WO2020080721A1 - 생체 심부 조직의 미세 영상 획득 시스템 및 이의 미세 영상 제공 방법 - Google Patents

생체 심부 조직의 미세 영상 획득 시스템 및 이의 미세 영상 제공 방법 Download PDF

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WO2020080721A1
WO2020080721A1 PCT/KR2019/013128 KR2019013128W WO2020080721A1 WO 2020080721 A1 WO2020080721 A1 WO 2020080721A1 KR 2019013128 W KR2019013128 W KR 2019013128W WO 2020080721 A1 WO2020080721 A1 WO 2020080721A1
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WO
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probe
image acquisition
acquisition system
lens
endoscopic probe
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PCT/KR2019/013128
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French (fr)
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김필한
공은지
안진효
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한국과학기술원
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/24—Base structure

Definitions

  • the present invention relates to bio-imaging technology.
  • Endomicroscopy using a fluorescence signal was developed to observe cell- and molecular-level phenomena occurring in deep body tissue.
  • the brain or small intestine tissues are organically connected while performing special functions for each microstructure, and are distributed over a wide and deep area compared to other tissues. There are limits.
  • a fluorescence endoscope has been studied that inserts an optical probe into a living body to image the front or side view of deep tissue.
  • the present invention relates to a system for obtaining a microscopic image of a deep body tissue and a method for providing the microscopic image (SYSTEM FOR IN VIVO MICROSCOPIC IMAGING OF DEEP TISSUE, AND MICROSCOPIC IMAGING METHOD).
  • the problem to be solved is to provide a microscopic imaging system that acquires a stereoscopic and repetitive microscopic image of deep tissue in a living body.
  • a wall glass capillary is implanted into a living animal, inserted into the glass tube, and vertically moved and rotated. It is to use an endoscope probe.
  • the problem to be solved is that when the endoscopic probe is inserted into a glass tube implanted in a living animal, the endoscopic probe coupled to the microscope device irradiates light of multiple wavelengths while vertically moving and rotating, and the microscope device emits the fluorescence signal emitted from the deep part of the tissue. It is to provide a micro imaging system that acquires and fine-images.
  • the problem to be solved is to implant a square-type window chamber (square-type window chamber) into a living animal, and use an endoscopic probe that is inserted into the square imaging chamber and moves and rotates vertically.
  • a microscopic image acquisition system a microscope device that scans light of a plurality of wavelengths and transmits it to an objective lens, and detects a fluorescence signal reflected from the biological tissue and enters the objective lens.
  • the endoscope probe Inserted into the objective lens to transmit the light incident from the objective lens to the side opening of the lower end, and the endoscope probe composed of a lens that transmits the fluorescent signal emitted from the fluorescent material-labeled biological tissue to the objective lens, and the endoscope probe is fixed
  • the endoscope probe includes a rotating probe moving device for rotating or vertically moving the fixed endoscope probe.
  • the endoscopic probe may include a refractive index distribution lens (GRIN lens) for transmitting light transmitted through the objective lens, and a microprism for irradiating light transmitted from the refractive index distribution lens to the side.
  • GRIN lens refractive index distribution lens
  • the endoscopic probe may be composed of a coupling lens, a relay lens, and an imaging lens.
  • the rotatable probe moving device may include a probe holder for fixing the endoscopic probe, a rotating frame for inserting and rotating the probe holder, and a moving stage for vertically or horizontally moving the rotating frame.
  • the rotatable probe moving device may move the rotating frame to rotate the endoscopic probe fixed to the probe holder, and move the moving stage to move the endoscopic probe in a vertical direction.
  • the micro-image acquisition system may further include a stage in which the implanted device is stereotactically fixed, and a plate to which the implantation device is attached may be fixed to the stage.
  • the implantation device can be fixed to the plate and implanted into the animal.
  • the implantation device may be filled with a liquid of a specific refractive index to control the refraction of light irradiated from the endoscopic probe.
  • the microscope device includes laser light sources that emit light of the plurality of wavelengths, a scanner that scans light from the laser light sources using a plurality of mirrors, and the object that transmits light that has passed through the scanner to the endoscopic probe.
  • a lens includes a lens, photodetectors for detecting the fluorescence signal passing through pinholes installed on the confocal plane by wavelength, among the fluorescence signals from the endoscopic probe, and a computing device for generating an image by combining signals output from the photodetectors can do.
  • the microscope device may include a multi-photon microscopy.
  • the computing device may generate a fluorescence image in which a fluorescent material labeled on a biological tissue having a specific depth is excited by the laser light sources.
  • the computing device may stereoscopically generate a fluorescent image of the biological tissue based on the rotation and vertical movement position of the endoscopic probe.
  • the implantation device may be a wall glass capillary or a square-type window chamber in which a passage through which the endoscopic probe is inserted is implemented.
  • a method for obtaining a fine image of a micro image acquisition system comprising: irradiating light of a plurality of wavelengths of a microscope device to a biological tissue through an endoscopic probe, and using the fluorescent signal emitted from the biological tissue, And generating a fluorescent image in which the fluorescent substance labeled on the tissue is excited by a multi-wavelength laser.
  • the light of the plurality of wavelengths is transmitted from the objective lens of the microscope device to the lens of the endoscopic probe and irradiated to the biological tissue around the lateral opening of the endoscopic probe, and the fluorescent signal is transmitted from the lens of the endoscopic probe to the objective lens. Is delivered.
  • the endoscopic probe is inserted into a wall glass capillary or a square-type window chamber implanted in living tissue and rotates and moves vertically.
  • the fluorescent image of the biological tissue may be generated in three dimensions based on the rotation and vertical movement position of the endoscopic probe.
  • the microscope device may include a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • the living animal tissue is fluorescence-imaged, it is possible to accurately observe in real time the phenomenon occurring in the biological tissue in which physiological and behavioral characteristics are maintained.
  • the microscopic image of the same deep body tissue can be repeatedly obtained, changes in the biological tissue over time can be observed over a long period of time and repeatedly.
  • the endoscopic probe since the endoscopic probe is vertically moved and rotated, an enlarged image of a large area can be obtained, and a three-dimensional image as well as two-dimensional image can be obtained.
  • a deep tissue that cannot be accessed by a conventional fluorescence endoscope can be stably accessed repeatedly over a long period of time. Accordingly, according to the embodiment, various diseases or biological phenomena occurring in various deep tissues including brain tissue can be more accurately identified over a long period of time.
  • FIG. 1 is a block diagram of a fine image acquisition system according to an embodiment.
  • FIG 2 is an illustration of an endoscopic probe according to one embodiment.
  • FIG 3 is an example of a rotatable probe moving device according to an embodiment.
  • FIG. 4 is an illustration of a confocal microscope device according to one embodiment.
  • FIG. 5 is a view illustrating a skull-attached plate for implanting a glass tube in vivo according to an embodiment.
  • FIG. 6 is a view illustrating a state in which a mouse is fixed to a stage of a micro image acquisition system according to an embodiment.
  • FIG. 7 is an example of a brain tissue image of a mouse obtained with a fine image acquisition system according to an embodiment.
  • FIG. 9 is a flowchart of a method for obtaining a fine image according to an embodiment.
  • FIG. 10 is an illustration of an implantation device implanted in a living body according to another embodiment.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of a fine image acquisition system according to an embodiment
  • FIG. 2 is an example of an endoscopic probe according to an embodiment
  • FIG. 3 is an example of a rotational probe moving device according to an embodiment.
  • the micro-image acquisition system 10 is a microscope device (microscope apparatus) 100, a certain length of the endoscope probe (endoscopeprobe) 200, the light incident from the objective lens of the microscope device 100 is exposed It includes a rotating probe moving device 300 for fixing the endoscope probe 200 to be transmitted to the probe 200 and vertically moving or rotating the endoscope probe 200.
  • a wall glass capillary 400 is implanted in the tissue of a living animal.
  • the animal into which the glass tube 400 is inserted is fixed to a motorized stage capable of a stereotactic system.
  • the endoscopic probe 200 fixed to the rotatable probe moving device 300 is inserted into the glass tube 400 implanted in the tissue of a living animal.
  • the endoscope probe 200 inserted into the glass tube 400 irradiates light to the tissue core while vertically moving and rotating by the rotating probe moving device 300, and the light emitted from the fluorescent substance-labeled tissue core (fluorescence signal) To the microscope device 100.
  • the positional relationship between the objective lens and the endoscope probe 200 of the microscope device 100 and the positional relationship between the endoscope probe 200 and the glass tube 400 are designed to enable precise adjustment.
  • the microscope device 100 may be various types of microscopes, for example, confocal microscopy or multi-photon microscopy.
  • the microscope device 100 emits a fluorescent material by a laser scanning method, and detects light transmitted from the endoscopic probe 200 to generate a 2D or 3D image.
  • the endoscope probe 200 is a side-view endoscope that irradiates light in the direction of the wall of the glass tube 400, and transmits light, which enters through the objective lens of the microscope device 100, to the imaging site inside the living tissue, and The light reflected from the inside of the tissue is transmitted back to the objective lens.
  • the shape of the endoscopic probe 200 may vary, but in the present invention, it may be inserted into the glass tube 400 and may be a rod or needle shape that may include a gradient index lens (GRIN lens).
  • GRIN lens gradient index lens
  • the microscopic image acquisition system 10 can repeatedly generate a microscopic image of deep tissue in vivo without tissue damage.
  • the upper end of the endoscopic probe 200 includes a lens structure that is coupled to the rotary probe moving device 300 and transmits light incident from the objective lens to the side opening of the lower end.
  • the endoscopic probe 200 may be made of a GRIN lens with microprism attached to the lower end for side imaging.
  • the optical conditions of the GRIN lens are optimized taking into account the conditions suitable for the observation of biological microstructures including minimal invasive.
  • Optical conditions include GRIN lens diameter (eg 1mm), length (eg 28.5mm), working distance, and size of the attached microprism (eg 0.7x0.7x0.7mm 3 ). do.
  • the interior of the endoscopic probe 200 may be a triplet lens structure composed of a coupling lens 210, a relay lens 220, and an imaging lens 230.
  • the coupling lens 210 and the imaging lens 230 may have a NA (Numerical Aperture) of 0.45 to 0.55, and the relay lens 220 may have a NA of 0.15 to 0.25.
  • NA Numerical Aperture
  • the NA of the coupling lens 210 and the imaging lens 230 may be 0.5
  • the NA of the relay lens 220 may be 0.2.
  • Rotating probe moving device 300 is a structure that can not only rotate the endoscopic probe 200, but also precisely adjust the horizontal movement of the endoscopic probe 200, the combined endoscopic probe 200 and the microscope device 100 It controls plane (X-axis and Y-axis) movement and vertical movement in the Z-axis direction, which are important for the positional relationship with the objective lens.
  • the rotatable probe moving device 300 includes a probe holder 310 for fixing the endoscopic probe 200, a rotation mount 330 for precisely rotating the probe holder 310, and a rotating frame It may include a translation stage (350) for precisely moving the X-axis, Y-axis, Z-axis 300.
  • the rotatable probe moving device 300 may be implemented with a combination of members that control rotation and three-axis movement (vertical and horizontal movement), and detailed configurations may be variously designed.
  • the glass tube 400 is manufactured in consideration of an operating distance (400um) of a light source that can be transmitted to a biological tissue through a GRIN lens.
  • the glass tube 400 may be, for example, a very thin glass tube having an inner diameter of 1.04 mm and an outer diameter of 1.2 mm.
  • the glass tube 400 can be implanted in an animal fixed to a plate designed to be suitable for skull attachment for precise axis adjustment.
  • the lower end of the glass tube 400 is blocked, and the upper end is pierced so that the endoscopic probe 200 is inserted.
  • the inner wall of the glass tube 400 may be surface-treated so that the endoscopic probe 200 can move and rotate smoothly.
  • the interior of the glass tube 400 may be filled with a liquid having a specific refractive index in consideration of the refraction of light from the endoscopic probe 200.
  • FIG. 4 is an illustration of a confocal microscope device according to one embodiment.
  • a confocal microscope can be used in the microscope device 100.
  • the confocal microscope device 100a uses laser light sources 110a, 110b, 110c, and 110d that emit light of multiple wavelengths, and a scanner 130 that scans light emitted from the laser light sources in the XY direction using a plurality of mirrors.
  • Objective lens 150 for incident the light passing through the scanner 130 to the target tissue labeled with a fluorescent substance
  • photodetectors 170a, 170b for detecting the fluorescent signal reflected from the objective lens focus through the pinhole by wavelength 170c, 170d
  • a computing device 190 that generates an image by combining signals detected by the photodetectors.
  • Each of the laser light sources 110a, 110b, 110c, and 110d is composed of four laser light sources in a visible light band, and may be, for example, laser light sources of wavelengths of 405 nm, 488 nm, 561 nm, and 640 nm.
  • the number and wavelength of laser light sources used as excitation light sources can be variously changed.
  • the light emitted from each of the laser light sources 110a, 110b, 110c, and 110d includes a beam pass filter (BPF), a gray filter (Neutral Density filter, NDF), and a beam splitter that separates beams according to wavelengths.
  • BPF beam pass filter
  • NDF Neutral Density filter
  • M Mirrors
  • the beam splitter may be a Dichroic Beam Splitter (DBS).
  • the scanner 130 may include a polygonal rotation mirror 131 and a galvanometer mirror 133.
  • the rotating polygon mirror 131 scans the X-axis
  • the galvanometer mirror scans the Y-axis to generate an X-Y Raster scan pattern.
  • the scanner 130 quickly moves the focal position of the objective lens 150 according to the laser scanning pattern.
  • the objective lens 150 enters the light passing through the scanner 130 into the target tissue labeled with a fluorescent material.
  • the light (fluorescent signal) emitted from the deep portion of the fluorescent material-labeled tissue enters the objective lens 150 through the endoscopic probe 200 and is transmitted to the scanner 130.
  • the objective lens 150 may be set to a 40-fold objective lens having a field of view of 250x250um 2 , but may be set to have various fields of view by setting a lens having an appropriate magnification.
  • the fluorescence signal is transmitted from the scanner 130 to the photodetectors 170a, 170b, 170c, 170d.
  • the photodetectors 170a, 170b, 170c, and 170d may be photomultiplier tubes (PMTs) separately installed for each wavelength, and the fluorescence signal of each wavelength is pinholes 173a installed in a confocal plane , 173b, 173c, 173d) and transferred to the photomultiplier tubes.
  • the pinhole may be a fine hole or a slit provided in the confocal surface.
  • the fluorescent signal transmitted from the scanner 130 may be separated for each wavelength through Dichroic beam splitters (DBSs).
  • DBSs Dichroic beam splitters
  • the computing device 190 combines the electrical signals received from the photodetectors 170a, 170b, 170c, and 170d according to a laser scanning pattern to generate microscopic images at the cellular and molecular level.
  • the computing device 190 may include a frame grabber.
  • the computing device 190 may acquire a two-dimensional image of a cell-level resolution capable of Z-axis partitioning at a rate of 30 frames per second.
  • the computing device 190 when signals are transmitted from the photodetectors 170a, 170b, 170c, 170d in real time according to the Z-axis movement or rotational movement of the endoscopic probe 200, the computing device 190 appears in the deep tissue of a living animal. Fluorescence can be imaged in real time at the cellular and molecular level.
  • FIG. 5 is a view illustrating a skull-attached plate for implanting a glass tube in vivo according to an embodiment.
  • the glass tube 400 may be implanted in an animal while attached to the plate 500.
  • the implanted glass tube 400 may be attached to the plate 500.
  • a hole position in which at least one glass tube is inserted is determined.
  • the plate 500 is fixed to a motorized stage, so that the animal to which the glass tube 400 is attached can be stereotactically fixed. Thanks to the plate 500, the endoscopic probe 200 and the glass tube 400 are mechanically aligned, so that the endoscopic probe 200 can be accurately, stably and repeatedly inserted into the glass tube 400.
  • the glass tube insertion can be performed by inserting a glass tube into living tissue after blocking the bottom of the glass tube with an optical adhesive.
  • a microscopic image of a biological tissue in which physiological and behavioral characteristics are maintained is obtained through a surgical method in which the glass tube 400 attached to the plate 500 is inserted into the brain tissue.
  • the plate shape can be variously changed according to the position where the glass tube is inserted, the size and length of the glass tube, the size and area of the animal into which the glass tube is inserted, and the structure of the stage where the plate is fixed.
  • the skull-attached plate 500 for fixing the glass tube inserted into the brain tissue of the mouse is, for example, a stage connected to both ends of the glass tube insertion plate 510 and the glass tube insertion plate 510. It may be composed of fixed plates (530, 550).
  • the glass tube insertion plate 510 has at least one hole into which a glass tube is inserted.
  • the glass tube is attached and fixed through the hole of the glass tube insertion plate 510.
  • FIG. 6 is a view illustrating a state in which a mouse is fixed on a stage of a micro-image acquisition system according to an embodiment
  • FIG. 7 is an example of a brain tissue image of a mouse obtained with a micro-image acquisition system according to an embodiment.
  • a mouse to which a skull attachment plate 500 is attached by glass tube insertion is placed on the stage 600 of the micro-image acquisition system, and the skull attachment plate 500 is stage 600 It is fixed in stereotaxic. Then, the endoscopic probe 200 coupled to the rotatable probe moving device 300 vertically moves and rotates, and the light transmitted from the objective lens 150 is transmitted to the endoscopic probe 200 so that light is transmitted to the deep tissue in the glass tube. Is investigated.
  • the mouse may be fixed to the stage of the micro-image acquisition system.
  • DyLight 594 fluorescently bound Lectin antibody is injected into CX3CR1-GFP mice 1 hour before the experiment. Then, blood vessels are stained, and microglia cells of brain tissue express green fluorescence to obtain a fluorescence image as shown in FIG. 7. As the vertical movement and rotational movement of the endoscopic probe 200 and the vertical movement of the motor stage 600 proceed simultaneously, light of multiple wavelengths is irradiated, so that a high-resolution cell-level image can be obtained in the expanded region as shown in FIG. 7. .
  • blood vessels stained with Lectin549 antibody and GFP-expressing microglia can be divided into dual colors for imaging.
  • the insertion coordinates and depth in brain tissue can be re-verified through tissue extraction and fixation.
  • a large area fluorescent image can be obtained by vertical movement and rotation.
  • FIG. 9 is a flowchart of a method for obtaining a fine image according to an embodiment.
  • the micro-image acquisition system 10 irradiates light of a plurality of wavelengths of the microscope device 100 to the biological tissue through the endoscopic probe 200 (S110). Light passing through the objective lens of the microscope device 100 is transmitted to the endoscopic probe 200.
  • the micro-image acquisition system 10 is inserted into a glass tube implanted in a living tissue and acquires a fluorescence signal emitted from the living tissue from the endoscopic probe 200 irradiating light to the living tissue while rotating and vertically moving (S120).
  • the fine image acquisition system 10 separates and detects the fluorescent signal obtained from the endoscopic probe 200 for each wavelength (S130).
  • the fine image acquisition system 10 generates a fluorescence signal obtained from the endoscopic probe 200 as a 2D or 3D image in consideration of the fluorescence signal detection position according to the movement position of the endoscopic probe 200 (S140).
  • the movement position of the endoscopic probe 200 is determined by the rotation and vertical movement of the endoscopic probe 200.
  • FIG. 10 is an illustration of an implantation device implanted in a living body according to another embodiment.
  • a thin glass tube 400 may be implanted into a living animal tissue, or a square-type window chamber 410 may be implanted.
  • the rectangular imaging chamber 410 may be made of a chamber 411 and an upper wing 413.
  • the chamber 411 forms a certain space in the shape of a square tube.
  • the lower surface of the chamber 411 may be manufactured in a closed state.
  • the lower surface of the chamber 411 may be manufactured in a perforated state, and the experimenter may add a thin plate to the bottom.
  • a glass plate is attached to the side surface of the chamber 411.
  • the side surface of the chamber 4110 is manufactured in a perforated state, and the experimenter can attach the glass plate as an optic bond.
  • Light from the rotatable endoscope probe 200 may be transmitted to the tissue through a glass plate attached to the side surface.
  • the upper wing 413 is formed with a wing for fixing the chamber 411 and a passage for inserting the endoscope probe 200 into the chamber 411.
  • the upper wing 413 may be stably attached to the head (skull).
  • the upper wing 413 can replace a plate having a complicated structure as shown in FIG. 3 or simply implement it.
  • the size of the endoscopic probe 200 and the rectangular imaging chamber 410 may be variously changed.
  • the square imaging chamber 410 may image a wider plane than the thin glass tube 400. Since the square imaging chamber 410 moves in parallel with the glass plate attaching surface and moves up and down, it is possible to image a deeper tissue extended than the thin glass tube 400.
  • the present invention allows the glass tube 400 or the square imaging chamber 410 to be implanted in vivo, and by inserting an endoscope probe into the implantation device, it is possible to repeatedly access deep tissue in a living animal.
  • multi-channel cell-level imaging of a more extended region for a corresponding deep region is possible.
  • micro-image acquisition system 10 performs fluorescence imaging of animal tissue, it is possible to accurately observe in real time the phenomenon occurring in the biological tissue in which physiological and behavioral characteristics are maintained.
  • micro-image acquisition system 10 can repeatedly acquire micro-images of the same living body deep tissue, it is possible to observe long-term and long-term changes in the biological tissue over time.
  • the fine image acquisition system 10 can acquire an extended image of a large area because the endoscopic probe is vertically moved and rotated, and can acquire a three-dimensional image as well as a two-dimensional image.
  • the micro-image acquisition system 10 can stably access even deep tissue that cannot be accessed by a conventional fluorescence endoscope. Accordingly, the micro-image acquisition system 10 may identify various diseases or biological phenomena occurring in various deep tissues including brain tissue.
  • the embodiment of the present invention described above is not implemented only through an apparatus and method, and may be implemented through a program for realizing a function corresponding to the configuration of the embodiment of the present invention or a recording medium in which the program is recorded.

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Abstract

미세 영상 획득 시스템은, 복수 파장들의 빛을 주사(scanning)하여 대물 렌즈로 전달하고, 생체 조직에서 반사되어 대물 렌즈로 들어온 형광 신호를 검출하는 현미경 장치, 그리고 생체에 이식된 이식 장치에 삽입되어 상기 대물 렌즈에서 입사된 빛을 아랫단의 측면 개구부로 전달하고, 형광 물질 표지된 상기 생체 조직에서 발광된 형광 신호를 상기 대물 렌즈로 전달하는 렌즈로 구성된 내시프로브, 상기 내시프로브를 고정하고, 고정된 상기 내시프로브를 회전 또는 수직 이동시키는 회전형 프로브 이동 장치를 포함한다.

Description

생체 심부 조직의 미세 영상 획득 시스템 및 이의 미세 영상 제공 방법
본 발명은 바이오 이미징 기술에 관한 것이다.
형광 신호를 이용한 내시현미경(Endomicroscopy)은 생체 심부조직에서 일어나는 세포 및 분자 수준의 현상을 관찰하기 위해 개발되었다. 하지만, 뇌 혹은 소장의 조직은 미세 구조별 특수 기능을 수행하는 동시에 유기적으로 연결되어 있고, 다른 조직들에 비해 넓고 깊은 영역에 걸쳐 분포되어 있어, 이전 광학 영상 기술로 뇌 조직 등을 영상화하는 데에 한계가 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 광학 프로브를 생체 내로 삽입하여 심부 조직의 전면(front view) 또는 측면(side view)을 영상화하는 형광 내시현미경이 연구되었다.
하지만 광학 프로브를 동일 지점에 반복적으로 삽입하면 조직이 파괴되는 문제가 있다. 따라서, 기존 형광 내시현미경으로, 살아있는 생체의 심부 조직을 세포 수준에서 입체적이고 반복적으로 영상화하기 어렵다.
이러한 한계에도 불구하고, 생체 심부 조직에서 일어나는 현상을 정확히 관찰하기 위해서, 살아있는 동물의 생리적 특성 및 행동 특성이 유지된 상태에서 미세 영상을 획득하는 것이 필요하다. 또한, 시간에 따른 조직 변화를 관찰하기 위해 심부 조직의 세포 수준 고해상도 영상화를 반복적으로 수행하는 것이 필요하다. 이러한 생체 내 미세영상(in vivo microscopic imaging) 연구를 위한 새로운 기술이 필요하다.
본 발명은 생체 심부 조직의 미세 영상 획득 시스템 및 이의 미세 영상 제공 방법(SYSTEM FOR IN VIVO MICROSCOPIC IMAGING OF DEEP TISSUE, AND MICROSCOPIC IMAGING METHOD)에 관한 것이다.
해결하고자 하는 과제는 생체 심부 조직의 미세 영상을 입체적이고 반복적으로 획득하는 미세 영상 시스템을 제공하는 것이고, 특히, 살아있는 동물에 유리관(wall glass capillary)을 이식하고, 유리관에 삽입되어 수직 이동 및 회전하는 내시프로브(endoscope probe)를 이용하는 것이다.
해결하고자 하는 과제는 살아있는 동물에 이식된 유리관에 내시프로브가 삽입되면, 현미경 장치에 결합된 내시프로브가 수직 이동 및 회전하면서 다중 파장의 빛을 조사하고, 현미경 장치가 조직 심부에서 발광된 형광 신호를 획득하여 미세 영상화하는 미세 영상 시스템을 제공하는 것이다.
해결하고자 하는 과제는 사각 이미징 챔버(square-type window chamber)를 살아있는 동물에 이식하고, 사각 이미징 챔버에 삽입되어 수직 이동 및 회전하는 내시프로브를 이용하는 것이다.
한 실시예에 따른 미세 영상 획득 시스템으로서, 복수 파장들의 빛을 주사(scanning)하여 대물 렌즈로 전달하고, 생체 조직에서 반사되어 대물 렌즈로 들어온 형광 신호를 검출하는 현미경 장치, 생체에 이식된 이식 장치에 삽입되어 상기 대물 렌즈에서 입사된 빛을 아랫단의 측면 개구부로 전달하고, 형광 물질 표지된 상기 생체 조직에서 발광된 형광 신호를 상기 대물 렌즈로 전달하는 렌즈로 구성된 내시프로브, 그리고 상기 내시프로브를 고정하고, 고정된 상기 내시프로브를 회전 또는 수직 이동시키는 회전형 프로브 이동 장치를 포함한다.
상기 내시프로브는 상기 대물 렌즈를 투과한 빛을 전달하는 굴절률 분포형 렌즈(gradient index lens, GRIN lens), 그리고 상기 굴절률 분포형 렌즈로부터 전달된 빛을 측면으로 조사하는 마이크로프리즘을 포함할 수 있다.
상기 내시프로브는 커플링 렌즈(coupling lens), 릴레이 렌즈(relay lens), 그리고 이미징 렌즈(imaging lens)로 구성될 수 있다.
상기 회전형 프로브 이동 장치는 상기 내시프로브를 고정하는 프로브 홀더, 상기 프로브 홀더를 끼우고 회전시키는 회전 틀, 그리고 상기 회전 틀을 수직 또는 수평 이동시키는 이동 스테이지를 포함할 수 있다.
상기 회전형 프로브 이동 장치는 상기 회전 틀을 움직여 상기 프로브 홀더에 고정된 상기 내시프로브를 회전시키고, 상기 이동 스테이지를 움직여 상기 내시프로브를 수직 방향으로 이동시킬 수 있다.
상기 미세 영상 획득 시스템은 상기 이식 장치가 이식된 동물을 정위 고정(stereotactic system)하는 스테이지를 더 포함하고, 상기 이식 장치를 부착한 플레이트가 상기 스테이지에 고정될 수 있다.
상기 이식 장치는 상기 플레이트에 고정되어 상기 동물에 이식될 수 있다.
상기 이식 장치는 상기 내시프로브에서 조사된 빛의 굴절을 조절하는 특정 굴절률의 액체로 채워질 수 있다.
상기 현미경 장치는 상기 복수 파장들의 빛을 방출하는 레이저 광원들, 복수의 거울들을 이용하여 상기 레이저 광원들로부터 나오는 빛을 주사하는 스캐너, 상기 스캐너를 통과하여 나온 빛을 상기 내시프로브로 전달하는 상기 대물 렌즈, 상기 내시프로브로부터 들어온 형광 신호 중에서 공초점면에 설치된 핀홀들을 통과한 형광 신호를 파장별로 검출하는 광검출기들, 그리고 상기 광검출기들에서 출력된 신호들을 조합하여 영상을 생성하는 컴퓨팅 장치를 포함할 수 있다.
상기 현미경 장치는 다광자 현미경(Multi-photon microscopy)을 포함할 수 있다.
상기 컴퓨팅 장치는 상기 내시프로브가 회전하는 경우, 특정 깊이의 생체 조직에 표지된 형광 물질이 상기 레이저 광원들에 의해 여기되어 나타나는 형광 영상을 생성할 수 있다.
상기 컴퓨팅 장치는 상기 내시프로브의 회전 및 수직 이동 위치를 기초로, 상기 생체 조직의 형광 영상을 입체적으로 생성할 수 있다.
상기 이식 장치는 상기 내시프로브가 삽입되는 통로가 구현된 유리관(wall glass capillary) 또는 사각 이미징 챔버(square-type window chamber)일 수 있다.
한 실시예에 따른 미세 영상 획득 시스템의 미세 영상 획득 방법으로서, 현미경 장치의 복수 파장들의 빛을 내시프로브를 통해 생체 조직으로 조사하는 단계, 그리고 상기 생체 조직에서 발광된 형광 신호를 이용하여, 상기 생체 조직에 표지된 형광 물질이 다중 파장 레이저에 의해 여기되어 나타나는 형광 영상을 생성하는 단계를 포함한다. 상기 복수 파장들의 빛은 상기 현미경 장치의 대물 렌즈에서 상기 내시프로브의 렌즈로 전달되어 상기 내시프로브의 측면 개부구 주변의 생체 조직에 조사되고, 상기 형광 신호는 상기 내시프로브의 렌즈에서 상기 대물 렌즈로 전달된다. 상기 내시프로브는 생체 조직에 이식된 유리관(wall glass capillary) 또는 사각 이미징 챔버(square-type window chamber)에 삽입되어 회전 및 수직 이동한다.
상기 형광 영상을 생성하는 단계는 상기 내시프로브의 회전 및 수직 이동 위치를 기초로, 상기 생체 조직의 형광 영상을 입체적으로 생성할 수 있다.
상기 현미경 장치는 공초점 현미경 또는 다광자 현미경을 포함할 수 있다.
실시예에 따르면 살아있는 동물 조직을 형광 영상화하므로, 생리적 특성 및 행동 특성이 유지된 생체 조직에서 일어나는 현상을 실시간으로 정확히 관찰할 수 있다.
실시예에 따르면 동일한 생체 심부 조직의 미세 영상을 반복적으로 획득할 수 있으므로, 시간에 따른 생체 조직 변화를 장기적이고 반복적으로 관찰할 수 있다.
실시예에 따르면 내시프로브가 수직 이동 및 회전하므로, 대면적의 확장된 영상을 획득할 수 있고, 2차원뿐만 아니라 3차원의 입체적 영상을 획득할 수 있다.
실시예에 따르면 기존 형광 내시현미경으로 접근할 수 없는 심부 조직으로도 안정적으로 장기간에 걸쳐 반복적으로 접근할 수 있다. 따라서, 실시예에 따르면 뇌 조직을 포함한 다양한 심부 조직에서 발생하는 다양한 질병 혹은 생물학적 현상들을 보다 정밀하게 장기간에 걸쳐 확인할 수 있다.
도 1은 한 실시예에 따른 미세 영상 획득 시스템의 구성도이다.
도 2는 한 실시예에 따른 내시프로브의 예시이다.
도 3은 한 실시예에 따른 회전형 프로브 이동 장치의 예시이다.
도 4는 한 실시예에 따른 공초점 현미경 장치의 예시이다.
도 5는 한 실시예에 따른 생체 내 유리관 이식을 위한 두개골 부착형 플레이트를 설명하는 도면이다.
도 6은 한 실시예에 따른 미세 영상 획득 시스템의 스테이지에 마우스가 고정된 모습을 설명하는 도면이다.
도 7은 한 실시예에 따른 미세 영상 획득 시스템으로 획득한 마우스의 뇌조직 영상의 예시이다.
도 8은 한 실시예에 따라 획득한 대면적 형광 영상의 예시이다.
도 9는 한 실시예에 따른 미세 영상 획득 방법의 흐름도이다.
도 10은 다른 실시예에 따른 생체에 이식된 이식 장치의 예시이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서에 기재된 "…부", "…기", "모듈" 등의 용어는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미하며, 이는 하드웨어나 소프트웨어 또는 하드웨어 및 소프트웨어의 결합으로 구현될 수 있다.
도 1은 한 실시예에 따른 미세 영상 획득 시스템의 구성도이고, 도 2는 한 실시예에 따른 내시프로브의 예시이며, 도 3은 한 실시예에 따른 회전형 프로브 이동 장치의 예시이다.
도 1을 참고하면, 미세 영상 획득 시스템(10)은 현미경 장치(microscope apparatus)(100), 일정 길이의 내시프로브(endoscopeprobe)(200), 현미경 장치(100)의 대물 렌즈에서 입사된 빛이 내시프로브(200)로 전달되도록 내시프로브(200)를 고정하고 내시프로브(200)를 수직 이동 또는 회전시키는 회전형 프로브 이동 장치(300)를 포함한다.
살아있는 동물의 조직에 유리관(wall glass capillary)(400)이 이식된다. 유리관(400)이 삽입된 동물은 정위 고정(stereotactic system)이 가능한 모터 스테이지(motorized stage)에 고정된다. 이후, 회전형 프로브 이동 장치(300)에 고정된 내시프로브(200)가 살아있는 동물의 조직에 이식된 유리관(400)에 삽입된다. 유리관(400)에 삽입된 내시프로브(200)는 회전형 프로브 이동 장치(300)에 의해 수직 이동 및 회전하면서 조직 심부로 빛을 조사하고, 형광 물질 표지된 조직 심부에서 발광된 빛(형광 신호)을 현미경 장치(100)로 전달한다.
현미경 장치(100)의 대물 렌즈와 내시프로브(200)의 위치 관계, 그리고 내시프로브(200)와 유리관(400)의 위치 관계는 정밀한 조정이 가능하도록 설계된다.
현미경 장치(100)는 다양한 종류의 현미경일 수 있고, 예를 들면, 공초점 현미경(confocal microscopy)나 다광자 현미경(Multi-photon microscopy)을 이용할 수 있다. 현미경 장치(100)는 레이저 주사(laser scanning) 방식으로 형광 물질을 발광시키고, 내시프로브(200)로부터 전달된 빛을 검출하여 2차원 또는 3차원 영상을 생성한다.
내시프로브(200)는 유리관(400) 벽 방향으로 빛을 조사하는 측면 내시경(side-view endoscope)으로서, 현미경 장치(100) 대물렌즈를 통해 들어온 빛을 생체 조직 내부의 촬영 부위로 전달하고, 생체 조직 내부로부터 반사된 빛을 다시 대물렌즈로 전달한다. 내시프로브(200)의 모양은 다양할 수 있으나, 본 발명에서는 유리관(400)에 삽입이 가능하면서 굴절률 분포형 렌즈(gradient index lens, GRIN lens)를 포함할 수 있는 막대나 니들 모양일 수 있다.
내시프로브(200)는 동물의 조직에 이식된 유리관(400)에 삽입되므로, 미세 영상 획득 시스템(10)은 조직 손상 없이 생체 심부 조직의 미세 영상을 반복적으로 생성할 수 있다.
내시프로브(200)의 윗단은 회전형 프로브 이동 장치(300)에 결합하고, 대물 렌즈에서 입사된 빛을 아랫단의 측면 개구부로 전달하는 렌즈 구조를 포함한다.
도 2를 참고하면, 내시프로브(200)는 측면 영상화를 위해 아랫단에 마이크로프리즘(microprism)이 부착된 GRIN 렌즈로 제작될 수 있다. GRIN 렌즈의 광학적 조건은 저침습(minimal invasive)을 포함한 생체 미세조직 관찰에 적합한 조건들을 고려하여 최적화된다. 광학적 조건은 GRIN 렌즈 직경(예를 들면, 1mm), 길이(예를 들면, 28.5mm), 작동거리, 그리고 부착된 마이크로프리즘의 크기(예를 들며, 0.7x0.7x0.7mm3) 등을 포함한다. 내시프로브(200)의 내부는 커플링 렌즈(coupling lens)(210), 릴레이 렌즈(relay lens)(220), 이미징 렌즈(imaging lens)(230)로 구성된 트리플렛(triplet) 렌즈 구조일 수 있다. 커플링 렌즈(210)와 이미징 렌즈(230)의 NA(Numerical Aperture)는 0.45 내지 0.55이고, 중계렌즈(220)의 NA는 0.15 내지 0.25일수 있다. 예를 들면, 렌즈 직경이 1mm인 GRIN 렌즈로서, 커플링 렌즈(210)와 이미징 렌즈(230)의 NA는 0.5이고, 중계렌즈(220)의 NA는 0.2일 수 있다.
회전형 프로브 이동 장치(300)는 내시프로브(200)를 회전할 뿐만 아니라, 내시프로브(200)의 좌우상하 움직임을 정밀 조정할 수 있는 구조로서, 결합된 내시프로브(200)와 현미경 장치(100) 대물렌즈와의 위치 관계에 중요한 평면(X축 및 Y축)이동, Z축 방향의 수직 이동을 제어한다.
도 3을 참고하면, 회전형 프로브 이동 장치(300)는 내시프로브(200)를 고정하는 프로브 홀더(310), 프로브 홀더(310)를 정밀 회전시키는 회전 틀(rotation mount)(330), 회전 틀(300)을 X축, Y축, Z축 정밀 이동시키는 이동 스테이지(translation stage)(350)를 포함할 수 있다. 회전형 프로브 이동 장치(300)는 회전, 3축 이동(수직 및 수평 이동)을 제어하는 부재들의 조합으로 구현될 수 있고, 세부 구성은 다양하게 설계될 수 있다.
유리관(400)은 GRIN 렌즈를 통해 생체 조직으로 전달될 수 있는 광원의 작동거리(400um)를 고려하여 제작된다. 유리관(400)은 예를 들면, 내경 1.04mm 그리고 외경 1.2mm의 매우 얇은 유리관일 수 있다. 유리관(400)은 정밀한 축 조정을 위하여 두개골 부착에 적합하도록 고안된 플레이트에 고정된 상태로 동물에 이식될 수 있다. 유리관(400) 하단은 막혀있고, 상단은 내시프로브(200)가 삽입되도록 뚫려있다. 유리관(400)의 내벽은 내시프로브(200)가 매끄럽게 이동 및 회전할 수 있도록 표면 처리될 수 있다. 유리관(400)의 내부는 내시프로브(200)으로부터의 빛의 굴절을 고려하여 특정 굴절률을 갖는 액체로 채워질 수 있다.
도 4는 한 실시예에 따른 공초점 현미경 장치의 예시이다.
도 4를 참고하면, 공초점 현미경이 현미경 장치(100)에 이용될 수 있다.
공초점 현미경 장치(100a)는 복수 파장들의 빛을 방출하는 레이저 광원들(110a, 110b, 110c, 110d), 복수의 거울들을 이용하여 레이저 광원들로부터 나오는 빛을 X-Y 방향으로 주사하는 스캐너(130), 스캐너(130)를 통과하여 나온 빛을 형광 물질 표지된 타겟 조직으로 입사하는 대물렌즈(150), 핀홀을 통해 대물 렌즈 초점에서 반사된 형광 신호를 파장별로 검출하는 광검출기들(170a, 170b, 170c, 170d), 그리고 광검출기들에서 검출된 신호들을 조합하여 영상을 생성하는 컴퓨팅 장치(190)를 포함한다.
레이저 광원들(110a, 110b, 110c, 110d) 각각은 가시광선 대역의 네 개의 레이저 광원들로 구성되고, 예를 들면 405nm, 488nm, 561nm, 640nm의 파장의 레이저 광원일 수 있다. 여기 광원으로 사용되는 레이저 광원의 개수와 파장은 다양하게 변경될 수 있다.
레이저 광원들(110a, 110b, 110c, 110d) 각각에서 방출된 빛들은 빔통과필터(Beam Pass Filter, BPF), 회색필터(Neutral Density filter, NDF), 파장에 따라 빔을 분리하는 빔스플리터(Beam Splitter)를 거쳐, 스캐너(130)로 전달되도록 광 경로가 설계될 수 있다. 광 경로를 변경하기 위해 거울(Mirror, M)이 사용될 수 있다. 빔스플리터는 Dichroic 빔스플리터(Dichroic Beam Splitter, DBS)일 수 있다.
스캐너(130)는 회전 다각 거울(Polygonal Rotation Mirror)(131), 그리고 갈바노미터 거울(galvanometer mirror)(133)을 포함할 수 있다. 회전 다각 거울(131)은 X축을 스캐닝하고, 갈바노미터 거울은 Y축을 스캐닝하여 X-Y 래스터(Raster) 스캔 패턴을 생성할 수 있다. 스캐너(130)는 레이저 스캐닝 패턴에 따라 대물렌즈(150)의 초점 위치를 빠르게 이동시킨다.
대물렌즈(150)는 스캐너(130)를 통과하여 나온 빛을 형광 물질 표지된 타겟 조직으로 입사한다. 형광 물질 표지된 조직 심부에서 발광된 빛(형광 신호)은 내시프로브(200)를 거쳐 대물렌즈(150)로 들어오고, 스캐너(130)로 전달된다. 대물렌즈(150)는 250x250um2의 시야를 가지는 40배 대물렌즈로 설정될 수 있으나, 적절한 배율의 렌즈를 설정하여 다양한 시야를 갖도록 설정될 수 있다.
형광 신호는 스캐너(130)에서 광검출기들(170a, 170b, 170c, 170d)로 전달된다. 광검출기들(170a, 170b, 170c, 170d)은 파장마다 별도로 설치된 광전자 증배관들(photomultiplier tubes, PMTs)일 수 있고, 각 파장의 형광 신호는 공초점면(confocal plane)에 설치된 핀홀들(173a, 173b, 173c, 173d)을 통과하여 광전자 증배관들로 전달된다. 핀홀은 공초점면에 설치된 미세 구멍 또는 슬릿일 수 있다. 스캐너(130)로부터 전달된 형광 신호는 Dichroic 빔스플리터들(DBSs)을 통해 파장별로 분리될 수 있다. 광검출기들(170a, 170b, 170c, 170d) 각각은 입력된 형광 신호를 전기 신호로 변환하여 컴퓨팅 장치(190)로 전달한다.
컴퓨팅 장치(190)는 광검출기들(170a, 170b, 170c, 170d)로부터 수신한 전기 신호를 레이저 스캐닝 패턴에 따라 조합하여 세포 및 분자 수준의 미세 영상을 생성한다. 컴퓨팅 장치(190)는 프레임 그래버(Frame Grabber)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 컴퓨팅 장치(190)는 Z축 구획화가 가능한 세포 수준 해상도의 2차원 영상을 초당 30 프레임의 속도로 획득할 수 있다.
특히, 내시프로브(200)의 Z축 이동 또는 회전 이동에 따라 실시간으로 광검출기들(170a, 170b, 170c, 170d)로부터 신호들이 전달되면, 컴퓨팅 장치(190)는 살아있는 동물의 심부 조직에서의 나타나는 형광 현상을 세포 및 분자 수준으로 실시간 영상화할 수 있다.
도 5는 한 실시예에 따른 생체 내 유리관 이식을 위한 두개골 부착형 플레이트를 설명하는 도면이다.
도 5의 (a)를 참고하면, 유리관(400)은 플레이트(500)에 부착된 상태로 동물에 이식될 수 있다. 또는 이식된 유리관(400)은 플레이트(500)에 부착될 수 있다.
플레이트(500)는 현미경 장치(100)에 결합된 내시프로브(200)와의 정밀한 축 조정을 위하여, 적어도 하나의 유리관이 삽입되는 홀 위치가 결정된다. 또한, 플레이트(500)가 모터 스테이지(motorized stage)에 고정되어 유리관(400)이 부착된 동물을 정위 고정할 수 있다. 플레이트(500)덕분에, 내시프로브(200)와 유리관(400)이 기계적 정렬되어, 내시프로브(200)가 정확하고 안정적이고 반복적으로 유리관(400)에 삽입될 수 있다.
살아있는 동물에 유리관 이식 시 출혈에 의한 모세관 현상이 일어날 수 있으므로, 유리관 삽입술은 광학접착제로 유리관 하단을 막은 후 생체 조직 내 유리관 삽입을 할 수 있다. 특히, 본 발명은 플레이트(500)에 부착된 유리관(400)을 뇌 조직에 삽입하는 수술법을 통해, 생리적, 행동적 특성이 유지되는 생체 조직의 미세 영상을 획득할 수 있다.
플레이트 모양은 유리관이 삽입되는 위치 및 유리관의 크기와 길이, 유리관이 삽입되는 동물의 크기 및 부위, 플레이트가 고정되는 스테이지의 구조에 따라 다양하게 변경될 수 있다.
도 5의 (b)를 참고하면, 마우스의 뇌 조직에 삽입되는 유리관을 고정하는 두개골 부착형 플레이트(500)는 예를 들면, 유리관 삽입 플레이트(510), 유리관 삽입 플레이트(510) 양단에 연결된 스테이지 고정 플레이트들(530, 550)로 구성될 수 있다. 유리관 삽입 플레이트(510)는 유리관이 삽입되는 적어도 하나의 홀이 있다.
도 5의 (c)를 참고하면, 유리관 삽입 플레이트(510)의 홀을 통해 유리관이 부착 및 고정된다.
도 6은 한 실시예에 따른 미세 영상 획득 시스템의 스테이지에 마우스가 고정된 모습을 설명하는 도면이고, 도 7은 한 실시예에 따른 미세 영상 획득 시스템으로 획득한 마우스의 뇌조직 영상의 예시이다.
도 6의 (a)를 참고하면, 유리관 삽입술로 두개골 부착형 플레이트(500)가 부착된 마우스가 미세 영상 획득 시스템의 스테이지(600)에 놓이고, 두개골 부착형 플레이트(500)가 스테이지(600)에 정위 고정된다. 이후, 회전형 프로브 이동 장치(300)에 결합된 내시프로브(200)가 수직 이동 및 회전하고, 대물 렌즈(150)에서 투과된 빛이 내시프로브(200)로 전달되어 유리관 내 심부 조직으로 빛이 조사된다.
실제로, 도 6의 (b)와 같이, 미세 영상 획득 시스템의 스테이지에 마우스가 고정될 수 있다.
영상 획들을 위해 DyLight 594 형광이 결합된 Lectin 항체를 실험 전 1시간 전에 CX3CR1-GFP 마우스에 주입한다. 그러면 혈관(blood vessel)이 염색되고, 뇌 조직의 microglia 세포가 녹색 형광을 발현하여 도 7과 같은 형광 영상이 획득된다. 내시프로브(200)의 수직 이동 및 회전운동, 그리고 모터 스테이지(600)의 수직 이동이 동시에 진행되면서 다중 파장의 빛을 조사하므로, 도 7과 같이 확장된 영역에서 고해상도 세포 수준 영상을 획득할 수 있다.
도 7을 참고하면, 생체 심부조직의 대면적 및 다채널 영상화를 통해, Lectin549 항체로 염색된 혈관과 GFP-expressing microglia를 듀얼 컬러로 구분하여 영상화할 수 있다.
영상 획득 후 조직 적출 및 고정을 통하여 뇌 조직 내 삽입 좌표 및 깊이를 재검증할 수 있다.
도 8은 한 실시예에 따라 획득한 대면적 형광 영상의 예시이다.
도 8을 참고하면, 얇은 유리관을 따라 내시프로브(200)를 안정적이고 반복적으로 삽입할 수 있는 미세 영상 획득 시스템(10)에, FITC 형광물질이 도포된 렌즈 티슈 샘플을 적용한 결과, 내시프로브(200)의 수직 이동 및 회전에 의해 대면적 형광 영상을 얻을 수 있다.
도 9는 한 실시예에 따른 미세 영상 획득 방법의 흐름도이다.
도 9를 참고하면, 미세 영상 획득 시스템(10)은 현미경 장치(100)의 복수 파장들의 빛을 내시프로브(200)를 통해 생체 조직으로 조사한다(S110). 현미경 장치(100)의 대물렌즈를 통과한 빛은 내시프로브(200)로 전달된다.
미세 영상 획득 시스템(10)은 생체 조직에 이식된 유리관에 삽입되어 회전 및 수직 이동하면서 생체 조직에 빛을 조사하는 내시프로브(200)로부터, 생체 조직에서 발광된 형광 신호를 획득한다(S120).
미세 영상 획득 시스템(10)은 내시프로브(200)부터 획득한 형광 신호를 파장별로 분리 및 검출한다(S130).
미세 영상 획득 시스템(10)은 내시프로브(200)의 이동 위치에 따른 형광 신호 검출 위치를 고려하여, 내시프로브(200)부터 획득한 형광 신호를 2차원 또는 3차원 영상으로 생성한다(S140). 내시프로브(200)의 이동 위치는 내시프로브(200)의 회전 및 수직 이동에 의해 결정된다.
도 10은 다른 실시예에 따른 생체에 이식된 이식 장치의 예시이다.
도 10을 참고하면, 살아있는 동물의 조직에 얇은 유리관(400)이 이식될 수 있고, 또는 사각 이미징 챔버(square-type window chamber)(410)가 이식될 수 있다.
사각 이미징 챔버(410)는 챔버(411)와 상단 날개(413)로 제작될 수 있다. 챔버(411)는 사각형의 관 모양으로 일정 공간을 형성한다. 챔버(411)의 아랫면은 막힌 상태로 제작될 수 있다. 또는 챔버(411)의 아랫면은 뚫린 상태로 제작될 수 있고, 실험자가 얇은 판을 아래에 덧붙일 수 있다. 챔버(411)의 옆면은 유리판이 부착된다. 또는, 챔버(4110)의 옆면은 뚫린 상태로 제작되고, 실험자가 유리판을 optic bond로 부착할 수 있다. 옆면에 부착되는 유리판을 통해 회전형 내시 프로브(200)의 빛이 조직으로 전달될 수 있다.
상단 날개(413)는 챔버(411)를 고정하는 날개와, 챔버(411)로 내시 프로브(200)를 삽입하는 통로가 형성되어 있다. 예를 들면, 사각 이미징 챔버(410)가 뇌 조직에 이식되는 경우, 상단 날개(413)는 머리(skull)에 안정적으로 부착될 수 있다. 이러한 상단 날개(413)는 도 3과 같이 복잡한 구조의 플레이트를 대체하거나, 간단하게 구현할 수 있다.
참고로, 도 10에서, 내시프로브(200)가 사각 이미징 챔버(410)에 삽입된다는 것을 표현하기 위한 것으로서, 내시프로브(200)와 사각 이미징 챔버(410)의 크기는 다양하게 변경될 수 있다.
사각 이미징 챔버(410)는 얇은 유리관(400)보다 더 넓은 평면에 대하여 이미징할 수 있다. 사각 이미징 챔버(410)는 유리판 부착면과 평행하게 움직이며 상하 운동을 하므로, 얇은 유리관(400)보다 더 확장된 심부조직을 영상화할 수 있다.
이와 같이, 본 발명은 유리관(400) 또는 사각 이미징 챔버(410)를 생체 내 이식하고, 이식 장치 내부로 내시 프로브를 삽입함으로써, 살아있는 동물 내 심부조직으로 반복적으로 접근하는 것을 가능하게 한다. 특히, 유리관(400) 또는 사각 이미징 챔버(410)를 통해, 해당 심부 영역에 대해 보다 확장된 영역의 다채널 세포수준 영상화를 가능하게 한다.
이와 같이, 미세 영상 획득 시스템(10)은 동물 조직을 형광 영상화하므로, 생리적 특성 및 행동 특성이 유지된 생체 조직에서 일어나는 현상을 실시간으로 정확히 관찰할 수 있다.
미세 영상 획득 시스템(10)은 동일한 생체 심부 조직의 미세 영상을 반복적으로 획득할 수 있으므로, 시간에 따른 생체 조직 변화를 장기적이고 반복적으로 관찰할 수 있다.
미세 영상 획득 시스템(10)은 내시프로브가 수직 이동 및 회전하므로, 대면적의 확장된 영상을 획득할 수 있고, 2차원뿐만 아니라 3차원의 입체적 영상을 획득할 수 있다.
미세 영상 획득 시스템(10)은 기존 형광 내시현미경으로 접근할 수 없는 심부 조직으로도 안정적으로 접근할 수 있다. 따라서, 미세 영상 획득 시스템(10)은 뇌 조직을 포함한 다양한 심부 조직에서 발생하는 다양한 질병 혹은 생물학적 현상들을 확인할 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명의 실시예는 장치 및 방법을 통해서만 구현이 되는 것은 아니며, 본 발명의 실시예의 구성에 대응하는 기능을 실현하는 프로그램 또는 그 프로그램이 기록된 기록 매체를 통해 구현될 수도 있다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (16)

  1. 미세 영상 획득 시스템으로서,
    복수 파장들의 빛을 주사(scanning)하여 대물 렌즈로 전달하고, 생체 조직에서 반사되어 대물 렌즈로 들어온 형광 신호를 검출하는 현미경 장치,
    생체에 이식된 이식 장치에 삽입되어 상기 대물 렌즈에서 입사된 빛을 아랫단의 측면 개구부로 전달하고, 형광 물질 표지된 상기 생체 조직에서 발광된 형광 신호를 상기 대물 렌즈로 전달하는 렌즈로 구성된 내시프로브, 그리고
    상기 내시프로브를 고정하고, 고정된 상기 내시프로브를 회전 또는 수직 이동시키는 회전형 프로브 이동 장치
    를 포함하는 미세 영상 획득 시스템.
  2. 제1항에서,
    상기 내시프로브는
    상기 대물 렌즈를 투과한 빛을 전달하는 굴절률 분포형 렌즈(gradient index lens, GRIN lens), 그리고 상기 굴절률 분포형 렌즈로부터 전달된 빛을 측면으로 조사하는 마이크로프리즘을 포함하는, 미세 영상 획득 시스템.
  3. 제1항에서,
    상기 내시프로브는
    커플링 렌즈(coupling lens), 릴레이 렌즈(relay lens), 그리고 이미징 렌즈(imaging lens)로 구성되는 미세 영상 획득 시스템.
  4. 제1항에서,
    상기 회전형 프로브 이동 장치는
    상기 내시프로브를 고정하는 프로브 홀더,
    상기 프로브 홀더를 끼우고 회전시키는 회전 틀, 그리고
    상기 회전 틀을 수직 또는 수평 이동시키는 이동 스테이지
    를 포함하는, 미세 영상 획득 시스템.
  5. 제4항에서,
    상기 회전형 프로브 이동 장치는
    상기 회전 틀을 움직여 상기 프로브 홀더에 고정된 상기 내시프로브를 회전시키고, 상기 이동 스테이지를 움직여 상기 내시프로브를 수직 방향으로 이동시키는, 미세 영상 획득 시스템.
  6. 제1항에서,
    상기 이식 장치가 이식된 동물을 정위 고정(stereotactic system)하는 스테이지를 더 포함하고,
    상기 이식 장치를 부착한 플레이트가 상기 스테이지에 고정되는, 미세 영상 획득 시스템.
  7. 제1항에서,
    상기 이식 장치는 상기 플레이트에 고정되어 상기 동물에 이식되는, 미세 영상 획득 시스템.
  8. 제1항에서,
    상기 이식 장치는 상기 내시프로브에서 조사된 빛의 굴절을 조절하는 특정 굴절률의 액체로 채워지는, 미세 영상 획득 시스템
  9. 제1항에서,
    상기 현미경 장치는
    상기 복수 파장들의 빛을 방출하는 레이저 광원들,
    복수의 거울들을 이용하여 상기 레이저 광원들로부터 나오는 빛을 주사하는 스캐너,
    상기 스캐너를 통과하여 나온 빛을 상기 내시프로브로 전달하는 상기 대물 렌즈,
    상기 내시프로브로부터 들어온 형광 신호 중에서 공초점면에 설치된 핀홀들을 통과한 형광 신호를 파장별로 검출하는 광검출기들, 그리고
    상기 광검출기들에서 출력된 신호들을 조합하여 영상을 생성하는 컴퓨팅 장치를 포함하는, 미세 영상 획득 시스템.
  10. 제1항에서,
    상기 현미경 장치는
    다광자 현미경(Multi-photon microscopy)을 포함하는, 미세 영상 획득 시스템.
  11. 제1항에서,
    상기 컴퓨팅 장치는
    상기 내시프로브가 회전하는 경우, 특정 깊이의 생체 조직에 표지된 형광 물질이 상기 레이저 광원들에 의해 여기되어 나타나는 형광 영상을 생성하는, 미세 영상 획득 시스템.
  12. 제9항에서,
    상기 컴퓨팅 장치는
    상기 내시프로브의 회전 및 수직 이동 위치를 기초로, 상기 생체 조직의 형광 영상을 입체적으로 생성하는, 미세 영상 획득 시스템.
  13. 제1항에서,
    상기 이식 장치는
    상기 내시프로브가 삽입되는 통로가 구현된 유리관(wall glass capillary) 또는 사각 이미징 챔버(square-type window chamber)인, 미세 영상 획득 시스템.
  14. 미세 영상 획득 시스템의 미세 영상 획득 방법으로서,
    현미경 장치의 복수 파장들의 빛을 내시프로브를 통해 생체 조직으로 조사하는 단계, 그리고
    상기 생체 조직에서 발광된 형광 신호를 이용하여, 상기 생체 조직에 표지된 형광 물질이 다중 파장 레이저에 의해 여기되어 나타나는 형광 영상을 생성하는 단계를 포함하고,
    상기 복수 파장들의 빛은 상기 현미경 장치의 대물 렌즈에서 상기 내시프로브의 렌즈로 전달되어 상기 내시프로브의 측면 개부구 주변의 생체 조직에 조사되고, 상기 형광 신호는 상기 내시프로브의 렌즈에서 상기 대물 렌즈로 전달되며,
    상기 내시프로브는 생체 조직에 이식된 유리관(wall glass capillary) 또는 사각 이미징 챔버(square-type window chamber)에 삽입되어 회전 및 수직 이동하는, 미세 영상 획득 방법.
  15. 제14항에서,
    상기 형광 영상을 생성하는 단계는
    상기 내시프로브의 회전 및 수직 이동 위치를 기초로, 상기 생체 조직의 형광 영상을 입체적으로 생성하는, 미세 영상 획득 방법.
  16. 제14항에서,
    상기 현미경 장치는 공초점 현미경 또는 다광자 현미경을 포함하는, 미세 영상 획득 방법.
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