WO2020091408A1 - 반려동물에서 종양질병의 보조적 진단을 위한 바이오마커 검사방법 - Google Patents

반려동물에서 종양질병의 보조적 진단을 위한 바이오마커 검사방법 Download PDF

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주후돈
김현정
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Definitions

  • the present invention relates to a method for examining a malignant tumor in a companion animal, and more particularly, to a method used for diagnosis through a combination of various biomarkers.
  • tumor diseases in animals do not have an assistive diagnostic means, such as detection of appropriate biomarkers for tumor diseases, such as regular examinations.
  • an assistive diagnostic means such as detection of appropriate biomarkers for tumor diseases, such as regular examinations.
  • biomarkers which are indicators that can detect changes in the body using proteins, DNA, RNA (re-nucleic acid), and metabolites, can be used to determine the normal or pathological conditions of living organisms and the degree of reaction to drugs. Measure objectively.
  • These biomarkers can be applied to companion animals, and in companion animals, tumor diseases generally involve various inflammations and changes in blood vessels, so these biomarkers can help in the diagnosis and prognosis of tumor diseases.
  • the regular check-up system provides health care for the elderly population by preventing various diseases and tumor diseases, but in the case of companion animals, the regular check-up system despite the proportion of aged dogs over 6 years old exceeding 35%. It is a reality that this is not common and lacks checkup items.
  • the tumor disease of a companion animal and the accompanying inflammation and protein markers that increase in the blood during changes in blood vessels confirm the effectiveness in the blood sample of the companion animal tumor disease and check the companion animal. It is intended to present an invention that can be used as an auxiliary system for the diagnosis of tumor disease, but simpler and more accurate than existing methods for diagnosing malignant tumors.
  • An object of the present invention is to propose a test method for improving the accuracy in detecting various tumor diseases occurring in a companion animal by performing three types of marker tests on the companion animal's blood.
  • the present invention is to generate a measurement value for each biomarker by measuring a plurality of biomarkers in a sample collected from a companion animal, comparing the biomarker measurement value with a corresponding reference value, and It provides a method for examining a tumor disease of a companion animal, comprising the step of determining the possibility of a tumor disease of the companion animal according to the number of biomarkers in which the measured biomarker value exceeds the reference value.
  • the positive predictive rate of tumor disease detecting various tumor diseases in companion animals has been increased from 73% to 90%.
  • FIG. 1 is a view for explaining a cCRP inspection method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a view for explaining a D-dimer inspection method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating an AFP inspection method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 shows a screen of a dedicated device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a view for explaining the principle of immunofluorescence of cCRP, D-dimer, AFP cartridge according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a view for explaining the housing of the cartridge used in the embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a view for explaining the structure of the strip used in the embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a view illustrating a reagent applied according to an embodiment of the present invention.
  • a method for examining a tumor disease in a companion animal using a biomarker test method for an auxiliary diagnosis of a tumor disease in a companion animal according to one embodiment of the present invention.
  • the method for examining a tumor disease of a companion animal includes measuring a plurality of biomarkers in a sample collected from a companion animal to generate a measurement value for each biomarker, comparing the measured biomarker value with a corresponding reference value, and And determining a possibility of tumor disease of the companion animal according to the number of biomarkers whose biomarker measurement value exceeds the reference value.
  • the companion animal is a mammal, and preferably a dog.
  • the sample may be selected from one or more of a companion animal's cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or urine.
  • the biomarker measurement uses a fluorescence reader, which is an optical analysis device, and can preferably be performed through fluorescence LFI (Lateral flow immunoassay).
  • the fluorescence LFI (Lateral flow immunoassay, lateral flow immunoassay) uses an immunological method to detect a target using an antibody of the same principle as ELISA, but a general ELISA detects by labeling an enzyme with an antibody while fluorescence LFI ( Lateral flow immunoassay (lateral flow immunoassay) is a device that quantifies the protein concentration by reading the fluorescence attached to the sample and converting it into a numerical method by labeling fluorescence. More preferably, Bet chroma may be used in the fluorescent LFI (Lateral flow immunoassay) device.
  • the lateral flow analysis strip 100 shows its configuration in FIG. 6.
  • the lateral flow analysis strip 100 is formed of a porous matrix 110 allowing capillary flow in the housing 102 formed by combining up and down.
  • the sample pad 120 allows a mixture of a sample and a detection buffer to be applied from the sample port 104 to flow to the porous matrix 110.
  • a test line 140 and a control line 160 are positioned downstream from the sample pad 120.
  • a capture agent is fixed to the test line 140 and the control line 160 in a physical adsorption method.
  • the capture agent may be a specific antibody, antigen, or oligonucleotide that hybridizes to a certain sequence of nucleic acids in response to the analyte.
  • the capture agent may be a D-dimer, AFP or cCRP protein.
  • an absorption pad 170 is disposed at a downstream end of the porous matrix 110. The absorption pad 170 absorbs the excess liquid sample applied from the sample port 104 and maintains lateral flow along the porous matrix 110.
  • the control line 160 may be located upstream or downstream of the test line 140. Positive or negative control reagents or capture agents are fixed to the control line 160.
  • Fluorescent labels capable of detecting fluorescent labeling in the fluorescent LFI include gold nanoparticles, colored latex beads, carbon nanoparticles, selenium nanoparticles, silver nanoparticles, quantum dots, up It can be selected from the group consisting of up converting phosphors and organic fluorophores.
  • the up-converting phosphors (up converting phosphors) of the lanthanide-based phosphors Europium (Europium, EU (Eu 2 O 3 )), gadolinium (Gadolinium, Gd (Gd 2 O 3 )), terbium (Terbium, Tb (Tb 4) O 7 )) or Ytterbium (Yb (Yb 2 O 3 )) atoms may be a fluorescent conjugated antibody.
  • the biomarker may be one or more selected from the group consisting of D-dimer, AFP or cCRP protein, and preferably, all three biomarkers are selected and used.
  • the reference value is a reference value for tumor diagnosis of a companion animal, which is a value set based on the cut off concentration value of the biomarker.
  • the cut-off concentration value that has been set as a reference is a biomarker concentration value set based on when the sensitivity of the biomarker is 80%.
  • the cut-off concentration value is different for each biomarker, D-dimer is 66.46 ng / ml or more, AFP is 39.24 ng / ml or more, and cCRP is based on 2.81 ng / ml or more.
  • D-dimer is 66.46 ng / ml or more
  • AFP is 39.24 ng / ml or more
  • cCRP is based on 2.81 ng / ml or more.
  • the tumors capable of diagnosing tumors include epithelial cell carcinoma (SCC, transitional cell carcinoma (TCC)), anal sac adenocarcinoma (Perianal adeno carcinoma), lung tumor (Lung adenocarcinoma, Pulmonary adenosquamous cell carcinima) , Hepatocellular carcinoma (HCC), Multicentric lymphoma (lymphoma), Carotid body tumor, Nasal cell carcinoma, Ovarian carcinoma, Oral melanoma / melanoma in oral, Mast cell tumor, bronchiectasis / Thyroglosa duct cyst with bronchiectasis, gallbladder mucocele, basal cell carcinoma, and mammary tumor.
  • SCC epithelial cell carcinoma
  • TCC transitional cell carcinoma
  • TCC transitional cell carcinoma
  • Perianal adeno carcinoma Perianal adeno carcinoma
  • lung tumor Long adenocarcinoma
  • HCC Hepat
  • the step of classifying the risk group may be classified according to the number of biomarkers in which the biomarker measurement value exceeds a reference value.
  • the classification is classified as a risk group when the number of biomarkers is one, a high risk group when two, and a very high risk group when three.
  • the present invention proposes a method for providing supplementary diagnostic information of various tumor diseases through examination of the three biomarkers as described above in a companion animal.
  • various biomarkers such as AFP, CEA, PSA, and CA-12, are used for screening or prognostic testing in order to diagnose malignant tumors. Examination of these tumor-specific biomarkers has been proven as an auxiliary diagnostic means by many literatures.
  • primary diagnosis is performed through imaging, endoscopy, and biopsy, and tumors are identified, and diagnosis is performed by obtaining supplementary information through biomarker tests specific to the tumor.
  • the present inventor proposes a method of providing supplementary diagnostic information through a combination of three general biomarker tests and test results, although the tumor disease of the companion animal is not complete.
  • the biomarker applied in the embodiment of the present invention is as follows.
  • Canine C-reactive protein (cCRP)
  • cCRP is an Acute phase Protein (APP) protein produced in the liver at the beginning of an acute inflammatory reaction, and rapidly increases in blood when an inflammatory reaction or infection occurs. Therefore, it can be used for monitoring before and after infection or surgery by rapidly responding to inflammatory reactions or tissue damage in the body. Since inflammation is a basic response to many abnormal conditions, CRP testing is relatively specific for detecting the presence of systemic inflammation, but it does not necessarily provide information about the cause of systemic inflammation. It is known that CRP levels are elevated in dogs with viral infections, dogs with active bacterial or fungal infections, dogs with chronic inflammatory diseases such as some types of arthritis, and sometimes dogs with cancer. Therefore, if the inflammation caused by cancer occurs, it is thought that it will increase in companion animal cancer.
  • APP Acute phase Protein
  • DIC intravascular coagulation
  • D-dimer increases.
  • D-dimer is also used in the diagnosis of deep vein thrombosis (DVT) or pulmonary embolism because it increases in thrombogenic diseases. D-dimer is also likely to increase when cancer cells cause thrombosis.
  • ⁇ -Petoprotein appeared in clinical trials after it was known that it was detected in the blood of primary liver cancer patients. It is confirmed that AFP is made from liver cancer cells, and is called a fetal fetal protein (carcinofetal protein) in the fact that it is a common protein between fetal liver and tumor. It is said that 90% of primary liver cancers are positive for AFP, and primary liver cancers that cannot detect AFP in the blood are made in liver cancer cells but are not secreted. In addition, it is also made in a part of gastric cancer, and hepatitis and cirrhosis transducers sometimes show high levels in the blood due to hot flashes. Fetal cancer of the testicles or ovaries also produces AFP. Therefore, if the inflammation caused by cancer occurs, it is thought that it will increase in companion animal cancer.
  • AFP is made from liver cancer cells, and is called a fetal fetal protein (carcinofetal protein) in the fact that it is a common protein between fetal liver and tumor. It
  • Example 2 The same procedure as in Example 1 was performed, but instead of the d-Dimer test solution, a tube containing AFP test solution was used. After installing the dispensed test cartridge in the dedicated equipment, start the inspection. Measured automatically after 15 minutes
  • Example 2 Performed in the same manner as in Example 1, but taking 10 ⁇ l of the amount of the sample, using a tube containing the cCRP test solution instead of the d-Dimer test solution, and mounting the dispensed test cartridge on a dedicated device for inspection Start, but after 3 minutes, check the result.
  • the tumor test reference concentration which is a standard for comparing the measured values of Examples 1 to 3, is cut off for each marker of a standard having a sensitivity of 80% or more, and the corresponding concentrations are shown in Table 2 below.
  • the population of the normal group measured in Table 2 was 30 dogs, and the population of the disease group (tumor disease) was 79 dogs, and MediCalc. was used for the statistical program using the ROC curve analysis.
  • cut off concentration based on 80% sensitivity in D-dimer canine tumor disease is 66.46 ng / ml
  • sensitivity in AFP canine tumor disease is 39.24 ng / ml in cutoff concentration based on 80%
  • cCRP sensitivity in canine tumor disease It was confirmed that the cut off concentration based on 80% was 2.81 ng / ml.
  • the positive item means the number of individuals determined to be tumor disease.
  • AFP the average concentration of a tumor sample.
  • D-dimer the average concentration of a tumor sample.
  • the cut-off concentration based on 80% sensitivity is calculated by the Medcalc.statistics program, and it means the individual higher than the concentration, and the negative item means the lower individual than the selected cut-off concentration, which is the upper positive judgment criterion. .
  • the sensitivity is a probability of receiving a positive determination in a population with tumor disease, that is, a probability of being diagnosed as positive as a result of measuring Vet chroma in a patient with tumor disease.
  • the specificity is a probability of receiving a negative judgment in a normal group of individuals, that is, a probability of being diagnosed as a negative as a result of measuring Vet chroma in a normal group of individuals.
  • the above accuracy is a probability that the population with tumor disease is judged as positive in the entire population, and the probability that the normal group is judged as Negative, that is, the probability that the diagnosis name and the Vet chroma positive, and the negative judgment rate match.
  • the positive predictive rate is a probability that there is a tumor disease of a diagnosis in a positive individual group, and the calculation formula and meaning will be described as shown in Table 4.
  • the 81% oncology positive estimation rate can be diagnosed through the test of the D-dimer marker, and the 74% oncology positive estimation rate can be diagnosed through the test of the AFP marker. And, through the examination of the cCRP marker, it was confirmed that the positive estimation rate of 73% tumor disease can be diagnosed.
  • individuals who are recognized as positive in each marker and can diagnose the positive estimation rate can be classified and managed as a benign tumor risk group as the probability of a benign tumor increases.
  • the positive predictive rate is confirmed with reference to Table 5, 84% of tumor disease positive estimation rate can be diagnosed through screening of D-dimer and AFP (single marker D-dimer, AFP (81, 74%) more positive) Diagnosis rate is increased), 88% oncology positive predictive rate can be diagnosed through screening tests of D-dimer and cCRP (positive diagnosis rate is higher than that of single marker D-dimer, cCRP (81, 73%)), and screening of AFP and cCRP Through this, it can be confirmed that 80% tumor disease positive predictive rate can be diagnosed (positive diagnosis rate is higher than that of the single marker AFP and cCRP (74, 73%) tests).
  • the individuals recognized as positive in the two markers can be managed as classified as a high-risk group of benign tumors as the probability of a weak tumor is higher than the individuals recognized as positive in one marker.
  • the predictive rate of positive for tumor disease of companion animals is 90%, which is significantly higher than that of the single marker or two markers combined test. You can check.
  • individuals recognized as positive in three markers can be managed as classified as benign tumor ultra-high-risk groups as the probability of a weak tumor is higher than those recognized as positive in two or fewer markers.

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Abstract

본 발명은 반려동물의 종양질병 검사방법으로서, 반려동물에서 종양질병의 보조적 진단을 위한 3가지 바이오마커를 복합적으로 사용하는 방법을 제공한다.상기와 같은 본 발명에 따르면, 반려동물에서 종양질병의 보조적 진단을 위한 3가지 바이오마커를 복합적으로 사용하는 방법을 사용함으로써, 반려동물에서 나타나는 여러 가지 종양질병을 탐지하는 종양질환 양성예측율이 기존에 73%에서 90%까지 증가하는 효과가 있다.

Description

반려동물에서 종양질병의 보조적 진단을 위한 바이오마커 검사방법
본 발명은 반려동물에서 악성종양의 검사방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 여러 바이오마커의 조합을 통하여 진단에 사용하는 방법에 관한 것이다.
동물에서 종양 질병은 인간과 달리 정기검진 등 종양 질병에 대하여 적절한 바이오마커의 탐지검사 등 보조적 진단 수단이 없다. 동물에서는 일반 동물병원에서 조형검사, 조직검사 등 정밀검사를 일상적으로 수행할 수 없어 한계가 있다. 일반적으로 사람의 경우에도 단백질이나 DNA, RNA(리복핵산), 대사 물질 등을 이용해 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표인 바이오마커를 활용하면 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정한다. 이런 바이오마커를 반려동물에게도 적용가능하며, 반려 동물에서도 일반적으로 종양 질병은 여러 가지 염증, 혈관 내 변화를 수반하므로 이들 바이오마커는 종양 질병의 진단과 예후검사에 도움을 줄 수 있다.
그러나 아직까지 반려동물 종양질병의 진단과 예방, 관리는 인간의 종양질병 관리와 달리 정밀검사를 일상적으로 사용할 수 없는 비용 및 시스템의 한계가 있으며, 특히 바이오마커를 복합적으로 적용하여 반려동물에 대한 악성종양을 검출하는 방식은 제시되지 않았다.
인간의 경우 정기적 검진 시스템으로 각종 질병 및 종양질환 등의 예방으로 고령인구에 대한 건강관리가 이루어지고 있으나, 반려동물의 경우는 6세 이상의 노령견의 비율이 35%를 넘어감에도 불구하고 정기검진 시스템이 일반적이지 않고 검진 항목도 부족한 것이 현실이다.
따라서 본원 발명에서는 상기와 같이 바이오마커를 복합적으로 사용하여 반려동물의 종양질환 및 이에 수반되는 염증 및 혈관 내 변화 시 혈액 내 증가하는 단백질 마커로 반려동물 종양질환 혈액 시료에서의 유효성을 확인하여 반려동물 종양질환 진단의 보조적 시스템으로 활용하여 기존의 악성종양 진단방법에 비해 간단하면서도 정확도를 더욱 높일 수 있는 발명에 대해 제시하고자 한다.
본 발명의 목적은, 반려동물의 혈액에서 3종의 마커 검사를 수행함으로써, 반려동물에서 나타나는 여러 가지 종양질병을 탐지하는데 정확도를 높이는 검사방법을 제안하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 반려동물로부터 채취된 시료 내의 복수의 바이오마커를 측정하여 각각의 바이오마커에 대해 측정값을 생성하는 단계, 상기 바이오마커 측정값과 해당 기준값을 비교하는 단계 및 상기 바이오마커 측정값이 상기 기준값을 초과하는 바이오마커의 개수에 따라 상기 반려동물의 종양질병의 가능성을 판단하는 단계를 포함하는 반려동물의 종양질병 검사방법을 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 반려동물에서 종양질병의 보조적 진단을 위한 바이오마커 검사방법에서 제시하는 3가지 바이오마커를 복합적으로 사용함으로써, 반려동물에서 나타나는 여러 가지 종양질병을 탐지하는 종양질환 양성 예측율이 기존에 73%에서 90%까지 증가하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 cCRP 검사 방법을 설명하는 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 D-dimer 검사 방법을 설명하는 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 AFP 검사 방법을 설명하는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 전용 장비의 화면을 도시한다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 cCRP, D-dimer, AFP카트리지의 면역형광검사 원리를 설명하는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 사용된 카트리지의 하우징을 설명하는 도면이다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 사용된 스트립의 구조를 설명하는 도면이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따라 적용된 시약을 설명하는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 형태에 따른 반려동물에서 종양질병의 보조적 진단을 위한 바이오마커 검사방법을 이용한 반려동물의 종양질병 검사방법을 제공한다.
상기 반려동물의 종양질병 검사방법은 반려동물로부터 채취된 시료 내의 복수의 바이오마커를 측정하여 각각의 바이오마커에 대해 측정값을 생성하는 단계, 상기 바이오마커 측정값과 해당 기준값을 비교하는 단계 및 상기 바이오마커 측정값이 상기 기준값을 초과하는 바이오마커의 개수에 따라 상기 반려동물의 종양질병의 가능성을 판단하는 단계를 포함한다.
상기 반려동물은 포유류이고, 바람직하게는 개(Dog)일 수 있다.
상기 시료는 반려동물의 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 중에 하나 이상을 선택할 수 있다.
상기 바이오마커 측정은 광학분석 장치인 형광 판독기를 이용하며, 바람직하게는 형광 LFI(Lateral flow immunoassay, 측방유동면역분석기)를 통해 수행될 수 있다. 상기 형광 LFI(Lateral flow immunoassay, 측방유동면역분석기)는 ELISA와 같은 원리의 항체를 이용하여 target을 Detection 하는 면역학적인 방법을 이용하나, 일반적인 ELISA는 항체에 효소를 labeling하여 Detection하는 반면에 형광 LFI(Lateral flow immunoassay, 측방유동면역분석기)는 형광을 labeliing하는 방식으로 시료 내에 부착된 형광을 읽고 수치화로 전환하여 단백질의 농도를 정량화하는 장치이다. 더 바람직하게는 상기 형광 LFI(Lateral flow immunoassay, 측방유동면역분석기)장치 중에 벳 크로마(Vet chroma)를 사용할 수 있다.
상기 형광 LFI(Lateral flow immunoassay, 측방유동면역분석기)를 통해 분석 수행시 측방 유동 분석 스트립에 시료를 인가하여 검출한다.
상기 측방 유동 분석 스트립(100)은 도6에 그 구성을 도시하고 있다. 도시된 바와 같이, 상기 측방 유동 분석 스트립(100)은 상하로 결합하여 이루어지는 하우징(102) 안에 모세관 유동을 허용하는 다공성 매트릭스(110)가 형성된다. 샘플 패드(120)는 시료와 검출 버퍼가 혼합된 용액이 샘플 포트(104)에서 인가되어 상기 다공성 매트릭스(110)로 흐르도록 한다. 상기 다공성 매트릭스(110) 상에서 상기 샘플 패드(120)로부터 하류(downstream) 방향으로 테스트 라인(140), 컨트롤 라인(160)이 위치한다. 상기 테스트라인(140) 및 상기 컨트롤라인(160)에는 캡처 에이전트가 물리흡착방식으로 고정되어 있다. 상기 캡처 에이전트는 분석물질에 반응하는 특정 항체, 항원, 또는 일정한 서열의 핵산에 교잡하는 올리고뉴클레오타이드 일 수 있다. 바람직하게는 상기 캡처 에이전트는 D-dimer, AFP 또는 cCRP 단백질일수 있다. 그리고 상기 다공성 매트릭스(110)의 하류 단부에는 흡수패드(170)가 배치된다. 상기 흡수 패드(170)는 상기 샘플 포트(104)에서 인가된 과량의 액상 시료를 흡수하고, 상기 다공성 매트릭스(110)를 따라 측방 유동을 유지한다.
상기 컨트롤 라인(160)은 상기 테스트라인(140)의 상류 또는 하류 측에 위치할 수 있다. 상기 컨트롤 라인(160)에는 양성 또는 음성 대조군 시약 또는 캡처 에이전트가 고정된다.
상기 형광 LFI(Lateral flow immunoassay, 측방유동면역분석기)에서 형광 labeling 검출 가능한 형광 표지는 금 나노입자, 착색된 라텍스 비드, 탄소 나노입자, 셀레늄 나노입자, 은 나노입자, 퀀텀닷(quantum dots), 업 변환 형광체(up converting phosphors), 유기 형광체(organic fluorophores)로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 업 변환 형광체(up converting phosphors) 중에서 란탄계열의 형광체 유로퓸(Europium, EU(Eu2O3)), 가돌리늄(Gadolinium, Gd(Gd2O3)), 터븀(Terbium, Tb(Tb4O7)) 또는 이터븀(Ytterbium, Yb(Yb2O3))원자가 접합한 형광접합항체일 수 있다.
상기 바이오마커는 D-dimer, AFP 또는 cCRP 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상을 선택할 수 있고, 바람직하게는 상기 바이오마커 3종을 모두 선택하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기 기준값은 반려동물의 종양진단 기준이 되는 수치이며, 이는 상기 바이오마커의 cut off 농도 값을 기준으로 설정된 값이다. 이때 설정 기준이 된 cut off 농도 값은 바이오마커의 민감도가 80%일 때를 기준으로 설정한 바이오마커 농도 수치이다.
상기 cut off 농도 값은 각각의 바이오마커 별로 상이하여 D-dimer는 66.46 ng/ml 이상이고, AFP는 39.24 ng/ml 이상이며, cCRP는 2.81 ng/ml 이상을 기준으로 한다. 이때 바이오마커의 측정값이 각각의 cut off 농도 값 이상일 경우 반려동물의 종양진단 여부를 진단할 수 있다.
상기 종양진단이 가능한 종양은 상피세포암(SCC(Squamous-cell carcinoma), TCC(transitional cell carcinoma)), 항문종양(Anal sac adenocarcinoma, Perianal adeno carcinoma), 폐종양(Lung adenocarcinoma, Pulmonary adenosquamous cell carcinima), 간암(HCC(Hepatocellular carcinoma)), 림프종(Multicentric lymphoma, lymphoma), 경동맥암(Carotid body tumor), 비강세포암(Nasal cell carcinoma), 난소암(Ovarian carcinoma), 구강 흑색종/비만세포종(melanoma in oral, Mast cell tumor), 기관지확장증/갑상선 낭종(Thyroglosa duct cyst with bronchiectasis), 담낭 점액낭종(gallbladder mucocele), 기저세포종(basal cell carcinoma) 및 유선종양 등이 있다.
상기 위험군을 분류하는 단계는 상기 바이오마커 측정값이 기준값을 초과하는 바이오마커 개수에 따라 분류할 수 있다.
상기 분류는, 상기 바이오마커 개수가 하나일 경우에는 위험군, 2개일 경우 고위험군, 3개일 경우에는 초고위험군으로 분류하는 것이다.
본 발명은 반려동물에서 상기와 같은 3가지 바이오마커의 검사를 통하여 여러 가지 종양질병의 보조적 진단정보를 제공하는 방법을 제시한다. 사람에서는 악성종양의 진단을 위하여 AFP, CEA, PSA, CA-12 등 종양의 종류, 단계에 따라 다양한 바이오마커가 스크린 검사 또는 예후검사를 위하여 사용된다. 이들 종양특이 바이오마커의 검사는 보조적 진단수단으로서 이미 많은 문헌에 의하여 그 유효성이 증명되어 왔다.
사람에서는 영상진단, 내시경, 조직검사를 통하여 1차 진단을 시행하고 종양을 특정하고, 해당 종양 특이적인 바이오마커 검사를 통하여 보조적인 정보를 획득하는 방식으로 진단을 시행한다.
하지만, 동물에서는 사람과 달리 영상진단, 생검과 같은 직접적 종양검사를 시행하는 것은 비용, 기술적문제, 사회적 문제로 인하여 어려움이 있다. 본 발명자 등은 이러한 점에 착안하여 반려동물의 종양질병을 완전하지는 않지만 3가지 일반적인 바이오마커 검사와 검사결과의 조합을 통하여 보조적 진단정보를 제공하는 방법을 제시한다.
본 발명의 실시예에서 적용한 바이오마커는 다음과 같다.
1. Canine C-reactive protein(cCRP)
cCRP 는 급성 염증 반응의 초기에 간에서 생성되는 Acute phase Protein(APP) 단백질로 염증반응이나 감염이 일어났을 때 혈액 내에 급격히 증가한다. 따라서 체내의 염증 반응이나 조직 손상에 빠르게 반응하여 감염이나 수술 전후의 모니터링에 사용될 수 있다. 염증은 많은 비정상 상태에 대한 기본적인 반응이므로 CRP 검사는 전신 염증의 존재를 탐지하는데 상대적으로 특이한 반면에 전신 염증의 원인에 대한 정보를 반드시 제공하지는 않는다. CRP 농도는 바이러스성 감염이 있는 개, 활동성 세균성 또는 곰팡이 감염이 있는 개, 일부 유형의 관절염과 같은 만성 염증성 질환이 있는 개, 때로는 암이 있는 개에서 높아진다고 알려져 있다. 따라서 암으로 인해 유발된 염증 발생 시 반려동물 cancer에서 증가할 것으로 판단된다.
2. D-dimer
범혈관내응고증(DIC)을 진단하는데 있어 중요한 검사법의 하나로 DIC는 혈관내 응고기전이 활성화되고 여기에 이어 섬유소 용해가 계속적으로 일어나는 상태인데 이때 D-dimer가 증가한다. D-dimer는 혈전형성 질환에서도 증가하기 때문에 심부정맥 혈전증(DVT)이나 폐색전증의 진단에도 이용된다. D-dimer 역시 암세포로 유발 혈전 발생 시에도 증가할 가능성이 있다고 판단된다.
3. AFP[ α-fetoprotein , α-FP ]
α-페토프로테인은 원발성간암(原發性肝癌)환자 혈중에서 검출된다는 사실이 알려진 후로 임상 검사에 등장하게 되었다. AFP는 간암세포에서 만들어진다는 사실이 확인되고 있으며, 태아간(胎兒肝)과 종양과의 공통 단백이라는 사실에서 암태아단백(癌胎兒蛋白, carcinofetal protein)이라고 일컬어지고 있다. 원발성간암의 90%에서 AFP가 양성이며, 혈중에서 AFP를 검출할 수 없는 원발성간암도 간암세포에서는 만들어지고 있으나 분비되지 않을 뿐이라고 말해지고 있다. 그 밖에 위암의 일부에서도 만들어지고 있으며, 또 간염, 간경변환자에서도 일과성으로 혈중에서 높은 수치를 나타내는 경우가 있다. 고환(睾丸)이나 난소의 태아성 암(胎兒性癌)도 AFP를 생성한다. 따라서 암으로 인해 유발된 염증 발생 시 반려동물 cancer에서 증가할 것으로 판단된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1.
건강한 실험군인 대조군과 악성종양을 가진 실험군의 혈액을 채취하여 준비한다. 준비된 혈액을 원심분리로 분리하여 혈장을 준비한다. Capillary cap의 마개 부분을 이용하여 검사액 뚜껑에 구멍을 낸 다음, 피펫으로 검체(혈장) 또는 정도 관리 물질(Vet chroma의 Quality를 유지화기 위하여 확인하는 Control 시료) 50㎕ 를 취하여 d-Dimer 검사액이 들어있는 튜브에 넣는다. Capillary cap을 검사액 튜브에 완전히 삽입하고 샘플과 검사액이 잘 석이도록 10번 이상 흔들어 준다. 샘플과 석인 검사액 튜브의 capillary cap의 마개를 제거하고, 검사액 튜브를 눌러 2방울을 버린 후, 다음 2방울을 카트리지의 샘플 투입구에 넣어준다. 분주된 검사 카트리지를 전용 장비에 장착 후 검사를 시작한다. 12분 경과 후, 자동으로 측정된다. 형광 LFI(Lateral flow immunoassay, 측방유동면역분석기) 전용 장비인 벳 크로마(Vet chroma)의 측정값 결과(스크리닝 검사 결과)를 화면에서 확인한다.
실시예 2.
상기 실시예1과 동일하게 수행하되, 상기 d-Dimer 검사액 대신에 AFP 검사액이 들어있는 튜브를 사용하여 수행한다. 분주된 검사 카트리지를 전용 장비에 장착 후 검사를 시작한다. 15분 경과 후, 자동으로 측정된다
실시예 3.
상기 실시예1과 동일하게 수행하되, 검체의 양의 10㎕ 를 취하고, d-Dimer 검사액 대신에 cCRP 검사액이 들어있는 튜브를 사용하고, 상기 분주된 검사 카트리지를 전용 장비에 장착 후 검사를 시작하되 3분 경과 후 결과를 확인한다.
상기 실시예 1 내지 3에서 수행한 측정 결과는 아래 표1과 같았다.
■ 반려동물 시료에서의 3종 마커 측정 결과
Diagnostic Decision (진단명) 스크리닝 검사 결과 (mean concentration, 평균값)
D-dimer [ng/ml] AFP [ng/ml] cCRP [mg/L] No. of Samples
상피세포암 SCC(Squamous-cell carcinoma), TCC(transitional cell carcinoma) 1575.01 81.05 51.6 8
항문종양 Anal sac adenocarcinoma, Perianal adeno carcinoma 1607.09 119.68 44.58 6
폐종양 Lung adenocarcinoma, Pulmonary adenosquamous cell carcinima 4744.23 59.36 119.03 4
간암 HCC(Hepatocellular carcinoma) 3081.97 876.12 43.29 14
림프종 Multicentric lymphoma, lymphoma 179.77 141.18 4.74 24
경동맥암 Carotid body tumor 169.69 46.45 5.58 4
비강세포암 Nasal cell carcinoma 931.64 66.7 12.63 5
난소암 Ovarian carcinoma 3058.38 74.56 59.67 3
구강 흑색종, 비만세포종 melanoma in oral/Mast cell tumor 143.34 31.57 26.16 3
기관지확장증, 갑상선 낭종 Thyroglosa duct cyst with bronchiectasis 1077.66 164.25 299.3 2
담낭 점액낭종 gallbladder mucocele 8738 51.63 123.61 5
기저세포종 basal cell carcinoma 66.67 98.54 16.54 1
종양검체 전체 Cancer group 2114.45 150.93 67.23 79
건강한 개체 Healthy control 149.69 71.09 4.97 30
참고치 Human 250 70 10 -
이때 상기 실시예 1 내지 3의 측정값을 비교할 기준이 되는 종양검사 기준농도는 Sensitivity(민감도)가 80% 이상인 기준의 각각의 마커별 Cut off이며, 해당 농도는 아래 표 2와 같다.
바이오마커 단위 검출범위 정상치 종양진단 P value AUC 민감도 특이도
D-Dimer ng/mL 50-10.000 <250 >=66.46 0.004 0.693 80% 50%
AFP ng/mL 5-350 <20 >=39.24 0.706 0.527 80% 27%
cCRP mg/L 5-500 <10 >=2.81 0.245 0.583 80% 23%
상기 표 2에서 측정된 정상군 개체수는 30마리의 개, 질병군(종양질환)의 개체수는 79마리의 개이고, ROC curve 분석 사용 통계 프로그램은 MediCalc.을 사용하였다.
산출예 1.
상기와 같이 D-dimer 개 종양질환에서의 민감도 80%기준 cut off농도는 66.46 ng/ml, AFP 개 종양질환에서의 민감도 80%기준 cut off농도는 39.24 ng/ml, cCRP 개 종양질환에서의 민감도 80%기준 cut off농도는 2.81 ng/ml 임을 확인하였다.
이를 기준으로 측정한 각각의 바이오마커의 평균값은 하기 표 3과 같다.
　 D-dimer AFP cCRP
Diagnostic Decision (진단명) Diagnostic Decision (진단명) Diagnostic Decision (진단명)
Vet chroma 측정 Positive Negative Positive Negative Positive Negative
Positive 64 15 64 23 63 23
Negative 15 15 15 7 16 7
민감도(Sen.) 81% 81% 80%
특이도(Sep.) 50% 23% 23%
Accuracy 72% 65% 64%
양성 예측률(PPV) =TP/(TP+FP) 81% 74% 73%
상기 표 3을 참조하면 확인 가능한 항목들이 다음과 같다.
상기 Positive 항목은 종양질환이라고 판정한 개체수를 의미한다. Vet chroma 측정 결과에서의 Positive의 의미를 설명 하자면 정상군 30, 종양질환 질병군 70개체의 혈액 시료에서 AFP, D-dimer. cCRP를 측정하여 Medcalc.통계 프로그램으로 민감도 80% 기준인 Cut-off 농도를 산출 후 그 농도보다 높은 개체를 의미하며, 상기 Negative 항목은 상위 Positive 판단기준인 선정 Cut-off 농도보다 하위 개체를 의미한다.
상기 민감도는 종양질환이 있는 개체군에서 양성 판정을 받을 확률이며, 즉 종양질환 환자군에서 Vet chroma 측정 결과로 Positive(양성)라고 진단받을 확률을 의미한다.
상기 특이도는 정상군 개체에서 음성 판정을 받을 확률이며, 즉 정상군 개체군에서 Vet chroma 측정 결과로 Negative(음성)이라고 진단받을 확률을 의미한다.
상기 정확도(Accuracy)는 전체 개체군에서 종양질환이 있는 개체군을 Positive(양성)으로 판단하고, 정상군을 Negative(음성)으로 판단할 확률로, 즉 진단명과 Vet chroma 양성, 음성 판정률이 일치할 확률을 의미한다.
상기 양성예측률은 양성개체군에서 진단명의 종양질환이 있을 확률로, 상기 계산식과 의미에 대하여 표 4와 같이 설명한다.
Diagnostic Decision (진단명)Positive Diagnostic Decision (진단명)Negative Sub Total
Vet chroma Positive True positive(TP) False Positive(FN) TP+FP
Vet chroma Negative False Negative(FN) False Negative(FN) FN+TN
Sub Total TP+FN FP+TN TP+FP+FN+TN
Sensitivity (민감도) 진단 Positive군에서 Vet chroma 측정결과로 양성 판정 받을 확률 TP/(TP+FN)*100
Specificity (특이도) 진단 Negative에서 Vet chroma 측정결과로 음성 판정 받을 확률 TN/(FP+TN)*100
Accuracy (정확도) 전체개체군에서 종양질환을 양성으로 정상군을 음성으로 판정할 확률 TP+TN/(TP+FP+FN+TN)*100
Positive predictive value(PPV, 양성 예측률) Vet chroma 검사기준 양성개체군에서 진단명의 종양질환(Positive)이 있을 확률 TP/(TP+FP)*100
상기 표 3를 참조하여 상기 양성예측률을 확인하면, D-dimer마커의 검사를 통해 81% 종양질병 양성추정률 진단할 수 있으며, 상기 AFP마커의 검사를 통해 74% 종양질병 양성추정률 진단 할 수 있고, 상기 cCRP마커의 검사를 통해 73% 종양질병 양성추정률 진단 할 수 있음을 확인할 수 있었다. 상기와 같이 각각의 마커에서 Positive로 인식되어 양성추정률을 진단 할 수 있는 개체는 그만큼 양성종양일 확률이 높아지면서 양성종양 위험군으로 분류되어 관리할 수 있다.
산출예 2.
실시예 1 내지 실시예 3에서 측정된 마커들을 단일검사로 검출하여 확인한 결과를 2종씩 분류 한 후, 세개의 마커 중 한 개라도 종양진단에 결과와 일치하면 Potitive, Negative로 인지하여 표 4와 같이 민감도, 특이도, 양성 양성예측률을 분석한 결과 아래 표 5와 같은 양성예측율을 얻을 수 있었다.
D-dimer-AFP D-dimer-cCRP AFP-cCRP
Diagnostic Decision (진단명) Diagnostic Decision (진단명) Diagnostic Decision (진단명)
Vet chroma 측정 Positive Negative Positive Negative Positive Negative
Positive 74 14 75 10 75 19
Negative 5 16 4 20 4 11
민감도(Sen.) 94% 95% 95%
특이도(Sep.) 53% 67% 37%
Accuracy 83% 87% 79%
양성예측률(PPV) =TP/(TP+FP) 84% 88% 80%
상기 표 5를 참조하여 상기 양성예측률을 확인하면 D-dimer와 AFP의 스크린 검사를 통해서 84% 종양질병 양성추정률을 진단할 수 있고(단일마커D-dimer, AFP(81, 74%)보다 양성진단율 높아짐), D-dimer와 cCRP의 스크린 검사를 통해서 88% 종양질병 양성예측률 진단할 수 있으며(단일마커D-dimer, cCRP(81, 73%)보다 양성진단율 높아짐), AFP와 cCRP의 스크린 검사를 통해서 80% 종양질병 양성예측률 진단할 수 있음을(단일마커 AFP, cCRP(74, 73%)검사보다 양성진단율 높아짐) 확인할 수 있다. 이렇게 2개의 마커에서 Positive로 인식된 개체는 1개의 마커에서 Positive로 인식된 개체보다 그만큼 약성종양일 확률이 높아지면서 양성종양 고위험군으로 분류되어 관리할 수 있다.
산출예 3.
실시예 1 내지 실시예 3에서 측정된 마커들을 단일검사로 검출하여 확인한 결과를 토대로, 세 개의 마커 모두를 종양진단에서 결과와 일치하면 Potitive, Negative로 인지하여 표 4와 같이 민감도, 특이도, 양성 양성예측률을 분석한 결과 아래 표 6와 같은 양성예측율을 얻을 수 있었다.
D-dimer-AFP-cCRP
Diagnostic Decision (진단명)
Vet chroma Positive Negative
Positive 77 9
Negative 2 21
민감도(Sen.) 97%
특이도(Sep.) 70%
Accuracy 90%
양성예측률(PPV)=TP/(TP+FP) 90%
상기 표 6를 참조하면, D-dimer, AFP와 cCRP를 포함하는 3종의 마커 동시 검사 시 반려동물 종양질환 양성 예측률이 90%로 단일마커나 2종의 마커 결합 검사 시보다 월등히 양성예측률 높아짐을 확인 할 수 있다. 이렇게 3개의 마커에서 Positive로 인식된 개체는 2개 이하의 마커에서 Positive로 인식된 개체보다 그만큼 약성종양일 확률이 높아지면서 양성종양 초고위험군으로 분류되어 관리할 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
[부호의 설명]
100 측방 유동 분석 스트립 102 하우징
104 샘플 포트 110 다공성 매트릭스
120 샘플 패드 140 테스트 라인
160 컨트롤 라인 170 흡수패드

Claims (5)

  1. 반려동물에서 종양질병의 진단을 위한 바이오마커 검사방법에 있어서,
    반려동물로부터 채취된 시료 내의 복수의 바이오마커를 측정하여 각각의 바이오마커에 대해 측정값을 생성하는 단계;
    상기 바이오마커 측정값과 해당 기준값을 비교하는 단계; 및
    상기 바이오마커 측정값이 상기 기준값을 초과하는 바이오마커의 개수에 따라 상기 반려동물의 종양질병의 가능성을 판단하는 단계를 포함하는 반려동물의 종양질병 검사방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 반려동물은,
    포유류인 것을 특징으로 하는 반려동물에서 종양질병의 보조적 진단을 위한 바이오마커 검사방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 시료는,
    세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨를 포함하는 것을 특징으로 하는 반려동물에서 종양질병의 보조적 진단을 위한 바이오마커 검사방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 바이오마커 측정은,
    형광 LFI(Lateral flow immunoassay, 측방유동면역분석기)를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 반려동물에서 종양질병의 보조적 진단을 위한 바이오마커 검사방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 바이오마커는,
    D-dimer, AFP 또는 cCRP 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 반려동물에서 종양질병의 보조적 진단을 위한 바이오마커 검사방법.
PCT/KR2019/014448 2018-10-30 2019-10-30 반려동물에서 종양질병의 보조적 진단을 위한 바이오마커 검사방법 WO2020091408A1 (ko)

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