WO2020079302A2 - Gel lipidico nanoestructurado, procedimiento de preparacion y uso - Google Patents

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Definitions

  • the present invention is framed in the field of topical and ocular formulations with potential bioedicical applications.
  • the object of the invention is a ge! Nanostructured lipid formed by interleaving of sheets and vesicles and composed of phospholipids, fatty acids and a high water content. Its structure and fluidity respond reversibly to temperature and pH and are capable of transporting at least one hydrophilic substance inside the foot! and also to follicle. Their particular organization, with part of the water trapped in vesicles and these vesicles trapped or sandwiched between extended sheets, makes them very suitable as systems to incorporate molecules of different polar nature in different compartments. Its exclusively lipid composition guarantees high blocompatibility and its rheological behavior makes them easily applicable topically and ocularly.
  • Another object of the present invention is the procedure for preparing said gels and their use in topical and ocular applications.
  • the dense emulsion / gei type systems made up of lipids usually form only at high lipid concentrations (> 50%) generating phases of high packaging such as cubic or lamellar [L. Rydhag, I. Wiiton, The fun ⁇ an of phospholipids of soybean ecithin in emulsiona, J. Am. Oil Chem. Soc. 58 (1981) 830-837]
  • W02006 / 122638 which refers to bialuronic acid or derivatives thereof structured in liposomes for the repair of skin and tissue defects
  • ES2423760 describes a process for the manufacture of a base cosmetic composition that includes coating liposomes with a particle size of 250-600 nm in an aqueous gel with a viscosity in the range of 4,000 to 20,000 mPa s, which include in its volume aqueous three or four liposomes respectively containing at least one active substance in their aqueous volume, where the active substances contained in the included liposomes are different from each other and the included liposomes have a particle size in the range of 50-200 nm.
  • the three or four liposomes are introduced by stirring in water and then a liposome-forming agent, a gelling agent and a neutralizing product are introduced into the mixture of water and liposomes.
  • WO20Q6 / 0Q2G50 presents an injectable non-liposomal composition for use as a tissue filler in the form of a gel or paste comprising a phospholipid component in a range of between 10% and 90% relative to the total weight of the composition. No reference is made to the presence of a fatty acid in the lipid composition that is present in a range of 10% to 90%.
  • the object of the invention is a pharmaceutical composition for the controlled release of an active compound, which comprises a vesicular phospholipidic gel with packaged liposomes.
  • the percentage of phospholipid in the composition is at least 30% and the presence of any fatty acid is not related.
  • WO2011 / 101153 claims liposomes containing cosmetic or dermopharmaceutical active ingredients and adjuvants linked to cationic polymers. Whatever phosphoipid is in the liposome composition, there is always the presence of a polymer.
  • the object of the present invention is a nanostructured lipid gel formed by intercalating sheets and vesicles.
  • nanostructured gel should be understood as referring to materials with gel-like rheological behavior that are organized with at least one dimension below 100 nm. It has been observed that they are also organized on the micro scale. That is to say, they are organized both in the nano and in the microscale.
  • the nanostructured gel can be formed with a low lipid content, the intervention of polymers or surfactants not being necessary to promote dispersion.
  • the first aspect of the present invention is a nanostructured Iipidic gel formed by intercalating sheets and vesicles, characterized in that it comprises: - Between 3% and 30% lipid concentration formed by a mixture of phospholipids and fatty acids in a molar ratio between 5: 1 and 1: 1 without the presence of polymers or surfactants
  • the lipid gel has:
  • the phospholipid is selected, among others, from phosphatidiicolines, phosphatidylserines, phosphatidylglycero !, phosphatidylinositol and phosphatidylethanolamines, preferably being hydrogenated soybean phosphatidylcholine.
  • Fatty acid is a fatty acid of chain length between 10 and 24 C atoms, saturated or unsaturated with one or more double bonds; Fatty acid is preferably selected from palmitic, stearic, oleic, iinoleic, lignoceric, icosapentaenoic (ERA) or docosahexaenoic (DHA). Oieic acid is that used in preferred embodiments.
  • the lipid gel incorporates an active ingredient that is selected from a hydrophilic compound or a lipophilic compound.
  • active ingredient options are:
  • a second aspect of the present invention constitutes a process for preparing a nanostructured lipid gel as defined above, comprising the steps of:
  • the mixture is dispersed by mixing the lipid components at the specified concentrations and molar ratios in an organic solvent, particularly chloroform. Depending on the lipids used, other solvents such as ethanol, methanol or mixtures thereof may be required. Subsequently, the solvent is evaporated on a rotary evaporator followed by drying and subsequent hydration by adding the water in the specified concentration range under stirring conditions and at room temperature. As for adjusting the pH of the lipid dispersion, it can be done with a sodium hydroxide solution.
  • a third aspect of the invention is the use of a nanostructured lipid gel as defined above in cutaneous, mucous or ocular application systems.
  • Figure 1 oscillatory test as a function of frequency to confirm the rheological behavior of the material as a gel and comparison with the lipid dispersion of the article by Talló K. et al. (2016).
  • Figure 2 images of transmission electron cryomicroscopy (cryo-TEM) showing the lamellar and vesicular structure of the gels.
  • SAXS Small angle X-ray scattering profile
  • FIG 4 A) Large angle X-ray scattering profile (WAXS)
  • Figure 5 section of skin showing retention of the lipid system (red) and marking of the epidermis (blue).
  • Figure 6 section of skin with a follicle (white arrow) where the permeation of fluorescence (green) and the marking of the epidermis (blue) can be seen.
  • Figure 7 Effect of the gel on the wound.
  • the main novel feature of the lipid gels object of the present invention is that a mixture formed solely of lipids, without the intervention of polymers or surfactants, and that contains a very high water content, up to 97%, is capable of being structured as a gel.
  • dense emulsion / gel type systems consisting solely of lipids usually form at high lipid concentrations (> 50%) generating high packaging phases such as cubic or lamellar, while the More dilute systems require other compounds such as surfactants, geifying agents or polymers to achieve a gel-like rheological behavior.
  • the gel maintains a semi-rigid structure and shows a translucent white color at room temperature, while it becomes fluid and transparent from a certain temperature that varies depending on the lipid composition of the system and can be from 5 ° C. It should be noted that this process is reversible and the gel structure recovers once cooled below that variable temperature depending on the lipid composition of the system.
  • the phospholipids most used to prepare the systems are part of the group of phosphatidylcholines and are a commercial product obtained from soy lecithin known in English as "hydrogenated soy phosphatidylcholine (HSPC)”.
  • the HSPC is mixed with oleic acid (AO) in a molar ratio of 3: 1 and the pH is adjusted to 5-8 by sodium hydroxide. This pH range is a determining factor for the correct gel formation.
  • the total lipid concentration by weight (HSPC + AO) has been established as optimal at 5% since highly diluted systems ( ⁇ 3%) do not form, while more concentrated systems (> 10%) are difficult to disperse with methods. conventional.
  • a freezing process of the lipid dispersion is necessary, followed by a heating process.
  • the results obtained are equivalent, although the formation and reversibility conditions vary depending on physicochemical parameters of lipids.
  • the molar ratio between the lipids present in the mixture can vary with similar results.
  • the lipid concentration with which most of our results have been obtained has been 5%, higher concentrations also give rise to the formation of these gels.
  • Table 1 shows several examples of systems that make up the gel with a description of their appearance and behavior:
  • HSPC hydrogenated soybean phosphatidiicoline
  • LA igneous acid
  • SA stearic acid
  • the main objective of this technique is to determine if the obtained samples behaved rheologically like a gel.
  • SAXS Small Angle X-ray Scattering
  • the gei is composed of a laminar structure.
  • SAXS narrow angle X-ray scattering profile
  • the location of the following Bragg bands at positions 3q and 4q indicate a multilayered structure that would have a spacing of 7 nm and an organization as shown in Figure 3B.
  • WAXS Wide Angle X-ray Scattering
  • FIG 5 it can be seen how the lipid matrix of the gei (red) is retained in the upper part of the stratum corneum (outermost layer of the foot!) Without reaching the epidermis (blue).
  • Figure 6 shows how fluorescein dissolved in the aqueous phase of the gei (green) is able to permeate through the skin, covering the entire stratum corneum and the epidermis. From! In the same way it can be seen how it is also able to go down through the follicle, even dyeing the hair (blue arrow). It is important to mention that a control was performed with an aqueous solution with fluorescein (without incorporating the ge!) And it only got to incorporate slightly in the stratum corneum.
  • Wound skin explants were seeded into culture wells using DMEM as the culture medium supplemented with FBS, antibiotics, and L-glutamine. The atonements were kept in these culture conditions for 14 days. During this period, the wound produced in the skin explants was treated with the gel every other day. Explants with wound and without treatment were kept in culture for comparative purposes.
  • the explants were frozen in liquid nitrogen soaked in OCT. Skin cuts of 8 microns were made using a cryostat. Said sections were stained with Eosin and Hematoxylin and observed with an optical microscope.
  • Figure 7 shows the difference between gel-treated and untreated wounds. It is observed that the Iipidic matrix of the gel (blue color of Hematoxylin) is retained in the wound. In addition, some re-epithelisation and wound closure can be observed in treated wounds relative to untreated ones. Behavior
  • Theological gel makes it easy to apply and to remain confined to the application area. Its structure, large interconnected vesicles, could act as a support for the skin cells to grow, promoting the healing of! tissue. Large sheets could also favor the growth of new cells and, in addition, being sheets formed by lipid bilayers with a structure very similar to the lipid matrix of the dermal stratum corneum, they could protect the wound and promote proper recovery of barrier function. Once the wound is healed, or during the healing process, the gel structure would be dismantled and the components of the gel, lipids and water, completely biocompatibies, could be integrated into the tissue structure.
  • the appearance of vascular injury or coagulation in response to a compound is the basis for employing this technique as an indicator of the probability that a substance will damage mucous membranes, especially the cornea of the human eye, in vitro.
  • the eggshell is carefully removed, moistening the membrane with a NaCI solution at 37 ° C. Then the NaCI solution is removed and the white membrane is removed without damaging any blood vessels.
  • Ocular Irritation Index (Ol ⁇ )
  • H, V, and C are the time in seconds when that change appears. If there is no alteration, they are equivalent to 300.
  • the result obtained from the formula can be interpreted using Table 2:

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Abstract

El objeto de la invención es un gel lipídico nanoestructurado formado por intercalado de láminas y vesículas y compuesto por fosfolípidos, ácidos grasos y un alto contenido en agua. Su estructura y fluidez responden de forma reversible a la temperatura y al pH y son capaces de transportar al menos un principio activo dentro de la piel y también a folículo. Su composición exclusivamente lipídica garantiza alta biocompatibilidad y su comportamiento reológico los hace fácilmente aplicables a nivel tópico y ocular.

Description

DESCRIPCIÓN
GEL LIPIPICO NANOESTKUCTUKADO. PROCEDIMIENTO DE PREPARACION Y
USO
SECTOR DE LA TÉCNICA Y OBJETO DE LA ¡INVENCION
La presente invención se enmarca en ei sector de las formulaciones tópicas y oculares con potenciales aplicaciones bio édicas.
El objeto de la invención es un ge! lipídico nanoestructurado formado por intercalado de láminas y vesículas y compuesto por fosfolípidos, ácidos grasos y un alto contenido en agua. Su estructura y fluidez responden de forma reversible a la temperatura y al pH y son capaces de transportar al menos una sustancia hidrofílica dentro de la pie! y también a folículo. Su particular organización, con parte del agua atrapada en vesículas y estas vesículas atrapadas o intercaladas entre láminas extendidas, ¡os hace muy adecuados como sistemas para incorporar moléculas de diferente naturaleza polar en diferentes compartimentos. Su composición exclusivamente lipídica garantiza alta blocompatibilidad y su comportamiento reológico los hace fácilmente aplicables a nivel tópico y ocular.
Constituye otro objeto de la presente invención el procedimiento de preparación de los referidos geles y su uso en aplicaciones tópicas y oculares.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Los sistemas de tipo emulsión/gei densos constituidos por lípidos suelen formarse únicamente a altas concentraciones lipídicas (>50%) generando fases de alto empaquetamiento como las cúbicas o lamelares [L. Rydhag, I. Wiiton, The fun ían of phospholipids of soybean ¡ecithin in emulsiona, J. Am. Oil Chem. Soc. 58 (1981) 830- 837]
Los sistemas más diluidos requieren de otros compuestos tales como tensioactivos, geiificantes o polímeros para conseguir la gelífícacíón [H.E. Warriner, S.H.J. ídzíak, N.L Slack, P. Davidson, C.R. Safinya, Lameüar Biogels: Fluid-Membrane-Based Hydrogels Contaíning Poíymer Lipids, Science 271 (1996) p. 969 -973] [US6207186] Estos compuestos restan biocompatibilidad a los sistemas y pueden causar sensibilizaciones y respuestas adversas en aplicaciones biomédicas.
Otros documentos de interés y que reflejan el estado de la técnica son:
W02006/122638, que hace referencia a ácido bialurónico o derivados del mismo estructurados en líposomas para la reparación de defectos de la piel y de tejidos
No se refiere en este documento la utilización de ácidos grasos en la composición de la fase lipídica ni la proporción de agua
ES2423760 describe un procedimiento para la fabricación de una composición cosmética de base que incluye líposomas de revestimiento con un tamaño de partícula de 250-600 nm en un gel acuoso con una viscosidad en el rango de 4.000 hasta 20.000 mPa s, que incluyen en su volumen acuoso tres o cuatro líposomas que contienen respectivamente ai menos una sustancia activa en su volumen acuoso, donde las sustancias activas contenidas en los líposomas incluidos son diferentes las unas de las otras y los líposomas incluidos poseen un tamaño de partícula en el rango de 50-200 nm. Los tres o cuatro líposomas se introducen mediante agitación en agua y a continuación en la mezcla de agua y líposomas se introduce un agente formador de líposomas, un agente gelificante y un producto neutralizante. Como agentes formadores de líposomas se mencionan, entre otros, la lecitina y la fosfatidiicolina, pero no se refiere la presencia de ácidos grasos. El documento WO20Q6/0Q2G50 presenta una composición no liposomal inyectable para ser usada como rellenador de tejidos en forma de gel o pasta que comprende un componente fosfolipídlco en un rango comprendido entre el 10% y el 90% respecto ai peso total de la composición. No se hace ninguna referencia a la presencia de un ácido graso en la composición lipídica que está presente en un rango del 10% al 90%. En el documento EP221Q589 el objeto de la invención es una composición farmacéutica para la liberación controlada de un compuesto activo, que comprende un gel fosfolipídlco vesicular con líposomas empaquetados. El porcentaje de fosfolípido en la composición es de, al menos, el 30% y no se refiere la presencia de ningún ácido graso. En WO2011/101153 se reivindican liposomas que contienen ingredientes cosméticos o dermofarmaceútícamente activos y adyuvantes unidos a polímeros catiónicos. Sea cual sea el fosfoiípido que esté en la composición de los liposomas, siempre se cuenta con la presencia de un polímero.
El artículo de Talló, K; López, O. y col. Vesicular nanostructures composed of oleica cid and phosphatidylcholine: Effect of pH and moiar ratio ; Chemistry and Physics of Lipids 213 (2018) 96 - 101 se refiere a sistemas nanoestructurados formados por fosfatidilcoiina hidrogenada de soja y ácido oleico. Se observó que los medios alcalinos y las proporciones elevadas de ácido oleico incrementaban la fluidez de ¡as membranas. El producto que se obtiene es una dispersión líquida. En este artículo, el término“gel” hace referencia a la fase gel, también conocida como fase cristalina o sólida de las membranas lipídicas. Esto no significa que el sistema se comporte macroscópicamente como un ge!, sino que a nivel molecular las cadenas hidrocarbonadas se encuentran empaquetadas dando una mayor rigidez a las membranas que forman ios sistemas.
Figure imgf000004_0001
El objeto de la presente invención es un gel íipídico nanoestructurado formado por intercalado de láminas y vesículas.
En el contexto de la presente invención, el término “gel nanoestructurado” debe entenderse como relativo a materiales con comportamiento reológico tipo gel que están organizados con al menos una dimensión por debajo de los 100 nm. Se ba observado que también se organizan en la escala micro. Es decir están organizados tanto en la nano como en la microescaia.
A diferencia de la mayoría de métodos conocidos reflejados en la discusión del estado de la técnica, en la presente invención el gel nanoestructurado puede formarse con un contenido bajo en lípido, no siendo necesaria la intervención de polímeros o tensoactivos para favorecer la dispersión.
El primer aspecto de la presente invención es un gel Iipídico nanoestructurado formado por intercalado de láminas y vesículas, caracterizado porque comprende: - entre un 3% y un 30% de concentración lipídica formada por una mezcla de fosfolípidos y ácidos grasos en relación molar comprendida entre 5:1 y 1 :1 sin presencia de polímeros o tensoactivos
- entre un 70% y un 97% de agua.
En un modo preferente de realización, el gel lipídico presenta:
- una concentración lipídica comprendida entre un 3% y un 10%
- una relación molar entre fosfolípidos y ácidos grasos comprendida entre 3:1 y 1 :1
- un contendido en agua comprendido entre el 90% y el 97%.
El fosfolípido se selecciona, entre otros, de fosfatidiicolinas, fosfatidilserinas, fosfatidilglicero!, fosfatidilinositol y fosfatidiletanolaminas, siendo preferentemente fosfatidilcolina de soja hidrogenada.
El ácido graso es un ácido graso de longitud de cadena entre 10 y 24 átomos de C, saturado o insaturado con uno o más dobles enlaces; preferentemente el ácido graso se selecciona entre palmítico, esteárico, oieico, iinoleico, lignocérico, icosapentaenoico (ERA) o docosahexaenoico (DHA). El ácido oieico es el utilizado en modos preferentes de realización.
Para su utilización en sistemas de aplicación cutánea u ocular, el gel lipídico incorpora un principio activo que se selecciona entre un compuesto hidrofílico o un compuesto iipofíiico. Algunas opciones de principio activo son:
- esfingoiípidos
- colesterol
- antioxidantes
- antibióticos
- antiinflamatorios
- proteínas
Para comprobar que moléculas de diferente naturaleza se incorporan bien en el sistema y poder hacer un seguimiento dentro de la piel, se utilizan compuestos como por ejemplo la fluoresceína sódica o un conjugado Iipofíiico de la rodamina. Constituye un segundo aspecto de la presente invención un procedimiento de preparación de un gel ¡ipídico nanoestructurado según se ha definido anteriormente, que comprende las etapas de:
- dispersión de la mezcla de los componentes lipidíeos en agua sin intervención de polímeros o tensoactivos
- formación del gel a partir de la dispersión lipídica obtenida en la etapa anterior
El procedimiento se lleva a cabo sin intervención de polímeros o tensoactivos comprendiendo la formación del gel las siguientes subetapas:
- ajuste del pH de la dispersión lipídica entre 5 y 8 con un compuesto básico
- congelación de la dispersión con pH ajustado a una temperatura igual o inferior a 20°C durante un periodo de tiempo de al menos 1 minuto
- descongelación y calentamiento de la dispersión a una temperatura comprendida entre 5 y 90°C.
- enfriamiento a temperatura ambiente de la dispersión geiificada procedente de la etapa anterior.
En un modo preferente de realización, la dispersión de la mezcla se realiza mezclando ios componentes lipidíeos a las concentraciones y relaciones molares especificadas en un disolvente orgánico, particularmente cloroformo. Según ios lípidos usados, podrían requerirse otros disolventes como etanol, metanol o mezclas de ios mismos. Posteriormente, se procede a la evaporación del disolvente en rotavapor seguido de desecación y posterior hidratación mediante adición del agua en el rango de concentraciones especificadas en condiciones de agitación y a temperatura ambiente. En cuanto ai ajuste del pH de la dispersión lipídica, puede realizarse con una solución de hidróxido sódico.
Por último, constituye un tercer aspecto de la invención el uso de un gel lipídico nanoestructurado según se ha definido anteriormente en sistemas de aplicación cutánea, mucosa u ocular.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1 : ensayo oscilatorio en función de la frecuencia para confirmación del comportamiento reológico del material como un gel y comparación con la dispersión lipídica del artículo de Talló K. et al. (2018). Figura 2: imágenes de criomicroscopía electrónica de transmisión (cryo-TEM) donde se aprecia la estructura laminar y vesicular de los geles.
Figura 3: A) perfil de dispersión de rayos X con ángulo pequeño (SAXS)
B) estructura lamelar
Figura 4: A) perfil de dispersión de rayos X con ángulo grande (WAXS)
B) empaquetamiento hexagonal
Figura 5: sección de piel donde se aprecia la retención del sistema lipídico (rojo) y el mareaje de la epidermis (azul).
Figura 6: sección de piel con un folículo (flecha blanca) donde se aprecia la permeación de la fluorescencia (verde) y el mareaje de la epidermis (azul).
Figura 7: Efecto del gel sobre herida.
DESCRIPCIÓN DETALLADA Y IVIODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCION
La principal característica novedosa de los geles lipidíeos objeto de la presente invención es que una mezcla formada únicamente por lípidos, sin intervención de polímeros o tensoactivos, y que contiene un muy alto contenido en agua, hasta el 97%, sea capaz de estructurarse como un gel. Como se ha indicado en la discusión del estado de la técnica, ios sistemas de tipo emulsión/gel densos constituidos únicamente por lípidos suelen formarse a altas concentraciones iipídicas (>50%) generando fases de alto empaquetamiento como las cúbicas o lamelares, mientras que los sistemas más diluidos requieren de otros compuestos tales como tensoactivos, geiificantes o polímeros para conseguir un comportamiento reológico tipo gel.
Una vez formado, el gel mantiene una estructura semirrígida y muestra un color blanco translúcido a temperatura ambiente, mientras que se vuelve fluido y transparente a partir de determinada temperatura que varía en función de la composición iipídica del sistema y que puede ser a partir de 5°C. Cabe destacar que este proceso es reversible y la estructura de gel se recupera una vez enfriado por debajo de esa temperatura variable en función de la composición Iipídica del sistema.
Composición
Los fosfolípidos más usados para preparar los sistemas forman parte del grupo de las fosfatidilcolinas y son un producto comercial obtenido a partir de lecitina de soja conocido en inglés como“hydrogenated soy phosphatidylcholine (HSPC)”. i
Para formar el gel se mezcla la HSPC con el ácido oleico (AO) en una relación molar de 3:1 y se ajusta el pH entre 5 - 8 mediante hidróxido de sodio. Este rango de pH es un factor determinante para la correcta formación del gel. La concentración lipídica total en peso (HSPC + AO) se ha establecido como óptima en un 5% ya que sistemas muy diluidos (< 3%) no se forman, mientras que sistemas más concentrados (> 10%) son difíciles de dispersar con métodos convencionales.
Para la formación de los geles es necesario un proceso de congelación de la dispersión lipídica y luego uno de calentamiento. Con otros fosfolípidos de diferentes características al HSPC, particularmente diferentes cabezas polares y diferentes cadenas alquílicas, y con otros ácidos grasos distintos al ácido oleico, los resultados obtenidos son equivalentes, aunque las condiciones de formación y reversibilidad varían en función de parámetros físico- químicos de los lípidos. La relación molar entre ios lípidos presentes en la mezcla puede variar con resultados similares. Aunque la concentración lipídica con la que se han obtenido la mayor parte de nuestros resultados ha sido 5%, concentraciones más altas también dan lugar a la formación de estos geles.
En la Tabla 1 se muestran varios ejemplos de sistemas que forman el gel con una descripción de su aspecto y comportamiento:
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000008_0002
HSPC: fosfatidiicolina hidrogenada de soja
DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina
DMPC: dimiristoilfosfatidilcolina
OA: ácido oleico
LA: ácido iignocérico SA: ácido esteárico
Figure imgf000009_0001
Reo!oaia
El objetivo principal de esta técnica es determinar si las muestras obtenidas se comportaban reológicamente como un gel
Iniciaimente se realizó un ensayo oscilatorio de amplitud (“Strain Sweep”) donde se determinó la zona de viscoeiasticidad lineal (LVR) para así poder trabajar con unos parámetros fiables. Seguidamente se realizó un ensayo oscilatorio en función de ¡a frecuencia (“Frequency Sweep”) para evaluar las propiedades viscosas y elásticas dei material.
Como se ha referido en la discusión dei estado de la técnica, en el artículo de Talló, K; López, O y col. Vesicular nanostructures composed of oleica cid and phosphatidylcholine: Effect of pH and molar ratio Chemistry and Physlcs of Lipids 213 (2018) 96 - 101 se presenta una dispersión acuosa de vesículas que a nivel macroscópico se comporta como un líquido viscoso. Este sistema difiere claramente a nivel reoiógico y estructural del gel iipídico nanoestructurado de la presente invención. Aunque ambos tienen ios mismos componentes químicos, el método de preparación permite que el sistema descrito en la presente solicitud se estructure como un gel y no como una simple dispersión. A simple vista se aprecia como el gel mantiene una estructura rígida mientras que la dispersión acuosa de vesículas fluye en su recipiente. Con la finalidad de mostrar que se trata de productos distintos, con un comportamiento reoiógico diferenciado, se ha realizado un ensayo oscilatorio a ambos sistemas con las mismas condiciones de pH, concentración y temperatura (Figura 1).
Tal y como se puede apreciar en la Figura 1 , el gel (invención) y la dispersión lipídica (preparada con el protocolo descrito en Talló et al. 2018) presentan un comportamiento reoiógico muy distinto. Los valores del módulo elástico (G ) y el módulo viscoso (G”) dei gel superan en dos órdenes de magnitud a los valores de G y G” de la dispersión de vesículas descrita en el artículo. Esto significa que el gel Iipídico objeto de la presente invención está mucho más estructurado a nivel microscópico dando una mayor consistencia y rigidez al producto. También se ve como el valor de G’ del gel es claramente mayor ai de G” lo que indica que el comportamiento elástico (sólido) prevalece sobre el viscoso. En cambio, para la dispersión de vesículas los valores de G’ y G” son casi idénticos, llegándose a cruzar en algún punto, lo que indica el comportamiento viscoso de la dispersión es equiparable ai elástico.
Microscopía electrónica
Para poder apreciar la estructura nanoscopica de los geles, las muestras se criofijaron siguiendo diferentes procedimientos. En algunos casos se forzó una fractura a través de la muestra para poder revelar posibles agregados de tipo laminar o vesicular. Se observaron las muestras mediante criomicroscopia electrónica de transmisión (cryo- TEM). La figura 2 muestra distintas imágenes de la muestra donde se pueden apreciar apilamientos de membranas planas extendidas combinadas con vesículas unilamilares. La extensión de las láminas alcanzaba las mieras aunque el espesor se ajusta a una membrana lipídica. Las vesículas se encuentran intercaladas entre las láminas y exhiben tamaños entorno a los 100 - 150 nm de diámetro.
Dispersión de rayos X con ánguio pequeño ( SAXS )
Con esta técnica se determinó que el gei está compuesto por una estructura laminar. Este hecho se puede apreciar a partir del perfil de dispersión de rayos X a ángulo estrecho (SAXS) mostrado en la figura 3A. En dicha figura se observa una banda ancha correspondiente a un espaciado de repetición de aproximadamente de 7 nm, calculado a partir del vector de dispersión q y la ecuación qn=2mT/d, donde d es la distancia de repetición, n el orden de dispersión y q el vector de dispersión. La localización de las siguientes bandas de Bragg en posiciones 3q y4q indican una estructura multilaminar que tendría un espaciado de 7 nm y una organización como la mostrada en la figura 3B.
Dispersión de rayos X con ángulo grande (WAXS)
Mediante esta técnica se pudo determinar el empaquetamiento lateral de los fosfolípídos. Como se muestra en la figura 4A, solo existe un único pico correspondiente a un valor de espaciado entre cabezas polares de 4.2 Á, lo cual indicaría que se trata de un empaquetamiento hexagonal tal como se muestra en la figura 4B. Aplicación sobre piel
La consistencia estructura! de un ge! supone una clara ventaja sobre una dispersión lipídica !iquida como la de Talló K. et al (2018) ya que facilita la aplicación a nivel tópico. Este factor es evidente teniendo en cuenta que la mayoría de productos comerciales para aplicación cutánea son cremas o geies. A nivel estructural, la organización laminar de membranas lipídicas confiere una mayor estabilidad al producto mientras que un sistema vesicular como el descrito en Talló et a!. (2018) tiende a agregarse y flocular si no se añaden estabilizantes. Así mismo, pequeñas diferencias estructurales a nivel microscópico pueden suponer una gran diferencia en el campo de la farmacocinética y la administración de medicamentos.
Permeación cutánea
Para evaluar el potencial de estos geles como sistemas de aplicación cutánea, se realizó un ensayo de permeación “in vitro” en pie! porcina y se realizaron observaciones mediante microscopía de fluorescencia.
Se formaron dos geles que se aplicaron sobre la superficie de la piel. En uno de ellos se formó el ge! incorporando una sonda fluorescente de color rojo (rodamina B) a fin de observar en que zonas de la pie! se retienen los fosfolípidos que forman e! gei. En el otro gei se añadió una sonda verde fluorescente (fluoresceína) en la fase acuosa con la finalidad de simular un posible principio activo soluble en agua incorporado en el ge!. El gei se aplicó suavemente sobre ¡a piel y se dejó permeando toda la noche a 37°C en un ambiente húmedo. Luego se cortó la piel en secciones y se hizo un mareaje de las células en color azul para poder distinguir las distintas capas cutáneas.
En la figura 5 se puede apreciar como la matriz lipídica del gei (rojo) queda retenida en la parte superior del estrato corneo (capa más externa de la pie!) sin llegar a la epidermis (azul). En la figura 6 se muestra como la fluoresceína disuelta en la fase acuosa del gei (verde) es capaz de permear a través de la piel llegando a cubrir todo el estrato corneo y la epidermis. De! mismo modo se aprecia como también es capaz de bajar por el folículo llegando a teñir el pelo (flecha azul). Es importante mencionar que se realizó un control con una solución acuosa con fluoresceína (sin incorporar al ge!) y solo llego a incorporarse ligeramente en el estrato corneo. Por lo tanto, el gei promovió el paso de esta molécula (fluoresceína) a través de la piel. Estos resultados demuestran que es posible la formación de geles formados por combinación de fosfolípidos y ácido oleico en agua, siendo el contenido en agua muy alto (hasta 97%). Estos geles carecen de usuales moléculas gelificantes como son polímeros o tensoactivos y su estructura y fluidez responden de forma reversible a la temperatura y ai pH. Además son capaces de transportar ai menos una sustancia hidrofílica dentro de la piel y también a folículo.
Su particular organización, con parte del agua atrapada en vesículas y estas vesículas atrapadas o intercaladas entre láminas extendidas, ios hace muy adecuados como sistemas para incorporar moléculas de diferente naturaleza polar en diferentes compartimentos. Su composición exclusivamente iipídica garantiza alta biocompatibilidad. Su comportamiento reológico los hace fácilmente aplicables a nivel tópico y ocular y su capacidad de responder a parámetros biológicos apunta hacia potenciales aplicaciones biomédicas.
Efecto cicatrizante
Para evaluar el potencial efecto cicatrizante del gel se han llevado a cabo estudios de curación de herida en explantes de piel ex-vivo.
Se produjo una herida en piel porcina recién extraída con un punch dermatológico. Los explantes de piel con herida se sembraron en pocilios de cultivo usando DMEM como medio de cultivo suplementado con FBS, antibióticos y L-glutamina. Los expiantes se mantuvieron en estas condiciones de cultivo durante 14 días. Durante este periodo la herida producida en los explantes de piel se trató con el gel cada dos días. Se mantuvieron en cultivo explantes con herida y sin tratamiento a efectos comparativos.
Después de 14 días los explantes se congelaron en nitrógeno líquido embebidos en OCT. Se efectuaron cortes de la piel de 8 mieras utilizando un criostato. Dichas secciones se tiñeron con Eosina y Hematoxílina y se observaron con un microscopio óptico.
En la figura 7 se puede observar la diferencia entre las heridas tratadas con el gel y las no tratadas. Se observa que la matriz Iipídica del gel (color azulado de la Hematoxílina) queda retenida en la herida. Además, puede observarse cierta re-epiteíízacíón y cierre de la herida en las heridas tratadas con respecto a las no tratadas. El comportamiento teológico del gel hace que sea fácil de aplicar y que se quede confinado en la zona de aplicación. Su estructura, vesículas grandes interconectadas, podrían actuar como soporte para que las células de la piel puedan crecer fomentando la curación de! tejido. Las grandes láminas también podrían favorecer el crecimiento de nuevas células y además, al ser láminas formadas por bicapas lipídicas de estructura muy similar a la matriz lipídica del estrato córneo dérmico podrían proteger la herida y fomentar la correcta recuperación de la función barrera. Una vez curada la herida, o durante el proceso de curación, la estructura del gel se iría desmontando y ios componentes del gel, lípidos y agua, completamente biocompatibies, se podrían ir integrando en la estructura del tejido.
Ensayo de irritación ocular
Con el objetivo de proponer potenciales usos del gel en aplicaciones oculares se estudió la posible irritación ocular de este material mediante ensayo Het-Cam.
El gel formado por HSPC y AO con relación molar 3:1 y concentración lipídica total 5%, se aplicó directamente sobre la membrana corioalantoidea del huevo de gallina debido a su parecido con la córnea humana. La aparición de lesión vascular o coagulación en respuesta a un compuesto es la base para emplear esta técnica como un indicador de la probabilidad de que una sustancia dañe las membranas mucosas, especialmente la córnea del ojo humano, in vitro. Para ejecutar el método se retira cuidadosamente la cáscara del huevo, humedeciendo la membrana con una solución de NaCI a 37°C. Seguidamente se elimina la solución de NaCI y se retira la membrana blanca sin dañar ningún vaso sanguíneo.
A continuación se aplica la muestra de gel y se observa la aparición de hemorragia (H), vasoconstricción (V) y / o coagulación (C) durante 5 minutos.
Finalmente, se estima el índice Ocular de Irritación (Olí) por la siguiente fórmula:
r^|~~ (301— H)-5 . (301-V)'S ^ (301— C}-9
~~ 300 300 * 300
H, V y C son el tiempo en segundos cuando aparece ese cambio. Si no hay alteración, equivalen a 300. El resultado obtenido de la fórmula puede ser interpretado mediante la Tabla 2:
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000014_0002
Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3:
Figure imgf000014_0003
Tanto la formulación inicial como la formulación diluida demostraron ser no irritantes, por io que se puede afirmar que ei gel no provoca irritación ocular.

Claims

REIVINDICACIONES
1 Ge! lipídico nanoestructurado formado por intercalado de láminas y vesículas, caracterizado porque comprende:
- entre un 3% y un 30% de concentración lipídica formada por una mezcla de fosfolípidos y ácidos grasos en relación molar comprendida entre 5:1 y 1 :1 sin presencia de polímeros o tensoactivos
- entre un 70% y un 97% de agua
2.- Gel lipídico según la reivindicación 1 , caracterizado porque:
- la concentración lipídica está comprendida entre un 3% y un 10%
- la relación molar entre fosfolípidos y ácidos grasos está comprendida entre 3:1 y 1 :1
- el contendido en agua está comprendido entre ei 90% y el 97%.
3.- Gel lipídico según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el fosfolípido se selecciona entre fosfatidiicolinas, fosfatidilserinas, fosfatidilglicero!, fosfatidiiinositol y fosfatidiletanolaminas.
4„~ Gel lipídico según la reivindicación 3, caracterizado porque el fosfolípido es fosfatidilcoiina de soja hidrogenada.
5.- Gel lipídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el ácido graso es un ácido graso de longitud de cadena entre 10 y 24 átomos de C, saturado o insaturado con uno o más dobles enlaces.
6.- Gel lipídico según la reivindicación 5 caracterizado porque el ácido graso se selecciona entre palmítico, esteárico, oieico, iinoieico, iignocérico, ERA o DMA.
7.- Gel lipídico según la reivindicación 6, caracterizado porque el ácido graso es ácido oieico.
8.- Gel lipídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque incorpora un principio activo que se selecciona entre un compuesto hidrofílico o un compuesto lipofílico.
9.- Gel lipídico según la reivindicación 8, caracterizado porque el principio activo es un esfingolípido, colesterol, un antioxidante, un antibiótico, un antiinflamatorio, una proteína o combinaciones de los mismos.
10.- Gel lipídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque incorpora fluoresceína sódica.
11.- Gel lipídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque incorpora un conjugado iipofíiico de la rodamina.
12.- Procedimiento de preparación de un gel lipídico nanoestructurado según se define en las reivindicaciones 1 a 11 , que comprende las etapas de:
- dispersión de la mezcla de los componentes lipidíeos en agua sin intervención de polímeros o tensoactivos
- formación del gel a partir de la dispersión lipídiea obtenida en la etapa anterior caracterizado porque el procedimiento se lleva a cabo sin intervención de polímeros o tensoactivos comprendiendo la formación del gel las siguientes subetapas:
- ajuste del pH de la dispersión lipídiea entre 5 y 8 con un compuesto básico
- congelación de la dispersión con pH ajustado a una temperatura igual o inferior a 20°C durante un periodo de tiempo de igual o superior a 1 minuto.
- descongelación y calentamiento de la dispersión a una temperatura
comprendida entre 5°C y 90°C.
- enfriamiento a temperatura ambiente de la dispersión gelificada procedente de la etapa anterior.
13.~ Procedimiento de preparación de un gel lipídico según la reivindicación 12, caracterizado porque la dispersión de la mezcla se realiza mezclando los componentes lipidíeos a las concentraciones y relaciones molares especificadas en un disolvente orgánico y evaporación del mismo en rotavapor seguido de desecación y posterior hidratacíón mediante adición del agua en el rango de concentraciones especificadas en condiciones de agitación y a temperatura ambiente
14.- Procedimiento de preparación de un gel lipídico según las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado porque el disolvente orgánico es cloroformo y porque el ajuste del pH de la dispersión lipídiea se realiza con una solución de hidróxido sódico. 18
15,~ Uso de un gel ¡ípídico nanoestructurado según se define en las reivindicaciones 1 a 11 en sistemas de aplicación cutánea, mucosa u ocular.
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