WO2020095864A1 - 多重遺伝子破壊アスペルギルス属微生物及びその製造方法 - Google Patents
多重遺伝子破壊アスペルギルス属微生物及びその製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2020095864A1 WO2020095864A1 PCT/JP2019/043173 JP2019043173W WO2020095864A1 WO 2020095864 A1 WO2020095864 A1 WO 2020095864A1 JP 2019043173 W JP2019043173 W JP 2019043173W WO 2020095864 A1 WO2020095864 A1 WO 2020095864A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- gene
- selectable marker
- marker gene
- aspergillus
- microorganism
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/102—Plasmid DNA for yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/66—Aspergillus
Definitions
- the present invention relates to a transformed Aspergillus microorganism in which at least two kinds of genes on a chromosome are destroyed, and a method for producing the same.
- Microorganisms of the genus Aspergillus are used as a koji mold used in a koji-making process, which is one of the processes for producing fermented foods such as soy sauce and miso, and are also used for producing various substances. Therefore, there is a demand for a technique of modifying a microorganism belonging to the genus Aspergillus so as to express a desired trait, for example, by destroying a target gene on the chromosome.
- a marker recycling method (also called a marker recycling method) is known as a method for destroying a target gene on the host chromosome.
- the selectable marker gene is removed so that the selectable marker gene does not remain on the transformant chromosome, and the selectable marker gene is regenerated. It is a method of using.
- the selectable marker gene used in the marker recycling method is required to have a system capable of easily confirming replacement with the selectable marker gene and removal of the selectable marker gene.
- the pyrG gene is used in Aspergillus microorganisms.
- a microorganism belonging to the genus Aspergillus can grow without adding uridine and / or uracil (hereinafter sometimes referred to as uridine / uracil) because it has the pyrG gene on the chromosome, but biosynthesis of uridine monophosphate is possible.
- An intermediate of orotidine metabolizes 5-fluoroorotic acid (5-FOA), which is an analog of 5'-monophosphate, to synthesize toxic 5-fluorouracil (5-FU). Therefore, an Aspergillus microorganism having the pyrG gene on its chromosome cannot grow even if it is cultured in the presence of 5-FOA.
- an Aspergillus microorganism having no pyrG gene on the chromosome cannot metabolize 5-FOA, and thus can grow even in the presence of 5-FOA, but becomes uridine / uracil auxotrophic.
- selectable marker gene that can be used in the marker recycling method, such as the pyrG gene, counter selection using the fact that the expression of that gene makes it impossible to grow in an environment containing a specific drug (5-FOA, etc.) It is required to be a selectable marker gene that can be used for In other words, if no drug that can be used for counter selection has been found, the selectable marker gene cannot be used in the marker recycling method.
- transformants in which a target gene on the chromosome of a pyrG gene-deficient Aspergillus microorganism was replaced with the pyrG gene were selected using a uridine / uracil-free medium, and then the selected transformants were treated with 5-
- a transformant deficient in the target gene and the pyrG gene can be obtained as a 5-FOA resistant strain.
- the selectable marker gene used in the marker recycling method for Aspergillus microorganisms at present, only the pyrG gene described above is used. Further, in the counter selection of the niaD-deficient strain using the drug and the counter selection of the sC-deficient strain, the background growth of the non-deficient strain is substantially observed because the selective pressure of the drug is weak, and therefore, substantially, At present, it is rarely used in the marker recycling method.
- Patent Document 1 (the entire description of which is incorporated herein by reference) describes a gene involved in tryptophan biosynthesis in a transformant using Rhizopus dermar as a host. It is described that the presence or absence of a trpC gene deficiency is evaluated by confirming the presence or absence of growth in the presence of 5-fluoroanthranilic acid (5-FAA). Further, the following Non-Patent Document 1 (the entire description of which is incorporated herein by reference) discloses a transformed Aspergillus deficient in the pyrG gene and the argB gene, which is the arginine biosynthesis gene, as selectable marker genes. Acreatas are listed.
- Non-patent document 2 (the entire description of which is incorporated herein by reference) describes that the trpC gene of Aspergillus niger was irreversibly deleted.
- Non-Patent Document 3 (the entire description of which is incorporated herein by reference) describes the use of counter-selection of the TRP1 marker gene in yeast ( Saccharomyces cerevisiae ) that is completely different from Aspergillus microorganisms. ..
- Patent Document 1 a trpC gene-deficient strain is selected based on the presence or absence of growth in the presence of 5-FAA.
- Patent Document 1 does not describe that the trpC gene can be used as a recyclable selection marker gene for use in the marker recycling method.
- the defective argB gene is not a selectable marker gene that can be used in the marker recycling method. Further, in Non-Patent Document 1, using another selectable marker gene instead of the argB gene, for example, using a specific selectable marker gene among genes involved in the biosynthesis of many amino acids, There is no description.
- Non-Patent Documents 2 and 3 also do not describe these matters.
- a gene corresponding to the TRP1 marker gene of yeast has not been found in Aspergillus microorganisms.
- a first problem to be solved by the present invention is to provide a transformed Aspergillus microorganism deficient in at least two types of selectable marker genes that can be used in the marker recycling method, and a method for producing the same.
- a second problem to be solved by the present invention is at least on a chromosome of a microorganism of the genus Aspergillus transformed by a marker recycling method using a composition containing at least two kinds of nucleic acid fragments containing a selectable marker gene. It is to provide a method for deleting two types of target genes.
- the inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above-mentioned problems, and have come to pay attention to genes involved in tryptophan biosynthesis among various genes expected to be available. Then, using a transformed Aspergillus genus microorganism deficient in this tryptophan biosynthesis gene as a host, a nucleic acid fragment containing a loop-out region and a tryptophan biosynthesis gene was introduced into the locus of the target gene, and growth in the absence of tryptophan. It was found that the substitution of the target gene with the tryptophan biosynthesis gene was confirmed by the above, and further that the removal of the tryptophan biosynthesis gene by loop-out could be confirmed by the growth in the presence of 5-FAA.
- the present inventors set the abundances of 5-FOA and 5-FAA to a predetermined concentration, and thereby caused a double disruption in which the tryptophan biosynthesis gene and the pyrG gene were deleted as selectable marker genes.
- the present inventor has produced and selected the above double disruption transformed Aspergillus microorganism, and further by using the double disruption transformed Aspergillus microorganism, We succeeded in efficiently deleting two kinds of target nucleic acids on the chromosome in a short time.
- the present invention has been completed based on such knowledge and successful examples.
- the following transformed Aspergillus microorganism, composition and method are provided.
- Selection marker genes available to at least two markers Recycling Law on the chromosome deficient, a transformed Aspergillus (Aspergillus) microorganisms, the selectable marker gene, the tryptophan biosynthetic gene and tryptophan biosynthesis The transformed Aspergillus microorganism containing a gene different from the gene.
- a composition for transforming a microorganism of the genus Aspergillus comprising at least two kinds of nucleic acid fragments containing a loop-out region and a selectable marker gene that can be used in the marker recycling method between the homologous recombination regions.
- the composition which comprises a nucleic acid fragment in which the selectable marker gene is a tryptophan biosynthesis gene and a nucleic acid fragment in which the selectable marker gene is a gene different from the tryptophan biosynthesis gene.
- the gene different from the tryptophan biosynthesis gene is a selectable marker gene selected from the group consisting of a uracil biosynthesis gene, a sulfate metabolism gene, and a nitrate metabolism gene, any one of [1] to [4]
- the tryptophan biosynthesis gene is the trpC gene, and the gene different from the tryptophan biosynthesis gene is at least one gene selected from the group consisting of the pyrG gene, the niaD gene, and the sC gene.
- the first selectable marker gene that can be used in the marker recycling method on the chromosome and the second selectable marker gene that can be used in the marker recycling method are deleted, including the following steps (1) to (3) A method for producing a transformed Aspergillus microorganism, wherein one of the first selectable marker gene and the second selectable marker gene is a tryptophan biosynthesis gene, and the other complements the requirement for a nutritional substance.
- a gene involved in the biosynthesis of a toxic substance from the analogue of the nutritional substance (1) Using a nucleic acid fragment containing a loop-out region and a first selectable marker gene between homologous recombination regions, a transformed Aspergillus microorganism lacking the first selectable marker gene on the chromosome Obtaining a transformed Aspergillus microorganism by homologous recombination targeting the second selectable marker gene; (2) The transformed Aspergillus microorganism obtained in the step (1) is cultured in the presence of a nutritional substance corresponding to the second selectable marker gene, so that the first selectable marker is present on the chromosome.
- the transformed Aspergillus genus microorganism selected in the step (2) is treated with a nutritional substance corresponding to the first selection marker gene, an analogue of the nutritional substance, and a nutrition corresponding to the second selection marker gene.
- a step of selecting a transformed Aspergillus microorganism deficient in the first selectable marker gene and the second selectable marker gene on the chromosome by culturing in the presence of a sex substance.
- Transformation using the first selection marker gene that can be used in the marker recycling method and the second selection marker gene that can be used in the marker recycling method including the following steps (A) and (B) A method for deleting two types of target genes on a chromosome of a microorganism belonging to the genus Aspergillus, wherein one of the first selectable marker gene and the second selectable marker gene is a tryptophan biosynthesis gene, and the other is a nutrient.
- a transformed Aspergillus microorganism deficient in a first selectable marker gene and a second selectable marker gene on a chromosome is provided with a loop-out region and a first selectable region between homologous recombination regions for a first target gene.
- the first target gene Using the second nucleic acid fragment containing the loop-out region and the second selectable marker gene between the first nucleic acid fragment containing the marker gene and the homologous recombination region for the second target gene, the first target gene And a step of obtaining a transformed Aspergillus microorganism by homologous recombination using the second target gene as a target; and (B) the transformed Aspergillus microorganism obtained in the step (A), Staining by culturing in the absence of a nutritional substance corresponding to a selectable marker gene and a nutritional substance corresponding to the second selectable marker gene
- the first selection marker gene and said second selection marker gene is the step of selecting transformed Aspergillus microorganism inserted above.
- the transformed Aspergillus microorganism selected in the step (B) corresponds to a nutritional substance corresponding to the first selection marker gene, an analog of the nutritional substance, and the second selection marker gene.
- the first selectable marker gene is a tryptophan biosynthesis gene
- the nutritional substance analog corresponding to the first selectable marker gene is 5-FAA
- the concentration of the 5-FAA is 0.
- the second selectable marker gene is the pyrG gene
- the nutritional substance analogue corresponding to the first selectable marker gene is 5-FOA
- the concentration of the 5-FOA is 0.05% (w / v) to 0.15% (w / v)
- Selection marker genes available to at least two markers Recycling Law on the chromosome deficient, a transformed Aspergillus (Aspergillus) microorganisms, said selection marker gene comprises a trpC gene and pyrG genes, the Transformed Aspergillus microorganism.
- a composition for transforming a microorganism of the genus Aspergillus which comprises at least two nucleic acid fragments containing a loop-out region and a selectable marker gene that can be used in the marker recycling method between the homologous recombination regions.
- the composition which comprises a nucleic acid fragment in which the selectable marker gene is the trpC gene and a nucleic acid fragment in which the selectable marker gene is the pyrG gene.
- the transformed Aspergillus microorganism is Aspergillus microorganisms other than the host organism Aspergillus Akureatasu (Aspergillus aculeatus), preferably the host organism is Aspergillus sojae (Aspergillus sojae), Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae), Aspergillus tamarii , Aspergillus luchuensis , Aspergillus usamii or any of Aspergillus usamii [101] or Aspergillus saiui ( Aspergillus ), or Aspergillus citei ( Aspergillus ).
- the first selectable marker gene that can be used in the marker recycling method on the chromosome and the second selectable marker gene that can be used in the marker recycling method are deleted, including the following steps (1) to (3) A method for producing a transformed Aspergillus microorganism, wherein one of the first selectable marker gene and the second selectable marker gene is a trpC gene and the other is a pyrG gene, which corresponds to the trpC gene.
- the nutritional substance is tryptophan
- the analog of tryptophan is 5-FAA
- the nutritional substance corresponding to the pyrG gene is uracil and / or uridine
- the analog of uracil and / or uridine is 5-FOA
- the transformed Aspergillus genus microorganism selected in the step (2) is treated with a nutritional substance corresponding to the first selection marker gene, an analogue of the nutritional substance, and a nutrition corresponding to the second selection marker gene.
- a step of selecting a transformed Aspergillus microorganism deficient in the first selectable marker gene and the second selectable marker gene on the chromosome by culturing in the presence of a sex substance.
- Transformation using the first selectable marker gene that can be used in the marker recycling method and the second selectable marker gene that can be used in the marker recycling method including the following steps (A) and (B) A method for deleting two types of target genes on a chromosome of an Aspergillus microorganism, wherein one of the first selectable marker gene and the second selectable marker gene is a trpC gene and the other is a pyrG gene.
- the trophC gene-corresponding trophic substance is tryptophan
- the tryptophan analogue is 5-FAA
- the pyrG gene-corresponding trophic substance is uracil and / or uridine
- the uracil and / or uridine analogue is The method, which is 5-FOA:
- a transformed Aspergillus microorganism deficient in a first selectable marker gene and a second selectable marker gene on a chromosome is provided with a loop-out region and a first selectable region between homologous recombination regions for a first target gene.
- the first target gene Using the second nucleic acid fragment containing the loop-out region and the second selectable marker gene between the first nucleic acid fragment containing the marker gene and the homologous recombination region for the second target gene, the first target gene And a step of obtaining a transformed Aspergillus microorganism by homologous recombination using the second target gene as a target; and (B) the transformed Aspergillus microorganism obtained in the step (A), Staining by culturing in the absence of a nutritional substance corresponding to a selectable marker gene and a nutritional substance corresponding to the second selectable marker gene
- the first selection marker gene and said second selection marker gene is the step of selecting transformed Aspergillus microorganism inserted above.
- the transformed Aspergillus microorganism selected in the step (B) corresponds to a nutritional substance corresponding to the first selection marker gene, an analog of the nutritional substance, and the second selection marker gene.
- the concentration of the 5-FAA is 0.005% (w / v) to 0.02% (w / v), and the concentration of the 5-FOA is 0.05% (w / v).
- the transformed Aspergillus microorganism is Aspergillus microorganisms other than the host organism Aspergillus Akureatasu (Aspergillus aculeatus), preferably the host organism is Aspergillus sojae (Aspergillus sojae), Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae), Aspergillus tamarii , Aspergillus luchuensis , Aspergillus usamii or any of Aspergillus usamii 104 or Aspergillus saiui ( Aspergillo ).
- Aspergillus sojae Aspergillus sojae
- Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae
- Aspergillus tamarii aspergillus luchuensis
- Aspergillus usamii or any of Aspergillus usamii 104 or Aspergillus saiui
- the transformed Aspergillus microorganism and method which is one aspect of the present invention, at least two kinds of target nucleic acids on the chromosome of the transformed Aspergillus microorganism are efficiently deleted in a short time by utilizing the marker recycling method. be able to.
- a transformed Aspergillus microorganism deficient in at least two types of selectable marker genes applicable to the marker recycling method can be produced.
- FIG. 1 is a diagram showing an outline of the tryptophan biosynthetic pathway of yeast.
- FIG. 2 is a diagram showing the outline of transformation of Aspergillus soya KP-del strain using an AstrpC disruption cassette as described in Examples described later.
- FIG. 3 is a diagram showing an outline of transformation of an AstrpC-disrupted strain using an Asparp1 disruption cassette, as described in Examples described later.
- FIG. 4A is a diagram showing the result of agarose gel electrophoresis for selection of Asparp1 disrupted strain, as described in Examples described later.
- FIG. 4B is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis for selection of Asparp1 disrupted strains, as described in Examples described later.
- FIG. 5 shows the outline of the selection procedure of a strain from which the trpC gene and the parp1 gene have been removed, in which the trpC gene introduced into the Asparp1 disrupted strain has been removed by loop-out, and 5-FAA resistance, as described in Examples described later. It is a figure which shows the appearance frequency of a strain.
- FIG. 6A is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis for selection of AstrpC-depleted strains, as described in Examples described later.
- FIG. 6B is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis for selection of AstrpC-depleted strains, as described in Examples described later.
- FIG. 6A is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis for selection of AstrpC-depleted strains, as described in Examples described later.
- FIG. 6B is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis for selection of Astrp
- FIG. 7 is a diagram showing the outline of transformation of an AotrpC-disrupted strain using an AohypG-disrupted cassette, as described in Examples described later.
- FIG. 8 is a diagram showing an outline of a procedure for selecting a strain from which the trpC gene and the hypG gene have been removed, in which the trpC gene introduced into the AohypG-disrupted strain has been removed by loop-out, as described in Examples described later. is there.
- FIG. 9A is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis for selection of AotrpC-depleted strains, as described in Examples described later.
- FIG. 9B is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis for selection of AotrpC-depleted strains, as described in Examples described later.
- FIG. 10 is a diagram showing an outline of a procedure for producing an AspyrG / AstrpC double disruption strain as described in Examples described later.
- FIG. 11 is a diagram showing an outline of the procedure from the production of the Asparp1 / Asnph double disruption strain to the production of the AspyrG / AstrpC double elimination strain, as described in Examples described later.
- FIG. 12 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis for selection of Asparp1 ⁇ Asnph double disruption strains, as described in Examples described later.
- FIG. 13A is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis for selection of AspyrG / AstrpC double-depleted strains, as described in Examples described later.
- FIG. 13B is a diagram showing the result of agarose gel electrophoresis for selection of AspyrG / AstrpC double-depleted strain, as described in Examples described later.
- FIG. 13C is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis for selection of AspyrG / AstrpC double-depleted strains, as described in Examples described later.
- gene defect means that a gene is not normally transcribed due to the deletion of part or all of the gene, and that the transcribed protein does not exert its original function. It means that the expression of the gene is blocked without functioning in In the present specification, a gene defect and a gene disruption are used synonymously.
- the “expression of a gene” means that a protein encoded by a gene is produced in a form having an original structure and activity through transcription, translation and the like.
- the “selection marker gene” is a gene that brings about a trait used as a means for selecting transformants, so that transformants can be specifically selected in the presence or absence of the corresponding selective substance. Or what makes it possible not to do so.
- the “function of the selectable marker gene” means that the transformant can be specifically selected in the presence or absence of the corresponding selective substance.
- the selectable marker gene is a drug resistance gene
- the function of the selectable marker gene allows the transformant to be specifically selected in the presence of the drug.
- the selectable marker gene is an auxotrophic gene, the function of the selectable marker gene is exerted, so that the transformant can be specifically selected in the absence of the nutritional substance.
- the “selectable marker gene that can be used in the marker recycling method” means that the expression of that gene makes it impossible to grow in an environment containing a specific drug, which can be used for counter selection. A selectable marker gene.
- the “homologous recombination region” is a nucleic acid homologous to a region on both sides (that is, upstream (5 ′ end side) and downstream (3 ′ end side)) of a target gene (target gene) on a chromosome. An array.
- the region upstream of the target gene is called “homologous recombination upstream region”
- the region downstream of the target gene is called “homologous recombination downstream region”.
- Loop-out refers to a phenomenon in which homologous nucleic acid sequences on the same chromosome recombine with each other, and the nucleic acid sequences between them fall out.
- the “loop-out region” is a region that enables loop-out, and refers to a region for removing a selectable marker gene to be introduced together with the loop-out region by loop-out.
- Biosynthetic gene means one or more genes that express a protein that functions in the biosynthetic pathway of a target substance, and, for example, an enzyme that catalyzes a reaction for converting into a target substance. Examples include genes that are expressed.
- Metal gene means one or more genes that express a protein that functions in the metabolic pathway of a target substance, and catalyzes a reaction for converting a target substance into another substance, for example. Examples include genes that express enzymes.
- Transformation Aspergillus (Aspergillus) microorganism which is one embodiment of the present invention, as two or selectable marker genes available more marker Recycling Law deficient in the chromosomal Aspergillus microorganism is a host organism , A microorganism of the genus Aspergillus transformed into a host organism.
- the composition according to one aspect of the present invention is used to destroy a target gene in a transformed Aspergillus microorganism according to one aspect of the present invention, wherein a loop-out region and a marker recycling method are provided between homologous recombination regions. And at least two or more nucleic acid fragments containing a selectable marker gene that can be used for
- one or more selectable marker genes that can be used in the marker recycling method is a tryptophan biosynthesis gene, and a selectable marker that can be used in the marker recycling method.
- Another one type or two or more types of genes are genes different from the tryptophan biosynthesis gene.
- FIG. 1 An outline of the yeast tryptophan biosynthetic pathway is shown in FIG.
- tryptophan biosynthesis includes TRP4 (anthranilate phosphoryloxysyltransferase), TRP1 (phosporibosylanthranylate isophylase anthracenase lysate verses), and TRP3 (indole-3-glycerate phosphonate).
- TRP4 anthranilate phosphoryloxysyltransferase
- TRP1 phosporibosylanthranylate isophylase anthracenase lysate verses
- TRP3 indole-3-glycerate phosphonate
- the gene encoding the enzyme corresponding to TRP5 was in the region of 1470936-1473260 of scaffold 00060, the region of 917953-920152 of scaffold 00036, the region of 350582-352846 of scaffold 00007 and the region of 662605-559898 of scaffold 00011. As described above, it was very difficult to predict that there are four genes encoding an enzyme corresponding to TRP5, and it was extremely difficult to destroy them all.
- Aspergillus soya NBRC4239 strain genes encoding enzymes corresponding to the respective enzymes of TRP1 and TRP3 were not found.
- the gene encoding the enzyme having the functions of TRP1 and TRP3 was predicted to be in the region 1213700-1211376 of scaffold 0408 (DF093577.1), and the region was named AsstrC gene.
- Aspergillus soja it succeeded in obtaining a transformed Aspergillus genus microorganism that is unable to biosynthesize tryptophan from anthranilic acid by destroying the AstrpC gene.
- the tryptophan biosynthesis gene as a selectable marker gene that can be used in the marker recycling method is preferably a gene encoding an enzyme having the functions of yeast TRP1 and TRP3, that is, the trpC gene, It may be a gene encoding an enzyme corresponding to yeast TRP4, TRP5 or TRP2.
- the tryptophan biosynthesis gene any one of the above genes may be used alone or in combination of two or more.
- the gene different from the tryptophan biosynthetic gene is not particularly limited as long as it is a selectable marker gene that can be used in a marker recycling method different from the tryptophan biosynthetic gene, and examples thereof include a drug resistance gene and an auxotrophic gene.
- the auxotrophic gene is not particularly limited as long as it is a gene that complements the auxotrophy of the host organism, and examples thereof include the pyrG gene, niaD gene, and sC gene.
- the gene different from the tryptophan biosynthesis gene one of the above-mentioned genes may be used alone, or two or more thereof may be used in combination. It should be noted that the siaD gene-deficient strain is resistant to chlorate, and the sC gene-deficient strain is resistant to selenate.
- the pyrG gene, trpC gene, niaD gene, and sC gene are registered in NCBI GenBank ([URL] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) for each origin organism.
- Table 1 shows the accession numbers of GenBank of pyrG gene, trpC gene, niaD gene and sC gene of Aspergillus soja, Aspergillus oryzae and Aspergillus niger.
- Aspergillus soja the scaffold on the chromosome is shown.
- Those skilled in the art can obtain the nucleotide sequences of these genes of Aspergillus microorganisms by referring to NCBI GenBank.
- the version of scaffold 00028 from Aspergillus soya is DF093570.1
- the version of scaffold00009 from Aspergillus soya is DF093562.1.
- the gene different from the tryptophan biosynthesis gene is preferably an auxotrophic gene from the viewpoint of easy selection of transformants.
- the auxotrophic genes include biosynthetic genes and metabolic genes.
- a gene that complements the auxotrophy of the auxotrophic substance and is involved in the biosynthesis of the toxic substance from the analogue of the auxotrophic substance is more preferable, and the uracil biosynthesis gene, sulfate Metabolism genes and nitrate metabolism genes are more preferred, pyrG genes, niaD genes and sC genes are even more preferred.
- the selectable marker gene that can be used in the marker recycling method does not have to be completely the same as the gene originally possessed by the origin organism that has the selectable marker gene that can be used in the marker recycling method (ie, the wild-type gene), and at least the wild-type gene As long as the gene expresses a protein having the same or similar enzymatic properties as the protein expressed by the gene (that is, wild-type protein), it is stringent with the base sequence complementary to the base sequence of the wild-type gene. It may be a DNA having a base sequence that hybridizes under the conditions.
- the "base sequence that hybridizes under stringent conditions” means that a DNA having a base sequence of a wild-type gene is used as a probe, and a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method are used. Means the base sequence of DNA obtained by using
- the "stringent conditions" in the present specification are conditions under which a signal of a specific hybrid is clearly distinguished from a signal of a non-specific hybrid, and the hybridization system used, the type of probe, and the sequence. And depends on the length. Such conditions can be determined by changing the temperature of hybridization, the temperature of washing and the salt concentration. For example, when a nonspecific hybrid signal is strongly detected, the specificity can be increased by raising the temperature of hybridization and washing and, if necessary, lowering the salt concentration of washing. Further, when no specific hybrid signal is detected, the hybrid can be stabilized by lowering the temperature of hybridization and washing and, if necessary, increasing the salt concentration of washing.
- stringent conditions include, for example, a DNA probe as a probe, hybridization is 5 ⁇ SSC, 1.0% (w / v) blocking reagent for nucleic acid hybridization (Roche Diagnostics) , 0.1% (w / v) N-lauroyl sarcosine, 0.02% (w / v) SDS, overnight (about 8 to 16 hours). Washing is performed using 0.1 to 0.5 ⁇ SSC, 0.1% (w / v) SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0.1% (w / v) SDS for 15 minutes twice. To do.
- the temperature for hybridization and washing is 65 ° C or higher, preferably 68 ° C or higher.
- DNA having a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions for example, a DNA having a nucleotide sequence of a wild-type gene derived from a colony or plaque or a filter on which a fragment of the DNA is immobilized is used, and After carrying out hybridization at 40 to 75 ° C. in the presence of DNA obtained by hybridization under the above stringent conditions or 0.5 to 2.0 M NaCl, preferably 0.7 to 1. After hybridization at 65 ° C in the presence of 0M NaCl, 0.1 to 1xSSC solution (1xSSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate) is used at 65 ° C. Examples thereof include DNA that can be identified by washing the filter.
- Examples of the DNA containing a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions include a DNA having a certain degree of sequence identity with the nucleotide sequence of the DNA having the nucleotide sequence of the wild-type gene used as a probe. 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more with the nucleotide sequence of the type gene DNA having a sequence identity of 98% or more, or 99% or more, and more preferably 99.5% or more.
- the upper limit of the sequence identity is not particularly limited and is typically 100%.
- the base sequence that hybridizes with the base sequence complementary to the base sequence of the wild-type gene under stringent conditions is, for example, in the base sequence of the wild-type gene, if 100 bases in the base sequence is one unit. , 1 to several, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 15, and even more preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 per unit. It includes base sequences having base deletions, substitutions, additions, and the like.
- base deletion means that there is a deletion or disappearance of the base in the sequence
- substitution of the base means that the base in the sequence is replaced by another base
- "Addition of base” means that a new base is added so as to be inserted.
- a protein encoded by a base sequence that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence of the wild-type gene under stringent conditions is 1 to several in the amino acid sequence of the protein encoded by the base sequence of the wild-type gene. Although it is probable that the protein has an amino acid sequence having deletion, substitution, addition, etc. of individual amino acids, it has the same enzymatic activity as the protein encoded by the nucleotide sequence of the wild-type gene.
- a protein having the same or similar enzymatic properties as the wild-type protein has an amino acid sequence having a deletion, substitution, addition, etc. of 1 to several amino acids in the amino acid sequence of the wild-type protein. It may consist of Here, the range of "1 to several" in “deletion, substitution, addition of 1 to several amino acids” of the amino acid sequence is not particularly limited, but, for example, 100 amino acids in the amino acid sequence is one unit. For example, about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 units per unit, preferably Means about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 and more preferably about 1, 2, 3, 4 or 5.
- deletion of amino acid means deletion or deletion of amino acid residue in the sequence
- substitution of amino acid means that amino acid residue in the sequence is replaced with another amino acid residue.
- addition of amino acids means that new amino acid residues are added so as to be inserted into the sequence.
- a specific embodiment of "deletion, substitution, addition of 1 to several amino acids” is an embodiment in which 1 to several amino acids are replaced with another chemically similar amino acid.
- a case where a certain hydrophobic amino acid is substituted with another hydrophobic amino acid a case where a certain polar amino acid is substituted with another polar amino acid having the same charge, and the like can be mentioned.
- Such chemically similar amino acids are known in the art for each amino acid.
- Specific examples include non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine and methionine.
- Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine and cysteine.
- Examples of the basic amino acid having a positive charge include arginine, histidine, lysine and the like.
- Examples of the acidic amino acid having a negative charge include aspartic acid and glutamic acid.
- amino acid sequence having a deletion, substitution, addition, etc. of 1 to several amino acids in the amino acid sequence of the wild-type protein include amino acid sequences having a certain degree of sequence identity with the amino acid sequence of the wild-type protein. , 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% with the amino acid sequence of the wild-type protein
- an amino acid sequence having a sequence identity of 97% or more, 98% or more, or 99% or more, and more preferably 99.5% or more can be mentioned.
- the upper limit of the sequence identity is not particularly limited and is typically 100%.
- the method for determining the sequence identity of the base sequence or the amino acid sequence is not particularly limited, but, for example, using a commonly known method, the amino acid sequence of the wild-type gene or the wild-type protein expressed by the wild-type gene and the target base can be used. It can be determined by aligning a sequence or an amino acid sequence and using a program for calculating the concordance rate of both sequences.
- Each of the above-mentioned methods can be generally used to search a sequence showing sequence identity in a database, but as a means for determining the sequence identity of individual sequences, Genetyx network version version 12.0. Homology analysis of No. 1 (Genetics) can also be used. This method is based on the Lipman-Pearson method (Science 227: 1435-1441, 1985; the entire description of which is incorporated herein by reference). When analyzing the sequence identity of nucleotide sequences, a protein coding region (CDS or ORF) is used if possible.
- CDS protein coding region
- the selectable marker gene that can be used in the marker recycling method is derived from, for example, an organism species whose expression as a selectable marker gene that can be used in the marker recycling method or a function as a selectable marker gene that can be used in the marker recycling method can be confirmed.
- the selectable marker gene-derived organism that can be used in the marker recycling method is, for example, a microorganism, and preferably an Aspergillus microorganism that is the same as or closely related to the host organism.
- Aspergillus microorganisms Aspergillus sojae (Aspergillus sojae), Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae), Aspergillus niger (Aspergillus niger), Aspergillus tamari (Aspergillus tamarii), Aspergillus Ruchuenshisu (Aspergillus luchuensis), Aspergillus Usami (Aspergillus usamii), Aspergillus Akureatasu (Aspergillus aculeatus), Aspergillus saitoi (Aspergillus saitoi), Aspergillus nidulans (Aspergillus nidulans) is like .
- Aspergillus microorganisms Aspergillus soja, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus tamari, Aspergillus rutuensis, Aspergillus usami, Aspergillus acreatas and Aspergillus cytoii, miso, soy sauce.
- Aspergillus microorganisms Aspergillus soja, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus tamari, Aspergillus rutuensis, Aspergillus usami, Aspergillus acreatas and Aspergillus cytoii, miso, soy sauce. Due to their high enzyme productivity and high reliability due to their long-term use, they are used industrially. It is a possible microorganism.
- a selectable marker gene that can be used in the marker recycling method is introduced into a host organism and transformed to express a selectable marker gene protein that can be used in the marker recycling method, and the transformant expresses a phenotypic character different from that of the host organism. Comes to present. Therefore, the selectable marker gene protein that can be used in the marker recycling method expressed in the transformant is not inactivated by the growth conditions of the host organism and can be used in the marker recycling method in order to exert the selectable marker function.
- the organism from which the selectable marker gene is derived is preferably an Aspergillus microorganism whose growth conditions are similar to those of the host organism to be transformed.
- the host organism is particularly limited as long as it has a selectable marker gene that can be used in the marker recycling method on the chromosome and is deficient in the selectable marker gene so that the function of the selectable marker gene can be exerted. Not done.
- Aspergillus microorganisms are preferably Aspergillus microorganisms other than Aspergillus acreatas, and if safety and easiness of culture are added, Aspergillus soja, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus tamari, Aspergillus More preferably, it is a microorganism of the genus Aspergillus such as Luthuensis, Aspergillus usami, Aspergillus cytoii, Aspergillus nidulans.
- the host organism may be a wild strain or a transformant obtained by transforming the wild strain in advance.
- the transformant which is used as a host organism and is obtained by transforming a wild strain in advance, is not particularly limited.
- Aspergillus microorganisms tend to have a low frequency of homologous recombination, when producing a transformant by homologous recombination, ku encoding proteins such as Ku70 and Ku80 involved in the non-homologous recombination mechanism is used. It is preferable to use a transformed Aspergillus microorganism in which the gene is suppressed.
- Such suppression of the ku gene can be carried out by any method known to those skilled in the art.
- a ku gene disruption vector can be used to disrupt the ku gene, or an antisense expression vector for the ku gene.
- the transformed Aspergillus microorganism thus obtained has a significantly increased frequency of homologous recombination as compared to the original Aspergillus microorganism before being genetically manipulated to suppress the ku gene. Specifically, it is increased at least 2-fold, preferably at least 5-fold, preferably at least 10-fold, preferably at least about 50-fold.
- One embodiment of the transformant is that the host organism is Aspergillus soja, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus tamari, Aspergillus rutuensis, Aspergillus usami or Aspergillus cytoii, and the trpC gene on the chromosome. It is a transformed Aspergillus microorganism lacking a gene, but is not limited thereto.
- a method for producing a transformed Aspergillus microorganism deficient in a selectable marker gene that can be used in the marker recycling method is not particularly limited, and for example, a selectable marker gene that can be used in the marker recycling method on the chromosome of the host organism according to a conventional method. Can be deleted or a foreign nucleic acid fragment can be inserted or substituted at the gene locus of the selectable marker gene to delete the selectable marker gene that can be used in the marker recycling method.
- the step is preferably carried out by utilizing homologous recombination.
- a foreign nucleic acid fragment is constructed to be ligated between the homologous recombination region homologous to the upstream region and the downstream region of the selectable marker gene that can be used in the marker recycling method on the chromosome.
- Examples of such a method include introducing the nucleic acid fragment into a host organism, and substituting a foreign nucleic acid fragment for a selectable marker gene that can be used in the marker recycling method on the chromosome by homologous recombination.
- a nucleic acid fragment produced to transform a host organism may be referred to as a transformation cassette.
- the foreign nucleic acid fragment is preferably a selectable marker gene that can be used in a marker recycling method different from a selectable marker gene that can be used in a marker recycling method to be deleted.
- the transformation cassette preferably contains a loop-out region.
- a transformation cassette containing a loop-out region and a foreign nucleic acid fragment if a region having the same sequence as the loop-out region is located upstream or downstream of the site on the chromosome of the host organism that can be introduced by homologous recombination, the homology After the transformation cassette is introduced into the chromosome of the host organism by recombination, homologous recombination occurs between the loop-out region upstream or downstream of the loop-out region and a region homologous to the introduced foreign body.
- Nucleic acid fragments can be removed by looping out. By taking such means, it is possible to obtain a transformant in which the foreign nucleic acid fragment is removed after introducing the foreign nucleic acid fragment into the locus of the selectable marker gene.
- the transformation cassette is, for example, a nucleic acid fragment containing a loop-out region and a foreign nucleic acid fragment between homologous recombination regions.
- the nucleic acid fragment is a polymerase chain reaction (hereinafter referred to as "PCR") of DNA fragments of the homologous recombination upstream region, the loop-out region and the homologous recombination downstream region according to a conventional method using the chromosomal DNA of Aspergillus microorganism as a template.
- PCR polymerase chain reaction
- the homologous recombination upstream region, the loop-out region, the foreign nucleic acid (DNA) fragment, and the homologous recombination downstream region are ligated in this order to the In-Fusion Cloning Site at the multi-cloning site of the plasmid pUC19. It can be obtained by preparing a plasmid and then amplifying the obtained plasmid for construct using the template DNA as a template by PCR.
- the method for extracting the chromosomal DNA is not particularly limited, but, for example, culturing a microorganism of the genus Aspergillus, removing water from the obtained microbial cells, and physically grinding it using a mortar or the like while cooling in liquid nitrogen. A finer powdery microbial cell piece is prepared, and the chromosomal DNA fraction is extracted from the microbial cell piece by an ordinary method.
- a commercially available chromosomal DNA extraction kit such as DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) can be used.
- a method for transforming a microorganism of the genus Aspergillus a method known to those skilled in the art can be appropriately selected. For example, after preparing protoplasts of a host organism, a protoplast PEG method using polyethylene glycol and calcium chloride (for example, Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989, JP 2007-222055 A, etc .; the entire description of the document is incorporated herein by reference.
- a medium for regenerating an Aspergillus microorganism an appropriate medium is used depending on the host organism used, the selectable marker gene to be deleted, and the introduced foreign nucleic acid fragment. For example, when Aspergillus sojae is used as the host organism and a drug resistance gene is used as the foreign nucleic acid fragment, regeneration of the transformant can be performed using, for example, a minimal agar medium containing the corresponding drug.
- a transformed Aspergillus microorganism was produced by extracting chromosomal DNA from the transformant, performing PCR using this as a template, and producing a PCR product that can be amplified when transformation occurs. You may check by checking.
- a forward primer complementary to a region located upstream of the homologous recombination upstream region incorporated in the transformation cassette and a region complementary to a region located further downstream than the homologous recombination downstream region incorporated in the transformation cassette. It is preferable to perform PCR in combination with a specific reverse primer to confirm that a product of the expected length is produced when homologous recombination occurs.
- the selectable marker genes that can be used in the marker recycling method are the trpC gene and the pyrG gene
- the transformed Aspergillus microorganism lacking the pyrG gene is used as the host organism, and the loop-out region and the pyrG gene are inserted between the homologous recombination regions.
- the transformed Aspergillus microorganism deficient in trpC gene and pyrG gene is obtained by transforming the trpC gene so as to be deficient in the trpC gene and removing the introduced pyrG gene by loop-out.
- As a transformed Aspergillus microorganism deficient in the pyrG gene for example, the Aspergillus soya KP-del strain described in Example 2 of Japanese Patent No. 6261039 (the entire description of which is incorporated herein by reference). And so on.
- a specific example of the method for producing a transformed Aspergillus microorganism is the method described in Example 2 of Japanese Patent No. 6261039, but is not limited thereto. According to this method, a strain in which the auxotrophic gene is inactivated by natural mutation is obtained from a wild strain of Aspergillus microorganism.
- the auxotrophic gene may or may not be a selectable marker gene that can be used in the marker recycling method to be deleted.
- the auxotrophic gene is a selectable marker gene that can be used in the marker recycling method to be deleted
- the auxotrophic gene is a selectable marker gene that can be used in the marker recycling method to be deleted
- the auxotrophic gene is deleted, Then, the auxotrophic gene is removed by loop-out to obtain a transformed Aspergillus microorganism deficient in the selectable marker gene that can be used for the two types of marker recycling method on the chromosome.
- the auxotrophic gene is not a selectable marker gene that can be used in the marker recycling method to be deleted
- the auxotrophic gene is a gene of a selectable marker gene that can be used in a marker recycling method different from the tryptophan biosynthesis gene.
- Introducing a tryptophan biosynthesis gene by introducing it into the gene locus, and then removing a selectable marker gene that can be used for a marker recycling method different from the introduced tryptophan biosynthesis gene by looping out.
- Ri two selectable marker genes available marker Recycling Law on the chromosome deficient, can be obtained transformant Aspergillus microorganism.
- the auxotrophic gene into the locus of the tryptophan biosynthesis gene, the tryptophan biosynthesis gene is deleted, and then the tryptophan biosynthesis gene can be used for a marker recycling method different from the tryptophan biosynthesis gene.
- the selectable marker gene that can be used in a marker recycling method different from the tryptophan biosynthetic gene is deleted, and then the introduced tryptophan biosynthetic gene is removed by loopout, A transformed Aspergillus microorganism deficient in a selectable marker gene that can be used for two types of marker recycling methods on a chromosome can be obtained.
- Another aspect of the present invention is a method for producing a transformed Aspergillus microorganism according to one aspect of the present invention.
- the manufacturing method of one embodiment of the present invention includes at least the following steps. However, in the following steps, one of the first selection marker gene and the second selection marker gene that can be used in the marker recycling method is a tryptophan biosynthesis gene, and the other one complements the requirement for a nutritional substance. And a gene involved in the biosynthesis of a toxic substance from the analogue of the nutritional substance.
- a nucleic acid fragment containing a loop-out region and a first selectable marker gene between homologous recombination regions in a transformed Aspergillus microorganism lacking the first selectable marker gene that can be used in the marker recycling method on a chromosome Step (2) to obtain a transformed Aspergillus microorganism by targeting a second selectable marker gene that can be used in the marker recycling method on the chromosome by using By culturing a transformed Aspergillus microorganism in the presence of a nutritional substance corresponding to the second selectable marker gene, the first selectable marker gene is inserted on the chromosome, and the second selectable marker gene on the chromosome is inserted.
- Two or more target genes on the chromosome of the transformed Aspergillus microorganism can be deleted simultaneously or stepwise.
- Another aspect of the present invention is a method for deleting two types of target genes on a chromosome of a transformed Aspergillus microorganism of one aspect of the present invention.
- the method for deleting a target gene according to one aspect of the present invention includes at least the following steps (A) and (B).
- one of the first selection marker gene and the second selection marker gene that can be used in the marker recycling method is a tryptophan biosynthesis gene, and the other one complements the requirement for a nutritional substance.
- a gene involved in the biosynthesis of a toxic substance from the analogue of the nutritional substance is a gene involved in the biosynthesis of a toxic substance from the analogue of the nutritional substance.
- the method for deleting a target gene preferably further includes the following step (C):
- the transformed Aspergillus microorganism selected in the step (B) corresponds to a nutritional substance corresponding to the first selection marker gene, an analog of the nutritional substance, and the second selection marker gene.
- a first nucleic acid fragment for the first target gene, a first selectable marker usable in the marker recycling method is carried out using a nutritional substance corresponding to a gene, an analog of the nutritional substance, and a nutritional substance corresponding to a second selectable marker gene that can be used in the marker recycling method. And then using the second nucleic acid fragment for the second target gene, the nutritional substance corresponding to the second selection marker gene and an analog of the nutritional substance, and the nutritional substance corresponding to the first selection marker gene. Then, the above steps (A) to (C) may be performed.
- step (C) can be performed stepwise by dividing it into a step of removing the first selection marker gene and a step of removing the second selection marker gene.
- step (C) can be performed stepwise by dividing it into a step of removing the first selection marker gene and a step of removing the second selection marker gene.
- the first selectable marker gene that can be used in the marker recycling method is the pyrG gene, and Of the nutritional substance corresponding to the first selection marker gene is uracil / uridine, and the analogue of the nutritional substance corresponding to the first selection marker gene is 5-FOA.
- the gene is the trpC gene, the trophic substance corresponding to the second selectable marker gene is tryptophan, and the analogue of the trophic substance corresponding to the second selectable marker gene is 5-FAA.
- the first selectable marker gene that can be used in the marker recycling method is the trpC gene
- the trophic substance corresponding to the first selectable marker gene is tryptophan
- the analogue of the trophic substance corresponding to the first selectable marker gene is 5-FAA
- the second selectable marker usable in the marker recycling method is the pyrG gene
- the trophic substance corresponding to the second selectable marker gene is uracil / uridine
- the analogue of the trophic substance corresponding to the second selectable marker gene is 5-FOA.
- the concentrations of 5-FAA and 5-FOA used in the selection of a strain resistant to 5-FAA, a strain resistant to 5-FOA, and a strain resistant to 5-FAA and 5-FOA is preferably lower than when they are used alone.
- concentration of 5-FAA and 5-FOA used in the selection of strains resistant to 5-FAA and 5-FOA is preferably lower than when they are used alone.
- the target gene in the method for deleting a target gene according to one embodiment of the present invention is not particularly limited and may be appropriately set according to the purpose of research or investigation.
- the target genes are parp1 gene and nph gene, and a double disruption strain in which these genes are disrupted can be obtained.
- a gene that can be used in two types of marker recycling methods cannot be achieved only by using a gene that can be used in one type of marker recycling method. It becomes possible by using it. For example, using a transformed Aspergillus microorganism lacking the pyrG gene and the trpC gene, the trpC gene is introduced into the locus of the ku gene to prepare a ku-disrupted strain.
- nucleic acid fragment containing the trpC gene between the homologous recombination regions can be used, but also two kinds of nucleic acid in a form in which the fragment is divided so as to partially overlap each other in the middle of the trpC gene. It is also possible to prepare and mix the fragments and use them for ku gene disruption. Then, after introducing and removing the pyrG gene at the locus of the protease gene as a target gene, and repeating the introduction and removal of the pyrG gene at another protease locus as necessary, the introduced trpC gene was removed. Restore the ku gene.
- the primers used in this example are shown in Tables 2A and 2B.
- the sequences in lower case represent additional sequences for connecting to adjacent fragments.
- Example 1 Use of trpC gene as a selectable marker gene applicable to the marker recycling method in Aspergillus soja] 1.
- the cells were collected from the obtained culture broth by filtration, sandwiched between paper towels to remove water, and pulverized while cooling with liquid nitrogen using a mortar and pestle previously cooled with liquid nitrogen. Chromosomal DNA was extracted from the obtained crushed cells using DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen).
- Plasmid pUC19 was transformed with upstream region 1 for homologous recombination (As upstream region 1), pyrG gene which is a transformation marker complementing uridine / uracil auxotrophy, and A construct plasmid in which the downstream region 1 (As downstream region 1) for homologous recombination was ligated in order was prepared as follows.
- Primers used for amplifying As upstream region 1, AspyrG gene and As downstream region 1 are SEQ ID NOs: 1 to 6.
- the amplified DNA fragment was purified using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen).
- pUC19 As pUC19, pUC19 linearized Vector attached to In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) was used. 3 types of DNA fragments amplified at In-Fusion Cloning Site at the multi-cloning site of pUC19 are ligated using the above-mentioned In-Fusion HD Cloning Kit according to the protocol attached to the kit, and for constructing A plasmid was obtained.
- the obtained transformed Escherichia coli was shake-cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin. After culturing, the culture solution was centrifuged to collect bacterial cells. Plasmid DNA was extracted from the obtained bacterial cells by using FastGene Plasmamid Mini Kit (Nippon Genetics Co., Ltd.) according to the protocol attached to the kit.
- a plasmid was obtained in which the sequences of As upstream region 1-AspyrG-As downstream region 1 were sequentially linked to the multi-cloning site of pUC19.
- the resulting plasmid was designated as pTrpC_HR.
- an AstrpC disruption cassette was obtained in which the sequences of As upstream region 1-AspyrG-As downstream region 1 were linked in order.
- the pyrG gene was introduced into the locus of the trpC gene on the chromosome of the Aspergillus soya KP-del strain, and the trpC gene was deleted. And the AstrpC disrupted strain having the pyrG gene was prepared.
- the uracil auxotrophy of the host is complemented by the AspyrG gene inserted at the position of the AstrpC gene, and instead, tryptophan is auxotrophic.
- the selected AstrpC disrupted strain was subjected to PCR and restriction enzyme digestion of the PCR product to confirm that the AstrpC disrupted cassette was introduced by homologous recombination.
- the primers used are SEQ ID NOS: 13-14.
- the AstrpC disrupted strain produced a 5.7 kb PCR product, which was digested with KpnI to yield 2.4 kb, 2.1 kb and 1.2 kb fragments.
- a PCR product of 6.4 kb was produced, and by digesting this with KpnI, fragments of 3.5 kb and 2.9 kb were produced.
- Gene disruption using AstrpC marker gene (2-1) Gene for disruption As a gene for disruption, a region of 3347080-3344733 of scaffold00063 (DF093585.1) from the public genome database (BioProject Accession: PRJDA60265) of Aspergillus soya NBRC4239 strain. It was decided to target the gene of poly (ADP-ribose) polymerase predicted by the above. The gene was named Asparp1 gene.
- (2-2) Preparation of a plasmid containing a cassette for destroying Asparp1
- the plasmid pUC19 was constructed with an upstream region 2 (As upstream region 2) for looping out and a loop-out.
- a plasmid pPARP1_LO_Trp was prepared by sequentially ligating a region 1 for As (out loop region 1), an AstrpC gene and a downstream region 2 for homologous recombination (As downstream region 2).
- the primers used are SEQ ID NOs: 15-22.
- an Asparp1 disruption cassette was obtained in which the sequences of As upstream region 2-As loop-out region 1-AsstrpC-As downstream region 2 were linked in order.
- FIG. 3 by transforming with the Asparp1 disruption cassette, the trpC gene was introduced into the parp1 gene locus on the chromosome of the AstrpC disruptant strain, and the parp1 gene was deleted, and A transformed Aspergillus soyaa carrying the trpC gene was prepared.
- the transformed Aspergillus soja in which Asparp1 has been disrupted has the tryptophan requirement of the host complemented by the AstpC gene inserted at the position of the Asparp1 gene.
- the primers used are SEQ ID NOs: 29 to 30.
- FIG. 4B The result of agarose gel electrophoresis is shown in FIG. 4B.
- transformants 2 and 7 produced a PCR product of 9.6 kb.
- a PCR product of 5.3 kb was generated.
- the transformants 2 and 7 (PARP_2 and PARP_7, respectively) were made Asparp1 disrupted strains.
- FIG. 5 shows the number of conidia of the smeared PARP_2 and PARP_7, the number of resistant strains that appeared, and the frequency of appearance of resistant strains calculated from them.
- the loop-out resulted in a 3.0 kb PCR product, as expected.
- a 9.6 kb PCR product is generated.
- Example 2 Use of trpC gene as a selectable marker gene that can be used in the marker recycling method in Aspergillus oryzae] 1.
- Preparation of AotrpC-disrupted strain In the same manner as in Example 1, using the chromosomal DNA of Aspergillus oryzae RIB40 strain as a template, the upstream region 1 (Ao upstream region 1) for homologous recombination and the downstream region 1 (for homologous recombination) After obtaining the DNA fragment of the Ao downstream region 1), a construct plasmid pAoTrpC_HR was constructed in which the Ao upstream region 1, the AspyrG gene and the Ao downstream region 1 were sequentially ligated to the plasmid pUC19.
- the primers used are SEQ ID NOs: 31 to 34.
- the AotrpC disruption cassette was amplified.
- the primers used are SEQ ID NOs: 35 to 36.
- an AotrpC disruption cassette was obtained in which the sequences of Ao upstream region 1-AspyrG-Ao downstream region 1 were linked in order.
- Aspergillus oryzae RkuN16ptr1 strain Aspergillus oryzae RkuN16ptr1 strain (Mol. Genet. Genomics, 275: 460, 2006, Biosci. Biotechnol. Biochem, 70: 135 as described in Japanese Patent No. 5704609. , 2006; the entire description of the document is incorporated herein by reference.
- the pyrG gene and the ku70 gene are disrupted.
- Transformed Aspergillus oryzae in which AotrpC is disrupted is complemented with uracil / uridine auxotrophy of the host by the AspyrG gene inserted at the position of the AotrpC gene, and instead becomes tryptophan auxotrophic.
- a strain in which the AotrpC gene was disrupted was selected by confirming by PCR using the chromosomal DNA of transformed Aspergillus oryzae as a template.
- the primers used are SEQ ID NOS: 9-10 and 37-38.
- the selected AotrpC-disrupted strain was subjected to PCR and restriction enzyme digestion of the PCR product, thereby confirming that the AotrpC-disrupted cassette was introduced by homologous recombination.
- the primers used are SEQ ID NOS: 14 and 39.
- the AotrpC-disrupted strain produced a 5.7 kb PCR product, which was digested with KpnI to yield 2.5 kb, 2.1 kb and 1.2 kb fragments.
- a PCR product of 6.3 kb was generated, and by digesting this with KpnI, fragments of 3.5 kb and 2.8 kb were generated.
- the AotrpC-disrupted strain which was confirmed to have the AotrpC disruption cassette introduced by homologous recombination, was inoculated on a plate of Czapek-Dox minimal agar medium containing or not containing 1 mM tryptophan, respectively, at 30 ° C. for 5 days. It was incubated and confirmed to grow only in a medium containing tryptophan.
- the AotrpC-disrupted strain and the Aspergillus oryzae RIB40 strain as a control were inoculated on a plate of Sabouraud dextrose agar medium (BD) containing 0.12% (w / v) 5-FAA and 1 mM tryptophan, and kept at 30 ° C for 4 days. Incubated. The RIB40 strain did not grow at all, whereas the AotrpC-disrupted strain grew. This confirmed that the AotrpC-disrupted strain was resistant to 5-FAA.
- BD Sabouraud dextrose agar medium
- AohypG As a gene for gene disruption using the AotrpC marker gene, a predicted gene of unknown function in the region of 1456616-1457378 of SC102 was used from the public genome database of Aspergillus oryzae RIB40 strain (BioProject Accession: PRJNA20809). The gene was named AohypG.
- the upstream region 2 (Ao upstream region 2) for homologous recombination, the AotrpC gene, and the region for loopout (Ao loopout region 1 ) And a DNA fragment of the downstream region 2 (Ao downstream region 2) for homologous recombination are obtained, and then Ao upstream region 2, AotrpC gene, Ao loop-out region 1 and Ao downstream region 2 are sequentially ligated to the plasmid pUC19.
- the constructed plasmid pAoHypG_LO_TrpC for construct was prepared.
- the primers used are SEQ ID NOS: 20 and 40-46.
- an AohypG disruption cassette was obtained in which the sequences of Ao upstream region 2-AotrpC-Ao loop-out region 1-Ao downstream region 2 were sequentially linked.
- the AohypG disrupted strain was prepared by the following procedure.
- the outline of transformation of the AotrpC-disrupted strain using the AohypG disruption cassette is shown in FIG. 7.
- the trpC gene was introduced into the locus of the hypG gene on the chromosome of the AotrpC disruptant strain, and the hypG gene was deleted, and A transformed Aspergillus oryzae having the trpC gene was prepared.
- the tryptophan auxotrophy of the host is complemented by the AotrpC gene inserted at the position of the AohypG gene.
- Example 2 In the same manner as in Example 1, a strain in which the AohypG gene was disrupted was selected by extracting chromosomal DNA from the transformant and confirming by PCR.
- the primers used are those of SEQ ID NOs: 37-38 and 49-50.
- the primers used are SEQ ID NOS: 51-52.
- Conidia of the AohypG-disrupted strain were spread on a plate of Sabouraud dextrose agar medium (BD) containing 1 mM tryptophan and 0.12% (w / v) 5-FAA, and incubated at 30 ° C for 5 days or longer.
- BD Sabouraud dextrose agar medium
- Example 2 In addition, by the same method as in Example 1, it was confirmed that the AotrpC-depleted strain grows only in a medium containing tryptophan, that is, it requires tryptophan. Moreover, it was shown that AotrpC can be removed by using 5-FAA.
- Example 3 Use of trpC gene as a selectable marker gene applicable to the marker recycling method in Aspergillus niger] 1. Preparation of AntrpC-disrupted strain In the same manner as in Example 1, the upstream region 1 (An upstream region) for homologous recombination was prepared using the chromosomal DNA of Aspergillus niger A1179 strain ( ⁇ kusA, pyrG-; obtained from Fungal Genetics Stock Center) as a template.
- the AntrpC disruption cassette was amplified.
- the primers used are those of SEQ ID NOs: 57-58.
- an AntrpC disruption cassette was obtained in which the sequences of An upstream region 1-AspyrG-An downstream region 1 were linked in order.
- the AspyrG gene inserted at the position of the AntrpC gene complements the uracil auxotrophy of the host, and instead becomes tryptophan.
- a strain in which the AntrpC gene was disrupted was selected by confirming by PCR using the chromosomal DNA of transformed Aspergillus niger as a template.
- the primers used are those of SEQ ID NOs: 59-62.
- the selected AntrpC-disrupted strain was subjected to PCR and restriction enzyme digestion of the PCR product to confirm that the AntrpC-disrupted cassette was introduced by homologous recombination.
- the primers used are SEQ ID NOs: 63-64.
- the AntrpC disrupted strain produced a 5.5 kb PCR product, which was digested with KpnI to yield 2.4 kb, 2.0 kb and 1.2 kb fragments. Although a 6.1 kb PCR product was produced in the host, the PCR product was not digested with KpnI.
- the AntrpC-disrupted strain confirmed to have the AntrpC-disruption cassette introduced by homologous recombination was inoculated on a plate of Czapek-Dox minimal agar medium containing or not containing 1 mM tryptophan, and the inoculum was kept at 30 ° C for 7 days. It was incubated and confirmed to grow only in a medium containing tryptophan.
- AntrpC As a gene disruption disruption gene using the AntrpC marker gene, a gene for TpsC, which is trehalose 6-phosphate synthase possessed by Aspergillus niger (BMC Microbiol 14, 90 (2014), [Website] https://www.ncbi.org). nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3991884/; the entire description of which is incorporated herein by reference. The gene was designated AntpsC.
- the upstream region 2 for homologous recombination (An upstream region 2), the region for loopout (An loopout region 1), AntrpC
- the An upstream region 2 the An loop-out region 1, the AntrpC gene and the An downstream region 2 were ligated to the plasmid pUC19 in order.
- the constructed plasmid pAnTpsC_LO_TrpC for construct was constructed.
- the primers used are SEQ ID NOs: 65-72.
- an AntpsC disruption cassette was obtained.
- the primers used are SEQ ID NOs: 73 to 74.
- an AntpsC disruption cassette was obtained in which the sequences of An upstream region 2-An loop-out region 1-AntrpC-An downstream region 2 were linked in order.
- AntpsC-disrupted strain was prepared by transforming the AntrpC-disrupted strain with the AntpsC-disrupted cassette according to the following procedure.
- a strain in which the AntpsC gene was disrupted was selected by extracting chromosomal DNA from the transformant and confirming it by PCR.
- the primers used are the primers of SEQ ID NOs: 61-62 and 75-76.
- the selected AntpsC-disrupted strain was subjected to PCR to confirm that the AntpsC-disrupted cassette was introduced by homologous recombination.
- the primers used are SEQ ID NOs: 77 to 78.
- the AntpsC-disrupted strain produced a 9.1 kb PCR product.
- a PCR product of 5.9 kb was generated.
- AntrpC-depleted strain grows only in a medium containing tryptophan, that is, it is auxotrophic for tryptophan. It was also shown that AntrpC can be removed by using 5-FAA.
- Example 4 Construction of double disruption strain lacking AspyrG gene and AstrpC gene
- the AstpC gene in the Aspergillus soja AspyrG-disrupted strain was disrupted with the AspyrG gene, and then the introduced AspyrG was removed by loop-out to prepare an AspyrG-AstrpC double disrupted strain.
- FIG. 10 shows an outline of the procedure for producing an AspyrG / AstrpC double disruption strain.
- a region 2 for loop-out was obtained by performing PCR and purification of the PCR product using the chromosomal DNA of Aspergillus soja NBRC4239 strain as a template.
- the primers used are SEQ ID NOs: 81 to 82.
- the obtained vector fragment and As loop-out region 2 were ligated according to the method described in (1-2) of Example 1, and the As upstream region 1-As loop-out region 2 was added to the multi-cloning site of pUC19.
- a plasmid was obtained in which the sequences of -AspyrG-As downstream region 1 were ligated in order.
- the resulting plasmid was designated as pTrpC_LO_pyrG.
- a loop-out capable AstrpC disruption cassette was obtained in which the sequences of As upstream region 1-As loop-out region 2-AspyrG-As downstream region 1 were linked in order.
- the transformed Aspergillus soja deficient in AstrpC is complemented with uracil / uridine auxotrophy of the host by the AspyrG gene inserted at the position of the AstrpC gene, and instead becomes tryptophan auxotrophic.
- Conidia were collected from the plate with transformed Aspergillus soja using 0.01% (w / v) Tween 80 solution. A conidia suspension appropriately diluted with the same solution was spread on a plate of potato dextrose agar medium containing 0.04% (w / v) 5-FAA and 1 mM tryptophan, and incubated at 30 ° C. for 4 days.
- the resulting 5-FAA resistant strain was inoculated on a plate of Czapek-Dox minimal agar medium with or without 1 mM tryptophan, incubated at 30 ° C. for 4 days, and grown only in a medium containing tryptophan, That is, a strain showing a requirement for tryptophan was selected.
- Chromosomal DNA was extracted from a tryptophan auxotrophic strain, and PCR and restriction enzyme digestion of the PCR product were carried out to confirm that a loop-out capable AstrpC disruption cassette was introduced by homologous recombination by agarose gel electrophoresis. confirmed.
- the primers used are SEQ ID NOS: 13 and 83.
- the 5-FOA-resistant strain was further looped out from the AstrpC-disrupted strain to obtain the AspyrG gene.
- the AstrpC-disrupted strain was confirmed to be the AspyrG / AstrpC double disruption strain. That is, it was confirmed that the PCR generated a PCR product of 3.9 kb as expected after loop-out. As described above, the PCR product obtained before loop-out is 8.8 kb.
- Non-disrupted strain (Aspergillus soya NBRC4239 strain), AspyrG disrupted strain (Aspergillus soya KP-del strain), AstrpC disrupted strain (prepared in Example 1) and AspyrG AstrpC Double-disrupted strains were used to assess 5-FOA and 5-FAA resistance of these strains by the following procedure.
- the AspyrG-disrupted strain and the AstrpC-disrupted strain could not grow due to the presence of 5-FAA and 5-FOA in the medium, respectively.
- Example 1 0.04% (w / v) 5-FAA was used for selection of ⁇ trpC strain. Further, in Example 4, 0.3% (w / v) 5-FOA was used for selection of the ⁇ pyrG strain. However, as shown in Table 3, when these were used alone, the combination of drug concentrations (0.3% (w / v) 5-FOA and 0.04% (w / v) 5-FAA) showed no effect. The strain did not grow either.
- the plasmid pUC19 had an upstream region 2 (As upstream region 3) for homologous recombination and a region 3 (As loopout region 3) for loopout.
- AspyrG gene and the downstream region 3 (As downstream region 3) for homologous recombination were sequentially ligated to prepare a plasmid pNpH_LO_pyrG.
- the primers used are those of SEQ ID NOs: 84-89.
- the AspyrG gene DNA fragment used was that prepared in (1-2) of Example 1.
- PCR and purification of the PCR product were carried out according to the description in (1-3) above, to obtain an Asnph disruption cassette.
- the primers used are the primers of SEQ ID NOs: 90-91.
- an Asnph disruption cassette was obtained in which the sequences of As upstream region 3-As loop out region 3-AspyrG-As downstream region 3 were linked in sequence.
- FIG. 11 shows an outline of the procedure up to the production of the AspyrG / AstrpC double-removed strain obtained by looping out.
- Transformation was performed by the protoplast PEG method using the obtained protoplasts, 20 ⁇ g of Asparp1 disruption cassette (produced in Example 1) and 20 ⁇ g of Asnph disruption cassette, and then 0.5% (w / v) agar. Using Czapek-Dox minimal medium containing 1.2 M sorbitol and 1.2 M, the mixture was incubated at 30 ° C. for 5 days or longer to obtain transformed Aspergillus soja with the ability to form colonies.
- the uracil auxotrophy and tryptophan auxotrophy of the host AspyrG.AstrpC double disruption strain are complemented by the introduced AspyrG gene and AstrpC gene, respectively. It should be noted that the strain in which only one is complemented cannot grow in the above medium.
- chromosomal DNA was extracted from the transformant and confirmed by PCR to select a strain in which both Asparp1 gene and Asnph gene were disrupted.
- the primers used are SEQ ID NOs: 25-28 and 92-93.
- the Asparp1 and Asnph double disruption strains selected were confirmed by PCR to confirm that both the Asparp1 disruption cassette and the Asnph disruption cassette were introduced by homologous recombination.
- the primers used are SEQ ID NOs: 29-30 and 94-95.
- Disruption of the Asparp1 gene resulted in a 9.6 kb PCR product.
- a PCR product of 5.3 kb was generated in the host.
- a PCR product of 8.5 kb was generated due to the disruption of the Asnph gene.
- a 5.9 kb PCR product was generated in the host.
- loop-out occurred near the region where the Asnph gene originally existed, and a product of 3.4 kb was produced as expected.
- a PCR product of 8.5 kb is generated.
- the AspyrG / AstrpC double-removed strain was inoculated on a plate of 4 types of agar medium shown in (1) to (4) below, and incubated at 30 ° C. for 5 days or more.
- (1) Czapek-Dox minimal agar medium (2) Czapek-Dox minimal agar medium containing 1 mM tryptophan (3) Czapek-Dox minimal agar medium containing 20 mM uracil (4) Czapek agar minimal DXP containing 1 mM tryptophan and 20 mM uracil Culture medium
- Chromosomal DNA was extracted from the strain whose growth was confirmed, and PCR was carried out by the method described in (3-1) of Example 5 above to remove AspyrG / AstrpC marker gene and AspyrG / AstrpC doubled. It was confirmed to be a removed strain.
- a transformed Aspergillus microorganism, a composition and a method according to one embodiment of the present invention can efficiently transform an Aspergillus microorganism having a high utility value in the food industry, and further have a structure or function of an Aspergillus microorganism. It is possible to rapidly detect new phenotypes due to simultaneous disruption of genes that are similar or related.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本発明の目的は、少なくとも2種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物及びその利用のための組成物を提供することにある。上記目的は、染色体上の少なくとも2種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属(<u>Aspergillus</u>)微生物及び相同組換え領域の間にループアウト領域及びマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の少なくとも2種類を含む、アスペルギルス属微生物形質転換用組成物であって、前記選択マーカー遺伝子は、トリプトファン生合成遺伝子及びトリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子を含むものなどにより解決される。
Description
本発明は、染色体上の少なくとも2種類の遺伝子が破壊された形質転換アスペルギルス属微生物及びその製造方法に関する。
アスペルギルス属(Aspergillus)微生物は、醤油や味噌などの発酵食品の製造工程の一つである製麹工程に用いられる麹菌として利用される他、様々な物質生産に利用されている。そこで、染色体上にある標的遺伝子を破壊するなどして、所望の形質を表現するようにアスペルギルス属微生物を改変する技術が求められている。
宿主の染色体上にある標的遺伝子を破壊する方法としては、マーカーリサイクル法(マーカーリサイクリング法ともよばれる。)がある。マーカーリサイクル法は、相同組換えによって標的遺伝子を選択マーカー遺伝子に置換した後、選択マーカー遺伝子を除去させて、形質転換体の染色体上に選択マーカー遺伝子が残らないようにして、選択マーカー遺伝子を再利用するという方法である。
マーカーリサイクル法で用いられる選択マーカー遺伝子としては、選択マーカー遺伝子による置換及び選択マーカー遺伝子の除去が容易に確認できるシステムを備えていることが求められる。このようなマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子として、アスペルギルス属微生物ではpyrG遺伝子が用いられている。
アスペルギルス属微生物は、染色体上にpyrG遺伝子を有することにより、ウリジン及び/又はウラシル(以下、ウリジン/ウラシルと表記する場合もある。)を添加しなくても生育できるが、ウリジンモノリン酸の生合成の中間体であるオロチジン 5’-モノリン酸のアナログである5-フルオロオロチン酸(5-FOA)を代謝して毒性のある5-フルオロウラシル(5-FU)を合成する。したがって、染色体上にpyrG遺伝子を有するアスペルギルス属微生物は、5-FOAの存在下で培養しても生育できない。これに対して、染色体上にpyrG遺伝子を有さないアスペルギルス属微生物は、5-FOAを代謝できないことから、5-FOAが存在していても生育できるが、ウリジン/ウラシル要求性となる。
pyrG遺伝子のように、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子としては、その遺伝子が発現することにより、特定の薬剤(5-FOAなど)を含む環境下では生育できなくなることを利用したカウンター選抜に利用可能な選択マーカー遺伝子であることが求められる。換言すれば、カウンター選抜に利用できる薬剤が見つかっていなければ、その選択マーカー遺伝子はマーカーリサイクル法に利用できない。
この性質を利用して、pyrG遺伝子欠損アスペルギルス属微生物の染色体上の標的遺伝子をpyrG遺伝子で置換した形質転換体をウリジン/ウラシル非含有培地を用いて選抜し、次いで選抜した形質転換体を5-FOA含有培地を用いてカウンター選抜することにより、5-FOA耐性株として標的遺伝子及びpyrG遺伝子が欠損した形質転換体を得ることができる。
ただし、アスペルギルス属微生物を対象としたマーカーリサイクル法で用いられる選択マーカー遺伝子としては、現状では、上記したpyrG遺伝子が用いられているのみである。また、薬剤を使用したniaD欠損株のカウンター選抜や、sC欠損株のカウンター選抜においては、いずれも薬剤の選択圧が弱いために非欠損株のバックグラウンドの生育が見られることから、実質的にマーカーリサイクル法にはほとんど用いられていないのが現状である。
一方、下記特許文献1(該文献の全記載はここに開示として援用される。)には、リゾプス・デルマー(Rhizopus delemar)を宿主とする形質転換体について、トリプトファンの生合成に関与する遺伝子であるtrpC遺伝子の欠損の有無を5-フルオロアントラニル酸(5-FAA)の存在下での生育の有無を確認することにより評価していることが記載されている。また、下記非特許文献1(該文献の全記載はここに開示として援用される。)には、選択マーカー遺伝子として、pyrG遺伝子及びアルギニンの生合成遺伝子であるargB遺伝子を欠損した形質転換アスペルギルス・アクレアタスが記載されている。非特許文献2(該文献の全記載はここに開示として援用される。)には、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)のtrpC遺伝子を不可逆的に欠損したことが記載されている。非特許文献3(該文献の全記載はここに開示として援用される。)には、アスペルギルス属微生物とは全く相違する酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるTRP1マーカー遺伝子のカウンター選抜の使用について記載されている。
TANI et al.,AMB Express,2013,3:4,https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/2191-0855-3-4
GOOSEN et al.,Molecular and General Genetics,1989, Vol.219,P.282-288
TOYN et al.,Yeast,2000, Vol.16,P.553-560
特許文献1では、5-FAA存在下での生育の有無により、trpC遺伝子欠損株を選抜している。しかし、特許文献1には、trpC遺伝子を、マーカーリサイクル法で用いるためのリサイクル可能な選択マーカー遺伝子として使用できることについての記載は無い。
また、非特許文献1に記載の形質転換アスペルギルス・アクレアタスについて、欠損したargB遺伝子はマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子ではない。また、非特許文献1には、argB遺伝子に代えて別の選択マーカー遺伝子を利用すること、例えば、数多くあるアミノ酸の生合成に関与する遺伝子のうち、特定の選択マーカー遺伝子を利用することについて、なんら記載が無い。
さらに、宿主生物であるアスペルギルス属微生物をマーカーリサイクル法により形質転換するに際して、pyrG遺伝子と同程度のリサイクルが可能であり、pyrG遺伝子に代えて利用可能な選択マーカー遺伝子についてはこれまでにほとんど知られていない。特に、アスペルギルス属微生物を対象として、pyrG遺伝子とともに用いることが可能である、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子による置換及び除去を容易に確認できるシステムについても、これまでにほとんど知られていない。非特許文献2及び3にもこれらのことについて記載が無い。特に、本発明者が調べたところによれば、酵母のTRP1マーカー遺伝子に相当する遺伝子はアスペルギルス属微生物には見出せていない。
そこで、本発明が解決しようとする第1の課題は、マーカーリサイクル法に利用可能な少なくとも2種類の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物及びその製造方法を提供することにある。
本発明が解決しようとする第2の課題は、選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の少なくとも2種類を含む組成物を用いて、マーカーリサイクル法を利用して形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上にある少なくとも2種類の標的遺伝子を欠損する方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討したところ、利用可能性が想定される種々の遺伝子のうち、トリプトファンの生合成に関与する遺伝子に着眼するに至った。そして、このトリプトファン生合成遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を宿主として、標的遺伝子の遺伝子座に、ループアウト領域及びトリプトファン生合成遺伝子を含む核酸断片を導入したところ、トリプトファン非存在下での生育により標的遺伝子とトリプトファン生合成遺伝子との置換が確認でき、さらに5-FAA存在下での生育によりトリプトファン生合成遺伝子のループアウトによる除去が確認できることを見出した。
そして、驚くべきことに、本発明者は、5-FOA及び5-FAAの存在量を所定の濃度に設定することにより、選択マーカー遺伝子としてトリプトファン生合成遺伝子及びpyrG遺伝子を欠損させた二重破壊形質転換アスペルギルス属微生物を製造及び選抜することに成功した。アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼといったアスペルギルス属微生物は薬剤に対する耐性が高いことが知られている。そのために、アスペルギルス属微生物に対して、5-FAAをトリプトファン生合成系遺伝子欠損株のカウンター選抜に使用できるか否か、使用できるとしても5-FAAの濃度をどの程度に設定すればよいかなどについて、これまでに知見はなかった。これに加えて、選択圧が弱いこと、すなわち感受性と耐性との差が小さいために適した薬剤濃度を設定することが困難であるおそれさえも想定された。このような技術的背景があるにもかかわらず、本発明者は、上記二重破壊形質転換アスペルギルス属微生物を製造及び選抜すること、更には該二重破壊形質転換アスペルギルス属微生物を用いることにより、染色体上にある2種類の標的核酸を効率良く短時間で欠損させることに成功した。本発明はこのような知見や成功例に基づいて完成するに至った発明である。
したがって、本発明の一態様によれば、以下の形質転換アスペルギルス属微生物、組成物及び方法が提供される。
[1]染色体上の少なくとも2種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属(Aspergillus)微生物であって、前記選択マーカー遺伝子は、トリプトファン生合成遺伝子及びトリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子を含む、前記形質転換アスペルギルス属微生物。
[2]相同組換え領域の間にループアウト領域及びマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の少なくとも2種類を含む、アスペルギルス属微生物形質転換用組成物であって、前記核酸断片は、前記選択マーカー遺伝子がトリプトファン生合成遺伝子である核酸断片及び前記選択マーカー遺伝子がトリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子である核酸断片を含む、前記組成物。
[3]前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)以外のアスペルギルス属微生物である、[1]~[2]のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
[4]前記トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、[1]~[3]のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
[5]前記トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、ウラシル生合成遺伝子、硫酸塩代謝遺伝子及び硝酸塩代謝遺伝子からなる群から選ばれる選択マーカー遺伝子である、[1]~[4]のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
[6]前記トリプトファン生合成遺伝子はtrpC遺伝子であり、かつ、トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、pyrG遺伝子、niaD遺伝子及びsC遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1種の遺伝子である、[1]~[5]のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
[7]下記の工程(1)~工程(3)を含む、染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物の製造方法であって、該第1の選択マーカー遺伝子及び該第2の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がトリプトファン生合成遺伝子であり、他方が栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、前記方法:
(1)染色体上の第1の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む核酸断片を用いて、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;
(2)前記工程(1)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子が挿入され、かつ、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程;及び、
(3)前記工程(2)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
[8]下記の工程(A)~工程(B)を含む、マーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子を利用した、形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の2種類の標的遺伝子の欠損方法であって、該第1の選択マーカー遺伝子及び該第2の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がトリプトファン生合成遺伝子であり、他方が栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、前記方法:
(A)染色体上の第1の選択マーカー遺伝子及び第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、第1の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む第1の核酸断片及び第2の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第2の選択マーカー遺伝子を含む第2の核酸断片を用いて、該第1の標的遺伝子及び該第2の標的遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;及び
(B)前記工程(A)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の非存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が挿入された形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
[9]さらに下記の工程(C)を含む、[8]に記載の方法:
(C)前記工程(B)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログの存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子、前記第2の選択マーカー遺伝子、前記第1の標的遺伝子及び前記第2の標的遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
[10]前記第1の選択マーカー遺伝子はトリプトファン生合成遺伝子であり、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは5-FAAであり、及び該5-FAAの濃度は0.005%(w/v)~0.02%(w/v)であり、かつ、
前記第2の選択マーカー遺伝子はpyrG遺伝子であり、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは5-FOAであり、及び該5-FOAの濃度は0.05%(w/v)~0.15%(w/v)である、[9]に記載の方法。
[11]前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス以外のアスペルギルス属微生物である、[7]~[10]のいずれか1項に記載の方法。
[101]染色体上の少なくとも2種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属(Aspergillus)微生物であって、前記選択マーカー遺伝子はtrpC遺伝子及びpyrG遺伝子を含む、前記形質転換アスペルギルス属微生物。
[102]相同組換え領域の間にループアウト領域及びマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の少なくとも2種類を含む、アスペルギルス属微生物形質転換用組成物であって、前記核酸断片は、前記選択マーカー遺伝子がtrpC遺伝子である核酸断片及び前記選択マーカー遺伝子がpyrG遺伝子である核酸断片を含む、前記組成物。
[103]前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)以外のアスペルギルス属微生物であり、好ましくは宿主生物がアスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamarii)、アスペルギルス・ルチュエンシス(Aspergillus luchuensis)、アスペルギルス・ウサミ(Aspergillus usamii)又はアスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)である、[101]~[102]のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
[104]下記の工程(1)~工程(3)を含む、染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物の製造方法であって、該第1の選択マーカー遺伝子及び該第2の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がtrpC遺伝子であり、他方がpyrG遺伝子であり、trpC遺伝子に対応する栄養性物質がトリプトファンであり、トリプトファンのアナログが5-FAAであり、pyrG遺伝子に対応する栄養性物質がウラシル及び/又はウリジンであり、ウラシル及び/又はウリジンのアナログが5-FOAである、前記方法:
(1)染色体上の第1の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む核酸断片を用いて、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;
(2)前記工程(1)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子が挿入され、かつ、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程;及び、
(3)前記工程(2)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
[105]下記の工程(A)~工程(B)を含む、マーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子を利用した、形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の2種類の標的遺伝子の欠損方法であって、該第1の選択マーカー遺伝子及び該第2の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がtrpC遺伝子であり、他方がpyrG遺伝子であり、trpC遺伝子に対応する栄養性物質がトリプトファンであり、トリプトファンのアナログが5-FAAであり、pyrG遺伝子に対応する栄養性物質がウラシル及び/又はウリジンであり、ウラシル及び/又はウリジンのアナログが5-FOAである、前記方法:
(A)染色体上の第1の選択マーカー遺伝子及び第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、第1の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む第1の核酸断片及び第2の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第2の選択マーカー遺伝子を含む第2の核酸断片を用いて、該第1の標的遺伝子及び該第2の標的遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;及び
(B)前記工程(A)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の非存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が挿入された形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
[106]さらに下記の工程(C)を含む、[105]に記載の方法:
(C)前記工程(B)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログの存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子、前記第2の選択マーカー遺伝子、前記第1の標的遺伝子及び前記第2の標的遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
[107]前記5-FAAの濃度は0.005%(w/v)~0.02%(w/v)であり、かつ、前記5-FOAの濃度は0.05%(w/v)~0.15%(w/v)である、[106]に記載の方法。
[108]前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)以外のアスペルギルス属微生物であり、好ましくは宿主生物がアスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamarii)、アスペルギルス・ルチュエンシス(Aspergillus luchuensis)、アスペルギルス・ウサミ(Aspergillus usamii)又はアスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)である、[104]~[107]のいずれか1項に記載の方法。
[1]染色体上の少なくとも2種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属(Aspergillus)微生物であって、前記選択マーカー遺伝子は、トリプトファン生合成遺伝子及びトリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子を含む、前記形質転換アスペルギルス属微生物。
[2]相同組換え領域の間にループアウト領域及びマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の少なくとも2種類を含む、アスペルギルス属微生物形質転換用組成物であって、前記核酸断片は、前記選択マーカー遺伝子がトリプトファン生合成遺伝子である核酸断片及び前記選択マーカー遺伝子がトリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子である核酸断片を含む、前記組成物。
[3]前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)以外のアスペルギルス属微生物である、[1]~[2]のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
[4]前記トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、[1]~[3]のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
[5]前記トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、ウラシル生合成遺伝子、硫酸塩代謝遺伝子及び硝酸塩代謝遺伝子からなる群から選ばれる選択マーカー遺伝子である、[1]~[4]のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
[6]前記トリプトファン生合成遺伝子はtrpC遺伝子であり、かつ、トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、pyrG遺伝子、niaD遺伝子及びsC遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1種の遺伝子である、[1]~[5]のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
[7]下記の工程(1)~工程(3)を含む、染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物の製造方法であって、該第1の選択マーカー遺伝子及び該第2の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がトリプトファン生合成遺伝子であり、他方が栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、前記方法:
(1)染色体上の第1の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む核酸断片を用いて、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;
(2)前記工程(1)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子が挿入され、かつ、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程;及び、
(3)前記工程(2)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
[8]下記の工程(A)~工程(B)を含む、マーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子を利用した、形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の2種類の標的遺伝子の欠損方法であって、該第1の選択マーカー遺伝子及び該第2の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がトリプトファン生合成遺伝子であり、他方が栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、前記方法:
(A)染色体上の第1の選択マーカー遺伝子及び第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、第1の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む第1の核酸断片及び第2の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第2の選択マーカー遺伝子を含む第2の核酸断片を用いて、該第1の標的遺伝子及び該第2の標的遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;及び
(B)前記工程(A)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の非存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が挿入された形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
[9]さらに下記の工程(C)を含む、[8]に記載の方法:
(C)前記工程(B)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログの存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子、前記第2の選択マーカー遺伝子、前記第1の標的遺伝子及び前記第2の標的遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
[10]前記第1の選択マーカー遺伝子はトリプトファン生合成遺伝子であり、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは5-FAAであり、及び該5-FAAの濃度は0.005%(w/v)~0.02%(w/v)であり、かつ、
前記第2の選択マーカー遺伝子はpyrG遺伝子であり、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは5-FOAであり、及び該5-FOAの濃度は0.05%(w/v)~0.15%(w/v)である、[9]に記載の方法。
[11]前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス以外のアスペルギルス属微生物である、[7]~[10]のいずれか1項に記載の方法。
[101]染色体上の少なくとも2種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属(Aspergillus)微生物であって、前記選択マーカー遺伝子はtrpC遺伝子及びpyrG遺伝子を含む、前記形質転換アスペルギルス属微生物。
[102]相同組換え領域の間にループアウト領域及びマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の少なくとも2種類を含む、アスペルギルス属微生物形質転換用組成物であって、前記核酸断片は、前記選択マーカー遺伝子がtrpC遺伝子である核酸断片及び前記選択マーカー遺伝子がpyrG遺伝子である核酸断片を含む、前記組成物。
[103]前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)以外のアスペルギルス属微生物であり、好ましくは宿主生物がアスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamarii)、アスペルギルス・ルチュエンシス(Aspergillus luchuensis)、アスペルギルス・ウサミ(Aspergillus usamii)又はアスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)である、[101]~[102]のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
[104]下記の工程(1)~工程(3)を含む、染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物の製造方法であって、該第1の選択マーカー遺伝子及び該第2の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がtrpC遺伝子であり、他方がpyrG遺伝子であり、trpC遺伝子に対応する栄養性物質がトリプトファンであり、トリプトファンのアナログが5-FAAであり、pyrG遺伝子に対応する栄養性物質がウラシル及び/又はウリジンであり、ウラシル及び/又はウリジンのアナログが5-FOAである、前記方法:
(1)染色体上の第1の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む核酸断片を用いて、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;
(2)前記工程(1)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子が挿入され、かつ、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程;及び、
(3)前記工程(2)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
[105]下記の工程(A)~工程(B)を含む、マーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子を利用した、形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の2種類の標的遺伝子の欠損方法であって、該第1の選択マーカー遺伝子及び該第2の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がtrpC遺伝子であり、他方がpyrG遺伝子であり、trpC遺伝子に対応する栄養性物質がトリプトファンであり、トリプトファンのアナログが5-FAAであり、pyrG遺伝子に対応する栄養性物質がウラシル及び/又はウリジンであり、ウラシル及び/又はウリジンのアナログが5-FOAである、前記方法:
(A)染色体上の第1の選択マーカー遺伝子及び第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、第1の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む第1の核酸断片及び第2の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第2の選択マーカー遺伝子を含む第2の核酸断片を用いて、該第1の標的遺伝子及び該第2の標的遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;及び
(B)前記工程(A)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の非存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が挿入された形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
[106]さらに下記の工程(C)を含む、[105]に記載の方法:
(C)前記工程(B)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログの存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子、前記第2の選択マーカー遺伝子、前記第1の標的遺伝子及び前記第2の標的遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
[107]前記5-FAAの濃度は0.005%(w/v)~0.02%(w/v)であり、かつ、前記5-FOAの濃度は0.05%(w/v)~0.15%(w/v)である、[106]に記載の方法。
[108]前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)以外のアスペルギルス属微生物であり、好ましくは宿主生物がアスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamarii)、アスペルギルス・ルチュエンシス(Aspergillus luchuensis)、アスペルギルス・ウサミ(Aspergillus usamii)又はアスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)である、[104]~[107]のいずれか1項に記載の方法。
本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属微生物及び方法によれば、マーカーリサイクル法を利用して、形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上にある少なくとも2種類の標的核酸を効率良く短時間で欠損させることができる。本発明の一態様である組成物及び方法によれば、マーカーリサイクル法に利用可能な少なくとも2種類の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を製造することができる。本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属微生物、組成物及び方法を応用することにより、構造若しくは機能が類似又は関連する遺伝子の同時破壊による新たな表現型を迅速に検出することが期待できる。
以下、本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属微生物、組成物及び方法の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。
本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。
例えば、「及び/又は」とは、列記した複数の関連項目のいずれか1つ、又は2つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。
「遺伝子の欠損」とは、遺伝子の一部又は全部が欠損することにより、遺伝子が正常に転写されないこと、転写されたタンパク質が本来のタンパク質の機能を発揮しないことなどのように、遺伝子が正常に機能せずに遺伝子の発現が妨げられていることを意味する。本明細書では、遺伝子の欠損と遺伝子の破壊とは同義で用いられる。
「遺伝子の発現」とは、転写や翻訳などを介して、遺伝子によってコードされるタンパク質が本来の構造や活性を有する態様で生産されることを意味する。
「選択マーカー遺伝子」とは、形質転換体の選択手段として使用される形質をもたらす遺伝子であり、対応する選択性物質の存在下若しくは非存在下で、形質転換体が特異的に選択されるように、又はされないようにすることを可能にするものをいう。「選択マーカー遺伝子の機能」とは、対応する選択性物質の存在下又は非存在下で形質転換体が特異的に選択されるようにすることを可能にすることをいう。例えば、選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である場合は、選択マーカー遺伝子の機能が発揮することにより、薬剤の存在下で形質転換体は特異的に選択されるようになる。また、選択マーカー遺伝子が栄養要求性遺伝子である場合は、選択マーカー遺伝子の機能が発揮することにより、栄養物質の非存在下で形質転換体は特異的に選択されるようになる。選択マーカー遺伝子のうち、「マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子」とは、その遺伝子が発現することにより、特定の薬剤を含む環境下では生育できなくなることを利用したカウンター選抜に利用可能な選択マーカー遺伝子をいう。
「相同組換え領域」とは、染色体上にある標的とする遺伝子(標的遺伝子)の両側(すなわち、上流(5’末端側)及び下流(3’末端側))にある領域とそれぞれ相同な核酸配列をいう。「相同組換え領域」のうち、標的遺伝子の上流側にある領域を「相同組換え上流領域」とよび、標的遺伝子の下流側にある領域を「相同組換え下流領域」とよぶ。
「ループアウト」とは、同一染色体上にある相同な核酸配列同士が組換えを起こし、その間にある核酸配列が抜け落ちる現象をいう。「ループアウト領域」は、ループアウトを可能にする領域であり、例えば、ループアウト領域と一緒に導入する選択マーカー遺伝子をループアウトにより除去するための領域をいう。
「生合成遺伝子」とは、対象とする物質の生合成経路において機能するタンパク質を発現する1種類又は2種類以上の遺伝子を意味し、例えば、対象とする物質へ変換する反応を触媒する酵素を発現する遺伝子などが挙げられる。
「代謝遺伝子」とは、対象とする物質の代謝経路において機能するタンパク質を発現する1種類又は2種類以上の遺伝子を意味し、例えば、対象とする物質を別の物質へ変換する反応を触媒する酵素を発現する遺伝子などが挙げられる。
(形質転換アスペルギルス属微生物及び組成物の概要)
本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属(Aspergillus)微生物は、宿主生物であるアスペルギルス属微生物の染色体上にある2種類又はそれ以上のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損するように、宿主生物を形質転換したアスペルギルス属微生物である。また、本発明の一態様である組成物は、本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属微生物における標的遺伝子を破壊するために用いられ、相同組換え領域の間にループアウト領域及びマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の2種類又はそれ以上を少なくとも含む。
本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属(Aspergillus)微生物は、宿主生物であるアスペルギルス属微生物の染色体上にある2種類又はそれ以上のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損するように、宿主生物を形質転換したアスペルギルス属微生物である。また、本発明の一態様である組成物は、本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属微生物における標的遺伝子を破壊するために用いられ、相同組換え領域の間にループアウト領域及びマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の2種類又はそれ以上を少なくとも含む。
本発明の一態様の形質転換アスペルギルス属微生物及び組成物において、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の1種類又は2種類以上はトリプトファン生合成遺伝子であり、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の別の1種類又は2種類以上はトリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子である。
(マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子)
酵母のトリプトファン生合成経路の概要を図1に示す。図1に示すとおり、酵母では、トリプトファンの生合成には、TRP4(anthranilate phosphoribosyltransferase)、TRP1(phosphoribosylanthranilate isomerase)、TRP3(indole-3-glycerol phosphate synthase)及びTRP5(tryptophan synthase)の4種の酵素が関与している。なお、chorismateからanthranilateへの反応は、TRP2(Anthranilate synthase)が触媒する。
酵母のトリプトファン生合成経路の概要を図1に示す。図1に示すとおり、酵母では、トリプトファンの生合成には、TRP4(anthranilate phosphoribosyltransferase)、TRP1(phosphoribosylanthranilate isomerase)、TRP3(indole-3-glycerol phosphate synthase)及びTRP5(tryptophan synthase)の4種の酵素が関与している。なお、chorismateからanthranilateへの反応は、TRP2(Anthranilate synthase)が触媒する。
これに対して、本発明者は、アスペルギルス・ソーヤ(A.sojae)NBRC4239株の公開ゲノムデータベース(BioProject Accession:PRJDA60265)から、TRP4に相当する酵素をコードする遺伝子はscaffold00063の1554760-1553403の領域にあると予測した。そして、該領域を破壊しようと試みたところ、該領域を破壊した染色体と非破壊の染色体とが混在した株しか得られず、結果として該領域を破壊した株は得られなかった。
また、TRP5に相当する酵素をコードする遺伝子はscaffold00060の1470936-1473260の領域、scaffold00036の917953-920152の領域、scaffold00057の350582-352846の領域及びscaffold00011の662605-659898の領域にあると予測した。このようにTRP5に相当する酵素をコードする遺伝子は4個あると予測して、それらを全て破壊することは非常に困難であることから断念した。
さらに、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株において、TRP1及びTRP3のそれぞれの酵素に相当する酵素をコードする遺伝子は見当らなかった。その一方で、TRP1及びTRP3の機能を兼ね備えた酵素をコードする遺伝子はscaffold00048(DF093577.1)の1213700-1211376の領域にあると予測し、該領域をAstrpC遺伝子と名付けた。そして、アスペルギルス・ソーヤにおいて、AstrpC遺伝子を破壊することにより、アントラニル酸からトリプトファンを生合成することができない形質転換アスペルギルス属微生物を得ることに成功した。
上記した経緯に基づけば、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子としてのトリプトファン生合成遺伝子としては、酵母のTRP1及びTRP3の機能を兼ね備えた酵素をコードする遺伝子、すなわち、trpC遺伝子が好ましいが、酵母のTRP4、TRP5又はTRP2に相当する酵素をコードする遺伝子であってもよい。トリプトファン生合成遺伝子は、上記した遺伝子のいずれか1種を単独で、又は2種以上を組み合わせて用いてもよい。
トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、トリプトファン生合成遺伝子とは異なるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子などが挙げられる。栄養要求性遺伝子は宿主生物の栄養要求性を相補する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、pyrG遺伝子、niaD遺伝子、sC遺伝子などが挙げられる。トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、上記した遺伝子の1種を単独で、又は2種以上を組み合わせて用いることができる。なお、niaD遺伝子が欠損した株は塩素酸塩に対して耐性を有し、sC遺伝子が欠損した株はセレン酸に対して耐性を有するという形質を示す。
pyrG遺伝子、trpC遺伝子、niaD遺伝子及びsC遺伝子は、それぞれ由来生物ごとにNCBI GenBank([URL]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)に登録されている。例えば、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ及びアスペルギルス・ニガーのpyrG遺伝子、trpC遺伝子、niaD遺伝子及びsC遺伝子のGenBankのアクセッション番号を表1に示す。なお、アスペルギルス・ソーヤについては、染色体上のscaffoldを示す。当業者であれば、NCBI GenBankを参照することにより、アスペルギルス属微生物のこれらの遺伝子の塩基配列を取得できる。アスペルギルス・ソーヤのscaffold00028のバージョンはDF093570.1であり、アスペルギルス・ソーヤのscaffold00009のバージョンはDF093562.1である。
トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、上記した遺伝子のうち、形質転換体の選抜の容易性の観点から、栄養要求性遺伝子が好ましい。栄養要求性遺伝子は、生合成遺伝子及び代謝遺伝子を包含する。栄養要求性遺伝子の中でも、栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子であることがより好ましく、ウラシル生合成遺伝子、硫酸塩代謝遺伝子及び硝酸塩代謝遺伝子がさらに好ましく、pyrG遺伝子、niaD遺伝子及びsC遺伝子がなおさらに好ましい。
マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子は、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を有する由来生物が本来保有する遺伝子(すなわち、野生型遺伝子)と完全に同一でなくともよく、少なくとも野生型遺伝子が発現するタンパク質(すなわち、野生型タンパク質)と同一の、又は近似する酵素学的性質を有するタンパク質を発現する遺伝子である限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するDNAなどであってもよい。
本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、野生型遺伝子の塩基配列を有するDNAをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるDNAの塩基配列を意味する。
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、プローブとしてDNAプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、5×SSC、1.0%(w/v) 核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬(ロシュ・ダイアグノスティクス社)、0.1%(w/v) N-ラウロイルサルコシン、0.02%(w/v) SDSを用い、一晩(8~16時間程度)で行う。洗浄は、0.1~0.5×SSC、0.1%(w/v) SDS、好ましくは0.1×SSC、0.1%(w/v) SDSを用い、15分間、2回行う。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行う温度は65℃以上、好ましくは68℃以上である。
また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するDNAとしては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するDNA又は該DNAの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるDNAや0.5~2.0MのNaCl存在下にて、40~75℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは0.7~1.0MのNaCl存在下にて、65℃でハイブリダイゼーションを実施した後、0.1~1×SSC溶液(1×SSC溶液は、150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウム)を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるDNAなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションの方法は、Molecular Cloning:A laboratory Manual,2nd-Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY.,1989、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1-38,John Wiley&Sons,1987-1997(以下、これらの文献を参考技術文献とよぶ場合がある;該文献の全記載はここに開示として援用される。)などに記載されている方法に準じて実施することができる。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するDNAを得るための条件を適宜設定することができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むDNAとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列を有するDNAの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するDNAが挙げられ、例えば、野生型遺伝子の塩基配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上又は99%以上、さらに好ましくは99.5%以上の配列同一性を有するDNAが挙げられる。該配列同一性の上限は特に限定されず、典型的には100%である。
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、塩基配列における塩基数100個を一単位とすれば、野生型遺伝子の塩基配列において、該一単位あたり、1から数個、好ましくは1から20個、より好ましくは1から15個、さらに好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列を含む。ここで、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質が有するアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有するタンパク質である蓋然性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ酵素活性を有するものである。
野生型タンパク質と同一の、又は近似する酵素学的性質を有するタンパク質は、そのアミノ酸配列が、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで、アミノ酸配列の「1から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「1から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸数100個を一単位とすれば、該一単位あたり、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個程度、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個程度、より好ましくは1、2、3、4又は5個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
「1から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、1から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性(中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
野生型タンパク質が有するアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列としては、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上又は99%以上、さらに好ましくは99.5%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。該配列同一性の上限は特に限定されず、典型的には100%である。
(配列同一性を算出するための手段)
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られる方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子が発現する野生型タンパク質のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られる方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子が発現する野生型タンパク質のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。
2つの塩基配列やアミノ酸配列における一致率を算出するためのプログラムとしては、例えば、Karlin及びAltschulのアルゴリズム(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268、1990;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877、1993;該文献の全記載はここに開示として援用される。)が知られており、このアルゴリズムを用いたBLASTプログラムがAltschulなどによって開発されている(J.Mol.Biol.215:403-410、1990;該文献の全記載はここに開示として援用される。)。さらに、BLASTより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるGapped BLASTも知られている(Nucleic Acids Res.25:3389-3402、1997;該文献の全記載はここに開示として援用される。)。したがって、当業者は例えば上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。これらは、例えば、米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイト(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)において利用可能である。
上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Genetyxネットワーク版 version 12.0.1(ジェネティックス社)のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Lipman-Pearson法(Science 227:1435-1441、1985;該文献の全記載はここに開示として援用される。)に基づくものである。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であればタンパク質をコードしている領域(CDS又はORF)を用いる。
(マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の由来)
マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子は、例えば、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の発現又はマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子としての機能が確認できる生物種などに由来する。マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の由来生物としては、例えば、微生物などが挙げられ、宿主生物と同一又は近縁種のアスペルギルス属微生物であることが好ましい。アスペルギルス属微生物の具体例としては、アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamarii)、アスペルギルス・ルチュエンシス(Aspergillus luchuensis)、アスペルギルス・ウサミ(Aspergillus usamii)、アスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)などが挙げられる。
マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子は、例えば、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の発現又はマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子としての機能が確認できる生物種などに由来する。マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の由来生物としては、例えば、微生物などが挙げられ、宿主生物と同一又は近縁種のアスペルギルス属微生物であることが好ましい。アスペルギルス属微生物の具体例としては、アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamarii)、アスペルギルス・ルチュエンシス(Aspergillus luchuensis)、アスペルギルス・ウサミ(Aspergillus usamii)、アスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)などが挙げられる。
上記アスペルギルス属微生物の具体例として挙げたうち、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・アクレアタス及びアスペルギルス・サイトイは、味噌、醤油、日本酒、焼酎などの醸造食品の製造、クエン酸製造、アミラーゼなどの酵素剤製造への使用実績が豊富であり、高い酵素生産性と長年の利用による安全性に対する高い信頼性とから、産業上利用可能な微生物である。
マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子は、宿主生物に導入して形質転換することにより、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子タンパク質が発現して、形質転換体は宿主生物と異なる表現形質を呈するようになる。そこで、形質転換体において発現されるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子タンパク質が、宿主生物の生育条件によって不活化せず、選択マーカー機能を発揮するためには、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の由来生物は、形質転換すべき宿主生物と生育条件が近似するアスペルギルス属微生物であることが好ましい。
(宿主生物)
宿主生物としては、染色体上にマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を有し、該選択マーカー遺伝子を欠損することにより、該選択マーカー遺伝子の機能が発揮し得るアスペルギルス属微生物であれば特に限定されない。ただし、アスペルギルス属微生物は、アスペルギルス・アクレアタス以外のアスペルギルス属微生物であることが好ましく、安全性や培養の容易性を加味すれば、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・サイトイ、アスペルギルス・ニデュランスなどのアスペルギルス属微生物であることがより好ましい。
宿主生物としては、染色体上にマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を有し、該選択マーカー遺伝子を欠損することにより、該選択マーカー遺伝子の機能が発揮し得るアスペルギルス属微生物であれば特に限定されない。ただし、アスペルギルス属微生物は、アスペルギルス・アクレアタス以外のアスペルギルス属微生物であることが好ましく、安全性や培養の容易性を加味すれば、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・サイトイ、アスペルギルス・ニデュランスなどのアスペルギルス属微生物であることがより好ましい。
宿主生物は、野生株でもよいが、予め野生株を形質転換した形質転換体でもよい。宿主生物として利用される、予め野生株を形質転換した形質転換体は、特に限定されない。
例えば、アスペルギルス属微生物は相同組換え頻度が低い傾向にあることから、相同組換えで形質転換体を作製する場合には、非相同組換え機構に関与するKu70、Ku80などのタンパク質をコードするku遺伝子が抑制された形質転換アスペルギルス属微生物を使用することが好ましい。
このようなku遺伝子の抑制は、当業者に公知の任意の方法で実施することができるが、例えば、ku遺伝子破壊ベクターを使用してku遺伝子を破壊することや、ku遺伝子のアンチセンス発現ベクターを利用するアンチセンスRNA法によって、ku遺伝子を不活化することなどによって達成可能である。また、Casヌクレアーゼと、ku遺伝子を標的としたガイドRNAとを利用したゲノム編集の手法によりku遺伝子を破壊することも可能である。こうして得られる形質転換アスペルギルス属微生物は、ku遺伝子の抑制に関する遺伝子操作が施される前の元のアスペルギルス属微生物と比較して、相同組換え頻度が顕著に上昇している。具体的には、少なくとも2倍、好ましくは少なくとも5倍、好ましくは少なくとも10倍、好ましくは少なくとも約50倍上昇している。
(形質転換体の一実施態様)
形質転換体の一実施態様は、宿主生物がアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ウサミ又はアスペルギルス・サイトイである、染色体上のpyrG遺伝子及びtrpC遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物であるが、これに限定されない。
形質転換体の一実施態様は、宿主生物がアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ウサミ又はアスペルギルス・サイトイである、染色体上のpyrG遺伝子及びtrpC遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物であるが、これに限定されない。
(形質転換アスペルギルス属微生物の製造方法)
マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、宿主生物の染色体上にあるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠落するように、又は該選択マーカー遺伝子の遺伝子座に外来核酸断片を挿入又は置換するようにして、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を欠損させる工程を含む方法などが挙げられる。該工程は相同組換えを利用して実施することが好ましい。
マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、宿主生物の染色体上にあるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠落するように、又は該選択マーカー遺伝子の遺伝子座に外来核酸断片を挿入又は置換するようにして、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を欠損させる工程を含む方法などが挙げられる。該工程は相同組換えを利用して実施することが好ましい。
相同組換えを利用する方法では、例えば、染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の上流領域及び下流領域と相同な相同組換え領域の間に、外来核酸断片を連結するように構築した核酸断片を宿主生物に導入して、相同組換えにより染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を外来核酸断片と置換する方法などが挙げられる。本明細書では、宿主生物を形質転換するために作製された核酸断片を形質転換用カセットとよぶ場合がある。外来核酸断片は、欠損させるべきマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子とは異なるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子であることが好ましい。
形質転換用カセットは、ループアウト領域を含むことが好ましい。ループアウト領域及び外来核酸断片を含む形質転換用カセットにおいて、ループアウト領域と同じ配列をもつ領域が、宿主生物の染色体上における相同組換えで導入可能な部位の上流又は下流にある場合は、相同組換えにより形質転換用カセットが宿主生物の染色体上に導入された後、ループアウト領域の上流又は下流にあるループアウト領域と相同な領域との間で相同組換えが起きることにより、導入した外来核酸断片をループアウトにより除去することができる。このような手段を講じることにより、選択マーカー遺伝子の遺伝子座に外来核酸断片を導入した後、外来核酸断片を除去した形質転換体を得ることができる。
形質転換用カセットの一態様は、例えば、相同組換え領域の間にループアウト領域及び外来核酸断片を含む核酸断片である。該核酸断片は、アスペルギルス属微生物の染色体DNAを鋳型として、常法に従って、相同組換え上流領域、ループアウト領域及び相同組換え下流領域のDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応(以下「PCR」と表記する)によりそれぞれ得た後、プラスミドpUC19のマルチクローニングサイトにあるIn-Fusion Cloning Siteに、相同組換え上流領域、ループアウト領域、外来核酸(DNA)断片及び相同組換え下流領域を順に連結させたコンストラクト用プラスミドを作製し、次いで得られたコンストラクト用プラスミドを鋳型DNAとしてPCRにより増幅することにより得ることができる。
染色体DNAを抽出する方法は特に限定されないが、例えば、アスペルギルス属微生物を培養し、得られた菌体から水分を取り除き、液体窒素中で冷却しながら乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から通常の方法により染色体DNA画分を抽出する。染色体DNA抽出操作には、DNeasy Plant Mini Kit(キアゲン社)などの市販の染色体DNA抽出キットが利用できる。
アスペルギルス属微生物の形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主生物のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストPEG法(例えば、Mol.Gen.Genet.218、99-104、1989、特開2007-222055号公報などを参照;該文献の全記載はここに開示として援用される。)を用いることができる。アスペルギルス属微生物を再生させるための培地は、用いる宿主生物と欠損させる選択マーカー遺伝子や導入した外来核酸断片とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主生物としてアスペルギルス・ソーヤを用い、外来核酸断片として薬剤耐性遺伝子を用いた場合は、形質転換体の再生は、例えば、対応する薬剤を含む最少寒天培地を用いて行うことができる。
マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物が作製されたことの確認は、欠損したマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の機能が認められる条件下で形質転換体を培養し、生育の有無を確認することにより行うことができる。例えば、欠損したマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子がtrpC遺伝子及びpyrG遺伝子である場合は、5-フルオロアントラニル酸(5-FAA)及び5-フルオロオロチン酸(5-FOA)の存在下での生育を確認することにより、形質転換アスペルギルス属微生物が作製されたことを確認することができる。
また、形質転換アスペルギルス属微生物が作製されたことの確認は、形質転換体から染色体DNAを抽出し、これを鋳型としてPCRを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なPCR産物が生じることを確認することにより行ってもよい。
例えば、形質転換用カセットに組み込んだ相同組換え上流領域よりさらに上流に位置する領域に相補的なフォワードプライマーと、形質転換用カセットに組み込んだ相同組換え下流領域よりさらに下流に位置する領域に相補的なリバースプライマーとの組み合わせでPCRを行い、相同組換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。
マーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子を欠損した形質転換体に対して、さらにマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子を欠損させることにより、2種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換体を作製することができる。この手順を繰り返すことにより、複数のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換体を作製することができる。
例えば、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子がtrpC遺伝子及びpyrG遺伝子である場合、pyrG遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を宿主生物として、相同組換え領域の間にループアウト領域及びpyrG遺伝子を含む形質転換用カセットによりtrpC遺伝子を欠損するように形質転換し、さらに導入したpyrG遺伝子をループアウトにより除去することにより、trpC遺伝子及びpyrG遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物が得られる。pyrG遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物としては、例えば、特許第6261039号公報(該文献の全記載はここに開示として援用される。)の実施例2の記載のアスペルギルス・ソーヤKP-del株などが挙げられる。
形質転換アスペルギルス属微生物の作製方法の具体例として、特許第6261039号公報の実施例2の記載の方法が挙げられるが、これに限定されない。該方法によれば、アスペルギルス属微生物の野生株から自然変異により該栄養要求性遺伝子が不活性化された株を取得する。該栄養要求性遺伝子は欠損させるべきマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子であっても、そうでなくても、どちらでもよい。
栄養要求性遺伝子が欠損させるべきマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子である場合は、該栄養要求性遺伝子をトリプトファン生合成遺伝子の遺伝子座に導入することにより、トリプトファン生合成遺伝子を欠損させ、次いで該栄養要求性遺伝子をループアウトにより除去することにより、染色体上の2種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属微生物が得られる。
栄養要求性遺伝子が欠損させるべきマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子ではない場合は、例えば、該栄養要求性遺伝子をトリプトファン生合成遺伝子とは異なるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の遺伝子座に導入することにより、トリプトファン生合成遺伝子とは異なるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を欠損させ、次いでトリプトファン生合成遺伝子とは異なるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子をトリプトファン生合成遺伝子の遺伝子座に導入することにより、トリプトファン生合成遺伝子を欠損させ、次いで導入したトリプトファン生合成遺伝子とは異なるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子をループアウトにより除去することにより、染色体上の2種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属微生物が得られ得る。また、例えば、上記栄養要求性遺伝子をトリプトファン生合成遺伝子の遺伝子座に導入することにより、トリプトファン生合成遺伝子を欠損させ、次いでトリプトファン生合成遺伝子をトリプトファン生合成遺伝子とは異なるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の遺伝子座に導入することにより、トリプトファン生合成遺伝子とは異なるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を欠損させ、次いで導入したトリプトファン生合成遺伝子をループアウトにより除去することにより、染色体上の2種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属微生物が得られ得る。
本発明の別の一態様は、本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属微生物の製造方法である。本発明の一態様の製造方法は、少なくとも下記の工程を含む。ただし、下記工程において、マーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及び第2の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がトリプトファン生合成遺伝子であり、他方が栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である。
(1)染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む核酸断片を用いて、染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程
(2)前記工程(1)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子が挿入され、かつ、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程
(3)前記工程(2)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程
(1)染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む核酸断片を用いて、染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程
(2)前記工程(1)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子が挿入され、かつ、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程
(3)前記工程(2)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程
(標的遺伝子の欠損方法)
本発明の一態様の形質転換アスペルギルス属微生物を利用すれば、形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の2種類又はそれ以上の標的遺伝子を同時的に、又は段階的に欠損させることができる。
本発明の一態様の形質転換アスペルギルス属微生物を利用すれば、形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の2種類又はそれ以上の標的遺伝子を同時的に、又は段階的に欠損させることができる。
本発明の別の一態様は、本発明の一態様の形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の2種類の標的遺伝子の欠損方法である。本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法は、少なくとも下記の工程(A)~(B)を含む。ただし、下記工程において、マーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及び第2の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がトリプトファン生合成遺伝子であり、他方が栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である。
(A)染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、第1の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む第1の核酸断片及び第2の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第2の選択マーカー遺伝子を含む第2の核酸断片を用いて、該第1の標的遺伝子及び該第2の標的遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;及び、
(B)前記工程(A)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の非存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が挿入された形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
(A)染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、第1の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む第1の核酸断片及び第2の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第2の選択マーカー遺伝子を含む第2の核酸断片を用いて、該第1の標的遺伝子及び該第2の標的遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;及び、
(B)前記工程(A)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の非存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が挿入された形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法は、さらに下記の工程(C)を含むことが好ましい:
(C)前記工程(B)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログの存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子、前記第2の選択マーカー遺伝子、前記第1の標的遺伝子及び前記第2の標的遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
(C)前記工程(B)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログの存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子、前記第2の選択マーカー遺伝子、前記第1の標的遺伝子及び前記第2の標的遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の2種類又はそれ以上の標的遺伝子を段階的に欠損させたければ、第1の標的遺伝子に対する第1の核酸断片、マーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ、及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質を使用して上記工程(A)~(C)を実施した後に、第2の標的遺伝子に対する第2の核酸断片、第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ、及び第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質を使用して上記工程(A)~(C)を実施することなどをすればよい。また、工程(C)を第1の選択マーカー遺伝子を除去する工程と第2の選択マーカー遺伝子を除去する工程とに分けて段階的に行うこともできる。このような段階的な標的遺伝子の欠損方法もまた、本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法に包含される。
(方法の具体例)
本発明の一態様の製造方法及び本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法の非限定的な具体例において、マーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子はpyrG遺伝子であり、第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質はウラシル/ウリジンであり、第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは5-FOAであり、マーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子はtrpC遺伝子であり、第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質はトリプトファンであり、第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは5-FAAである。
本発明の一態様の製造方法及び本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法の非限定的な具体例において、マーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子はpyrG遺伝子であり、第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質はウラシル/ウリジンであり、第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは5-FOAであり、マーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子はtrpC遺伝子であり、第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質はトリプトファンであり、第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは5-FAAである。
本発明の一態様の製造方法及び本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法の別の非限定的な具体例において、マーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子はtrpC遺伝子であり、第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質はトリプトファンであり、第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは5-FAAであり、マーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子はpyrG遺伝子であり、第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質はウラシル/ウリジンであり、第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは5-FOAである。
上記具体例において、5-FAAに耐性を有する株、5-FOAに耐性を有する株並びに5-FAA及び5-FOAに耐性を有する株の選抜の際に用いる5-FAA及び5-FOAの濃度がそれぞれ異なることは、本発明者によって初めて見出された知見である。5-FAA及び5-FOAに耐性を有する株の選抜の際に用いる5-FAA及び5-FOAの濃度は、それらを単独で用いる場合よりも小さい濃度であることが好ましい。5-FAAに耐性を有する株の選抜には、0.03%(w/v)~0.05%(w/v)5-FAAを用いることが好ましい。5-FOAに耐性を有する株の選抜には、0.2%(w/v)~0.4%(w/v)5-FOAを用いることが好ましい。5-FAA及び5-FOAに耐性を有する株の選抜には、0.005%(w/v)~0.02%(w/v)5-FAA及び0.05%(w/v)~0.15%(w/v)5-FOAを用いることが好ましい。
本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法における標的遺伝子は特に限定されず、研究や調査の目的に応じて適宜設定すればよい。例えば、後述する実施例に記載があるとおり、宿主生物がアスペルギルス・ソーヤである場合、標的遺伝子をparp1遺伝子及びnph遺伝子として、これらの遺伝子が破壊された二重破壊株を得ることができる。
また、本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法を応用すると、1種類のマーカーリサイクル法に利用可能な遺伝子を用いるのみでは達成し得ないことが2種類のマーカーリサイクル法に利用可能な遺伝子を用いることで可能になる。例えば、pyrG遺伝子及びtrpC遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を用いて、ku遺伝子の遺伝子座にtrpC遺伝子を導入してku破壊株を作製する。この際、相同組換え領域の間にtrpC遺伝子を含む核酸断片を用いることができるのみでなく、trpC遺伝子の中程で互いに部分的に重複するように該断片を分割した形の2種の核酸断片を調製し、混合したものを、ku遺伝子破壊に用いることも可能である。次いで標的遺伝子としてプロテアーゼ遺伝子の遺伝子座にpyrG遺伝子を導入及び除去した後、必要に応じてさらに別のプロテアーゼ遺伝子座へのpyrG遺伝子の導入及び除去を繰り返した後、導入したtrpC遺伝子を除去してku遺伝子を復活させる。この際、ku遺伝子を部分的に重複させておくことでループアウトによりtrpC遺伝子の除去と共にku遺伝子を復活させることが可能である。得られたプロテアーゼ遺伝子破壊株に対して、所望のタンパク質を発現する遺伝子発現用カセットを非相同組換えでランダムに多コピー導入することにより、該タンパク質をプロテアーゼによる分解を防ぎながら高発現する株を得ることができる。
本発明の一態様の製造方法及び本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法では、本発明の課題を解決し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
本実施例で用いたプライマーを表2A~表2Bに示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列は隣接する断片に連結するための付加配列を示す。
[例1.アスペルギルス・ソーヤにおけるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子としてのtrpC遺伝子の利用]
1.AstrpC破壊株の作製
(1-1)染色体DNAの抽出
150ml容量の三角フラスコにポリペプトンデキストリン培地(1%(w/v)ポリペプトン、2%(w/v)デキストリン、0.5%(w/v)KH2PO4、0.1%(w/v)NaNO3、0.05%(w/v)MgSO4・7H2O、0.1%(w/v)カザミノ酸;pH6.0)を蒸留水で30ml調製し、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株の分生子を接種して30℃で一晩振とう培養した。
1.AstrpC破壊株の作製
(1-1)染色体DNAの抽出
150ml容量の三角フラスコにポリペプトンデキストリン培地(1%(w/v)ポリペプトン、2%(w/v)デキストリン、0.5%(w/v)KH2PO4、0.1%(w/v)NaNO3、0.05%(w/v)MgSO4・7H2O、0.1%(w/v)カザミノ酸;pH6.0)を蒸留水で30ml調製し、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株の分生子を接種して30℃で一晩振とう培養した。
得られた培養液からろ過により菌体を回収し、ペーパータオルに挟んで水分を除き、予め液体窒素で冷却した乳鉢及び乳棒を用いて液体窒素で冷却しながら菌体を粉砕した。得られた粉砕菌体からDNeasy Plant Mini Kit(キアゲン社)を用いて染色体DNAを抽出した。
(1-2)AstrpC破壊用カセットを含むプラスミドの作製
プラスミドpUC19に、相同組換えのための上流領域1(As上流領域1)、ウリジン/ウラシル要求性を相補する形質転換マーカーであるpyrG遺伝子及び相同組換えのための下流領域1(As下流領域1)を順に連結させたコンストラクト用プラスミドを次のとおりに作製した。
プラスミドpUC19に、相同組換えのための上流領域1(As上流領域1)、ウリジン/ウラシル要求性を相補する形質転換マーカーであるpyrG遺伝子及び相同組換えのための下流領域1(As下流領域1)を順に連結させたコンストラクト用プラスミドを次のとおりに作製した。
As上流領域1、AspyrG遺伝子及びAs下流領域1を増幅するために、鋳型DNAとして上記(1-1)で得られたアスペルギルス・ソーヤNBRC4239株の染色体DNA、PCRの酵素としてQ5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix(ニュー・イングランド・バイオラボ社)、装置としてT100サーマルサイクラー(バイオ・ラッド社)を使用して、酵素に添付されたプロトコールに従ってPCRを実施した。
As上流領域1、AspyrG遺伝子及びAs下流領域1を増幅するために使用したプライマー配列番号1~6のプライマーである。増幅したDNA断片をQIAquick PCR Purification Kit(キアゲン社)を用いて精製した。
pUC19は、In-Fusion HD Cloning Kit(クロンテック社)に付属されているpUC19 linearized Vectorを用いた。pUC19のマルチクローニングサイトにあるIn-Fusion Cloning Siteにて、増幅した3種のDNA断片を、上記したIn-Fusion HD Cloning Kitを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、コンストラクト用プラスミドを得た。
得られたコンストラクト用プラスミドにより、コンピテントセルであるECOS Competent E.coli JM109(ニッポンジーン社)を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。
得られた形質転換大腸菌を、50μg/mlのアンピシリンを含むLB液体培地で37℃、一晩振とう培養した。培養後の培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体について、FastGene Plasmid Mini Kit(日本ジェネティクス社)を用いて、キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドDNAを抽出した。
pUC19のマルチクローニングサイトに、As上流領域1-AspyrG-As下流領域1の配列が順に連結されたプラスミドを得た。得られたプラスミドをpTrpC_HRとした。
(1-3)AstrpC破壊用カセットの増幅
鋳型DNAとして上記(1-2)で得られたプラスミドpTrpC_HRを用いて、上記(1-2)の記載に準じてPCR及びPCR産物の精製を実施することによりAstrpC破壊用カセットを得た。使用したプライマーは配列番号7~8のプライマーである。
鋳型DNAとして上記(1-2)で得られたプラスミドpTrpC_HRを用いて、上記(1-2)の記載に準じてPCR及びPCR産物の精製を実施することによりAstrpC破壊用カセットを得た。使用したプライマーは配列番号7~8のプライマーである。
上記のようにして、As上流領域1-AspyrG-As下流領域1の配列が順に連結されたAstrpC破壊用カセットを得た。
(1-4)アスペルギルス・ソーヤKP-del株の形質転換
宿主として、特許第6261039号公報の実施例2の記載に準じて、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株の染色体上のpyrG遺伝子及び遺伝子ターゲッティング効率の向上のために、非相同組換えに関与する遺伝子であるku70遺伝子を破壊したアスペルギルス・ソーヤKP-del株を作製した。AstrpC破壊用カセットを用いたアスペルギルス・ソーヤKP-del株の形質転換の概略を図2に示す。図2に示されているとおり、AstrpC破壊用カセットを用いて形質転換することにより、アスペルギルス・ソーヤKP-del株の染色体上のtrpC遺伝子の遺伝子座にpyrG遺伝子を導入して、trpC遺伝子が欠損し、かつ、pyrG遺伝子を有するAstrpC破壊株を作製した。
宿主として、特許第6261039号公報の実施例2の記載に準じて、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株の染色体上のpyrG遺伝子及び遺伝子ターゲッティング効率の向上のために、非相同組換えに関与する遺伝子であるku70遺伝子を破壊したアスペルギルス・ソーヤKP-del株を作製した。AstrpC破壊用カセットを用いたアスペルギルス・ソーヤKP-del株の形質転換の概略を図2に示す。図2に示されているとおり、AstrpC破壊用カセットを用いて形質転換することにより、アスペルギルス・ソーヤKP-del株の染色体上のtrpC遺伝子の遺伝子座にpyrG遺伝子を導入して、trpC遺伝子が欠損し、かつ、pyrG遺伝子を有するAstrpC破壊株を作製した。
500ml容量の三角フラスコに20mM ウラシル及び20mM ウリジンを含むポリペプトンデキストリン液体培地 100mlに、アスペルギルス・ソーヤKP-del株の分生子を接種し、30℃で約20時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び20μgのAstrpC破壊用カセットを用いて、プロトプラストPEG法により形質転換を行い、次いで1mM トリプトファン、0.5%(w/v)寒天及び1.2M ソルビトールを含むCzapek-Dox最少培地(ディフコ社;pH6)を用いて、30℃、5日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。
AstrpCが破壊された形質転換アスペルギルス・ソーヤは、AstrpC遺伝子の位置に挿入されたAspyrG遺伝子によって宿主のウラシル要求性が相補され、代わりにトリプトファン要求性になる。
(1-5)AstrpC破壊株の選抜
上記(1-2)に準じて抽出した形質転換アスペルギルス・ソーヤの染色体DNAを鋳型として、PCRで確認することにより、AstrpC遺伝子が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号9~12のプライマーである。
上記(1-2)に準じて抽出した形質転換アスペルギルス・ソーヤの染色体DNAを鋳型として、PCRで確認することにより、AstrpC遺伝子が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号9~12のプライマーである。
上記のPCRを実施することにより、AstrpC遺伝子由来の692bpのPCR産物が生じず、破壊対象ではないAslig1遺伝子由来の439bpのPCR産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認し、AstrpC破壊株を選抜した。
選抜したAstrpC破壊株について、PCR及びPCR産物の制限酵素消化処理を行うことにより、AstrpC破壊用カセットが相同組換えで導入されたことを確認した。使用したプライマーは配列番号13~14のプライマーである。
AstrpC破壊株では、5.7kbのPCR産物が生じ、これをKpnIで消化することにより2.4kb、2.1kb及び1.2kbの断片が生じた。なお、宿主では、6.4kbのPCR産物が生じ、これをKpnIで消化することにより3.5kb及び2.9kbの断片が生じた。
(1-6)トリプトファン要求性の確認
AstrpC破壊用カセットが相同組換えで導入されていることを確認したAstrpC破壊株を、1mM トリプトファンを含む、又は含まないCzapek-Dox最少寒天培地のプレートにそれぞれ植菌して、30℃、4日間インキュベートし、トリプトファンを含む培地でのみ生育することを確認した。
AstrpC破壊用カセットが相同組換えで導入されていることを確認したAstrpC破壊株を、1mM トリプトファンを含む、又は含まないCzapek-Dox最少寒天培地のプレートにそれぞれ植菌して、30℃、4日間インキュベートし、トリプトファンを含む培地でのみ生育することを確認した。
(1-7)AstrpC破壊株の5-FAA耐性の確認
AstrpC破壊株及び対照としてアスペルギルス・ソーヤNBRC4239株を、0.04%(w/v)5-FAA及び1mM トリプトファンを含むポテトデキストロース寒天培地(日水製薬社)のプレートに植菌し、30℃、4日間インキュベートした。NBRC4239株は全く生育しなかったのに対し、AstrpC破壊株は生育した。これにより、AstrpC破壊株は5-FAAに耐性を示すことを確認した。なお、5-FAA(5-フルオロアントラニル酸;東京化成工業社)は、エタノールを用いて10%溶液を調製し、最終濃度が上記濃度になるように培地に添加して使用した。
AstrpC破壊株及び対照としてアスペルギルス・ソーヤNBRC4239株を、0.04%(w/v)5-FAA及び1mM トリプトファンを含むポテトデキストロース寒天培地(日水製薬社)のプレートに植菌し、30℃、4日間インキュベートした。NBRC4239株は全く生育しなかったのに対し、AstrpC破壊株は生育した。これにより、AstrpC破壊株は5-FAAに耐性を示すことを確認した。なお、5-FAA(5-フルオロアントラニル酸;東京化成工業社)は、エタノールを用いて10%溶液を調製し、最終濃度が上記濃度になるように培地に添加して使用した。
5-FAA濃度を0.02%(w/v)に変えて同様に行ったところ、AstrpC破壊株及びNBRC4239株はともに生育した。したがって、アスペルギルス・ソーヤに対して0.04%(w/v)5-FAAを用いることにより、AstrpC破壊株を選抜できることがわかった。
2.AstrpCマーカー遺伝子を用いた遺伝子破壊
(2-1)破壊対象遺伝子
破壊対象遺伝子として、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株の公開ゲノムデータベース(BioProject Accession:PRJDA60265)から、scaffold00063(DF093585.1)の3347080-3344733の領域に予測されるpoly(ADP-ribose) polymeraseの遺伝子を対象とすることにした。該遺伝子を、Asparp1遺伝子とした。
(2-1)破壊対象遺伝子
破壊対象遺伝子として、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株の公開ゲノムデータベース(BioProject Accession:PRJDA60265)から、scaffold00063(DF093585.1)の3347080-3344733の領域に予測されるpoly(ADP-ribose) polymeraseの遺伝子を対象とすることにした。該遺伝子を、Asparp1遺伝子とした。
(2-2)Asparp1破壊用カセットを含むプラスミドの作製
上記(1-2)に記載の方法に準じて、プラスミドpUC19に、相同組換えのための上流領域2(As上流領域2)、ループアウトのための領域1(Asループアウト領域1)、AstrpC遺伝子及び相同組換えのための下流領域2(As下流領域2)を順に連結させたプラスミドpPARP1_LO_Trpを作製した。使用したプライマーは配列番号15~22のプライマーである。
上記(1-2)に記載の方法に準じて、プラスミドpUC19に、相同組換えのための上流領域2(As上流領域2)、ループアウトのための領域1(Asループアウト領域1)、AstrpC遺伝子及び相同組換えのための下流領域2(As下流領域2)を順に連結させたプラスミドpPARP1_LO_Trpを作製した。使用したプライマーは配列番号15~22のプライマーである。
(2-3)Asparp1破壊用カセットの増幅
鋳型DNAとして上記(2-2)で得られたプラスミドpPARP1_LO_Trpを用いて、上記(1-3)の記載に準じてPCR及びPCR産物の精製を実施することにより、Asparp1破壊用カセットを得た。使用したプライマーは配列番号23~24のプライマーである。
鋳型DNAとして上記(2-2)で得られたプラスミドpPARP1_LO_Trpを用いて、上記(1-3)の記載に準じてPCR及びPCR産物の精製を実施することにより、Asparp1破壊用カセットを得た。使用したプライマーは配列番号23~24のプライマーである。
上記のようにして、As上流領域2-Asループアウト領域1-AstrpC-As下流領域2の配列が順に連結されたAsparp1破壊用カセットを得た。
(2-4)Asparp1破壊株の作製
以下の手順により、Asparp1破壊株を作製した。なお、Asparp1破壊用カセットを用いたAstrpC破壊株の形質転換の概略を図3に示す。図3に示されているとおり、Asparp1破壊用カセットを用いて形質転換することにより、AstrpC破壊株の染色体上のparp1遺伝子の遺伝子座にtrpC遺伝子を導入して、parp1遺伝子が欠損し、かつ、trpC遺伝子を有する形質転換アスペルギルス・ソーヤを作製した。
以下の手順により、Asparp1破壊株を作製した。なお、Asparp1破壊用カセットを用いたAstrpC破壊株の形質転換の概略を図3に示す。図3に示されているとおり、Asparp1破壊用カセットを用いて形質転換することにより、AstrpC破壊株の染色体上のparp1遺伝子の遺伝子座にtrpC遺伝子を導入して、parp1遺伝子が欠損し、かつ、trpC遺伝子を有する形質転換アスペルギルス・ソーヤを作製した。
500ml容量の三角フラスコに1mM トリプトファンを含むポリペプトンデキストリン液体培地 100mlに、AstrpC破壊株の分生子を接種し、30℃で約24時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び20μgのAsparp1破壊用カセットを用いて、プロトプラストPEG法により形質転換を行い、次いで0.5%(w/v)寒天及び1.2M ソルビトールを含むCzapek-Dox最少培地を用いて、30℃、5日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。
Asparp1が破壊された形質転換アスペルギルス・ソーヤは、Asparp1遺伝子の位置に挿入されたAstrpC遺伝子によって宿主のトリプトファン要求性が相補されている。
(2-5)Asparp1破壊株の選抜
上記(1-5)の記載に準じて、形質転換株から染色体DNAを抽出してPCRで確認することにより、Asparp1遺伝子が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号25~28のプライマーである。
上記(1-5)の記載に準じて、形質転換株から染色体DNAを抽出してPCRで確認することにより、Asparp1遺伝子が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号25~28のプライマーである。
上記のPCRを実施することにより、Asparp1遺伝子由来の460bpのPCR産物が生じず、破壊対象ではないAsPtefプロモーター由来の720bpのPCR産物が生じたことをアガロースゲル電気泳動により確認した。アガロースゲル電気泳動の結果を図4Aに示す。図4Aに示すとおり、形質転換株2、6及び7では、parp1遺伝子のPCR産物(PARP)が生じなかった。
選抜したAsparp1破壊株について、PCRを行うことにより、Asparp1破壊用カセットが相同組換えで導入されたことをアガロースゲル電気泳動により確認した。使用したプライマーは配列番号29~30のプライマーである。
アガロースゲル電気泳動の結果を図4Bに示す。図4Bに示すとおり、上記の形質転換株2、6及び7のうち、形質転換株2及び7では9.6kbのPCR産物が生じた。なお、宿主では、5.3kbのPCR産物が生じた。これにより、形質転換株2及び7(それぞれPARP_2及びPARP_7)をAsparp1破壊株とした。
3.導入したAstrpCマーカー遺伝子の除去
(3-1)AstrpC除去株の確認
図5に概略を示すとおり、以下の手順により、Asparp1破壊株に導入したtrpC遺伝子をループアウトにより除去した、trpC遺伝子及びparp1遺伝子が除去された株を選抜した。
(3-1)AstrpC除去株の確認
図5に概略を示すとおり、以下の手順により、Asparp1破壊株に導入したtrpC遺伝子をループアウトにより除去した、trpC遺伝子及びparp1遺伝子が除去された株を選抜した。
Asparp1破壊株の分生子を、1mM トリプトファン及び0.04%(w/v)5-FAAを含むポテトデキストロース寒天培地(日水製薬社)のプレートに塗沫し、30℃、4日間にてインキュベートした。図5に、塗沫したPARP_2及びPARP_7の分生子数、出現した耐性株数及びそれらから算出された耐性株出現頻度を示す。
生じた5-FAA耐性株から染色体DNAを抽出して配列番号29~30のプライマーを用いてPCRを行うことにより、ループアウトが起きてAstrpCが除去されたAstrpC除去株であることをアガロースゲル電気泳動により確認した。PARP_7株より選抜した5-FAA耐性株7株を対象としたアガロースゲル電気泳動の結果を図6Aに示す。
図6Aが示すととおり、ループアウトが起きることにより、想定どおりに、3.0kbのPCR産物が生じた。なお、ループアウトが起きない場合は、9.6kbのPCR産物を生じる。
また、AstrpC除去株から染色体DNAを抽出して、配列番号9~12のプライマーを用いてPCRを行うことにより、AstrpC遺伝子由来の692bpのPCR産物が生じず、破壊対象ではないAslig1遺伝子由来の439bpのPCR産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認した。PARP_7株より選抜した5-FAA耐性株7株を対象としたアガロースゲル電気泳動の結果を図6Bに示す。これらの7株をAstrpC除去株として選抜した。
(3-2)トリプトファン要求性の確認
選抜したAstrpC除去株を、1mM トリプトファンを含む、又は含まないCzapek-Dox最少寒天培地のプレートにそれぞれ植菌して、30℃、4日間インキュベートすることにより、AstrpC除去株は、トリプトファンを含む培地でのみ生育する、すなわちトリプトファン要求性であることを確認した。また、5-FAAを用いることにより、AstrpCが除去できることが示された。
選抜したAstrpC除去株を、1mM トリプトファンを含む、又は含まないCzapek-Dox最少寒天培地のプレートにそれぞれ植菌して、30℃、4日間インキュベートすることにより、AstrpC除去株は、トリプトファンを含む培地でのみ生育する、すなわちトリプトファン要求性であることを確認した。また、5-FAAを用いることにより、AstrpCが除去できることが示された。
[例2.アスペルギルス・オリゼにおけるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子としてのtrpC遺伝子の利用]
1.AotrpC破壊株の作製
例1と同様にして、アスペルギルス・オリゼRIB40株の染色体DNAを鋳型として、相同組換えのための上流領域1(Ao上流領域1)及び相同組換えのための下流領域1(Ao下流領域1)のDNA断片を得た後、プラスミドpUC19に、Ao上流領域1、AspyrG遺伝子及びAo下流領域1を順に連結させたコンストラクト用プラスミドpAoTrpC_HRを作製した。使用したプライマーは配列番号31~34のプライマーである。
1.AotrpC破壊株の作製
例1と同様にして、アスペルギルス・オリゼRIB40株の染色体DNAを鋳型として、相同組換えのための上流領域1(Ao上流領域1)及び相同組換えのための下流領域1(Ao下流領域1)のDNA断片を得た後、プラスミドpUC19に、Ao上流領域1、AspyrG遺伝子及びAo下流領域1を順に連結させたコンストラクト用プラスミドpAoTrpC_HRを作製した。使用したプライマーは配列番号31~34のプライマーである。
次いで、例1と同様にして、鋳型DNAとしてプラスミドpAoTrpC_HRを用いて、AotrpC破壊用カセットを増幅した。使用したプライマーは配列番号35~36のプライマーである。
上記のようにして、Ao上流領域1-AspyrG-Ao下流領域1の配列が順に連結されたAotrpC破壊用カセットを得た。
AotrpC破壊株を作製するための宿主として、特許第5704609号公報に記載があるとおりの、アスペルギルス・オリゼRkuN16ptr1株(Mol.Genet.Genomics,275:460,2006, Biosci.Biotechnol.Biochem,70:135,2006;該文献の全記載はここに開示として援用される。)を用いた。なお、RkuN16ptr1株ではpyrG遺伝子及びku70遺伝子が破壊してある。
500ml容量の三角フラスコに10mM ウラシルを含むポリペプトンデキストリン液体培地100mlに、アスペルギルス・オリゼRkuN16ptr1株の分生子を接種し、30℃で約20時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び20μgのAotrpC破壊用カセットを用いて、プロトプラストPEG法により形質転換を行い、次いで1mM トリプトファン、0.5%(w/v)寒天及び1.2M ソルビトールを含むCzapek-Dox最少培地を用いて、30℃、5日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・オリゼを得た。
AotrpCが破壊された形質転換アスペルギルス・オリゼは、AotrpC遺伝子の位置に挿入されたAspyrG遺伝子によって宿主のウラシル/ウリジン要求性が相補され、代わりにトリプトファン要求性になる。
次いで、例1と同様にして、形質転換アスペルギルス・オリゼの染色体DNAを鋳型として、PCRで確認することにより、AotrpC遺伝子が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号9~10及び37~38のプライマーである。
上記のPCRを実施することにより、AotrpC遺伝子由来の692bpのPCR産物が生じず、破壊対象ではないAolig1遺伝子由来の462bpのPCR産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認し、AotrpC破壊株を選抜した。
選抜したAotrpC破壊株について、PCR及びPCR産物の制限酵素消化処理を行うことにより、AotrpC破壊用カセットが相同組換えで導入されたことを確認した。使用したプライマーは配列番号14及び39のプライマーである。
AotrpC破壊株では、5.7kbのPCR産物が生じ、これをKpnIで消化することにより2.5kb、2.1kb及び1.2kbの断片が生じた。なお、宿主では、6.3kbのPCR産物が生じ、これをKpnIで消化することにより3.5kb及び2.8kbの断片が生じた。
AotrpC破壊用カセットが相同組換えで導入されていることを確認したAotrpC破壊株を、1mM トリプトファンを含む、又は含まないCzapek-Dox最少寒天培地のプレートにそれぞれ植菌して、30℃、5日間インキュベートし、トリプトファンを含む培地でのみ生育することを確認した。
AotrpC破壊株及び対照としてアスペルギルス・オリゼRIB40株を、0.12%(w/v)5-FAA及び1mM トリプトファンを含むサブローデキストロース寒天培地(BD社)のプレートに植菌し、30℃、4日間インキュベートした。RIB40株は全く生育しなかったのに対し、AotrpC破壊株は生育した。これにより、AotrpC破壊株は5-FAAに耐性を示すことを確認した。
また、5-FAA濃度を0.1%(w/v)に変えて同様に行ったところ、AotrpC破壊株及びRIB40株はともに生育した。したがって、アスペルギルス・オリゼに対して0.12%(w/v)5-FAAを用いることにより、AotrpC破壊株が選抜できることがわかった。
2.AotrpCマーカー遺伝子を用いた遺伝子破壊
破壊対象遺伝子として、アスペルギルス・オリゼRIB40株の公開ゲノムデータベース(BioProject Accession:PRJNA20809)から、SC102の1456616-1457378の領域にある機能不明の予測遺伝子を用いた。該遺伝子を、AohypGとした。
破壊対象遺伝子として、アスペルギルス・オリゼRIB40株の公開ゲノムデータベース(BioProject Accession:PRJNA20809)から、SC102の1456616-1457378の領域にある機能不明の予測遺伝子を用いた。該遺伝子を、AohypGとした。
例1と同様にして、アスペルギルス・オリゼRIB40株の染色体DNAを鋳型として、相同組換えのための上流領域2(Ao上流領域2)、AotrpC遺伝子、ループアウトのための領域(Aoループアウト領域1)及び相同組換えのための下流領域2(Ao下流領域2)のDNA断片を得た後、プラスミドpUC19に、Ao上流領域2、AotrpC遺伝子、Aoループアウト領域1及びAo下流領域2を順に連結させたコンストラクト用プラスミドpAoHypG_LO_TrpCを作製した。使用したプライマーは配列番号20及び40~46のプライマーである。
例1と同様にして、鋳型DNAとして上記で得られたプラスミドpAoHypG_LO_TrpCを用いて、AohypG破壊用カセットを得た。使用したプライマーは配列番号47~48のプライマーである。
上記のようにして、Ao上流領域2-AotrpC-Aoループアウト領域1-Ao下流領域2の配列が順に連結されたAohypG破壊用カセットを得た。
以下の手順により、AohypG破壊株を作製した。なお、AohypG破壊用カセットを用いたAotrpC破壊株の形質転換の概略を図7に示す。図7に示されているとおり、AohypG破壊用カセットを用いて形質転換することにより、AotrpC破壊株の染色体上のhypG遺伝子の遺伝子座にtrpC遺伝子を導入して、hypG遺伝子が欠損し、かつ、trpC遺伝子を有する形質転換アスペルギルス・オリゼを作製した。
500ml容量の三角フラスコにおける1mM トリプトファンを含むポテトデキストロース液体培地(BD社)100mlに、アスペルギルス・オリゼAotrpC破壊株の分生子を接種し、30℃で約24時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び20μgのAohypG破壊用カセットを用いて、プロトプラストPEG法により形質転換を行い、次いで0.5%(w/v)寒天及び1.2Mソルビトールを含むCzapek-Dox最少培地を用いて、30℃、5日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・オリゼを得た。
AohypGが破壊された形質転換アスペルギルス・オリゼは、AohypG遺伝子の位置に挿入されたAotrpC遺伝子によって宿主のトリプトファン要求性が相補されている。
例1と同様にして、形質転換株から染色体DNAを抽出してPCRで確認することにより、AohypG遺伝子が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号37~38及び49~50のプライマーである。
上記のPCRを実施することにより、AohypG遺伝子由来の702bpのPCR産物が生じず、破壊対象ではないAolig1由来の462bpのPCR産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認し、AohypG破壊株を選抜した。
選抜したAohypG破壊株について、PCRを行うことにより、AohypG破壊用カセットが相同組換えで導入されたことを確認した。使用したプライマーは配列番号51~52のプライマーである。
AohypG破壊株では、8.6kbのPCR産物が生じた。なお、宿主では、4.3kbのPCR産物が生じた。
3.導入したAotrpCマーカー遺伝子の除去
図8に概略を示すとおり、以下の手順により、AohypG破壊株に導入したtrpC遺伝子をループアウトにより除去した、trpC遺伝子及びhypG遺伝子が除去された株を選抜した。
図8に概略を示すとおり、以下の手順により、AohypG破壊株に導入したtrpC遺伝子をループアウトにより除去した、trpC遺伝子及びhypG遺伝子が除去された株を選抜した。
AohypG破壊株の分生子を、1mM トリプトファン及び0.12%(w/v)5-FAAを含むサブローデキストロース寒天培地(BD社)のプレートに塗沫し、30℃、5日間以上インキュベートした。
生じた5-FAA耐性株から染色体DNAを抽出して配列番号51~52のプライマーを用いてPCRを行うことにより、ループアウトが起きてAotrpCが除去されたAotrpC除去株であることをアガロースゲル電気泳動により確認した。生じた5-FAA耐性株6株を対象にしたアガロースゲル電気泳動の結果を図9Aに示す。
図9Aが示すとおり、いずれの5-FAA耐性株においても、ループアウトが起きることにより、想定どおりに、2.7kbの産物が生じた。なお、ループアウトが起きない場合は、8.6kbのPCR産物を生じる。
また、5-FAA耐性株から染色体DNAを抽出して、配列番号9~10及び37~38のプライマーを用いてPCRを行うことにより、AotrpC遺伝子由来の692bpのPCR産物が生じず、破壊対象ではないAolig1遺伝子由来の462bpのPCR産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認した。5-FAA耐性株6株を対象としたアガロースゲル電気泳動の結果を図9Bに示す。これらの6株をAotrpC除去株として選抜した。
また、例1と同様の方法によって、AotrpC除去株は、トリプトファンを含む培地でのみ生育する、すなわちトリプトファン要求性であることを確認した。また、5-FAAを用いることにより、AotrpCが除去できることが示された。
[例3.アスペルギルス・ニガーにおけるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子としてのtrpC遺伝子の利用]
1.AntrpC破壊株の作製
例1と同様にして、アスペルギルス・ニガーA1179株(ΔkusA、pyrG-;Fungal Genetics Stock Centerから入手)の染色体DNAを鋳型として、相同組換えのための上流領域1(An上流領域1)及び相同組換えのための下流領域1(An下流領域1)のDNA断片を得た後、プラスミドpUC19に、An上流領域1、AspyrG遺伝子及びAn下流領域1を順に連結させたコンストラクト用プラスミドpAnTrpC_HRを作製した。使用したプライマーは配列番号53~56のプライマーである。
1.AntrpC破壊株の作製
例1と同様にして、アスペルギルス・ニガーA1179株(ΔkusA、pyrG-;Fungal Genetics Stock Centerから入手)の染色体DNAを鋳型として、相同組換えのための上流領域1(An上流領域1)及び相同組換えのための下流領域1(An下流領域1)のDNA断片を得た後、プラスミドpUC19に、An上流領域1、AspyrG遺伝子及びAn下流領域1を順に連結させたコンストラクト用プラスミドpAnTrpC_HRを作製した。使用したプライマーは配列番号53~56のプライマーである。
次いで、例1と同様にして、鋳型DNAとしてプラスミドpAnTrpC_HRを用いて、AntrpC破壊用カセットを増幅した。使用したプライマーは配列番号57~58のプライマーである。
上記のようにして、An上流領域1-AspyrG-An下流領域1の配列が順に連結されたAntrpC破壊用カセットを得た。
500ml容量の三角フラスコの中に10mM ウラシル及び10mM ウリジンを含むポテトデキストロース液体培地(BD社)100mlに、アスペルギルス・ニガーA1179株の分生子を接種し、30℃で約16時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び20μgのAntrpC破壊用カセットを用いて、プロトプラストPEG法により形質転換を行い、次いで1mM トリプトファン、0.5%(w/v)寒天及び1.2M ソルビトールを含むCzapek-Dox最少培地を用いて、30℃、4日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ニガーを得た。
AntrpCが破壊された形質転換アスペルギルス・ニガーは、AntrpC遺伝子の位置に挿入されたAspyrG遺伝子によって宿主のウラシル要求性が相補され、代わりにトリプトファン要求性になる。
次いで、例1と同様にして、形質転換アスペルギルス・ニガーの染色体DNAを鋳型として、PCRで確認することにより、AntrpC遺伝子が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号59~62のプライマーである。
上記のPCRを実施することにより、AntrpC遺伝子由来の420bpのPCR産物が生じず、導入されたAspyrG遺伝子由来の862bpのPCR産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認し、AntrpC破壊株を選抜した。
選抜したAntrpC破壊株について、PCR及びPCR産物の制限酵素消化処理を行うことにより、AntrpC破壊用カセットが相同組換えで導入されたことを確認した。使用したプライマーは配列番号63~64のプライマーである。
AntrpC破壊株では、5.5kbのPCR産物が生じ、これをKpnIで消化することにより2.4kb、2.0kb及び1.2kbの断片が生じた。なお、宿主では、6.1kbのPCR産物が生じるが、該PCR産物はKpnIで消化されなかった。
AntrpC破壊用カセットが相同組換えで導入されていることを確認したAntrpC破壊株を、1mM トリプトファンを含む、又は含まないCzapek-Dox最少寒天培地のプレートにそれぞれ植菌して、30℃、7日間インキュベートし、トリプトファンを含む培地でのみ生育することを確認した。
2.AntrpCマーカー遺伝子を用いた遺伝子破壊
破壊対象遺伝子として、アスペルギルス・ニガーが有するトレハロース6リン酸合成酵素であるTpsCの遺伝子(BMC Microbiol 14,90(2014)、[Website]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3991884/を参照;該文献の全記載はここに開示として援用される。)を用いた。該遺伝子を、AntpsCとした。
破壊対象遺伝子として、アスペルギルス・ニガーが有するトレハロース6リン酸合成酵素であるTpsCの遺伝子(BMC Microbiol 14,90(2014)、[Website]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3991884/を参照;該文献の全記載はここに開示として援用される。)を用いた。該遺伝子を、AntpsCとした。
例1と同様にして、アスペルギルス・ニガーA1179株の染色体DNAを鋳型として、相同組換えのための上流領域2(An上流領域2)、ループアウトのための領域(Anループアウト領域1)、AntrpC遺伝子及び相同組換えのための下流領域2(An下流領域2)のDNA断片を得た後、プラスミドpUC19に、An上流領域2、Anループアウト領域1、AntrpC遺伝子及びAn下流領域2を順に連結させたコンストラクト用プラスミドpAnTpsC_LO_TrpCを作製した。使用したプライマーは配列番号65~72のプライマーである。
例1と同様にして、鋳型DNAとして上記で得られたプラスミドpAnTpsC_LO_TrpCを用いて、AntpsC破壊用カセットを得た。使用したプライマーは配列番号73~74のプライマーである。
上記のようにして、An上流領域2-Anループアウト領域1-AntrpC-An下流領域2の配列が順に連結されたAntpsC破壊用カセットを得た。
以下の手順により、AntrpC破壊株をAntpsC破壊用カセットを用いて形質転換することにより、AntpsC破壊株を作製した。
500ml容量の三角フラスコの中に1mM トリプトファンを含むポテトデキストロース液体培地 100mlに、アスペルギルス・ニガーAntrpC破壊株の分生子を接種し、30℃で約16時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び20μgのAntpsC破壊用カセットを用いて、プロトプラストPEG法により形質転換を行い、次いで0.5%(w/v)寒天及び1.2Mソルビトールを含むCzapek-Dox最少培地を用いて、30℃、4日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ニガーを得た。
AntpsCが破壊された形質転換アスペルギルス・ニガーは、AntpsC遺伝子の位置に挿入されたAntrpC遺伝子によって宿主のトリプトファン要求性が相補されている。
例1と同様にして、形質転換株から染色体DNAを抽出してPCRで確認することにより、AntpsC遺伝子が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号61~62及び75~76のプライマーである。
上記のPCRを実施することにより、AntpsC遺伝子由来の430bpのPCR産物が生じず、導入したAspyrG遺伝子由来の862bpのPCR産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認し、AntpsC破壊株を選抜した。
選抜したAntpsC破壊株について、PCRを行うことにより、AntpsC破壊用カセットが相同組換えで導入されたことを確認した。使用したプライマーは配列番号77~78のプライマーである。
AntpsC破壊株では、9.1kbのPCR産物が生じた。なお、宿主では、5.9kbのPCR産物が生じた。
3.導入したAntrpCマーカー遺伝子の除去
AntpsC破壊株の分生子を、1mM トリプトファン及び0.015%(w/v)5-FAAを含むポテトデキストロース寒天培地のプレートに塗沫し、30℃、4日間以上インキュベートした。
AntpsC破壊株の分生子を、1mM トリプトファン及び0.015%(w/v)5-FAAを含むポテトデキストロース寒天培地のプレートに塗沫し、30℃、4日間以上インキュベートした。
生じた5-FAA耐性株から染色体DNAを抽出して配列番号77~78のプライマーを用いてPCRを行うことにより、ループアウトが起きてAntrpCが除去されたAntrpC除去株であることを確認した。
ループアウトが起きることにより、想定どおりに、2.9kbの産物が生じた。なお、ループアウトが起きない場合は、9.1kbのPCR産物を生じる。
また、例1と同様の方法によって、AntrpC除去株は、トリプトファンを含む培地でのみ生育する、すなわちトリプトファン要求性であることを確認した。また、5-FAAを用いることにより、AntrpCが除去できることが示された。
[例4.AspyrG遺伝子及びAstrpC遺伝子を欠損した二重破壊株の作製]
以下の手順により、アスペルギルス・ソーヤのAspyrG破壊株におけるAstrpC遺伝子を、AspyrG遺伝子で破壊した後、導入したAspyrGをループアウトで除くことにより、AspyrG・AstrpC二重破壊株を作製した。AspyrG・AstrpC二重破壊株の作製手順の概略を図10に示す。
以下の手順により、アスペルギルス・ソーヤのAspyrG破壊株におけるAstrpC遺伝子を、AspyrG遺伝子で破壊した後、導入したAspyrGをループアウトで除くことにより、AspyrG・AstrpC二重破壊株を作製した。AspyrG・AstrpC二重破壊株の作製手順の概略を図10に示す。
1.ループアウト可能なAstrpC破壊用カセットの作製
例1で作製したプラスミドpTrpC_HRを鋳型として、Inverse PCR及びPCR産物の精製を実施することにより、ベクター断片を得た。使用したプライマーは配列番号79~80のプライマーである。
例1で作製したプラスミドpTrpC_HRを鋳型として、Inverse PCR及びPCR産物の精製を実施することにより、ベクター断片を得た。使用したプライマーは配列番号79~80のプライマーである。
アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株の染色体DNAを鋳型として、PCR及びPCR産物の精製を実施することにより、ループアウトのための領域2(Asループアウト領域2)を得た。使用したプライマーは配列番号81~82のプライマーである。
得られたベクター断片とAsループアウト領域2とを用いて例1の(1-2)に記載の方法に準じて連結し、pUC19のマルチクローニングサイトに、As上流領域1-Asループアウト領域2-AspyrG-As下流領域1の配列が順に連結されたプラスミドを得た。得られたプラスミドをpTrpC_LO_pyrGとした。
次いで、例1の(1-3)と同様にして、鋳型DNAとしてプラスミドプラスミドpTrpC_LO_pyrGを用いて、ループアウト可能なAstrpC破壊用カセットを増幅した。使用したプライマーは配列番号7~8のプライマーである。
上記のようにして、As上流領域1-Asループアウト領域2-AspyrG-As下流領域1の配列が順に連結されたループアウト可能なAstrpC破壊用カセットを得た。
2.AstrpC破壊株の作製
例1の(1-4)に記載の方法に準じて、ループアウト可能なAstrpC破壊用カセットを用いて、アスペルギルス・ソーヤKP-del株を形質転換することにより、形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。
例1の(1-4)に記載の方法に準じて、ループアウト可能なAstrpC破壊用カセットを用いて、アスペルギルス・ソーヤKP-del株を形質転換することにより、形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。
AstrpCが破壊された形質転換アスペルギルス・ソーヤは、AstrpC遺伝子の位置に挿入されたAspyrG遺伝子によって宿主のウラシル/ウリジン要求性が相補され、代わりにトリプトファン要求性になる。
形質転換アスペルギルス・ソーヤが生じたプレートから、0.01%(w/v)Tween80溶液を用いて分生子を回収した。同溶液で適宜希釈した分生子懸濁液を0.04%(w/v)5-FAA及び1mM トリプトファンを含むポテトデキストロース寒天培地のプレートに塗沫し、30℃、4日間インキュベートした。
生じた5-FAA耐性株を、1mM トリプトファンを含む、又は含まないCzapek-Dox最少寒天培地のプレートにそれぞれ植菌して、30℃、4日間インキュベートし、トリプトファンを含む培地でのみ生育する株、すなわち、トリプトファン要求性を示す株を選抜した。
トリプトファン要求性の株から染色体DNAを抽出して、PCR及びPCR産物の制限酵素消化を行うことにより、ループアウト可能なAstrpC破壊用カセットが相同組換えで導入されていることをアガロースゲル電気泳動により確認した。使用したプライマーは配列番号13及び83のプライマーである。
AstrpC破壊株では、8.8kbのPCR産物が生じ、これをBamHIで消化しても切断されなかった。なお、宿主では、8.2kbのPCR産物が生じ、これをBamHIで消化することにより4.3kb及び3.8kbの断片が生じた。
3.AspyrG・AstrpC二重破壊株の作製
上記で得たAstrpC破壊株の分生子を、1mM トリプトファン、20mM ウラシル及び0.3%(w/v)5-FOAを含むCzapek-Dox最少寒天培地のプレートに塗沫し、30℃、5日間以上インキュベートすることにより、5-FOA耐性株を選抜した。なお、5-FOA(5-フルオロオロチン酸;Fluorochem社)は、1.2%水溶液をpH6に調整し、次いでフィルターろ過滅菌したものを、最終濃度が上記濃度になるように培地に添加して使用した。
上記で得たAstrpC破壊株の分生子を、1mM トリプトファン、20mM ウラシル及び0.3%(w/v)5-FOAを含むCzapek-Dox最少寒天培地のプレートに塗沫し、30℃、5日間以上インキュベートすることにより、5-FOA耐性株を選抜した。なお、5-FOA(5-フルオロオロチン酸;Fluorochem社)は、1.2%水溶液をpH6に調整し、次いでフィルターろ過滅菌したものを、最終濃度が上記濃度になるように培地に添加して使用した。
5-FOA耐性株から染色体DNAを抽出して、配列番号13及び83のプライマーを使用してPCRを行うことにより、5-FOA耐性株は、ループアウトが起きることによってAstrpC破壊株からさらにAspyrG遺伝子が除去されたAspyrG・AstrpC二重破壊株であることを確認した。すなわち、該PCRにより、ループアウト後に想定されるとおりの3.9kbのPCR産物が生じたことを確認した。なお、上記のとおりに、ループアウト前に得られるPCR産物は8.8kbである。
4.トリプトファン要求性及びウラシル要求性の確認
AspyrG・AstrpC二重破壊株を下記(1)~(4)に示す4種の寒天培地のプレートに植菌し、30℃、5日間以上インキュベートした。
(1)Czapek-Dox最少寒天培地
(2)1mM トリプトファンを含むCzapek-Dox最少寒天培地
(3)20mM ウラシルを含むCzapek-Dox最少寒天培地
(4)1mM トリプトファン及び20mM ウラシルを含むCzapek-Dox最少寒天培地
AspyrG・AstrpC二重破壊株を下記(1)~(4)に示す4種の寒天培地のプレートに植菌し、30℃、5日間以上インキュベートした。
(1)Czapek-Dox最少寒天培地
(2)1mM トリプトファンを含むCzapek-Dox最少寒天培地
(3)20mM ウラシルを含むCzapek-Dox最少寒天培地
(4)1mM トリプトファン及び20mM ウラシルを含むCzapek-Dox最少寒天培地
AspyrG・AstrpC二重破壊株は、上記(4)のトリプトファン及びウラシルを含む培地のみで生育し、トリプトファン及びウラシルの両方に対して要求性を示すことを確認した。
5.5-FOA耐性及び5-FAA耐性の確認
非破壊株(アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株)、AspyrG破壊株(アスペルギルス・ソーヤKP-del株)、AstrpC破壊株(例1で作製)及びAspyrG・AstrpC二重破壊株を用いて、以下の手順により、これらの菌株の5-FOA耐性及び5-FAA耐性を評価した。
非破壊株(アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株)、AspyrG破壊株(アスペルギルス・ソーヤKP-del株)、AstrpC破壊株(例1で作製)及びAspyrG・AstrpC二重破壊株を用いて、以下の手順により、これらの菌株の5-FOA耐性及び5-FAA耐性を評価した。
1mM トリプトファン、20mM ウラシル並びに表3に示す濃度の5-FOA及び5-FAAを含むポテトデキストロース寒天培地のプレートに植菌し、30℃、4日間インキュベートした。プレートにおけるコロニーの形成の有無により、各菌株の5-FOA耐性及び5-FAA耐性を確認した。
AspyrG破壊株及びAstrpC破壊株は、それぞれ培地中に5-FAA及び5-FOAが存在することにより、生育することができなかった。
例1ではΔtrpC株の選抜に0.04%(w/v)5-FAAを用いた。また、例4では、ΔpyrG株の選抜に0.3%(w/v)5-FOAを用いた。しかし、表3が示すとおり、これらを単独で用いる際の薬剤濃度(0.3%(w/v)5-FOA及び0.04%(w/v)5-FAA)での併用ではいずれの菌株も生育しなかった。
一方、両薬剤濃度を1/2、さらに1/4に下げて用いたところ、AspyrG・AstrpC二重破壊株のみが生育した。濃度を1/4に下げても効果を示したことから、5-FOA及び5-FAAは相乗的に効果を示すことが明らかになった。このような培地を用いることでAspyrG・AstrpC二重破壊株を選抜できることが判明した。
[例5.マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子としてのpyrG遺伝子及びtrpC遺伝子の同時使用]
1.Asnph破壊用カセットの作製
破壊対象遺伝子として、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株の公開ゲノムデータベース(BioProject Accession:PRJDA60265)から、scaffold00033(DF093572.1)の1904082-1905244の領域に予測されるプロテアーゼの遺伝子を対象とすることにした。該遺伝子を、Asnph遺伝子とした。
1.Asnph破壊用カセットの作製
破壊対象遺伝子として、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株の公開ゲノムデータベース(BioProject Accession:PRJDA60265)から、scaffold00033(DF093572.1)の1904082-1905244の領域に予測されるプロテアーゼの遺伝子を対象とすることにした。該遺伝子を、Asnph遺伝子とした。
例1の(1-2)に記載の方法に準じて、プラスミドpUC19に、相同組換えのための上流領域2(As上流領域3)、ループアウトのための領域3(Asループアウト領域3)、AspyrG遺伝子及び相同組換えのための下流領域3(As下流領域3)を順に連結させたプラスミドpNpH_LO_pyrGを作製した。使用したプライマーは配列番号84~89のプライマーである。なお、AspyrG遺伝子のDNA断片は例1の(1-2)で作製したものを用いた。
得られたプラスミドpNpH_LO_pyrGを鋳型DNAとして用いて、上記(1-3)の記載に準じてPCR及びPCR産物の精製を実施することにより、Asnph破壊用カセットを得た。使用したプライマーは配列番号90~91のプライマーである。
上記のようにして、As上流領域3-Asループアウト領域3-AspyrG-As下流領域3の配列が順に連結されたAsnph破壊用カセットを得た。
2.Asparp1・Asnph二重破壊株の作製
Asparp1破壊用カセット及びAsnph破壊用カセットを用いたAspyrG・AstrpC二重破壊株の形質転換によるAsparp1・Asnph二重破壊株の作製から、AspyrGマーカー遺伝子及びAstrpCマーカー遺伝子をループアウトさせて得られるAspyrG・AstrpC二重除去株の作製までの手順の概略を図11に示す。
Asparp1破壊用カセット及びAsnph破壊用カセットを用いたAspyrG・AstrpC二重破壊株の形質転換によるAsparp1・Asnph二重破壊株の作製から、AspyrGマーカー遺伝子及びAstrpCマーカー遺伝子をループアウトさせて得られるAspyrG・AstrpC二重除去株の作製までの手順の概略を図11に示す。
500ml容量の三角フラスコにおいて1mM トリプトファン、20mM ウラシル及び20mM ウリジンを含むポテトデキストロース液体培地 100mlに、例4で作製したアスペルギルス・ソーヤAspyrG・AstrpC二重破壊株の分生子を接種し、30℃で約24時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト並びに20μgのAsparp1破壊用カセット(例1で作製したもの)及び20μgのAsnph破壊用カセットを用いて、プロトプラストPEG法により形質転換を行い、次いで0.5%(w/v)寒天及び1.2M ソルビトールを含むCzapek-Dox最少培地を用いて、30℃、5日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。
宿主であるAspyrG・AstrpC二重破壊株のウラシル要求性及びトリプトファン要求性は導入したAspyrG遺伝子及びAstrpC遺伝子によってそれぞれ相補される。なお、片方のみが相補された株は上記培地では生育できない。
上記(1-5)の記載に準じて、形質転換株から染色体DNAを抽出してPCRで確認することにより、Asparp1遺伝子及びAsnph遺伝子の両方が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号25~28及び92~93のプライマーである。
上記のPCRを実施することにより、Asparp1遺伝子由来の460bpのPCR産物及びAsnph由来の291bpのPCR産物が生じず、破壊対象ではないAsPtefプロモーター由来の720bpのPCR産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認した。アガロースゲル電気泳動の結果を図12に示す。図12に示す形質転換株7、9及び13をAsparp1・Asnph二重破壊株として選抜した。
選抜したAsparp1・Asnph二重破壊株について、PCRで確認することにより、Asparp1破壊用カセット及びAsnph破壊用カセットが共に相同組換えで導入されていることを確認した。使用したプライマーは配列番号29~30及び94~95のプライマーである。
Asparp1遺伝子が破壊されていることにより9.6kbのPCR産物が生じた。なお、宿主では5.3kbのPCR産物が生じた。また、Asnph遺伝子が破壊されていることにより8.5kbのPCR産物が生じた。なお、宿主では5.9kbのPCR産物が生じた。
3.導入したAspyrGマーカー遺伝子及びAstrpCマーカー遺伝子の除去
(3-1)同時ループアウト
Asparp1・Asnph二重破壊株の分生子を、1mM トリプトファン、20mM ウラシル、0.08%(w/v)5-FOA及び0.01%(w/v)5-FAAを含むポテトデキストロース寒天培地のプレートに塗沫し、30℃、10日間以上インキュベートした。
(3-1)同時ループアウト
Asparp1・Asnph二重破壊株の分生子を、1mM トリプトファン、20mM ウラシル、0.08%(w/v)5-FOA及び0.01%(w/v)5-FAAを含むポテトデキストロース寒天培地のプレートに塗沫し、30℃、10日間以上インキュベートした。
生じた5-FOA耐性・5-FAA耐性株を同組成の寒天培地のプレートに植菌し、30℃、4日間にてインキュベートすることにより生育することを確認した。
生育を確認した株から染色体DNAを抽出して、配列番号29~30、94~95、9~10、11~12及び61~62のプライマーを用いてPCRを行うことにより、AspyrGマーカー遺伝子及びAstrpCマーカー遺伝子が除去された株であることをアガロースゲル電気泳動により確認した。上記2において、Asparp1・Asnph二重破壊株として選抜した形質転換株13のループアウト後の3株を対象としたアガロースゲル電気泳動の結果を図13A~図13Bに示す。
図13Aが示すとおり、本来Asparp1遺伝子が存在していた領域付近でループアウトが起きることにより、想定どおりに、3.0kbの産物が生じた。なお、ループアウトが起きない場合は、9.6kbのPCR産物を生じる。
図13Bが示すとおり、本来Asnph遺伝子が存在していた領域付近でループアウトが起きることにより、想定どおりに、3.4kbの産物が生じた。なお、ループアウトが起きない場合は、8.5kbのPCR産物を生じる。
AspyrG遺伝子由来の862bpのPCR産物及びAstrpC遺伝子由来の692bpのPCR産物が生じず、破壊対象ではないAslig1遺伝子由来の439bpのPCR産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認した。結果を図13Cに示す。これらの結果より、上記形質転換株13のループアウト後の3株をAspyrG・AstrpC二重除去株として選抜した。
AspyrG・AstrpC二重除去株を下記(1)~(4)に示す4種の寒天培地のプレートに植菌し、30℃、5日間以上インキュベートした。
(1)Czapek-Dox最少寒天培地
(2)1mM トリプトファンを含むCzapek-Dox最少寒天培地
(3)20mM ウラシルを含むCzapek-Dox最少寒天培地
(4)1mM トリプトファン及び20mM ウラシルを含むCzapek-Dox最少寒天培地
(1)Czapek-Dox最少寒天培地
(2)1mM トリプトファンを含むCzapek-Dox最少寒天培地
(3)20mM ウラシルを含むCzapek-Dox最少寒天培地
(4)1mM トリプトファン及び20mM ウラシルを含むCzapek-Dox最少寒天培地
AspyrG・AstrpC二重除去株は、上記(4)のトリプトファン及びウラシルを含む培地のみで生育し、トリプトファン及びウラシルの両方に対して要求性を示すことを確認した。これにより、2種マーカー遺伝子の同時ループアウトができたことが確認された。
(3-2)2段階ループアウト
Asparp1・Asnph二重破壊株の分生子を、20mM ウラシル及び0.3%(w/v)5-FOAを含むCzapek-Dox最少寒天培地のプレートに塗沫し、30℃、5日間以上インキュベートした。5-FOA耐性株(AspyrG除去株)が生じたプレートから、0.01%(w/v)Tween80溶液を用いて分生子を回収し、同溶液で適宜希釈することにより、分生子懸濁液を調製した。
Asparp1・Asnph二重破壊株の分生子を、20mM ウラシル及び0.3%(w/v)5-FOAを含むCzapek-Dox最少寒天培地のプレートに塗沫し、30℃、5日間以上インキュベートした。5-FOA耐性株(AspyrG除去株)が生じたプレートから、0.01%(w/v)Tween80溶液を用いて分生子を回収し、同溶液で適宜希釈することにより、分生子懸濁液を調製した。
得られた分生子懸濁液の適量を、1mM トリプトファン、20mM ウラシル、0.08%(w/v)5-FOA及び0.01%(w/v)5-FAAを含むポテトデキストロース寒天培地のプレートに塗沫し、30℃、4日間にてインキュベートした。
生じた5-FOA・5-FAA耐性株を同組成の寒天培地のプレートに植菌し、30℃、4日間にてインキュベートすることにより生育することを確認した。
生育を確認した株から染色体DNAを抽出して、上記例5の(3-1)に記載の方法により、PCRを行うことにより、AspyrGマーカー遺伝子及びAstrpCマーカー遺伝子が除去されたAspyrG・AstrpC二重除去株であることを確認した。
また、上記例5の(3-1)に記載の方法により、AspyrG・AstrpC二重除去株は、ウラシル及びトリプトファンの両方に対して要求性を示すことを確認した。これにより、2種マーカー遺伝子の2段階ループアウトができたことが確認された。
本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属微生物、組成物及び方法は、食品産業において利用価値が高いアスペルギルス属微生物の形質転換を効率良く実施することができ、さらにアスペルギルス属微生物が有する構造若しくは機能が類似又は関連する遺伝子の同時破壊による新たな表現型を迅速に検出することが可能である。
本出願は、2018年11月5日出願の日本特願2018-208022号及び2019年6月12日出願の日本特願2019-109602号の優先権を主張し、その全記載は、ここに開示として援用される。
Claims (11)
- 染色体上の少なくとも2種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属(Aspergillus)微生物であって、前記選択マーカー遺伝子はトリプトファン生合成遺伝子及びトリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子を含む、前記形質転換アスペルギルス属微生物。
- 相同組換え領域の間にループアウト領域及びマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の少なくとも2種類を含む、アスペルギルス属微生物形質転換用組成物であって、前記核酸断片は、前記選択マーカー遺伝子がトリプトファン生合成遺伝子である核酸断片及び前記選択マーカー遺伝子がトリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子である核酸断片を含む、前記組成物。
- 前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)以外のアスペルギルス属微生物である、請求項1~2のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
- 前記トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、請求項1~3のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
- 前記トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、ウラシル生合成遺伝子、硫酸塩代謝遺伝子及び硝酸塩代謝遺伝子からなる群から選ばれる選択マーカー遺伝子である、請求項1~4のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
- 前記トリプトファン生合成遺伝子はtrpC遺伝子であり、かつ、トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、pyrG遺伝子、niaD遺伝子及びsC遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1種の遺伝子である、請求項1~5のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
- 下記の工程(1)~工程(3)を含む、染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物の製造方法であって、該第1の選択マーカー遺伝子及び該第2の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がトリプトファン生合成遺伝子であり、他方が栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、前記方法:
(1)染色体上の第1の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む核酸断片を用いて、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;
(2)前記工程(1)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子が挿入され、かつ、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程;及び、
(3)前記工程(2)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。 - 下記の工程(A)~工程(B)を含む、マーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子を利用した、形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の2種類の標的遺伝子の欠損方法であって、該第1の選択マーカー遺伝子及び該第2の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がトリプトファン生合成遺伝子であり、他方が栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、前記方法:
(A)染色体上の第1の選択マーカー遺伝子及び第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、第1の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む第1の核酸断片及び第2の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第2の選択マーカー遺伝子を含む第2の核酸断片を用いて、該第1の標的遺伝子及び該第2の標的遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;及び
(B)前記工程(A)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の非存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が挿入された形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。 - さらに下記の工程(C)を含む、請求項8に記載の方法:
(C)前記工程(B)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログの存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子、前記第2の選択マーカー遺伝子、前記第1の標的遺伝子及び前記第2の標的遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。 - 前記第1の選択マーカー遺伝子はトリプトファン生合成遺伝子であり、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは5-FAAであり、及び該5-FAAの濃度は0.005%(w/v)~0.02%(w/v)であり、かつ、
前記第2の選択マーカー遺伝子はpyrG遺伝子であり、前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは5-FOAであり、及び該5-FOAの濃度は0.05%(w/v)~0.15%(w/v)である、請求項9に記載の方法。 - 前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス以外のアスペルギルス属微生物である、請求項7~10のいずれか1項に記載の方法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201980071269.XA CN113056553A (zh) | 2018-11-05 | 2019-11-04 | 多重基因破坏曲霉属微生物及其制造方法 |
EP19882317.1A EP3878944A4 (en) | 2018-11-05 | 2019-11-04 | MICROORGANISM FOR MULTIPLE KILLING OF THE ASPERGILLUS GENUS AND PROCESS FOR PRODUCTION THEREOF |
US17/289,047 US20210403929A1 (en) | 2018-11-05 | 2019-11-04 | An aspergillus microorganism carrying disruptions of multiple genes and a method of producing thereof |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018-208022 | 2018-11-05 | ||
JP2018208022 | 2018-11-05 | ||
JP2019-109602 | 2019-06-12 | ||
JP2019109602A JP6599583B1 (ja) | 2018-11-05 | 2019-06-12 | 多重遺伝子破壊アスペルギルス属微生物及びその製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2020095864A1 true WO2020095864A1 (ja) | 2020-05-14 |
Family
ID=68383344
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2019/043173 WO2020095864A1 (ja) | 2018-11-05 | 2019-11-04 | 多重遺伝子破壊アスペルギルス属微生物及びその製造方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210403929A1 (ja) |
EP (1) | EP3878944A4 (ja) |
JP (1) | JP6599583B1 (ja) |
CN (1) | CN113056553A (ja) |
WO (1) | WO2020095864A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112111415A (zh) * | 2020-09-16 | 2020-12-22 | 福建农林大学 | 一种pyrG筛选标记循环利用的方法及应用 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2024096123A1 (ja) * | 2022-11-04 | 2024-05-10 | 株式会社バイオパレット | 遺伝子が改変された微生物およびその生産方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS574609B2 (ja) | 1974-02-12 | 1982-01-27 | ||
JPS6261039B2 (ja) | 1979-06-26 | 1987-12-18 | Ansuchi* Nashionaru Do Ra Rusherushu Agunoromiku | |
JP2006158269A (ja) * | 2004-12-06 | 2006-06-22 | Noda Inst For Scient Res | 相同組換え頻度が上昇した形質転換菌 |
JP2007222055A (ja) | 2006-02-22 | 2007-09-06 | Noda Inst For Scient Res | 染色体領域欠失株の作製方法 |
WO2017135317A1 (ja) | 2016-02-04 | 2017-08-10 | 花王株式会社 | 変異糸状菌の製造方法 |
JP2019109602A (ja) | 2017-12-15 | 2019-07-04 | クラリオン株式会社 | 信号機認識装置 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103596970A (zh) * | 2011-03-11 | 2014-02-19 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 载体-宿主系统 |
-
2019
- 2019-06-12 JP JP2019109602A patent/JP6599583B1/ja active Active
- 2019-11-04 WO PCT/JP2019/043173 patent/WO2020095864A1/ja unknown
- 2019-11-04 EP EP19882317.1A patent/EP3878944A4/en active Pending
- 2019-11-04 US US17/289,047 patent/US20210403929A1/en active Pending
- 2019-11-04 CN CN201980071269.XA patent/CN113056553A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS574609B2 (ja) | 1974-02-12 | 1982-01-27 | ||
JPS6261039B2 (ja) | 1979-06-26 | 1987-12-18 | Ansuchi* Nashionaru Do Ra Rusherushu Agunoromiku | |
JP2006158269A (ja) * | 2004-12-06 | 2006-06-22 | Noda Inst For Scient Res | 相同組換え頻度が上昇した形質転換菌 |
JP2007222055A (ja) | 2006-02-22 | 2007-09-06 | Noda Inst For Scient Res | 染色体領域欠失株の作製方法 |
WO2017135317A1 (ja) | 2016-02-04 | 2017-08-10 | 花王株式会社 | 変異糸状菌の製造方法 |
JP2019109602A (ja) | 2017-12-15 | 2019-07-04 | クラリオン株式会社 | 信号機認識装置 |
Non-Patent Citations (19)
Title |
---|
"Current Protocols in Molecular Biology", 1987, JOHN WILEY & SONS |
ALTSCHUL ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410 |
BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM, vol. 70, 2006, pages 135 |
BMC MICROBIOL, vol. 14, 2014, pages 90, Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3991884> |
GOOSEN ET AL., MOLECULAR AND GENERAL GENETICS, vol. 219, 1989, pages 282 - 288 |
GOOSEN, T. ET AL.: "Tryptophan auxotrophic mutants in Aspergillus niger: 1-7 Inactivation of the trpC gene by cotransformation mutagenesis", MOLECULAR AND GENERAL GENETICS, vol. 219, 1989, pages 282 - 288, XP055705057 * |
KARLINALTSCHUL, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 87, 1990, pages 2264 - 2268 |
LIPMAN-PEARSON, SCIENCE, vol. 227, 1985, pages 1435 - 1441 |
MOL. GEN. GENET., vol. 218, 1989, pages 99 - 104 |
MOL. GENET. GENOMICS, vol. 275, 2006, pages 460 |
NIELSEN, M. L. ET AL.: "Efficient PCR-based gene targeting with a recyclable marker for Aspergillus nidulans", FUNGAL GENETICS AND BIOLOGY, vol. 43, no. 1, 2006, pages 54 - 64, XP024918908, DOI: 10.1016/j.fgb.2005.09.005 * |
NUCLEIC ACIDS RES., vol. 25, 1997, pages 3389 - 3402 |
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873 - 5877 |
See also references of EP3878944A4 |
TAKAHASHI, T. ET AL.: "Enhanced gene targeting frequency in ku70 and ku80 disruption mutants of Aspergillus sojae and Aspergillus oryzae", MOLECULAR GENETICS AND GENOMICS, vol. 275, no. 5, 2006, pages 460 - 470, XP019428009, DOI: 10.1007/s00438-006-0104-1 * |
TANI ET AL., AMB EXPRESS, vol. 3, 2013, pages 4, Retrieved from the Internet <URL:https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/2191-0855-3-4> |
TANI, S. ET AL.: "Reversible impairment of the ku80 gene by a recyclable 1-7 marker in Aspergillus aculeatus", AME EXPRESS, vol. 3, 2013, pages 4, XP055705054, Retrieved from the Internet <URL:https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/2191-0855-3-4> * |
TOYN ET AL., YEAST, vol. 16, 2000, pages 553 - 560 |
TOYN, J. H. ET AL.: "A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance", YEAST, vol. 16, 2000, pages 553 - 560, XP055705060 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112111415A (zh) * | 2020-09-16 | 2020-12-22 | 福建农林大学 | 一种pyrG筛选标记循环利用的方法及应用 |
CN112111415B (zh) * | 2020-09-16 | 2022-10-14 | 福建农林大学 | 一种pyrG筛选标记循环利用的方法及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2020074748A (ja) | 2020-05-21 |
JP6599583B1 (ja) | 2019-10-30 |
CN113056553A (zh) | 2021-06-29 |
EP3878944A4 (en) | 2022-11-02 |
EP3878944A1 (en) | 2021-09-15 |
US20210403929A1 (en) | 2021-12-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Li et al. | Developing Aspergillus niger as a cell factory for food enzyme production | |
EP3327112B1 (en) | Agse-deficient strain | |
CN105492604B (zh) | 受调节的pepc表达 | |
JP2007222055A (ja) | 染色体領域欠失株の作製方法 | |
Zhang et al. | Enhanced production of heterologous proteins by the filamentous fungus Trichoderma reesei via disruption of the alkaline serine protease SPW combined with a pH control strategy | |
JP2012213376A (ja) | γ−グルタミル化合物を含有する酵母エキスの製造方法及び当該方法に用いられる酵母 | |
WO2020095864A1 (ja) | 多重遺伝子破壊アスペルギルス属微生物及びその製造方法 | |
JP6489014B2 (ja) | Abu、γ−Glu−Abu、及び/又はγ−Glu−Abu−Glyを高含有する酵母 | |
EP3077521B1 (en) | Novel genome alteration system for microorganisms | |
WO2018166943A1 (en) | Zinc binuclear cluster transcriptional regulator-deficient strain | |
JP5344857B2 (ja) | 糸状菌プロテアーゼの生産方法 | |
Sun et al. | Development of a novel expression platform for heterologous protein production via deleting the p53-like regulator Vib1 in Trichoderma reesei | |
EP2922954B1 (en) | Gene cluster for biosynthesis of cornexistin and hydroxycornexistin | |
JP4756125B2 (ja) | アスペルギルス・オリザの新規変異株及び選択マーカー | |
JP4495904B2 (ja) | 改変プロモーター | |
JP4228644B2 (ja) | γ−グルタミルシステインの製造法 | |
JP2013021940A (ja) | 遺伝子欠損酵母の製造方法 | |
JP6474477B2 (ja) | マーカー遺伝子 | |
JP5507062B2 (ja) | 高発現プロモーター | |
JP6274502B2 (ja) | 相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株を取得する方法 | |
JP2004329143A (ja) | アスペルギルス属糸状菌由来の環状ヌクレオチド、アスペルギルス属糸状菌セルフクローニング株の製造方法及びセルフクローニング株 | |
RU2439157C2 (ru) | ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫХ ТРАНСФОРМАНТОВ ГРИБОВ РОДА Rhizopus | |
US8703444B2 (en) | Pichia pastoris deficient in endogenous secreted protease | |
JP5473179B2 (ja) | アスペルギルス・オリザの新規変異株及び選択マーカー | |
Miki et al. | Analysis of nitrogen source assimilation in industrial strains of Aspergillus oryzae |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 19882317 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2019882317 Country of ref document: EP Effective date: 20210607 |