WO2020083871A1 - Composes polysaccharidiques, et leur utilisation pour stimuler des reponses de defense des plantes contre les microorganismes pathogenes - Google Patents

Composes polysaccharidiques, et leur utilisation pour stimuler des reponses de defense des plantes contre les microorganismes pathogenes Download PDF

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oligogalacturonan
methylation
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David WENDEHENNE
Maud COMBIER
Benoit POINSSOT
Jérôme PELLOUX
Estelle Bonnin
Marie-Jeanne CREPEAU
Sylvain JEANDROZ
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Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Universite de Picardie Jules Verne
Institut National Superieur des Sciences Agronomiques de lAlimentation et de lEnvironnement
Universite de Bourgogne
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Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Universite de Picardie Jules Verne
Institut National Superieur des Sciences Agronomiques de lAlimentation et de lEnvironnement
Universite de Bourgogne
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H7/00—Compounds containing non-saccharide radicals linked to saccharide radicals by a carbon-to-carbon bond
    • C07H7/02—Acyclic radicals
    • C07H7/033—Uronic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products

Definitions

  • the present invention relates to novel completely demethylated oligogalacturonans having a degree of polymerization from 1 to 10, and their use for stimulating defense responses of plants against pathogenic microorganisms.
  • the present invention finds, for example, applications in the field of plant protection, of biocontrol.
  • Plant cells actually have proteins capable of recognizing molecular patterns carried by pathogens (Pogen, Pathogen-Associated Molecular Patterns) but also virulence factors produced by them.
  • Pogen Pathogen-Associated Molecular Patterns
  • This second scenario involves vegetable proteins called resistance proteins.
  • Defense reactions of the plant can therefore be induced and mimicked by the application of molecules produced by the pathogen (in particular by PAMPs) or even originating from the plant itself (molecules resulting from the degradation of the plant by the pathogen or DAMP, Damage-Associated Molecular Patterns, commonly known as SDP or elicitors). More generally, molecules mimicking plant or fungal signals can be used.
  • the elicitors are of significant biotechnological interest. It has thus been demonstrated that the application of SDP is capable of reducing the sensitivity to virulent pathogens and thus ensuring a form of protection (induced resistance). In addition, these molecules lead to an induction of resistance against a wide range of pathogens (Trouvelot et al., 2014) [1] Some of these molecules have shown real effectiveness in cultivated plots and allow the quantity of phytosanitary products to be reduced. synthesis conventionally used in the fight of cultures against diseases. Description of the invention
  • the inventors have identified new elicitor molecules of interest. These natural molecules, derived from polysaccharides originating from the wall of plants, have chemical characteristics and original properties. They have a strong phyto-protective activity under controlled conditions. They are in particular capable of inducing in the model plant Arabidopsis thaliana and in the vine (Vitis vinifera) defense responses and a phenomenon of very effective resistance to several pathogenic microorganisms. The use of these molecules will therefore make it possible to confer protection on crops in greenhouses or in the field (horticulture, vegetable crops, field crops) against cryptogamic diseases and thus reduce the use of phytosanitary products.
  • oligogalacturonans having a degree of polymerization lower than those described in the literature (Van Cutsem and Messiaen, 1994; Ferrari et al., 2007) [2, 3] and / or entering the composition of the products currently developed (eg COS-OGA developed by Fytofend) which favor longer molecules of DP between 9 and 20. More precisely, they have a degree of polymerization from 1 to 10, preferably from 4 to 10, preferably from 4 to 6, and most preferably centered on 5. Another characteristic of these new oligogalacturonans is that they are completely demethylated (DMO).
  • DMO completely demethylated
  • the present invention is the first use of this type of chemical modification of oligogalacturonans for stimulating the defenses of plants.
  • the present invention therefore relates to an oligogalacturonan of formula (I) below:
  • formula (I) having a degree of methylation of 0 and a degree of polymerization of 1 to 10, preferably from 4 to 10, preferably from 4 to 6, and most preferably centered on 5 and of the following majority formula:
  • the present invention also relates to a process for obtaining the oligogalacturonans of the invention comprising the steps of:
  • step c) preparation of a fraction of oligogalacturonans by acid autolysis of the homogalacturonane obtained in step b), followed by precipitation with ethanol.
  • Pectins are present in large quantities in the primary walls of Dicotyledons, in particular in the vegetable walls of many fruits (citrus or citrus (orange, lemon, grapefruit, etc ...), apple, etc ...] and vegetables. According to a particular embodiment of the process of the invention, the pectins are preferably obtained from citrus.
  • step c) makes it possible to obtain oligogalacturonans with different DPs.
  • precipitation in ethanol 85% for obtaining oligogalacturonans mainly from DP2 precipitation in ethanol 64% for obtaining oligogalacturonanes mainly from DP5
  • precipitation in ethanol 30% for obtaining oligogalacturonanes mainly from DP12 precipitation in 15% ethanol to obtain oligogalacturonans mainly DP28.
  • the other conditions do not vary.
  • the process of the present invention can also comprise a step of fractionation d) of the fraction of oligogalacturonans obtained in step c), by a method well known to those skilled in the art, for example, by dialysis, by high performance liquid chromatography, or exclusion chromatography, etc. in order to isolate / purify the oligogalacturonans according to their degree of polymerization ( DP).
  • a method well known to those skilled in the art for example, by dialysis, by high performance liquid chromatography, or exclusion chromatography, etc. in order to isolate / purify the oligogalacturonans according to their degree of polymerization ( DP).
  • the present invention also relates to the use of the oligogalacturonans of the invention in phyto-protection. They indeed stimulate the defense responses of plants against pathogenic microorganisms.
  • FIG. 1 represents the production of active forms of oxygen (FAO) induced in Arabidopsis thaliana by oligogalacturonans (OG) mainly of degree of polymerization 5 (DP5) with different degrees of methylation (DMO, DM30 and DM 60) (A ), and of different degrees of polymerization (DP5, DP12 and DP28) with a degree of methylation 0 (DM0) (B).
  • FAO active forms of oxygen
  • OG oligogalacturonans
  • FIG. 2 represents the estimation of the level of accumulation of the transcripts of the PER4 (A), WRKY75 (B), RLP7 (C) and PAD3 (D) genes in Arabidopsis thaliana by oligogalacturonans (OG) mainly of degree of polymerization 5 (DP5) with different degrees of methylation (DM0, DM30 and DM 60).
  • OG oligogalacturonans
  • FIG. 3 represents the estimation of the level of accumulation of the transcripts of the PER4 (A), WRKY75 (B), RLP7 (C) and PAD3 (D) genes in Arabidopsis thaliana by oligogalacturonans (OG) of different degrees of polymerization ( mainly DP5, DP12 or DP28) with a degree of methylation 0 (DM0).
  • OG oligogalacturonans
  • FIG. 4 represents the levels of protection induced in Arabidopsis thaliana by oligogalacturonans (OG) mainly of degree of polymerization 5 (DP5) with different degrees of methylation (DM0, DM30 and DM 60) with respect to Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa ).
  • OG oligogalacturonans
  • DP5 degree of polymerization 5
  • DM0, DM30 and DM 60 degrees of methylation
  • Hpa Hyaloperonospora arabidopsidis
  • FIG. 5 represents the levels of protection induced in Arabidopsis thaliana by oligogalacturonans (OG) of different degrees of polymerization (mainly DP5, DP12 or DP28) with a degree of methylation 0 (DM0) with respect to Hyaloperonospora arabidopsidis ( Hpa) (A) and Botrytis cinerea (B).
  • OG oligogalacturonans
  • DM0 degree of methylation 0
  • Hpa Hyaloperonospora arabidopsidis
  • B Botrytis cinerea
  • FIG. 7 represents the levels of protection induced in the vine (Vitis vinifera) by oligogalacturonans (OG)
  • A mainly of degree of polymerization (DP5) with different degrees of methylation (DM0, DM30 or DM60) vis-à-vis of the pathogen Plasmopara viticola (downy mildew agent)
  • B mainly of degree of polymerization 5, 12 or 28 (DP5, DP12 or DP28) with a degree of methylation 0 (DM0) vis-à-vis the pathogen Plasmopara viticola ( downy mildew agent).
  • the efficacy of DP5, DP12 and DP28 is also compared with that of sulfated laminarin (tallow lam.).
  • FIG. 8 represents the levels of protection induced in the vine (Vitis vinifera) by oligogalacturonan (OG) of degree of polymerization 5 (DP5) with a degree of methylation 0 (DM0), and by the substance of synthetic origin BION ® 50 WG, in comparison with an untreated control, against the pathogen Plasmopara viticola (agent of downy mildew).
  • OG oligogalacturonan
  • DP5 degree of polymerization 5
  • DM0 degree of methylation 0
  • oligogalacturonans of degree of polymerization mainly centered on 5 (DP5) with a degree of methylation 0 (DMO) were obtained as follows:
  • the molecules of interest were obtained from citrus pectins.
  • the pectins were treated cold (+ 4 ° C) after solubilization in water overnight at 7.5 g / L and deesterification with sodium hydroxide at pH 12 for 24 h. The pH was then lowered to pH 4.5 by adding 1N hydrochloric acid. The solution was concentrated twice and then precipitated with ethanol (final concentration 72%) at 4 ° C. The precipitate was washed with 72% ethanol and dried by exchange of solvents. The yield of deesterified pectins was of the order of 94%.
  • the de-esterified pectins were dissolved in water at 10 g / L overnight.
  • the solution was acidified by adding hydrochloric acid to a final concentration of 0.1 N and kept at 80 ° C for 72 h.
  • the homogalacturonan thus isolated precipitated.
  • the precipitate was washed with 0.1 N hydrochloric acid and then with water, then dried by exchange of solvents. The expected yield was around 55% on the initial pectin.
  • the homogalacturonan obtained was dissolved in water at 10 g / L and subjected to autolysis while maintaining it at a temperature of 100 ° C for 24 h.
  • the soluble fraction was concentrated and precipitated in ethanol (EtOH) 64% at 4 ° C. After recovery of the precipitate in water and dialysis, the expected yield was around 25% on homogalacturonan, or around 14% on the initial pectin.
  • step c) The ethanol precipitation conditions, as described above in step c) were adjusted to vary the majority DP of the fraction of oligogalacturonans obtained at the end of the production process described above. So :
  • oligogalacturonans of higher purity of a particular DP, (for example DP4 or DP6) from the fraction of oligogalacturonanes obtained according to process described above which mainly comprises oligogalacturonans of DP5, by purification on a Carbopac semi-preparative column and detection by HPAEC-PAD after elution in a KOAc buffer (pH8).
  • Plants have developed effective defense strategies to combat pathogens. Following the direct or indirect recognition of the aggressor, molecular defense mechanisms, characterized in particular by the production of active forms of oxygen (FAO) or the expression of genes coding for defense proteins, are activated.
  • FAO active forms of oxygen
  • CAM and more particularly of H2O2
  • the production of CAM, and more particularly of H2O2 was measured by the chemoluminescence technique of luminol according to the protocol described by Rasul et al. (2012) [4] from leaf discs of Arabidopsis thaliana treated with different oligogalacturonans at a concentration of 50 pg / ml.
  • FIG. 1A The results presented in FIG. 1A made it possible to compare the effects of three degrees of methylation (DM) 0, 30 and 60 for an oligogalacturonan (OG) of degree of polymerization 5 (DP5), and this in comparison with a treatment with flg22 , protein known to trigger the production of H 2 0 2 .
  • DM0 induced higher production than the other two molecules (DM30 and 60).
  • EXAMPLE 3 PROTECTION TEST: CAPACITY OF THE ELICITRIC MOLECULES OF THE INVENTION TO INDUCE RESISTANCE TO PATHOGENS 3.1 Protection in Arabidopsis thaliana
  • oligogalacturonans The levels of protection induced by oligogalacturonans (OG) were estimated against two pathogens Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa) and Botrytis cinerea. These two pathogens are taxonomically different; they belong respectively to the group of oomycetes and to the group of fungi. In addition, they each have a different way of life (biotrophic and necrotrophic respectively) which results, among other things, in the induction in plants of different immune mechanisms (Pieterse et al., 2009) [5].
  • the protection tests were first carried out on the whole plant after treatment by spraying until runoff with oligogalacturonans (OG) of degree of polymerization 5 (DP5) with different degrees of methylation (DM0, 30 and 60) at a concentration of 200 pg / ml.
  • OG oligogalacturonans
  • the treatments were carried out 24 hours before inoculation with Hpa of 3 week old plants by spraying a suspension spores (2.5x10 5 conidies.mL-1) until fine droplets form on the upper side of the leaves.
  • the plants were then placed in a growth chamber, and the effect of the OGs was evaluated after 7 days post-inoculation with Hpa by counting the number of spores per gram of fresh weight of the plant.
  • FIG. 4 presents the results concerning the effect of the degree of methylation for DP5.
  • DMO oligogalacturonan reduced symptoms by 60% (compared to the untreated control).
  • the protection tests were carried out on the whole plant after treatment by spraying until runoff with oligogalacturonans (OG) of different degrees of polymerization (DP5, 12 and 28) with a degree of methylation 0 (DM0) used at a concentration of 200 pg / ml.
  • the treatments were carried out 24 hours (i) before inoculation with Hpa (A) of 3-week-old plants by spraying with a suspension of spores ( 2.5 ⁇ 10 5 conidia.mL-1) until fine droplets formed on the upper surface of the leaves, or (ii) before inoculation with B.
  • cinerea (B) of 4-week-old plants by depositing four droplets of 5 ⁇ l of spore suspension (5x10 4 conidies.mL-1) on four leaves of each plant. The plants were then placed in a growth chamber, and the effect of the OGs was evaluated (i) after 7 days post-inoculation with Hpa by counting the number of spores per gram of fresh weight of the plant, or (ii) after 3 days post-inoculation with B. cinerea by measuring the mean diameter (in mm) of the lesions and counting the percentage of lesions developing outside the inoculation droplet.
  • Plasmopara viticola downy mildew agent
  • FIG. 7A presents the results concerning the effect of the degree of methylation for DP5.
  • BMD reduced symptoms by almost 80% (compared to the untreated control) and was significantly more effective than other BMDs.
  • results presented in FIG. 7B relate to the effect of the degree of polymerization for demethylated OGs (DM0). These results made it possible to show that, compared to the untreated control, the products DP5 and DP28 significantly reduced the colonization of P. viticola and the severity of the disease; the DP5 product showing the best efficiency. The results presented in FIG. 7B also show that the DP5 product has a higher efficiency than the sulfated laminarin (treatment at a concentration of 1 mg / ml), another SDP of polysaccharide origin whose protection on the vine vis-à-vis of P. viticola has been described in the literature by Vogellot et al. (2008) [7]

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux oligogalacturonanes possédant un degré de méthylation de 0 et un degré de polymérisation de 1 à 10, et leur utilisation pour stimuler des réponses de défense des plantes contre des microorganismes pathogènes.

Description

COMPOSES POLYSACCHARIDIQUES, ET LEUR UTILISATION POUR STIMULER DES REPONSES DE DEFENSE DES PLANTES CONTRE LES MICROORGANISMES PATHOGENES
DESCRIPTION
Domaine technique de l’invention
La présente invention concerne de nouveaux oligogalacturonanes complètement déméthylés et possédant un degré de polymérisation de 1 à 10, et leur utilisation pour stimuler des réponses de défense des plantes contre des microorganismes pathogènes.
La présente invention trouve par exemple des applications dans le domaine de la protection des végétaux, du biocontrôle.
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.
Etat de la technique
Dans leur environnement, les plantes sont confrontées à des microorganismes pathogènes incluant des bactéries, des champignons, des oomycètes ainsi que des virus. Elles résistent à la plupart de ces agresseurs via l’activation de processus de défense (concept d’immunité des plantes). Toutefois lorsque cette résistance est inefficace, le développement du microorganisme altère la croissance de la plante, voire tue la plante engendrant ainsi des pertes annuelles de récolte avoisinant les 30% à l’échelle mondiale. Comprendre les mécanismes associés aux processus infectieux et à la résistance des plantes aux maladies représente ainsi un enjeu majeur en agriculture.
L’utilisation des produits phytosanitaires utilisés classiquement en protection des cultures contre les maladies est problématique en termes de respect de l’environnement et de santé des utilisateurs et des consommateurs [voir par exemple le rapport d’information fait au nom de la mission commune d’information sur les pesticides et leur impact sur la santé et l’environnement présenté par Madame la Sénatrice N. Bonnefoy (Sénat, Session ordinaire de 2012-2013, Vol. 12). Des dispositions ont déjà été prises, dans le cadre du plan Ecophyto, afin de réduire l’utilisation de ces produits. Le développement de méthodes de protection des cultures plus respectueuses de l’environnement et à moindre risque pour l’utilisateur et les populations est un enjeu majeur. Dans ce contexte, la stimulation des défenses naturelles des plantes par des stimulateurs de défense de plantes (SDP) ou éliciteurs a déjà montré un réel potentiel d’application.
L’activation des mécanismes de défense des plantes nécessite la reconnaissance de l’agent pathogène. Les cellules végétales possèdent effectivement des protéines capables de reconnaître des motifs moléculaires portés par les pathogènes (PAMP, Pathogen-Associated Molecular Patterns) mais également des facteurs de virulence produits par ces derniers. Ce second cas de figure implique des protéines végétales appelées protéines de résistance. Les réactions de défense de la plante peuvent donc être induites et mimées par l’application de molécules produites par le pathogène (notamment par des PAMP) voire issues de la plante elle-même (molécules résultant de la dégradation de la plante par le pathogène ou DAMP, Damage-Associated Molecular Patterns, communément appelées SDP ou éliciteurs). De manière plus générale, des molécules mimant les signaux végétaux ou fongiques peuvent être utilisés.
Les éliciteurs présentent un intérêt biotechnologique important, Il a été ainsi démontré que l’application de SDP était capable de diminuer la sensibilité aux pathogènes virulents et ainsi assurer une forme de protection (résistance induite). De plus, ces molécules conduisent à une induction de résistance contre une large gamme de pathogènes (Trouvelot et al., 2014) [1] Certaines de ces molécules ont montré une réelle efficacité en parcelle cultivée et permettent de réduire la quantité de produits phytosanitaires de synthèse classiquement utilisés dans la lutte des cultures contre les maladies. Description de l’invention
Les Inventeurs ont identifié de nouvelles molécules élicitrices d’intérêt. Ces molécules naturelles, issues de polysaccharides provenant de la paroi des végétaux, présentent des caractéristiques chimiques et des propriétés originales. Elles présentent une forte activité phyto-protectrice en conditions contrôlées. Elles sont notamment capables d’induire chez la plante modèle Arabidopsis thaliana et chez la vigne ( Vitis vinifera) des réponses de défense et un phénomène de résistance très efficace à plusieurs microorganismes pathogènes. L’utilisation de ces molécules va donc permettre de conférer une protection de cultures en serres ou en plein champ (horticulture, plantes maraîchères, grandes cultures) contre des maladies cryptogamiques et ainsi réduire l’utilisation de produits phytosanitaires. Ces nouvelles molécules élicitrices des réponses de défenses des plantes sont des oligogalacturonanes possédant un degré de polymérisation inférieur à ceux décrits dans la littérature (Van Cutsem et Messiaen, 1994 ; Ferrari et al., 2007) [2, 3] et/ou entrant dans la composition des produits actuellement développés (e.g. COS-OGA développé par Fytofend) qui privilégient des molécules plus longues de DP compris entre 9 et 20. Plus précisément ils possèdent un degré de polymérisation de 1 à 10, de préférence de 4 à 10, préférentiellement de 4 à 6, et tout préférentiellement centré sur 5. Une autre caractéristique de ces nouveaux oligogalacturonanes est qu’ils sont complètement déméthylés (DMO).
Bien que le procédé de déméthylation des oligogalacturonanes soit connu, la présente invention est la première utilisation de ce type de modification chimique des oligogalacturonanes pour la stimulation des défenses des plantes.
La présente invention a donc pour objet un oligogalacturonane de formule (I) suivante :
Figure imgf000005_0001
formule (I) possédant un degré de méthylation de 0 et un degré de polymérisation de 1 à 10, de préférence de 4 à 10, préférentiellement de 4 à 6, et tout préférentiellement centré sur 5 et de formule majoritaire suivante :
Figure imgf000006_0001
La présente invention a également pour objet un procédé d’obtention des oligogalacturonanes de l’invention comprenant les étapes de :
a) déméthylation des pectines par désestérification ;
b) extraction en condition acide d’un homogalacturonane à partir des pectines désestérifiées obtenues à l’étape a) ;
c) préparation d’une fraction d’oligogalacturonanes par autolyse acide de l’homogalacturonane obtenu à l’étape b), suivie d’une précipitation en éthanol.
Les pectines sont présentes en grande quantité dans les parois primaires des Dicotylédones, en particulier dans les parois végétales de nombreux fruits [agrumes ou citrus (orange, citron, pamplemousse, etc...), pomme, etc...] et légumes. Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l’invention, les pectines sont de préférence issues du citrus.
Il est à noter que la variation de la concentration en éthanol à l’étape c) permet d’obtenir des oligogalacturonanes de DP différents. Par exemple : précipitation en éthanol 85% pour l’obtention d’oligogalacturonanes majoritairement de DP2, précipitation en éthanol 64% pour l’obtention d’oligogalacturonanes majoritairement de DP5, précipitation en éthanol 30% pour l’obtention d’oligogalacturonanes majoritairement de DP12, précipitation en éthanol 15% pour l’obtention d’oligogalacturonanes majoritairement de DP28. Les autres conditions ne varient pas.
Le procédé de la présente invention peut comprendre en outre une étape de fractionnement d) de la fraction d’oligogalacturonanes obtenue à l’étape c), par une méthode bien connue de l’Homme du métier, par exemple, par dialyse, par chromatographie en phase liquide à haute performance, ou par chromatographie d’exclusion, etc... afin d’isoler/purifier les oligogalacturonanes selon leur degré de polymérisation (DP).
La présente invention a également pour objet l’utilisation des oligogalacturonanes de l’invention en phyto-protection. Ils permettent en effet de stimuler les réponses de défense des plantes contre des microorganismes pathogènes. Brève description des figures
La figure 1 représente la production de formes actives de l’oxygène (FAO) induite chez Arabidopsis thaliana par des oligogalacturonanes (OG) majoritairement de degré de polymérisation 5 (DP5) avec différents degrés de méthylation (DMO, DM30 et DM 60) (A), et de différents degrés de polymérisation (DP5, DP12 et DP28) avec un degré de méthylation 0 (DM0) (B).
La figure 2 représente l’estimation du niveau d’accumulation des transcrits des gènes PER4 (A), WRKY75 (B), RLP7 (C) et PAD3 (D) chez Arabidopsis thaliana par des oligogalacturonanes (OG) majoritairement de degré de polymérisation 5 (DP5) avec différents degrés de méthylation (DM0, DM30 et DM 60).
La figure 3 représente l’estimation du niveau d’accumulation des transcrits des gènes PER4 (A), WRKY75 (B), RLP7 (C) et PAD3 (D) chez Arabidopsis thaliana par des oligogalacturonanes (OG) de différents degrés de polymérisation (majoritairement de DP5, DP12 ou DP28) avec un degré de méthylation 0 (DM0).
La figure 4 représente les niveaux de protection induits chez Arabidopsis thaliana par des oligogalacturonanes (OG) majoritairement de degré de polymérisation 5 (DP5) avec différents degrés de méthylation (DM0, DM30 et DM 60) vis-à-vis de Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa).
La figure 5 représente les niveaux de protection induits chez Arabidopsis thaliana par des oligogalacturonanes (OG) de différents degrés de polymérisation (majoritairement de DP5, DP12 ou DP28) avec un degré de méthylation 0 (DM0) vis- à-vis de Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa) (A) et de Botrytis cinerea (B). La figure 6 compare les niveaux de protection induits chez Arabidopsis thaliana par des oligoalacturonanes majoritairement de degré de polymérisation 5 (DP5) et de degré de méthylation 0, avec deux oligogalacturonanes de pureté supérieure et de degré de polymérisation 4 (DP4) et 6 (DP6), respectivement, et un degré de méthylation 0 (DM0), et avec un produit OG commercialisé (CosA) vis-à-vis de Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa) (A) et de Botrytis cinerea (B).
La figure 7 représente les niveaux de protection induits chez la vigne (Vitis vinifera) par des oligogalacturonanes (OG) (A) majoritairement de degré de polymérisation (DP5) avec différents degrés de méthylation (DM0, DM30 ou DM60) vis-à-vis du pathogène Plasmopara viticola (agent du mildiou), et (B) majoritairement de degré de polymérisation 5, 12 ou 28 (DP5, DP12 ou DP28) avec un degré de méthylation 0 (DM0) vis-à-vis du pathogène Plasmopara viticola (agent du mildiou). L’efficacité des produits DP5, DP12 et DP28 est également comparée avec celle de la laminarine sulfatée (lam. suif.).
La figure 8 représente les niveaux de protection induits chez la vigne (Vitis vinifera) par l’oligogalacturonane (OG) de degré de polymérisation 5 (DP5) avec un degré de méthylation 0 (DM0), et par la substance d’origine synthétique BION® 50 WG, en comparaison d’un témoin non traité, vis-à-vis du pathogène Plasmopara viticola (agent du mildiou).
EXEMPLES
(à vérifier / compléter)
EXEMPLE 1 : SYNTHESE - PRODUCTION - IDENTIFICATION DES MOLECULES ELICITRICES DE L’INVENTION
Les oligogalacturonanes (OG) de degré de polymérisation majoritairement centrés sur 5 (DP5) avec un degré de méthylation 0 (DMO) ont été obtenus comme suit :
a) Déméthylation des pectines
Les molécules d’intérêt ont été obtenues à partir de pectines de citrus. Les pectines ont été traitées à froid (+4°C) après solubilisation dans l’eau une nuit à 7,5 g/L et désestérification par la soude à pH 12 pendant 24 h. Le pH a ensuite été abaissé à pH 4,5 par ajout d’acide chlorhydrique 1 N. La solution a été concentrée 2 fois puis précipitée par l’éthanol (concentration finale 72%) à 4°C. Le précipité a été lavé à l’éthanol 72% et séché par échange de solvants. Le rendement en pectines désestérifiées a été de l’ordre de 94%. b) Extraction d’un homogalacturonane
Les pectines désestérifiées ont été solubilisées dans l’eau à 10 g/L pendant une nuit. La solution a été acidifiée par ajout d’acide chlorhydrique jusqu’à une concentration finale de 0,1 N et maintenue à 80°C pendant 72 h. L’homogalacturonane ainsi isolé a précipité. Le précipité a été lavé par l’acide chlorhydrique 0,1 N puis par de l’eau, puis séché par échange de solvants. Le rendement attendu a été de l’ordre de 55% sur la pectine initiale. c) Préparation d’une fraction d’oligogalacturonanes centrée sur DP 5.
L’homogalacturonane obtenu a été solubilisé dans l’eau à 10 g/L et soumis à autolyse en le maintenant à une température de 100°C pendant 24 h. La fraction soluble a été concentrée et précipitée en éthanol (EtOH) 64% à 4°C. Après reprise en eau du précipité et dialyse, le rendement attendu a été de l’ordre de 25% sur l’homogalacturonane, soit environ 14% sur la pectine initiale.
Les conditions de précipitation à l’éthanol, telles que décrites ci-dessus à l’étape c) ont été ajustées pour faire varier le DP majoritaire de la fraction d’oligogalacturonanes obtenue à l’issue du procédé de production décrit ci-dessus. Ainsi :
- EtOH 85% pour fraction d’oligogalacturonanes de DP centré sur 2.
- EtOH 64% pour fraction d’oligogalacturoanes de DP centré sur 5.
- EtOH 30% pour fraction d’oligogalacturonanes de DP centré sur 12
- EtOH 15% pour fraction d’oligogalacturonanes de DP centré sur 28.
Suite à l’étape de précipitation en éthanol, il a été possible d’isoler des oligogalacturonanes d’une pureté supérieure, d’un DP particulier, (par exemple de DP4 ou DP6) à partir de la fraction d’oligogalacturonanes obtenue selon le procédé décrit ci-dessus qui comprend majoritairement des oligogalacturonanes de DP5, par purification sur colonne semi-préparative Carbopac et détection par HPAEC-PAD après élution dans un tampon KOAc (pH8).
EXEMPLE 2 : TEST DE L’ACTIVITE BIOLOGIQUE DES MOLECULES ELICITRICES DE L’INVENTION CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA : MESURE D’EVENEMENTS CELLULAIRES ET MOLECULAIRES MOBILISES LORS DE LA REPONSE IMMUNITAIRE DES PLANTES.
Les plantes ont élaboré des stratégies de défense efficace pour lutter contre les agents pathogènes. Suite à la reconnaissance directe ou indirecte de l’agresseur, des mécanismes moléculaires de défense, caractérisés notamment par la production de formes actives de l'oxygène (FAO) ou l’expression de gènes codant pour des protéines de défenses, sont activés.
2.1. Production de formes actives de l’oxygène (FAO)
La production de FAO, et plus particulièrement de H2O2, a été mesurée par la technique de chimioluminescence du luminol selon le protocole décrit par Rasul et al. (2012) [4] à partir de disques foliaires d’Arabidopsis thaliana traitée par différents oligogalacturonanes à une concentration de 50 pg/ml..
Les résultats présentés dans la figure 1A ont permis de comparer les effets de trois degrés de méthylation (DM) 0, 30 et 60 pour un oligogalacturonane (OG) de degré de polymérisation 5 (DP5), et ceci en comparaison avec un traitement par flg22, protéine connue pour déclencher la production d’H202. Le DM0 a induit une production supérieure aux deux autres molécules (DM30 et 60).
Les résultats présentés dans la figure 1 B ont permis de comparer les effets de trois degrés de polymérisation (DP) 5, 12 et 28 avec un DM0 et ceci en comparaison avec un traitement par flg22, protéine connue pour déclencher la production d’H202.
Il est ressorti que DP5 induit une production de FAO au moins deux fois supérieure aux autres molécules testées.
2.2. Expression de gènes marqueurs de l’immunité végétale L’accumulation des transcrits de quatre gènes marqueurs de défense (WRKY75, PER4, PAD3 et RLP7) a également été mesurée selon le protocole décrit par Rasul et al. (2012) [4] à partir de disques foliaires d’Arabidopsis thaliana traitée par différents oligogalacturonanes (OG) à une concentration de 50 pg/ml.
Les résultats présentés dans la figure 2 ont permis de mettre en évidence que trois oligogalacturonanes (OG) de degré de polymérisation 5 (DP5) avec différents degrés de méthylation (DMO, 30 et 60) ont permis d’induire l’expression des quatre gènes marqueurs. Il est à noter que l’oligogalacturonane de DM0 a induit la plus forte expression des quatre gènes de défense étudiés
Les résultats présentés dans a figure 3 ont permis de mettre en évidence que trois oligogalacturonanes (OG) de différents degrés de polymérisation (DP5, 12 et 28) avec un degré de méthylation 0 (DM0) ont permis d’induire l’expression des quatre gènes marqueurs. Il est à noter que l’oligogalacturonane DP5 a induit en moyenne la plus forte expression des quatre gènes de défense étudiés.
EXEMPLE 3 : TEST DE PROTECTION : CAPACITE DES MOLECULES ELICITRICES DE L’INVENTION A INDUIRE LA RESISTANCE FACE AUX PATHOGENES 3.1 Protection chez Arabidopsis thaliana
Les niveaux de protection induit par les oligogalacturonanes (OG) ont été estimés contre deux pathogènes Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa) et Botrytis cinerea. Ces deux pathogènes sont taxonomiquement différents ; ils appartiennent respectivement au groupe des oomycètes et au groupe des champignons. De plus, ils possèdent chacun un mode de vie différent (respectivement biotrophe et nécrotrophe) ce qui se traduit, en autres, par l’induction chez la plantes de mécanismes immunitaires différents (Pieterse et al., 2009) [5].
Les tests de protection ont premièrement été réalisés sur plante entière après traitement par pulvérisation jusqu’à ruissellement avec des oligogalacturonanes (OG) de degré de polymérisation 5 (DP5) avec différents degré de méthylation (DM0, 30 et 60) à une concentration de 200 pg/ml. Les traitements ont été réalisés 24h avant l’inoculation avec Hpa de plantes de 3 semaines par pulvérisation d’une suspension de spores (2,5x105 conidies.mL-1 ) jusqu’à formation de fines gouttelettes sur la face supérieure des feuilles. Les plantes ont ensuite été placées en chambre de croissance, et l’effet des OG a été évalué après 7 jours post-inoculation avec Hpa par comptage du nombre de spores par gramme de poids frais de plante.
La figure 4 présente les résultats concernant l’effet du degré de méthylation pour le DP5. L’oligogalacturonane de DMO a réduit de 60% les symptômes (par rapport au témoin non traité).
Deuxièmement, les tests de protection ont été réalisés sur plante entière après traitement par pulvérisation jusqu’à ruissellement avec des oligogalacturonanes (OG) de différents degrés de polymérisation (DP5, 12 et 28) avec un degré de méthylation 0 (DM0) utilisés à une concentration de 200 pg/ml. Les traitements ont été réalisés 24h (i) avant l’inoculation avec Hpa (A) de plantes de 3 semaines par pulvérisation d’une suspension de spores (2,5x105 conidies.mL-1 ) jusqu’à formation de fines gouttelettes sur la face supérieure des feuilles, ou (ii) avant l’inoculation avec B. cinerea (B) de plantes de 4 semaines en déposant quatre gouttelettes de 5 pi de suspension de spores (5x104 conidies.mL-1 ) sur quatre feuilles de chaque plante. Les plantes ont ensuite été placées en chambre de croissance, et l’effet des OG a été évalué (i) après 7 jours post-inoculation avec Hpa par comptage du nombre de spores par gramme de poids frais de plante, ou (ii) après 3 jours post-inoculation avec B. cinerea par mesure du diamètre moyen (en mm) des lésions et en comptant le pourcentage de lésions se développant en dehors de la gouttelette d’inoculation.
Les résultats présentés dans la figure 5 ont permis de montrer que globalement le produit DP5 est plus efficace que les DP12 et DP28.
Concernant la protection contre Hpa (Figure 5A), DP12 et DP28 n’induisent aucune protection, voire une augmentation des symptômes (valeurs supérieures ou égales à 100%). Les résultats présentés dans la figure 5B ont permis de montrer que les trois molécules ont réduit le diamètre des nécroses induites par B. cinerea en comparaison au témoin non traité ; le produit DP5 réduisant de 33% le diamètre des nécroses induites par B. cinerea.
Par la suite, des essais ont permis de comparer le produit DP5 à deux produits de pureté supérieure de DP4 et DP6.et au produit OG commercialisé ( i.e . COS-OGA ou CosA) dans la capacité à induire la résistance chez Arabidopsis thaliana contre Hpa et B. cinerea (Figure 6A et 6B, respectivement). Les résultats présentés dans la figure 6 ont montré que la fraction d’oligogalacturonanes de DP centré majoritairement sur 5 (DP5) est la plus efficace contre Hpa (A) et B. cinerea (B) en permettant de retarder la progression de l’infection par rapport aux plantes témoin, mais que les fractions d’oligogalacturonanes de DP4 ou DP6 purifiées qui en dérivent ont montré également une efficacité significative selon le pathosystème étudié. En revanche, COS-OGA (CosA) s’est montré inefficace dans les deux cas.
Cela a renforcé l’intérêt d’utiliser des fractions d’oligogalacturonanes obtenues après l’étape de précipitation en éthanol, par exemple de fractions d’oligogalacturonanes de DP centré majoritairement sur 5 (contenant un peu de DP4 et DP6), car présentent au moins la même efficacité sinon meilleure que des sous- fractions plus purifiées qui en dérivent et sont plus simples et moins coûteuses à obtenir. 3.2. Test de protection de la vigne ( Vitis vinifera) contre le pathogène
Plasmopara viticola (agent du mildiou).
La capacité des oligogalacturonanes à induire une résistance a été estimée chez la vigne contre P. viticola. Cet oomycète biotrophe est responsable de pertes importantes du rendement et de la qualité des récoltes.
Pour ce faire, une estimation de la colonisation par le pathogène P. viticola de la surface de feuilles de V. vinifera préalablement traitées par différents oligogalacturonanes a été réalisée. Le traitement par les oligogalacturonanes (concentration de 2mg/ml) a été réalisé 48h avant inoculation par l’agent pathogène selon le protocole décrit par Khiook et al. (2013) [6].
La figure 7A présente les résultats concernant l’effet du degré de méthylation pour le DP5. DMO a réduit de près de 80% les symptômes (par rapport au témoin non traité) et a été significativement plus efficace que les autres DM.
Les résultats présentés dans la figure 7B concernent l’effet du degré de polymérisation pour des OG déméthylés (DM0). Ces résultats ont permis de montrer que, par rapport au témoin non traité, les produits DP5 et DP28 ont réduit de manière significative la colonisation de P. viticola et la sévérité de la maladie ; le produit DP5 montrant la meilleure efficacité. Les résultats présentés dans la Figure 7B montrent également que le produit DP5 possède une efficacité supérieure à la laminarine sulfatée (traitement à une concentration de 1 mg/ml), autre SDP d’origine polysaccharidique dont la protection sur la vigne vis-à-vis de P. viticola a été décrite dans la littérature par Trouvelot et al. (2008) [7]
Une estimation de la colonisation par le pathogène P. viticola de la surface de feuilles de V. vinifera préalablement traitées par (i) l’oligogalacturonane DP5 ou (ii) une substance d’origine synthétique (BION® 50 WG ; 50 % acibenzolar-S-méthyl), homologuée sur certaines cultures dont elle stimule les défenses naturelles et décrite comme efficace sur la vigne dans la littérature (Perazzolli et al., 2008) [8], a également été réalisée. Le traitement s’est déroulé comme décrit ci-dessus, et la sévérité de la maladie a été estimée d’après la méthode décrite par Khiook et al. (2013) [6].
Les résultats présentés dans la Figure 8 confirment l’efficacité de l’oligogalacturonane DP5 en comparaison du témoin non traité, et montrent que l’oligogalacturonane DP5 possède une efficacité équivalente au fongicide BION® 50 WG utilisé à 1 mg/ml.
Liste des références
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3. Ferrari et al., Plant Physiol., 144 : 367-379, 2007
4. Rasul et al., Plant Cell Environ., 35 : 1483-1499, 2012
5. Pieterse et al., Nat. Chem. Biol., 5 : 308-316, 2009
6. Khiook et al., J. Microbiol. Methods 95 : 235-244, 2013
7. Trouvelot et al., Mol. Plant-Microb. Interact. , 21 : 232-243, 2008
8. Perazzolli et al., Biological control, 47(2) : 228-234, 2008

Claims

REVENDICATIONS
1 ) Oligogalacturonane de formule (I) suivante :
Figure imgf000016_0001
formule (I)
possédant un degré de méthylation de 0 et un degré de polymérisation de 1 à 10.
2) Oligogalacturonane selon la revendication 1 , possédant un degré de polymérisation de 4 à 6.
3) Oligogalacturonane selon la revendication 2, possédant un degré de polymérisation centré sur 5 et de formule suivante :
Figure imgf000016_0002
4) Procédé de préparation d’un oligogalacturonane selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant les étapes suivantes :
a) déméthylation des pectines par désestérification ;
b) extraction en condition acide d’un homogalacturonane à partir des pectines désestérifiées obtenues à l’étape a) ;
c) préparation d’une fraction d’oligogalacturonanes par autolyse acide de l’homogalacturonane obtenu à l’étape b), suivie d’une précipitation en éthanol.
5) Procédé selon la revendication 4, comprenant en outre une étape de fractionnement d) afin d’isoler ou purifier les oligogalacturonanes de même degré de polymérisation. 6) Procédé selon la revendication 5, où l’étape de fractionnement d) est réalisée par dialyse, par chromatographie en phase liquide à haute performance, ou par chromatographie d’exclusion.
7) Procédé selon l’une quelconque des revendications 4 à 6, où la concentration en éthanol de l’étape c) est de 64%.
8) Oligogalacturonane obtenu par un procédé selon l’une quelconque des revendications 4 à 7, de formule (I) suivante :
Figure imgf000017_0001
formule (I)
possédant un degré de méthylation de 0 et un degré de polymérisation de 1 à 10.
9) Utilisation d’un oligogalacturonane selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 et 8, en phyto-protection.
10) Utilisation selon la revendication 9, pour stimuler des réponses de défense des plantes contre des microorganismes pathogènes.
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