WO2020090225A1

WO2020090225A1 - 細胞数を推定する方法および細胞数を推定する装置

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Publication number: WO2020090225A1
Application number: PCT/JP2019/034982
Authority: WO
Inventors: 翼櫻井; 圭佑平
Original assignee: Ｐｈｃホールディングス株式会社
Priority date: 2018-11-02
Filing date: 2019-09-05
Publication date: 2020-05-07
Also published as: EP3859008A4; EP3859008B1; EP3859008A1; US20210254125A1; CN112888792A; JP7038230B2; JPWO2020090225A1

Abstract

【課題】非侵襲的に細胞数を推定する方法および装置を提供すること。【解決手段】　簡便な方法、たとえば分光法を用いて、ある細胞を培養する培地に含まれる、細胞代謝物の濃度を推定する。予め得られている前記細胞代謝物の濃度と前記ある細胞の細胞数との関係を示す関係情報に当てはめることにより、前記ある細胞の細胞数を推定することができる。　ここで、分光法においては、細胞代謝物の濃度が高いほど、細胞消費物の実際の濃度を正確に推定することができるため、細胞培養初期～中期においては、細胞の培養に伴って経時で減少する細胞消費物の濃度を推定し、細胞培養中期～後期においては、細胞の培養に伴って経時で増加する細胞産生物の濃度を推定する。これによって、細胞培養初期から終期に至るまでの全ての範囲において細胞数の推定が可能である。

Description

細胞数を推定する方法および細胞数を推定する装置

　本発明は、細胞数を推定する方法および細胞数を推定する装置に関する。

　たとえば、がんや白血病の治療方法として、患者の免疫に関わる細胞を患者の体内から取り出して、患者の体外で人工的に培養した後、再び患者の体内に戻す方法が知られている。その際、培養中の細胞数を、非侵襲的方法で、かつ連続的に推定したいという製造における要望が存在する。なお、本明細書において、「非侵襲的方法」とは、対象である細胞をサンプリングしない方法をいう。

　細胞代謝物の濃度と細胞数とは、相関性があることが知られている。そこで、培養中の細胞数を推定する方法として、細胞の培養に伴い経時で変化する培地中の細胞代謝物の濃度を推定し、推定した濃度を、既存のデータベースと照合する方法が考えられる（たとえば特許文献１参照）。データベースには、細胞代謝物の濃度と細胞数との関係情報が格納されている。なお、本明細書において、「細胞代謝物」とは、細胞の代謝に使用される細胞消費物および細胞産生物を意味する。細胞消費物は、細胞の代謝の過程で消費される物質である。したがって、細胞の培養に伴い経時で減少する。細胞消費物は、たとえばグルコースである。細胞産生物は、細胞の代謝の過程で産生される物質である。したがって、細胞の培養に伴い経時で増加する。細胞産生物は、たとえばラクテートである。

　細胞代謝物の濃度と細胞数との関係情報は、細胞数を推定する前提となることから、高い精度を有することが必要とされる。細胞代謝物の濃度と細胞数との関係情報を高い精度で取得する方法として、バイオアッセイ法が挙げられる。具体例としては、まず、細胞を培養している培地の一部を採取する。採取した培地に特定の細胞代謝物のみと反応する試薬を加え、試薬を培地中の細胞代謝物と反応させることにより生成される反応物の発光シグナルを検出する。ここで、発光シグナルは、検出可能であれば、可視光、蛍光、リン光等の種類を問わない。

　ここで、発光シグナルの強度と細胞代謝物の濃度とは比例関係にある。したがって、発光シグナルを検出することによって、採取した培地中の細胞代謝物の濃度を測定することができる。培地中の細胞数は、細胞計算盤の使用等による公知の方法で測定することができる。これによって、細胞代謝物のある濃度における細胞数の情報を得ることができる。同様にして細胞代謝物の様々な濃度における細胞数の情報を得ることによって、細胞代謝物の濃度と細胞数との関係情報を取得することができる。また、試薬として、細胞代謝物の濃度に依存した呈色を示す呈色試薬等を用いてもよい。

　しかしながら、バイオアッセイ法は、侵襲的な方法であり、採取器具等が培地と接触することが避けられない。従って、培地の汚染などの問題が存在する。また、培養中において多数回にわたりサンプリングすることは困難であるから、細胞数の情報を断続的にしか得ることができない。

　そこで、バイオアッセイ法とは別に、分光法によるアプローチが考えられる。具体的には、培地に、細胞に悪影響を与えない波長の光線を照射し、その吸光度や散乱度を測定する。得られた測定値に対して多変量解析などの解析手段を用いることによって、細胞代謝物の濃度を推定することができる。このようにして推定した細胞代謝物の濃度を、バイオアッセイ法を用いて取得された関係情報と照会することにより、推定した細胞代謝物の濃度における細胞数を推定することが可能である。分光法は、非侵襲的であり、かつ連続的に細胞代謝物の濃度を推定できる利点がある。

特開２０１４－４５６６３号公報

　しかしながら、分光法では一般的に、細胞代謝物の濃度が高い場合にしか正確な濃度を推定することができない。たとえば、グルコースとラクテートを例に説明すると、グルコースの濃度は、細胞の培養に伴って低下するため、一定の培養期間が経過すると正確に推定することができなくなる。逆に、ラクテートの濃度は、細胞の培養に伴って上昇するため、一定の培養期間が経過しなければ正確に推定することができない。

　本発明は、非侵襲的、かつ連続的に細胞数を推定する方法および装置を提供することを目的とする。

解決を解決するための手段

　すなわち本発明は、培地中に含まれる細胞代謝物の濃度に応じた値を取得可能な方法を用いて、ある細胞を培養する培地に含まれる、第一の細胞代謝物の濃度を推定する工程と、推定した前記第一の細胞代謝物の濃度が、閾値以上である場合、推定した前記第一の細胞代謝物の濃度を、予め得られている前記第一の細胞代謝物の濃度と前記ある細胞の細胞数との関係を示す第一の関係情報に当てはめることにより、前記ある細胞の細胞数を推定する工程と、推定した前記第一の細胞代謝物の濃度が、閾値未満である場合、前記方法を用いて、前記培地に含まれる第二の細胞代謝物の濃度を推定する工程と、推定した前記第二の細胞代謝物の濃度が、閾値以上である場合、推定した前記第二の細胞代謝物の濃度を、予め得られている前記第二の細胞代謝物の濃度と前記ある細胞の細胞数との関係を示す第二の関係情報に当てはめることにより、前記ある細胞の細胞数を推定する工程と、を有する細胞数の推定方法である。

　また、本発明は、ある細胞の細胞数を推定する装置であって、培地中に含まれる細胞代謝物の濃度に応じた値を取得可能な方法を用いて測定されたデータに基づいて、ある細胞を培養する培地に含まれる、細胞代謝物の濃度を推定する第一の推定部と、推定した前記細胞代謝物の濃度が、閾値以上であるかどうかを判定する判定部と、前記判定部による判定結果に応じて、推定した前記細胞代謝物の濃度を、予め得られている前記細胞代謝物の濃度と前記ある細胞の細胞数との関係を示す関係情報に当てはめることにより、ある細胞の細胞数を推定する第二の推定部と、を有し、前記第二の推定部は、前記第一の推定部により推定した第一の細胞代謝物の濃度が、閾値以上であると判定された場合、推定した前記第一の細胞代謝物の濃度を、予め得られている前記第一の細胞代謝物の濃度と前記ある細胞の細胞数との関係を示す第一の関係情報に当てはめることにより、前記ある細胞の細胞数を推定し、前記第一の推定部は、推定した前記第一の細胞代謝物の濃度が、閾値未満であると判定された場合、前記培地に含まれる第二の細胞代謝物の濃度を推定し、前記第二の推定部は、推定した前記第二の細胞代謝物の濃度が、閾値以上であると判定された場合、推定した前記第二の細胞代謝物の濃度を、予め得られている前記第二の細胞代謝物の濃度と前記ある細胞の細胞数との関係を示す第二の関係情報に当てはめることにより、前記ある細胞の細胞数を推定する、装置である。

　本発明によれば、非侵襲的、かつ連続的に細胞数を推定することができる。

第１の例に係る、細胞の細胞数を推定する装置を示す図である。第１の例に係る、制御部を示す図である。第１の例に係る、細胞の細胞数を推定する方法を示すフローチャートである。第２の例に係る、細胞の細胞数を推定する装置を示す図である。第２の例に係る、制御部を示す図である。第２の例に係る、細胞の細胞数を推定する方法を示すフローチャートである。細胞数と培養日数との関係を表すグラフである。グルコースの濃度と培養日数との関係を表すグラフである。ラクテートの濃度と培養日数との関係を表すグラフである。多変量解析を用いて推定したグルコースの濃度とバイオアッセイ法を用いて得られた濃度との関係を表すグラフである。多変量解析を用いて推定したラクテートの濃度とバイオアッセイ法を用いて得られた濃度との関係を表すグラフである。

　以下、本発明の形態について説明するが、本発明の範囲は、実施例を含めた当該記載に限定されるものではない。

＜関係情報の取得について＞
　関係情報は、細胞代謝物の濃度とある細胞の細胞数との関係を示す情報である。関係情報は、細胞代謝物毎に存在する。

　関係情報は、様々な方法により取得することができる。特に、精度の高い関係情報を取得できる点からバイオアッセイ法が好ましい。バイオアッセイ法としては、生物学的な応答を取得・分析する方法であれば、上述したような試薬を用いた方法に限定されず、質量分析法、抗体法等、様々な方法を用いることができる。

＜培地中に含まれる細胞代謝物の濃度に応じた値を取得する方法について＞
　非侵襲的かつ連続的に測定結果が得られる方法であることが好ましい。培地中に含まれる細胞代謝物の濃度に応じた値としては、光学的もしくは電気的な値が挙げられる。これらの値は、たとえば公知のセンサーを用いて取得することができる。

　例として、上述のような分光法が挙げられる。分光法は、培地に対して細胞に悪影響を与えない波長の光線を照射し、吸光度や散乱度を測定する方法である。さらに、非侵襲的かつ連続的に測定結果が得られる方法である。得られた測定結果に対して多変量解析などの解析手段を用いることによって、細胞代謝物の濃度を推定することができる（後述）。

　分光法は、濃度を推定する細胞代謝物に応じて、近赤外分光法、可視分光法、蛍光分光法、およびラマン分光法等を用いることができる。たとえば蛍光分光法は、細胞代謝物と特異的に結合することで蛍光を発するプローブを培地に加え、その蛍光強度を計測する方法である。なお、蛍光分光法を用いる場合、センサーとして機能する基質にプローブを固定化し、保護膜で覆った状態とすることがより好ましい。このように保護膜で覆うことにより、プローブの流出を防止し、非侵襲的な測定が可能となる。分光法は、細胞に悪影響を与えないものである限り、これらに限定されるものではない。

　また、分光法の代わりに電気化学方式が挙げられる。電気化学方式は、分析物を基質とする酵素を用いて電気的な値を取得する方法である。電気的な値は、分析物の濃度に対応している。電気化学方式は、非侵襲的かつ連続的に測定結果が得られる方法である。ここで、分析物を細胞代謝物とすることにより、細胞代謝物の濃度に対応した電気的な値を取得することができる。

　電気化学方式に用いるセンサーとしては、たとえば、グルコースを連続的に測定できる酵素センサー、乳酸を連続的に測定できる酵素センサーを用いることができる。なお、これらの酵素センサーは、細胞をサンプリングする必要の無い非侵襲的なセンサーである一方、測定時には培地にセンサーを接地させる必要がある。そこで、電気化学方式を使用する場合、酵素センサーの接地面には保護膜を設けることが好ましい。保護膜により、酵素センサーの接地による細胞への悪影響を低減できる。なお、電気化学方式に用いるセンサーは、細胞に悪影響を与えない限り、保護膜を設けた酵素センサーに限定されるものではない。

＜細胞代謝物の濃度の推定＞
　細胞代謝物の濃度は、上記方法によって得られた吸光度や散乱度の値、或いは電気的な値を、統計的手法を用いて解析することにより得られる。

　統計的手法は、上記方法により測定したデータの数、照射した波長等の条件に応じて、公知の技術を利用することができる。

＝＝第１の例＝＝
　ここで、第１の例として、培地中に含まれる細胞代謝物の濃度に応じた値を取得する方法として分光法を用い、統計的手法として多変量解析を用いることにより、細胞代謝物の濃度の推定を行う例について述べる。

（細胞数の推定）
　推定した細胞代謝物の濃度を、当該細胞代謝物に対応する関係情報に当てはめることにより、細胞数を推定することができる。

　一方で、分光法を用いる場合には、細胞代謝物の濃度が高い場合にしか正確な濃度を推定することができない。

　ここで、細胞代謝物のうち、細胞消費物は、細胞の培養に伴って経時で減少する。一方、細胞代謝物のうち、細胞産生物は、細胞の培養に伴って経時で増加する。

　すなわち、培養後期には細胞消費物の濃度を正確に推定することができない。また、培養初期には細胞産生物の濃度を正確に推定することができない。

　そこで、本実施形態に係る方法は、細胞消費物の濃度または細胞産生物の濃度のいずれかに基づいて、細胞数の推定を行う。

　具体的には、推定した細胞消費物の濃度が、閾値以上である場合、推定した細胞消費物の濃度を、予め得られている細胞消費物の濃度とある細胞の細胞数との関係を示す関係情報に当てはめることにより、ある細胞の細胞数を推定する。

　一方、推定した細胞消費物の濃度が、閾値未満である場合、細胞産生物の濃度を推定する。推定した細胞産生物の濃度が、閾値以上である場合、推定した細胞産生物の濃度を、予め得られている細胞産生物の濃度とある細胞の細胞数との関係を示す関係情報に当てはめることにより、ある細胞の細胞数を推定する。

　閾値は、細胞代謝物において、分光法を用いて細胞代謝物の実際の濃度を正確に推定することができる濃度の下限値である。閾値を求める方法としては、たとえば交差検証法が用いられる。具体的には、まず、近赤外分光法を用い、既知の細胞代謝物の濃度（「実測濃度」とする）を有する培地の吸光度を測定し、多変量解析を用いて吸光度から細胞代謝物の濃度を推定する。この工程を多数回繰り返して、実測濃度と推定した細胞代謝物の濃度との関係のデータを蓄積する。次に、交差検証法を用いて、実測濃度と推定した細胞代謝物の濃度との相関係数が０．７以上になるまで前記蓄積した測定データから低い濃度のデータを削除し、相関係数が０．７以上になった時の測定データの最低濃度を閾値とする等の方法が考えられる。

　細胞代謝物としては、細胞消費物および細胞産生物の組み合わせであることが好ましい。上述したように、細胞消費物は、濃度が高い培養初期～中期において、実際の濃度を正確に推定することができる。一方、細胞産生物は、濃度が高くなる培養中期～終期において、実際の濃度を正確に推定することができる。したがって、細胞消費物の濃度または細胞産生物の濃度を用いることにより、培養のいずれの段階であっても、細胞数を推定することができる。

　細胞消費物と細胞産生物の組み合わせとしては、グルコースとラクテートの組合せ、或いはグルタミンとグルタミン酸の組み合わせなどが挙げられる。たとえば、Ｔ細胞は、グルコースを消費し、ラクテートを産生する。

　上記説明における、細胞消費物は「第一の細胞代謝物」の一例であり、細胞産生物は「第二の細胞代謝物」の一例である。また、細胞消費物の濃度とある細胞の細胞数との関係を示す関係情報は「第一の関係情報」の一例であり、細胞産生物の濃度とある細胞の細胞数との関係を示す関係情報は「第二の関係情報」の一例である。なお、細胞消費物より先に細胞産生物の濃度を閾値と比較する場合、細胞産生物が「第一の細胞代謝物」に相当し、細胞消費物が「第二の細胞代謝物」に相当する。

（細胞数を測定する装置）
　図１を参照して、第１の例に係る細胞数を推定する装置１０について説明する。

　装置１０は、記憶部１１、分光測定部１２、制御部１３、表示部１４、及び操作部１５を備える。

［記憶部］
　記憶部１１は、装置１０に関する各種情報を記憶する。本実施形態に係る記憶部１１は、予め得られた複数の細胞代謝物の濃度とある細胞の細胞数との関係を示す関係情報を記憶する。

［分光測定部］
　分光測定部１２は、培地に対して所定波長の帯域を持つ光を照射し、吸収光、反射光および散乱光を受光する。分光測定部１２は、受光した光を制御部１３に出力する。

［制御部］
　制御部１３は、ＣＰＵおよびメモリ（図示なし）を備える。ＣＰＵは、メモリに記憶された動作プログラムを実行することにより各種の制御機能を実現する。メモリは、ＣＰＵに実行されるプログラムを記憶したり、プログラムの実行時に各種情報を一時的に記憶したりする記憶装置である。本実施形態において、制御部１３は、分光解析部１３ａ、第一の推定部１３ｂ、判定部１３ｃ、第二の推定部１３ｄ、及び表示制御部１３ｅとして機能する（図２参照）。

　分光解析部１３ａは、分光測定部１２より受光した光から、吸光度や散乱度を測定する。吸光度や散乱度の測定は、公知の手法を利用することができる。

　第一の推定部１３ｂは、分光法を用いて測定されたデータに基づいて、ある細胞を培養する培地に含まれる、細胞代謝物の濃度を推定する。データは、分光解析部１３ａにより得られた吸光度等である。また、細胞代謝物の濃度の推定には、上述の方法を用いることができる。

　判定部１３ｃは、推定した細胞代謝物の濃度が、閾値以上であるかどうかを判定する。

　第二の推定部１３ｄは、判定部１３ｃによる判定結果に応じて、推定した細胞代謝物の濃度を、記憶部１１に記憶されている関係情報に当てはめることにより、ある細胞の細胞数を推定する。

　ここで、本実施形態に係る具体的な処理について説明を行う。まず、第一の推定部１３ｂは、第一の細胞代謝物の濃度を推定する。判定部１３ｃは、推定した第一の細胞代謝物の濃度が、閾値以上であるかどうかを判定する。

　推定した第一の細胞代謝物の濃度が、閾値以上であると判定された場合、第二の推定部１３ｄは、推定した第一の細胞代謝物の濃度を、記憶部１１に記憶されている第一の関係情報に当てはめることにより、ある細胞の細胞数を推定する。

　一方、推定した第一の細胞代謝物の濃度が、閾値未満であると判定された場合、第一の推定部１３ｂは、培地に含まれる第二の細胞代謝物の濃度を推定する。判定部１３ｃは、推定した第二の細胞代謝物の濃度が、閾値以上であるかどうかを判定する。

　推定した第二の細胞代謝物の濃度が、閾値以上であると判定された場合、第二の推定部１３ｄは、推定した第二の細胞代謝物の濃度を、記憶部１１に記憶されている第二の関係情報に当てはめることにより、ある細胞の細胞数を推定する。

　表示制御部１３ｅは、装置１０における各種表示制御を行う。表示制御部１３ｅは、たとえば、細胞数を推定した結果を表示部１４に表示させる。

［表示部・操作部］
　表示部１４は、ディスプレイ等、各種情報を表示する構成である。操作部１５は、マウスやキーボード、或いは表示部１４に表示されるタッチパネル等、装置１０に対して各種指示入力を行うための構成である。なお、装置１０は、表示部１４に表示された情報をプリントアウトする機能や、外部のプリンタから出力する機能を持っていてもよい。

（細胞数を推定する方法について）
　次に、図３を参照して、装置１０を利用して細胞Ｃの細胞数を推定する方法について説明する。この例では、細胞Ｃが細胞消費物Ｘを消費し、細胞産生物Ｙを産生する例について述べる。また、細胞消費物Ｘの濃度を先に推定するものとする。さらに、細胞消費物Ｘの濃度と細胞Ｃの細胞数との関係を示す第一の関係情報、及び細胞産生物の濃度と細胞Ｃの細胞数との関係を示す第二の関係情報は、バイオアッセイ法を用いて予め求められているものとする。

　まず、装置１０に、細胞Ｃを培養している培地を載置する。

　分光測定部１２は、培地に所定の波長の光を照射して、吸収光等を受光し、受光した光を制御部１３に出力する。

　分光解析部１３ａは、細胞Ｃを培養する培地に含まれる、細胞消費物Ｘの吸光度及び散乱度を測定する（Ｓ１０１）。

　第一の推定部１３ｂは、Ｓ１０１で測定された吸光度及び散乱度のデータを解析して、細胞消費物Ｘの濃度を推定する（Ｓ１０２）。

　判定部１３ｃは、Ｓ１０２で推定した細胞消費物Ｘの濃度が、閾値以上であるか否かを判定する。閾値以上である場合（Ｓ１０３でＹＥＳの場合）、第二の推定部１３ｄは、Ｓ１０２で推定した細胞消費物Ｘの濃度を、記憶部１１に記憶されている第一の関係情報に当てはめることにより、細胞Ｃの細胞数を推定する（Ｓ１０４）。

一方、推定した細胞代謝物の濃度が、閾値未満である場合（Ｓ１０３でＮＯの場合）、分光解析部１３ａは、細胞Ｃを培養する培地に含まれる、細胞産生物Ｙの吸光度及び散乱度を測定する（Ｓ１０５）。

　第一の推定部１３ｂは、Ｓ１０５で測定された吸光度及び散乱度のデータを解析して、細胞産生物Ｙの濃度を推定する（Ｓ１０６）。

　第二の推定部１３ｄは、Ｓ１０６で推定した細胞産生物Ｙの濃度を、記憶部１１に記憶されている第二の関係情報に当てはめることにより、細胞Ｃの細胞数を推定する（Ｓ１０７）。このようにして、培養のいずれの段階であっても、細胞数を推定することができる。なお、細胞の種類や培養の状態によっては、細胞消費物及び細胞産生物のいずれの濃度も閾値未満となる可能性がある。そのような場合には、細胞数の推定ができないため、処理を終了する。

　グルコースとラクテートのように、細胞消費物の減少と細胞産生物の増加との関係が明確である細胞代謝物を対象とする場合、Ｓ１０６で推定した細胞産生物Ｙの濃度について、Ｓ１０７のステップを経ることなく、第二の推定部１３ｄで、Ｓ１０６で推定した細胞産生物Ｙの濃度を、記憶部１１に記憶されている第二の関係情報に当てはめることにより、細胞Ｃの細胞数を推定してもよい。

＝＝第２の例＝＝
　次に、第２の例として、培地中に含まれる細胞代謝物の濃度に応じた値を取得する方法として電気化学方式を用い、細胞代謝物の濃度と取得した電気的な値との相関性を解析することにより、細胞代謝物の濃度の推定を行う例について述べる。

（細胞数の推定）
　第１の例と同様であるため詳細な説明を省略する。

（細胞数を測定する装置）
　図４を参照して、第２の例に係る細胞数を推定する装置２０について説明する。装置２０は、記憶部２１、電気測定部２２、制御部２３、表示部２４、及び操作部２５を備える。

［記憶部・表示部・操作部］
　記憶部２１、表示部２４、及び操作部２５は、第１の例における記憶部１１、表示部１４、及び操作部１５と同様の構成であるため詳細な説明を省略する。

［電気測定部］
　電気測定部２２は、特定の細胞代謝物の変化に伴う電気的な値を測定する。電気測定部２２は、上述の酵素センサーを用いることができる。電気測定部２２は、測定した値を制御部２３に出力する。

［制御部］
　本実施形態における、制御部２３は、第一の推定部２３ａ、判定部２３ｂ、第二の推定部２３ｃ、及び表示制御部２３ｄとして機能する（図５参照）。

　第一の推定部２３ａは、電気化学方式を用いて測定された電気的な値に基づいて、ある細胞を培養する培地に含まれる、細胞代謝物の濃度を推定する。細胞代謝物の濃度の推定には、上述の方法を用いることができる。

　判定部２３ｂは、推定した細胞代謝物の濃度が、閾値以上であるかどうかを判定する。

　第二の推定部２３ｃは、判定部２３ｂによる判定結果に応じて、推定した細胞代謝物の濃度を、記憶部２１に記憶されている関係情報に当てはめることにより、ある細胞の細胞数を推定する。

　ここで、本実施形態に係る具体的な処理について説明を行う。まず、第一の推定部２３ａは、第一の細胞代謝物の濃度を推定する。判定部２３ｂは、推定した第一の細胞代謝物の濃度が、閾値以上であるかどうかを判定する。

　推定した第一の細胞代謝物の濃度が、閾値以上であると判定された場合、第二の推定部２３ｃは、推定した第一の細胞代謝物の濃度を、記憶部２１に記憶されている第一の関係情報に当てはめることにより、ある細胞の細胞数を推定する。

　一方、推定した第一の細胞代謝物の濃度が、閾値未満であると判定された場合、第一の推定部２３ａは、培地に含まれる第二の細胞代謝物の濃度を推定する。判定部２３ｂは、推定した第二の細胞代謝物の濃度が、閾値以上であるかどうかを判定する。

　推定した第二の細胞代謝物の濃度が、閾値以上であると判定された場合、第二の推定部２３ｃは、推定した第二の細胞代謝物の濃度を、記憶部２１に記憶されている第二の関係情報に当てはめることにより、ある細胞の細胞数を推定する。

　表示制御部２３ｄは、装置２０における各種表示制御を行う。表示制御部２３ｄは、たとえば、細胞数を推定した結果を表示部２４に表示させる。

（細胞数を推定する方法について）
　次に、図６を参照して、装置２０を利用して細胞Ｃの細胞数を推定する方法について説明する。この例では、細胞Ｃが細胞消費物Ｘを消費し、細胞産生物Ｙを産生する例について述べる。また、細胞消費物Ｘの濃度を先に推定するものとする。さらに、細胞消費物Ｘの濃度と細胞Ｃの細胞数との関係を示す第一の関係情報、及び細胞産生物の濃度と細胞Ｃの細胞数との関係を示す第二の関係情報は、バイオアッセイ法を用いて予め求められているものとする。

　まず、装置２０に、細胞Ｃを培養している培地を載置する。

　電気測定部２２は、細胞代謝物Ｘの変化に伴う電気的な値を測定し、制御部２３に出力する。

　第一の推定部２３ａは、電気測定部２２から出力された電気的な値を解析して、細胞消費物Ｘの濃度を推定する（Ｓ２０１）。

　判定部２３ｂは、Ｓ２０１で推定した細胞消費物Ｘの濃度が、閾値以上であるか否かを判定する。閾値以上である場合（Ｓ２０２でＹＥＳの場合）、第二の推定部２３ｃは、Ｓ２０１で推定した細胞消費物Ｘの濃度を、記憶部２１に記憶されている第一の関係情報に当てはめることにより、細胞Ｃの細胞数を推定する（Ｓ２０３）。

　一方、推定した細胞代謝物の濃度が、閾値未満である場合（Ｓ２０２でＮＯの場合）、第一の推定部２３ａは、電気測定部２２から出力された細胞代謝物Ｙの変化に伴う電気的な値を解析して、細胞Ｃを培養する培地に含まれる、細胞産生物Ｙの濃度を推定する（Ｓ２０４）。

　第二の推定部２３ｃは、Ｓ２０４で推定した細胞産生物Ｙの濃度を、記憶部２１に記憶されている第二の関係情報に当てはめることにより、細胞Ｃの細胞数を推定する（Ｓ２０５）。このようにして、培養のいずれの段階であっても、細胞数を推定することができる。なお、細胞の種類や培養の状態によっては、細胞消費物及び細胞産生物のいずれの濃度も閾値未満となる可能性がある。そのような場合には、細胞数の推定ができないため、処理を終了する。

＜その他＞
　なお、図３及び図６の例では細胞代謝物が２つの例について述べたがこれに限られない。すなわち、細胞代謝物が３つ以上の場合も利用できる。たとえば図３において、Ｓ１０６で推定した細胞産生物Ｙの濃度が、閾値未満である場合（Ｓ１０７でＮＯの場合）、細胞Ｃを培養する培地に含まれる、細胞消費物Ｘおよび細胞産生物Ｙとは別の細胞代謝物Ｚについて、上記と同様の手法により濃度を推定する。そして、推定した細胞代謝物Ｚの濃度を、予め得られている細胞代謝物Ｚの濃度とある細胞の細胞数との関係を示す関係情報に当てはめることにより、細胞Ｃの細胞数を推定する。

　本発明における細胞の推定方法の対象となる細胞は、患者の免疫に関わる細胞のみならず、他の細胞にも用いることができる。さらには、人間の細胞に限られず、他の動植物の細胞にも用いることができる。

＝＝実施例＝＝
　以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるべきものではない。

　バイオアッセイ法により、細胞代謝物の濃度と細胞数との関係を求める実施例、及び分光法により、細胞代謝物の濃度を推定する実施例について説明する。本実施例において、培養する細胞はＴ細胞である。また、培地に摂取したＴ細胞の数は、５．０×１０⁶個である。本実施例における細胞代謝物としては、培地に含まれる細胞消費物であるグルコースおよび細胞産生物であるラクテートを対象とした。以下、詳述する。

＜細胞代謝物の濃度と細胞数との関係について＞
（実験条件、方法）
　グルコース及びラクテートを、それぞれ個別に下記の試薬を用いて反応させ、発光シグナルを検出することによって濃度を測定した。細胞数は、コロニー数の測定等による公知の方法で測定した。なお、再現性を確認するため、同じ条件で３つのサンプルを用意し、実験を行った。

　（試薬）
　グルコース：Ｇｌｕｃｏｓｅ－ＧｌｏＡｓｓａｙ（プロメガ株式会社製）
　ラクテート：Ｌａｃｔａｔｅ－ＧｌｏＡｓｓａｙ（プロメガ株式会社製）

　（発光検出機器）
　ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉＤ３（モレキュラーデバイスジャパン株式会社製）

（結果）
　図７は、バイオアッセイ法を用いて得られたＴ細胞の細胞数と培養日数との関係を表すグラフである。具体的には、図７中のマーカーの通り、Ｔ細胞の播種直後、播種から３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、および１０日後に測定を行っている。

　図８Ａは、バイオアッセイ法を用いて得られたグルコースの濃度とＴ細胞の培養日数との関係を表すグラフである。細胞消費物であるグルコースの濃度は、細胞の培養に伴い経時で低下することがわかる。図８Ｂは、バイオアッセイ法を用いて得られたラクテートの濃度とＴ細胞の培養日数との関係を表すグラフである。細胞産生物であるラクテートの濃度は、細胞の培養に伴い経時で上昇することがわかる。なお、図中、「ｕＭ」は、１０^-6ｍｏｌ／Ｌを表す。

　図７、図８Ａおよび図８Ｂから、グルコースおよびラクテートの濃度と、細胞の細胞数との関係を示す関係情報が読み取れる。たとえばＴ細胞の播種から４日後におけるＴ細胞の細胞数は、図７から３つのサンプルの平均値を取ると、約５×１０⁷個である。Ｔ細胞の播種から４日後におけるグルコースの濃度は、同様に、図８Ａから、約８×１０^-6ｍｏｌ／Ｌ、ラクテートの濃度は、図８Ｂから、約１０×１０^-6ｍｏｌ／Ｌと読み取れる。すなわち、Ｔ細胞の数が約５×１０⁷個であるとき、グルコースの濃度は約８×１０^-6ｍｏｌ／Ｌ、ラクテートの濃度は約１０×１０^-6ｍｏｌ／Ｌである。

＜細胞代謝物の濃度の推定＞
　本実施例では分光法として近赤外線分光法を用いて、グルコースおよびラクテートの吸光度を測定することにより、Ｔ細胞の濃度を推定した。

（実験条件、方法）
（近赤外線波長）
　近赤外線の波長帯域幅は、１０６９～２２２１ｎｍである。
　グルコースの吸収波長は、１６００±３０ｎｍである。
　ラクテートの吸収波長は、１５８７～１８５１ｎｍ、２０８３ｎｍ～２３８０ｎｍである。なお、ラクテートについて、２２２１ｎｍより大きい波長は近赤外線の波長帯域を外れるので、実際に用いられた波長は、１５８７～１８５１ｎｍ、２０８３ｎｍ～２２２１ｎｍである。

（分光測定機器）
　分光測定部分としてＣ９９１４ＧＢ（浜松ホトニクス社製）を具備した分光測定機器（ＰＨＣ株式会社製）を用いた。

　細胞培養初期から終期（Ｔ細胞の播種から１０日後）まで、数回にわたって吸光度の測定を行った。

　測定した吸光度の値を、多変量解析を用いて解析することにより、Ｔ細胞の濃度を推定した。多変量解析の方法としては、交差検証を用いた。

（結果）
　結果を図９Ａおよび図９Ｂに示す。図９Ａの横軸は、バイオアッセイ法を用いて得られたグルコースの濃度である。図９Ａの縦軸は、多変量解析を用いて推定したグルコースの濃度である。図９Ｂの横軸は、バイオアッセイ法を用いて得られたラクテートの濃度である。図９Ｂの縦軸は、多変量解析を用いて推定したラクテートの濃度である。すなわち分光法を用いて推定したグルコースおよびラクテートの濃度の結果が、図９Ａおよび図９Ｂ中のドットの縦軸である。

　分光法によって推定した濃度から、グルコースについては、８×１０^-6ｍｏｌ／Ｌ未満である濃度の値と、ラクテートについては、１０×１０^-6ｍｏｌ／Ｌ未満である濃度の値を除くと、多変量解析を用いて推定した濃度とバイオアッセイ法を用いて得られた濃度との相関性がみられることがわかる。なお、相関性を確認するために、再び多変量解析を用いている。多変量解析の方法としては、最小二乗法を用いた。

＜まとめ＞
　上記実施例から明らかなように、グルコースの濃度が８×１０^-6ｍｏｌ／Ｌ以上となるＴ細胞の培養日数は、Ｔ細胞の播種後４日後までである。すなわち、グルコースを用いてＴ細胞の細胞数を推定することができる期間は、Ｔ細胞の播種後４日後までである。一方、ラクテートはグルコースが消費されることにより、産生する細胞代謝物であるため、Ｔ細胞の培養日数が経過するにつれて濃度は上昇する。上記実施例によれば、ラクテートの濃度が１０×１０^-6ｍｏｌ／Ｌ以上となるＴ細胞の培養日数は、Ｔ細胞の播種後４日後以降である。すなわち、ラクテートを用いてＴ細胞の細胞数を推定することができる期間は、Ｔ細胞の播種後４日後以降から細胞培養終期（上記実施例では１０日）までである。

　このようにして、細胞培養初期から終期（１０日）に至るまでの全ての範囲において、Ｔ細胞の細胞数の推定ができることがわかる。

Claims

　培地中に含まれる細胞代謝物の濃度に応じた値を取得可能な方法を用いて、ある細胞を培養する培地に含まれる、第一の細胞代謝物の濃度を推定する工程と、
　推定した前記第一の細胞代謝物の濃度が、閾値以上である場合、推定した前記第一の細胞代謝物の濃度を、予め得られている前記第一の細胞代謝物の濃度と前記ある細胞の細胞数との関係を示す第一の関係情報に当てはめることにより、前記ある細胞の細胞数を推定する工程と、
　推定した前記第一の細胞代謝物の濃度が、閾値未満である場合、前記方法を用いて、前記培地に含まれる第二の細胞代謝物の濃度を推定する工程と、
　推定した前記第二の細胞代謝物の濃度が、閾値以上である場合、推定した前記第二の細胞代謝物の濃度を、予め得られている前記第二の細胞代謝物の濃度と前記ある細胞の細胞数との関係を示す第二の関係情報に当てはめることにより、前記ある細胞の細胞数を推定する工程と、
　を有する細胞数の推定方法。
　推定した前記第二の細胞代謝物の濃度が、閾値未満である場合、前記方法を用いて、前記培地に含まれる第三の細胞代謝物の濃度を推定する工程と、
　推定した前記第三の細胞代謝物の濃度を、予め得られている前記第三の細胞代謝物の濃度と前記ある細胞の細胞数との関係を示す第三の関係情報に当てはめることにより、前記ある細胞の細胞数を推定する工程と、
　を有する、請求項１記載の細胞数の推定方法。
　前記第一の関係情報、前記第二の関係情報、および前記第三の関係情報は、バイオアッセイ法を用いて取得されることを特徴とする、請求項１または２記載の細胞数の推定方法。
　前記濃度の推定は、多変量解析を用いて行われることを特徴とする、請求項１～３いずれか１項に記載の細胞数の推定方法。
　培地中に含まれる細胞代謝物の濃度に応じた値を取得可能な方法は、分光法を用いて取得する方法であることを特徴とする、請求項１～４いずれか１項に記載の細胞数の推定方法。
　前記分光法は、近赤外分光法、可視分光法、蛍光分光法、およびラマン分光法から選択されるものであることを特徴とする、請求項５に記載の細胞数の推定方法。
　前記第一の細胞代謝物はグルコースであり、前記第二の細胞代謝物はラクテートであり、前記分光法は、近赤外分光法であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞数の推定方法。
　前記閾値は、
　既知の細胞代謝物の濃度（「実測濃度」とする）を有する培地の吸光度を近赤外分光法を用いて測定し、
　多変量解析を用いて前記吸光度から細胞代謝物の濃度を推定し、
　前記工程を繰り返すことにより、実測濃度と推定した細胞代謝物の濃度との関係のデータを蓄積し、
　交差検証法を用いて、実測濃度と推定した細胞代謝物の濃度との相関係数が０．７以上になるまで前記測定データから低い濃度のデータを削除し、
　相関係数が０．７以上になった時の測定データの最低濃度の値とする、請求項１記載の細胞数の測定方法。
　培地中に含まれる細胞代謝物の濃度に応じた値を取得可能な方法は、電気化学方式を用いて取得する方法であることを特徴とする、請求項１～４いずれか１項に記載の細胞数の推定方法。
　培地中に含まれる細胞代謝物の濃度に応じた値を取得可能な方法を用いて測定されたデータに基づいて、ある細胞を培養する培地に含まれる、細胞代謝物の濃度を推定する第一の推定部と、
　推定した前記細胞代謝物の濃度が、閾値以上であるかどうかを判定する判定部と、
　前記判定部による判定結果に応じて、推定した前記細胞代謝物の濃度を、予め得られている前記細胞代謝物の濃度と前記ある細胞の細胞数との関係を示す関係情報に当てはめることにより、ある細胞の細胞数を推定する第二の推定部と、
　を有し、
　前記第二の推定部は、
　前記第一の推定部により推定した第一の細胞代謝物の濃度が、閾値以上であると判定された場合、推定した前記第一の細胞代謝物の濃度を、予め得られている前記第一の細胞代謝物の濃度と前記ある細胞の細胞数との関係を示す第一の関係情報に当てはめることにより、前記ある細胞の細胞数を推定し、
　前記第一の推定部は、
　推定した前記第一の細胞代謝物の濃度が、閾値未満であると判定された場合、前記培地に含まれる第二の細胞代謝物の濃度を推定し、
　前記第二の推定部は、
　推定した前記第二の細胞代謝物の濃度が、閾値以上であると判定された場合、推定した前記第二の細胞代謝物の濃度を、予め得られている前記第二の細胞代謝物の濃度と前記ある細胞の細胞数との関係を示す第二の関係情報に当てはめることにより、前記ある細胞の細胞数を推定する、
　細胞数を推定する装置。