CN114585737A - 寡核苷酸组合物及其使用方法 - Google Patents

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吉加·德塞
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Abstract

尤其是，本披露提供了寡核苷酸及其组合物。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸和组合物可用于腺苷修饰。在一些实施例中，本披露提供了用于治疗可受益于腺苷修饰的多种病症、障碍或疾病的方法。

Description

寡核苷酸组合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年10月6日提交的美国临时申请号62/911,334、于2020年1月11日提交的美国临时申请号62/959,917、于2020年5月10日提交的美国临时申请号63/022,559和于2020年8月24日提交的美国临时申请号63/069,696的优先权，这些美国临时申请各自的全部内容通过援引并入本文。
背景技术
寡核苷酸可用于多种应用，例如治疗、诊断和/或研究应用。例如，靶向多种基因的寡核苷酸可用于治疗与此类靶基因有关的病症、障碍或疾病。
发明内容
尤其是，本披露提供了经设计的寡核苷酸及其组合物，这些寡核苷酸包含如本文所述的修饰(例如，对核碱基糖和/或核苷酸间键联的修饰，及其模式)。在一些实施例中，本披露的技术(化合物(例如，寡核苷酸)、组合物、方法等)(例如，寡核苷酸、寡核苷酸组合物、方法等)特别可用于编辑核酸，例如核酸中的定点编辑(例如，靶腺苷的编辑)。在一些实施例中，如本文所展示，所提供的技术可以显著改善核酸编辑的效率，例如对一个或多个A残基的修饰，诸如将A转化成I。在一些实施例中，本披露提供了用于RNA中的编辑(例如，用于修饰A残基，例如将A转化成I)的技术。在一些实施例中，本披露提供了用于转录物(例如，mRNA)中的编辑(例如，用于修饰A残基，例如将A转化成I)的技术。尤其是，所提供的技术提供了利用内源性蛋白诸如ADAR(作用于RNA的腺苷脱氨酶)蛋白(例如，ADAR1和/或ADR2)来编辑核酸，例如修饰A(例如，作为G至A突变的结果)的益处。本领域技术人员将认识到，与需要递送外源性组分(例如，蛋白(例如，经工程化以结合寡核苷酸(和/或其与靶核酸的双链体)以提供所需活性的那些蛋白)、编码蛋白的核酸、病毒等)的那些技术相比，内源性蛋白的这种利用可以避免许多挑战和/或提供多种益处。
特别地，在一些实施例中，所提供的技术的寡核苷酸包含有用的糖修饰和/或其模式(例如，某些修饰的存在和/或不存在)、核碱基修饰和/或其模式(例如，某些修饰的存在和/或不存在)、核苷酸间键联修饰和/或立体化学和/或其模式[例如，手性键联磷的类型、修饰和/或构型(Rp或Sp)等]等，其当与本文所述的一种或多种其他结构元件(例如，另外的化学部分)组合时可以提供高活性和/或多种所需的特性，例如，高核酸编辑效率、高选择性、高稳定性、高细胞摄取、低免疫刺激、低毒性、改善的分布、改善的亲和力等。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸提供高稳定性，例如，当与具有用于腺苷编辑的高百分比的天然RNA糖的寡核苷酸相比时。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸提供高活性，例如腺苷编辑活性。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸提供高选择性，例如，在一些实施例中，所提供的寡核苷酸提供靶核酸中的靶腺苷相对于相同靶核酸中的其他腺苷的选择性修饰(例如，靶腺苷处的修饰是靶核酸中的另一腺苷或所有其他腺苷处的修饰的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍或更多倍)。
在一些实施例中，本披露提供了包含第一结构域和第二结构域的寡核苷酸，其中第一结构域包含一个或多个2'-F修饰，并且第二结构域包含一个或多个不具有2'-F修饰的糖。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含一个或多个手性修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，该寡核苷酸包含：
(a)第一结构域；以及
(b)第二结构域，
其中第一结构域包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个包含2'-F修饰的糖，或第一结构域的所有糖的至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％包含2'-F修饰；
第二结构域包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个不含2'-F修饰的经修饰的糖，或第二结构域的所有糖的至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％不含2'-F修饰。
在一些实施例中，第二结构域包含如本文所述的第一子结构域、第二子结构域和第三子结构域，或由这些结构域组成。
在一些实施例中，第二结构域包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个独立地包含2'-OR修饰的经修饰的糖，或第二结构域的所有糖的至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％包含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，R是甲基。在一些实施例中，R是CH2CH2OCH3。如本文所述，根据本披露还可以利用其他糖修饰，任选地具有本文所述的碱基修饰和/或核苷酸间键联修饰。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸的碱基序列与包含靶腺苷的靶核酸的碱基序列基本上互补。在一些实施例中，当与靶核酸比对时，所提供的寡核苷酸包含一个或多个错配(非沃森-克里克碱基对)。在一些实施例中，当与靶核酸比对时，所提供的寡核苷酸包含一个或多个摇摆(wobble)(例如，G-U、I-A、G-A、I-U、I-C等)。在一些实施例中，错配和/或摇摆可帮助一种或多种蛋白(例如，ADAR1、ADAR2等)识别由所提供的寡核苷酸和靶核酸形成的双链体。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸与靶核酸形成双链体。在一些实施例中，ADAR蛋白识别并结合此类双链体。在一些实施例中，与靶腺苷相反的核苷位于所提供的寡核苷酸的中间，例如5'侧有5-50个核苷，而在其3'侧有1-50个核苷。在一些实施例中，5'侧具有比3'侧更多的核苷。在一些实施例中，5'侧具有比3'侧更少的核苷。在一些实施例中，5'侧具有与3'侧相同数目的核苷。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含表中所描述的寡核苷酸的15-40个(例如，15、20、25、30个等)连续碱基。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸的碱基序列是或包含表中所描述的寡核苷酸的碱基序列。
在一些实施例中，利用多种结构元件(例如，多种修饰、立体化学和其模式)，本披露可用短寡核苷酸(例如，长度为约20-40、25-40、25-35、26-32、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核碱基的那些寡核苷酸)实现所需的特性和高活性。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含经修饰的核碱基。在一些实施例中，经修饰的核碱基促进对靶腺苷的修饰。在一些实施例中，与存在U时相比，与靶腺嘌呤相反的核碱基保持与酶例如ADAR的相互作用，而与靶腺嘌呤的相互作用不如与U强烈(例如，形成较少的氢键)。在一些实施例中，相反核碱基和/或其相关联的糖提供一定的灵活性(例如，当与U相比时)以促进酶(例如，ADAR1、ADAR2等)对靶腺苷的修饰。在一些实施例中，紧邻相反核碱基(相对于靶腺嘌呤)的5'或3'的核碱基(例如，I及其衍生物)增强对靶腺嘌呤的修饰。尤其是，本披露认识到，当所提供的寡核苷酸及其靶核酸的双链体与修饰酶(例如，ADAR1或ADAR2)相互作用时，这样的核碱基可导致比G更小的空间位阻。在一些实施例中，选择(例如，当几个腺苷残基是合适的靶时)和/或设计(例如，通过利用本文所述的多种核碱基)寡核苷酸的碱基序列，使得可以减小或消除空间位阻(例如，没有G与靶A的相反核苷相邻)。
在一些实施例中，本披露的寡核苷酸提供经修饰的核苷酸间键联(即，不是天然磷酸酯键联的核苷酸间键联)。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联(例如，手性核苷酸间键联)的键联磷是手性的并且可以按不同的构型(Rp和Sp)存在。尤其是，本披露展示，经修饰的核苷酸间键联的并入，特别是具有对键联磷中心的立体化学的控制(使得与立体随机寡核苷酸制备物相比，在这种控制中心处富集一种构型)，可以显著改善特性(例如，稳定性)和/或活性(例如，腺苷修饰活性(例如，将腺苷转化成肌苷))。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸具有显著高于立体随机制备物的立体化学纯度。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸是手性控制的。
在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含一个或多个手性核苷酸间键联，其键联磷是手性的(例如，硫代磷酸酯核苷酸间键联)。在一些实施例中，寡核苷酸中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸间键联，或所有核苷酸间键联的至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，至少一个核苷酸间键联是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，至少一个核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，每个核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，至少一个手性核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个均是硫代磷酸酯核苷酸间键联。键联磷可以是Rp或Sp。在一些实施例中，至少一个键联磷是Rp。在一些实施例中，至少一个键联磷是Sp。在一些实施例中，寡核苷酸中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个手性核苷酸间键联，或所有手性核苷酸间键联的至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％是Sp。在一些实施例中，寡核苷酸中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个硫代磷酸酯核苷酸间键联，或所有硫代磷酸酯核苷酸间键联的至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％是Sp。
在一些实施例中，在组合物中控制所提供的寡核苷酸的一个或多个手性键联磷的立体化学。在一些实施例中，本披露提供了包含多个寡核苷酸的组合物，其中多个寡核苷酸共享共同碱基序列，并且独立地在一个或多个手性核苷酸间键联(“手性控制的核苷酸间键联”)(例如，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个手性核苷酸间键联，或所有手性核苷酸间键联的至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)处共享相同的键联磷构型(例如，对于手性键联磷，均是Rp或均是Sp)。在一些实施例中，它们在每个手性键联磷处共享相同的立体化学。在一些实施例中，多个寡核苷酸共享相同的构成。在一些实施例中，除了核苷酸间键联之外，多个寡核苷酸在结构上是相同的。在一些实施例中，多个寡核苷酸在结构上是相同的。在一些实施例中，组合物中的所有寡核苷酸、或共享共同碱基序列的所有寡核苷酸的至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％共享该多个寡核苷酸的骨架手性中心模式。在一些实施例中，组合物中的所有寡核苷酸、或共享共同碱基序列的所有寡核苷酸的至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％是该多个寡核苷酸。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物，其中组合物中所有寡核苷酸、或具有相同寡核苷酸碱基序列的所有寡核苷酸、或具有相同碱基序列以及糖和碱基修饰的所有寡核苷酸、或具有相同构成的所有寡核苷酸的至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％独立地在寡核苷酸的一个或多个手性核苷酸间键联(例如，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个手性核苷酸间键联，或所有手性核苷酸间键联的至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)处共享相同的键联磷构型(例如，对于手性键联磷，均是Rp或均是Sp)。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物，其中组合物中所有寡核苷酸、或具有相同寡核苷酸碱基序列的所有寡核苷酸、或具有相同碱基序列以及糖和碱基修饰的所有寡核苷酸、或具有相同构成的所有寡核苷酸的至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％是一种或多种形式的寡核苷酸(例如，酸形式、盐形式(例如，药学上可接受的盐形式；如本领域技术人员所理解的，在寡核苷酸是盐的情况下，寡核苷酸的相应酸或碱形式的其他盐形式)等)。
在一些实施例中，如本文所展示，手性控制的寡核苷酸组合物与相应的立体随机寡核苷酸组合物相比提供许多优点，例如更高的稳定性、活性等。在一些实施例中，据观察，手性控制的寡核苷酸组合物在采用ADAR蛋白的各种同种型(例如，ADAR1的p150和p110形式)时均提供高水平的腺苷修饰(例如，将A转化成I)活性，而相应的立体随机组合物仅在采用ADAR蛋白的某些同种型(例如，ADAR1的p150同种型)时才提供高水平的腺苷修饰(例如，将A转化成I)活性。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含另外的部分，例如靶向部分、碳水化合物部分等。在一些实施例中，另外的部分是或包含脱唾液酸糖蛋白受体的配体。在一些实施例中，另外的部分是或包含GalNAc或其衍生物。尤其是，另外的部分可以有利于向某些靶位置，例如细胞、组织、器官等(例如，包含与另外的部分相互作用的受体的位置)的递送。在一些实施例中，另外的部分有利于向肝的递送。
在一些实施例中，本披露提供了用于制备寡核苷酸及其组合物，特别是手性控制的寡核苷酸组合物的技术。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸及其组合物是高纯度的。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸在手性核苷酸间键联的键联磷处是至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％立体化学纯的。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸立体选择性地制备并且基本上不含立体异构体。在一些实施例中，在所提供的包含共享相同手性键联磷立体化学(例如，包含Rp和/或Sp中的一者或多者，其中每个手性键联磷独立地是Rp或Sp)模式的相同碱基序列的多个寡核苷酸的组合物中，组合物中与该多个寡核苷酸共享相同碱基序列的所有寡核苷酸的至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％共享相同的手性键联磷立体化学模式或是该多个寡核苷酸。在一些实施例中，在所提供的包含共享相同手性键联磷立体化学模式的相同碱基序列的多个寡核苷酸的组合物中，组合物中与该多个寡核苷酸共享相同构成的所有寡核苷酸的至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％共享相同的手性键联磷立体化学模式或是该多个寡核苷酸。
在一些实施例中，本披露描述了用于评估寡核苷酸及其组合物的有用技术。例如，本披露的多种技术可用于评估腺苷修饰。如本领域技术人员所理解的，在一些实施例中，腺苷的修饰/编辑可以通过测序、质谱法、对经修饰的核酸(例如，其中靶核酸的腺苷被转化成肌苷)的产物(例如，RNA、蛋白等)的评估(例如，水平、活性等)等来评估，任选地考虑修饰系统(例如，体外系统、离体系统、细胞、组织、器官、生物体、受试者等)中存在的其他组分(例如，ADAR蛋白)。本领域技术人员将理解，提供靶核酸的腺苷修饰的寡核苷酸也可以提供经修饰的核酸(例如，其中靶腺苷被转化成I)及其一种或多种产物(例如，mRNA、蛋白等)。在实例中描述了某些有用的技术。
如本文所述，可以多种形式提供/利用本披露的寡核苷酸和组合物。在一些实施例中，本披露提供了包含一种或多种形式的寡核苷酸的组合物，例如，酸形式(例如，其中天然磷酸酯键联以-O(P(O)(OH)-O-存在，硫代磷酸酯核苷酸间键联以-O(P(O)(SH)-O-存在)、碱形式、盐形式(例如，其中天然磷酸酯键联以盐形式(例如，钠盐-O(P(O)(O-Na+)-O-)存在，硫代磷酸酯核苷酸间键联以盐形式(例如，钠盐-O(P(O)(S-Na+)-O-)存在)等。如本领域技术人员所理解的，寡核苷酸可以以多种盐形式存在，包括药学上可接受的盐，并且在溶液(例如，多种水性缓冲体系)中，阳离子可以从阴离子解离。在一些实施例中，本披露提供了药物组合物，该药物组合物包含所提供的寡核苷酸和/或其一种或多种药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载剂。在一些实施例中，药物组合物是手性控制的寡核苷酸组合物。
所提供的技术可用于多种目的。例如，本领域技术人员将理解，所提供的技术可用于涉及腺苷修饰的许多目的，例如，校正G至A突变，调节某些核酸和/或由其编码的产物的水平(例如，通过引入A至G/I修饰来降低蛋白的水平)，调节剪接，调节翻译(例如，通过引入A至G/I修饰来调节翻译起始和/或终止位点)等。
在一些实施例中，本披露提供了用于预防或治疗适合腺苷修饰(例如，将A转化成I或G)的病症、障碍或疾病的技术。如本领域技术人员所理解的，I可执行G的一种或多种功能，例如碱基配对、翻译等。在一些实施例中，G至A突变可通过A至I的转化来校正，使得可以产生G形式核酸的一种或多种产物，例如蛋白。在一些实施例中，本披露提供了用于预防或治疗与突变相关联的病症、障碍或疾病的技术，这些技术包括向易感该病症、障碍或疾病或者患有该病症、障碍或疾病的受试者施用所提供的寡核苷酸或其组合物，该寡核苷酸或组合物可编辑突变。在一些实施例中，本披露提供了用于预防或治疗与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的技术，这些技术包括向易感该病症、障碍或疾病或者患有该病症、障碍或疾病的受试者施用所提供的寡核苷酸或其组合物，该寡核苷酸或组合物可编辑A。在一些实施例中，所提供的技术修饰转录物(例如，RNA转录物)中的A。在一些实施例中，A被转化成I。在一些实施例中，在翻译期间，蛋白合成机器将I读作G。在一些实施例中，A形式编码一种或多种与由其相应G形式编码的蛋白相比具有一种或多种更高的所需活性和/或一种或多种更好的所需特性的蛋白。在一些实施例中，A形式与其相应G形式相比提供更高水平的一种或多种具有一种或多种更高的所需活性和/或一种或多种更好的所需特性的蛋白。在一些实施例中，由A形式编码的产物在结构上与由其相应G形式编码的产物不同(例如，更长，在一些实施例中为全长蛋白)。在一些实施例中，A形式与其相应G形式相比提供在结构上相同的产物(例如，蛋白)。
如本领域技术人员将理解的，许多病症、障碍或疾病与可通过所提供的技术修饰的突变相关并且可使用所提供的技术来预防和/或治疗。例如，据报道，超过20,000种病症、障碍或疾病与G至A突变相关，并且可以受益于A至I编辑。
附图说明
图1.所提供的具有多种糖修饰模式的技术可以提供所需的活性。(a)ADAR1介导的编辑和(b)ADAR2介导的编辑。寡核苷酸都具有靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子的相同序列。将293T细胞分别用ADAR1和ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。测量cLuc活性并将其归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图2.所提供的包括多种核苷酸间键联修饰的技术可以提供所需活性。(a)和(b)：组合物都具有靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子的相同序列。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。测量cLuc活性并将其归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图3.所提供的包括多种糖修饰的技术可以提供所需活性。组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。测量cLuc活性并将其归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图4.所提供的包括多种糖类型的技术可以提供所需活性。组合物都具有靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子的相同序列。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。测量cLuc活性并将其归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图5.所提供的技术可以用短序列提供所需活性。组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用ADAR1(a和b)或ADAR2(c和d)、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。测量cLuc活性并将其归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图6.所提供的技术可以在没有外源性ADAR的情况下在多种细胞类型中提供所需活性。图6描绘了在不同细胞类型中在没有外源性ADAR的情况下对内源性靶(肌动蛋白的3'UTR中的TAG位点)的编辑。用50nM寡核苷酸转染细胞，48小时后对编辑进行测量。(对于RPE和NHBE细胞，N＝1，对于肝细胞，N＝2个生物重复样)
图7.所提供的包括多种数目的错配的技术可以提供所需活性。组合物均靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子并具有0-2个错配。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。在48和96h测量cLuc活性并将其归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图8.所提供的包括多种模式的错配的技术可以提供所需活性。组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图9.所提供的包括多种模式的错配的技术可以提供所需活性。组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图10.手性控制的寡核苷酸组合物可以提供所需活性。组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图11.手性控制的寡核苷酸组合物可以提供所需活性。组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物以不同的寡核苷酸浓度转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图12.手性控制的寡核苷酸组合物可以在没有外源性ADAR的情况下在多种细胞类型中提供显著更高的活性。组合物都靶向肌动蛋白的3'UTR中的UAG基序。将细胞用10μM剂量的寡核苷酸进行裸处理，或用50nM剂量的寡核苷酸进行转染。48小时后收获RNA，并通过桑格(Sanger)测序对编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。
图13.所提供的技术可以在没有外源性ADAR的情况下用短序列提供所需活性。图13描绘了在原代人视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)中的编辑。组合物都靶向肌动蛋白的3'UTR中的UAG基序。用50nM寡核苷酸转染原代人RPE细胞。48小时后收获RNA，并通过桑格测序对编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。
图14.手性控制的寡核苷酸组合物可以在没有外源性ADAR的情况下在多种细胞类型中提供高活性。组合物都靶向肌动蛋白的3'UTR中的UAG基序。将原代人支气管上皮细胞用10μM寡核苷酸进行裸处理，而原代RPE细胞用50nm寡核苷酸转染。48小时后收获RNA，并通过桑格测序对编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。
图15.所提供的包括多种核苷酸间键联模式的技术可以提供所需活性。组合物都具有相同的碱基序列，并且靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图16.所提供的包括多种核苷酸间键联模式的技术可以在没有外源性ADAR的情况下提供所需活性。组合物都靶向肌动蛋白的3'UTR中的UAG基序。将原代人肝细胞用3.3μM寡核苷酸进行裸处理。48小时后收获RNA，并通过桑格测序对编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。
图17.所提供的包括多种修饰和手性控制的技术可以在没有外源性ADAR的情况下提供所需活性。组合物都靶向肌动蛋白的3'UTR中的UAG基序。用50nM寡核苷酸转染原代人肝细胞。48小时后收获RNA，并通过桑格测序对编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。
图18.所提供的包括另外的部分的技术可以在没有外源性ADAR的情况下提供高活性。(a)和(b)：组合物都靶向β-肌动蛋白mRNA的3'UTR中的腺苷。将原代人肝细胞以不同的浓度进行裸处理。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。
图19.所提供的技术可以在没有外源性ADAR的情况下提供所需活性。图19描绘了对原代小鼠肝细胞中SERPINA1(PiZ等位基因)的编辑。组合物都靶向突变体人SERPINA1转录物(PiZZ等位基因)中的腺苷。用50nM寡核苷酸转染原代肝细胞(从表达突变体人转录物的小鼠模型中提取)。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。
图20.所提供的包括经修饰的碱基的技术可以在没有外源性ADAR的情况下提供高活性。图20描绘了对原代小鼠肝细胞中SERPINA1(PiZ等位基因)的编辑。组合物都靶向突变体人SERPINA1转录物(PiZZ等位基因)中的腺苷。用50nM寡核苷酸转染处理原代肝细胞(从表达突变体人转录物的小鼠模型中提取)。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。如图所示，所提供的包括经修饰的核碱基的设计可以大大改善活性。
图21.所提供的包括经修饰碱基的技术可以提供所需活性。组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物以不同的寡核苷酸浓度转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图22.图22描绘了寡核苷酸构型的实例。
图23.所提供的包括经修饰的碱基的技术可以提供高活性。组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图24.与立体随机寡核苷酸组合物相比，所提供的包括手性控制的寡核苷酸组合物的技术可以提供高活性。组合物使用内源性ADAR靶向指示的转录物内的UAG基序。用组合物以50nM的寡核苷酸浓度转染原代人肝细胞。通过在48小时处理后对收获的RNA进行桑格测序来确定靶向转录物的编辑百分比(n＝2个生物重复样)。如所展示的，所提供的技术可以为多种靶转录物提供高编辑效率。
图25.所提供的包括具有经修饰的核苷酸间键联的寡核苷酸的技术可以提供高活性。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含硫代磷酸酯键联和不带负电荷的核苷酸间键联，诸如n001。组合物靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用ADAR1-p150、荧光素酶报告构建体和指示的组合物以3.3nM的寡核苷酸浓度转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图26.所提供的包括含有另外的化学部分的寡核苷酸的技术可以提供高活性。组合物使用内源性ADAR靶向β-肌动蛋白mRNA的3'UTR中的腺苷。将原代猴肝细胞用指示的组合物以指示的浓度进行裸处理。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。
图27.所提供的包括具有经修饰的核苷酸间键联、糖修饰和/或另外的化学部分的寡核苷酸的技术可以提供高活性。组合物使用内源性ADAR靶向β-肌动蛋白mRNA的3'UTR中的腺苷。将原代人肝细胞用指示的组合物以指示的寡核苷酸浓度进行裸处理。通过桑格测序确定靶转录物的编辑百分比(n＝2个生物重复样)。
图28.所提供的包括含有多种经修饰的核苷酸间键联、糖修饰和/或另外的部分的寡核苷酸的技术可以提供高活性。组合物使用内源性ADAR靶向β-肌动蛋白mRNA的3'UTR中的腺苷。将原代人肝细胞用指示的组合物以指示的寡核苷酸浓度进行裸处理。通过桑格测序确定靶转录物的编辑百分比(n＝2个生物重复样)。在一些实施例中，某些结构元件，例如第二子结构域中的2'-F修饰的糖，与第二子结构域核苷键合的Rp硫代磷酸酯键联，错配的定位和/或存在或不存在，和/或某些位置处的不带负电荷的核苷酸间键联诸如n001可以改善编辑效率。
图29.所提供的包括具有经修饰的核苷酸间键联、糖修饰和/或另外的化学部分的寡核苷酸的技术可以提供高活性。将原代人肝细胞用指示的寡核苷酸组合物以指示的浓度进行裸处理。ADAR是内源性的。组合物靶向β-肌动蛋白mRNA的3'UTR中的腺苷。通过桑格测序对经编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。
图30.所提供的包括具有经修饰的核苷酸间键联、糖修饰和/或另外的化学部分的寡核苷酸的技术可以提供高活性。将原代人(a；*：未测定)或猴(b)肝细胞用指示的寡核苷酸组合物以指示的浓度进行裸处理。ADAR是内源性的。组合物靶向β-肌动蛋白mRNA的3'UTR中的腺苷。通过桑格测序对经编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。
图31.手性控制可以改善编辑效率。组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用编码ADAR1-p110或-p150的质粒、荧光素酶报告构建体和指示的寡核苷酸组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。尤其是，增加的手性控制的核苷酸间键联(例如，Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联)的数目/水平改善了ADAR1-p110和ADAR1-p150的编辑效率。
图32.手性控制可以改善编辑效率。组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用编码ADAR1-p110或-p150的质粒、荧光素酶报告构建体和指示的寡核苷酸组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。尤其是，增加的手性控制的核苷酸间键联(例如，Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联)的数目/水平改善了ADAR1-p110和ADAR1-p150的编辑效率。
图33.手性控制和经修饰的核苷酸间键联可以改善编辑效率。(a)组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用编码ADAR1-p110的质粒、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。(b)组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用编码ADAR1-p150的质粒、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图34.对包含天然磷酸酯键联的寡核苷酸的评估。在一些实施例中，可根据本披露利用天然磷酸酯键联(例如，数目、水平、位置、与其他结构特征(例如，修饰、模式等)组合等)以提供具有某些活性水平的寡核苷酸组合物。在图34中，可以根据本披露在寡核苷酸中利用天然磷酸酯键联。组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用编码ADAR1-p150或ADAR2的质粒、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图35.可以利用多种糖修饰来提供具有所需活性的寡核苷酸组合物。组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用编码ADAR1-p150或ADAR2的质粒、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图36.可以利用多种糖修饰来提供具有所需活性的寡核苷酸组合物。(a)组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用编码ADAR1-p150或ADAR2的质粒、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。(b)组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用编码ADAR1-p150或ADAR2的质粒、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图37.所提供的技术可以在灵长类动物中提供有效的编辑。向非人类灵长类动物(NHP)给予几种组合物(WV-37314、WV-37315和WV-37330)。组合物都靶向β-肌动蛋白mRNA的3'UTR中的腺苷。向动物每天一次皮下给予指示的组合物(n＝2只动物/组合物)，连续5天(5mg/kg)。最后一剂后两天收集肝活检样品。通过桑格测序来测量对靶的编辑。施用的所有三种组合物在不施用外源性ADAR的情况下提供了显著水平的对ACTB mRNA的体内编辑(25％-50％编辑)。
图38.所提供的技术可以在体内提供持久的编辑活性。在非人类灵长类动物(NHP)中评价了所提供的组合物。示出了肝(a)和肾(b)的某些数据。组合物都靶向β-肌动蛋白mRNA的3'UTR中的腺苷。向动物每天一次皮下给予指示的组合物(n＝2只动物/寡核苷酸)，连续5天(5mg/kg)。最后一剂后2天和最后一剂后45天收集肝活检样品，最后一剂后45天收集肾活检样品。通过桑格测序来测量对靶的编辑。通过杂交ELISA来测量组织中的寡核苷酸。
图39.所提供的技术可以在包括神经元细胞的多种系统中提供有效的编辑。在一些实施例中，分别在人iCell神经元和iCell星形胶质细胞(a)和(b)中评估组合物。组合物都靶向ACTB的3'UTR中的UAG基序并且包含具有相同碱基序列的寡核苷酸。将细胞用指示的组合物以指示的浓度进行裸处理，6天和5天后分别收获RNA。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2-3个生物重复样)。在(c)和(d)中呈现了某些另外的靶的某些初始结果。在人iCell神经元和iCell星形胶质细胞中评估了组合物对6个不同靶点的编辑。每种组合物都靶向指示的转录物中的UAG基序。将细胞用指示的组合物以指示的浓度进行裸处理，6天后收获RNA。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。
图40.经工程化以表达人ADAR1的小鼠与未经如此工程化的小鼠相比可以提供更类似于人类细胞的编辑活性谱。在从人ADAR1转基因小鼠、野生型小鼠和人原代肝细胞收获的原代肝细胞中评价组合物。施用的寡核苷酸包含GalNAc部分。显示了两种不同转录物UGP2(a)和EEF1A1(b)的某些编辑数据。对于每个靶，呈现了来自具有相同碱基序列但具有不同修饰的寡核苷酸的三种组合物的某些数据。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2-3个生物重复样)。经证实，在一些实施例中，根据本披露，手性控制和/或多种修饰可用于有效地改善编辑水平。对于每种类型的细胞，从左到右为：(a)：WV-38701、WV-38700和WV-38702；(b)：WV-38698、WV-38697和WV-38699。
图41.所提供的技术可以在体内提供编辑。呈现了某些体内数据，例如来自人-ADAR1-转基因小鼠的肝的体内数据。用包含GalNAc的寡核苷酸组合物处理动物。包括野生型(WT)小鼠作为对照。显示了两种不同转录物UGP2(a)和EEF1A1(b)上的UAG基序的某些编辑数据。对于每个靶，呈现了来自具有相同序列但具有不同修饰的寡核苷酸的两种组合物的某些数据。在第1、3和5天向每个处理组中的三只动物给予PBS或10mg/kg的指示组合物，并在第8天收集肝活检样品。(n＝3只小鼠/组)。经证实，在一些实施例中，根据本披露，包含不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)的寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物可用于有效地改善编辑水平，包括在体内。
图42.所提供的技术可以在包括中枢神经系统的多种组织中提供体内编辑。在人-ADAR1-转基因小鼠的CNS组织中评价组合物。提供了UGP2(a)和SRSF1(b)转录物的某些编辑数据。通过ICV注射用组合物处理动物。每组五只小鼠在第0天和第2天注射PBS、2×50μg剂量的寡核苷酸组合物，或在第0天注射单次100μg剂量。在第7天对动物进行尸检。收获来自指示组织的RNA，并通过桑格测序对编辑进行测量(n＝5只小鼠/组)。还通过杂交ELISA测量了寡核苷酸在不同脑组织中的分布。尤其是，证实了所提供的寡核苷酸可以被递送至多种组织并在其中提供编辑活性。
图43.使用siRNA减少某些蛋白。显示了在有或没有IFN-a的情况下用指示的siRNA试剂处理的ARPE-19细胞中的ADAR1 p150(上)、ADAR1 p110(中)和粘着斑蛋白负载对照(下)。
图44.在有和没有IFN-a处理的情况下，用siRNA介导的对指示的ADAR的耗竭，用WV-23928或WV-27395观察到的内源性ACTB的某些编辑数据。N≥3，平均值±SEM。****P<0.0001，通过韦尔奇双因素方差分析(Welch's two-way ANOVA)，然后进行双尾事后检验。nd，未检测到；NTC，非靶向对照。
图45.图45.所提供的技术可以提供高度特异性的编辑。(a)在WV-30298样品中检测到的变体的散点图(上)。中靶ACTB编辑和脱靶编辑具有>3的LOD得分和>5％的编辑。由Mutect2计算的LOD得分表示与模拟样品相比，变体存在于经处理的样品中的可能性优势比。对具有最高编辑百分比和最高LOD得分的基因进行标记。所有变体(潜在编辑位点)的重复样的总RNA覆盖度(下)。(b)WV-27458样品中变体的散点图(上)和总RNA覆盖度(下)。
图46.所提供的技术可以提供多重编辑。呈现了原代人肝细胞中的某些数据。(a)在各自20nM的单一(分离的)或多种(多重的)寡核苷酸组合物的存在下，在转染原代人肝细胞后，在指示的转录物上观察到的编辑百分比。(b)在各自1.1μM的单一(分离的)或多种(多重的)GalNAc缀合的寡核苷酸的存在下，在指示的转录物上检测到的编辑百分比。N＝3，平均值±SEM。*P<0.05，***P<0.001，通过双尾韦尔奇t检验。对于每个靶，从左到右为：分离的，多重的。
图47.经工程化以表达人ADAR1的小鼠与未经如此工程化的小鼠相比可以提供更类似于人类细胞的编辑活性谱。在从人ADAR1转基因小鼠、野生型小鼠和人原代肝细胞收获的原代肝细胞中评价组合物。施用的寡核苷酸包含GalNAc部分。显示了两种不同转录物UGP2(a-c)和EEF1A1(d-f)的某些编辑数据。对于每个靶，呈现了来自具有相同碱基序列但具有不同修饰的寡核苷酸的三种组合物的某些数据。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2-3个生物重复样)。经证实，在一些实施例中，根据本披露，手性控制和/或多种修饰可用于有效地改善编辑水平。
图48.所提供的技术提供了在包括CD8+T细胞在内的多种细胞类型中的编辑。图48描绘了通过裸摄取在原代人CD8+T细胞中的编辑。所有寡核苷酸具有相同的序列，并且所有寡核苷酸都靶向ACTB的3'UTR中的UAG基序。如所示预刺激原代T细胞24或96h，然后用指示浓度的寡核苷酸组合物进行裸处理，4天后收获RNA。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。
图49.所提供的技术提供了在包括原代人成纤维细胞在内的多种细胞类型中的编辑。图49描绘了通过裸摄取和转染在原代人成纤维细胞中的某些编辑。寡核苷酸组合物WV-37318靶向ACTB的3'UTR中的UAG基序。如所示通过转染(50nM)或通过裸摄取(10μM)处理三种不同的原代人成纤维细胞系，60小时后收获RNA。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。
图50.所提供的技术提供了在多种细胞类型中的编辑，包括在分离自非人类灵长类动物眼的离体视网膜组织中的编辑。图50描绘了分离自非人类灵长类动物眼的离体视网膜组织中的某些编辑。寡核苷酸组合物靶向ACTB的3'UTR中的UAG基序。在两个独立的实验中，新鲜解剖来自NHP的眼球，并通过裸摄取用寡核苷酸组合物处理视网膜组织。48小时后收获RNA。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝4-5个生物重复样/实验条件)。
图51.所提供的包括多种修饰的技术可以提供编辑。图51((a)-(d))描绘了原代人肝细胞中的某些编辑。寡核苷酸组合物靶向野生型SERPINA1(SA1)转录物的编码序列中的特定腺苷残基(替代位点#1、2、3或4)。经证实，包含多种修饰、序列和/或另外的化学部分的寡核苷酸可以提供所需编辑。用指示的组合物和浓度处理原代人肝细胞。48小时后收获RNA。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。
图52.所提供的包括多种修饰的技术可以提供编辑。图52描绘了原代人肝细胞中的某些编辑。寡核苷酸组合物靶向野生型SERPINA1(SA1)转录物的编码序列中的特定腺苷残基(替代位点#1、2、3或4)。用指示的寡核苷酸组合物和浓度处理原代人肝细胞。48小时后收获RNA。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。
图53.所提供的包括多种修饰的技术可以提供编辑。图53的(a)描绘了在原代人肝细胞中的编辑。寡核苷酸组合物靶向野生型SERPINA1(SA1)转录物的编码序列中的特定腺苷残基(替代位点#1)。
用指示的寡核苷酸组合物和浓度处理原代人肝细胞。48小时后收获RNA。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。图53的(b)描绘了在原代人肝细胞中的编辑。寡核苷酸组合物靶向野生型SERPINA1(SA1)转录物的编码序列中的特定腺苷残基(替代位点#2)。
用指示的寡核苷酸组合物和浓度处理原代人肝细胞。48小时后收获RNA。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。图53的(c)描绘了在原代人肝细胞中的编辑。寡核苷酸组合物靶向野生型SERPINA1(SA1)转录物的编码序列中的特定腺苷残基(替代位点#1或#2)。用指示的寡核苷酸组合物和浓度处理原代人肝细胞。48小时后收获RNA。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。
图54.去除摇摆和/或错配可以改善编辑水平。图54描绘了在原代人和NHP肝细胞中的编辑。寡核苷酸组合物靶向WT SERPINA1(SA1)转录物的编码序列中的特定腺苷残基(替代位点#1或#2)。用指示的寡核苷酸组合物和浓度处理原代人和NHP肝细胞。48小时后收获RNA。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。
图55.所提供的技术可以按不同的浓度在NHP和人类细胞中提供编辑。图55描绘了在原代人和NHP肝细胞中的编辑。寡核苷酸组合物靶向野生型SERPINA1(SA1)转录物的编码序列中的特定腺苷残基(替代位点#1或#2)。两种寡核苷酸组合物均具有针对NHP mRNA序列的G-U摇摆。用指示的寡核苷酸组合物和浓度处理原代人和NHP肝细胞。48小时后收获RNA。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。
图56.所提供的包括多种修饰的技术可以提供编辑。图56描绘了在原代NHP肝细胞中的编辑。寡核苷酸组合物靶向野生型SERPINA1(SA1)转录物的编码序列中的特定腺苷残基(替代位点#2)。用指示的寡核苷酸组合物和浓度处理原代NHP肝细胞。48小时后收获RNA。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。
图57.所提供的包括多种修饰(包括碱基修饰)的技术可以提供编辑。寡核苷酸组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用ADAR-p110或ADAR1-p150、荧光素酶报告构建体和指示的寡核苷酸组合物转染。测量cLuc活性并将其归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图58.所提供的包括多种修饰(包括无碱基单元)的技术可以提供编辑。寡核苷酸组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用ADAR-p110或ADAR1-p150、荧光素酶报告构建体和指示的寡核苷酸组合物转染。测量cLuc活性并将其归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
图59.所提供的包括多种修饰(包括碱基修饰)的技术可以提供编辑。图59描绘了通过在靶点对面的位置处包含经修饰的核碱基的寡核苷酸的组合物进行的编辑。寡核苷酸组合物都靶向SERPINA1(SA1)转录物的PiZ突变。用指示的寡核苷酸组合物转染稳定表达来自慢病毒载体的SA1-PiZ等位基因的ARPE细胞。3天后收集RNA。通过桑格测序对RNA编辑进行定量(n＝2个生物重复样)。
图60.所提供的包括多种类型的核碱基和糖的技术可以提供编辑。寡核苷酸组合物都靶向SERPINA1(SA1)转录物的PiZ突变。将293T细胞用表达SA1-PiZ等位基因、ADAR1-p110或ADAR1-p150的质粒和指示的寡核苷酸组合物转染。48小时后收集RNA。通过桑格测序对RNA编辑进行定量(n＝2个生物重复样)。
图61.所提供的包括多种类型的核碱基和糖的技术可以提供编辑。寡核苷酸组合物都靶向SERPINA1(SA1)转录物的PiZ突变。用指示的寡核苷酸组合物处理从SA1-PiZ小鼠模型新鲜收集的原代肝细胞。48小时后收集RNA。通过桑格测序对RNA编辑进行定量(n＝2个生物重复样)。
图62.所提供的包括多种类型的核碱基和糖的技术可以提供编辑。寡核苷酸组合物都靶向SERPINA1(SA1)转录物的PiZ突变。用指示的寡核苷酸组合物转染稳定表达来自慢病毒载体的SA1-PiZ等位基因的ARPE细胞。3天后收集RNA。通过桑格测序对RNA编辑进行定量(n＝2个生物重复样)。
图63.所提供的包括肌苷的技术可以提供编辑。寡核苷酸组合物都靶向SERPINA1(SA1)转录物的PiZ突变。用指示的寡核苷酸组合物转染稳定表达来自慢病毒载体的SA1-PiZ等位基因的ARPE细胞。3天后收集RNA。通过桑格测序对RNA编辑进行定量(n＝2个生物重复样)。
图64.所提供的在与靶点相反的位点处包括多种核碱基的技术可以提供编辑。图64描绘了对cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子的编辑。
具体实施方式
通过参考某些实施例的以下详细描述，可以更容易地理解本披露的技术。
定义
如本文所用，除非另外指明，否则应当应用下列定义。出于本披露的目的，根据元素周期表(Periodic Table of the Elements),CAS版本,Handbook of Chemistry andPhysics[化学与物理手册],第75版来鉴别化学元素。另外，有机化学的一般原理在“Organic Chemistry[有机化学]”,Thomas Sorrell,University Science Books[大学科学书籍],Sausalito[索萨利托]:1999以及“March's Advanced Organic Chemistry[马奇高级有机化学]”，第5版，编者：Smith,M.B.和March,J.,John Wiley&Sons,New York[纽约约翰威利父子公司]:2001中描述。
如本文在本披露中使用的，除非上下文另有明确说明，否则(i)术语“一个(a)”或“一种(an)”可以理解为是指“至少一个”；(ii)术语“或”可以理解为“和/或”；(iii)术语“含有(comprising)”，“包含(comprise)”，“包括(including)”(无论是否与“不限于”一起使用)和“包括(include)”(无论是否与“不限于”一起使用)可以理解为涵盖逐项列出的组分或步骤，无论是单独显示还是与一个或多个其他组分或步骤一起显示；(iv)术语“另一个”可以理解为是指至少一个另外的/第二的一个或多个；(v)术语“大约”和“约”可以理解为允许标准差，如本领域普通技术人员将理解的那样；和(vi)提供范围的情况下，包括端点。
除非另有说明，否则寡核苷酸及其元件(例如，碱基序列、糖修饰、核苷酸间键联、键联磷立体化学、其模式等)的描述是从5'至3'进行的。如本领域的技术人员将理解，在一些实施例中，寡核苷酸可以作为盐形式，特别是药学上可接受的盐形式(例如，钠盐)提供和/或使用。如本领域技术人员也将理解的，在一些实施例中，组合物中的单一寡核苷酸可被认为具有相同的构成和/或结构，即使在这样的组合物(例如，液体组合物)中，特别地，这样的寡核苷酸在特定时间可能处于不同的一种或多种盐形式(并且例如在液体组合物中时，其可以溶解并且寡核苷酸链可以阴离子形式存在)。例如，本领域技术人员将理解，在给定的pH下，沿着寡核苷酸链的单个核苷酸间键联可以呈酸(H)形式，或呈多种可能的盐形式之一(例如，钠盐或不同阳离子的盐，取决于制备物或组合物中可能存在哪些离子)，并且将会理解，只要它们的酸形式(例如，用H+代替所有阳离子，如果有的话)具有相同的构成和/或结构，这样的单一寡核苷酸可以适当地认为具有相同的构成和/或结构。
脂肪族：如本文所用，“脂肪族”意指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元(但非芳族)的直链(即非支链)或支链的经取代或未取代的烃链，或完全饱和或含有一个或多个不饱和单元(但非芳族)的经取代或未取代的单环、双环或多环烃环，或其组合。在一些实施例中，脂肪族基团含有1-50个脂肪族碳原子。在一些实施例中，脂肪族基团含有1-20个脂肪族碳原子。在其他实施例中，脂肪族基团含有1-10个脂肪族碳原子。在其他实施例中，脂肪族基团含有1-9个脂肪族碳原子。在其他实施例中，脂肪族基团含有1-8个脂肪族碳原子。在其他实施例中，脂肪族基团含有1-7个脂肪族碳原子。在其他实施例中，脂肪族基团含有1-6个脂肪族碳原子。在其他实施例中，脂肪族基团含有1-5个脂肪族碳原子，并且在其他实施例中，脂肪族基团含有1、2、3或4个脂肪族碳原子。合适的脂肪族基团包括但不限于直链或支链的经取代或未取代的烷基、烯基、炔基及其杂合物，诸如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。
烯基：如本文所用，术语“烯基”是指如本文所定义的具有一个或多个双键的脂肪族基团。
烷基：如本文所用，术语“烷基”以其本领域中的一般含义给出，并且可以包括饱和脂肪族基团，包括直链烷基、支链烷基、环烷基(脂环族基)、经烷基取代的环烷基和经环烷基取代的烷基。在一些实施例中，烷基具有1-100个碳原子。在某些实施例中，直链或支链烷基的骨架中具有约1-20个碳原子(例如，直链是C1-C20，支链是C2-C20)，替代性地具有约1-10个碳原子。在一些实施例中，环烷基环在这类环为单环、双环或多环时在其环结构中具有约3-10个碳原子，替代性地在环结构中具有约5、6或7个碳原子。在一些实施例中，烷基可以是低级烷基，其中低级烷基包含1-4个碳原子(例如，直链低级烷基是C1-C4)。
炔基：如本文所用，术语“炔基”是指如本文所定义的具有一个或多个三键的脂肪族基团。
类似物：术语“类似物”包括在结构上与参考化学部分或部分类别不同但能执行这种参考化学部分或部分类别的至少一种功能的任何化学部分。作为非限制性实例，核苷酸类似物在结构上与核苷酸不同，但能执行核苷酸的至少一种功能；核碱基类似物在结构上与核碱基不同，但能执行核碱基的至少一种功能；等等。
动物：如本文中所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的人类。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施例中，非人类动物是哺乳动物(例如，啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施例中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类和/或蠕虫。在一些实施例中，动物可是转基因动物、经基因工程化的动物和/或克隆体。
芳基：如本文所用，单独使用或作为较大部分如“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”的一部分使用的术语“芳基”是指总共具有五个至三十个环成员的单环、双环或多环环系，其中体系中的至少一个环是芳族的。在一些实施例中，芳基为总共具有五个至十四个环成员的单环、双环或多环环系，其中体系中的至少一个环是芳族的，并且其中体系中的各环含有3至7个环成员。在一些实施例中，每个单环单元是芳族的。在一些实施例中，芳基是联芳基。术语“芳基”与术语“芳基环”可互换使用。在本披露的某些实施例中，“芳基”是指包括但不限于苯基、联苯基、萘基、联萘基、蒽基等的芳族环系，其可具有一个或多个取代基。如本文所用，还包括在术语“芳基”的范围内的是其中芳环与一个或多个非芳环稠合的基团，诸如茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘啶基、啡啶基或四氢萘基等。
特征性部分：如本文所用，术语“特征性部分”在最广泛的意义上是指下述物质部分：其存在(或不存在)与该物质的特定特征、属性或活性的存在(或不存在)相关。在一些实施例中，物质的特征性部分是在该物质中和在共享特定特征、属性或活性的相关物质中发现，而未在不共享特定特征、属性或活性的那些物质中发现的部分。在某些实施例中，特征性部分与完整物质共享至少一个功能特性。例如，在一些实施例中，蛋白或多肽的“特征性部分”是含有氨基酸的连续区段或氨基酸的连续区段的集合的部分，这些氨基酸区段一起是蛋白或多肽特有的。在一些实施例中，每个这样的连续区段通常包含至少2、5、10、15、20、50或更多个氨基酸。通常，物质的特征性部分(例如，蛋白、抗体等的特征性部分)是这样的部分，其除了上文指定的序列和/或结构同一性之外，还与相关的完整物质共享至少一种功能特性。在一些实施例中，特征性部分可以是生物活性的。
手性控制：如本文所用，“手性控制”是指控制寡核苷酸内的手性核苷酸间键联中的手性键联磷的立体化学标识。如本文所用，手性核苷酸间键联是其键联磷为手性的核苷酸间键联。在一些实施例中，通过寡核苷酸的糖和碱基部分中不存在的手性元件实现控制，例如，在一些实施例中，通过在寡核苷酸制备期间使用一种或多种手性助剂实现控制，这些手性助剂通常是寡核苷酸制备期间使用的手性亚磷酰胺的一部分。与手性控制形成对比，本领域普通技术人员将认识到，如果使用常规寡核苷酸合成来形成手性核苷酸间键联，则不使用手性助剂的这样的常规寡核苷酸合成不能控制手性核苷酸间键联处的立体化学。在一些实施例中，控制寡核苷酸内每个手性核苷酸间键联中的每个手性键联磷的立体化学标识。
手性控制的寡核苷酸组合物：如本文所用，术语“手性控制的寡核苷酸组合物”、“手性控制的核酸组合物”等是指包含多个寡核苷酸(或核酸)的组合物，该多个寡核苷酸(或核酸)共享共同碱基序列，其中该多个寡核苷酸(或核酸)在一个或多个手性核苷酸间键联(手性控制的或立体限定的核苷酸间键联，其手性键联磷在组合物中呈Rp或Sp(“立体限定的”)，而非如同非手性控制的核苷酸间键联一样的随机Rp和Sp混合物)处共享相同的键联磷立体化学。在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物包含多个寡核苷酸(或核酸)，该多个寡核苷酸(或核酸)共享：1)共同碱基序列，2)共同骨架键联模式，以及3)共同骨架磷修饰模式，其中该多个寡核苷酸(或核酸)在一个或多个手性核苷酸间键联(手性控制的或立体限定的核苷酸间键联，其手性键联磷在组合物中呈Rp或Sp(“立体限定的”)，而非如同非手性控制的核苷酸间键联一样的随机Rp和Sp混合物)处共享相同的键联磷立体化学。与非手性控制的寡核苷酸组合物中的随机水平相比，手性控制的寡核苷酸组合物中该多个寡核苷酸(或核酸)的水平是预定的/控制的或富集的(例如，通过手性控制的寡核苷酸制备以立体选择性地形成一个或多个手性核苷酸间键联)。在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物中的所有寡核苷酸的约1％-100％(例如，约5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％、50％-90％，或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)是该多个寡核苷酸。在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物中共享共同碱基序列、共同骨架键联模式以及共同骨架磷修饰模式的所有寡核苷酸的约1％-100％(例如，约5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％、50％-90％，或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)是该多个寡核苷酸。在一些实施例中，水平为组合物中的所有寡核苷酸的；或组合物中共享共同碱基序列(例如，多个寡核苷酸或一种寡核苷酸类型的碱基序列)的所有寡核苷酸的；或组合物中共享共同碱基序列、共同骨架键联模式以及共同骨架磷修饰模式的所有寡核苷酸的；或组合物中共享共同碱基序列、共同碱基修饰模式、共同糖修饰模式、共同核苷酸间键联类型模式、和/或共同核苷酸间键联修饰模式的所有寡核苷酸的约1％-100％(例如，约5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％、50％-90％，或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)。在一些实施例中，该多个寡核苷酸在约1-50个(例如，约1-10、1-20、5-10、5-20、10-15、10-20、10-25、10-30、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20、或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个)手性核苷酸间键联处共享相同的立体化学。在一些实施例中，该多个寡核苷酸在约1％-100％(例如，约5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％、50％-90％，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，或至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)的手性核苷酸间键联处共享相同的立体化学。在一些实施例中，多个寡核苷酸(或核酸)共享相同的糖和/或核碱基修饰模式。在一些实施例中，多个寡核苷酸(或核酸)是相同寡核苷酸的多种形式(例如，相同寡核苷酸的酸和/或多种盐)。在一些实施例中，多个寡核苷酸(或核酸)具有相同的构成。在一些实施例中，多个寡核苷酸(或核酸)的水平为组合物中的与多个寡核苷酸(或核酸)具有相同构成的所有寡核苷酸(或核酸)的约1％-100％(例如，约5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80-100％、90-100％、95-100％、50％-90％，或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联是手性控制的核苷酸间键联，并且组合物是完全手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，多个寡核苷酸(或核酸)在结构上相同。在一些实施例中，手性控制的核苷酸间键联具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％，典型地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的非对映纯度。在一些实施例中，手性控制的核苷酸间键联链具有至少95％的非对映纯度。在一些实施例中，手性控制的核苷酸间键联链具有至少96％的非对映纯度。在一些实施例中，手性控制的核苷酸间键联链具有至少97％的非对映纯度。在一些实施例中，手性控制的核苷酸间键联链具有至少98％的非对映纯度。在一些实施例中，手性控制的核苷酸间键联链具有至少99％的非对映纯度。在一些实施例中，水平的百分比为或至少为(DS)nc，其中DS为如本披露所述的非对映纯度(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或更高)，并且nc为如本披露所述的手性控制的核苷酸间键联的数目(例如，1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个)。在一些实施例中，水平的百分比为或至少为(DS)nc，其中DS为95％-100％。例如，当DS为99％并且nc为10时，该百分比为或至少为90％((99％)10≈0.90＝90％)。在一些实施例中，组合物中多个寡核苷酸的水平表示为寡核苷酸中每个手性控制的核苷酸间键联链的非对映纯度的乘积。在一些实施例中，连接寡核苷酸(或核酸)中的两个核苷的核苷酸间键联的非对映纯度由连接相同的两个核苷的二聚体的核苷酸间键联的非对映纯度表示，其中使用可比较的条件，在一些情况下，相同的合成循环条件制备二聚体(例如，对于寡核苷酸.......NxNy......中Nx与Ny之间的键联，二聚体是NxNy)。在一些实施例中，不是所有的手性核苷酸间键联都是手性控制的核苷酸间键联，并且组合物是部分地手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，如在立体随机寡核苷酸组合物(例如，如本领域技术人员所理解的，来自传统寡核苷酸合成，例如亚磷酰胺方法)中通常观察到的，非手性控制的核苷酸间键联具有小于约80％、75％、70％、65％、60％、55％或约50％的非对映纯度。在一些实施例中，多个寡核苷酸(或核酸)具有相同的类型。在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物包含非随机水平或控制水平的各个寡核苷酸类型或核酸类型。例如，在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物包含一种且不超过一种寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物包含超过一种寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物包含多种寡核苷酸类型。在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物是一种寡核苷酸类型的寡核苷酸的组合物，该组合物包含非随机水平或控制水平的该寡核苷酸类型的多个寡核苷酸。
可比较的：术语“可比较的”在本文中用于描述两组(或更多组)彼此充分相似的条件或环境，以允许比较所获得的结果或观察到的现象。在一些实施例中，可比较的条件或环境的组的特征在于多个基本相同的特征和一个或少数变化的特征。本领域普通技术人员将理解，当由足够数量和类型的基本相同的特征表征时，条件的组彼此是可比较的，以保证合理的结论，即在不同组的条件或环境下获得的结果或观察到的现象的差异是由那些变化的特征的变化引起或指示的。
环脂肪族：术语“环脂肪族(cycloaliphatic)”、“碳环(carbocycle)”、“碳环基(carbocyclyl)”、“碳环基团(carbocyclic radical)”和“碳环(carbocyclic ring)”可互换使用，并且如本文所用，是指除非另有说明否则具有3至30个环成员的如本文所述的饱和或部分不饱和但非芳族的环状脂肪族单环、双环或多环环系。环脂肪族基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环庚烯基、环辛基、环辛烯基、降莰基、金刚烷基和环辛二烯基。在一些实施例中，环脂肪族基团具有3-6个碳原子。在一些实施例中，环脂肪族基团是饱和的并且是环烷基。术语“环脂肪族”还可包括与一个或多个芳族或非芳族环稠合的脂肪族环，诸如十氢萘基或四氢萘基。在一些实施例中，环脂肪族基团是双环的。在一些实施例中，环脂肪族基团是三环的。在一些实施例中，环脂肪族基团是多环的。在一些实施例中，“环脂肪族”是指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元但非芳族的C3-C6单环烃或C8-C10双环或多环烃，其具有连至分子的其余部分的单一连接点，或是指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元但非芳族的C9-C16多环烃，其具有连至分子的其余部分的单一连接点。
杂脂肪族：如本文所用，术语“杂脂肪族”以它在本领域中的普通含义给出，并且是指其中一个或多个碳原子独立地被一个或多个杂原子(例如，氧、氮、硫、硅、磷等)代替的如本文所述的脂肪族基团。在一些实施例中，选自C、CH、CH2及CH3的一个或多个单元独立地被一个或多个杂原子(包括其经氧化和/或取代形式)代替。在一些实施例中，杂脂肪族基团是杂烷基。在一些实施例中，杂脂肪族基团是杂烯基。
杂烷基：如本文所用，术语“杂烷基”以它在本领域中的普通含义给出，并且是指其中一个或多个碳原子独立地被一个或多个杂原子(例如，氧、氮、硫、硅、磷等)代替的如本文所述的烷基。杂烷基的实例包括但不限于烷氧基、聚(乙二醇)-、经烷基取代的氨基、四氢呋喃基、哌啶基、吗啉基等。
杂芳基：如本文所用，单独使用或作为较大部分例如“杂芳烷基”或“杂芳烷氧基”的一部分使用的术语“杂芳基”和“杂芳-”是指总共具有五个至三十个环成员的单环、双环或多环环系，其中体系中的至少一个环是芳族且至少一个芳环原子为杂原子。在一些实施例中，杂芳基是具有5至10个环原子的基团(即，单环、双环或多环)，在一些实施例中具有5、6、9或10个环原子。在一些实施例中，每个单环单元是芳族的。在一些实施例中，杂芳基具有在环状阵列中共享的6、10或14个π电子；并且除碳原子外，还具有一至五个杂原子。杂芳基包括但不限于噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。在一些实施例中，杂芳基是杂联芳基，诸如联吡啶基等。如本文所用，术语“杂芳基”和“杂芳基-”还包括其中杂芳环与一个或多个芳基环、环脂肪族环或杂环基环稠合的基团，其中附接基团或附接点在杂芳环上。非限制性实例包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基和吡啶并[2,3-b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮。杂芳基可以是单环的、双环的或多环的。术语“杂芳基”可以与术语“杂芳基环”、“杂芳基基团”或“杂芳族基”互换使用，这些术语中的任一者包括任选地经取代的环。术语“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基，其中烷基部分和杂芳基部分独立地任选地经取代。
杂原子：如本文所用，术语“杂原子”意指不是碳或氢的原子。在一些实施例中，杂原子是硼、氧、硫、氮、磷或硅(包括氮、硫、磷或硅的氧化形式；氮(例如，季铵化形式、亚胺基团中的形式等)、磷、硫、氧的带电形式；等等)。在一些实施例中，杂原子是硅、磷、氧、硫或氮。在一些实施例中，杂原子是硅、氧、硫或氮。在一些实施例中，杂原子是氧、硫或氮。
杂环：如本文所用，术语“杂环(heterocycle)”、“杂环基(heterocyclyl)”、“杂环基团(heterocyclic radical)”和“杂环(heterocyclic ring)”如本文所用可互换使用，并且是指饱和或部分不饱和且具有一个或多个杂原子环原子的单环、双环或多环部分(例如，3-30元)。在一些实施例中，杂环基是稳定的5元至7元单环、或7元至10元双环杂环部分，其是饱和或部分不饱和的并且除碳原子外还具有一个或多个、优选地一至四个如上所定义的杂原子。当关于杂环的环原子使用时，术语“氮”包括经取代的氮。作为实例，在具有0-3个选自氧、硫和氮的杂原子的饱和或部分不饱和环中，氮可以是N(诸如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(诸如在吡咯烷基中)或+NR(诸如在经N-取代的吡咯烷基中)。杂环可以在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处与其侧基附接，并且任何环原子可以任选地经取代。此类饱和或部分不饱和的杂环基团的实例包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氧戊环基、二氮杂
Figure BDA0003580200980000301
基、氧氮杂
Figure BDA0003580200980000302
基、硫氮杂
Figure BDA0003580200980000311
基、吗啉基和奎宁环基。术语“杂环(heterocycle)”、“杂环基(heterocyclyl)”、“杂环基环(heterocyclyl ring)”、“杂环基团(heterocyclic group)”、“杂环部分(heterocyclic moiety)”和“杂环基团(heterocyclicradical)”在本文中可互换使用，并且还包括其中杂环基环与一个或多个芳基、杂芳基或环脂肪族环稠合的基团，诸如吲哚啉基、3H-吲哚基、苯并二氢吡喃基、菲啶基或四氢喹啉基。杂环基可以是单环的、双环的或多环的。术语“杂环基烷基”是指被杂环基取代的烷基，其中烷基部分和杂环基部分独立地任选地经取代。
同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如，寡核苷酸、DNA、RNA等)之间和/或多肽分子之间的整体相关性。在一些实施例中，如果聚合分子的序列是至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的，则认为它们彼此“基本上相同”。例如，两个核酸或多肽序列的同一性百分比的计算可以通过为了最佳比较目的而对两个序列进行比对来进行(例如，可以在第一序列和第二序列中的一个或两个中引入缺口以实现最佳比对，并且出于比较目的，可以忽略不相同的序列)。在某些实施例中，为了比较目的而比对的序列的长度为参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少是95％或基本上100％。然后比较相应位置的核苷酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中相应位置相同的残基(例如，核苷酸或氨基酸)占据时，则分子在该位置是相同的。考虑到缺口的数目和每个缺口的长度(这需要引入以实现两个序列的最佳比对)，两个序列之间的同一性百分比为序列共享的相同位置的数目的函数。可以使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的确定。例如，可以使用Meyers和Miller算法(CABIOS[生物科学中的计算机应用],1989,4:11-17)确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比，该算法已被并入ALIGN程序(2.0版)。在一些示例性实施例中，使用ALIGN程序进行的核酸序列比较使用PAM120权重残差表、缺口长度罚分12和缺口罚分4。替代性地，可以使用NWSgapdna.CMP矩阵，使用GCG软件包中的GAP程序确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。
核苷酸间键联：如本文所用，短语“核苷酸间键联”通常是指连接寡核苷酸或核酸的核苷单元的键联。在一些实施例中，核苷酸间键联是磷酸二酯键联，如在天然存在的DNA和RNA分子中广泛发现的(天然磷酸酯键联(-OP(＝O)(OH)O-)，如本领域技术人员所理解的，其可以盐形式存在)。在一些实施例中，核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联(不是天然磷酸酯键联)。在一些实施例中，核苷酸间键联是“经修饰的核苷酸间键联”，其中磷酸二酯键联的至少一个氧原子或-OH被不同的有机或无机部分代替。在一些实施例中，这种有机或无机部分选自＝S、＝Se、＝NR'、-SR'、-SeR'、-N(R')2、B(R')3、-S-、-Se-和-N(R')-，其中每个R'独立地如本披露中所定义和描述。在一些实施例中，核苷酸间键联是磷酸三酯键联、硫代磷酸酯键联(或硫代磷酸酯二酯键联，即-OP(＝O)(SH)O-，如本领域技术人员所理解的，其可以盐形式存在)，或硫代磷酸三酯键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯键联。在一些实施例中，核苷酸间键联是例如PNA(肽核酸)或PMO(二氨基磷酸酯吗啉基寡聚物)键联之一。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联(例如，某些所提供的寡核苷酸中的n001)。本领域普通技术人员理解，由于键联中存在酸或碱部分，核苷酸间键联可以在给定pH下作为阴离子或阳离子存在。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是命名为s、s1、s2、s3、s4、s5、s6、s7、s8、s9、s10、s11、s12、s13、s14、s15、s16、s17和s18的经修饰的核苷酸间键联，如WO 2017/210647中所述。
体外：如本文所用，术语“体外”是指在人造环境中发生的事件，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中等，而不是在生物体(例如，动物、植物和/或微生物)内。
体内：如本文所用，术语“体内”是指在生物体(例如，动物、植物和/或微生物)内发生的事件。
键联磷：如本文所定义，短语“键联磷”用于指示所提及的特定磷原子是存在于核苷酸间键联中的磷原子，该磷原子对应于如天然存在的DNA和RNA中存在的磷酸二酯核苷酸间键联的磷原子。在一些实施例中，键联磷原子位于经修饰的核苷酸间键联中，其中磷酸二酯键联的每个氧原子任选地且独立地被有机或无机部分代替。在一些实施例中，键联磷原子是手性的(例如，如在硫代磷酸酯核苷酸间键联中)。在一些实施例中，键联磷原子是非手性的(例如，如在天然磷酸酯键联中)。
经修饰的核碱基：术语“经修饰的核碱基”、“经修饰的碱基”等是指与核碱基化学上不同但能执行核碱基的至少一种功能的化学部分。在一些实施例中，经修饰的核碱基是包含修饰的核碱基。在一些实施例中，经修饰的核碱基能够具有核碱基的至少一种功能，例如，在能够与包含至少互补碱基序列的核酸进行碱基配对的聚合物中形成部分。在一些实施例中，经修饰的核碱基是经取代的A、T、C、G或U，或A、T、C、G或U的经取代的互变异构体。在一些实施例中，在寡核苷酸的上下文中，经修饰的核碱基是指不是A、T、C、G或U的核碱基。
经修饰的核苷：术语“经修饰的核苷”是指衍生自天然核苷或在化学上类似于天然核苷但包含使其与天然核苷有区别的化学修饰的部分。经修饰的核苷的非限制性实例包括在碱基和/或糖处包含修饰的那些。经修饰的核苷的非限制性实例包括在糖处具有2'修饰的那些。经修饰的核苷的非限制性实例还包括无碱基核苷(其缺乏核碱基)。在一些实施例中，经修饰的核苷能够具有核苷的至少一种功能，例如，在能够与包含至少互补碱基序列的核酸进行碱基配对的聚合物中形成部分。
经修饰的核苷酸：术语“经修饰的核苷酸”包括在结构上与天然核苷酸不同但能执行天然核苷酸的至少一种功能的任何化学部分。在一些实施例中，经修饰的核苷酸包含在糖、碱基和/或核苷酸间键联处的修饰。在一些实施例中，经修饰的核苷酸包含经修饰的糖、经修饰的核碱基、和/或经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸能够具有核苷酸的至少一种功能，例如，在能够与包含至少互补碱基序列的核酸进行碱基配对的聚合物中形成亚基。
经修饰的糖：术语“经修饰的糖”是指可以代替糖的部分。经修饰的糖模仿糖的空间排列、电子特性、或一些其他物理化学特性。在一些实施例中，如本披露中所述，经修饰的糖是经取代的核糖或脱氧核糖。在一些实施例中，经修饰的糖包含2'-修饰。有用的2'-修饰的实例在本领域中被广泛使用并在本文中描述。在一些实施例中，2'-修饰是2'-F。在一些实施例中，2'-修饰是2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-10脂肪族基。在一些实施例中，2'-修饰是2'-OMe。在一些实施例中，2'-修饰是2'-MOE。在一些实施例中，经修饰的糖是双环糖(例如，LNA、BNA等中使用的糖)。在一些实施例中，在寡核苷酸的情况下，经修饰的糖是不是通常在天然RNA或DNA中发现的核糖或脱氧核糖的糖。
核酸：如本文所用，术语“核酸”包括任何核苷酸及其聚合物。如本文所用，术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)或其组合)的聚合形式。这些术语是指分子的一级结构，并且包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。这些术语包括作为等效物的RNA或DNA的类似物，其包含经修饰的核苷酸和/或经修饰的多核苷酸(诸如但不限于甲基化、被保护和/或封端的核苷酸或多核苷酸)。这些术语涵盖多核糖核苷酸或寡核糖核苷酸(RNA)和多脱氧核糖核苷酸或寡脱氧核糖核苷酸(DNA)；衍生自核碱基和/或经修饰的核碱基的N-糖苷或C-糖苷的RNA或DNA；衍生自糖和/或经修饰的糖的核酸；以及衍生自磷酸酯桥和/或经修饰的核苷酸间键联的核酸。该术语涵盖含有核碱基、经修饰的核碱基、糖、经修饰的糖、磷酸酯桥或经修饰的核苷酸间键联的任何组合的核酸。实例包括且不限于含有核糖部分的核酸、含有脱氧核糖部分的核酸、含有核糖部分和脱氧核糖部分的核酸、含有核糖部分和经修饰的核糖部分的核酸。除非另有说明，否则前缀“聚(poly-)”是指含有2至约10,000个核苷酸单体单元的核酸，并且其中前缀“寡(oligo-)”是指含有2至约200个核苷酸单体单元的核酸。
核碱基：术语“核碱基”是指核酸中参与氢键结合的部分，该氢键结合以序列特异性方式将一条核酸链与另一条互补链结合。最常见的天然存在的核碱基是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。在一些实施例中，天然存在的核碱基是经修饰的腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些实施例中，天然存在的核碱基是甲基化的腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些实施例中，核碱基包含杂芳基环，其中环原子是氮，并且当在核苷中时，氮键合到糖部分。在一些实施例中，核碱基包含杂环，其中环原子是氮，并且当在核苷中时，氮键合到糖部分。在一些实施例中，核碱基是“经修饰的核碱基”，即除腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)之外的核碱基。在一些实施例中，经修饰的核碱基是经取代的A、T、C、G或U。在一些实施例中，经修饰的核碱基是A、T、C、G或U的经取代的互变异构体。在一些实施例中，经修饰的核碱基是甲基化的腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些实施例中，经修饰的核碱基模拟核碱基的空间排列、电子特性或一些其他物理化学特性，并保留氢键结合的以序列特异性方式将一条核酸链与另一条核酸链结合的特性。在一些实施例中，经修饰的核碱基可与所有五种天然存在的碱基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、或鸟嘌呤)配对，而基本上不影响解链行为、被细胞内酶识别、或寡核苷酸双链体的活性。如本文所用，术语“核碱基”还涵盖用于代替天然的核苷酸或天然存在的核苷酸的结构类似物，诸如经修饰的核碱基和核碱基类似物。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的A、T、C、G或U，或A、T、C、G或U的任选地经取代的互变异构体。在一些实施例中，“核碱基”是指在寡核苷酸或核酸中的核碱基单元(例如，在寡核苷酸或核酸中的A、T、C、G或U)。
核苷：术语“核苷”是指其中核碱基或经修饰的核碱基与糖或经修饰的糖共价结合的部分。在一些实施例中，核苷是天然核苷，例如腺苷、脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷或脱氧胞苷。在一些实施例中，核苷是经修饰的核苷，例如选自腺苷、脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷和脱氧胞苷的经取代的天然核苷。在一些实施例中，核苷是经修饰的核苷，例如选自腺苷、脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷和脱氧胞苷的天然核苷的经取代的互变异构体。在一些实施例中，“核苷”是指寡核苷酸或核酸中的核苷单元。
核苷酸：如本文所用，术语“核苷酸”是指多核苷酸的单体单元，其由核碱基、糖和一个或多个核苷酸间键联(例如，天然DNA和RNA中的磷酸酯键联)组成。天然存在的碱基[鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)]是嘌呤或嘧啶的衍生物，但应当理解也包括天然存在的和非天然存在的碱基类似物。天然存在的糖是戊糖(五碳糖)，即脱氧核糖(其形成DNA)或核糖(其形成RNA)，但应当理解，也包括天然存在的和非天然存在的糖类似物。将核苷酸经由核苷酸间键联进行连接以形成核酸、或多核苷酸。许多核苷酸间键联是本领域已知的(诸如但不限于磷酸酯、硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯等)。人工核酸包括PNA(肽核酸)、磷酸三酯、硫代磷酸酯、H-膦酸酯、氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯、甲基膦酸酯、膦酰乙酸酯(phosphonoacetate)、硫代膦酰乙酸酯，以及天然核酸的磷酸酯骨架的其他变体，诸如本文所述的那些。在一些实施例中，天然核苷酸包含天然存在的碱基、糖和核苷酸间键联。如本文所用，术语“核苷酸”还涵盖用于代替天然核苷酸或天然存在的核苷酸的结构类似物，诸如经修饰的核苷酸和核苷酸类似物。在一些实施例中，“核苷酸”是指寡核苷酸或核酸中的核苷酸单元。
寡核苷酸：术语“寡核苷酸”是指核苷酸的聚合物或寡聚物，并且可以包含天然和非天然核碱基、糖和核苷酸间键联的任何组合。
寡核苷酸可以是单链或双链的。单链寡核苷酸可以具有双链区域(由单链寡核苷酸的两个部分形成)，并且包含两个寡核苷酸链的双链寡核苷酸可以具有单链区域，例如其中两个寡核苷酸链彼此不互补的区域。示例寡核苷酸包括但不限于结构基因、包含控制区和终止区的基因、自我复制系统(诸如病毒DNA或质粒DNA)、单链和双链RNAi试剂和其他RNA干扰试剂(RNAi试剂或iRNA试剂)、shRNA、反义寡核苷酸、核酶、微RNA、微RNA模拟物、supermir、适体、antimir、antagomir、Ul衔接子、形成三链体的寡核苷酸、G-四链体寡核苷酸、RNA激活子、免疫刺激性寡核苷酸和诱饵寡核苷酸。
本披露的寡核苷酸可以具有多种长度。在特定的实施例中，寡核苷酸的长度可以为约2至约200个核苷。在多个相关实施例中，(单链的、双链的、或三链的)寡核苷酸的长度范围可以从约4至约10个核苷、从约10至约50个核苷、从约20至约50个核苷、从约15至约30个核苷、从约20至约30个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为约9至约39个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少4个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少5个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少6个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少7个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少8个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少9个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少10个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少11个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少12个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少15个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少15个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少16个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少17个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少18个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少19个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少20个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少25个核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少30个核苷。在一些实施例中，在寡核苷酸长度中计数的每个核苷独立地包含核碱基，该核碱基包含具有至少一个氮环原子的环。在一些实施例中，寡核苷酸长度中计数的每个核苷独立地包含A、T、C、G或U，或任选地经取代的A、T、C、G或U，或A、T、C、G或U的任选地经取代的互变异构体。
寡核苷酸类型：如本文所用，短语“寡核苷酸类型”用于定义具有特定碱基序列、骨架键联模式(即，核苷酸间键联类型(例如，磷酸酯、硫代磷酸酯、硫代磷酸三酯等)的模式)、骨架手性中心模式[即，键联磷立体化学模式(Rp/Sp)]以及骨架磷修饰模式的寡核苷酸。在一些实施例中，共同的指定“类型”的寡核苷酸彼此在结构上相同。
本领域技术人员将理解，本披露的合成方法在合成寡核苷酸链期间提供一定程度的控制，使得可以提前设计和/或选择寡核苷酸链的每个核苷酸单元以在键联磷处具有特定的立体化学和/或在键联磷处具有特定的修饰、和/或具有特定的碱基、和/或具有特定的糖。在一些实施例中，提前设计和/或选择寡核苷酸链以在键联磷处具有立体中心的特定组合。在一些实施例中，设计和/或确定寡核苷酸链以在键联磷处具有修饰的特定组合。在一些实施例中，设计和/或选择寡核苷酸链以具有碱基的特定组合。在一些实施例中，设计和/或选择寡核苷酸链以具有一个或多个以上结构特征的特定组合。在一些实施例中，本披露提供了包含多个寡核苷酸分子或由其组成的组合物(例如，手性控制的寡核苷酸组合物)。在一些实施例中，所有此类分子属于同一类型(即，在结构上彼此相同)。然而，在一些实施例中，所提供的组合物包含多个不同类型的寡核苷酸(通常以预定的相对量)。
任选地经取代的：如本文所述，本披露的化合物(例如，寡核苷酸)可以含有任选地经取代的部分和/或经取代的部分。通常，术语“经取代的”，无论前面是否有术语“任选地”，均意指指定部分的一个或多个氢被合适的取代基代替。除非另外指明，否则“任选地经取代的”基团可以在该基团的每个可取代位置处具有合适的取代基，并且当任何给定结构中的超过一个位置可以被选自指定群组的超过一个取代基取代时，在每一位置处的取代基可以相同或不同。在一些实施例中，任选地经取代的基团是未取代的。本披露所设想的取代基的组合优选是导致形成稳定的或化学上可行的化合物的组合。如本文所用，术语“稳定”是指如下化合物，在出于本文所披露的一个或多个目的而经历其制备、检测以及在某些实施例中经历其回收、纯化和使用的条件时，它们基本上不发生改变。某些取代基描述如下。
在可取代原子(例如，合适的碳原子)上的合适的单价取代基独立地是卤素；-(CH2)0-4R°；-(CH2)0-4OR°；-O(CH2)0-4R°、-O-(CH2)0-4C(O)OR°；-(CH2)0-4CH(OR°)2；-(CH2)0- 4Ph，其可经R°取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph，其可经R°取代；-CH＝CHPh，其可经R°取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1-吡啶基，其可经R°取代；-NO2；-CN；-N3；-(CH2)0-4N(R°)2；-(CH2)0-4N(R°)C(O)R°；-N(R°)C(S)R°；-(CH2)0-4N(R°)C(O)NR°2；-N(R°)C(S)NR°2；-(CH2)0-4N(R°)C(O)OR°；-N(R°)N(R°)C(O)R°；-N(R°)N(R°)C(O)NR°2；-N(R°)N(R°)C(O)OR°；-(CH2)0-4C(O)R°；-C(S)R°；-(CH2)0-4C(O)OR°；-(CH2)0-4C(O)SR°；-(CH2)0-4C(O)OSiR°3；-(CH2)0-4OC(O)R°；-OC(O)(CH2)0-4SR°、-SC(S)SR°；-(CH2)0-4SC(O)R°；-(CH2)0-4C(O)NR°2；-C(S)NR°2；-C(S)SR°；-(CH2)0-4OC(O)NR°2；-C(O)N(OR°)R°；-C(O)C(O)R°；-C(O)CH2C(O)R°；-C(NOR°)R°；-(CH2)0- 4SSR°；-(CH2)0-4S(O)2R°；-(CH2)0-4S(O)2OR°；-(CH2)0-4OS(O)2R°；-S(O)2NR°2；-(CH2)0-4S(O)R°；-N(R°)S(O)2NR°2；-N(R°)S(O)2R°；-N(OR°)R°；-C(NH)NR°2；-Si(R°)3；-OSi(R°)3；-B(R°)2；-OB(R°)2；-OB(OR°)2；-P(R°)2；-P(OR°)2；-P(R°)(OR°)；-OP(R°)2；-OP(OR°)2；-OP(R°)(OR°)；-P(O)(R°)2；-P(O)(OR°)2；-OP(O)(R°)2；-OP(O)(OR°)2；-OP(O)(OR°)(SR°)；-SP(O)(R°)2；-SP(O)(OR°)2；-N(R°)P(O)(R°)2；-N(R°)P(O)(OR°)2；-P(R°)2[B(R°)3]；-P(OR°)2[B(R°)3]；-OP(R°)2[B(R°)3]；-OP(OR°)2[B(R°)3]；-(C1-4直链或支链亚烷基)O-N(R°)2；或-(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)O-N(R°)2，其中每个R°可如本文所定义取代且独立地是氢；C1-20脂肪族基；具有1至5个独立地选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子的C1-20杂脂肪族基；-CH2-(C6-14芳基)；-O(CH2)0-1(C6-14芳基)；-CH2-(5元至14元杂芳基环)；具有0至5个独立地选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子的5元至20元单环、双环或多环的饱和环、部分不饱和环或芳基环；或者不管上述定义，两个独立出现的R°与居于它们之间的一个或多个原子合在一起形成具有0至5个独立地选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子的5元至20元单环、双环或多环的饱和环、部分不饱和环或芳基环，其可如下文所定义取代。
R°(或由两个独立出现的R°与居于它们之间的原子共同形成的环)上的适合的单价取代基独立地是卤素、-(CH2)0-2R●、-(卤代R●)、-(CH2)0-2OH、-(CH2)0-2OR●、-(CH2)0-2CH(OR●)2、-O(卤代R●)、-CN、-N3、-(CH2)0-2C(O)R●、-(CH2)0-2C(O)OH、-(CH2)0-2C(O)OR●、-(CH2)0-2SR●、-(CH2)0-2SH、-(CH2)0-2NH2、-(CH2)0-2NHR●、-(CH2)0-2NR● 2、-NO2、-SiR● 3、-OSiR● 3、-C(O)SR●、(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)OR●或-SSR●，其中每个R●是未取代的或在前面有“卤代”的情况下仅被一个或多个卤素取代，并且独立地选自C1-4脂肪族基、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph以及具有0-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环。在R°的饱和碳原子上的合适的二价取代基包括＝O及＝S。
例如在合适的碳原子上的合适的二价取代基独立地是以下这些：＝O、＝S、＝NNR* 2、＝NNHC(O)R*、＝NNHC(O)OR*、＝NNHS(O)2R*、＝NR*、＝NOR*、-O(C(R* 2))2-3O-或-S(C(R* 2))2-3S-，其中每个独立出现的R*选自氢、可以如下文所定义地被取代的C1-6脂肪族，以及具有0-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的未取代的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环。与“任选地经取代的”基团的邻位可取代碳结合的合适的二价取代基包括：-O(CR* 2)2- 3O-，其中每个独立出现的R*选自氢、可以如下文所定义地被取代的C1-6脂肪族，以及具有0-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的未取代的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环。
R*的脂肪族基团上的合适的取代基独立地是卤素、-R●、-(卤代R●)、-OH、-OR●、-O(卤代R●)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR●、-NH2、-NHR●、-NR● 2、或-NO2，其中每个R●是未取代的或在前面有“卤代”的情况下仅被一个或多个卤素取代，并且独立地是C1-4脂肪族基团、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph或具有0至4个独立地选自氮、氧及硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环。
在一些实施例中，可取代氮上的合适取代基独立地是
Figure BDA0003580200980000391
Figure BDA0003580200980000392
Figure BDA0003580200980000393
或
Figure BDA0003580200980000396
其中每个
Figure BDA0003580200980000394
独立地是氢，可按以下定义经取代的C1-6脂肪族基，未取代的-OPh或具有0-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环，或尽管有上述定义，但两个独立出现的
Figure BDA0003580200980000395
与居于它们之间的一个或多个原子合在一起形成未取代的具有0-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3-12元饱和的、部分不饱和的或芳基的单环或双环。
Figure BDA0003580200980000401
的脂肪族基团上的合适的取代基独立地是卤素、-R●、-(卤代R●)、-OH、-OR●、-O(卤代R●)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR●、-NH2、-NHR●、-NR● 2、或-NO2，其中每个R●是未取代的或在前面有“卤代”的情况下仅被一个或多个卤素取代，并且独立地是C1-4脂肪族基团、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph或具有0至4个独立地选自氮、氧及硫的杂原子的5-6元饱和环、部分不饱和环或芳基环。
P-修饰：如本文所用，术语“P-修饰”是指在键联磷处除立体化学修饰以外的任何修饰。在一些实施例中，P-修饰包含添加、取代或移除与键联磷共价附接的侧基部分。
部分不饱和的：如本文使用的，术语“部分不饱和的”是指包括至少一个双键或三键的环部分。术语“部分不饱和的”意在涵盖具有多个不饱和的位点的环，但是如在此定义的不意在包括芳基或杂芳基部分。
药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”是指与一种或多种药学上可接受的载剂一起配制的活性剂。在一些实施例中，活性剂以适合于在治疗方案中施用的单位剂量存在，其显示当施用于相关群体时实现预定的治疗效果的统计学显著概率。在一些实施例中，药物组合物能以固体或液体形式被特别配制以进行施用，包括适用于以下的那些：口服施用，例如，浸液(drench)(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如，针对口腔、舌下和全身吸收的那些)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂(应用于舌)；肠胃外施用，例如，作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放的配制品通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射；局部应用，例如，作为乳膏剂、软膏剂、或控制释放贴剂或喷雾剂应用于皮肤、肺或口腔；阴道内或直肠内，例如作为阴道栓剂、乳膏剂或泡沫剂；舌下；眼部；透皮；或经鼻、肺以及应用于其他粘膜表面。
药学上可接受的：如本文所用，短语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内适合于与人类和动物的组织接触使用而无过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
药学上可接受的载剂：如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料，其涉及将主题化合物从一个器官(或身体的一部分)携带或运输到另一个器官或身体的一部分。在与配制品的其他成分相容并且对患者无害的意义上，每种载剂必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载剂的材料的一些实例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及在药物配制品中采用的其他无毒相容的物质。
药学上可接受的盐：如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指适合于在制药环境中使用的此类化合物的盐，即，在合理医学判断的范围内，适合于与人类和低等动物的组织接触使用而无不当毒性、刺激、过敏反应等并且与合理的效益/风险比相称的盐。药学上可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences[药物科学杂志],66:1-19(1977)中详细地描述了药学上可接受的盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐包括但不限于无毒的酸加成盐，其是使用无机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸或使用有机酸诸如乙酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸或通过使用本领域中所使用的其他方法诸如离子交换形成的具有氨基的盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐包括但不限于己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、氢碘化物、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐(lactobionate)、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。在一些实施例中，所提供的化合物(例如，寡核苷酸)包含一个或多个酸性基团，并且药学上可接受的盐是碱金属盐、碱土金属盐或铵盐(例如，N(R)3的铵盐，其中每个R在本披露中被独立地定义和描述)。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。在一些实施例中，药学上可接受的盐是钠盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是钾盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是钙盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐适当地包括使用平衡离子(诸如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、具有从1至6个碳原子的烷基、磺酸根以及芳基磺酸根)形成的无毒铵、季铵以及胺阳离子。在一些实施例中，所提供的化合物包含多于一个酸性基团，例如，寡核苷酸可以包含两个或更多个酸性基团(例如，天然磷酸酯键联和/或经修饰的核苷酸间键联)。在一些实施例中，这种化合物的药学上可接受的盐(或者通常，盐)包含两个或更多个阳离子，该两个或更多个阳离子可以是相同的或不同的。在一些实施例中，在药学上可接受的盐(或一般地说，盐)中，酸性基团中的所有可电离的氢(例如，在具有不超过约11、10、9、8、7、6、5、4、3或2；在一些实施例中，不超过约7；在一些实施例中，不超过约6；在一些实施例中，不超过约5；在一些实施例中，不超过约4；在一些实施例中，不超过约3的pKa的水溶液中)被阳离子置换。在一些实施例中，每个硫代磷酸酯和磷酸酯基团独立地以其盐形式存在(例如，如果是钠盐，则分别是-O-P(O)(SNa)-O-和-O-P(O)(ONa)-O-)。在一些实施例中，每个硫代磷酸酯和磷酸酯核苷酸间键联独立地以其盐形式存在(例如，如果是钠盐，则分别是-O-P(O)(SNa)-O-和-O-P(O)(ONa)-O-)。在一些实施例中，药学上可接受的盐是寡核苷酸的钠盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是寡核苷酸的钠盐，其中每个酸性磷酸酯和经修饰的磷酸酯基团(例如，硫代磷酸酯，磷酸酯等)(如果有的话)以盐形式存在(所有均以钠盐)。
预定的：“预定的”意指有意选择的或非随机的或控制的，例如与随机出现、随机或在无控制的情况下达成相反。阅读本说明书的本领域普通技术人员将理解，本披露提供了以下技术，这些技术允许对将并入寡核苷酸组合物中的特定化学特征和/或立体化学特征进行选择且进一步允许具有这类化学特征和/或立体化学特征的寡核苷酸组合物的控制制备。此类所提供的组合物是如本文所述的“预定的”。因为某些寡核苷酸通过不进行控制以有意产生特定化学特征和/或立体化学特征的过程而偶然产生，所以可能含有这些寡核苷酸的组合物不是“预定的”组合物。在一些实施例中，预定的组合物是可有意地复制(例如，通过对经控制的过程的重复)的组合物。在一些实施例中，组合物中多个寡核苷酸的预定水平意指组合物中该多个寡核苷酸的绝对量和/或相对量(比率、百分比等)是经控制的。在一些实施例中，组合物中多个寡核苷酸的预定水平通过手性控制的寡核苷酸制备而获得。
保护基：如本文所用，术语“保护基”是本领域熟知的并且包括在ProtectingGroups in Organic Synthesis[有机合成中的保护基]T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第3版,John Wiley&Sons[约翰威利父子公司],1999(其全部内容通过援引并入本文)中详细描述的那些。还包括那些特别适用于核苷和核苷酸化学的保护基，这些保护基在由SergeL.Beaucage等人在2012年6月编辑的Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry[核酸化学实验室指南]中描述，将章节2的全部内容通过援引并入本文。合适的氨基保护基包括氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、氨基甲酸9-芴基甲酯(Fmoc)、氨基甲酸9-(2-磺基)芴基甲酯、氨基甲酸9-(2,7-二溴)芴基甲酯、氨基甲酸2,7-二叔丁酯-[9-(10,10-二氧代-10,10,10,10-四氢噻吨基)]甲酯(DBD-Tmoc)、氨基甲酸4-甲氧基苯甲酰甲酯(Phenoc)、氨基甲酸2,2,2-三氯乙酯(Troc)、氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基乙酯(Teoc)、氨基甲酸2-苯基乙酯(hZ)、氨基甲酸1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙酯(Adpoc)、氨基甲酸1,1-二甲基-2-卤代乙酯、氨基甲酸1,1-二甲基-2,2-二溴乙酯(DB-t-BOC)、氨基甲酸1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙酯(TCBOC)、氨基甲酸1-甲基-1-(4-联苯基)乙酯(Bpoc)、氨基甲酸1-(3,5-二叔丁基苯基)-1-甲基乙酯(t-Bumeoc)、氨基甲酸2-(2'-和4'-吡啶基)乙酯(Pyoc)、氨基甲酸2-(N,N-二环己基甲酰胺基)乙酯、氨基甲酸叔丁酯(BOC)、氨基甲酸1-金刚烷基酯(Adoc)、氨基甲酸乙烯基酯(Voc)、氨基甲酸烯丙基酯(Alloc)、氨基甲酸1-异丙基烯丙基酯(Ipaoc)、氨基甲酸肉桂基酯(Coc)、氨基甲酸4-硝基肉桂基酯(Noc)、氨基甲酸8-喹啉基酯、氨基甲酸N-羟基哌啶基酯、氨基甲酸烷基二硫酯、氨基甲酸苄基酯(Cbz)、氨基甲酸对甲氧基苄基酯(Moz)、氨基甲酸对硝基苄基酯、氨基甲酸对溴苄基酯、氨基甲酸对氯苄基酯、氨基甲酸2,4-二氯苄基酯、氨基甲酸4-甲基亚磺酰基苄基酯(Msz)、氨基甲酸9-蒽基甲基酯、氨基甲酸二苯基甲基酯、氨基甲酸2-甲基硫代乙基酯、氨基甲酸2-甲基磺酰基乙基酯、氨基甲酸2-(对甲苯磺酰基)乙基酯、氨基甲酸[2-(1,3-二噻烷基)]甲基酯(Dmoc)、氨基甲酸4-甲基苯硫基酯(Mtpc)、氨基甲酸2,4-二甲基苯硫基酯(Bmpc)、氨基甲酸2-膦酰基乙酯(Peoc)、氨基甲酸2-三苯基膦酰异丙酯(Ppoc)、氨基甲酸1,1-二甲基-2-氰乙基酯、氨基甲酸间氯对酰氧基苄基酯、氨基甲酸对(二羟基硼基)苄基酯、氨基甲酸5-苯并异噁唑基甲基酯、氨基甲酸2-(三氟甲基)-6-色酮基甲基酯(Tcroc)、氨基甲酸间硝基苯基酯、氨基甲酸3,5-二甲氧基苄基酯、氨基甲酸邻硝基苄基酯、氨基甲酸3,4-二甲氧基-6-硝基苄基酯、氨基甲酸苯基(邻硝基苯基)甲基酯、吩噻嗪基-(10)-羰基衍生物、N'-对甲苯磺酰基氨基羰基衍生物、N'-苯基氨基硫代羰基衍生物、氨基甲酸叔戊酯、硫代氨基甲酸S-苄基酯、氨基甲酸对氰基苄基酯、氨基甲酸环丁基酯、氨基甲酸环己基酯、氨基甲酸环戊基酯、氨基甲酸环丙基甲基酯、氨基甲酸对癸氧基苄基酯、氨基甲酸2,2-二甲氧基羰基乙烯基酯、氨基甲酸邻-(N,N-二甲基甲酰胺基)苄基酯、氨基甲酸1,1-二甲基-3-(N,N-二甲基甲酰胺基)丙基酯、氨基甲酸1,1-二甲基丙炔基酯、氨基甲酸二(2-吡啶基)甲基酯、氨基甲酸2-呋喃基甲基酯、氨基甲酸2-碘乙基酯、氨基甲酸异冰片基酯、氨基甲酸异丁基酯、氨基甲酸异烟酯、氨基甲酸对(对'-甲氧基苯基偶氮)苄基酯、氨基甲酸1-甲基环丁基酯、氨基甲酸1-甲基环己基酯、氨基甲酸1-甲基-1-环丙基甲基酯、氨基甲酸1-甲基-1-(3,5-二甲氧基苯基)乙基酯、氨基甲酸1-甲基-1-(对苯基偶氮基苯基)乙基酯、氨基甲酸1-甲基-1-苯基乙基酯、氨基甲酸1-甲基-1-(4-吡啶基)乙基酯、氨基甲酸苯基酯、氨基甲酸对(苯偶氮基)苄基酯、氨基甲酸2,4,6-三叔丁基苯基酯、氨基甲酸4-(三甲基铵)苄基酯、氨基甲酸2,4,6-三甲基苄基酯、甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯乙酰胺、3-苯基丙酰胺、吡啶酰胺、3-吡啶基甲酰胺、N-苯甲酰基苯基丙氨酰基衍生物、苯甲酰胺、对苯基苯甲酰胺、邻硝基苯基乙酰胺、邻硝基苯氧基乙酰胺、乙酰乙酰胺、(N'-二硫代苄氧基羰基氨基)乙酰胺、3-(对羟基苯基)丙酰胺、3-(邻硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻硝基苯氧基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻苯基偶氮基苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、邻硝基肉桂酰胺、N-乙酰基蛋氨酸衍生物、邻硝基苯甲酰胺、邻(苯甲酰基氧基甲基)苯甲酰胺、4,5-二苯基-3-噁唑啉-2-酮、N-邻苯二甲酰亚胺、N-二噻丁二酰亚胺(Dts)、N-2,3-二苯基马来酰亚胺、N-2,5-二甲基吡咯、N-1,1,4,4-四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烷加合物(STABASE)、5-取代的1,3-二甲基-1,3,5-三氮杂环己-2-酮、5-取代的1,3-二苄基-1,3,5-三氮杂环己-2-酮、1-取代的3,5-二硝基-4-吡啶酮、N-甲胺、N-烯丙胺、N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲胺(SEM)、N-3-乙酰氧基丙胺、N-(1-异丙基-4-硝基-2-氧代-3-吡咯啉-3-基)胺、季铵盐、N-苄基胺、N-二(4-甲氧基苯基)甲胺、N-5-二苯并环庚胺、N-三苯基甲胺(Tr)、N-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]胺(MMTr)、N-9-苯基芴基胺(PhF)、N-2,7-二氯-9-芴基亚甲胺、N-二茂铁基甲基氨基(Fcm)、N-2-吡啶甲基氨基N'-氧化物、N-1,1-二甲基硫代亚甲基胺、N-亚苄基胺、N-对甲氧基亚苄基胺、N-二苯基亚甲基胺、N-[(2-吡啶基)均三甲苯基]亚甲基胺、N-(N'，N'-二甲氨基亚甲基)胺、N,N'-异亚丙基二胺、N-对硝基亚苄基胺、N-亚水杨基胺、N-5-氯亚水杨基胺、N-(5-氯-2-羟基苯基)苯亚甲基胺、N-环亚己基胺、N-(5,5-二甲基-3-氧代-1-环己烯基)胺、N-硼烷衍生物、N-二苯基硼酸衍生物、N-[苯基(五羰基铬-或钨)羰基]胺、N-铜螯合物、N-锌螯合物、N-硝基胺、N-亚硝基胺、胺N-氧化物、二苯基膦酰胺(dpp)、二甲基硫代膦酰胺(Mpt)、二苯基硫代膦酰胺(Ppt)、二烷基氨基磷酸酯、二苄基氨基磷酸酯、二苯基氨基磷酸酯、苯亚磺酰胺、邻硝基苯亚磺酰胺(Nps)、2,4-二硝基苯亚磺酰胺、五氯苯亚磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯亚磺酰胺、三苯基甲基亚磺酰胺、3-硝基吡啶亚磺酰胺(Npys)、对甲苯磺酰胺(Ts)、苯磺酰胺、2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mtr)、2,4,6-三甲氧基苯磺酰胺(Mtb)、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Pme)、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mte)、4-甲氧基苯磺酰胺(Mbs)、2,4,6-三甲基苯磺酰胺(Mts)、2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰胺(iMds)、2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰胺(Pmc)、甲磺酰胺(Ms)、β-三甲基甲硅烷基乙磺酰胺(SES)、9-蒽磺酰胺、4-(4',8'-二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺(DNMBS)、苄基磺酰胺、三氟甲基磺酰胺和苯甲酰甲基磺酰胺。
被适当保护的羧酸进一步包括但不限于甲硅烷基保护的、烷基保护的、烯基保护的、芳基保护的和芳基烷基保护的羧酸。合适的甲硅烷基的实例包括三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基联苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基等。合适的烷基的实例包括甲基、苄基、对甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、三苯甲基、叔丁基、四氢吡喃-2-基。合适的烯基的实例包括烯丙基。合适的芳基的实例包括任选地经取代的苯基、联苯基、或萘基。合适的芳基烷基的实例包括任选地经取代的苄基(例如，对甲氧基苄基(MPM)、3,4-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基、2,6-二氯苄基、对氰基苄基)，以及2-吡啶甲基和4-吡啶甲基。
合适的羟基保护基包括甲基、甲氧基甲基(MOM)、甲基硫代甲基(MTM)、叔丁基硫代甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苄氧基甲基(BOM)、对甲氧基苄氧基甲基(PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(对-AOM)、愈创木酚甲基(GUM)、叔丁氧基甲基、4-戊烯基氧基甲基(POM)、甲硅烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2,2,2-三氯乙氧基甲基、二(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEMOR)、四氢吡喃基(THP)、3-溴四氢吡喃基、四氢噻喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基(MTHP)、4-甲氧基四氢噻喃基、4-甲氧基四氢噻喃基S,S-二氧化物、1-[(2-氯代-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(CTMP)、1,4-二噁烷-2-基、四氢呋喃基、四氢噻吩基(tetrahydrothiofuranyl)、2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氢-7,8,8-三甲基-4,7-桥亚甲基苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(苯基氢硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、对甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基、2,6-二氯苄基、对氰基苄基、对苯基苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基N-氧化基、二苯基甲基、p,p'-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4-(4'-溴苯酰基氧基苯基)二苯基甲基、4,4',4”-三(4,5-二氯邻苯二甲酰亚胺基苯基)甲基、4,4',4”-三(乙酰丙酰基氧基苯基)甲基、4,4',4”-三(苯甲酰基氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)二(4',4”-二甲氧基苯基)甲基、1,1-二(4-甲氧基苯基)-1'-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)吨基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1,3-苯并二硫烷-2-基、苯并异噻唑基S,S-二氧化基、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、二甲基异丙基甲硅烷基(IPDMS)、二乙基异丙基甲硅烷基(DEIPS)、二甲基叔己基(thexyl)甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三苄基甲硅烷基、三对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基(DPMS)、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基(TBMPS)、甲酸酯、苯甲酰甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4,4-(亚乙基二硫代)戊酸酯(乙酰丙酰基二硫代乙缩醛)、新戊酸酯、金刚酸酯(adamantoate)、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯(菜酸酯(mesitoate))、烷基甲基碳酸酯、9-芴基甲基碳酸酯(Fmoc)、烷基乙基碳酸酯、烷基2,2,2-三氯乙基碳酸酯(Troc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯(TMSEC)、2-(苯基磺酰基)乙基碳酸酯(Psec)、2-(三苯基磷鎓基)乙基碳酸酯(Peoc)、烷基异丁基碳酸酯、烷基乙烯基碳酸酯、烷基烯丙基碳酸酯、烷基对硝基苯基碳酸酯、烷基苄基碳酸酯、烷基对甲氧基苄基碳酸酯、烷基3,4-二甲氧基苄基碳酸酯、烷基邻硝基苄基碳酸酯、烷基对硝基苄基碳酸酯、烷基S-苄基硫代碳酸酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯、二硫代碳酸甲酯、2-碘苯甲酸酯、4-叠氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、邻-(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲酰基苯磺酸酯、2-(甲硫基甲氧基)乙基、4-(甲硫基甲氧基)丁酸酯、2-(甲硫基甲氧基甲基)苯甲酸酯、2,6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2,6-二氯-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2,4-二(1,1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、异丁酸酯、单琥珀酸酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、对-(甲氧基羰基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、烷基N,N,N',N'-四甲基二氨基磷酸酯、烷基N-苯基氨基甲酸酯、硼酸酯、二甲基硫膦基、烷基2,4-二硝基苯基次磺酸酯、硫酸酯、甲磺酸酯(methanesulfonate、mesylate)、苄基磺酸酯以及甲苯磺酸酯(Ts)。为了保护1,2-二醇或1,3-二醇，保护基包括亚甲基缩醛、亚乙基缩醛、1-叔丁基亚乙基缩酮、1-苯基亚乙基缩酮、(4-甲氧基苯基)亚乙基缩醛、2,2,2-三氯亚乙基缩醛、缩丙酮、亚环戊基缩酮、亚环己基缩酮、亚环庚基缩酮、亚苄基缩醛、对-甲氧基亚苄基缩醛、2,4-二甲氧基亚苄基缩酮、3,4-二甲氧基亚苄基缩醛、2-硝基亚苄基缩醛、甲氧基亚甲基缩醛、乙氧基亚甲基缩醛、二甲氧基亚甲基原酸酯、1-甲氧基亚乙基原酸酯、1-乙氧基亚乙基原酸酯、1,2-二甲氧基亚乙基原酸酯、α-甲氧基亚苄基原酸酯、1-(N,N-二甲基氨基)亚乙基衍生物、α-(N,N'-二甲基氨基)亚苄基衍生物、2-氧杂亚环戊基原酸酯、二-叔丁基亚甲硅烷基(DTBS)、1,3-(1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷亚基)衍生物(TIPDS)、四-叔丁氧基二硅氧烷-1,3-二亚基衍生物(TBDS)、碳酸酯、环硼酸酯、乙基硼酸酯和苯基硼酸酯。
在一些实施例中，羟基保护基是乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、对氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、2,6-二氯苄基、联苯基甲基、对硝基苄基、三苯基甲基(三苯甲基)、4,4'-二甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基联苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、9-芴基甲基碳酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基(MMTr)、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr)和4,4',4”-三甲氧基三苯甲基(TMTr)、2-氰基乙基(CE或Cne)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基(TSE)、2-(2-硝基苯基)乙基、2-(4-氰基苯基)乙基、2-(4-硝基苯基)乙基(NPE)、2-(4-硝基苯基磺酰基)乙基、3,5-二氯苯基、2,4-二甲基苯基、2-硝基苯基、4-硝基苯基、2,4,6-三甲基苯基、2-(2-硝基苯基)乙基、丁基硫代羰基、4,4',4”-三(苯甲酰基氧基)三苯甲基、联苯基氨基甲酰基、乙酰丙酰基、2-(二溴甲基)苯甲酰基(Dbmb)、2-(异丙基硫代甲氧基甲基)苯甲酰基(Ptmt)、9-苯基氧杂蒽-9-基(苯基呫吨基(pixyl))或9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。在一些实施例中，每个羟基保护基独立地选自乙酰基、苄基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基联苯基甲硅烷基和4,4'-二甲氧基三苯甲基。在一些实施例中，羟基保护基选自下组，该组由以下组成：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基和4,4'-二甲氧基三苯甲基。在一些实施例中，磷键联保护基是在整个寡核苷酸合成中与磷键联(例如，核苷酸间键联)附接的基团。在一些实施例中，保护基与硫代磷酸酯基团的硫原子附接。在一些实施例中，保护基与核苷酸间硫代磷酸酯键联的氧原子附接。在一些实施例中，保护基与核苷酸间磷酸酯键联的氧原子附接。在一些实施例中，保护基是2-氰基乙基(CE或Cne)、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-硝基乙基、2-磺酰基乙基、甲基、苄基、邻硝基苄基、2-(对硝基苯基)乙基(NPE或Npe)、2-苯基乙基、3-(N-叔丁基甲酰胺基)-1-丙基、4-氧代戊基、4-甲硫基-l-丁基、2-氰基-1,1-二甲基乙基、4-N-甲基氨基丁基、3-(2-吡啶基)-1-丙基、2-[N-甲基-N-(2-吡啶基)]氨基乙基、2-(N-甲酰基,N-甲基)氨基乙基、或4-[N-甲基-N-(2,2,2-三氟乙酰基)氨基]丁基。
受试者：如本文所用，术语“受试者”或“测试受试者”是指任何生物体，根据本披露向该生物体施用化合物(例如，寡核苷酸)或组合物，例如用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。通常的受试者包括动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物和人；昆虫；蠕虫；等等)和植物。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者可能患有和/或易患疾病、障碍和/或病症。
基本上：如在此所使用，术语“基本上”是指展示出一个所感兴趣的特征或特性的总体的或接近总体的范围或程度的定性的状态。与第二序列基本上相同或互补的碱基序列与第二序列不完全相同或互补，但与第二序列大部分或几乎相同或互补。在一些实施例中，具有与另一寡核苷酸或核酸基本上互补的序列的寡核苷酸以与具有完全互补序列的寡核苷酸类似的方式与该寡核苷酸或核酸形成双链体。此外，生物和/或化学领域的普通技术人员应当理解的是生物学和化学现象(如果有的话)很少会达到完成和/或进行到完成或实现或避免绝对的结果。因此，术语“基本上”被用在此处用来获得在许多生物学和/或化学现象中潜在地缺少的内在的完全性。
糖：术语“糖”是指呈封闭和/或开放形式的单糖或多糖。在一些实施例中，糖是单糖。在一些实施例中，糖是多糖。糖包括但不限于核糖、脱氧核糖、戊呋喃糖、戊吡喃糖和己吡喃糖部分。如本文所用，术语“糖”还涵盖用于代替常规糖分子的结构类似物，诸如二醇、形成核酸类似物的骨架的聚合物、二醇核酸(“GNA”)等。如本文所用，术语“糖”还涵盖用于代替天然核苷酸或天然存在的核苷酸的结构类似物，诸如经修饰的糖和核苷酸糖。在一些实施例中，糖是RNA或DNA糖(核糖或脱氧核糖)。在一些实施例中，糖是经修饰的核糖或脱氧核糖，例如2'-修饰的、5'-修饰的等。如本文所述，在一些实施例中，当用于寡核苷酸和/或核酸时，经修饰的糖可以提供一种或多种所需的特性、活性等。在一些实施例中，糖是任选地经取代的核糖或脱氧核糖。在一些实施例中，“糖”是指寡核苷酸或核酸中的糖单元。
易患：“易患”疾病、障碍和/或病症的个体是比一般公众成员具有更高的发展疾病、障碍和/或病症的风险的个体。在一些实施例中，易患疾病、障碍和/或病症的个体有患该疾病、障碍和/或病症的倾向。在一些实施例中，易患疾病、障碍和/或病症的个体可以未被诊断出患有该疾病、障碍和/或病症。在一些实施例中，易患疾病、障碍和/或病症的个体可以表现出该疾病、障碍和/或病症的症状。在一些实施例中，易患疾病、障碍和/或病症的个体可以不表现出该疾病、障碍和/或病症的症状。在一些实施例中，易患疾病、障碍和/或病症的个体将会发展出该疾病、障碍和/或病症。在一些实施例中，易患疾病、障碍和/或病症的个体将不会发展出该疾病、障碍和/或病症。
治疗剂：如本文所用，术语“治疗剂”通常是指当施用于受试者时引起期望的作用(例如，期望的生物学、临床或药理作用)的任何药剂。在一些实施例中，如果药剂在整个合适群体中表现出统计学上显著的作用，则认为该药剂是治疗剂。在一些实施例中，合适的人群是患有和/或易患疾病、障碍或病症的受试者的群体。在一些实施例中，合适的群体是模型生物的群体。在一些实施例中，可以通过一项或多项标准来定义合适的群体，这些标准诸如为年龄组、性别、遗传背景、在接受疗法之前预先存在的临床病症。在一些实施例中，当以有效量向受试者施用时，治疗剂是减轻以下，改善以下，缓解以下，抑制以下，预防以下，延迟以下的发作，降低以下的严重性和/或降低以下的发生率的物质：受试者中的疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征。在一些实施例中，“治疗剂”是在可以被销售施用于人之前已经或需要被政府机构批准的药剂。在一些实施例中，“治疗剂”是需要药物处方才能施用于人的药剂。在一些实施例中，治疗剂是所提供的化合物，例如所提供的寡核苷酸。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”意指当作为治疗方案的一部分施用时引发所希望的生物反应的物质(例如，治疗剂、组合物和/或配制品)的量。在一些实施例中，物质的治疗有效量是当施用于患有或易患疾病、障碍和/或病症的受试者时，足以治疗、诊断、预防、和/或延迟疾病、障碍和/或病症的发作的量。如本领域的普通技术人员将理解，物质的有效量可取决于以下这类因素变化：如所希望的生物学终点、待递送的物质、靶细胞或组织等。例如，用于治疗疾病、障碍和/或病症的配制品中化合物的有效量是缓解、改善、减轻、抑制、预防、延迟疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征的发作，降低疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征的严重程度，和/或降低疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征的发病率的量。在一些实施例中，以单个剂量施用治疗有效量；在一些实施例中，需要多个单位剂量来递送治疗有效量。
治疗：如本文所用，术语“治疗(treat、treatment、或treating)”是指用于部分地或完全缓解、改善、减轻、抑制、预防、延迟疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征的发作，降低疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征的严重程度，和/或降低疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征的发生率的任何方法。治疗可以施用于未表现出疾病、障碍和/或病症的迹象的受试者。在一些实施例中，治疗可以施用给仅表现出疾病、障碍和/或病症的早期迹象的受试者，例如出于降低与疾病、障碍和/或病症相关联的病理学风险的目的。
不饱和的：如本文所用，术语“不饱和的”意指具有一个或多个不饱和单元的部分。
野生型：如本文所用，术语“野生型”具有其本领域理解的含义，其是指具有如在“正常”(与突变体、患病、改变等对比)状态或背景中在自然界中发现的结构和/或活性的实体。本领域普通技术人员将理解，野生型基因和多肽通常以多种不同形式(例如，等位基因)存在。
如本领域技术人员将理解的，本文描述的涉及所提供的化合物(例如，寡核苷酸)的方法和组合物通常也适用于此类化合物的药学上可接受的盐。
某些实施例的描述
寡核苷酸可用于多种应用，例如治疗、诊断和研究应用。天然存在的核酸的用途受到例如它们对内切和外切核酸酶的敏感性的限制。这样，已经开发了多种合成的对应物来规避这些缺点和/或进一步改善多种特性和活性。这些合成对应物包括含有化学修饰的合成寡核苷酸，这些化学修饰例如为碱基修饰、糖修饰、骨架修饰等，其尤其使得这些分子不太容易降解且改善了寡核苷酸的其他特性和/或活性。
从结构的角度来看，对核苷酸间键联的修饰会引入手性，并且某些特性和活性可能会受到寡核苷酸的键联磷原子构型的影响。例如，骨架键联磷原子的手性尤其会影响结合亲和力、与互补RNA的序列特异性结合、对核酸酶的稳定性、活性、递送、药代动力学等。
尤其是，本披露利用用于控制多种结构元件例如糖修饰及其模式、核碱基修饰及其模式、经修饰的核苷酸间键联及其模式、键联磷立体化学及其模式、另外的化学部分(通常不在寡核苷酸链中的部分)及其模式等的技术。由于能够完全控制寡核苷酸的结构元件，本披露提供了具有改进的和/或新的特性和/或活性的寡核苷酸，其用于多种应用，例如作为治疗剂、探针等。例如，如本文所展示，所提供的寡核苷酸及其组合物对于编辑靶核酸中的靶腺苷特别有效，以在一些实施例中通过将A转化成I来校正G至A突变。
在一些实施例中，寡核苷酸包含与核酸(例如，DNA、前体mRNA、mRNA等)的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60，典型地15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60个或更多个连续碱基相同或者完全或基本上互补的序列。在一些实施例中，核酸是包含一个或多个靶腺苷的靶核酸。在一些实施例中，靶核酸包含一个且不多于一个靶腺苷。在一些实施例中，寡核苷酸可与靶核酸杂交。在一些实施例中，这样的杂交有利于核酸或其产物中的A被例如ADAR1、ADAR2等修饰(例如，将A转化成I)。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其中该寡核苷酸具有碱基序列，该碱基序列是或包含本文披露(例如，在表中)的寡核苷酸或核酸的约10-40、约15-40、约20-40、或至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34个连续碱基，或与本文披露的靶RNA序列基因、转录物等互补的序列，并且其中每个T可以任选地并且独立地被U代替并且反之亦然。在一些实施例中，本披露提供了如本文披露(例如，在表中)的寡核苷酸或寡核苷酸组合物。
在一些实施例中，寡核苷酸是用于在靶核酸(例如，RNA)中定点编辑核苷(例如，靶腺苷)的单链寡核苷酸。
如本文所述，寡核苷酸可以含有一个或多个经修饰的核苷酸间键联(非天然磷酸酯键联)。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是手性核苷酸间键联，其键联磷是手性的。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个带负电荷的核苷酸间键联(例如，硫代磷酸酯核苷酸间键联、天然磷酸酯键联等)。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个中性核苷酸间键联。
在一些实施例中，寡核苷酸是手性控制的。在一些实施例中，寡核苷酸是手性纯的(或“立体异构体”，“立体化学纯的”)，其中寡核苷酸以单一立体异构体形式存在(在许多情况下是单一非对映异构(或“非对映”))形式，因为寡核苷酸中可以存在多个手性中心，例如在键联磷，糖碳等处)。如本领域技术人员所理解的，手性纯的寡核苷酸与它的其他立体异构形式分离(其程度是，可能存在一些杂质，因为化学和生物过程、选择性和/或纯化等，很少(如果有的话)达到绝对完全性)。在手性纯的寡核苷酸中，每个手性中心就其构型而言是独立地限定的(对于手性纯的寡核苷酸，每个核苷酸间键联是独立地立体限定的或手性控制的)。与包含立体限定的键联磷的手性控制和手性纯的寡核苷酸形成对比，包含手性键联磷的外消旋的(或“立体随机的”、“非手性控制的”)寡核苷酸(例如，来自传统的亚磷酰胺寡核苷酸合成，其中在偶联步骤中无立体化学控制并与传统的硫化作用相结合(形成立体随机的硫代磷酸酯核苷酸间键联))是指各种立体异构体的随机混合物(通常是非对映异构体(或“非对映体”)，因为在寡核苷酸中有多个手性中心；例如，来自使用除了核苷和键联磷中的手性元素不含其他手性元素的试剂进行的传统寡核苷酸制备)。例如，对于其中*是硫代磷酸酯核苷酸间键联(其包含手性键联磷)的A*A*A，外消旋寡核苷酸制备物包括四个非对映体[22＝4，考虑到两个手性键联磷，它们各自可以两种构型(Sp或Rp)之一存在]：A *S A*S A、A *S A *R A、A *R A *S A和A *R A *R A，其中*S代表Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联，*R代表Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。对于手性纯的寡核苷酸，例如A *S A *S A，它以单一的立体异构形式存在，并且与其他立体异构体(例如，非对映体A *S A *R A、A *R A *SA和A *R A *R A)分开。
在一些实施例中，寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个立体随机核苷酸间键联(在核苷酸碱键联处的Rp和Sp键联磷的混合物，例如来自传统的非手性控制的寡核苷酸合成)。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个(例如，1-60、1-50、1-40、1-30、1-25、1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60个或更多个)手性控制的核苷酸间键联(在核苷酸碱键联处的Rp或Sp键联磷，例如来自手性控制的寡核苷酸合成)。在一些实施例中，核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，核苷酸间键联是立体随机硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，核苷酸间键联是手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联。
尤其是，本披露提供了用于制备手性控制的(在一些实施例中，为立体化学纯的)寡核苷酸的技术。在一些实施例中，寡核苷酸是立体化学纯的。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸为约5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80-100％、90-100％、95-100％、50％-90％，或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，或至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％立体化学纯的。
在一些实施例中，本披露提供了多种寡核苷酸组合物。在一些实施例中，寡核苷酸组合物是立体随机或不是手性控制的。在一些实施例中，在所提供的组合物的寡核苷酸中不存在手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，组合物中寡核苷酸的核苷酸间键联包含一个或多个手性控制的核苷酸间键联(例如，手性控制的寡核苷酸组合物)。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物包含共享共同碱基序列的多个寡核苷酸，其中寡核苷酸中的一个或多个核苷酸间键联是手性控制的，并且一个或多个核苷酸间键联是立体随机的(非手性控制的)。在一些实施例中，寡核苷酸组合物包含共享共同碱基序列的多个寡核苷酸，其中寡核苷酸中包含手性键联磷的每个核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，多个寡核苷酸共享相同的碱基序列，以及相同的碱基和糖修饰。在一些实施例中，多个寡核苷酸共享相同的碱基序列，以及相同的碱基、糖和核苷酸间键联修饰。在一些实施例中，寡核苷酸组合物包含具有相同组成的寡核苷酸，其中一个或多个核苷酸间键联是手性控制的，并且一个或多个核苷酸间键联是立体随机的(非手性控制的)。在一些实施例中，寡核苷酸组合物包含具有相同组成的寡核苷酸，其中包含手性键联磷的每个核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，所有寡核苷酸或具有共同碱基序列的所有寡核苷酸的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％是该多个寡核苷酸。
在一些实施例中，本披露提供了用于制备、评估和/或利用所提供的寡核苷酸及其组合物的技术。
如本披露中使用的，在一些实施例中，“一个或多个”是1-200、1-150、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个。在一些实施例中，“一个或多个”是一个。在一些实施例中，“一个或多个”是两个。在一些实施例中，“一个或多个”是三个。在一些实施例中，“一个或多个”是四个。在一些实施例中，“一个或多个”是五个。在一些实施例中，“一个或多个”是六个。在一些实施例中，“一个或多个”是七个。在一些实施例中，“一个或多个”是八个。在一些实施例中，“一个或多个”是九个。在一些实施例中，“一个或多个”是十个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少一个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少两个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少三个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少四个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少五个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少六个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少七个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少八个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少九个。在一些实施例中，“一个或多个”是至少十个。
如本披露中使用的，在一些实施例中，“至少一个”是一个或多个。
寡核苷酸
尤其是，本披露提供了具有多种设计的寡核苷酸，其可包含本披露中描述的多种核碱基及其模式、糖及其模式、核苷酸间键联及其模式和/或另外的化学部分及其模式。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸可指导靶核酸中的A至I编辑。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸是能够在靶RNA序列中定点编辑腺苷(将A转化成I)的单链寡核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸具有合适的长度和序列互补性以与靶核酸特异性杂交。在一些实施例中，寡核苷酸足够长并且与靶核酸足够互补以将靶核酸与其他核酸区分开来从而降低脱靶效应。在一些实施例中，寡核苷酸足够短以有利于递送，降低制造复杂性和/或成本，从而维持所需的特性和活性(例如，腺苷的编辑)。
在一些实施例中，寡核苷酸具有约10-200个(例如，约10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90、10-100、10-120、10-150、20-30、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-120、20-150、20-200、25-30、25-40、25-50、25-60、25-70、25-80、25-90、25-100、25-120、25-150、25-200、30-40、30-50、30-60、30-70、30-80、30-90、30-100、30-120、30-150、30-200、10、20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、60个等)核碱基的长度。在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列的长度为约10-60个核碱基。在一些实施例中，碱基序列的长度为约15-50个核碱基。在一些实施例中，碱基序列的长度为约15至约35个核碱基。在一些实施例中，碱基序列的长度为约25至约34个核碱基。在一些实施例中，碱基序列的长度为约26至约35个核碱基。在一些实施例中，碱基序列的长度为约27至约32个核碱基。在一些实施例中，碱基序列的长度为约29至约35个核碱基。在一些实施例中，碱基序列的长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核碱基。在一些其他实施例中，碱基序列的长度为或至少为35个核碱基。在一些其他实施例中，碱基序列的长度为或至少为34个核碱基。在一些其他实施例中，碱基序列的长度为或至少为33个核碱基。在一些其他实施例中，碱基序列的长度为或至少为32个核碱基。在一些其他实施例中，碱基序列的长度为或至少为31个核碱基。在一些其他实施例中，碱基序列的长度为或至少为30个核碱基。在一些其他实施例中，碱基序列的长度为或至少为29个核碱基。在一些其他实施例中，碱基序列的长度为或至少为28个核碱基。在一些其他实施例中，碱基序列的长度为或至少为27个核碱基。在一些其他实施例中，碱基序列的长度为或至少为26个核碱基。在一些其他实施例中，双链体中互补部分的碱基序列的长度为至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、16、27、28、29、30、31、32、33、34、35个或更多个核碱基。在一些其他实施例中，其长度为至少18个核碱基。在一些其他实施例中，其长度为至少19个核碱基。在一些其他实施例中，其长度为至少20个核碱基。在一些其他实施例中，其长度为至少21个核碱基。在一些其他实施例中，其长度为至少22个核碱基。在一些其他实施例中，其长度为至少23个核碱基。在一些其他实施例中，其长度为至少24个核碱基。在一些其他实施例中，其长度为至少25个核碱基。尤其是，本披露提供了与先前报道的腺苷编辑寡核苷酸相比具有相当的或更好的特性和/或相当的或更高的活性但长度更短的寡核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列与靶核酸的碱基序列互补(例如，与靶核酸的包含靶腺苷的一部分互补)，具有0-10个(例如，0-1、0-2、0-3、0-4、0-5、0-6、0-7、0-8、0-9、0-10、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)不是沃森-克里克碱基对(AT、AU和CG)的错配。在一些实施例中，不存在错配。在一些实施例中，存在1个错配。在一些实施例中，存在2个错配。在一些实施例中，存在3个错配。在一些实施例中，存在4个错配。在一些实施例中，存在5个错配。在一些实施例中，存在6个错配。在一些实施例中，存在7个错配。在一些实施例中，存在8个错配。在一些实施例中，存在9个错配。在一些实施例中，存在10个错配。在一些实施例中，寡核苷酸可以含有不是为互补性而设计的部分(例如，环、蛋白结合序列等，用于募集蛋白，例如ADAR)。如本领域技术人员将理解的，当计算错配和/或互补性时，可以适当地排除这样的部分。在一些实施例中，例如寡核苷酸与靶核酸之间的互补性为约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)。在一些实施例中，互补性为至少约60％。在一些实施例中，互补性为至少约65％。在一些实施例中，互补性为至少约70％。在一些实施例中，互补性为至少约75％。在一些实施例中，互补性为至少约80％。在一些实施例中，互补性为至少约85％。在一些实施例中，互补性为至少约90％。在一些实施例中，互补性为至少约95％。在一些实施例中，在寡核苷酸的长度上互补性为100％。在一些实施例中，在寡核苷酸的长度上，除了在与靶核苷(例如，腺苷)相反的核苷处，互补性为100％。通常，互补性基于沃森-克里克碱基对AT、AU和CG。本领域技术人员将理解，当评估不同长度的两个序列(例如，所提供的寡核苷酸和靶核酸)的互补性时，互补性可适当地基于较短序列的长度和/或两个序列之间的最大互补性。在许多实施例中，寡核苷酸和靶核酸具有足够的互补性，使得修饰选择性地针对靶腺苷位点。
在一些实施例中，一个或多个错配独立地是摇摆。在一些实施例中，每个错配是摇摆。在一些实施例中，存在0-10个(例如，0-1、0-2、0-3、0-4、0-5、0-6、0-7、0-8、0-9、0-10、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)摇摆。在一些实施例中，数目为0。在一些实施例中，数目为1。在一些实施例中，数目为2。在一些实施例中，数目为3。在一些实施例中，数目为4。在一些实施例中，数目为5。在一些实施例中，摇摆是G-U、I-A、G-A、I-U、I-C、I-T、A-A或反向A-T。在一些实施例中，摇摆是G-U、I-A、G-A、I-U或I-C。在一些实施例中，当I是与靶核苷相反的核苷相邻的3'紧邻核苷时，I-C可以被认为是匹配。
在一些实施例中，寡核苷酸和靶核酸的双链体包含一个或多个凸起，每个凸起独立地包含一个或多个不是摇摆的错配。在一些实施例中，存在0-10个(例如，0-1、0-2、0-3、0-4、0-5、0-6、0-7、0-8、0-9、0-10、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)凸起。在一些实施例中，数目为0。在一些实施例中，数目为1。在一些实施例中，数目为2。在一些实施例中，数目为3。在一些实施例中，数目为4。在一些实施例中，数目为5。
在一些实施例中，两个错配之间、错配和寡核苷酸的一端或两端(或其一部分，例如第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域)之间和/或错配和与靶腺苷相反的核苷之间的距离可独立地是0-50、0-40、0-30、0-25、0-20、0-15、0-10个(例如，0-1、0-2、0-3、0-4、0-5、0-6、0-7、0-8、0-9、0-10、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个)核碱基(不包括错配、末端核苷和与靶腺苷相反的核苷)。在一些实施例中，数目为0-30。在一些实施例中，数目为0-20。在一些实施例中，数目为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，两个错配之间的距离为0-20。在一些实施例中，两个错配之间的距离为1-10。在一些实施例中，错配和寡核苷酸的5'-末端核苷之间的距离为0-20。在一些实施例中，错配和寡核苷酸的5'-末端核苷之间的距离为5-20。在一些实施例中，错配和寡核苷酸的3'-末端核苷之间的距离为0-40。在一些实施例中，错配和寡核苷酸的3'-末端核苷之间的距离为5-20。在一些实施例中，错配和与靶腺苷相反的核苷之间的距离为0-20。在一些实施例中，错配和与靶腺苷相反的核苷之间的距离为1-10。在一些实施例中，对于一定距离，核碱基的数目为0。在一些实施例中，其为1。在一些实施例中，其为2。在一些实施例中，其为3。在一些实施例中，其为4。在一些实施例中，其为5。在一些实施例中，其为6。在一些实施例中，其为7。在一些实施例中，其为8。在一些实施例中，其为9。在一些实施例中，其为10。在一些实施例中，其为11。在一些实施例中，其为12。在一些实施例中，其为13。在一些实施例中，其为14。在一些实施例中，其为15。在一些实施例中，其为16。在一些实施例中，其为17。在一些实施例中，其为18。在一些实施例中，其为19。在一些实施例中，其为20。在一些实施例中，错配位于第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域或第三子结构域的末端，例如5'-末端或3'-末端。在一些实施例中，错配位于与靶腺苷相反的核苷处。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸可以指导靶核酸中的腺苷编辑(例如，将A转化成I)并且具有由本文披露的寡核苷酸的碱基序列组成、包含该碱基序列或包含该碱基序列的一部分(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19个或更多个连续碱基的跨度)的碱基序列，其中每个T可以独立地被U代替并且反之亦然，并且该寡核苷酸包含碱基、糖和/或核苷酸间键联的至少一种非天然存在的修饰。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含一个或多个碳水化合物部分。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含一个或多个GalNAc部分。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含一个或多个靶向部分。本文描述了可以与寡核苷酸链缀合的此类另外的化学部分的非限制性实例。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸可指导靶序列或其产物中G至A突变的校正。在一些实施例中，G至A突变的校正是或包括将A转化成I，其可以在翻译或其他生物过程中被读作G。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸可经由ADAR介导的脱氨来指导靶序列或其产物中G至A突变的校正。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸可通过募集内源性ADAR(例如，在靶细胞中)并且促进ADAR介导的脱氨而经由ADAR介导的脱氨来指导靶序列或其产物中的G至A突变的校正。然而，无论如何，本披露不限于任何特定机制。在一些实施例中，本披露提供了能够经由双链RNA干扰、单链RNA干扰、RNA酶H介导的敲低、翻译的空间位阻、ADAR介导的脱氨、或两个或更多个这样的机制的组合操作的寡核苷酸、组合物、方法等。
在一些实施例中，寡核苷酸包含本文例如在表中所述的结构元件或其部分。在一些实施例中，寡核苷酸具有包含该碱基序列(或其一部分)的碱基序列(其中每个T可以独立地被U取代)，化学修饰模式(或其一部分)和/或本文中所披露的(例如，在表或图中，或本文以其他方式披露的)寡核苷酸的形式。在一些实施例中，这样的寡核苷酸可指导靶序列或其产物中G至A突变的校正。
尤其是，所提供的寡核苷酸可与其靶核酸(例如，前体mRNA、成熟mRNA等)杂交。在一些实施例中，寡核苷酸可以在RNA加工的任何阶段与靶RNA序列核酸(包括但不限于前体mRNA或成熟mRNA)杂交。在一些实施例中，寡核苷酸可与寡核苷酸核酸或其互补序列的任何元件杂交，包括但不限于：启动子区域、增强子区域、转录终止区域、翻译起始信号、翻译终止信号、编码区域、非编码区域、外显子、内含子、内含子/外显子或外显子/内含子连接，5'UTR或3'UTR。
在一些实施例中，寡核苷酸与来源于靶点(例如，靶序列)的有义链的转录物的两个或更多个变体杂交。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含水平增加的一种或多种同位素。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸例如经一种或多种元素(例如，氢、碳、氮等)的一种或多种同位素标记。在一些实施例中，所提供的组合物中的所提供的寡核苷酸(例如，组合物的多个寡核苷酸)包含碱基修饰、糖修饰和/或核苷酸间键联修饰，其中这些寡核苷酸含有富集水平的氘。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸在一个或多个位置被氘标记(用-2H代替-1H)。在一些实施例中，寡核苷酸链或与该寡核苷酸链缀合的任何部分(例如，靶向部分等)的一个或多个1H经2H取代。此类寡核苷酸可用于本文所述的组合物和方法中。
在一些实施例中，寡核苷酸包含如本文所述的一个或多个经修饰的核碱基、一个或多个经修饰的糖和/或一个或多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含一定水平的经修饰的核碱基、经修饰的糖和/或经修饰的核苷酸间键联，例如分别为寡核苷酸内的所有核碱基、糖和核苷酸间键联的约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。
在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个经修饰的糖。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核碱基。根据本披露，可以将多种修饰引入糖和/或核碱基。例如，在一些实施例中，修饰是US 9006198中描述的修饰。在一些实施例中，修饰是在US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9982257、US 20170037399、US 20180216108、US20180216107、US 9598458、WO 2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/022473、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019032612、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO2020/191252中描述的修饰，其各自的糖、碱基和核苷酸间键联独立地通过援引并入本文。
在一些实施例中，核苷中的核碱基是或包含具有以下结构的环BA：BA-I、BA-I-a、BA-I-b、BA-II、BA-II-a、BA-II-b、BA-III、BA-III-a、BA-III-b、BA-IV、BA-IV-a、BA-IV-b、BA-V、BA-V-a、BA-V-b或BA-VI，或环BA的互变异构体，其中核碱基是任选地经取代的或被保护的。
在一些实施例中，糖是包含2'-修饰(例如，2'-F、2'-OR，其中R是任选地经取代的脂肪族基)的经修饰的糖，或双环糖(例如，LNA糖)，或无环糖(例如，UNA糖)。
在一些实施例中，如本文所述，所提供的寡核苷酸包含一个或多个结构域，其各自独立地具有如本文所述的某些长度、修饰、键联磷立体化学等。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个经修饰的糖和/或一个或多个经修饰的核苷酸间键联的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含各自独立地包含一个或多个核碱基的第一结构域和第二结构域。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，该寡核苷酸包含：
第一结构域；以及
第二结构域，
其中：
该第一结构域包含一个或多个2'-F修饰；
该第二结构域包含一个或多个不具有2'-F修饰的糖。
在一些实施例中，寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)包含一定水平的经修饰的糖。在一些实施例中，经修饰的糖包含2'-修饰。在一些实施例中，经修饰的糖是双环糖。在一些实施例中，经修饰的糖是无环糖(例如，通过断裂相应环糖的C2-C3键)。在一些实施例中，经修饰的糖包含5'-修饰。通常，除非另有说明，例如由上下文说明，否则本披露的寡核苷酸在其5'-末端具有游离的5'-OH并且在其3'-末端具有游离的3'-OH。在一些实施例中，寡核苷酸的5'-末端糖可以包含经修饰的5'-OH。
在一些实施例中，水平分别是寡核苷酸或其部分中所有糖的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，百分比为至少约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。
在一些实施例中，寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)包含一定水平的经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)包含一定水平的手性核苷酸间键联。在一些实施例中，水平分别是寡核苷酸或其部分中所有核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，百分比为至少约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。
在一些实施例中，寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)包含一定水平的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)包含一定水平的Sp核苷酸间键联。在一些实施例中，水平分别是寡核苷酸或其部分中所有核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，水平分别是寡核苷酸或其部分中所有手性核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，百分比为至少约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。
在一些实施例中，寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)包含一定水平的Sp核苷酸间键联。在一些实施例中，水平分别是寡核苷酸或其部分中所有核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，水平分别是寡核苷酸或其部分中所有手性核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，水平分别是寡核苷酸或其部分中所有手性控制的核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，百分比为至少约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。在一些实施例中，约1-50、1-40、1-30，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸间键联独立地是Sp手性核苷酸间键联。在许多实施例中，据观察，寡核苷酸或其某些部分中高百分比的Sp核苷酸间键联(例如，相对于Rp核苷酸间键联和/或天然磷酸酯键联)可以提供改善的特性和/或活性，例如，高稳定性和/或高腺苷编辑活性。
在一些实施例中，寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)包含一定水平的Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，水平分别是寡核苷酸或其部分中所有核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，水平分别是寡核苷酸或其部分中所有手性核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，水平分别是寡核苷酸或其部分中所有手性控制的核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，百分比为至少约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约5％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约10％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约15％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约20％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约25％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约30％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约35％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约40％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约45％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约50％。在一些实施例中，约1-50、1-40、1-30，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸间键联独立地是Rp手性核苷酸间键联。在一些实施例中，数目为约或不大于约1。在一些实施例中，数目为约或不大于约2。在一些实施例中，数目为约或不大于约3。在一些实施例中，数目为约或不大于约4。在一些实施例中，数目为约或不大于约5。在一些实施例中，数目为约或不大于约6。在一些实施例中，数目为约或不大于约7。在一些实施例中，数目为约或不大于约8。在一些实施例中，数目为约或不大于约9。在一些实施例中，数目为约或不大于约10。
虽然不希望受理论的束缚，但注意到在一些情况下，核苷酸间键联的Rp和Sp构型可影响由寡核苷酸和靶核酸诸如RNA形成的双链复合物的螺旋构象的结构变化，并且ADAR蛋白可通过多个结构域识别多种靶(例如，由寡核苷酸和靶核酸诸如RNA形成的双链复合物)并与其相互作用。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸及其组合物促进和/或增强寡核苷酸、靶核酸和/或ADAR蛋白的相互作用谱，以通过多种修饰的并入和/或对立体化学的控制来提供ADAR蛋白的有效腺苷修饰。
在一些实施例中，寡核苷酸可具有或包含碱基序列；核苷酸间键联、碱基修饰、糖修饰，另外的化学部分或其模式；和/或本文例如在表中所述的任何其他结构元件。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸或组合物的特征在于，当其在系统(例如，ADAR介导的脱氨系统)中与包含靶腺苷的靶核酸接触时，靶腺苷的修饰(例如，靶A的脱氨)相对于在参考条件(例如，选自由不存在组合物、存在参考寡核苷酸或组合物及其组合组成的组)下观察到的靶腺苷的修饰得到改善。在一些实施例中，修饰，例如ADAR介导的脱氨(例如，内源性ADAR介导的脱氨)增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000倍或更多。
在一些实施例中，寡核苷酸以盐形式提供。在一些实施例中，寡核苷酸以盐的形式提供，这些盐包含作为盐形式存在的带负电荷的核苷酸间键联(例如，硫代磷酸酯核苷酸间键联、天然磷酸酯键联等)。在一些实施例中，寡核苷酸以药学上可接受的盐的形式提供。在一些实施例中，寡核苷酸以金属盐的形式提供。在一些实施例中，寡核苷酸以钠盐的形式提供。在一些实施例中，寡核苷酸以铵盐的形式提供。在一些实施例中，寡核苷酸以金属盐例如钠盐的形式提供，其中每个带负电荷的核苷酸间键联独立地呈盐形式(例如，针对钠盐，对于硫代磷酸酯核苷酸间键联是-O-P(O)(SNa)-O-，对于天然磷酸酯键联是-O-P(O)(ONa)-O-，等等)。
在一些实施例中，寡核苷酸是手性控制的，其包含一个或多个手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸是立体化学纯的。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸或其组合物基本上不含其他立体异构体。在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物。
如本文所述，本披露的寡核苷酸可以高纯度(例如，50％-100％)提供。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸具有高立体化学纯度(例如，50％-100％)。在一些实施例中，所提供的组合物中的寡核苷酸具有高立体化学纯度(例如，一种立体异构体与相同寡核苷酸的其他立体异构体相比具有高百分比(例如，50％-100％))。在一些实施例中，百分比为至少或约50％。在一些实施例中，百分比为至少或约60％。在一些实施例中，百分比为至少或约70％。在一些实施例中，百分比为至少或约75％。在一些实施例中，百分比为至少或约80％。在一些实施例中，百分比为至少或约85％。在一些实施例中，百分比为至少或约90％。在一些实施例中，百分比为至少或约95％。
第一结构域
如本文所述，在一些实施例中，寡核苷酸包含第一结构域和第二结构域。在一些实施例中，寡核苷酸由第一结构域和第二结构域组成。下文以实例描述某些实施例。
在一些实施例中，第一结构域具有约2-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等)核碱基的长度。在一些实施例中，第一结构域具有约5-30个核碱基的长度。在一些实施例中，第一结构域具有约10-30个核碱基的长度。在一些实施例中，第一结构域具有约10-20个核碱基的长度。在一些实施例中，第一结构域具有约13-16个核碱基的长度。在一些实施例中，第一结构域具有10个核碱基的长度。在一些实施例中，第一结构域具有11个核碱基的长度。在一些实施例中，第一结构域具有12个核碱基的长度。在一些实施例中，第一结构域具有13个核碱基的长度。在一些实施例中，第一结构域具有14个核碱基的长度。在一些实施例中，第一结构域具有15个核碱基的长度。在一些实施例中，第一结构域具有16个核碱基的长度。在一些实施例中，第一结构域具有17个核碱基的长度。在一些实施例中，第一结构域具有18个核碱基的长度。在一些实施例中，第一结构域具有19个核碱基的长度。在一些实施例中，第一结构域具有20个核碱基的长度。
在一些实施例中，第一结构域是寡核苷酸的约或至少约5％-95％、10％-90％、20％-80％、30％-70％、40％-70％、40％-60％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％。在一些实施例中，百分比为约30％-80％。在一些实施例中，百分比为约30％-70％。在一些实施例中，百分比为约40％-60％。在一些实施例中，百分比为约20％。在一些实施例中，百分比为约25％。在一些实施例中，百分比为约30％。在一些实施例中，百分比为约35％。在一些实施例中，百分比为约40％。在一些实施例中，百分比为约45％。在一些实施例中，百分比为约50％。在一些实施例中，百分比为约55％。在一些实施例中，百分比为约60％。在一些实施例中，百分比为约65％。在一些实施例中，百分比为约70％。在一些实施例中，百分比为约75％。在一些实施例中，百分比为约80％。在一些实施例中，百分比为约85％。在一些实施例中，百分比为约90％。
在一些实施例中，当寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，在第一结构域中存在一个或多个(例如，1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)错配。在一些实施例中，存在1个错配。在一些实施例中，存在2个错配。在一些实施例中，存在3个错配。在一些实施例中，存在4个错配。在一些实施例中，存在5个错配。在一些实施例中，存在6个错配。在一些实施例中，存在7个错配。在一些实施例中，存在8个错配。在一些实施例中，存在9个错配。在一些实施例中，存在10个错配。
在一些实施例中，当寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，在第一结构域中存在一个或多个(例如，1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)摇摆。在一些实施例中，存在1个摇摆。在一些实施例中，存在2个摇摆。在一些实施例中，存在3个摇摆。在一些实施例中，存在4个摇摆。在一些实施例中，存在5个摇摆。在一些实施例中，存在6个摇摆。在一些实施例中，存在7个摇摆。在一些实施例中，存在8个摇摆。在一些实施例中，存在9个摇摆。在一些实施例中，存在10个摇摆。
在一些实施例中，第一结构域区域中的寡核苷酸和靶核酸的双链体包含一个或多个凸起，每个凸起独立地包含一个或多个不是摇摆的错配。在一些实施例中，存在0-10个(例如，0-1、0-2、0-3、0-4、0-5、0-6、0-7、0-8、0-9、0-10、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)凸起。在一些实施例中，数目为0。在一些实施例中，数目为1。在一些实施例中，数目为2。在一些实施例中，数目为3。在一些实施例中，数目为4。在一些实施例中，数目为5。
在一些实施例中，第一结构域与靶核酸完全互补。
在一些实施例中，第一结构域包含一个或多个经修饰的核碱基。
在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个包含两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)。在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个包含2'-OH的糖(例如，天然RNA糖)。在一些实施例中，第一结构域包含一个或多个经修饰的糖。在一些实施例中，经修饰的糖包含2'-修饰。在一些实施例中，经修饰的糖是双环糖，例如LNA糖。在一些实施例中，经修饰的糖是无环糖(例如，通过断裂相应环糖的C2-C3键)。
在一些实施例中，第一结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖。在一些实施例中，第一结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)具有2'-F修饰的经修饰的糖。
在一些实施例中，第一结构域中的所有糖的约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，第一结构域中所有糖的约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)独立地是2'-F修饰的糖。在一些实施例中，百分比为至少约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。
在一些实施例中，第一结构域不含双环糖或2'-OR修饰的糖，其中R不是-H。在一些实施例中，第一结构域包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)双环糖和/或2'-OR修饰的糖，其中R不是-H。在一些实施例中，第一结构域包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)2'-OR修饰的糖，其中R不是-H。在一些实施例中，第一结构域包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-10脂肪族基。在一些实施例中，与2'-F修饰的糖的水平相比，单独或组合的双环糖和/或2'-OR修饰的糖(其中R不是-H)的水平相对较低。在一些实施例中，第一结构域中不超过约1％-95％(例如，不超过约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％等)的糖包含2'-OMe。在一些实施例中，第一结构域中不超过约50％的糖包含2'-OMe。在一些实施例中，第一结构域中不超过约1％-95％(例如，不超过约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％等)的糖包含2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第一结构域中不超过约50％的糖包含2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第一结构域中不超过约40％的糖包含2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第一结构域中不超过约30％的糖包含2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第一结构域中不超过约25％的糖包含2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第一结构域中不超过约20％的糖包含2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第一结构域中不超过约10％的糖包含2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，如本文所述，2'-OR是2'-MOE。在一些实施例中，如本文所述，2'-OR是2'-MOE或2'-OMe。在一些实施例中，第一结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-N(R)2修饰的经修饰的糖。在一些实施例中，第一结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-NH2修饰的经修饰的糖。在一些实施例中，第一结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)双环糖，例如LNA糖。在一些实施例中，第一结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)无环糖(例如，UNA糖)。在一些实施例中，第一结构域中的多个5'-末端糖独立地是2'-OR修饰的糖，其中R不是-H。在一些实施例中，第一结构域中的多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)5'-末端糖独立地是2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，来自第一结构域的5'-末端的前约1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个糖独立地是2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，前一个是2'-OR修饰的。在一些实施例中，前两个独立地是2'-OR修饰的。在一些实施例中，前三个独立地是2'-OR修饰的。在一些实施例中，前四个独立地是2'-OR修饰的。在一些实施例中，前五个独立地是2'-OR修饰的。在一些实施例中，结构域(例如，第一结构域)、子结构域(例如，第一子结构域)或寡核苷酸中的所有2'-OR修饰均是相同的。在一些实施例中，2'-OR是2'-MOE。在一些实施例中，2'-OR是2'-OMe。
在一些实施例中，第一结构域中没有糖包含2'-OR。在一些实施例中，第一结构域中没有糖包含2'-OMe。在一些实施例中，第一结构域中没有糖包含2'-MOE。在一些实施例中，第一结构域中没有糖包含2'-MOE或2'-OMe。在一些实施例中，第一结构域中没有糖包含2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第一结构域中的每个糖均包含2'-F。
在一些实施例中，第一结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，第一结构域中的核苷酸间键联的约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，第一结构域中的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的或手性的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的或手性的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的或手性的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联，例如n001。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或中性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，第一结构域中的至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，第一结构域中的手性核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是手性控制的。在一些实施例中，第一结构域中的硫代磷酸酯核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是手性控制的。在一些实施例中，每个独立地是手性控制的。在一些实施例中，第一结构域中的至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，第一结构域中的至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)硫代磷酸酯核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，第一结构域中的手性核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是Sp。在一些实施例中，第一结构域中的硫代磷酸酯核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是Sp。在一些实施例中，数目为一个或多个。在一些实施例中，数目为2个或更多个。在一些实施例中，数目为3个或更多个。在一些实施例中，数目为4个或更多个。在一些实施例中，数目为5个或更多个。在一些实施例中，数目为6个或更多个。在一些实施例中，数目为7个或更多个。在一些实施例中，数目为8个或更多个。在一些实施例中，数目为9个或更多个。在一些实施例中，数目为10个或更多个。在一些实施例中，数目为11个或更多个。在一些实施例中，数目为12个或更多个。在一些实施例中，数目为13个或更多个。在一些实施例中，数目为14个或更多个。在一些实施例中，数目为15个或更多个。在一些实施例中，百分比为至少约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。在一些实施例中，连接两个第一结构域核苷的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是Sp手性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联独立地是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，第一结构域的核苷酸间键联与第一结构域的两个核苷键合。在一些实施例中，与第一结构域中的核苷和第二结构域中的核苷键合的核苷酸间键联可以被适当地认为是第一结构域的核苷酸间键联。在一些实施例中，与第一结构域中的核苷和第二结构域中的核苷键合的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联；在一些实施例中，其是手性核苷酸间键联；在一些实施例中，其是手性控制的；在一些实施例中，其是Rp；在一些实施例中，其是Sp。在许多实施例中，据观察，高百分比的Sp核苷酸间键联(例如，相对于Rp核苷酸间键联和/或天然磷酸酯键联)可以提供改善的特性和/或活性，例如，高稳定性和/或高腺苷编辑活性。
在一些实施例中，第一结构域包含一定水平的Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，水平为第一结构域中的所有核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，水平为第一结构域中的所有手性核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，水平为第一结构域中的所有手性控制的核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，百分比为约或不超过约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约5％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约10％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约15％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约20％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约25％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约30％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约35％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约40％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约45％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约50％。在一些实施例中，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸间键联独立地是Rp手性核苷酸间键联。在一些实施例中，数目为约或不大于约1。在一些实施例中，数目为约或不大于约2。在一些实施例中，数目为约或不大于约3。在一些实施例中，数目为约或不大于约4。在一些实施例中，数目为约或不大于约5。在一些实施例中，数目为约或不大于约6。在一些实施例中，数目为约或不大于约7。在一些实施例中，数目为约或不大于约8。在一些实施例中，数目为约或不大于约9。在一些实施例中，数目为约或不大于约10。
在一些实施例中，第一结构域中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性控制的。在一些实施例中，每个独立地是Sp或Rp。在一些实施例中，高水平是如本文所述的Sp。在一些实施例中，第一结构域中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。
在一些实施例中，如在某些实例中所展示的，第一结构域包含一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联，其各自任选地并且独立地是手性控制的。在一些实施例中，每个不带负电荷的核苷酸间键联独立地是n001。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，每个手性不带负电荷的核苷酸间键联都不是手性控制的。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Rp。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，每个手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，第一结构域中不带负电荷的核苷酸间键联的数目为约1-10，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施例中，其为约1。在一些实施例中，其为约2。在一些实施例中，其为约3。在一些实施例中，其为约4。在一些实施例中，其为约5。在一些实施例中，两个或更多个不带负电荷的核苷酸间键联是连续的。在一些实施例中，没有两个不带负电荷的核苷酸间键联是连续的。在一些实施例中，第一结构域中的所有不带负电荷的核苷酸间键联都是连续的(例如，3个连续的不带负电荷的核苷酸间键联)。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联，或两个或更多个连续的不带负电荷的核苷酸间键联位于第一结构域的5'-末端。在一些实施例中，连接第一结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是Sp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是Rp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是Sp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是Rp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联，诸如n001。在一些实施例中，第一结构域的前两个核苷是寡核苷酸的前两个核苷。
在一些实施例中，第一结构域包含一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，第一结构域不含天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，第一结构域募集蛋白诸如ADAR蛋白(例如，ADAR1、ADAR2等)、促进或有助于该蛋白的募集。在一些实施例中，第一结构域募集蛋白诸如ADAR蛋白，或促进或有助于与该蛋白的相互作用。在一些实施例中，第一结构域与ADAR的RNA结合结构域(RBD)接触。在一些实施例中，第一结构域基本上不与ADAR的第二RBD结构域接触。在一些实施例中，第一结构域基本上不与ADAR的具有脱氨酶活性的催化结构域接触。在一些实施例中，多种核碱基、糖和/或核苷酸间键联可与蛋白(例如，ADAR蛋白)的一个或多个残基相互作用。
第二结构域
如本文所述，在一些实施例中，寡核苷酸从5'至3'包含第一结构域和第二结构域。在一些实施例中，寡核苷酸由第一结构域和第二结构域组成。下文以实例描述第二结构域的某些实施例。在一些实施例中，第二结构域包含与待修饰(例如，转化成I)的靶腺苷相反的核苷。
在一些实施例中，第二结构域具有约2-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等)核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有约5-30个核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有约10-30个核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有约10-20个核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有约5-15个核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有约13-16个核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有约1-7个核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有10个核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有11个核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有12个核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有13个核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有14个核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有15个核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有16个核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有17个核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有18个核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有19个核碱基的长度。在一些实施例中，第二结构域具有20个核碱基的长度。
在一些实施例中，第二结构域是寡核苷酸的约或至少约5％-95％、10％-90％、20％-80％、30％-70％、40％-70％、40％-60％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％。在一些实施例中，百分比为约30％-80％。在一些实施例中，百分比为约30％-70％。在一些实施例中，百分比为约40％-60％。在一些实施例中，百分比为约20％。在一些实施例中，百分比为约25％。在一些实施例中，百分比为约30％。
在一些实施例中，百分比为约35％。在一些实施例中，百分比为约40％。
在一些实施例中，百分比为约45％。在一些实施例中，百分比为约50％。在一些实施例中，百分比为约55％。在一些实施例中，百分比为约60％。在一些实施例中，百分比为约65％。在一些实施例中，百分比为约70％。在一些实施例中，百分比为约75％。在一些实施例中，百分比为约80％。在一些实施例中，百分比为约85％。在一些实施例中，百分比为约90％。
在一些实施例中，当寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，在第二结构域中存在一个或多个(例如，1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)错配。在一些实施例中，存在1个错配。在一些实施例中，存在2个错配。在一些实施例中，存在3个错配。在一些实施例中，存在4个错配。在一些实施例中，存在5个错配。在一些实施例中，存在6个错配。在一些实施例中，存在7个错配。在一些实施例中，存在8个错配。在一些实施例中，存在9个错配。在一些实施例中，存在10个错配。
在一些实施例中，当寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，在第二结构域中存在一个或多个(例如，1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)摇摆。在一些实施例中，存在1个摇摆。在一些实施例中，存在2个摇摆。在一些实施例中，存在3个摇摆。在一些实施例中，存在4个摇摆。在一些实施例中，存在5个摇摆。在一些实施例中，存在6个摇摆。在一些实施例中，存在7个摇摆。在一些实施例中，存在8个摇摆。在一些实施例中，存在9个摇摆。在一些实施例中，存在10个摇摆。
在一些实施例中，第二结构域区域中的寡核苷酸和靶核酸的双链体包含一个或多个凸起，每个凸起独立地包含一个或多个不是摇摆的错配。在一些实施例中，存在0-10个(例如，0-1、0-2、0-3、0-4、0-5、0-6、0-7、0-8、0-9、0-10、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)凸起。在一些实施例中，数目为0。在一些实施例中，数目为1。在一些实施例中，数目为2。在一些实施例中，数目为3。在一些实施例中，数目为4。在一些实施例中，数目为5。
在一些实施例中，第二结构域与靶核酸完全互补。
在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个经修饰的核碱基。
在一些实施例中，第二结构域包含与靶腺苷相反的核苷，例如当寡核苷酸与靶核酸形成双链体时。在一些实施例中，相反核碱基是任选地经取代的或被保护的U，或是U的任选地经取代的或被保护的互变异构体。在一些实施例中，相反核碱基是U。
在一些实施例中，与U相比，相反核碱基与靶腺苷的靶腺嘌呤具有较弱的氢键结合。在一些实施例中，与U相比，相反核碱基与靶腺苷的靶腺嘌呤形成较少的氢键。在一些实施例中，相反核碱基与蛋白(例如，ADAR)的一个或多个氨基酸残基形成一个或多个氢键，这些残基与和靶腺苷相反的U形成一个或多个氢键。在一些实施例中，相反核碱基与ADAR的每个氨基酸残基形成一个或多个氢键，该每个氨基酸残基与和靶腺苷相反的U形成一个或多个氢键。在一些实施例中，通过减弱与靶A的氢键结合和/或维持或增强与蛋白诸如ADAR1、ADAR2等的相互作用，某些相反核碱基有利于和/或促进腺苷修饰，例如被ADAR蛋白诸如ADAR1和ADAR2修饰。
在一些实施例中，相反核碱基是任选地经取代的或被保护的C，或是C的任选地经取代的或被保护的互变异构体。在一些实施例中，相反核碱基是C。在一些实施例中，相反核碱基是任选地经取代的或被保护的A，或是A的任选地经取代的或被保护的互变异构体。在一些实施例中，相反核碱基是A。在一些实施例中，相反核碱基是假异胞嘧啶的任选地经取代的或被保护的核碱基，或是假异胞嘧啶的核碱基的任选地经取代的或被保护的互变异构体。在一些实施例中，相反核碱基是假异胞嘧啶的核碱基。
在一些实施例中，如本文所述，核苷，例如相反核苷是无碱基的(例如，具有L010、L012、L028等的结构)。
经修饰的核碱基的许多有用的实施例，例如用于相反核碱基，也在下面描述。在一些实施例中，如本文所述(例如，在多种寡核苷酸中)，本披露提供了包含例如与靶核苷诸如A相反的核苷的核碱基的寡核苷酸，该核碱基是或包含C、A、aC、b007U、b001U、b001A、b002U、b001C、b003U、b002C、b004U、b003C、b005U、b002I、b006U、b003I、b008U、b009U、b002A、b003A、b001G或zdnp。在一些实施例中，核碱基是C。在一些实施例中，核碱基是A。在一些实施例中，核碱基是aC。在一些实施例中，核碱基是b007U。在一些实施例中，核碱基是b001U。在一些实施例中，核碱基是b001A。在一些实施例中，核碱基是b002U。在一些实施例中，核碱基是b001C。在一些实施例中，核碱基是b003U。在一些实施例中，核碱基是b002C。在一些实施例中，核碱基是b004U。在一些实施例中，核碱基是b003C。在一些实施例中，核碱基是b005U。在一些实施例中，核碱基是b002I。在一些实施例中，核碱基是b006U。在一些实施例中，核碱基是b003I。在一些实施例中，核碱基是b008U。在一些实施例中，核碱基是b009U。在一些实施例中，核碱基是b002A。在一些实施例中，核碱基是b003A。在一些实施例中，核碱基是b001G。在一些实施例中，核碱基是zdnp。在一些实施例中，如本领域技术人员理解的，对核碱基进行保护，例如用于寡核苷酸合成。例如，在一些实施例中，核碱基是具有
Figure BDA0003580200980000841
的结构的被保护的b001A，其中R'如本文所述。在一些实施例中，R'是-C(O)R。在一些实施例中，R'是-C(O)Ph。
某些经修饰的核碱基
在一些实施例中，BA是或包含环BA或其互变异构体，其中环BA是具有0-10个杂原子的任选地经取代的5-20元单环、双环或多环。在一些实施例中，环BA是或包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元单环、双环或多环，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，环BA是饱和的。在一些实施例中，环BA包含一个或多个不饱和度。在一些实施例中，环BA是部分不饱和的。在一些实施例中，环BA是芳族的。
在一些实施例中，BA是或包含环BA，其中环BA是具有0-10个杂原子的任选地经取代的5-20元单环、双环或多环。在一些实施例中，环BA是或包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元单环、双环或多环，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，环BA是饱和的。在一些实施例中，环BA包含一个或多个不饱和度。在一些实施例中，环BA是部分不饱和的。在一些实施例中，环BA是芳族的。
在一些实施例中，BA是或包含环BA。在一些实施例中，BA是环BA。在一些实施例中，BA是或包含环BA的互变异构体。在一些实施例中，BA是环BA的互变异构体。
在一些实施例中，本披露的结构含有一个或多个任选地经取代的环(例如，环BA、-Cy-、环BAA、R、由合在一起的R基团形成等)。在一些实施例中，环是具有0-10个(例如，1-10、1-5，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)杂原子的任选地经取代的C3-30、C3-20、C3-15、C3-10、C3-9、C3-8、C3-7、C3-6、C5-50、C5-20、C5-15、C5-10、C5-9、C5-8、C5-7、C5-6或3-30(例如，3-30、3-20、3-15、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、5-50、5-20、5-15、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30等)元单环、双环或多环。在一些实施例中，环是具有0-3个杂原子的任选地经取代的3-10元单环或双环、饱和、部分饱和的或芳族环。在一些实施例中，环是取代的。在一些实施例中，环未被取代。在一些实施例中，环是3、4、5、6、7、8、9或10元的。在一些实施例中，环是5、6或7元的。在一些实施例中，环是5元的。在一些实施例中，环是6元的。在一些实施例中，环是7元的。在一些实施例中，环是单环的。在一些实施例中，环是双环的。在一些实施例中，环是多环的。在一些实施例中，环是饱和的。在一些实施例中，环含有至少一个不饱和度。在一些实施例中，环是部分不饱和的。在一些实施例中，环是芳族的。在一些实施例中，环具有0-5个杂原子。在一些实施例中，环具有1-5个杂原子。在一些实施例中，环具有一个或多个杂原子。在一些实施例中，环具有1个杂原子。在一些实施例中，环具有2个杂原子。在一些实施例中，环具有3个杂原子。在一些实施例中，环具有4个杂原子。在一些实施例中，环具有5个杂原子。在一些实施例中，杂原子是氮。在一些实施例中，杂原子是氧。在一些实施例中，环被取代，例如被一个或多个烷基和任选地被一个或多个如本文所述的其他取代基取代。在一些实施例中，取代基是甲基。
在一些实施例中，本披露的单环、双环或多环(例如，环BA、-Cy-、环BAA、R、由合在一起的R基团形成等)的每个单环单元独立地是具有0-5个杂原子的任选地经取代的5-7元饱和、部分不饱和或芳族环。在一些实施例中，一个或多个单环单元独立地包含一个或多个不饱和度。在一些实施例中，一个或多个单环单元是饱和的。在一些实施例中，一个或多个单环单元是部分饱和的。在一些实施例中，一个或多个单环单元是芳族的。在一些实施例中，一个或多个单环单元独立地具有1-5个杂原子。在一些实施例中，一个或多个单环单元独立地具有至少一个氮原子。在一些实施例中，每个单环单元独立地是5或6元的。在一些实施例中，单环单元是5元的。在一些实施例中，单环单元是5元的并且具有1-2个氮原子。在一些实施例中，单环单元是6元的。
在一些实施例中，单环单元是6元的并且具有1-2个氮原子。除非另有说明，否则环及其单环单元是任选地经取代的。
不希望受任何特定理论的限制，本披露认识到在一些实施例中，核碱基(例如，BA)的结构可影响与蛋白(例如，ADAR蛋白，诸如ADAR1、ADAR2等)的相互作用。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含可促进寡核苷酸与酶(例如，ADAR1)相互作用的核碱基。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含可降低碱基配对强度(例如，与A-T/U或C-G相比)的核碱基。在一些实施例中，本披露认识到，通过维持和/或增强第一核碱基与蛋白(例如，像ADAR1的酶)的相互作用(例如，氢键结合)和/或减少第一核碱基与其在双链体中的另一条链上的对应核碱基(例如，A)的相互作用(例如，氢键结合)，可以显著改善蛋白(例如，像ADAR1的酶)对对应核碱基的修饰。在一些实施例中，本披露提供了包含这样的第一核碱基的寡核苷酸(例如，本文所述的BA的多种实施例)。诸如第一核碱基的示例性实施例如本文所述。在一些实施例中，当包含这样的第一核碱基的寡核苷酸与另一核酸进行最大互补性比对时，第一核碱基与A相反。在一些实施例中，可以使用本披露的技术有效地修饰如在本披露的许多实施例中例示的与第一核碱基相反的这样的A。
在一些实施例中，环BA包含部分
Figure BDA0003580200980000861
其中各变量独立地如本文所述。在一些实施例中，环BA包含部分
Figure BDA0003580200980000862
Figure BDA0003580200980000863
其中各变量独立地如本文所述。在一些实施例中，环BA包含部分
Figure BDA0003580200980000864
其中各变量独立地如本文所述。在一些实施例中，环BA包含部分
Figure BDA0003580200980000865
其中各变量独立地如本文所述。在一些实施例中，X1与糖键合。在一些实施例中，X1是-N(-)-。在一些实施例中，X1是-C(＝)-。在一些实施例中，X2是-C(O)-。在一些实施例中，X3是-NH-。在一些实施例中，X4不是-C(O)-。在一些实施例中，X4是-C(O)-，并且形成分子内氢键，例如，与具有相同核苷酸单元的部分(例如，在X5的相同BA单元内(例如，与氢键供体(例如，-OH、SH等))。在一些实施例中，X4是-C(＝NH)-。在一些实施例中，环BA包含部分
Figure BDA0003580200980000871
其中各变量独立地如本文所述。在一些实施例中，X4'是-C(O)-。在一些实施例中，X5'是-NH-。
在一些实施例中，BA是任选地经取代的或被保护的C或其互变异构体。在一些实施例中，BA是任选地经取代的或任选地被保护的C。在一些实施例中，BA是C的任选地经取代的或任选地被保护的互变异构体。在一些实施例中，BA是C。在一些实施例中，BA是经取代的C。在一些实施例中，BA是被保护的C。在一些实施例中，BA是C的经取代的互变异构体。在一些实施例中，BA是C的被保护的互变异构体。
在一些实施例中，环BA具有式BA-I的结构：
Figure BDA0003580200980000872
其中：
环BA是具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元单环、双环或多环、饱和、部分饱和的或芳族环；
每个
Figure BDA0003580200980000873
独立地是单键或双键；
X1是-N(-)-或-C(-)＝；
X2是-C(O)-、-C(RB2)＝或-C(ORB2)＝，其中RB2是-LB2-R'；
X3是-N(RB3)-或-N＝，其中RB3是-LB3-R'；
X4是-C(RB4)＝、-C(-N(RB4)2)＝、-C(RB4)2-、-C(O)-或-C(＝NRB4)-，其中每个RB4独立地是-LB4-RB41，或同一个原子上的两个RB4合在一起形成＝O、＝C(-LB4-RB41)2、＝N-LB4-RB41、或任选地经取代的＝CH2或＝NH，其中每个RB41独立地是R'；
LB2、LB3和LB4中的每一个独立地是LB；
每个LB独立地是共价键，或具有0-6个杂原子的任选地经取代的二价C1-10饱和或部分不饱和链，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被-Cy-、-O-、-S-、-N(R')-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR')-、-C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R')-、-C(O)S-或-C(O)O-代替；
每个-Cy-独立地是具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环；
每个R'独立地是-R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)N(R)2或-SO2R；以及
每个R独立地是-H，或选自以下的任选地经取代的基团：C1-20脂肪族基、具有1-10个杂原子的C1-20杂脂肪族基、C6-20芳基、C6-20芳基脂肪族基、具有1-10个杂原子的C6-20芳基杂脂肪族基、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基和具有1-10个杂原子的3-20元杂环基，或
两个R基团任选地且独立地合在一起形成共价键，或
同一个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与该原子合在一起形成除该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环；或
两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子合在一起形成除居于它们之间的原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。
在一些实施例中，环BA(例如，式BA-I之一)具有式BA-I-a的结构：
Figure BDA0003580200980000881
在一些实施例中，环BA(例如，式BA-I、BA-I-a等之一)具有式BA-I-b的结构：
Figure BDA0003580200980000891
在一些实施例中，环BA(例如，式BA-I之一)具有式BA-II的结构：
Figure BDA0003580200980000892
其中：
X5是-C(RB5)2-、-N(RB5)-、-C(RB5)＝、-C(O)-或-N＝，其中每个RB5独立地是卤素或-LB5-RB51，其中RB51是-R'、-N(R')2、-OR'或-SR'；
LB5是LB；以及
其他变量各自独立地如本文所述。
在一些实施例中，环BA(例如，式BA-I、BA-I-a、BA-II等之一)具有式BA-II-a的结构：
Figure BDA0003580200980000893
在一些实施例中，环BA(例如，式BA-I、BA-I-a、BA-I-b、BA-II、BA-II-a等之一)具有式BA-II-b的结构：
Figure BDA0003580200980000901
在一些实施例中，环BA(例如，式BA-I、BA-II等之一)具有式BA-III的结构：
Figure BDA0003580200980000902
其中：
X6是-C(RB6)＝、-C(ORB6)＝、-C(RB6)2-、-C(O)-或-N＝，其中每个RB6独立地是-LB6-RB61，或同一个原子上的两个RB6合在一起形成＝O、＝C(-LB6-RB61)2、＝N-LB6-RB61、或任选地经取代的＝CH2或＝NH，其中每个RB61独立地是R'；
LB6是LB；以及
其他变量各自独立地如本文所述。
在一些实施例中，环BA(例如，式BA-I、BA-I-a、BA-II、BA-II-a、BA-III等之一)具有式BA-III-a的结构：
Figure BDA0003580200980000903
在一些实施例中，环BA(例如，式BA-I、BA-I-a、BA-I-b、BA-II、BA-II-a、BA-II-b、BA-III、BA-III-a等之一)具有式BA-III-b的结构：
Figure BDA0003580200980000911
在一些实施例中，环BA(例如，式BA-I、BA-II等之一)具有式BA-IV的结构：
Figure BDA0003580200980000912
其中：
环BAA是具有0-5个杂原子的任选地经取代的5-14元单环、双环或多环，并且
其他变量各自独立地如本文所述。
在一些实施例中，环BA(例如，式BA-I、BA-I-a、BA-II、BA-II-a等之一)具有式BA-IV-a的结构：
Figure BDA0003580200980000913
BA-IV-a
在一些实施例中，环BA(例如，式BA-I、BA-I-a、BA-II、BA-II-a等之一)具有式BA-IV-b的结构：
Figure BDA0003580200980000921
在一些实施例中，环BA(例如，式BA-I、BA-II、BA-III、BA-IV等之一)具有式BA-V的结构：
Figure BDA0003580200980000922
在一些实施例中，环BA(例如，式BA-I、BA-I-a、BA-II、BA-II-a、BA-III、BA-III-a、BA-IV、BA-IV-a、BA-V等之一)具有式BA-V-a的结构：
Figure BDA0003580200980000923
在一些实施例中，环BA(例如，式BA-I、BA-I-a、BA-I-b、BA-II、BA-II-a、BA-II-b、BA-III、BA-III-a、BA-III-b、BA-IV、BA-IV-a、BA-IV-b、BA-V、BA-V-a等之一)具有式BA-V-a的结构：
Figure BDA0003580200980000924
Figure BDA0003580200980000931
在一些实施例中，环BA具有式BA-VI的结构：
Figure BDA0003580200980000932
其中：
X1'是-N(-)-或-C(-)＝；
X2'是-C(O)-或-C(RB2')＝，其中RB2'是LB2'-R'；
每个
Figure BDA0003580200980000933
独立地是单键或双键；
X3'是-N(RB3')-或-N＝，其中RB3'是-LB3'-R'；
X4'是-C(RB4')＝、-C(ORB4')＝、-C(-N(RB4')2)＝、-C(RB4')2-、-C(O)-或-C(＝NRB4')-，其中每个RB4'独立地是-LB4'-RB41'，或同一个原子上的两个RB4'合在一起形成＝O、＝C(-LB4'-RB41')2、＝N-LB4'-RB41'、或任选地经取代的＝CH2或＝NH，其中每个RB41'独立地是-R'；
X5'是N(RB5')-或-N＝，其中RB5'是-LB5'-R'；
X6'是-C(RB6')＝、-C(ORB6')＝、-C(RB6')2-、-C(O)-或-N＝，其中每个RB6'独立地是-LB6'-RB61'，或同一个原子上的两个RB6'合在一起形成＝O、＝C(-LB6'-RB61')2、＝N-LB6'-RB61'、或任选地经取代的＝CH2或＝NH，其中每个RB61'独立地是R'；
X7'是-C(RB7')＝、-C(ORB6')＝、-C(RB7')2-、-C(O)-、-N(RB7')-或-N＝，其中每个RB7'独立地是-L7'-RB71'，或同一个原子上的两个RB7'合在一起形成＝O、＝C(-L7'-RB71')2、＝N-L7'-RB71'、或任选地经取代的＝CH2或＝NH，其中每个RB71'独立地是R'；
LB2'、LB3'、LB4'、LB5'和LB6'独立地是LB；以及
其他变量各自独立地如本文所述。
在一些实施例中，
Figure BDA0003580200980000941
是单键。在一些实施例中，
Figure BDA0003580200980000942
是双键。
在一些实施例中，X1是-(N-)-。在一些实施例中，X1是-C(-)＝。
在一些实施例中，X2是-C(O)-。在一些实施例中，X2是-C(RB2)＝。在一些实施例中，X2是-C(ORB2)＝。在一些实施例中，X2是-CH＝。
在一些实施例中，LB2是共价键。
在一些实施例中，RB2是适合于寡核苷酸合成的保护基，例如羟基保护基。在一些实施例中，RB2是R'。在一些实施例中，RB2是-H。
在一些实施例中，X3是-N(RB3)-。在一些实施例中，X3是-NH-。在一些实施例中，X3是-N＝。
在一些实施例中，LB3是共价键。
在一些实施例中，RB3是适合于寡核苷酸合成的保护基，例如氨基保护基(例如，Bz)。在一些实施例中，RB3是R'。在一些实施例中，RB3是-C(O)R。在一些实施例中，RB3是R。在一些实施例中，RB3是-H。
在一些实施例中，X4是-C(RB4)＝。在一些实施例中，X4是-C(R)＝。在一些实施例中，X4是-CH＝。在一些实施例中，X4是-C(ORB4)＝。在一些实施例中，X4是-C(-N(RB4)2)＝。在一些实施例中，X4是-C(-NHRB4)＝。在一些实施例中，X4是-C(-NHR')＝。在一些实施例中，X4是-C(-NHR')＝。在一些实施例中，X4是-C(-NH2)＝。在一些实施例中，X4是-C(-NHC(O)R)＝。在一些实施例中，X4是-C(RB4)2-。在一些实施例中，X4是-CH2-。在一些实施例中，X4是-C(O)-。在一些实施例中，X4是-C(O)-，其中O形成分子内氢键。在一些实施例中，O与相同BA的X5的氢键供体形成氢键。在一些实施例中，X4是-C(＝NRB4)-。在一些实施例中，X4是-C((＝NRB4)-，其中N形成分子内氢键。在一些实施例中，N与相同BA的X5的氢键供体形成氢键。
在一些实施例中，RB4-LB4-RB41。在一些实施例中，同一原子上的两个RB4合在一起形成＝O、＝C(-LB4-RB41)2、＝N-LB4-RB41或任选地经取代的＝CH2或＝NH。
在一些实施例中，同一原子上的两个RB4合在一起形成＝O。在一些实施例中，同一原子上的两个RB4合在一起形成＝C(-LB4-RB41)2。在一些实施例中，＝C(-LB4-RB41)2是＝CH-LB4-RB41。在一些实施例中，＝C(-LB4-RB41)2是＝CHR'。在一些实施例中，＝C(-LB4-RB41)2是＝CHR。在一些实施例中，同一原子上的两个RB4合在一起形成＝N-LB4-RB41。在一些实施例中，＝N-LB4-RB41是＝N-R。在一些实施例中，同一原子上的两个RB4合在一起形成＝CH2。在一些实施例中，同一原子上的两个RB4合在一起形成＝NH。在一些实施例中，所形成的基团是用于寡核苷酸合成的合适的保护基，例如氨基保护基。
在一些实施例中，X4是-C(-N＝C(-LB4-RB41)2)＝。在一些实施例中，X4是-C(-N＝CH-LB4-RB41)＝。在一些实施例中，X4是-C(-N＝CH-N(CH3)2)＝。
在一些实施例中，X4(例如，-C(＝N-R)-、＝C(R)-等)的R任选地与例如X5的另一个R合在一起形成如本文所述的环。
在一些实施例中，RB4是R'。在一些实施例中，RB4是R。在一些实施例中，RB4是-H。
在一些实施例中，RB4是适合于寡核苷酸合成的保护基，例如氨基或羟基保护基。在一些实施例中，RB4是R'。在一些实施例中，RB4是-CH2CH2-(4-硝基苯基)。
在一些实施例中，LB4是共价键。在一些实施例中，LB4不是共价键。在一些实施例中，至少一个亚甲基单元被-C(O)-代替。在一些实施例中，至少一个亚甲基单元被-C(O)N(R')-代替。在一些实施例中，至少一个亚甲基单元被-N(R')-代替。在一些实施例中，至少一个亚甲基单元被-NH-代替。在一些实施例中，LB4是或包含任选地经取代的-N＝CH-。
在一些实施例中，RB41是R'。在一些实施例中，RB41是-H。在一些实施例中，RB41是R。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，R是苯基。
在一些实施例中，X5是-C(RB5)2-。在一些实施例中，X5是-ChRB5-。在一些实施例中，X5是-CH2-。在一些实施例中，X5是-N(RB5)-。在一些实施例中，X5是-NH-。在一些实施例中，X5是-C(RB5)＝。在一些实施例中，X5是-C(R)＝。在一些实施例中，X5是-CH＝。在一些实施例中，X5是-N＝。在一些实施例中，X5是-C(O)-。
在一些实施例中，RB5是卤素。在一些实施例中，RB5是-LB5-RB51。在一些实施例中，RB5是-LB5-RB51，其中RB51是R'、-NHR'、-OH或-SH。在一些实施例中，RB5是-LB5-RB51，其中RB51是-NHR、-OH或-SH。在一些实施例中，RB5是-LB5-RB51，其中RB51是-NH2、-OH或-SH。在一些实施例中，RB5是-C(O)-RB51。在一些实施例中，RB5是R'。在一些实施例中，RB5是R。在一些实施例中，RB5是-H。在一些实施例中，RB5是-OH。在一些实施例中，RB5是-CH2OH。
在一些实施例中，当X4是-C(O)-时，X5是-C(RB5)2-、-C(RB5)＝或-N(RB5)-，其中RB5是LB5-RB51，其中RB51是NHR'、OH或-SH。在一些实施例中，X4是-C(O)-，并且RB51是或包含氢键供体，其与X4的O形成氢键。
在一些实施例中，LB5是共价键。在一些实施例中，LB5是或包含C(O)-。在一些实施例中，LB5是或包含-O-。在一些实施例中，LB5是或包含-OC(O)-。在一些实施例中，LB5是或包含-CH2OC(O)-。
在一些实施例中，R51是-R'。在一些实施例中，R51是-R。在一些实施例中，R51是-H。在一些实施例中，R51是-N(R')2。在一些实施例中，R51是-NHR'。在一些实施例中，R51是-NHR。在一些实施例中，R51是-NH2。在一些实施例中，R51是-OR'。在一些实施例中，R51是-OR。在一些实施例中，R51是-OH。在一些实施例中，R51是-SR'。在一些实施例中，R51是-SR。在一些实施例中，R51是-SH。在一些实施例中，R是苄基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，R是苯基。在一些实施例中，R是甲基。
在一些实施例中，RB5是-C(O)-RB51。在一些实施例中，RB5是-C(O)NHCH2Ph。在一些实施例中，RB5是-C(O)NHPh。在一些实施例中，RB5是-C(O)NHCH3。在一些实施例中，RB5是-OC(O)-RB51。在一些实施例中，RB5是-OC(O)-R。在一些实施例中，RB5是-OC(O)CH3。
在一些实施例中，X5直接键合到X1，并且环BA是5元的。
在一些实施例中，X6是-C(RB6)＝。在一些实施例中，X6是-CH＝。在一些实施例中，X6是-C(ORB6)＝。在一些实施例中，X6是-C(RB6)2-。在一些实施例中，X6是-CH2-。在一些实施例中，X6是-C(O)-。在一些实施例中，X6是-N＝。
在一些实施例中，RB6是-LB6-RB61。在一些实施例中，同一原子上的两个RB6合在一起形成＝O、＝C(-LB6-RB61)2、＝N-LB6-RB61或任选地经取代的＝CH2或＝NH。在一些实施例中，同一原子上的两个RB6合在一起形成＝O。在一些实施例中，LB6是共价键。在一些实施例中，RB6是R。在一些实施例中，RB6是-H。
在一些实施例中，RB6是适合于寡核苷酸合成的保护基，例如氨基或羟基保护基。在一些实施例中，RB6是R。在一些实施例中，
在一些实施例中，LB6是共价键。在一些实施例中，LB6是任选地经取代的C1-10亚烷基。在一些实施例中，LB6是-CH2CH2-。在一些实施例中，RB6是-CH2CH2-(4-硝基苯基)。
在一些实施例中，RB61是R'。在一些实施例中，RB61是R。在一些实施例中，RB61是-H。
在一些实施例中，环BAA是5元的。在一些实施例中，环BAA是5元的。在一些实施例中，环BAA具有一个杂原子。在一些实施例中，环BAA具有2个杂原子。在一些实施例中，杂原子是氮。在一些实施例中，杂原子是氧。
在一些实施例中，X1'是-(N-)-。在一些实施例中，X1'是-C(-)＝。
在一些实施例中，X2'是-C(O)-。在一些实施例中，X2'是-C(RB2')＝。在一些实施例中，X2'是-CH＝。
在一些实施例中，LB2'是共价键。
在一些实施例中，RB2'是R'。在一些实施例中，RB2'是R。在一些实施例中，RB2'是-H。在一些实施例中，X2'是-CH＝。
在一些实施例中，X3'是-N(RB3')-。在一些实施例中，X3'是-N(R')-。在一些实施例中，X3'是-NH-。在一些实施例中，X3'是-N＝。
在一些实施例中，LB3'是共价键。
在一些实施例中，RB3'是R'。在一些实施例中，RB3'是R。在一些实施例中，RB3'是-H。
在一些实施例中，X4'是-C(RB4')＝。在一些实施例中，X4'是-C(ORB4')＝。在一些实施例中，X4'是-C(-N(RB4')2)＝。在一些实施例中，X4'是-C(-NHRB4')＝。在一些实施例中，X4'是-C(-NH2)＝。在一些实施例中，X4'是-C(-NHR')＝。在一些实施例中，X4'是-C(-NHC(O)R)＝。在一些实施例中，X4'是-C(RB4')2-。在一些实施例中，X4'是-C(O)-。在一些实施例中，X4'是-C(＝NRB4')-。
在一些实施例中，RB4'是-LB4'-RB41'。在一些实施例中，同一原子上的两个RB4'合在一起形成＝O、＝C(-LB4'-RB41')2、＝N-LB4'-RB41'或任选地经取代的＝CH2或＝NH。在一些实施例中，同一原子上的两个RB4'合在一起形成＝O。在一些实施例中，同一原子上的两个RB4'合在一起形成＝C(-LB4'-RB41')2。在一些实施例中，同一原子上的两个RB4'合在一起形成＝N-LB4'-RB41'。在一些实施例中，同一原子上的两个RB4'合在一起形成＝CH2。在一些实施例中，同一原子上的两个RB4'合在一起形成＝NH。在一些实施例中，所形成的基团是用于寡核苷酸合成的合适的保护基，例如氨基保护基。
在一些实施例中，X4'是-C(-N＝C(-LB4'-RB41')2)＝。在一些实施例中，X4'是-C(-N＝CH-LB4'-RB41')＝。在一些实施例中，X4'是-C(-N＝CH-N(CH3)2)＝。
在一些实施例中，RB4'是R'。在一些实施例中，RB4'是R。在一些实施例中，RB4'是-H。
在一些实施例中，RB4'是适合于寡核苷酸合成的保护基，例如氨基或羟基保护基。在一些实施例中，RB4'是R'。在一些实施例中，RB4'是-CH2CH2-(4-硝基苯基)。
在一些实施例中，LB4'是共价键。在一些实施例中，LB4'是任选地经取代的C1-10亚烷基。在一些实施例中，LB4'是-CH2CH2-。在一些实施例中，至少一个亚甲基单元被-N(R')-代替。在一些实施例中，R'是R。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，R是苯基。在一些实施例中，R是甲基。在一些实施例中，R是-H。
在一些实施例中，RB41'是R'。在一些实施例中，RB41'是R。在一些实施例中，RB41'是-H。
在一些实施例中，X5'是-N(RB5')-。在一些实施例中，X5'是-NH-。在一些实施例中，X5'是-N＝。
在一些实施例中，LB5'是共价键。
在一些实施例中，RB5'是R'。在一些实施例中，RB5'是R。在一些实施例中，RB5'是-H。
在一些实施例中，X6'是-C(RB6')＝。在一些实施例中，X6'是-CH＝。在一些实施例中，X6'是-C(ORB6')＝。在一些实施例中，X6'是-C(RB6')2-。在一些实施例中，X6'是-C(O)-。在一些实施例中，X6'是-N＝。
在一些实施例中，RB6'是-LB6'-RB61'。在一些实施例中，同一原子上的两个RB6'合在一起形成＝O、＝C(-LB6'-RB61')2、＝N-LB6'-RB61'或任选地经取代的＝CH2或＝NH。在一些实施例中，同一原子上的两个RB6'合在一起形成＝O。
在一些实施例中，LB6'是共价键。在一些实施例中，LB6'是任选地经取代的C1-10亚烷基。在一些实施例中，LB6'是-CH2CH2-。
在一些实施例中，RB6'是R'。在一些实施例中，RB6'是R。在一些实施例中，RB6'是-H。在一些实施例中，RB6'是适合于寡核苷酸合成的保护基，例如氨基或羟基保护基。在一些实施例中，RB6'是R'。在一些实施例中，RB6'是-CH2CH2-(4-硝基苯基)。
在一些实施例中，RB61'是R'。在一些实施例中，RB61'是R。在一些实施例中，RB61'是-H。
在一些实施例中，X7'是-C(RB7')＝。在一些实施例中，X7'是-CH＝。在一些实施例中，X7'是-C(ORB7')＝。在一些实施例中，X7'是-C(RB7')2-。在一些实施例中，X7'是-C(O)-。在一些实施例中，X7'是-N(RB7')-。在一些实施例中，X7'是-NH-。在一些实施例中，X7'是-N＝。
在一些实施例中，RB7'是-L7'-RB71'。在一些实施例中，同一原子上的两个RB7'合在一起形成＝O、＝C(-L7'-RB71')2、＝N-L7'-RB71'或任选地经取代的＝CH2或＝NH。在一些实施例中，同一原子上的两个RB7'合在一起形成＝O。在一些实施例中，L7'是共价键。在一些实施例中，RB7'是R。在一些实施例中，RB7'是-H。
在一些实施例中，RB71'是R'。在一些实施例中，RB71'是R。在一些实施例中，RB71'是-H。
在一些实施例中，LB是共价键。在一些实施例中，LB是任选地经取代的二价C1-10饱和或部分不饱和脂肪族链，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被-Cy-、-O-、-S-、-N(R')-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR')-、-C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R')-、-C(O)S-或-C(O)O-代替。在一些实施例中，LB是具有1-6个杂原子的任选地经取代的二价C1-10饱和或部分不饱和的杂脂肪族链，其中一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被-Cy-、-O-、-S-、-N(R')-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR')-、-C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R')-、-C(O)S-或-C(O)O-代替。在一些实施例中，至少亚甲基单元被代替。在一些实施例中，LB是任选地经取代的C1-10亚烷基。在一些实施例中，LB是-CH2CH2-。在一些实施例中，至少一个亚甲基单元被-C(O)-代替。在一些实施例中，至少一个亚甲基单元被-C(O)N(R')-代替。在一些实施例中，至少一个亚甲基单元被-N(R')-代替。在一些实施例中，至少一个亚甲基单元被-NH-代替。在一些实施例中，至少一个亚甲基单元被-Cy-代替。在一些实施例中，LB是或包含任选地经取代的-N＝CH-。在一些实施例中，LB是或包含-C(O)-。在一些实施例中，LB是或包含-O-。在一些实施例中，LB是或包含-OC(O)-。在一些实施例中，LB是或包含-CH2OC(O)-。
在一些实施例中，每个-Cy-独立地是具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环、饱和、部分饱和的或芳族环。本文描述了-Cy-的合适的单环单元。在一些实施例中，-Cy-是单环的。在一些实施例中，-Cy-是双环的。在一些实施例中，-Cy-是多环的。在一些实施例中，-Cy-是具有0-5个杂原子的任选地经取代的二价3-10元单环、饱和或部分不饱和的环。在一些实施例中，-Cy-是具有0-5个杂原子的任选地经取代的二价5-10元芳环。在一些实施例中，-Cy-是任选地经取代的亚苯基。在一些实施例中，-Cy-是亚苯基。
在一些实施例中，R'是R。在一些实施例中，R'是-C(O)R。在一些实施例中，R'是-C(O)OR。在一些实施例中，R'是-C(O)N(R)2。在一些实施例中，R'是-SO2R。
在一些实施例中，多种结构中的R'是保护基(例如，对于氨基、羟基等)，例如，适合于寡核苷酸合成的保护基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，R是苯基。在一些实施例中，R是4-硝基苯基。在一些实施例中，R是-CH2CH2-(4-硝基苯基)。在一些实施例中，R'是-C(O)NPh2。
在一些实施例中，每个R独立地是-H或选自以下的任选地经取代的基团：C1-20脂肪族基、具有1-10个杂原子的C1-20杂脂肪族基、C6-30芳基、C6-30芳基脂肪族基、具有1-10个杂原子的C6-30芳基杂脂肪族基、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基和具有1-10个杂原子的3-30元杂环基。在一些实施例中，两个R基团任选地且独立地合在一起形成共价键。在一些实施例中，同一个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与该原子合在一起形成除该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环。在一些实施例中，同一个原子上的两个基团任选地且独立地与该原子合在一起形成除该原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-20元单环、双环或多环。在一些实施例中，两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选地且独立地与居于它们之间的原子合在一起形成除居于它们之间的原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。在一些实施例中，两个或更多个原子上的两个基团任选地且独立地与居于它们之间的原子合在一起形成除居于它们之间的原子外还具有0-10个杂原子的任选地经取代的3-30元单环、双环或多环。在一些实施例中，所形成的环是单环的。在一些实施例中，所形成的环是双环的。在一些实施例中，所形成的环是多环的。在一些实施例中，每个单环单元独立地是3-10(例如，3-8、3-7、3-6、5-10、5-8、5-7、5-6、3、4、5、6、7、8、9或10等)元的，并且独立地是饱和的、部分饱和的或芳族的，并且独立地具有0-5个杂原子。在一些实施例中，环是饱和的。在一些实施例中，环是部分饱和的。在一些实施例中，环是芳族的。在一些实施例中，所形成的环具有1-5个杂原子。在一些实施例中，所形成的环具有1个杂原子。在一些实施例中，所形成的环具有2个杂原子。在一些实施例中，杂原子是氮。在一些实施例中，杂原子是氧。
在一些实施例中，R是-H。
在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-20、C1-15、C1-10、C1-8、C1-6、C1-5、C1-4、C1-3或C1-2脂肪族基。在一些实施例中，R是任选地经取代的烷基。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R是任选地经取代的甲基。在一些实施例中，R是任选地经取代的环脂肪族基。在一些实施例中，R是任选地经取代的环烷基。
在一些实施例中，R是具有1-10个杂原子的任选地经取代的C1-20杂脂肪族基。
在一些实施例中，R是任选地经取代的C6-20芳基。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，R是苯基。
在一些实施例中，R是任选地经取代的C6-20芳基脂肪族基。在一些实施例中，R是任选地经取代的C6-20芳基烷基。在一些实施例中，R是苄基。在一些实施例中，R是具有1-10个杂原子的任选地经取代的C6-20芳基杂脂肪族基。
在一些实施例中，R是具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元杂芳基。在一些实施例中，R是具有1-4个杂原子的任选地经取代的5元杂芳基。在一些实施例中，R是具有1-4个杂原子的任选地经取代的6元杂芳基。在一些实施例中，R是具有1-10个杂原子的任选地经取代的3-20元杂环基。在一些实施例中，R是具有1-5个杂原子的任选地经取代的3-10元杂环基。在一些实施例中，R是具有1-5个杂原子的任选地经取代的5-6元杂环基。在一些实施例中，杂环基是饱和的。在一些实施例中，杂环基是部分饱和的。
在一些实施例中，杂原子选自硼、氮、氧、硫、硅和磷。在一些实施例中，杂原子选自氮、氧、硫和硅。在一些实施例中，杂原子选自氮、氧和硫。在一些实施例中，杂原子是氮。在一些实施例中，杂原子是氧。在一些实施例中，杂原子是硫。
如本领域技术人员所理解的，针对变量描述的实施例可以容易地组合以提供多种结构。本领域技术人员还理解，针对变量描述的实施例可以容易地用于可以是该变量的其他变量，例如，R的实施例用于R'RB2、RB3、RB4、RB5、RB6、RB2'、RB3'、RB4'、RB5'、RB6'等；LB的实施例用于LB2、LB3、LB4、LB5、LB6、LB2'、LB3'、LB4'、LB5'、LB6'等。示例性实施例及其组合包括但不限于本文例示的结构。某些实例描述如下。
例如，在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001031
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001032
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001033
在一些实施例中，X4是-C(O)-，并且X4的-C(O)-中的O可与R5的-H(例如，R5'的-NHR'、-OH或-SH中的-H)形成氢键。在一些实施例中，X4是-C(O)-，并且X5是-C(R5)＝。在一些实施例中，R5'是-NHR'。在一些实施例中，R5是-LB5-NHR'。在一些实施例中，LB5是任选地经取代的-CH2-。在一些实施例中，亚甲基单元被-C(O)-代替。在一些实施例中，LB5是-C(O)-。在一些实施例中，R'是任选地经取代的甲基。在一些实施例中，R'是-CH2Ph。在一些实施例中，R'是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，R'是苯基。在一些实施例中，R'是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，R'是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R'是任选地经取代的甲基。在一些实施例中，R'是甲基。在一些实施例中，环BA是任选地被保护的
Figure BDA0003580200980001041
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001042
在一些实施例中，环BA是任选地被保护的
Figure BDA0003580200980001043
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001044
在一些实施例中，环BA是任选地被保护的
Figure BDA0003580200980001045
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001046
在一些实施例中，环BA是任选地被保护的
Figure BDA0003580200980001047
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001048
在一些实施例中，环BA是任选地被保护的
Figure BDA0003580200980001049
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA00035802009800010410
在一些实施例中，环BA是任选地被保护的
Figure BDA00035802009800010411
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA00035802009800010412
在一些实施例中，环BA是任选地被保护的
Figure BDA0003580200980001051
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001052
在一些实施例中，X1是-C(-)＝，并且X4是＝C(-N(RB4)2)-。在一些实施例中，同一原子(例如，氮原子)上的两个R基团合在一起形成任选地经取代的＝CH2或＝NH。在一些实施例中，同一原子(例如，氮原子)上的两个R基团合在一起形成任选地经取代的＝C(-LB4-R)2、＝N-LB4-R。在一些实施例中，所形成的基团是＝CHN(R)2。在一些实施例中，所形成的基团是＝CHN(CH3)2。在一些实施例中，X4是＝C(-N＝CHN(CH3)2)-。在一些实施例中，-N(RB4)2是-NRB4。在一些实施例中，RB4是-NHC(O)R。在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001053
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001054
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001055
在一些实施例中，X1是-N(-)-，X2是-C(O)-，并且X3是-N(RB3)-。在一些实施例中，X1是-N(-)-，X2是-C(O)-，X3是-N(RB3)-，并且X4是-C(RB4)＝。在一些实施例中，X1是-N(-)-，X2是-C(O)-，X3是-N(RB3)-，X4是-C(RB4)＝，并且X5是-C(RB5)＝。在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001056
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001057
在一些实施例中，X3是-N(R')-。在一些实施例中，R'是-C(O)R。在一些实施例中，X4是-C(RB4)2-。在一些实施例中，RB4是-R。在一些实施例中，RB4是-H。在一些实施例中，X4是-CH2-。在一些实施例中，X5是-C(RB5)2-。在一些实施例中，RB5是-R。在一些实施例中，RB5是-H。在一些实施例中，X5是-CH2-。在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001061
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001062
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001063
在一些实施例中，X4是-C(RB4)＝。在一些实施例中，X4是-CH＝。在一些实施例中，X5是-C(RB5)＝。在一些实施例中，X5是-CH＝。在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001064
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001065
在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001066
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001067
在一些实施例中，X4是-C(RB4)2-。在一些实施例中，X4是-CH2-。在一些实施例中，X5是-C(RB5)＝。在一些实施例中，X5是-CH＝。在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001068
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001069
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA00035802009800010610
在一些实施例中，X1是-N(-)-，X2是-C(O)-，X3是-N(RB3)-，X4是-C(RB4)＝，X5是-C(RB5)＝，X6是-C(O)-。在一些实施例中，RB3、RB4和RB5各自独立地是R。在一些实施例中，RB3是-H。在一些实施例中，RB4是-H。在一些实施例中，RB5是-H。在一些实施例中，BA是或包含任选地经取代的或被保护的
Figure BDA00035802009800010611
在一些实施例中，BA是
Figure BDA00035802009800010612
在一些实施例中，X1是-N(-)-，X2是-C(O)-，X3是-N(RB3)-。在一些实施例中，X4是-C(RB4)2-，其中两个RB4合在一起形成＝O或＝C(-LB4-RB41)2、＝N-LB4-RB41。在一些实施例中，X4是-C(＝NRB4)-。在一些实施例中，X5是-C(RB5)＝。在一些实施例中，RB41或RB4和RB5是R，并且与居于它们之间的原子合在一起形成如本文所述的任选地经取代的环。在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001071
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001072
在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001073
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001074
在一些实施例中，X1是-N(-)-，X2是-C(O)-，X3是-N＝。在一些实施例中，X4是-C(-N(RB4)2)＝。在一些实施例中，X4是-C(-NHRB4)＝。在一些实施例中，X5是-C(RB5)＝。在一些实施例中，一个RB4和RB5合在一起形成如本文所述的任选地经取代的环。在一些实施例中，所形成的环是具有氮原子的任选地经取代的5元环。在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001075
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001076
在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001077
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001078
在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001079
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA00035802009800010710
在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001081
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001082
在一些实施例中，环BA具有式BA-IV或BA-V的结构。在一些实施例中，X1是-N(-)-，X2是-C(O)-，并且X3是-N＝。在一些实施例中，X1是-N(-)-，X2是-C(O)-，X3是-N＝，并且X6是-C(RB6)＝。在一些实施例中，环BAA是5-6元的。在一些实施例中，环BAA是单环的。在一些实施例中，环BAA是部分不饱和的。在一些实施例中，环BAA是芳族的。在一些实施例中，环BAA具有0-2个杂原子。在一些实施例中，环BAA具有1-2个杂原子。在一些实施例中，环BAA具有一个杂原子。在一些实施例中，环BAA具有2个杂原子。在一些实施例中，杂原子是氮。在一些实施例中，杂原子是氧。在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001083
或
Figure BDA0003580200980001084
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001085
或
Figure BDA0003580200980001086
在一些实施例中，环BA是任选地经取代的5元环。在一些实施例中，X1键合到X5。在一些实施例中，X4和X5各自独立地是-CH＝。在一些实施例中，X1是-N(-)-，X2是-C(O)-，X3是-NH-，X4是-CH＝，并且X5是-CH＝。在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001087
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001088
在一些实施例中，环BA具有式BA-VI的结构。在一些实施例中，X1'是-N(-)-，X2'是-C(O)-并且X3'是-N(RB3)-。在一些实施例中，X1'是-N(-)-，X2'是-C(O)-，X3'是-N(RB3)-，X4'是-C(RB4')＝，X5'是-N＝，X6'是-C(RB6')＝，并且X7'是-N＝。在一些实施例中，X1'是-N(-)-，X2'是-C(O)-，X3'是-N(RB3)-，X4'是-C(RB4')＝，X5'是-C(RB5')＝，X6'是-C(RB6')＝，并且X7'是-C(RB7')＝。在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001091
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001092
在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001093
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001094
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001095
在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001096
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001097
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001098
在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001099
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001101
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001102
在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001103
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001104
在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001105
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001106
在一些实施例中，X1'是-N(-)-，X2'是-C(RB2')＝，并且X3'是-N＝。在一些实施例中，X1'是-N(-)-，X2'是-C(RB2')＝，X3'是-N＝，X4'是-C(-N(RB4')2)＝，X5'是-N＝，X6'是-C(O)-，并且X7'是-N(RB7')-。在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001107
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001108
在一些实施例中，X1是-C(-)＝，X2是-C(O)-，并且X3是-N(RB3)-。在一些实施例中，X1是-C(-)＝，X2是-C(O)-，X3是-N(RB3)-、-C(-N(RB4)2)＝，并且X4是-C(RB4)＝。在一些实施例中，X1是-C(-)＝，X2是-C(O)-，X3是-N(RB3)-、-C(-N(RB4)2)＝，X4是-C(RB4)＝，并且X6是-C(RB6)＝。在一些实施例中，RB3、RB4和RB6各自独立地是-H。在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001111
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001112
在一些实施例中，环BA是任选地经取代的或被保护的
Figure BDA0003580200980001113
在一些实施例中，环BA是
Figure BDA0003580200980001114
如本文所述，环BA可以是任选地经取代的。在一些实施例中，当X2、X3、X4、X5、X6、X2'、X3'、X4'、X5'、X6'和X7'是-CH＝、-C(OH)＝、-C(-NH2)＝、-CH2-、-C(＝NH)-或-NH-时，它们各自独立地且任选地经取代。在一些实施例中，当X2、X3、X4、X5、X6、X2'、X3'、X4'、X5'、X6'和X7'是-CH＝、-CH2-或-NH-时，它们各自独立地且任选地经取代。在一些实施例中，当X2、X3、X4、X5、X6、X2'、X3'、X4'、X5'、X6'和X7'是-CH＝时，它们各自独立地且任选地经取代。在一些实施例中，当X2、X3、X4、X5、X6、X2'、X3'、X4'、X5'、X6'和X7'是-CH2-时，它们各自独立地且任选地经取代。在一些实施例中，当X2、X3、X4、X5、X6、X2'、X3'、X4'、X5'、X6'和X7'是-NH-时，它们各自独立地且任选地经取代。在一些实施例中，X2是任选地经取代的-CH＝、-C(OH)＝、-C(-NH2)＝、-CH2-、-C(＝NH)-或-NH-。在一些实施例中，X3是任选地经取代的-CH＝、-C(OH)＝、-C(-NH2)＝、-CH2-、-C(＝NH)-或-NH-。在一些实施例中，X4是任选地经取代的-CH＝、-C(OH)＝、-C(-NH2)＝、-CH2-、-C(＝NH)-或-NH-。在一些实施例中，X5是任选地经取代的-CH＝、-C(OH)＝、-C(-NH2)＝、-CH2-、-C(＝NH)-或-NH-。在一些实施例中，X6是任选地经取代的-CH＝、-C(OH)＝、-C(-NH2)＝、-CH2-、-C(＝NH)-或-NH-。在一些实施例中，X2'是任选地经取代的-CH＝、-C(OH)＝、-C(-NH2)＝、-CH2-、-C(＝NH)-或-NH-。在一些实施例中，X3'是任选地经取代的-CH＝、-C(OH)＝、-C(-NH2)＝、-CH2-、-C(＝NH)-或-NH-。在一些实施例中，X4'是任选地经取代的-CH＝、-C(OH)＝、-C(-NH2)＝、-CH2-、-C(＝NH)-或-NH-。在一些实施例中，X5'是任选地经取代的-CH＝、-C(OH)＝、-C(-NH2)＝、-CH2-、-C(＝NH)-或-NH-。在一些实施例中，X6'是任选地经取代的-CH＝、-C(OH)＝、-C(-NH2)＝、-CH2-、-C(＝NH)-或-NH-。在一些实施例中，X7'是任选地经取代的-CH＝、-C(OH)＝、-C(-NH2)＝、-CH2-、-C(＝NH)-或-NH-。
如本文所展示，在一些实施例中，所提供的包含与靶腺苷相反的某些核碱基(例如，b001A、b002A、b008U、C、A等)的寡核苷酸尤其可以提供改善的编辑效率(例如，与参考核碱基诸如U相比)。在一些实施例中，相反核苷在其3'侧与I连接。
在一些实施例中，相反核苷是无碱基的，例如具有L010
Figure BDA0003580200980001121
L012
Figure BDA0003580200980001122
或L028
Figure BDA0003580200980001123
的结构。如本领域技术人员所理解的和在多种寡核苷酸中所展示的，无碱基核苷也可用于寡核苷酸的其他部分，并且寡核苷酸可以包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5个或更多个)任选地连续的无碱基核苷。在一些实施例中，第一结构域包含一个或多个任选地连续的无碱基核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个且不多于一个无碱基核苷。在一些实施例中，每个无碱基核苷独立地在第一结构域中或在第二结构域的第一子结构域中。在一些实施例中，每个无碱基核苷独立地在第一结构域中。在一些实施例中，每个无碱基核苷独立地在第二结构域的第一子结构域中。在一些实施例中，无碱基核苷与靶腺苷相反。如本文所展示，单个无碱基核苷可以代替各自独立地包含参考寡核苷酸中的核碱基的一个或多个核苷，例如，L010可用于代替1个包含核碱基的核苷，L012可用于代替1、2或3个各自独立地包含核碱基的核苷，并且L028可用于代替1、2或3个各自独立地包含核碱基的核苷。在一些实施例中，碱性核苷通过立体随机键联(例如，立体随机硫代磷酸酯核苷酸间键联)连接到其3'紧邻核苷(其任选地是无碱基的)。在一些实施例中，每个碱性核苷独立地通过立体随机键联(例如，立体随机硫代磷酸酯核苷酸间键联)连接到其3'紧邻核苷(其任选地是无碱基的)。
在一些实施例中，与靶腺嘌呤相反的经修饰的核碱基可以极大地改善寡核苷酸的特性和/或活性。在一些实施例中，在相反位置处的经修饰的核碱基可以提供高活性，甚至当存在与其相邻(例如，在3'侧)的G时，和/或其他核碱基(例如，C)提供低得多的活性或几乎检测不到的活性。
在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个包含两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)。在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个包含2'-OH的糖(例如，天然RNA糖)。在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个经修饰的糖。在一些实施例中，经修饰的糖包含2'-修饰。在一些实施例中，经修饰的糖是双环糖，例如LNA糖。在一些实施例中，经修饰的糖是无环糖(例如，通过断裂相应环糖的C2-C3键)。
在一些实施例中，第二结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖。在一些实施例中，第二结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖，其独立地是双环糖(例如，LNA糖)或2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第二结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖，其独立地是2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，数目为1。在一些实施例中，数目为2。在一些实施例中，数目为3。在一些实施例中，数目为4。在一些实施例中，数目为5。在一些实施例中，数目为6。在一些实施例中，数目为7。在一些实施例中，数目为8。在一些实施例中，数目为9。在一些实施例中，数目为10。在一些实施例中，数目为11。在一些实施例中，数目为12。在一些实施例中，数目为13。在一些实施例中，数目为14。在一些实施例中，数目为15。在一些实施例中，数目为16。在一些实施例中，数目为17。在一些实施例中，数目为18。在一些实施例中，数目为19。在一些实施例中，数目为20。在一些实施例中，R是甲基。
在一些实施例中，第二结构域中所有糖的约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，第二结构域中所有糖的约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)独立地是双环糖(例如，LNA糖)或2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第二结构域中所有糖的约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)独立地是2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，百分比为至少约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。在一些实施例中，R是甲基。
在一些实施例中，第二结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖，其独立地具有不是2'-F的修饰。在一些实施例中，第二结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是具有不是2'-F的修饰的经修饰的糖。在一些实施例中，第二结构域中约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是具有不是2'-F的修饰的经修饰的糖。在一些实施例中，第二结构域的经修饰的糖各自独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个2'-F修饰的糖。在一些实施例中，第二结构域不含2'-F修饰的糖。在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个双环糖和/或2'-OR修饰的糖，其中R不是-H。在一些实施例中，与2'-F修饰的糖的水平相比，单独或组合的双环糖和/或2'-OR修饰的糖(其中R不是-H)的水平相对较高。在一些实施例中，第二结构域中不超过约1％-95％(例如，不超过约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％等)的糖包含2'-F。在一些实施例中，第二结构域中不超过约50％的糖包含2'-F。在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-N(R)2修饰的经修饰的糖。在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-NH2修饰的经修饰的糖。在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)双环糖，例如LNA糖。在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)无环糖(例如，UNA糖)。
在一些实施例中，第二结构域中不超过约1％-95％(例如，不超过约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％等)的糖包含2'-MOE。在一些实施例中，第二结构域中不超过约50％的糖包含2'-MOE。在一些实施例中，第二结构域中没有糖包含2'-MOE。
在一些实施例中，第二结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，第二结构域中的核苷酸间键联的约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，第二结构域中的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的或手性的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的或手性的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的或手性的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联，例如n001。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或中性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，第二结构域中的至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，第二结构域中的手性核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是手性控制的。在一些实施例中，第二结构域中的硫代磷酸酯核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是手性控制的。在一些实施例中，每个独立地是手性控制的。在一些实施例中，第二结构域中的至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，每个独立地是手性控制的。在一些实施例中，第二结构域中的至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)硫代磷酸酯核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，第二结构域中的手性核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是Sp。在一些实施例中，第二结构域中的硫代磷酸酯核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是Sp。在一些实施例中，数目为一个或多个。在一些实施例中，数目为2个或更多个。在一些实施例中，数目为3个或更多个。在一些实施例中，数目为4个或更多个。在一些实施例中，数目为5个或更多个。在一些实施例中，数目为6个或更多个。在一些实施例中，数目为7个或更多个。在一些实施例中，数目为8个或更多个。在一些实施例中，数目为9个或更多个。在一些实施例中，数目为10个或更多个。在一些实施例中，数目为11个或更多个。在一些实施例中，数目为12个或更多个。在一些实施例中，数目为13个或更多个。在一些实施例中，数目为14个或更多个。在一些实施例中，数目为15个或更多个。在一些实施例中，百分比为至少约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。在一些实施例中，连接两个第二结构域核苷的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是Sp手性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联独立地是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，第二结构域的核苷酸间键联与第二结构域的两个核苷键合。在一些实施例中，与第一结构域中的核苷和第二结构域中的核苷键合的核苷酸间键联可以被适当地认为是第二结构域的核苷酸间键联。在一些实施例中，据观察，高百分比的Sp核苷酸间键联(例如，相对于Rp核苷酸间键联和/或天然磷酸酯键联)可以提供改善的特性和/或活性，例如，高稳定性和/或高腺苷编辑活性。
在一些实施例中，第二结构域包含一定水平的Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，水平为第二结构域中的所有核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，水平为第二结构域中的所有手性核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，水平为第二结构域中的所有手性控制的核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，百分比为约或不超过约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约5％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约10％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约15％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约20％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约25％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约30％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约35％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约40％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约45％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约50％。在一些实施例中，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸间键联独立地是Rp手性核苷酸间键联。在一些实施例中，数目为约或不大于约1。在一些实施例中，数目为约或不大于约2。在一些实施例中，数目为约或不大于约3。在一些实施例中，数目为约或不大于约4。在一些实施例中，数目为约或不大于约5。在一些实施例中，数目为约或不大于约6。在一些实施例中，数目为约或不大于约7。在一些实施例中，数目为约或不大于约8。在一些实施例中，数目为约或不大于约9。在一些实施例中，数目为约或不大于约10。
在一些实施例中，第二结构域中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性控制的。在一些实施例中，每个独立地是Sp或Rp。在一些实施例中，高水平是如本文所述的Sp。在一些实施例中，第二结构域中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，一个或多个，例如约1-5个(例如，约1、2、3、4或5个)是Rp。
在一些实施例中，第二结构域中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性控制的。在一些实施例中，每个独立地是Sp或Rp。在一些实施例中，高水平是如本文所述的Sp。在一些实施例中，第二结构域中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，一个或多个，例如约1-5个(例如，约1、2、3、4或5个)是Rp。
在一些实施例中，如在某些实例中所展示的，第二结构域包含一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联，其各自任选地并且独立地是手性控制的。在一些实施例中，每个不带负电荷的核苷酸间键联独立地是n001。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，每个手性不带负电荷的核苷酸间键联都不是手性控制的。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Rp。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，每个手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，第二结构域中不带负电荷的核苷酸间键联的数目为约1-10，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施例中，其为约1。在一些实施例中，其为约2。在一些实施例中，其为约3。在一些实施例中，其为约4。在一些实施例中，其为约5。在一些实施例中，两个或更多个不带负电荷的核苷酸间键联是连续的。在一些实施例中，没有两个不带负电荷的核苷酸间键联是连续的。在一些实施例中，第二结构域中的所有不带负电荷的核苷酸间键联都是连续的(例如，3个连续的不带负电荷的核苷酸间键联)。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联，或两个或更多个(例如，约2个、约3个、约4个等)连续的不带负电荷的核苷酸间键联位于第二结构域的3'-末端。在一些实施例中，第二结构域的最后两个或三个或四个核苷酸间键联包含至少一个不是不带负电荷的核苷酸间键联的核苷酸间键联。在一些实施例中，第二结构域的最后两个或三个或四个核苷酸间键联包含至少一个不是n001的核苷酸间键联。
在一些实施例中，连接第二结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是Sp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是Rp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，第二结构域的最后两个核苷是寡核苷酸的最后两个核苷。在一些实施例中，连接第二结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是Sp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是Rp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联，诸如n001。
在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，第二结构域不含天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，第二结构域募集蛋白诸如ADAR蛋白，促进或有助于该蛋白的募集。在一些实施例中，第二结构域募集蛋白诸如ADAR蛋白，或促进或有助于与该蛋白的相互作用。在一些实施例中，第二结构域与ADAR的RNA结合结构域(RBD)接触。在一些实施例中，第二结构域与ADAR的具有脱氨酶活性的催化结构域接触。在一些实施例中，多种核碱基、糖和/或核苷酸间键联可与蛋白(例如，ADAR蛋白)的一个或多个残基相互作用。
在一些实施例中，第二结构域包含如本文所述的第一子结构域或由其组成。在一些实施例中，第二结构域包含如本文所述的第二子结构域或由其组成。在一些实施例中，第二结构域如本文所述的第三子结构域或由其组成。在一些实施例中，第二结构域从5'至3'包含第一子结构域、第二子结构域和第三子结构域，或由这些结构域组成。下面描述此类子结构域的某些实施例。
第一子结构域
如本文所述，在一些实施例中，寡核苷酸从5'至3'包含第一结构域和第二结构域。在一些实施例中，第二结构域从5'至3'包含第一子结构域、第二子结构域和第三子结构域或由这些结构域组成。下文以实例描述第一子结构域的某些实施例。在一些实施例中，第一子结构域包含与待修饰(例如，转化成I)的靶腺苷相反的核苷。
在一些实施例中，第一子结构域具有约1-50、1-40、1-30、1-20个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等)核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有约5-30个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有约10-30个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有约10-20个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有约5-15个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有约13-16个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有约6-12个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有约6-9个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有约1-10个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有约1-7个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有1个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有2个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有3个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有4个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有5个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有6个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有7个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有8个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有9个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有10个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有11个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有12个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有13个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有14个核碱基的长度。在一些实施例中，第一子结构域具有15个核碱基的长度。
在一些实施例中，第一子结构域是第二结构域的约或至少约5％-95％、10％-90％、20％-80％、30％-70％、40％-70％、40％-60％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％。在一些实施例中，百分比为约30％-80％。在一些实施例中，百分比为约30％-70％。在一些实施例中，百分比为约40％-60％。在一些实施例中，百分比为约20％。在一些实施例中，百分比为约25％。在一些实施例中，百分比为约30％。在一些实施例中，百分比为约35％。在一些实施例中，百分比为约40％。在一些实施例中，百分比为约45％。在一些实施例中，百分比为约50％。在一些实施例中，百分比为约55％。在一些实施例中，百分比为约60％。在一些实施例中，百分比为约65％。在一些实施例中，百分比为约70％。在一些实施例中，百分比为约75％。在一些实施例中，百分比为约80％。在一些实施例中，百分比为约85％。在一些实施例中，百分比为约90％。
在一些实施例中，当寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，在第一子结构域中存在一个或多个(例如，1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)错配。在一些实施例中，存在1个错配。在一些实施例中，存在2个错配。在一些实施例中，存在3个错配。在一些实施例中，存在4个错配。在一些实施例中，存在5个错配。在一些实施例中，存在6个错配。在一些实施例中，存在7个错配。在一些实施例中，存在8个错配。在一些实施例中，存在9个错配。在一些实施例中，存在10个错配。
在一些实施例中，当寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，在第一子结构域中存在一个或多个(例如，1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)摇摆。在一些实施例中，存在1个摇摆。在一些实施例中，存在2个摇摆。在一些实施例中，存在3个摇摆。在一些实施例中，存在4个摇摆。在一些实施例中，存在5个摇摆。在一些实施例中，存在6个摇摆。在一些实施例中，存在7个摇摆。在一些实施例中，存在8个摇摆。在一些实施例中，存在9个摇摆。在一些实施例中，存在10个摇摆。
在一些实施例中，第一子结构域区域中的寡核苷酸和靶核酸的双链体包含一个或多个凸起，每个凸起独立地包含一个或多个不是摇摆的错配。在一些实施例中，存在0-10个(例如，0-1、0-2、0-3、0-4、0-5、0-6、0-7、0-8、0-9、0-10、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)凸起。在一些实施例中，数目为0。在一些实施例中，数目为1。在一些实施例中，数目为2。在一些实施例中，数目为3。在一些实施例中，数目为4。在一些实施例中，数目为5。
在一些实施例中，第一子结构域与靶核酸完全互补。
在一些实施例中，第一子结构域包含一个或多个经修饰的核碱基。
在一些实施例中，第一子结构域包含与靶腺苷相反的核苷，例如当寡核苷酸与靶核酸形成双链体时。本文描述了合适的核碱基，包括相反核苷中的经修饰的核碱基。例如，在一些实施例中，相反核碱基是任选地经取代的或被保护的核碱基，其选自C、C的互变异构体、U、U的互变异构体、A、A的互变异构体和是或包含具有以下结构的环BA的核碱基：BA-I、BA-I-a、BA-I-b、BA-II、BA-II-a、BA-II-b、BA-III、BA-III-a、BA-III-b、BA-IV、BA-IV-a、BA-IV-b、BA-V、BA-V-a、BA-V-b或BA-VI，或环BA的互变异构体。
在一些实施例中，第一子结构域包含一个或多个包含两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)。在一些实施例中，第一子结构域包含一个或多个包含2'-OH的糖(例如，天然RNA糖)。在一些实施例中，第一子结构域包含一个或多个经修饰的糖。在一些实施例中，经修饰的糖包含2'-修饰。在一些实施例中，经修饰的糖是双环糖，例如LNA糖。在一些实施例中，经修饰的糖是无环糖(例如，通过断裂相应环糖的C2-C3键)。
在一些实施例中，第一子结构域包含约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖。在一些实施例中，第一子结构域包含约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖，其独立地是双环糖(例如，LNA糖)或2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第一子结构域包含约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖，其独立地是2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，数目为1。在一些实施例中，数目为2。在一些实施例中，数目为3。在一些实施例中，数目为4。在一些实施例中，数目为5。在一些实施例中，数目为6。在一些实施例中，数目为7。在一些实施例中，数目为8。在一些实施例中，数目为9。在一些实施例中，数目为10。在一些实施例中，数目为11。在一些实施例中，数目为12。在一些实施例中，数目为13。在一些实施例中，数目为14。在一些实施例中，数目为15。在一些实施例中，数目为16。在一些实施例中，数目为17。在一些实施例中，数目为18。在一些实施例中，数目为19。在一些实施例中，数目为20。在一些实施例中，R是甲基。
在一些实施例中，第一子结构域中所有糖的约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，第一子结构域中所有糖的约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)独立地是双环糖(例如，LNA糖)或2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第一子结构域中所有糖的约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)独立地是2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，百分比为至少约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。在一些实施例中，R是甲基。
在一些实施例中，第一子结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖，其独立地具有不是2'-F的修饰。在一些实施例中，第一子结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是具有不是2'-F的修饰的经修饰的糖。在一些实施例中，第一子结构域中约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是具有不是2'-F的修饰的经修饰的糖。在一些实施例中，第一子结构域的经修饰的糖各自独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
在一些实施例中，第一子结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖，其独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第一子结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖的经修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第一子结构域中约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖的经修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
在一些实施例中，第一子结构域中的每个糖独立地包含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰。在一些实施例中，第一子结构域中的每个糖独立地包含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰，其中LB是任选地经取代的-CH2-。在一些实施例中，第一子结构域中的每个糖独立地包含2'-OMe。
在一些实施例中，第一子结构域包含一个或多个2'-F修饰的糖。在一些实施例中，第一子结构域不含2'-F修饰的糖。在一些实施例中，第一子结构域包含一个或多个双环糖和/或2'-OR修饰的糖，其中R不是-H。在一些实施例中，与2'-F修饰的糖的水平相比，单独或组合的双环糖和/或2'-OR修饰的糖(其中R不是-H)的水平相对较高。在一些实施例中，第一子结构域中不超过约1％-95％(例如，不超过约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％等)的糖包含2'-F。在一些实施例中，第一子结构域中不超过约50％的糖包含2'-F。在一些实施例中，第一子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-N(R)2修饰的经修饰的糖。在一些实施例中，第一子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-NH2修饰的经修饰的糖。在一些实施例中，第一子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)双环糖，例如LNA糖。在一些实施例中，第一子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)无环糖(例如，UNA糖)。
在一些实施例中，第一子结构域中不超过约1％-95％(例如，不超过约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％等)的糖包含2'-MOE。在一些实施例中，第一子结构域中不超过约50％的糖包含2'-MOE。在一些实施例中，第一子结构域中没有糖包含2'-MOE。
在一些实施例中，第一子结构域包含约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，第一子结构域中的核苷酸间键联的约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，第一子结构域中的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的或手性的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的或手性的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的或手性的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联，例如n001。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或中性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，第一子结构域中的至少约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，第一子结构域中的手性核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是手性控制的。在一些实施例中，第一子结构域中的硫代磷酸酯核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是手性控制的。在一些实施例中，每个独立地是手性控制的。在一些实施例中，第一子结构域中的至少约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，第一子结构域中的至少约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)硫代磷酸酯核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，第一子结构域中的手性核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是Sp。在一些实施例中，第一子结构域中的硫代磷酸酯核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是Sp。在一些实施例中，数目为一个或多个。在一些实施例中，数目为2个或更多个。在一些实施例中，数目为3个或更多个。在一些实施例中，数目为4个或更多个。在一些实施例中，数目为5个或更多个。在一些实施例中，数目为6个或更多个。在一些实施例中，数目为7个或更多个。在一些实施例中，数目为8个或更多个。在一些实施例中，数目为9个或更多个。在一些实施例中，数目为10个或更多个。在一些实施例中，数目为11个或更多个。在一些实施例中，数目为12个或更多个。在一些实施例中，数目为13个或更多个。在一些实施例中，数目为14个或更多个。在一些实施例中，数目为15个或更多个。在一些实施例中，百分比为至少约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。在一些实施例中，连接两个第一子结构域核苷的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是Sp手性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联独立地是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，第一子结构域的核苷酸间键联与第一子结构域的两个核苷键合。在一些实施例中，与第一子结构域中的核苷和第二子结构域中的核苷键合的核苷酸间键联可以被适当地认为是第一子结构域的核苷酸间键联。在一些实施例中，与第一子结构域中的核苷和第二子结构域中的核苷键合的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联；在一些实施例中，其是手性核苷酸间键联；在一些实施例中，其是手性控制的；在一些实施例中，其是Rp；在一些实施例中，其是Sp。
在一些实施例中，第一子结构域包含一定水平的Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，水平为第一子结构域中的所有核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，水平为第一子结构域中的所有手性核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，水平为第一子结构域中的所有手性控制的核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，百分比为约或不超过约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约5％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约10％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约15％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约20％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约25％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约30％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约35％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约40％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约45％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约50％。在一些实施例中，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸间键联独立地是Rp手性核苷酸间键联。在一些实施例中，数目为约或不大于约1。在一些实施例中，数目为约或不大于约2。在一些实施例中，数目为约或不大于约3。在一些实施例中，数目为约或不大于约4。在一些实施例中，数目为约或不大于约5。在一些实施例中，数目为约或不大于约6。在一些实施例中，数目为约或不大于约7。在一些实施例中，数目为约或不大于约8。在一些实施例中，数目为约或不大于约9。在一些实施例中，数目为约或不大于约10。
在一些实施例中，第一子结构域中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性控制的。在一些实施例中，每个独立地是Sp或Rp。在一些实施例中，高水平是如本文所述的Sp。在一些实施例中，第一子结构域中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，一个或多个，例如约1-5个(例如，约1、2、3、4或5个)是Rp。
在一些实施例中，如在某些实例中所展示的，第一子结构域包含一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联，其各自任选地并且独立地是手性控制的。在一些实施例中，每个不带负电荷的核苷酸间键联独立地是n001。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，每个手性不带负电荷的核苷酸间键联都不是手性控制的。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Rp。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，每个手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，第一子结构域中不带负电荷的核苷酸间键联的数目为约1-10，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施例中，其为约1。在一些实施例中，其为约2。在一些实施例中，其为约3。在一些实施例中，其为约4。在一些实施例中，其为约5。在一些实施例中，两个或更多个不带负电荷的核苷酸间键联是连续的。在一些实施例中，没有两个不带负电荷的核苷酸间键联是连续的。在一些实施例中，第一子结构域中的所有不带负电荷的核苷酸间键联都是连续的(例如，3个连续的不带负电荷的核苷酸间键联)。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联，或两个或更多个(例如，约2个、约3个、约4个等)连续的不带负电荷的核苷酸间键联位于第一子结构域的3'-末端。在一些实施例中，第一子结构域的最后两个或三个或四个核苷酸间键联包含至少一个不是不带负电荷的核苷酸间键联的核苷酸间键联。在一些实施例中，第一子结构域的最后两个或三个或四个核苷酸间键联包含至少一个不是n001的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一子结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一子结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是Sp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一子结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是Rp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一子结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一子结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一子结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一子结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是Sp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一子结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是Rp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一子结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第一子结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联，诸如n001。
在一些实施例中，第一子结构域包含一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，第一子结构域不含天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，第一子结构域包含5'-末端部分，例如具有约1-20、1-15、1-10、3-8或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核碱基的长度的部分。在一些实施例中，5'-末端部分具有约3-6个核碱基的长度。在一些实施例中，长度为一个核碱基。在一些实施例中，长度为2个核碱基。在一些实施例中，长度为3个核碱基。在一些实施例中，长度为4个核碱基。在一些实施例中，长度为5个核碱基。在一些实施例中，长度为6个核碱基。在一些实施例中，长度为7个核碱基。在一些实施例中，长度为8个核碱基。在一些实施例中，长度为9个核碱基。在一些实施例中，长度为10个核碱基。在一些实施例中，5'-末端部分包含第一子结构域的5'-末端核碱基。
在一些实施例中，5'-末端部分包含一个或多个具有两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)。在一些实施例中，5'-末端部分包含一个或多个具有2'-OH的糖(例如，天然RNA糖)。在一些实施例中，5'-末端部分中的一个或多个(例如，约1-20、1-15、1-10、3-8或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，5'-末端部分中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，每个糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，经修饰的糖独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
在一些实施例中，一个或多个经修饰的糖独立地包含2'-F或2'-OR，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，一个或多个经修饰的糖独立地是2'-F或2'-OMe。在一些实施例中，5'-末端部分中的每个经修饰的糖独立地是双环糖(例如，LNA糖)或具有2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，5'-末端部分中的每个经修饰的糖独立地是双环糖(例如，LNA糖)或具有2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，5'-末端部分中的每个经修饰的糖独立地是具有2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，R是甲基。
在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，5'-末端部分的每个核苷酸间键联是Sp。
在一些实施例中，5'-末端部分包含如本文所述的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)错配。在一些实施例中，5'-末端部分包含如本文所述的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)摇摆。在一些实施例中，5'-末端部分与靶核酸约60-100％(例如，66％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多)互补。在一些实施例中，互补性为60％或更高。在一些实施例中，互补性为70％或更高。在一些实施例中，互补性为75％或更高。在一些实施例中，互补性为80％或更高。在一些实施例中，互补性为90％或更高。
在一些实施例中，第一子结构域包含3'-末端部分，例如具有约1-20、1-15、1-10、1-5、1-3、3-8或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核碱基的长度的部分。在一些实施例中，3'-末端部分具有约1-3个核碱基的长度。在一些实施例中，长度为一个核碱基。在一些实施例中，长度为2个核碱基。在一些实施例中，长度为3个核碱基。在一些实施例中，长度为4个核碱基。在一些实施例中，长度为5个核碱基。在一些实施例中，长度为6个核碱基。在一些实施例中，长度为7个核碱基。在一些实施例中，长度为8个核碱基。在一些实施例中，长度为9个核碱基。在一些实施例中，长度为10个核碱基。在一些实施例中，3'-末端部分包含第一子结构域的3'-末端核碱基。在一些实施例中，第一子结构域包含5'-末端部分和3'-末端部分或由其组成。
在一些实施例中，5'-末端部分包含一个或多个具有两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)。在一些实施例中，5'-末端部分包含一个或多个具有2'-OH的糖(例如，天然RNA糖)。在一些实施例中，3'-末端部分中的一个或多个(例如，约1-20、1-15、1-10、3-8或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，3'-末端部分中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，每个糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，经修饰的糖独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
在一些实施例中，一个或多个经修饰的糖独立地包含2'-F或2'-OR，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，一个或多个经修饰的糖独立地是2'-F或2'-OMe。在一些实施例中，5'-末端部分中的每个经修饰的糖独立地是双环糖(例如，LNA糖)或具有2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，5'-末端部分中的每个经修饰的糖独立地是双环糖(例如，LNA糖)或具有2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，5'-末端部分中的每个经修饰的糖独立地是具有2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，R是甲基。
在一些实施例中，与5'-末端部分相比，3'-末端部分包含更高水平(数量和/或百分比)的2'-F修饰的糖和/或含有两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)，和/或更低水平(数量和/或百分比)的其他类型的经修饰的糖，例如，双环糖和/或具有2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，与5'-末端部分相比，3'-末端部分包含更高水平的2'-F修饰的糖和/或更低水平的2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，与5'-末端部分相比，3'-末端部分包含更高水平的2'-F修饰的糖和/或更低水平的2'-OMe修饰的糖。在一些实施例中，与5'-末端部分相比，3'-末端部分包含更高水平的天然DNA糖和/或更低水平的2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，与5'-末端部分相比，3'-末端部分包含更高水平的天然DNA糖和/或更低水平的2'-OMe修饰的糖。在一些实施例中，3'-末端部分包含低水平的(例如，不超过50％、40％、30％、25％、20％或10％的，或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)作为双环糖或含有2'-OR的糖的经修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基(例如，甲基)。在一些实施例中，3'-末端部分不含作为双环糖或含有2'-OR的糖的经修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基(例如，甲基)。
在一些实施例中，一个或多个经修饰的糖独立地包含2'-F。在一些实施例中，没有经修饰的糖包含2'-OMe或其他2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，3'-末端部分的每个糖独立地包含两个2'-H或2'-F修饰。在一些实施例中，3'-末端部分包含1、2、3、4或5个2'-F修饰的糖。在一些实施例中，3'-末端部分包含1-3个2'-F修饰的糖。在一些实施例中，3'-末端部分包含1、2、3、4或5个天然DNA糖。在一些实施例中，3'-末端部分包含1-3个天然DNA糖。
在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，3'-末端部分的每个核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，与5'-末端部分相比，3'-末端部分包含更高水平(数量和/或百分比)的Rp核苷酸间键联和/或天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，3'-末端部分包含如本文所述的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)错配。在一些实施例中，3'-末端部分包含如本文所述的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)摇摆。在一些实施例中，3'-末端部分与靶核酸约60-100％(例如，66％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多)互补。在一些实施例中，互补性为60％或更高。在一些实施例中，互补性为70％或更高。在一些实施例中，互补性为75％或更高。在一些实施例中，互补性为80％或更高。在一些实施例中，互补性为90％或更高。
在一些实施例中，第一子结构域募集蛋白诸如ADAR蛋白(例如，ADAR1、ADAR2等)、促进或有助于该蛋白的募集。在一些实施例中，第一子结构域募集蛋白诸如ADAR蛋白，或促进或有助于与该蛋白的相互作用。在一些实施例中，第一子结构域与ADAR的RNA结合结构域(RBD)接触。在一些实施例中，第一子结构域与ADAR的具有脱氨酶活性的催化结构域接触。在一些实施例中，第一子结构域与ADAR1的具有脱氨酶活性的结构域接触。在一些实施例中，第一子结构域与ADAR2的具有脱氨酶活性的结构域接触。在一些实施例中，第一子结构域的多种核碱基、糖和/或核苷酸间键联可与蛋白(例如，ADAR蛋白)的一个或多个残基相互作用。
第二子结构域
如本文所述，在一些实施例中，寡核苷酸从5'至3'包含第一结构域和第二结构域。在一些实施例中，第二结构域从5'至3'包含第一子结构域、第二子结构域和第三子结构域或由这些结构域组成。下文以实例描述第二子结构域的某些实施例。在一些实施例中，第二子结构域包含与待修饰(例如，转化成I)的靶腺苷相反的核苷。在一些实施例中，第二子结构域包含一个且不多于一个与靶腺苷相反的核苷。在一些实施例中，与寡核苷酸的靶腺苷相反的每个核苷均在第二子结构域中。
在一些实施例中，第二子结构域具有约1-10、1-5、1-3或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核碱基的长度。在一些实施例中，第二子结构域具有约1-10个核碱基的长度。在一些实施例中，第二子结构域具有约1-5个核碱基的长度。在一些实施例中，第二子结构域具有约1-3个核碱基的长度。在一些实施例中，第二子结构域具有1个核碱基的长度。在一些实施例中，第二子结构域具有2个核碱基的长度。在一些实施例中，第二子结构域具有3个核碱基的长度。
在一些实施例中，当寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，在第二子结构域中存在一个或多个(例如，1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)错配。在一些实施例中，存在1个错配。在一些实施例中，存在2个错配。在一些实施例中，存在3个错配。在一些实施例中，存在4个错配。在一些实施例中，存在5个错配。在一些实施例中，存在6个错配。在一些实施例中，存在7个错配。在一些实施例中，存在8个错配。在一些实施例中，存在9个错配。在一些实施例中，存在10个错配。
在一些实施例中，第二子结构域包含一个且不多于一个错配。在一些实施例中，第二子结构域包含两个且不多于两个错配。在一些实施例中，第二子结构域包含两个且不超过两个错配，其中一个错配位于靶腺苷和其相反核苷之间，和/或一个错配位于与靶腺苷相邻的核苷和其在寡核苷酸中的相应核苷之间。在一些实施例中，位于与靶腺苷相邻的核苷和其在寡核苷酸中的相应核苷之间的错配是摇摆。在一些实施例中，摇摆是I-C。在一些实施例中，C与靶腺苷相邻，例如紧邻其3'侧。
在一些实施例中，当寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，在第二子结构域中存在一个或多个(例如，1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)摇摆。在一些实施例中，存在1个摇摆。在一些实施例中，存在2个摇摆。在一些实施例中，存在3个摇摆。在一些实施例中，存在4个摇摆。在一些实施例中，存在5个摇摆。在一些实施例中，存在6个摇摆。在一些实施例中，存在7个摇摆。在一些实施例中，存在8个摇摆。在一些实施例中，存在9个摇摆。在一些实施例中，存在10个摇摆。
在一些实施例中，第二子结构域区域中的寡核苷酸和靶核酸的双链体包含一个或多个凸起，每个凸起独立地包含一个或多个不是摇摆的错配。在一些实施例中，存在0-10个(例如，0-1、0-2、0-3、0-4、0-5、0-6、0-7、0-8、0-9、0-10、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)凸起。在一些实施例中，数目为0。在一些实施例中，数目为1。在一些实施例中，数目为2。在一些实施例中，数目为3。在一些实施例中，数目为4。在一些实施例中，数目为5。
在一些实施例中，第二子结构域与靶核酸完全互补。
在一些实施例中，第二子结构域包含一个或多个经修饰的核碱基。
在一些实施例中，第二子结构域包含与靶腺苷相反的核苷，例如当寡核苷酸与靶核酸形成双链体时。本文描述了合适的核碱基，包括相反核苷中的经修饰的核碱基。例如，在一些实施例中，相反核碱基是任选地经取代的或被保护的核碱基，其选自C、C的互变异构体、U、U的互变异构体、A、A的互变异构体和是或包含具有以下结构的环BA的核碱基：BA-I、BA-I-a、BA-I-b、BA-II、BA-II-a、BA-II-b、BA-III、BA-III-a、BA-III-b、BA-IV、BA-IV-a、BA-IV-b、BA-V、BA-V-a、BA-V-b或BA-VI，或环BA的互变异构体。例如，在一些实施例中，相反核碱基选自
Figure BDA0003580200980001441
Figure BDA0003580200980001442
或
Figure BDA0003580200980001443
在一些实施例中，相反核碱基是
Figure BDA0003580200980001444
在一些实施例中，相反核碱基是
Figure BDA0003580200980001445
在一些实施例中，相反核碱基是
Figure BDA0003580200980001446
在一些实施例中，相反核碱基是
Figure BDA0003580200980001447
在一些实施例中，相反核碱基是
Figure BDA0003580200980001448
在一些实施例中，相反核碱基是
Figure BDA0003580200980001449
在一些实施例中，相反核碱基是
Figure BDA00035802009800014410
在一些实施例中，相反核碱基是
Figure BDA00035802009800014411
在一些实施例中，相反核碱基是
Figure BDA0003580200980001451
在一些实施例中，相反核碱基是
Figure BDA0003580200980001452
在一些实施例中，相反核碱基是
Figure BDA0003580200980001453
在一些实施例中，相反核碱基是
Figure BDA0003580200980001454
在一些实施例中，第二子结构域包含与相反核碱基相邻的经修饰的核碱基。在一些实施例中，其在5'侧。在一些实施例中，其在3'侧。在一些实施例中，在每一侧上独立地存在经修饰的核碱基。尤其是，本披露认识到邻近(例如，与其相邻)相反核碱基的核碱基可引起对靶核酸、寡核苷酸和/或其双链体的识别、结合、相互作用和/或修饰的破坏(例如，空间位阻)。在一些实施例中，破坏与相邻的G相关。在一些实施例中，本披露提供了可以代替G并且提供与G相比改善的稳定性和/或活性的核碱基。例如，在一些实施例中，相邻核碱基(例如，相反核苷的3'-紧邻核苷)是次黄嘌呤(代替G以减少破坏(例如，空间位阻)和/或与C形成摇摆碱基配对)。在一些实施例中，相邻核碱基是次黄嘌呤的衍生物。在一些实施例中，3'-紧邻核苷包含是或包含具有式BA-VI结构的环BA的核碱基。在一些实施例中，相邻的核碱基是
Figure BDA0003580200980001455
在一些实施例中，相邻的核碱基是
Figure BDA0003580200980001456
在一些实施例中，第二子结构域包含一个或多个包含两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)。在一些实施例中，第二子结构域包含一个或多个包含2'-OH的糖(例如，天然RNA糖)。在一些实施例中，第二子结构域包含一个或多个经修饰的糖。在一些实施例中，经修饰的糖包含2'-修饰。在一些实施例中，经修饰的糖是双环糖，例如LNA糖。在一些实施例中，经修饰的糖是无环糖(例如，通过断裂相应环糖的C2-C3键)。在一些实施例中，相反核苷包含无环糖诸如UNA糖。在一些实施例中，这种无环糖为蛋白对靶腺苷进行修饰提供了灵活性。
在一些实施例中，第二子结构域包含约1-10(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个经修饰的糖，这些经修饰的糖独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第二子结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖的经修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
在一些实施例中，第二子结构域中的低水平的(例如，不超过50％、40％、30％、25％、20％或10％的，或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)糖独立地包含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰。在一些实施例中，第二子结构域中的每个糖独立地不含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰，其中LB是任选地经取代的-CH2-。在一些实施例中，第二子结构域中的每个糖独立地不含2'-OMe。
在一些实施例中，第二子结构域包含一个或多个2'-F修饰的糖。
在一些实施例中，第二子结构域中的高水平(例如，约60-100％，或约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多，或100％)的或所有的糖独立地是2'-F修饰的糖、包含两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)、或包含2'-OH的糖(例如，天然RNA糖)。在一些实施例中，第二子结构域中的高水平(例如，约60-100％，或约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多，或100％)的或所有的糖独立地是2'-F修饰的糖、天然DNA糖或天然RNA糖。在一些实施例中，第二子结构域中的高水平(例如，约60-100％，或约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多，或100％)的或所有的糖独立地是2'-F修饰的糖和天然DNA糖。在一些实施例中，水平为100％。在一些实施例中，第二子结构域包含1、2、3、4或5个2'-F修饰的糖。在一些实施例中，第二子结构域包含1、2、3、4或5个包含两个2'-H的糖。在一些实施例中，第二子结构域包含1、2、3、4或5个天然DNA糖。在一些实施例中，第二子结构域包含1、2、3、4或5个包含2'-OH的糖。在一些实施例中，第二子结构域包含1、2、3、4或5个天然RNA糖。在一些实施例中，数目为1。在一些实施例中，数目为2。在一些实施例中，数目为3。在一些实施例中，数目为4。在一些实施例中，数目为5。
在一些实施例中，与靶腺苷相反的核苷的糖(“相反糖”)、与相反核苷5'-相邻的核苷的糖(“5'-相邻糖”)和/或与相反核苷3'-相邻的核苷的糖(“3-相邻糖”)独立地且任选地是2'-F修饰的糖、包含两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)或包含2'-OH的糖(例如，天然RNA糖)。在一些实施例中，相反糖是2'-F修饰的糖。在一些实施例中，相反糖是包含两个2'-H的糖。在一些实施例中，相反糖是天然DNA糖。在一些实施例中，相反糖是包含2'-OH的糖。在一些实施例中，相反糖是天然RNA糖。例如，在一些实施例中，寡核苷酸中的5'-相邻糖、相反糖和3'-相邻糖各自独立地是天然DNA糖。在一些实施例中，5'-相邻糖是2'-F修饰的糖，并且相反糖和3'-相邻糖各自独立地是天然DNA糖。
在一些实施例中，5'-相邻糖是2'-F修饰的糖。在一些实施例中，5'-相邻糖是包含两个2'-H的糖。在一些实施例中，5'-相邻糖是天然DNA糖。在一些实施例中，5'-相邻糖是包含2'-OH的糖。在一些实施例中，5'-相邻糖是天然RNA糖。
在一些实施例中，3'-相邻糖是2'-F修饰的糖。在一些实施例中，3'-相邻糖是包含两个2'-H的糖。在一些实施例中，3'-相邻糖是天然DNA糖。在一些实施例中，3'-相邻糖是包含2'-OH的糖。在一些实施例中，3'-相邻糖是天然RNA糖。
在一些实施例中，第二子结构域中不超过约1％-95％(例如，不超过约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％等)的糖包含2'-MOE。在一些实施例中，第二子结构域中不超过约50％的糖包含2'-MOE。在一些实施例中，第二子结构域中没有糖包含2'-MOE。
在一些实施例中，第二子结构域包含约1-10(例如，约1-5、1-4、1-3，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，第二子结构域中的核苷酸间键联的约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，第二子结构域中的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的或手性的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的或手性的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的或手性的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联，例如n001。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或中性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，第二子结构域中的至少约1-10(例如，约1-5、1-4、1-3，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个手性核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，第二子结构域中的手性核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是手性控制的。在一些实施例中，第二子结构域中的硫代磷酸酯核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是手性控制的。在一些实施例中，每个独立地是手性控制的。在一些实施例中，第二子结构域中的至少约1-10(例如，约1-5、1-4、1-3，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个手性核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，第二子结构域中的至少约1-10(例如，约1-5、1-4、1-3，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个硫代磷酸酯核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，第二子结构域中的手性核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是Sp。在一些实施例中，第二子结构域中的硫代磷酸酯核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是Sp。在一些实施例中，数目为一个或多个。在一些实施例中，数目为2个或更多个。在一些实施例中，数目为3个或更多个。在一些实施例中，数目为4个或更多个。在一些实施例中，百分比为至少约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。在一些实施例中，连接两个第二子结构域核苷的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是Sp手性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联独立地是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，第二子结构域的核苷酸间键联与第二子结构域的两个核苷键合。在一些实施例中，与第二子结构域中的核苷和第一子结构域或第三子结构域中的核苷键合的核苷酸间键联可以被适当地认为是第二子结构域的核苷酸间键联。在一些实施例中，与第二子结构域中的核苷和第一子结构域或第三子结构域中的核苷键合的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联；在一些实施例中，其是手性核苷酸间键联；在一些实施例中，其是手性控制的；在一些实施例中，其是Rp；在一些实施例中，其是Sp。
在一些实施例中，第二子结构域包含一定水平的Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，水平为第二子结构域中的所有核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，水平为第二子结构域中的所有手性核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，水平为第二子结构域中的所有手性控制的核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，百分比为约或不超过约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约5％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约10％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约15％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约20％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约25％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约30％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约35％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约40％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约45％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约50％。在一些实施例中，1-10(例如，约1-5、1-4、1-3，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个核苷酸间键联独立地是Rp手性核苷酸间键联。在一些实施例中，数目为约或不大于约1。在一些实施例中，数目为约或不大于约2。在一些实施例中，数目为约或不大于约3。在一些实施例中，数目为约或不大于约4。在一些实施例中，数目为约或不大于约5。在一些实施例中，数目为约或不大于约6。在一些实施例中，数目为约或不大于约7。在一些实施例中，数目为约或不大于约8。在一些实施例中，数目为约或不大于约9。在一些实施例中，数目为约或不大于约10。在一些实施例中，与其他部分(例如，第一结构域、第二结构域整体、第一子结构域、第三子结构域或其部分)相比，第二子结构域包含更高水平(数量和/或百分比)的Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，第二子结构域包含比Sp核苷酸间键联更高水平(数量和/或百分比)的Rp核苷酸间键联。
在一些实施例中，第二子结构域中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性控制的。在一些实施例中，每个独立地是Sp或Rp。在一些实施例中，高水平是如本文所述的Sp。在一些实施例中，第二子结构域中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，一个或多个，例如约1-5个(例如，约1、2、3、4或5个)是Rp。
在一些实施例中，如在某些实例中所展示的，第二子结构域包含一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联，其各自任选地并且独立地是手性控制的。在一些实施例中，每个不带负电荷的核苷酸间键联独立地是n001。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，每个手性不带负电荷的核苷酸间键联都不是手性控制的。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Rp。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，每个手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，第二子结构域中不带负电荷的核苷酸间键联的数目为约1-5，或约1、2、3、4或5。在一些实施例中，其为约1。在一些实施例中，其为约2。在一些实施例中，其为约3。在一些实施例中，其为约4。在一些实施例中，其为约5。在一些实施例中，两个或更多个不带负电荷的核苷酸间键联是连续的。在一些实施例中，没有两个不带负电荷的核苷酸间键联是连续的。在一些实施例中，第二子结构域中的所有不带负电荷的核苷酸间键联都是连续的(例如，3个连续的不带负电荷的核苷酸间键联)。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联，或两个或更多个(例如，约2个、约3个、约4个等)连续的不带负电荷的核苷酸间键联位于第二子结构域的3'-末端。在一些实施例中，第二子结构域的最后两个或三个或四个核苷酸间键联包含至少一个不是不带负电荷的核苷酸间键联的核苷酸间键联。在一些实施例中，第二子结构域的最后两个或三个或四个核苷酸间键联包含至少一个不是n001的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二子结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二子结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是Sp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二子结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是Rp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二子结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二子结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二子结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二子结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是Sp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二子结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是Rp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二子结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二子结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二子结构域的最后一个核苷和第三子结构域的第一个核苷的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二子结构域的最后一个核苷和第三子结构域的第一个核苷的核苷酸间键联是Sp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二子结构域的最后一个核苷和第三子结构域的第一个核苷的核苷酸间键联是Rp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二子结构域的最后一个核苷和第三子结构域的第一个核苷的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第二子结构域的最后一个核苷和第三子结构域的第一个核苷的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联，诸如n001。
在一些实施例中，第二子结构域包含一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，第二子结构域不含天然磷酸酯键联。在一些实施例中，第二子结构域包含至少1个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，第二子结构域包含至少2个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，第二子结构域包含至少3个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，第二子结构域包含至少4个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，第二子结构域包含至少5个天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，相反核苷通过天然磷酸酯键联与其5'紧邻核苷连接。在一些实施例中，相反核苷通过天然磷酸酯键联与其5'紧邻核苷连接。在一些实施例中，相反核苷通过经修饰的核苷酸间键联与其5'紧邻核苷连接。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是带中性电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是Sp。
在一些实施例中，相反核苷通过天然磷酸酯键联与其3'紧邻核苷(相对于相反核苷在-1位)连接。在一些实施例中，相反核苷通过经修饰的核苷酸间键联与其3'紧邻核苷连接。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是带中性电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联并且是手性控制的。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联并且是Sp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联并且是Rp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)并且是手性控制的。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)并且是手性控制的并且是Rp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)并且是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)并且不是手性控制的。
在一些实施例中，相对于相反核苷在-1位的核苷以及相对于相反核苷在-2位的核苷(例如，在5'-…N0N-1N-2…3'中，如果N0是相反核苷，则N-1在-1位并且N-2在-2位)通过天然磷酸酯键联连接。在一些实施例中，它们通过经修饰的核苷酸间键联连接。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是带中性电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联并且是手性控制的。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联并且是Sp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联并且是Rp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)并且是手性控制的。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)并且是手性控制的并且是Rp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)并且是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)并且不是手性控制的。
在一些实施例中，第二子结构域的核苷和第三子结构域的核苷通过天然磷酸酯键联连接。在一些实施例中，它们通过经修饰的核苷酸间键联连接。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是带中性电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联并且是手性控制的。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联并且是Sp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联并且是Rp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)并且是手性控制的。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)并且是手性控制的并且是Rp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)并且是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)并且不是手性控制的。
在一些实施例中，寡核苷酸包含5'-N1N0N-1-3'，其中N1、N0和N-1中的每一个独立地是核苷，N1和N0与如本文所述的核苷酸间键联键合，并且N-1和N0与如本文所述的核苷酸间键联键合，并且N0与靶腺苷相反。在一些实施例中，N1、N0和N-1中的每一个的糖独立地是天然DNA糖或2'-F修饰的糖。在一些实施例中，N1、N0和N-1中的每一个的糖独立地是天然DNA糖。在一些实施例中，N1的糖是2'-修饰的糖，并且N0和N-1中的每一个的糖独立地是天然DNA糖。在一些实施例中，此类寡核苷酸提供高编辑水平。在一些实施例中，与N-1键合的两个核苷酸间键联中的每一个独立地是Rp。在一些实施例中，与N-1键合的两个核苷酸间键联中的每一个独立地是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，与N-1键合的两个核苷酸间键联中的每一个独立地是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且寡核苷酸中的每个其他硫代磷酸酯核苷酸间键联(如果有的话)独立地是Sp。在一些实施例中，与N1键合的5'核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，与N1和N0键合的核苷酸间键联(即，与N1键合的3'核苷酸间键联)是Rp。在一些实施例中，与N-1和N0键合的核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，与N-1键合的3'核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，与N0键合的每个核苷酸间键联独立地是Rp。在一些实施例中，与N0或N1键合的每个核苷酸间键联独立地是Rp。在一些实施例中，与N0或N-1键合的每个核苷酸间键联独立地是Rp。在一些实施例中，与N1键合的每个核苷酸间键联独立地是Rp。在一些实施例中，每个Rp核苷酸间键联独立地是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸中的每个其他手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是Sp。
在一些实施例中，5'紧邻核苷(例如，N1)的糖独立地选自天然DNA糖、天然RNA糖和2'-F修饰的糖(例如，R2s是-F)。在一些实施例中，相反核苷(例如，N0)的糖独立地选自天然DNA糖、天然RNA糖和2'-F修饰的糖。在一些实施例中，3'紧邻核苷(例如，N-1)的糖独立地选自天然DNA糖、天然RNA糖和2'-F修饰的糖。在一些实施例中，5'紧邻核苷、相反核苷和3'紧邻核苷的糖各自独立地是天然DNA糖。在一些实施例中，5'紧邻核苷、相反核苷和3'紧邻核苷的糖分别是天然DNA糖、天然RNA糖和天然DNA糖。在一些实施例中，5'紧邻核苷、相反核苷和3'紧邻核苷的糖分别是2'-F修饰的糖、天然RNA糖和天然DNA糖。
在一些实施例中，相反核苷的糖是天然RNA糖。在一些实施例中，这种相反核苷与3'紧邻I核苷(其任选地在比对时与靶核酸中的C互补)一起使用。在一些实施例中，3'紧邻核苷(例如，N-1)与其3'紧邻核苷(例如，N-2)之间的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联，例如，n001。在一些实施例中，其是立体随机的。在一些实施例中，其是手性控制的并且是Rp。在一些实施例中，其是手性控制的并且是Sp。
在一些实施例中，与3'紧邻核苷(例如，N-1)及其3'相邻核苷(例如，5'-N1N0N-1N-2-3'中的N-2)键合的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，其是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，其是立体随机的。在一些实施例中，其是立体随机硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，其是立体随机不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，其是立体随机n001。在一些实施例中，其是手性控制的。在一些实施例中，其是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，其是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，其是手性控制的。在一些实施例中，其是Rp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，其是Sp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是n001。
在一些实施例中，N-1是I。在一些实施例中，例如当靶核酸包含5'-CA-3'(其中A是靶腺苷)时，用I代替G。在一些实施例中，5'-N1N0N-1-3'是5'-N1N0I-3'。在一些实施例中，N0是b001A、b002A、b003A、b008U、b001C、C、A或U。在一些实施例中，N0是b001A、b002A、b008U、b001C、C或A。在一些实施例中，N0是b001A、b002A、b008U或b001C。在一些实施例中，N0是b001A。在一些实施例中，N0是b002A。在一些实施例中，N0是b003A。在一些实施例中，N0是b008U。在一些实施例中，N0是b001C。在一些实施例中，N0是A。在一些实施例中，N0是U。
如本文所展示，在一些实施例中，所提供的包含与靶腺苷相反的某些核碱基(例如，b001A、b002A、b008U、C、A等)的寡核苷酸尤其可以提供改善的编辑效率(例如，与参考核碱基诸如U相比)。在一些实施例中，相反核苷在其3'侧与I连接。
在一些实施例中，第二子结构域包含5'-末端部分，例如长度为约1-5、1-3或1、2、3、4或5个核碱基的部分。在一些实施例中，长度为一个核碱基。在一些实施例中，长度为2个核碱基。在一些实施例中，长度为3个核碱基。在一些实施例中，长度为4个核碱基。在一些实施例中，长度为5个核碱基。
在一些实施例中，5'-末端部分包含一个或多个具有两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)。在一些实施例中，5'-末端部分包含一个或多个具有2'-OH的糖(例如，天然RNA糖)。在一些实施例中，5'-末端部分中的一个或多个(例如，约1-5、1-3或1、2、3、4或5个)糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，5'-末端部分中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，每个糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，经修饰的糖独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
在一些实施例中，5'-末端部分中的低水平的(例如，不超过50％、40％、30％、25％、20％或10％的，或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)糖独立地包含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰。在一些实施例中，5'-末端部分中的每个糖独立地不含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰，其中LB是任选地经取代的-CH2-。在一些实施例中，5'-末端部分中的每个糖独立地不含2'-OMe。
在一些实施例中，5'-末端部分包含一个或多个2'-F修饰的糖。
在一些实施例中，5'-末端中的高水平(例如，约60-100％，或约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多，或100％)的或所有的糖独立地是2'-F修饰的糖、包含两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)、或包含2'-OH的糖(例如，天然RNA糖)。在一些实施例中，5'-末端部分中的高水平(例如，约60-100％，或约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多，或100％)的或所有的糖独立地是2'-F修饰的糖、天然DNA糖或天然RNA糖。在一些实施例中，5'-末端部分中的高水平(例如，约60-100％，或约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多，或100％)的或所有的糖独立地是2'-F修饰的糖和天然DNA糖。在一些实施例中，水平为100％。在一些实施例中，5'-末端部分的糖选自具有两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)和2'-F修饰的糖。在一些实施例中，5'-末端部分包含1、2、3、4或5个2'-F修饰的糖。在一些实施例中，5'-末端部分包含1、2、3、4或5个包含两个2'-H的糖。在一些实施例中，5'-末端部分包含1、2、3、4或5个天然DNA糖。在一些实施例中，5'-末端部分包含1、2、3、4或5个包含2'-OH的糖。在一些实施例中，5'-末端部分包含1、2、3、4或5个天然RNA糖。在一些实施例中，数目为1。在一些实施例中，数目为2。在一些实施例中，数目为3。在一些实施例中，数目为4。在一些实施例中，数目为5。
在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，5'-末端部分的每个核苷酸间键联是Sp。
在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，5'-末端部分的每个核苷酸间键联是Rp。
在一些实施例中，5'-末端部分包含如本文所述的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)错配。在一些实施例中，5'-末端部分包含如本文所述的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)摇摆。在一些实施例中，5'-末端部分与靶核酸约60-100％(例如，66％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多)互补。在一些实施例中，互补性为60％或更高。在一些实施例中，互补性为70％或更高。在一些实施例中，互补性为75％或更高。在一些实施例中，互补性为80％或更高。在一些实施例中，互补性为90％或更高。
在一些实施例中，5'-末端部分包含与相反核苷5'相邻的核苷。在一些实施例中，与相反核苷5'相邻的核苷包含如本文所述的核碱基。
在一些实施例中，第二子结构域包含3'-末端部分，例如长度为约1-5、1-3或1、2、3、4或5个核碱基的部分。在一些实施例中，长度为一个核碱基。在一些实施例中，长度为2个核碱基。在一些实施例中，长度为3个核碱基。在一些实施例中，长度为4个核碱基。在一些实施例中，长度为5个核碱基。在一些实施例中，第二子结构域由5'-末端部分和3'-末端部分组成。
在一些实施例中，3'-末端部分包含一个或多个具有两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)。在一些实施例中，3'-末端部分包含一个或多个具有2'-OH的糖(例如，天然RNA糖)。在一些实施例中，3'-末端部分中的一个或多个(例如，约1-5、1-3或1、2、3、4或5个)糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，3'-末端部分中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，每个糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，经修饰的糖独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
在一些实施例中，3'-末端部分中的低水平的(例如，不超过50％、40％、30％、25％、20％或10％的，或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)糖独立地包含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰。在一些实施例中，3'-末端部分中的每个糖独立地不含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰，其中LB是任选地经取代的-CH2-。在一些实施例中，3'-末端部分中的每个糖独立地不含2'-OMe。
在一些实施例中，3'-末端部分包含一个或多个2'-F修饰的糖。
在一些实施例中，3'-末端中的高水平(例如，约60-100％，或约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多，或100％)的或所有的糖独立地是2'-F修饰的糖、包含两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)、或包含2'-OH的糖(例如，天然RNA糖)。在一些实施例中，3'-末端部分中的高水平(例如，约60-100％，或约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多，或100％)的或所有的糖独立地是2'-F修饰的糖、天然DNA糖或天然RNA糖。在一些实施例中，3'-末端部分中的高水平(例如，约60-100％，或约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多，或100％)的或所有的糖独立地是2'-F修饰的糖和天然DNA糖。在一些实施例中，水平为100％。在一些实施例中，3'-末端部分的糖选自具有两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)和2'-F修饰的糖。在一些实施例中，3'-末端部分包含1、2、3、4或5个2'-F修饰的糖。在一些实施例中，3'-末端部分包含1、2、3、4或5个包含两个2'-H的糖。在一些实施例中，3'-末端部分包含1、2、3、4或5个天然DNA糖。在一些实施例中，3'-末端部分包含1、2、3、4或5个包含2'-OH的糖。在一些实施例中，3'-末端部分包含1、2、3、4或5个天然RNA糖。在一些实施例中，数目为1。在一些实施例中，数目为2。在一些实施例中，数目为3。在一些实施例中，数目为4。在一些实施例中，数目为5。
在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，3'-末端部分的每个核苷酸间键联是Sp。
在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，3'-末端部分的每个核苷酸间键联是Rp。
在一些实施例中，3'-末端部分包含如本文所述的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)错配。在一些实施例中，3'-末端部分包含如本文所述的一个或多个(例如，约1、2、3、4或5个)摇摆。在一些实施例中，3'-末端部分与靶核酸约60-100％(例如，66％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多)互补。在一些实施例中，互补性为60％或更高。在一些实施例中，互补性为70％或更高。在一些实施例中，互补性为75％或更高。在一些实施例中，互补性为80％或更高。在一些实施例中，互补性为90％或更高。
在一些实施例中，3'-末端部分包含与相反核苷3'相邻的核苷。在一些实施例中，与相反核苷3'相邻的核苷包含如本文所述的核碱基。在一些实施例中，与相反核苷3'相邻的核苷与靶核酸中的相应核苷形成摇摆对。在一些实施例中，与相反核苷3'相邻的核苷的核碱基是次黄嘌呤；在一些实施例中，其是次黄嘌呤的衍生物。
在一些实施例中，第二子结构域募集蛋白诸如ADAR蛋白(例如，ADAR1、ADAR2等)、促进或有助于该蛋白的募集。在一些实施例中，第二子结构域募集蛋白诸如ADAR蛋白，或促进或有助于与该蛋白的相互作用。在一些实施例中，第二子结构域与ADAR的RNA结合结构域(RBD)接触。在一些实施例中，第二子结构域与ADAR的具有脱氨酶活性的催化结构域接触。在一些实施例中，第二子结构域与ADAR1的具有脱氨酶活性的结构域接触。在一些实施例中，第二子结构域与ADAR2的具有脱氨酶活性的结构域接触。在一些实施例中，第二子结构域的多种核碱基、糖和/或核苷酸间键联可与蛋白(例如，ADAR蛋白)的一个或多个残基相互作用。
第三子结构域
如本文所述，在一些实施例中，寡核苷酸从5'至3'包含第一结构域和第二结构域。在一些实施例中，第二结构域从5'至3'包含第一子结构域、第二子结构域和第三子结构域或由这些结构域组成。下文以实例描述第三子结构域的某些实施例。
在一些实施例中，第三子结构域具有约1-50、1-40、1-30、1-20个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等)核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有约5-30个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有约10-30个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有约10-20个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有约5-15个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有约13-16个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有约6-12个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有约6-9个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有约1-10个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有约1-7个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有1个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有2个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有3个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有4个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有5个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有6个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有7个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有8个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有9个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有10个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有11个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有12个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有13个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有14个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域具有15个核碱基的长度。在一些实施例中，第三子结构域比第一子结构域短。在一些实施例中，第三子结构域比第一结构域短。在一些实施例中，第三子结构域包含第二结构域的3'-末端核碱基。
在一些实施例中，第三子结构域是第二结构域的约或至少约5％-95％、10％-90％、20％-80％、30％-70％、40％-70％、40％-60％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％。在一些实施例中，百分比为约30％-80％。在一些实施例中，百分比为约30％-70％。在一些实施例中，百分比为约40％-60％。在一些实施例中，百分比为约20％。在一些实施例中，百分比为约25％。在一些实施例中，百分比为约30％。在一些实施例中，百分比为约35％。在一些实施例中，百分比为约40％。在一些实施例中，百分比为约45％。在一些实施例中，百分比为约50％。在一些实施例中，百分比为约55％。在一些实施例中，百分比为约60％。在一些实施例中，百分比为约65％。在一些实施例中，百分比为约70％。在一些实施例中，百分比为约75％。在一些实施例中，百分比为约80％。在一些实施例中，百分比为约85％。在一些实施例中，百分比为约90％。
在一些实施例中，当寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，在第三子结构域中存在一个或多个(例如，1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)错配。在一些实施例中，存在1个错配。在一些实施例中，存在2个错配。在一些实施例中，存在3个错配。在一些实施例中，存在4个错配。在一些实施例中，存在5个错配。在一些实施例中，存在6个错配。在一些实施例中，存在7个错配。在一些实施例中，存在8个错配。在一些实施例中，存在9个错配。在一些实施例中，存在10个错配。
在一些实施例中，当寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，在第三子结构域中存在一个或多个(例如，1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)摇摆。在一些实施例中，存在1个摇摆。在一些实施例中，存在2个摇摆。在一些实施例中，存在3个摇摆。在一些实施例中，存在4个摇摆。在一些实施例中，存在5个摇摆。在一些实施例中，存在6个摇摆。在一些实施例中，存在7个摇摆。在一些实施例中，存在8个摇摆。在一些实施例中，存在9个摇摆。在一些实施例中，存在10个摇摆。
在一些实施例中，第三子结构域区域中的寡核苷酸和靶核酸的双链体包含一个或多个凸起，每个凸起独立地包含一个或多个不是摇摆的错配。在一些实施例中，存在0-10个(例如，0-1、0-2、0-3、0-4、0-5、0-6、0-7、0-8、0-9、0-10、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)凸起。在一些实施例中，数目为0。在一些实施例中，数目为1。在一些实施例中，数目为2。在一些实施例中，数目为3。在一些实施例中，数目为4。在一些实施例中，数目为5。
在一些实施例中，第三子结构域与靶核酸完全互补。
在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个经修饰的核碱基。
在一些实施例中，第三结构域包含与靶腺苷相反的核苷(相反核苷)。在一些实施例中，第三结构域包含与相反核苷3'相邻的核苷。在一些实施例中，第三结构域包含与相反核苷5'相邻的核苷。本文已经描述了多种合适的相反核苷，包括糖及其核碱基。
在一些实施例中，例如当寡核苷酸与靶核酸形成双链体时，第三子结构域包含与靶腺苷相反的核苷。本文描述了合适的核碱基，包括相反核苷中的经修饰的核碱基。例如，在一些实施例中，相反核碱基是任选地经取代的或被保护的核碱基，其选自C、C的互变异构体、U、U的互变异构体、A、A的互变异构体和是或包含具有以下结构的环BA的核碱基：BA-I、BA-I-a、BA-I-b、BA-II、BA-II-a、BA-II-b、BA-III、BA-III-a、BA-III-b、BA-IV、BA-IV-a、BA-IV-b、BA-V、BA-V-a、BA-V-b或BA-VI，或环BA的互变异构体。
在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个包含两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)。在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个包含2'-OH的糖(例如，天然RNA糖)。在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个经修饰的糖。在一些实施例中，经修饰的糖包含2'-修饰。在一些实施例中，经修饰的糖是双环糖，例如LNA糖。在一些实施例中，经修饰的糖是无环糖(例如，通过断裂相应环糖的C2-C3键)。
在一些实施例中，第三子结构域包含约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖。在一些实施例中，第三子结构域包含约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖，其独立地是双环糖(例如，LNA糖)或2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第三子结构域包含约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖，其独立地是2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，数目为1。在一些实施例中，数目为2。在一些实施例中，数目为3。在一些实施例中，数目为4。在一些实施例中，数目为5。在一些实施例中，数目为6。在一些实施例中，数目为7。在一些实施例中，数目为8。在一些实施例中，数目为9。在一些实施例中，数目为10。在一些实施例中，数目为11。在一些实施例中，数目为12。在一些实施例中，数目为13。在一些实施例中，数目为14。在一些实施例中，数目为15。在一些实施例中，数目为16。在一些实施例中，数目为17。在一些实施例中，数目为18。在一些实施例中，数目为19。在一些实施例中，数目为20。在一些实施例中，R是甲基。
在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-OH的糖。在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含两个2'-H的糖。在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)RNA糖。在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)DNA糖。
在一些实施例中，第三子结构域中所有糖的约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，第三子结构域中所有糖的约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)独立地是双环糖(例如，LNA糖)或2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第三子结构域中所有糖的约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)独立地是2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，百分比为至少约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。在一些实施例中，R是甲基。
在一些实施例中，第三子结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖，其独立地具有不是2'-F的修饰。在一些实施例中，第三子结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是具有不是2'-F的修饰的经修饰的糖。在一些实施例中，第三子结构域中约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是具有不是2'-F的修饰的经修饰的糖。在一些实施例中，第三子结构域的经修饰的糖各自独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
在一些实施例中，第三子结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖，其独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第三子结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖的经修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第三子结构域中约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖的经修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
在一些实施例中，第三子结构域中的每个糖独立地包含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰。在一些实施例中，第三子结构域中的每个糖独立地包含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰，其中LB是任选地经取代的-CH2-。在一些实施例中，第三子结构域中的每个糖独立地包含2'-OMe。
在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)2'-F修饰的糖。在一些实施例中，第三子结构域不含2'-F修饰的糖。在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个双环糖和/或2'-OR修饰的糖，其中R不是-H。在一些实施例中，与2'-F修饰的糖的水平相比，单独或组合的双环糖和/或2'-OR修饰的糖(其中R不是-H)的水平相对较高。在一些实施例中，第三子结构域中不超过约1％-95％(例如，不超过约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％等)的糖包含2'-F。在一些实施例中，第三子结构域中不超过约50％的糖包含2'-F。在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-N(R)2修饰的经修饰的糖。在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-NH2修饰的经修饰的糖。在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)双环糖，例如LNA糖。在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)无环糖(例如，UNA糖)。
在一些实施例中，第三子结构域中不超过约1％-95％(例如，不超过约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％等)的糖包含2'-MOE。在一些实施例中，第三子结构域中不超过约50％的糖包含2'-MOE。在一些实施例中，第三子结构域中没有糖包含2'-MOE。
在一些实施例中，第三子结构域包含约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，第三子结构域中的核苷酸间键联的约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，第三子结构域中的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的或手性的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的或手性的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的或手性的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联，例如n001。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或中性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，第三子结构域中的至少约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，第三子结构域中的手性核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是手性控制的。在一些实施例中，第三子结构域中的硫代磷酸酯核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是手性控制的。在一些实施例中，每个独立地是手性控制的。在一些实施例中，第三子结构域中的至少约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，每个独立地是手性控制的。在一些实施例中，第三子结构域中的至少约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)硫代磷酸酯核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，第三子结构域中的手性核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是Sp。在一些实施例中，第三子结构域中的硫代磷酸酯核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是Sp。在一些实施例中，数目为一个或多个。在一些实施例中，数目为2个或更多个。在一些实施例中，数目为3个或更多个。在一些实施例中，数目为4个或更多个。在一些实施例中，数目为5个或更多个。在一些实施例中，数目为6个或更多个。在一些实施例中，数目为7个或更多个。在一些实施例中，数目为8个或更多个。在一些实施例中，数目为9个或更多个。在一些实施例中，数目为10个或更多个。在一些实施例中，数目为11个或更多个。在一些实施例中，数目为12个或更多个。在一些实施例中，数目为13个或更多个。在一些实施例中，数目为14个或更多个。在一些实施例中，数目为15个或更多个。在一些实施例中，百分比为至少约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。在一些实施例中，连接两个第三子结构域核苷的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是Sp手性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联独立地是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，第三子结构域的核苷酸间键联与第三子结构域的两个核苷键合。在一些实施例中，与第三子结构域中的核苷和第二子结构域中的核苷键合的核苷酸间键联可以被适当地认为是第三子结构域的核苷酸间键联。在一些实施例中，与第三子结构域中的核苷和第二子结构域中的核苷键合的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联；在一些实施例中，其是手性核苷酸间键联；在一些实施例中，其是手性控制的；在一些实施例中，其是Rp；在一些实施例中，其是Sp。
在一些实施例中，第三子结构域包含一定水平的Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，水平为第三子结构域中的所有核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，水平为第三子结构域中的所有手性核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，水平为第三子结构域中的所有手性控制的核苷酸间键联的约例如约5％-100％、约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等。在一些实施例中，百分比为约或不超过约50％。在一些实施例中，百分比为至少约55％。在一些实施例中，百分比为至少约60％。在一些实施例中，百分比为至少约65％。在一些实施例中，百分比为至少约70％。在一些实施例中，百分比为至少约75％。在一些实施例中，百分比为至少约80％。在一些实施例中，百分比为至少约85％。在一些实施例中，百分比为至少约90％。在一些实施例中，百分比为至少约95％。在一些实施例中，百分比为约100％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约5％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约10％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约15％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约20％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约25％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约30％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约35％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约40％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约45％。在一些实施例中，百分比为约或不超过约50％。在一些实施例中，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸间键联独立地是Rp手性核苷酸间键联。在一些实施例中，数目为约或不大于约1。在一些实施例中，数目为约或不大于约2。在一些实施例中，数目为约或不大于约3。在一些实施例中，数目为约或不大于约4。在一些实施例中，数目为约或不大于约5。在一些实施例中，数目为约或不大于约6。在一些实施例中，数目为约或不大于约7。在一些实施例中，数目为约或不大于约8。在一些实施例中，数目为约或不大于约9。在一些实施例中，数目为约或不大于约10。
在一些实施例中，第三子结构域中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性控制的。在一些实施例中，每个独立地是Sp或Rp。在一些实施例中，高水平是如本文所述的Sp。在一些实施例中，第三子结构域中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，一个或多个，例如约1-5个(例如，约1、2、3、4或5个)是Rp。
在一些实施例中，如在某些实例中所展示的，第三子结构域包含一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联，其各自任选地并且独立地是手性控制的。在一些实施例中，每个不带负电荷的核苷酸间键联独立地是n001。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，每个手性不带负电荷的核苷酸间键联都不是手性控制的。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Rp。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，每个手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，第三子结构域中不带负电荷的核苷酸间键联的数目为约1-10，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施例中，其为约1。在一些实施例中，其为约2。在一些实施例中，其为约3。在一些实施例中，其为约4。在一些实施例中，其为约5。在一些实施例中，两个或更多个不带负电荷的核苷酸间键联是连续的。在一些实施例中，没有两个不带负电荷的核苷酸间键联是连续的。在一些实施例中，第三子结构域中的所有不带负电荷的核苷酸间键联都是连续的(例如，3个连续的不带负电荷的核苷酸间键联)。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联，或两个或更多个(例如，约2个、约3个、约4个等)连续的不带负电荷的核苷酸间键联位于第三子结构域的3'-末端。在一些实施例中，第三子结构域的最后两个或三个或四个核苷酸间键联包含至少一个不是不带负电荷的核苷酸间键联的核苷酸间键联。在一些实施例中，第三子结构域的最后两个或三个或四个核苷酸间键联包含至少一个不是n001的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第三子结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第三子结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是Sp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第三子结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是Rp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第三子结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第三子结构域的最后两个核苷的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，第三子结构域的最后两个核苷是第二结构域的最后两个核苷。在一些实施例中，第三子结构域的最后两个核苷是寡核苷酸的最后两个核苷。在一些实施例中，连接第三子结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第三子结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是Sp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第三子结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是Rp不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第三子结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，连接第三子结构域的前两个核苷的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联，诸如n001。
在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)天然磷酸酯键联。在一些实施例中，第三结构域不含天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，第三子结构域包含5'-末端部分，例如具有约1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-3、3-8或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核碱基的长度的部分。在一些实施例中，5'-末端部分具有约1-3个核碱基的长度。在一些实施例中，长度为一个核碱基。在一些实施例中，长度为2个核碱基。在一些实施例中，长度为3个核碱基。在一些实施例中，长度为4个核碱基。在一些实施例中，长度为5个核碱基。在一些实施例中，长度为6个核碱基。在一些实施例中，长度为7个核碱基。在一些实施例中，长度为8个核碱基。在一些实施例中，长度为9个核碱基。在一些实施例中，长度为10个核碱基。在一些实施例中，5'-末端部分包含第三子结构域的5'-末端核碱基。在一些实施例中，第三子结构域包含3'-末端部分和5'-末端部分或由其组成。在一些实施例中，5'-末端部分包含第三子结构域的5'-末端核碱基。在一些实施例中，第三子结构域的5'-末端部分与第二子结构域键合。
在一些实施例中，5'-末端部分包含一个或多个具有两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)。在一些实施例中，5'-末端部分包含一个或多个具有2'-OH的糖(例如，天然RNA糖)。在一些实施例中，5'-末端部分中的一个或多个(例如，约1-20、1-15、1-10、3-8或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，5'-末端部分中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，每个糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，经修饰的糖独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
在一些实施例中，一个或多个经修饰的糖独立地包含2'-F或2'-OR，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，一个或多个经修饰的糖独立地是2'-F或2'-OMe。在一些实施例中，5'-末端部分中的每个经修饰的糖独立地是双环糖(例如，LNA糖)或具有2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，5'-末端部分中的每个经修饰的糖独立地是双环糖(例如，LNA糖)或具有2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，5'-末端部分中的每个经修饰的糖独立地是具有2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，R是甲基。
在一些实施例中，与3'-末端部分相比，5'-末端部分包含更高水平(数量和/或百分比)的2'-F修饰的糖和/或含有两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)，和/或更低水平(数量和/或百分比)的其他类型的经修饰的糖，例如，双环糖和/或具有2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，与3'-末端部分相比，5'-末端部分包含更高水平的2'-F修饰的糖和/或更低水平的2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，与3'-末端部分相比，5'-末端部分包含更高水平的2'-F修饰的糖和/或更低水平的2'-OMe修饰的糖。在一些实施例中，与3'-末端部分相比，5'-末端部分包含更高水平的天然DNA糖和/或更低水平的2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，与3'-末端部分相比，5'-末端部分包含更高水平的天然DNA糖和/或更低水平的2'-OMe修饰的糖。在一些实施例中，5'-末端部分包含低水平的(例如，不超过50％、40％、30％、25％、20％或10％的，或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)作为双环糖或含有2'-OR的糖的经修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基(例如，甲基)。在一些实施例中，5'-末端部分不含作为双环糖或含有2'-OR的糖的经修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基(例如，甲基)。
在一些实施例中，一个或多个经修饰的糖独立地包含2'-F。在一些实施例中，没有经修饰的糖包含2'-OMe或其他2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，5'-末端部分的每个糖独立地包含两个2'-H或2'-F修饰。在一些实施例中，5'-末端部分包含1、2、3、4或5个2'-F修饰的糖。在一些实施例中，5'-末端部分包含1-3个2'-F修饰的糖。在一些实施例中，5'-末端部分包含1、2、3、4或5个天然DNA糖。在一些实施例中，5'-末端部分包含1-3个天然DNA糖。
在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，5'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，5'-末端部分的每个核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，与3'-末端部分相比，5'-末端部分包含更高水平(数量和/或百分比)的Rp核苷酸间键联和/或天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，5'-末端部分包含如本文所述的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)错配。在一些实施例中，5'-末端部分包含如本文所述的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)摇摆。在一些实施例中，5'-末端部分与靶核酸约60-100％(例如，66％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多)互补。在一些实施例中，互补性为60％或更高。在一些实施例中，互补性为70％或更高。在一些实施例中，互补性为75％或更高。在一些实施例中，互补性为80％或更高。在一些实施例中，互补性为90％或更高。
在一些实施例中，第三子结构域包含3'-末端部分，例如具有约1-20、1-15、1-10、1-8、1-4、3-8或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核碱基的长度的部分。在一些实施例中，3'-末端部分具有约3-6个核碱基的长度。在一些实施例中，长度为一个核碱基。在一些实施例中，长度为2个核碱基。在一些实施例中，长度为3个核碱基。在一些实施例中，长度为4个核碱基。在一些实施例中，长度为5个核碱基。在一些实施例中，长度为6个核碱基。在一些实施例中，长度为7个核碱基。在一些实施例中，长度为8个核碱基。在一些实施例中，长度为9个核碱基。在一些实施例中，长度为10个核碱基。在一些实施例中，3'-末端部分包含第三子结构域的3'-末端核碱基。
在一些实施例中，3'-末端部分包含一个或多个具有两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)。在一些实施例中，3'-末端部分包含一个或多个具有2'-OH的糖(例如，天然RNA糖)。在一些实施例中，3'-末端部分中的一个或多个(例如，约1-20、1-15、1-10、3-8或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，3'-末端部分中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，每个糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，经修饰的糖独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
在一些实施例中，一个或多个经修饰的糖独立地包含2'-F或2'-OR，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，一个或多个经修饰的糖独立地是2'-F或2'-OMe。在一些实施例中，3'-末端部分中的每个经修饰的糖独立地是双环糖(例如，LNA糖)或具有2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，3'-末端部分中的每个经修饰的糖独立地是双环糖(例如，LNA糖)或具有2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，3'-末端部分中的每个经修饰的糖独立地是具有2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，R是甲基。
在一些实施例中，3'-末端部分中的一个或多个糖独立地包含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰。在一些实施例中，3'-末端部分中的每个糖独立地包含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰。在一些实施例中，LB是任选地经取代的-CH2-。在一些实施例中，LB是-CH2-。在一些实施例中，3'-末端部分中的每个糖独立地包含2'-OMe。
在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联是Rp。在一些实施例中，3'-末端部分的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，3'-末端部分的每个核苷酸间键联是Sp。
在一些实施例中，3'-末端部分包含如本文所述的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)错配。在一些实施例中，3'-末端部分包含如本文所述的一个或多个(例如，约1-10个，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)摇摆。在一些实施例中，3'-末端部分与靶核酸约60-100％(例如，66％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多)互补。在一些实施例中，互补性为60％或更高。在一些实施例中，互补性为70％或更高。在一些实施例中，互补性为75％或更高。在一些实施例中，互补性为80％或更高。在一些实施例中，互补性为90％或更高。
在一些实施例中，第三子结构域募集蛋白诸如ADAR蛋白(例如，ADAR1、ADAR2等)、促进或有助于该蛋白的募集。在一些实施例中，第三子结构域募集蛋白诸如ADAR蛋白，或促进或有助于与该蛋白的相互作用。在一些实施例中，第三子结构域与ADAR的RNA结合结构域(RBD)接触。在一些实施例中，第三子结构域与ADAR的具有脱氨酶活性的催化结构域接触。在一些实施例中，第三子结构域与ADAR1的具有脱氨酶活性的结构域接触。在一些实施例中，第三子结构域与ADAR2的具有脱氨酶活性的结构域接触。在一些实施例中，第三子结构域的多种核碱基、糖和/或核苷酸间键联可与蛋白(例如，ADAR蛋白)的一个或多个残基相互作用。
如本文所展示，可以在寡核苷酸中利用手性核苷酸间键联的键联磷的手性控制以提供多种特性和/或活性。在一些实施例中，Rp核苷酸间键联(例如，Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联)、Sp核苷酸间键联(例如，Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联)或非手性控制的核苷酸间键联(例如，非手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联)位于与靶腺苷相反的核苷的位置-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7和+8中的一个或多个位置处(“+”是从核苷向寡核苷酸的5'-末端计数的，其中+1位置处的核苷酸间键联是与核苷的5'-碳键合的核苷酸间键联，并且“-”是从核苷向寡核苷酸的3'-末端计数的，其中-1位置处的核苷酸间键联是与3'-碳键合的核苷酸间键联)。在一些实施例中，Rp核苷酸间键联(例如，Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联)在与靶腺苷相反的核苷的位置-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7和+8中的一个或多个位置处。在一些实施例中，Rp核苷酸间键联(例如，Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联)在与靶腺苷相反的核苷的位置-2、-1、+3、+4、+5、+6、+7和+8中的一个或多个位置处。在一些实施例中，Sp核苷酸间键联(例如，Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联)在与靶腺苷相反的核苷的位置-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7和+8中的一个或多个位置处。在一些实施例中，Sp核苷酸间键联(例如，Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联)在与靶腺苷相反的核苷的位置-2、-1、+3、+4、+5、+6、+7和+8中的一个或多个位置处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联(例如，非手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联)在与靶腺苷相反的核苷的位置-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7和+8中的一个或多个位置处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联(例如，非手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联)在与靶腺苷相反的核苷的位置-2、-1、+3、+4、+5、+6、+7和+8中的一个或多个位置处。
在一些实施例中，Rp在位置+8处。在一些实施例中，Rp在位置+7处。在一些实施例中，Rp在位置-6处。在一些实施例中，Rp在位置+5处。在一些实施例中，Rp在位置+4处。在一些实施例中，Rp在位置+3处。在一些实施例中，Rp在位置+2处。在一些实施例中，Rp在位置+1处。在一些实施例中，Rp在位置-1处。在一些实施例中，Rp在位置-2处。在一些实施例中，Rp在位置-3处。在一些实施例中，Rp在位置-4处。在一些实施例中，Rp在位置-5处。在一些实施例中，Rp在位置-6处。在一些实施例中，Rp在位置-7处。在一些实施例中，Rp在位置-8处。在一些实施例中，Rp是手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联的构型。在一些实施例中，Sp在位置+8处。在一些实施例中，Sp在位置+7处。在一些实施例中，Sp在位置-6处。在一些实施例中，Sp在位置+5处。在一些实施例中，Sp在位置+4处。在一些实施例中，Sp在位置+3处。在一些实施例中，Sp在位置+2处。在一些实施例中，Sp在位置+1处。在一些实施例中，Sp在位置-1处。在一些实施例中，Sp在位置-2处。在一些实施例中，Sp在位置-3处。在一些实施例中，Sp在位置-4处。在一些实施例中，Sp在位置-5处。在一些实施例中，Sp在位置-6处。在一些实施例中，Sp在位置-7处。在一些实施例中，Sp在位置-8处。在一些实施例中，Sp是手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联的构型。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联在位置+8处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联在位置+7处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联在位置-6处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联在位置+5处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联在位置+4处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联在位置+3处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联在位置+2处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联在位置+1处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联在位置-1处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联在位置-2处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联在位置-3处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联在位置-4处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联在位置-5处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联在位置-6处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联在位置-7处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联在位置-8处。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联是非手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联。
在一些实施例中，第一结构域包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)Rp核苷酸间键联(例如，Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联)。在一些实施例中，第一结构域包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)Sp核苷酸间键联(例如，Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联)。在一些实施例中，第一结构域包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)非手性控制的核苷酸间键联(例如，非手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联)。在一些实施例中，此类核苷酸间键联是连续的。在一些实施例中，第一结构域中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的或所有的核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，第一结构域中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的或所有的硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)Rp核苷酸间键联(例如，Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联)。在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)Sp核苷酸间键联(例如，Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联)。在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)非手性控制的核苷酸间键联(例如，非手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联)。在一些实施例中，此类核苷酸间键联是连续的。在一些实施例中，第二结构域中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的或所有的核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，第二结构域中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的或所有的硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，第一子结构域包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)Rp核苷酸间键联(例如，Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联)。在一些实施例中，第一子结构域包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)Sp核苷酸间键联(例如，Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联)。在一些实施例中，第一子结构域包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)非手性控制的核苷酸间键联(例如，非手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联)。在一些实施例中，此类核苷酸间键联是连续的。在一些实施例中，此类核苷酸间键联在第一子结构域的3'-末端部分处。
在一些实施例中，在所提供的寡核苷酸及其组合物中使用一个或多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)包含一个或多个(例如，约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个或更多个)天然磷酸酯键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)包含两个或更多个(例如，约或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个或更多个)连续天然磷酸酯键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)包含不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)包含不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个连续天然磷酸酯键联。在一些实施例中，在所提供的寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)中约或至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的或所有的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，在所提供的寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)中约或至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的或所有的核苷酸间键联不是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，在所提供的寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)中约或至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的或所有的核苷酸间键联不是连续天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸或其部分包含一个或多个天然磷酸酯键联和一个或多个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸或其部分包含一个或多个天然磷酸酯键联和一个或多个手性控制的经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)包含不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个天然磷酸酯键联，其各自独立地与不含2'-OR修饰的两个糖键合，其中R如本文所述但不是-H。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)包含不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个连续天然磷酸酯键联，其各自独立地与不含2'-OR修饰的两个糖键合，其中R如本文所述但不是-H。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)包含不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个天然磷酸酯键联，其各自独立地与两个2'-F修饰的糖键合。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)包含不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个连续的天然磷酸酯键联，其各自独立地与两个2'-F修饰的糖键合。在一些实施例中，在寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)中，不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个，例如，不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个等与不含2'-OR修饰(其中R如本文所述但不是-H)的两个糖键合的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，在寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)中，不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个，例如，不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个等与两个2'-F修饰的糖键合的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，在寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)中，不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，例如，不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过约30％、不超过约40％、不超过50％等与不含2'-OR修饰(其中R如本文所述但不是-H)的两个糖键合的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，在寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)中，不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，例如，不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过约30％、不超过约40％、不超过50％等与两个2'-F修饰的糖键合的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，在寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)中，不超过约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个，例如，不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个等与不含2'-OR修饰(其中R如本文所述但不是-H)的两个糖键合的连续核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，在寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)中，不超过约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个，例如，不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个等与两个2'-F修饰的糖键合的连续核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，天然磷酸酯键联在与靶腺苷相反的核苷的位置-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7和+8中的一个或多个位置处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置-1和+1中的一个或多个位置处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置-1和+1处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置-1处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置+1处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置+8处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置+7处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置-6处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置+5处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置+4处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置+3处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置+2处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置-2处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置-3处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置-4处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置-5处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置-6处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置-7处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置-8处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置-1处，并且经修饰的核苷酸间键联在位置+1处。在一些实施例中，天然磷酸酯键联在位置+1处，并且经修饰的核苷酸间键联在位置-1处。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是手性控制的Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是手性控制的并且是Rp。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是手性控制的Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，第二结构域包含不超过2个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，第二结构域包含不超过1个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，可以在寡核苷酸或其部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等)的多种位置利用单个天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，在寡核苷酸或其部分的特定位置利用特定类型的糖。例如，在一些实施例中，第一结构域包含多个2'-F修饰的糖(和任选地多个2'-OR修饰的糖，其中R不是-H，在一些实施例中处于比2'-F修饰的糖更低的水平)；第一子结构域包含多个2'-OR修饰的糖，其中R不是-H(例如，2'-OMe修饰的糖；和任选地多个2'-F糖，在一些实施例中处于比2'-OR修饰的糖更低的水平，其中R不是-H)；第二结构域包含一个或多个天然DNA糖(在位置2'处没有取代)和/或一个或多个2'-F修饰的糖；和/或第三子结构域包含多个2'-OR修饰的糖，其中R不是-H(例如，2'-OMe修饰的糖；和任选地多个2'-F糖，在一些实施例中处于比2'-OR修饰的糖更低的水平，其中R不是-H)。在一些实施例中，特定类型的糖独立地在与靶腺苷相反的核苷的位置-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、0、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7和+8中的一个或多个位置处(“+”是从该核苷向寡核苷酸的5'-末端计数的，“-”是从该核苷向寡核苷酸的3'-末端计数的，其中位置0是与靶腺苷相反的该核苷的位置，例如：5'-…N+2N+1N0N-1N-2…3')。在一些实施例中，特定类型的糖独立地在位置-5、-4、-3、-2、-1、0、+1、+2、+3、+4和+5中的一个或多个位置处。在一些实施例中，特定类型的糖独立地在位置-3、-2、-1、0、+1、+2和+3中的一个或多个位置处。在一些实施例中，特定类型的糖独立地在位置-2、-1、0、+1和+2中的一个或多个位置处。在一些实施例中，特定类型的糖独立地在位置-1、0和+1中的一个或多个位置处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置+8处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置+7处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置+6处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置+5处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置+4处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置+3处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置+2处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置+1处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置0处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置-8处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置-7处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置-6处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置-5处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置-4处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置-3处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置-2处。在一些实施例中，特定类型的糖在位置-1处。在一些实施例中，特定类型的糖独立地是选自天然DNA糖(在2'-碳处有两个2'-H)、2'-OMe修饰的糖和2'-F修饰的糖的糖。在一些实施例中，特定类型的糖独立地是选自天然DNA糖(在2'-碳处有两个2'-H)和2'-OMe修饰的糖的糖。在一些实施例中，特定类型的糖独立地是选自天然DNA糖(在2'-碳处有两个2'-H)和2'-F修饰的糖的糖，例如对于位置0、-1和/或+1处的糖。在一些实施例中，特定类型的糖是天然DNA糖(在2'-碳处有两个2'-H)，例如在位置-1、0或+1处。在一些实施例中，特定类型的糖是2'-F修饰的糖，例如在位置-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、0、+1、+2、+3、+4、+5、
+6、+7和/或+8处。在一些实施例中，特定类型的糖是2'-F修饰的糖，例如在位置-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、+2、+3、+4、+5、+6、+7和/或+8处。在一些实施例中，2'-F修饰的糖在位置-2处。在一些实施例中，2'-F修饰的糖在位置-3处。在一些实施例中，2'-F修饰的糖在位置-4处。在一些实施例中，2'-F修饰的糖在位置+2处。在一些实施例中，2'-F修饰的糖在位置+3处。在一些实施例中，2'-F修饰的糖在位置+4处。在一些实施例中，2'-F修饰的糖在位置+5处。在一些实施例中，2'-F修饰的糖在位置+6处。在一些实施例中，2'-F修饰的糖在位置+7处。在一些实施例中，2'-F修饰的糖在位置+8处。在一些实施例中，特定类型的糖是2'-OMe修饰的糖，例如在位置-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、0、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7和/或+8处。在一些实施例中，特定类型的糖是2'-OMe修饰的糖，例如在位置-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、+2、+3、+4、+5、+6、+7和/或+8处。在一些实施例中，2'-OMe修饰的糖在位置-2处。在一些实施例中，2'-OMe修饰的糖在位置-3处。在一些实施例中，2'-OMe修饰的糖在位置-4处。在一些实施例中，2'-OMe修饰的糖在位置+2处。在一些实施例中，2'-OMe修饰的糖在位置+3处。在一些实施例中，2'-OMe修饰的糖在位置+4处。在一些实施例中，2'-OMe修饰的糖在位置+5处。在一些实施例中，2'-OMe修饰的糖在位置+6处。在一些实施例中，2'-OMe修饰的糖在位置+7处。在一些实施例中，2'-OMe修饰的糖在位置+8处。在一些实施例中，位置0处的糖不是2'-MOE修饰的糖。在一些实施例中，位置0处的糖是天然DNA糖(在2'-碳处有两个2'-H)。在一些实施例中，位置0处的糖不是2'-MOE修饰的糖。在一些实施例中，位置-1处的糖不是2'-MOE修饰的糖。在一些实施例中，位置-2处的糖不是2'-MOE修饰的糖。在一些实施例中，位置-3处的糖不是2'-MOE修饰的糖。在一些实施例中，第一结构域包含一个或多个2'-F修饰的糖和任选地2'-OR修饰的糖(在一些实施例中处于比2'-F修饰的糖更低的水平)，其中R如本文所述并且不是-H。在一些实施例中，第一结构域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个2'-OR修饰的糖(在一些实施例中处于比2'-F修饰的糖更低的水平)，其中R如本文所述并且不是-H。在一些实施例中，第一结构域包含1、2、3或4个，或1个且不多于1个、2个且不多于2个、3个且不多于3个、或4个且不多于4个2'-OR修饰的糖，其中R是C1-6脂肪族基。在一些实施例中，第一结构域的第一糖、第二糖、第三糖和/或第四糖独立地是2'-OR修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，包含2'-OR的糖是连续的。在一些实施例中，第一结构域在其5'-末端包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续的糖，其中每个糖独立地包含2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，2'-OR是2'-OMe。在一些实施例中，2'-OR是2'-MOE。在一些实施例中，第二结构域包含一个或多个2'-OR修饰的糖(在一些实施例中处于更低的水平)，其中R如本文所述并且不是-H，和任选地2'-F修饰的糖(在一些实施例中处于更低的水平)。在一些实施例中，第一子结构域包含一个或多个2'-OR修饰的糖(在一些实施例中处于更低的水平)，其中R如本文所述并且不是-H，和任选地2'-F修饰的糖(在一些实施例中处于更低的水平)。在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个2'-OR修饰的糖(在一些实施例中处于更低的水平)，其中R如本文所述并且不是-H，和任选地2'-F修饰的糖(在一些实施例中处于更低的水平；在一些实施例中，以更高的水平)。在一些实施例中，第三子结构域包含约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个2'-F修饰的糖。在一些实施例中，第三子结构域包含约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续的2'-F修饰的糖。在一些实施例中，第三子结构域中约或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的糖独立地包含2'-F修饰。在一些实施例中，第三子结构域中的第一2'-F修饰的糖(从5'至3')不是第三子结构域中的第一糖。在一些实施例中，第三结构域中的第一2'-F修饰的糖在相对于与靶腺苷相反的核苷的位置-3处。在一些实施例中，第三子结构域中的每个糖独立地是经修饰的糖。在一些实施例中，第三子结构域中的每个糖独立地是经修饰的糖，其中修饰选自2'-F和2'-OR，其中R是C1-6脂肪族基。在一些实施例中，修饰选自2'-F和2'-OMe。在一些实施例中，第三子结构域中的每个经修饰的糖独立地是2'-F修饰的糖。在一些实施例中，第三子结构域中的每个经修饰的糖独立地是2'-OMe修饰的糖。在一些实施例中，第三子结构域中的一个或多个经修饰的糖独立地是2'-OMe修饰的糖，并且第三子结构域中的一个或多个经修饰的糖独立地是2'-F修饰的糖。在一些实施例中，第三子结构域中的每个经修饰的糖独立地是2'-F修饰的糖，但第三子结构域的第一糖除外，其在一些实施例中是2'-OMe修饰的糖。在一些实施例中，第三子结构域包含一个或多个2'-OR修饰的糖(在一些实施例中处于更低的水平)，其中R如本文所述并且不是-H，和任选地2'-F修饰的糖(在一些实施例中处于更低的水平)。在一些实施例中，2'-OR是2'-OMe。在一些实施例中，2'-OR是2'-MOE。
碱基序列
如本领域技术人员所理解的，本披露的结构特征，诸如核碱基修饰、糖修饰、核苷酸间键联修饰、键联磷立体化学等及其组合可与多种合适的碱基序列一起使用以提供具有所需特性和/或活性的寡核苷酸和组合物。例如，用于腺苷修饰(例如，在ADAR蛋白存在下转化成I)的寡核苷酸通常具有与包含靶腺苷的靶核酸序列充分互补的序列。与靶腺苷相反的核苷可存在于寡核苷酸的多种位置。在一些实施例中，一个或多个相反核苷在第一结构域中。在一些实施例中，一个或多个相反核苷在第二结构域中。在一些实施例中，一个或多个相反核苷在第一子结构域中。在一些实施例中，一个或多个相反核苷在第二子结构域中。在一些实施例中，一个或多个相反核苷在第三子结构域中。本披露的寡核苷酸可以靶向一个或多个靶腺苷。在一些实施例中，一个或多个相反核苷各自独立地在具有第二子结构域的结构特征的部分中，并且各自独立地具有如本文所述的相反核苷的一个或多个或所有结构特征。在许多实施例中，例如，为了靶向G至A突变，寡核苷酸可以选择性地靶向一个且仅一个靶腺苷进行修饰，例如通过ADAR以转化成I。在一些实施例中，相反核苷更靠近寡核苷酸的3'-末端而不是5'-末端。
在一些实施例中，寡核苷酸具有本文所述(例如，在表中)的碱基序列或其具有0-5个(例如，0、1、2、3、4或5个)错配的部分(例如，10-50、10-40、10-30、10-20或10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或至少10、至少15、至少20、至少25个连续核碱基的跨度)，其中每个T可以独立地被U取代并且反之亦然。在一些实施例中，寡核苷酸包含本文所述的碱基序列或其部分，其中部分是具有0-5个错配的至少10个连续核碱基的跨度、或至少15个连续核碱基的跨度。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸具有本文所述的碱基序列或其部分，其中部分是至少10个连续核碱基的跨度、或具有1-5个错配的至少10个连续核碱基的跨度，其中每个T可以独立地被U取代并且反之亦然。
在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列包含与核酸(例如，基因或其转录物(例如，mRNA))的碱基序列相同或互补的碱基序列的10-60个(例如，约或至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60个；在一些实施例中，至少15个；在一些实施例中，至少16个；在一些实施例中，至少17个；在一些实施例中，至少18个；在一些实施例中，至少19个；在一些实施例中，至少20个；在一些实施例中，至少21个；在一些实施例中，至少22个；在一些实施例中，至少23个；在一些实施例中，至少24个；在一些实施例中，至少25个；在一些实施例中，至少26个；在一些实施例中，至少27个；在一些实施例中，至少28个；在一些实施例中，至少29个；在一些实施例中，至少30个；在一些实施例中，至少31个；在一些实施例中，至少32个；在一些实施例中，至少33个；在一些实施例中，至少34个；在一些实施例中，至少35个)碱基(任选地连续地)，或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列是或包含与基因或其转录物中的靶序列互补的序列。在一些实施例中，序列的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60个或更多个核碱基。
在一些实施例中，靶序列是或包含核酸序列(例如，基因或其转录物的)的特征性序列，因为其定义该核酸序列超过相关生物体中的其他核酸序列；例如，特征性序列不存在于相关生物体中的其他基因组核酸序列(例如，基因)或其转录物中或至少与其具有多种错配。在一些实施例中，转录物的特征性序列定义该转录物超过相关生物体中的其他转录物；例如，在一些实施例中，特征性序列不存于从不同核酸序列(例如，不同基因)转录的转录物中。在一些实施例中，来自核酸序列的转录物变体(例如，基因的mRNA变体)可共享共同特征性序列，该特征性序列定义它们来自例如其他基因的转录物。在一些实施例中，特征性序列包含靶腺苷。在一些实施例中，寡核苷酸选择性地与包含靶腺苷的核酸形成双链体，其中靶腺苷在双链体区域内并且可以被蛋白诸如ADAR1或ADAR2修饰。
如本领域技术人员所理解的，所提供的寡核苷酸的碱基序列通常具有足够的长度和与其靶核酸例如RNA转录物(例如，前体mRNA、成熟mRNA等)的互补性，以用于例如靶腺苷的定点编辑。在一些实施例中，寡核苷酸与靶RNA序列的包含靶腺苷的一部分互补(如本领域技术人员所理解的，在许多情况下，靶核酸长于本披露的寡核苷酸，并且可基于两个寡核苷酸中较短的寡核苷酸来适当地评估互补性)。在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列与表中披露的寡核苷酸的碱基序列具有90％或更高的同一性，其中每个T可以独立地被U取代并且反之亦然。在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列与表中披露的寡核苷酸的碱基序列具有95％或更高的同一性，其中每个T可以独立地被U取代并且反之亦然。在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列包含表中披露的寡核苷酸的15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多个碱基的连续跨度，其中每个T可独立地被U取代并且反之亦然，但该跨度内的一个或多个碱基是无碱基的(例如，核碱基不存在于核苷酸中)。
在一些实施例中，本披露涉及具有碱基序列的寡核苷酸，该碱基序列包含本文披露的任何寡核苷酸的碱基序列，其中每个T可以独立地被U代替并且反之亦然。
在一些实施例中，本披露涉及具有作为本文披露的任何寡核苷酸的碱基序列的碱基序列的寡核苷酸，其中每个T可以独立地被U代替并且反之亦然。
在一些实施例中，本披露涉及具有包含本文披露的任何寡核苷酸的碱基序列的至少15个连续碱基的碱基序列的寡核苷酸，其中每个T可以独立地被U代替并且反之亦然。
在一些实施例中，本披露涉及具有与本文披露的任何寡核苷酸的碱基序列至少90％相同的碱基序列的寡核苷酸，其中每个T可以独立地被U代替并且反之亦然。
在一些实施例中，本披露涉及具有与本文披露的任何寡核苷酸的碱基序列至少95％相同的碱基序列的寡核苷酸，其中每个T可以独立地被U代替并且反之亦然。
在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列是或包含本文所述的任何寡核苷酸的碱基序列的10-40个，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个连续碱基，其中每个T可以独立地被U代替并且反之亦然。
在一些实施例中，寡核苷酸是本文表中呈现的寡核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸的碱基序列与靶核酸(例如，包含靶腺苷的部分)的碱基序列互补。
在一些实施例中，寡核苷酸具有包含表中寡核苷酸的至少15个连续碱基(例如，15、16、17、18、19或20个)的碱基序列，其中每个T可独立地被U取代并且反之亦然。
在一些实施例中，寡核苷酸包含任一表中所述的碱基序列或其部分(例如，包含10-40个，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核碱基的部分)，其中每个T可独立地被U代替并且反之亦然，和/或任一表中所述的糖、核碱基和/或核苷酸间键联修饰和/或立体化学和/或其模式，和/或任一表中所述的另外的化学部分(除寡核苷酸链之外，例如还有靶部分、脂质部分、碳水化合物部分等)。
在一些实施例中，术语“互补的”、“完全互补的”和“基本上互补的”可用于寡核苷酸与靶序列之间的碱基匹配，如本领域技术人员从其使用的上下文将理解的。应注意，用U取代T或反过来通常都不会改变互补的量。如本文所用，与靶序列“基本上互补”的寡核苷酸在很大程度上或大部分是互补的，但不必是100％互补的。在一些实施例中，基本上互补的序列(例如，寡核苷酸)在与其靶序列最大比对时具有一个或多个，例如1、2、3、4或5个错配。在一些实施例中，寡核苷酸具有与靶核酸的靶序列基本上互补的碱基序列。在一些实施例中，寡核苷酸具有与本文披露的寡核苷酸的序列的互补序列基本上互补的碱基序列。如本领域技术人员所理解的，在一些实施例中，寡核苷酸的序列不需要与寡核苷酸的靶100％互补即可执行其功能(例如，在核酸中将A转化成I)。在一些实施例中，错配在寡核苷酸的5'和/或3'末端或中间被良好耐受。在一些实施例中，一个或多个错配优选用于如本文所展示的腺苷修饰。在一些实施例中，寡核苷酸包含用于与靶核酸互补的部分，和任选地不主要用于与靶核酸互补的部分；例如，在一些实施例中，寡核苷酸可以包含用于蛋白结合的部分。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸的碱基序列与其靶序列完全互补(A-T/U和C-G碱基配对)。在一些实施例中，除了在与靶核苷(例如，腺苷)相反的核苷处，所提供的寡核苷酸的碱基序列与其靶序列完全互补(A-T/U和C-G碱基配对)。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，该寡核苷酸包含在表中所述的寡核苷酸中发现的序列，其中一个或多个U独立地并且任选地被T代替，或反之亦然。在一些实施例中，寡核苷酸可包含至少一个T和/或至少一个U。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，该寡核苷酸包含在本文表中所述的寡核苷酸中发现的序列，其中所述序列与表中描述的寡核苷酸的序列具有超过50％的同一性。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其碱基序列是表中所披露的寡核苷酸的序列，其中每个T可以独立地被U代替并且反之亦然。在一些实施例中，本披露提供了包含在表中的寡核苷酸中发现的序列的寡核苷酸，其中该寡核苷酸具有本文表中的相同寡核苷酸或另一种寡核苷酸的骨架键联模式、骨架手性中心模式和/或骨架磷修饰模式。
在一些实施例中，本披露提供了具有以下碱基序列的寡核苷酸，该碱基序列是本文披露(例如，在表中)的寡核苷酸的碱基序列或包含本其一部分，其中每个T可以独立地被U代替并且反之亦然，其中该寡核苷酸任选地进一步包含化学修饰、立体化学、形式、本文描述的另外的化学部分(例如，靶向部分、脂质部分、碳水化合物部分等)和/或另一结构特征。
在一些实施例中，“部分”(例如，碱基序列或修饰模式或其他结构元件的部分)为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个单体单元长。
阅读本披露内容的本领域技术人员将理解，本文的技术可用于靶向包含用于编辑的靶腺苷的多种靶核酸。在一些实施例中，靶核酸是PiZZ等位基因的转录物。在一些实施例中，靶腺苷是…atcgacAagaaagggactgaagc...。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸具有合适的碱基序列，使得它们具有足够的互补性以选择性地与包含用于编辑的靶腺苷的转录物的一部分形成双链体。
如本文所述，与靶核苷(例如，A)相反的核苷可以位于多种位置。在一些实施例中，相反核苷在相对于寡核苷酸的5'-末端的位置2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30或更远的位置处。在一些实施例中，它在相对于寡核苷酸的5'-末端的位置3或更远的位置处。在一些实施例中，它在相对于寡核苷酸的5'-末端的位置4或更远的位置处。在一些实施例中，它在相对于寡核苷酸的5'-末端的位置5或更远的位置处。在一些实施例中，它在相对于寡核苷酸的5'-末端的位置6或更远的位置处。在一些实施例中，它在相对于寡核苷酸的5'-末端的位置7或更远的位置处。在一些实施例中，它在相对于寡核苷酸的5'-末端的位置8或更远的位置处。在一些实施例中，它在相对于寡核苷酸的5'-末端的位置9或更远的位置处。在一些实施例中，它在相对于寡核苷酸的5'-末端的位置10或更远的位置处。在一些实施例中，相反核苷在相对于寡核苷酸的3'-末端的位置2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30或更远的位置处。在一些实施例中，它在相对于寡核苷酸的3'-末端的位置3或更远的位置处。在一些实施例中，它在相对于寡核苷酸的3'-末端的位置4或更远的位置处。在一些实施例中，它在相对于寡核苷酸的3'-末端的位置5或更远的位置处。在一些实施例中，它在相对于寡核苷酸的3'-末端的位置6或更远的位置处。在一些实施例中，它在相对于寡核苷酸的3'-末端的位置7或更远的位置处。在一些实施例中，它在相对于寡核苷酸的3'-末端的位置8或更远的位置处。在一些实施例中，它在相对于寡核苷酸的3'-末端的位置9或更远的位置处。在一些实施例中，它在相对于寡核苷酸的3'-末端的位置10或更远的位置处。在一些实施例中，当进行最大互补性比对时，在相对于5'-末端和/或3'-末端的位置1处的核碱基与靶序列中的相应核碱基互补。在一些实施例中，某些位置，例如位置6、7或8，可以提供更高的编辑效率。
作为实例，下表1中呈现了某些寡核苷酸，这些寡核苷酸包含某些示例碱基序列、核碱基修饰及其模式、糖修饰及其模式、核苷酸间键联及其模式、键联磷立体化学及其模式、接头和/或另外的化学部分。尤其是，这些寡核苷酸可用于校正基因或基因产物中的G至A突变(例如，通过将A转化成I)。在一些实施例中，表中列出的是立体随机寡核苷酸组合物。在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物。
Figure BDA0003580200980001991
Figure BDA0003580200980002001
Figure BDA0003580200980002011
Figure BDA0003580200980002021
Figure BDA0003580200980002031
Figure BDA0003580200980002041
Figure BDA0003580200980002051
Figure BDA0003580200980002061
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Figure BDA0003580200980002101
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Figure BDA0003580200980002121
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Figure BDA0003580200980002181
Figure BDA0003580200980002191
Figure BDA0003580200980002201
Figure BDA0003580200980002211
Figure BDA0003580200980002221
Figure BDA0003580200980002231
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Figure BDA0003580200980002251
Figure BDA0003580200980002261
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Figure BDA0003580200980002301
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Figure BDA0003580200980002331
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Figure BDA0003580200980002401
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Figure BDA0003580200980002501
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Figure BDA0003580200980002531
Figure BDA0003580200980002541
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Figure BDA0003580200980002561
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Figure BDA0003580200980002601
Figure BDA0003580200980002611
Figure BDA0003580200980002621
Figure BDA0003580200980002631
Figure BDA0003580200980002641
Figure BDA0003580200980002651
Figure BDA0003580200980002661
Figure BDA0003580200980002671
注意事项：
表1(例如，表1A、表1B、表1C等)中的描述、碱基序列和立体化学/键联因其长度而可能分为多行。除非另有说明，否则表1中的所有寡核苷酸均为单链的。如本领域技术人员所理解的，除非另外指明(例如，用r、m、m5、eo等)，否则核苷单元是未修饰的并且含有未修饰的核碱基和2'-脱氧糖；除非另外指明，否则键联是天然磷酸酯键联；酸性/碱性基团独立地可以盐的形式存在。如果未指定糖，则糖是天然DNA糖；并且如果未指定核苷酸间键联，则核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。烷基部分和修饰：
m：2'-OMe；
m5：C的5位处的甲基(核碱基是5-甲基胞嘧啶)；
m5lC：C的5位处的甲基(核碱基是5-甲基胞嘧啶)并且糖是LNA糖；l：LNA糖；
I：核碱基是次黄嘌呤；
f：2'-F；
r：2'-OH；
eo：2'-MOE(2'-OCH2CH2OCH3)；
m5Ceo：5-甲基2'-O-甲氧基乙基C；
O、PO：磷酸二酯(磷酸酯)。其可以是键联或是末端基团(或其组分)，例如接头与寡核苷酸链之间的键联、核苷酸间键联(天然磷酸酯键联)等。磷酸二酯通常在立体化学/键联列中以“O”指示而通常不在描述列中标记(如果其为末端基团，例如5'-末端基团，则其在描述中指示而通常不在立体化学/键联列中指示)；如果在描述列中未指示键联，则除非另外指明，否则其通常是磷酸二酯。注意，接头(例如，L001)与寡核苷酸链之间的磷酸酯键联可以不在描述列中标记，但可以在立体化学/键联列中用“O”指示；
*、PS：硫代磷酸酯。它可以是末端基团(如果其为末端基团，例如5'-末端基团，则在描述列中指示而通常不在立体化学/键联中指示)，或键联，例如，接头(例如，L001)与寡核苷酸链之间的键联、核苷酸间键联(硫代磷酸酯核苷酸间键联)等；
R、Rp：呈Rp构象的硫代磷酸酯。注意，描述中的*R表示呈Rp构型的单个硫代磷酸酯键联；
S、Sp：呈Sp构象的硫代磷酸酯。注意，描述中的*S表示呈Sp构型的单个硫代磷酸酯键联；
X：立体随机硫代磷酸酯；
n001：
Figure BDA0003580200980002691
nX：立体随机n001；
nR或n001R：呈Rp构型的n001；
nS或n001S：呈Sp构型的n001；
Mod001：
Figure BDA0003580200980002692
L001：-NH-(CH2)6-接头(C6接头、C6胺接头或C6氨基接头)，其通过-NH-连接到Mod(例如，Mod001)，并且在例如WV-27457的情况下，通过磷酸酯键联(O或PO)连接到寡核苷酸链的5'-末端。例如，在WV-27457中，L001通过-NH-(形成酰胺基团-C(O)-NH-)连接到Mod001，并且通过磷酸酯键联(O)连接到寡核苷酸链；
L010：
Figure BDA0003580200980002701
在一些实施例中，当L010存在于寡核苷酸的中间时，其作为其他糖(例如，DNA糖)与核苷酸间键联键合，例如，其5'-碳与另一单元(例如，糖的3')连接，并且其3'-碳独立地与另一单元(例如，碳的5'-碳)连接，例如，经由键联(例如，磷酸酯键联(O或PO)或硫代磷酸酯键联(可以不是手性控制的或是手性控制的(Sp或Rp)))；
L012：-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。当L012存在于寡核苷酸的中间时，其两个末端中的每一个独立地与核苷酸间键联(例如，磷酸酯键联(O或PO)或硫代磷酸酯键联(可以不是手性控制的或是手性控制的(Sp或Rp)))键合；
L025：
Figure BDA0003580200980002702
其中-CH2-连接位点用作糖(例如，DNA糖)的C5连接位点并连接到另一单元(例如，糖的3')，并且环上的连接位点用作C3连接位点并连接到另一单元(例如，碳的5'-碳)，其各自独立地例如经由键联(例如，磷酸酯键联(O或PO)或硫代磷酸酯键联(可以不是手性控制的或是手性控制的(Sp或Rp)))连接。当L025在5'-末端而没有任何修饰时，其-CH2-连接位点与-OH键合。例如，多种寡核苷酸中的L025L025L025-具有
Figure BDA0003580200980002703
的结构(可以以多种盐形式存在)并且经由所指示的键联(例如，磷酸酯键联(O或PO)或硫代磷酸酯键联(可以不是手性控制的或是手性控制的(Sp或Rp)))连接到寡核苷酸链的5'-碳；
L028：-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。当L028存在于寡核苷酸的中间时，其两个末端中的每一个独立地与核苷酸间键联(例如，磷酸酯键联(O或PO)或硫代磷酸酯键联(可以不是手性控制的或是手性控制的(Sp或Rp)))键合；
环上的连接位点用作糖(例如，DNA糖)的C3连接位点，其各自独立地键合到
sm04：
Figure BDA0003580200980002711
sm04跟随其所结合的核碱基；例如，在WV-28787中，例如，“Usm04”指示U键合到sm04
Figure BDA0003580200980002712
a：2'-NH2；
b001U：碱基为
Figure BDA0003580200980002713
的核苷；
b001rU：碱基
Figure BDA0003580200980002714
为且糖为天然RNA糖(r)的核苷；
b002U：碱基为
Figure BDA0003580200980002715
的核苷；
b003U：碱基为
Figure BDA0003580200980002716
的核苷；
b004U：碱基为
Figure BDA0003580200980002721
的核苷；
b005U：碱基为
Figure BDA0003580200980002722
的核苷；
b006U：碱基为
Figure BDA0003580200980002723
的核苷；
b007U：碱基为
Figure BDA0003580200980002724
的核苷；
b008U：碱基为
Figure BDA0003580200980002725
的核苷；
b009U：碱基为
Figure BDA0003580200980002726
的核苷；
b003I：碱基为
Figure BDA0003580200980002727
的核苷；
b001G：碱基为
Figure BDA0003580200980002728
的核苷；
b001A：碱基为
Figure BDA0003580200980002731
的核苷；
b002A：碱基为
Figure BDA0003580200980002732
的核苷；
b003A：碱基为
Figure BDA0003580200980002733
的核苷；
zdnp：碱基为
Figure BDA0003580200980002734
的核苷；
b001C：碱基为
Figure BDA0003580200980002735
的核苷；
b002C：碱基为
Figure BDA0003580200980002736
的核苷；
b003C：碱基为
Figure BDA0003580200980002737
的核苷。
寡核苷酸组合物
尤其是，本披露提供了多种寡核苷酸组合物。在一些实施例中，本披露提供了本文所述的寡核苷酸的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，寡核苷酸组合物包含本披露中所述的多个寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸组合物是手性控制的。在一些实施例中，寡核苷酸组合物不是手性控制的(立体随机的)。
天然磷酸酯键联的键联磷是非手性的。许多修饰的核苷酸间键联，例如硫代磷酸酯核苷酸间键联的键联磷是手性的。在一些实施例中，在寡核苷酸组合物的制备期间(例如，在传统的亚磷酰胺寡核苷酸合成中)，不有意地设计或控制手性键联磷的构型，从而产生非手性控制(立体随机)的寡核苷酸组合物(基本上是外消旋制备物)，其是各种立体异构体的复杂的随机的混合物(非对映异构体)-对于具有n个手性核苷酸间键联(键联磷是手性的)的寡核苷酸，通常是2n个立体异构体(例如，当n是10时，210＝1,032；当n是20时，220＝1,048,576)。这些立体异构体具有相同的构成，但是其键联磷的立体化学模式不同。
在一些实施例中，立体随机的寡核苷酸组合物具有足够用于某些目的和/或应用的特性和/或活性。在一些实施例中，与手性控制的寡核苷酸组合物相比，立体随机的寡核苷酸组合物可以更便宜地、更容易地和/或更简单地生产。然而，立体随机组合物中的立体异构体可具有不同的特性、活性和/或毒性，导致特别是与某些相同构造的寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物相比，立体随机组合物的治疗效果不一致和/或非预期的副作用。
在一些实施例中，本披露涵盖用于设计和制备手性控制的寡核苷酸组合物的技术。在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，例如表1中的在其立体化学/键联中包含S和/或R的许多寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物包含控制/预定(不是如立体随机组合物中那样随机的)水平的多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸在一个或多个手性核苷酸间键联(手性控制的核苷酸间键联)处共享相同的键联磷立体化学。在一些实施例中，寡核苷酸共享相同的骨架手性中心模式(键联磷的立体化学)。在一些实施例中，骨架手性中心模式如本披露中所述。在一些实施例中，多个寡核苷酸是结构相同的。
在一些实施例中，本披露提供了包含多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中该多个寡核苷酸共享：
1)共同碱基序列，和
2)独立地在一个或多个(例如，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个)手性核苷酸间键联处相同的键联磷立体化学(“手性控制的核苷酸间键联”)。
在一些实施例中，本披露提供了包含多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中该多个寡核苷酸共享：
1)共同碱基序列，和
2)独立地在一个或多个(例如，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个)手性核苷酸间键联处相同的键联磷立体化学(“手性控制的核苷酸间键联”)；
其中相对于共享该共同碱基序列的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物，该组合物富集该多个寡核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物是手性控制的寡核苷酸组合物，该组合物包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸共享：
共同碱基序列，
共同骨架键联模式，以及
在一个或多个(例如，1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)手性核苷酸间键联(手性控制的核苷酸间键联)处相同的键联磷立体化学，
其中相对于共享共同碱基序列和骨架键联模式的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物，该组合物富集该多个寡核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物是手性控制的寡核苷酸组合物，该组合物包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸共享：
共同碱基序列，
共同骨架键联模式，以及
共同骨架手性中心模式，该模式包含至少一个Sp，
其中相对于共享共同碱基序列和骨架键联模式的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物，该组合物富集该多个寡核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物是手性控制的寡核苷酸组合物，该组合物包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸共享：
共同碱基序列，
共同骨架键联模式，以及
共同骨架手性中心模式，该模式包含至少一个Rp，
其中相对于共享共同碱基序列和骨架键联模式的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物，该组合物富集该多个寡核苷酸。
在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，该组合物包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸共享：
1)共同构成，以及
2)在一个或多个(例如，1-50、1-40、1-30、1-25、1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个)手性核苷酸间键联(手性控制的核苷酸间键联)处相同的键联磷立体化学，
其中相对于具有共同构成的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物，该组合物富集该多个寡核苷酸。
在一些实施例中，本披露提供了包含多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中该多个寡核苷酸共享：
1)共同碱基序列，和
2)独立地在一个或多个(例如，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个)手性核苷酸间键联处相同的键联磷立体化学(“手性控制的核苷酸间键联”)；
其中每个手性控制的核苷酸间键联的键联磷的立体化学纯度独立地是80％-100％(例如，85-100％、90-100％，约或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％)。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物是手性控制的寡核苷酸组合物，该组合物包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸共享：
共同碱基序列，
共同骨架键联模式，以及
在一个或多个(例如，1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)手性核苷酸间键联(手性控制的核苷酸间键联)处相同的键联磷立体化学，
其中每个手性控制的核苷酸间键联的键联磷的立体化学纯度独立地是80％-100％(例如，85-100％、90-100％，约或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％)。
在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，该组合物包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸共享：
1)共同构成，以及
2)在一个或多个(例如，1-50、1-40、1-30、1-25、1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个)手性核苷酸间键联(手性控制的核苷酸间键联)处相同的键联磷立体化学，
其中每个手性控制的核苷酸间键联的键联磷的立体化学纯度独立地是80％-100％(例如，85-100％、90-100％，约或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％)。
在一些实施例中，本披露提供了包含多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中该多个寡核苷酸共享：
1)共同碱基序列，和
2)独立地在一个或多个(例如，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个)手性核苷酸间键联处相同的键联磷立体化学(“手性控制的核苷酸间键联”)；
其中该共同碱基序列与核酸的一部分的碱基序列互补，该部分包含靶腺苷。
在一些实施例中，本披露提供了包含一种或多种多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中每种多个寡核苷酸独立地共享：
1)共同碱基序列，和
2)独立地在一个或多个(例如，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个)手性核苷酸间键联处相同的键联磷立体化学(“手性控制的核苷酸间键联”)；
其中每种多个寡核苷酸的共同碱基序列独立地与核酸的一部分的碱基序列互补，该部分包含靶腺苷。
在一些实施例中，本披露提供了组合物，该组合物包含多个寡核苷酸，这些寡核苷酸具有特定的寡核苷酸类型，其特征在于：
a)共同碱基序列；
b)共同骨架键联模式；
c)共同骨架手性中心模式；
d)共同骨架磷修饰模式；
该组合物是手性控制的，因为该组合物相对于具有相同的共同碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物，富集该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，或在该组合物中共享该共同碱基序列的所有寡核苷酸中的非随机水平是该多个寡核苷酸；以及
其中该共同碱基序列与核酸的一部分的碱基序列互补，该部分包含靶腺苷。
在一些实施例中，如本文所述，一部分可以为约或至少约10-40、15-40、20-40，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个核碱基长。在一些实施例中，一部分为核酸的约或至少约或不超过约1％-50％。在一些实施例中，一部分为核酸的全长。在一些实施例中，共同碱基序列与如本文所述的核酸的一部分的碱基序列互补。在一些实施例中，除了在与靶腺苷相反的核碱基处，它在整个长度上是完全互补的。在一些实施例中，它在整个长度上是完全互补的。在一些实施例中，靶腺苷与病症、障碍或疾病有关。在一些实施例中，靶腺苷是与病症、障碍或疾病相关联的G至A突变。在一些实施例中，通过所提供的寡核苷酸或组合物将靶腺苷编辑成I。在一些实施例中，如本文所述，编辑增加转录物或其产物(例如，mRNA、蛋白等)的表达、水平和/或活性。在一些实施例中，如本文所述，编辑降低转录物或其产物(例如，mRNA、蛋白等)的表达、水平和/或活性。
在一些实施例中，多个寡核苷酸共享相同的核碱基修饰和/或糖修饰。在一些实施例中，多个寡核苷酸共享相同的核苷酸间键联修饰(其中核苷酸间键联可以呈多种酸、碱和/或盐形式)。在一些实施例中，多个寡核苷酸共享相同的核碱基修饰、糖修饰和核苷酸间键联修饰(如果有的话)。在一些实施例中，多个寡核苷酸具有相同的形式，例如酸形式、碱形式或特定盐形式(例如，药学上可接受的盐形式，例如盐形式)。在一些实施例中，组合物中的寡核苷酸可以以一种或多种形式存在，例如酸形式、碱形式和/或一种或多种盐形式。在一些实施例中，在水溶液中(例如，当溶解于如PBS的缓冲液中时)，阴离子和阳离子可以解离。在一些实施例中，多个寡核苷酸具有相同的构成。在一些实施例中，多个寡核苷酸在结构上是相同的。在一些实施例中，本披露提供了包含多个寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物，其中这些寡核苷酸具有共同构成，并且在一个或多个(例如，1-60、1-50、1-40、1-30、1-25、1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60个或更多个)手性核苷酸间键联(手性控制的核苷酸间键联)处共享相同的键联磷立体化学，其中该组合物相对于具有共同构成的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物，富集该多个寡核苷酸。
在一些实施例中，至少一个手性核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，至少2个核苷酸间键联独立地是手性控制的。在一些实施例中，手性控制的核苷酸间键联的数目为至少3。在一些实施例中，其为至少4。在一些实施例中，其为至少5。在一些实施例中，其为至少6。在一些实施例中，其为至少7。在一些实施例中，其为至少8。在一些实施例中，其为至少9。在一些实施例中，其为至少10。在一些实施例中，其为至少11。在一些实施例中，其为至少12。在一些实施例中，其为至少13。在一些实施例中，其为至少14。在一些实施例中，其为至少15。在一些实施例中，其为至少20。在一些实施例中，其为至少25。在一些实施例中，其为至少30。
在一些实施例中，所有核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是手性控制的。在一些实施例中，所有手性核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是手性控制的。在一些实施例中，所有硫代磷酸酯核苷酸间键联的至少5％-100％(例如，约10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)是手性控制的。在一些实施例中，百分比为至少50％。在一些实施例中，百分比为至少60％。在一些实施例中，百分比为至少70％。在一些实施例中，百分比为至少80％。在一些实施例中，百分比为至少90％。在一些实施例中，百分比为至少90％。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，每个硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性控制的。
在一些实施例中，不超过1-10个，例如不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个手性核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，不超过1个手性核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，不超过2个手性核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，不超过3个手性核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，不超过4个手性核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，不超过5个手性核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，非手性控制的核苷酸间键联的数目为1。在一些实施例中，其为2。在一些实施例中，其为3。在一些实施例中，其为4。在一些实施例中，其为5。
在一些实施例中，相对于基本上外消旋的制备物的富集是：组合物中的所有寡核苷酸、或组合物中共享多个寡核苷酸的共同碱基序列的所有寡核苷酸、或组合物中共享多个寡核苷酸的共同构成的所有寡核苷酸的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％是该多个寡核苷酸。在一些实施例中，百分比为至少10％。在一些实施例中，百分比为至少20％。在一些实施例中，百分比为至少30％。在一些实施例中，百分比为至少40％。在一些实施例中，百分比为至少50％。在一些实施例中，其为至少60％。在一些实施例中，其为至少70％。在一些实施例中，其为至少80％。在一些实施例中，其为至少90％。在一些实施例中，其为至少95％。
对手性控制的寡核苷酸组合物中的多个寡核苷酸的水平进行控制。相比之下，在非手性控制的(或立体随机的、外消旋的)寡核苷酸组合物(或制备物)中，寡核苷酸的水平是随机的且不进行控制的。在一些实施例中，相对于基本上外消旋的制备物的富集是本文描述的水平。
在一些实施例中，百分比水平(例如，控制水平、预定水平、富集)为或至少为(DS)nc，其中DS(各个核苷酸间键联的非对映纯度)为90％-100％，并且nc为如本披露所述的手性控制的核苷酸间键联的数目(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)。在一些实施例中，每个手性核苷酸间键联是手性控制的，并且nc为手性核苷酸间键联的数目。在一些实施例中，DS为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或更大。在一些实施例中，DS为或至少为90％。在一些实施例中，DS为或至少为91％。在一些实施例中，DS为或至少为92％。在一些实施例中，DS为或至少为93％。在一些实施例中，DS为或至少为94％。在一些实施例中，DS为或至少为95％。在一些实施例中，DS为或至少为96％。在一些实施例中，DS为或至少为97％。在一些实施例中，DS为或至少为98％。在一些实施例中，DS为或至少为99％。在一些实施例中，水平(例如，控制水平、预定水平、富集)是组合物中共享相同构成的所有寡核苷酸的百分比，其中该百分比为或至少为(DS)nc。例如，当DS为99％并且nc为10时，该百分比为或至少为90％((99％)10≈0.90＝90％)。如本领域技术人员所理解的，在立体随机制备物中，该百分比通常为约1/2nc-当nc为10时，该百分比为约1/210≈0.001＝0.1％。在一些实施例中，富集(例如，相对于基本上外消旋的制备物)水平等是：组合物中的所有寡核苷酸、或组合物中共享多个寡核苷酸的共同碱基序列的所有寡核苷酸、或组合物中共享多个寡核苷酸的共同构成的所有寡核苷酸的至少约(DS)nc为该多个寡核苷酸。在一些实施例中，它是组合物中的所有寡核苷酸。在一些实施例中，它是组合物中共享多个寡核苷酸的共同碱基序列的所有寡核苷酸。在一些实施例中，它是组合物中共享多个寡核苷酸的共同构成的所有寡核苷酸。在一些实施例中，可以适当地认为寡核苷酸的多种形式(例如，多种盐形式)具有相同的构成。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物(也称为寡核苷酸组合物)是包含多个寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物，其中这些寡核苷酸共享：
共同碱基序列，
共同骨架键联模式，以及
在一个或多个手性核苷酸间键联(手性控制的核苷酸间键联)处的相同键联磷立体化学，
其中组合物中共享共同碱基序列和骨架键联模式的所有寡核苷酸中的该多个寡核苷酸的百分比为至少(DS)nc，其中DS为90％-100％，并且nc为手性控制的核苷酸间键联的数目。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物(也称为寡核苷酸组合物)是包含多个寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物，其中这些寡核苷酸共享：
共同碱基序列，
共同骨架键联模式，以及
共同骨架手性中心模式，该模式包含至少一个Sp，
其中组合物中共享共同碱基序列和骨架键联模式的所有寡核苷酸中的该多个寡核苷酸的百分比为至少(DS)nc，其中DS为90％-100％，并且nc为手性控制的核苷酸间键联的数目。
在一些实施例中，可以将组合物中的多个寡核苷酸的非对映纯度的水平确定为寡核苷酸中每个手性控制的核苷酸间键联的非对映纯度的乘积。在一些实施例中，连接寡核苷酸(或核酸)中的两个核苷的核苷酸间键联的非对映纯度由连接相同的两个核苷的二聚体的核苷酸间键联的非对映纯度表示，其中使用可比较的条件，在一些情况下，相同的合成循环条件制备二聚体(例如，对于寡核苷酸.......NxNy......中Nx与Ny之间的键联，二聚体是NxNy)。
在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物包含两种或更多种多个寡核苷酸，其中每种多个寡核苷酸各自独立地是如本文所述的多个寡核苷酸(例如，在多种手性控制的寡核苷酸组合物中)。例如，在一些实施例中，每种多个寡核苷酸独立地共享共同碱基序列，以及在一个或多个手性核苷酸间键联处的相同的键联磷立体化学，并且每种多个寡核苷酸与该多个寡核苷酸的立体随机制备物相比独立地富集，或者每种多个寡核苷酸独立地具有如本文所述的水平。在一些实施例中，至少两种多个寡核苷酸或每种多个寡核苷酸独立地靶向不同的腺苷。在一些实施例中，至少两种多个寡核苷酸或每种多个寡核苷酸独立地靶向相同或不同核酸的不同转录物。在一些实施例中，至少两种多个寡核苷酸或每种多个寡核苷酸独立地靶向不同基因的转录物。尤其是，在一些实施例中，此类组合物可用于同时和在同一系统中靶向两个或更多个靶。
在一些实施例中，所有手性核苷酸间键联都是手性控制的，并且组合物是完全手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，不是所有的手性核苷酸间键联都是手性控制的核苷酸间键联，并且组合物是部分地手性控制的寡核苷酸组合物。
寡核苷酸可以包含骨架手性中心的多种模式(手性键联磷的立体化学模式)或由其组成。在本披露中描述了骨架手性中心的某些有用的模式。在一些实施例中，多个寡核苷酸共享共同骨架手性中心模式，其是或包含本披露中描述的模式(例如，如在“键联磷立体化学及其模式”、表1中的手性控制的寡核苷酸的骨架手性中心模式等中)。
在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物是手性纯的(或立体纯的，立体化学纯的)寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸组合物包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸是相同的[包括这些寡核苷酸的每个手性元件，包括每个手性键联磷，是独立定义的(立体限定的)]，并且该组合物不含其他立体异构体。寡核苷酸立体异构体的手性纯(或立体纯，立体化学纯)的寡核苷酸组合物不含其他立体异构体(如本领域技术人员所理解的，一个或多个非预期的立体异构体可以作为杂质存在)。
手性控制的寡核苷酸组合物相对于立体随机的寡核苷酸组合物可以显示许多优点。尤其是，就寡核苷酸结构而言，手性控制的寡核苷酸组合物比相应的立体随机的寡核苷酸组合物更均匀。通过控制立体化学，可以制备和评估各个立体异构体的组合物，从而可以开发具有所需特性和/或活性的立体异构体的手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，与例如相应的立体随机的寡核苷酸组合物相比，手性控制的寡核苷酸组合物提供了更好的递送、稳定性、清除率、活性、选择性和/或毒性特征。在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物提供更好的功效、更少的副作用和/或更方便和有效的剂量方案。尤其是，如本文所述的骨架手性中心模式任选地与本文所述的其他结构特征(例如，核碱基、糖、核苷酸间键联等的修饰)组合可用于以高效率提供所需的定向腺苷编辑。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物包含一个或多个立体控制的(手性控制的；在一些实施例中，立体纯的)核苷酸间键联和一个或多个立体随机的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸组合物包含一个或多个立体控制的(手性控制的；在一些实施例中，立体纯的)核苷酸间键联和一个或多个立体随机的核苷酸间键联。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物包含一个或多个立体控制的(例如，手性控制的或立体纯的)核苷酸间键联和一个或多个立体随机的核苷酸间键联。此类寡核苷酸可以靶向多种核酸并且可以具有多种碱基序列，并且可以提供有效的腺苷编辑(例如，将A转化成I)。
在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，所提供的手性控制的寡核苷酸组合物包含具有相同构成的多个寡核苷酸，并且具有一个或多个核苷酸间键联。在一些实施例中，例如在手性控制的寡核苷酸组合物中的多个寡核苷酸是选自表1的多个寡核苷酸(和/或其多种盐形式中的一种或多种)，其中该寡核苷酸在手性控制的核苷酸间键联中包含至少一个Rp或Sp键联磷。在一些实施例中，例如在手性控制的寡核苷酸组合物中的多个寡核苷酸是选自表1的多个寡核苷酸(和/或其多种盐形式中的一种或多种)，其中寡核苷酸中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性控制的(每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是Rp或Sp)。在一些实施例中，寡核苷酸组合物，例如寡核苷酸组合物是单一寡核苷酸的基本上纯的制备物，因为在一些情况下，在某些纯化程序后，在该组合物中的不是该单一寡核苷酸的寡核苷酸是来自该单一寡核苷酸的制备过程中的杂质。在一些实施例中，单一寡核苷酸是表1的寡核苷酸，其中该寡核苷酸的每个手性核苷酸间键联是手性控制的(例如，在“立体化学/键联”中表示为S或R，但不是X)。
在一些实施例中，相对于相应的立体随机寡核苷酸组合物，手性控制的寡核苷酸组合物可以具有增加的活性和/或稳定性，增加的递送，和/或降低的引起不利作用诸如补体、TLR9激活等的能力。在一些实施例中，立体随机(非手性控制的)寡核苷酸组合物与手性控制的寡核苷酸组合物的不同之处在于其相应的多个寡核苷酸不含有任何手性控制的核苷酸间键联，但是立体随机寡核苷酸组合物与手性控制的寡核苷酸组合物在其他方面相同。
在一些实施例中，本披露涉及能够调节基因或其基因产物的水平、活性或表达的手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，与参考条件相比(例如，不存在本披露的寡核苷酸和/或组合物，和/或存在参考寡核苷酸和/或寡核苷酸组合物(例如，具有相同碱基序列但不同修饰的寡核苷酸、具有可比较结构(例如，碱基序列、修饰等)但缺乏立体化学控制的寡核苷酸的立体随机组合物等)，基因或其基因产物的水平、活性或表达增加(例如，通过将A转化成I以恢复正确的G至A突变、以增加蛋白翻译水平、以增加特定蛋白同种型的产生、以调节剪接从而增加特定剪接产物和由此编码的蛋白的水平等)，而在一些实施例中，基因或其基因产物的水平、活性或表达降低(例如，通过将A转化成I以产生终止密码子和/或改变密码子、以降低蛋白翻译水平、以减少特定蛋白同种型的产生、以调节剪接从而降低特定剪接产物和由此编码的蛋白的水平等)。
在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，该组合物能够增加基因或其基因产物的水平、活性或表达，并且包含共享共同碱基序列的多个寡核苷酸，该共同碱基序列是或包含本文披露的碱基序列(例如，在表1中，其中每个T可独立地被U代替并且反之亦然)的跨度(例如，至少10或15个连续碱基)。在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，该组合物能够增加基因或其基因产物的水平、活性或表达，并且包含共享共同碱基序列的多个寡核苷酸，该共同碱基序列是或包含本文披露的碱基序列(例如，在表1中，其中每个T可独立地被U代替并且反之亦然)。在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，该组合物能够增加基因或其基因产物的水平、活性或表达，并且包含共享共同碱基序列的多个寡核苷酸，该共同碱基序列是本文披露的碱基序列(例如，在表1中，其中每个T可独立地被U代替并且反之亦然)。
在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，该组合物能够降低基因或其基因产物的水平、活性或表达，并且包含共享共同碱基序列的多个寡核苷酸，该共同碱基序列是或包含本文披露的碱基序列(例如，在表1中，其中每个T可独立地被U代替并且反之亦然)的跨度(例如，至少10或15个连续碱基)。在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，该组合物能够降低基因或其基因产物的水平、活性或表达，并且包含共享共同碱基序列的多个寡核苷酸，该共同碱基序列是或包含本文披露的碱基序列(例如，在表1中，其中每个T可独立地被U代替并且反之亦然)。在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，该组合物能够降低基因或其基因产物的水平、活性或表达，并且包含共享共同碱基序列的多个寡核苷酸，该共同碱基序列是本文披露的碱基序列(例如，在表1中，其中每个T可独立地被U代替并且反之亦然)。
在一些实施例中，所提供的手性控制的寡核苷酸组合物是包含多个寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物是手性纯的(或“立体化学纯的”)寡核苷酸组合物。在一些实施例中，本披露提供了表1中的寡核苷酸的手性纯的寡核苷酸组合物，其中该寡核苷酸的每个手性核苷酸间键联独立地是手性控制的(Rp或Sp，例如，可以从“立体化学/键联”中的R或S而不是X来确定)。如本领域普通技术人员将理解的那样，化学选择性很少(如果有的话)达到完全性(绝对100％)。在一些实施例中，手性纯的寡核苷酸组合物包含多个寡核苷酸，其中该多个寡核苷酸在结构上相同并且都具有相同的结构(相同的立体异构形式；在寡核苷酸的情况下，通常与通常在寡核苷酸中存在的多个手性中心相同的非对映形式)，并且手性纯的寡核苷酸组合物不含有任何其他立体异构体(在寡核苷酸的情况下，通常如通常在寡核苷酸中存在的多个手性中心的非对映体；其程度例如可通过立体选择性制备实现)。如本领域技术人员所理解的，立体随机的(或“外消旋的”、“非手性控制的”)寡核苷酸组合物是许多立体异构体的随机混合物(例如，2n个非对映异构体，其中n是寡核苷酸的手性键联磷的数目，其中其他手性中心(例如，糖中的碳手性中心)是手性控制的，各自独立地以一种构型存在，并且仅手性键联磷中心不是手性控制的)。
显示手性控制的寡核苷酸组合物(例如，手性控制的寡核苷酸组合物在调节靶基因和/或其产物的水平、活性和/或表达方面)的特性和/或活性的某些数据显示在例如本披露的实例中。
在一些实施例中，本披露提供了包含寡核苷酸的寡核苷酸组合物，这些寡核苷酸包含至少一个手性键联磷。在一些实施例中，本披露提供了包含寡核苷酸的寡核苷酸组合物，这些寡核苷酸包含至少一个手性键联磷。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸组合物，其中寡核苷酸包含手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中键联磷具有Rp构型。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸组合物，其中寡核苷酸包含手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中键联磷具有Sp构型。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸组合物，其中寡核苷酸包含手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中键联磷具有Rp构型并且键联磷具有Sp构型。在一些实施例中，此类寡核苷酸组合物是手性控制的，并且Rp和/或Sp核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。
在一些实施例中，与参考寡核苷酸或寡核苷酸组合物相比，所提供的寡核苷酸或寡核苷酸组合物(例如，手性控制的寡核苷酸组合物)出人意料地有效。在一些实施例中，所需的生物效应(例如，如通过mRNA、蛋白等的水平增加(如果期望增加的话)和/或降低(如果期望降低的话)所测量的，这些mRNA、蛋白等的水平以增加为目标)可以增强超过1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或100倍(例如，如通过所需的mRNA、蛋白等的水平所测量的)。在一些实施例中，变化通过与参考条件相比所需的mRNA和/或蛋白水平的增加或不期望的mRNA和/或蛋白水平的降低来衡量。在一些实施例中，变化通过与参考条件相比所需的mRNA和/或蛋白水平的增加来衡量。在一些实施例中，变化通过与参考条件相比不期望的mRNA和/或水平的降低来衡量。在一些实施例中，参考条件分别是不存在所提供的寡核苷酸或寡核苷酸组合物，和/或存在参考寡核苷酸或寡核苷酸组合物。在一些实施例中，参考寡核苷酸共享相同的碱基序列，但具有不同的核碱基修饰、糖修饰、核苷酸间键联修饰和/或键联磷立体化学。在一些实施例中，参考寡核苷酸组合物是具有相同的碱基序列但不同的核碱基修饰、糖修饰、核苷酸间键联修饰和/或键联磷立体化学的寡核苷酸的组合物。在一些实施例中，用于手性控制的寡核苷酸组合物的参考组合物是具有相同碱基序列、核碱基修饰、糖修饰和/或核苷酸间键联修饰(但缺乏键联磷立体化学控制和/或具有低水平的键联磷立体化学控制)或具有相同构成的寡核苷酸的相应立体随机组合物。
在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，其中至少一个手性控制的核苷酸间键联的键联磷是Sp。在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，其中手性控制的核苷酸间键联的大部分键联磷是Sp。在一些实施例中，所有手性控制的核苷酸间键联(或所有手性核苷酸间键联或所有核苷酸间键联)中的约50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％、55％-95％、60％-95％、65％-95％，或约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多是Sp。在一些实施例中，所有手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联中的约50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％、55％-95％、60％-95％、65％-95％，或约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多是Sp。在一些实施例中，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个硫代磷酸酯核苷酸间键联是非手性控制的或是手性控制的并且是Rp。在一些实施例中，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性控制的并且是Rp。在一些实施例中，其不超过1。在一些实施例中，其不超过2。在一些实施例中，其不超过3。在一些实施例中，其不超过4。在一些实施例中，其不超过5。在一些实施例中，每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性控制的。在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，其中大部分手性核苷酸间键联是手性控制的并且在其键联磷处是Sp。在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，其中每个手性核苷酸间键联是手性控制的并且每个手性键联磷是Sp。在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，例如手性控制的寡核苷酸组合物，其中至少一个手性控制的核苷酸间键联具有Rp键联磷。在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，其中至少一个手性控制的核苷酸间键联包含Rp键联磷并且至少一个手性控制的核苷酸间键联包含Sp键联磷。
在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，其中至少两个手性控制的核苷酸间键联具有相对于彼此的不同键联磷立体化学和/或不同的P-修饰，其中P-修饰是在键联磷处的修饰。在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，其中至少两个手性控制的核苷酸间键联具有相对于彼此不同的立体化学，并且寡核苷酸的骨架手性中心模式的特征在于交替立体化学的重复模式。
在某些实施例中，本披露提供了包含多个寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物，其中在每个寡核苷酸中，至少两个单独的核苷酸间键联具有相对于彼此的不同P-修饰。在某些实施例中，本披露提供了包含多个寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物，其中在每个寡核苷酸中，至少两个单独的核苷酸间键联具有相对于彼此的不同P-修饰，并且每个寡核苷酸包含天然磷酸酯键联。在某些实施例中，本披露提供了包含多个寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物，其中在每个寡核苷酸中，至少两个单独的核苷酸间键联具有相对于彼此的不同P-修饰，并且每个寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键联。在某些实施例中，本披露提供了包含多个寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物，其中在每个寡核苷酸中，至少两个单独的核苷酸间键联具有相对于彼此的不同P-修饰，并且每个寡核苷酸包含天然磷酸酯键联和硫代磷酸酯核苷酸间键联。在某些实施例中，本披露提供了包含多个寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物，其中在每个寡核苷酸中，至少两个单独的核苷酸间键联具有相对于彼此的不同P-修饰，并且每个寡核苷酸包含硫代磷酸三酯核苷酸间键联。在某些实施例中，本披露提供了包含多个寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物，其中在每个寡核苷酸中，至少两个单独的核苷酸间键联具有相对于彼此的不同P-修饰，并且每个寡核苷酸包含天然磷酸酯键联和硫代磷酸三酯核苷酸间键联。在某些实施例中，本披露提供了包含多个寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物，其中在每个寡核苷酸中，至少两个单独的核苷酸间键联具有相对于彼此的不同P-修饰，并且每个寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键联和硫代磷酸三酯核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，该组合物包含多个寡核苷酸，这些寡核苷酸共享共同碱基序列，该共同碱基序列是本文披露的寡核苷酸的碱基序列，其中至少一个核苷酸间键联是手性控制的。
键联磷立体化学和骨架手性中心模式
尤其是，本披露提供了多种寡核苷酸组合物。在一些实施例中，本披露提供了本文所述的寡核苷酸的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，寡核苷酸组合物包含本披露中所述的多个寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸组合物是手性控制的。在一些实施例中，寡核苷酸组合物不是手性控制的(立体随机的)。
与天然磷酸酯键联形成对比，手性修饰的核苷酸间键联(例如硫代磷酸酯核苷酸间键联)的键联磷是手性的。尤其是，本披露提供了包括控制手性核苷酸间键联中的手性键联磷的立体化学的技术(例如，寡核苷酸、组合物、方法等)。在一些实施例中，如本文所展示，立体化学的控制可以提供改善的特性和/或活性，包括所需的稳定性、降低的毒性、改善的对靶核酸的修饰、改善的对转录物和/或其编码产物(例如，mRNA、蛋白等)的水平的调节等。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸和/或其区域的骨架手性中心的有用模式，该模式包括从5'至3'的手性键联磷中的每个手性键联磷(Rp或Sp)的立体化学、每个非手性键联磷(Op，如果有的话)的指示等的组合。在各种表中(例如，作为实例的立体化学/键联)提供了某些模式；此类模式可以应用于具有多种碱基序列和修饰(例如，本文所述的那些，包括其模式)的多种寡核苷酸。
本文广泛描述了骨架手性中心的有用模式，例如用于寡核苷酸、第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域、第三子结构域等的那些。例如，在一些实施例中，寡核苷酸或其一个或多个部分(例如，第一结构域、第二结构域、第一子结构域、第二子结构域和/或第三子结构域，和/或其中的5'-末端部分和/或3'-末端部分)的高水平的Sp核苷酸间键联提供高稳定性和/或活性。在一些实施例中，第一结构域包含高水平的Sp核苷酸间键联。在一些实施例中，第二结构域包含高水平的Sp核苷酸间键联(以相对于天然磷酸酯键联和/或Rp核苷酸间键联的数量和/或百分比计)。在一些实施例中，第一子结构域包含高水平的Sp核苷酸间键联。在一些实施例中，第二子结构域包含高水平的Sp核苷酸间键联。在一些实施例中，第三子结构域包含高水平的Sp核苷酸间键联。在一些实施例中，如本文所展示，可以在多种位置和/或部分使用Rp核苷酸间键联。例如，在一些实施例中，第一结构域包含一个或多个或高水平的Rp核苷酸间键联，并且在一些实施例中，第二子结构域包含一个或多个或高水平的Rp核苷酸间键联。
在一些实施例中，在手性控制的核苷酸间键联中的许多键联磷是Sp。在一些实施例中，至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的手性控制的核苷酸间键联具有Sp键联磷。在一些实施例中，所有手性核苷酸间键联中的至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％是具有Sp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，所有核苷酸间键联中的至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％是具有Sp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，该百分比为至少20％。在一些实施例中，百分比为至少30％。在一些实施例中，百分比为至少40％。在一些实施例中，百分比为至少50％。在一些实施例中，百分比为至少60％。在一些实施例中，百分比为至少65％。在一些实施例中，百分比为至少70％。在一些实施例中，百分比为至少75％。在一些实施例中，百分比为至少80％。在一些实施例中，百分比为至少90％。在一些实施例中，百分比为至少95％。在一些实施例中，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少5个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少6个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少7个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少8个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少9个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少10个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少11个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少12个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少13个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少14个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少15个核苷酸间键联是具有Sp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸间键联是具有Rp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸间键联是具有Rp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸中的一个且不超过一个核苷酸间键联是具有Rp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸中的2个且不超过2个核苷酸间键联是具有Rp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸中的3个且不超过3个核苷酸间键联是具有Rp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸中的4个且不超过4个核苷酸间键联是具有Rp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸中的5个且不超过5个核苷酸间键联是具有Rp键联磷的手性控制的核苷酸间键联。
在一些实施例中，除了一个或少数核苷酸间键联(例如，寡核苷酸中所有手性控制的核苷酸间键联中、或所有手性核苷酸间键联中、或所有核苷酸间键联中1、2、3、4或5个，和/或低于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)呈Rp构型外，寡核苷酸或其一部分中所有、基本上所有或大部分核苷酸间键联呈Sp构型(例如，寡核苷酸中所有手性控制的核苷酸间键联、或所有手性核苷酸间键联、或所有核苷酸间键联的约50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％、55％-95％、60％-95％、65％-95％，或约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多)。在一些实施例中，第一结构域中的所有、基本上所有或大部分核苷酸间键联呈Sp构型(例如，第一结构域中所有手性控制的核苷酸间键联、或所有手性核苷酸间键联、或所有核苷酸间键联的约50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％、55％-95％、60％-95％、65％-95％，或约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多)。在一些实施例中，第一结构域中的每个核苷酸间键联是呈Sp构型的硫代磷酸酯。在一些实施例中，结构域中的每个核苷酸间键联是呈Sp构型的硫代磷酸酯。在一些实施例中，第二结构域中的所有、基本上所有或大部分核苷酸间键联呈Sp构型(例如，第二结构域中所有手性控制的核苷酸间键联、或所有手性核苷酸间键联、或所有核苷酸间键联的约50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％、55％-95％、60％-95％、65％-95％，或约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多)。在一些实施例中，第二结构域中的每个核苷酸间键联是呈Sp构型的硫代磷酸酯。在一些实施例中，除了一个呈Rp构型的硫代磷酸酯外，第二结构域中的每个核苷酸间键联是呈Sp构型的硫代磷酸酯。在一些实施例中，第二结构域的子结构域中的所有、基本上所有或大部分核苷酸间键联呈Sp构型(例如，第二结构域的第一子结构域中所有手性控制的核苷酸间键联、或所有手性核苷酸间键联、或所有核苷酸间键联的约50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％、55％-95％、60％-95％、65％-95％，或约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多)。在一些实施例中，第二结构域的第一子结构域中的每个核苷酸间键联是呈Sp构型的硫代磷酸酯。在一些实施例中，除了一个呈Rp构型的硫代磷酸酯外，第二结构域的第一子结构域中的每个核苷酸间键联是呈Sp构型的硫代磷酸酯。在一些实施例中，除了一个或少量呈Rp构型的核苷酸间键联外，第二结构域的第二子结构域中的所有、基本上所有或大部分核苷酸间键联呈Sp构型(例如，第二结构域的第二子结构域中所有手性控制的核苷酸间键联、或所有手性核苷酸间键联、或所有核苷酸间键联的约50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％、55％-95％、60％-95％、65％-95％，或约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多)。在一些实施例中，除了一个呈Rp构型的硫代磷酸酯外，第二结构域的第二子结构域中的每个核苷酸间键联是呈Sp构型的硫代磷酸酯。在一些实施例中，除了一个呈Rp构型的硫代磷酸酯外，第二结构域的第二子结构域中的每个核苷酸间键联是呈Sp构型的硫代磷酸酯。在一些实施例中，第二结构域的第三子结构域中的所有、基本上所有或大部分核苷酸间键联呈Sp构型(例如，第二结构域的第三子结构域中所有手性控制的核苷酸间键联、或所有手性核苷酸间键联、或所有核苷酸间键联的约50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％、55％-95％、60％-95％、65％-95％，或约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多)。在一些实施例中，除了一个呈Rp构型的硫代磷酸酯外，第二结构域的第三子结构域中的每个核苷酸间键联是呈Sp构型的硫代磷酸酯。在一些实施例中，除了一个呈Rp构型的硫代磷酸酯外，第二结构域的第三子结构域中的每个核苷酸间键联是呈Sp构型的硫代磷酸酯。
在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个且不超过一个Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含五个或更多个Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸中所有手性控制的核苷酸间键联的约5％-50％是Rp。在一些实施例中，寡核苷酸中所有手性控制的核苷酸间键联的约5％-40％是Rp。在一些实施例中，某些部分(例如，结构域、子结构域等)可以包含相对更多(数量和/或百分比)的Rp核苷酸间键联，例如第二子结构域。
在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，其中该组合物包含非随机或控制水平的多个寡核苷酸，其中该多个寡核苷酸共享共同碱基序列，并且独立地在至少1-60、1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个或更多个手性核苷酸间键联处共享键联磷的相同构型。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含2-30个手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸组合物包含5-30个手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸组合物包含10-30个手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个手性控制的核苷酸间键联。
在一些实施例中，所有核苷酸间键联中的约1％-100％是手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，所有手性核苷酸间键联中的约1-100％是手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，百分比为约5％-100％。在一些实施例中，百分比为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、965、96％、98％或99％。在一些实施例中，百分比为约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、965、96％、98％或99％。
在一些实施例中，呈Sp构型的核苷酸间键联(具有Sp键联磷)是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，非手性核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，呈Rp构型的核苷酸间键联(具有Rp键联磷)是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，呈Sp构型的每个核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个非手性核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，呈Rp构型的每个核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，呈Sp构型的每个核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联，每个非手性核苷酸间键联是天然磷酸酯键联，并且呈Rp构型的每个核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。
在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物中的所提供的寡核苷酸各自包含不同类型的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少一个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联并且独立地是手性控制的。
在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物中的寡核苷酸各自包含至少两个相对于彼此具有不同的立体化学和/或不同的P-修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，至少两个核苷酸间键联具有彼此不同的立体化学。在一些实施例中，寡核苷酸各自包含骨架手性中心模式，该模式包含交替键联磷立体化学。
在一些实施例中，硫代磷酸三酯键联包含手性助剂，其例如用于控制反应(例如，在寡核苷酸合成循环中的偶联反应)的立体选择性。在一些实施例中，硫代磷酸三酯键联不含手性助剂。在一些实施例中，有意地维持硫代磷酸三酯键联直至施用寡核苷酸组合物给受试者，和/或在施用寡核苷酸组合物给受试者期间有意地维持硫代磷酸三酯键联。
在一些实施例中，寡核苷酸连接到固体支持物。在一些实施例中，固体支持物是寡核苷酸合成的支持物。在一些实施例中，固体支持物包括玻璃。在一些实施例中，固体支持物是CPG(可控孔度玻璃)。在一些实施例中，固体支持物是聚合物。在一些实施例中，固体支持物是聚苯乙烯。在一些实施例中，固体支持物是高度交联的聚苯乙烯(HCP)。在一些实施例中，固体支持物是可控孔度玻璃(CPG)和高度交联的聚苯乙烯(HCP)的杂合支持物。在一些实施例中，固体支持物是金属泡沫。在一些实施例中，固体支持物是树脂。在一些实施例中，从固体支持物上切割寡核苷酸。
在一些实施例中，许多寡核苷酸及其组合物(其中寡核苷酸中除了手性键联磷中心的所有其他手性中心已经被立体限定(例如，糖中的碳手性中心，其在例如用于寡核苷酸合成的亚磷酰胺中限定))的纯度，特别是立体化学纯度，和特别是非对映纯度可以通过在偶联步骤中当形成手性核苷酸间键联时手性键联磷处的立体选择性(如本领域技术人员所理解的，在寡核苷酸合成的许多情况(其中寡核苷酸包含多于一个手性中心)下的非对映选择性)来控制。在一些实施例中，偶联步骤在键联磷处具有60％的立体选择性(当存在其他手性中心时为非对映选择性)。在这样的偶联步骤之后，可以认为形成的新的核苷酸间键联具有60％的立体化学纯度(对于寡核苷酸，鉴于其他手性中心的存在，通常是非对映纯度)。在一些实施例中，每个偶联步骤独立地具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的立体选择性。在一些实施例中，手性控制的核苷酸间键联通常以至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99.5％或几乎100％(在一些实施例中，至少85％；在一些实施例中，至少87％；在一些实施例中，至少90％；在一些实施例中，至少95％；在一些实施例中，至少96％；在一些实施例中，至少97％；在一些实施例中，至少98％；在一些实施例中，至少99％)的立体选择性形成。在一些实施例中，立体选择性为至少85％。在一些实施例中，立体选择性为至少87％。在一些实施例中，立体选择性为至少90％。在一些实施例中，每个偶联步骤独立地具有几乎100％的立体选择性。
在一些实施例中，组合物中手性中心(例如，手性键联磷)的立体纯度为至少60％、70％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％。在一些实施例中，立体纯度为至少80％。在一些实施例中，立体纯度是至少85％。在一些实施例中，立体纯度是至少87％。在一些实施例中，立体纯度是至少90％。在一些实施例中，立体纯度为几乎100％。在一些实施例中，每个手性控制的核苷酸间键联在其手性键联磷处独立地具有至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99.5％或几乎100％(在一些实施例中，至少85％；在一些实施例中，至少87％；在一些实施例中，至少90％；在一些实施例中，至少95％；在一些实施例中，至少96％；在一些实施例中，至少97％；在一些实施例中，至少98％；在一些实施例中，至少99％)的立体化学纯度(对于具有多个手性中心的寡核苷酸，通常为非对映纯度)。在一些实施例中，手性控制的核苷酸间键联具有至少90％的立体化学纯度。在一些实施例中，大部分手性控制的核苷酸间键联独立地具有至少90％的立体化学纯度。在一些实施例中，每个手性控制的核苷酸间键联独立地具有至少90％的立体化学纯度。在一些实施例中，每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性控制的。在一些实施例中，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或所有手性控制的核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或所有手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联是Sp。在一些实施例中，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或所有硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。
立体选择性和立体纯度可以通过多种技术来评估。在一些实施例中，立体选择性和/或立体纯度几乎为100％，因为当通过分析方法(例如，NMR、HPLC等)分析组合物时，几乎所有可检测的立体异构体都具有预期的立体化学。
在一些实施例中，单体(如本领域技术人员所理解的，在许多实施例中，用于寡核苷酸合成的亚磷酰胺)的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个偶联独立地具有小于约60％、70％、80％、85％或90％的立体选择性[对于寡核苷酸合成，就一个或多个形成的键联磷手性中心而言，通常是非对映选择性]。
在一些实施例中，在立体随机(或外消旋)制备物(或立体随机/非手性控制的寡核苷酸组合物)中，寡核苷酸的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个手性核苷酸间键联独立地具有相对于核苷酸间键联的手性键联磷小于约60％、65％、70％、75％、80％或85％的立体化学纯度(对于包含多个手性中心的寡核苷酸，通常为非对映纯度)。在一些实施例中，立体化学纯度(立体纯度)小于约60％。在一些实施例中，立体化学纯度(立体纯度)小于约65％。在一些实施例中，立体化学纯度(立体纯度)小于约70％。在一些实施例中，立体化学纯度(立体纯度)小于约75％。在一些实施例中，立体化学纯度(立体纯度)小于约80％。
在一些实施例中，本披露的化合物(例如，寡核苷酸、手性助剂等)包含多个手性元素(例如，多个碳和/或磷(例如，手性核苷酸间键联的键联磷)手性中心)。在一些实施例中，所提供的化合物(例如，寡核苷酸)的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个手性元件各自独立地具有如本文所述的非对映纯度。在一些实施例中，非对映纯度为至少85％。在一些实施例中，非对映纯度为至少86％。在一些实施例中，非对映纯度为至少87％。在一些实施例中，非对映纯度为至少88％。在一些实施例中，非对映纯度为至少89％。在一些实施例中，非对映纯度为至少90％。在一些实施例中，非对映纯度为至少91％。在一些实施例中，非对映纯度为至少92％。在一些实施例中，非对映纯度为至少93％。在一些实施例中，非对映纯度为至少94％。在一些实施例中，非对映纯度为至少95％。在一些实施例中，非对映纯度为至少96％。在一些实施例中，非对映纯度为至少97％。在一些实施例中，非对映纯度为至少98％。在一些实施例中，非对映纯度为至少99％。
如本领域普通技术人员所理解的，在一些实施例中，可以通过在相同的或可比较的条件下二聚体形成的非对映选择性和所制备的二聚体的非对映纯度来评估偶联的非对映选择性或手性键联磷中心的非对映纯度，其中二聚体具有相同的5'-和3'-核苷以及核苷酸间键联。
多种技术可用于鉴定或证实手性元素的立体化学(例如，手性键联磷的构型)和/或骨架手性中心模式，和/或用于评估立体选择性(例如，寡核苷酸合成中的偶联步骤的非对映选择性)和/或立体化学纯度(例如，核苷酸间键联、化合物(例如，寡核苷酸)等的非对映纯度)。示例技术包括NMR[例如1D(一维)和/或2D(二维)1H-31PHETCOR(异核相关光谱)]、HPLC、RP-HPLC、质谱、LC-MS以及立体特异性核酸酶对核苷酸间键联的切割等，它们可以单独或组合使用。有用的核酸酶的实例包括苯甲酸酶、微球菌核酸酶和svPDE(蛇毒磷酸二酯酶)，其对于具有Rp键联磷(例如，Rp硫代磷酸酯键联)的某些核苷酸间键联具有特异性；以及核酸酶P1、绿豆核酸酶和核酸酶S1，其对于具有Sp键联磷的核苷酸间键联(例如，Sp硫代磷酸酯键联)具有特异性。不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，在至少一些情况下，特定核酸酶对寡核苷酸的切割可能受到结构元件例如化学修饰(例如，糖的2'修饰)、碱基序列或立体化学环境的影响。例如，观察到在某些情况下，对具有Rp键联磷的核苷酸间键联有特异性的苯甲酸酶和微球菌核酸酶无法切割侧接有Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联的分离的Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。
在一些实施例中，共享共同碱基序列、共同骨架键联模式和共同骨架手性中心模式的寡核苷酸共享共同骨架磷修饰模式和共同碱基修饰模式。在一些实施例中，共享共同碱基序列、共同骨架键联模式和共同骨架手性中心模式的寡核苷酸组合物共享共同骨架磷修饰模式和共同核苷修饰模式。在一些实施例中，共享共同碱基序列、共同骨架键联模式和共同骨架手性中心模式的寡核苷酸具有相同的结构。
在一些实施例中，本披露提供了包含能够指导靶核酸中的靶腺苷脱氨的多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中该多个寡核苷酸具有特定的寡核苷酸类型，该组合物是手性控制的，因为相对于具有相同碱基序列的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物而言，该组合物富集该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸组合物中的多个寡核苷酸或特定寡核苷酸类型的寡核苷酸是寡核苷酸。在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，该组合物包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸共享：
共同碱基序列；
共同骨架键联模式；以及
在一个或多个手性核苷酸间键联(手性控制的核苷酸间键联)处的相同键联磷立体化学，
其中相对于共享共同碱基序列和骨架键联模式的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物，该组合物富集该多个寡核苷酸。
在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，该组合物包含多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸共享：
共同碱基序列；
共同骨架键联模式；以及
共同骨架手性中心模式，该组合物是单一寡核苷酸的基本上纯的制备物，因为该组合物中至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的寡核苷酸具有共同碱基序列、共同骨架键联模式以及共同骨架手性中心模式。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物类型进一步由以下方面定义：4)另外的化学部分，如果有的话。
在一些实施例中，该百分比为至少约10％。在一些实施例中，该百分比为至少约20％。在一些实施例中，该百分比为至少约30％。在一些实施例中，该百分比为至少约40％。在一些实施例中，该百分比为至少约50％。在一些实施例中，该百分比为至少约60％。在一些实施例中，该百分比为至少约70％。在一些实施例中，该百分比为至少约75％。在一些实施例中，该百分比为至少约80％。在一些实施例中，该百分比为至少约85％。在一些实施例中，该百分比为至少约90％。在一些实施例中，该百分比为至少约91％。在一些实施例中，该百分比为至少约92％。在一些实施例中，该百分比为至少约93％。在一些实施例中，该百分比为至少约94％。在一些实施例中，该百分比为至少约95％。在一些实施例中，该百分比为至少约96％。在一些实施例中，该百分比为至少约97％。在一些实施例中，该百分比为至少约98％。在一些实施例中，该百分比为至少约99％。在一些实施例中，百分比为或大于(DS)nc，其中DS和nc各自独立地如本披露中所述。
在一些实施例中，多个寡核苷酸共享相同的构成。在一些实施例中，多个寡核苷酸是相同的(相同的立体异构体)。在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物是立体纯寡核苷酸组合物，其中该多个寡核苷酸是相同的(相同的立体异构体)，并且该组合物不含任何其他立体异构体。本领域技术人员将理解，一种或多种其他立体异构体可能作为杂质存在，因为工艺、选择性、纯化等可能无法实现完全性。
在一些实施例中，所提供的组合物的特征在于当它与靶核酸接触[例如，转录物(例如，前体mRNA，成熟mRNA，与组合物的寡核苷酸杂交的其他类型的RNA等)]时，靶核酸和/或由此编码的产物的水平和/与在参考条件下观察到的相比降低。在一些实施例中，核酸和/或其产物的水平增加，该核酸是靶核酸的A至I编辑的产物。在一些实施例中，参考条件选自由以下组成的组：不存在组合物、存在参考组合物、及其组合。在一些实施例中，参考条件是不存在组合物。在一些实施例中，参考条件是存在参考组合物。在一些实施例中，参考组合物是其寡核苷酸不与靶核酸杂交的组合物。在一些实施例中，参考组合物是其寡核苷酸不含与靶核酸充分互补的序列的组合物。在一些实施例中，参考组合物是其寡核苷酸共享相同的碱基序列但不共享相同的核碱基、糖和/或核苷酸间键联修饰的组合物。在一些实施例中，所提供的组合物是手性控制的寡核苷酸组合物，而参考组合物是非手性控制的寡核苷酸组合物，其在其他方面相同但不是手性控制的(例如，与手性控制的寡核苷酸组合物中的多个寡核苷酸具有相同构成的寡核苷酸的外消旋制备物)。
在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，该组合物包含能够指导靶核酸中的靶腺苷脱氨的多个寡核苷酸，其中这些寡核苷酸共享：
共同碱基序列，
共同骨架键联模式，以及
在一个或多个手性核苷酸间键联(手性控制的核苷酸间键联)处的相同键联磷立体化学，
其中相对于共享共同碱基序列和骨架键联模式的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物，该组合物富集该多个寡核苷酸，
该寡核苷酸组合物的特征在于：当它与靶序列接触时，靶核酸中的靶腺苷脱氨相对于在参考条件下观察到的脱氨有所改善，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物及其组合。
如本领域技术人员所理解的，可以使用多种技术来评估靶腺苷的脱氨。在一些实施例中，技术是测序，其中脱氨的腺苷被检测为G或I。在一些实施例中，通过产物(例如，RNA、蛋白(例如，由其中靶A被I代替但在其他方面与靶核酸相同的序列编码)等)的水平来评估脱氨。
如本文所展示，寡核苷酸结构单元(例如，糖修饰、骨架键联、骨架手性中心、骨架磷修饰、其模式等)及其组合可以提供令人惊讶地改善的特性和/或生物活性。
在一些实施例中，寡核苷酸组合物是单一寡核苷酸立体异构体的基本上纯的制备物，因为组合物中具有相同构成但不具有立体异构体的寡核苷酸是来自所述寡核苷酸立体异构体的制备过程的杂质，在一些情况下，在某些纯化程序之后。
在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸和寡核苷酸组合物，并且在一些实施例中，提供了立体纯的寡核苷酸和寡核苷酸组合物。例如，在一些实施例中，所提供的组合物包含非随机水平或控制水平的一种或多种单独的寡核苷酸类型。在一些实施例中，同一寡核苷酸类型的寡核苷酸是相同的。
核碱基
根据本披露，多种核碱基可用于所提供的寡核苷酸中。在一些实施例中，核碱基是天然核碱基，最常见的天然核碱基是A、T、C、G和U。在一些实施例中，核碱基是经修饰的核碱基，因为它不是A、T、C、G或U。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的A、T、C、G或U，或A、T、C、G或U的经取代的互变异构体。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的A、T、C、G或U，例如5mC、5-羟甲基C等。在一些实施例中，核碱基是烷基取代的A、T、C、G或U。在一些实施例中，核碱基是A。在一些实施例中，核碱基是T。在一些实施例中，核碱基是C。在一些实施例中，核碱基是G。在一些实施例中，核碱基是U。在一些实施例中，核碱基是5mC。在一些实施例中，核碱基是取代的A、T、C、G或U。在一些实施例中，核碱基是A、T、C、G或U的经取代的互变异构体。在一些实施例中，取代保护核碱基中的某些官能团以最小化寡核苷酸合成过程中不希望的反应。在寡核苷酸合成中用于核碱基保护的合适技术是本领域众所周知的，并且可以根据本披露使用。在一些实施例中，经修饰的核碱基改善了寡核苷酸的特性和/或活性。例如，在许多情况下，可以使用5mC代替C来调节某些不希望的生物学效应，例如免疫应答。在一些实施例中，当确定序列同一性时，将具有相同氢键模式的经取代的核碱基与未取代的核碱基相同处理，例如5mC可以与C相同处理[例如，具有5mC代替C(例如，AT5mCG)的寡核苷酸被认为与在一个或多个相应位置(例如，ATCG)具有C的寡核苷酸具有相同的碱基序列]。在一些实施例中，核碱基是或包含具有至少一个氮原子的任选地经取代的环。在一些实施例中，核碱基包含如本文所述的环BA，其中环BA的至少一个单环包含氮环原子。
在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个A、T、C、G或U。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个任选地经取代的A、T、C、G或U。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-甲酰基胞嘧啶或5-羧基胞嘧啶。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个5-甲基胞苷。在一些实施例中，寡核苷酸中的每个核碱基选自由任选地经取代的A、T、C、G和U，以及任选地经取代的A、T、C、G和U的互变异构体组成的组。在一些实施例中，寡核苷酸中的每个核碱基是任选地被保护的A、T、C、G和U。在一些实施例中，寡核苷酸中的每个核碱基是任选地经取代的A、T、C、G或U。在一些实施例中，寡核苷酸中的每个核碱基选自由A、T、C、G、U和5mC组成的组。
如本文所展示，在某些位置(例如，在与靶腺苷相反的核苷和/或其相邻核苷中)利用某些核碱基可以提供具有改善的特性和/或活性(例如，腺苷编辑成I)的寡核苷酸。在一些实施例中，有用的核碱基是或包含如本文所述的环BA。在一些实施例中，核苷中的核碱基是或包含具有以下结构的环BA：BA-I、BA-I-a、BA-I-b、BA-II、BA-II-a、BA-II-b、BA-III、BA-III-a、BA-III-b、BA-IV、BA-IV-a、BA-IV-b、BA-V、BA-V-a、BA-V-b或BA-VI，或环BA的互变异构体，其中核碱基是任选地经取代的或被保护的。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的或被保护的以下结构，或任选地经取代的或被保护的以下结构的互变异构体：
Figure BDA0003580200980003051
Figure BDA0003580200980003061
在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个此类核碱基的寡核苷酸。在一些实施例中，本披露提供了包含此类核碱基的亚磷酰胺。在一些实施例中，亚磷酰胺是CED亚磷酰胺。在一些实施例中，亚磷酰胺包含如本文所述的手性助剂部分(例如，其中P与O和N形成键)。在一些实施例中，RNS包含这样的核碱基。在一些实施例中，对核碱基进行保护以用于寡核苷酸合成。
在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的2AP(2-氨基嘌呤，
Figure BDA0003580200980003062
)或DAP(2,6-二氨基嘌呤，
Figure BDA0003580200980003063
)。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的2AP。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的DAP。在一些实施例中，核碱基是2AP。在一些实施例中，核碱基是DAP。
如本领域技术人员所理解的，多种核碱基在本领域中是已知的并且可以根据本披露使用，例如，在以下文献中描述的那些：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US9982257、US 20170037399、US 20180216108、US 20180216107、US 9598458、WO 2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/022473、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019032612、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的糖、碱基和核苷酸间键联修饰独立地通过援引并入本文。在一些实施例中，核碱基被保护并且可用于寡核苷酸合成。
在一些实施例中，核碱基是天然核碱基或衍生自天然核碱基的经修饰的核碱基。实例包括任选地其各自的氨基被酰基保护基保护的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤，2-氟尿嘧啶，2-氟胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，2,6-二氨基嘌呤，氮杂胞嘧啶，嘧啶类似物(诸如假异胞嘧啶和假尿嘧啶)，以及其他经修饰的核碱基(诸如8-取代的嘌呤、黄嘌呤、或次黄嘌呤，后两个是天然降解产物)。经修饰的核碱基的某些实例披露于Chiu和Rana,RNA,2003,9,1034-1048；Limbach等人Nucleic Acids Research[核酸研究],1994,22,2183-2196；以及Revankar和Rao,Comprehensive Natural Products Chemistry[天然产物综合化学],第7卷,313中。在一些实施例中，经修饰的核碱基是取代的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤。在一些实施例中，经修饰的核碱基是尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤的例如就氢键合和/或碱基配对而言的功能代替物。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或鸟嘌呤。在一些实施例中，核碱基是尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或鸟嘌呤。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含一个或多个5-甲基胞嘧啶。在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，该寡核苷酸的碱基序列在本文中例如在表1中披露，其中每个T可以独立地被U代替并且反之亦然，并且每个胞嘧啶任选地并且独立地被5-甲基胞嘧啶代替，或反之亦然。如本领域技术人员所理解的，在一些实施例中，就寡核苷酸的碱基序列而言，可以将5mC视为C-这种寡核苷酸在C位置包含核碱基修饰(例如，参见表1中的各种寡核苷酸)。在寡核苷酸的描述中，通常除非另有说明，否则核碱基、糖和核苷酸间键联是未修饰的。
在一些实施例中，经修饰的碱基是任选地经取代的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶或其互变异构体。在一些实施例中，经修饰的核碱基是通过以下方式而被一个或多个修饰所修饰的经修饰的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶：
核碱基被一个或多个独立地选自以下的任选地经取代的基团修饰：酰基、卤素、氨基、叠氮基、烷基、烯基、炔基、芳基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂环基、杂芳基、羧基、羟基、生物素、亲和素、链霉亲和素、经取代的甲硅烷基及其组合；
核碱基的一个或多个原子独立地被选自碳、氮和硫的不同原子代替；
核碱基中的一个或多个双键独立地被氢化；或
一个或多个芳基或杂芳基环独立地插入核碱基中。
在一些实施例中，碱基是任选地经取代的A、T、C、G或U，其中一个或多个-NH2独立地且任选地被-C(-L-R1)3代替，一个或多个-NH-独立地且任选地被-C(-L-R1)2-代替，一个或多个＝N-独立地且任选地被-C(-L-R1)-代替，一个或多个＝CH-独立地且任选地被＝N-代替，并且一个或多个＝O独立地且任选地被＝S、＝N(-L-R1)或＝C(-L-R1)2代替，其中两个或更多个-L-R1任选地与居于它们之间的原子合在一起形成具有0-10个杂原子环原子的3-30元双环或多环。在一些实施例中，经修饰的碱基是任选地经取代的A、T、C、G或U，其中一个或多个-NH2独立地且任选地被-C(-L-R1)3代替，一个或多个-NH-独立地且任选地被-C(-L-R1)2-代替，一个或多个＝N-独立地且任选地被-C(-L-R1)-代替，一个或多个＝CH-独立地且任选地被＝N-代替，并且一个或多个＝O独立地且任选地被＝S、＝N(-L-R1)或＝C(-L-R1)2代替，其中两个或更多个-L-R1任选地与居于它们之间的原子合在一起形成具有0-10个杂原子环原子的3-30元双环或多环，其中经修饰的碱基不同于天然A、T、C、G和U。在一些实施例中，碱基是任选地经取代的A、T、C、G或U。在一些实施例中，经修饰碱基是取代的A、T、C、G或U，其中经修饰的碱基不同于天然A、T、C、G和U。
在一些实施例中，经修饰的核碱基是本领域(例如，WO 2017/210647)中已知的经修饰的核碱基。在一些实施例中，经修饰的核碱基是其中已添加一个或多个芳基和/或杂芳基环(诸如苯环)的尺寸扩大的核碱基。在以下文献中描述了经修饰的核碱基的某些实例，包括核碱基代替物：Glen研究目录(Glen Research,Sterling,Virginia[弗吉尼亚州斯特林的格兰研究公司])；Krueger AT等人,Acc.Chem.Res.[化学研究评述],2007,40,141-150；Kool,ET,Acc.Chem.Res.[化学研究评述],2002,35,936-943；Benner S.A.等人,Nat.Rev.Genet.[遗传学自然评论],2005,6,553-543；Romesberg,F.E.等人,Curr.Opin.Chem.Biol.[化学生物学新见],2003,7,723-733；或Hirao,I.,Curr.Opin.Chem.Biol.[化学生物学新见],2006,10,622-627。在一些实施例中，尺寸扩大的核碱基是例如WO 2017/210647中描述的大小扩增的核碱基。在一些实施例中，经修饰的核碱基是诸如咕啉或卟啉衍生的环之类的部分。某些卟啉衍生的碱基代替物已在例如Morales-Rojas,H和Kool,ET,Org.Lett.[有机快报],2002,4,4377-4380中描述。在一些实施例中，卟啉衍生的环是例如WO 2017/219647中描述的卟啉衍生的环。在一些实施例中，经修饰的核碱基是在例如WO 2017/219647中描述的经修饰的核碱基。在一些实施例中，经修饰的核碱基是荧光的。此类发荧光的经修饰的核碱基的实例包括菲、芘、茋(stillbene)、异黄嘌呤、异黄蝶呤、三联苯、三噻吩、苯并三噻吩、香豆素、二氧四氢蝶啶、系拴茋(tetheredstillbene)、苯并尿嘧啶、萘并尿嘧啶等，以及例如WO 2017/210647中描述的那些。在一些实施例中，核碱基或经修饰的核碱基选自：C5-丙炔T、C5-丙炔C、C5-噻唑、吩噁嗪、2-硫代胸腺嘧啶、5-三唑基苯基胸腺嘧啶、二氨基嘌呤和N2-氨基丙基鸟嘌呤。
在一些实施例中，经修饰的核碱基选自5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶、烷基或炔基取代的嘧啶、烷基取代的嘌呤，以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤。在某些实施例中，经修饰的核碱基选自2-氨基丙基腺嘌呤、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-N-甲基鸟嘌呤、6-N-甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-氮尿嘧啶、6-氮胞嘧啶、6-氮胸腺嘧啶、5-核糖基尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代嘌呤、8-氨基嘌呤、8-硫醇嘌呤、8-硫代烷基嘌呤、8-羟基嘌呤、8-氮杂嘌呤及其他8-取代的嘌呤、5-卤代、特别是5-溴、5-三氟甲基、5-卤代尿嘧啶及5-卤代胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、6-N-苯甲酰基腺嘌呤、2-N-异丁酰基鸟嘌呤、4-N-苯甲酰基胞嘧啶、4-N-苯甲酰基尿嘧啶、5-甲基4-N-苯甲酰基胞嘧啶、5-甲基4-N-苯甲酰基尿嘧啶、通用碱基、疏水性碱基、混杂碱基、大小扩展的碱基，以及氟化碱基。在一些实施例中，经修饰的核碱基是三环嘧啶，诸如l,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮、l,3-二氮杂吩噻嗪-2-酮或9-(2-氨基乙氧基)-l,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮(G形夹(G-clamp))。在一些实施例中，经修饰的核碱基是其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环代替的那些核碱基，例如，7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶或2-吡啶酮。在一些实施例中，经修饰的核碱基是在以下文献中披露的那些：US 3687808，The Concise Encyclopedia Of Polymer ScienceAnd Engineering[聚合物科学与工程简明百科全书],Kroschwitz,J.I.编辑,John Wiley&Sons[约翰威利父子公司],1990,858-859；Englisch等人,Angewandte Chemie,International Edition[应用化学国际版],1991,30,613；Sanghvi,Y.S.,第15章,Antisense Research and Applications[反义研究与应用],Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑,CRC Press[CRC出版社],1993,273-288；或第6章和第15章,Antisense DrugTechnology[反义药物技术],Crooke S.T.编辑,CRC Press[CRC出版社],2008,163-166和442-443。
在一些实施例中，经修饰的核碱基及其方法是在US 20030158403、US 3687808、US4845205、US 5130302、US 5134066、US 5 175273、US 5367066、US 5432272、US 5434257、US5457187、US 5459255、US 5484908、US 5502177、US 5525711、US 5552540、US 5587469、US5594 121、US 5596091、US 5614617、US 5645985、US 5681941、US 5750692、US 5763588、US5830653或US 6005096中描述的那些。
在一些实施例中，经修饰的核碱基是经取代的。在一些实施例中，经修饰的核碱基是经取代的，使得其含有例如连接到荧光部分、生物素或亲和素部分、或其他蛋白或肽的杂原子、烷基或连接部分。在一些实施例中，经修饰的核碱基是并非最经典意义上的核碱基，但功能类似于核碱基的“通用碱基”。通用碱基的一个实例是3-硝基吡咯。
在一些实施例中，可用于所提供的技术中的核苷包括经修饰的核碱基和/或经修饰的糖，例如4-乙酰基胞苷；5-(羧基羟甲基)尿苷；2'-O-甲基胞苷；5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-羧甲基氨基甲基尿苷；二氢尿苷；2'-O-甲基假尿苷；β,D-半乳糖基Q核苷；2'-O-甲基鸟苷；N6-异戊烯基腺苷；1-甲基腺苷；1-甲基假尿苷；1-甲基鸟苷；l-甲基肌苷；2,2-二甲基鸟苷；2-甲基腺苷；2-甲基鸟苷；N7-甲基鸟苷；3-甲基-胞苷；5-甲基胞苷；5-羟甲基胞苷；5-甲酰基胞嘧啶；5-羧基胞嘧啶；N6-甲基腺苷；7-甲基鸟苷；5-甲基氨基乙基尿苷；5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷；β,D-甘露糖基Q核苷；5-甲氧基羰基甲基尿苷；5-甲氧基尿苷；2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷；N-((9-β,D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸；N-((9-β,D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)-N-甲基氨甲酰基)苏氨酸；尿苷-5-氧基乙酸甲酯；尿苷-5-氧基乙酸(v)；假尿苷；Q核苷；2-硫代胞苷；5-甲基-2-硫代尿苷；2-硫代尿苷；4-硫代尿苷；5-甲基尿苷；2'-O-甲基-5-甲基尿苷；以及2'-O-甲基尿苷。
在一些实施例中，核碱基例如经修饰的核碱基包含一个或多个生物分子结合部分，诸如抗体、抗体片段、生物素、亲和素、链霉亲和素、受体配体或螯合部分。在其他实施例中，核碱基是5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶或2,6-二氨基嘌呤。在一些实施例中，核碱基包含被荧光或生物分子结合部分进行的取代。在一些实施例中，取代基是荧光部分。在一些实施例中，取代基是生物素或亲和素。
核碱基的某些实例及相关方法在US 3687808、4845205、US 513030、US 5134066、US 5175273、US 5367066、US 5432272、US 5457187、US 5457191、US 5459255、US 5484908、US 5502177、US 5525711、US 5552540、US 5587469、US 5594121、US 5596091、US 5614617、US 5681941、US 5750692、US 6015886、US 6147200、US 6166197、US 6222025、US 6235887、US 6380368、US 6528640、US 6639062、US 6617438、US 7045610、US 7427672、US或US7495088中描述。
在一些实施例中，寡核苷酸包含在以下任一文献中描述的核碱基、糖、核苷和/或核苷酸间键联：Gryaznov,S；Chen,J.-K.J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]1994,116,3143；Hendrix等人1997 Chem.Eur.J.[欧洲化学杂志]3:110；Hyrup等人1996Bioorg.Med.Chem.[生物有机化学与医药化学]4:5；Jepsen等人2004 Oligo.[寡核苷酸]14:130-146；Jones等人J.Org.Chem.[有机化学杂志]1993,58,2983；Koizumi等人2003Nuc.Acids Res.[核酸研究]12:3267-3273；Koshkin等人1998 Tetrahedron[四面体]54:3607-3630；Kumar等人1998 Bioo.Med.Chem.Let.[生物有机化学与医药化学快报]8:2219-2222；Lauritsen等人2002 Chem.Comm.[化学通讯]5:530-531；Lauritsen等人2003Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报]13:253-256；Mesmaeker等人Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.[应用化学英文国际版]1994,33,226；Morita等人2001Nucl.Acids Res.[核酸研究]增刊1:241-242；Morita等人2002 Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报]12:73-76；Morita等人2003 Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报]2211-2226；Nielsen等人1997 Chem.Soc.Rev.[化学学会评论]73；Nielsen等人1997 J.Chem.Soc.[化学学会杂志]Perkins Transl.1:3423-3433；Obika等人1997 Tetrahedron Lett.[四面体快报]38(50):8735-8；Obika等人1998 TetrahedronLett.[四面体快报]39:5401-5404；Pallan等人2012 Chem.Comm.[化学通讯]48:8195-8197；Petersen等人2003 TRENDS Biotech.[生物技术趋势]21:74-81；Rajwanshi等人1999Chem.Commun.[化学通讯]1395-1396；Schultz等人1996 Nucleic Acids Res.[核酸研究]24:2966；Seth等人2009 J.Med.Chem.[药物化学杂志]52:10-13；Seth等人2010J.Med.Chem.[药物化学杂志]53:8309-8318；Seth等人2010 J.Org.Chem.[有机化学杂志]75:1569-1581；Seth等人2012 Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报]22:296-299；Seth等人2012 Mol.Ther-Nuc.Acids.[分子疗法-核酸]1,e47；Seth,Punit P；Siwkowski,Andrew；Allerson,Charles R；Vasquez,Guillermo；Lee,Sam；Prakash,ThazhaP；Kinberger,Garth；Migawa,Michael T；Gaus,Hans；Bhat,Balkrishen；等人,来自NucleicAcids Symposium Series[核酸研讨会丛刊](2008),52(1),553-554；Singh等人1998Chem.Comm.[化学通讯]1247-1248；Singh等人1998J.Org.Chem.[有机化学杂志]63:10035-39；Singh等人1998J.Org.Chem.[有机化学杂志]63:6078-6079；Sorensen2003Chem.Comm.[化学通讯]2130-2131；Ts'o等人Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年刊]1988,507,220；Van Aerschot等人1995Angew.Chem.Int.Ed.Engl.[应用化学英文国际版]34:1338；Vasseur等人J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]1992,114,4006；WO2007090071；或WO 2016/079181。
在一些实施例中，寡核苷酸包含在以下任一文献中描述的经修饰的核碱基、核苷或核苷酸：Feldman等人2017J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]139:11427-11433,Feldman等人.2017 Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]114:E6478-E6479,Hwang等人.2009 Nucl.Acids Res.[核酸研究]37:4757-4763,Hwang等人.2008J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]130:14872-14882,Lavergne等人.2012 Chem.Eur.J.[欧洲化学杂志]18:1231-1239,Lavergne等人.2013 J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]135:5408-5419,Ledbetter等人.2018 J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]140:758-765,Malyshev等人.2009 J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]131:14620-14621,Seo等人.2009 Chem.Bio.Chem.[化学生物化学]10:2394-2400，例如d3FB、d2Py类似物、d2Py、d3MPy、d4MPy、d5MPy、d34DMPy、d35DMPy、d45DMPy、d5FM、d5PrM、d5SICS、dFEMO、dMMO2、dNaM、dNM01、dTPT3；具有2'-叠氮基糖、2'-氯基糖、2'-氨基糖或阿拉伯糖的核苷酸；异喹诺酮核苷酸、萘基核苷酸及氮杂吲哚核苷酸；以及其修饰及衍生物及官能化形式，例如其中糖包含2'修饰和/或其他修饰的那些，以及具有间氯、间溴、间碘、间甲基或间丙炔基取代基的dMMO2衍生物。
在一些实施例中，核碱基包含至少一个任选地经取代的环，该环包含杂原子环原子。在一些实施例中，核碱基包含至少一个任选地经取代的环，该环包含氮环原子。在一些实施例中，这样的环是芳族的。在一些实施例中，核碱基通过杂原子键合到糖。在一些实施例中，核碱基通过氮原子键合到糖。在一些实施例中，核碱基通过环氮原子键合到糖。
在一些实施例中，寡核苷酸包含如下描述的核碱基或经修饰的核碱基：WO 2018/022473、WO 2018/098264、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的碱基和经修饰的核碱基独立地通过援引并入本文。
在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的嘌呤碱基残基。在一些实施例中，核碱基是被保护的嘌呤碱基残基。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的腺嘌呤残基。在一些实施例中，核碱基是被保护的腺嘌呤残基。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的鸟嘌呤残基。在一些实施例中，核碱基是被保护的鸟嘌呤残基。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的胞嘧啶残基。在一些实施例中，核碱基是被保护的胞嘧啶残基。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的胸腺嘧啶残基。在一些实施例中，核碱基是被保护的胸腺嘧啶残基。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的尿嘧啶残基。在一些实施例中，核碱基是被保护的尿嘧啶残基。在一些实施例中，核碱基是任选地经取代的5-甲基胞嘧啶残基。在一些实施例中，核碱基是被保护的5-甲基胞嘧啶残基。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含例如在以下文献中描述的经修饰的核碱基：US 5552540、US 6222025、US 6528640、US 4845205、US 5681941、US 5750692、US6015886、US 5614617、US 6147200、US 5457187、US 6639062、US 7427672、US 5459255、US5484908、US 7045610、US 3687808、US 5502177、US 5525711 6235887、US 5175273、US6617438、US 5594121、US 6380368、US 5367066、US 5587469、US 6166197、US 5432272、US7495088、US 5134066或US 5596091。
在一些实施例中，核碱基是如用于寡核苷酸制备中的被保护的碱基残基。在一些实施例中，核碱基是在US 2011/0294124、US 2015/0211006、US 2015/0197540、WO 2015/107425、WO 2017/192679、WO 2018/022473、WO 2018/098264、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252中展示的碱基残基，其各自的碱基残基独立地通过援引并入本文。
糖
根据本披露，可以使用多种糖，包括经修饰的糖。在一些实施例中，本披露任选地与其他结构元件(例如，核苷酸间键联修饰及其模式、其骨架手性中心模式等)组合地提供糖修饰及其模式，这些其他结构元件在并入寡核苷酸中时可以提供改善的特性和/或活性。
最常见的天然存在的核苷包括连接到核碱基腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)的核糖(例如，在RNA中)或脱氧核糖(例如，在DNA中)。在一些实施例中，糖，例如表1中的许多寡核苷酸中的各种糖(除非另外说明)，是DNA核酸或寡核苷酸中的天然DNA糖，其具有
Figure BDA0003580200980003151
的结构，其中核碱基连接到1'位并且3'和5'位连接到核苷酸间键联(如本领域技术人员所理解的，如果在寡核苷酸的5'-末端，则5'位可以连接到5'-末端基团(例如，-OH)，并且如果在寡核苷酸的3'-末端，则3'位可以连接到3'-末端基团(例如，-OH))。在一些实施例中，糖是在RNA核酸或寡核苷酸中的天然RNA糖，其具有
Figure BDA0003580200980003152
的结构，其中核碱基连接到1'位并且3'和5'位连接到核苷酸间键联(如本领域技术人员所理解的，如果在寡核苷酸的5'-末端，则5'位可以连接到5'-末端基团(例如，-OH)，并且如果在寡核苷酸的3'-末端，则3'位可以连接到3'-末端基团(例如，-OH))。在一些实施例中，糖是经修饰的糖，因为它不是天然DNA糖或天然RNA糖。尤其是，经修饰的糖可以提供改善的稳定性。在一些实施例中，经修饰的糖可用于改变和/或优化一种或多种杂交特性。在一些实施例中，经修饰的糖可用于改变和/或优化靶核酸识别。在一些实施例中，经修饰的糖可以用于优化Tm。在一些实施例中，经修饰的糖可用于改善寡核苷酸活性。
糖可以在多种位置结合到核苷酸间键联上。作为非限制性实例，核苷酸间键联可以键合到糖的2'、3'、4'或5'位。在一些实施例中，如天然核酸中最常见的，除非另外指明，否则核苷酸间键联在5'位与一个糖并且在3'位与另一个糖连接。
在一些实施例中，糖是任选地经取代的天然DNA或RNA糖。在一些实施例中，糖是任选地经取代的
Figure BDA0003580200980003153
在一些实施例中，2'位置是任选地经取代的。在一些实施例中，糖是
Figure BDA0003580200980003161
在一些实施例中，糖具有
Figure BDA0003580200980003162
或
Figure BDA0003580200980003163
的结构，其中R1s、R2s、R3s、R4s和R5s各自独立地是-H、合适的取代基或合适的糖修饰(例如，US 9394333、US9744183、US 9605019、US 9982257、US 20170037399、US 20180216108、US 20180216107、US9598458、WO 2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/022473、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/032612、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252中描述的那些，其各自的取代基、糖修饰、R1s、R2s、R3s、R4s和R5s的描述和经修饰的糖独立地通过援引并入本文)。在一些实施例中，R1s、R2s、R3s、R4s和R5s各自独立地是Rs，其中每个Rs独立地是-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-N3、-NO、-NO2、-Ls-R'、-Ls-OR'、-Ls-SR'、-Ls-N(R')2、-O-Ls-OR'、-O-Ls-SR'、或-O-Ls-N(R')2，其中每个R'独立地如本文所述，并且每个Ls独立地是共价键或任选地经取代的二价C1-6脂肪族基或具有1至4个杂原子的杂脂肪族基；或两个Rs合在一起形成桥-Ls-。在一些实施例中，R'是任选地经取代的C1-10脂肪族基。在一些实施例中，糖具有
Figure BDA0003580200980003164
的结构。表1中使用了多种这样的糖。在一些实施例中，糖具有
Figure BDA0003580200980003165
的结构。在一些实施例中，2'-修饰的糖具有
Figure BDA0003580200980003166
的结构，其中R2s是2'-修饰。在一些实施例中，糖具有
Figure BDA0003580200980003167
的结构，其中R2s是-H、卤素或-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，R2s是-H。在一些实施例中，R2s是-F。在一些实施例中，R2s是-OMe。在一些实施例中，经修饰的核苷是mA、mT、mC、m5mC、mG、mU等，其中R2s是-OMe。在一些实施例中，R2s是-OCH2CH2OMe。在一些实施例中，经修饰的核苷是Aeo、Teo、Ceo、m5Ceo、Geo、Ueo等，其中R2s是-OCH2CH2OMe。在一些实施例中，2'-F修饰的糖具有
Figure BDA0003580200980003171
的结构。在一些实施例中，2'-OMe修饰的糖具有
Figure BDA0003580200980003172
的结构。
在一些实施例中，糖具有
Figure BDA0003580200980003173
的结构，其中R2s和R4s合在一起形成-Ls-，其中Ls是共价键或任选地经取代的二价C1-6脂肪族基或具有1至4个杂原子的杂脂肪族基。在一些实施例中，每个杂原子独立地选自氮、氧或硫)。在一些实施例中，Ls是任选地经取代的C2-O-CH2-C4。在一些实施例中，Ls是C2-O-CH2-C4。在一些实施例中，Ls是C2-O-(R)-CH(CH2CH3)-C4。在一些实施例中，Ls是C2-O-(S)-CH(CH2CH3)-C4。
在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷具有
Figure BDA0003580200980003174
或其盐形式的结构，其中BAs是-H或任选地经取代的或被保护的核碱基(例如，BA)，并且R2s如本文所述。在一些实施例中，R2s是-OH、卤素或任选地经取代的C1-C6烷氧基。在一些实施例中，BAs是-H。在一些实施例中，BAs是任选地经取代的或被保护的核碱基。在一些实施例中，BAs是BA。在一些实施例中，R2s是-F。在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷具有
Figure BDA0003580200980003175
或其盐形式的结构，其中每个变量独立地如本文所述。在一些实施例中，R2s是-H、-OH、卤素或任选地经取代的C1-C6烷氧基。在一些实施例中，R2s是-H。在一些实施例中，R2s是-F。在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷具有
Figure BDA0003580200980003181
的结构，其中每个变量如本文所述。在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷具有
Figure BDA0003580200980003182
或其盐形式的结构，其中每个变量独立地如本文所述。在一些实施例中，R2s是-H、-OH、卤素或任选地经取代的C1-C6烷氧基。在一些实施例中，R2s是-H。在一些实施例中，R2s是-F。在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷具有
Figure BDA0003580200980003183
或其盐形式的结构，其中R2s'是Rs，并且Rs、R2s和BAs各自独立地如本文所述。在一些实施例中，R2s和R2s'各自独立地是-H、-OH、卤素或任选地经取代的C1-C6烷氧基。在一些实施例中，R2s是-H。在一些实施例中，R2s是-OH。在一些实施例中，R2s是卤素。在一些实施例中，R2s是-F。在一些实施例中，R2s是任选地经取代的C1-C6烷氧基。在一些实施例中，R2s'是-H。在一些实施例中，R2s'是-OH。在一些实施例中，R2s'是卤素。在一些实施例中，R2s'是-F。在一些实施例中，R2s'是任选地经取代的C1-C6烷氧基。在一些实施例中，BAs是-H。在一些实施例中，BAs是任选地经取代的或被保护的核碱基。在一些实施例中，BAs是BA。在一些实施例中，核碱基诸如BA任选地经取代的或被保护以用于寡核苷酸合成。某些此类包含糖和核碱基的核苷及其用途在WO 2020/154342中描述。在一些实施例中，寡核苷酸包含此类核苷。在一些实施例中，亚磷酰胺包含此类核苷(在一些实施例中，一个连接位点(例如，-CH2-连接位点)键合到任选地经取代的-OH，例如，(-ODMTr)，并且一个连接位点(例如，环连接位点)键合到也键合到亚磷酰胺的P的O)。在一些实施例中，5'紧邻核苷(例如，N1)、相反核苷(N0)和3'紧邻核苷(例如，N-1)中的一个或多个或每一个独立地是这种核苷。
在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷具有
Figure BDA0003580200980003184
或其盐形式的结构，其中R6s和R7s各自独立地是Rs，BAs是-H或任选地经取代的或被保护的核碱基(例如，BA)，并且Rs独立地如本文所述。在一些实施例中，R6s是-H、-OH或卤素，并且R7s是-H、-OH、卤素或任选地经取代的C1-C6烷氧基。在一些实施例中，BAs是-H。在一些实施例中，BAs是任选地经取代的或被保护的核碱基。在一些实施例中，BAs是BA。在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷具有
Figure BDA0003580200980003191
或其盐形式的结构，其中R8s和R9s各自独立地是Rs，并且Rs和BAs各自独立地如本文所述。在一些实施例中，R8s是-H或卤素，并且R9s是-H、-OH、卤素或任选地经取代的C1-C6烷氧基。在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷具有
Figure BDA0003580200980003192
或其盐形式的结构，其中R10s和R11s各自独立地是Rs，并且Rs和BAs各自独立地如本文所述。在一些实施例中，R10s是-H或卤素，并且R11s是-H、-OH、卤素或任选地经取代的C1-C6烷氧基。在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷具有
Figure BDA0003580200980003193
或其盐形式的结构，其中BAs如本文所述。本领域技术人员理解，在一些实施例中，氮可以直接键合到键联磷。在一些实施例中，卤素是-F。在一些实施例中，BAs是-H。在一些实施例中，BAs是任选地经取代的或被保护的核碱基。在一些实施例中，BAs是BA。在一些实施例中，核碱基诸如BA任选地经取代的或被保护以用于寡核苷酸合成。某些此类包含糖和核碱基的核苷及其用途在WO 2020/154343中描述。在一些实施例中，寡核苷酸包含此类核苷。在一些实施例中，亚磷酰胺包含此类核苷(在一些实施例中，一个连接位点(例如，-CH2-连接位点)键合到任选地经取代的-OH，例如-ODMTr，并且一个连接位点(例如，环连接位点)键合到亚磷酰胺的P(例如，当连接环原子是N时)或键合到也键合到亚磷酰胺的P的O(例如，当连接环原子是C时))。在一些实施例中，5'紧邻核苷(例如，N1)、相反核苷(N0)和3'紧邻核苷(例如，N-1)中的一个或多个或每一个独立地是这种核苷。
在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷具有
Figure BDA0003580200980003194
或其盐形式的结构，其中各变量如本文所述。在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷具有
Figure BDA0003580200980003201
或其盐形式的结构，其中各变量如本文所述。在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷具有
Figure BDA0003580200980003202
或其盐形式的结构，其中各变量如本文所述。在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷具有
Figure BDA0003580200980003203
或其盐形式的结构，其中R12s是Rs,并且Rs和BAs各自独立地如本文所述。在一些实施例中，R12s是-H、-OH、卤素、任选地经取代的C1-6烷基、任选地经取代的C1-6杂烷基或任选地经取代的C1-6烷氧基。在一些实施例中，卤素是-F。在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷具有
Figure BDA0003580200980003204
或其盐形式的结构，其中各变量如本文所述。在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷酸具有
Figure BDA0003580200980003205
或其盐形式的结构，其中R13s是Rs,并且Rs和BAs各自独立地如本文所述。在一些实施例中，R13s是-H或任选地经取代的C1-C6烷基。在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷具有
Figure BDA0003580200980003206
或其盐形式的结构，其中各变量如本文所述。在一些实施例中，包含经修饰的糖的核苷酸具有
Figure BDA0003580200980003207
或其盐形式的结构，其中每个变量如本文所述。在一些实施例中，键联是酰胺键联。在一些实施例中，BAs是-H。在一些实施例中，BAs是任选地经取代的或被保护的核碱基。在一些实施例中，BAs是BA。在一些实施例中，核碱基诸如BA任选地经取代的或被保护以用于寡核苷酸合成。某些此类包含糖和核碱基的核苷和核苷酸及其用途在WO 2020/154344中描述。在一些实施例中，寡核苷酸包含此类核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含此类核苷(在一些实施例中，一个连接位点(例如，-CH2-连接位点)键合到任选地经取代的-OH，例如，(-ODMTr)，并且一个连接位点(例如，环连接位点)键合到也键合到亚磷酰胺的P的O)。在一些实施例中，5'紧邻核苷(例如，N1)、相反核苷(N0)和3'紧邻核苷(例如，N-1)中的一个或多个或每一个独立地是这种核苷。
在一些实施例中，糖是无环糖，例如UNA糖。在一些实施例中，糖是任选地经取代的
Figure BDA0003580200980003211
在一些实施例中，2'位置是任选地经取代的。在一些实施例中，糖是
Figure BDA0003580200980003212
在一些实施例中，糖具有
Figure BDA0003580200980003213
的结构。在一些实施例中，R2s是-OH。
在一些实施例中，R1s、R2s、R3s、R4s和R5s各自独立地是Rs，其中Rs独立地是-H、卤素、-CN、-N3、-NO、-NO2、-Ls-R'、-Ls-Si(R')3、-Ls-OR'、-Ls-SR'、-Ls-N(R')2、-O-Ls-R'、-O-Ls-Si(R)3、-O-Ls-OR'、-O-Ls-SR'或-O-Ls-N(R')2；其中Ls是如本文所述的LB，并且每个其他变量独立地如本文所述。在一些实施例中，R1s和R2s各自独立地是Rs。在一些实施例中，Rs是-H。在一些实施例中，Rs不是-H。在一些实施例中，Ls是共价键。在一些实施例中，R2s和R4s各自独立地是-H、-F、-OR、-N(R)2。在一些实施例中，R2s是-H、-F、-OR、-N(R)2。在一些实施例中，R4s是-H。在一些实施例中，R2s和R4s形成2'-O-Ls-，其中Ls是任选地经取代的C1-6亚烷基。在一些实施例中，Ls是任选地经取代的-CH2-。在一些实施例中，Ls是任选地经取代的-CH2-。
在一些实施例中，R是氢。在一些实施例中，R不是氢。在一些实施例中，R是选自以下的任选地经取代的基团：C1-10脂肪族基、具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的C1-10杂脂肪族基、C6-20芳基、具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的5元至20元杂芳环以及具有1-10个独立地选自氧、氮、硫、磷及硅的杂原子的3元至20元杂环。
在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-30脂肪族基。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-20脂肪族基。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-15脂肪族基。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-10脂肪族基。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R是任选地经取代的己基、戊基、丁基、丙基、乙基或甲基。在一些实施例中，R是任选地经取代的己基。在一些实施例中，R是任选地经取代的戊基。在一些实施例中，R是任选地经取代的丁基。在一些实施例中，R是任选地经取代的丙基。在一些实施例中，R是任选地经取代的乙基。在一些实施例中，R是任选地经取代的甲基。在一些实施例中，R是己基。在一些实施例中，R是戊基。在一些实施例中，R是丁基。在一些实施例中，R是丙基。在一些实施例中，R是乙基。在一些实施例中，R是甲基。在一些实施例中，R是异丙基。在一些实施例中，R是正丙基。在一些实施例中，R是叔丁基。在一些实施例中，R是仲丁基。在一些实施例中，R是正丁基。在一些实施例中，R是-(CH2)2OCH3。
在一些实施例中，R是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，R是苯基。
在一些实施例中，R2s是如本披露中所述的2'-修饰，并且R4s是-H。在一些实施例中，R2s是-OR，其中R不是氢。在一些实施例中，R2s是-F。在一些实施例中，R2s是-OMe。在一些实施例中，R2s是-OCH2CH2CH3，例如在表1中使用的各种Xeo中(X是m5C、T、G、A等)。在一些实施例中，R2s选自-H、-F和-OR，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R2s选自-H、-F和-OMe。
在一些实施例中，糖是双环糖，例如其中R2s和R4s形成如本披露中所述的任选地经取代的环的糖。在一些实施例中，糖选自LNA糖、BNA糖、cEt糖等。在一些实施例中，桥在2'碳原子与4'碳原子之间(对应于R2s和R4s与居于它们之间的原子合在一起形成如本文所述的任选地经取代的环)。在一些实施例中，桥是2'-La-Lb-4'，其中La是La是-O-、-S-或N(R)，并且Lb是任选地经取代的C1-4二价脂肪族链，例如亚甲基。
在一些实施例中，糖是2'-OMe、2'-MOE、2'-F、LNA(锁核酸)糖、ENA(乙烯桥核酸)糖、BNA(NMe)(甲氨基桥核酸)糖、2'-F ANA(2'-F阿拉伯糖)、α-DNA(α-D-核糖)、2’/5’ODN(例如，2'/5'连接的寡核苷酸)、Inv(转化糖、例如转化脱氧核糖)、AmR(氨基-核糖)、ThioR(硫代-核糖)、HNA(己糖核酸)、CeNA(环己烯核酸)或MOR(吗啉代)糖。
本领域技术人员在阅读本披露内容后将理解，多种类型的糖修饰是已知的并且可以根据本披露内容使用。在一些实施例中，糖修饰是2'-修饰(例如，R2s)。在一些实施例中，2'-修饰是2'-F。在一些实施例中，2'-修饰是2'-OR，其中R不是氢。在一些实施例中，2'-修饰是2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，2'-修饰是2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，2'-修饰是2'-OMe。在一些实施例中，2'-修饰是2'-MOE。在一些实施例中，2'-修饰是-O-Lb-或-Lb-Lb-，其将糖部分的2'-碳连接到糖部分的另一个碳。在一些实施例中，2'-修饰是2'-O-Lb-4'或2'-Lb-Lb-4'，其将糖部分的2'-碳连接到糖部分的4'-碳。在一些实施例中，2'-修饰是S-cEt。在一些实施例中，经修饰的糖是LNA糖。在一些实施例中，-Lb-是-C(R)2-。在一些实施例中，2'-修饰是(C2-O-C(R)2-C4)，其中每个R独立地如本披露中所述。在一些实施例中，2'-修饰是LNA糖修饰(C2-O-CH2-C4)。在一些实施例中，2'-修饰是(C2-O-CHR-C4)，其中R如本披露中所述。在一些实施例中，2'-修饰是(C2-O-(R)-CHR-C4)，其中R如本披露中所述并且不是氢。在一些实施例中，2'-修饰是(C2-O-(S)-CHR-C4)，其中R如本披露中所述并且不是氢。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R是未取代的C1-6烷基。在一些实施例中，R是甲基。在一些实施例中，R是乙基。在一些实施例中，2'-修饰是(C2-O-CHR-C4)，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，2'-修饰是(C2-O-CHR-C4)，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，2'-修饰是(C2-O-CHR-C4)，其中R是甲基。在一些实施例中，2'-修饰是(C2-O-CHR-C4)，其中R是乙基。在一些实施例中，2'-修饰是(C2-O-(R)-CHR-C4)，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，2'-修饰是(C2-O-(R)-CHR-C4)，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，2'-修饰是(C2-O-(R)-CHR-C4)，其中R是甲基。在一些实施例中，2'-修饰是(C2-O-(R)-CHR-C4)，其中R是乙基。在一些实施例中，2'-修饰是(C2-O-(S)-CHR-C4)，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，2'-修饰是(C2-O-(S)-CHR-C4)，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，2'-修饰是(C2-O-(S)-CHR-C4)，其中R是甲基。在一些实施例中，2'-修饰是(C2-O-(S)-CHR-C4)，其中R是乙基。在一些实施例中，2'-修饰是C2-O-(R)-CH(CH2CH3)-C4。在一些实施例中，2'-修饰是C2-O-(S)-CH(CH2CH3)-C4。在一些实施例中，糖是天然DNA糖。在一些实施例中，糖是天然RNA糖。在一些实施例中，糖是任选地经取代的天然DNA糖。在一些实施例中，糖是任选地在2'取代的天然DNA糖。在一些实施例中，糖是在2'取代的天然DNA糖(2'-修饰)。在一些实施例中，糖是在2'修饰的天然DNA糖(2'-修饰)。
在一些实施例中，糖是任选地经取代的核糖或脱氧核糖。在一些实施例中，糖是任选地经修饰的核糖或脱氧核糖，其中该核糖或脱氧核糖部分的一个或多个羟基任选且独立地被卤素、R'、-N(R')2、-OR'或-SR'代替，其中每个R'如本文所述。在一些实施例中，糖是任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2'位是任选地经取代的。在一些实施例中，糖是任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2'位任选地被卤素、R'、-N(R')2、-OR'或-SR'取代，其中每个R'独立地在本披露中描述。在一些实施例中，糖是任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2'位是任选地被卤素取代的。在一些实施例中，糖是任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2'位任选地被一个或多个-F取代。在一些实施例中，糖是任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2'位任选地被-OR'取代，其中每个R'独立地在本披露中描述。在一些实施例中，糖是任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2'位任选地被-OR'取代，其中每个R'独立地是任选地经取代的C1-C6脂肪族基。在一些实施例中，糖是任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2'位任选地被-OR'取代，其中每个R'独立地是任选地经取代的C1-C6烷基。在一些实施例中，糖是任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2'位任选地被-OMe取代。在一些实施例中，糖是任选地经取代的脱氧核糖，其中脱氧核糖的2'位任选地被-O-甲氧基乙基取代。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的糖。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的糖和一个或多个天然糖。
双环糖的实例包括α-L-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')LNA、β-D-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')LNA、亚乙基氧基(4'-(CH2)2-O-2')LNA、氨基氧基(4'-CH2-O-N(R)-2')LNA和氧基氨基(4'-CH2-N(R)-O-2')LNA的糖。在一些实施例中，双环糖，例如LNA或BNA糖，是在两个糖碳之间具有至少一个桥的糖。在一些实施例中，核苷中的双环糖可以具有α-L-呋喃核糖或β-D-呋喃核糖的立体化学构型。
在一些实施例中，双环糖可以通过异构体构型进一步定义。例如，包含4'-(CH2)-O-2'桥的糖可以呈α-L构型或β-D构型。在一些实施例中，4'至2'桥是-L-4'-(CH2)-O-2'、b-D-4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R')-2'、4'-CH2-N(R')-O-2'、4'-CH(R')-O-2'、4'-CH(CH3)-O-2'、4'-CH2-S-2'、4'-CH2-N(R')-2'、4'-CH2-CH(R')-2'、4'-CH2-CH(CH3)-2'和4'-(CH2)3-2'，其中每个R'如本披露中所述。在一些实施例中，R'是-H、保护基或任选地经取代的C1-C12烷基。在一些实施例中，R'是-H或任选地经取代的C1-C12烷基。
在一些实施例中，双环糖是α-L-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA、β-D-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA、亚乙基氧基(4'-(CH2)2-O-2')BNA、氨基氧基(4'-CH2-O-N(R)-2')BNA、氧氨基(4'-CH2-N(R)-O-2')BNA、甲基(亚甲基氧基)(4'-CH(CH3)-O-2')BNA(也称为受限制的乙基或cEt)、亚甲基-硫基(4'-CH2-S-2')BNA、亚甲基-氨基(4'-CH2-N(R)-2')BNA、甲基碳环(4'-CH2-CH(CH3)-2')BNA、亚丙基碳环(4'-(CH2)3-2')BNA或乙烯基BNA的糖。
在一些实施例中，糖修饰是US 9006198中描述的修饰。在一些实施例中，经修饰的糖在US 9006198中描述。在一些实施例中，糖修饰是在US 9394333、US 9744183、US9605019、US 9982257、US 20170037399、US 20180216108、US 20180216107、US 9598458、WO2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO2018/098264、WO 2018/022473、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/032612、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252中描述的修饰，其各自的糖修饰和经修饰的糖独立地通过援引并入。
在一些实施例中，经修饰的糖是在以下文献中描述的糖：US 5658873、US5118800、US 5393878、US 5514785、US 5627053、US 7034133；7084125、US 7399845、US5319080、US 5591722、US 5597909、US 5466786、US 6268490、US 6525191、US 5519134、US5576427、US 6794499、US 6998484、US 7053207、US 4981957、US 5359044、US 6770748、US7427672、US 5446137、US 6670461、US 7569686、US 7741457、US 8022193、US 8030467、US8278425、US 5610300、US 5646265、US 8278426、US 5567811、US 5700920、US 8278283、US5639873、US 5670633、US 8314227、US 2008/0039618或US 2009/0012281。
在一些实施例中，糖修饰是2'-OMe、2'-MOE、2'-LNA、2'-F、5'-乙烯基或S-cEt。在一些实施例中，经修饰的糖是FRNA糖、FANA糖或吗啉代糖。在一些实施例中，寡核苷酸包含核酸类似物，例如GNA、LNA、PNA、TNA、F-HNA(F-THP或3'-氟四氢吡喃)、MNA(甘露醇核酸，例如Leumann 2002 Bioorg.Med.Chem.[生物有机化学与医药化学杂志]10:841-854)、ANA(安尼妥(anitol)核酸)或吗啉代或其一部分。在一些实施例中，糖修饰用另一个环状或无环状部分代替天然糖。此类部分的实例在本领域中是众所周知的，例如用于吗啉代、二醇核酸等中的那些，并且可以根据本披露使用。如本领域技术人员所理解的，当与经修饰的糖一起使用时，在一些实施例中，核苷酸间键联可以被修饰，例如，如在吗啉代、PNA等中。
在一些实施例中，糖是在6-位具有(R)或(S)手性的6'-修饰的双环糖，例如在US7399845中描述的那些。在一些实施例中，糖是在5-位具有(R)或(S)手性的5'-修饰的双环糖，例如在US 20070287831中描述的那些。
在一些实施例中，经修饰的糖在2'位含有一个或多个取代基(通常是一个取代基，并且通常在轴向位置)，其独立地选自-F；-CF3、-CN、-N3、-NO、-NO2、-OR'、-SR'、或-N(R')2，其中每个R'独立地在本披露中描述；-O-(C1-C10烷基)、-S-(C1-C10烷基)、-NH-(C1-C10烷基)、或-N(C1-C10烷基)2；-O-(C2-C10烯基)、-S-(C2-C10烯基)、-NH-(C2-C10烯基)、或-N(C2-C10烯基)2；-O-(C2-C10炔基)、-S-(C2-C10炔基)、-NH-(C2-C10炔基)、或-N(C2-C10炔基)2；或-O--(C1-C10亚烷基)-O--(C1-C10烷基)、-O-(C1-C10亚烷基)-NH-(C1-C10烷基)或-O-(C1-C10亚烷基)-NH(C1-C10烷基)2、-NH-(C1-C10亚烷基)-O-(C1-C10烷基)、或-N(C1-C10烷基)-(C1-C10亚烷基)-O-(C1-C10烷基)，其中烷基、亚烷基、烯基和炔基各自独立且任选地经取代。在一些实施例中，取代基是-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)nNH2、MOE、DMAOE或DMAEOE，其中n是1至约10。在一些实施例中，经修饰的糖是WO 2001/088198和Martin等人,Helv.Chim.Acta[瑞士化学学报],1995,78,486-504中描述的糖。在一些实施例中，经修饰的糖包含一个或多个选自以下的基团：经取代的甲硅烷基、切割RNA的基团、报告基团、荧光标记、嵌入剂、用于改善核酸的药代动力学特性的基团、用于改善核酸的药效学特性的基团、或其他具有类似特性的取代基。在一些实施例中，在2'、3'、4'或5'位中的一个或多个上进行修饰，包括在3'-末端核苷上的糖的3'位或在5'-末端核苷的5'位。
在一些实施例中，核糖的2'-OH被选自以下的基团代替：-H、-F；-CF3、-CN、-N3、-NO、-NO2、-OR'、-SR'、或-N(R')2，其中每个R'独立地在本披露中描述；-O-(C1-C10烷基)、-S-(C1-C10烷基)、-NH-(C1-C10烷基)、或-N(C1-C10烷基)2；-O-(C2-C10烯基)、-S-(C2-C10烯基)、-NH-(C2-C10烯基)、或-N(C2-C10烯基)2；-O-(C2-C10炔基)、-S-(C2-C10炔基)、-NH-(C2-C10炔基)、或-N(C2-C10炔基)2；或-O-(C1-C10亚烷基)-O--(C1-C10烷基)、-O-(C1-C10亚烷基)-NH-(C1-C10烷基)或-O-(C1-C10亚烷基)-NH(C1-C10烷基)2、-NH-(C1-C10亚烷基)-O-(C1-C10烷基)、或-N(C1-C10烷基)-(C1-C10亚烷基)-O-(C1-C10烷基)，其中烷基、亚烷基、烯基和炔基各自独立且任选地经取代。在一些实施例中，2'-OH被-H(脱氧核糖)代替。在一些实施例中，2'-OH被-F代替。在一些实施例中，2'-OH被-OR'代替。在一些实施例中，2'-OH被-OMe代替。在一些实施例中，2'-OH被-OCH2CH2OMe代替。
在一些实施例中，糖修饰是2'-修饰。通常使用的2'-修饰包括但不限于2'-OR，其中R不是氢并且如本披露中所述。在一些实施例中，修饰是2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，修饰是2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，修饰是2'-OMe。在一些实施例中，修饰是2'-MOE。在一些实施例中，2'-修饰是S-cEt。在一些实施例中，经修饰的糖是LNA糖。在一些实施例中，2'-修饰是-F。在一些实施例中，2'-修饰是FANA。在一些实施例中，2'-修饰是FRNA。在一些实施例中，糖修饰是5'-修饰，例如5'-Me。在一些实施例中，糖修饰改变糖环的大小。在一些实施例中，糖修饰是FHNA中的糖部分。
在一些实施例中，糖修饰用另一个环状或无环状部分代替糖部分。这类部分的实例是本领域广泛已知的，包括但不限于吗啉基(任选地具有其二氨基磷酸酯键联)、二醇核酸等中所使用的那些部分。
在一些实施例中，寡核苷酸的一个或多个糖被修饰。在一些实施例中，经修饰的糖包含2'-修饰。在一些实施例中，每个经修饰的糖独立地包含2'-修饰。在一些实施例中，2'-修饰是2'-OR。在一些实施例中，2'-修饰是2'-OMe。在一些实施例中，2'-修饰是2'-MOE。在一些实施例中，2'-修饰是LNA糖修饰。在一些实施例中，2'-修饰是2'-F。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2'-修饰。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2'-OR或2'-F。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2'-OR或2'-F，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2'-OR或2'-F，其中至少一个是2'-F。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2'-OR或2'-F，其中R是任选地经取代的C1-6烷基，并且其中至少一个是2'-OR。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2'-OR或2'-F，其中至少一个是2'-F，并且至少一个是2'-OR。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2'-OR或2'-F，其中R是任选地经取代的C1-6烷基，并且其中至少一个是2'-F，并且至少一个是2'-OR。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2'-OR。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，每个糖修饰是2'-OMe。在一些实施例中，每个糖修饰是2'-MOE。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2'-OMe或2'-MOE。在一些实施例中，每个糖修饰独立地是2'-OMe、2'-MOE或LNA糖。
经修饰的糖包括代替呋喃戊糖基糖的环丁基或环戊基部分。此类经修饰的糖的代表性实例包括在US 4,981,957、US 5,118,800、US 5,319,080或US 5,359,044中描述的那些。在一些实施例中，核糖环内的氧原子被氮、硫、硒或碳代替。在一些实施例中，-O-被-N(R')-、-S-、-Se-或-C(R')2-代替。在一些实施例中，经修饰的糖是经修饰的核糖，其中核糖环内的氧原子被氮代替，并且其中氮任选地被烷基(例如，甲基、乙基、异丙基等)取代。
经修饰的糖的非限制性实例是甘油，其是甘油核酸(GNA)的一部分，例如，如以下文献中所述：Zhang,R等人.,J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志],2008,130,5846-5847；Zhang L等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]2005,127,4174-4175以及Tsai CH等人,PNAS[美国国家科学院院刊]2007,14598-14603。
柔性核酸(FNA)基于甲酰甘油的混合乙缩醛缩醛胺，例如，如Joyce GF等人,PNAS[美国国家科学院院刊],1987,84,4398-4402以及Heuberger BD和Switzer C,J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志],2008,130,412-413中所述。
在一些实施例中，寡核苷酸和/或其经修饰的核苷包含在以下文献中描述的糖或经修饰的糖：WO 2018/022473、WO 2018/098264、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或O 2020/191252，其各自的糖和经修饰的糖独立地通过援引并入本文。
在一些实施例中，糖中的一个或多个羟基任选地且独立地被卤素、R'-N(R')2、-OR'或-SR'代替，其中每个R'独立地在本披露中描述。
在一些实施例中，经修饰的核苷是在以下文献中描述的任何经修饰的核苷：WO2018/022473、WO 2018/098264、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的经修饰的核苷独立地通过援引并入本文。
在一些实施例中，糖修饰是5'-乙烯基(R或S)、5'-甲基(R或S)、2'-SH、2'-F、2'-OCH3、2'-OCH2CH3、2'-OCH2CH2F或2'-O(CH2)20CH3。在一些实施例中，在2'位上的取代基，例如2'-修饰基团是烯丙基、氨基、叠氮基、硫基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、OCH2F、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)和O-CH2-C(＝O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)，其中每个烯丙基、氨基和烷基任选地经取代，并且Rl、Rm和Rn各自独立地是如本披露中所述的R'。在一些实施例中，Rl、Rm和Rn各自独立地是-H或任选地经取代的C1-C10烷基。
在一些实施例中，双环糖在两个糖碳原子之间，例如在4'和2'核糖基环碳原子之间包含桥，例如-Lb-Lb-、-L-等。在一些实施例中，桥是4'-(CH2)-O-2'(例如，LNA糖)、4'-(CH2)-S-2'、4'-(CH2)2-O-2'(例如，ENA糖)、4'-CH(R')-O-2'(例如，4'-CH(CH3)-O-2'、4'-CH(CH2OCH3)-O-2'和US 7399845中的实例等)、4'-CH(R')2-O-2'(例如，4'-C(CH3)(CH3)-O-2'和WO 2009006478中的实例等)、4'-CH2-N(OR')-2'(例如，4'-CH2-N(OCH3)-2'、WO2008150729中的实例等)、4'-CH2-O-N(R')-2'(例如，4'-CH2-O-N(CH3)-2'、US 20040171570中的实例等)、4'-CH2-N(R')-O-2'[例如，其中R是-H、C1-C12烷基、或保护基(例如，参见US7427672)]、4'-C(R')2-C(H)(R')-2'(例如，4'-CH2-C(H)(CH3)-2'、Chattopadhyaya等人,J.Org.Chem.[有机化学杂志],2009,74,118-134等)或4'-C(R')2-C(＝C(R')2)-2'(例如，4'-CH2-C(＝CH2)-2'、WO 2008154401中的实例等)。
在一些实施例中，糖是四氢吡喃或THP糖。在一些实施例中，经修饰的核苷是四氢吡喃核苷或THP核苷(其是用六元四氢吡喃糖代替典型的天然核苷中的呋喃戊糖基残基的核苷)。THP糖和/或核苷包括用于己糖醇核酸(HNA)、安尼妥(anitol)核酸(ANA)、甘露醇核酸(MNA)(例如，Leumann,Bioorg.Med.Chem.[生物有机化学与医药化学],2002,10,841-854)或氟代HNA(F-HNA)的那些。
在一些实施例中，糖包含具有多于5个原子和/或多于一个杂原子的环，例如吗啉代糖，其在以下文献中描述：例如Braasch等人,Biochemistry[生物化学],2002,41,4503-4510；US 5698685；US 5166315；US 5185444；US 5034506；等等)。
如本领域技术人员将理解的，糖、核碱基、核苷酸间键联等的修饰可以并且经常与寡核苷酸(例如，参见表1中的各种寡核苷酸)组合使用。
在一些实施例中，核苷具有代替天然存在的核苷中的呋喃戊糖基残基的六元环己烯基。示例环己烯基核苷及其制备和用途在以下文献中描述：例如WO 2010036696；Robeyns等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志],2008,130(6),1979-1984；Horvath等人,Tetrahedron Letters[四面体快报],2007,48,3621-3623；Nauwelaerts等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志],2007,129(30),9340-9348；Gu等人,Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids[核苷、核苷酸与核酸],2005,24(5-7),993-998；Nauwelaerts等人,Nucleic Acids Research[核酸研究],2005,33(8),2452-2463；Robeyns等人,ActaCrystallographica,Section F:Structural Biology and CrystallizationCommunications[晶体学报，部分F：结构生物学与结晶通讯],2005,F61(6),585-586；Gu等人,Tetrahedron[四面体],2004,60(9),2111-2123；Gu等人,Oligonucleotides[寡核苷酸],2003,13(6),479-489；Wang等人,J.Org.Chem.[有机化学杂志],2003,68,4499-4505；Verbeure等人,Nucleic Acids Research[核酸研究],2001,29(24),4941-4947；Wang等人,J.Org.Chem.[有机化学杂志],2001,66,8478-82；Wang等人,Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids[核苷、核苷酸与核酸],2001,20(4-7),785-788；Wang等人,J.Am.Chem.[美国化学杂志],2000,122,8595-8602；WO 2006047842；WO 2001049687；等等。
许多单环、双环和三环环系适合作为糖代替物(经修饰的糖)，并且可以根据本披露使用。参见例如Leumann,Christian J.Bioorg.&Med.Chem.[生物有机化学与医药化学杂志],2002,10,841-854。此类环系可以进行多种另外的取代以进一步增强其特性和/或活性。
在一些实施例中，2'-修饰的糖是在2'位被修饰的呋喃糖基糖。在一些实施例中，2'-修饰是卤素、-R'(其中R'不是-H)、-OR'(其中R'不是-H)、-SR'、-N(R')2、任选地经取代的-CH2-CH＝CH2、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基。在一些实施例中，2'-修饰选自-O[(CH2)nO]mCH3、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nCH3、-O(CH2)nF、-O(CH2)nONH2、-OCH2C(＝O)N(H)CH3和-O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中每个n和m独立地是1至约10。在一些实施例中，2'-修饰是任选地经取代的C1-C12烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷芳基、任选地经取代的芳烷基、任选地经取代的-O-烷芳基、任选地经取代的-O-芳烷基、-SH、-SCH3、-OCN、-Cl、-Br、-CN、-F、-CF3、-OCF3、-SOCH3、-SO2CH3、-ONO2、-NO2、-N3、-NH2、任选地经取代的杂环烷基、任选地经取代的杂环烷芳基、任选地经取代的氨基烷基氨基、任选地经取代的聚烷基氨基、经取代的甲硅烷基、报告基团、嵌入剂、用于改善药代动力学特性的基团、用于改善药效学特性的基团和其他取代基。在一些实施例中，2'-修饰是2'-MOE修饰(例如，参见Baker等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],1997,272,11944-12000)。在一些情况下，据报道，与未修饰的糖和一些其他经修饰的核苷(诸如2'-O-甲基，2'-O-丙基和2'-O-氨基丙基)相比，2'-MOE修饰具有改善的结合亲和力。还报道了具有2'-MOE修饰的寡核苷酸能够抑制基因表达，具有体内应用前景(参见，例如Martin,Helv.Chim.Acta[瑞士化学学报],1995,78,486-504；Altmann等人,Chimia[化学],1996,50,168-176；Altmann等人,Biochem.Soc.Trans.[生化学会会刊],1996,24,630-637；以及Altmann等人,NucleosidesNucleotides[核苷与核苷酸],1997,16,917-926；等等)。
在一些实施例中，2'-修饰的或2'-取代的糖或核苷是在糖的2'位包含除-H(通常不视为取代基)或-OH以外的取代基的糖或核苷。在一些实施例中，2'-修饰的糖是双环糖，该双环糖包含连接糖环的两个碳原子(其中一个是2'碳)的桥。在一些实施例中，2'-修饰是非桥联的，例如烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、任选地经取代的-O-烯丙基、任选地经取代的-O-C1-C10烷基、-OCF3、-O(CH2)2OCH3、2'-O(CH2)2SCH3、-O(CH2)2ON(Rm)(Rn)或-OCH2C(＝O)N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是-H或任选地经取代的C1-C10烷基。
某些经修饰的糖、其制备和用途在US 4981957、US 5118800、US 5319080、US5359044、US 5393878、US 5446137、US 5466786、US 5514785、US 5519134、US 5567811、US5576427、US 5591722、US 5597909、US 5610300、US 5627053、US 5639873、US 5646265、US5670633、US 5700920、US 5792847、US 6600032和WO 2005121371中描述。
在一些实施例中，糖是N-甲醇卡巴(N-methanocarba)、LNA、cMOE BNA、cEt BNA、α-L-LNA或相关类似物、HNA、Me-ANA、MOE-ANA、Ara-FHNA、FHNA、R-6'-Me-FHNA、S-6'-Me-FHNA、ENA或c-ANA。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是C3-酰胺(例如，具有与C3'连接的酰胺修饰的糖，Mutisya等人2014 Nucleic Acids Res.[核酸研究]2014年6月1日；42(10):6542-6551)，甲缩醛，硫代甲缩醛，MMI[例如，亚甲基(甲基亚氨基)，Peoc'h等人2006Nucleosides and Nucleotides[核苷与核苷酸]16(7-9)]，PMO(二氨基磷酸酯连接的吗啉代)键联(其连接两个糖)或PNA(肽核酸)键联。在一些实施例中，核苷酸间键联和/或糖的实例在以下文献中描述：Allerson等人.2005 J.Med.Chem.[医药化学杂志]48:901-4；BMCL[生物有机化学与医药化学通讯]2011 21:1122；BMCL[生物有机化学与医药化学通讯]201121:588；BMCL[生物有机化学与医药化学通讯]2012 22:296；Chattopadhyaya等人2007J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]129:8362；Chem.Bio.Chem.[有机化学杂志]201314:58；Curr.Prot.Nucl.Acids Chem.[核酸化学当前方案]2011 1.24.1；Egli等人2011J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]133:16642；Hendrix等人1997 Chem.Eur.J.[欧洲化学杂志]3:110；Hyrup等人1996Bioorg.Med.Chem.[生物有机化学与医药化学]4:5；Imanishi 1997 Tet.Lett.[有机快报]38:8735；J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]1994,116,3143；J.Med.Chem.[药物化学杂志]2009 52:10；J.Org.Chem.[有机化学杂志]2010 75:1589；Jepsen等人2004Oligo.[寡核苷酸]14:130-146；Jones等人J.Org.Chem.[有机化学杂志]1993,58,2983；Jung等人2014 ACIEE 53:9893；Kodama等人2014 AGDS；Koizumi 2003 BMC 11:2211；Koizumi等人2003 Nuc.Acids Res.[核酸研究]12:3267-3273；Koshkin等人1998 Tetrahedron[四面体]54:3607-3630；Kumar等人1998Bioo.Med.Chem.Let.[生物有机化学与医药化学快报]8:2219-2222；Lauritsen等人2002Chem.Comm.[化学通讯]5:530-531；Lauritsen等人2003 Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报]13:253-256；Lima等人2012 Cell[细胞]150:883-894；Mesmaeker等人Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.[应用化学英文国际版]1994,33,226；Migawa等人2013 Org.Lett.[有机快报]15:4316；Mol.Ther.[分子疗法]Nucl.Acids[分子疗法-核酸]2012 1:e47；Morita等人2001 Nucl.Acids Res.[核酸研究]增刊1:241-242；Morita等人2002 Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报]12:73-76；Morita等人2003Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报]2211-2226；Murray等人2012Nucl.Acids Res.[核酸研究]40:6135；Nielsen等人1997 Chem.Soc.Rev.[化学学会评论]73；Nielsen等人1997 J.Chem.Soc.[化学学会杂志]Perkins Transl.1:3423-3433；Obika等人1997 Tetrahedron Lett.[四面体快报]38(50):8735-8；Obika等人1998 TetrahedronLett.[四面体快报]39:5401-5404；Obika等人2008 J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]130:4886；Obika等人2011 Org.Lett.[有机快报]13:6050；Oestergaard等人2014 JOC 79:8877；Pallan等人2012 Biochem.[生物化学]51:7；Pallan等人2012 Chem.Comm.[化学通讯]48:8195-8197；Petersen等人2003 TRENDS Biotech.[生物技术趋势]21:74-81；Prakash等人2010 J.Med.Chem.[药物化学杂志]53:1636；Prakash等人2015 Nucl.AcidsRes.[核酸研究]43:2993-3011；Prakash等人2016 Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报]26:2817-2820；Rajwanshi等人1999 Chem.Commun.[化学通讯]1395-1396；Schultz等人1996 Nucleic Acids Res.[核酸研究]24:2966；Seth等人2008Nucl.Acid Sym.Ser.[核酸研讨会丛刊]52:553；Seth等人2009 J.Med.Chem.[药物化学杂志]52:10-13；Seth等人2010 J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]132:14942；Seth等人2010 J.Med.Chem.[药物化学杂志]53:8309-8318；Seth等人2010 J.Org.Chem.[有机化学杂志]75:1569-1581；Seth等人2011 BMCL[生物有机化学与医药化学通讯]21:4690；Seth等人201 2Bioo.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报]22:296-299；Seth等人2012Mol.Ther-Nuc.Acids.[分子疗法-核酸]1,e47；Seth等人,Nucleic Acids SymposiumSeries[核酸研讨会丛刊](2008),52(1),553-554；Singh等人1998 Chem.Comm.[化学通讯]1247-1248；Singh等人1998 J.Org.Chem.[有机化学杂志]63:10035-39；Singh等人1998J.Org.Chem.[有机化学杂志]63:6078-6079；Sorensen 2003 Chem.Comm.[化学通讯]2130-2131；Starrup等人2010 Nucl.Acids Res.[核酸研究]38:7100；Swayze等人2007Nucl.Acids Res.[核酸研究]35:687；Ts'o等人Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年刊]1988,507,220；Van Aerschot等人1995 Angew.Chem.Int.Ed.Engl.[应用化学英文国际版]34:1338；Vasseur等人J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]1992,114,4006；WO2007090071；WO 2016079181；US 6326199；US 6066500；或US 6440739。
在一些实施例中，寡核苷酸或其部分(例如，结构域、子结构域等)包含高水平的2'-F修饰的糖，例如，寡核苷酸或其部分(例如，结构域、子结构域等)中约10％-100％(例如，约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多，或约100％)的糖包含2'-F。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分中约50％或更多的糖包含2'-F。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分中约60％或更多的糖包含2'-F。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分中约70％或更多的糖包含2'-F。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分中约80％或更多的糖包含2'-F。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分中约90％或更多的糖包含2'-F。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分还包含一个或多个不含2'-F的糖(例如，不含修饰的糖和/或包含其他修饰的糖)。
在一些实施例中，寡核苷酸或其部分(例如，结构域、子结构域等)中不超过约1％-95％(例如，不超过约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％等)的糖包含2'-MOE。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分中不超过约50％的糖包含2'-MOE。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分中没有糖包含2'-MOE。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分中不超过1、2、3、4或5个糖包含2'-MOE。
可用于制备寡核苷酸或其类似物的多种另外的糖是本领域已知的，并且可以根据本披露使用。
核苷酸间键联
在一些实施例中，寡核苷酸包含碱基修饰、糖修饰和/或核苷酸间键联修饰。根据本披露，可以利用多种核苷酸间键联来连接包含核碱基的单元，例如核苷。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷酸间键联和一个或多个天然磷酸酯键联两者。如本领域技术人员所公知的，天然磷酸酯键联广泛存在于天然DNA和RNA分子中；它们具有-OP(O)(OH)O-的结构，连接DNA和RNA的核苷中的糖，并且可呈多种盐形式，例如在生理pH值(约7.4)下，天然磷酸酯键联主要是以具有-OP(O)(O-)O-阴离子的盐形式存在。经修饰的核苷酸间键联或非天然磷酸酯键联是不为天然磷酸酯键联或其盐形式的核苷酸间键联。经修饰的核苷酸间键联取决于它们的结构也可以呈其盐形式。例如，如本领域技术人员所理解的，具有-OP(O)(SH)O-的结构的硫代磷酸酯核苷酸间键联可以呈多种盐形式，例如在生理pH下(约7.4)，其中阴离子是-OP(O)(S-)O-。
在一些实施例中，寡核苷酸包含核苷酸间键联，该核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸盐、3'-硫代磷酸盐或5'-硫代磷酸盐。
在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是包含手性键联磷的手性核苷酸间键联。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是硫代磷酸酯键联。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，手性核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，手性核苷酸间键联就其手性键联磷而言是手性控制的。在一些实施例中，手性核苷酸间键联就其手性键联磷而言是立体化学纯的。在一些实施例中，手性核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，骨架手性中心模式包含以下或由以下组成：手性控制的核苷酸间键联(Rp或Sp)的位置和键联磷构型以及非手性核苷酸间键联(例如，天然磷酸酯键联)的位置。
在一些实施例中，核苷酸间键联包含P-修饰，其中P-修饰是键联磷处的修饰。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是不含磷但用于例如在肽核酸(PNA)中连接两个糖或两个各自独立地包含核碱基的部分的部分。
在一些实施例中，寡核苷酸包含经修饰的核苷酸间键联，例如本文和/或在以下文献中描述的具有式I、I-a、I-b或I-c的结构的那些：WO 2018/022473、WO 2018/098264、WO2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的核苷酸间键联(例如，具有式I、I-a、I-b、I-c等的那些)独立地通过援引并入本文。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是手性核苷酸间键联。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。
在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是带正电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个中性核苷酸间键联的寡核苷酸。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等或其盐形式的结构，如本文和/或以下文献中所述：US 9394333、US 9744183、US9605019、US 9982257、US 20170037399、US 20180216108、US 20180216107、US 9598458、WO2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO2018/098264、WO 2018/022473、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/032612、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的不带负电荷的核苷酸间键联(例如，具有式I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等的那些或其合适的盐形式)独立地通过援引并入本文。
在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联可以改善递送和/或活性(例如，腺苷编辑活性)。
在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联(例如，不带负电荷的核苷酸间键联)包含任选地经取代的三唑基。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联(例如，不带负电荷的核苷酸间键联)包含任选地经取代的炔基。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含三唑或炔烃部分。在一些实施例中，三唑部分(例如，三唑基)是任选地经取代的。在一些实施例中，三唑部分(例如，三唑基)是经取代的。在一些实施例中，三唑部分是未取代的。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含任选地经取代的环状胍部分。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003371
的结构并且任选地是手性控制的，其中R1是-L-R'，其中L是如本文所述的LB，并且R'如本文所述。在一些实施例中，每个R1独立地是R'。在一些实施例中，每个R'独立地是R。在一些实施例中，两个R1是R并且合在一起形成如本文所述的环。在一些实施例中，两个不同氮原子上的两个R1是R并且合在一起形成如本文所述的环。在一些实施例中，R1独立地是如本文所述的任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，R1是甲基。在一些实施例中，同一氮原子上的两个R'是R并且合在一起形成如本文所述的环。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003381
的结构并且任选地是手性控制的。在一些实施例中，
Figure BDA0003580200980003382
是
Figure BDA0003580200980003383
在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含任选地经取代的环状胍部分，并且具有以下结构：
Figure BDA0003580200980003384
或
Figure BDA0003580200980003385
其中W是O或S。在一些实施例中，W是O。在一些实施例中，W是S。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是立体化学控制的。
在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联是包含三唑部分的核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联或不带负电荷的核苷酸间键联包含任选地经取代的三唑基。在一些实施例中，包含三唑部分(例如，任选地经取代的三唑基)的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003386
的结构。在一些实施例中，包含三唑部分的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003387
的结构。在一些实施例中，包含三唑部分的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003388
的式，其中W是O或S。在一些实施例中，包含炔烃部分(例如，任选地经取代的炔基)的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003389
的式，其中W是O或S。在一些实施例中，核苷酸间键联(例如，不带负电荷的核苷酸间键联、中性核苷酸间键联)包含环状胍部分。在一些实施例中，包含环状胍部分的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003391
的结构。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联是或包含选自以下的结构：
Figure BDA0003580200980003392
Figure BDA0003580200980003393
或
Figure BDA0003580200980003394
其中W是O或S。
在一些实施例中，核苷酸间键联包含Tmg基团
Figure BDA0003580200980003395
在一些实施例中，核苷酸间键联包含Tmg基团并具有
Figure BDA0003580200980003396
的结构(“Tmg核苷酸间键联”)。在一些实施例中，中性核苷酸间键联包括PNA和PMO的核苷酸间键联以及Tmg核苷酸间键联。
在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2等或其盐形式的结构。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的3-20元杂环基或杂芳基。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的3-20元杂环基或杂芳基，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，这种杂环基或杂芳基具有5元环。在一些实施例中，这种杂环基或杂芳基具有6元环。
在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元杂芳基。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元杂芳基，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-4个杂原子的任选地经取代的5-6元杂芳基，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-4个杂原子的任选地经取代的5元杂芳基，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，杂芳基直接键合到键联磷。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含任选地经取代的三唑基。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含未取代的三唑基，例如，
Figure BDA0003580200980003401
在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含经取代的三唑基，例如，
Figure BDA0003580200980003402
在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元杂环基。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-10个杂原子的任选地经取代的5-20元杂环基，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-4个杂原子的任选地经取代的5-6元杂环基，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含具有1-4个杂原子的任选地经取代的5元杂环基，其中至少一个杂原子是氮。在一些实施例中，至少两个杂原子是氮。在一些实施例中，杂环基直接键合到键联磷。在一些实施例中，当杂环基是经由其＝N-直接与键联磷键合的胍部分的一部分时，该杂环基经由接头(例如，＝N-)与键联磷键合。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含任选地经取代的
Figure BDA0003580200980003403
基团。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含经取代的
Figure BDA0003580200980003404
基团。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含
Figure BDA0003580200980003405
基团，其中每个R1独立地是-L-R。在一些实施例中，每个R1独立地是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，每个R1独立地是甲基。
在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联(例如，不带负电荷的核苷酸间键联)包含三唑或炔烃部分，其各自是任选地经取代的。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含三唑部分。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含未取代的三唑部分。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含经取代的三唑部分。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含烷基部分。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含任选地经取代的炔基。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含未取代的炔基。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联包含经取代的炔基。在一些实施例中，炔基直接键合到键联磷。
在一些实施例中，寡核苷酸包含不同类型的核苷酸间磷键联。在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少一个经修饰的(非天然)核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少一个硫代磷酸酯。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个天然磷酸酯键联和至少一个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联和至少一个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联、至少一个天然磷酸酯键联和至少一个不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个(例如，1-50、1-40、1-30、1-20、1-15、1-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是不带负电的，因为在给定pH下在水溶液中，少于50％、40％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的核苷酸间键联以带负电的盐形式存在。在一些实施例中，pH为约pH 7.4。在一些实施例中，pH为约4-9。在一些实施例中，百分比小于10％。在一些实施例中，百分比小于5％。在一些实施例中，百分比小于1％。在一些实施例中，核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联，因为核苷酸间键联的中性形式于水中不具有不超过约1、2、3、4、5、6或7的pKa。在一些实施例中，没有pKa为7或更小。在一些实施例中，没有pKa为6或更小。在一些实施例中，没有pKa为5或更小。在一些实施例中，没有pKa为4或更小。在一些实施例中，没有pKa为3或更小。在一些实施例中，没有pKa为2或更小。在一些实施例中，没有pKa为1或更小。在一些实施例中，核苷酸间键联的中性形式的pKa可表示为具有结构CH3-核苷酸间键联-CH3的化合物的中性形式的pKa。例如，具有式I的结构的核苷酸间键联的中性形式的pKa可由具有
Figure BDA0003580200980003411
的结构的化合物的中性形式的pKa表示(其中X、Y、Z各自独立地是-O-、-S-、-N(R')-；L是LB，并且R1是-L-R')，
Figure BDA0003580200980003421
的pKa可以由
Figure BDA0003580200980003422
的pKa表示。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是带正电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含胍部分。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含杂芳基碱基部分。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含三唑部分。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联包含炔基部分。
在一些实施例中，中性或不带负电荷的核苷酸间键联具有以下任一文献中描述的任何中性或不带负电荷的核苷酸间键联的结构：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US9982257、US 20170037399、US 20180216108、US 20180216107、US 9598458、WO 2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/022473、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/032612、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612、和/或WO 2020/191252,2607、WO 2019032612、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的每个中性或不带负电荷的核苷酸间键联特此通过援引并入。
在一些实施例中，每个R'独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，各R'独立地是任选地经取代的C1-6烷基。在一些实施例中，每个R'独立地是-CH3。在一些实施例中，各Rs是-H。
在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003423
的结构。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003431
的结构。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003432
的结构。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003433
的结构。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003434
的结构。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003435
的结构。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003436
的结构。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003437
的结构。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003438
的结构。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003439
的结构。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BDA00035802009800034310
的结构。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联具有
Figure BDA00035802009800034311
的结构。在一些实施例中，W是O。在一些实施例中，W是S。在一些实施例中，中性核苷酸间键联是上述不带负电荷的核苷酸间键联。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含1个或多个具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1或II-d-2的核苷酸间键联，其在以下文献中描述：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US9982257、US 20170037399、US 20180216108、US 20180216107、US 9598458、WO 2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/022473、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/032612、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032607、WO 2019032612、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252(式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1或II-d-2或其盐形式)，其各自独立地通过援引并入本文。
在一些实施例中，寡核苷酸包含中性核苷酸间键联和手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含中性核苷酸间键联和不是中性核苷酸间键联的手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含中性核苷酸间键联和手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联和一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键联的寡核苷酸，其中该寡核苷酸中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个中性核苷酸间键联和一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键联的寡核苷酸，其中该寡核苷酸中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，中性核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，中性核苷酸间键联不是手性控制的。
不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，中性核苷酸间键联可以比硫代磷酸酯核苷酸间键联(PS)更具疏水性，而硫代磷酸酯核苷酸间键联可以比天然磷酸酯键联(PO)更具疏水性。通常，不同于PS或PO，中性核苷酸间键联具有更少的电荷。不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，将一个或多个中性核苷酸间键联并入寡核苷酸中可以增加寡核苷酸被细胞摄取和/或从内体逃脱的能力。不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，将一个或多个中性核苷酸间键联并入可用于调节在寡核苷酸与其靶核酸之间形成的双链体的解链温度。
不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，将一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联(例如，中性核苷酸间键联)并入寡核苷酸中可能能够增加寡核苷酸介导诸如靶腺苷编辑的功能的能力。
如本领域技术人员所理解的，核苷酸间键联诸如天然磷酸酯键联和具有式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2的那些或其盐形式通常连接两个核苷(其可以是天然的或经修饰的)，如以下文献中所述：US 9394333、US 9744183、US 9605019、US 9982257、US 20170037399、US20180216108、US 20180216107、US 9598458、WO 2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/022473、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO2019032612、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO2019/032612和/或WO 2020/191252(式I、I-a、I-b、I-c、I-n-1、I-n-2、I-n-3、I-n-4、II、II-a-1、II-a-2、II-b-1、II-b-2、II-c-1、II-c-2、II-d-1、II-d-2或其盐形式)，其各自独立地通过援引并入本文。如天然DNA和RNA中的典型连接是核苷酸间键联与两个糖(其可以是未修饰的或如本文所述的经修饰的)形成键。在许多实施例中，如本文所例示的，核苷酸间键联通过其氧原子或杂原子(例如，在各式中的Y和Z)与在其5'碳处的一个任选地经修饰的核糖或脱氧核糖和在其3'碳处的另一个任选地经修饰的核糖或脱氧核糖形成键。在一些实施例中，通过核苷酸间键联连接的每个核苷单元独立地包含独立地是任选地经取代的A、T、C、G或U或A、T、C、G或U的经取代的互变异构体的核碱基，或包含具有至少一个氮原子的任选地经取代的杂环基和/或杂芳基环的核碱基。
如本领域技术人员所理解的，根据本披露，可以利用许多其他类型的核苷酸间键联，例如，在以下文献中描述的那些：美国专利号3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,177,195、5,023,243、5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,188,897、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,423、5,264,564、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,938、5,405,939、5,434,257、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,466,677、5,470,967、5,476,925、5,489,677、5,519,126、5,536,821、5,541,307、5,541,316、5,550,111、5,561,225、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,596,086、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,625,050、5,633,360、5,64,562、5,663,312、5,677,437、5,677,439、6,160,109、6,239,265、6,028,188、6,124,445、6,169,170、6,172,209、6,277,603、6,326,199、6,346,614、6,444,423、6,531,590、6,534,639、6,608,035、6,683,167、6,858,715、6,867,294、6,878,805、7,015,315、7,041,816、7,273,933、7,321,029或RE39464。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联是在以下文献中描述的经修饰的核苷酸间键联：US 9982257、US 20170037399、US 20180216108、WO 2017192664、WO 2017015575、WO2017062862、WO 2018067973、WO 2017160741、WO 2017192679、WO 2017210647、WO2018098264、PCT/US18/35687、PCT/US18/38835或PCT/US18/51398，其各自的核碱基、糖、核苷酸间键联、手性助剂/试剂以及寡核苷酸合成技术(试剂、条件、循环等)独立地通过援引并入本文。
在一些实施例中，寡核苷酸中的每个核苷酸间键联独立地选自天然磷酸酯键联、硫代磷酸酯键联和不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)。在一些实施例中，寡核苷酸中的每个核苷酸间键联独立地选自天然磷酸酯键联、硫代磷酸酯键联和中性核苷酸间键联(例如，n001)。
在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个核苷酸，这些核苷酸独立地包含在某些条件下易于“自行释放”的磷修饰。即，在某些条件下，设计特定的磷修饰，以使其从寡核苷酸自切割以提供例如天然磷酸酯键联。在一些实施例中，这样的磷修饰具有-O-L-R1的结构，其中L是如本文所述的LB，并且R1是如本文所述的R'。在一些实施例中，磷修饰具有-S-L-R1的结构，其中L和R1各自独立地如本披露中所述。此类磷修饰基团的某些实例可以在US9982257中找到。在一些实施例中，自行释放基团包含吗啉基。在一些实施例中，自行释放基团的特征在于将试剂递送至核苷酸间磷接头的能力，该试剂有助于进一步修饰磷原子，例如脱硫。在一些实施例中，该试剂是水，并且进一步的修饰是水解以形成天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个核苷酸间键联，其改善寡核苷酸的一种或多种药物特性和/或活性。在本领域充分记载，某些寡核苷酸被核酸酶迅速降解，并且表现出较差的通过细胞质细胞膜发生的细胞摄取(Poijarvi-Virta等人,Curr.Med.Chem.[当代药物化学](2006),13(28)；3441-65；Wagner等人,Med.Res.Rev.[医学研究评论](2000),20(6):417-51；Peyrottes等人,Mini Rev.Med.Chem.[药物化学短评](2004),4(4):395-408；Gosselin等人,(1996),43(1):196-208；Bologna等人,(2002),Antisense&Nucleic Acid Drug Development[反义和核酸药物开发]12:33-41)。Vives等人(NucleicAcids Research[核酸研究](1999),27(20):4071-76)报道，在某些条件下，叔丁基SATE原寡核苷酸(pro-oligonucleotide)相比于母体寡核苷酸表现出明显增加的细胞渗透。
寡核苷酸可以包含多种天然磷酸酯键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸的5％或更多的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸的10％或更多的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸的15％或更多的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸的20％或更多的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸的25％或更多的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸的30％或更多的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸的35％或更多的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸的40％或更多的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含4、5、6、7、8、9、10个或更多个天然磷酸酯键联。在一些实施例中，天然磷酸酯键联的数目为2。在一些实施例中，天然磷酸酯键联的数目为3。在一些实施例中，天然磷酸酯键联的数目为4。在一些实施例中，天然磷酸酯键联的数目为5。在一些实施例中，天然磷酸酯键联的数目为6。在一些实施例中，天然磷酸酯键联的数目为7。在一些实施例中，天然磷酸酯键联的数目为8。在一些实施例中，一些或全部天然磷酸酯键联是连续的。
在一些实施例中，本披露展示，在至少一些情况下，尤其是在5'-末端和/或3'-末端的Sp核苷酸间键联可以改善寡核苷酸稳定性。在一些实施例中，本披露展示，尤其是，天然磷酸酯键联和/或Rp核苷酸间键联可以改善寡核苷酸从系统中移除。如本领域普通技术人员所理解的，根据本披露，可以利用本领域已知的多种测定法来评估此类特性。
在一些实施例中，寡核苷酸或其部分(例如，结构域、子结构域等)中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性控制的。在一些实施例中，每个独立地是Sp或Rp。在一些实施例中，高水平是如本文所述的Sp。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分中的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，一个或多个，例如约1-5个(例如，约1、2、3、4或5个)是Rp。
在一些实施例中，如在某些实例中所展示的，寡核苷酸或其部分包含一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联，其各自任选地并且独立地是手性控制的。在一些实施例中，每个不带负电荷的核苷酸间键联独立地是n001。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，每个手性不带负电荷的核苷酸间键联都不是手性控制的。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Rp。在一些实施例中，手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，每个手性不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分中不带负电荷的核苷酸间键联的数目为约1-10，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施例中，其为约1。在一些实施例中，其为约2。在一些实施例中，其为约3。在一些实施例中，其为约4。在一些实施例中，其为约5。在一些实施例中，其为约6。在一些实施例中，其为约7。在一些实施例中，其为约8。在一些实施例中，其为约9。在一些实施例中，其为约10。在一些实施例中，两个或更多个不带负电荷的核苷酸间键联是连续的。在一些实施例中，没有两个不带负电荷的核苷酸间键联是连续的。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分中的所有不带负电荷的核苷酸间键联都是连续的(例如，3个连续的不带负电荷的核苷酸间键联)。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联，或两个或更多个(例如，约2个、约3个、约4个等)连续的不带负电荷的核苷酸间键联在寡核苷酸或其部分的3'-末端。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分的最后两个或三个或四个核苷酸间键联包含至少一个不是不带负电荷的核苷酸间键联的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分的最后两个或三个或四个核苷酸间键联包含至少一个不是n001的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接寡核苷酸或其部分的前两个核苷的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接寡核苷酸或其部分的最后两个核苷的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，连接寡核苷酸或其部分的前两个核苷的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，其是Sp。在一些实施例中，连接寡核苷酸或其部分的最后两个核苷的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，其是Sp。
在一些实施例中，一个或多个手性核苷酸间键联是手性控制的，并且一个或多个手性核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性控制的，并且一个或多个不带负电荷的核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，每个硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地是手性控制的，并且每个不带负电荷的核苷酸间键联不是手性控制的。在一些实施例中，寡核苷酸的前两个核苷之间的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，最后两个核苷之间的核苷酸间键联各自独立地是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，两者独立地是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个另外的核苷酸间键联，例如，其中一个位于相对于与靶核苷(例如，靶腺苷)相反的核苷的位置-1和-2处的核苷之间(两个核苷紧邻与靶核苷相反的核苷的3'(例如，在…N0N-1N-2…中，N0是与靶核苷相反的核苷，N-1和N-2分别在位置-1和-2处)。在一些实施例中，每个不带负电荷的核苷酸间键联独立地是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，每个不带负电荷的核苷酸间键联独立地是n001。
如本文所展示，在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联诸如n001可以提供改善的特性和/或活性。在一些实施例中，在寡核苷酸中，各自独立地键合到包含如本文所述的核碱基的两个核苷的5'-末端核苷酸间键联和/或3'-末端核苷酸间键联是如本文所述的不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，前一个或多个(例如，前1、2和/或3个)和/或最后一个或多个(例如，最后1、2、3、4、5、6或7个)核苷酸间键联(其各自独立地键合到第一结构域中的两个核苷)独立地是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，第一结构域的第一核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，键合到第一结构域的两个核苷的最后一个核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，第二结构域的最后一个核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，第二结构域中间的一个或多个核苷酸间键联(例如，第4、第5和第6核苷酸间键联中的一个或多个，其各自独立地键合到第二结构域的两个核苷)独立地是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，键合到第二结构域的两个核苷的第11个核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，不键合到与靶核苷相反的核苷但键合到其3'紧邻核苷的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是n001。在一些实施例中，每个不带负电荷的核苷酸间键联是n001。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是立体随机的。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Rp。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。在一些实施例中，每个不带负电荷的核苷酸间键联独立地是手性控制的。在一些实施例中，第一结构域的一个或多个核苷酸间键联(例如，第4、第5、第6、第7和第8核苷酸间键联中的一个或多个，其各自独立地键合到第一结构域的两个核苷)独立地不是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，第二结构域的一个或多个核苷酸间键联(例如，第1、第2、第3、第7、第8、第9、第12和第13核苷酸间键联中的一个或多个，其各自独立地键合到第一结构域的两个核苷)独立地不是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，第二结构域的第2和第3核苷酸间键联中的一个或两个不是不带负电荷的核苷酸间键联。在一些实施例中，不是不带负电荷的核苷酸间键联的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，其是立体随机硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，其是Rp手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，其是Sp手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联。
在一些实施例中，组合物中控制水平的寡核苷酸是所需的寡核苷酸。在一些实施例中，在组合物中的共享共同碱基序列(例如，用于某目的的所需序列)的所有寡核苷酸中，或在组合物中的所有寡核苷酸中，所需寡核苷酸(其可以以多种形式(例如，盐形式)存在并且通常仅在非手性控制的核苷酸间键联处不同(对于该目的，相同立体异构体的各种形式可被认为是相同的))的水平为约5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80-100％、90-100％、95-100％、50％-90％，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，或至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，水平为至少约50％。在一些实施例中，水平为至少约60％。在一些实施例中，水平为至少约70％。在一些实施例中，水平为至少约75％。在一些实施例中，水平为至少约80％。在一些实施例中，水平为至少约85％。在一些实施例中，水平为至少约90％。在一些实施例中，水平为或至少为(DS)nc，其中DS为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％，并且nc为如本披露所述的手性控制的核苷酸间键联的数目(例如，1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个)。在一些实施例中，水平为或至少为(DS)nc，其中DS为95％-100％。
多种类型的核苷酸间键联可以与其他结构元件例如糖组合使用，以实现所需的寡核苷酸特性和/或活性。例如，本披露在设计寡核苷酸时通常利用经修饰的核苷酸间键联和经修饰的糖，任选地具有天然磷酸酯键联和天然糖。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个经修饰的糖的寡核苷酸。在一些实施例中，本披露提供了包含一个或多个经修饰的糖和一个或多个经修饰的核苷酸间键联的寡核苷酸，其中一个或多个是天然磷酸酯键联。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含多个天然RNA糖(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个，它们中的两个或更多个或全部任选地是连续的)。在一些实施例中，此类寡核苷酸包含经修饰的糖，例如2'-OR修饰的糖，其中R在一端或两端不是-H(例如，2-OMe、2-MOE等)，和/或多种经修饰的核苷酸间键联(例如，硫代磷酸酯核苷酸间键联、不带负电荷的核苷酸间键联等)。在一些实施例中，在5'-末端存在一个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个以上这样的2'-OR修饰的糖，其中R不是-H。在一些实施例中，在3'-末端存在一个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个以上这样的2'-OR修饰的糖，其中R不是-H。在一些实施例中，每个2'-修饰的糖独立地是2'-OR修饰的糖，其中R不是-H。在一些实施例中，如本文所述，2'-OR是2'-OMe。在一些实施例中，2'-OR是2'-MOE。在一些实施例中，2'-OR中的每一个独立地是2'-OMe或2'-MOE。在一些实施例中，每个2'-OR是2'-OMe。
另外的化学部分
在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个另外的化学部分。多种另外的化学部分，例如靶向部分、碳水化合物部分、脂质部分等是本领域已知的并且可以根据本披露内容用于调节所提供的寡核苷酸的特性和/或活性，例如稳定性、半衰期、活性、递送、药效动力学特性、药代动力学特性等。在一些实施例中，某些另外的化学部分促进将寡核苷酸递送至所需的细胞、组织和/或器官，包括但不限于中枢神经系统的细胞。在一些实施例中，某些另外的化学部分促进寡核苷酸的内化。在一些实施例中，某些另外的化学部分提高寡核苷酸稳定性。在一些实施例中，本披露提供用于将多种另外的化学部分并入寡核苷酸中的技术。
在一些实施例中，与参考寡核苷酸例如不具有另外的化学部分但在其他方面相同的参考寡核苷酸相比，包含另外的化学部分的寡核苷酸表现出增加的向组织中的递送和/或在组织中的活性。
在一些实施例中，另外的化学部分的非限制性实例包括碳水化合物部分、靶向部分等，其在并入寡核苷酸中时可以改善一种或多种特性。在一些实施例中，另外的化学部分选自：葡萄糖、GluNAc(N-乙酰葡糖胺)及茴香酰胺部分。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸可一包含两个或更多个另外的化学部分，其中这些另外的化学部分是相同或不相同的，或属于同一类别(例如，碳水化合物部分、糖部分、靶向部分等)或不属于同一类别。
在一些实施例中，另外的化学部分是靶向部分。在一些实施例中，另外的化学部分是或包含碳水化合物部分。在一些实施例中，另外的化学部分是或包含脂质部分。在一些实施例中，另外的化学部分是或包含例如细胞受体(诸如σ受体、脱唾液酸糖蛋白受体等)的配体部分。在一些实施例中，配体部分是或包含茴香酰胺部分，其可是σ受体的配体部分。在一些实施例中，配体部分是或包含GalNAc部分，其可以是脱唾液酸糖蛋白受体的配体部分。在一些实施例中，另外的化学部分促进向肝的递送。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸可以包含一个或多个接头和另外的化学部分(例如，靶向部分)，和/或可以是手性控制的或不是手性控制的，和/或具有如本文所述的碱基序列和/或一个或多个修饰和/或形式。
根据本披露可使用多种接头、碳水化合物部分和靶向部分(包括本领域中已知的许多者)。在一些实施例中，碳水化合物部分是靶向部分。在一些实施例中，靶向部分是碳水化合物部分。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含适合递送的另外的化学部分，例如葡萄糖、GluNAc(N-乙酰基胺葡糖胺)、茴香胺或选自以下的结构：
Figure BDA0003580200980003531
Figure BDA0003580200980003541
Figure BDA0003580200980003542
和
Figure BDA0003580200980003543
在一些实施例中，n是1。在一些实施例中，n是2。在一些实施例中，n是3。在一些实施例中，n是4。在一些实施例中，n是5。在一些实施例中，n是6。在一些实施例中，n是7。在一些实施例中，n是8。
在一些实施例中，另外的化学部分是实例(包括并入多种寡核苷酸中的多种另外的化学部分的实例)中描述的任何化学部分。
在一些实施例中，与寡核苷酸缀合的另外的化学部分能够将寡核苷酸靶向中枢神经系统中的细胞。
在一些实施例中，另外的化学部分包含或是细胞受体配体。在一些实施例中，另外的化学部分包含或是蛋白结合剂，例如，与细胞表面蛋白结合的蛋白结合剂。这些部分尤其可用于将寡核苷酸靶向递送至表达相应受体或蛋白的细胞。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸的另外的化学部分包含茴香酰胺或其衍生物或类似物，并且能够使寡核苷酸靶向表达特定受体(诸如σ1受体)的细胞。
在一些实施例中，对所提供的寡核苷酸进行配制以施用至表达其靶的身体细胞和/或组织。在一些实施例中，与寡核苷酸缀合的另外的化学部分能够将寡核苷酸靶向细胞。
在一些实施例中，另外的化学部分选自任选地经取代的苯基、
Figure BDA0003580200980003551
Figure BDA0003580200980003552
和
Figure BDA0003580200980003553
其中n'是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，并且每个其他变量如本披露中所述。在一些实施例中，Rs是F。在一些实施例中，Rs是OMe。在一些实施例中，Rs是OH。在一些实施例中，Rs是NHAc。在一些实施例中，Rs是NHCOCF3。在一些实施例中，R'是H。在一些实施例中，R是H。在一些实施例中，R2s是NHAc，并且R5s是OH。在一些实施例中，R2s是对茴香酰基，并且R5s是OH。在一些实施例中，R2s是NHAc，并且R5s是对茴香酰基。在一些实施例中，R2s是OH，并且R5s是对茴香酰基。在一些实施例中，另外的化学部分选自
Figure BDA0003580200980003554
Figure BDA0003580200980003555
Figure BDA0003580200980003561
Figure BDA0003580200980003562
和
Figure BDA0003580200980003563
在一些实施例中，n'是1。在一些实施例中，n'是0。在一些实施例中，n”是1。在一些实施例中，n”是2。
在一些实施例中，另外的化学部分是或包含脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)配体。
不希望受任何特定理论的束缚，本披露指出，还已经报道了ASGPR1在小鼠的海马区和/或小脑浦肯野细胞层中表达。http://mouse.brain-map.org/experiment/show/2048
多种其他ASGPR配体是本领域已知的，并且可以根据本披露使用。在一些实施例中，ASGPR配体是碳水化合物。在一些实施例中，ASGPR配体是GalNac或其衍生物或类似物。在一些实施例中，ASGPR配体是Sanhueza等人.J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志],2017,139(9),第3528-3536页中描述的ASGPR配体。在一些实施例中，ASGPR配体是Mamidyala等人.J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志],2012,134,第1978-1981页中描述的ASGPR配体。在一些实施例中，ASGPR配体是US 20160207953中描述的ASGPR配体。在一些实施例中，ASGPR配体是例如在US 20160207953中披露的经取代的6,8-二氧杂双环[3.2.1]辛烷-2,3-二醇衍生物。在一些实施例中，ASGPR配体是例如在US 20150329555中描述的ASGPR配体。在一些实施例中，ASGPR配体是例如在US 20150329555中披露的经取代的6,8-二氧杂双环[3.2.1]辛烷-2,3-二醇衍生物。在一些实施例中，ASGPR配体是在US 8877917、US20160376585、US 10086081或US 8106022中描述的ASGPR配体。这些文献中描述的ASGPR配体通过援引并入本文。本领域技术人员将理解，包括本文件中描述的那些技术在内的多种技术是已知的，用于评估化学部分与ASGPR的结合，并且可以根据本披露来利用。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸与ASGPR配体缀合。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含ASGPR配体。在一些实施例中，另外的化学部分包含ASGPR配体，该ASGPR配体是
Figure BDA0003580200980003571
Figure BDA0003580200980003572
或
Figure BDA0003580200980003573
其中各变量独立地如本披露中所描述。在一些实施例中，R是-H。在一些实施例中，R'是-C(O)R。
在一些实施例中，另外的化学部分是或包含
Figure BDA0003580200980003574
在一些实施例中，另外的化学部分是或包含
Figure BDA0003580200980003575
在一些实施例中，另外的化学部分是或包含
Figure BDA0003580200980003576
在一些实施例中，另外的化学部分是或包含
Figure BDA0003580200980003577
在一些实施例中，另外的化学部分是或包含任选地经取代的
Figure BDA0003580200980003578
在一些实施例中，另外的化学部分是或包含
Figure BDA0003580200980003579
在一些实施例中，另外的化学部分是或包含
Figure BDA00035802009800035710
在一些实施例中，另外的化学部分是或包含
Figure BDA0003580200980003581
在一些实施例中，另外的化学部分是或包含
Figure BDA0003580200980003582
在一些实施例中，另外的化学部分包含一个或多个可以与例如寡核苷酸靶细胞结合的部分。例如，在一些实施例中，另外的化学部分包含一个或多个蛋白配体部分，例如，在一些实施例中，另外的化学部分包含多个部分，其中每个独立地是ASGPR配体。在一些实施例中，如在Mod 001和Mod083中，另外的化学部分包含三个这样的配体。
Mod001：
Figure BDA0003580200980003583
Mod083：
Figure BDA0003580200980003584
在一些实施例中，寡核苷酸包含
Figure BDA0003580200980003591
其中每个变量独立地如本文所述。在一些实施例中，每个-OR'是-OAc，并且-N(R')2是-NHAc。在一些实施例中，寡核苷酸包含
Figure BDA0003580200980003592
在一些实施例中，每个R'是-H。在一些实施例中，每个-OR'是-OH，并且每个-N(R')2是-NHC(O)R。在一些实施例中，每个-OR'是-OH，并且每个-N(R')2是-NHAc。在一些实施例中，寡核苷酸包含
Figure BDA0003580200980003593
(L025)。在一些实施例中，-CH2-连接位点用作糖中的C5连接位点。在一些实施例中，环上的连接位点用作糖中的C3连接位点。此类部分可以利用例如亚磷酰胺诸如
Figure BDA0003580200980003594
(例如，
Figure BDA0003580200980003595
)引入(本领域技术人员理解，可以替代性地利用一个或多个其他基团，诸如用于-OH、-NH2-、-N(i-Pr)2、-OCH2CH2CN等的保护基，并且保护基可以在多种合适的条件下移除，有时在寡核苷酸脱保护和/或切割步骤期间移除)。在一些实施例中，寡核苷酸包含2个、3个或更多个(例如，3个且不多于3个)
Figure BDA0003580200980003601
在一些实施例中，寡核苷酸包含2个、3个或更多个(例如，3个且不多于3个)
Figure BDA0003580200980003602
在一些实施例中，此类部分的拷贝通过如本文所述的核苷酸间键联(例如，天然磷酸酯键联)连接。在一些实施例中，当在5'-末端时，-CH2-连接位点键合到-OH。在一些实施例中，寡核苷酸包含
Figure BDA0003580200980003603
在一些实施例中，每个-OR'是-OAc，并且-N(R')2是-NHAc。在一些实施例中，寡核苷酸包含
Figure BDA0003580200980003604
尤其是，
Figure BDA0003580200980003611
可用于以相当的和/或更好的活性和/或特性引入
Figure BDA0003580200980003612
在一些实施例中，对于相同数量的
Figure BDA0003580200980003613
其提供改善的制备效率和/或较低的成本(例如，当与Mod001相比时)。
在一些实施例中，另外的化学部分是本文例如在表1中描述的Mod基团。
在一些实施例中，另外的化学部分是Mod001。在一些实施例中，另外的化学部分是Mod083。在一些实施例中，另外的化学部分(例如，Mod基团)直接缀合(例如，没有接头)到寡核苷酸的其余部分。在一些实施例中，经由接头将另外的化学部分缀合到寡核苷酸的其余部分。在一些实施例中，另外的化学部分(例如，Mod基团)可以直接连接和/或经由接头连接到寡核苷酸的核碱基、糖和/或核苷酸间键联。在一些实施例中，Mod基团直接或经由接头连接到糖。在一些实施例中，Mod基团直接或经由接头连接到5'-末端糖。在一些实施例中，Mod基团通过5'碳直接或经由接头连接到5'-末端糖。有关实例，参见表1中的各种寡核苷酸。在一些实施例中，Mod基团直接或经由接头连接到3'-末端糖。在一些实施例中，Mod基团通过3'碳直接或经由接头连接到3'-末端糖。在一些实施例中，Mod基团直接或经由接头连接到核碱基。在一些实施例中，Mod基团直接或经由接头连接到核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含通过L001连接到寡核苷酸链的5'-末端的Mod001。
如本领域技术人员所理解的，另外的化学部分可以在多种位置连接到寡核苷酸链，例如5'-末端、3'-末端或中间位置(例如，在糖、碱基、核苷酸间键联等上)。在一些实施例中，其连接在5'-末端。在一些实施例中，其连接在3'-末端。在一些实施例中，其连接在中间的核苷酸处。
某些另外的化学部分(例如，脂质部分、靶向部分、碳水化合物部分)，包括但不限于Mod012、Mod039、Mod062、Mod085、Mod086和Mod094，以及用于将另外的化学部分连接到寡核苷酸链的多种接头，包括但不限于L001、L003、L004、L008、L009和L010，在WO 2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/022473、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019032612、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252中描述，其各自的另外的化学部分和接头独立地通过援引并入本文，并且可以根据本披露使用。在一些实施例中，另外的化学部分是洋地黄毒苷或生物素或其衍生物。
在一些实施例中，寡核苷酸包含接头，例如L001、L004、L008和/或另外的化学部分，例如Mod012、Mod039、Mod062、Mod085、Mod086或Mod094。在一些实施例中，接头，例如L001、L003、L004、L008、L009、L110等连接到Mod，例如Mod012、Mod039、Mod062、Mod085、Mod086、Mod094等。
L001：-NH-(CH2)6-接头(也称为C6接头、C6胺接头或C6氨基接头)，其通过-NH-连接到Mod(如果有的话)，并且通过如在-CH2-连接位点处所示的磷酸酯键联(-O-P(O)(OH)-O-，其可以盐的形式存在，并且可表示为O或PO)或硫代磷酸酯键联(-O-P(O)(SH)-O-，其可以盐形式存在，并且可表示为*(如果硫代磷酸酯不是手性控制的)；或*S、S或Sp(如果硫代磷酸酯是手性控制的并且具有Sp构型)；或*R、R或Rp(如果硫代磷酸酯是手性控制的并且具有Rp构型))连接到寡核苷酸链的5'-末端或3'-末端。如果不存在Mod，则L001通过-NH-连接到-H；
L003：
Figure BDA0003580200980003621
接头。在一些实施例中，它通过其氨基连接到Mod(如果有的话)(如果没有Mod，则连接到-H)，并且例如经由键联(例如，磷酸酯键联(O或PO)或硫代磷酸酯键联(可以不是手性控制的，或是手性控制的(Sp或Rp)))连接到寡核苷酸链的5'-末端或3'-末端；
L004：具有-NH(CH2)4CH(CH2OH)CH2-的结构的接头，其中-NH-连接到Mod(通过-C(O)-)或-H，并且-CH2-连接位点通过键联连接到寡核苷酸链(例如，在3'-末端)，该键联是例如磷酸二酯键联(-O-P(O)(OH)-O-，其可以盐形式存在，并且可以表示为O或PO)、硫代磷酸酯键联(-O-P(O)(SH)-O-，其可以盐形式存在，并且可以表示为*(如果硫代磷酸酯不是手性控制的)；或*S、S或Sp(如果硫代磷酸酯是手性控制的并且具有Sp构型)；或*R、R或Rp(如果硫代磷酸酯是手性控制的并且具有Rp构型))、或二硫代磷酸酯键联(-O-P(S)(SH)-O-，其可以盐形式存在，并且可以表示为PS2或:或D)。例如，L004前面紧接星号(例如，*L004)表示键联是硫代磷酸酯键联，而L004前面未紧接星号表示键联是磷酸二酯键联。例如，在终止于...mAL004的寡核苷酸中，接头L004通过磷酸二酯键联(经由-CH2-位点)连接到3'-末端糖(其是2'-OMe修饰的并且连接到核碱基A)的3'位，并且L004接头经由-NH-连接到-H。类似地，在一个或多个寡核苷酸中，L004接头通过磷酸二酯键联(经由-CH2-位点)连接到3'-末端糖的3'位，并且L004经由-NH-连接到例如Mod012、Mod085、Mod086等；
L008：具有-C(O)-(CH2)9-的结构的接头，其中-C(O)-连接到Mod(通过-NH-)或-OH(如果未指示Mod)，并且-CH2-连接位点通过键联连接到寡核苷酸链(例如，在5'-末端)，该键联是例如磷酸二酯键联(-O-P(O)(OH)-O-，其可以盐形式存在，并且可以表示为O或PO)、硫代磷酸酯键联(-O-P(O)(SH)-O-，其可以盐形式存在，并且可以表示为*(如果硫代磷酸酯不是手性控制的)；或*S、S或Sp(如果硫代磷酸酯是手性控制的并且具有Sp构型)；或*R、R或Rp(如果硫代磷酸酯是手性控制的并且具有Rp构型))、或二硫代磷酸酯键联(-O-P(S)(SH)-O-，其可以盐形式存在，并且可以表示为PS2或:或D)。例如，在具有5'-L008mN*mN*mN*mN*N*N*N*N*N*N*N*N*N*N*mN*mN*mN*mN-3'的序列并且具有OXXXXXXXXXXXXXXXXX的立体化学/键联的示例性寡核苷酸(其中N是碱基，其中O是天然磷酸酯核苷酸间键联，并且其中X是立体随机硫代磷酸酯)中，L008通过-C(O)-连接到-OH，并且通过磷酸酯键联(在“立体化学/键联”中表示为“O”)连接到寡核苷酸链的5'-末端；又如，在具有5'-Mod062L008mN*mN*mN*mN*N*N*N*N*N*N*N*N*N*N*mN*mN*mN*mN-3'的序列并且具有OXXXXXXXXXXXXXXXXX的立体化学/键联的示例性寡核苷酸(其中N是碱基)中，L008通过-C(O)-连接到Mod062，并且通过磷酸酯键联(在“立体化学/键联”中表示为“O”)连接到寡核苷酸链的5'-末端；
L009：-CH2CH2CH2-。在一些实施例中，当L009存在于没有Mod的寡核苷酸的5'-末端时，L009的一端连接到-OH并且另一端例如经由键联(例如，磷酸酯键联(O或PO)或硫代磷酸酯键联(可以不是手性控制的，或是手性控制的(Sp或Rp)))连接到寡核苷酸链的5'-碳；
L010：
Figure BDA0003580200980003641
在一些实施例中，当L010存在于没有Mod的寡核苷酸的5'-末端时，L010的5'-碳连接到-OH并且3'-碳经由键联(例如，磷酸酯键联(O或PO)或硫代磷酸酯键联(可以不是手性控制的，或是手性控制的(Sp或Rp)))连接到寡核苷酸链的5'-碳；
Mod012(在一些实施例中，-C(O)-连接到接头诸如L001、L004、L008等的-NH-)：
Figure BDA0003580200980003642
Mod039(在一些实施例中，-C(O)-连接到接头诸如L001、L003、L004、L008、L009、L110等的-NH-)：
Figure BDA0003580200980003643
Mod062(在一些实施例中，-C(O)-连接到接头诸如L001、L003、L004、L008、L009、L110等的-NH-)：
Figure BDA0003580200980003651
Mod085(在一些实施例中，-C(O)-连接到接头诸如L001、L003、L004、L008、L009、L110等的-NH-)：
Figure BDA0003580200980003652
Mod086(在一些实施例中，-C(O)-连接到接头诸如L001、L003、L004、L008、L009、L110等的-NH-)：
Figure BDA0003580200980003653
Mod094(在一些实施例中，经由例如磷酸酯键联、硫代磷酸酯键联(其任选地是手性控制的)等键联连接到核苷酸间键联，或连接到寡核苷酸的5'-末端或3'-末端。例如，在具有5'-mN*mN*mN*mN*N*N*N*N*N*N*N*N*N*N*mN*mN*mN*mNMod094-3'的序列并且具有XXXXX XXXXX XXXXX XXO的立体化学/键联(其中N是碱基)的示例性寡核苷酸中，Mod094通过磷酸酯基团连接到寡核苷酸链的3'-末端(3'-末端糖的3'-碳)(磷酸酯基团未在下面示出并且可以以盐形式存在；并且在“立体化学/键联”(...XXXXO)中表示为“O”))：
Figure BDA0003580200980003661
在一些实施例中，另外的化学部分是WO 2012/030683中描述的化学部分。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含WO 2012/030683中描述的化学结构(例如，接头、脂质、增溶基团和/或靶向配体)。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含以下文献中描述的另外的化学部分和/或修饰(例如，核碱基、糖、核苷酸间键联等的修饰)：美国专利号5,688,941、6,294,664、6,320,017、6,576,752、5,258,506、5,591,584、4,958,013、5,082,830、5,118,802、5,138,045、6,783,931、5,254,469、5,414,077、5,486,603、5,112,963、5,599,928、6,900,297、5,214,136、5,109,124、5,512,439、4,667,025、5,525,465、5,514,785、5,565,552、5,541,313、5,545,730、4,835,263、4,876,335、5,578,717、5,580,731、5,451,463、5,510,475、4,904,582、5,082,830、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,828,979、5,595,726、5,214,136、5,245,022、5,317,098、5,371,241、5,391,723、4,948,882、5,218,105、5,112,963、5,567,810、5,574,142、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、5,585,481、5,292,873、5,552,538、5,512,667、5,597,696、5,599,923、7,037,646、5,587,371、5,416,203、5,262,536、5,272,250或8,106,022。
在一些实施例中，另外的化学部分(例如，Mod)经由接头连接。多种接头在本领域中是可获得的并且可根据本披露使用，例如，用于使多种部分与蛋白(例如，与抗体缀合以形成抗体-药物缀合物)、核酸等缀合的那些接头。某些有用的接头在US 9982257、US20170037399、US 20180216108、US 20180216107、US 9598458、WO 2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/223056、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252中描述，其各自的接头部分独立地通过援引并入本文。在一些实施例中，作为非限制性实例，接头是L001、L004、L009或L010。在一些实施例中，寡核苷酸包含接头，但不含除接头以外的另外的化学部分。在一些实施例中，寡核苷酸包含接头，但不含除接头以外的另外的化学部分，其中接头是L001、L004、L009或L010。
如本文所展示，在一些实施例中，所提供的技术可以提供高水平的活性和/或所需的特性，而不利用据报道为所需的和/或必需的特定结构元件(例如，修饰、键联构型和/或模式等)(例如，WO 2019/219581中报道的那些)，但某些此类结构元件可与根据本披露的多种其他结构元件组合并入寡核苷酸中。例如，在一些实施例中，本披露的寡核苷酸在与靶核苷(例如，靶腺苷)相反的核苷的3'具有较少的核苷，在一个或多个据报道硫代磷酸酯核苷酸间键联不受欢迎或不被允许的位置处包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键联，在一个或多个据报道Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联不受欢迎或不被允许的位置处包含一个或多个Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联，在一个或多个据报道Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联不受欢迎或不被允许的位置处包含一个或多个Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联，和/或与据报道对某些寡核苷酸特性和/或活性有利的或所需的那些修饰和/或立体化学相比，在一个或多个位置包含不同的修饰(例如，核苷酸间键联修饰、糖修饰等)和/或立体化学(例如，存在2'-MOE、在特定位置不存在硫代磷酸酯键联、在特定位置不存在Sp硫代磷酸酯键联和/或在特定位置存在Rp硫代磷酸酯键联据报道对某些寡核苷酸特性和/或活性是有利或所需的；如本文所展示，所提供的技术可以提供所需的特性和/或高活性，而无需利用2'-MOE，无需在一个或多个此类特定位置处避免硫代磷酸酯键联，无需在一个或多个此类特定位置处避免Sp硫代磷酸酯键联，和/或无需在一个或多个此类特定位置处避免Rp硫代磷酸酯键联)。另外地或替代性地，所提供的寡核苷酸包含先前未认识到的结构元件，诸如利用某些修饰(例如，碱基修饰、糖修饰(例如，2'-F)、键联修饰(例如，不带负电荷的核苷酸间键联)、另外的部分等)及其水平、模式和组合。
例如，在一些实施例中，如本文所述，所提供的寡核苷酸包含不超过5、6、7、8、9、10、11或12个位于与靶核苷(例如，靶腺苷)相反的核苷的3'的核苷。
替代性地或另外地，如本文所述(例如，在某些实例中展示的)，对于在与靶核苷(例如，靶腺苷)相反的核苷的3'的结构元件，在一些实施例中，在与靶核苷(例如，靶腺苷)相反的核苷的3'的核苷酸间键联的约50％-100％(例如，约或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％)各自独立地是经修饰的核苷酸间键联，其任选地是手性控制的。在一些实施例中，在与靶核苷相反的核苷的3'不超过1、2或3个核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，没有这样的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，不超过1个这样的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，不超过2个这样的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，不超过3个这样的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯或不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)。在一些实施例中，每个硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，在与靶核苷相反的核苷的3'不超过1、2或3个核苷酸间键联是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，在其糖的3'-位(被认为是-1位)键合到与靶核苷相反的核苷的核苷酸间键联是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，它是在与靶核苷相反的核苷的3'的唯一Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，在相对于与靶核苷相反的核苷的位置-3处的核苷酸间键联(例如，对于…N0N-1N-2N-3…，连接N-2和N-3的核苷酸间键联，其中N0是与靶核苷相反的核苷)不是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，在相对于与靶核苷相反的核苷的位置-6处的核苷酸间键联不是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，相对于与靶核苷相反的核苷在位置-4和/或-5处的核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联，例如硫代磷酸酯核苷酸间键联，或独立地是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，位置-1、-3、-4、-5和-6处的一个或多个或所有核苷酸间键联各自独立地是Sp核苷酸间键联。在一些实施例中，位置-1、-3、-4、-5和-6处的一个或多个或所有核苷酸间键联各自独立地是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，位置-4和/或-5处的核苷酸间键联各自独立地是Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，位置-4和/或-5处的核苷酸间键联各自独立地是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在许多实施例中，不超过1、2、3、4或5个核苷酸间键联是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。
替代性地或另外地，如本文所述(例如，在某些实例中展示的)，在一些实施例中，在与靶核苷(例如，靶腺苷)相反的核苷的5'的核苷酸间键联的约50％-100％(例如，约或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％)各自独立地是经修饰的核苷酸间键联，其任选地是手性控制的。在一些实施例中，在与靶核苷(例如，靶腺苷)相反的核苷的5'没有核苷酸间键联或不超过1、2或3个核苷酸间键联不是经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，在与靶核苷(例如，靶腺苷)相反的核苷的5'没有核苷酸间键联或不超过1、2或3个核苷酸间键联不是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，在与靶核苷(例如，靶腺苷)相反的核苷的5'没有核苷酸间键联或不超过1、2或3个核苷酸间键联不是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，在与靶核苷(例如，靶腺苷)相反的核苷的5'不超过1、2或3个核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，没有这样的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，不超过1个这样的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，不超过2个这样的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，不超过3个这样的核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。在一些实施例中，每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯或不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)。在一些实施例中，在与靶核苷相反的核苷的5'不存在2、3或4个连续核苷酸间键联，其各自不是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，在与靶核苷相反的核苷的5'不存在2、3或4个连续的核苷酸间键联，其各自是手性控制的并且不是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，在与靶核苷(例如，靶腺苷)相反的核苷的5'没有或不超过1、2、3、4或5个核苷酸间键联是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，在其糖的5'-位(被认为是+1位)键合到与靶核苷相反的核苷的核苷酸间键联是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，它是在与靶核苷相反的核苷的3'的唯一Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，在相对于与靶核苷相反的核苷的位置+5处的核苷酸间键联(例如，对于…N+5N+4N+3N+2N+1N0…，连接N+4和N+5的核苷酸间键联，其中N0是与靶核苷相反的核苷)不是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，位置+11处的核苷酸间键联不是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，相对于与靶核苷相反的核苷，在位置+6至+8处的一个或多个或所有核苷酸间键联各自独立地是经修饰的核苷酸间键联，其任选地是手性控制的。在一些实施例中，它们各自独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，它们各自独立地是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，相对于与靶核苷相反的核苷，在位置+6至+8处的一个或多个或所有核苷酸间键联各自独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联，其任选地是手性控制的。在一些实施例中，位置+6、+7、+8、+9和+11处的一个或多个或所有核苷酸间键联各自独立地是Rp核苷酸间键联。在一些实施例中，位置+6、+7、+8、+9和+11处的一个或多个或所有核苷酸间键联各自独立地是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，在相对于与靶腺苷相反的核苷的位置+5、+6、+7、+8和+9处的一个或多个或所有核苷酸间键联各自独立地是Sp核苷酸间键联。在一些实施例中，在相对于与靶腺苷相反的核苷的位置+5、+6、+7、+8和+9处的一个或多个或所有核苷酸间键联各自独立地是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，位置+5处的核苷酸间键联是Sp核苷酸间键联。在一些实施例中，位置+5处的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，位置+6处的核苷酸间键联是Sp核苷酸间键联。在一些实施例中，位置+6处的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，位置+7处的核苷酸间键联是Sp核苷酸间键联。在一些实施例中，位置+7处的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，位置+8处的核苷酸间键联是Sp核苷酸间键联。在一些实施例中，位置+8处的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，位置+9处的核苷酸间键联是Sp核苷酸间键联。在一些实施例中，位置+9处的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个，或约50％-100％(例如，约或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％)的在与靶核苷(例如，靶腺苷)相反的核苷的5'的核苷酸间键联各自独立地是手性控制的，并且是Sp核苷酸间键联。在一些实施例中，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个，或约50％-100％(例如，约或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％)的在与靶核苷(例如，靶腺苷)相反的核苷的5'的硫代磷酸酯核苷酸间键联各自独立地是手性控制的，并且是Sp。在一些实施例中，在与靶核苷(例如，靶腺苷)相反的核苷的5'的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，在与靶核苷(例如，靶腺苷)相反的核苷的5'的每个硫代磷酸酯核苷酸间键联是Sp。
寡核苷酸和组合物的产生
多种方法可以用于产生寡核苷酸和组合物，并且可以根据本披露使用。例如，传统的亚磷酰胺化学(例如，包含-CH2CH2CN和-N(i-Pr)2的亚磷酰胺)可用于制备立体随机的寡核苷酸和组合物，并且某些试剂和手性控制的技术可用于制备手性控制的寡核苷酸组合物，例如如以下文献中所述：US 9982257、US 20170037399、US 20180216108、US20180216107、US 9598458、WO 2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/223056、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的试剂和方法通过援引并入本文。
在一些实施例中，寡核苷酸及其组合物的手性控制/立体选择性制备包括利用手性助剂，例如作为单体亚磷酰胺的一部分。此类手性助剂和亚磷酰胺的实例在以下文献中描述：US 9982257、US 20170037399、US 20180216108、US 20180216107、US 9598458、WO2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO2018/098264、WO 2018/223056、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的手性助剂和亚磷酰胺独立地通过援引并入本文。在一些实施例中，手性助剂是以下任一文献中描述的手性助剂：WO 2018/022473、WO 2018/098264、WO 2018/223056、WO2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的手性助剂独立地通过援引并入本文。
在一些实施例中，手性控制的制备技术(包括寡核苷酸合成循环、试剂和条件)在以下文献中描述：US 9982257、US 20170037399、US 20180216108、US 20180216107、US9598458、WO 2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/022473、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019032612、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612、WO 2018/223056、WO 2018/223073、WO 2018/223081、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO 2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的寡核苷酸合成方法、循环、试剂和条件独立地通过援引并入本文。
一旦合成，通常将进一步纯化所提供的寡核苷酸和组合物。合适的纯化技术是本领域技术人员众所周知的和实践的，包括但不限于在以下文献中描述的那些：US 9982257、US 20170037399、US 20180216108、US 20180216107、US 9598458、WO 2017/062862、WO2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO2018/223056、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，其各自的纯化技术独立地通过援引并入本文。
在一些实施例中，循环包括偶联、封端、修饰和解封闭或由其组成。在一些实施例中，循环包括偶联、封端、修饰、封端和解封闭或由其组成。这些步骤通常以其列出的顺序执行，但是在一些实施例中，如本领域技术人员所理解的，可以改变某些步骤的顺序，例如封端和修饰。如果需要，可以重复一个或多个步骤以提高转化率、产率和/或纯度，如本领域技术人员通常在合成中所进行的。例如，在一些实施例中，可以重复进行偶联；在一些实施例中，可以重复进行修饰(例如，氧化以安装＝O，硫化以安装＝S，等等)；在一些实施例中，在修饰后重复进行偶联，其可以将P(III)键联转化成在某些情况下可以更稳定的P(V)键联，并且偶联后通常进行修饰以转化新形成的P(III)键联为P(V)键联。在一些实施例中，当重复步骤时，可以采用不同的条件(例如，浓度、温度、试剂、时间等)。
用于配制所提供的寡核苷酸和/或制备药物组合物的技术，例如用于经由多种途径施用给受试者的技术，在本领域中是容易获得的，并且可以根据本披露使用，例如以下文献中描述的那些：US 9982257、US 20170037399、US 20180216108、US 20180216107、US9598458、WO 2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/223056或WO 2018/237194及其中引用的参考文献。
用于配制所提供的寡核苷酸和/或制备药物组合物的技术，例如用于经由多种途径施用给受试者的技术，在本领域中是容易获得的，并且可以根据本披露使用，例如以下文献中描述的那些：US 9982257、US 20170037399、US 20180216108、US 20180216107、US9598458、WO 2017/062862、WO 2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO 2018/223056或WO 2018/237194及其中引用的参考文献。
在一些实施例中，有用的手性助剂具有
Figure BDA0003580200980003731
Figure BDA0003580200980003732
或
Figure BDA0003580200980003733
或其盐的结构，其中RC11是-LC1-RC1，LC1是任选地经取代的--CH2-。RC1是R、-Si(R)3、-SO2R或吸电子基团，并且RC2和RC3与居于它们之间的原子合在一起形成除了氮原子外还具有0-2个杂原子的任选地经取代的3-10元饱和环。在一些实施例中，有用的手性助剂具有
Figure BDA0003580200980003734
或
Figure BDA0003580200980003735
的结构，其中RC1是R、-Si(R)3或-SO2R，并且RC2和RC3与居于它们之间的原子合在一起形成除氮原子外还具有0-2个杂原子的任选地经取代的3-7元饱和环。所形成的环是任选地经取代的5元环。在一些实施例中，有用的手性助剂具有
Figure BDA0003580200980003736
或
Figure BDA0003580200980003737
或其盐的结构。在一些实施例中，有用的手性助剂具有
Figure BDA0003580200980003738
或
Figure BDA0003580200980003739
的结构。在一些实施例中，有用的手性助剂是DPSE手性助剂。在一些实施例中，手性助剂的纯度或立体化学纯度为至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，其为至少85％。在一些实施例中，其为至少90％。在一些实施例中，其为至少95％。在一些实施例中，其为至少96％。在一些实施例中，其为至少97％。在一些实施例中，其为至少98％。在一些实施例中，其为至少99％。
在一些实施例中，LC1是-CH2-。在一些实施例中，LC1是取代的-CH2-。在一些实施例中，LC1是单取代的-CH2-。
在一些实施例中，RC1是R。在一些实施例中，RC1是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，RC1是-SiR3。在一些实施例中，RC1是-SiPh2Me。在一些实施例中，RC1是-SO2R。在一些实施例中，R不是氢。在一些实施例中，R是任选地经取代的苯基。在一些实施例中，R是苯基。在一些实施例中，R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。在一些实施例中，R是C1-6烷基。在一些实施例中，R是甲基。在一些实施例中，R是叔丁基。
在一些实施例中，RC1是吸电子基团，诸如-C(O)R、-OP(O)(OR)2、-OP(O)(R)2、-P(O)(R)2、-S(O)R、-S(O)2R等。在一些实施例中，包含吸电子基团RC1基团的手性助剂特别可用于制备与天然RNA糖键合的手性控制的不带负电荷的核苷酸间键联和/或手性控制的核苷酸间键联。
在一些实施例中，RC2和RC3与居于它们之间的原子合在一起形成除氮原子外不具有杂原子的任选地经取代的3-10(例如，3、4、5、6、7、8、9或10)元饱和环。在一些实施例中，RC2和RC3与居于它们之间的原子合在一起形成除氮原子外不具有杂原子的任选地经取代的5元饱和环。
在一些实施例中，用于制备寡核苷酸和/或组合物的方法包括使用本文所述的手性助剂，例如用于构建一个或多个手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，使用DPSE手性助剂独立地构建一个或多个手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，使用DPSE手性助剂独立地构建每个手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，使用
Figure BDA0003580200980003741
或
Figure BDA0003580200980003742
或其盐(其中RAU如本文所述)独立地构建一个或多个手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，使用
Figure BDA0003580200980003743
或
Figure BDA0003580200980003744
或其盐独立地构建每个手性控制的不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)。在一些实施例中，使用
Figure BDA0003580200980003745
或
Figure BDA0003580200980003751
或其盐独立地构建每个手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，RAU是任选地经取代的C1-20、C1-10、C1-6、C1-5、或C1-4脂肪族基。在一些实施例中，RAU是任选地经取代的C1-20、C1-10、C1-6、C1-5或C1-4烷基。在一些实施例中，RAU是任选地经取代的芳基。在一些实施例中，RAU是苯基。在一些实施例中，使用PSM手性助剂构建一个或多个手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，使用PSM手性助剂独立地构建每个手性控制的不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)。在一些实施例中，使用PSM手性助剂独立地构建每个手性控制的核苷酸间键联。如本领域技术人员所理解的，在亚磷酰胺中经常使用手性助剂(例如，
Figure BDA0003580200980003752
或
Figure BDA0003580200980003753
(DPSE亚磷酰胺)，
Figure BDA0003580200980003754
或
Figure BDA0003580200980003755
(其中RAU独立地如本文所述；当RAU是-Ph、PSM亚磷酰胺时)，其中RNS是任选地经取代/被保护的核苷(例如，任选地被保护以用于寡核苷酸合成)或其盐等)用于寡核苷酸制备。在一些实施例中，方法包括提供DPSE和/或PSM亚磷酰胺或其盐。在一些实施例中，所提供的方法包括使DPSE和/或PSM亚磷酰胺或其盐与-OH(例如，核苷或寡核苷酸链的5'-OH)接触。如本领域技术人员所理解的，接触可以在多种合适的条件下进行，从而形成磷键联。在一些实施例中，每个手性控制的核苷酸间键联的制备独立地包括使DPSE或PSM亚磷酰胺或其盐与-OH(例如，核苷或寡核苷酸链的5'-OH)接触。在一些实施例中，每个手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联的制备独立地包括使DPSE亚磷酰胺或其盐与-OH(例如，核苷或寡核苷酸链的5'-OH)接触。在一些实施例中，每个手性控制的不带负电荷的核苷酸间键联(如n001)的制备独立地包括使PSM亚磷酰胺或其盐与-OH(例如，核苷或寡核苷酸链的5'-OH)接触。在一些实施例中，每个手性控制的核苷酸间键联的制备独立地包括使PSM亚磷酰胺或其盐与-OH(例如，核苷或寡核苷酸链的5'-OH)接触。在一些实施例中，接触形成P(III)键联，该键联包含键合到两个糖的磷原子和手性助剂部分(例如，
Figure BDA0003580200980003761
或
Figure BDA0003580200980003762
或其盐形式(例如，来自DPSE亚磷酰胺或其盐)，
Figure BDA0003580200980003763
或
Figure BDA0003580200980003764
或其盐形式(其中RAU独立地如本文所述；当RAU是-Ph时，例如来自PSM亚磷酰胺或其盐)等)。在一些实施例中，寡核苷酸包含P(III)键联，该键联包含例如来自DPSE或PSM亚磷酰胺的手性助剂部分。在一些实施例中，包含手性助剂部分的P(III)键联是手性控制的。在一些实施例中，可以例如在将P(III)键联转化成P(V)键联之前(例如，在硫化、与叠氮化物反应等之前)保护手性助剂部分。在一些实施例中，被保护的手性助剂具有以下结构：
Figure BDA0003580200980003765
或
Figure BDA0003580200980003766
或其盐形式(例如，其中R'独立地如本文所述；例如，来自DPSE亚磷酰胺或其盐)，或
Figure BDA0003580200980003767
或
Figure BDA0003580200980003768
或其盐形式(其中每个R'和RAU独立地如本文所述；当RAU是-Ph时，例如来自PSM亚磷酰胺或其盐)，其中每个R'独立地如本文所述。在一些实施例中，R'是-C(O)R，其中R如本文所述。在一些实施例中，R是-CH3。在一些实施例中，寡核苷酸包含被保护的手性助剂。在一些实施例中，寡核苷酸中的每个手性控制的核苷酸间键联独立地包含
Figure BDA0003580200980003769
或
Figure BDA00035802009800037610
或其盐形式，或
Figure BDA00035802009800037611
或
Figure BDA00035802009800037612
或其盐形式。在一些实施例中，寡核苷酸中的每个手性控制的核苷酸间键联独立地包含
Figure BDA00035802009800037613
或
Figure BDA00035802009800037614
或其盐形式。在一些实施例中，R'是-C(O)R。在一些实施例中，R'是-C(O)CH3。在一些实施例中，RAU是Ph。在一些实施例中，寡核苷酸包含一种或多种
Figure BDA0003580200980003771
或其盐形式(PIII-1)，其中每个变量独立地如本文所述。在一些实施例中，寡核苷酸包含一种或多种
Figure BDA0003580200980003772
或其盐形式(PIII-2)，其中每个变量独立地如本文所述。在一些实施例中，寡核苷酸包含一种或多种
Figure BDA0003580200980003773
或其盐形式(PIII-5)，其中每个变量独立地如本文所述。在一些实施例中，寡核苷酸包含一种或多种
Figure BDA0003580200980003774
或其盐形式(PIII-6)，其中每个变量独立地如本文所述。在一些实施例中，5'-末端核苷酸间键联是PIII-1、PIII-2、PIII-5或PIII-6。在一些实施例中，5'-末端核苷酸间键联是PIII-1或PIII-2。在一些实施例中，R'是-H。在一些实施例中，R'是-C(O)R。在一些实施例中，R'是-C(O)CH3。在一些实施例中，RAU是-Ph。在一些实施例中，将P(III)键联转化成P(V)键联。在一些实施例中，P(V)键联包含键合到两个糖的磷原子、手性助剂部分(例如，
Figure BDA0003580200980003775
或
Figure BDA0003580200980003776
或其盐形式(其中R'如本文所述；例如来自DPSE亚磷酰胺或其盐)，
Figure BDA0003580200980003781
或
Figure BDA0003580200980003782
或其盐形式(其中R'和RAU各自独立地如本文所述；当RAU是-Ph时，例如来自PSM亚磷酰胺或其盐)等)，以及S或
Figure BDA0003580200980003783
在一些实施例中，P(V)键联包含键合到两个糖的磷原子、
Figure BDA0003580200980003784
或
Figure BDA0003580200980003785
或其盐形式(其中R'和RAU各自独立地如本文所述；当RAU是-Ph时，例如来自PSM亚磷酰胺或其盐)等)，以及S或
Figure BDA0003580200980003786
在一些实施例中，P(V)键联包含键合到两个糖的磷原子、
Figure BDA0003580200980003787
或
Figure BDA0003580200980003788
或其盐形式(其中R'和RAU各自独立地如本文所述；当RAU是-Ph时，例如来自PSM亚磷酰胺或其盐)等)，以及S。在一些实施例中，P(V)键联包含键合到两个糖的磷原子、
Figure BDA0003580200980003789
或
Figure BDA00035802009800037810
或其盐形式(其中R'和RAU各自独立地如本文所述；当RAU是-Ph时，例如来自PSM亚磷酰胺或其盐)等)，以及
Figure BDA00035802009800037811
本领域技术人员将理解，
Figure BDA00035802009800037812
可以与平衡离子(例如，在一些实施例中为PF6 -)一起存在。在一些实施例中，寡核苷酸包含一种或多种
Figure BDA0003580200980003791
或其盐形式(PV-1)，其中每个变量独立地如本文所述。在一些实施例中，寡核苷酸包含一种或多种
Figure BDA0003580200980003792
或其盐形式(PV-2)，其中每个变量独立地如本文所述。在一些实施例中，寡核苷酸包含一种或多种
Figure BDA0003580200980003793
或其盐形式(PV-3)，其中每个变量独立地如本文所述。在一些实施例中，寡核苷酸包含一种或多种
Figure BDA0003580200980003794
或其盐形式(PV-4)，其中每个变量独立地如本文所述。在一些实施例中，寡核苷酸包含一种或多种
Figure BDA0003580200980003795
或其盐形式(PV-5)，其中每个变量独立地如本文所述。在一些实施例中，寡核苷酸包含一种或多种
Figure BDA0003580200980003801
或其盐形式(PV-6)，其中每个变量独立地如本文所述。在一些实施例中，寡核苷酸的每个手性核苷酸间键联或每个手性控制的核苷酸间键联独立地选自PIII-1、PIII-2、PIII-5、PIII-6、PV-1、PV-2、PV-3、PV-4、PV-5和PV-6。在一些实施例中，寡核苷酸的每个手性核苷酸间键联或每个手性控制的核苷酸间键联独立地选自PIII-1、PIII-2、PV-1、PV-2、PV-3和PV-4。在一些实施例中，PIII-1、PIII-2、PIII-5或PIII-6的键联通常是5'-末端核苷酸间键联。在一些实施例中，寡核苷酸的每个手性核苷酸间键联或每个手性控制的核苷酸间键联独立地选自PV-1、PV-2、PV-3、PV-4、PV-5和PV-6。在一些实施例中，寡核苷酸的每个手性核苷酸间键联或每个手性控制的核苷酸间键联独立地选自PV-1、PV-2、PV-3或PV-4。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸是如本文所述的(例如，表A1的)寡核苷酸，其中每个*S独立地被PV-3或PV-5代替，每个*R独立地被PV-4或PV-6代替，每个n001R独立地被PV-1代替，并且每个n001S独立地被PV-2代替。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸是如本文所述的(例如，表A1的)寡核苷酸，其中每个*S独立地被PV-3代替，每个*R独立地被PV-4代替，每个n001R独立地被PV-1代替，并且每个n001S独立地被PV-2代替。在一些实施例中，每个天然磷酸酯键联独立地被前体(例如，
Figure BDA0003580200980003802
)代替。在一些实施例中，R'是-H。在一些实施例中，R'是-C(O)R。在一些实施例中，R'是-C(O)CH3。在一些实施例中，RAU是-Ph。在一些实施例中，方法包括除去一个或多个手性助剂部分，从而形成硫代磷酸酯和/或不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)(例如，从V-1、PV-2、PV-3、PV-4、PV-5、PV-6等)。在一些实施例中，除去手性助剂(例如，PSM)包括在无水条件下使寡核苷酸与碱(例如，N(R)3，诸如DEA)接触。
在一些实施例中，如本领域技术人员所理解的，为了制备手性控制的核苷酸间键联，通常以手性富集或纯的形式(例如，具有如本文所述的纯度(例如，约或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或约100％))使用亚磷酰胺(例如，DPSE或PSM亚磷酰胺)。
在一些实施例中，本披露提供了用于制备寡核苷酸及其组合物的有用试剂。在一些实施例中，亚磷酰胺包含如本文所述的核苷、核碱基和糖。在一些实施例中，如本领域技术人员将理解的，对于寡核苷酸合成，核碱基和糖被适当地保护。在一些实施例中，亚磷酰胺具有RNS-P(OR)N(R)2的结构，其中RNS是任选地被保护的核苷部分。在一些实施例中，亚磷酰胺具有RNS-P(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2的结构。在一些实施例中，亚磷酰胺包含核碱基，该核碱基是或包含环BA，其中环BA具有BA-I、BA-I-a、BA-I-b、BA-II、BA-II-a、BA-II-b、BA-III、BA-III-a、BA-III-b、BA-IV、BA-IV-a、BA-IV-b、BA-V、BA-V-a、BA-V-b或BA-VI的结构，或环BA的互变异构体，其中核碱基是任选地经取代的或被保护的。在一些实施例中，亚磷酰胺包含手性助剂部分，其中磷键合到手性助剂部分的氧和氮原子。在一些实施例中，亚磷酰胺具有
Figure BDA0003580200980003811
或
Figure BDA0003580200980003812
或其盐的结构，其中RNS是被保护的核苷部分(例如，5'-OH和/或对于寡核苷酸合成适合保护的核碱基)，并且每个其他变量独立地如本文所述。在一些实施例中，亚磷酰胺具有
Figure BDA0003580200980003813
或
Figure BDA0003580200980003814
的结构，其中RNS是被保护的核苷部分(例如，5'-OH和/或对于寡核苷酸合成适合保护的核碱基)，RC1是R、-Si(R)3或-SO2R，并且RC2和RC3与居于它们之间的原子合在一起形成除氮原子外还具有0-2个杂原子的任选地经取代的3-7元饱和环，其中偶联形成核苷酸间键联。在一些实施例中，RNS的5'-OH被保护。在一些实施例中，RNS的5'-OH作为-ODMTr被保护。在一些实施例中，RNS通过其3'-O-键合到磷。在一些实施例中，RC2和RC3形成的环是任选地经取代的5元环。在一些实施例中，亚磷酰胺具有
Figure BDA0003580200980003821
或
Figure BDA0003580200980003822
或其盐的结构。在一些实施例中，亚磷酰胺具有
Figure BDA0003580200980003823
或
Figure BDA0003580200980003824
的结构。在一些实施例中，如本文所述，RNS包含经修饰的核碱基(例如，b001A、b002A、b003A、b008U、b001C等)，其任选地被保护用于寡核苷酸合成。
在一些实施例中，亚磷酰胺的纯度或立体化学纯度为至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，其为至少85％。在一些实施例中，其为至少90％。在一些实施例中，其为至少95％。
在一些实施例中，本披露提供了用于制备寡核苷酸或组合物的方法，该方法包括使寡核苷酸或核苷的游离-OH(例如，游离5'-OH)与如本文所述的亚磷酰胺偶联。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸，其中寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷酸间键联，其各自独立地具有-O5-PL(W)(RCA)-O3-的结构，其中：
PL是P或P(＝W)；
W是O、S或WN；
WN是＝N-C(-N(R1)2＝N+(R1)2Q-；
Q-是阴离子；
RCA是或包含任选地封端的手性助剂部分，
O5是键合到糖的5'-碳的氧，并且
O3是键合到糖的3'-碳的氧。
在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联任选地是手性控制的。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键联任选地是手性控制的。
在一些实施例中，提供了包括从这样的经修饰的核苷酸间键联移除RCA的方法。在一些实施例中，在移除后，与RCA的键合被-OH代替。在一些实施例中，在移除后，与RCA的键合被＝O代替，并且与WN的键合被-N＝C(N(R1)2)2代替。
在一些实施例中，PL是P＝S，并且当移除RCA时，这样的核苷酸间键联被转化成硫代磷酸酯核苷酸间键联。
在一些实施例中，PL是P＝WN，并且当移除RCA时，这样的核苷酸间键联被转化成具有
Figure BDA0003580200980003831
的结构的核苷酸间键联。在一些实施例中，具有
Figure BDA0003580200980003832
的结构的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003833
的结构。在一些实施例中，具有
Figure BDA0003580200980003834
的结构的核苷酸间键联具有
Figure BDA0003580200980003835
的结构。
在一些实施例中，PL是P(例如，在来自亚磷酰胺与5'-OH偶联的新形成的核苷酸间键联中)。在一些实施例中，W是O或S。在一些实施例中，W是S(例如，在硫化之后)。在一些实施例中，W是O(例如，在氧化后)。在一些实施例中，某些不带负电荷的核苷酸间键联或中性核苷酸间键联可通过使P(III)亚磷酸三酯核苷酸间键联与叠氮基咪唑啉盐(例如，包含
Figure BDA0003580200980003836
的化合物)在合适的条件下反应而制备。在一些实施例中，叠氮基咪唑啉盐是PF6 -的盐。在一些实施例中，叠氮基咪唑啉盐是
Figure BDA0003580200980003837
的盐。在一些实施例中，叠氮基咪唑啉盐是2-叠氮基-1,3-二甲基咪唑啉六氟磷酸盐。
如本领域技术人员所理解的，Q-可以是存在于系统中(例如，在寡核苷酸合成中)的多种合适的阴离子，并且可以在寡核苷酸制备过程期间根据循环、过程阶段、试剂、溶剂等而变化。在一些实施例中，Q-是PF6 -。
在一些实施例中，RCA是
Figure BDA0003580200980003841
或
Figure BDA0003580200980003842
其中RC4是-H或-C(O)R'，并且每个其他变量独立地如本文所述。在一些实施例中，RCA是
Figure BDA0003580200980003843
或
Figure BDA0003580200980003844
其中RC1是R、-Si(R)3或-SO2R，RC2和RC3与居于它们之间的原子合在一起形成任选地经取代的3-7元饱和环，该环除了氮原子外还具有0-2个杂原子，RC4是-H或-C(O)R'。在一些实施例中，RC4是-H。在一些实施例中，RC4是-C(O)CH3。在一些实施例中，RC2和RC3合在一起形成任选地经取代的5元环。
在一些实施例中，RC4是-H(例如，在来自亚磷酰胺与5'-OH偶联的新形成的核苷酸间键联中)。在一些实施例中，RC4是-C(O)R(例如，在胺的封端之后)。在一些实施例中，R是甲基。
在一些实施例中，每个手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联独立地从-O5-PL(W)(RCA)-O3-转化。
ADAR
尤其是，所提供的技术可以通过将A转化成I来提供对靶腺苷的修饰/编辑。在一些实施例中，寡核苷酸和/或由寡核苷酸与靶核酸形成的双链体与蛋白(例如，ADAR蛋白)相互作用。在一些实施例中，此类蛋白包含腺苷修饰活性并且可以修饰靶核酸中的靶腺苷，例如将它们转化成肌苷。
ADAR蛋白是在多种细胞、组织、器官和/或生物体中天然表达的蛋白。据报道，一些ADAR蛋白(例如，ADAR1和ADAR2)可以通过脱氨来编辑腺苷，从而将腺苷转化成肌苷，肌苷可以提供多种功能，包括在翻译过程中被读作或类似于G。已经报道了ADAR介导的mRNA编辑(例如，脱氨)的机制。例如，据报道，ADAR蛋白催化具有错配的双链RNA底物上的腺苷向肌苷的转化。如本领域技术人员所理解的，肌苷可以通过细胞翻译和/或剪接机制被辨识为鸟苷。ADAR因此可用于核酸(例如，前体mRNA和mRNA底物)的功能性腺苷至鸟苷编辑。
在一些实施例中，本披露提供了用于ADAR介导的靶核酸(例如，RNA)中的靶腺苷编辑的寡核苷酸及其组合物。ADAR介导的RNA编辑可以提供优于DNA编辑的若干优点，例如，因为不需要重组蛋白如Cas9的表达，所以递送被简化。ADAR1和ADAR2均是内源酶，因此单独的寡核苷酸的细胞递送可足以进行编辑。脱靶效应(如果有的话)是瞬时的并且不改变基因组DNA。另外，ADAR介导的编辑可用于有丝分裂后细胞，并且不需要用于HDR模板进行修复。已经报道了具有共同功能结构域的3种脊椎动物ADAR基因(Nishikura Nat Rev Mol CellBiol.[自然评论：分子细胞生物学]2016年2月；17(2):83-96；Nishikura Annu RevBiochem.[生物化学年鉴]2010；79:321-349；Thomas和Beal Bioessays[生物学论文集].2017年4月；39(4))。所有3种ADAR均含有dsRNA结合结构域(dsRBD)，其可接触dsRNA底物。一些ADAR1还含有Z-DNA结合结构域。据报道，ADAR1在脑、肺、肾、肝和心脏等中显著表达，并且可以以两种同种型存在。在一些实施例中，同种型p150可以由干扰素诱导，而同种型p110可以组成型表达。在一些实施例中，使用p110可能是有益的，因为据报道它是泛在和组成型表达的。ADAR2可以在例如脑和肺中高表达，并且据报道仅定位到细胞核中。据报道，ADAR3无催化活性并且仅在脑中表达。当选择治疗靶时，可以考虑组织表达的潜在差异。
已经报道了寡核苷酸用于通过ADAR进行RNA编辑。尤其是，本披露认识到先前报道的技术通常具有一个或多个缺点，诸如低稳定性(例如，具有天然RNA糖的寡核苷酸)、低编辑效率、低编辑特异性(例如，在与寡核苷酸基本上互补的靶核酸的一部分中编辑许多A)、用于ADAR识别/募集的寡核苷酸中的特定结构、外源蛋白(例如，被工程化以识别具有特定结构的寡核苷酸和/或其双链体(例如，具有靶核酸)以用于编辑的那些)等。此外，当寡核苷酸包含经修饰的核苷酸间键联的一个或多个手性键联磷时，先前报道的技术通常利用立体随机寡核苷酸组合物。
例如，多种报道的寡核苷酸含有ADAR募集结构域。Merkle等人,Nat Biotechnol.[自然-生物技术]2019年2月；37(2):133-138披露了包含不完美的20bp发夹ADAR募集结构域的寡核苷酸，该结构域是募集内源性人ADAR2以编辑内源性转录物的分子内茎环。Mali等人,Nat Methods.[自然-方法]2019年3月；16(3):239-242中报道的寡核苷酸除了与靶mRNA杂交的特异性结构域外还包含ADAR底物GluR2前信使RNA序列或MS2发夹。
某些报道的编辑方法利用外源或工程化蛋白，例如，利用CRISPR/Cas9系统的那些。例如，Komor等人Nature[自然]2016第533卷,第420-424页披露了与CRISPR-Cas9偶联以产生可编程DNA碱基编辑器的脱氨酶。因为它参与外源编辑蛋白，所以它需要递送CRISPR/Cas9系统和指导RNA两者。
尤其是，本披露提供了包括一个或多个特征诸如糖修饰、碱基修饰、核苷酸间键联修饰、立体化学控制、其多种模式等的技术，以解决现有腺苷编辑技术中遭受的一个或多个或所有缺点，例如，通过提供本文所述的设计的寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物。例如，如本文所展示，ADAR募集环是可选的，并且对于所提供的技术来说不是必需的。
如本领域技术人员所理解的，一个或多个这样的有用特征可用于改进现有技术中的寡核苷酸(例如，WO 2016097212、WO 2017220751、WO 2018041973、WO 2018134301 A1中所述的那些，其各自的寡核苷酸和寡核苷酸组合物独立地通过援引并入本文)。在一些实施例中，本披露通过将本文所述的一个或多个有用特征应用于先前报道的寡核苷酸碱基序列来提供对先前技术的改进。在一些实施例中，本披露提供了可用于腺苷编辑的先前报道的寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，本披露提供了使用立体随机寡核苷酸组合物对先前报道的腺苷编辑的改进，其通过使用手性控制的寡核苷酸组合物进行这样的编辑来进行。
据报道，ADAR蛋白可具有多种同种型。例如，ADAR1尤其具有报道的p110同种型和报道的p150同种型。在一些实施例中，据观察，对于多种同种型(在一些实施例中，p110和p150同种型两者)，某些手性控制的寡核苷酸组合物可以提供高水平的腺苷修饰(例如，将A转化成I)，而对于一种或多种同种型而言(例如，p110)立体随机组合物提供低水平的腺苷修饰。在一些实施例中，手性控制的寡核苷酸组合物对于在表达或包含ADAR1的p110同种型的系统(例如，细胞、组织、器官、生物体、受试者等)中的腺苷修饰特别有用，特别是相对于p150同种型表达或包含高水平的ADAR1的p110同种型的那些系统，或不表达或表达低水平的ADAR1 p150的那些系统。
在一些实施例中，本披露提供了在结构中不需要茎环的顺式作用(CisA)寡核苷酸。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸可以通过碱基配对与靶mRNA形成dsRNA结构。在一些实施例中，所形成的dsRNA结构(任选地具有二级错配)含有促进ADAR结合的凸起，并且因此可以促进ADAR介导的编辑(例如，靶腺苷的脱氨)。在一些实施例中，本披露的寡核苷酸比LSL寡核苷酸或CSL寡核苷酸短，例如长度不超过或为约32nt，不超过或为约31nt，不超过或为约30nt，不超过或为约29nt，不超过或为约28nt，不超过或为约27nt，或不超过或为约26nt，并且可以提供高编辑效率。
对所提供技的术的评估/表征
如本领域的技术人员所理解的，可利用多种技术来评估/表征根据本披露所提供的技术。某些有用的技术在实例中描述；如所展示的，尤其是，本披露描述了适于评估和表征所提供的技术的多种体内和体外技术。在一些实施例中，例如在具有或不具有外源性ADAR多肽的情况下在细胞中评估/表征所提供的技术；另外地或替代性地，在一些实施例中，例如在动物(例如，非人类灵长类动物和小鼠)中评估/表征所提供的技术。
尤其是，本披露包括这样的见解：可在多种人类系统(例如，细胞)中提供编辑的多种药剂(例如，寡核苷酸)及其组合物可能在不含或不表达人ADAR(例如，人ADAR1)的某些细胞(例如，小鼠细胞)和某些动物诸如啮齿类动物(例如，小鼠)中不会显示出编辑或显示出低得多的编辑水平。特别地，小鼠(一种常用的动物模型)对于评估用于在人类中编辑的多种药剂(例如，寡核苷酸)可能具有有限的用途，因为在人类细胞中有活性的多种药剂在未经工程化以包含或表达适当的ADAR1(例如，人ADAR1)多肽或其特征性部分的小鼠细胞和动物中不提供或提供非常低水平的活性(参见图40和图47，野生型(WT)小鼠和细胞、人类细胞以及经工程化以表达hADAR1 p110的细胞和小鼠(huADAR小鼠)的数据)。在一些实施例中，本披露提供了表达人ADAR1多肽或其特征性部分的工程化细胞和非人动物。在一些实施例中，此类细胞和人类可用于评估和表征所提供的技术。在一些实施例中，人ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1多肽或其特征性部分。在一些实施例中，人ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1 p110多肽或其特征性部分。在一些实施例中，人ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1 p150多肽或其特征性部分。在一些实施例中，人ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1。在一些实施例中，人ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1p110肽。在一些实施例中，人ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1 p150肽。在一些实施例中，人ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1的一个或多个或所有以下结构域：Z-DNA结合结构域、dsRNA结合结构域和脱氨酶结构域。在一些实施例中，人ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1 Z-DNA结合结构域中的一者或两者；替代性地或另外地，在一些实施例中，人ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1 dsRNA结合结构域中的一者、两者或全部；替代性地或另外地，人ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人脱氨酶结构域。在一些实施例中，人ADAR1多肽或其特征性部分可与小鼠ADAR1多肽或其特征性部分一起表达，例如一个或多个人dsRNA结合结构域可经工程化以与小鼠脱氨酶结构域一起表达以形成人-小鼠杂合ADAR1多肽。在一些实施例中，细胞和/或非人动物被工程化以包含和/或表达编码如本文所述的人ADAR1多肽或其特征性部分的多核苷酸。在一些实施例中，细胞和/或非人动物的基因组被工程化以包含编码如本文所述的人ADAR1多肽或其特征性部分的多核苷酸。在一些实施例中，细胞和/或非人动物的种系基因组被工程化以包含编码如本文所述的人ADAR1多肽或其特征性部分的多核苷酸。在一些实施例中，细胞和非人动物被工程化以在其基因组(在一些实施例中，种系基因组)中包含各自独立地与病症、障碍或疾病相关联的一个或多个A至G突变(例如，突变(例如，SERPINA1基因中导致AIAT蛋白的氨基酸位置342(E342K)处的谷氨酸至赖氨酸取代的突变(例如，c.1024G>A)。如本文所展示，尤其是，此类细胞和动物可用于评估/表征所提供的技术，例如评估/表征多种寡核苷酸及其组合物的编辑特性和/或活性，包括评估其对抗一种或多种病症、障碍或疾病的用途。在一些实施例中，细胞是啮齿类动物细胞。在一些实施例中，细胞是小鼠细胞。在一些实施例中，动物是啮齿类动物。在一些实施例中，动物是小鼠。
在一些实施例中，本披露提供了用于评估/表征细胞和/或非人动物的技术，包括被工程化以包含或表达ADAR1多肽或其特征性部分，或编码ADAR1多肽或其特征性部分的多核苷酸的那些细胞和/或非人动物，该ADAR1多肽或其特征性部分和/或多核苷酸在工程化之前不在这些细胞和/或非人动物中和/或不在这些细胞和/或非人动物中表达。在一些实施例中，所提供的方法包括向细胞或其群体施用一种或多种寡核苷酸或组合物，该一种或多种寡核苷酸或组合物可以各自独立地编辑可比较的人类细胞或其群体中的腺苷。在一些实施例中，所提供的方法包括向动物或其群体施用一种或多种寡核苷酸或组合物，该一种或多种寡核苷酸或组合物可以各自独立地编辑人类细胞或其群体中的腺苷。在一些实施例中，将待评估/表征的细胞中或来自动物的细胞中的编辑水平与在可比较的人类细胞中观察到的编辑水平进行比较。在一些实施例中，可比较的人类细胞与待评估/表征的细胞或来自动物的细胞具有相同的类型。在一些实施例中，细胞是啮齿类动物细胞。在一些实施例中，细胞是小鼠细胞。在一些实施例中，动物是啮齿类动物。在一些实施例中，动物是小鼠。在一些实施例中，将一种或多种寡核苷酸或组合物单独施用于单独的细胞和/或动物。在一些实施例中，一种或多种寡核苷酸或组合物可以任选地同时施用于细胞和/或动物的同一集合。可编辑多种靶腺苷的多种寡核苷酸和组合物如本文所述并可相应地使用。
用途和应用
如本领域技术人员所理解的，寡核苷酸可用于多种目的。在一些实施例中，所提供的技术(例如，寡核苷酸、组合物、方法等)可用于调节多种核酸(例如，RNA)和/或由其编码的产物(例如，蛋白)的水平和/或活性。在一些实施例中，所提供的技术可以降低不期望的靶核酸(例如，包含不期望的腺苷)和/或其产物的水平和/或活性。在一些实施例中，所提供的技术可以增加所需的靶核酸(例如，在一个或多个位置处包含I而不是不期望的腺苷)和/或其产物的水平和/或活性。
例如，在一些实施例中，所提供的技术可以用作用于靶RNA序列中靶腺苷的定点编辑的单链寡核苷酸。在一些实施例中，所提供的技术能够调节表达和活性的水平。尤其是，本披露通过所提供的技术提供了改进，该改进可以是改进多种所需的生物功能，包括但不限于治疗和/或预防多种病症、障碍或疾病(例如，与G至A突变相关联的那些)。
在一些实施例中，所提供的技术可以调节靶基因的活性和/或功能。在一些实施例中，靶基因是意图改变一种或多种基因产物(例如，RNA和/或蛋白产物)的表达和/或活性的基因。在许多实施例中，靶基因具有待改变的靶腺苷残基，并且可以受益于此类残基向肌苷残基的转化。在一些实施例中，当如本文所述的寡核苷酸作用于特定靶基因时，与不存在寡核苷酸时相比，当存在寡核苷酸时，该基因的一种或多种基因产物的水平和/或活性可以改变。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸和组合物可用于通过以下方式来治疗多种病症、障碍或疾病：降低与病症、障碍或疾病相关联的靶转录物和/或由其编码的产物的水平和/或活性，并且任选地提供与病症、障碍或疾病较少相关或不相关的转录物和/或由其编码的产物(例如，通过将靶腺苷转化成肌苷以校正G至A突变、改变剪接等)。在一些实施例中，本披露提供了用于预防或治疗病症、障碍或疾病的方法，这些方法包括向易患或患有该病症、障碍或疾病的受试者施用有效量的所提供的寡核苷酸或组合物。在一些实施例中，本披露提供了用于预防或治疗病症、障碍或疾病的方法，这些方法包括向易患或患有病症、障碍或疾病的受试者施用所提供的单链寡核苷酸或其组合物，以用于对靶RNA序列中的核苷酸(例如，靶腺苷)进行定点编辑。在一些实施例中，所提供的用于定点编辑靶RNA序列中的核苷酸的单链寡核苷酸具有与转录物的一部分部分地或完全地互补的碱基序列，该转录物与病症、障碍或疾病相关。在一些实施例中，碱基序列使得其优先结合与病症、障碍或疾病有关的转录物，而不是与所述病症、障碍或疾病无关的其他转录物。在一些实施例中，病症、障碍或疾病与G至A突变相关。
在一些实施例中，所提供的方法中的寡核苷酸组合物是手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，治疗病症、障碍或疾病的方法可以包括施用包含共享共同碱基序列的多个寡核苷酸的组合物，该碱基序列与靶转录物中的靶序列互补。尤其是，本披露提供了一种改善，其包括作为寡核苷酸组合物施用如本披露所述的手性控制的寡核苷酸组合物，该手性控制的寡核苷酸组合物的特征在于，当其在系统中与靶转录物接触时，转录物的腺苷编辑相对于在参考条件下观察到的腺苷编辑得到改善，该参考条件选自由以下组成的组：不存在该组合物、存在参考组合物及其任何组合。在一些实施例中，参考组合物是相同序列或构成的寡核苷酸的外消旋制备物。在一些实施例中，靶转录物是寡核苷酸转录物。
如本领域技术人员所理解的，尤其是，所提供的技术可用于涉及腺苷至肌苷转化和/或可受益于腺苷至肌苷转化的多种应用。下面描述某些应用。
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阅读本披露内容的本领域技术人员将理解，多种G至A突变，例如来自C至T突变(一种发生在人类基因中的最常见的突变类型)的转录物中的那些突变，可以被校正并因此受益于所提供的技术。在一些实施例中，所提供的技术可用于靶向与多种极性或带电荷的氨基酸(例如，Ser、Tyr、Asp、Glu、His、Asn、Gln、Lys等)、终止密码子(乳白型、赭石型和琥珀型)、转录起始位点、剪接信号、微RNA识别位点、重复元件、微RNA(miRNA)、编码蛋白的转录物等相关联的突变。尤其是，所提供的技术可以引起不同的功能结果，例如改变的剪接、恢复/改善的蛋白表达和/或功能等。
在一些实施例中，通过编辑，所提供的技术可以恢复蛋白功能(例如，修复不能进行剪接校正的无义和错义突变，移除终止突变，防止蛋白错误折叠和聚集等，并且可以用于预防和/或治疗多种病症、障碍或疾病，诸如隐性或显性的遗传性疾病)，修饰蛋白功能(例如，改变蛋白加工(例如，蛋白酶切割位点)，蛋白-蛋白相互作用，调节信号传导途径等，并且可以用于预防和/或治疗多种病症、障碍或疾病，诸如与离子通道渗透性相关的那些)，蛋白上调(例如，miRNA靶点修饰，修饰上游ORF，修饰泛素化位点等，并且可以用于预防和/或治疗多种病症、障碍或疾病，诸如单倍剂量不足的疾病))。
某些应用例如在WO 2016097212、WO 2017220751、WO 2018041973和/或WO2018134301A1中描述。
在一些实施例中，当寡核苷酸或寡核苷酸组合物与系统中包含靶腺苷的靶核酸接触时，靶核酸中的靶腺苷被修饰。在一些实施例中，当寡核苷酸或寡核苷酸组合物与系统中包含靶腺苷的靶核酸接触时，与不存在产物或存在参考寡核苷酸相比，靶核酸的水平降低。在一些实施例中，当寡核苷酸或寡核苷酸组合物与系统中包含靶腺苷的靶核酸接触时，与不存在寡核苷酸或存在参考寡核苷酸相比，靶核酸或其产物的剪接被改变。在一些实施例中，当寡核苷酸或寡核苷酸组合物与系统中包含靶腺苷的靶核酸接触时，与不存在产物或存在参考寡核苷酸相比，靶核酸的产物的水平被改变。在一些实施例中，产物的水平增加，其中该产物是核酸或由核酸编码，该核酸在其他方面与靶核酸相同但靶腺苷被修饰。在一些实施例中，产物的水平增加，其中该产物是核酸或由核酸编码，该核酸在其他方面与靶核酸相同但靶腺苷被肌苷代替。在一些实施例中，产物的水平增加，其中该产物是核酸或由核酸编码，该核酸在其他方面与靶核酸相同但靶腺苷的腺嘌呤被鸟嘌呤代替。在一些实施例中，产物是蛋白。在一些实施例中，靶腺苷是来自鸟嘌呤的突变。在一些实施例中，靶腺苷与相同位置的鸟嘌呤相比与病症、障碍或疾病更相关。在一些实施例中，寡核苷酸能够与靶核酸形成双链复合物。在一些实施例中，靶核酸或其部分是或包含RNA。在一些实施例中，靶腺苷是RNA的靶腺苷。在一些实施例中，靶腺苷被修饰，并且该修饰是或包括靶腺苷的脱氨。在一些实施例中，靶腺苷被修饰并且该修饰是或包括靶腺苷向肌苷的转化。在一些实施例中，修饰由ADAR蛋白促进。在一些实施例中，系统是含有ADAR蛋白的体外或离体系统。在一些实施例中，系统是或包括含有或表达ADAR蛋白的细胞。在一些实施例中，系统是包含含有或表达ADAR蛋白的细胞的受试者。在一些实施例中，ADAR蛋白是ADAR1。在一些实施例中，ADAR1蛋白是或包含p110同种型。在一些实施例中，ADAR1蛋白是或包含p150同种型。在一些实施例中，ADAR1蛋白是或包含p110和p150同种型。在一些实施例中，ADAR蛋白是ADAR2。如本文所展示，本披露尤其提供了用于将酶募集到靶点(例如，包含靶A的那些靶点)的技术，这些技术包括使此类靶点与所提供的寡核苷酸或其组合物接触，或向包含或表达包含此类靶点的多核苷酸(例如，RNA)的系统施用所提供的寡核苷酸或其组合物。在一些实施例中，酶是RNA编辑酶，诸如如本文所述的ADAR1、ADAR2等。
在一些实施例中，包含多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物提供比用可比较的参考寡核苷酸组合物观察到的更高水平，例如靶腺苷以更高水平被修饰。在一些实施例中，参考寡核苷酸组合物不含该多个寡核苷酸或包含更低水平的该多个寡核苷酸。在一些实施例中，参考组合物不含与该多个寡核苷酸具有相同构成的寡核苷酸。在一些实施例中，参考组合物不含与该多个寡核苷酸具有相同结构的寡核苷酸。在一些实施例中，参考寡核苷酸组合物是这样的组合物，其与该多个寡核苷酸具有相同碱基序列的寡核苷酸与该多个寡核苷酸相比包含更低水平的2'-F修饰。在一些实施例中，参考寡核苷酸组合物是这样的组合物，其与该多个寡核苷酸具有相同碱基序列的寡核苷酸与该多个寡核苷酸相比包含更低水平的2'-OMe修饰。在一些实施例中，参考寡核苷酸组合物是这样的组合物，其与该多个寡核苷酸具有相同碱基序列的寡核苷酸与该多个寡核苷酸相比具有不同的糖修饰模式。在一些实施例中，参考寡核苷酸组合物是这样的组合物，其与该多个寡核苷酸具有相同碱基序列的寡核苷酸与该多个寡核苷酸相比包含更低水平的经修饰的核苷酸间键联。在一些实施例中，参考寡核苷酸组合物是这样的组合物，其与该多个寡核苷酸具有相同碱基序列的寡核苷酸与该多个寡核苷酸相比包含更低水平的硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，组合物是立体随机寡核苷酸组合物。在一些实施例中，参考组合物是与该多个寡核苷酸具有相同构成的寡核苷酸的立体随机寡核苷酸组合物。
在一些实施例中，本披露提供了用于修饰靶核酸中的靶腺苷的技术，这些技术包括使靶核酸与如本文所述的所提供的寡核苷酸或寡核苷酸组合物接触。在一些实施例中，本披露提供了用于使靶核酸中的靶腺苷脱氨的方法，该方法包括使靶核酸与如本文所述的寡核苷酸或组合物接触。在一些实施例中，本披露提供了用于产生特定核酸的产物、或者恢复或增加特定核酸的产物的水平的方法，该方法包括使靶核酸与所提供的寡核苷酸或组合物接触，其中靶核酸包含靶腺苷，并且该特定核酸与靶核酸的不同之处在于该特定核酸具有I或G而不是靶腺苷。在一些实施例中，本披露提供了用于降低靶核酸的产物的水平的方法，该方法包括使靶核酸与本披露的寡核苷酸或组合物接触，其中靶核酸包含靶腺苷。在一些实施例中，产物是蛋白。在一些实施例中，产物是mRNA。
在一些实施例中，本披露提供了方法，该方法包括：
使寡核苷酸或组合物与包含靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触，其中：
寡核苷酸组合物中的一个或多个寡核苷酸的碱基序列与靶核酸的碱基序列基本上互补；并且
靶核酸包含靶腺苷；
其中靶腺苷被修饰。
在一些实施例中，本披露提供了方法，该方法包括：
1)获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；以及
2)获得靶核酸中靶腺苷的参考修饰水平，该水平是当参考寡核苷酸组合物与包含靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含比该参考多个寡核苷酸更多的具有2'-F修饰的糖，更多的具有2'-OR修饰的糖，其中R不是-H，和/或更多的手性核苷酸间键联；以及
与该参考寡核苷酸组合物的寡核苷酸相比，该第一寡核苷酸组合物提供更高水平的修饰。
在一些实施例中，本披露提供了方法，该方法包括：
获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；并且
其中靶腺苷的该第一修饰水平高于靶腺苷的参考修饰水平，其中该参考水平是在参考寡核苷酸组合物与包含靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含比该参考多个寡核苷酸更多的具有2'-F修饰的糖，更多的具有2'-OR修饰的糖，其中R不是-H，和/或更多的手性核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露提供了方法，该方法包括：
1)获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；以及
2)获得靶核酸中靶腺苷的参考修饰水平，该水平是当参考寡核苷酸组合物与包含靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含比该参考多个寡核苷酸更多的具有2'-F修饰的糖，更多的具有2'-OR修饰的糖，其中R不是-H，和/或更多的手性控制的手性核苷酸间键联；以及
与该参考寡核苷酸组合物的寡核苷酸相比，该第一寡核苷酸组合物提供更高水平的修饰。
在一些实施例中，本披露提供了方法，该方法包括：
获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；并且
其中靶腺苷的该第一修饰水平高于靶腺苷的参考修饰水平，其中该参考水平是在参考寡核苷酸组合物与包含靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含比该参考多个寡核苷酸更多的具有2'-F修饰的糖，更多的具有2'-OR修饰的糖，其中R不是-H，和/或更多的手性控制的手性核苷酸间键联。
在一些实施例中，本披露提供了方法，该方法包括：
1)获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；以及
2)获得靶核酸中靶腺苷的参考修饰水平，该水平是当参考寡核苷酸组合物与包含靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含一个或多个手性控制的手性核苷酸间键联；以及
该参考多个寡核苷酸不含手性控制的手性核苷酸间键联(参考寡核苷酸组合物是“立体随机组合物”)；以及
与该参考寡核苷酸组合物的寡核苷酸相比，该第一寡核苷酸组合物提供更高水平的修饰。
在一些实施例中，本披露提供了方法，该方法包括：
获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；并且
其中靶腺苷的该第一修饰水平高于靶腺苷的参考修饰水平，其中该参考水平是在参考寡核苷酸组合物与包含靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含一个或多个手性控制的手性核苷酸间键联；以及
该参考多个寡核苷酸不含手性控制的手性核苷酸间键联(参考寡核苷酸组合物是“立体随机组合物”)。
在一些实施例中，第一寡核苷酸组合物是如本文所述的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，第一寡核苷酸组合物是手性控制的寡核苷酸组合物。在一些实施例中，脱氨酶是ADAR酶。在一些实施例中，脱氨酶是ADAR1。在一些实施例中，脱氨酶是ADAR2。在一些实施例中，样品是或包含细胞。在一些实施例中，与不同于靶核酸的核酸相比，靶核酸与病症、障碍或疾病，或所需的特性或功能的减弱，或不期望的特性或功能的增强更相关，该不同在于其在靶腺苷的位置具有I或G而不是该靶腺苷。在一些实施例中，靶腺苷是G至A突变。
尤其是，本披露的寡核苷酸设计，例如核碱基、糖、核苷酸间键联修饰、键联磷立体化学的控制和/或其模式，可应用于改进现有技术。在一些实施例中，本披露通过向现有技术中的寡核苷酸引入本披露的一个或多个结构特征，例如核碱基、糖、核苷酸间键联修饰、键联磷立体化学的控制和/或其模式，提供了对现有技术的改进。在一些实施例中，改进是或包括来自键联磷立体化学控制的改进。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸或寡核苷酸组合物不引起核酸的显著降解(例如，不超过约5％-100％(例如，不超过约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等))。在一些实施例中，组合物不引起靶核酸中显著的不期望的外显子跳跃或改变的外显子包含(例如，不超过约5％-100％(例如，不超过约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等))。
在一些实施例中，所提供的技术可以提供高水平的腺苷编辑(例如，转化成肌苷)。在一些实施例中，靶腺苷编辑的百分比为约10％-100％，例如至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施例中，其为至少10％。在一些实施例中，其为至少15％。在一些实施例中，其为至少20％。在一些实施例中，其为至少25％。在一些实施例中，其为至少30％。在一些实施例中，其为至少35％。在一些实施例中，其为至少40％。在一些实施例中，其为至少45％。在一些实施例中，其为至少50％。在一些实施例中，其为至少60％。在一些实施例中，其为至少70％。在一些实施例中，其为至少75％。在一些实施例中，其为至少80％。在一些实施例中，其为至少85％。在一些实施例中，其为至少90％。在一些实施例中，其为至少95％。在一些实施例中，其为至少约100％。
在一些实施例中，寡核苷酸或其组合物能够介导靶核酸或其产物的表达或水平的降低(例如，通过将靶腺苷修饰为肌苷)。在一些实施例中，寡核苷酸或其组合物能够在体外介导细胞中靶基因或其基因产物的表达或水平的降低(例如，通过将靶腺苷修饰为肌苷)。在一些实施例中，表达或水平可以降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施例中，通过由寡核苷酸或其组合物(例如，在体外在细胞中以10μM或更低的浓度)指导的ADAR介导的脱氨，靶基因或其基因产物的表达或水平可以降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施例中，寡核苷酸或其组合物能够在1nM、5nM、10nM或更低的浓度下提供合适水平的活性(例如，当在体外或体内在细胞中测定时)。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸和组合物的活性可以通过IC50来评估，IC50是在适合的条件下(例如，基于细胞的体外测定中)使靶核酸或其产物的水平降低50％的抑制浓度。在一些实施例中，例如当在基于细胞的测定中评估时，所提供的寡核苷酸或组合物具有不超过0.001、0.01、0.1、0.5、1、2、5、10、50、100、200、500或1000nM的IC50。在一些实施例中，IC50不超过约500nM。在一些实施例中，IC50不超过约200nM。在一些实施例中，IC50不超过约100nM。在一些实施例中，IC50不超过约50nM。在一些实施例中，IC50不超过约25nM。在一些实施例中，IC50不超过约10nM。在一些实施例中，IC50不超过约5nM。在一些实施例中，IC50不超过约2nM。在一些实施例中，IC50不超过约1nM。在一些实施例中，IC50不超过约0.5nM。
在一些实施例中，所提供的技术可以提供靶腺苷相对于靶腺苷中的其他腺苷残基的选择性编辑。在一些实施例中，靶腺苷相对于非靶腺苷的选择性为至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍(例如，如通过在合适的条件下靶腺苷相对于非靶腺苷的编辑水平所测量的，或通过用于某一编辑水平(例如，0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％等)的寡核苷酸浓度所测量的)。在一些实施例中，选择性为至少2倍。在一些实施例中，选择性为至少3倍。在一些实施例中，选择性为至少4倍。在一些实施例中，选择性为至少5倍。在一些实施例中，选择性为至少10倍。在一些实施例中，选择性为至少25倍。在一些实施例中，选择性为至少50倍。在一些实施例中，选择性为至少100倍。
在一些实施例中，本披露提供了用于抑制靶核酸序列的转录物的方法，对于该靶核酸序列，群体中存在一个或多个相似核酸序列，靶序列和相似序列中的每一者包含相对于相似序列限定靶序列的特定特征性序列元件，该方法包括使包含靶核酸序列的转录物的样品与寡核苷酸或包含共享共同碱基序列的多个寡核苷酸的组合物接触，其中该寡核苷酸的碱基序列或该多个寡核苷酸的共同碱基序列是或包含与限定靶核酸序列的特征性序列元件互补的序列。在一些实施例中，其中当寡核苷酸或寡核苷酸组合物与包含靶核酸序列和相似核酸序列两者的转录物的系统接触时，靶核酸序列的转录物以比相似核酸序列所观察到的抑制水平更高的水平被抑制。在一些实施例中，对靶核酸序列的转录物的抑制可以是对类似核酸序列观察到的抑制的1.1-100、2-100、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施例中，靶核酸序列与病症、障碍或疾病相关(或与类似的核酸序列相比，与病症、障碍或疾病更相关)。如本领域技术人员将理解的，选择性减少与病症、障碍或疾病相关联的转录物(和/或其产物)，同时保持与病症、障碍或疾病无关或较少相关的转录物可以提供许多优点，例如，提供疾病治疗和/或预防，同时保持一种或多种所需的生物功能(其可以尤其产生较少的或不太严重的副作用)。
在一些实施例中，如本文所展示，在系统(例如，本文所述的报告子测定)中，选择性为至少10倍，或20、30、40或50倍或更多倍。在一些实施例中，寡核苷酸或组合物可有效降低突变体蛋白的水平(例如，突变体蛋白降低至少50％、60％、70％或更多)，同时维持系统中野生型蛋白的水平(例如，保留至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的野生型蛋白)。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸在多种生物系统中(例如，在小鼠脑匀浆中)是稳定的(例如，在1、2、3、4、5、6、7或8天后剩余至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多)。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸具有低毒性。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸及其组合物(例如，手性控制的寡核苷酸及其组合物)不显著激活TLR9(例如，当与参考寡核苷酸及其组合物(例如，对应的立体随机寡核苷酸及其组合物)相比时)。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸及其组合物(例如，手性控制的寡核苷酸及其组合物)不显著诱导补体激活(例如，当与参考寡核苷酸及其组合物(例如，对应的立体随机寡核苷酸及其组合物)相比时)。
对于多种应用，所提供的寡核苷酸和/或组合物可以作为药物组合物提供。在一些实施例中，本披露提供了药物组合物，该组合物包含或递送有效量的寡核苷酸或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，药物组合物可包含多种形式的寡核苷酸，例如酸、碱和多种药学上可接受的盐形式。在一些实施例中，药学上可接受的盐是钠盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是钾盐。在一些实施例中，药学上可接受的盐是胺盐(例如，具有N(R)3的结构的胺的盐)。在一些实施例中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载剂。在一些实施例中，药物组合物是或包含液体溶液。在一些实施例中，液体组合物具有控制的pH范围，例如约生理pH或为生理pH。
尤其是，本披露提供了用于预防或治疗病症、障碍或疾病的技术。在一些实施例中，病症、障碍或疾病适合(例如，可以受益于)A向I的转化。在一些实施例中，本披露提供了用于预防或治疗适合G至A突变的病症、障碍或疾病的方法，该方法包括向易患或患有该病症、障碍或疾病的受试者施用有效量的如本文所述的寡核苷酸或组合物。在一些实施例中，本披露提供了用于预防或治疗与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的方法，该方法包括向易患或患有该病症、障碍或疾病的受试者施用有效量的如本文所述的寡核苷酸或组合物。在一些实施例中，寡核苷酸组合物中的一种或多种寡核苷酸的碱基序列与包含靶腺苷的靶核酸的碱基序列基本上互补。在一些实施例中，与病症、障碍或疾病相关联的细胞、组织或器官包含或表达ADAR蛋白。在一些实施例中，与病症、障碍或疾病相关联的细胞、组织或器官包含或表达ADAR1(例如，p110和/或p150形式)。在一些实施例中，与病症、障碍或疾病相关联的细胞、组织或器官包含或表达ADAR2。在一些实施例中，病症、障碍或疾病如本文所述。在一些实施例中，病症、障碍或疾病是α-1抗胰蛋白酶缺乏症。在一些实施例中，方法包括将靶腺苷转化成I。
在一些实施例中，本披露提供了包含与靶序列互补的序列的寡核苷酸。在一些实施例中，本披露提供了指导位点特异性(也可称为定点)编辑(例如，脱氨)的寡核苷酸。在一些实施例中，本披露提供了指导由ADAR(例如，内源性ADAR)介导的位点特异性腺苷编辑的寡核苷酸。多种所提供的寡核苷酸可以用作用于靶RNA序列中核苷酸的定点编辑的单链寡核苷酸。在一些实施例中，本披露提供了使用所提供的用于靶RNA序列中核苷酸的定点编辑的单链寡核苷酸及其组合物来预防和/或治疗与靶序列中的G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的方法。在一些实施例中，本披露提供了用作药物的寡核苷酸及其组合物，这些药物例如用于与靶序列中的G至A突变相关联的病症、障碍或疾病。在一些实施例中，本披露提供了用于治疗与靶序列中的G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的寡核苷酸及其组合物。在一些实施例中，本披露提供了用于制备药物的寡核苷酸及其组合物，这些药物用于治疗与靶序列中的G至A突变相关联的相关病症、障碍或疾病。
在一些实施例中，本披露提供了用于预防、治疗或改善易患或患有与靶序列中的G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的受试者的该病症、障碍或疾病的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的寡核苷酸或其药物组合物。
在一些实施例中，本披露提供用于使细胞的靶序列中的靶腺苷脱氨的方法，该方法包括：使该细胞与寡核苷酸或其组合物接触。在一些实施例中，本披露提供了使细胞的靶序列(例如，转录物)中的靶腺苷脱氨的方法，该方法包括：使该细胞与寡核苷酸或其组合物接触。在一些实施例中，本披露提供了用于降低细胞中与G至A突变相关联的蛋白的水平的方法，该方法包括：使该细胞与寡核苷酸或其组合物接触。在一些实施例中，所提供的方法可以选择性地降低转录物和/或由其编码的产物的水平，这些转录物和/或产物与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病有关。在一些实施例中，所提供的方法可以相对于在靶A的位置处具有G的其他方面相同的核酸选择性地编辑靶核酸，例如包含不期望的A(例如，G至A突变)的转录物。
在一些实施例中，本披露提供了用于降低有需要的哺乳动物中的突变基因(例如，G至A突变)表达的方法，该方法包括向该哺乳动物施用核酸-脂质颗粒，该核酸-脂质颗粒包含所提供的用于定点编辑靶RNA序列中的核苷酸的单链寡核苷酸或其组合物。
在一些实施例中，本披露提供了用于体内递送寡核苷酸的方法，该方法包括向哺乳动物施用寡核苷酸或其组合物。
在一些实施例中，适合于治疗与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的受试者或患者可由健康护理专业人员鉴别或诊断。
在一些实施例中，与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的症状可以是可受益于A至I转化的任何病症、障碍或疾病。
在一些实施例中，所提供的用于靶RNA序列中核苷酸的定点编辑的单链寡核苷酸或其组合物可以预防、治疗、改善或减缓与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病，或与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的至少一种症状。
在一些实施例中，本披露的方法可以用于治疗受试者的与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病，其中该方法包括向受试者施用治疗有效量的寡核苷酸或其药物组合物。
在一些实施例中，所提供的方法可以减轻与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的至少一种症状，其中该方法包括向受试者施用治疗有效量的寡核苷酸或其药物组合物。
在一些实施例中，向患者或受试者施用寡核苷酸能够介导以下任一个或多个方面：减缓与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的进展；延迟与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病或其至少一种症状的发作；改善与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的一种或多种指标；和/或增加患者或受试者的存活时间或寿命。
在一些实施例中，减缓疾病进展可涉及在易患或患有与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病(诸如本文所述的那些)的个体中预防或延迟一个或多个临床参数的临床上不合需要的变化。使用本文所述的一种或多种疾病评估测试来鉴别易感或患有与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的个体中疾病进展的减缓完全在医师的能力范围内。另外，应当理解，除了本文所述的那些以外，医师还可以对个体进行诊断测试，以评估易患或患有与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的个体的疾病进展速率。
医师可以使用与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的家族史，或与具有相似遗传特征的其他患者的比较。
在一些实施例中，与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的指标包括由医学专业人员(诸如医师)用于诊断或测量病症、障碍或疾病的进展的参数。
在一些实施例中，向受试者施用寡核苷酸或其组合物和另外的药剂和/或方法，例如另外的治疗剂和/或方法。在一些实施例中，寡核苷酸或其组合物可以单独施用或与一种或多种其他治疗剂和/或治疗组合施用。当组合施用时，每种组分可以同时或以任何顺序在不同时间点依次施用。在一些实施例中，可以分开地但在时间上足够紧密地施用每种组分，以提供期望的治疗效果。在一些实施例中，同时提供所提供的寡核苷酸和其他治疗成分。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸和另外的治疗组分可以作为一种组合物施用。在一些实施例中，在一个时间点，被施用的受试者可以同时暴露于所提供的寡核苷酸和另外的组分。
在一些实施例中，另外的治疗剂可以与寡核苷酸物理缀合。在一些实施例中，另外的药剂是GalNAc。在一些实施例中，所提供的用于靶RNA序列中核苷酸的定点编辑的单链寡核苷酸可以与另外的药剂物理缀合。在一些实施例中，另外的药剂寡核苷酸可具有如本披露中所述的碱基序列、糖、核碱基、核苷酸间键联，糖、核碱基和/或核苷酸间键联修饰模式，骨架手性中心模式等，或其任何组合，其中每个T独立地被U代替并且反之亦然。在一些实施例中，寡核苷酸可与第二寡核苷酸物理缀合，该第二寡核苷酸可降低(直接或间接)靶序列的表达、活性和/或水平，或可用于治疗与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病。
在一些实施例中，所提供的用于靶RNA序列中核苷酸的定点编辑的单链寡核苷酸可以与一种或多种另外的(或第二)治疗剂一起施用，以用于与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病。
在一些实施例中，可以向受试者施用寡核苷酸和另外的治疗剂，其中该另外的治疗剂是可用于治疗待治疗的病症、障碍或疾病的本文所述或本领域已知的药剂。
在一些实施例中，所提供的用于靶RNA序列中核苷酸的定点编辑的单链寡核苷酸可以与用于病症、障碍或疾病或其症状的一种或多种治疗一起共同施用或作为治疗方案的一部分与用于病症、障碍或疾病或其症状的一种或多种治疗一起使用，该一种或多种治疗包括但不限于：适体、lncRNA、lncRNA抑制剂、抗体、肽、小分子、靶向其他靶的其他寡核苷酸。
在一些实施例中，作为非限制性实例，另外的治疗性处理是编辑基因的方法。
在一些实施例中，作为非限制性实例，另外的治疗剂是寡核苷酸。
在一些实施例中，可以在寡核苷酸之前、同时或之后向受试者施用第二或另外的治疗剂。在一些实施例中，第二或另外的治疗剂可以多次施用给受试者，并且寡核苷酸也多次施用给受试者，并且以任何顺序施用。
在一些实施例中，改善可以包括降低在疾病状态下过高的基因或基因产物的表达、活性和/或水平；增加在疾病状态下过低的基因或基因产物的表达、活性和/或水平；和/或降低基因或基因产物的突变型和/或疾病相关变体的表达、活性和/或水平。
在一些实施例中，可用于治疗、改善和/或预防与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的寡核苷酸或组合物可以经由多种合适的可用技术施用(例如，施用给受试者)。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸，例如用于靶RNA序列中核苷酸的定点编辑的单链寡核苷酸，可以作为药物组合物施用，例如以用于治疗、改善和/或预防病症、障碍或疾病。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含至少一个手性控制的核苷酸间键联。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸组合物是手性控制的。
尤其是，与参考技术(例如，不存在或存在低水平的手性控制(例如，立体随机寡核苷酸组合物(例如，具有相同碱基序列或相同构成的寡核苷酸的立体随机寡核苷酸组合物))，和/或不存在或存在低水平的某些修饰及其模式(例如，2'-F、不带负电荷的核苷酸间键联等))相比，本披露的技术(例如，寡核苷酸及其组合物)可以提供多种改进和优点，诸如改善的稳定性、递送、编辑效率、药代动力学和/或药效动力学。在一些实施例中，参考寡核苷酸组合物是具有相同碱基序列的寡核苷酸的立体随机寡核苷酸组合物。在一些实施例中，参考寡核苷酸组合物是具有相同构成的寡核苷酸的立体随机寡核苷酸组合物(如本领域技术人员所理解的，在一些实施例中，多种盐形式可适当地视为具有相同构成)。在一些实施例中，参考寡核苷酸是不含不带负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸。在一些实施例中，参考寡核苷酸不含n001。在一些实施例中，参考寡核苷酸组合物是不含不带负电荷的核苷酸间键联的寡核苷酸的组合物。在一些实施例中，参考寡核苷酸组合物是不含n001的寡核苷酸的组合物。在一些实施例中，与参考技术相比，所提供的技术可以较低的单位或总剂量使用，和/或可以较低的剂量和/或较长的剂量间隔施用(例如，以实现相当的或更好的效果)。在一些实施例中，所提供的技术可以提供持久的编辑。在一些实施例中，所提供的技术一旦施用就能在一段时间内，例如在最后一剂后约或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60天或更多天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个月，以某一水平或更高的水平(例如，对提供某些生物和/或治疗效果有用和/或足够的水平)提供活性，例如，靶编辑。在一些实施例中，所提供的技术提供低毒性。在一些实施例中，与参考技术相比，所提供的技术可以较高的单位或总剂量使用，和/或可以更多的剂量和/或更短的剂量间隔施用(例如，以实现更好的效果)。在一些实施例中，总剂量可以作为单一剂量施用。在一些实施例中，总剂量可以作为两个或更多个单一剂量施用。在一些实施例中，与作为两个或更多个单一剂量施用时相比，作为单一剂量施用的总剂量可以提供更高的最大编辑水平。
在一些情况下，已经施用寡核苷酸作为药物的患者可能经历某些副作用或不良反应，包括：血小板减少、肾毒性、肾小球肾炎和/或凝血异常；遗传毒性、靶器官重复剂量毒性和病理效应；剂量反应和暴露关系；慢性毒性；幼年毒性；生殖和发育毒性；心血管安全性；注射部位反应；细胞因子应答补体效应；免疫原性；和/或致癌性。在一些实施例中，施用另外的治疗剂以抵消施用寡核苷酸的副作用或不良反应。在一些实施例中，与用于靶RNA序列中核苷酸的定点编辑的不同单链寡核苷酸相比，用于靶RNA序列中核苷酸的定点编辑的特定单链寡核苷酸可具有降低的引起副作用或不良反应的能力。
在一些实施例中，可以向患者施用另外的治疗剂，以控制或减轻与寡核苷酸施用相关联的一种或多种副作用或不良反应。
在一些实施例中，可将寡核苷酸和一种或多种另外的治疗剂施用给患者(以任何顺序)，其中可以向患者施用另外的治疗剂，以控制或减轻与寡核苷酸施用相关联的一种或多种副作用或不良反应。
在一些实施例中，可将寡核苷酸和一种或多种另外的治疗剂施用给患者(以任何顺序)，其中可以向患者施用另外的治疗剂，以控制或减轻与寡核苷酸施用相关联的一种或多种副作用或不良反应。
在一些实施例中，可将寡核苷酸和一种或多种另外的治疗剂施用给患者(以任何顺序)，其中可以向患者施用另外的治疗剂，以控制或减轻与寡核苷酸施用相关联的一种或多种副作用或不良反应，并且其中寡核苷酸通过任何生化机制起作用，该生化机制包括但不限于：降低靶基因或其基因产物的水平、表达和/或活性，增加或降低靶基因mRNA中一个或多个外显子的跳读，ADAR介导的脱氮，RNaseH介导的机制，空间位阻介导的机制和/或RNA干扰介导的机制，其中寡核苷酸是单链或双链的。
在一些实施例中，可将寡核苷酸组合物和一种或多种另外的治疗剂施用给患者(以任何顺序)，其中可以向患者施用另外的治疗剂，以控制或减轻与寡核苷酸组合物施用相关联的一种或多种副作用或不良反应，并且其中寡核苷酸组合物可以是手性控制的或包含至少一个手性控制的核苷酸间键联(包括但不限于手性控制的硫代磷酸酯)。
多种病症、障碍或疾病可以受益于腺苷编辑，包括与G至A突变相关联的那些，例如囊性纤维化、赫尔勒综合征(Hurler Syndrome)、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏、帕金森病、阿尔茨海默病、白化病、肌萎缩症侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、卡德西尔综合征(Cadasilsyndrome)、腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease)、慢性阻塞性肺病(COPD)、远端脊髓性肌萎缩症(DSMA)、杜氏/贝克尔肌营养不良(Duchenne/Becker musculardystrophy)、营养不良型大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病(Fabrydisease)、因子V莱顿相关疾病(Factor V Leiden associated disorder)、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、戈谢病(Gaucher's Disease)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色素沉着症、亨特综合征(Hunter Syndrome)、亨廷顿病(Huntington's disease)、炎症性肠病(IBD)、遗传性多凝集综合征、莱伯氏先天性黑蒙症(Leber congenital amaurosis)、莱施-尼汉综合征(Lesch-Nyhan syndrome)、林奇综合征(Lynch syndrome)、马凡综合征(Marfan syndrome)、粘多糖贮积症、肌营养不良、肌强直性营养不良I型和II型、神经纤维瘤病、尼曼匹克病(Niemann-Pick disease)A、B和C型、NY-eso1相关癌症、黑斑息肉综合征(Peutz-Jeghers Syndrome)、苯丙酮尿症、庞贝氏病(Pompe's disease)、原发性睫毛疾病、凝血酶原突变相关疾病(诸如凝血酶原G20210A突变)、肺动脉高压、色素性视网膜炎、桑霍夫病(Sandhoff Disease)、严重联合免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞性贫血、脊髓性肌肉萎缩症、斯特格氏病(Stargardt's Disease)、泰萨二氏病(Tay-Sachs Disease)、乌谢尔综合征(Usher syndrome)、X连锁免疫缺陷、斯特奇-韦伯综合征和多种癌症。
在一些实施例中，病症、障碍或疾病是α-1抗胰蛋白酶(AIAT)缺乏(AATD)。
α-1抗胰蛋白酶(AIAT)缺乏(AATD)是据报道由SERPINA1基因(也称为PI、AIA、AAT、PIl、AIAT、PR02275和alpha1AT)的缺陷导致的遗传疾病。严重的AIAT缺乏与包括肺和肝表型在内的多种表型相关。
据报道，AIAT缺乏是北欧血统受试者中最常见的遗传疾病之一。仅在美国严重AAT缺乏的患病率就达到80,000-100,000例。在欧盟的数量估计相似。全世界估计有300万人患有严重的AAT缺乏。IAT缺乏会引起肺气肿，受试者在其第三或第四个十年中出现肺气肿。AIAT缺乏也可引起肝衰竭和肝细胞癌，高达30％的患有严重AIAT缺乏的受试者会发展出明显的肝病，包括肝硬化、暴发性肝衰竭和肝细胞癌。
SERPINA1基因中的A突变(即，c.1024G>A)导致成熟AIAT蛋白的氨基酸位置342处的谷氨酸至赖氨酸取代(E342K，“Z突变”)。这种错义突变影响蛋白构象和分泌，从而导致AIAT的循环水平降低。携带Z突变的等位基因被鉴定为PiZ等位基因。PiZ等位基因纯合的受试者称为PiZZ携带者，并表达正常水平的10％-15％的血清A1AT。约95％有A1AT缺陷症状的受试者具有PiZZ基因型。Z突变杂合的受试者称为PiMZ突变体，并表达正常水平的60％的血清A1AT。在确诊的患者中，90％患有严重AAT缺乏的患者具有ZZ突变。美国约有30,000至50,000人具有PiZZ基因型。
A1AT缺乏的病理生理学可随受影响的器官而变化。据报道，肝病是由于功能获得机制引起的。异常折叠的A1AT，特别是Z型A1AT(Z-AT)在肝细胞内聚集和聚合。A1AT内含物存在于PiZZ受试者中，并且被认为引起肝硬化，并且在一些情况下引起肝细胞癌。肝病中功能获得机制的证据得到了无效纯合子的支持。这些受试者不产生A1AT并且不发展肝细胞内含物或肝病。
据报道，AIAT缺乏在高达约50％的AIAT受试者中导致肝病，并且在高达约30％的受试者中导致严重的肝病。肝病可能表现为：(a)儿童期中自限性的肝硬化，(b)儿童期或成年期中需要肝移植或导致死亡的严重肝硬化，和(c)通常致死的肝细胞癌。据报道，肝病的发病呈双峰型，主要影响儿童或成人。儿童疾病在许多情况下是自限性的，但可能导致终末期、致命性肝硬化。据报道，高达约18％的具有PiZZ基因型的受试者可在儿童期中发展出临床上显著的肝异常。据报道，约2％的PiZZ受试者发生严重的肝硬化，导致在儿童期死亡(Sveger 1988；Volpert 2000)。成人发病的肝病可影响具有所有基因型的受试者，但在具有PiZZ基因型的受试者中较早出现。据报道，约2％-10％的AIAT缺陷型受试者发展出成人发病的肝病。
与AIAT缺乏相关联的肺病目前通过静脉内施用人源性代替AIAT蛋白来治疗，但除了成本高昂和需要在受试者的整个生命期内频繁注射外，该方法仅部分有效。目前用化学疗法和手术来治疗患有肝细胞癌的AIAT缺陷型受试者，但没有令人满意的方法来预防AIAT缺乏可能致命的肝表现。
尤其是，本披露认识到需要改善对AIAT缺乏(例如，包括其肝和肺表现)的治疗。在一些实施例中，本披露提供了用于预防或治疗与α-1抗胰蛋白酶(AIAT)缺乏相关联的病症、障碍或疾病的技术，例如，通过提供可以将A突变转化成I的寡核苷酸和/或组合物，该I可以在蛋白翻译期间被读作G，从而为蛋白翻译校正G至A突变。尤其是，改变一种或多种肝细胞中的SERPINA1可以通过减少或消除毒性Z蛋白(Z-AAT)的产生来预防AIAT缺乏受试者中肝病的进展。在某些实施例中，通过利用所提供的技术消除或减少Z蛋白的产生。在某些实施例中，与未接受治疗的受试者相比，疾病被治愈、未进展或进展延迟。
在某些实施例中，如本文所述的技术可以为一种或多种经处理的肝细胞的存活提供选择性优势。在某些实施例中，靶细胞被修饰。在一些实施例中，用本文的技术处理的细胞可能不会产生毒性Z蛋白。在一些实施例中，未被修饰的患病细胞产生毒性Z蛋白，并且可经历继发于由Z蛋白错误折叠诱导的内质网(ER)应激的细胞凋亡。在某些实施例中，在使用所提供的技术处理之后，经处理的细胞将存活而未经处理的细胞将死亡。这种选择性优势可以驱动肝细胞的最终定殖，其中大部分是SERPINA1校正的细胞。
在一些实施例中，当将寡核苷酸施用于患有或易患与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的患者时，该寡核苷酸能够减轻该病症、障碍或疾病的至少一种症状和/或能够延迟或预防由于基因或基因产物中的G至A突变引起的病症、障碍或疾病的至少一种症状的发作、恶化和/或降低其恶化速率和/或程度。
在一些实施例中，所提供的技术可以提供对系统(例如，细胞、组织、器官、动物等)中的两个或更多个位点的编辑(“多重编辑”)。在一些实施例中，所提供的技术可以靶向相同转录物的两个或更多个位点并提供对这些位点的编辑。在一些实施例中，所提供的技术可以靶向来自相同核酸或不同核酸的两种或更多种不同转录物并提供对这些转录物的编辑。在一些实施例中，所提供的技术可以靶向来自两种或更多种不同核酸的转录物并提供对这些转录物的编辑。在一些实施例中，所提供的技术可靶向来自两种或更多种不同基因的转录物并提供对这些转录物的编辑。在一些实施例中，在同时编辑的靶中，各自独立地处于生物学和/或治疗相关的水平。在一些实施例中，在多重编辑中，一个或多个或所有靶以与在可比较条件下单独进行的编辑相当的水平独立地编辑。在一些实施例中，利用两种或更多种单独的组合物来执行多重编辑，每种组合物独立地靶向一个或多个靶。在一些实施例中，这些组合物同时施用。在一些实施例中，这些组合物以合适的间隔施用。在一些实施例中，一种或多种组合物在一种或多种其他组合物之前或之后施用。在一些实施例中，使用单一组合物进行多重编辑，例如包含两种或更多种多个寡核苷酸的组合物，其中该多个寡核苷酸靶向不同的靶。在一些实施例中，每种多个寡核苷酸独立地靶向不同的腺苷。在一些实施例中，每种多个寡核苷酸独立地靶向不同的转录物。在一些实施例中，每种多个寡核苷酸独立地靶向不同的基因。在一些实施例中，两种或更多种多个寡核苷酸可靶向同一靶，但该多个寡核苷酸一起靶向所需的靶。
如本文所述，所提供的技术可以提供许多优点。例如，在一些实施例中，所提供的技术比作用于DNA的技术更安全，因为所提供的技术可以提供可逆且可调的RNA编辑(例如，通过调节剂量)。另外地和替代性地，如本文所展示，所提供的技术可以在表达内源性ADAR蛋白的系统中提供高水平的编辑，从而避免在多种情况下引入外源性蛋白的需要。此外，所提供的技术不需要依赖于辅助递送媒介物诸如病毒载体或脂质纳米颗粒的复合寡核苷酸，如在许多其他技术中使用的，特别是用于细胞培养以外的应用。在一些实施例中，所提供的技术可以使用内源性ADAR酶以高效率提供序列特异性A至I RNA编辑，并且可在不存在人工递送剂的情况下递送到多种系统(例如，细胞)中。
阅读本披露内容的本领域技术人员将理解，可以使用根据本披露内容的多种技术递送所提供的寡核苷酸及其组合物。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸和组合物可以经由转染或脂质转染来递送。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸及其组合物可在不存在递送助剂(诸如用于转染或脂质转染中的那些)的情况下递送。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸和组合物可以经由转染或脂质转染来递送。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸及其组合物以裸递送方式递送。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含可促进递送的另外的化学部分。例如，在一些实施例中，另外的化学部分是或包含受体(例如，脱唾液酸糖蛋白受体)的配体部分(例如，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc))。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸及其组合物可以通过GalNAc介导的递送来递送。
尤其是，本披露以实例提供了以下实施例：
1.一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含：
第一结构域；以及
第二结构域，
其中：
该第一结构域包含一个或多个2'-F修饰；
该第二结构域包含一个或多个不具有2'-F修饰的糖。
2.一种包含一个或多个经修饰的糖和/或一个或多个经修饰的核苷酸间键联的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含各自独立地包含一个或多个核碱基的第一结构域和第二结构域。
3.如实施例1或2所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸在系统中与包含靶腺苷的靶核酸接触时，该靶核酸中的靶腺苷被修饰。
4.如实施例1或2所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与系统中包含靶腺苷的靶核酸接触时，与不存在产物或存在参考寡核苷酸相比，该靶核酸的水平降低。
5.如实施例1或2所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与系统中包含靶腺苷的靶核酸接触时，与不存在该寡核苷酸或存在参考寡核苷酸相比，该靶核酸或其产物的剪接被改变。
6.如实施例1或2所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与系统中包含靶腺苷的靶核酸接触时，与不存在产物或存在参考寡核苷酸相比，该靶核酸的产物的水平被改变。
7.如实施例4-6中任一项所述的寡核苷酸，其中该靶核酸被修饰。
8.如实施例3-7中任一项所述的寡核苷酸，其中产物的水平增加，其中该产物是核酸或由核酸编码，该核酸在其他方面与该靶核酸相同但该靶腺苷被修饰。
9.如实施例3-7中任一项所述的寡核苷酸，其中产物的水平增加，其中该产物是核酸或由核酸编码，该核酸在其他方面与该靶核酸相同但该靶腺苷被肌苷代替。
10.如实施例3-7中任一项所述的寡核苷酸，其中产物的水平增加，其中该产物是核酸或由核酸编码，该核酸在其他方面与该靶核酸相同但该靶腺苷的腺嘌呤被鸟嘌呤代替。
11.如实施例8-10中任一项所述的寡核苷酸，其中该产物是蛋白。
12.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该靶腺苷是来自鸟嘌呤的突变。
13.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该靶腺苷与相同位置处的鸟嘌呤相比与病症、障碍或疾病更相关。
14.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸能够与该靶核酸形成双链复合物。
15.如实施例3-14所述的寡核苷酸，其中靶核酸或其部分是或包含RNA。
16.如实施例3-15中任一项所述的寡核苷酸，其中该靶腺苷是RNA的靶腺苷。
17.如实施例3-16中任一项所述的寡核苷酸，其中该靶腺苷被修饰，并且该修饰是或包括该靶腺苷的脱氨。
18.如实施例3-17中任一项所述的寡核苷酸，其中该靶腺苷被修饰并且该修饰是或包括将该靶腺苷转化成肌苷。
19.如实施例3-18中任一项所述的寡核苷酸，其中该修饰由ADAR蛋白促进。
20.如实施例3-19中任一项所述的寡核苷酸，其中该系统是包含ADAR蛋白的体外或离体系统。
21.如实施例3-19中任一项所述的寡核苷酸，其中该系统是或包括含有或表达ADAR蛋白的细胞。
22.如实施例3-19中任一项所述的寡核苷酸，其中该系统是包含含有或表达ADAR蛋白的细胞的受试者。
23.如实施例19-22中任一项所述的寡核苷酸，其中该ADAR蛋白是ADAR1。
24.如实施例19-22中任一项所述的寡核苷酸，其中该ADAR蛋白是ADAR2。
25.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸具有约10-200个(例如，约10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90、10-100、10-120、10-150、20-30、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-120、20-150、20-200、25-30、25-40、25-50、25-60、25-70、25-80、25-90、25-100、25-120、25-150、25-200、30-40、30-50、30-60、30-70、30-80、30-90、30-100、30-120、30-150、30-200、10、20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、60个等)核碱基的长度。
26.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸具有约26-35个核碱基的长度。
27.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸具有约29-35个核碱基的长度。
28.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸的碱基序列与包含该靶腺苷的该靶核酸的一部分的碱基序列互补，具有0-10个(例如，0-1、0-2、0-3、0-4、0-5、0-6、0-7、0-8、0-9、0-10、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)不是沃森-克里克碱基对的错配。
29.如实施例28所述的寡核苷酸，其中一个或多个错配独立地是摇摆碱基配对。
30.如实施例28-29中任一项所述的寡核苷酸，其中互补性为约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)。
31.如实施例28-29中任一项所述的寡核苷酸，其中该互补性为约90％-100％或约95-100％。
32.如实施例28-29中任一项所述的寡核苷酸，其中该互补性为100％。
33.如实施例28-29中任一项所述的寡核苷酸，其中除了在与靶核苷(例如，腺苷)相反的核苷处，该互补性为100％。
34.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸由第一结构域和第二结构域组成。
35.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域具有约2-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等)核碱基的长度。
36.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域具有约10-25个核碱基的长度。
37.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域具有约15个核碱基的长度。
38.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第一结构域包含一个或多个(例如，1-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)错配。
39.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第一结构域包含两个或更多个错配。
40.如实施例1-35中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第一结构域包含一个且不多于一个错配。
41.如实施例1-35中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第一结构域包含两个且不多于两个错配。
42.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第一结构域包含一个或多个(例如，1-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)凸起。
43.如实施例42所述的寡核苷酸，其中每个凸起独立地包含一个或多个不是沃森-克里克或摇摆对的碱基对。
44.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第一结构域包含一个或多个(例如，1-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)摇摆对。
45.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第一结构域包含两个或更多个摇摆对。
46.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第一结构域包含两个且不多于两个摇摆对。
47.如实施例1-35中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域与靶核酸完全互补。
48.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)具有2'-F修饰的糖。
49.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地包含2'-F修饰。
50.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地包含2'-F修饰。
51.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中不超过约1％-95％(例如，不超过约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％等)的糖包含2'-OMe。
52.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中不超过约50％的糖包含2'-OMe。
53.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中不超过约1％-95％(例如，不超过约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％等)的糖包含2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
54.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中不超过约50％的糖包含2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
55.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中不超过约1％-95％(例如，不超过约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％等)的糖包含2'-OR。
56.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中不超过约50％的糖包含2'-OR。
57.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-OR修饰的经修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
58.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-MOE修饰的经修饰的糖。
59.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-OMe修饰的经修饰的糖。
60.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中从第一结构域的5'-末端计的前约1-5个，例如1、2、3、4或5个糖独立地是2'-OR修饰的糖，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
61.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中从第一结构域的5'-末端计的前约1-5个，例如1、2、3、4或5个糖独立地是2'-MOE修饰的糖。
62.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-N(R)2修饰的经修饰的糖，其中每个R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
63.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-NH2修饰的经修饰的糖。
64.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)LNA糖。
65.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)无环糖(例如，UNA糖)。
66.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-F修饰的经修饰的糖。
67.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-OH的糖。
68.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含两个2'-H的糖。
69.如实施例1-56中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中没有糖包含2'-OR。
70.如实施例1-56中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中没有糖包含2'-OMe。
71.如实施例1-56中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中没有糖包含2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
72.如实施例1-56中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中的每个糖包含2'-F。
73.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的核苷酸间键联。
74.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联。
75.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联。
76.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。
77.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或不带负电荷的核苷酸间键联。
78.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或中性核苷酸间键联。
79.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键联。
80.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含1、2、3、4或5个不带负电荷的核苷酸间键联。
81.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域的第一核苷与第二核苷之间的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。
82.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域的最后一个核苷与倒数第二个核苷之间的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。
83.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是手性控制的。
84.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的手性核苷酸间键联是手性控制的。
85.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域的第一核苷与第二核苷之间的核苷酸间键联是手性控制的。
86.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域的最后一个核苷与倒数第二个核苷之间的核苷酸间键联是手性控制的。
87.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个手性核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。
88.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是Sp。
89.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中至少5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的手性核苷酸间键联是Sp。
90.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中的每个手性核苷酸间键联是Sp。
91.如实施例1-89中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域的第一核苷与第二核苷之间的核苷酸间键联是Rp。
92.如实施例1-89和91中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域的最后一个和倒数第二个核苷之间的核苷酸间键联是Rp。
93.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。
94.如实施例1-92中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含一个或多个天然磷酸酯键联。
95.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域能够将ADAR蛋白募集到靶核酸，或促进或有助于将ADAR蛋白募集到靶核酸。
96.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域能够使ADAR蛋白与靶核酸相互作用，或促进或有助于ADAR蛋白与靶核酸相互作用。
97.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域与ADAR的RNA结合结构域(RBD)接触。
98.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域基本上不与ADAR的第二RBD结构域接触。
99.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一结构域基本上不与ADAR的具有脱氨酶活性的催化结构域接触。
100.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域具有约2-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等)核碱基的长度。
101.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域具有约1-7个核碱基的长度。
102.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域具有约5-15个核碱基的长度。
103.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域具有约10-25个核碱基的长度。
104.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域具有约15个核碱基的长度。
105.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二结构域包含一个或多个(例如，1-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)错配。
106.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二结构域包含两个或更多个错配。
107.如实施例1-100中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二结构域包含一个且不多于一个错配。
108.如实施例1-100中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二结构域包含两个且不多于两个错配。
109.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二结构域包含一个或多个(例如，1-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)凸起。
110.如实施例109所述的寡核苷酸，其中每个凸出部分独立地包含一个或多个不是沃森-克里克或摇摆对的碱基对。
111.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二结构域包含一个或多个(例如，1-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)摇摆对。
112.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二结构域包含两个或更多个摇摆对。
113.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二结构域包含两个且不多于两个摇摆对。
114.如实施例1-100中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域与靶核酸完全互补。
115.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二结构域包含与靶腺苷相反的核苷。
116.如实施例115所述的寡核苷酸，其中该相反核碱基是任选地经取代的或被保护的U，或是U的任选地经取代的或被保护的互变异构体。
117.如实施例115所述的寡核苷酸，其中该相反核碱基是U。
118.如实施例115所述的寡核苷酸，其中该相反核碱基是任选地经取代的或被保护的C，或是C的任选地经取代的或被保护的互变异构体。
119.如实施例115所述的寡核苷酸，其中该相反核碱基是C。
120.如实施例115所述的寡核苷酸，其中该相反核碱基是任选地经取代的或被保护的A，或是A的任选地经取代的或被保护的互变异构体。
121.如实施例115所述的寡核苷酸，其中该相反核碱基是A。
122.如实施例115所述的寡核苷酸，其中该相反核碱基是任选地经取代的或被保护的假异胞嘧啶的核碱基，或是该假异胞嘧啶的核碱基的任选地经取代的或被保护的互变异构体。
123.如实施例115所述的寡核苷酸，其中该相反核碱基是假异胞嘧啶的核碱基。
124.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含核碱基BA，其中BA是或包含环BA或其互变异构体，其中环BA是具有0-10个杂原子的任选地经取代的5-20元单环、双环或多环。
125.一种寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含核碱基BA，其中BA是或包含环BA或其互变异构体，其中环BA是具有0-10个杂原子的任选地经取代的5-20元单环、双环或多环。
126.如实施例115所述的寡核苷酸，其中该核碱基是BA，其中BA是或包含环BA或其互变异构体，其中环BA是具有0-10个杂原子的任选地经取代的5-20元单环、双环或多环。
127.如实施例124-126中任一项所述的寡核苷酸，其中与U相比，BA与腺苷的靶腺嘌呤具有较弱的氢键结合。
128.如实施例124-127中任一项所述的寡核苷酸，其中与U相比，BA与腺苷的靶腺嘌呤形成较少的氢键。
129.如实施例124-128中任一项所述的寡核苷酸，其中BA与ADAR的一个或多个氨基酸残基形成一个或多个氢键，这些残基与和靶腺苷相反的U形成一个或多个氢键。
130.如实施例124-129中任一项所述的寡核苷酸，其中BA与ADAR的每个氨基酸残基形成一个或多个氢键，该每个氨基酸残基与和靶腺苷相反的U形成一个或多个氢键。
131.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA包含
Figure BDA0003580200980004261
132.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA包含
Figure BDA0003580200980004262
133.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA包含
Figure BDA0003580200980004263
134.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA包含
Figure BDA0003580200980004264
135.如实施例124至134中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-I的结构。
136.如实施例124-134中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-I-a的结构。
137.如实施例124-134中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-I-b的结构。
138.如实施例124至134中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-II的结构。
139.如实施例124至134中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-II-a的结构。
140.如实施例124至134中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-II-b的结构。
141.如实施例124至134中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-III的结构。
142.如实施例124-134中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-III-a的结构。
143.如实施例124-134中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-III-b的结构。
144.如实施例124-143中任一项所述的寡核苷酸，其中当X1、X2、X3、X4、X5、X6、X1'、X2'、X3'、X4'、X5'、X6'和X7'是-CH＝、-C(OH)＝、-C(-NH2)＝、-CH2-、-C(＝NH)-或-NH-时，它们各自独立地且任选地经取代。
145.如实施例131-144中任一项所述的寡核苷酸，其中X1是-N(-)-。
146.如实施例131-144中任一项所述的寡核苷酸，其中X1是-C(-)＝。
147.如实施例131-146中任一项所述的寡核苷酸，其中X2是-C(O)-。
148.如实施例131-147中任一项所述的寡核苷酸，其中X3是-NR'-。
149.如实施例131-148中任一项所述的寡核苷酸，其中X3是任选地经取代的-NH-。
150.如实施例131-148中任一项所述的寡核苷酸，其中X3是-NH-。
151.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是-C(RB4)＝、-C(-N(RB4)2)＝、-C(RB4)2-或-C(＝NRB4)-。
152.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是-C(RB4)＝。
153.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是任选地经取代的-CH＝。
154.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是-CH＝。
155.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是-C(-N(RB4)2)＝。
156.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是任选地经取代的-C(-NH2)＝。
157.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是-C(-NH2)＝。
158.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是-C(-N＝CHNR2)＝。
159.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是-C(-N＝CHN(CH3)2)＝。
160.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是-C(-NHR')＝。
161.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是-C(RB4)2-。
162.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是任选地经取代的-CH2-。
163.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是-CH2-。
164.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是任选地经取代的-C(＝NH)-。
165.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是-C(＝NRB4)-。
166.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是-C(O)＝，其中氧原子具有比U中的对应-C(O)-弱的氢键受体。
167.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是-C(O)＝，其中氧原子形成分子内氢键。
168.如实施例131-150中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是-C(O)＝，其中氧原子与同一核碱基内的氢形成氢键。
169.如实施例138-168中任一项所述的寡核苷酸，其中X5是-C(RB5)2-。
170.如实施例138-168中任一项所述的寡核苷酸，其中X5是任选地经取代的-CH2-。
171.如实施例138-168中任一项所述的寡核苷酸，其中X5是-CH2-。
172.如实施例138-168中任一项所述的寡核苷酸，其中X5是-C(RB5)＝。
173.如实施例138-168中任一项所述的寡核苷酸，其中X5是任选地经取代的-C(-NO2)＝。
174.如实施例138-168中任一项所述的寡核苷酸，其中X5是任选地经取代的-CH＝。
175.如实施例138-168中任一项所述的寡核苷酸，其中X5是-CH＝。
176.如实施例138-168中任一项所述的寡核苷酸，其中X5是-C(-LB5-RB51)＝，其中RB51是-R'、-N(R')2、-OR'或-SR'。
177.如实施例138-168中任一项所述的寡核苷酸，其中X5是-C(-LB5-RB51)＝，其中RB51是-N(R')2、-OR'或-SR'。
178.如实施例138-168中任一项所述的寡核苷酸，其中X5是-C(-LB5-RB51)＝，其中RB51是-NHR'。
179.如实施例176-178中任一项所述的寡核苷酸，其中LB5是或包含-C(O)。
180.如实施例138-168中任一项所述的寡核苷酸，其中X5是-N＝。
181.如实施例178-179中任一项所述的寡核苷酸，其中X4是-C(O)＝，其中氧原子与RB51中的-NHR'、-OH或-SH的氢形成氢键。
182.如实施例124-134中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-IV的结构。
183.如实施例124-134中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-IV-a的结构。
184.如实施例124-134中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-IV-b的结构。
185.如实施例124-134中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-V的结构。
186.如实施例124-134中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-V-a的结构。
187.如实施例124-134中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-V-b的结构。
188.如实施例124-134中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-VI的结构。
189.如实施例182-188中任一项所述的寡核苷酸，其中当X1、X2、X3、X4、X5、X6、X1'、X2'、X3'、X4'、X5'、X6'和X7'是-CH＝、-C(OH)＝、-C(-NH2)＝、-CH2-、-C(＝NH)-或-NH-时，它们各自独立地且任选地经取代。
190.如实施例182-189中任一项所述的寡核苷酸，其中X1是-N(-)-。
191.如实施例182-189中任一项所述的寡核苷酸，其中X1是-C(-)＝。
192.如实施例182-191中任一项所述的寡核苷酸，其中X2是任选地经取代的-CH＝。
193.如实施例182-191中任一项所述的寡核苷酸，其中X2是-CH＝。
194.如实施例182-191中任一项所述的寡核苷酸，其中X2是-C(O)-。
195.如实施例182-194中任一项所述的寡核苷酸，其中X3是-NR'-。
196.如实施例182-194中任一项所述的寡核苷酸，其中X3是任选地经取代的-NH-。
197.如实施例182-194中任一项所述的寡核苷酸，其中X3是-NH-。
198.如实施例182至197中任一项所述的寡核苷酸，其中环BAA是5元的。
199.如实施例182至197中任一项所述的寡核苷酸，其中环BAA是6元的。
200.如实施例182-199中任一项所述的寡核苷酸，其中环BAA是具有1-3个杂原子的任选地经取代的环。
201.如实施例200所述的寡核苷酸，其中杂原子是氮。
202.如实施例200-201中任一项所述的寡核苷酸，其中环BAA包含两个氮。
203.如实施例200-201中任一项所述的寡核苷酸，其中杂原子是氧。
204.如实施例141-203中任一项所述的寡核苷酸，其中X6是-C(RB6)＝、-C(ORB6)＝、-C(RB6)2-或-C(O)-。
205.如实施例141-203中任一项所述的寡核苷酸，其中X6是-C(R)＝、-C(R)2-或-C(O)-。
206.如实施例141-203中任一项所述的寡核苷酸，其中X6是任选地经取代的-CH＝。
207.如实施例141-203中任一项所述的寡核苷酸，其中X6是-CH＝。
208.如实施例141-203中任一项所述的寡核苷酸，其中X6是任选地经取代的-CH2-。
209.如实施例141-203中任一项所述的寡核苷酸，其中X6是-CH2-。
210.如实施例141-203中任一项所述的寡核苷酸，其中X6是-C(O)-。
211.如实施例115-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA包含
Figure BDA0003580200980004311
212.如实施例124-130或211中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA具有式BA-VI的结构。
213.如实施例211所述的寡核苷酸，其中X1'是-N(-)-。
214.如实施例211所述的寡核苷酸，其中X1'是-C(-)＝。
215.如实施例211-214中任一项所述的寡核苷酸，其中X2'是-C(O)-。
216.如实施例211-214中任一项所述的寡核苷酸，其中X2'是任选地经取代的-CH＝。
217.如实施例211-214中任一项所述的寡核苷酸，其中X2'是-CH＝。
218.如实施例211-214中任一项所述的寡核苷酸，其中X2'是-C(-)＝。
219.如实施例211-217中任一项所述的寡核苷酸，其中X3'是-NR'-。
220.如实施例211-217中任一项所述的寡核苷酸，其中X3'是任选地经取代的-NH-。
221.如实施例211-217中任一项所述的寡核苷酸，其中X3'是-NH-。
222.如实施例211-217中任一项所述的寡核苷酸，其中X3'是-N＝。
223.如实施例211-222中任一项所述的寡核苷酸，其中X4'是-C(O)＝。
224.如实施例211-222中任一项所述的寡核苷酸，其中X4'是-C(ORB4')＝。
225.如实施例211-222中任一项所述的寡核苷酸，其中X4'是-C(RB4')＝。
226.如实施例211-222中任一项所述的寡核苷酸，其中X4'是任选地经取代的-CH＝。
227.如实施例211-222中任一项所述的寡核苷酸，其中X4'是-CH＝。
228.如实施例211-222中任一项所述的寡核苷酸，其中X4'是-C(-N(RB4')2)＝。
229.如实施例211-222中任一项所述的寡核苷酸，其中X4'是任选地经取代的-C(-NH2)＝。
230.如实施例211-222中任一项所述的寡核苷酸，其中X4'是-C(-NH2)＝。
231.如实施例211-222中任一项所述的寡核苷酸，其中X4'是-C(-N＝CHN(CH3)2)＝。
232.如实施例211-222中任一项所述的寡核苷酸，其中X4'是-C(-NC(O)R')＝。
233.如实施例211-232中任一项所述的寡核苷酸，其中X5'是任选地经取代的-NH-。
234.如实施例211-232中任一项所述的寡核苷酸，其中X5'是-NH-。
235.如实施例211-232中任一项所述的寡核苷酸，其中X5'是-N＝。
236.如实施例211-232中任一项所述的寡核苷酸，其中X5'是-C(RB5')＝。
237.如实施例211-232中任一项所述的寡核苷酸，其中X5'是任选地经取代的-CH＝。
238.如实施例211-232中任一项所述的寡核苷酸，其中X5'是-CH＝。
239.如实施例211-238中任一项所述的寡核苷酸，其中X6'是-C(RB6')＝。
240.如实施例211-238中任一项所述的寡核苷酸，其中X6'是任选地经取代的-CH＝。
241.如实施例211-238中任一项所述的寡核苷酸，其中X6'是-CH＝。
242.如实施例211-238中任一项所述的寡核苷酸，其中X6'是-C(O)＝。
243.如实施例211-238中任一项所述的寡核苷酸，其中X6'是-C(ORB6')＝。
244.如实施例211-238中任一项所述的寡核苷酸，其中X6'是-C(OR')＝。
245.如实施例211-244中任一项所述的寡核苷酸，其中X7'是-C(RB7')＝。
246.如实施例211-244中任一项所述的寡核苷酸，其中X7'是任选地经取代的-CH＝。
247.如实施例211-244中任一项所述的寡核苷酸，其中X7'是-CH＝。
248.如实施例211-244中任一项所述的寡核苷酸，其中X7'是任选地经取代的-NH-。
249.如实施例211-244中任一项所述的寡核苷酸，其中X7'是-NH-。
250.如实施例211-244中任一项所述的寡核苷酸，其中X7'是-N＝。
251.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004341
252.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004342
253.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004343
254.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004344
其中R'是-C(O)R。
255.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004345
其中R'是-C(O)Ph。
256.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004351
257.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004352
258.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004353
259.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004354
260.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004355
261.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004356
262.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004357
263.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004361
264.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004362
265.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004363
266.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004364
267.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004365
268.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004366
269.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004371
270.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004372
271.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004373
272.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004374
273.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004375
274.如实施例124-130中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是
Figure BDA0003580200980004376
275.如实施例124-274中任一项所述的寡核苷酸，其中核碱基是环BA或其互变异构体。
276.如实施例124-274中任一项所述的寡核苷酸，其中核碱基是经取代的环BA或其互变异构体。
277.如实施例124-274中任一项所述的寡核苷酸，其中核碱基是任选地经取代的环BA或其互变异构体，其中每个环-CH＝、-CH2-和-NH-任选地且独立地被取代。
278.如实施例124-274中任一项所述的寡核苷酸，其中核碱基是任选地经取代的环BA或其互变异构体，其中每个环-CH＝和-CH2-任选地且独立地被取代。
279.如实施例124-274中任一项所述的寡核苷酸，其中核碱基是任选地经取代的环BA或其互变异构体，其中每个环-CH＝任选地且独立地被取代。
280.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)独立地具有不是2'-F的修饰的经修饰的糖。
281.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是具有不是2'-F的修饰的经修饰的糖。
282.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域中约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是具有不是2'-F的修饰的经修饰的糖。
283.如实施例120-282中任一项所述的寡核苷酸，其中这些经修饰的糖独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
284.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-F修饰的经修饰的糖。
285.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-OR修饰的经修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
286.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-OMe修饰的经修饰的糖。
287.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-N(R)2修饰的经修饰的糖，其中每个R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
288.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-NH2修饰的经修饰的糖。
289.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)LNA糖。
290.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)无环糖(例如，UNA糖)。
291.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-F修饰的经修饰的糖。
292.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-OH的糖。
293.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含两个2'-H的糖。
294.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的核苷酸间键联。
295.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联。
296.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域中约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联。
297.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。
298.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或不带负电荷的核苷酸间键联。
299.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或中性核苷酸间键联。
300.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键联。
301.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含1、2、3、4或5个不带负电荷的核苷酸间键联。
302.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域的最后一个核苷与倒数第二个核苷之间的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。
303.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域的第一核苷与第二核苷之间的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。
304.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域中至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是手性控制的。
305.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域中至少5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的手性核苷酸间键联是手性控制的。
306.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域的最后一个核苷与倒数第二个核苷之间的核苷酸间键联是手性控制的。
307.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域的第一核苷与第二核苷之间的核苷酸间键联是手性控制的。
308.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个手性核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。
309.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域中至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是Sp。
310.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域中至少5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的手性核苷酸间键联是Sp，或者其中该第二结构域中的每个手性核苷酸间键联是Sp。
311.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域的第一核苷与第二核苷之间的核苷酸间键联是Rp。
312.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域的最后一个核苷与倒数第二个核苷之间的核苷酸间键联是Rp。
313.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域中的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。
314.如实施例1-312中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含一个或多个天然磷酸酯键联。
315.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域能够将ADAR蛋白募集到靶核酸，或促进或有助于将ADAR蛋白募集到靶核酸。
316.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域能够使ADAR蛋白与靶核酸相互作用，或促进或有助于ADAR蛋白与靶核酸相互作用。
317.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域与具有酶活性的结构域接触。
318.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域与具有ADAR1脱氨酶活性的结构域接触。
319.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域与具有ADAR2脱氨酶活性的结构域接触。
320.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域从5'到3'包含第一子结构域、第二子结构域和第三子结构域，或由这些结构域组成。
321.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域从5'到3'由第一子结构域、第二子结构域和第三子结构域组成。
322.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域具有约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等)核碱基的长度。
323.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域具有约10-20个(例如，约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)核碱基的长度。
324.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第一子结构域包含一个或多个(例如，1-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)错配。
325.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第一子结构域包含两个或更多个错配。
326.如实施例1-324中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第一子结构域包含一个且不多于一个错配。
327.如实施例1-324中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第一子结构域包含两个且不多于两个错配。
328.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第一子结构域包含一个或多个(例如，1-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)凸起。
329.如实施例328所述的寡核苷酸，其中每个凸出部分独立地包含一个或多个不是沃森-克里克或摇摆对的碱基对。
330.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第一子结构域包含一个或多个(例如，1-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)摇摆对。
331.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第一子结构域包含两个或更多个摇摆对。
332.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第一子结构域包含两个且不多于两个摇摆对。
333.如实施例1-322中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域与靶核酸完全互补。
334.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)独立地具有不是2'-F的修饰的经修饰的糖。
335.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是具有不是2'-F的修饰的经修饰的糖。
336.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域中约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是具有不是2'-F的修饰的经修饰的糖。
337.如实施例334-336中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖，其独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
338.如实施例334-336中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖的经修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
339.如实施例334-336中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域中约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖的经修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
340.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-N(R)2修饰的经修饰的糖，其中每个R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
341.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-NH2修饰的经修饰的糖。
342.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)LNA糖。
343.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)无环糖(例如，UNA糖)。
344.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-F修饰的经修饰的糖。
345.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-OH的糖。
346.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含两个2'-H的糖。
347.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-OR修饰的经修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
348.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-OMe修饰的经修饰的糖。
349.如实施例320-339中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域中的每个糖独立地包含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰。
350.如实施例349所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域中的每个糖独立地包含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰，其中LB是任选地经取代的-CH2-。
351.如实施例349所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域中的每个糖独立地包含2'-OMe。
352.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域包含具有约3-8个核碱基的长度的5'-末端部分。
353.如实施例352所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分具有约3-6个核碱基的长度。
354.如实施例352或353所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分包含该第一子结构域的5'-末端核碱基。
355.如实施例352-354中任一项所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分中的一个或多个糖独立地是经修饰的糖。
356.如实施例355所述的寡核苷酸，其中这些经修饰的糖独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
357.如实施例355所述的寡核苷酸，其中一个或多个经修饰的糖独立地包含2'-F或2'-OR，其中R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
358.如实施例355所述的寡核苷酸，其中一个或多个经修饰的糖独立地是2'-F或2'-OMe。
359.如实施例352-358中任一项所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分包含一个或多个错配。
360.如实施例352-359中任一项所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分包含一个或多个摇摆。
361.如实施例352-360中任一项所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分与靶核酸约60-100％(例如，66％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多)互补。
362.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域包含具有约3-8个核碱基的长度的3'-末端部分。
363.如实施例362所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分具有约1-3个核碱基的长度。
364.如实施例362或363所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分包含该第一子结构域的3'-末端核碱基。
365.如实施例362-364中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分中的一个或多个糖独立地是经修饰的糖。
366.如实施例365所述的寡核苷酸，其中这些经修饰的糖独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
367.如实施例365所述的寡核苷酸，其中一个或多个经修饰的糖独立地包含2'-F。
368.如实施例365-367中任一项所述的寡核苷酸，其中没有经修饰的糖包含2'-OMe。
369.如实施例362-368中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分的每个糖独立地包含两个2'-H或2'-F修饰。
370.如实施例352-358中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分包含一个或多个错配。
371.如实施例352-359中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分包含一个或多个摇摆。
372.如实施例352-360中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分与靶核酸约60-100％(例如，66％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多)互补。
373.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的核苷酸间键联。
374.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联。
375.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域中约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联。
376.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。
377.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域的第一核苷与第二核苷之间的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。
378.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或不带负电荷的核苷酸间键联。
379.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或中性核苷酸间键联。
380.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域中至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是手性控制的。
381.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域中至少5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的手性核苷酸间键联是手性控制的。
382.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域的第一核苷与第二核苷之间的核苷酸间键联是手性控制的。
383.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个手性核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。
384.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域中至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是Sp。
385.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域中至少5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的手性核苷酸间键联是Sp。
386.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域中的每个手性核苷酸间键联是Sp。
387.如实施例1-386中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域的第一核苷与第二核苷之间的核苷酸间键联是Rp。
388.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域中的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。
389.如实施例1-387中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域包含一个或多个天然磷酸酯键联。
390.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域能够将ADAR蛋白募集到靶核酸，或促进或有助于将ADAR蛋白募集到靶核酸。
391.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域能够使ADAR蛋白与靶核酸相互作用，或促进或有助于ADAR蛋白与靶核酸相互作用。
392.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域与具有酶活性的结构域接触。
393.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域与具有ADAR1脱氨酶活性的结构域接触。
394.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域与具有ADAR2脱氨酶活性的结构域接触。
395.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域具有约1-10个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核碱基的长度。
396.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域具有约1-5个(例如，约1、2、3、4或5个)核碱基的长度。
397.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域具有约1、2或3个核碱基的长度。
398.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域具有3个核碱基的长度。
399.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域包含与靶腺苷相反的核苷。
400.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含一个且不超过一个与靶腺苷相反的核苷。
401.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二子结构域包含一个或多个(例如，1-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)错配。
402.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二子结构域包含两个或更多个错配。
403.如实施例1-401中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二子结构域包含一个且不多于一个错配。
404.如实施例1-401中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二子结构域包含两个且不多于两个错配。
405.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二子结构域包含一个或多个(例如，1-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)凸起。
406.如实施例405所述的寡核苷酸，其中每个凸出部分独立地包含一个或多个不是沃森-克里克或摇摆对的碱基对。
407.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二子结构域包含一个或多个(例如，1-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)摇摆对。
408.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二子结构域包含两个或更多个摇摆对。
409.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二子结构域包含两个且不多于两个摇摆对。
410.如实施例1-400中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域与靶核酸完全互补。
411.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域包含一个或多个包含两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)。
412.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域包含一个或多个包含2'-OH的糖(例如，天然RNA糖)。
413.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域包含约1-10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)经修饰的糖。
414.如实施例413所述的寡核苷酸，其中每个经修饰的糖独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
415.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域不含包含2'-OMe修饰的经修饰的糖。
416.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域不含包含2'-OR修饰的经修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
417.如实施例413所述的寡核苷酸，其中每个2'-修饰的糖是包含2'-F修饰的糖。
418.如实施例1-416中任一项所述的寡核苷酸，其中该相反核苷的糖是无环糖(例如，UNA糖)。
419.如实施例1-416中任一项所述的寡核苷酸，其中该相反核苷的糖包含两个2'-H。
420.如实施例1-416中任一项所述的寡核苷酸，其中该相反核苷的糖包含2'-OH。
421.如实施例1-416中任一项所述的寡核苷酸，其中该相反核苷的糖是天然DNA糖。
422.如实施例1-416中任一项所述的寡核苷酸，其中该相反核苷的糖被修饰。
423.如实施例1-416中任一项所述的寡核苷酸，其中该相反核苷的糖包含2'-F。
424.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中与该相反核苷5'-相邻的核苷的糖(5'-…N1N0…3'中的N1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)包含两个2'-H。
425.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中与该相反核苷5'-相邻的核苷的糖(5'-…N1N0…3'中的N1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)包含2'-OH。
426.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中与该相反核苷5'-相邻的核苷的糖(5'-…N1N0…3'中的N1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)是天然DNA糖。
427.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中与该相反核苷5'-相邻的核苷的糖(5'-…N1N0…3'中的N1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)包含2'-F。
428.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中与该相反核苷3'-相邻的核苷的糖(5'-…N0N-1…3'中的N-1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)包含两个2'-H。
429.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中与该相反核苷3'-相邻的核苷的糖(5'-…N0N-1…3'中的N-1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)包含2'-OH。
430.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中与该相反核苷3'-相邻的核苷的糖(5'-…N0N-1…3'中的N-1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)是天然DNA糖。
431.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中与该相反核苷3'-相邻的核苷的糖(5'-…N0N-1…3'中的N-1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)包含2'-F。
432.如实施例1-416中任一项所述的寡核苷酸，其中该相反核苷的糖、与该相反核苷5'-相邻的核苷的糖(5'-…N1N0…3'中的N1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)和与相反核苷3'-相邻的核苷的糖(5'-…N0N-1…3'中的N-1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)各自独立地是天然DNA糖。
433.如实施例1-416中任一项所述的寡核苷酸，其中该相反核苷的糖是天然DNA糖，与该相反核苷5'-相邻的核苷的糖(5'-…N1N0…3'中的N1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)是2'-F修饰的糖，并且与该相反核苷3'-相邻的核苷的糖(5'-…N0N-1…3'中的N-1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)是天然DNA糖。
434.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域包含连接到该相反核苷的5'-侧的5'-末端部分。
435.如实施例431所述的寡核苷酸，其中当与靶核酸进行互补性比对时，该5'-末端部分包含一个或多个错配或摇摆。
436.如实施例431或435所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分具有1、2或3个核碱基的长度。
437.如实施例431-436中任一项所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分的糖选自具有两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)和2'-F修饰的糖。
438.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域包含连接到该相反核苷的3'-侧的3'-末端部分。
439.如实施例438所述的寡核苷酸，其中当与靶核酸进行互补性比对时，该3'-末端部分包含一个或多个错配或摇摆。
440.如实施例438所述的寡核苷酸，其中当与靶核酸进行互补性比对时，该3'-末端部分包含一个或多个错配和/或摇摆。
441.如实施例438所述的寡核苷酸，其中当与靶核酸进行互补性比对时，该3'-末端部分包含一个或多个摇摆。
442.如实施例438所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分包含I或其衍生物。
443.如实施例438所述的寡核苷酸，其中当与靶核酸进行互补性比对时，该3'-末端部分包含I和I-C摇摆。
444.如实施例438-443中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分具有1、2或3个核碱基的长度。
445.如实施例438-444中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分的糖选自具有两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)和2'-F修饰的糖。
446.如实施例438-444中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分的糖是具有两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)。
447.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域包含约1-10个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的核苷酸间键联。
448.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联。
449.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域中约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联。
450.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域中的每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。
451.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域中的每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或不带负电荷的核苷酸间键联。
452.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域中的每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或中性核苷酸间键联。
453.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域中至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是手性控制的。
454.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域中至少5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的手性核苷酸间键联是手性控制的。
455.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域中的每个手性核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。
456.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域中至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是Sp。
457.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域中至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是Rp。
458.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域中至少5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的手性核苷酸间键联是Sp。
459.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域中的每个手性核苷酸间键联是Sp。
460.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域中的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。
461.如实施例1-459中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域包含一个或多个天然磷酸酯键联。
462.如实施例1-459中任一项所述的寡核苷酸，其中该相反核苷通过天然磷酸酯键联连接到其5'紧邻核苷。
463.如实施例1-461中任一项所述的寡核苷酸，其中该相反核苷通过经修饰的核苷酸间键联连接到其5'紧邻核苷。
464.如实施例1-463中任一项所述的寡核苷酸，其中该相反核苷通过经修饰的核苷酸间键联连接到其3'紧邻核苷。
465.如实施例1至464中任一项所述的寡核苷酸，其中与相反核苷(位置0)3'紧邻的核苷(位置-1)通过经修饰的核苷酸间键联连接到其3'紧邻核苷(位置-2)。
466.如实施例463-465中任一项所述的寡核苷酸，其中该经修饰的核苷酸间键联是手性核苷酸间键联。
467.如实施例463-466中任一项所述的寡核苷酸，其中该经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。
468.如实施例463-466中任一项所述的寡核苷酸，其中该经修饰的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。
469.如实施例463-466中任一项所述的寡核苷酸，其中该经修饰的核苷酸间键联是带中性电荷的核苷酸间键联。
470.如实施例466-469中任一项所述的寡核苷酸，其中该手性核苷酸间键联是手性控制的。
471.如实施例466-470中任一项所述的寡核苷酸，其中该手性核苷酸间键联是Rp。
472.如实施例466-470中任一项所述的寡核苷酸，其中该手性核苷酸间键联是Sp。
473.如实施例462-472中任一项所述的寡核苷酸，其中该5'紧邻核苷包含经修饰的糖。
474.如实施例462-472中任一项所述的寡核苷酸，其中该5'紧邻核苷包含含有2'-F修饰的经修饰的糖。
475.如实施例462-472中任一项所述的寡核苷酸，其中该5'紧邻核苷包含含有两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)。
476.如实施例1-459和461-475中任一项所述的寡核苷酸，其中该相反核苷通过天然磷酸酯键联连接到其3'紧邻核苷。
477.如实施例1-459和461-475中任一项所述的寡核苷酸，其中该相反核苷通过经修饰的核苷酸间键联连接到其3'紧邻核苷。
478.如实施例477所述的寡核苷酸，其中该经修饰的核苷酸间键联是手性核苷酸间键联。
479.如实施例477或478所述的寡核苷酸，其中该经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。
480.如实施例477或478所述的寡核苷酸，其中该经修饰的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。
481.如实施例477或478所述的寡核苷酸，其中该经修饰的核苷酸间键联是带中性电荷的核苷酸间键联。
482.如实施例478-481中任一项所述的寡核苷酸，其中该手性核苷酸间键联是手性控制的。
483.如实施例478-482中任一项所述的寡核苷酸，其中该手性核苷酸间键联是Rp。
484.如实施例478-482中任一项所述的寡核苷酸，其中该手性核苷酸间键联是Sp。
485.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'紧邻核苷包含经修饰的糖。
486.如实施例484所述的寡核苷酸，其中该3'紧邻核苷包含含有2'-F修饰的经修饰的糖。
487.如实施例484所述的寡核苷酸，其中该3'紧邻核苷包含含有两个2'-H的糖(例如，天然DNA糖)。
488.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'-紧邻核苷包含不是G的碱基。
489.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'-紧邻核苷包含空间位阻小于G的碱基。
490.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'-紧邻核苷包含核碱基，该核碱基是或包含具有式BA-VI的结构的环BA。
491.如实施例488-490中任一项所述的寡核苷酸，其中环BA是如实施例213-279中任一项所述的环BA。
492.如实施例488-491中任一项所述的寡核苷酸，其中该核碱基是
Figure BDA0003580200980004631
493.如实施例488-491中任一项所述的寡核苷酸，其中该核碱基是
Figure BDA0003580200980004632
494.如实施例488-491中任一项所述的寡核苷酸，其中该核碱基是次黄嘌呤。
495.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中靶核酸包含5'-CA-3'，其中A是靶腺苷。
496.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中5'紧邻核苷中的糖是或包含
Figure BDA0003580200980004633
497.如实施例1-495中任一项所述的寡核苷酸，其中5'紧邻核苷中的糖是或包含
Figure BDA0003580200980004634
498.如实施例1-495中任一项所述的寡核苷酸，其中5'紧邻核苷中的糖是或包含
Figure BDA0003580200980004635
499.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中与靶核苷相反的核苷中的糖是或包含
Figure BDA0003580200980004641
500.如实施例1-498中任一项所述的寡核苷酸，其中与靶核苷相反的核苷中的糖是或包含
Figure BDA0003580200980004642
501.如实施例1-498中任一项所述的寡核苷酸，其中与靶核苷相反的核苷中的糖是或包含
Figure BDA0003580200980004643
502.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中3'紧邻核苷中的糖是或包含
Figure BDA0003580200980004644
503.如实施例1-501中任一项所述的寡核苷酸，其中3'紧邻核苷中的糖是或包含
Figure BDA0003580200980004645
504.如实施例1-501中任一项所述的寡核苷酸，其中3'-紧邻核苷中的糖是或包含
Figure BDA0003580200980004646
505.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域能够将ADAR蛋白募集到靶核酸，或促进或有助于将ADAR蛋白募集到靶核酸。
506.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域能够使ADAR蛋白与靶核酸相互作用，或促进或有助于ADAR蛋白与靶核酸相互作用。
507.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域与具有酶活性的结构域接触。
508.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域与具有ADAR1脱氨酶活性的结构域接触。
509.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域与具有ADAR2脱氨酶活性的结构域接触。
510.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域具有约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等)核碱基的长度。
511.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域具有约1-10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核碱基的长度。
512.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第三子结构域包含一个或多个(例如，1-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)错配。
513.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第三子结构域包含两个或更多个错配。
514.如实施例1-512中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第三子结构域包含一个且不多于一个错配。
515.如实施例1-512中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第三子结构域包含两个且不多于两个错配。
516.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第三子结构域包含一个或多个(例如，1-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)凸起。
517.如实施例516所述的寡核苷酸，其中每个凸出部分独立地包含一个或多个不是沃森-克里克或摇摆对的碱基对。
518.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第三子结构域包含一个或多个(例如，1-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)摇摆对。
519.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第三子结构域包含两个或更多个摇摆对。
520.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第三子结构域包含两个且不多于两个摇摆对。
521.如实施例1-511中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域与靶核酸完全互补。
522.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)独立地具有不是2'-F的修饰的经修饰的糖。
523.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是具有不是2'-F的修饰的经修饰的糖。
524.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域中约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是具有不是2'-F的修饰的经修饰的糖。
525.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的糖，其独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
526.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖的经修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
527.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域中约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的糖独立地是选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖的经修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
528.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-N(R)2修饰的经修饰的糖，其中每个R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
529.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-NH2修饰的经修饰的糖。
530.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)LNA糖。
531.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)无环糖(例如，UNA糖)。
532.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-F修饰的经修饰的糖。
533.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-OH的糖。
534.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含两个2'-H的糖。
535.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-OR修饰的经修饰的糖，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
536.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域包含一个或多个(例如，约1-20，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等)包含2'-OMe修饰的经修饰的糖。
537.如实施例1-527中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域中的每个糖独立地包含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰。
538.如实施例537所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域中的每个糖独立地包含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰，其中LB是任选地经取代的-CH2-。
539.如实施例537所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域中的每个糖独立地包含2'-OMe。
540.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域包含具有约1-8个核碱基的长度的5'-末端部分。
541.如实施例540所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分具有约1、2或3个核碱基的长度。
542.如实施例540或541所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分与该第二子结构域键合。
543.如实施例540-542中任一项所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分中的一个或多个糖独立地是经修饰的糖。
544.如实施例543所述的寡核苷酸，其中这些经修饰的糖独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
545.如实施例543所述的寡核苷酸，其中一个或多个经修饰的糖独立地包含2'-F。
546.如实施例540-542中任一项所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分的一个或多个糖独立地包含两个2'-H(例如，天然DNA糖)。
547.如实施例540-546中任一项所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分的一个或多个糖独立地包含2'-OH(例如，天然RNA糖)。
548.如实施例540-542中任一项所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分的糖独立地包含两个2'-H(例如，天然DNA糖)或2'-OH(例如，天然RNA糖)。
549.如实施例540-542中任一项所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分的糖独立地是天然DNA或RNA糖。
550.如实施例540-549中任一项所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分包含一个或多个错配。
551.如实施例540-550中任一项所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分包含一个或多个摇摆。
552.如实施例540-551中任一项所述的寡核苷酸，其中该5'-末端部分与靶核酸约60-100％(例如，66％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多)互补。
553.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域包含具有约1-8个核碱基的长度的3'-末端部分。
554.如实施例553所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分具有约1、2、3或4个核碱基的长度。
555.如实施例553或554所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分包含该第三子结构域的3'-末端核碱基。
556.如实施例553-555中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分中的一个或多个糖独立地是经修饰的糖。
557.如实施例556所述的寡核苷酸，其中这些经修饰的糖独立地选自双环糖(例如，LNA糖)、无环糖(例如，UNA糖)、具有2'-OR修饰的糖或具有2'-N(R)2修饰的糖，其中每个R独立地是任选地经取代的C1-6脂肪族基。
558.如实施例556-557中任一项所述的寡核苷酸，其中一个或多个经修饰的糖独立地包含2'-F。
559.如实施例556-557中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域中至少20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％的糖独立地包含2'-F。
560.如实施例556-559中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分中的一个或多个糖独立地包含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰。
561.如实施例560所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分中的每个糖独立地包含2'-OR修饰，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基，或2'-O-LB-4'修饰。
562.如实施例560-561中任一项所述的寡核苷酸，其中LB是任选地经取代的-CH2-。
563.如实施例560-561中任一项所述的寡核苷酸，其中LB是-CH2-。
564.如实施例560所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分中的每个糖独立地包含2'-OMe。
565.如实施例553-564中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分包含一个或多个错配。
566.如实施例553-565中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分包含一个或多个摇摆。
567.如实施例553-566中任一项所述的寡核苷酸，其中该3'-末端部分与靶核酸约60-100％(例如，66％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多)互补。
568.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域包含约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)经修饰的核苷酸间键联。
569.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域中约5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联。
570.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域中约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联。
571.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。
572.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域的最后一个核苷与倒数第二个核苷之间的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。
573.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或不带负电荷的核苷酸间键联。
574.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或中性核苷酸间键联。
575.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域中至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是手性控制的。
576.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域中至少5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的手性核苷酸间键联是手性控制的。
577.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域的最后一个核苷与倒数第二个核苷之间的核苷酸间键联是手性控制的。
578.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个手性核苷酸间键联独立地是手性控制的核苷酸间键联。
579.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域中至少约1-50个(例如，约5、6、7、8、9或10-约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个，或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40或50个等，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等)手性核苷酸间键联是Sp。
580.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域中至少5％-100％(例如，约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的手性核苷酸间键联是Sp。
581.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域中的每个手性核苷酸间键联是Sp。
582.如实施例1-580中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域的最后一个核苷与倒数第二个核苷之间的核苷酸间键联是Rp。
583.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中连接该第二子结构域的最后一个核苷和该第三子结构域的第一个核苷的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。
584.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中在位置-2处的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。
585.如实施例583-584中任一项所述的寡核苷酸，其中该不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。
586.如实施例585所述的寡核苷酸，其中该不带负电荷的核苷酸间键联是Rp。
587.如实施例585所述的寡核苷酸，其中该不带负电荷的核苷酸间键联是Sp。
588.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域中的每个核苷酸间键联独立地是经修饰的核苷酸间键联。
589.如实施例1-587中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域包含一个或多个天然磷酸酯键联。
590.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域能够将ADAR蛋白募集到靶核酸，或促进或有助于将ADAR蛋白募集到靶核酸。
591.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域能够使ADAR蛋白与靶核酸相互作用，或促进或有助于ADAR蛋白与靶核酸相互作用。
592.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域与具有酶活性的结构域接触。
593.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域与具有ADAR1脱氨酶活性的结构域接触。
594.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域与具有ADAR2脱氨酶活性的结构域接触。
595.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个摇摆碱基对独立地是G-U、I-A、G-A、I-U、I-C、I-T、A-A或反向A-T。
596.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个摇摆碱基对独立地是G-U、I-A、G-A、I-U或I-C。
597.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个环糖或每个糖独立地是任选地经取代的
Figure BDA0003580200980004751
598.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中每个环糖或每个糖独立地具有
Figure BDA0003580200980004752
的结构。
599.如实施例598所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含一个或多个糖，其中R2s和R4s是H。
600.如实施例598-599中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含一个或多个糖，其中R2s是-OR，并且R4s是H。
601.如实施例598-600中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含一个或多个糖，其中R2s是-OR，其中R是任选地经取代的C1-4烷基并且R4s是H。
602.如实施例598-601中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含一个或多个糖，其中R2s是-OMe并且R4s是H。
603.如实施例598-602中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含一个或多个糖，其中R2s是-F并且R4s是H。
604.如实施例598-603中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含一个或多个糖，其中R4s和R2s形成具有任选地经取代的2'-O-CH2-4'的结构的桥。
605.如实施例598-603中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含一个或多个糖，其中R4s和R2s形成具有2'-O-CH2-4'的结构的桥。
606.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含另外的化学部分。
607.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含靶向部分。
608.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含碳水化合物部分。
609.如实施例604-608中任一项所述的寡核苷酸，其中该部分是或包含脱唾液酸糖蛋白受体的配体。
610.如实施例604-609中任一项所述的寡核苷酸，其中该部分是或包含GalNAc或其衍生物。
611.如实施例604-610中任一项所述的寡核苷酸，其中该部分是或包含任选地经取代的
Figure BDA0003580200980004771
612.如实施例604-610中任一项所述的寡核苷酸，其中该部分是或包含任选地经取代的
Figure BDA0003580200980004772
613.如实施例604-612中任一项所述的寡核苷酸，其中该部分通过接头连接到寡核苷酸链。
614.如实施例613所述的寡核苷酸，其中该接头是或包含L001。
615.如实施例499所述的寡核苷酸，其中L001通过磷酸酯基团连接到寡核苷酸链的5'-末端5'-碳。
616.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸呈盐形式。
617.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸呈药学上可接受的盐形式。
618.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸呈钠盐形式。
619.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸呈铵盐形式。
620.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中如果有的话，至少一个或每个中性核苷酸间键联独立地是n001。
621.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中如果有的话，每个不带负电荷的核苷酸间键联独立地是n001。
622.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中不超过5、6、7、8、9、10、11或12个核苷位于与靶腺苷相反的核苷的3'。
623.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中不超过5、6、7、8、9、10、11或12个核苷位于与靶核苷相反的核苷的3'，其中这些核苷中的每一个独立地是任选地经取代的A、T、C、G、U或其互变异构体。
624.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中位于与靶腺苷相反的核苷的3'的约50％-100％(例如，约或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％)的核苷酸间键联各自独立地是经修饰的核苷酸间键联。
625.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中位于与靶腺苷相反的核苷的3'的约50％-100％(例如，约或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％)的核苷酸间键联各自独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或不带负电荷的核苷酸间键联。
626.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中在与靶腺苷相反的核苷的3'不超过1、2或3个核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。
627.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中在与靶腺苷相反的核苷的3'不超过1、2或3个核苷酸间键联是Rp核苷酸间键联。
628.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中在与靶腺苷相反的核苷的3'不超过1、2或3个核苷酸间键联是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。
629.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中在与靶核苷相反的核苷与其3'紧邻核苷(被认为是-1位)之间的核苷酸间键联是立体随机硫代磷酸酯核苷酸间键联。
630.如实施例1-628中任一项所述的寡核苷酸，其中在与靶核苷相反的核苷与其3'紧邻核苷(被认为是-1位)之间的核苷酸间键联是手性控制的Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。
631.如实施例1-628中任一项所述的寡核苷酸，其中在与靶核苷相反的核苷与其3'紧邻核苷(被认为是-1位)之间的核苷酸间键联是手性控制的Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。
632.如实施例1-628中任一项所述的寡核苷酸，其中在其糖的3'-位(被认为是-1位)处键合到与靶核苷相反的核苷的核苷酸间键联是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且任选地只有Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联位于与靶腺苷相反的核苷的3'。
633.如实施例1-628中任一项所述的寡核苷酸，其中在其糖的3'-位(被认为是-1位)处键合到与靶核苷相反的核苷的核苷酸间键联是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。
634.如实施例1-628中任一项所述的寡核苷酸，其中在其糖的3'-位(被认为是-1位)处键合到与靶核苷相反的核苷的核苷酸间键联是立体随机硫代磷酸酯核苷酸间键联。
635.如实施例1-628中任一项所述的寡核苷酸，其中在与靶核苷相反的核苷的3'紧邻核苷与下一个3'紧邻核苷之间的核苷酸间键联(例如，5'-…N0N-1N-2…-3'的N-1与N-2之间的位置-2，其中N0表示与靶核苷相反的核苷)是不带负电荷的核苷酸间键联。
636.如实施例635所述的寡核苷酸，其中该不带负电荷的核苷酸间键联是立体随机的。
637.如实施例635所述的寡核苷酸，其中该不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。
638.如实施例635所述的寡核苷酸，其中该不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。
639.如实施例635所述的寡核苷酸，其中该不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Rp。
640.如实施例635-639中任一项所述的寡核苷酸，其中不带负电荷的核苷酸间键联是n001。
641.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该第一核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。
642.如实施例641所述的寡核苷酸，其中该不带负电荷的核苷酸间键联是立体随机的。
643.如实施例641所述的寡核苷酸，其中该不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。
644.如实施例641所述的寡核苷酸，其中该不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。
645.如实施例641所述的寡核苷酸，其中该不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Rp。
646.如实施例641-645中任一项所述的寡核苷酸，其中不带负电荷的核苷酸间键联是n001。
647.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中最后一个核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。
648.如实施例647所述的寡核苷酸，其中该不带负电荷的核苷酸间键联是立体随机的。
649.如实施例647所述的寡核苷酸，其中该不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的。
650.如实施例647所述的寡核苷酸，其中该不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Sp。
651.如实施例647所述的寡核苷酸，其中该不带负电荷的核苷酸间键联是手性控制的并且是Rp。
652.如实施例647-651中任一项所述的寡核苷酸，其中不带负电荷的核苷酸间键联是n001。
653.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中在相对于与靶腺苷相反的核苷的位置-3处的核苷酸间键联不是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。
654.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中在相对于与靶腺苷相反的核苷的位置-6处的核苷酸间键联不是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。
655.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中在相对于与靶核苷相反的核苷的位置-4和/或-5处的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联，例如硫代磷酸酯核苷酸间键联。
656.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中与靶核苷相反的核苷在从5'-末端起的位置2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30或更远处。
657.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中与靶核苷相反的核苷在从3'-末端起的位置2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30或更远处。
658.如实施例656或657所述的寡核苷酸，其中该位置是位置4。
659.如实施例656或657所述的寡核苷酸，其中该位置是位置5。
660.如实施例656或657所述的寡核苷酸，其中该位置是位置6。
661.如实施例656或657所述的寡核苷酸，其中该位置是位置7。
662.如实施例656或657所述的寡核苷酸，其中该位置是位置8。
663.如实施例656或657所述的寡核苷酸，其中该位置是位置9。
664.如实施例656或657所述的寡核苷酸，其中该位置是位置10。
665.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，位于与靶腺苷相反的核苷的5'的约50％-100％(例如，约或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％)的核苷酸间键联各自独立地是经修饰的核苷酸间键联，其任选地是手性控制的。
666.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，位于与靶核苷(例如，靶腺苷)相反的核苷的5'的约50％-100％(例如，约或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％)的硫代磷酸酯核苷酸间键联各自是手性控制的并且是Sp。
667.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中在与靶腺苷相反的核苷的5'没有或不超过1、2或3个核苷酸间键联是天然磷酸酯键联。
668.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，在相对于与靶核苷相反的核苷的位置+5处的核苷酸间键联(例如，对于…N+5N+4N+3N+2N+1N0…，连接N+4和N+5的核苷酸间键联，其中N0是与靶核苷相反的核苷)不是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。
669.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中在相对于与靶腺苷相反的核苷的位置+6至+8处的一个或多个或所有核苷酸间键联各自独立地是经修饰的核苷酸间键联，其任选地是手性控制的。
670.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中在相对于与靶腺苷相反的核苷的位置+6至+8处的一个或多个或所有核苷酸间键联各自独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联，其任选地是手性控制的。
671.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中在相对于与靶腺苷相反的核苷的位置+6、+7、+8、+9和+11处的一个或多个或所有核苷酸间键联各自独立地是Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联。
672.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中在相对于与靶腺苷相反的核苷的位置+5、+6、+7、+8和+9处的一个或多个或所有核苷酸间键联各自独立地是Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联。
673.如前述实施例中任一项所述的寡聚核苷酸，其中该寡聚核苷酸与PiZZ等位基因(例如，atcgacAagaaagggactgaagc)具有约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的互补性。
674.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸具有约10％-100％(例如，约10％-95％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的纯度。
675.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸具有约50％-100％(例如，约50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等)的纯度。
676.一种药物组合物，该药物组合物包含或递送有效量的如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载剂。
677.一种包含多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中该多个寡核苷酸共享：
1)共同碱基序列，和
2)独立地在一个或多个(例如，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个)手性核苷酸间键联处相同的键联磷立体化学(“手性控制的核苷酸间键联”)；
其中该多个寡核苷酸各自独立地是如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸或其酸、碱或盐形式。
678.一种包含多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中该多个寡核苷酸共享：
1)共同碱基序列，和
2)独立地在一个或多个(例如，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个)手性核苷酸间键联处相同的键联磷立体化学(“手性控制的核苷酸间键联”)；
其中该多个寡核苷酸各自独立地是如实施例780-803中任一项所述的寡核苷酸或其酸、碱或盐形式。
679.一种包含多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中该多个寡核苷酸共享：
1)共同碱基序列，和
2)独立地在一个或多个(例如，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个)手性核苷酸间键联处相同的键联磷立体化学(“手性控制的核苷酸间键联”)；
其中该共同碱基序列与核酸的一部分的碱基序列互补，该部分包含靶腺苷。
680.如实施例679所述的组合物，其中该共同碱基序列与核酸的一部分的碱基序列互补，具有0-10个(例如，0-1、0-2、0-3、0-4、0-5、0-6、0-7、0-8、0-9、0-10、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)不是沃森-克里克碱基对的错配。
681.如实施例679所述的组合物，其中该共同碱基序列与核酸的一部分的碱基序列互补，具有0-5个不是沃森-克里克碱基对的错配。
682.如实施例679所述的组合物，其中除了与靶腺苷相反的核苷，该共同碱基序列在该共同碱基序列的整个长度上与核酸的一部分的碱基序列100％互补。
683.如实施例679所述的组合物，其中该共同碱基序列在该共同碱基序列的整个长度上与核酸的一部分的碱基序列100％互补。
684.如实施例677-683中任一项所述的组合物，其中当在表达ADAR的系统中与核酸接触时，该组合物能够靶向A至I。
685.如实施例677-684中任一项所述的组合物，其中该靶腺苷是与病症、障碍或疾病相关联的G至A突变。
686.如实施例677-685中任一项所述的组合物，其中该多个寡核苷酸共享相同的碱基修饰和糖修饰。
687.如实施例677-686中任一项所述的组合物，其中该多个寡核苷酸共享相同的骨架手性中心模式。
688.如实施例677-687中任一项所述的组合物，其中与没有核苷酸间键联是手性控制的寡核苷酸的立体随机制备物相比，该组合物富集该多个寡核苷酸。
689.如实施例677-687中任一项所述的组合物，其中该组合物中共享该共同碱基序列以及相同碱基和糖修饰的所有寡核苷酸中的非随机水平是该多个寡核苷酸。
690.如实施例677-687中任一项所述的组合物，其中该组合物中共享该共同碱基序列的所有寡核苷酸中的非随机水平是该多个寡核苷酸。
691.如实施例677-690中任一项所述的组合物，其中该多个寡核苷酸是相同的寡核苷酸或其一种或多种药学上可接受的盐。
692.如实施例677-690中任一项所述的组合物，其中该多个寡核苷酸是相同酸形式寡核苷酸的一种或多种药学上可接受的盐。
693.如实施例677-690中任一项所述的组合物，其中该多个寡核苷酸具有相同构成。
694.如实施例693所述的组合物，其中该组合物中与该多个寡核苷酸共享相同碱基序列的所有寡核苷酸中的非随机水平是该多个寡核苷酸。
695.如实施例693所述的组合物，其中该组合物中共享相同构成的所有寡核苷酸中的非随机水平是该多个寡核苷酸。
696.如实施例677-690中任一项所述的组合物，其中该多个寡核苷酸具有相同结构。
697.如实施例677-696中任一项所述的组合物，其中该多个寡核苷酸是钠盐。
698.如实施例677-697中任一项所述的组合物，其中该多个寡核苷酸在10个或更多个手性核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学。
699.如实施例677-698中任一项所述的组合物，其中该多个寡核苷酸在每个硫代磷酸酯核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学。
700.如实施例677-699中任一项所述的组合物，其中该多个寡核苷酸在一个或多个或任何不带负电荷的核苷酸间键联处不共享相同的键联磷立体化学。
701.一种包含一种或多种多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中每种多个寡核苷酸独立地共享：
1)共同碱基序列，和
2)独立地在一个或多个(例如，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个)手性核苷酸间键联处相同的键联磷立体化学(“手性控制的核苷酸间键联”)；
其中该多个寡核苷酸各自独立地是如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸或其酸、碱或盐形式。
702.一种包含一种或多种多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中每种多个寡核苷酸独立地共享：
1)共同碱基序列，和
2)独立地在一个或多个(例如，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个)手性核苷酸间键联处相同的键联磷立体化学(“手性控制的核苷酸间键联”)；
其中该多个寡核苷酸各自独立地是如前述实施例和实施例780-803中任一项所述的寡核苷酸，或其酸、碱或盐形式。
703.一种包含一种或多种多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中每种多个寡核苷酸独立地共享：
1)共同碱基序列，和
2)独立地在一个或多个(例如，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个)手性核苷酸间键联处相同的键联磷立体化学(“手性控制的核苷酸间键联”)；
其中该多个寡核苷酸各自独立地是如实施例780-803中任一项所述的寡核苷酸或其酸、碱或盐形式。
704.一种包含一种或多种多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中每种多个寡核苷酸独立地共享：
1)共同碱基序列，和
2)独立地在一个或多个(例如，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个)手性核苷酸间键联处相同的键联磷立体化学(“手性控制的核苷酸间键联”)；
其中每种多个寡核苷酸的共同碱基序列独立地与核酸的一部分的碱基序列互补，该部分包含靶腺苷。
705.如实施例所述的组合物，其中该共同碱基序列与核酸的一部分的碱基序列互补，具有0-10个(例如，0-1、0-2、0-3、0-4、0-5、0-6、0-7、0-8、0-9、0-10、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)不是沃森-克里克碱基对的错配。
706.如实施例705所述的组合物，其中每种多个寡核苷酸的该共同碱基序列独立地与核酸的一部分的碱基序列互补，具有0-5个不是沃森-克里克碱基对的错配。
707.如实施例705所述的组合物，其中除了与靶腺苷相反的核苷，每种多个寡核苷酸的该共同碱基序列独立地在该共同碱基序列的整个长度上与核酸的一部分的碱基序列100％互补。
708.如实施例705所述的组合物，其中每种多个寡核苷酸的该共同碱基序列独立地在该共同碱基序列的整个长度上与核酸的一部分的碱基序列100％互补。
709.如实施例701-708中任一项所述的组合物，其中当在表达ADAR的系统中与核酸接触时，每种多个寡核苷酸可以独立地编辑靶A至I。
710.如实施例701-709中任一项所述的组合物，其中靶腺苷是与病症、障碍或疾病相关联的G至A突变。
711.如实施例701-710中任一项所述的组合物，其中该组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)多个寡核苷酸。
712.如实施例701-711中任一项所述的组合物，其中至少两种多个寡核苷酸的共同碱基序列是不同的。
713.如实施例701-712中任一项所述的组合物，其中没有两种多个寡核苷酸共享相同的共同碱基序列。
714.如实施例701-713中任一项所述的组合物，其中至少两种多个寡核苷酸靶向不同的腺苷。
715.如实施例701-714中任一项所述的组合物，其中没有两种多个寡核苷酸靶向相同的腺苷。
716.如实施例701-715中任一项所述的组合物，其中至少两种多个寡核苷酸靶向不同的转录物。
717.如实施例701-716中任一项所述的组合物，其中没有两种多个寡核苷酸靶向相同的转录物。
718.如实施例701-717中任一项所述的组合物，其中至少两种多个寡核苷酸靶向来自不同多核苷酸的转录物中的腺苷残基。
719.如实施例701-720中任一项所述的组合物，其中没有两种多个寡核苷酸靶向来自相同多核苷酸的转录物。
720.如实施例701-719中任一项所述的组合物，其中至少两种多个寡核苷酸靶向来自不同基因的转录物中的腺苷残基。
721.如实施例701-720中任一项所述的组合物，其中没有两种多个寡核苷酸靶向来自相同基因的转录物。
722.如实施例701-721中任一项所述的组合物，其中每种多个寡核苷酸独立地共享该多个寡核苷酸内的相同碱基和糖修饰。
723.如实施例701-722中任一项所述的组合物，其中每种多个寡核苷酸独立地共享该多个寡核苷酸内的相同骨架手性中心模式。
724.如实施例701-723中任一项所述的组合物，其中独立地对于每种多个寡核酸，与没有核苷酸间键联是手性控制的多个寡核苷酸的立体随机制备物相比，该组合物富集该多个寡核苷酸。
725.如实施例701-724中任一项所述的组合物，其中独立地对于每种多个寡核酸，该组合物中共享该共同碱基序列以及相同碱基和糖修饰的所有寡核苷酸中的非随机水平是该多个寡核苷酸。
726.如实施例701-724中任一项所述的组合物，其中独立地对于每种多个寡核酸，该组合物中共享该共同碱基序列的所有寡核苷酸中的非随机水平是该多个寡核苷酸。
727.如实施例701-726中任一项所述的组合物，其中独立地对于每种多个寡核酸，该多个寡核苷酸是相同的寡核苷酸或其一种或多种药学上可接受的盐。
728.如实施例701-727中任一项所述的组合物，其中独立地对于每种多个寡核酸，该多个寡核苷酸是相同酸形式寡核苷酸的一种或多种药学上可接受的盐。
729.如实施例701-726中任一项所述的组合物，其中独立地对于每种多个寡核酸，该多个寡核苷酸具有相同构成。
730.如实施例729所述的组合物，其中独立地对于每种多个寡核酸，该组合物中与该多个寡核苷酸共享相同碱基序列的所有寡核苷酸中的非随机水平是该多个寡核苷酸。
731.如实施例729所述的组合物，其中独立地对于每种多个寡核酸，该组合物中共享相同构成的所有寡核苷酸中的非随机水平是该多个寡核苷酸。
732.如实施例701-731中任一项所述的组合物，其中独立地对于一种或两种或所有多个寡核苷酸，该多个寡核苷酸具有相同结构。
733.如实施例701-732中任一项所述的组合物，其中独立地对于一种或两种或所有多个寡核苷酸，该多个寡核苷酸各自独立地是药学上可接受的盐形式。
734.如实施例701-732中任一项所述的组合物，其中独立地对于一种或两种或所有多个寡核苷酸，该多个寡核苷酸是钠盐。
735.如实施例701-734中任一项所述的组合物，其中独立地对于一种或两种或所有多个寡核苷酸，该多个寡核苷酸在10个或更多个手性核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学。
736.如实施例701-735中任一项所述的组合物，其中独立地对于每种多个寡核苷酸，该多个寡核苷酸在10个或更多个手性核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学。
737.如实施例701-736中任一项所述的组合物，其中独立地对于一种或两种或所有多个寡核苷酸，该多个寡核苷酸在每个硫代磷酸酯核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学。
738.如实施例701-737中任一项所述的组合物，其中独立地对于每种多个寡核苷酸，该多个寡核苷酸在每个硫代磷酸酯核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学。
739.如实施例701-738中任一项所述的组合物，其中独立地对于一种或两种或所有多个寡核苷酸，该多个寡核苷酸不在一个或多个或任何不带负电荷的核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学。
740.如实施例701-739中任一项所述的组合物，其中独立地对于每种多个寡核苷酸，该多个寡核苷酸不在一个或多个或任何不带负电荷的核苷酸间键联处共享相同的键联磷立体化学。
741.一种包含属于特定寡核苷酸类型的多个寡核苷酸的组合物，该多个寡核苷酸的特征在于：
a)共同碱基序列；
b)共同骨架键联模式；
c)共同骨架手性中心模式；
d)共同骨架磷修饰模式；
该组合物是手性控制的，因为该组合物相对于具有相同的共同碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物，富集该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，或在该组合物中共享该共同碱基序列的所有寡核苷酸中的非随机水平是该多个寡核苷酸；以及
其中该多个寡核苷酸各自独立地是如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸或其酸、碱或盐形式。
742.一种包含属于特定寡核苷酸类型的多个寡核苷酸的组合物，该多个寡核苷酸的特征在于：
a)共同碱基序列；
b)共同骨架键联模式；
c)共同骨架手性中心模式；
d)共同骨架磷修饰模式；
该组合物是手性控制的，因为该组合物相对于具有相同的共同碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物，富集该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，或在该组合物中共享该共同碱基序列的所有寡核苷酸中的非随机水平是该多个寡核苷酸；以及
其中该多个寡核苷酸各自独立地是如实施例780-803中任一项所述的寡核苷酸或其酸、碱或盐形式。
743.一种包含属于特定寡核苷酸类型的多个寡核苷酸的组合物，该多个寡核苷酸的特征在于：
a)共同碱基序列；
b)共同骨架键联模式；
c)共同骨架手性中心模式；
d)共同骨架磷修饰模式；
该组合物是手性控制的，因为该组合物相对于具有相同的共同碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物，富集该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，或在该组合物中共享该共同碱基序列的所有寡核苷酸中的非随机水平是该多个寡核苷酸；以及
其中该共同碱基序列与核酸的一部分的碱基序列互补，该部分包含靶腺苷。
744.如实施例743所述的组合物，其中该共同碱基序列与核酸的一部分的碱基序列互补，具有0-10个(例如，0-1、0-2、0-3、0-4、0-5、0-6、0-7、0-8、0-9、0-10、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)不是沃森-克里克碱基对的错配。
745.如实施例743所述的组合物，其中该共同碱基序列与核酸的一部分的碱基序列互补，具有0-5个不是沃森-克里克碱基对的错配。
746.如实施例743所述的组合物，其中除了与靶腺苷相反的核苷，该共同碱基序列在该共同碱基序列的整个长度上与核酸的一部分的碱基序列100％互补。
747.如实施例743所述的组合物，其中该共同碱基序列在该共同碱基序列的整个长度上与核酸的一部分的碱基序列100％互补。
748.如实施例741-747中任一项所述的组合物，其中当在表达ADAR的系统中与核酸接触时，该组合物能够靶向A至I。
749.如实施例741-748中任一项所述的组合物，其中该靶腺苷是与病症、障碍或疾病相关联的G至A突变。
750.如实施例741-749中任一项所述的组合物，其中相对于具有相同的共同碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物，该组合物富集该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸。
751.如实施例741-750中任一项所述的组合物，其中该组合物中共享该共同碱基序列的所有寡核苷酸中的非随机水平是该多个寡核苷酸。
752.如实施例677-751中任一项所述的组合物，其中该组合物的寡核苷酸中共享该多个寡核苷酸的共同碱基序列的多个寡核苷酸的水平为约或至少约(DS)nc，其中DS为约85％-100％(例如，约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或更多)并且nc为手性控制的核苷酸间键联的数目。
753.如实施例677-751中任一项所述的组合物，其中对于每种多个寡核苷酸，该组合物的寡核苷酸中共享该多个寡核苷酸的共同碱基序列的多个寡核苷酸的水平独立地是约或至少约(DS)nc，其中DS为约85％-100％(例如，约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或更多)并且nc为手性控制的核苷酸间键联的数目。
754.如实施例677-751中任一项所述的组合物，其中该组合物的寡核苷酸中共享该多个寡核苷酸的共同构成的多个寡核苷酸的水平为约或至少约(DS)nc，其中DS为约85％-100％(例如，约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或更多)并且nc为手性控制的核苷酸间键联的数目。
755.如实施例677-751中任一项所述的组合物，其中对于每种多个寡核苷酸，该组合物的寡核苷酸中共享该多个寡核苷酸的共同构成的多个寡核苷酸的水平独立地是约或至少约(DS)nc，其中DS为约85％-100％(例如，约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或更多)并且nc为手性控制的核苷酸间键联的数目。
756.如实施例677-755中任一项所述的组合物，其中DS为约90％-100％(例如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或更多)。
757.如实施例752-756中任一项所述的组合物，其中nc为约5-40(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)或更大。
758.如实施例677-751中任一项所述的组合物，其中该水平为至少约10％-100％，或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
759.如实施例677-751中任一项所述的组合物，其中该水平为至少约50％-100％，或至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
760.如实施例677-759中任一项所述的组合物，其中当该组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时，该靶腺苷残基被修饰。
761.如实施例760所述的组合物，其中该修饰是或包括由ADAR1进行的修饰。
762.如实施例760或761所述的组合物，其中该修饰是或包括由ADAR2进行的修饰。
763.如实施例760-762中任一项所述的组合物，其中该修饰在体外进行。
764.如实施例760-762中任一项所述的组合物，其中该样品是细胞。
765.如实施例760-764中任一项所述的组合物，其中该靶腺苷被转化成肌苷。
766.如实施例760-765中任一项所述的组合物，其中该靶腺苷被修饰至比用可比较的参考寡核苷酸组合物所观察到的更大的程度。
767.如实施例766所述的组合物，其中该参考寡核苷酸组合物不含该多个寡核苷酸或包含更低水平的该多个寡核苷酸。
768.如实施例766-767中任一项所述的组合物，其中该参考组合物不含具有与该多个寡核苷酸相同的构成的寡核苷酸。
769.如实施例766-768中任一项所述的组合物，其中该参考组合物不含具有与该多个寡核苷酸相同的结构的寡核苷酸。
770.如实施例766所述的组合物，其中该参考寡核苷酸组合物是这样的组合物，其与该多个寡核苷酸具有相同碱基序列的寡核苷酸与该多个寡核苷酸相比包含更低水平的2'-F修饰。
771.如实施例766-770中任一项所述的组合物，其中该参考寡核苷酸组合物是这样的组合物，其与该多个寡核苷酸具有相同碱基序列的寡核苷酸与该多个寡核苷酸相比包含更低水平的2'-OMe修饰。
772.如实施例766-771中任一项所述的组合物，其中该参考寡核苷酸组合物是这样的组合物，其与该多个寡核苷酸具有相同碱基序列的寡核苷酸与该多个寡核苷酸相比具有不同的糖修饰模式。
773.如实施例766-772中任一项所述的组合物，其中该参考寡核苷酸组合物是这样的组合物，其与该多个寡核苷酸具有相同碱基序列的寡核苷酸与该多个寡核苷酸相比包含更低水平的经修饰的核苷酸间键联。
774.如实施例766-773中任一项所述的组合物，其中该参考寡核苷酸组合物是这样的组合物，其与该多个寡核苷酸具有相同碱基序列的寡核苷酸与该多个寡核苷酸相比包含更低水平的硫代磷酸酯核苷酸间键联。
775.如实施例766-774中任一项所述的组合物，其中该参考组合物是立体随机寡核苷酸组合物。
776.如实施例766所述的组合物，其中该参考组合物是与该多个寡核苷酸具有相同构成的寡核苷酸的立体随机寡核苷酸组合物。
777.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该组合物不引起核酸的显著降解(例如，不超过约5％-100％(例如，不超过约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等))。
778.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中该组合物不引起该靶核酸中显著的外显子跳跃或改变的外显子包含(例如，不超过约5％-100％(例如，不超过约10％-100％、20-100％、30％-100％、40％-100％、50％-80％、50％-85％、50％-90％、50％-95％、60％-80％、60％-85％、60％-90％、60％-95％、60％-100％、65％-80％、65％-85％、65％-90％、65％-95％、65％-100％、70％-80％、70％-85％、70％-90％、70％-95％、70％-100％、75％-80％、75％-85％、75％-90％、75％-95％、75％-100％、80％-85％、80％-90％、80％-95％、80％-100％、85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％等))。
779.如实施例677-778中任一项所述的组合物，其中该组合物是药物组合物，并且进一步包含药学上可接受的载剂。
780.一种寡核苷酸，其中除了在经修饰的核苷酸间键联的位置处是具有-O5-PL(RCA)-O3-的结构的键联外，该寡核苷酸在其他方面与如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸相同，其中：
PL是P或P(＝W)；
W是O、S或WN；
RCA是或包含任选地经取代的或封端的手性助剂部分，
O5是键合到糖的5'-碳的氧，并且
O3是键合到糖的3'-碳的氧。
781.如实施例780所述的寡核苷酸，其中该手性助剂被去除，该键联被转化成经修饰的核苷酸间键联。
782.如实施例780所述的寡核苷酸，其中经修饰的核苷酸间键联是硫代磷酸酯核苷酸间键联。
783.如实施例782所述的寡核苷酸，其中当W被-SH代替并且RCA被O代替时，PL具有与该硫代磷酸酯核苷酸间键联的键联磷相同的构型。
784.如实施例780-783中任一项所述的寡核苷酸，其中经修饰的核苷酸间键联是中性核苷酸间键联。
785.如实施例780-783中任一项所述的寡核苷酸，其中经修饰的核苷酸间键联是n001。
786.如实施例780-785中任一项所述的寡核苷酸，其中在硫代磷酸酯核苷酸间键联的每个位置处独立地是具有-O5-PL(W)(RCA)-O3-的结构的键联。
787.如实施例780-785中任一项所述的寡核苷酸，其中在经修饰的核苷酸间键联的每个位置处独立地是具有-O5-PL(W)(RCA)-O3-的结构的键联。
788.如实施例780-787中任一项所述的寡核苷酸，其中一个或每个W是S。
789.如实施例780-788中任一项所述的寡核苷酸，其中一个且仅一个PL是P。
790.如实施例780-789中任一项所述的寡核苷酸，其中每个RCA独立地是
Figure BDA0003580200980004981
或
Figure BDA0003580200980004982
791.如实施例780-789中任一项所述的寡核苷酸，其中每个RCA独立地是
Figure BDA0003580200980004983
或
Figure BDA0003580200980004984
其中RC1是R、-Si(R)3或-SO2R，RC2和RC3与居于它们之间的原子合在一起形成任选地经取代的3-7元饱和或部分不饱和环，该环除了氮原子外还具有0-2个杂原子，RC4是-H或-C(O)R'。
792.如实施例790或791所述的寡核苷酸，其中在键联中，RC4是-C(O)R并且PL是P。
793.如实施例791-792中任一项所述的寡核苷酸，其中在键联中，RC4是-C(O)R并且W是S。
794.如实施例791-793中任一项所述的寡核苷酸，其中在W是S的每个键联中，RC4是-C(O)R'。
795.如实施例791-794中任一项所述的寡核苷酸，其中RC4是-C(O)CH3。
796.如实施例791所述的寡核苷酸，其中在键联中，RC4是-H并且PL是P。
797.如实施例791-796中任一项所述的寡核苷酸，其中RC2和RC3与居于它们之间的原子合在一起形成除氮原子外不具有杂原子的任选地经取代的5元环。
798.如实施例791-797中任一项所述的寡核苷酸，其中每个RCA独立地是
Figure BDA0003580200980004991
或
Figure BDA0003580200980004992
799.如实施例791-798中任一项所述的寡核苷酸，其中RC1是-SiPh2Me。
800.如实施例791-798中任一项所述的寡核苷酸，其中RC1是-SO2R。
801.如实施例791-798中任一项所述的寡核苷酸，其中RC1是-SO2R，其中R是任选地经取代的C1-10脂肪族基。
802.如实施例791-798中任一项所述的寡核苷酸，其中RC1是-SO2R，其中R是任选地经取代的苯基。
803.如实施例791-798中任一项所述的寡核苷酸，其中RC1是-SO2R，其中R是苯基。
804.一种亚磷酰胺，其中该亚磷酰胺的核碱基是如实施例1-675中任一项所述的核碱基或其互变异构体，其中该核碱基或其互变异构体是任选地经取代的或被保护的。
805.一种亚磷酰胺，其中核碱基是或包含环BA，其中环BA具有BA-I、BA-I-a、BA-I-b、BA-II、BA-II-a、BA-II-b、BA-III、BA-III-a、BA-III-b、BA-IV、BA-IV-a、BA-IV-b、BA-V、BA-V-a、BA-V-b或BA-VI的结构，或环BA的互变异构体，其中该核碱基是任选地经取代的或被保护的。
806.如实施例804-805中任一项所述的亚磷酰胺，其中该亚磷酰胺的糖是如实施例1-675中任一项所述的糖，其中该糖是任选地被保护的。
807.如实施例804-806中任一项所述的亚磷酰胺，其中该亚磷酰胺具有RNS-P(OR)N(R)2的结构，其中RNS是任选地被保护的核苷部分，并且每个R如本文所述。
808.如实施例804-806中任一项所述的亚磷酰胺，其中该亚磷酰胺具有RNS-P(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2的结构。
809.如实施例804-806中任一项所述的亚磷酰胺，其中该亚磷酰胺包含手性助剂部分，其中该磷键合到该手性助剂部分的氧和氮原子。
810.如实施例804-806或809中任一项所述的亚磷酰胺，其中该亚磷酰胺具有
Figure BDA0003580200980005001
或
Figure BDA0003580200980005002
或其盐的结构。
811.如实施例804-806或809中任一项所述的亚磷酰胺，其中该亚磷酰胺具有
Figure BDA0003580200980005003
或
Figure BDA0003580200980005004
的结构，其中RNS是任选地被保护的核苷部分，RC1是R、-Si(R)3或-SO2R，RC2和RC3与居于它们之间的原子合在一起形成任选地经取代的3-7元饱和或部分不饱和环，该环除了氮原子外还具有0-2个杂原子。
812.如实施例807-811中任一项所述的亚磷酰胺，其中RNS的5'-OH被保护。
813.如实施例812所述的亚磷酰胺，其中RNS的5'-OH作为-ODMTr被保护。
814.如实施例807-813中任一项所述的亚磷酰胺，其中RNS通过其3'-O-键合到磷。
815.如实施例810-814中任一项所述的亚磷酰胺，其中RC2和RC3与居于它们之间的原子合在一起形成除氮原子外不具有杂原子的任选地经取代的5元饱和环。
816.如实施例810-815中任一项所述的亚磷酰胺，其中该亚磷酰胺具有
Figure BDA0003580200980005005
或
Figure BDA0003580200980005006
或其盐的结构。
817.如实施例810-815中任一项所述的亚磷酰胺，其中该亚磷酰胺具有
Figure BDA0003580200980005011
或
Figure BDA0003580200980005012
的结构。
818.如实施例810-817中任一项所述的亚磷酰胺，其中RC1是-SiPh2Me。
819.如实施例810-817中任一项所述的亚磷酰胺，其中RC1是-SO2R。
820.如实施例810-817中任一项所述的亚磷酰胺，其中RC1是-SO2R，其中R是任选地经取代的C1-10脂肪族基。
821.如实施例810-817中任一项所述的亚磷酰胺，其中RC1是-SO2R，其中R是任选地经取代的苯基。
822.如实施例810-817任一项所述的亚磷酰胺，其中RC1是-SO2R，其中R是苯基。
823.如实施例810-822中任一项所述的亚磷酰胺，其中该亚磷酰胺的纯度为至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
824.一种用于制备寡核苷酸或组合物的方法，该方法包括使寡核苷酸或核苷的5'-OH与如实施例780-823中任一项所述的亚磷酰胺偶联。
825.一种用于制备寡核苷酸或组合物的方法，该方法包括使寡核苷酸或核苷的5'-OH与如实施例810-823中任一项所述的亚磷酰胺偶联。
826.一种用于制备寡核苷酸或组合物的方法，该方法包括从如实施例677-803中任一项所述的寡核苷酸去除手性助剂部分。
827.如实施例824-826中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸或该组合物中的寡核苷酸包含含有2'-OH的糖。
828.如实施例824-827中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸或该组合物中的寡核苷酸包含含有2'-OH的糖，其中该糖键合到手性控制的核苷酸间键联。
829.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸、组合物或方法，其中每个杂原子独立地选自氮、氧、硅、磷和硫。
830.如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸、组合物或方法，其中每个核碱基独立地包含具有至少一个氮的任选地经取代的环。
831.一种用于表征寡核苷酸或组合物的方法，该方法包括：
将该寡核苷酸或组合物施用于包含或表达ADAR1多肽或其特征性部分，或编码ADAR1多肽或其特征性部分的多核苷酸的细胞或其群体。
832.如实施例831中任一项所述的方法，其中细胞是小鼠细胞。
833.如实施例831-832中任一项所述的方法，其中该细胞的基因组包含编码ADAR1多肽或其特征性部分的多核苷酸。
834.一种用于表征寡核苷酸或组合物的方法，该方法包括：
将该寡核苷酸或组合物施用于包含或表达ADAR1多肽或其特征性部分，或编码ADAR1多肽或其特征性部分的多核苷酸的非人类动物或其群体。
835.如实施例834所述的方法，其中该动物是小鼠。
836.如实施例834-835中任一项所述的方法，其中该动物的基因组包含编码ADAR1多肽或其特征性部分的多核苷酸。
837.如实施例834-835中任一项所述的方法，其中该动物的种系基因组包含编码ADAR1多肽或其特征性部分的多核苷酸。
838.如实施例831-837中任一项所述的方法，其中ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1 Z-DNA结合结构域中的一者或两者。
839.如实施例831-838中任一项所述的方法，其中ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1 dsRNA结合结构域中的一者或多者或全部。
840.如实施例831-839中任一项所述的方法，其中ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人脱氨酶结构域。
841.如实施例831-840中任一项所述的方法，其中ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1。
842.如实施例831-841中任一项所述的方法，其中ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1 p110。
843.如实施例831-841中任一项所述的方法，其中ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1 p150。
844.如实施例831-843中任一项所述的方法，其中与在工程化之前的细胞或工程化之前的动物的细胞或其群体中观察到的寡核苷酸或组合物的活性水平相比，从细胞或动物的细胞或其群体中观察到的寡核苷酸或组合物的活性水平与在可比较的人类细胞或其群体中观察到的寡核苷酸或组合物的活性水平更相似。
845.如实施例844所述的方法，其中可比较的人类细胞与细胞或动物的细胞具有相同的类型。
846.一种用于修饰靶核酸中的靶腺苷的方法，该方法包括使该靶核酸与如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸或组合物接触。
847.一种用于使靶核酸中的靶腺苷脱氨的方法，该方法包括使该靶核酸与如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸或组合物接触。
848.一种用于产生特定核酸的产物、或者恢复或增加特定核酸的产物的水平的方法，该方法包括使靶核酸与如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸或组合物接触，其中该靶核酸包含靶腺苷，并且该特定核酸与该靶核酸的不同之处在于该特定核酸具有I或G而不是该靶腺苷。
849.一种用于降低靶核酸的产物的水平的方法，该方法包括使靶核酸与如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸或组合物接触，其中该靶核酸包含靶腺苷。
850.如实施例848或849所述的方法，其中该产物是蛋白。
851.如实施例848或849所述的方法，其中该产物是mRNA。
852.如实施例846-851中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸组合物中的一个或多个寡核苷酸的碱基序列与该靶核酸的碱基序列基本上互补。
853.如实施例846-852中任一项所述的方法，其中该靶核酸在样品中。
854.一种方法，该方法包括：
使如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸或组合物与包含靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触，其中：
该寡核苷酸组合物中的一个或多个寡核苷酸的碱基序列与该靶核酸的碱基序列基本上互补；并且
该靶核酸包含靶腺苷；
其中该靶腺苷被修饰。
855.一种方法，该方法包括：
1)获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；以及
2)获得靶核酸中靶腺苷的参考修饰水平，该水平是当参考寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含比该参考多个寡核苷酸更多的具有2'-F修饰的糖，更多的具有2'-OR修饰的糖，其中R不是-H，和/或更多的手性核苷酸间键联；以及
与该参考寡核苷酸组合物的寡核苷酸相比，该第一寡核苷酸组合物提供更高水平的修饰。
856.一种方法，该方法包括：
获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；并且
其中靶腺苷的该第一修饰水平高于该靶腺苷的参考修饰水平，其中该参考水平是在参考寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含比该参考多个寡核苷酸更多的具有2'-F修饰的糖，更多的具有2'-OR修饰的糖，其中R不是-H，和/或更多的手性核苷酸间键联。
857.一种方法，该方法包括：
1)获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；以及
2)获得靶核酸中靶腺苷的参考修饰水平，该水平是当参考寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含比该参考多个寡核苷酸更多的具有2'-F修饰的糖，更多的具有2'-OR修饰的糖，其中R不是-H，和/或更多的手性控制的手性核苷酸间键联；以及
与该参考寡核苷酸组合物的寡核苷酸相比，该第一寡核苷酸组合物提供更高水平的修饰。
858.一种方法，该方法包括：
获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；并且
其中靶腺苷的该第一修饰水平高于该靶腺苷的参考修饰水平，其中该参考水平是在参考寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含比该参考多个寡核苷酸更多的具有2'-F修饰的糖，更多的具有2'-OR修饰的糖，其中R不是-H，和/或更多的手性控制的手性核苷酸间键联。
859.一种方法，该方法包括：
1)获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；以及
2)获得靶核酸中靶腺苷的参考修饰水平，该水平是当参考寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含一个或多个手性控制的手性核苷酸间键联；以及
该参考多个寡核苷酸不含手性控制的手性核苷酸间键联(参考寡核苷酸组合物是“立体随机组合物”)；以及
与该参考寡核苷酸组合物的寡核苷酸相比，该第一寡核苷酸组合物提供更高水平的修饰。
860.一种方法，该方法包括：
获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；并且
其中靶腺苷的该第一修饰水平高于该靶腺苷的参考修饰水平，其中该参考水平是在参考寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含一个或多个手性控制的手性核苷酸间键联；以及
该参考多个寡核苷酸不含手性控制的手性核苷酸间键联(参考寡核苷酸组合物是“立体随机组合物”)。
861.如实施例855-860中任一项所述的方法，其中第一寡核苷酸组合物是如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸组合物。
862.如实施例855-861中任一项所述的方法，其中该参考寡核苷酸组合物是如实施例767-776中任一项所述的参考寡核苷酸组合物。
863.如实施例846-862中任一项所述的方法，其中该脱氨酶是ADAR酶。
864.如实施例846-862中任一项所述的方法，其中该脱氨酶是ADAR1。
865.如实施例846-862中任一项所述的方法，其中该脱氨酶是ADAR2。
866.如实施例846-865中任一项所述的方法，其中该靶核酸是或包含RNA。
867.如实施例846-866中任一项所述的方法，其中样品是细胞。
868.如实施例846-867中任一项所述的方法，其中与不同于该靶核酸的核酸相比，该靶核酸与病症、障碍或疾病，或所需的特性或功能的减弱，或不期望的特性或功能的增强更相关，该不同在于其在靶腺苷的位置具有I或G而不是该靶腺苷。
869.如实施例846-867中任一项所述的方法，其中该靶腺苷是G至A突变。
870.一种用于预防或治疗适合G至A突变的病症、障碍或疾病的方法，该方法包括向易患或患有该病症、障碍或疾病的受试者施用有效量的如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸或组合物。
871.一种用于预防或治疗与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的方法，该方法包括向易患或患有该病症、障碍或疾病的受试者施用有效量的如前述实施例中任一项所述的寡核苷酸或组合物。
872.如实施例870或871所述的方法，其中该寡核苷酸组合物中的一个或多个寡核苷酸的碱基序列与包含作为突变的靶腺苷的靶核酸的碱基序列基本上互补。
873.如实施例871-872中任一项所述的方法，其中该病症、障碍或疾病适合A至G或A至I修饰。
874.如实施例870-873中任一项所述的方法，其中与该病症、障碍或疾病相关联的细胞包含或表达ADAR蛋白。
875.如实施例870-873中任一项所述的方法，其中与该病症、障碍或疾病相关联的细胞包含或表达ADAR1。
876.如实施例870-873中任一项所述的方法，其中与该病症、障碍或疾病相关联的细胞包含或表达ADAR2。
877.如实施例870-876中任一项所述的方法，其中该病症、障碍或疾病是α-1抗胰蛋白酶缺乏或与之相关。
878.如实施例846-877中任一项所述的方法，该方法包括将靶腺苷转化成I。
879.如实施例846-878中任一项所述的方法，其中靶向并编辑两种或更多种不同的腺苷。
880.如实施例846-878中任一项所述的方法，其中靶向并编辑两种或更多种不同的转录物。
881.如实施例846-878中任一项所述的方法，其中靶向并编辑来自两种或更多种不同多核苷酸的转录物。
882.如实施例846-878中任一项所述的方法，其中靶向并编辑来自两种或更多种基因的转录物。
883.如实施例879-882中任一项所述的方法，该方法包括施用两种或更多种寡核苷酸，每种寡核苷酸独立地靶向不同的靶，并且每种寡核苷酸独立地是如实施例1-675中任一项所述的寡核苷酸或其盐。
884.如实施例879-882中任一项所述的方法，该方法包括施用两种或更多种寡核苷酸组合物，每种寡核苷酸组合物独立地靶向至少一种不同的靶，并且每种寡核苷酸组合物独立地是如实施例676-779中任一项所述的组合物。
885.如实施例879-884中任一项所述的方法，该方法包括施用如实施例701-779中任一项所述的组合物。
886.如实施例879-885中任一项所述的方法，其中两种或更多种寡核苷酸或组合物同时施用。
887.如实施例879-886中任一项所述的方法，其中两种或更多种寡核苷酸或组合物在单一组合物中同时施用。
888.如实施例879-886中任一项所述的方法，其中两种或更多种寡核苷酸或组合物作为分开的组合物施用。
889.如实施例879-885中任一项所述的方法，其中一种或多种寡核苷酸或组合物在一种或多种其他寡核苷酸或组合物之前或之后施用。
实例
本文呈现了所提供的技术(化合物(寡核苷酸、试剂等)、组合物、方法(制备方法、使用方法、评估方法等)等)的某些实例。
本领域的技术人员应了解，可以利用许多技术来评估所提供技术的特性和/或活性，例如下文实例中所描述的那些技术。
实例1.用于评估腺苷编辑的有用技术。
可以使用多种系统来评估寡核苷酸设计。在一些实施例中，在HEK293T细胞中制备和评估cLuc寡核苷酸。在一些实施例中，在用针对人ADAR1或人ADAR2的质粒和cLuc荧光素酶报告质粒转染的293T细胞中评估靶向cLuc(海萤(Cypridina))的寡核苷酸。cLuc报告质粒由与荧光素酶相关的(高斯(Gaussia))gLuc-p2A-cLuc(W85X)组成。cLuc报告子由ADAR介导的A>I编辑激活。使用以下等式计算寡核苷酸的编辑活性：
倍数变化＝经处理的寡核苷酸(cLuc/gLuc)/模拟(cLuc/gLuc)
在一些实施例中，使用Liptofectamine 2000转染方案(Thermo 11668030)将报告质粒和ADAR1或ADAR2质粒一起转染到HEK293T细胞中。在合适的时间段(例如，24小时)后，将表达报告子和ADAR质粒的HEK293T细胞用适量的寡核苷酸针对每个实验反向转染。在48、72和/或96小时后分别使用PierceTM高斯荧光素酶辉光测定试剂盒(PierceTM16161)或PierceTM海萤荧光素酶辉光测定试剂盒(PierceTM16170)测量cLuc和gLuc活性。
实例2.所提供的技术在没有外源性ADAR的情况下提供所需的编辑。
在一些实施例中，在原代人肝细胞中评估寡核苷酸和组合物以评估腺苷编辑。将靶向ACTB mRNA的寡核苷酸使用Liptofectamine RNAimax转染方案(Thermo 11668030)转染，或在Gymnotic自由摄取条件下递送至原代人肝细胞(吉布可公司(Gibco))。48小时后，使用SV 96总RNA分离系统方案(普洛麦格公司(Promega)：Z3505)收集总RNA。将位于内源性表达的靶RNA的编辑位点侧翼的引物用于使用Phusion高保真DNA聚合酶方案(赛默公司(Thermo)：F-530XL)的PCR。对PCR产物进行桑格测序，并使用EditR程序(https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/)计算ADAR介导的编辑的百分比。所提供的技术在没有外源性ADAR的情况下提供了所需的编辑。
实例3.所提供的技术在没有外源性ADAR的情况下在多种细胞类型中提供所需的编辑。
在一些实施例中，在原代支气管上皮细胞中评估寡核苷酸及其组合物以评估腺苷编辑。将靶向ACTB mRNA的寡核苷酸使用Liptofectamine RNAimax转染方案(Thermo11668030)转染，或在Gymnotic自由摄取条件下递送至原代支气管上皮细胞(龙沙公司(Lonza))。48小时后，使用SV 96总RNA分离系统方案(普洛麦格公司：Z3505)收集总RNA。将位于内源性表达的靶RNA的编辑位点侧翼的引物用于使用Phusion高保真DNA聚合酶方案(赛默公司(Thermo)：F-530XL)的PCR。对PCR产物进行桑格测序，并使用EditR程序计算ADAR介导的编辑的百分比。所提供的技术在没有外源性ADAR的情况下提供了编辑。
实例4.所提供的技术在没有外源性ADAR的情况下在多种细胞类型中提供所需的编辑。
在一些实施例中，在原代视网膜色素上皮细胞中评估寡核苷酸和组合物的腺苷编辑。将靶向ACTB mRNA的寡核苷酸使用Liptofectamine RNAimax转染方案(Thermo11668030)转染，或在Gymnotic自由摄取条件下递送至原代人视网膜色素上皮细胞(龙沙公司)。48小时后，使用SV 96总RNA分离系统方案(普洛麦格公司：Z3505)收集总RNA。将位于内源性表达的靶RNA的编辑位点侧翼的引物用于使用Phusion高保真DNA聚合酶方案(赛默公司：F-530XL)的PCR。对PCR产物进行桑格测序，并使用EditR程序计算ADAR介导的编辑的百分比。所提供的技术在没有外源性ADAR的情况下提供了编辑。
实例5.所提供的技术提供对多种靶核酸的所需编辑。
在一些实施例中，在原代小鼠肝细胞中评估寡核苷酸和组合物。从NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(SERPINA1*E342K)#Slcw/SzJ小鼠模型(杰克逊实验室(TheJackson Laboratory)：028842)分离原代肝细胞。将靶向SerpinA1 mRNA的寡核苷酸使用Liptofectamine RNAimax转染方案(Thermo 11668030)转染，或在Gymnotic自由摄取条件下递送至分离的原代人肝细胞。48小时后，使用SV 96总RNA分离系统方案(普洛麦格公司：Z3505)收集总RNA。将位于内源性表达的靶RNA的编辑位点侧翼的引物用于使用Phusion高保真DNA聚合酶方案(赛默公司：F-530XL)的PCR。对PCR产物进行桑格测序，并使用EditR程序计算ADAR介导的编辑的百分比。所提供的技术提供了所需的编辑。
实例6.所提供的技术可以提供编辑活性。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸组合物，这些寡核苷酸组合物尤其可以递送多种活性，例如腺苷编辑活性。例如，包含所提供的糖修饰设计的寡核苷酸的组合物可以提供编辑活性。某些数据呈现在例如图1和若干其他图中。如所展示的，在一些实施例中，根据本披露，在某些位置(例如，第一结构域中的2'-F、第二结构域中的2'-OMe等)的一个或多个糖修饰任选地与其他修饰(例如，经修饰的核苷酸间键联，诸如硫代磷酸酯核苷酸间键联)一起可以改善编辑水平。
实例7.所提供的技术可以提供编辑活性。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸组合物，这些寡核苷酸组合物尤其可以递送多种活性，例如腺苷编辑活性。例如，包含所提供的核苷酸间键联修饰设计的寡核苷酸的组合物可以提供编辑活性。某些数据呈现在例如图2和若干其他图中。如图2所示，在一些实施例中，根据本披露，将一个或多个经修饰的核苷酸间键联(例如，硫代磷酸酯核苷酸间键联)并入可以改善编辑水平。
实例8.所提供的包括多种糖修饰的技术可以提供编辑活性。
尤其是，本披露展示，包含多种糖修饰的寡核苷酸及其组合物可以提供编辑活性，如例如各图中所示。图3中呈现了某些数据，其中评估了多种寡核苷酸组合物。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。测量cLuc活性并将其归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。如所展示的，在一些实施例中，在编辑位点处和/或附近利用某些糖，例如天然DNA糖、2'-F修饰的糖等提供编辑活性。在一些实施例中，寡核苷酸包含5'-N1N0N-1-3'，其中N1、N0和N-1中的每一个独立地是核苷，N1和N0与如本文所述的核苷酸间键联键合，并且N-1和N0与如本文所述的核苷酸间键联键合，并且N0与靶腺苷相反。在一些实施例中，N1、N0和N-1中的每一个的糖独立地是天然DNA糖。在一些实施例中，N1的糖是2'-修饰的糖，并且N0和N-1中的每一个的糖独立地是天然DNA糖。在一些实施例中，此类寡核苷酸提供高编辑水平。
实例9.所提供的包括多种糖类型的技术可以提供编辑活性。
尤其是，本披露展示，包含多种糖类型的寡核苷酸及其组合物可以提供编辑活性，如例如各图中所示。图4中呈现了某些数据，其中评估了多种寡核苷酸组合物。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。测量cLuc活性并将其归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
实例10.所提供的技术可以用短序列提供编辑活性。
在一些实施例中，本披露提供了与例如现有技术相比具有短序列的寡核苷酸及其组合物。此类寡核苷酸和组合物可以提供许多优点，例如对于制造、递送等而言。如在例如各图中所展示的，所提供的寡核苷酸和组合物可以在不使用长序列的情况下提供编辑活性。图5中呈现了某些数据，其中评估了多种寡核苷酸组合物。将293T细胞用ADAR1(a和b)或ADAR2(c和d)、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。测量cLuc活性并将其归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。如所展示的，例如当与ADAR1和/或ADAR2接触时，多种长度(例如，27、28、29、20、31、32或更长)的寡核苷酸可以提供编辑。
实例11.所提供的技术可以在没有外源性ADAR的情况下在多种细胞类型中提供编辑活性。
在一些实施例中，所提供的技术不需要外源性ADAR即可提供所需的结果，例如如各图中所示。图6中呈现了某些数据，该图描绘了在没有外源性ADAR的情况下在不同细胞类型中编辑内源性靶(肌动蛋白的3'UTR中的TAG位点)。用50nM寡核苷酸转染细胞，48小时后测定编辑。(对于RPE和NHBE细胞，N＝1，对于肝细胞，N＝2个生物重复样)
实例12.所提供的包括多种数目的错配的技术可以提供编辑活性。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸与靶核酸完全互补。在一些实施例中，存在一个或多个错配。尤其是，本披露展示，包含多种数目的错配的寡核苷酸及其组合物可以提供编辑活性，例如如各图中所示。图7中呈现了某些数据，其中评估了多种寡核苷酸组合物。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。在48和96h测量cLuc活性并将其归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
实例13.所提供的包括多种错配模式的技术可以提供编辑活性。
在一些实施例中，错配在其间具有不同的距离并且处于不同的位置(例如，相对于末端，与靶腺苷相反的核苷等)。尤其是，本披露展示，可以利用多种错配模式来提供编辑活性，例如如各图中所示。图8中呈现了某些数据，其中评估了多种寡核苷酸组合物。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
实例14.所提供的包括多种错配模式的技术可以提供编辑活性。
图9提供了另外的数据，该数据显示具有多种错配模式的寡核苷酸及其组合物可以提供编辑活性。对于图9，组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
实例15.手性控制的寡核苷酸组合物可以提供高活性。
尤其是，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，其可以提供优于相应的立体随机组合物的多种优点。在一些实施例中，如例如各图中所示，手性控制的寡核苷酸组合物可以提供编辑活性。不受任何特定理论的束缚，手性控制的核苷酸间键联可以提供改善的寡核苷酸稳定性和/或通过与ADAR的某些立体化学特异性相互作用促进ADAR蛋白的腺苷编辑。图10中呈现了某些数据，其中评估了多种寡核苷酸组合物。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。尤其是，展示了包含Sp核苷酸间键联(例如，Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联)的寡核苷酸的手性控制的寡核苷酸组合物可以提供更高水平的编辑(例如，与参考立体随机组合物和/或包含更少Sp和/或更多Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联的寡核苷酸的某些手性控制的寡核苷酸组合物相比)。在一些实施例中，Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联可用于根据本披露的寡核苷酸中间的位置，例如与第二子结构域的核苷键合等。
实例16.手性控制的寡核苷酸组合物可以提供高活性。
在一些实施例中，本披露提供了手性控制的寡核苷酸组合物，这些寡核苷酸组合物尤其可以递送高活性，例如腺苷编辑活性。在一些实施例中，如图11所示，与参考立体随机寡核苷酸组合物相比，手性控制的寡核苷酸组合物可以递送高达8至10倍的ADAR1介导的编辑活性。
实例17.手性控制的寡核苷酸组合物可以在没有外源性ADAR的情况下在多种细胞类型中提供显著更高的活性。
尤其是，本披露展示，手性控制的寡核苷酸组合物可以在没有外源性ADAR的情况下提供意想不到的高活性。图12中呈现了某些数据，其中评估了多种寡核苷酸组合物。将细胞用10μM剂量的寡核苷酸进行裸处理，或用50nM剂量的寡核苷酸进行转染。48小时后收获RNA，并通过桑格测序对编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。
实例18.所提供的技术可以在没有外源性ADAR的情况下用短序列提供编辑活性。
如本文所展示，所提供的技术可以使用多种长度的寡核苷酸及其组合物来递送编辑活性。图13中呈现了某些数据，该图描绘了原代人视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)中的编辑。组合物都靶向肌动蛋白的3'UTR中的UAG基序。用50nM寡核苷酸转染原代人RPE细胞。48小时后收获RNA，并通过桑格测序对编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。
实例19.手性控制的寡核苷酸组合物可以在没有外源性ADAR的情况下在多种细胞类型中提供高活性。
所提供的技术的某些优点(例如，高活性)展示于图14中，其中评估了多种寡核苷酸组合物。将原代人支气管上皮细胞用10μM寡核苷酸进行裸处理，而原代RPE细胞用50nm寡核苷酸转染。48小时后收获RNA，并通过桑格测序对编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。
实例20.所提供的包括多种核苷酸间键联模式的技术可以提供编辑活性。
尤其是，本披露提供了具有多种类型的核苷酸间键联(及其模式)的寡核苷酸。某些核苷酸间键联，例如中性核苷酸间键联，可以改善寡核苷酸的一种或多种特性和/或活性。尤其是，本披露展示，多种类型的核苷酸间键联可用于提供编辑活性，例如如各图中所示。图15中呈现了某些数据，其中评估了多种寡核苷酸组合物。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
实例21.所提供的包括多种核苷酸间键联模式的技术可以在没有外源性ADAR的情况下提供编辑活性。
尤其是，本披露展示，所提供的包括多种核苷酸间键联模式的技术可以在没有外源性ADAR的情况下提供编辑活性，例如如图16所示，其中评估了多种寡核苷酸组合物。将原代人肝细胞用3.3μM寡核苷酸进行裸处理。48小时后收获RNA，并通过桑格测序对编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。
实例22.所提供的包括多种修饰和手性控制的技术可以在没有外源性ADAR的情况下提供编辑活性。
如本文所述，所提供的技术可以利用多种所提供的特征，例如修饰和/或立体化学控制，以提供高活性的寡核苷酸和组合物。在一些实施例中，所提供的修饰，例如在与靶腺苷相反的核苷处的修饰，可以在没有外源性ADAR的情况下提供高腺苷编辑活性，例如如图17中所示，其中评估了多种寡核苷酸组合物。用50nM寡核苷酸转染原代人肝细胞。48小时后收获RNA，并通过桑格测序对编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。
实例23.所提供的包括另外的部分的技术可以在没有外源性ADAR的情况下提供编辑活性。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包含另外的化学部分，例如GalNAc及其衍生物。在一些实施例中，另外的部分的并入提供改善的特性和/或活性。图18中呈现了某些数据，其中评估了包含GalNAc部分的寡核苷酸的组成。将原代人肝细胞以不同的浓度进行裸处理。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。在原代人肝细胞的一组数据中，通过手性控制的寡核苷酸组合物WV-27458和WV-27460的编辑达到了ACTB的65％-75％，并且WV-27458和WV-27460的绝对EC50分别为309.0nM(95％CI：259.0-359.1nM)和166.2nM(95％CI：144.6-187.8nM)，而立体随机组合物WV-30298的编辑稳定在低于50％，从而证实手性控制的寡核苷酸组合物尤其可以提供改善的编辑。如本文所描述和展示的，当利用多种递送技术时，手性控制尤其可以提供增加的活性。例如，在一组使用裸递送的实验中(支气管上皮细胞，10μM寡核苷酸浓度)，没有观察到立体随机组合物WV-23928的ACTB编辑，而手性控制的寡核苷酸组合物WV-27387提供了约19％的ACTB编辑。
实例24.所提供的包括经修饰的核碱基的技术可在没有外源性ADAR的情况下提供编辑活性。
在一些实施例中，所提供的技术在某些位置包含经修饰的核碱基，并且此类经修饰的核碱基可以提供多种优点，例如高活性。在一些实施例中，如本文所展示，例如在图19中，如设计的那样包含经修饰的核碱基的寡核苷酸可以提供显著更高的活性(例如，次黄嘌呤与靶腺嘌呤相反的核碱基相邻)。图19描绘了对原代小鼠肝细胞中SERPINA1(PiZ等位基因)的编辑。组合物都靶向突变体人SERPINA1转录物(PiZZ等位基因)中的腺苷。用50nM寡核苷酸转染原代肝细胞(从表达突变体人转录物的小鼠模型中提取)。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。
实例25.所提供的包括经修饰的核碱基的技术可在没有外源性ADAR的情况下提供编辑活性。
在一些实施例中，所提供的技术在某些位置(例如，与靶腺苷相反)包含经修饰的核碱基，并且此类经修饰的核碱基可以提供多种优点，例如高活性。在一些实施例中，如本文所展示，例如在图20中，如设计的那样包含经修饰的核碱基(在图20中，假异胞嘧啶)的寡核苷酸可以提供显著更高的活性。图20描绘了对原代小鼠肝细胞中SERPINA1(PiZ等位基因)的编辑。组合物都靶向突变体人SERPINA1转录物(PiZZ等位基因)中的腺苷。用50nM寡核苷酸转染处理原代肝细胞(从表达突变体人转录物的小鼠模型中提取)。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。如图所示，所提供的包括经修饰的核碱基的设计可以大大改善活性。
实例26.所提供的包括多种核碱基的技术可以提供编辑活性。
尤其是，本披露展示，包含多种核碱基(包括经修饰的核碱基)的寡核苷酸可以提供编辑。图21中呈现了某些数据。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物以不同的寡核苷酸浓度转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。
实例27.所提供的包括多种核碱基的技术可以提供编辑活性。
尤其是，本披露展示，包含多种核碱基(包括经修饰的核碱基)的寡核苷酸可以提供增强的编辑。在一些实施例中，包含经修饰的核碱基的核苷直接在靶腺苷对面(在一些实施例中，此类核苷被称为“与靶腺苷相反的核苷”或“相反核苷”)。图21中呈现了某些数据，其中评估了包含8-氧代腺苷的寡核苷酸的组合物。将293T细胞用ADAR1或ADAR2、荧光素酶报告构建体和指示的组合物以不同的寡核苷酸浓度转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。如本文所展示，8-氧代腺苷可以提供更高的编辑效率。不希望受任何理论的限制，8-氧代腺苷可以与Adar酶形成比例如胞嘧啶更多和/或更强的氢键，因为该酶在其嘌呤环的7'位具有N-H键。
实例28.1-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-3,4-二氢嘧啶-2(1H)-酮的合成。
Figure BDA0003580200980005191
步骤1.将嘧啶-2-醇盐酸盐(40g，301.78mmol，1eq.)在HMDS(800mL)中的混合物脱气并用N2吹扫3次，然后将混合物在130℃在N2气氛下搅拌2h。反应混合物变澄清。向反应混合物中添加甲苯(500mL*2)，然后减压浓缩以除去溶剂。粗产物2-((三甲基甲硅烷基)氧基)嘧啶(50g，粗品，呈黄色油状物)不经进一步纯化即用于下一步骤。
步骤2.向(2S,3R,4R,5R)-2-乙酰氧基-5-((苯甲酰氧基)甲基)四氢呋喃-3,4-二基二苯甲酸酯(60g，118.93mmol，1eq.)在DCE(1200mL)中的溶液中添加溶解于DCE(600mL)中的化合物2-((三甲基甲硅烷基)氧基)嘧啶(26.82g，159.37mmol，1.34eq.)和SnCl4(43.69g，167.70mmol，19.59mL，1.41eq.)，并添加分子筛4A(10g)。将混合物在15℃搅拌12h。将反应混合物减压浓缩以去除溶剂。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/1至0:1)纯化。得到呈黄色固体的(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲酰氧基)甲基)-5-(2-氧代嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3,4-二基二苯甲酸酯(128g，99.56％产率)。TLC：(石油醚:乙酸乙酯＝0:1)：Rf＝0.32。MS：445.2(M-95)+。
步骤3.向(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲酰氧基)甲基)-5-(2-氧代嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3,4-二基二苯甲酸酯(40g，74.00mmol，1eq.)在THF(2000mL)中的溶液中添加溶解于MeOH(100mL)的NaBH4(3.08g，81.40mmol，1.1eq.)。将混合物在0℃搅拌1h。将反应混合物减压浓缩以去除溶剂。向残余物中添加H2O(1500mL)，然后用EtOAc(2000mL)稀释并用EtOAc(2000mL*3)萃取。经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩得到残余物。通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝2:3)纯化残余物，得到呈黄色固体的(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲酰氧基)甲基)-5-(2-氧代-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3,4-二基二苯甲酸酯(13g，23.96mmol，10.79％产率)，并且得到呈黄色固体的(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲酰氧基)甲基)-5-(2-氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3,4-二基二苯甲酸酯(19g，35.02mmol，15.77％产率)。MS：543.0(M+H)+。
步骤4.向(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲酰氧基)甲基)-5-(2-氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3,4-二基二苯甲酸酯(4g，7.37mmol，1eq.)在MeOH(40mL)和DCM(20mL)中的溶液中添加NH3.H2O(25.84g，184.32mmol，28.40mL，25％纯度，25eq)。减压浓缩反应混合物以除去溶剂，然后通过在旋转蒸发器上与甲苯(30mL*2)共沸蒸馏来干燥粗品。将粗品通过反相HPLC(0.1％NH3·H2O条件)纯化，得到呈黄色固体的1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3,4-二氢嘧啶-2(1H)-酮(1.7g，7.38mmol，100％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝7.97-7.76(m,1H),7.51-7.28(m,2H),6.78(br s,1H),6.32(brd,J＝8.1Hz,1H),5.63(br d,J＝5.6Hz,1H),4.95-4.80(m,1H),3.90-3.82(m,2H),3.77(brd,J＝12.7Hz,1H),3.65(br d,J＝2.7Hz,1H),3.54-3.36(m,2H)；MS：230.8(M+H)+。
步骤5.向1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3,4-二氢嘧啶-2(1H)-酮(1g，4.34mmol，1eq.)在吡啶(20mL)中的溶液中添加DMTr-Cl(1.62g，4.77mmol，1.1eq.)。将混合物在15℃搅拌2h。将反应混合物减压浓缩以去除溶剂。将残余物通过制备型HPLC(柱：Agela DuraShell C18 150*25mm*5μm；流动相：[水(0.04％NH3H2O)-ACN]；B％：35％-55％，22min)纯化。得到呈黄色固体的1-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)-3,4-二氢嘧啶-2(1H)-酮(0.3g，563.29μmol，12.98％产率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.42(d,J＝7.7Hz,2H),7.36-7.28(m,5H),7.22(d,J＝7.3Hz,1H),6.83(d,J＝8.8Hz,4H),6.44(d,J＝8.2Hz,1H),5.84-5.70(m,1H),5.03(br s,1H),4.84-4.69(m,1H),4.21(d,J＝3.3Hz,2H),4.10(br s,1H),3.98(br s,2H),3.80(s,6H),3.50(s,1H),3.38(br d,J＝3.1Hz,1H),3.26(dd,J＝3.6,10.5Hz,2H)
步骤5.向1-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)-3,4-二氢嘧啶-2(1H)-酮(0.7g，1.31mmol，1eq.)在THF(32mL)中的溶液中添加AgNO3(267.93mg，1.58mmol，1.2eq.)和吡啶(519.82mg，6.57mmol，530.43μL，5eq.)，然后添加TBSCl(217.91mg，1.45mmol，177.16μL，1.1eq.)。向反应混合物中添加饱和NaHCO3(水溶液，5mL)并用EtOAc(10mL*3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩得到残余物。将残余物通过制备型TLC(SiO2，石油醚:乙酸乙酯＝1:1)纯化。得到呈白色固体的1-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-3,4-二氢嘧啶-2(1H)-酮(WV-NU-072)(0.39g，602.93μmol，45.87％产率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.42(d,J＝7.5Hz,2H),7.36-7.27(m,6H),7.25-7.19(m,1H),6.84(d,J＝8.6Hz,4H),6.46(br d,J＝8.1Hz,1H),5.92(d,J＝6.0Hz,1H),4.83(br s,1H),4.79-4.70(m,1H),4.32(t,J＝5.8Hz,1H),4.13(brd,J＝7.0Hz,1H),4.06-4.00(m,1H),3.99-3.90(m,2H),3.80(s,6H),3.44(dd,J＝2.5,10.5Hz,1H),3.26(dd,J＝3.1,10.4Hz,1H),1.00-0.89(m,9H),0.18(d,J＝2.6Hz,6H)。
实例29.-苄基-1-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺的合成。
Figure BDA0003580200980005221
步骤1.向化合物1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-5-碘嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(90g，243.18mmol，1eq.)和DMAP(2.97g，24.32mmol，0.1eq.)在吡啶(900mL)中的溶液中添加DMTrCl(90.64g，267.50mmol，1.1eq.)。将混合物在15℃搅拌3h。TLC显示反应完成。将反应混合物用EtOAc(2000mL)稀释并用饱和NaHCO3(水溶液，1000mL)洗涤。将水相用EtOAc(1000mL*2)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩得到残余物。将残余物通过MPLC(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝9/1至0:1，然后乙酸乙酯:MeOH＝50:1，1％TEA)纯化。得到呈棕色固体的1-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)-5-碘嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(132g，196.29mmol，80.72％产率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝8.03(s,1H),7.34(br d,J＝7.6Hz,2H),7.26-7.18(m,6H),7.15-7.08(m,1H),6.76(d,J＝8.7Hz,4H),6.07(br s,2H),5.85(br d,J＝4.3Hz,1H),4.40(br t,J＝4.5Hz,1H),4.32(br d,J＝3.9Hz,1H),4.16(brs,1H),3.67(s,6H),3.40-3.24(m,2H)。
步骤2.将1-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)-5-碘嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(63g，93.69mmol，1eq.)、苯甲胺盐酸盐(47.09g，327.90mmol，3.5eq.)、Pd(PPh3)4(21.65g，18.74mmol，0.2eq.)、TEA(189.60g，1.87mol，260.80mL，20eq.)在用CO饱和的THF(630mL)中在150Psi和70℃下在高压釜中搅拌48h。LC-MS显示起始材料消失。将反应混合物过滤并减压浓缩得到残余物。将残余物通过MPLC(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝9/1至0:1，1％TEA)纯化。得到呈黄色固体的N-苄基-1-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(25g，36.78mmol，39.26％产率)。MS：671.0(M-H)-。
步骤3.向N-苄基-1-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(25g，36.78mmol，1eq.)在THF(500mL)中的溶液中添加硝酸银(7.50g，44.14mmol，1.2eq.)、吡啶(14.55g，183.90mmol，14.84mL，5eq.)和TBSCl(7.21g，47.81mmol，5.86mL，1.3eq.)。将混合物在暗处在15℃下搅拌48h。TLC显示起始材料已消耗。向反应混合物中添加饱和NaHCO3(水溶液，50mL)并用EtOAc(500mL*3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩得到残余物。将残余物通过MPLC(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝9/1至0/1)纯化2次。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝9/1至0/1)纯化6次。得到呈黄色固体的N-苄基-1-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(WV-NU-074)(4.4g)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝8.75(t,J＝5.8Hz,1H),8.52(s,1H),7.63-7.57(m,9H),7.51-7.44(m,5H),7.43-7.35(m,12H),7.33-7.08(m,30H),6.76(dd,J＝1.1,8.9Hz,5H),5.77(d,J＝4.4Hz,1H),4.56-4.44(m,2H),4.37(d,J＝5.8Hz,3H),4.31-4.26(m,1H),4.01-3.90(m,2H),3.69(s,7H),3.45-3.30(m,2H),0.85-0.80(m,9H),0.00(d,J＝3.3Hz,6H)；MS：792.3(M-H+)。
实例30.1-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-N-甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺的合成。
Figure BDA0003580200980005231
步骤1.将1-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)-5-碘嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(63g，93.69mmol，1eq.)、甲胺盐酸盐(63.26g，936.85mmol，10eq.)、Pd(PPh3)4(21.65g，18.74mmol，0.2eq.)、TEA(189.60g，1.87mol，260.80mL，20eq.)在用CO饱和的THF(500mL)中在150Psi和70℃下在高压釜中搅拌48h。LC-MS显示起始材料已消耗，检测到一个具有所需MS的主峰。将反应混合物过滤并减压浓缩得到残余物。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝0:1，5％TEA，运行3次，Rf＝0.30)。将残余物通过MPLC(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝9/1至0:1，1％TEA)纯化3次。得到呈黄色固体的1-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)-N-甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(13.6g，22.53mmol，24.05％产率)。MS：602.1(M-H)-。
步骤2.向1-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)-5-碘嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(13.6g，22.53mmol，1eq.)在THF(260mL)中的溶液中添加硝酸银(4.59g，27.04mmol，1.2eq.)、吡啶(8.91g，112.65mmol，9.09mL，5eq.)和TBSCl(4.41g，29.29mmol，3.59mL，1.3eq.)。将混合物在15℃搅拌48h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:1，Rf＝0.52和0.65)显示起始材料已消耗，检测到一个期望的斑点。向反应混合物中添加饱和NaHCO3(水溶液，100mL)并用EtOAc(300mL*3)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩得到残余物。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:4，5％TEA，Rf＝0.10和0.20)。将残余物通过MPLC(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝9/1至0/1，1％TEA)纯化。得到呈白色固体的1-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-N-甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(WV-NU-075)(10.5g)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝8.52(d,J＝15.8Hz,2H),8.43-8.26(m,2H),7.61(dd,J＝7.9,11.9Hz,1H),7.50-7.34(m,5H),7.33-7.08(m,15H),6.76(br d,J＝8.3Hz,8H),5.75(dd,J＝4.4,15.6Hz,1H),4.32-4.11(m,2H),4.01-3.90(m,2H),3.77-3.63(m,12H),3.43-3.16(m,4H),2.97-2.76(m,6H),0.87-0.81(m,9H),0.79-0.73(m,9H),0.10--0.02(m,6H),-0.04--0.10(m,3H),-0.12--0.19(m,3H)；MS：716.3(M-H)+。
实例31.1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)四氢嘧啶-2(1H)-酮的合成。
Figure BDA0003580200980005251
步骤1.将4-甲基苯甲酰氯(93.91g，607.46mmol，80.27mL，2eq.)与1-O-甲基-2-脱氧-D-核糖(45g，303.73mmol，36.89mL，1eq.)溶解在丙酮(500mL)中，然后缓慢添加Et3N(67.62g，668.21mmol，93.01mL，2.2eq.)，确保温度低于20℃，并将混合物在15℃下搅拌16h。LCMS和TLC(石油醚/乙酸乙酯＝3:1)显示1-O-甲基-2-脱氧-D-核糖已消耗，发现了所需的物质。过滤混合物，蒸发滤液，得到粗品。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝30/1至10/1)纯化三次以得到呈黄色固体的(2R,3S)-4-甲基苯甲酸-5-甲氧基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(70g，182.09mmol，59.95％产率)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝8.05-7.92(m,4H),7.31-7.25(m,4H),5.68-5.42(m,1H),5.31-5.21(m,1H),4.71-4.48(m,3H),3.47(s,2H),3.41(s,2H),2.66-2.53(m,1H),2.47-2.37(m,7H)；MS：407.2(M+Na)+。
步骤2.在0℃下将HCl(气体)鼓泡到化合物(2R,3S)-4-甲基苯甲酸-5-甲氧基-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(33g，85.84mmol，1eq.)在无水Et2O(600mL)中的溶液中持续1h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝3:1，Rf＝0.21)显示起始材料已消耗。将固体过滤并用无水乙醚(2*150mL)洗涤，并将滤饼在高真空下干燥得到呈白色固体的(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸-5-氯-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(26g，66.87mmol，77.89％产率)，无需任何进一步纯化。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝8.02(d,J＝8.1Hz,2H),7.92(d,J＝8.1Hz,2H),7.36-7.20(m,4H),6.50(d,J＝5.0Hz,1H),5.58(dd,J＝2.4,7.1Hz,1H),4.88(q,J＝3.3Hz,1H),4.75-4.55(m,2H),2.89(ddd,J＝5.3,7.4,15.0Hz,1H),2.77(d,J＝15.0Hz,1H),2.44(d,J＝4.8Hz,5H)；TLC(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)，Rf＝0.21。
步骤3.在-30℃下向(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸-5-氯-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(26g，66.87mmol，1eq.)、分子筛4A(10g，66.87mmol，1eq.)和化合物2-((三甲基甲硅烷基)氧基)嘧啶(38.08g，226.31mmol，4eq.)在DCE(900mL)中的溶液中添加溶解于DCE(100mL)中的SnCl4(24.56g，94.28mmol，11.01mL，1.41eq.)。将混合物在-30℃搅拌5h。TLC显示起始材料已消耗。浓缩混合物以得到粗品。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝10/1至0/1)纯化，得到50g粗品，并通过RP-HPLC再纯化，得到呈白色固体的((2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸-3-((4-甲基苯甲酰基)氧基)-5-(2-氧代嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-2-基)甲酯(19g，42.37mmol，63.36％产率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝8.57(dd,J＝2.9,4.0Hz,1H),8.17(dd,J＝2.8,6.8Hz,1H),7.97(d,J＝8.3Hz,2H),7.83(d,J＝8.3Hz,2H),7.34-7.20(m,5H),6.40-6.23(m,2H),5.62(br d,J＝6.4Hz,1H),4.86-4.75(m,1H),4.74-4.64(m,2H),3.22(ddd,J＝1.8,5.6,14.6Hz,1H),2.44(d,J＝10.6Hz,7H),2.35-2.23(m,1H)；TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)，Rf＝0.05。
步骤4.向((2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸-3-((4-甲基苯甲酰基)氧基)-5-(2-氧代嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-2-基)甲酯(20g，44.60mmol，1eq.)在MeOH(400mL)中的溶液中添加Pd/C(5g，10％纯度)。将悬浮液在真空下脱气并用H2吹扫数次。将混合物在H2(20psi)下在45℃搅拌12小时。LCMS显示起始材料已消耗。将反应混合物过滤，并将滤液浓缩，得到呈黄色油状物的((2R,3S,5R)-3-(苯甲酰氧基)-5-(2-氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-2-基)苯甲酸甲酯(20g，粗品)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.97-7.89(m,4H),7.27-7.22(m,4H),6.68-6.53(m,1H),5.56-5.41(m,1H),5.04(br s,1H),4.71-4.28(m,4H),3.46-3.07(m,5H),2.47-2.39(m,7H),2.38-1.80(m,5H)；MS：(M+H+)453.2
步骤5.将((2R,3S,5R)-3-(苯甲酰氧基)-5-(2-氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-2-基)苯甲酸甲酯(20g，44.20mmol，1eq.)在NaOMe(9.55g，176.80mmol，4eq.)中的溶液溶解于MEOH(900mL)中，将混合物在15℃下搅拌3.5h。将混合物浓缩，得到呈黄色油状物的1-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)四氢嘧啶-2(1H)-酮(9.5g，粗品)。MS：217.1(M+H)+。
步骤6.向化合物7(9.5g，43.93mmol，1eq.)在吡啶(80mL)中的溶液中添加DMTCl(16.37g，48.33mmol，1.1eq.)，将混合物在15℃下搅拌4h。LCMS显示化合物7已消耗，发现了所需的物质。向混合物中添加饱和NaHCO3(水溶液，300mL)并用乙酸乙酯(200mL*2)萃取，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到粗品。将混合物通过硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝20:1，0:1，5％TEA)纯化3次，得到8g。将2g粗混合物通过制备型HPLC柱(Agela DuraShell C18250*50mm*10μm；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：25％-50％，25min)再纯化，得到呈白色固体的1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)四氢嘧啶-2(1H)-酮(WV-NU-092)(4.1g，42％产率)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.45-7.40(m,2H),7.34-7.28(m,5H),7.24-7.19(m,1H),6.83(d,J＝8.8Hz,4H),6.46(t,J＝7.1Hz,1H),5.31(s,1H),4.80(br s,1H),4.37-4.29(m,1H),3.85-3.78(m,7H),3.45-3.23(m,5H),3.16-3.05(m,1H),2.27(d,J＝4.3Hz,1H),2.21-2.10(m,1H),2.04-1.96(m,2H),1.90-1.82(m,2H)；MS：517.3(M-H)-。
实例32.1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-2,4-二氧代-N-苯基-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺的合成。
Figure BDA0003580200980005271
向1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-5-碘嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(30g，45.70mmol，1eq.)在THF(300mL)中的溶液中添加Pd(PPh3)4(10.56g，9.14mmol，0.2eq.)、PhNH2(42.56g，456.99mmol，41.72mL，10eq.)和TEA(92.49g，913.99mmol，127.22mL，20eq.)。将混合物在高压釜中在70℃下在CO(50Psi)中搅拌120h。将反应混合物减压浓缩以去除溶剂。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/0至0/1，然后乙酸乙酯/甲醇＝10/1，5％TEA)纯化。(TLC：乙酸乙酯:石油醚＝2:1，Rf＝0.20)。得到呈黄色固体的化合物WV-NU-108(11.5g，17.70mmol，38.73％产率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝10.46(s,1H),8.66(s,1H),7.59(d,J＝7.8Hz,2H),7.34(d,J＝7.4Hz,2H),7.29(s,1H),7.26-7.18(m,7H),7.16-7.09(m,1H),7.08-7.01(m,1H),6.82-6.71(m,4H),6.13(t,J＝6.4Hz,1H),4.37-4.28(m,1H),3.97(d,J＝4.6Hz,1H),3.68(d,J＝3.1Hz,6H),3.48-3.40(m,1H),3.38-3.30(m,1H),2.48(ddd,J＝4.1,6.3,13.9Hz,1H),2.23(td,J＝6.6,13.8Hz,1H)；13C NMR(101MHz,氯仿-d)δ＝162.94,159.27,158.59,158.57,149.34,146.62,144.53,137.97,135.64,135.50,130.11,130.05,128.95,128.07,127.96,126.97,124.34,120.35,113.31,113.28,106.32,86.99,86.71,86.21,77.36,77.05,76.73,72.41,63.60,60.46,55.18,40.74,21.08,14.22；MS：648.2(M-H+)648.2。
实例33.1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-N-甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺的合成。
Figure BDA0003580200980005281
向1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-5-碘嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(30g，45.70mmol，1eq.)在THF(300mL)中的溶液中添加Pd(PPh3)4(10.56g，9.14mmol，0.2eq.)、甲胺(30.86g，456.99mmol，2.78mL，10eq.，HCl)和TEA(92.49g，913.99mmol，127.22mL，20eq.)。将混合物在高压釜中在70℃下在CO(50Psi)中搅拌72h。LCMS显示化合物1已消耗并且主峰是期望的。TLC：(乙酸乙酯:石油醚＝2:1，Rf＝0.23)。将反应混合物减压浓缩以去除溶剂。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/0至0/1，5％TEA，然后乙酸乙酯:甲醇＝10/1，5％TEA)纯化。得到呈黄色固体的化合物WV-NU-113(15g，25.53mmol，55.86％产率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝8.59(s,1H),8.50-8.39(m,1H),7.40(d,J＝7.4Hz,2H),7.34-7.27(m,5H),7.26(s,1H),7.23-7.16(m,1H),6.84(d,J＝8.9Hz,4H),6.16(s,1H),4.35(br d,J＝6.6Hz,1H),3.97(s,1H),3.79(s,6H),3.47(br d,J＝4.6Hz,1H),3.42-3.33(m,1H),2.93(d,J＝4.9Hz,3H),2.54-2.41(m,1H),2.25(s,1H)；MS：610.2(M+Na)+。
实例34.3-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(WV-NU-096)的合成。
Figure BDA0003580200980005291
步骤1.将2,4-二甲氧基嘧啶(25g，178.39mmol，1eq.)、乙酰氯(38.50g，490.46mmol，35.00mL，2.75eq.)的混合物脱气并用N2吹扫3次，然后将混合物在25℃在N2气氛下搅拌24h。TLC显示2,4-二甲氧基嘧啶被完全消耗，然后向混合物中添加甲苯(200mL)，然后真空浓缩，重复3次。然后将残余物溶解于MeOH(2000mL)中，然后向混合物中添加甲醇钠(10.60g，196.23mmol，1.1eq.)。将混合物在50℃搅拌1h。TLC显示形成一个新的斑点。将混合物真空浓缩，并将残余物溶解于二噁烷(1000mL)中，然后真空浓缩。得到呈白色固体的4-甲氧基嘧啶-2(1H)-酮(89g，粗品)。
步骤2.向4-甲氧基嘧啶-2(1H)-酮(20g，158.59mmol，1eq.)在二噁烷(500mL)和丙烯腈(84.15g，1.59mol，105.19mL，10eq.)中的溶液中添加NaOMe溶液(1M，158.59mL，1eq.)。将混合物在25℃搅拌12h。LC-MS显示4-甲氧基嘧啶-2(1H)-酮被完全消耗，检测到一个具有所需质量的主峰。将反应物过滤，并将滤饼用H2O(300mL)淬灭，然后过滤，将滤液用DCM/二噁烷＝50/1(100mL*3)萃取，然后将有机相通过Na2SO4干燥，然后真空浓缩。得到呈黄色油状物的3-(4-甲氧基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)丙腈(12g，粗品)。MS：180.3(M+H+)。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝0:1)Rf1＝0.43
步骤3.向(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸-5-氯-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(14g，36.00mmol，1eq.)和3-(4-甲氧基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)丙腈(6.45g，36.00mmol，1eq.)在DCE(200mL)中的溶液中添加4A MS(20g)。将混合物在25℃搅拌48h。TLC指示起始材料被完全消耗，形成了新的斑点。将反应物过滤，并将滤液真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝10/1至5/1，1/1，0/1)纯化。得到呈白色固体的(2R,3S)-4-甲基苯甲酸-5-(3-(2-氰乙基)-2,6-二氧代-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(1g，粗品)。MS：540.3(M+Na+)；TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)Rf＝0.08。
步骤4.向(2R,3S)-4-甲基苯甲酸-5-(3-(2-氰乙基)-2,6-二氧代-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(1.5g，3.06mmol，1eq.)在MeOH(15mL)中的溶液中添加NaOMe(579.45mg，10.73mmol，3.5eq.)。将混合物在25℃搅拌12h。LC-MS显示起始材料被完全消耗，检测到一个具有所需质量的主峰。向溶液中添加NH4Cl(570mg)，然后真空浓缩混合物。将残余物溶解于吡啶(50mL)中，并在高真空中浓缩，重复3次。得到呈黄色油状物的3-((4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(699mg，粗品)。MS：251.2(M+Na)+。
步骤5.向3-((4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(699mg，3.06mmol，1eq.)在吡啶(30mL)中的溶液中添加DMTrCl(1.25g，3.68mmol，1.2eq.)。将混合物在25℃搅拌12h。LC-MS显示起始材料被完全消耗，检测到两个具有所需质量的峰。将混合物真空浓缩。将残余物用饱和NaHCO3水溶液(50mL)淬灭，然后用EtOAc(20mL*3)萃取。将合并的有机相用盐水(50mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过制备型HPLC(中性条件)纯化。柱：Agela DuraShell C18 250*50mm*10μm；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：42％-62％，22min。得到呈黄色固体的3-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(WV-NU-096)(500mg，892.35μmol，29.13％产率，94.69％纯度)。得到呈白色固体的3-((2S,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(WV-NU-096A)(360mg，569.62μmol，18.60％产率，83.951％纯度)。
WV-NU-096:1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝9.84(br s,1H),7.44(br d,J＝7.8Hz,2H),7.33(d,J＝8.8Hz,4H),7.26-7.22(m,2H),7.22-7.15(m,1H),6.80(dd,J＝1.8,8.6Hz,4H),6.72-6.58(m,2H),5.54(d,J＝7.6Hz,1H),4.64(q,J＝6.1Hz,1H),3.96-3.86(m,1H),3.84-3.67(m,6H),3.52-3.41(m,1H),3.35(dd,J＝5.9,9.3Hz,1H),2.90-2.74(m,1H),2.24-2.10(m,1H)；13C NMR(101MHz,氯仿-d)δ＝162.84,158.45,152.27,144.82,138.95,136.00,135.99,129.14,128.79,128.16,127.82,130.07,126.82,113.12,102.22,86.38,84.94,81.13,73.40,64.67,55.21,55.19,37.19；MS：529.2(M-H+)；TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)Rf＝0.14。
WV-NU-096A：1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝8.72(br s,1H),7.44(d,J＝7.6Hz,2H),7.37-7.27(m,7H),7.24-7.16(m,2H),7.12(br d,J＝7.9Hz,1H),5.76(d,J＝7.5Hz,1H),5.14(br d,J＝11.5Hz,1H),4.40(br s,1H),4.37-4.29(m,1H),3.80(s,6H),3.25(dd,J＝3.9,9.9Hz,1H),3.11(dd,J＝3.9,10.0Hz,1H),2.93(td,J＝8.9,14.8Hz,1H),2.26(br dd,J＝2.9,14.8Hz,1H)；13C NMR(101MHz,氯仿-d)δ＝163.22,158.62,158.45,151.82,144.72,138.62,135.96,135.81,130.03,130.01,129.11,128.10,127.86,127.74,127.06,126.77,113.16,102.86,88.75,86.36,83.63,74.29,64.76,55.19,39.69；LCMS：M-H+＝529.2，纯度：83.95％；TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)Rf＝0.23。
实例35.(2R,3S,5R)-5-(3-苯甲酰基-2-氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺的合成。
Figure BDA0003580200980005321
步骤1：将1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)四氢嘧啶-2(1H)-酮(1.17g，2.26mmol)在吡啶(10.2mL)中的溶液用氯三甲基硅烷(1.43mL，11.31mmol)处理。在室温下搅拌1.5h。TLC和LC-MS显示形成了预期的中间体。冷却至0℃。向反应溶液中滴加苯甲酰氯(288.73μL，2.49mmol)。首先在0℃继续搅拌15min，然后在室温下搅拌过夜。LC-MS显示观察到预期的中间体。添加冰水(3.9mL)。继续搅拌2h。LC-MS显示反应完成。将反应溶液用盐水(20mL)稀释，然后用EtOAc(3×60mL)萃取。将合并的有机物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将所得的粗产物通过正相柱色谱法使用25％-100％EtOAc/己烷(各流动相含有5％的三乙胺)梯度纯化，得到呈白色泡沫状的所需产物1-苯甲酰基-3-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)四氢嘧啶-2(1H)-酮(底向上)和不需要的非对映体(底向下)的3:2比率混合物(1.04g，73.7％产率)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.50-7.15(m,14H),6.93-6.83(m,4H),6.03(q,J＝6.8,5.9Hz,1H),5.23(d,J＝3.9Hz,0.41H,来自不想要的非对映体的OH质子),5.15(d,J＝4.6Hz,0.66H,来自所需产物的OH质子),4.15-4.07(m,1H),3.79-3.59(m,8H),3.57-3.48(m,1H),3.44-3.37(m,1H),3.31-3.26(m,1H),3.14-3.06(m,1H),3.01-2.87(m,1H),2.12-2.06(m,1H),2.05-1.99(m,1H),1.95-1.86(m,1H),1.86-1.79(m,1H)；MS(ESI),645.67[M+Na]+。
步骤2：向1-苯甲酰基-3-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)四氢嘧啶-2(1H)-酮(底向上)和不需要的非对映体(底向下)的3:2比率干燥混合物(1.3g，2.09mmol)在THF(11mL)中的溶液中添加三乙胺(1.05mL，7.52mmol)。冷却至0℃。在4min的时间内向反应溶液中滴加2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(0.56mL，2.51mmol)。将反应溶液首先在0℃下继续搅拌1h，然后在室温下搅拌2h。LC-MS显示形成了产物。添加三乙胺(1mL)，然后添加MgSO4(0.3g)和EtOAc(20mL)。搅拌2min。将混合物通过烧结漏斗过滤。用EtOAc(20mL)冲洗漏斗中的固体。浓缩滤液。将所得的粗亚磷酰胺通过正相柱色谱法使用20％-60％EtOAc/己烷(各流动相含有2.5％的三乙胺)纯化，得到呈白色泡沫状的所需(2R,3S,5R)-5-(3-苯甲酰基-2-氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺和不需要的非对映体(底向下)的3:2比率混合物(0.90g，52.4％产率)。31P NMR(162MHz,氯仿-d)δ148.86(s，来自两种不需要的立体异构体中的一种，底向下),148.72(s，来自两种不需要的立体异构体中的另一种，底向下),148.48(s，来自两种所需的立体异构体中的一种，底向上),148.38(s，来自两种所需的立体异构体中的另一种，底向上)；MS(ESI),823.47[M+H]+。
实例36.(2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-5-(苯基氨基甲酰基)-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺的合成。
Figure BDA0003580200980005331
向干燥的1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-2,4-二氧代-N-苯基-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(2.0g，3.08mmol)在THF(17.4mL)中的溶液中添加三乙胺(1.72mL，12.31mmol)。冷却至0℃。在5min的时间内向溶液中滴加2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(0.89mL，4.0mmol)。将反应溶液首先在0℃下继续搅拌30min，然后在室温下搅拌3.5h。TLC显示反应完成。添加三乙胺(1.72mL)，然后添加无水MgSO4(0.55g)和EtOAc(25mL)。搅拌2min。过滤混合物。用EtOAc(25mL)冲洗烧结漏斗中的固体。浓缩滤液。将所得的粗产物通过正相柱色谱法使用20％-100％EtOAc/己烷(各流动相含有5％的三乙胺)梯度纯化，得到呈白色泡沫状的(2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-5-(苯基氨基甲酰基)-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(2.61g，99.8％产率)。1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ10.64(bs,1H),8.78-8.72(m,1H),7.65(d,J＝8.0Hz,2H),7.41(t,J＝6.5Hz,2H),7.33(q,J＝8.0Hz,6H),7.29-7.24(m,3H),7.18(q,J＝7.4Hz,1H),7.10(t,J＝7.4Hz,1H),6.83(q,J＝7.3,6.7Hz,4H),6.20(q,J＝7.3Hz,1H),4.50-4.42(m,1H),4.26-4.19(m,1H),3.88-3.77(m,1H),3.70-3.61(m,1H),3.61-3.50(m,2H),3.42-3.32(m,2H),2.78-2.65(m,1H),2.45(t,J＝6.7Hz,1H),2.32-2.24(m,2H),1.27(t,J＝7.7Hz,3H),1.20-1.13(m,9H)；31PNMR(243MHz,氯仿-d)δ149.19,148.80；MS(ESI),848.68[M-H]-。
实例37.9-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((1S,3S,3aS)-3-((甲基二苯基甲硅烷基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-1-基)氧基)四氢呋喃-2-基)-1,9-二氢-6H-嘌呤-6-酮的合成。
Figure BDA0003580200980005341
将干燥的9-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢-呋喃-2-基)-1,9-二氢-6H-嘌呤-6-酮(7.5g，13.52mmol)不良地溶解于THF(500mL)中。添加三乙胺(9.42mL，67.62mmol)。将反应烧瓶置于水浴中。在8min的时间内添加(3S,3aS)-1-氯-3-((甲基二苯基甲硅烷基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷(0.9574M的THF溶液，19.78mL，18.93mmol)。移去水浴，将反应浆料在室温下搅拌5h。TLC和LC-MS显示反应不完全，因为底物的溶解性差。添加三乙胺(9.4mL)，然后添加MgSO4(6.0g)和EtOAc(150mL)。将混合物通过填充有硅藻土薄层的烧结漏斗过滤。用EtOAc(100mL)冲洗漏斗中的固体。浓缩滤液。将所得的粗产物通过正相柱色谱法使用0-100％ACN/EtOAc(各流动相含有5％的三乙胺)梯度纯化，得到呈白色泡沫状固体的9-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((1S,3S,3aS)-3-((甲基二苯基甲硅烷基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-1-基)氧基)四氢呋喃-2-基)-1,9-二氢-6H-嘌呤-6-酮(2.4g，19.9％产率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.96(s,1H),7.90(s,1H),7.52-7.17(m,19H),6.84-6.74(m,4H),6.31-6.24(m,1H),4.89-4.81(m,1H),4.77(dt,J＝10.1,5.6Hz,1H),4.07-4.01(m,1H),3.76(s,6H),3.54(ddd,J＝18.2,14.9,7.8Hz,1H),3.36(dq,J＝12.9,5.9Hz,1H),3.26(d,J＝4.4Hz,2H),3.09(qd,J＝10.8,4.1Hz,1H),2.48(dt,J＝13.7,6.7Hz,1H),2.37-2.27(m,1H),1.90-1.83(m,1H),1.75-1.65(m,1H),1.56(dd,J＝14.7,9.0Hz,1H),1.43(dd,J＝14.2,6.0Hz,2H),1.31-1.21(m,1H),0.63(s,3H)；31P NMR(162MHz,氯仿-d)δ151.40；MS(ESI),894.91[M+H]+。
实例38.(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-5-氧代戊基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基二乙酸酯的合成。
Figure BDA0003580200980005351
向5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酸(36.0g，80.46mmol)在DCM(450mL)中的溶液中添加N-羟基琥珀酰亚胺(13.89g，120.69mmol)，然后添加三乙胺(33.6mL，241mmol)。将溶液冷却至0℃。分批添加EDC·HCl(30.8g，160.9mmol)。首先在0℃继续搅拌5min，然后在室温下搅拌过夜。LC-MS显示反应完成。蒸发挥发物，得到浑浊油状物，将其悬浮于EtOAc(450mL)中并用水(150mL)洗涤。将水层用EtOAc(3×225mL)反萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将所得的油腻泡沫与DCM(3×100mL)共蒸发，然后在高真空下进一步干燥过夜，得到产物(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-5-氧代戊基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基二乙酸酯(40.9g，93.4％产率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.82(d,J＝8.8Hz,1H),5.35(dd,J＝3.5,1.2Hz,1H),5.27(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.71(d,J＝8.4Hz,1H),4.23-4.07(m,2H),4.05-3.89(m,1H),3.94-3.85(m,2H),3.60(ddd,J＝11.0,6.4,4.8Hz,1H),2.87(m,4H),2.79-2.56(m,2H),2.15(s,3H),2.05(s,3H),2.00(s,3H),1.95(s,3H),1.91-1.65(m,4H)；MS(ESI),545.20[M+H]+。
实例39.1-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-16,16-双((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5,11,18-三氧代-14-氧杂-6,10,17-三氮杂二十烷-29-酸的合成。
Figure BDA0003580200980005371
步骤1：将12-[[2-[3-[3-(叔丁氧基羰基氨基)丙基氨基]-3-氧代-丙氧基]-1,1-双[[3-[3-(叔丁氧基羰基氨基)丙基氨基]-3-氧代-丙氧基]甲基]乙基]氨基]-12-氧代-十二烷酸苄酯(20.8g，18.765mmol)在DCM(140mL)中的溶液冷却至0℃。在10min的时间内添加三氟乙酸(43.4mL，562.96mmol)。首先在0℃下继续搅拌15min，然后在室温下搅拌3h。LC-MS显示反应完成。蒸发挥发物。将所得的残余物依次与DCM(150mL)和ACN(150mL)共蒸发。将残余物再溶解于ACN(30mL)中并用乙醚(300mL)研磨。将所得的白色浑浊混合物置于冰箱中过夜。滗析乙醚层。将剩余的油状物再次与ACN(30mL)共蒸发，得到油状物。将油状物在高真空下进一步干燥三夜，得到呈油状物的12-((1,19-二氨基-10-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5,15-二氧代-8,12-二氧杂-4,16-二氮杂十九烷-10-基)氨基)-12-氧代十二烷酸苄酯三(2,2,2-三氟乙酸盐)(25.37g，118％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.03(t,J＝5.8Hz,3H),7.78(bs,9H),7.40-7.30(m,5H),6.98(s,1H),5.08(s,2H),3.60-3.50(m,12H),3.11(q,J＝6.6Hz,6H),2.84-2.70(m,6H),2.38-2.28(m,8H),2.05(t,J＝7.48Hz,2H),1.67(p,J＝7.0Hz,6H),1.57-1.48(m,2H),1.46-1.39(m,2H),1.27-1.17(m,12H)；MS(ESI),808.57[M+H]+。
步骤2：向12-((1,19-二氨基-10-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5,15-二氧代-8,12-二氧杂-4,16-二氮杂十九烷-10-基)氨基)-12-氧代十二烷酸苄酯三(2,2,2-三氟乙酸盐)(21.5g，18.694mmol)中添加乙腈(125mL)和DIPEA(39.1mL，224.33mmol)。向所得的浑浊溶液中添加DCM(125mL)，混合物变成澄清溶液。将(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-5-氧代戊基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基二乙酸酯(40.9g，75.113mmol)在DCM(250mL)中的溶液冷却至0℃。在15min的时间内将碱化的胺溶液缓慢添加到冷的亲电体溶液中。首先在0℃下继续搅拌10min，然后在室温下搅拌70min。LC-MS显示反应完成。浓缩反应溶液。将所得的油状物首先与ACN(2×50mL)共蒸发，然后与DCM(2×50mL)共蒸发。将粗产物通过正相柱色谱法使用0-40％MeOH/DCM梯度纯化，得到呈白色泡沫状的12-[[2-[3-[3-[5-[3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基戊酰基氨基]丙基氨基]-3-氧代-丙氧基]-1,1-双[[3-[3-[5-[3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基戊酰基氨基]丙基氨基]-3-氧代-丙氧基]甲基]乙基]氨基]-12-氧代-十二烷酸苄酯(33.7g，86.1％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.85-7.77(m,6H),7.71(t,J＝5.7Hz,3H),7.42-7.28(m,5H),6.96(s,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,3H),5.08(s,2H),4.97(dd,J＝11.2,3.4Hz,3H),4.48(d,J＝8.4Hz,3H),4.07-3.96(m,9H),3.87(dt,J＝11.2,8.8Hz,3H),3.71(dd,J＝10.3,5.6Hz,3H),3.58-3.50(m,12H),3.40(dt,J＝9.7,6.0Hz,3H),3.03(p,J＝6.3Hz,12H),2.36-2.24(m,8H),2.10(s,9H),2.07-2.01(m,8H),1.99(s,9H),1.89(s,9H),1.77(s,9H),1.56-1.41(m,22H),1.28-1.18(m,12H)；MS(ESI),1048.95[M/2+H]+。
步骤3：将12-[[2-[3-[3-[5-[3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基戊酰基氨基]丙基氨基]-3-氧代-丙氧基]-1,1-双[[3-[3-[5-[3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基戊酰基氨基]丙基氨基]-3-氧代-丙氧基]甲基]乙基]氨基]-12-氧代-十二烷酸酯(30.8g，14.692mmol)溶解于EtOAc(450mL)和MeOH(150mL)中。添加钯碳(10重量％载量，2.48g)。在搅拌的同时，将烧瓶抽空并用氢气回填(重复两次)。将反应物在氢气球下氢化3h。LC-MS显示反应完成。将反应混合物通过填充有硅藻土薄层的烧结漏斗过滤。用EtOAc/MeOH(2:1；总计900mL)洗涤漏斗中的固体。将滤液浓缩，得到油腻白色泡沫，将其与DCM(3×100mL)共蒸发。然后将产物在高真空下干燥两夜，得到呈白色泡沫状的1-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-16,16-双((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酰胺基)丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-5,11,18-三氧代-14-氧杂-6,10,17-三氮杂二十烷-29-酸(29.5g，100％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.96(s,1H),7.87-7.79(m,6H),7.74(t,J＝5.6Hz,3H),6.99(s,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,3H),4.96(dd,J＝11.2,3.4Hz,3H),4.48(d,J＝8.5Hz,3H),4.06-3.98(m,9H),3.87(dt,J＝11.2,8.8Hz,3H),3.70(dt,J＝10.5,5.6Hz,3H),3.58-3.48(m,12H),3.40(dt,J＝9.6,6.0Hz,3H),3.03(p,J＝6.3Hz,12H),2.27(t,J＝6.4Hz,6H),2.18(t,J＝7.4Hz,2H),2.10(s,9H),2.07-2.01(m,8H),1.99(s,9H),1.89(s,9H),1.77(s,9H),1.56-1.41(m,22H),1.28-1.15(m,12H)；MS(ESI),1004.00[M/2+H]+。
实例40.C12接头三触角GalNAc亚磷酰胺的合成。
Figure BDA0003580200980005391
Figure BDA0003580200980005401
步骤1：向圆底烧瓶中装入GalNAc乙酰基衍生物(20.0g，9.86mmol)、HATU(3.94g，10.35mmol)和ACN(165mL)。在搅拌的同时，添加DIPEA(2.58mL，14.79mmol)。搅拌10min，得到前体A。将6-氨基-1-己醇(1.16g，9.86mmol)溶解于ACN(65mL)中。在搅拌下，在2min的时间内将前体A缓慢倒入氨基醇溶液中。添加另外的DIPEA(0.5mL)。将反应溶液搅拌45min。LC-MS显示反应完成。蒸发挥发物。将所得的粗产物溶解于DCM(600mL)中并用水(2×50mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将所得的粗残余物通过正相柱色谱法(ISCO220g金柱)使用5％-25％MeOH/DCM梯度纯化，得到呈固体状的[(3R,5S,6R)-5-乙酰胺基-6-[5-[3-[3-[3-[3-[3-[5-[(2R,3S,5R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基戊酰基氨基]丙基氨基]-3-氧代-丙氧基]-2-[[3-[3-[5-[(2R,3S,5R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基戊酰基氨基]丙基氨基]-3-氧代-丙氧基]甲基]-2-[[12-(6-羟基己基氨基)-12-氧代-十二酰基]氨基]丙氧基]丙酰胺基]丙基氨基]-5-氧代-戊氧基]-3,4-二乙酰氧基-四氢吡喃-2-基]乙酸甲酯(17.9g，86.2％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.86-7.77(m,6H),7.77-7.68(m,4H),6.98(s,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,3H),4.96(dd,J＝11.3,3.4Hz,3H),4.48(d,J＝8.5Hz,3H),4.33(t,J＝5.1Hz,1H),4.08-3.95(m,9H),3.87(dt,J＝11.2,8.8Hz,3H),3.70(dt,J＝10.3,5.6Hz,3H),3.61-3.46(m,12H),3.46-3.33(m,5H),3.02(h,J＝6.1Hz,14H),2.27(t,J＝6.4Hz,6H),2.10(s,9H),2.08-2.00(m,10H),1.99(s,9H),1.89(s,9H),1.77(s,9H),1.56-1.31(m,26H),1.31-1.14(m,16H)；MS(ESI),1054.0[M/2+H]+。
步骤2：将干燥的[(3R,5S,6R)-5-乙酰胺基-6-[5-[3-[3-[3-[3-[3-[5-[(2R,3S,5R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基戊酰基氨基]丙基氨基]-3-氧代-丙氧基]-2-[[3-[3-[5-[(2R,3S,5R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基戊酰基氨基]丙基氨基]-3-氧代-丙氧基]甲基]-2-[[12-(6-羟基己基氨基)-12-氧代-十二酰基]氨基]丙氧基]丙酰胺基]丙基氨基]-5-氧代-戊氧基]-3,4-二乙酰氧基-四氢吡喃-2-基]乙酸甲酯(32.19g，15.29mmol)在DCM(90mL)中的溶液冷却到0℃。在3min的时间内滴加2-氰乙基N,N,N′,N′-四异丙基二氨基磷酸甲酯(9.71mL，30.58mmol)。将溶液搅拌5min。一次性添加5-(乙硫基)-1H-四唑(2.29g，17.58mmol)。首先在0℃下继续搅拌5min，然后在室温下搅拌6h。TLC显示反应完成。添加三乙胺(8.3mL)。搅拌5min。将混合物浓缩。将所得的粗产物通过正相柱色谱法使用0-80％ACN/EtOAc(各流动相含有5％的三乙胺)梯度纯化，得到呈灰白色泡沫状的所需的C12接头三触角GalNAc亚磷酰胺(27.2g，77.1％产率)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.86-7.78(m,6H),7.73(t,J＝5.7Hz,3H),7.69(t,J＝5.6Hz,1H),6.98(s,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,3H),4.96(dd,J＝11.2,3.5Hz,3H),4.48(d,J＝8.5Hz,3H),4.06-3.98(m,9H),3.87(dt,J＝11.2,8.8Hz,3H),3.74-3.67(m,5H),3.62-3.50(m,16H),3.40(dt,J＝9.7,6.2Hz,3H),3.02(dq,J＝15.4,8.7,7.7Hz,14H),2.75(t,J＝5.9Hz,2H),2.27(t,J＝6.4Hz,6H),2.10(s,9H),2.07-2.00(m,10H),1.99(s,9H),1.89(s,9H),1.77(s,9H),1.56-1.40(m,26H),1.39-1.17(m,16H),1.13(t,J＝6.6Hz,12H)；31P NMR(243MHz,DMSO-d6)δ146.32；MS(ESI),1153.24[M/2+H]+。
实例41.寡核苷酸组合物的制备。
用于制备寡核苷酸和寡核苷酸组合物(立体随机的和手性控制的)的多种技术是已知的并且可以根据本披露使用，包括例如在以下文献中描述的方法和试剂：US 9982257、US 20170037399、US 20180216108、US 20180216107、US 9598458、WO 2017/062862、WO2018/067973、WO 2017/160741、WO 2017/192679、WO 2017/210647、WO 2018/098264、WO2018/223056、WO 2018/237194、WO 2019/032607、WO 2019/055951、WO 2019/075357、WO2019/200185、WO 2019/217784、WO 2019/032612和/或WO 2020/191252，它们各自的方法和试剂通过援引并入本文。
合成并评估了许多寡核苷酸组合物。在一些最近制备的寡核苷酸组合物中观察到的寡核苷酸的MS数据如下(当同一寡核苷酸呈现多个数字时，这些数字可以是在不同批次/实验中观察到的MS数据)：WV-20666：10167.1；WV-20689：10183；WV-20690：10198.4；WV-20691：10215.3；WV-20692：10230.3；WV-20693：10246.5；WV-20694：10262.7；WV-20695：10278.9；WV-20696：10294.3；WV-20697：10311.3；WV-20698：10327；WV-20699：10342.9；WV-20700：10358.5；WV-20701：10376；WV-20702：10391.1；WV-20703：10407.5；WV-20704：10423.6；WV-20706：10199；WV-20707：10215.3；WV-20708：10230.6；WV-20709：10246.5；WV-20710：10262.6；WV-20711：10279.3；WV-20712：10294.2；WV-20713：10310.8；WV-20714：10327；WV-20715：10342.9；WV-20716：10358.7；WV-20717：10246.3；WV-20718：10262.7；WV-20719：10278.3；WV-20720：10294.2；WV-20721：10311.4；WV-20722：10327.1；WV-20723：10342.8；WV-20724：10358.7；WV-20725：10374.8；WV-20726：10391；WV-20727：10182.9；WV-20728：10182.7；WV-20729：10182.7；WV-20730：10182.9；WV-20731：10230.8；WV-20732：10199.1；WV-20733：10663.7；WV-20734：10194.7；WV-20735：10222.7；WV-20736：10250.5；WV-20737：10278.3；WV-20738：10306.7；WV-20739：10334.8；WV-20740：10362.9；WV-20741：10194.8；WV-20742：10208.5；WV-20743：10236.8；WV-20744：10263.9；WV-20745：10293.1；WV-20746：10320.4；WV-20747：10093.9；WV-20748：10098.1；WV-20749：10101.9；WV-20750：10106.4；WV-20751：10110.5；WV-20752：10113.5；WV-20753：10118.3；WV-20754：10122.6；WV-20755：10098；WV-20756：10100；WV-20757：10104.3；WV-20758：10107.7；WV-20759：10111.8；WV-20760：10116.7；WV-23388：10098；WV-23395：10612.3；WV-24111：10046.8；WV-24112：10047；WV-24113：10047；WV-24114：10046.8；WV-24115：10047；WV-24116：10046.8；WV-24117：10046.9；WV-24118：10046.8；WV-24119：10046.9；WV-24120：10047.1；WV-24121：10047；WV-24122：10047.1；WV-24123：10047；WV-24124：10047；WV-24125：10046.9；WV-24126：10046.9；WV-24127：10047；WV-24128：10046.5；WV-24129：10047；WV-24130：10046.8；WV-24131：10046.8；WV-24132：10047；WV-24133：10047.1；WV-24134：10047；WV-24135：10047；WV-24136：10046.9；WV-24137：10047.1；WV-24138：10047；WV-24139：10046.8；WV-24140：10046.4；WV-24141：10046.9；WV-24142：10047；WV-24143：10047.1；WV-24144：10047；WV-24145：10047.1；WV-24146：10046.9；WV-24147：10046.7；WV-24148：10047；WV-24149：10047；WV-24150：10047.1；WV-24151：10047.1；WV-24152：10047.1；WV-24153：10047.1；WV-24154：10047.1；WV-24155：10047.1；WV-24156：10046.7；WV-24157：10047；WV-24158：10047.1；WV-27457：12613.1；WV-27458：11954.6；WV-27459：12631；WV-27460：11972.7；WV-27521：10064.1；WV-31133：10737.8；WV-31134：10869.1；WV-31135：10790.3；WV-31137：10779.4；WV-31138：10788.2；WV-31139：10039.1；WV-31140：10168.8；WV-31141：10091.0；WV-31143：10079.0；WV-31144：10089.6；WV-31632：10772.7；WV-31633：10786.6；WV-31634：10072.7；WV-31635：10087.2；WV-31748：10762.5；WV-31749：10064.4；WV-28788：10169.1；WV-27458：11954.6；WV-31940：10285.5；WV-35741:12352.0。
如本文所述和证实的，本披露的技术可用于制备包含多种结构特征的寡核苷酸的多种组合物。在一些实施例中，如本文所证实的，所提供的技术，例如，利用包含吸电子基团的手性助剂(例如，包含吸电子基团(例如，-SO2RC1、-C(O)RC1等)的RC11)的那些技术，尤其可用于制备包含2′-OH糖(例如，R2s＝OH的糖，诸如通常在天然RNA中发现的糖)的寡核苷酸的手性控制的组合物，尤其当此类糖键合到手性控制的核苷酸间键联时。下面作为实例描述了WV-29874的制备。
根据以下循环进行25μmol规模的手性控制的寡核苷酸组合物(WV-29874)的自动化固相合成：
Figure BDA0003580200980005431
IBN：异丁腈；MeIm:N-甲基咪唑；PhIMT:N-苯基咪唑鎓三氟甲磺酸盐；XH：苍耳烷氢化物。进行多次循环直至达到所需的长度。PSM亚磷酰胺用于形成手性控制的核苷酸间键联(对于2'-OH，用TBS(叔丁基二甲基甲硅烷基)保护)。
完成合成循环后，通过无水碱处理(DEA处理)除去PSM手性助剂基团。将CPG在35℃下用40％MeNH2(5.0mL)处理30min，然后冷却至室温并通过膜过滤分离CPG，用8.0mL DMSO洗涤。向滤液中添加TEA(三乙胺)-3HF(5.0mL)并在45℃下搅拌1h，这可以从2'-OH移除TBS保护基。将反应混合物冷却至室温并用10mL 50mM NaOAc(pH 5.2)稀释。通过LTQ和RP-UPLC分析粗物质。将粗物质通过RP-HPLC采用50mM TEAA(三乙基乙酸铵)中的MeCN的线性梯度进行纯化，通过tC18 SepPak柱脱盐，得到目标寡核苷酸。
使用以下程序进行脱盐：
如果存在，从样品中蒸发MeCN。
采用4CV的100％乙腈(HPLC级)调节柱。
采用2CV的40％MeCN(溶于Millipore Bio-Pak水，无内毒素)冲洗柱。
采用4CV的水(Millipore Bio-Pak，无内毒素)冲洗柱。
采用2CV的50mM TEAA(溶于Millipore Bio-Pak水，无内毒素)平衡柱。
将纯级分上样到经平衡的柱上。在一些实施例中，重力上样提供最大量的结合，用真空缓慢上样提供适当的结合，而用真空快速上样导致较差的结合。
用2CV的BioPak水洗涤柱以洗去TEAA。
用2CV的100mM NaOAc洗涤柱，用钠交换寡核苷酸骨架上的铵。
用BioPak水洗涤柱，直到洗脱液的电导率<20uS/cm。
用2倍柱体积的40％MeCN(溶于Millipore Bio-Pak水，无内毒素)洗脱产物。
在30℃下置于Speed-vac上过夜以除去乙腈并浓缩。
一次制备的结果：合成规模：25μmol；粗OD：874OD；粗UPLC纯度：32.17％；粗LTQ纯度：62.45％；最终ODs：59.8OD；最终UPLC纯度：59.85％；最终MS纯度：74.51％；以及最终观测到的MS：10064.4(计算值10,063.68)。
实例42.与立体随机寡核苷酸组合物相比，所提供的包括手性控制的寡核苷酸组合物的技术可以提供高活性。
尤其是，本披露展示，与不含手性控制的核苷酸间键联的立体随机组合物相比，所提供的包含多种手性控制的核苷酸间键联的组合物可以提供高活性。例如，如图24所示，评估了多种手性控制的寡核苷酸组合物，这些组合物对于多种靶转录物提供了比立体随机组合物更高的活性。用50nM的寡核苷酸转染原代人肝细胞。48小时后收获RNA，并通过桑格测序对编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。
实例43.所提供的包括具有经修饰的核苷酸间键联的寡核苷酸的技术可以提供高活性。
尤其是，本披露展示，所提供的包括多种核苷酸间键联类型和模式的技术可以提供编辑活性，例如如图25所示，其中评估了多种寡核苷酸组合物。组合物靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用ADAR1-p150、荧光素酶报告构建体和指示的组合物以3.3nM的寡核苷酸浓度转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。在一些实施例中，在某些位置将不带负电荷的核苷酸间键联诸如n001并入可以提供更高的编辑活性。
实例44.所提供的包括含有另外的化学部分的寡核苷酸的技术可以提供高活性。
尤其是，本披露展示，所提供的包括多种核苷酸间键联模式、糖修饰模式和/或另外的化学部分的技术可以在有或没有外源性ADAR的情况下提供高编辑活性，例如如图26所示，其中评估了多种寡核苷酸组合物。将原代猴肝细胞用指示的寡核苷酸组合物进行裸处理。通过桑格测序来测量对靶的编辑(n＝2个生物重复样)。在一些实施例中，某些结构元件，例如第二子结构域中的2'-F修饰的糖，与第二子结构域核苷键合的Rp硫代磷酸酯键联(如图所示，与某一第二子结构域核苷键合的两个Rp硫代磷酸酯键联)，和/或某些位置处的不带负电荷的核苷酸间键联诸如n001可以改善编辑效率。
实例45.所提供的包括具有经修饰的核苷酸间键联、糖修饰和/或另外的化学部分的寡核苷酸的技术可以提供高活性。
尤其是，本披露展示，所提供的包括具有经修饰的核苷酸间键联、糖修饰和/或另外的化学部分的寡核苷酸的技术可以提供高活性，例如如图27所示，其中评估了多种寡核苷酸组合物。将原代人肝细胞用指示的寡核苷酸组合物进行裸处理。通过桑格测序对经编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。在一些实施例中，某些结构元件，例如第二子结构域中的2'-F修饰的糖，与第二子结构域核苷键合的Rp硫代磷酸酯键联，错配的定位，和/或某些位置处的不带负电荷的核苷酸间键联诸如n001可以改善编辑效率。
实例46.所提供的包括含有多种经修饰的核苷酸间键联、糖修饰和/或另外的部分的寡核苷酸的技术可以提供高活性。
尤其是，本披露展示，所提供的包括多种核苷酸间键联修饰、糖修饰和/或另外的部分及其模式的技术可以在有或没有外源性ADAR的情况下提供高编辑活性，例如如图28所示，其中评估了多种寡核苷酸组合物。将原代人肝细胞用指示的寡核苷酸组合物进行裸处理。通过桑格测序对经编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。在一些实施例中，某些结构元件，例如第二子结构域中的2'-F修饰的糖，与第二子结构域核苷键合的Rp硫代磷酸酯键联，错配的定位和/或存在或不存在，和/或某些位置处的不带负电荷的核苷酸间键联诸如n001可以改善编辑效率。实例47。所提供的包括具有经修饰的核苷酸间键联、糖修饰和/或另外的化学部分的寡核苷酸的技术可以提供高活性。
尤其是，本披露展示，所提供的包括具有经修饰的核苷酸间键联、糖修饰和/或另外的化学部分的寡核苷酸的技术可以提供高活性，例如如图29中所示，其中评估了多种寡核苷酸组合物(如在各图中和其他地方，寡核苷酸/组合物的详细描述可以在例如表1(例如，表1A、表1B、表1C和/或表1D)中找到；在一些情况下，寡核苷酸/组合物可以仅由数字表示(例如，在图29中，WV-32101、WV-35713、WV-35737和WV-35736仅由它们的数字(分别为32101、35713、35737和35736)表示))。将原代人肝细胞用指示的寡核苷酸组合物以指示的浓度进行裸处理。ADAR是内源性的。组合物靶向β-肌动蛋白mRNA的3'UTR中的腺苷。通过桑格测序对经编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联的某些模式和/或不带负电荷的核苷酸间键联的数目增加可以增加编辑效率。在一些实施例中，减少错配和/或利用在第二结构域(例如，第二子结构域(例如，与待编辑的靶腺苷相反的核苷(例如，在5'侧)相邻)处包含2'-F修饰的糖的核苷可以提供增加的编辑效率。
实例47.所提供的包括具有经修饰的核苷酸间键联、糖修饰和/或另外的化学部分的寡核苷酸的技术可以提供高活性。
尤其是，本披露展示，所提供的包括具有经修饰的核苷酸间键联、糖修饰和/或另外的化学部分的寡核苷酸的技术可以提供高活性，例如如图29所示，其中评估了多种寡核苷酸组合物。将原代人肝细胞用指示的寡核苷酸组合物以指示的浓度进行裸处理。ADAR是内源性的。组合物靶向β-肌动蛋白mRNA的3'UTR中的腺苷。通过桑格测序对经编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。在一些实施例中，不带负电荷的核苷酸间键联的某些模式和/或不带负电荷的核苷酸间键联的数目增加可以增加编辑效率。在一些实施例中，减少错配和/或利用在第二结构域(例如，第二子结构域(例如，与待编辑的靶腺苷相反的核苷(例如，在5'侧)相邻)处包含2'-F修饰的糖的核苷可以提供增加的编辑效率。
实例48.所提供的包括具有经修饰的核苷酸间键联、糖修饰和/或另外的化学部分的寡核苷酸的技术可以提供高活性。
尤其是，本披露展示，所提供的包括具有经修饰的核苷酸间键联、糖修饰和/或另外的化学部分的寡核苷酸的技术可以提供高活性，例如如图30所示，其中评估了多种寡核苷酸组合物。将原代人或猴肝细胞用指示的寡核苷酸组合物以指示的浓度进行裸处理。ADAR是内源性的。组合物靶向β-肌动蛋白mRNA的3'UTR中的腺苷。通过桑格测序对经编辑的转录物的百分比进行定量(n＝2个生物重复样)。如图30所示，除了2'-F以外的糖修饰，例如2'-OR，其中R是任选地经取代的C1-6脂肪族基(诸如2'-OMe和2'-MOE)，可以以一定水平(例如，数量和/或百分比)和/或模式用于寡核苷酸中，包括第一结构域中。此外，多种骨架手性中心模式，包括包含多种不带负电荷的核苷酸间键联的立体化学的模式，可以用于编辑。
实例49.手性控制可以改善编辑效率。
尤其是，本披露展示，经修饰的核苷酸间键联诸如硫代磷酸酯核苷酸间键联的手性控制可以改善活性。在一些实施例中，如图31和图32所示，第一结构域和/或第二结构域(及其子结构域)和/或寡核苷酸中的手性控制的核苷酸间键联(例如，手性控制的Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联)的数目/水平增加可以提供改善的编辑效率。在一些实施例中，可在某些位置使用一个或多个非手性控制的核苷酸间键联以提供具有某些活性水平的组合物。组合物都靶向cLuc编码序列内的提前UAG终止密码子。将293T细胞用编码ADAR1-p110或-p150的质粒、荧光素酶报告构建体和指示的寡核苷酸组合物转染。将cLuc活性归一化为模拟处理的样品中的Gluc表达(n＝2个生物重复样)。在一些实施例中，Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联增加ADAR1-p110和/或ADAR1-p150的RBD结合和/或脱氨酶结构域活性。
实例50.手性控制和经修饰的核苷酸间键联可以改善编辑效率。
在一些实施例中，本披露展示，包含经修饰的核苷酸间键联(例如，硫代磷酸酯核苷酸间键联)的寡核苷酸的组合物可以提供改善的编辑活性。在一些实施例中，本披露提供包含手性控制的经修饰的核苷酸间键联的寡核苷酸的组合物，并且展示手性控制可以改善所需的活性。在一些实施例中，如图33所示，第一结构域和/或第二结构域(及其子结构域)和/或寡核苷酸中的经修饰的核苷酸间键联(例如，硫代磷酸酯核苷酸间键联)和/或手性控制的核苷酸间键联(例如，手性控制的Sp硫代磷酸酯核苷酸间键联)的数目/水平增加可以提供改善的编辑效率。在一些实施例中，可以在某些位置使用天然磷酸酯键联以提供具有某些活性水平的组合物(例如，参见图33和图34)。
实例51.可以利用多种糖修饰来提供具有所需活性的寡核苷酸组合物。
尤其是，本披露展示，根据本披露可以利用多种糖修饰来提供可以提供编辑活性的寡核苷酸及其组合物。例如，2'-修饰(例如，其中R不是氢的2'-OR)可以根据本披露以多种水平和/或模式用于寡核苷酸中以提供例如腺苷编辑活性。如图35所示，2'-OR修饰(其中R不是-H)可用于多种位置。应注意，在一些实施例中，可能优选的是，在某些情况下在某些位置具有除2'-MOE之外的糖修饰(例如，具有2'-OMe)。如图36所示，2'-F修饰可用于多种位置。应注意，在一些实施例中，可能优选的是，在某些情况下在某些位置具有除2'-F之外的糖修饰(例如，具有2'-OMe)。
实例52.所提供的技术可以在体内提供高水平的活性。
如上文所述和本文所证实的，所提供的技术尤其可以在体内提供高水平的编辑活性，包括在灵长类动物中。如本文所展示，多种所提供的技术可以在非人类灵长类动物模型中提供高效率的腺苷编辑。
在一些实施例中，在给予时，将5mg/kg皮下(SC)剂量的WV-37314、WV-37315或WV-37330施用给非原初食蟹猴(5-8kg)连续5天。最后一剂后48小时，给动物施用麻醉和镇痛以进行活检程序。在麻醉下，从所有可用动物收集肝活检样品。对于每只动物，收集两个肝活检样品(80-120mg)，立即称重并置于适当的收集小瓶中，并且在液氮中快速冷冻。将每个单独的样品置于单独的管中。然后将样品储存在干冰上，直到转移到设定为保持-60至-80℃的冷冻器中。
对于RNA分离，将冷冻组织添加到1000μL Trizol中并均质化。向每个样品中添加200μL氯仿，剧烈振荡，温育5分钟，然后以10,000xg离心5分钟。将上清液(水相)从SV96总RNA提取试剂盒(普洛麦格公司)转移到结合板，并按照方案提取RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒按照制造商(应用生物系统公司(Applied Biosystems))的推荐，通过将9μL总RNA添加到20μL RT反应中来合成cDNA。在使用Phusion高保真DNA聚合酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)：目录号#F530)的PCR反应中使用2μL cDNA，以使用得自IDT的定制引物扩增ACTB转录物。使用AMPure XP磁珠根据制造商的方案纯化PCR产物，并通过桑格测序(美国金唯智公司(Genewiz,USA))进行分析。然后使用EditR程序(https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/)对编辑百分比定量。图37中呈现了某些结果。如所展示的，所提供的技术在这些灵长类动物中提供高水平的编辑活性。
实例53.所提供的技术可以在体内提供持久的编辑活性。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸组合物，这些寡核苷酸组合物尤其可以在体内提供编辑活性。如所述，所提供技术的技术可以提供增加的稳定性、高水平的编辑等，如本实例和图38中所证实。如所展示的，所提供的技术可在最后一剂后长时间(例如，约或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45天或更多天)提供所需的编辑活性。在一些实施例中，所需的编辑活性/编辑水平可以在最后一剂后长时间维持，例如约或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45天或更多天。
图38中呈现了某些数据，该图描绘了非人类灵长类动物(NHP)肝(a)和肾(b)(在给予时，非原初食蟹猴(5-8kg))中的编辑。组合物都靶向β-肌动蛋白mRNA的3'UTR中的腺苷。向动物给予寡核苷酸组合物(WV-37314、WV-37315和WV-37330)，在第2天和最后一剂后45天收集肝活检样本，在最后一剂后45天收集肾。如图38(a)所证实的，所有三种寡核苷酸组合物(WV-37314、WV-37315和WV-37330)在第2天和最后一剂后至少45天都在肝中在没有外源性ADAR的情况下提供了ACTB mRNA的体内编辑(编辑范围为25％-50％)，并且编辑水平在最后一剂后至少45天保持较高。此外，如在图38(b)中可以看出，所有三种寡核苷酸组合物(WV-37314、WV-37315和WV-37330)在最后一剂后至少45天都在肾中在没有外源性ADAR的情况下提供了体内ACTB mRNA编辑(编辑范围为5％-15％)。在肝和肾中都进行了分析以评估寡核苷酸量。图38示出了第2天和最后一剂后45天肝的某些数据，范围为150-1000μg/g组织，以及最后一剂后45天肾的某些数据，范围为5-35μg/g组织，证实了所提供的寡核苷酸组合物向多种组织的递送和/或在多种组织中的稳定性。如图38中所证实，在一些实施例中，所提供的寡核苷酸可以相对于其他组织(例如，肾)选择性地递送到一个或多个组织(例如，肝)中和/或以较高的水平维持。
实例54.所提供的技术可以在多种系统中提供编辑活性。
如所描述的，本披露提供尤其可以在多种系统(例如，多种类型的细胞、组织、器官、生物体等)中提供编辑的技术。图39中呈现了某些数据，其证实在人类神经元细胞中的编辑。将iCell神经元和iCell星形胶质细胞(分别为a和b；也可分别称为iNeuron和iAstrocyte；均可得自Brainxell)用指示浓度的指示寡核苷酸组合物通过裸递送进行处理。如图39(a)所示，所有4种寡核苷酸组合物(WV-27404、WV-37317、WV-37318和WV-37324)均在人神经元中提供了编辑。已证实，在一些实施例中，可根据本披露使用不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)来改善编辑水平(例如，在iCell神经元中与不同浓度的WV-27404相比，WV-37317、WV-37318和WV-37324提供更高水平的编辑，(a))。图39(b)中呈现了iCell星形胶质细胞中ACTB编辑的某些数据。iCell神经元和iCell星形胶质细胞中另外的靶腺苷编辑的某些数据分别在(c)和(d)中呈现。将细胞用指示浓度的指示寡核苷酸组合物通过裸递送进行处理。向iCell神经元和星形胶质细胞分别给予包含WV-40590(靶向UGP2)、WV-40591(靶向EEF1A1)、WV-40592(靶向SRSF1)、WV-40595(靶向HSP90AB1)、WV-40596(靶向HSP90B1)和WV-40594(靶向GHITM)的寡核苷酸组合物，这些寡核苷酸组合物各自靶向它们相应的mRNA。阅读本披露的本领域技术人员将理解，尤其是，根据本披露使用所提供的技术可以实现更高的编辑水平(例如，比图中呈现的编辑水平更高)。尤其是，图39展示了所提供的技术可以通过裸递送而有效地递送至神经元细胞，并且可以在此类细胞中提供高水平的编辑达至少数天的时间(例如，如图39所示，至少5天或6天)。
实例55.用于评估寡核苷酸技术的有用技术。
尤其是，本披露提供了用于评估药剂(例如寡核苷酸)及其组合物的编辑(例如A至I(G)编辑)的技术。在一些实施例中，本披露提供了可用于评估药剂(例如，寡核苷酸)及其组合物的技术，这些药剂及其组合物与如本文所述的ADAR多肽(例如，ADAR1多肽)相互作用和/或调节或利用该多肽的一种或多种功能。在一些实施例中，本披露提供了经工程化以包含和/或表达ADAR1多肽或其特征性部分，或编码ADAR1多肽或其特征性部分的多核苷酸的非人类动物细胞和/或非人类动物。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含灵长类动物ADAR1或其特征性部分。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含灵长类动物ADAR1。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是灵长类动物ADAR1。在一些实施例中，灵长类动物是非人类灵长类动物。在一些实施例中，灵长类动物是人。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人p110 ADAR1或其特征性部分。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人p110 ADAR1。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是人p110 ADAR1。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人p150ADAR1或其特征性部分。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人p150ADAR1。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是人p150 ADAR1。在一些实施例中，非人动物是啮齿类动物。在一些实施例中，其为大鼠。在一些实施例中，其为小鼠。在一些实施例中，本披露提供经工程化以表达人ADAR1的小鼠。在一些实施例中，本披露提供经工程化以表达人ADAR1的小鼠细胞。
尤其是，本实例展示了所提供的技术特别可用于评估可用于编辑(例如，实例中所述的腺苷编辑)的药剂(例如，寡核苷酸)及其组合物。尤其是，本披露指出并且本实例证实，可在多种人类细胞中提供编辑的多种药剂(例如，寡核苷酸)及其组合物可能在不含或不表达人ADAR(例如，人ADAR1)的某些细胞(例如，小鼠细胞)和某些动物诸如啮齿类动物(例如，小鼠)中不会显示出编辑或显示出低得多的编辑水平；特别地，小鼠(一种常用的动物模型)对于评估用于在人类中编辑的多种药剂(例如，寡核苷酸)可能具有有限的用途，因为在人类中有活性的药剂可能不会显示出活性或显示出非常低水平的活性(参见图40和图47，野生型(WT)小鼠和细胞、人类细胞以及经工程化以表达hADAR1 p110的细胞和小鼠(huADAR小鼠)的数据)。在一些实施例中，本披露提供了经工程化以表达人ADAR1(例如，人ADAR1p110、p150等)的细胞和非人类动物(例如，啮齿类动物诸如小鼠)，以及它们用于评估编辑剂(诸如寡核苷酸)及其组合物的用途。尤其是，此类工程化的细胞和/或动物与未如此工程化的细胞和/或动物相比可展示出与人类细胞中的活性更相关和/或更可预测人类细胞中的活性的活性。
表达人ADAR1的非人类小鼠的产生：可根据本披露使用多种技术来提供经工程化以表达人ADAR1多肽或其特征性部分的小鼠。以实例描述了某些有用的技术，例如实例62。
如图40、图41和图47所示，在经工程化以表达人ADAR1的小鼠细胞(图40和图47)和动物(图41)中，与未经工程化以表达人ADAR1的参考小鼠细胞和动物相比，多种寡核苷酸显示出与其在人类细胞中的活性谱非常相似的活性谱，例如，与表达人ADAR1的人类细胞和/或经工程化以表达人ADAR1的小鼠细胞和动物相比，许多寡核苷酸在未经工程化以表达人ADAR1的参考小鼠细胞和动物中未显示出活性或显示出低得多的活性水平。
实例56.所提供的包括手性控制和多种核苷酸间键联的技术可以在体外和体内提供高编辑活性。
尤其是，本实例证实手性控制和多种类型的核苷酸间键联可用于有效地改善编辑效率。如图40、图41和图47所示，手性控制的寡核苷酸组合物(例如，图40(a)中的WV-38700和WV-38702，以及图40(b)中的WV-38697和WV-38699)与参考非手性控制的寡核苷酸组合物(例如，分别为图40(a)和(b)中的WV-38701和WV-38698；另见图47)相比可以提供更高的编辑效率。尤其是，本实例证实根据本披露并入不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)也可以提高体内和体外编辑效率(图40(a)和图41(a)中的WV-38702，以及图40(b)和图41(b)中的WV-38699；另见图47)。将细胞给予靶向UGP(WV-38700、WV-38700和WV-38702)或EEF1A1(WV-38697、WV-38697和WV-38699)的GalNAc缀合的寡核苷酸的组合物。对于图41，在经工程化以内源性表达人ADAR-p110的C57/Blk6小鼠(人ADAR-p110小鼠)中，通过以10mg/kg每隔一天皮下(SC)施用向动物给予指定的寡核苷酸组合物，总共3个剂量(第1、3和5天)。使用相同的给药方案向野生型C57/Blk6小鼠用WV-38702和WV-38699组合物给药。最后一剂后3天(第8天)收集所有小鼠的肝。尤其是，本实例证实，在一些实施例中，根据本披露，手性控制的寡核苷酸组合物，特别是包含不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001)的寡核苷酸可以提供改善的编辑效率。
实例58.所提供的技术可以提供体内编辑活性。
在一些实施例中，本披露提供了寡核苷酸组合物，这些寡核苷酸组合物尤其可以在多种系统中，例如在体内的多种细胞、组织和/或器官中提供编辑活性。图42中呈现了某些数据，从而证实所提供的技术可以在体内在多种组织(包括CNS)中提供编辑。通过脑室内(ICV)施用单一100μg剂量或2×50μg剂量(间隔2天)的指定寡聚核苷酸组合物向经工程化以内源性表达人Adar-p110的C57/Blk6鼠(人ADAR-p110鼠)给药。单一剂量后8天以及最后一次50μg剂量后6天，收集并分析多个CNS组织。如在图42中可以看出，UGP2寡核苷酸(WV-40590)存在于所分析的所有脑区域中，浓度范围为5-60μg/g组织(a)。UGP2 mRNA在所分析的所有组织(皮质、小脑、纹状体、海马体、脑干和脊髓)中均被编辑，编辑百分比范围为10％-60％。对于另一种靶SRSF1，在所分析的所有脑区域中均观察到寡核苷酸(WV-40592)，浓度范围为5-45μg/g组织(b)，并且SRSF1 mRNA在所分析的所有组织(皮质、小脑、纹状体、海马体、脑干和脊髓)中均显示出编辑，编辑百分比范围为10％-40％。尤其是，本实例证实所提供的技术可以在体内在多种组织(包括CNS)中提供编辑，并且可以在最后一剂后至少一周提供编辑。
实例59.某些组合物的活性可以与某些ADAR多肽的水平相关。
如本文所述，所提供的技术可利用多种多肽来提供编辑。不希望受任何理论的限制，在一些实施例中，所提供的技术利用ADAR1来提供编辑；在一些实施例中，所提供的技术利用ADAR1 p110来提供编辑；在一些实施例中，所提供的技术利用ADAR1 p150来提供编辑；在一些实施例中，所提供的技术利用ADAR2来提供编辑；在一些实施例中，一种或多种ADAR多肽和/或其同种型的水平可以比一种或多种其他ADAR多肽和/或其同种型与编辑水平更相关；在一些实施例中，所提供的技术利用两种或更多种ADAR蛋白(例如，ADAR1、ADAR2等)和/或其同种型(例如，ADAR1的p110和/或p150)；在一些实施例中，所提供的技术利用ADAR1的p110和p150两者以及任选的其他同种型。在一些实施例中，编辑水平与ADAR1的水平相关联。在一些实施例中，编辑水平与ADAR1 p110的水平相关联。在一些实施例中，编辑水平与ADAR1 p150的水平相关联。在一些实施例中，编辑水平与ADAR1 p110的水平的关联大于与ADAR1 p150的水平的关联(例如，如对于某些手性控制的寡核苷酸组合物所观察到的)。在一些实施例中，编辑水平与ADAR1 p150的水平的关联大于与ADAR1 p110的水平的关联(例如，如对于某些立体随机寡核苷酸组合物所观察到的)。尤其是，本实例提供了显示在某些情况下某些寡核苷酸组合物的某些编辑水平与某些蛋白(和/或其同种型)水平之间的某些观察到的关联的数据。在一些实施例中，当某些蛋白的水平降低时，将靶向ADAR1(两种同种型)、ADAR1 p150或ADAR2的小干扰RNA(siRNA)试剂用于评估编辑活性(图43和图44)。将寡核苷酸组合物转染到细胞中。如图所示，IFN-a处理可增加ARPE-19细胞中的ADAR1 p150表达水平。使用立体随机寡核苷酸组合物WV-23928，与非IFN-a处理相比，在IFN-a刺激后观察到编辑水平增加(图44，左图，NTC-siRNA)。ADAR1(p110和p150)或单独的ADAR1 p150的敲低减少了编辑，包括用IFN-a刺激时。不希望受理论的限制，WV-23928的编辑可以与ADAR1p150的水平相关联，并且在一些实施例中，该关联可以比p110的水平和/或比WV-27395的编辑更甚。不希望受理论的限制，与WV-23928相比，手性控制的寡核苷酸组合物WV-27395的编辑可与ADAR1 p150的水平或IFN-a处理较少相关(或在一些实施例中，不显著相关)，和/或可与ADAR1 p110的水平更多相关。在一些实施例中，IFN-a处理不显著影响由WV-27395提供的编辑水平(图44，右图)。在这些测试条件下没有检测到显著水平的ADAR2蛋白，并且siRNA介导的ADAR2耗竭似乎对WV-23928或WV-27395的编辑效率没有显著影响(图44)。
实例60.所提供的技术可以提供高特异性。
尤其是，所提供的技术可以提供高特异性。本实例提供某些数据作为证实这种特异性的实例。
在一些实施例中，为了评估特异性，使用链特异性文库进行深度RNA测序(RNA-seq)以定量中靶编辑和脱靶编辑。在一些实施例中，在原代人肝细胞中评价了手性控制的寡核苷酸组合物WV-27458和立体随机组合物WV-30298。在一些实施例中，观察到用RNA-seq检测的中靶编辑的百分比与用桑格测序检测到的百分比良好相关(R2＝0.996)。而且，与WV-30298(31.9％，图4b)相比，用WV-27458(53.8％)检测到更高百分比的ACTB编辑。在ACTB转录物中的其他任何地方都没有检测到编辑。
为了评估整个转录组的脱靶编辑，用Mutect2调用编辑位点。在一些实施例中，Mutect 2尤其可以提供检测低频变体的灵敏度和预过滤模拟样品和处理样品中的变体的能力。检测到的对处理样品特异的大多数变体在重复区域(例如，Alu重复区域)中，并且类似于其他报道，这些变体被滤出。在一些实施例中，所提供的技术可以指导序列特异性编辑以靶向转录物而不破坏天然编辑稳态(例如，如由Alu重复区域中鉴定的多种变体所证明的)。在应用过滤器的情况下，在WV-30298处理的样品中鉴定出178种变体，而在WV-27458处理的样品中鉴定出169种变体，它们在模拟处理的样品中未发现。这些变体是可能发生脱靶编辑的潜在位点。
大多数这些变体映射至3'-非翻译区；所有变体均具有比靶向ACTB位点低得多的LOD得分(ACT-69低40倍，WV-27458低80倍)。此外，大多数潜在脱靶编辑具有低读段覆盖度(WV-27458：编辑>10％的平均覆盖度＝45，<10％的平均覆盖度＝139；WV-30298：>10％的平均覆盖度＝43，<10％的平均覆盖度＝143)或以低百分比发生(<10％的读段)，表明WV-30298和WV-27458都引起高度特异性的编辑活性(图45)。用WV-30298(145)和WV-27458(154)检测的脱靶位点之间几乎没有重叠(24)，并且脱靶位点周围的序列与ACTB中的靶序列无关，表明脱靶编辑(如果有的话)可能不是序列依赖性的。在24个共享的脱靶位点中，大多数具有高覆盖度和低编辑百分比，表明它们是相对罕见的事件。尤其是，本文呈现的数据证实所提供的技术可以提供靶腺苷的高度特异性的A至I编辑。
实例61.所提供的技术可以提供多重编辑。
尤其是，所提供的技术可以同时提供对系统中若干靶的编辑。下面描述实例。
在一个实验中，在多重条件下编辑原代人肝细胞中三种基因的转录物。如所展示的，在转染后实现了所有三种基因的转录物的有效编辑。在一些实施例中，与分离的情况相比，在多重条件下EEF1A转录物的编辑可减少(图46(a)，韦尔奇t检验，P<0.05)，但仍可实现相当高的编辑水平。当使用包含GalNAc的寡核苷酸时，也实现了多重编辑(图46(b))。尤其是，这些数据展示了所提供的技术可以提供有效的多重编辑，在本实例中的一些情况下，在没有外源性ADAR的情况下提供有效的多重编辑。
实例62.所提供的动物模型证实了体内编辑活性。
如本文所述，可利用多种技术来评估所提供的技术。尤其是，本实例以实例描述了某些这样的有用技术。本领域技术人员理解，根据本披露，可以调节多种参数、条件等以评估所提供的技术，例如靶向多种腺苷的寡核苷酸组合物。
DNA表达构建体。在一些实施例中，使用双荧光素酶报告子评估RNA编辑。在一些实施例中，其由美国金斯瑞公司(Genscript)合成并基于先前的报道(例如，Cox,D.B.T.等人.RNA editing with CRISPR-Cas13[采用CRISPR-Cas13的RNA编辑].Science[科学](美国纽约)358,1019-1027,doi:10.1126/science.aaq0180(2017))。在一些实施例中，从头合成(美国金斯瑞公司)编码人ADAR1 p110(NM_001025107)、人ADAR1 p150(NM_001111)和人ADAR2(NM_001112)的质粒。
细胞系。多种细胞可用于评估所提供的技术。在一些实施例中，细胞是可商购获得的。在一些实施例中，可以根据报道的程序制备细胞。例如，ARPE-19细胞可以获自ATCC(CRL-2302，弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,Virginia))，原代人视网膜色素上皮细胞(RPE)获自龙沙公司(目录号00194987，瑞士巴塞尔)，原代人肝细胞获自赛默飞世尔公司(目录号HMCPUS，美国)，以及原代人支气管上皮细胞获自龙沙公司(目录号CC-2540)。
荧光素酶报告子测定。在一些实施例中，本披露提供并利用荧光素酶报告子测定来评估所提供的编辑剂，例如寡核苷酸或其组合物。下面以实例描述有用的程序。
将以每孔700,000个细胞接种在6孔皿中的293T细胞在接种后16小时用1.25μg荧光素酶报告构建体和ADAR1表达载体或ADAR2表达载体，使用5μL Lipofectamine 2000(美国赛默飞世尔公司)在OptiMEM中根据制造商的方案转染。第二天早上，用新鲜的完全培养基补充细胞。八小时后，分离细胞并在96孔板中反向转染。将寡核苷酸和Lipofectamine2000(美国赛默飞世尔公司)(0.25μL/孔)各自在单独的管中在OptiMEM中稀释到10μL的最终体积。5min后，将两种稀释液混合并温育20min，然后将它们添加到缺乏抗生素的培养基中的130μL细胞悬浮液(20,000个细胞/孔)中。48-96小时后，使用Pierce高斯或海萤荧光素酶辉光测定试剂盒(赛默飞世尔公司，目录号分别为16161和16171)测量荧光素酶活性。根据制造商的方案，使用含有分泌的荧光素酶的培养基的两个20μL等分试样来测量荧光素酶活性(每次荧光素酶测定采用20μL)。将cLuc活性归一化为来自相同孔的gLuc活性，并将所有数据标准化为模拟转染对照(无寡核苷酸)。在一些实施例中，实验作为生物重复样进行，n＝2。
siRNA和IFN-alpha(IFN-a)研究。在一些实施例中，利用此类技术来评估所提供的技术。下面以实例描述一个实验。将以每孔250,000个细胞接种在6孔皿中的ARPE-19细胞用20nM的适当siRNA和7μL的Lipofectamine RNAiMAX(生命科技公司(Life Technologies))转染。在单独的管中，将siRNA和RNAiMAX各自稀释到OptiMEM中达到250μL的最终体积。5min后，将两种稀释液混合并温育20min，然后在1.5mL完全培养基中均匀分配至ARPE-19细胞。24h后，分离细胞并接种到96孔板(12,000个细胞/孔)中用于寡核苷酸转染或接种到6孔板中以验证蛋白敲低。16h后，用寡核苷酸转染96孔板中的细胞。将寡核苷酸和LipofectamineRNAiMAX(0.3μL/孔)在单独的管中稀释到OptiMEM中达到10μL的最佳终体积。5min后，将两种稀释液混合并温育20min，然后将它们添加到100μL新鲜补充培养基中的细胞中。在寡核苷酸转染时，将IFN-a(密理博公司(Millipore)，目录号IF007)以6000U/mL的最终浓度添加到培养基中。siRNA来自赛默飞世尔公司并靶向ADAR1(两种同种型；ADAR1沉默子选择siRNA，目录号4390824s1008)、ADAR1 p150(定制沉默子选择siRNA，有义链：5'-GCCUCGCGGGCGCAAUGAAtt；反义链：5'-UUCAUUGCGCCCGCGAGGCat)、ADAR2(ADARB1沉默子选择siRNA，目录号4392420s1012)，或非靶向对照(沉默子选择阴性对照1号，目录号4390843)。
蛋白印迹。在一些实施例中，使用蛋白印迹。本领域技术人员理解，根据本披露可以利用多种方案。在一个实施例中，对于蛋白印迹，将细胞用PBS洗涤一次，并在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液(赛默公司，目录号89900)中裂解。将澄清的裂解物转移到新的管中，并使用BCA蛋白测定试剂盒根据制造商的方案定量总蛋白。通过在具有还原剂的XT样品缓冲液中在90℃下加热5min使样品变性。将每个样品7μg蛋白加载到Criterion XT 4％-12％蛋白凝胶上并用XT MOPS运行缓冲液解析。使用BioRad Trans-Blot Turbo系统将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。将膜在5％牛奶溶液中封闭1小时，并在4℃下用在TBST中1:1,000稀释的一抗(抗ADAR1：细胞信号公司(Cell Signaling)目录号1417；抗粘着斑蛋白：英杰公司(Invitrogen)目录号MA5-11690)染色过夜。洗涤膜并在室温下与在PBS、5％脱脂奶中1:10,000稀释的二抗(分别为Donkey抗兔-IRDye 800CW和山羊抗小鼠-IRDye680LT)温育1h。洗涤后，在ODYSSEY CLx成像系统上观察膜。用Image Studio Lite 5.2版软件分析蛋白条带的强度。
内源性RNA编辑测定。在一些实施例中，利用内源性RNA编辑测定来评估所提供的技术。这里以实例描述有用的方案。为了评估转染条件下内源性转录物的编辑，将原代肝细胞(每个孔10,000-20,000个细胞)接种在96孔板中。16h后，使用Lipofectamine RNAiMax(0.3μL/孔)转染寡核苷酸(50nM最终浓度)。将寡核苷酸和Lipofectamine在单独的管中稀释到10μL的最终体积。5min后，将两种稀释液混合并再温育20min，然后将它们添加到100μL培养基中的细胞中。48小时后收获RNA。对于GalNAc介导的摄取，在接种肝细胞(每孔10,000个肝细胞；96孔板)时，将寡核苷酸以所需的浓度添加到培养基中。对于裸摄取，将NHBE细胞接种在96孔板中(每孔5,000个细胞)，16h后用含有所需浓度的寡核苷酸的新鲜培养基处理细胞。48h后收集RNA，例如使用下述方案。
在一些实施例中，使用Promega SV 96总RNA分离系统根据制造商的方案从细胞收获RNA。以40-50μL的最终体积洗脱RNA。将9μL RNA用于使用高容量cDNA反转录试剂盒(生命科技公司，目录号4374967)在20μL反应中根据制造商方案生成cDNA。将2μL cDNA用于使用Phusion高保真DNA聚合酶(赛默飞世尔公司，目录号F530)和转录物适当的引物扩增感兴趣的转录物。某些有用的引物以实例列举如下；本领域技术人员理解其他引物可用于相同和其他基因。将PCR产物使用AMPure XP珠(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))纯化，并通过桑格测序(美国金唯智公司)分析。使用EditR软件(https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/)对A至I编辑进行定量。
人类
转录物 正向引物 反向引物
ACTB 5‘-CGAGCATCCCCCAAAGTTCAC-3’ 5‘-CACTCCCAGGGAGACCAAAAGC-3’
EEF1A1 5‘-GGTGTTGGTGAATTTGAAGCTGG-3’ 5‘-GTCAGTTGGACGAGTTGGTGG-3’
EIF4H 5‘-CCCCTACACAGCATACGTAGG-3’ 5‘-CCTTTTCTGAATCCAAAGCCACC-3’
HSP90B1 5‘-CGCTGATCAGAGACATGCTTCG-3’ 5‘-CTTCTTCATCTGTTCCCACATCC-3’
SRSF1 5‘-TCCTAACATCTACATTCCCTTCG-3’ 5‘-CTAAGCACTGTGACAAATTAGCC-3’
UGP2 5‘-ACAGAAGCTTGGTACCCTCC-3’ 5‘-TGTGCTTTTGGCACTTGAGC-3’
小鼠
转录物 正向引物 反向引物
UGP2 CCTCCAGGGCATGGAGATATC CCATGTCAATGGCATTCTGTTCC
EEF1A1 CACCGAGCCACCATACAGTC GAACACCAGTCTCCACTCGG
SRSF1 CTACATTCCCCTCATGTCTTTGG GATCTGATCCTCCTCAATCCTCC
对转录组测序以评估编辑特异性。在一些实施例中，利用转录组测序来评估特异性。下面以实例描述有用的方案：
寡核苷酸处理和RNA收获。对于脱靶编辑分析，将原代人肝细胞接种在6孔板中并如上所述用寡核苷酸组合物(1μM最终浓度)处理。48h后，将细胞用PBS洗涤并收集在每孔1mL Trizol中。向每个样品中添加200μL氯仿，充分混合并温育10min，然后以13,000g离心10min。将水相转移至Promega SV 96总RNA分离系统柱，并根据制造商的方案提取RNA。每个生物重复样使用2个孔以确保足够的RNA质量和数量。
总RNA被核糖体耗尽，并产生了链特异性文库(美国金唯智公司)。用IlluminaNovaSeq平台(美国加利福利亚州圣地亚哥的依诺米那公司(Illumina,San Diego,CA,USA))对每个样品的50M读段(2×150bp)进行测序。使用BBTools的BB净化(BBDecontamination)，用Kmers(BBDuk)修剪(https://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/bb-tools-user-guide/)移除适配子序列。在变体调用之前，使用用于调用RNA测序数据中的变体的GATK最佳实践(https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035531192-RNAse q-short-variant-discovery-SNPs-Indels-)处理读段。简言之，使用STAR比对器两遍程序(STAR aligner 2-pass)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.26/)将经修剪的读段与基因组组装GRCh38进行比对。将Picard'sAddOrReplaceReadGroups用于更改模拟样品和处理样品的组名，并将Picard's MarkDuplicates用于移除PCR重复读段。将GATK'sSplitNCigar和BaseRecalbiatrion用于格式化内含子上的RNA读段，并用于检测在文库制备期间可能出现的任何系统偏倚。对于变体调用，使用Mutect2来检测处理样品所特有的变体。对于每次比较，所有三个处理重复样与肿瘤样品等同，三个模拟复重复样与正常样品等同。在FilterMutectCalls之后，仅保留通过的变体。将TLOD用于确定检测到的变体的显著性。为了过滤已知的ADAR编辑位点，从Mutect2输出中过滤Alu重复区域。Alu重复区域取自UCSC表浏览器(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables)。删除编辑<5％的变体。使用Annovar注释剩余的变体。
统计。根据本披露可以利用多种统计方法。在一些实施例中，使用以下统计方法。所有统计分析和绘图均在R计算环境(v 3.6.0)和KNIME(康斯坦茨信息挖掘工具(KonstanzInformation Miner))平台(v 4.1.3)中生成。对于所有统计比较，假定不等方差。将双尾韦尔奇t检验和韦尔奇单向方差分析分别用于比较一个因素的两个平均值和多个平均值。对于双因素分析，使用car R软件包(v 3.0-7)进行经white调整的双向方差分析以校正不等方差。在方差分析之后，当适用时，使用multcomp R软件包(v 1.4-13)进行双尾成对比较和Dunnett事后比较，其中通过单步法经由多变量t分布(R软件包mvtnorm，v1.1-0)针对多个假设调整P值，并使用稳健HC3协方差估计来调整异方差性(R软件包sandwich，v 2.5-1)。对于剂量反应曲线，拟合三参数对数逻辑函数，并使用R软件包drc(v 3.0-1)计算绝对EC50值。使用R软件包ggplot2(v.3.3.0)生成其余的图。
经工程化以表达人ADAR1的小鼠的产生。可利用多种技术产生表达人ADAR1的工程化小鼠。例如，在US US10314297B2中描述了某些有用的技术。下面描述一个实例。
合成了人ADAR-1同种型p110(例如，转录变体4)多核苷酸并通过桑格测序来证实。还合成了人ADAR-1同种型p150(转录变体1)多核苷酸并通过桑格测序来证实。将片段用限制酶消化并连接到靶向载体中。本领域技术人员理解可以使用多种载体。在一些实施例中，载体包含选择标记(例如，氨苄青霉素抗性阳性选择标记)、复制起点，以及以5'至3'顺序包含：5'(又名“左”)同源臂、腺病毒衍生的剪接受体、KOZAK序列、感兴趣的编码序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号和3'(又名“右”)同源臂。下文以实例提供某些序列；也可以将其他序列用于相同目的：
5'同源臂：
GGAAGAGTCCTGACCCAGGGAAGACATTAAAAAGGTAGTGGGGTCGACTAGATGAAGGAGAGCCTTTCTCTCTGGGCAAGAGCGGTGCAATGGTGTGTAAAGGTAGCTGAGAAGACGAAAAGGGCAAGCATCTTCCTGCTACCAGGCTGGGGAGGCCCAGGCCCACGACCCCGAGGAGAGGGAACGCAGGGAGACTGAGGTGACCCTTCTTTCCCCCGGGGCCCGGTCGTGTGGTTCGGTGTCTCTTTTCTGTTGGACCCTTACCTTGACCCAGGCGCTGCCGGGGCCTGGGCCCGGGCTGCGGCGCACGGCACTCCCGGGAGGCAGCGAGACTCGAGTTAGGCCCAACGCGGCGCCACGGCGTTTCCTGGCCGGGAATGGCCCGTACCCGTGAGGTGGGGGTGGGGGGCAGAAAAGGCGGAGCGAGCCCGAGGCGGGGAGGGGGAGGGCCAGGGGCGGAGGGGGCCGGCACTACTGTGTTGGCGGACTGGCGGGACTAGGGCTGCGTGAGTCTCTGAGCGCAGGCGGGCGGCGGCCGCCCCTCCCCCGGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCTCACTCAGCCCGCTGCCCGAGCGGAAACGCCACTGACCGCACGGGGATTCCCAGTGCCGGCGCCAGGGGCACGCGGGACACGCCCCCTCCCGCCGCGCCATTGGCCTCTCCGCCCACCGCCCCACACTTATTGGCCGGTGCGCCGCCAATCAGCGGAGGCTGCCGGGGCCGCCTAAAGAAGAGGCTGTGCTTTGGGGCTCCGGCTCCTCAGAGAGCCTCGGCTAGGTAGGGGATCGGGACTCTGGCGGGAGGGCGGCTTGGTGCGTTTGCGGGGATGGGCGGCCGCGGCAGGCCCTCCGAGCGTGGTGGAGCCGTTCTGTGAGACAGCCGGGTACGAGTCGTGACGCTGGAAGGGGCAAGCGGGTGGTGGGCAGGAATGCGGTCCGCCCTGCAGCAACCGGAGGGGGAGGGAGAAGGGAGCGGAAAAGTCTCCACCGGACGCGGCCATGGCTCGGGGGGGGGGGGGCAGCGGAGGAGCGCTTCCGGCCGACGTCTCGTCGCTGATTGGCTTCTTTTCCTCCCGCCGTGTGTGAAAACACAAATGGCGTGTTTTGGTTGGCGTAAGGCGCCTGTCAGTTAACGGCAGCCGGAGTGCGCAGCCGCCGGCAGCCTCGCTCTGCCCACTGGGTGGGGCGGGAGGTAGGTGGGGTGAGGCGAGCTGGACGTGCGGGCGCGGTCGGCCTCTGGCGGGGCGGGGGAGGGGAGGGAGGGTCAGCGAAAGTAGCTCGCGCGCGAGCGGCCGCCCACCCTCCCCTTCCTCTGGGGGAGTCGTTTTACCCGCCGCCGGCCGGGCCTCGTCGTCTGATTGGCTCTCGGGGCCCAGAAAACTGGCCCTTGCCATTGGCTCGTGTTCGTGCAAGTTGAGTCCATCCGCCGGCCAGCGGGGGCGGCGAGGAGGCGCTCCCAGGTTCCGGCCCTCCCCTCGGCCCCGCGCCGCAGAGTCTGGCCGCGCGCCCCTGCGCAACGTGGCAGGAAGCGCGCGCTGGGGGCGGGGACGGGCAGTAGGGCTGAGCGGCTGCGGGGCGGGTGCAAGCACGTTTCCGACTTGAGTTGCCTCAAGAGGGGCGTGCTGAGCCAGACCTCCATCGCGCACTCCGGGGAGTGGAGGGAAGGAGCGAGGGCTCAGTTGGGCTGTTTTGGAGGCAGGAAGCACTTGCTCTCCCAAAGTCGCTCTGAGTTGTTATCAGTAAGGGAGCTGCAGTGGAGTAGGCGGGGAGAAGGCCGCACCCTTCTC
剪接受体：
gtgacctgcacgtctagggcgcagtagtccagggtttccttgatgatgtcatacttatcctgtcccttttttttccacagctcgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagt
人ADAR1 p110：
ATGGCCGAGATCAAGGAGAAAATCTGCGACTATCTCTTCAATGTGTCTGACTCCTCTGCCCTGAATTTGGCTAAAAATATTGGCCTTACCAAGGCCCGAGATATAAATGCTGTGCTAATTGACATGGAAAGGCAGGGGGATGTCTATAGACAAGGGACAACCCCTCCCATATGGCATTTGACAGACAAGAAGCGAGAGAGGATGCAAATCAAGAGAAATACGAACAGTGTTCCTGAAACCGCTCCAGCTGCAATCCCTGAGACCAAAAGAAACGCAGAGTTCCTCACCTGTAATATACCCACATCAAATGCCTCAAATAACATGGTAACCACAGAAAAAGTGGAGAATGGGCAGGAACCTGTCATAAAGTTAGAAAACAGGCAAGAGGCCAGACCAGAACCAGCAAGACTGAAACCACCTGTTCATTACAATGGCCCCTCAAAAGCAGGGTATGTTGACTTTGAAAATGGCCAGTGGGCCACAGATGACATCCCAGATGACTTGAATAGTATCCGCGCAGCACCAGGTGAGTTTCGAGCCATCATGGAGATGCCCTCCTTCTACAGTCATGGCTTGCCACGGTGTTCACCCTACAAGAAACTGACAGAGTGCCAGCTGAAGAACCCCATCAGCGGGCTGTTAGAATATGCCCAGTTCGCTAGTCAAACCTGTGAGTTCAACATGATAGAGCAGAGTGGACCACCCCATGAACCTCGATTTAAATTCCAGGTTGTCATCAATGGCCGAGAGTTTCCCCCAGCTGAAGCTGGAAGCAAGAAAGTGGCCAAGCAGGATGCAGCTATGAAAGCCATGACAATTCTGCTAGAGGAAGCCAAAGCCAAGGACAGTGGAAAATCAGAAGAATCATCCCACTATTCCACAGAGAAAGAATCAGAGAAGACTGCAGAGTCCCAGACCCCCACCCCTTCAGCCACATCCTTCTTTTCTGGGAAGAGCCCCGTCACCACACTGCTTGAGTGTATGCACAAATTGGGGAACTCCTGCGAATTCCGTCTCCTGTCCAAAGAAGGCCCTGCCCATGAACCCAAGTTCCAATACTGTGTTGCAGTGGGAGCCCAAACTTTCCCCAGTGTGAGTGCTCCCAGCAAGAAAGTGGCAAAGCAGATGGCCGCAGAGGAAGCCATGAAGGCCCTGCATGGGGAGGCGACCAACTCCATGGCTTCTGATAACCAGCCTGAAGGTATGATCTCAGAGTCACTTGATAACTTGGAATCCATGATGCCCAACAAGGTCAGGAAGATTGGCGAGCTCGTGAGATACCTGAACACCAACCCTGTGGGTGGCCTTTTGGAGTACGCCCGCTCCCATGGCTTTGCTGCTGAATTCAAGTTGGTCGACCAGTCCGGACCTCCTCACGAGCCCAAGTTCGTTTACCAAGCAAAAGTTGGGGGTCGCTGGTTCCCAGCCGTCTGCGCACACAGCAAGAAGCAAGGCAAGCAGGAAGCAGCAGATGCGGCTCTCCGTGTCTTGATTGGGGAGAACGAGAAGGCAGAACGCATGGGTTTCACAGAGGTAACCCCAGTGACAGGGGCCAGTCTCAGAAGAACTATGCTCCTCCTCTCAAGGTCCCCAGAAGCACAGCCAAAGACACTCCCTCTCACTGGCAGCACCTTCCATGACCAGATAGCCATGCTGAGCCACCGGTGCTTCAACACTCTGACTAACAGCTTCCAGCCCTCCTTGCTCGGCCGCAAGATTCTGGCCGCCATCATTATGAAAAAAGACTCTGAGGACATGGGTGTCGTCGTCAGCTTGGGAACAGGGAATCGCTGTGTAAAAGGAGATTCTCTCAGCCTAAAAGGAGAAACTGTCAATGACTGCCATGCAGAAATAATCTCCCGGAGAGGCTTCATCAGGTTTCTCTACAGTGAGTTAATGAAATACAACTCCCAGACTGCGAAGGATAGTATATTTGAACCTGCTAAGGGAGGAGAAAAGCTCCAAATAAAAAAGACTGTGTCATTCCATCTGTATATCAGCACTGCTCCGTGTGGAGATGGCGCCCTCTTTGACAAGTCCTGCAGCGACCGTGCTATGGAAAGCACAGAATCCCGCCACTACCCTGTCTTCGAGAATCCCAAACAAGGAAAGCTCCGCACCAAGGTGGAGAACGGAGAAGGCACAATCCCTGTGGAATCCAGTGACATTGTGCCTACGTGGGATGGCATTCGGCTCGGGGAGAGACTCCGTACCATGTCCTGTAGTGACAAAATCCTACGCTGGAACGTGCTGGGCCTGCAAGGGGCACTGTTGACCCACTTCCTGCAGCCCATTTATCTCAAATCTGTCACATTGGGTTACCTTTTCAGCCAAGGGCATCTGACCCGTGCTATTTGCTGTCGTGTGACAAGAGATGGGAGTGCATTTGAGGATGGACTACGACATCCCTTTATTGTCAACCACCCCAAGGTTGGCAGAGTCAGCATATATGATTCCAAAAGGCAATCCGGGAAGACTAAGGAGACAAGCGTCAACTGGTGTCTGGCTGATGGCTATGACCTGGAGATCCTGGACGGTACCAGAGGCACTGTGGATGGGCCACGGAATGAATTGTCCCGGGTCTCCAAAAAGAACATTTTTCTTCTATTTAAGAAGCTCTGCTCCTTCCGTTACCGCAGGGATCTACTGAGACTCTCCTATGGTGAGGCCAAGAAAGCTGCCCGTGACTACGAGACGGCCAAGAACTACTTCAAAAAAGGCCTGAAGGATATGGGCTATGGGAACTGGATTAGCAAACCCCAGGAGGAAAAGAACTTTTATCTCTGCCCAGTATAG
人ADAR1 p150：
ATGAATCCGCGGCAGGGGTATTCCCTCAGCGGATACTACACCCATCCATTTCAAGGCTATGAGCACAGACAGCTCAGATACCAGCAGCCTGGGCCAGGATCTTCCCCCAGTAGTTTCCTGCTTAAGCAAATAGAATTTCTCAAGGGGCAGCTCCCAGAAGCACCGGTGATTGGAAAGCAGACACCGTCACTGCCACCTTCCCTCCCAGGACTCCGGCCAAGGTTTCCAGTACTACTTGCCTCCAGTACCAGAGGCAGGCAAGTGGACATCAGGGGTGTCCCCAGGGGCGTGCATCTCGGAAGTCAGGGGCTCCAGAGAGGGTTCCAGCATCCTTCACCACGTGGCAGGAGTCTGCCACAGAGAGGTGTTGATTGCCTTTCCTCACATTTCCAGGAACTGAGTATCTACCAAGATCAGGAACAAAGGATCTTAAAGTTCCTGGAAGAGCTTGGGGAAGGGAAGGCCACCACAGCACATGATCTGTCTGGGAAACTTGGGACTCCGAAGAAAGAAATCAATCGAGTTTTATACTCCCTGGCAAAGAAGGGCAAGCTACAGAAAGAGGCAGGAACACCCCCTTTGTGGAAAATCGCGGTCTCCACTCAGGCTTGGAACCAGCACAGCGGAGTGGTAAGACCAGACGGTCATAGCCAAGGAGCCCCAAACTCAGACCCGAGTTTGGAACCGGAAGACAGAAACTCCACATCTGTCTCAGAAGATCTTCTTGAGCCTTTTATTGCAGTCTCAGCTCAGGCTTGGAACCAGCACAGCGGAGTGGTAAGACCAGACAGTCATAGCCAAGGATCCCCAAACTCAGACCCAGGTTTGGAACCTGAAGACAGCAACTCCACATCTGCCTTGGAAGATCCTCTTGAGTTTTTAGACATGGCCGAGATCAAGGAGAAAATCTGCGACTATCTCTTCAATGTGTCTGACTCCTCTGCCCTGAATTTGGCTAAAAATATTGGCCTTACCAAGGCCCGAGATATAAATGCTGTGCTAATTGACATGGAAAGGCAGGGGGATGTCTATAGACAAGGGACAACCCCTCCCATATGGCATTTGACAGACAAGAAGCGAGAGAGGATGCAAATCAAGAGAAATACGAACAGTGTTCCTGAAACCGCTCCAGCTGCAATCCCTGAGACCAAAAGAAACGCAGAGTTCCTCACCTGTAATATACCCACATCAAATGCCTCAAATAACATGGTAACCACAGAAAAAGTGGAGAATGGGCAGGAACCTGTCATAAAGTTAGAAAACAGGCAAGAGGCCAGACCAGAACCAGCAAGACTGAAACCACCTGTTCATTACAATGGCCCCTCAAAAGCAGGGTATGTTGACTTTGAAAATGGCCAGTGGGCCACAGATGACATCCCAGATGACTTGAATAGTATCCGCGCAGCACCAGGTGAGTTTCGAGCCATCATGGAGATGCCCTCCTTCTACAGTCATGGCTTGCCACGGTGTTCACCCTACAAGAAACTGACAGAGTGCCAGCTGAAGAACCCCATCAGCGGGCTGTTAGAATATGCCCAGTTCGCTAGTCAAACCTGTGAGTTCAACATGATAGAGCAGAGTGGACCACCCCATGAACCTCGATTTAAATTCCAGGTTGTCATCAATGGCCGAGAGTTTCCCCCAGCTGAAGCTGGAAGCAAGAAAGTGGCCAAGCAGGATGCAGCTATGAAAGCCATGACAATTCTGCTAGAGGAAGCCAAAGCCAAGGACAGTGGAAAATCAGAAGAATCATCCCACTATTCCACAGAGAAAGAATCAGAGAAGACTGCAGAGTCCCAGACCCCCACCCCTTCAGCCACATCCTTCTTTTCTGGGAAGAGCCCCGTCACCACACTGCTTGAGTGTATGCACAAATTGGGGAACTCCTGCGAATTCCGTCTCCTGTCCAAAGAAGGCCCTGCCCATGAACCCAAGTTCCAATACTGTGTTGCAGTGGGAGCCCAAACTTTCCCCAGTGTGAGTGCTCCCAGCAAGAAAGTGGCAAAGCAGATGGCCGCAGAGGAAGCCATGAAGGCCCTGCATGGGGAGGCGACCAACTCCATGGCTTCTGATAACCAGCCTGAAGGTATGATCTCAGAGTCACTTGATAACTTGGAATCCATGATGCCCAACAAGGTCAGGAAGATTGGCGAGCTCGTGAGATACCTGAACACCAACCCTGTGGGTGGCCTTTTGGAGTACGCCCGCTCCCATGGCTTTGCTGCTGAATTCAAGTTGGTCGACCAGTCCGGACCTCCTCACGAGCCCAAGTTCGTTTACCAAGCAAAAGTTGGGGGTCGCTGGTTCCCAGCCGTCTGCGCACACAGCAAGAAGCAAGGCAAGCAGGAAGCAGCAGATGCGGCTCTCCGTGTCTTGATTGGGGAGAACGAGAAGGCAGAACGCATGGGTTTCACAGAGGTAACCCCAGTGACAGGGGCCAGTCTCAGAAGAACTATGCTCCTCCTCTCAAGGTCCCCAGAAGCACAGCCAAAGACACTCCCTCTCACTGGCAGCACCTTCCATGACCAGATAGCCATGCTGAGCCACCGGTGCTTCAACACTCTGACTAACAGCTTCCAGCCCTCCTTGCTCGGCCGCAAGATTCTGGCCGCCATCATTATGAAAAAAGACTCTGAGGACATGGGTGTCGTCGTCAGCTTGGGAACAGGGAATCGCTGTGTGAAAGGAGATTCTCTCAGCCTAAAAGGAGAAACTGTCAATGACTGCCATGCAGAAATAATCTCCCGGAGAGGCTTCATCAGGTTTCTCTACAGTGAGTTAATGAAATACAACTCCCAGACTGCGAAGGATAGTATATTTGAACCTGCTAAGGGAGGAGAAAAGCTCCAAATAAAAAAGACTGTGTCATTCCATCTGTATATCAGCACTGCTCCGTGTGGAGATGGCGCCCTCTTTGACAAGTCCTGCAGCGACCGTGCTATGGAAAGCACAGAATCCCGCCACTACCCTGTCTTCGAGAATCCCAAACAAGGAAAGCTCCGCACCAAGGTGGAGAACGGAGAAGGCACAATCCCTGTGGAATCCAGTGACATTGTGCCTACGTGGGATGGCATTCGGCTCGGGGAGAGACTCCGTACCATGTCCTGTAGTGACAAAATCCTACGCTGGAACGTGCTGGGCCTGCAAGGGGCACTGTTGACCCACTTCCTGCAGCCCATTTATCTCAAATCTGTCACATTGGGTTACCTTTTCAGCCAAGGGCATCTGACCCGTGCTATTTGCTGTCGTGTGACAAGAGATGGGAGTGCATTTGAGGATGGACTACGACATCCCTTTATTGTCAACCACCCCAAGGTTGGCAGAGTCAGCATATATGATTCCAAAAGGCAATCCGGGAAGACTAAGGAGACAAGCGTCAACTGGTGTCTGGCTGATGGCTATGACCTGGAGATCCTGGACGGTACCAGAGGCACTGTGGATGGGCCACGGAATGAATTGTCCCGGGTCTCCAAAAAGAACATTTTTCTTCTATTTAAGAAGCTCTGCTCCTTCCGTTACCGCAGGGATCTACTGAGACTCTCCTATGGTGAGGCCAAGAAAGCTGCCCGTGACTACGAGACGGCCAAGAACTACTTCAAAAAAGGCCTGAAGGATATGGGCTATGGGAACTGGATTAGCAAACCCCAGGAGGAAAAGAACTTTTATCTCTGCCCAGTATAG
土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)：
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGC
聚腺苷酸化信号：
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATGGCAGGCATGCTGGGGA
3'(又名“右”)同源臂
CGGAGGGGGGAGGGGAGTGTTGCAATACCTTTCTGGGAGTTCTCTGCTGCCTCCTGGCTTCTGAGGACCGCCCTGGGCCTGGGAGAATCCCTTCCCCCTCTTCCCTCGTGATCTGCAACTCCAGTCTTTCTAGAAGATGGGCGGGAGTCTTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAACCTGGTGTGTGGGCGTTGTCCTGCAGGGGAATTGAACAGGTGTAAAATTGGAGGGACAAGACTTCCCACAGATTTTCGGTTTTGTCGGGAAGTTTTTTAATAGGGGCAAATAAGGAAAATGGGAGGATAGGTAGTCATCTGGGGTTTTATGCAGCAAAACTACAGGTTATTATTGCTTGTGATCCGCCTCGGAGTATTTTCCATCGAGGTAGATTAAAGACATGCTCACCCGAGTTTTATACTCTCCTGCTTGAGATCCTTACTACAGTATGAAATTACAGTGTCGCGAGTTAGACTATGTAAGCAGAATTTTAATCATTTTTAAAGAGCCCAGTACTTCATATCCATTTCTCCCGCTCCTTCTGCAGCCTTATCAAAAGGTATTTTAGAACACTCATTTTAGCCCCATTTTCATTTATTATACTGGCTTATCCAACCCCTAGACAGAGCATTGGCATTTTCCCTTTCCTGATCTTAGAAGTCTGATGACTCATGAAACCAGACAGATTAGTTACATACACCACAAATCGAGGCTGTAGCTGGGGCCTCAACACTGCAGTTCTTTTATAACTCCTTAGTACACTTTTTGTTGATCCTTTGCCTTGATCCTTAATTTTCAGTGTCTATCACCTCTCCCGTCAGGTGGTGTTCCACATTTGGGCCTATTCTCAGTCCAGGGAGTTTTACAACAATAGATGTATTGAGAATCCAACCTAAAGCTTAACTTTCCACTCCCATGAATGCCTCTCTCCTTTTTCTCCATTTATAAACTGAGCTATTAACCATTAATGGTTTCCAGGTGGATGTCTCCTCCCCCAATATTACCTGATGTATCTTACATATTGCCAGGCTGATATTTTAAGACATTAAAAGGTATATTTCATTATTGAGCCACATGGTATTGATTACTGCTTACTAAAATTTTGTCATTGTACACATCTGTAAAAGGTGGTTCCTTTTGGAATGCAAAGTTCAGGTGTTTGTTGTCTTTCCTGACCTAAGGTCTTGTGAGCTTGTATTTTTTCTATTTAAGCAGTGCTTTCTCTTGGACTGGCTTGACTCATGGCATTCTACACGTTATTGCTGGTCTAAATGTGATTTTGCCAAGCTTCTTCAGGACCTATAATTTTGCTTGACTTGTAGCCAAACACAAGTAAAATGATTAAGCAACAAATGTATTTGTGAAGCTTGGTTTTTAGGTTGTTGTGTTGTGTGTGCTTGTGCTCTATAATAATACTATCCAGGGGCTGGAGAGGTGGCTCGGAGTTCAAGAGCACAGACTGCTCTTCCAGAAGTCCTGAGTTCAATTCCCAGCAACCACATGGTGGCTCACAACCATCTGTAATGGGATCTGATGCCCTCTTCTGGTGTGTCTGAAGACCACAAGTGTATTCACATTAAATAAATAAATCCTCCTTCTTCTTCTTTTTTTTTTTTTTAAAGAGAATACTGTCTCCAGTAGAATTTACTGAAGTAATGAAATACTTTGTGTTTGTTCCAATATGGTAGCCAATAATCAAATTACTCTTTAAGCACTGGAAATGTTACCAAGGAACTAATTTTTATTTGAAGTGTAACTGTGGACAGAGGAGCCATAACTGCAGACT
在一些实施例中，将载体繁殖和线性化以提供用于注射的多核苷酸。
根据本披露可以使用多种技术将编码ADAR1多肽或其特征性部分的多核苷酸导入基因组。在一些实施例中，使用可商购获得的极致基因组编辑(Extreme Genome Editing，EGETM)系统。将多核苷酸注射到受精卵中后，将受精卵转移到代孕母体中。在一些实施例中，通过PCR和桑格测序对幼仔进行基因型分析，以鉴定和证实感兴趣的多核苷酸的插入。
使用根据本披露的可用方法，利用鉴定的初始幼仔建立感兴趣的多核苷酸的稳定种系传播。例如，在一些实施例中，将对于huADAR1 p110或p150插入而言是杂合的初始幼仔与C57BL/6J小鼠杂交以产生稳定的F1后代。在一个杂交中，将WT雄性C57BL/6J动物与证实的等位基因携带者雌性交配，并使用PCR对所产生的幼仔进行基因型分析。在另一个杂交中，将许多WT雌性C57BL/6J与证实的等位基因携带者雄性交配，并使用PCR对所产生的幼仔进行基因型分析以证实插入。另外通过DNA印迹基因型分析来评估这些F1动物以证实感兴趣的多核苷酸(例如，编码huADAR1 p110的多核苷酸)的存在。根据本披露可通过标准育种技术产生纯合的工程化动物。例如，将包含其序列编码人ADAR1 p110的多核苷酸的杂合动物交配以产生多窝幼仔，最初可获得的基因型分析数据表明存在多个WT、多个杂合子和多个纯合子。通过蛋白印迹证实所导入的多核苷酸在多种组织中的表达。例如，证实了人ADAR1 p110在肺、肝细胞、小脑、脑桥/髓质、皮质和中脑中的表达，并且在多种情况下以与原代人类细胞例如人肝细胞(对于肝细胞而言)和人iCell神经元(对于神经元组织而言)相似的水平表达。
实例63.用于制备所提供的化合物(包括多种寡核苷酸)的某些技术。
如本文所述，本披露提供了用于制备所提供的化合物(包括多种寡核苷酸)及其组合物的多种技术。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸中的一个或多个或所有核苷酸间键联是手性控制的。在一些实施例中，所提供的化合物是手性控制的。在一些实施例中，所提供的化合物是手性纯的。下文作为实例描述了某些有用的化合物的制备。
(2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(2,6-二氧代-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺的合成
Figure BDA0003580200980005691
向干燥的3-[(2R,4R,5R)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-羟基-四氢呋喃-2-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮(476.5mg，0.90mmol)在THF(6mL)中的溶液中添加三乙胺(0.50mL，3.59mmol)。冷却至0℃。向澄清溶液中滴加2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(0.24mL，1.08mmol)。将所得的白色浆液在0℃下继续搅拌1h，然后在室温下搅拌1h15min。TLC和LCMS显示仅形成少量产物且起始材料为主要产物。添加另外的三乙胺(0.45mL)，然后滴加另外的2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(0.22mL)。将反应混合物在室温下继续搅拌2h。TLC显示起始材料已消耗。添加三乙胺(0.6mL)，然后添加无水MgSO4(380mg)和EtOAc(10mL)。过滤混合物，浓缩澄清滤液，得到呈油脂状物质的粗产物。将粗产物通过正相柱色谱法使用10％-100％EtOAc/己烷(各流动相含有5％的三乙胺)梯度纯化，得到呈白色泡沫状的标题化合物(0.394g，60.0％产率)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ9.13(s,1H),7.50-7.43(m,2H),7.35(td,J＝7.3,1.5Hz,4H),7.27-7.19(m,2H),7.20-7.12(m,1H),6.82-6.71(m,5H),6.66(dd,J＝7.7,5.4Hz,1H),5.55(dd,J＝7.7,0.8Hz,1H),4.73-4.59(m1H),4.15-4.06(m,1H),3.83-3.67(m,7H),3.60-3.52(m,1H),3.50(ddt,J＝16.9,13.6,6.7Hz,1H),3.36-3.30(m,1H),2.85(dddd,J＝18.1,13.2,8.0,5.1Hz,1H),2.59(dt,J＝12.8,6.3Hz,1H),2.44-2.32(m,1H),2.26(dddd,J＝33.7,13.6,8.6,5.4Hz,1H),1.27(dd,J＝8.5,6.8Hz,2H),1.15(d,J＝6.8Hz,3H),1.12(d,J＝6.8Hz,6H),1.01(d,J＝6.8Hz,3H)；31PNMR(243MHz,CDCl3)δ148.45,148.33；MS(ESI),729.82[M-H]-。
3-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((1S,3S,3aS)-3-((甲基二苯基甲硅烷基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-1-基)氧基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮的合成
Figure BDA0003580200980005701
向干燥的3-[(2R,4R,5R)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-羟基-四氢呋喃-2-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮(695mg，1.31mmol)在THF(9mL)中的溶液中添加三乙胺(0.88mL，6.29mmol)。将溶液冷却至0℃。滴加[(3S,3aS)-1-氯-3a,4,5,6-四氢-3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-3-基]甲基-甲基-二苯基-硅烷(0.9574M的THF溶液，2.19mL，2.1mmol)。将所得的浑浊反应溶液在0℃下搅拌2h，然后在室温下搅拌2h。TLC和LCMS显示反应未完成。再次冷却至0℃。添加另外的三乙胺(0.274mL)，然后滴加另外的[(3S,3aS)-1-氯-3a,4,5,6-四氢-3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-3-基]甲基-甲基-二苯基-硅烷(0.9574M的THF溶液，0.684mL)。将白色浆液在0℃下继续搅拌2.5h。TLC和LCMS显示仅有少量的起始材料仍残留。用水(23μL)淬灭反应。添加无水MgSO4(313mg)。通过硅藻土过滤混合物，浓缩澄清滤液，得到呈灰白色泡沫状的粗产物。将粗产物通过正相柱色谱法使用20％-100％EtOAc/己烷(各流动相含有5％的三乙胺)梯度纯化，得到呈白色泡沫状的标题化合物(0.685g，60.1％产率)。1H NMR(600MHz,DMSO)δ11.04(s,1H),7.54-7.49(m,3H),7.49-7.45(m,2H),7.40-7.33(m,3H),7.33-7.28(m,3H),7.28-7.19(m,8H),7.19-7.16(m,1H),6.85-6.77(m,4H),6.44(dd,J＝8.7,4.2Hz,1H),5.59(d,J＝7.6Hz,1H),4.75-4.66(m,1H),4.63(dt,J＝10.2,5.3Hz,1H),3.77-3.66(m,7H),3.31-3.25(m,1H),3.25-3.19(m,1H),3.13(dd,J＝9.9,7.7Hz,1H),3.01(ddd,J＝17.9,8.6,4.5Hz,1H),2.58-2.51(m,1H),1.88-1.78(m,2H),1.77-1.71(m,1H),1.58-1.52(m,1H),1.48-1.41(m,2H),1.41-1.36(m,1H),1.12(dq,J＝13.5,11.4,10.6Hz,1H),0.58(s,3H)；31P NMR(243MHz,DMSO)δ142.16；MS(ESI),868.37[M-H]-。
1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-1,3-二氢-2H-咪唑-2-酮的合成
Figure BDA0003580200980005711
步骤1.两批：将1,3-二氢-2H-咪唑-2-酮(20g，237.88mmol，1eq.)、(NH4)2SO4(2.40g，18.16mmol，1.36mL，7.64e-2eq.)在HMDS(450mL)和DCE(150mL)中的混合物在90℃下回流2h。反应物变澄清。将两批合并用于后处理。通过蒸发从混合物中除去过量的HMDS和二氯乙烷。得到呈白色固体的2-((三甲基甲硅烷基)氧基)-1H-咪唑(74.34g，粗品)。
步骤2.两批：将2-((三甲基甲硅烷基)氧基)-1H-咪唑(37g，236.79mmol，3eq.)和(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸-5-氯-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯(30.69g，78.93mmol，1eq.)溶解于MeCN(390mL)中。在-15℃下向混合物中滴加SnCl4(4.11g，15.79mmol，1.84mL，0.2eq.)的MeCN(10mL)溶液，并将溶液在25℃下搅拌1h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:1，Rf＝0.2)指示(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸-5-氯-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯被完全消耗并且形成一个主要的新斑点。根据TLC，反应是干净的。将两批合并用于后处理：将反应混合物倒入二氯甲烷(600mL)和饱和NaHCO3溶液(400mL)中。将有机层用饱和氯化钠溶液(60mL)洗涤，用MgSO4干燥，并真空蒸发。通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝3/1至0/1)纯化粗品。纯化后，在TLC板上可以看到产物。得到呈黄色油状物的((2R,3S)-4-甲基苯甲酸-3-((4-甲基苯甲酰基)氧基)-5-(2-氧代-2,3-二氢-1H-咪唑-1-基)四氢呋喃-2-基)甲酯的混合物(25g，57.28mmol，36.29％产率)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝9.68-9.40(m,1H),8.02-7.68(m,4H),7.33-6.98(m,5H),6.56-5.41(m,4H),4.73-4.35(m,3H),2.99-2.39(m,2H),2.38-2.25(m,6H)。
步骤3.两批：将((2R,3S)-4-甲基苯甲酸-3-((4-甲基苯甲酰基)氧基)-5-(2-氧代-2,3-二氢-1H-咪唑-1-基)四氢呋喃-2-基)甲酯的混合物(12.5g，28.64mmol，1eq.)在氨(600mL)中的溶液在25℃下搅拌混合物12h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1/1，产物Rf＝0.0)指示完全消耗并且形成一个新的斑点。将两批合并用于后处理：将反应混合物减压浓缩，得到黄色油状物。没有进一步纯化。得到呈黄色油状物的1-((4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1,3-二氢-2H-咪唑-2-酮(11.47g，粗品)。LCMS：(M+H+:201.1)。
步骤4.两批：向1-((4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1,3-二氢-2H-咪唑-2-酮混合物(5.73g，28.62mmol，1eq.)在吡啶(150mL)中的溶液中添加DMTCl(11.65g，34.35mmol，1.2eq.)。将混合物在25℃搅拌12h。LCMS显示起始材料被完全消耗，检测到一个具有所需质量的主峰。将两批合并用于后处理：将所得的浑浊溶液用H2O(400mL)稀释并用EtOAc(800mL)萃取。将合并的萃取物用H2O(100mL)和盐水(150mL)洗涤。将溶液干燥(Na2SO4)、过滤并减压浓缩。通过MPLC(石油醚/乙酸乙酯＝3/1至0/1)纯化粗化合物。得到呈黄色固体的1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-1,3-二氢-2H-咪唑-2-酮(WV-NU-117)(9.5g，17.39mmol，30.38％产率，92.001％纯度)和WV-NU-117A(6.9g，12.62mmol，22.04％产率，91.885％纯度)。WV-NU-117：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝10.01(br s,1H),7.43-7.33(m,2H),7.32-7.09(m,8H),6.87(br dd,J＝1.8,8.9Hz,4H),6.41-6.29(m,2H),5.84(br t,J＝6.9Hz,1H),5.22(d,J＝4.5Hz,1H),4.17(br d,J＝3.4Hz,1H),3.85-3.76(m,1H),3.73(s,6H),3.06(br d,J＝4.9Hz,2H),2.25-2.11(m,1H),2.06-1.99(m,1H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ＝158.53,130.19,128.27,128.21,113.64,85.92,55.50；LCMS(M-H+)：501.1,纯度92.0％。WV-NU-117A：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝10.00(br s,1H),7.45-7.22(m,9H),6.90(br d,J＝8.6Hz,4H),5.86(br dd,J＝4.2,7.8Hz,1H),5.48(d,J＝4.6Hz,1H),4.13(br dd,J＝3.1,7.1Hz,1H),3.74(s,6H),3.09-2.89(m,2H),2.05-1.95(m,2H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ＝158.53,153.67,136.11,130.17,128.32,128.16,113.69,109.84,108.72,85.92,85.65,82.20,71.60,55.50；LCMS(M-H+)：501.2,纯度91.9％。
(2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(2-氧代-2,3-二氢-1H-咪唑-1-基)四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺的合成
Figure BDA0003580200980005731
在0℃下向WV-NU-117(1.8g，3.58mmol，1eq.)在DMF(20mL)中的溶液中添加5-乙基硫烷基-2H-四唑(466.23mg，3.58mmol，1eq.)和1-甲基咪唑(588.14mg，7.16mmol，571.01μL，2eq.)，然后添加3-双(二异丙基氨基)磷酰氧基丙腈(1.19g，3.94mmol，1.25mL，1.1eq.)。将混合物在0-25℃下搅拌3h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝0:1，Rf1＝0.55，Rf2＝0.50)指示WV-NU-117已消耗并且形成了三个新的斑点。通过在0℃添加饱和NaHCO3水溶液(50mL)淬灭反应混合物，并用EtOAc(20mL*4)萃取。经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩得到残余物。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/0至0/1，然后乙酸乙酯/乙腈＝10:1，5％TEA)纯化。得到呈黄色油状物的(2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(2-氧代-2,3-二氢-1H-咪唑-1-基)四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(WV-NU-117-CEP)(0.8g，1.14mmol，31.78％产率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝10.03-9.82(m,1H),7.76(s,1H),7.50-7.39(m,2H),7.36-7.28(m,5H),7.26-7.13(m,2H),6.93-6.71(m,4H),6.41-6.31(m,1H),6.26-6.20(m,1H),6.14-6.06(m,1H),4.69-4.50(m,1H),4.27-4.14(m,2H),3.83-3.72(m,6H),3.69-3.41(m,5H),3.39-3.27(m,1H),3.25-3.17(m,1H),2.76(br d,J＝1.5Hz,2H),2.66-2.56(m,1H),2.47-2.29(m,3H),1.28(dd,J＝5.8,6.5Hz,12H),1.21-1.12(m,8H),1.07(d,J＝6.8Hz,2H)；31P NMR(162MHZ,氯仿-d)δ148.47,148.26；LCMS：(M+H+)＝703.3。
1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((1S,3S,3aS)-3-((甲基二苯基甲硅烷基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-1-基)氧基)四氢呋喃-2-基)-1,3-二氢-2H-咪唑-2-酮的合成
Figure BDA0003580200980005741
将rbf中的干燥的3-[(2R,4R,5R)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-羟基-四氢呋喃-2-基]-1H-咪唑-2-酮(2.0g，3.98mmol)溶解于THF(26mL)中。向澄清溶液中添加三乙胺(3.74mL，26.86mmol)。滴加[(3S,3aS)-1-氯-3a,4,5,6-四氢-3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-3-基]甲基-甲基-二苯基-硅烷(0.96M的THF溶液，7.48mL，7.16mmol)。将所得的浑浊反应溶液在室温下搅拌2.5h。TLC和LCMS显示反应完成。添加无水MgSO4(480mg)。搅拌1min。过滤混合物，并浓缩滤液。将所得的粗产物通过正相柱色谱法使用20％-100％EtOAc/己烷(各流动相含有5％的三乙胺)梯度纯化，得到呈白色泡沫状的1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((1S,3S,3aS)-3-((甲基二苯基甲硅烷基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-1-基)氧基)四氢呋喃-2-基)-1,3-二氢-2H-咪唑-2-酮(1.59g，47.4％产率)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ9.46(s,1H),7.48(tq,J＝6.6,2.8,2.3Hz,4H),7.44-7.40(m,2H),7.30(dddd,J＝12.6,7.6,6.3,4.6Hz,10H),7.27-7.25(m,2H),7.22-7.18(m,1H),6.85-6.78(m,4H),6.30(t,J＝2.6Hz,1H),6.19(t,J＝2.6Hz,1H),6.03(dd,J＝8.2,5.8Hz,1H),4.73(dq,J＝9.2,6.0Hz,2H),3.86(q,J＝3.4Hz,1H),3.76(s,6H),3.49(ddt,J＝14.8,10.6,7.6Hz,1H),3.31-3.23(m,2H),3.14(dd,J＝10.3,3.7Hz,1H),3.04(tdd,J＝10.8,8.8,4.3Hz,1H),2.17(ddd,J＝13.4,5.8,2.7Hz,1H),2.10(ddd,J＝13.8,8.3,6.3Hz,1H),1.83(ddt,J＝12.6,7.7,3.9Hz,1H),1.68-1.62(m,1H),1.53(dd,J＝14.6,8.8Hz,1H),1.43-1.33(m,2H),1.25-1.17(m,1H),0.60(s,3H)；31P NMR(243MHz,CDCl3)δ151.32；MS(ESI),842.12[M+H]+。
(1S,3S,3aS)-1-(((2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-3-基)氧基)-3-((甲基二苯基甲硅烷基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷的合成
Figure BDA0003580200980005751
将rbf中的干燥的(2R,3R,5R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-5-[6-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基)嘌呤-9-基]四氢呋喃-3-醇(2.5g，3.82mmol)溶解于THF(26mL)中。向澄清溶液中添加三乙胺(3.59mL，25.77mmol)。滴加[(3S,3aS)-1-氯-3a,4,5,6-四氢-3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-3-基]甲基-甲基-二苯基-硅烷(0.96M的THF溶液，7.18mL，6.87mmol)。将所得的浑浊反应溶液在室温下搅拌4h。TLC和LCMS显示反应完成。过滤混合物，并浓缩滤液。将所得的粗产物通过正相柱色谱法使用10％-85％EtOAc/己烷(各流动相含有1.5％的三乙胺)梯度纯化，得到呈白色泡沫状的(1S,3S,3aS)-1-(((2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-3-基)氧基)-3-((甲基二苯基甲硅烷基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷(2.89g，76.1％产率)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.42(s,1H),7.99(s,1H),7.50-7.45(m,4H),7.41-7.37(m,2H),7.27(td,J＝5.7,4.9,1.7Hz,7H),7.25-7.21(m,2H),7.21-7.14(m,4H),6.80-6.74(m,4H),6.34(dd,J＝7.8,5.9Hz,1H),4.88(ddt,J＝8.8,5.7,2.7Hz,1H),4.79(dt,J＝9.1,5.5Hz,1H),4.73-4.67(m,2H),4.04(td,J＝4.2,2.5Hz,1H),3.76(s,6H),3.53(ddt,J＝14.8,10.6,7.7Hz,1H),3.41-3.33(m,1H),3.29(dd,J＝10.3,4.3Hz,1H),3.25(dd,J＝10.3,4.4Hz,1H),3.07(tdd,J＝10.8,8.9,4.2Hz,1H),2.54(ddd,J＝13.8,7.9,6.1Hz,1H),2.31(ddd,J＝13.5,6.0,2.7Hz,1H),1.86(tt,J＝8.8,4.5Hz,1H),1.74-1.65(m,1H),1.55(dd,J＝14.7,9.1Hz,1H),1.48-1.39(m,2H),1.33-1.21(m,3H),0.63(s,3H),0.11(s,9H)；31P NMR(243MHz,CDCl3)δ150.68；MS(ESI),994.13[M+H]+。
(1S,3S,3aS)-1-(((2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-3-基)氧基)-3-((苯基磺酰基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷的合成
Figure BDA0003580200980005761
将rbf中的干燥的(2R,3R,5R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-5-[6-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基)嘌呤-9-基]四氢呋喃-3-醇(2.5g，3.82mmol)溶解于THF(26mL)中。向澄清溶液中添加三乙胺(3.59mL，25.77mmol)。滴加(3S,3aS)-3-(苯磺酰基甲基)-1-氯-3a,4,5,6-四氢-3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷(L-PSM Cl)(0.9M的THF溶液，7.64mL，6.87mmol)。将所得的浑浊反应溶液在室温下搅拌4h 40min。TLC和LCMS显示反应完成。过滤混合物，并浓缩滤液。将所得的粗产物通过正相柱色谱法使用20％-100％EtOAc/己烷(各流动相含有5％的三乙胺)梯度纯化，得到呈白色泡沫状的(1S,3S,3aS)-1-(((2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-3-基)氧基)-3-((苯基磺酰基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷(1.51g，42.3％产率)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.44(s,1H),8.05(s,1H),7.92-7.87(m,2H),7.60-7.54(m,1H),7.48(t,J＝7.8Hz,2H),7.43-7.37(m,2H),7.31-7.28(m,3H),7.26-7.23(m,3H),7.22-7.16(m,1H),6.79(d,J＝8.7Hz,4H),6.44(dd,J＝7.8,5.9Hz,1H),5.04(q,J＝6.0Hz,1H),4.93(ddt,J＝8.8,5.8,2.6Hz,1H),4.72-4.66(m,2H),4.17(td,J＝4.4,2.4Hz,1H),3.77(s,6H),3.66(dq,J＝10.1,6.0Hz,1H),3.56-3.50(m,1H),3.48(dd,J＝14.8,7.1Hz,1H),3.37(dt,J＝14.9,5.1Hz,2H),3.31(dd,J＝10.3,4.5Hz,1H),3.18-3.09(m,1H),2.89(ddd,J＝13.7,7.9,6.0Hz,1H),2.56(ddd,J＝13.6,6.0,2.6Hz,1H),1.93-1.86(m,1H),1.79(dt,J＝11.6,8.6Hz,1H),1.69-1.64(m,1H),1.31-1.25(m,2H),1.18-1.08(m,1H),0.10(s,9H)；31P NMR(243MHz,CDCl3)δ152.58；MS(ESI),938.58[M+H]+。
N-(9-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(WV-NU-137)的合成
Figure BDA0003580200980005771
步骤1.向Na(9.99g，434.67mmol)在BnOH(391.84g，3.62mol)中的溶液，3h后，添加(2R,3S,5R)-5-(6-氨基-8-溴-9H-嘌呤-9-基)-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-醇(25g，75.73mmol)。将混合物在15℃搅拌12h。通过在0℃添加800mL HCl(1M)淬灭反应混合物，然后添加饱和NaHCO3水溶液，直到pH～9，并用EtOAc(1000mL*3)萃取，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝5/1至乙酸乙酯:甲醇＝10/1)纯化，得到呈黄色油状物的(2R,3S,5R)-5-(6-氨基-8-(苄氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-醇(35g，64.67％产率)。LCMS：(M+H+)：358.2。
步骤2.向(2R,3S,5R)-5-(6-氨基-8-(苄氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-醇(50g，139.91mmol)(通过在旋转蒸发器上与吡啶(200mL*3)共沸蒸馏而干燥)中添加HMDS(338.72g，2.10mol)。将混合物在150℃搅拌12h。将反应混合物减压浓缩以去除溶剂。得到呈黄色油状物的8-(苄氧基)-9-((2R,4S,5R)-4-((三甲基甲硅烷基)氧基)-5-(((三甲基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-胺(70.2g，粗品)，无需纯化。
步骤3.向8-(苄氧基)-9-((2R,4S,5R)-4-((三甲基甲硅烷基)氧基)-5-(((三甲基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-胺(70.2g)在吡啶(500mL)中的溶液中添加BzCl(29.50g)。将混合物在20℃下搅拌2h。添加MeOH(500mL)和水(500mL)，10min后添加NH3.H2O(250mL)，30min后添加H2O(500mL)并用EtOAc(500mL*4)萃取，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/0至0/1，然后乙酸乙酯/甲醇＝10:1)纯化，得到呈黄色固体的N-(8-(苄氧基)-9-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(36g，55.76％产率)。LCMS：(M+H+)：462.2。
步骤4.向N-(8-(苄氧基)-9-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(36g，78mmol)在THF(500mL)和MeOH(500mL)中的溶液中添加Pd/C(9g，39.01mmol，10％纯度)。将混合物在15℃下在H2(15psi)中搅拌3h。将混合物过滤，并将滤液减压浓缩，得到呈黄色固体的N-(9-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(28.9g，粗品)。LCMS：(M+H+)：372.2。
步骤5.向N-(9-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(28.9g，77.82mmol)在吡啶(300mL)中的溶液中添加DMTCl(26.37g，77.82mmol)，将混合物在15℃下搅拌12h。在0℃下通过添加水(200mL)淬灭反应混合物，并用EtOAc(300mL*3)萃取。经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩得到残余物。通过硅胶色谱法(石油醚/醋酸乙酯＝10/1，1/4，5％TEA)纯化残余物，得到呈白色固体的N-(9-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(WV-NU-137)(32g，57.75％产率)。1HNMR(400MHz,400MHz,DMSO-d6)δ＝8.38-8.24(m,1H),8.12-8.00(m,2H),7.67-7.60(m,1H),7.58-7.51(m,2H),7.38-7.33(m,2H),7.26-7.13(m,7H),6.81(dd,J＝9.0,13.3Hz,4H),6.25(t,J＝6.8Hz,1H),5.29(d,J＝4.6Hz,1H),4.56-4.49(m,1H),3.95(q,J＝4.9Hz,1H),3.71(d,J＝4.4Hz,6H),3.20-3.15(m,2H),3.08(td,J＝6.5,13.0Hz,1H),2.21-2.10(m,1H)；LCMS(M-H+)：672.2。
N-(9-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((1S,3S,3aS)-3-((甲基二苯基甲硅烷基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-1-基)氧基)四氢呋喃-2-基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺的合成
Figure BDA0003580200980005791
将rbf中的干燥的N-[9-[(2R,4R,5R)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-羟基-四氢呋喃-2-基]-8-氧代-7H-嘌呤-6-基]苯甲酰胺(4.0g，5.94mmol)溶解于THF(50mL)中。向澄清溶液中添加三乙胺(5.59mL，40.08mmol)。滴加[(3S,3aS)-1-氯-3a,4,5,6-四氢-3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-3-基]甲基-甲基-二苯基-硅烷(0.96M的THF溶液，11.16mL，10.69mmol)。将反应溶液在室温下搅拌2h。TLC显示反应完成。添加无水MgSO4(708mg)。搅拌1min。过滤混合物，并浓缩滤液。将所得的粗产物通过正相柱色谱法使用0％-100％EtOAc/己烷(各流动相含有1.5％的三乙胺)梯度纯化，得到呈白色泡沫状的N-(9-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((1S,3S,3aS)-3-((甲基二苯基甲硅烷基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-1-基)氧基)四氢呋喃-2-基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(4.45g，74.0％产率)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ9.42(s,1H),8.59(s,1H),8.17(s,1H),7.98-7.93(m,2H),7.68-7.62(m,1H),7.58-7.53(m,2H),7.53-7.46(m,4H),7.45-7.40(m,2H),7.33-7.26(m,7H),7.24-7.17(m,5H),7.16-7.11(m,1H),6.76-6.69(m,4H),6.30(dd,J＝7.3,6.1Hz,1H),5.05(ddt,J＝8.9,6.9,4.5Hz,1H),4.85(dt,J＝8.9,5.7Hz,1H),4.03(q,J＝5.0Hz,1H),3.73(d,J＝4.5Hz,6H),3.49(ddt,J＝14.6,10.6,7.6Hz,1H),3.40(ddt,J＝12.6,7.0,5.5Hz,1H),3.34(dd,J＝10.1,4.9Hz,1H),3.25(dd,J＝10.1,5.9Hz,1H),2.97(tdd,J＝10.8,8.8,4.3Hz,1H),2.83(dt,J＝13.3,6.6Hz,1H),2.08(ddd,J＝13.5,7.4,4.6Hz,1H),1.84(ddt,J＝12.2,8.5,4.3Hz,1H),1.70-1.63(m,1H),1.55(dd,J＝14.7,8.9Hz,1H),1.45-1.38(m,2H),1.30-1.20(m,1H),0.65(s,3H)；31P NMR(243MHz,CDCl3)δ148.40；MS(ESI),1013.18[M+H]+。
N-(9-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((1S,3S,3aS)-3-((苯基磺酰基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-1-基)氧基)四氢呋喃-2-基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺的合成
Figure BDA0003580200980005811
向干燥的N-[9-[(2R,4R,5R)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-羟基-四氢呋喃-2-基]-8-氧代-7H-嘌呤-6-基]苯甲酰胺(3.0g，4.45mmol)在THF(30mL)中的溶液中添加三乙胺(1.55mL，11.13mmol)。滴加(3S,3aS)-3-(苯磺酰基甲基)-1-氯-3a,4,5,6-四氢-3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷(0.9M的THF溶液，8.91mL，8.02mmol)。将所得的灰白色浆液在室温下搅拌2h。TLC和LCMS显示反应完成。用水(80μL)淬灭反应。添加无水MgSO4(1.07g)。通过硅藻土过滤混合物，浓缩滤液，得到呈灰白色泡沫状的粗产物。将粗产物通过正相柱色谱法使用20％-100％EtOAc/己烷(各流动相含有2.5％的三乙胺)梯度纯化，得到呈白色泡沫状的标题化合物(2.979g，69.9％产率)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ9.45(s,1H),8.60(s,1H),8.24(s,1H),7.97-7.92(m,2H),7.92-7.88(m,2H),7.67-7.62(m,1H),7.62-7.57(m,1H),7.57-7.48(m,4H),7.45-7.40(m,2H),7.34-7.28(m,4H),7.21(dd,J＝8.3,6.7Hz,2H),7.19-7.13(m,1H),6.79-6.72(m,4H),6.39(t,J＝6.8Hz,1H),5.09(ddt,J＝14.7,6.9,4.9Hz,2H),4.08-4.03(m,1H),3.76(s,3H),3.75(s,3H),3.69(dq,J＝9.8,5.9Hz,1H),3.52-3.42(m,2H),3.37(ddd,J＝12.2,5.4,2.4Hz,2H),3.34-3.24(m,2H),3.03(tdd,J＝10.3,8.8,4.1Hz,1H),2.30(ddd,J＝13.5,7.3,4.5Hz,1H),1.87(dt,J＝11.4,5.9Hz,1H),1.80-1.72(m,1H),1.70-1.63(m,1H),1.12(dtd,J＝11.7,10.1,8.5Hz,1H)；31P NMR(243MHz,CDCl3)δ149.85；MS(ESI),955.37[M-H]-。
N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺的合成
Figure BDA0003580200980005821
步骤1.向Na(21g，913.45mmol，21.65mL，8.43eq.)在BnOH(1000mL)中的溶液，3小时后，添加(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氨基-8-溴-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3,4-二醇(37.5g，108.34mmol，1.0eq.)。将混合物在15℃下搅拌12h。将混合物倒入冷的1NHCl(2500mL)中并用EtOAc(1500mL)萃取。向水相添加饱和NaHCO3(水溶液)直至pH>8，分离出白色滤饼，过滤并浓缩，获得粗品。得到呈白色固体的(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氨基-8-(苄氧基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3,4-二醇(80g，粗品)。LCMS：(M+H+)：374.4。
步骤2.向(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氨基-8-(苄氧基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3,4-二醇(39.0g，104.46mmol，1.0eq.)在HMDS(400mL)中的溶液中，将混合物在130℃搅拌12h。将反应混合物减压浓缩，获得残余物。得到呈棕色固体的N-(8-(苄氧基)-9-((2R,3R,4R,5R)-4-羟基-3-((三甲基甲硅烷基)氧基)-5-(((三甲基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(61.62g，粗品)。
步骤3.向N-(8-(苄氧基)-9-((2R,3R,4R,5R)-4-羟基-3-((三甲基甲硅烷基)氧基)-5-(((三甲基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(46.0g，77.98mmol，1eq.)在吡啶(460mL)中的溶液中添加苯甲酰氯(21.92g，155.96mmol，18.12mL，2.0eq.)。将混合物在20℃搅拌1h。向反应混合物中添加500mL MeOH:H2O(1:1)并在15℃下搅拌10min。然后向混合物中添加NH3。添加H2O(150mL)并在15℃下搅拌10min。然后将混合物通过200mL H2O稀释并通过800mL EtOAc(200mL*4)萃取。向混合物中添加200mL盐水并用Na2SO4干燥。然后将混合物减压浓缩，得到残余物。通过柱色谱法纯化残余物。得到呈黄色固体的N-(8-(苄氧基)-9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(33.99g，71.19mmol，91.29％产率)。LCMS：(M+H+)：478.4。
步骤4.在H2(15psi)下，向N-(8-(苄氧基)-9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(35.1g，73.51mmol，1eq.)在MeOH(1500mL)和THF(500mL)中的溶液中添加Pd/C(7.0g，10％纯度)。将混合物在20℃下搅拌1h。将反应物过滤并减压浓缩，得到残余物。残余物未经纯化且得到呈棕色固体的N-(9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(19.6g，50.60mmol，68.83％产率)。LCMS：(M+H+)：388.2。
步骤5.向N-(9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(14.8g，38.21mmol，1eq.)在吡啶(150mL)中的溶液中添加DMTCl(15.54g，45.85mmol，1.2eq.)。将混合物在20℃下搅拌2h。将反应混合物用10mL H2O稀释并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用100mL盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝100/1至0/1)纯化。得到呈棕色固体的N-(9-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(13.2g，19.14mmol，50.09％产率)。LCMS：(M+H+)：690.5。
步骤6.向N-(9-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(10.20g，14.79mmol，1eq.)在DMF(100mL)中的溶液中添加咪唑(3.02g，44.37mmol，3.00eq.)和TBSCl(2.01g，13.31mmol，1.63mL，0.9eq.)。将混合物在15℃下搅拌10h。将混合物用乙酸乙酯稀释并用NaHCO3溶液洗涤。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩得到残余物。将残余物通过柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝100/1至1/1)纯化。得到呈黄色固体的N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(3.82g，4.75mmol，32.13％产率)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝9.51(s,1H),8.57(s,1H),8.26(s,1H),8.03(s,1H),7.96(d,J＝7.5Hz,2H),7.70-7.63(m,1H),7.61-7.54(m,2H),7.48(d,J＝7.3Hz,2H),7.36(dd,J＝2.0,8.9Hz,4H),7.26-7.16(m,3H),6.78(d,J＝8.7Hz,4H),5.99(d,J＝4.6Hz,1H),5.32-5.27(m,1H),4.48(q,J＝5.5Hz,1H),4.13-4.08(m,1H),3.78(s,6H),3.46(dd,J＝3.9,10.3Hz,1H),3.32(dd,J＝5.3,10.3Hz,1H),2.70(d,J＝5.9Hz,1H),2.06(s,1H),1.58(s,2H),1.27(t,J＝7.2Hz,1H),0.89(s,9H),0.05(s,3H),-0.01(s,3H)；LCMS：(M-H+)：802.3。
N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-(((1S,3S,3aS)-3-((苯基磺酰基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-1-基)氧基)四氢呋喃-2-基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺的合成
Figure BDA0003580200980005841
向干燥的N-[9-[(2R,3S,5R)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基-4-羟基-四氢呋喃-2-基]-8-氧代-7H-嘌呤-6-基]苯甲酰胺(3.5g，4.35mmol)在THF(35mL)中的溶液中添加三乙胺(1.52mL，10.88mmol)。滴加(3S,3aS)-3-(苯磺酰基甲基)-1-氯-3a,4,5,6-四氢-3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷(0.9M的THF溶液，8.71mL，7.84mmol)。将所得的浑浊溶液在室温下搅拌3.5h。TLC和LCMS显示反应完成。用水(78μL)淬灭反应。添加无水MgSO4(1.05g)。通过硅藻土过滤混合物，浓缩滤液，得到呈灰白色泡沫状的粗产物。将粗产物通过正相柱色谱法使用20％-100％EtOAc/己烷(各流动相含有2.5％的三乙胺)梯度纯化，得到呈白色泡沫状的标题化合物(3.512g，74.2％产率)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ9.48(s,1H),8.62(s,1H),8.24(s,1H),7.96-7.92(m,2H),7.90-7.85(m,2H),7.67-7.61(m,1H),7.57(td,J＝7.2,1.2Hz,1H),7.54(t,J＝7.8Hz,2H),7.50-7.43(m,4H),7.38-7.32(m,4H),7.22(dd,J＝8.4,6.9Hz,2H),7.19-7.13(m,1H),6.79-6.72(m,4H),6.01(d,J＝5.4Hz,1H),5.33(t,J＝5.3Hz,1H),5.00(q,J＝6.2Hz,1H),4.78(dt,J＝10.8,4.7Hz,1H),4.06(q,J＝4.4Hz,1H),3.76(s,6H),3.67(dq,J＝11.4,5.8Hz,1H),3.49-3.34(m,4H),3.19(dd,J＝10.4,4.9Hz,1H),3.01(qd,J＝9.5,4.0Hz,1H),1.85(t,J＝5.8Hz,1H),1.77-1.70(m,1H),1.68-1.62(m,1H),1.16-1.06(m,1H),0.83(s,9H),0.02(s,3H),-0.09(s,3H)；31P NMR(243MHz,CDCl3)δ152.12；MS(ESI),1086.13[M-H]-。
1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-1,3-二氢-2H-苯并[d]咪唑-2-酮的合成
Figure BDA0003580200980005851
步骤1.在0℃下向1,3-二氢苯并咪唑-2-酮(30g，223.66mmol，1eq.)在THF(210mL)中的溶液中添加NaH(22.37g，559.14mmol，60％纯度，2.5eq.)。将反应物搅拌15min，然后一次性向上述反应混合物中添加(2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸-5-氯-2-(((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基酯。将所得悬浮液搅拌5h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)显示检测到产物。通过添加H2O(2000mL)淬灭反应，并用2000mL乙酸乙酯萃取两次。将有机层依次用饱和NaCl水溶液和H2O洗涤并用无水Na2SO4干燥。减压蒸发有机溶剂。通过制备型MPLC(中性条件)纯化残余物，得到呈白色泡沫状固体的((2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸-3-((4-甲基苯甲酰基)氧基)-5-(2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-1-基)四氢呋喃-2-基)甲酯(25g，粗品)。
步骤2.向((2R,3S,5R)-4-甲基苯甲酸-3-((4-甲基苯甲酰基)氧基)-5-(2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-1-基)四氢呋喃-2-基)甲酯(25g，51.39mmol，1eq.)在MeOH(250mL)中的溶液中添加NaOMe(8.33g，154.16mmol，3eq.)。将反应在25℃下搅拌12h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)显示检测到产物。向上述反应中添加NH4Cl(8.33g)。将反应混合物减压浓缩，得到呈黄色油状物的1-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1,3-二氢-2H-苯并[d]咪唑-2-酮(12.86g，粗品)。
步骤3.向1-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1,3-二氢-2H-苯并[d]咪唑-2-酮(12.86g，51.39mmol，1eq.)在吡啶(60mL)中的溶液中添加DMTrCl(19.15g，56.53mmol，1.1eq.)。将反应在25℃下搅拌5h。LCMS(产物：RT＝1.305min)显示检测到产物。将合并的萃取物用H2O(500mL)和盐水(450mL)洗涤。将溶液干燥(Na2SO4)、过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/醋酸乙酯＝10/1至0/1)纯化，得到呈黄色固体的产物1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-1,3-二氢-2H-苯并[d]咪唑-2-酮(WV-NU-136)(10.20g，18.26mmol，35.54％产率，98.95％纯度)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝10.93(s,1H),7.37(d,J＝7.1Hz,2H),7.26-7.21(m,7H),6.97(d,J＝4.0Hz,2H),6.81(t,J＝8.3Hz,4H),6.72-6.65(m,1H),6.72-6.65(m,1H),6.14(t,J＝7.1Hz,1H),5.30(d,J＝4.9Hz,1H),4.43(br dd,J＝4.0,7.3Hz,1H),3.87(brd,J＝3.1Hz,1H),3.70(d,J＝1.3Hz,6H),3.27-3.20(m,1H),3.17-3.13(m,1H),2.75-2.64(m,1H),2.01(ddd,J＝3.4,6.7,10.0Hz,1H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ＝177.55,163.23,158.43,150.01,140.76,135.02,134.93,133.64,133.26,132.97,131.85,126.59,125.56,118.35,115.20,118.34,115.20,114.13,90.71,89.86,86.72,75.60,68.98,64.97,60.23,45.37,45.16,44.95,44.54,44.74(br t,J＝41.8Hz,1C),44.12,25.98,19.30；LCMS：M+H+＝551.2；纯度：98.95％。
1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((1S,3S,3aS)-3-((甲基二苯基甲硅烷基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-1-基)氧基)四氢呋喃-2-基)-1,3-二氢-2H-苯并[d]咪唑-2-酮的合成
Figure BDA0003580200980005871
将rbf中的干燥的3-[(2R,4R,5R)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-羟基-四氢呋喃-2-基]-1H-苯并咪唑-2-酮(4.0g，7.24mmol)溶解于THF(50mL)中。向澄清溶液中添加三乙胺(5.67mL，40.72mmol)。滴加[(3S,3aS)-1-氯-3a,4,5,6-四氢-3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-3-基]甲基-甲基-二苯基-硅烷(0.96M的THF溶液，11.34mL，10.86mmol)。将所得的浑浊反应溶液在室温下搅拌2h。TLC和LCMS显示反应未完成。添加另外的三乙胺(1.13mL，8.143mmol)，然后添加另外的[(3S,3aS)-1-氯-3a,4,5,6-四氢-3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-3-基]甲基-甲基-二苯基-硅烷溶液(2.27mL，2.1714mmol)。搅拌2h。TLC和LCMS显示反应完成。添加三乙胺(5.7mL)，然后添加Na2SO4(1.54g)。搅拌5min。过滤混合物，并浓缩滤液。将所得的粗产物通过正相柱色谱法使用10％-75％EtOAc/己烷(各流动相含有5％的三乙胺)梯度纯化，得到呈白色泡沫状的1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((1S,3S,3aS)-3-((甲基二苯基甲硅烷基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-1-基)氧基)四氢呋喃-2-基)-1,3-二氢-2H-苯并[d]咪唑-2-酮(4.89g，75.7％产率)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ9.10(s,1H),7.51-7.43(m,6H),7.38-7.30(m,5H),7.29-7.16(m,8H),7.16-7.10(m,1H),7.02-6.96(m,2H),6.79-6.75(m,4H),6.58(td,J＝7.5,1.6Hz,1H),6.21(dd,J＝8.7,6.1Hz,1H),4.99(td,J＝7.6,6.6,3.3Hz,1H),4.78(dt,J＝8.8,5.7Hz,1H),3.85(p,J＝3.7Hz,1H),3.74(s,6H),3.51(ddt,J＝14.8,10.5,7.7Hz,1H),3.37-3.29(m,3H),3.03(qd,J＝10.6,4.1Hz,1H),2.56(dt,J＝13.6,8.0Hz,1H),2.06-1.99(m,1H),1.86(dtt,J＝12.1,8.0,3.2Hz,1H),1.66(ddt,J＝16.0,12.8,8.0Hz,1H),1.53(dd,J＝14.7,8.8Hz,1H),1.41(dt,J＝14.5,7.1Hz,2H),1.26-1.18(m,1H),0.61(s,3H)；31P NMR(243MHz,CDCl3)δ149.86；MS(ESI),890.27[M-H]-。
9-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮的合成
Figure BDA0003580200980005881
步骤1.向(2R,3S,5R)-5-(6-氨基-8-溴-9H-嘌呤-9-基)-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-醇(50g，151.45mmol，1eq.)在吡啶(375mL)中的溶液中添加Ac2O(46.38g，454.36mmol，42.55mL，3eq.)和DMAP(1.85g，15.15mmol，0.1eq.)。将混合物在0-15℃下搅拌3h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝0:1，Rf＝0.29)表明(2R,3S,5R)-5-(6-氨基-8-溴-9H-嘌呤-9-基)-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-醇已消耗并且形成了一个新的斑点。向反应混合物中添加H2O(200mL)并用EtOAc(150mL*3)萃取，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，获得残余物。得到呈黄色油状物的粗((2R,3S,5R)-3-乙酰氧基-5-(6-氨基-8-溴-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)乙酸甲酯(62.7g，粗品)。LCMS：(M+H+)＝414.0,416.0。
步骤2.在25℃向((2R,3S,5R)-3-乙酰氧基-5-(6-氨基-8-溴-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)乙酸甲酯(26g，62.77mmol，1eq.)在THF(520mL)中的溶液中添加t-BuONO(12.95g，125.54mmol，14.93mL，2eq.)，并在70℃搅拌3h。然后向上述反应混合物中添加t-BuONO(12.95g，125.54mmol，14.93mL，2eq.)并搅拌3h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝0:1，Rf＝0.49)表明((2R,3S,5R)-3-乙酰氧基-5-(6-氨基-8-溴-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)乙酸甲酯已消耗并且形成了三个新的斑点。将反应混合物减压浓缩以去除溶剂。通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/0至0/1)纯化粗产物(59.76g)。TLC：(石油醚:乙酸乙酯＝0:1，Rf＝0.53)。得到呈黄色固体的((2R,3S,5R)-3-乙酰氧基-5-(8-溴-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)乙酸甲酯(28g，70.14mmol，46.85％产率)。LCMS：(M+H+)＝399.1,401。
步骤3.向NaH(22.19g，554.85mmol，60％纯度，1.5eq.)在THF(184mL)中的溶液中添加BnOH(40g，369.90mmol，38.46mL，1eq.)。将混合物在0-15℃下搅拌2h。呈灰色液体的粗产物苄氧基钠(48g，粗品)不经进一步纯化即用于下一步骤。向((2R,3S,5R)-3-乙酰氧基-5-(8-溴-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)乙酸甲酯(17.9g，44.84mmol，1eq.)在THF(180mL)中的溶液中添加BnONa(35.01g，269.04mmol，32.41mL，6eq.)。将混合物在15℃搅拌12h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝0:1，Rf＝0.60)表明((2R,3S,5R)-3-乙酰氧基-5-(8-溴-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)乙酸甲酯已消耗并且形成了两个新的斑点。通过在0℃添加水(300mL)淬灭反应混合物，并用EtOAc(150mL*3)萃取，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/0至0/1，然后乙酸乙酯/甲醇＝10:1)纯化。得到呈黄色固体的(2R,3S,5R)-5-(8-(苄氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-醇(6.4g，18.69mmol，26.89％产率)。LCMS：(M+H+)＝343.0。
步骤4.向(2R,3S,5R)-5-(8-(苄氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-醇(5g，14.61mmol，1eq.)在MeOH(150mL)中的溶液中添加Pd/C(2.5g，10％纯度)。将混合物在25℃下在H2(15PSI)中搅拌3h。TLC(乙酸乙酯:甲醇＝10:1，Rf＝0.24)表明(2R,3S,5R)-5-(8-(苄氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-醇已消耗并且形成了一个新的斑点。过滤Pd/C，减压浓缩反应混合物。得到呈黄色油状物的9-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮(3.68g，粗品)。LCMS：(M+H+)＝253.2。
步骤5.向9-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮(3.68g，14.59mmol，1eq.)在吡啶(72mL)中的溶液中添加DMTrCl(5.44g，16.05mmol，1.1eq.)。将混合物在15℃搅拌12h。TLC(乙酸乙酯:甲醇＝20:1，Rf＝0.17)表明化合物5已消耗并且形成了两个新的斑点。在0℃下向反应混合物中添加H2O(70ml)，并用EtOAc(50mL*3)萃取，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/1至0/1，然后乙酸乙酯/甲醇＝10:1，5％TEA)纯化。获得呈黄色固体的化合物WV-NU-135(3.2g，5.77mmol，39.55％产率)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ＝8.38(s,1H),8.21(s,1H),7.44-7.36(m,2H),7.27(d,J＝8.3Hz,4H),7.18(s,3H),6.81-6.69(m,4H),6.37(s,1H),4.74-4.66(m,1H),3.76(d,J＝3.5Hz,6H),3.38-3.33(m,1H),3.29-3.21(m,1H),2.29-2.15(m,1H)；13C NMR(101MHz,甲醇-d4)δ＝159.99,159.93,154.55,151.59,150.98,146.62,137.45,137.43,134.14,131.37,131.27,129.35,128.59,127.66,123.54,113.93,113.90,87.54,87.31,83.08,73.24,65.66,55.71,49.70,49.27,48.85,49.07(t,J＝42.9Hz,1C),48.43,36.89,14.51；LCMS：MS-H+＝553.3。
9-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((1S,3S,3aS)-3-((甲基二苯基甲硅烷基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-1-基)氧基)四氢呋喃-2-基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮的合成
Figure BDA0003580200980005901
将rbf中的干燥的9-[(2R,4R,5R)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-羟基-四氢呋喃-2-基]-7H-嘌呤-8-酮(1.6g，2.89mmol)溶解于THF(25mL)中。向澄清溶液中添加三乙胺(2.71mL，19.47mmol)。滴加[(3S,3aS)-1-氯-3a,4,5,6-四氢-3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-3-基]甲基-甲基-二苯基-硅烷(0.96M的THF溶液，5.42mL，5.19mmol)。将所得的浑浊反应溶液在室温下搅拌4.5h。TLC和LCMS显示反应未完成。添加另外的三乙胺(0.9mL，6.47mmol)，然后滴加另外的[(3S,3aS)-1-氯-3a,4,5,6-四氢-3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-3-基]甲基-甲基-二苯基-硅烷溶液(1.8mL，1.72mmol)。搅拌1h。TLC和LCMS显示反应完成。过滤混合物，并浓缩滤液。将所得的粗产物通过正相柱色谱法使用0-50％ACN/EtOAc(各流动相含有5％的三乙胺)梯度纯化，得到呈白色泡沫状的9-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((1S,3S,3aS)-3-((甲基二苯基甲硅烷基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-1-基)氧基)四氢呋喃-2-基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮(1.21g，46.8％产率)。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ8.44(s,1H),7.94(s,1H),7.50-7.41(m,6H),7.33-7.27(m,7H),7.19(dt,J＝15.3,7.0Hz,5H),7.14-7.10(m,1H),6.72(dd,J＝9.0,2.7Hz,4H),6.29(t,J＝6.9Hz,1H),5.03(ddt,J＝10.0,7.2,3.7Hz,1H),4.82(dt,J＝8.9,5.6Hz,1H),4.02(q,J＝4.7Hz,1H),3.72(s,6H),3.51(ddt,J＝14.6,10.6,7.6Hz,1H),3.38(td,J＝11.5,10.2,5.6Hz,2H),3.19(dd,J＝10.1,5.4Hz,1H),3.05-2.94(m,2H),2.10-2.01(m,1H),1.85(dtd,J＝12.6,8.8,7.8,3.5Hz,1H),1.65(ddd,J＝16.4,12.4,8.2Hz,1H),1.54(dd,J＝14.6,9.0Hz,1H),1.41(dt,J＝14.5,5.4Hz,2H),1.30-1.22(m,1H),0.63(s,3H)；31P NMR(243MHz,CDCl3)δ149.16；MS(ESI),892.26[M-H]-。
9-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((1R,3R,3aR)-3-((苯基磺酰基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷-1-基)氧基)四氢呋喃-2-基)-1,9-二氢-6H-嘌呤-6-酮的合成
Figure BDA0003580200980005911
将干燥的DMT-dI(46.0g，82.94mmol)部分地溶解于THF(460mL)中。向白色细浆液中添加三乙胺(24.28mL，174.18mmol)。缓慢添加(3R,3aR)-1-氯-3-((苯基磺酰基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷(0.85M的THF溶液，156.13mL，132.71mmol)。将具有一些块状物的混合物在室温下搅拌2h。添加另外的THF(230mL)。继续搅拌2h。混合物变成白色浆液。LCMS显示仅剩余少量起始材料，主要是所需的产物。TLC显示起始材料很少，主要是极性较小的斑点。再搅拌2.5h。用水(1.5mL)淬灭反应。添加无水MgSO4(20g)。通过硅藻土过滤混合物，浓缩澄清滤液，得到呈白色泡沫状的粗产物。将粗产物通过正相柱色谱法纯化使用0％-45％无水MeCN/EtOAc梯度纯化，得到呈白色泡沫状的标题化合物(44.12g，63.5％产率)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ12.78(s,1H),8.01(s,1H),7.99(s,1H),7.94-7.89(m,2H),7.63-7.57(m,1H),7.51(t,J＝7.8Hz,2H),7.42-7.36(m,2H),7.35-7.27(m,4H),7.27-7.23(m,2H),7.23-7.17(m,1H),6.83-6.77(m,4H),6.37(dd,J＝7.2,6.1Hz,1H),5.10(ddd,J＝7.8,5.8,4.5Hz,1H),4.84(ddt,J＝9.1,6.2,3.2Hz,1H),4.25(q,J＝4.1Hz,1H),3.77(s,6H),3.68(dt,J＝10.0,6.1Hz,1H),3.55-3.44(m,2H),3.42-3.33(m,3H),3.20(tdd,J＝10.2,8.7,4.0Hz,1H),2.81(dt,J＝13.5,6.3Hz,1H),2.54(ddd,J＝13.6,6.1,3.3Hz,1H),1.92-1.83(m,1H),1.80(td,J＝12.0,11.2,6.2Hz,1H),1.68-1.61(m,1H),1.14(dtd,J＝11.8,10.2,8.4Hz,1H)；31P NMR(243MHz,CDCl3)δ156.35；MS(ESI),836.34[M-H]-。
(1S,3S,3aS)-1-(((2R,3S)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)氧基)-3-((苯基磺酰基)甲基)四氢-1H,3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷的合成
Figure BDA0003580200980005921
向干燥的(2R,3R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢呋喃-3-醇(15.0g，35.67mmol)在THF(150mL)中的白色浆液中加入三乙胺(26.85mL，192.63mmol)。滴加(3S,3aS)-3-(苯磺酰基甲基)-1-氯-3a,4,5,6-四氢-3H-吡咯并[1,2-c][1,3,2]氧杂氮杂磷杂环戊烷(0.9M的THF溶液，71.34mL，64.21mmol)。将灰白色浆液在室温下搅拌5h。TLC和LCMS显示反应完成。用水(642μL)淬灭反应。添加无水MgSO4(8.56g)。将混合物通过硅藻土过滤，并将滤液浓缩，得到呈灰白色油腻泡沫状的粗产物。将粗产物通过正相柱色谱法使用30％-100％DCM/己烷(各流动相含有2.5％的三乙胺)梯度纯化，得到呈微黄色至灰白色泡沫状的标题化合物(14.53g，57.9％产率)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.90-7.86(m,2H),7.58(tt,J＝7.6,1.2Hz,1H),7.48(t,J＝7.8Hz,2H),7.44(d,J＝7.6Hz,2H),7.35-7.31(m,4H),7.28(t,J＝7.7Hz,2H),7.20(tt,J＝7.3,1.4Hz,1H),6.85-6.81(m,4H),4.96(q,J＝6.0Hz,1H),4.60(ddt,J＝8.7,6.1,2.2Hz,1H),4.03(td,J＝8.2,3.0Hz,1H),3.94(ddd,J＝9.8,8.2,6.2Hz,1H),3.90(td,J＝4.6,2.2Hz,1H),3.78(s,6H),3.60(dq,J＝10.0,5.9Hz,1H),3.52-3.43(m,2H),3.35(dd,J＝14.6,5.4Hz,1H),3.11(ddd,J＝9.1,5.7,3.9Hz,2H),3.05(dd,J＝9.8,4.4Hz,1H),2.16-2.07(m,1H),2.00-1.95(m,1H),1.86(tt,J＝6.1,2.6Hz,1H),1.76(ddd,J＝18.6,13.7,7.7Hz,1H),1.63(ddt,J＝13.4,7.0,3.5Hz,1H),1.13-1.05(m,1H)；31P NMR(243MHz,CDCl3)δ152.40；MS(ESI),726.86[M+Na]+。
(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-((6-((2S,4R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((2-氰基乙氧基)(二异丙基氨基)磷烷基)氧基)吡咯烷-1-基)-6-氧代己基)氨基)-5-氧代戊基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基二乙酸酯的合成
Figure BDA0003580200980005931
步骤1.对于两批：向5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酸(35g，78.22mmol)在CH3CN(350mL)中的溶液中添加HATU(44.61g，117.34mmol)和DIEA(40.44g，312.90mmol)，然后添加6-氨基-1-((2S,4R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-基)己-1-酮(41.67g，78.22mmol)。将混合物在15℃搅拌12h。LCMS显示主峰是期望的。在0℃下向反应混合物中添加水(500mL)，并用DCM(100mL*2)萃取，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/0至0/1，然后甲醇/乙酸乙酯＝1:5，5％TEA)纯化残余物，得到呈黄色固体的(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-((6-((2S,4R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-基)-6-氧代己基)氨基)-5-氧代戊基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基二乙酸酯(122g，81.05％产率)。LCMS：(M-H+)：960.5；1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.81(d,J＝9.2Hz,1H),7.69(t,J＝5.6Hz,1H),7.35-7.15(m,9H),6.92-6.83(m,4H),5.75(s,4H),5.21(d,J＝3.2Hz,1H),5.00-4.94(m,2H),4.48(d,J＝8.4Hz,1H),4.43-4.35(m,1H),4.17-3.98(m,5H),3.94-3.77(m,1H),3.73(s,7H),3.64-3.53(m1H),3.49-3.35(m,2H),3.20-3.10(m,1H),3.07-2.93(m,3H),2.20(t,J＝7.2Hz,2H),2.10(s,3H),2.06-1.96(m,7H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.55-1.33(m,8H),1.31-1.21(m,3H)。
步骤2.向通过甲苯(61g，63.40mmol)干燥的(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-((6-((2S,4R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-基)-6-氧代己基)氨基)-5-氧代戊基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基二乙酸酯在DCM(600mL)中的溶液中添加DIEA(9.83g，76.08mmol)，然后添加3-((氯(二异丙基氨基)磷烷基)氧基)丙腈(15.01g，63.40mmol)。将混合物在15℃搅拌2h。通过在0℃添加饱和NaHCO3水溶液(1000mL)淬灭反应混合物，并用EtOAc(800mL*3)萃取，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/0至0/1，然后EtOAc/ACN＝1/0至1/1，5％TEA)纯化，得到呈白色固体的(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-((6-((2S,4R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((2-氰基乙氧基)(二异丙基氨基)膦酰基)氧基)吡咯烷-1-基)-6-氧代己基)氨基)-5-氧代戊基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基二乙酸酯(54g，36.64％产率)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.36-7.27(m,2H),7.25-7.08(m,7H),6.83-6.79(m,4H),6.31-5.98(m,2H),5.29(d,J＝2.9Hz,1H),5.11(dd,J＝3.2,11.2Hz,1H),4.69-4.58(m,1H),4.53(s,1H),4.34-4.24(m,1H),4.08(br d,J＝4.9Hz,1H),3.82(br t,J＝5.1Hz,2H),3.76-3.65(m,7H),3.57-3.30(m,5H),3.25-2.99(m,5H),2.62-2.48(m,2H),2.33-2.00(m,9H),1.94-1.90(m,3H),1.90-1.82(m,3H),1.76-1.42(m,8H),1.42-1.31(m,2H),1.14-1.02(m,12H)；31PNMR(162MHz,氯仿-d)δ＝148.07(s),147.93(s),147.64(s),147.08(s)。
实例64.所提供的技术可以在多种类型的细胞中提供编辑。
如本文所述，所提供的技术可在多种类型的细胞中提供编辑并且可利用多种递送技术(例如，裸递送、转染等)递送。尤其是，本实例提供了证实由所提供的技术提供的多种益处的结果。
例如，在一些情况下，寡核苷酸组合物(WV-37317和WV-37318)通过裸递送而递送至用细胞因子预刺激24或96h的原代人CD8+T细胞。然后在给药后4天分析ACTB mRNA编辑的量。如图48所证实的，在所有测试的剂量下均实现了稳健的编辑。在一些实施例中，96h预刺激显示出比48h预刺激更高的编辑。
寡核苷酸组合物也在多种成纤维细胞系中通过裸递送或转染进行了评估。例如，如图49所示，用所指示的寡核苷酸组合物WV-37318通过转染(50nM)或裸摄取(10μM)处理三种不同的原代人成纤维细胞系。60小时后收获RNA。通过桑格测序来测量对靶的编辑。如图49所证实的，通过转染和裸递送均实现了ACTB mRNA编辑。
如在图50中所证实的，所提供的寡核苷酸组合物还在NHP眼(视网膜)中提供离体编辑。将来自NHP的眼球新鲜解剖并且通过裸摄取用寡核苷酸组合物WV-37317处理视网膜组织。48小时后收获RNA。通过桑格测序来测量对靶的编辑。如图50所证实的，在两组实验中在NHP眼(视网膜)中均实现了离体编辑。
实例65.根据本披露，可以利用多种结构元件来提供编辑。
如本文所述，可将多种元件(例如，糖、核碱基、核苷酸间键联、立体化学、另外的化学部分等)并入根据本披露的寡核苷酸中。尤其是，本实例进一步证实，包含如本披露中所述的多种元件(包括多种修饰)的寡核苷酸可以提供多种特性和/或活性。
例如，如本实例(例如，图51中呈现的某些数据)所证实的，包含多种特征(例如，修饰、立体化学等)的组合物可以提供对被选择作为靶的SerpinA1 mRNA转录物上的多种腺苷的编辑。这些靶点表示为替代物1至4。对于每种靶腺苷，设计、制备并评估了多种寡核苷酸组合物。在一些实施例中，某些寡核苷酸彼此相差一个核苷酸。使用了多种修饰，例如，2'-F修饰的糖(在第一结构域和/或第二结构域(例如，第二子结构域和/或第三子结构域)中)、2'-OR(其中R不是-H；例如，2'-OMe)修饰的糖(例如，在第二结构域(例如，第二子结构域和/或第三子结构域)中)、硫代磷酸酯核苷酸间键联(例如，Sp手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联(例如，在第一结构域和第二结构域中(例如，在第一子结构域、第二子结构域和/或第三子结构域中)、Rp手性控制的硫代磷酸酯核苷酸间键联(例如，在第二结构域中(例如，在第一子结构域和/或第二子结构域中(例如，连接相反核苷和3'紧邻核苷)))、不带负电荷的核苷酸间键联诸如n001(例如，在第一结构域中(例如，作为从5'-末端连接前两个核苷的第一核苷酸间键联)和/或在第二结构域中(例如，作为从5'-末端连接最后两个核苷的最后核苷酸间键联)和/或作为3'紧邻核苷与其3'相邻核苷之间的键联(例如，在N-1与N-2之间；参见例如WV-39588、WV-39590等)等等))、另外的化学部分等。如例如在图51中所证实的，包含多种修饰的寡核苷酸的组合物可以提供靶编辑。还如所证实的，与靶腺苷相反的核苷可置于寡核苷酸中的多种位置(例如，在一些情况下，从3'-末端开始的位置5、6、7、8、9或更远处)。证实了不同版本的GalNAc(例如，在Mod001或L025中)可以提供递送和/或活性。如本领域技术人员所理解的以及本文描述和证实的，在编辑后，所编辑的核碱基可执行G的多种功能(并且在一些情况下，编辑可称为A至G)。
如图52中所证实的，在多种实施例中，天然RNA糖可用于所提供的寡核苷酸中，并且在一些情况下，用于与靶腺苷相反的核苷中。在一些实施例中，RNA核苷与3'紧邻I核苷一起使用。在一些实施例中，3'紧邻I核苷通过Sp不带负电荷的核苷酸间键联诸如n001与其3'紧邻核苷键合。
尤其是，图53证实了根据本披露可以在不同部分利用不同数目的不带负电荷的核苷酸间键联。将寡核苷酸组合物给予原代人肝细胞(50nM和250nM)和较低浓度(50nM、25nM、12.5nM、6.25nM；参见(c))。在一些实施例中，某些修饰模式(例如，不带负电荷的核苷酸间键联和/或其立体化学)可以提供比其他修饰模式更高的效率。图53还证实，如本文所述，在一些实施例中，可将多种长度(例如，30、31、32等)的寡核苷酸用于编辑。
在一些实施例中，如图54中所证实的，移除非互补碱基配对(例如，摇摆和/或错配)可以改善编辑效率。将寡核苷酸以指定的剂量浓度给予原代人肝细胞和NHP肝细胞。如图54中所展示的，在一些实施例中，移除摇摆(例如，在第一结构域中)改善了NHP替代位点1和2的编辑水平。在一些实施例中，错配的加入降低了人serpinA1替代位点1和2的编辑水平。在一些实施例中，观察到靶向不同替代位点(例如，1和2)的寡核苷酸可以在一种或多种浓度下在人原代肝细胞中提供相似或相同的编辑水平，而它们在NHP原代肝细胞中对相应的靶点提供更不同的编辑水平。尤其是，图56证实，在一些实施例中，移除非互补碱基、添加更多的不带负电荷的核苷酸间键联(例如，n001；在结构域1和/或结构域2中)和/或更多的2'-F修饰的糖(例如，在结构域2中)可以增加编辑水平。
如本文所述，根据本披露内容，可以使用包括经修饰的核碱基在内的多种核碱基，例如在靶点对面的位置。在一些实施例中，某些核碱基提供改善的特性和/或活性。例如，图57中的数据证实，在一些实施例中，包含多种经修饰的核碱基(或无碱基核苷)的寡核苷酸可以提供编辑。在一些实施例中，观察到包含某些碱基修饰(诸如b001A和b008U)的寡核苷酸与参考组合物相比增加了编辑活性。
在一些实施例中，所提供的寡核苷酸在包含核碱基的核苷之间包含无碱基部分。如图58所证实的，包含一个或多个无碱基单元以代替包含核碱基的核苷的多种寡核苷酸可以提供编辑活性。设计了一组寡核苷酸以靶向cLUC mRNA上的UAG。在一些实施例中，观察到在某些位置的无碱基单元提供比其他位置更高的活性。在一些实施例中，观察到在某些情况下寡核苷酸可能通过ADAR1-p110、ADAR1-p150和ADAR2提供不同的绝对编辑水平和/或相对编辑水平。
图59提供了另外的示例性数据，这些数据证实了本文提供的多种碱基修饰可用于例如第二结构域，诸如与靶点相反的位置，以提供编辑活性。设计了靶向人SerpinA1 mRNA中的PIZ突变的寡核苷酸组合物，这些组合物含有不同的碱基修饰。然后将这些寡核苷酸组合物转染到表达人SerpinA1-PIZ等位基因的ARPE细胞中。在一些实施例中，观察到某些经修饰的核碱基b001A和b002A提供更高的编辑水平。在一些实施例中，观察到错配的移除改善了编辑水平。
如本文所述，所提供的在与靶点相反的位置处包含多种核碱基(例如，经修饰的核碱基)和糖(例如，天然DNA或RNA糖)的寡核苷酸可以提供编辑活性。图60中呈现了某些证实编辑的数据。例如，将SerpinA1-PIZ靶向性寡核苷酸组合物转染到表达人SerpinA1-PIZ等位基因和ADAR1-p110或ADAR1-p150的293T细胞中。如图60中所证实的，所有寡核苷酸组合物均通过ADAR1-p110和/或ADAR1-p150提供了SerpinA1-PIZ编辑。在一些实施例中，观察到包含某些经修饰的碱基(例如，b001A)的寡核苷酸组合物提供了人ADAR1-p110和ADAR1-p150的高编辑水平。在一些实施例中，观察到在与靶腺苷相反的核苷中包含天然RNA糖的寡核苷酸组合物提供了人ADAR1-p110和ADAR1-p150的高编辑水平。在一些实施例中，观察到碱基序列完全互补的寡核苷酸的寡核苷酸组合物提供了改善的编辑水平。
图61和图62中呈现了另外的数据，证实了所提供的寡核苷酸可以通过多种递送技术提供编辑。某些SerpinA1-PIZ靶向性寡核苷酸组合物通过裸摄取或GalNAc介导的摄取以指定的剂量浓度递送至表达人SerpinA1-PIZ等位基因的小鼠原代肝细胞。如图61所证实的，通过裸摄取和GalNac介导的摄取均实现了SerpinA1-PIZ编辑。在一些实施例中，观察到在与靶腺苷相反的位点包含某些经修饰的核碱基(例如，b001A)的寡核苷酸的组合物可以提供改善的编辑。在一些实施例中，观察到例如在与靶腺苷相反的位点处包含天然RNA糖的寡核苷酸的组合物可以提供改善的编辑。在一些实施例中，观察到在与靶腺苷相反的位点包含某些经修饰的核碱基(例如，b008U)的寡核苷酸的组合物可以提供改善的编辑。
又如，图63证实了例如在所提供的寡核苷酸的结构域2中的肌苷(例如，作为与靶核苷相反的核苷的3'紧邻核苷)可以提供编辑。在一些实施例中，观察到所提供的无错配的寡核苷酸可以提供更高的编辑水平。不希望受理论的限制，注意到错配可能对相对较短的寡核苷酸的编辑的影响比对较长的寡核苷酸的编辑的影响更大。在图63的特定情况下，除了WV-30297，没有观察到其他寡核苷酸组合物的显著编辑。
尤其是，图65提供了证实可将多种核碱基和糖用于根据本披露的寡核苷酸中以提供诸如编辑的活性的另外数据。在图65中，寡核苷酸组合物靶向cLUC mRNA中的UAG。在一些实施例中，将胸腺嘧啶用zdnp代替。如图65中所证实的，在与靶点相反的位点处包含多种核碱基(例如，C、zdnp、T、U等)和多种糖(例如，天然RNA糖、天然DNA糖)，并且在其他位置处包含多种糖(例如，第一结构域和/或第二结构域中的2'-F修饰的糖(例如，5'紧邻核苷)、第二结构域中的2'-OMe修饰的糖、第二结构域中的天然DNA糖等))的寡核苷酸可以提供编辑。在一些实施例中，观察到在与靶点相反的位点处的天然RNA糖可以提供改善的编辑。在一些实施例中，观察到在与靶点相反的位点包含zdnp的寡核苷酸可以提供比T改善的编辑。
虽然本文中已描述且展示了多种实施例，但本领域普通技术人员将容易想到，用于执行本披露中所描述的功能和/或获得本披露中所描述的结果和/或一个或多个优势的多种其他方法和/或结构，并且此类变化和/或修改中的每一者均被视为包括在内。更一般而言，本领域普通技术人员将容易理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料、构型等意指实例，并且实际参数、尺寸、材料和/或构型等将取决于使用本披露的传授内容的一个或多个特定应用。本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规实验就确定本披露中所述的特定实施例的许多等效物。因此，应当理解，上述实施例仅通过实例方式呈现，并且在所附权利要求书及其等效物的范围内，所要求的技术可以按照具体描述和要求以外的方式实施。另外，如果特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法等不是相互矛盾的，则在本披露的范围内包括两个或更多个此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法等的任何组合。

Claims (81)

1.一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含：
第一结构域；以及
第二结构域，
其中：
该第一结构域包含一个或多个2′-F修饰；
该第二结构域包含一个或多个不具有2′-F修饰的糖。
2.一种包含一个或多个经修饰的糖和/或一个或多个经修饰的核苷酸间键联的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含各自独立地包含一个或多个核碱基的第一结构域和第二结构域。
3.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与系统中包含靶腺苷的靶核酸接触时，该靶核酸中的靶腺苷被修饰，并且该修饰是或包含该靶腺苷向肌苷的转化。
4.如权利要求3所述的寡核苷酸，其中该修饰由ADAR蛋白促进。
5.如权利要求4所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸具有约26-35个核碱基的长度。
6.如权利要求4所述的寡核苷酸，其中该第二结构域具有约10-50个核碱基的长度。
7.如权利要求3所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中约50％-100％的糖独立地包含2′-F修饰。
8.如权利要求6所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中约50％-100％的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联。
9.如权利要求7所述的寡核苷酸，其中该第一结构域中至少约1-50个手性核苷酸间键联是手性控制的。
10.如权利要求8所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键联。
11.如权利要求9所述的寡核苷酸，其中该第一结构域包含1、2、3、4或5个不带负电荷的核苷酸间键联。
12.如权利要求10所述的寡核苷酸，其中该第一结构域的第一核苷与第二核苷之间的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。
13.如权利要求9所述的寡核苷酸，其中该第二结构域具有约10-50个核碱基的长度。
14.如权利要求13所述的寡核苷酸，其中当该寡核苷酸与靶核酸进行互补性比对时，该第二结构域包含与靶腺苷相反的核苷。
15.如权利要求14所述的寡核苷酸，其中该相反核碱基是任选地经取代的或被保护的U，或是U的任选地经取代的或被保护的互变异构体，或是任选地经取代的或被保护的C，或是C的任选地经取代的或被保护的互变异构体，或是任选地经取代的或被保护的A，或是A的任选地经取代的或被保护的互变异构体，或是任选地经取代的或被保护的假异胞嘧啶的核碱基，或是任选地经取代的或被保护的假异胞嘧啶的核碱基的互变异构体，或是核碱基BA，其中BA是或包含环BA或其互变异构体，其中环BA是具有0-10个杂原子的任选地经取代的5-20元单环、双环或多环。
16.如权利要求15所述的寡核苷酸，其中该核碱基是BA，其中BA是或包含环BA或其互变异构体，其中环BA是具有0-10个杂原子的任选地经取代的5-20元单环、双环或多环。
17.如权利要求16所述的寡核苷酸，其中与U相比，BA与该腺苷的靶腺嘌呤具有较弱的氢键结合。
18.如权利要求16所述的寡核苷酸，其中环BA包含
Figure FDA0003580200970000031
Figure FDA0003580200970000032
或具有式BA-I、BA-I-a、BA-I-b、BA-II、BA-II-a、BA-II-b、BA-III、BA-III-a或BA-III-b的结构。
19.如权利要求14所述的寡核苷酸，其中该相反核碱基是
Figure FDA0003580200970000033
20.如权利要求14所述的寡核苷酸，其中该相反核碱基是
Figure FDA0003580200970000041
21.如权利要求14所述的寡核苷酸，其中该相反核碱基是
Figure FDA0003580200970000042
22.如权利要求14所述的寡核苷酸，其中该第二结构域中约50％-100％的糖独立地是具有不是2′-F的修饰的经修饰的糖。
23.如权利要求22所述的寡核苷酸，其中该第二结构域中约50％-100％的核苷酸间键联是经修饰的核苷酸间键联。
24.如权利要求23所述的寡核苷酸，其中每个经修饰的核苷酸间键联独立地是硫代磷酸酯核苷酸间键联或不带负电荷的核苷酸间键联。
25.如权利要求24所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键联。
26.如权利要求25所述的寡核苷酸，其中该第二结构域包含1、2、3、4或5个不带负电荷的核苷酸间键联。
27.如权利要求26所述的寡核苷酸，其中该第二结构域的最后一个核苷与倒数第二个核苷之间的核苷酸间键联是不带负电荷的核苷酸间键联。
28.如权利要求25所述的寡核苷酸，其中该第二结构域中至少50％-100％的手性核苷酸间键联是手性控制的。
29.如权利要求28所述的寡核苷酸，其中该第二结构域从5′到3′包含第一子结构域、第二子结构域和第三子结构域，或由这些结构域组成。
30.如权利要求29所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域具有约5-50个核碱基的长度。
31.如权利要求30所述的寡核苷酸，其中该第一子结构域中约50％-100％的糖独立地是具有不是2′-F的修饰的经修饰的糖。
32.如权利要求31所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域具有3个核碱基的长度。
33.如权利要求32所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域包含与靶腺苷相反的核苷。
34.如权利要求33所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域包含一个或多个天然DNA糖。
35.如权利要求34所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域包含一个或多个天然RNA糖。
36.如权利要求34所述的寡核苷酸，其中该第二子结构域包含约2′-F修饰的糖。
37.如权利要求34所述的寡核苷酸，其中该相反核苷的糖包含2′OH。
38.如权利要求34所述的寡核苷酸，其中该相反核苷的糖是天然DNA糖。
39.如权利要求34所述的寡核苷酸，其中与该相反核苷5′-相邻的核苷的糖(5′...N1N0...3′中的N1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)是天然DNA糖。
40.如权利要求34所述的寡核苷酸，其中与该相反核苷5′-相邻的核苷的糖(5′...N1N0...3′中的N1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)包含2′-F。
41.如权利要求34所述的寡核苷酸，其中与该相反核苷3′-相邻的核苷的糖(5′...N0N-1...3′中的N-1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)是天然DNA糖。
42.如权利要求34所述的寡核苷酸，其中该相反核苷的糖、与该相反核苷5′-相邻的核苷的糖(5′...N1N0...3′中的N1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)和与相反核苷3′-相邻的核苷的糖(5′...N0N-1...3′中的N-1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)各自独立地是天然DNA糖。
43.如权利要求34所述的寡核苷酸，其中该相反核苷的糖是天然DNA糖，与该相反核苷5′-相邻的核苷的糖(5′...N1N0...3′中的N1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)是2′-F修饰的糖，并且与该相反核苷3′-相邻的核苷的糖(5′...N0N-1...3′中的N-1的糖，其中当与靶比对时，N0与靶腺苷相反)是天然DNA糖。
44.如权利要求34所述的寡核苷酸，其中与靶核苷相反的核苷通过Rp硫代磷酸酯核苷酸间键联连接到其3′紧邻核苷。
45.如权利要求34所述的寡核苷酸，其中与靶核苷相反的核苷(位置0)的3′紧邻的核苷(位置-1)通过不带负电荷的核苷酸间键联连接到其3′紧邻核苷(位置-2)。
46.如权利要求34所述的寡核苷酸，其中该3′-紧邻核苷包含不是G的碱基。
47.如权利要求34所述的寡核苷酸，其中该3′-紧邻核苷包含次黄嘌呤。
48.如权利要求34所述的寡核苷酸，其中该第三子结构域具有约1-10个核碱基的长度。
49.如权利要求34所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含是或包含GalNAc或其衍生物的部分。
50.一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含如本文所述的经修饰的核碱基。
51.一种寡核苷酸，其中除了在经修饰的核苷酸间键联的位置处是具有-O5-PL(RCA)-O3-的结构的键联外，该寡核苷酸在其他方面与如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸相同，其中：
PL是P或P(＝W)；
W是O、S或WN；
RCA是或包含任选地经取代的或封端的手性助剂部分，
O5是键合到糖的5′-碳的氧，并且
O3是键合到糖的3′-碳的氧。
52.如权利要求51所述的寡核苷酸，其中在经修饰的核苷酸间键联的每个位置独立地是具有-O5-PL(W)(RCA)-O3-的结构的键联。
53.如权利要求52所述的寡核苷酸，其中每个RCA独立地是
Figure FDA0003580200970000091
其中RC1是R、-Si(R)3或-SO2R，RC2和RC3与居于它们之间的原子合在一起形成任选地经取代的3-7元饱和环或部分不饱和环，该环除了氮原子外还具有0-2个杂原子，RC4是-H或-C(O)R′。
54.如权利要求52所述的寡核苷酸，其中每个RCA独立地是
Figure FDA0003580200970000092
55.如权利要求54所述的寡核苷酸，其中RC1是-SiPh2Me。
56.如权利要求54所述的寡核苷酸，其中RC1是-SO2R，其中R是任选地经取代的苯基。
57.如权利要求1-56中任一项所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸具有约10％-100％的纯度。
58.一种药物组合物，该药物组合物包含或递送有效量的如权利要求1-56中任一项所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载剂。
59.一种包含多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中该多个寡核苷酸共享：
1)共同碱基序列，和
2)独立地在一个或多个手性核苷酸间键联(“手性控制的核苷酸间键联”)处的相同键联磷立体化学；
其中该多个寡核苷酸各自独立地是如权利要求1-56中任一项所述的寡核苷酸或其酸、碱或盐形式；或
一种包含一种或多种多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中每种多个寡核苷酸独立地共享：
1)共同碱基序列，和
2)独立地在一个或多个手性核苷酸间键联(“手性控制的核苷酸间键联”)处的相同键联磷立体化学；
其中该多个寡核苷酸各自独立地是如权利要求1-56中任一项所述的寡核苷酸或其酸、碱或盐形式；或
一种包含属于特定寡核苷酸类型的多个寡核苷酸的组合物，该多个寡核苷酸的特征在于：
a)共同碱基序列；
b)共同骨架键联模式；
c)共同骨架手性中心模式；
d)共同骨架磷修饰模式；
该组合物是手性控制的，因为该组合物相对于具有相同的共同碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物，富集该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，或在该组合物中共享该共同碱基序列的所有寡核苷酸中的非随机水平是该多个寡核苷酸；以及
其中该多个寡核苷酸各自独立地是如权利要求1-56中任一项所述的寡核苷酸或其酸、碱或盐形式。
60.一种包含多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中该多个寡核苷酸共享：
1)共同碱基序列，和
2)独立地在一个或多个手性核苷酸间键联(“手性控制的核苷酸间键联”)处的相同键联磷立体化学；
其中该共同碱基序列与核酸的一部分的碱基序列互补，该部分包含靶腺苷；或
一种包含一种或多种多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，其中每种多个寡核苷酸独立地共享：
1)共同碱基序列，和
2)独立地在一个或多个手性核苷酸间键联(“手性控制的核苷酸间键联”)处的相同键联磷立体化学；
其中每种多个寡核苷酸的该共同碱基序列独立地与核酸的一部分的碱基序列互补，该部分包含靶腺苷；或
一种包含属于特定寡核苷酸类型的多个寡核苷酸的组合物，该多个寡核苷酸的特征在于：
a)共同碱基序列；
b)共同骨架键联模式；
c)共同骨架手性中心模式；
d)共同骨架磷修饰模式；
该组合物是手性控制的，因为该组合物相对于具有相同的共同碱基序列、骨架键联模式和骨架磷修饰模式的寡核苷酸的基本上外消旋的制备物，富集该特定寡核苷酸类型的寡核苷酸，或在该组合物中共享该共同碱基序列的所有寡核苷酸中的非随机水平是该多个寡核苷酸；以及
其中该共同碱基序列与核酸的一部分的碱基序列互补，该部分包含靶腺苷。
61.如权利要求59-60中任一项所述的组合物，其中该组合物的寡核苷酸中共享该多个寡核苷酸的共同碱基序列的多个寡核苷酸的水平为约或至少约(DS)nc，其中DS为约85％-100％(例如，约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或更多)并且nc为手性控制的核苷酸间键联的数目。
62.一种亚磷酰胺，其中该亚磷酰胺的核碱基是如本文所述的核碱基或其互变异构体，其中该核碱基或其互变异构体是任选地经取代的或被保护的。
63.一种亚磷酰胺，其中核碱基是或包含环BA，其中环BA具有BA-I、BA-I-a、BA-I-b、BA-II、BA-II-a、BA-II-b、BA-III、BA-III-a、BA-III-b、BA-IV、BA-IV-a、BA-IV-b、BA-V、BA-V-a、BA-V-b或BA-VI的结构，或环BA的互变异构体，其中该核碱基是任选地经取代的或被保护的。
64.如权利要求62或63所述的亚磷酰胺，其中该亚磷酰胺具有RNS-P(OR)N(R)2的结构，其中RNS是任选地经保护的核苷部分，并且每个R如本文所述。
65.如权利要求64所述的亚磷酰胺，其中该亚磷酰胺具有RNS-P(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2的结构。
66.如权利要求62或63所述的亚磷酰胺，其中该亚磷酰胺包含手性助剂部分，其中磷键合到该手性助剂部分的氧和氮原子。
67.如权利要求62或63所述的亚磷酰胺，其中该亚磷酰胺具有
Figure FDA0003580200970000131
的结构。
68.如权利要求67所述的亚磷酰胺，其中RC1是-SiPh2Me。
69.如权利要求67所述的亚磷酰胺，其中RC1是-SO2R，其中R是任选地经取代的C1-10脂肪族基或者其中R是任选地经取代的苯基。
70.一种用于制备寡核苷酸或组合物的方法，该方法包括使寡核苷酸或核苷的5′-OH与如权利要求62-69中任一项所述的亚磷酰胺偶联。
71.如权利要求70所述的方法，其中该寡核苷酸或该组合物中的寡核苷酸包含含有2′-OH的糖。
72.一种用于表征寡核苷酸或组合物的方法，该方法包括：
将该寡核苷酸或组合物施用于包含或表达ADAR1多肽或其特征性部分，或编码ADAR1多肽或其特征性部分的多核苷酸的细胞或其群体；或
将该寡核苷酸或组合物施用于包含或表达ADAR1多肽或其特征性部分，或编码ADAR1多肽或其特征性部分的多核苷酸的非人类动物或其群体。
73.一种用于修饰靶核酸中的靶腺苷的方法，该方法包括使该靶核酸与如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸或组合物接触。
74.一种用于使靶核酸中的靶腺苷脱氨的方法，该方法包括使该靶核酸与如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸或组合物接触；或
一种用于产生特定核酸的产物、或者恢复或增加特定核酸的产物的水平的方法，该方法包括使靶核酸与如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸或组合物接触，其中该靶核酸包含靶腺苷，并且该特定核酸与该靶核酸的不同之处在于该特定核酸具有I或G而不是该靶腺苷；或
一种用于降低靶核酸的产物的水平的方法，该方法包括使靶核酸与如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸或组合物接触，其中该靶核酸包含靶腺苷；或
一种方法，该方法包括：
使如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸或组合物与样品接触，该样品包含靶核酸和腺苷脱氨酶，其中：
该寡核苷酸组合物中的一个或多个寡核苷酸的碱基序列与该靶核酸的碱基序列基本上互补；以及
该靶核酸包含靶腺苷；
其中该靶腺苷被修饰；或
一种方法，该方法包括：
1)获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；以及
2)获得靶核酸中靶腺苷的参考修饰水平，该水平是当参考寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含比该参考多个寡核苷酸更多的具有2′-F修饰的糖，更多的具有2′-OR修饰的糖，其中R不是-H，和/或更多的手性核苷酸间键联；以及
与该参考寡核苷酸组合物的寡核苷酸相比，该第一寡核苷酸组合物提供更高水平的修饰；或
一种方法，该方法包括：
获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；并且
其中靶腺苷的该第一修饰水平高于该靶腺苷的参考修饰水平，其中该参考水平是在参考寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含比该参考多个寡核苷酸更多的具有2′-F修饰的糖，更多的具有2′-OR修饰的糖，其中R不是-H，和/或更多的手性核苷酸间键联；或
一种方法，该方法包括：
1)获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；以及
2)获得靶核酸中靶腺苷的参考修饰水平，该水平是当参考寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含比该参考多个寡核苷酸更多的具有2′-F修饰的糖，更多的具有2′-OR修饰的糖，其中R不是-H，和/或更多的手性控制的手性核苷酸间键联；以及
与该参考寡核苷酸组合物的寡核苷酸相比，该第一寡核苷酸组合物提供更高水平的修饰；或
一种方法，该方法包括：
获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；并且
其中靶腺苷的该第一修饰水平高于该靶腺苷的参考修饰水平，其中该参考水平是在参考寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含比该参考多个寡核苷酸更多的具有2′-F修饰的糖，更多的具有2′-OR修饰的糖，其中R不是-H，和/或更多的手性控制的手性核苷酸间键联；或
一种方法，该方法包括：
1)获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；以及
2)获得靶核酸中靶腺苷的参考修饰水平，该水平是当参考寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含一个或多个手性控制的手性核苷酸间键联；以及
该参考多个寡核苷酸不含手性控制的手性核苷酸间键联(参考寡核苷酸组合物是“立体随机组合物”)；以及
与该参考寡核苷酸组合物的寡核苷酸相比，该第一寡核苷酸组合物提供更高水平的修饰；或
一种方法，该方法包括：
获得靶核酸中靶腺苷的第一修饰水平，该水平是当第一寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该第一寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的第一多个寡核苷酸；以及
其中靶腺苷的该第一修饰水平高于该靶腺苷的参考修饰水平，其中该参考水平是在参考寡核苷酸组合物与包含该靶核酸和腺苷脱氨酶的样品接触时观察到的，其中该参考寡核苷酸组合物包含共享相同的与该靶核酸的碱基序列基本上互补的碱基序列的参考多个寡核苷酸；
其中：
该第一多个寡核苷酸包含一个或多个手性控制的手性核苷酸间键联；以及
该参考多个寡核苷酸不含手性控制的手性核苷酸间键联(参考寡核苷酸组合物是“立体随机组合物”)。
75.如权利要求74所述的方法，其中第一寡核苷酸组合物是如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸组合物。
76.如权利要求70-75所述的方法，其中该脱氨酶是ADAR酶。
77.如权利要求76所述的方法，其中与不同于靶核酸的核酸相比，该靶核酸与病症、障碍或疾病，或所需的特性或功能的减弱，或不期望的特性或功能的增强更相关，该不同在于其在靶腺苷的位置具有I或G而不是该靶腺苷。
78.如权利要求74所述的方法，其中该靶腺苷是G至A突变。
79.一种用于预防或治疗适合G至A突变的病症、障碍或疾病的方法，该方法包括向易患或患有该病症、障碍或疾病的受试者施用有效量的如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸或组合物；或
一种用于预防或治疗与G至A突变相关联的病症、障碍或疾病的方法，该方法包括向易患或患有该病症、障碍或疾病的受试者施用有效量的如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸或组合物。
80.如权利要求79中任一项所述的方法，其中该病症、障碍或疾病适合A至G或A至I修饰。
81.如说明书或实施例1-889中任一项所述的化合物、寡核苷酸、组合物或方法。
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