WO2020090211A1 - カチオン性人工オリゴ糖による二重鎖ｒｎａの安定化 - Google Patents

Abstract

（１）二重鎖ＲＮＡの骨格に修飾を導入するステップと、（２）ステップ（１）により得られた二重鎖ＲＮＡと、２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノーステトラマーなどのカチオン性オリゴ糖とを接触させるステップとを含む、二重鎖ＲＮＡの安定性を調節する方法を提供する。また、骨格に修飾が導入された二重鎖ＲＮＡと、２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノーステトラマーなどのカチオン性オリゴ糖との複合体を含んでなる核酸組成物であって、未修飾の二重鎖ＲＮＡと同等の薬学的活性を有し、かつ、未修飾の二重鎖ＲＮＡと比較して５倍以上長い血清半減期を有する、核酸組成物を提供する。

Description

カチオン性人工オリゴ糖による二重鎖ＲＮＡの安定化

　本発明は、カチオン性人工オリゴ糖による二重鎖ＲＮＡの安定化に関する。

　近年、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなどの二重鎖ＲＮＡを用いた核酸医薬の開発が盛んになりつつある。核酸医薬は、生体内のあらゆる遺伝子を標的とすることができるため、従来の薬剤では治療が困難であった種々の疾患に対して効果を発揮する新世代の治療薬として強く期待されている。一方、核酸は生体内のヌクレアーゼにより容易に分解されてしまうことが、核酸医薬の開発において大きな障壁となっている。

　現在開発が進められている核酸医薬では、ヌクレアーゼによる分解を防ぐために、様々な化学修飾が導入された核酸アナログが用いられている。化学修飾の代表的なものとして、リボース環の２’位の水酸基を２’－Ｏ－メチル基に置換した修飾（２’－Ｏ－メチル化）や、核酸と核酸をつなぐリン酸部の非架橋酸素原子の一つを硫黄原子に置換したホスホロチオエート修飾（チオリン酸化）などがある。これらの化学修飾はいずれもヌクレアーゼ抵抗性の付与を目的としたものであるが、その効果は限定的である。さらに、例えばｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡに過剰な化学修飾を導入すると、目的の遺伝子発現抑制作用が減弱してしまうという問題がある。そのため、二重鎖ＲＮＡを用いた核酸医薬の本来の機能活性を保持したまま、ヌクレアーゼ抵抗性を付与できる手法の確立が望まれている。

　二重鎖ＲＮＡを用いた核酸医薬のヌクレアーゼ抵抗性を向上させる別の方策として、カチオン性化合物をキャリア分子として用いることによる二重鎖構造の安定化が試みられている。血清中に存在するＲＮａｓｅは、二重鎖が解離して生じる一重鎖ＲＮＡを特異的に切断することから、二重鎖構造の安定化により、二重鎖ＲＮＡを用いた核酸医薬のＲＮａｓｅ抵抗性を改善できることが期待される。本発明者らは、二重鎖ＲＮＡに対して高い親和性を有するオリゴアミノ糖の合成に成功しており（特許文献１）、それらが二重鎖ＲＮＡのＲＮａｓｅ抵抗性をある程度向上させることを確認している（非特許文献１）。しかし、核酸医薬が薬学的活性を示す際には二重鎖が解離することが必要であるため、二重鎖構造が過度に安定化されてしまうと、核酸医薬の薬学的活性が低下することが問題となる。

国際公開第２０１０／１０４１９２号

Ｈａｒａ，Ｒ．Ｉ．ｅｔ　ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（２０１７），Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１７１０－１７１７

　本発明は、従来技術の諸問題を解消し、核酸医薬の機能活性を損なうことなく、安定性を高める方法を提供することを目的としてなされたものである。

　本発明者らは、鋭意研究の結果、骨格修飾を有する二重鎖ＲＮＡと、カチオン性オリゴ糖とを組み合わせることにより、二重鎖ＲＮＡの薬学的活性を維持したまま、血清半減期を飛躍的に改善できることを見出した。

　すなわち、本発明は、一実施形態によれば、二重鎖ＲＮＡの安定性を調節する方法であって、（１）二重鎖ＲＮＡの骨格に修飾を導入するステップと、（２）ステップ（１）により得られた二重鎖ＲＮＡと、一般式（Ｉ）：
　　Ｒ^１－Ｏ－（Ｘ）_ｎ－Ｒ^２
［式中、
　Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子または１価の置換基であり、
　ｎは、３～６の整数であり、
　ｎ個のＸは同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立して、以下の（ａ）～（ｉ）：

で表される２価の基（ここで、Ｒ^＋は、ＮＨ_３ ^＋または式（ＩＩ）：

　（ここで、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して水素原子もしくはメチル基である）で表される基である）から選択される］で表されるカチオン性オリゴ糖とを接触させるステップとを含む方法を提供するものである。

　また、本発明は、一実施形態によれば、（１）骨格に修飾が導入された二重鎖ＲＮＡと、（２）上記一般式（Ｉ）で表されるカチオン性オリゴ糖との複合体を含んでなる核酸組成物であって、未修飾の二重鎖ＲＮＡと同等の薬学的活性を有し、かつ、未修飾の二重鎖ＲＮＡと比較して５倍以上長い血清半減期を有する、核酸組成物を提供するものである。

　前記一般式（Ｉ）において、Ｒ^１が水素原子であり、Ｒ^２が水素原子または置換もしくは非置換のアルキル基であり、ｎが３または４であることが好ましい。

　前記一般式（Ｉ）で表されるカチオン性オリゴ糖は、２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノーステトラマーであることが好ましい。

　前記二重鎖ＲＮＡの骨格全体の少なくとも１０％が修飾されていてよい。

　前記修飾は２’－Ｏ－メチル化およびホスホロチオエート化から選択されてよく、ホスホロチオエート化であることが好ましい。

　前記修飾は、前記二重鎖ＲＮＡを構成する少なくとも一方のＲＮＡ鎖の３’末端領域の骨格に導入されることが好ましい。

　前記二重鎖ＲＮＡは１２～５０塩基対長であることが好ましい。

　本発明に係る方法は、骨格修飾の種類および数と、カチオン性オリゴ糖の種類を適切に組み合わせることにより、二重鎖ＲＮＡの薬学的活性を維持しつつ、二重鎖ＲＮＡに対して所望の安定性を付与することができる。そのため、二重鎖ＲＮＡを用いた核酸医薬の血清半減期を自在に制御でき、不必要かつ不本意な作用を低減または回避することが可能となる。

　また、本発明に係る核酸組成物は、薬学的活性を維持したまま、飛躍的に改善された血清半減期を有するため、少ない用量でも十分な効果を得ることができる。

図１は、カチオン性オリゴ糖である２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノーステトラマー（ＯＤＡＧａｌ４）の、二重鎖ＲＮＡの主溝に対する相互作用様式を示す模式図である。 図２は、血清溶液で処理されたＯＤＡＧａｌ４と複合体化された／されていない未修飾ｓｉＲＮＡ（ＨＰ２）を電気泳動により検出した図である。 図３は、図２の結果を定量化したグラフである。 図４は、図３の結果から算出されたｓｉＲＮＡの血清半減期を示すグラフである。 図５は、血清溶液で処理されたＯＤＡＧａｌ４と複合体化された／されていない未修飾ｓｉＲＮＡ（Ｂ２Ｍ２）を電気泳動により検出した図である。 図６は、図５の結果を定量化したグラフである。 図７は、図６の結果から算出されたｓｉＲＮＡの血清半減期を示すグラフである。 図８は、骨格修飾（２’－Ｏ－メチル化またはホスホロチオエート化）および／またはＯＤＡＧａｌ４との複合体化を有する／有しないｓｉＲＮＡ（ＨＰ２、ＨＰ２－Ｍ１～ＨＰ２－Ｍ３およびＨＰ２－Ｓ１～ＨＰ２－Ｓ３）の血清半減期を示すグラフである。 図９は、図８の結果から算出された血清半減期の相対比を示すグラフである。 図１０は、骨格修飾（２’－Ｏ－メチル化またはホスホロチオエート化）および／またはＯＤＡＧａｌ４との複合体化を有する／有しないｓｉＲＮＡ（Ｂ２Ｍ２、Ｂ２Ｍ２－Ｍ１～Ｂ２Ｍ２－Ｍ３およびＢ２Ｍ２－Ｓ１～Ｂ２Ｍ２－Ｓ３）の血清半減期を示すグラフである。 図１１は、図１０の結果から算出された血清半減期の相対比を示すグラフである。 図１２は、骨格修飾（２’－Ｏ－メチル化またはホスホロチオエート化）および／またはＯＤＡＧａｌ４との複合体化を有する／有しないｓｉＲＮＡ（ＨＰ２、ＨＰ２－Ｍ１～ＨＰ２－Ｍ３およびＨＰ２－Ｓ１～ＨＰ２－Ｓ３）のノックダウン効率（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）遺伝子発現レベルの相対比）を示すグラフである。 図１３は、骨格修飾（２’－Ｏ－メチル化またはホスホロチオエート化）および／またはＯＤＡＧａｌ４との複合体化を有する／有しないｓｉＲＮＡ（Ｂ２Ｍ２、Ｂ２Ｍ２－Ｍ１～Ｂ２Ｍ２－Ｍ３およびＢ２Ｍ２－Ｓ１～Ｂ２Ｍ２－Ｓ３）のノックダウン効率（β－２－マイクログロブリン遺伝子発現レベルの相対比）を示すグラフである。 図１４（Ａ）は、骨格修飾（ホスホロチオエート化）および／またはＯＤＡＧａｌ４との複合体化を有する／有しないｓｉＲＮＡ（ＨＰ２、ＨＰ２－Ｓ４～ＨＰ２－Ｓ７）の血清半減期を示すグラフである。図１４（Ｂ）は、（Ａ）の結果から算出された血清半減期の相対比を示すグラフである。 図１５（Ａ）は、骨格修飾（ホスホロチオエート化）および／またはＯＤＡＧａｌ４との複合体化を有する／有しないｓｉＲＮＡ（ＨＰ２、ＨＰ２－Ｓ８～ＨＰ２－Ｓ１１）の血清半減期を示すグラフである。図１５（Ｂ）は、（Ａ）の結果から算出された血清半減期の相対比を示すグラフである。 図１６（Ａ）は、骨格修飾（ホスホロチオエート化）および／またはＯＤＡＧａｌ４との複合体化を有する／有しないｓｉＲＮＡ（Ｂ２Ｍ２、Ｂ２Ｍ２－Ｓ４～Ｂ２Ｍ２－Ｓ７）の血清半減期を示すグラフである。図１６（Ｂ）は、（Ａ）の結果から算出された血清半減期の相対比を示すグラフである。 図１７（Ａ）は、骨格修飾（ホスホロチオエート化）および／またはＯＤＡＧａｌ４との複合体化を有する／有しないｓｉＲＮＡ（Ｂ２Ｍ２、Ｂ２Ｍ２－Ｓ８～Ｂ２Ｍ２－Ｓ１１）の血清半減期を示すグラフである。図１７（Ｂ）は、（Ａ）の結果から算出された血清半減期の相対比を示すグラフである。 図１８（Ａ）は、骨格修飾（ホスホロチオエート化）および／またはＯＤＡＧａｌ４との複合体化を有する／有しないｓｉＲＮＡ（ＨＰ２、ＨＰ２－Ｓ７、ＨＰ２－Ｓ１２およびＨＰ２－Ｓ１３）の血清半減期を示すグラフである。図１８（Ｂ）は、（Ａ）の結果から算出された血清半減期の相対比を示すグラフである。 図１９（Ａ）は、骨格修飾（ホスホロチオエート化）および／またはＯＤＡＧａｌ４との複合体化を有する／有しないｓｉＲＮＡであって、３’突出ＤＮＡ末端を有するｓｉＲＮＡ（ＨＰ２、ＨＰ２－ＴおよびＨＰ２－ＴＳ）の血清半減期を示すグラフである。図１９（Ｂ）は、（Ａ）の結果から算出された血清半減期の相対比を示すグラフである。 図２０（Ａ）は、骨格修飾（ホスホロチオエート化）および／またはＯＤＡＧａｌ４との複合体化を有する／有しないｓｉＲＮＡ（ＨＰ２、ＨＰ２－Ｓ１４～ＨＰ２－Ｓ１６）の血清半減期を示すグラフである。図２０（Ｂ）は、（Ａ）の結果から算出された血清半減期の相対比を示すグラフである。 図２１（Ａ）は、骨格修飾（２’－Ｏ－メチル化および／またはホスホロチオエート化）および／またはＯＤＡＧａｌ４との複合体化を有する／有しないｓｉＲＮＡ（ＨＰ２、ＨＰ２－Ｍ１、ＨＰ２－Ｓ１、ＨＰ２－ＭＳ１、ＨＰ２－Ｍ４、ＨＰ２－Ｓ２およびＨＰ２－ＭＳ２）の血清半減期を示すグラフである。図２１（Ｂ）は、（Ａ）の結果から算出された血清半減期の相対比を示すグラフである。 図２２（Ａ）は、骨格修飾（２’－Ｆ化および／またはホスホロチオエート化、ＬＮＡ化および／またはホスホロチオエート化）および／またはＯＤＡＧａｌ４との複合体化を有する／有しないｓｉＲＮＡ（ＨＰ２、ＨＰ２－Ｆ、ＨＰ２－ＦＳ、ＨＰ２－ＬおよびＨＰ２－ＬＳ）の血清半減期を示すグラフである。図２２（Ｂ）は、（Ａ）の結果から算出された血清半減期の相対比を示すグラフである。 図２３（Ａ）は、骨格修飾（ホスホロチオエート化）および／またはＯＤＡＧａｌ４との複合体化を有する／有しない平滑末端である短い二重鎖ＲＮＡ（１２塩基対）（１２Ｍおよび１２Ｍ－Ｓ）の血清半減期を示すグラフである。図２３（Ｂ）は、（Ａ）の結果から算出された血清半減期の相対比を示すグラフである。 図２４（Ａ）は、骨格修飾（ホスホロチオエート化）および／または各種カチオン性オリゴ糖との複合体化を有する／有しないｓｉＲＮＡ（ＨＰ２およびＨＰ２－Ｓ３）の血清半減期を示すグラフである。図２４（Ｂ）は、（Ａ）の結果から算出された血清半減期の相対比を示すグラフである。

　以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。

　本発明は、第一の実施形態によれば、二重鎖ＲＮＡの安定性を調節する方法であって、（１）二重鎖ＲＮＡの骨格に修飾を導入するステップと、（２）ステップ（１）により得られた二重鎖ＲＮＡと、一般式（Ｉ）：
　　Ｒ^１－Ｏ－（Ｘ）_ｎ－Ｒ^２
［式中、
　Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子または１価の置換基であり、
　ｎは、３～６の整数であり、
　ｎ個のＸは同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立して、以下の（ａ）～（ｉ）：

で表される２価の基（ここで、Ｒ^＋は、ＮＨ_３ ^＋または式（ＩＩ）：

　（ここで、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して水素原子もしくはメチル基である）で表される基である）から選択される］で表されるカチオン性オリゴ糖とを接触させるステップとを含む方法である。

　本実施形態において、二重鎖ＲＮＡの「安定性」とは、ＲＮＡの二重鎖構造の熱安定性および／または血中ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼに対する抵抗性を意味する。

　本実施形態の方法では、二重鎖ＲＮＡの骨格に修飾を導入する。本実施形態における「二重鎖ＲＮＡ」とは、任意の配列からなる一重鎖のＲＮＡと、前記配列に相補性を有する一重鎖のＲＮＡとが互いにハイブリダイズしたものをいう。なお、本実施形態における二重鎖ＲＮＡは、二重鎖ＲＮＡから実質的に構成されるものを含み得る。ここで、二重鎖ＲＮＡから「実質的に構成される」とは、二重鎖ＲＮＡの全体構造には影響しない程度に、例えば二重鎖ＲＮＡの末端などに、１～３塩基対程度の二重鎖ＤＮＡまたは二重鎖ＤＮＡ／ＲＮＡが含まれることを意味する。

　本実施形態における二重鎖ＲＮＡの長さは、特に限定されないが、例えば１０～２００塩基対長であってよく、好ましくは１２～５０塩基対長であってよい。本実施形態における好ましい二重鎖ＲＮＡとしては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびそれらの前駆体などが挙げられる。

　本実施形態における二重鎖ＲＮＡは、その全体にわたって完全な二重鎖を形成するものでなくともよく、実質的に二重鎖が形成されることを限度として、１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）のミスマッチまたはバルジが含まれてよい。言い換えれば、本実施形態における二重鎖ＲＮＡは、完璧または完全な（すなわち１００％の）相補性を有している必要はなく、少なくとも８０％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％の相補性を有していればよい。また、二重鎖を構成するＲＮＡ鎖のそれぞれは、同じ長さであってもよいし、異なる長さであってもよい。したがって、二重鎖ＲＮＡの末端は、平滑末端であってもよいし、粘着末端（５’突出または３’突出末端）であってもよい。あるいは、二重鎖ＲＮＡの末端の一方が相互に連結されてもよく、この場合、二重鎖ＲＮＡはヘアピン構造を形成することができる。

　本実施形態において、二重鎖ＲＮＡの「骨格」とは、ヌクレオシド間の結合部分（天然の核酸においては、３’から５’へのホスホジエステル結合）および／または糖部分を意味する。したがって、本実施形態の方法では、二重鎖を構成するＲＮＡ鎖のヌクレオシド間の結合部分および／または糖部分に修飾を導入する。ヌクレオシド間の結合部分における修飾としては、例えば、ホスホロチオエート化、ボラノホスフェート化、ホスホロジチオエート化、ボラノホスホロチオエート化などが挙げられる。糖部分における修飾としては、２’位の修飾（例えば、２’－Ｏ－メチル化、２’－Ｏ－メトキシメチル化、２’－Ｆ化など）、２’位と４’位の架橋（例えば、２’，４’－ＢＮＡ（別名ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ））、ａｍｉｎｏ－ＬＮＡ、ｔｈｉｏ－ＬＮＡ、α－Ｌ－ｏｘｙ－ＬＮＡ、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＡｍＮＡ（Ａｍｉｄｏ－ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＧｕＮＡ（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ｓｃｐＢＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－ｓｐｉｒｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ｃＥｔ－ＢＮＡ（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ　ｅｔｈｙ－ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、３’－ａｍｉｎｏ－２’，４’－ＢＮＡ、５’－ａｍｉｎｏ－２’，４’－ＢＮＡ、ＰｒＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、２’，４’－ＢＮＡＮＣ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、２’，４’－ＢＮＡＣＯＣ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）など）、糖部分のモルフォリノ環による置換などが挙げられる。本実施形態の方法では、これらの１種のみまたは２種以上の修飾を組み合わせて用いることができる。本実施形態の方法における好ましい修飾は、二重鎖ＲＮＡの用途や機能により異なるが、例えば、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡなどの二重鎖ＲＮＡには、２’－Ｏ－メチル化および／またはホスホロチオエート化が導入されることが好ましく、ホスホロチオエート化が導入されることが特に好ましい。

　本実施形態の方法では、二重鎖を構成するＲＮＡ鎖のいずれか一方または両方の骨格に少なくとも１つの修飾を導入することができる。ＲＮＡ鎖の骨格に含まれる修飾の数は、二重鎖ＲＮＡの所望の安定性に応じて適宜決定すればよい。本実施形態における二重鎖ＲＮＡは、その長さに応じて、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０個またはそれ以上の骨格修飾を含み得る。言い換えれば、本実施形態における二重鎖ＲＮＡは、例えば、二重鎖ＲＮＡの骨格全体（すなわち、二重鎖ＲＮＡ全体に含まれるヌクレオシド間の結合部分および／または糖部分）の約１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または１００％が修飾されたものであってよい。また、修飾を導入する部位は特に限定されず、例えば、全長にわたって分散して修飾を導入してもよいし、末端部分にのみ連続して修飾を導入してもよく、好ましくは、二重鎖を構成する少なくとも一方のＲＮＡ鎖の３’末端領域に修飾を導入することができる。

　ＲＮＡの骨格への修飾の導入は、すでに確立された従来公知の方法により行うことができる。また、核酸合成の受託業者に委託して、骨格修飾を有するＲＮＡを合成してもよい。

　次いで、骨格に修飾を導入された二重鎖ＲＮＡと、一般式（Ｉ）で表されるカチオン性オリゴ糖とを接触させる。

　一般式（Ｉ）において、Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立して、水素原子または１価の置換基である。１価の置換基としては、以下に限定されるものではないが、例えば、置換もしくは非置換のアルキル基が挙げられる。アルキル基は、例えばＣ_１－２０アルキル基であってよく、好ましくはＣ_１－１２アルキル基であってよく、さらに好ましくはＣ_１－６アルキル基であってよい。また、アルキル基には、直鎖状、分枝鎖状および環状のいずれの形態のものも含まれてよい。アルキル基は、１つまたは複数の水素原子が置換基によって置換されていてもよい。この場合における置換基には、例えば、水酸基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、オキソ基、スルホ基などが挙げられる。置換基の数および置換位置は特に限定されないが、置換基の数としては、０～３個が好ましい。一般式（Ｉ）において、好ましくは、Ｒ^１は水素原子であり、Ｒ^２は水素原子または置換もしくは非置換のＣ_１－６アルキル基である。

　一般式（Ｉ）において、ｎ個のＸは同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立して、上記の（ａ）～（ｉ）で表される２価の基から選択される。ここで、（ａ）～（ｉ）において、Ｒ^＋は、ＮＨ_３ ^＋または上記の式（ＩＩ）で表されるグアニジノ基であり、一般式（ＩＩ）において、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基である。一般式（Ｉ）において、ｎ個のＸのすべてが同一の２価の基であってもよい。例えば、（ａ）～（ｉ）において、Ｒ^＋がＮＨ_３ ^＋であって、（ａ）で表される２価の基がｎ個結合した場合には、２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－α－（１→４）－Ｄ－グルコピラノースオリゴマーとなり、（ｂ）で表される２価の基がｎ個結合した場合には、３，６－ジアミノ－３，６?ジデオキシ－α－（１→４）－Ｄ－グルコピラノースオリゴマーとなり、（ｄ）で表される２価の基がｎ個結合した場合には、２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－α－（１→４）－Ｄ－マンノピラノースオリゴマーとなり、（ｅ）で表される２価の基がｎ個結合した場合には、３，６－ジアミノ－３，６－ジデオキシ－α－（１→４）－Ｄ－マンノピラノースオリゴマーとなる。また、（ｇ）で表される２価の基がｎ個結合した場合には、２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノースオリゴマーとなり、（ｈ）で表される２価の基がｎ個結合した場合には、３，６－ジアミノ－３，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノースオリゴマーとなる。一般式（Ｉ）において、ｎ個のＸがすべて（ａ）、ｎ個のＸがすべて（ｄ）、またはｎ個のＸがすべて（ｇ）であることが好ましく、ｎ個のＸがすべて（ｇ）であることが特に好ましい。ｎは、３～６の整数であり、好ましくは３または４である。

　すなわち、本実施形態の方法において用いることができるカチオン性オリゴ糖は、２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－α－（１→４）－Ｄ－グルコピラノーストリマーもしくはテトラマー、３，６－ジアミノ－３，６－ジデオキシ－α－（１→４）－Ｄ－グルコピラノーストリマーもしくはテトラマー、２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－α－（１→４）－Ｄ－マンノピラノーストリマーもしくはテトラマー、３，６－ジアミノ－３，６－ジデオキシ－α－（１→４）－Ｄ－マンノピラノートリマーもしくはテトラマー、２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノーストリマーもしくはテトラマー、３，６－ジアミノ－３，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノーストリマーもしくはテトラマー、２，６－ジグアニジノ－２，６－ジデオキシ－α－（１→４）－Ｄ－グルコピラノーストリマーもしくはテトラマー、３，６－ジグアニジノ－３，６－ジデオキシ－α－（１→４）－Ｄ－グルコピラノーストリマーもしくはテトラマー、２，６－ジグアニジノ－２，６－ジデオキシ－α－（１→４）－Ｄ－マンノピラノーストリマーもしくはテトラマー、３，６－ジグアニジノ－３，６－ジデオキシ－α－（１→４）－Ｄ－マンノピラノーストリマーもしくはテトラマー、２，６－ジグアニジノ－２，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノーストリマーもしくはテトラマー、または３，６－ジグアニジノ－３，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノーストリマーもしくはテトラマーであることが好ましく、本実施形態の方法では、これらの１種のみまたは２種以上のカチオン性オリゴ糖を組み合わせて用いることができる。本実施形態の方法において用いることができるカチオン性オリゴ糖は、２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノーステトラマーであることが特に好ましい。

　本実施形態の方法において用いることができるカチオン性オリゴ糖は、国際公開第２０１０／１０４１９２号パンフレットに開示される化学合成方法およびそれに準ずる化学合成方法に、適宜従来公知の種々の方法を組み合わせて行うことにより合成することができる。

　骨格に修飾を導入された二重鎖ＲＮＡと、一般式（Ｉ）で表されるカチオン性オリゴ糖とは、両者を水または低塩濃度の緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水やトリス塩酸緩衝液など）に添加して、一定時間インキュベートすることにより接触させることができる。二重鎖ＲＮＡの濃度は、例えば１ｎＭ～１ｍＭの範囲で適宜選択することができる。カチオン性オリゴ糖の濃度は、二重鎖ＲＮＡの所望の安定性により異なるが、例えば１ｎＭ～１０ｍＭの範囲で適宜選択することができる。二重鎖ＲＮＡとカチオン性オリゴ糖との混合比（モル比）は、例えば２１塩基対長の二重鎖ＲＮＡであれば、二重鎖ＲＮＡ：カチオン性オリゴ糖＝１：１～１：１０とすることができる。インキュベーション時間は、例えば１０秒～２４時間であってよく、インキュベーション温度は、例えば０～４０℃であってよい。

　あるいは、一般式（Ｉ）で表されるカチオン性オリゴ糖を含む水溶液または低塩濃度の緩衝溶液中において、骨格に修飾を導入された一重鎖ＲＮＡおよびそれに相補性を有する一重鎖ＲＮＡをアニーリングすることによって、骨格に修飾を導入された二重鎖ＲＮＡと一般式（Ｉ）で表されるカチオン性オリゴ糖とを接触させてもよい。アニーリング条件は、例えば、溶液を９０～９５℃で３～２０分保持した後、－０．５～－１．５℃／分の速度で０～３０℃まで冷却すればよい。ＲＮＡおよびカチオン性オリゴ糖の濃度ならびに混合比は、上記と同様であってよい。

　二重鎖ＲＮＡは、一般に、Ａ型らせん構造と呼ばれる、狭く深い主溝と広く浅い副溝を有する立体構造をとっている。二重鎖ＲＮＡと、一般式（Ｉ）で表されるカチオン性オリゴ糖とが接触すると、カチオン性オリゴ糖はらせん構造の主溝に相互作用して二重鎖構造を安定化する。例として、カチオン性オリゴ糖である２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノーステトラマーの、二重鎖ＲＮＡの主溝に対する相互作用様式を図１に示す。ここで、ＲＮａｓｅは、らせん構造が崩れて生じる一重鎖ＲＮＡ部分を切断することにより、二重鎖ＲＮＡを分解する。したがって、特定の理論に拘束されることを望むものではないが、カチオン性オリゴ糖により安定化された二重鎖ＲＮＡは、一重鎖ＲＮＡ部分を生じにくい結果として、間接的に高いＲＮａｓｅ耐性を獲得することができるものと考えられる。これに対し、２’－Ｏ－メチル化やホスホロチオエート化などの骨格修飾は、主に一重鎖ＲＮＡに直接的にＲＮａｓｅ耐性を付与するものである。したがって、二重鎖構造を安定化するカチオン性オリゴ糖と、一重鎖ＲＮＡのＲＮａｓｅ耐性を高める骨格修飾との併用により、二重鎖ＲＮＡの安定性を自在に調節することができるものと考えられる。そのため、本実施形態の方法によれば、所望の血清半減期を有するＲＮＡベースの核酸医薬を得ることができ、高い薬理作用を得るとともに、不必要かつ不本意な作用を低減または回避することができる。

　また、本実施形態の方法によれば、二重鎖構造を安定化するカチオン性オリゴ糖の種類と、一重鎖ＲＮＡのＲＮａｓｅ耐性を高める骨格修飾種類および数とを適切に組み合わせることにより、薬学的活性を損なうことなく、極めて長い血清半減期を有する核酸組成物を調製することが可能である。本実施形態の方法によれば、未修飾の二重鎖ＲＮＡと比較して５倍以上、好ましくは１０倍以上、特に好ましくは２０倍以上の長い血清半減期を達成することができる。

　すなわち、本発明は、第二の実施形態によれば、（１）骨格に修飾が導入された二重鎖ＲＮＡと、（２）一般式（Ｉ）：
　　Ｒ^１－Ｏ－（Ｘ）_ｎ－Ｒ^２
［式中、
　Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子または１価の置換基であり、
　ｎは、３～６の整数であり、
　ｎ個のＸは同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立して、以下の（ａ）～（ｉ）：

で表される２価の基（ここで、Ｒ^＋は、ＮＨ_３ ^＋または式（ＩＩ）：

　（ここで、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して水素原子もしくはメチル基である）で表される基である）から選択される］で表されるカチオン性オリゴ糖と
の複合体を含んでなる核酸組成物であって、未修飾の二重鎖ＲＮＡと同等の薬学的活性を有し、かつ、未修飾の二重鎖ＲＮＡと比較して５倍以上長い血清半減期を有する、核酸組成物である。

　本実施形態における「二重鎖ＲＮＡ」、「骨格」、「修飾」および「カチオン性オリゴ糖」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。

　本実施形態の核酸組成物は、骨格に修飾が導入された二重鎖ＲＮＡと、一般式（Ｉ）で表されるカチオン性オリゴ糖との複合体（以下、「修飾二重鎖核酸－カチオン性オリゴ糖複合体」と記載する）を含んでなる。本実施形態における修飾二重鎖核酸－カチオン性オリゴ糖複合体は、第一の実施形態の方法と同様の手順にしたがって調製することができる。

　本実施形態の核酸組成物は、修飾二重鎖核酸－カチオン性オリゴ糖複合体のみから構成されてもよいが、一般的には、さらに任意の成分として、薬学的に許容される公知の希釈液、担体、賦形剤などを含んでよい。本実施形態の核酸組成物において、修飾二重鎖核酸－カチオン性オリゴ糖複合体の含有量は、特に限定されないが、通常は、核酸組成物１００重量部あたり、０．００１～１００重量部程度とすればよい。

　本実施形態の核酸組成物は、種々の剤型に製剤化することができ、剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤などが挙げられる。したがって、本実施形態の核酸組成物は、経口投与、腹腔内投与、皮内投与、静脈内投与、筋肉内投与、脳内投与など、種々の方法により投与することができる。本実施形態の核酸組成物は、固形剤または液剤とすることができ、好ましくは、注射剤や直腸投与剤などの液剤とすることができる。固形剤とする場合には、常法により、適切な添加物、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニトール、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などの添加剤や、さらに所望により結合剤、崩壊剤、潤沢剤などを配合することができる。固形剤を錠剤または丸剤とする場合は、所望によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの糖衣または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。液剤とする場合には、常法により、修飾二重鎖核酸－カチオン性オリゴ糖複合体を注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどの希釈剤に溶解し、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製すればよい。

　本実施形態の核酸組成物の投与量は、有効成分である二重鎖ＲＮＡまたはの量に換算し、所望の薬学的活性を得ることができる範囲において適宜設定すればよい。

　本実施形態の核酸組成物は、未修飾の二重鎖ＲＮＡと同等の薬学的活性を有し、かつ、未修飾の二重鎖ＲＮＡと比較して５倍以上、好ましくは１０倍以上、特に好ましくは２０倍以上の長い血清半減期を有する。本実施形態の核酸組成物が、とりわけ長い血清半減期を有するためには、カチオン性オリゴ糖として２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノーステトラマーを用い、かつ、二重鎖ＲＮＡの骨格全体の約１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または１００％がホスホロチオエート化されることが好ましい。骨格の一部を修飾する場合には、二重鎖を構成するＲＮＡ鎖の少なくとも一方の３’末端領域にホスホロチオエート化を導入することが好ましい。

　本実施形態の核酸組成物は、本来の薬学的活性および改善された血清半減期の両方を有する。そのため、少ない用量で所望の効果（例えば、ｓｉＲＮＡであれば標的遺伝子の発現抑制効果）を得ることができるため、有用である。

　以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。

＜１．材料および方法＞
（１）ｓｉＲＮＡの合成
　２’－Ｏ－メチル化またはホスホロチオエート化を含む／含まないヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）を標的とするｓｉＲＮＡ（以下、「ＨＰ２」と記載する）およびβ－２－マイクログロブリンを標的とするｓｉＲＮＡ（以下、「Ｂ２Ｍ２」と記載する）を調製した。ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、グライナー・ジャパン社またはジーンデザイン社に依頼して合成した。ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖を緩衝液（１００ｍＭの酢酸カリウム、２ｍＭの酢酸マグネシウム、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．４）中で混合し、サーマルサイクラー（Ｃ１０００、ＢＩＯ－ＲＡＤ社）により、９５℃で３分間加温した後、９５℃から２５℃まで－１．５℃／分の速度で冷却することによりアニーリングし、二重鎖ｓｉＲＮＡを得た。

　ｓｉＲＮＡの配列を表１に示す。大文字は未修飾ＲＮＡを、小文字の太字は２’－Ｏ－メチル化修飾を、小文字の斜体はホスホロチオエート化修飾を示す（具体的には、ホスホロチオエート化修飾は、小文字斜体で表記されたヌクレオシド間の結合部分に導入されている。以下の表３および表４についても同様である）。

　表１．ｓｉＲＮＡの配列

　また、ＨＰＲＴ１遺伝子およびβ－２－マイクログロブリン遺伝子のいずれに対しても作用しない配列からなるｓｉＲＮＡ（センス鎖：５’－ＧＵＡＣＣＧＣＡＣＧＵＣＡＵＵＣＧＵＡＵＣ－３’（配列番号２９）／アンチセンス鎖：５’－ＵＡＣＧＡＡＵＧＡＣＧＵＧＣＧＧＵＡＣＧＵ－３’（配列番号３０））を、上記と同様の手順により調製した（陰性対照）。

　カチオン性オリゴ糖である２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノーステトラマー（以下「ＯＤＡＧａｌ４」と記載する）を、Ｈａｒａらの方法（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（２０１７），Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１７１０－１７１７）により合成した。

（２）ｓｉＲＮＡの血清半減期の解析
　ｓｉＲＮＡ（５ｐｍｏｌ）およびＯＤＡＧａｌ４（２０ｐｍｏｌ）を緩衝液（１００ｍＭの酢酸カリウム、２ｍＭの酢酸マグネシウム、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．４）中で混合することにより、ｓｉＲＮＡ－ＯＤＡＧａｌ４複合体を形成させた。その後、終濃度１０％のマウス血清（シグマ・アルドリッチ社）を加え、３７℃でインキュベートした。血清の添加から０、４、６、８、１２、２４、３６、４８、７２または９６時間後に、反応液に電気泳動用緩衝液（ＥＸＥＬＤＹＥ　６×ＤＮＡ　Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｄｙｅ、ＳＭＯＢＩＯ社）を添加し、反応を停止し、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳｕｐｅｒＳｅｐ　ＤＮＡ、富士フイルム和光純薬社）に供した。泳動後のゲルをＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＩＩ（タカラバイオ社）で蛍光染色し、ＬＡＳ－４０００（富士フイルム社）で画像を取得した。ｓｉＲＮＡの蛍光強度をＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）により解析し、ｓｉＲＮＡを定量した。得られた測定値をＤｅｌｔａＧｒａｐｈソフトウェア（Ｒｅｄ　Ｒｏｃｋ　ｓｏｆｔｗａｒｅ社）またはＥｘｃｅｌソフトウェア（マイクロソフト社）で解析し、指数近似曲線式を得た。この曲線の関数式から、反応液中のｓｉＲＮＡの残存量が反応開始時の半分となるのに要する時間（分解半減期）を算出した。

（３）ｓｉＲＮＡの融解温度（Ｔｍ値）の解析
　２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）（１００μＬ）と滅菌水（７０μＬ）を混合した水溶液に、１００μＭのｓｉＲＮＡセンス鎖またはアンチセンス鎖水溶液を各５μＬずつ加え、十分に混和した。サーマルサイクラーを用いて９５℃で２０分間加熱した後、－０．５℃／分の速度で２０℃まで冷却した。１００μＭのＯＤＡＧａｌ４水溶液または滅菌水を２０μＬ加え、全量で２００μＬの水溶液を調製した。これを、ＵＶ－１６５０ＰＣ（島津製作所社）を用いて、２０℃から９５℃まで０．５℃／分の速度で昇温し、０．２℃ごとに２６０ｎｍと３２０ｎｍの紫外吸光度を測定した。横軸に温度、縦軸に２６０ｎｍの吸光度から３２０ｎｍの吸光度を差し引いた測定値をプロットし、融解温度曲線を得た。この曲線を１次微分し、ピーク値を示す温度をＴｍ値として算出した。

（４）遺伝子発現に対するｓｉＲＮＡの抑制作用の解析
　肝がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂを４８ウェルプレート（グライナー・ジャパン社）に播き、１０％仔牛胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭ培地中で２４時間培養した。ｓｉＲＮＡ（２．５ｐｍｏｌ）およびＯＤＡＧａｌ４（１０ｐｍｏｌ）を緩衝液（１００ｍＭの酢酸カリウム、２ｍＭの酢酸マグネシウム、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．４）中で混合した。その後、０．７５μのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　ｍａｘ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）と混合し、得られた混合液をウェルに添加し、４時間培養することにより、ｓｉＲＮＡを細胞に導入した。その後、新鮮培地に交換し、さらに２日間培養を継続した。次に、細胞から全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）を用いて抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社）を用いて逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＴＢ　Ｇｒｅｅｎ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（タカラバイオ社）とＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　４８０（ロシュ社）を使用して定量的ＰＣＲを行った。定量的ＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドは、ＰｒｏｂｅＦｉｎｄｅソフトウェア（ロシュ社）によって設計した。

＜２．未修飾ｓｉＲＮＡ－ＯＤＡＧａｌ４複合体の血清半減期の解析＞
　上記（１）で調製された未修飾ｓｉＲＮＡであるＨＰ２およびＢ２Ｍ２を用いて、上記（２）の手順により、未修飾ｓｉＲＮＡ－ＯＤＡＧａｌ４複合体の血清半減期を解析した。同時に、ＨＰ２－ＯＤＡＧａｌ４複合体およびＢ２Ｍ２－ＯＤＡＧａｌ４複合体に代えて、ＯＤＡＧａｌ４と複合体化していないＨＰ２およびＢ２Ｍ２を用いた以外は、上記（２）と同様の手順により、ＯＤＡＧａｌ４と複合体化していない未修飾ｓｉＲＮＡの血清半減期を解析した（陰性対照）。

　ＨＰ２についての結果を図２～４に、Ｂ２Ｍ２についての結果を図５～７に示す。ＨＰ２およびＢ２Ｍ２のいずれの未修飾ｓｉＲＮＡも、ＯＤＡＧａｌ４と複合体化することにより、血清半減期が２倍程度延長された（図４および図７）。また、ＨＰ２およびＢ２Ｍ２の他にも、９種類の異なる遺伝子に対する未修飾ｓｉＲＮＡについて同様の解析を行った結果、いずれも血清半減期が延長され、全１１種類を平均して２．０５倍に血清半減期が延長されることが確認された（データは省略）。この結果から、ＯＤＡＧａｌ４の安定化効果は、ｓｉＲＮＡの配列に依存しない普遍性の高いものであることが示された。

＜３．骨格を修飾されたｓｉＲＮＡ－ＯＤＡＧａｌ４複合体の血清半減期の解析＞
　上記（１）で調製された２’－Ｏ－メチル化またはホスホロチオエート化を含む／含まない各種ｓｉＲＮＡについて、上記（２）の手順により、ｓｉＲＮＡ－ＯＤＡＧａｌ４複合体の血清半減期を解析した。同時に、対照として、ＯＤＡＧａｌ４と複合体化していないｓｉＲＮＡの血清半減期を解析した。

　結果を図８～１１に示す。図８および１０は血清半減期（時間）を、図９および１１はＯＤＡＧａｌ４と複合体化していない未修飾ｓｉＲＮＡ（それぞれ、ＨＰ２またはＢ２Ｍ２）の血清半減期を１とした場合の相対値を示す。骨格に２’－Ｏ－メチル化を含むｓｉＲＮＡは、ＯＤＡＧａｌ４と複合体化していない状態では、２’－Ｏ－メチル化の数を増やすにしたがって、１～５倍程度まで延長された血清半減期を示した。一方、骨格にホスホロチオエート化を含むｓｉＲＮＡは、ＯＤＡＧａｌ４と複合体化していない状態では、血清半減期はほとんど変化しなかった。これに対し、骨格に２’－Ｏ－メチル化またはホスホロチオエート化を含むｓｉＲＮＡとＯＤＡＧａｌ４との複合体は、いずれも血清半減期が顕著に延長された。特に、ホスホロチオエート化を含むｓｉＲＮＡとＯＤＡＧａｌ４との複合体は、約１０～２０倍の血清半減期を有しており、ホスホロチオエート化とＯＤＡＧａｌ４による複合体化を組み合わせることにより、二重鎖ＲＮＡの血清半減期を相乗的かつ飛躍的に延長できることが示された。

＜４．ｓｉＲＮＡ－ＯＤＡＧａｌ４複合体のＴｍ値の解析＞
　骨格修飾およびＯＤＡＧａｌ４によるｓｉＲＮＡの二重鎖構造に対する安定化効果を評価するために、上記（３）の手順により、ＯＤＡＧａｌ４と複合体化した、またはしていない各種ｓｉＲＮＡについて、Ｔｍ値を測定した。

　結果を表２に示す。未修飾ｓｉＲＮＡであるＨＰ２およびＢ２Ｍ２は、ＯＤＡＧａｌ４と複合体化することにより、それぞれＴｍ値が１．１および３．７℃上昇した。また、２’－Ｏ－メチル化を増やすにしたがってＴｍ値が上昇し、２’－Ｏ－メチル化とＯＤＡＧａｌ４による複合体化を組み合わせることにより、さらにＴｍ値が上昇した。これに対し、ホスホロチオエート化されたｓｉＲＮＡは、ＯＤＡＧａｌ４と複合体化されていないときにはＴｍ値が低下するが、ＯＤＡＧａｌ４による複合体化と組み合わされることにより、Ｔｍ値が大きく上昇することが示された。特に、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方がホスホロチオエート化されたｓｉＲＮＡ（ＨＰ２－Ｓ３およびＢ２Ｍ２－Ｓ３）は、それぞれＴｍ値が４．６および７．９℃上昇した。これらの結果は、上記の血清半減期の解析結果とも一致するものであり、ＯＤＡＧａｌ４が二重鎖ＲＮＡに対して優れた安定化効果を有するものであることが示された。

　表２．ＯＤＡＧａｌ４と複合体化した、またはしていないｓｉＲＮＡのＴｍ値

＜５．ｓｉＲＮＡ－ＯＤＡＧａｌ４複合体の遺伝子発現に対する抑制効果の解析＞
　骨格修飾およびＯＤＡＧａｌ４によるｓｉＲＮＡの活性への影響を評価するために、上記（４）の手順により、ＯＤＡＧａｌ４と複合体化した、またはしていない上記（１）で調製された各種ｓｉＲＮＡについて、遺伝子発現に対する抑制効果を解析した。

　結果を図１２および１３に示す。図中、「Ｎｏｎｅ」は、ｓｉＲＮＡを含まない緩衝液（１００ｍＭの酢酸カリウム、２ｍＭの酢酸マグネシウム、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．４）を用いて同様の手順を行った結果を示し、「Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ」は、ＨＰＲＴ１遺伝子およびβ－２－マイクログロブリン遺伝子のいずれに対しても作用しない配列からなるｓｉＲＮＡを用いて同様の手順を行った結果を示す。ＯＤＡＧａｌ４と複合体化されていない未修飾ｓｉＲＮＡ（ＨＰ２およびＢ２Ｍ２）は、いずれも約２０％程度にまで遺伝子発現レベルを抑制したが、２’－Ｏ－メチル化の導入により、ノックダウン効果が減弱する傾向が確認された。特に、２’－Ｏ－メチル化が多く導入されたｓｉＲＮＡ（ＨＰ２－Ｍ３およびＢ２Ｍ２－Ｍ３）は、弱いノックダウン効果しか示さなかった。一方、ホスホロチオエート化されたｓｉＲＮＡはいずれも、未修飾ｓｉＲＮＡと同程度に遺伝子発現レベルを抑制した。ここで、ＯＤＡＧａｌ４により複合体化したｓｉＲＮＡはいずれも、ＯＤＡＧａｌ４により複合体化されていないｓｉＲＮＡと比較して、ノックダウン効果はほとんど変化しなかった。これらの結果から、ＯＤＡＧａｌ４はｓｉＲＮＡの活性に対して影響せず、二重鎖ＲＮＡの性質を変化させないものであることが明らかとなった。

　以上の結果から、骨格修飾とＯＤＡＧａｌ４とを組み合わせることにより、高い活性と安定性を兼ね備えた二重鎖ＲＮＡ医薬品を提供できることが示された。

＜６．骨格修飾の種類および導入部位の異なる二重鎖ＲＮＡの調製＞
　上記（１）と同様の手順により、骨格修飾の種類および導入部位の異なる種々の二重鎖ｓｉＲＮＡを調製した。配列を表３に示す。大文字は未修飾ＲＮＡを示す（ただし、「Ｔ」はチミジン（ＤＮＡ）を示す）。小文字は修飾ＲＮＡを示し：太字は２’－Ｏ－メチル化修飾を、斜体はホスホロチオエート化修飾を、太字の斜体は２’－Ｏ－メチル化修飾かつホスホロチオエート化修飾を、下線を付した太字は２’－Ｆ化修飾を示す。また、下線を付した大文字の太字はＬＮＡを示す。

　表３．ｓｉＲＮＡの配列

　表３に記載の各種ｓｉＲＮＡについて、上記（２）の手順により、ｓｉＲＮＡ－ＯＤＡＧａｌ４複合体の血清半減期を解析した。同時に、対照として、ＯＤＡＧａｌ４と複合体化していないｓｉＲＮＡの血清半減期を解析した（図１４～２２）。なお、図１４～２２において、（Ａ）は血清半減期（時間）を、（Ｂ）はＯＤＡＧａｌ４と複合体化していない未修飾ｓｉＲＮＡの血清半減期を１とした場合の相対値を示す。

＜７．骨格修飾の導入部位が異なるｓｉＲＮＡ－ＯＤＡＧａｌ４複合体の安定性の比較＞
　センス鎖またはアンチセンス鎖の一部（６塩基間）にホスホロチオエート化結合を導入したｓｉＲＮＡについての結果を図１４～１７に示す。図１４は、センス鎖の一部がホスホロチオエート化されたＨＰ２（ＨＰ２－Ｓ４～ＨＰ２－Ｓ７）についての結果を示し、図１５はアンチセンス鎖の一部がホスホロチオエート化されたＨＰ２（ＨＰ２－Ｓ８～ＨＰ２－Ｓ１１）についての結果を示し、図１６はセンス鎖の一部がホスホロチオエート化されたＢ２Ｍ２（Ｂ２Ｍ２－Ｓ４～Ｂ２Ｍ２－Ｓ７）についての結果を示し、図１７はアンチセンス鎖の一部がホスホロチオエート化されたＢ２Ｍ２（Ｂ２Ｍ２－Ｓ８～Ｂ２Ｍ２－Ｓ１１）についての結果を示す。いずれの場合にも、ホスホロチオエート化領域が３’末端に近いほど、ＯＤＡＧａｌ４との複合体化による顕著に高い安定化効果が見られた。

　センス鎖の一部（４塩基間）にホスホロチオエート化結合を導入したｓｉＲＮＡ（ＨＰ２－Ｓ１２およびＨＰ２－Ｓ１３）についての結果を図１８に示す。センス鎖の突出領域を含めた３’末端の４塩基間にホスホロチオエート化結合を導入したＨＰ２（ＨＰ２－Ｓ１２）とＯＤＡＧａｌ４との複合体は、わずかに改善された血清半減期を示した一方で、突出領域を除いた３’末端の４塩基間にホスホロチオエート化結合を導入したＨＰ２（ＨＰ２－Ｓ１３）とＯＤＡＧａｌ４との複合体は、顕著に改善された血清半減期を示した。なお、突出領域をＤＮＡに変更した場合でも同様の結果が得られた（図１９、ＨＰ２－ＴＳ）。

　センス鎖および／またはアンチセンス鎖の中央領域（１１塩基間）にホスホロチオエート化結合を導入したｓｉＲＮＡ（ＨＰ２－Ｓ１４～ＨＰ２－Ｓ１６）についての結果を図２０に示す。いずれもＯＤＡＧａｌ４との複合体化による高い安定化効果が得られたが、ｓｉＲＮＡの片鎖のみにホスホロチオエート化を導入した場合には、センス鎖またはアンチセンス鎖のどちらをホスホロチオエート化するかで安定化効果の程度が変化した。

　以上の結果から、ｓｉＲＮＡ－ＯＤＡＧａｌ４複合体において、ｓｉＲＮＡに導入する骨格修飾の導入部位やその長さを変更することにより、ｓｉＲＮＡに所望の安定性を付与することができることが示された。さらに、ｓｉＲＮＡ－ＯＤＡＧａｌ４複合体において、ｓｉＲＮＡの片鎖の３’末端の二重鎖領域のわずか４塩基間にホスホロチオエート化結合を導入するのみでも、顕著に高い安定化効果が得られることが示された。

＜８．骨格修飾の種類が異なるｓｉＲＮＡ－ＯＤＡＧａｌ４複合体の安定性の比較＞
　ホスホロチオエート化に代えて、またはホスホロチオエート化と組み合わせて、２’－Ｏ－メチル化、２’－Ｆ化、もしくはＬＮＡを導入したＨＰ２と、ＯＤＡＧａｌ４との複合体の血清半減期を、上記（２）の手順により解析した。結果を図２１および２２に示す。いずれの種類の骨格修飾を導入した場合でも、ＯＤＡＧａｌ４との複合体化による安定化効果が得られたが、特に、ホスホロチオエート化と組み合わせた場合に極めて高い安定化効果が得られた（図２１、ＨＰ２－ＭＳ１、ＨＰ２－ＭＳ２；図２２、ＨＰ２－ＦＳ、ＨＰ２－ＬＳ）。

＜９．短い二重鎖ＲＮＡ－ＯＤＡＧａｌ４複合体の安定性＞
　上記（１）と同様の手順により、ホスホロチオエート化を含む、または含まない、１２塩基対からなる短い二重鎖ＲＮＡ（平滑末端）を調製した。配列を表４に示す。大文字は未修飾ＲＮＡを示す。小文字の斜体はホスホロチオエート化修飾ＲＮＡを示す。

　表４．短鎖ＲＮＡの配列

　ｓｉＲＮＡに代えて、短い二重鎖ＲＮＡを用いた以外は、上記（２）と同様の手順により、短い二重鎖ＲＮＡの血清半減期を解析した。結果を図２３に示す。（Ａ）は血清半減期（時間）を、（Ｂ）はＯＤＡＧａｌ４と複合体化していない未修飾ｓｉＲＮＡの血清半減期を１とした場合の相対値を示す。この結果から、平滑末端かつ短い二重鎖ＲＮＡにおいても、ホスホロチオエート化とＯＤＡＧａｌ４による複合体化とを組み合わせることにより、顕著に高い安定化効果が得られることが示された（図２３、１２Ｍ－Ｓ）。

＜１０．ホスホロチオエート化ｓｉＲＮＡ－各種カチオン性オリゴ糖複合体の安定性の比較＞
　ホスホロチオエート化ｓｉＲＮＡであるＨＰ２－Ｓ３と、各種カチオン性オリゴ糖との複合体について、上記（２）と同様の手順により血清半減期を解析した。結果を図２４に示す。図２４中、「ＯＤＡＧｌｃ４」は、２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－α－（１→４）－Ｄ－グルコピラノーステトラマーを示し；「ＯＤＡＭａｎ４」は、２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－α－（１→４）－Ｄ－マンノピラノーステトラマーを示し；「ＯＤＧＧａｌ３」は、２，６－ジグアニジノ－２，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノーストリマーを示す。また、（Ａ）は血清半減期（時間）を、（Ｂ）はＯＤＡＧａｌ４と複合体化していない未修飾ｓｉＲＮＡの血清半減期を１とした場合の相対値を示す。この結果から、ＯＤＡＧａｌ４以外のカチオン性オリゴ糖による複合体化でも同様に、ホスホロチオエート化と組み合わせることにより、二重鎖ＲＮＡを顕著に安定化できることが確認された。

Claims (11)

1. 　二重鎖ＲＮＡの安定性を調節する方法であって、
   　（１）二重鎖ＲＮＡの骨格に少なくとも１つの修飾を導入するステップと、
   　（２）ステップ（１）により得られた二重鎖ＲＮＡと、一般式（Ｉ）：
   　　Ｒ^１－Ｏ－（Ｘ）_ｎ－Ｒ^２
   ［式中、
   　Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子または１価の置換基であり、
   　ｎは、３～６の整数であり、
   　ｎ個のＸは同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立して、以下の（ａ）～（ｉ）：
   

   

   で表される２価の基（ここで、Ｒ^＋は、ＮＨ_３ ^＋または式（ＩＩ）：
   

   

   　（ここで、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して水素原子もしくはメチル基である）で表される基である）から選択される］
   で表されるカチオン性オリゴ糖とを接触させるステップと
   を含む、方法。
2. 　前記一般式（Ｉ）において、
   　Ｒ^１が水素原子であり、
   　Ｒ^２が水素原子または置換もしくは非置換のＣ_１－６アルキル基であり、
   　ｎが３もしくは４である、
   請求項１に記載の方法。
3. 　前記一般式（Ｉ）で表されるカチオン性オリゴ糖が、２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノーステトラマーである、請求項１または２に記載の方法。
4. 　前記修飾が２’－Ｏ－メチル化およびホスホロチオエート化から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 　（１）骨格に修飾が導入された二重鎖ＲＮＡと、
   　（２）一般式（Ｉ）：
   　　Ｒ^１－Ｏ－（Ｘ）_ｎ－Ｒ^２
   ［式中、
   　Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子または１価の置換基であり、
   　ｎは、３～６の整数であり、
   　ｎ個のＸは同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立して、以下の（ａ）～（ｉ）：
   

   

   で表される２価の基（ここで、Ｒ^＋は、ＮＨ_３ ^＋または式（ＩＩ）：
   

   

   　（ここで、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して水素原子もしくはメチル基である）で表される基である）から選択される］
   で表されるカチオン性オリゴ糖と
   の複合体を含んでなる核酸組成物であって、未修飾の二重鎖ＲＮＡと同等の薬学的活性を有し、かつ、未修飾の二重鎖ＲＮＡと比較して５倍以上長い血清半減期を有する、核酸組成物。
6. 　前記一般式（Ｉ）において、
   　Ｒ^１が水素原子であり、
   　Ｒ^２が水素原子または置換もしくは非置換のＣ_１－６アルキル基であり、
   　ｎが３または４である、
   請求項５に記載の核酸組成物。
7. 　前記カチオン性オリゴ糖が、２，６－ジアミノ－２，６－ジデオキシ－β－（１→４）－Ｄ－ガラクトピラノーステトラマーである、請求項５または６に記載の核酸組成物。
8. 　前記二重鎖ＲＮＡの骨格全体の少なくとも１０％が修飾されている、請求項５～７のいずれか１項に記載の核酸組成物。
9. 　前記修飾が２’－Ｏ－メチル化およびホスホロチオエート化から選択される、請求項５～８のいずれか１項に記載の核酸組成物。
10. 　前記修飾が、前記二重鎖ＲＮＡを構成する少なくとも一方のＲＮＡ鎖の３’末端領域の骨格に導入される、請求項５～９のいずれか１項に記載の核酸組成物。
11. 　前記二重鎖ＲＮＡが１２～５０塩基対長である、請求項５～１０のいずれか１項に記載の核酸組成物。
     

Images