein Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No. 6)) gegeben und für 30-45 Minuten inkubiert. Anschließend wird die Malachitgrün-Arbeitslösung (Mischung aus Malachitgrün, Ammoniummolybdat und Schwefelsäure (Baykov et al. 1988)) zur Detektion des bei der Reaktion gebildeten Pi hinzugefügt und für20 Minuten im Dunkeln inkubiert. Durch Messen der Absorption bei 630 nm und Vergleich mit einer Kontrolle/Standard kann dann die in der Analytlösung vorhandene Glyphosatmenge bestimmt werden.
Zum Einstellen eines guten Signal-Rauschverhältnisses des Assays wurden in Fig. 2 verschiedene Belegungsdichten auf Polystyrol-Oberflächen getestet. Hierfür wurde insbesondere die Hydrophobinkonzentration variiert. Mit steigender Hydrophobinkonzentration ist eine höhere Enzymfunktion zu verzeichnen. Ab einer Hydrophobinkonzentration von 5 mM ist keine weitere Aktivitätssteigerung mehr zu beobachten. Die Hemmung des Enzyms mit 0,5 mM Glyphosat ist bei diesem Verhältnis detektierbar.
Als Machbarkeitsbeweis wurden in Fig. 3 verschiedene Glyphosatkonzentrationen zu einer funktionalisierten Glasoberfläche (Beschichtung mit 1 mM Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No. 6): 5 mM Ccg2 (SEQ ID No. 5)) gegeben und der Malachitgrün-Assay durchgeführt. Die Hemmung der Enzymaktivität bei verschiedenen Glyphosatkonzentrationen wird deutlich.
Im Vergleich zu Fig. 3, wurde für Fig. 4 die Glyphosat-abhängige Hemmung von 1 mM EcEPSPS (SEQ ID No. 4) in Lösung getestet. Die Hemmung des Enzyms wird hier nicht sichtbar.
Ebenfalls als Machbarkeitsnachweis wurden für Fig. 5 zwei verschiedene Phosphat-bindende Substanzen zu Lösungen mit verschiedenen Phosphatkonzentrationen gegeben und diese mindestens eine Stunde inkubiert, anschließend abzentrifugiert und mit Hilfe des Malachitgrün- Assays die verbleibende Phosphatmenge bestimmt.
Der Malachitgrün-Assay ist ein bekanntes Verfahren zum Nachweis von anorganischem Phosphat. Er beruht auf der Komplexierung von anorganischem Phosphat (Pi) mit Molybdat. In Anwesenheit von Malachitgrün führt diese Komplexierung zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums nach ca. 630 nm. Dementsprechend deutet eine hohe Absorption bei 630 nm auf eine hohe Konzentration an Pi hin. Dieses entsteht bei der Reaktion der EPSPS mit ihren Substraten Phosphoenolpyruvat (PEP) und Shikimat-3-phosphat (S3P). Dementsprechend kann der Malachitgrün-Assay für den Aktivitätsnachweis der EPSPS genutzt werden. Glyphosat führt zur Hemmung der EPSPS, da es mit PEP um die Bindung im aktiven Enzymzentrum konkurriert. Je mehr Glyphosat im umgebenden Medium ist, desto geringer ist die EPSPS- Aktivität.
In einer Variante des Nachweisverfahrens kann das EcEPSPS alternativ zu einer Chip- Oberfläche funktionserhaltend an suspendierte Hydrogelmikropartikel (Herstellung über Emulsions- und radikalischer Fällungspolymerisation von Polyethylenglykol-Diacrylamid mit anschließender radikalischer Pfropfung von Acrylsäuremonomeren zur Einführung der Carboxylgruppen, mittlerer Radius 20 pm) gekoppelt werden. Damit können größere Oberflächen mit immobilisierter EcEPSPS in kleineren Analytlösungen erzeugt und somit höhere Sensitivitäten erreicht werden.
Ausführungsbeispiel 1 : Nachweis von Glyphosat mittels funktionalisierter Oberfläche und Malachitgrün-Assay
Für die Erzeugung einer funktionalisierten Oberfläche wurden Fusionsproteine aus dem Hydrophobin Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa und der 5-Enolpyruvylshikimat-3- phosphatsynthase aus Escherichia (E.) coli (EcEPSPS) benötigt. Hierzu wurden die kodierenden Bereiche der jeweiligen Gene, verbunden über die Sequenz für einen flexiblen Glycin-Serin- Linker, in den Expressionsvektor pET28b (Novagen, Deutschland) übertragen. Hierbei liegt die Sequenz des Hydrophobins (SEQ ID No. 2) 5'-seitig und die der EcEPSPS (SEQ ID No. 1 ) 3'- seitig von der Linkersequenz. Zusätzlich befindet sich 5'-seitig von der Sequenz für das Fusionsprotein die Sequenz für einen (His)6-Tag, welcher für die Detektion und Reinigung des Fusionsproteins erforderlich ist. Weiterhin wurde für die Oberfläche das Hydrophobin ohne EcEPSPS benötigt. Die Gensequenz (SEQ ID No. 2) wurde dementsprechend ohne den Linker und die EcEPSPS-Sequenz in den Vektor pET28b übertragen. Die auf diese Weise modifizierten Vektoren wurden nach vollständiger Sequenzierung der eingebrachten Sequenzen, in den E. coli Expressionsstamm SHuffle T7 Express lysY (New England Biolabs, USA) übertragen. Dieser Expressionsstamm ist vorteilhaft für die Expression der Hydrophobine, da er zusätzlich für eine Disulfidbrückenisomerase kodiert, welche die korrekte Ausbildung der Disulfidbrücken der Hydrophobine begünstigt. Diese spielen eine wesentliche Rolle für die richtige Faltung des Proteins.
Die Proteinexpression wurde durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-ß-D-thiogalaktosid (IPTG) zu £. co//-Zellen, welche sich in der exponentiellen Wachstumsphase befanden, gestartet. Nach der Induktion wurden die Zellen für 4 weitere Stunden bei 30°C und 180 Umdrehungen in der Minute inkubiert. Anschließend wurden die Zellen pelletiert und gewaschen, um sie dann für die Proteinreinigung weiter verwenden zu können. Die angewendete Reinigungsmethode ist abhängig von der Löslichkeit der Proteine. Die löslichen Fusionsproteine (Ccg2_GS_EcEPSPS, SEQ ID No. 6) wurden mittels Nickel-Affinitätschromatografie unter nativen Bedingungen nach Herstellerangaben gereinigt, während die unlöslichen Hydrophobine mittels denaturierender Nickel-Affinitätschromatografie nach Herstellerangaben gereinigt wurden. Die Hydrophobine wurden vor der Dialyse durch Ultrafiltration konzentriert, für die Fusionsproteine war dies nicht nötig. Nach der Reinigung wurden die Hydrophobine gegen einen Redox-Rückfaltepuffer (10mM Glutathion reduziert, 1 mM Glutathion oxidiert; pH 5,4) und die Fusionsproteine gegen den Monsanto-Dialysepuffer (10 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 5% (v/v) 99,9% Glycerin, 1 mM DTT, pH 7 (Sammons et al. 2007)) dialysiert, anschließend im Kühlschrank gelagert und für die Funktionalisierung von 96-Wellplatten aus Polystyrol eingesetzt.
Die Funktionalisierung der 96-Well-Platten erfolgte durch Aufpipettieren der entsprechenden Proteinlösung mit anschließender 30-minütiger Inkubation. Daraufhin wurde der Überstand abgenommen, erneut für 5 Minuten inkubiert und die Wells danach gründlich mit Dialysepuffer gewaschen, um unspezifisch gebundenes Protein zu entfernen. Die Oberfläche wurde mit Dialysepuffer überschichtet und konnte dann für den Malachitgrün-Assay eingesetzt werden. Die beiden verschiedenen Proteinvarianten wurden benötigt, um ein optimales Verhältnis zwischen Fusionsprotein (bindet Glyphosat) und Hydrophobin (zur Stabilisierung der Oberfläche) einstellen zu können. Hierfür wurden die Proteinvarianten in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt und die Oberflächen funktionalisiert. Anschließend wurde der Malachitgrün-Assay durchgeführt. Der Malachitgrün-Assay ist ein Nachweisverfahren für anorganisches Phosphat.
Durch Testung verschiedener Verhältnisse von Fusionsprotein zu Hydrophobin konnte gezeigt werden, dass ein Verhältnis von 1 mM Fusionsprotein zu 5 mM Hydrophobin für den Assay gut geeignet ist (Fig. 2). Bei diesem Verhältnis zeigte sich eine gute EPSPS-Aktivität, d.h. es lag ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis vor. Steigende Hydrophobinkonzentrationen brachten keine weitere Aktivitätssteigerung. Geringere Mengen des Fusionsproteins führen zu geringeren Signalstärken, ebenso wie höhere Fusionsproteinkonzentrationen. Dies könnte auf eine sterische Behinderung der Proteinaktivität untereinander, auf Grund einer zu dichten Funktionalisierung, zurückzuführen sein. Ein weiterer Punkt der zu berücksichtigen ist, ist das mit steigender Fusionsproteinkonzentration die Sensitivität des Assays gegenüber Glyphosat abnimmt, da mehr freie Bindestellen gesättigt werden müssen, um den Aktivitätsverlust in Anwesenheit von Glyphosat messen zu können.
Die entwickelte Oberfläche bietet hier einen entscheidenden Vorteil gegenüber gelöstem Protein. Im verwendeten Konzentrationsbereich ist die Oberfläche deutlich sensitiver gegenüber Glyphosat als gelöstes Protein (Vergleich Fig. 3 und Fig. 4). Durch Variation des Verhältnisses von Fusionsprotein und Hydrophobin auf der Oberfläche kann zusätzlich die Sensitivität gegenüber Glyphosat sehr gezielt eingestellt werden und ermöglicht damit einen Nachweis von Glyphosat über einen weiten Konzentrationsbereich.
Um Falsch-Negative Ergebnisse zu verhindern, muss vor der Durchführung des Malachitgrün- Assays, Phosphat aus der Analyselösung entfernt werden. Dies lässt sich durch den Einsatz von kommerziell erhältlichen Phosphatbindern oder durch eine Eisenchlorid-Lösung realisieren (Fig. 5).
Ausführungsbeispiel 2: Spezifität des Nachweises von Glyphosat mittels funktionalisierter Oberfläche und Malachitgrün-Assay
Glyphosat ist ein Organophosphonat-Pestizid. Zur Bestimmung der Spezifität des Nachweises werden ein weiteres Organophosphonat-Pestizid (Glufosinat), ein Organophosphat-Pestizid (Chlorpyrifos) sowie das Hauptabbauprodukt von Glyphosat, a-Amino-3-hydroxy-5- methylisoxazol-4-propionsäure (AMPA), getestet (Fig. 6). Keine der drei getesteten Substanzen zeigte einen Einfluss auf die enzymatische Aktivität der EcEPSPS in einem Konzentrationsbereich zwischen 0 mM und 5 mM (Fig. 6A bis C). Damit bietet der erfindungsgemäße Assay ein hochspezifisches Detektionssystem für Glyphosat.
Zitierte Nichtpatentliteratur
Baykov AA, Evtushenko OA, Avaeva SM (1988)A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Anal Biochem. 171 (2), 266-270.
Sammons RD, Meyer J, Hall E, Ostrander E, Schräder S (2007) A simple continuous assay for EPSP Synthase in plant tissue. Cotton incorporated. Research programs from industry. Monsanto.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Detektion von Analyten in einer Probe umfassend die Schritte:
Bereitstellen einer Oberfläche mit einem immobilisierten Analytbindungspartner, wobei der Analytbindungspartner eine Affinität zur Interaktion mit einem zu detektierenden Analyten aufweist,
Kontaktieren des Analytbindungspartners mit einer Probe enthaltend den Analyten, wobei der Analyt mit dem Analytbindungspartner interagiert,
der Analytbindungspartner durch Interaktion mit dem Analyten gehemmt wird,
Kontaktieren des Analytbindungspartners mit einem Substrat, wobei das Substrat durch den Analytbindungspartners zu einem Produkt umgesetzt wird,
Quantifizierung des Produkts und
Korrelation des quantifizierten Produkts mit einer Referenzprobe,
wobei der Analyt Glyphosat ist,
wobei der Analytbindungspartner eine Proteindomäne umfasst, aufweisend die enzymatische Aktivität des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase.
2. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner als Fusionsprotein ausgebildet ist.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner eine Proteindomäne umfasst, ausgewählt aus Hydrophobinen, bevorzugt die Hydrophobin-Domäne Ccg2 mit der SEQ ID No.5
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner als Fusionsprotein mit der SEQ ID No. 6 ausgebildet ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert wird, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydrophobin im Bereich von 1 :2 bis 1 :10, bevorzugt zwischen 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt um 1 :5 liegt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Immobilisierung des Analytbindungspartners eine Mischung aus dem Fusionsprotein mit der SEQ ID No. 6 und der Hydrophobin-Domäne Ccg2 mit der SEQ ID No. 5 im Verhältnis 1 :2 bis 1 :10, bevorzugt zwischen 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt um 1 :5, ganz besonders bevorzugt 1 :5 erfolgt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Quantifizierung des Produkts durch optische Detektion des Produkts, bevorzugt photometrisch erfolgt
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Quantifizierung des Produkts mittels Malachitgrün-Assay erfolgt.
9. Oberfläche aufweisend einen Analytbindungspartner, wobei der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein, aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3- phosphat-Synthase-Domäne, ist.
10. Oberfläche nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert ist, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydrophobin im Bereich von 1 :2 bis 1 :10, bevorzugt zwischen 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt um 1 :5 liegt.
1 1. Oberfläche nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein ist, welches die SEQ ID No. 6 aufweist.
12. Kit zur Detektion von Analyten umfassend i. einen Analytbindungspartner aufweisend eine enzymatische Aktivität zur Umsetzung eines Substrats,
wobei der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin- Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne ist, sowie ii. ein Hydrophobin.
13. Kit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Kit ein Fusionsprotein mit der SEQ ID No. 6 sowie ein Hydrophobin mit der SEQ ID No. 5 umfasst.
14. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, einer Oberfläche nach einem der Ansprüche 9 bis 11 sowie eines Kits nach Anspruch 12 oder 13 zur Detektion von Analyten.
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