WO2020067590A1 - Protein chip for quantitative analysis - Google Patents

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protein
target protein
bioreceptor
metal
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최준규
유창혁
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주식회사 스몰머신즈
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Definitions

  • the present invention relates to a protein chip, and more particularly, to a protein chip including a plurality of detection units functionally configured to perform a high-precision quantitative analysis of a target protein and a method for quantitative analysis of a target protein using the same.
  • Quantitative analysis methods of target proteins include Enzyme Immunoassay (EI), Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA), Fluorescence Immunoassay, FIA , Bioassays such as RNA abundance analysis, and the like are well known.
  • EI Enzyme Immunoassay
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • RIA Radioimmunoassay
  • Fluorescence Immunoassay FIA
  • Bioassays such as RNA abundance analysis, and the like are well known.
  • the results of quantitative protein analysis play an important role in areas such as detection of test subjects, human or veterinary diagnostics, forensic diagnostics, environmental analysis, food analysis, and biodefense screening of hazardous substances in the air or in water. can do.
  • the risk caused by the radioactive material may be a problem.
  • the quantitative analysis method of proteins based on the analysis method using the existing ELISA method can obtain only the analysis value for one protein at a time, the consumption of samples, time, labor, and consumables is required to analyze multiple proteins. Not only is it necessary, but it is difficult to trust the result absolutely because it is not analyzed in one sample.
  • the protein chip is a target that immobilizes dozens to hundreds of different proteins, ligands and bio-receptors such as antibodies and antibodies on a solid substrate, and specifically reacts with them. It may be a chip configured to analyze the presence of the protein using an analysis method such as a fluorescence signal meter.
  • the method for quantitative analysis of the target protein based on the protein chip may be performed by analyzing the interaction of the target protein with the bioreceptor disposed on the chip.
  • the main protein in the cell may exist at a single molecular level.
  • detection efficiency may be low.
  • the development of a new level of protein chip to detect and quantify the target protein present in a very small amount This is necessary.
  • the conventional method for quantitative analysis of proteins based on protein chips can be performed by purchasing a protein chip to which a bioreceptor of a target protein is attached, and thus, when the type of target protein increases, an expensive protein chip Due to this, there is a problem that the analysis cost also increases.
  • the inventors of the present invention closely watched for a detection region of a function for substantially detecting a target protein in a protein chip. As a result, the inventors of the present invention were able to develop a new protein chip in which metal was deposited on a protein chip.
  • the inventors of the present invention were able to confirm that the detection portion with a metal spot can detect the target protein with high sensitivity and precision. Furthermore, the inventors of the present invention, in the detection unit, was configured so that the bioreceptor for the target protein to be quantitatively analyzed by the end user for each metal spot.
  • the inventors of the present invention if the area occupied by the metal spot in the same area is the same condition, that is, the area ratio occupied by the metal spot is the same, the smaller the size of the metal spot, the fluorescent signal detected by the fluorescently labeled antibody bound to the metal spot It was confirmed that is increased.
  • the inventors of the present invention can precisely adjust the immobilization density in the sub-detector of the bioreceptor by placing a plurality of sub-detectors configured to gradually increase the density of metal spots in the detector on the protein quantitative analysis chip. It was confirmed that the sensitivity and precision of the quantitative analysis of the target protein were improved than the conventional protein chip.
  • the inventors of the present invention when attaching a bioreceptor for a target protein on a metal spot in the form of coating a self-assembly monolayer (SAM) film on a substrate of a protein chip, the orientation of the bioreceptor increases I could recognize it. Furthermore, the inventors of the present invention were able to confirm that the smaller the size of the metal spot, the more uniform the signal generated according to the binding of the target protein and the bioreceptor and greatly amplified.
  • SAM self-assembly monolayer
  • the inventors of the present invention when a bioreceptor for a specific target protein on a protein chip is fixed with different numbers per unit area, i.e., with different densities, the properties of the bioreceptor having different dissociation factors are determined. It can be recognized that the dynamic range of signals generated according to the immune response of the target protein and antibody can be expanded.
  • the inventors of the present invention were able to recognize that a target protein of the same concentration may have a unique binding amount according to the density of the bioreceptor, and a regression line can be obtained by graphically showing the correlation thereof. As a result, the inventors of the present invention were able to identify a regression line having a unique slope value according to the concentration of the target protein.
  • the inventors of the present invention were able to develop a quantitative analysis method of a target antigen capable of tracking the concentration of the target protein with a slope value of a regression line based on the response signal of the antigen (target protein) versus the density of the antibody.
  • the inventors of the present invention by providing such a method for quantitative analysis of the target antigen, to solve the hassle of the standard protein signal value in a protein quantitative analysis method using a conventional protein chip, and the actual value of the noise signal It was confirmed that distortion can be reduced.
  • the problem to be solved by the present invention is to detect a target protein, a plurality of sub-detection units including a plurality of quantitative analysis units made of metal spots, and performing optical analysis to detect a plurality of quantitative analysis units It is to provide a protein chip capable of quantitative analysis of the target protein.
  • Another problem to be solved by the present invention is to fix a bioreceptor that specifically binds to a target protein in a metal spot of a protein chip, process a sample containing the target protein on a chip for protein quantification, and provide multiple It is to provide a method for quantitative analysis of a target protein, comprising performing a quantitative analysis of the target protein detected in the quantitative analysis unit.
  • Another problem to be solved by the present invention is to provide a kit for quantitative analysis of a target protein, comprising a protein chip and a bioreceptor that specifically binds to a target protein.
  • a protein chip including a substrate includes a plurality of sub-detection units configured to detect a target protein, and each of the plurality of sub-detection units includes a plurality of quantitative analysis units (units) made of metal spots.
  • the protein chip of this configuration is configured to enable quantitative analysis of the target protein detected in a plurality of quantitative analysis units by performing optical analysis.
  • each of the plurality of quantitative analysis units includes a metal spot and a bioreceptor that specifically binds a target protein, each of which may have a different density of metal spots from each other. Furthermore, the bioreceptor can be attached to the metal spot.
  • a plurality of quantitative analysis units are arranged in series within one sub-detection unit, and the plurality of quantitative analysis units arranged in series may be configured to gradually increase the density of the metal spot.
  • each of the plurality of quantitative analysis units may include metal spots having a shape of dots having a predetermined size and disposed in different numbers for each of the plurality of analysis units so as to have different densities from each other. You can.
  • each of the plurality of quantitative analysis units may include metal spots having a polygonal shape and disposed in different sizes for each of the plurality of analysis units to have different densities.
  • the plurality of quantitative analysis units further comprises a linker configured to be attached to the metal spot, and the bioreceptor can be attached to the metal spot by the linker.
  • the protein chip may further include a self-assembled monolayer configured to cover a metal spot on a substrate and attach a linker on the metal spot.
  • it may be a target protein or bioreceptor, or fluorescence-labeled.
  • the metal spots may be arranged on the substrate at regular intervals to form a pattern.
  • the line width of the pattern may be 7 ⁇ m to 12 ⁇ m.
  • the metal spot has a dot shape having a diameter of 500 nm to 10 ⁇ m, and the pattern may be formed by a dot-shaped metal spot.
  • the metal spot may be made of at least one metal from the group consisting of Au, Ni, Cu, Zn, Fe, Al, Ti, Pt, Hg, Ag, Pb and alloys thereof. .
  • the plurality of sub-detection units constitute one of the plurality of detection units, and each of the plurality of detection units may be configured to detect different target proteins from each other.
  • a plurality of sub-detection units may be arranged at intervals of 0.3 mm to 0.9 mm in one detection unit.
  • a method for quantitative analysis of a target protein using a protein chip is provided.
  • the quantitative analysis method the step of immobilizing a bioreceptor that specifically binds to a target protein to a metal spot disposed in a plurality of quantitative analysis units of the protein chip of the present invention, the target protein and the bioreceptor react, the target And processing the sample containing the protein on the chip for protein quantification and performing the quantitative analysis of the target protein detected in the plurality of quantitative analysis units.
  • the target protein or bioreceptor is fluorescently labeled
  • the step of performing quantitative analysis is to quantitatively analyze the target protein by measuring the intensity of fluorescence with respect to subunits composed of a plurality of quantitative analysis units. It may include the step of performing.
  • each of the plurality of quantitative analysis units has a density of different metal spots
  • the step of fixing the bioreceptor is such that the plurality of quantitative analysis units have different densities of the bioreceptors, so that the multiple quantitative analysis And fixing the bioreceptor on the metal spot of the unit.
  • the step of performing the quantitative analysis may include performing a quantitative analysis of the target protein by measuring the amount of binding to the target protein according to the density of the bioreceptor for a plurality of quantitative analysis units.
  • the step of performing quantitative analysis measures a binding amount of a target protein that binds to a bioreceptor having a different density from each other, graphically displays the correlation thereof, obtains a regression line, and obtains the slope value thereof It may include the step of performing a quantitative analysis of the target protein.
  • the step of performing the quantitative analysis may include performing a quantitative analysis of a target protein using at least one method selected from the group consisting of mass spectrometry.
  • the method for quantitative analysis of a target protein further comprises placing a linker that indirectly connects the bioreceptor and the metal spot on the spot, performed before the step of immobilizing the bioreceptor.
  • fixing the bioreceptor may include fixing the bioreceptor on a metal spot disposed in a plurality of quantitative analysis units through a linker.
  • the step of placing the linker on the metal spot comprises a linker and a self-assembleable molecule to cover the metal spot on the substrate of the protein chip and attach the linker on the metal spot. Coating the protein chip onto a plurality of quantitative analysis units using a coating solution.
  • kits for quantitative analysis of a target protein which includes a protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • the kit includes the protein chip of the present invention and a bioreceptor that specifically binds to the target protein.
  • the kit for quantitative analysis of proteins may further include a buffer solution.
  • the present invention has an effect capable of detecting a very small amount of target protein with high sensitivity from a small amount of sample by providing a protein chip equipped with a sub-detecting unit including a quantitative analysis unit formed by a metal spot.
  • the present invention if the conditions of the same area occupied by the metal spots in the same region, that is, the area ratios of the metal spots are the same, the smaller the size of the metal spot, the more the fluorescent signal detected by the fluorescently labeled antibody bound to the metal spot.
  • the increased phenomenon unlike DNA strands that can be replicated upon detection and obtain the effect of signal amplification, it has the effect of signal amplification in detecting proteins that are not capable of replication.
  • the present invention precisely fixes the immobilization density in the sub-detector of the bioreceptor by placing a sub-detector comprising a plurality of quantitative analysis units configured to gradually increase the density of metal spots in the detection section on the protein quantitative analysis chip. Can be adjusted.
  • the present invention has an effect capable of providing a quantitative analysis result with improved sensitivity and precision than a conventional protein chip.
  • the present invention has an effect capable of overcoming the limitations of a conventional protein chip, in which a bioreceptor for detecting a specific protein is fixed.
  • the present invention provides an effect of reducing an analysis cost by configuring a bioreceptor for a target protein to be quantitatively analyzed by an end user for each metal spot present in the detection unit. You can. Furthermore, the present invention has an effect capable of providing quantitative analysis for a plurality of target proteins through one analysis.
  • the bioreceptors for a specific target protein can be immobilized at different numbers per unit area, i.e., at different densities, to have different dissociation factors.
  • the dynamic range of the resulting signal can be enlarged.
  • the present invention can provide a method for quantitative analysis of a target antigen capable of tracking the concentration of a target protein with a slope value of a regression line based on a response signal of the antigen (target protein) to the density of the antibody.
  • the present invention is easier than the conventional method, as it solves the hassle associated with the standard protein signal value in the protein quantitative analysis method using a conventional protein chip, and reduces the distortion of the actual value due to the noise signal. And has the effect of performing accurate quantitative analysis.
  • 1A is a schematic plan view of a protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • 1B is an exemplary view showing a detection unit, a sub-detection unit, and a quantitative analysis unit of a protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • 1C exemplarily shows a quantitative analysis unit that is gradually disposed according to the density of a metal spot in a sub-detection unit of a protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 1d shows the results of the analysis of the fluorescence intensity measured according to the density of the metal spot disposed on the substrate.
  • 1E to 1G exemplarily illustrate a quantitative analysis unit that is gradually disposed according to the density of a metal spot in a sub-detection unit of a protein chip according to various embodiments of the present invention.
  • 1H to 1J illustrate that a bioreceptor is fixed to a quantitative analysis unit of a protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 exemplarily shows a detection unit, a sub-detection unit, and a quantitative analysis unit of a protein chip according to another embodiment of the present invention.
  • 3A and 3B exemplarily show a region separation membrane used in a protein chip according to various embodiments of the present invention.
  • FIG. 4 shows a procedure of quantitative analysis of a target protein using a protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5a shows the results of the analysis of the intensity of the signal along the surface of one metal spot for the protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5b shows the results of analyzing the signal intensity according to the density of the antibody and the signal amplification effect according to the metal spot size, for the protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5c shows the results of the analysis of the slope value of the regression line according to the concentration of the antigen for the protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • the protein chip according to an embodiment of the present invention is configured to enable quantitative analysis of a target protein detected in a plurality of quantitative analysis units by performing optical analysis.
  • the substrate of the protein chip includes a plurality of sub-detection units configured to detect a target protein, and each of the plurality of sub-detection units includes a plurality of quantitative analysis units made of metal spots.
  • protein chip may mean a single chip configured to separate, detect and quantify a target protein.
  • a bioreceptor configured to react with a target protein may be fixed on a substrate made of a polymer such as glass, silicon, silicon, polypropylene, or the like.
  • the protein chip disclosed in this specification may be interpreted in the same way as a protein chip for quantitative analysis, a slide for protein array, and a protein quantitative chip.
  • the protein chip in the present specification may encompass a chip in which the bioreceptor is not fixed or a chip in which the bioreceptor for a specific protein is fixed.
  • the substrate of the protein chip may be made of a material selected from the group consisting of glass, silicon, polypropylene, nylon, plastic, and metal, but is not limited thereto.
  • target protein may mean a protein to be present in a sample and a quantitative analysis using a protein chip.
  • the target protein may be a biomarker of an antibody, antigen, enzyme, or peptide unit, but is not limited thereto.
  • bioreceptor can mean any substance that interacts with a target protein.
  • the bioreceptor may be at least one of proteins, ligands, nucleic acids, carbohydrates, and antibodies that interact with the target protein, but is not limited thereto and may be variously set according to the properties of the target protein.
  • the bioreceptor can be an antibody.
  • the bioreceptor may be an antibody targeting one target protein and having different dissociation factors.
  • the protein chip of the present invention may be capable of quantitative analysis of a wider concentration region for one target protein.
  • the target protein or bioreceptor can be a fluorescence-labeled receptor.
  • the fluorescently labeled target protein may be a protein to which a fluorochrome that generates fluorescence by light stimulation is bound before being processed on the protein chip of the present invention.
  • the fluorescently labeled bioreceptor may be a receptor bound with a pigment that generates fluorescence.
  • the fluorescent pigment may be a pigment protein of fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate (RITC) or picoerythrin that emits red-orange fluorescence, but is not limited thereto. .
  • the user quantifies the target protein by detecting a signal according to the interaction of the bioreceptor and the target protein in the protein chip using an analysis method such as fluorescence antibody method, flow cytometry, immunofluorescence method, etc. Analysis can be performed.
  • the bioreceptor used for mass spectrometry of a target protein in the present specification is not limited to a fluorescently labeled receptor.
  • a bioreceptor without a fluorescent dye SPR imaging analysis, surface-enhanced laser desorption-ionization (SELDI) mass spectrometry, atomic force microscope (AFM) analysis and matrixassisted laser MALDI-TOF Desorption / ionization time-of-flight
  • SEDM surface-enhanced laser desorption-ionization
  • AFM atomic force microscope
  • MALDI-TOF Desorption / ionization time-of-flight matrixassisted laser MALDI-TOF Desorption / ionization time-of-flight
  • the term “sub-detection unit” may mean a region configured to detect a target protein on a protein chip.
  • the sub-detection unit may be composed of a plurality of quantitative analysis units (units) including a plurality of metal spots (spots) formed by depositing metal on a substrate of a protein chip.
  • the sub-detection unit may mean all regions in which metal spots are present in the protein chip.
  • one detection unit may be formed.
  • the protein chip of the present invention may include a plurality of independent detection units. Accordingly, quantitative analysis of target proteins of multiple samples may be performed through one analysis.
  • the term “quantitative analysis unit” may mean a unit in which detection and quantitative analysis of a target protein are substantially performed in a sub-detection unit. At this time, the aforementioned metal spots may be disposed in the quantitative analysis unit.
  • metal spot may refer to spots formed by depositing metal on a substrate of a protein chip as described above. At this time, a bioreceptor according to the target protein may be attached on the metal spot.
  • a linker may be attached to the metal spot, and the bioreceptor may be fixed to the metal spot through the linker.
  • the linker may be a protein A / G, dextran (dextran) or PEG (polyethylene glycol), but is not limited thereto.
  • the linker can be attached to the metal spot surface by coating the coating solution comprising the linker and the self-assembleable molecule in a single layer on a quantitative analysis unit of the protein chip.
  • a self-assembled monolayer (SAM) can be formed on the substrate of the protein chip.
  • each of the plurality of quantitative analysis units may include metal spots having a dot shape of a certain size and disposed in different numbers for each of the plurality of analysis units to have different densities.
  • each of the plurality of quantitative analysis units may include a metal spot having a polygonal shape and disposed in different sizes for each of the plurality of analysis units so as to have different densities.
  • the metal spot may have a dot shape having a unit of 10 ⁇ m from 500 nm, but may have various shapes as long as the metal is deposited to have a constant area on the substrate of the protein chip.
  • the diameter of the dot-shaped metal spot may be 500 nm to 10 ⁇ m.
  • the signal amplification effect may be obtained, but the diameter of the metal spot may be 500 nm to 1 ⁇ m, but is not limited thereto.
  • the line width of the formed pattern may be 7 ⁇ m to 12 ⁇ m, but is not limited thereto.
  • the metal spot may be at least one of the group consisting of Au, Ni, Cu, Zn, Fe, Al, Ti, Pt, Hg, Ag, Pb and alloys thereof.
  • the metal spot disclosed in the present specification may be gold, but is not limited thereto, and may be variously set according to the type of target protein and the type of bioreceptor.
  • the detection unit may include a plurality of sub-detection units on which metal spots capable of attaching bioreceptors according to target proteins are disposed.
  • sub detection unit may mean a subunit of the detection unit.
  • the sub-detection units may be arranged at intervals of 0.3 mm to 0.9 mm in one detection unit. However, it is not limited thereto.
  • a plurality of quantitative analysis units may be arranged in series, within one sub-detection unit, and the plurality of quantitative analysis units arranged in series may be configured to gradually increase or decrease the density of metal spots.
  • the detection portion of the protein chip of the present invention may be composed of sub-detection portions including a quantitative analysis unit configured to gradually change the density of the metal spot.
  • the change in density of the metal spot may mean a change in density of the bioreceptor.
  • the signal according to the reaction between the bioreceptor and the target protein may increase in direct proportion. That is, the target protein may have a unique binding amount (unique slope value) according to the concentration of the bioreceptor depending on its type. Therefore, as the user can estimate the concentration of the target protein by using the slope value of the target protein in reverse, quantitative analysis of the target protein may be possible.
  • the quantitative analysis method using the unique slope value can reduce an error in analysis due to enhancement or reduction of a signal due to equipment or other environmental factors.
  • the user can perform quantitative analysis with improved precision and sensitivity to the target protein by using only one detection unit among a plurality of detection units and one single analysis.
  • the detection unit configured to detect the target protein in the protein chip is composed of sub-units composed of metal spots having a certain density
  • multiple iterative experiments may be required for high-precision and sensitive quantitative analysis of the target protein. have. That is, when using a conventional protein chip with a fixed bioreceptor having a certain density, quantitative analysis with high precision and sensitivity to a target protein may be difficult. Furthermore, such a conventional protein chip may require a reference signal value of a standard protein for quantitative analysis.
  • the protein chip may further include a self-assembled monolayer disposed on the detection unit.
  • the user can identify a plurality of different target proteins in independent detection regions using a single protein chip, and perform quantitative analysis on each target protein.
  • sample may mean a sample containing a target protein.
  • the analysis sample can be a fluid sample.
  • fluid sample for example, cell lysate, whole blood, plasma, serum, saliva, ocular fluid, cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, ascites fluid, synovial fluid, and peritoneal fluid, but are not limited thereto.
  • the sample can be easily selected by the user according to the purpose of use of the protein chip of the present invention.
  • the sample may be lysed prior to being processed on the protein chip of the present invention, depending on its type.
  • 1A is a schematic plan view of a protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • the protein chip 100 may include a plurality of detection units 110 and a barcode unit 120.
  • the detection unit 110 may include a plurality of sub-detection units 112.
  • the sub-detection unit 112 may include a plurality of quantitative analysis units 112.
  • the protein chip 100 may be configured to detect different target proteins for each of the plurality of detection units 110, so that a user can detect a plurality of target proteins using one protein chip 100 and Quantitative analysis can be performed. Meanwhile, the user can check information on each protein chip 100 through the barcode unit 120. For example, when there are many types of samples to be analyzed, the user may classify the type of the protein chip 100 through the barcode unit 120.
  • 1B is an exemplary view showing a detection unit, a sub-detection unit, and a quantitative analysis unit of a protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • one detection unit 110 may include a plurality of sub-detection units 112.
  • the sub-detecting unit 112 is formed by depositing metal on the substrate constituting the protein chip 100, and a plurality of quantitative analysis units 112 (a), 112 (b), and 112 (c) having different metal spot densities, respectively. ), 112 (d), 112 (e), 112 (f), 112 (g) and 112 (h)).
  • a plurality of quantitative analysis units 112 (a), 112 (b), 112 (c), 112 (d), 112 (e), 112 (f), 112 (g) and 112 (h)) are one Within the sub-detector 112, may be arranged in series (e.g., 112 (a), 112 (b), 112 (c) and 112 (d), or 112 (e), 112 (f) , 112 (g) and 112 (h)), a plurality of quantitative analysis units arranged in series (e.g., 112 (a), 112 (b), 112 (c) and 112 (d), Or 112 (e), 112 (f), 112 (g) and 112 (h)) may increase the density of metal spots gradually.
  • a bioreceptor according to the target protein may be attached on the metal spot. That is, as the density of metal spots gradually increases, a plurality of quantitative analysis units 112 (a), 112 (b), 112 (c), 112 (d), 112 (e), 112 (f), 112 (g) and 112 (h)), the concentration of the bioreceptor can also be gradually increased.
  • bio Quantitative analysis of the target protein may be performed by measuring a signal according to the reaction between the receptor and the target protein.
  • the signal according to the reaction between the bioreceptor and the target protein may increase in direct proportion. That is, the target protein may have a unique binding amount (unique slope value) according to the concentration of the bioreceptor depending on its type. Therefore, as the user can estimate the concentration of the target protein by using the slope value of the target protein in reverse, quantitative analysis of the target protein may be possible.
  • the quantitative analysis method using the unique slope value can reduce an error in analysis due to enhancement or reduction of a signal due to equipment or other environmental factors.
  • 1C exemplarily shows a quantitative analysis unit that is gradually disposed according to the density of a metal spot in a sub-detection unit of a protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • the quantitative analysis unit 112 (a), the density of the metal spot 114 (a) is 20%, the metal spot 114 (b) Quantitative analysis unit 112 (d) with a density of 50% and quantitative analysis unit 112 (h) with a density of metal spot 114 (c) of 90% are shown.
  • the quantitative analysis units 112 (a), 112 (d) and 112 (h) have different metal spots 114 (a), 114 (b) and 114 (c) for the same area. It can be arranged in number. Accordingly, the quantitative analysis units 112 (a), 112 (d), and 112 (h) are sub-detectors such that the density of the metal spots 114 (a), 114 (b), and 114 (c) is gradually increased. It can be configured within 112. For example, referring to FIG. 1D together, an analysis result of the measured fluorescence intensity appears after differently arranging the density of metal spots on the substrate. More specifically, it appears that the intensity of fluorescence gradually increases or decreases depending on the reaction with the target protein according to the density of the metal spot.
  • the metal spots 114 (a), 114 (b), and 114 (c) are attached with a bioreceptor that reacts with the target protein
  • the density of each of the metal spots 114 (a), 114 (b) and 114 (c) of 112 (h)) may correspond to the density (or concentration) of the bioreceptor.
  • the user can perform quantitative analysis on the target protein by using only one detection unit 110 among the plurality of detection units 110 and only one single analysis.
  • the metal spots 114 (a), 114 (b) and 114 (c) are, in dot form, at regular intervals within the quantitative analysis units 112 (a), 112 (d) and 112 (h).
  • a specific pattern may be formed, wherein the line width of the formed gold pattern may be 10 ⁇ m, however, depending on the shape of the metal spot disposed in the quantitative analysis unit and the area of each quantitative analysis unit.
  • the method for setting the density of the metal spot is not limited to the above.
  • 1E to 1G exemplarily illustrate a quantitative analysis unit that is gradually disposed according to the density of a metal spot in a sub-detection unit of a protein chip according to various embodiments of the present invention.
  • a quantitative analysis unit 112 (d) with a density of 50% and a quantitative analysis unit 112 (h) with a density of metal spot 114 '(c) of 90% is shown.
  • the metal spots 114 '(a), 114' (b), and 114 '(c) in the form of rectangular rods are attached to the quantitative analysis units 112 (a), 112 (d) and 112 (h). Accordingly, it can be arranged in different numbers. Thus, each of the quantitative analysis units 112 (a), 112 (d) and 112 (h), the total metal spots 114 '(a), 114' (b) and 114 '(c) ))) As the area occupied by these may differ, each may have a different density.
  • a quantitative analysis unit 112 (a) having a density of 20% of the metal spot 114 '' (a), and a metal spot 114 '' Quantitative analysis units 112 (d) with a density of (b)) of 50% and quantitative analysis units 112 (h) with a density of metal spots 114 '' (c) of 90% are shown.
  • the square-shaped metal spots 114 '' (a), 114 '' (b) and 114 '' (c)) are quantitative analysis units 112 (a), 112 (d) and 112 (h). ) May have a different area.
  • the quantitative analysis unit 112 (a) having a density of the metal spot 114 '' '(a) is 20%
  • quantitative analysis unit 112 (h) with a density of metal spot 114 '' '(c) of 90% is shown. do.
  • the metal spots 114 '' '(a), 114' '' (b) and 114 '' '(c)) are one quantitative analysis unit 112 (a), 112 (d), or 112 ( h)). Furthermore, the metal spots 114 '' '(a), 114' '' (b) and 114 '' '(c)) are quantitative analysis units 112 (a), 112 (d) and 112 (h)) It may be arranged to have a different area.
  • 1H to 1J illustrate that a bioreceptor is fixed to a quantitative analysis unit of a protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • a bioreceptor 118 such as an antibody
  • a linker molecule 116 can be attached onto a metal spot 114 through a linker molecule 116.
  • the linker molecule 116, the coating solution containing the linker molecule 116 and self-assembleable molecule is a single on the quantitative analysis unit 112 (a), 112 (d) and 112 (h) of the protein chip By being coated with a layer, it can be attached to the metal spot 114 surface.
  • the bioreceptor 118 can be stably fixed on the biochip by the coating of the single molecular layer 119, and may have orientation.
  • the substrate of the protein chip 100 is It may be covered with a single molecular layer 119, and a linker 116 may be attached to the metal spot 114. Thereafter, the bioreceptor 118 according to the target protein may be combined through an additional reaction.
  • the protein chip disclosed in the present specification is not limited to the above-described form.
  • a bioreceptor 118 such as an antibody, can be attached directly onto the metal spot 114.
  • the bioreceptor 118 is coated with a single layer on a quantitative analysis unit 112 (a), 112 (d), and 112 (h) of the protein chip by coating a coating solution containing self-assembleable molecules, thereby forming a metal spot. (114) may be attached to the surface.
  • the bioreceptor 118 can be stably fixed on the biochip by the coating of the single molecular layer 119, and may have orientation.
  • the bioreceptor 118 may be directly attached to the metal spot 114 without coating of a single molecular layer.
  • FIG. 2 exemplarily shows a detection unit, a sub-detection unit, and a quantitative analysis unit of a protein chip according to another embodiment of the present invention.
  • the protein chip 200 comprises a plurality of detection units 210, a plurality of sub-detection units 212 forming the detection unit 210, and a sub-detection unit 210 It includes a plurality of quantitative analysis units 212 (a), 212 (b), 212 (c), 212 (d) and 212 (e).
  • the shape of the detection unit formed on the protein chip is not limited thereto.
  • the protein chip 300 may include one detection unit 310 formed on a substrate.
  • a plurality of detection units 310 may be formed by arranging region separation membranes 320 ′ and 320 ′′, which provide independent detection regions on the protein chip 300.
  • the region separation membranes 320 ′ and 320 ′′ may be in a detachable form on the detection unit 310 of the protein chip 300.
  • FIG. 4 shows a procedure of quantitative analysis of a target protein using a protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • the quantitative analysis method of the target protein first, to fix the bioreceptor that specifically binds to the target protein on the detection portion of the protein chip of the present invention (S410), the sample protein containing the target protein It is configured to process on a chip (S420) and perform quantitative analysis of the detected target protein (S430).
  • the bioreceptor in the step of fixing the bioreceptor (S410), the bioreceptor is placed on the metal spots of the plurality of quantitative analysis units such that the plurality of quantitative analysis units have different densities of bioreceptors. Can be fixed.
  • each of the plurality of quantitative analysis units may have a different density of metal spots.
  • the bioreceptor in the step of fixing the bioreceptor (S410), the bioreceptor may be fixed on a metal spot of the plurality of quantitative analysis units such that the plurality of quantitative analysis units have different densities of bioreceptors.
  • a linker that indirectly connects the bioreceptor and the metal spot is performed before the step of fixing the bioreceptor (S410) on the metal spot.
  • the step of placing may be further performed.
  • the bioreceptor may be attached to a metal spot disposed in a plurality of quantitative analysis units through a linker.
  • the linker covers a metal spot on the substrate of the protein chip, and a coating solution configured to coat the linker on the metal spot is coated, thereby allowing a plurality of quantitative analysis units of the protein chip It can be attached to.
  • the bioreceptor used in the step (S410) of fixing the bioreceptor may be a fluorescently labeled receptor, but is not limited thereto.
  • step (S420) of processing a sample containing the target protein on a protein quantitative analysis chip interaction of the target protein and the bioreceptor attached on the metal spot may occur.
  • a step (S420) of processing a sample containing a target protein on a protein quantitative analysis chip an immune response of the fluorescently labeled bioreceptor and the target protein occurs, and a fluorescent signal may be generated by the immune response.
  • a fluorescence signal may be generated as the immune response of the bioreceptor and the pre-fluorescence-labeled target protein occurs.
  • the quantitative analysis of the target protein may be performed by measuring the intensity of fluorescence with respect to a subunit composed of a plurality of quantitative analysis units.
  • the quantitative analysis of the target protein is performed by measuring the amount of binding to the target protein according to the density of the bioreceptor for a plurality of quantitative analysis units This can be done.
  • the signal according to the reaction between the bioreceptor and the target protein may increase in direct proportion. That is, the target protein may have a unique binding amount (unique slope value) according to the concentration of the bioreceptor depending on its type. Therefore, as the user can estimate the concentration of the target protein by using the slope value of the target protein in reverse, quantitative analysis of the target protein may be possible.
  • the method for quantitative analysis of a target protein according to various embodiments of the present invention using such a unique slope value can reduce an error in analysis due to enhancement or reduction of a signal due to equipment or other environmental factors.
  • step (S430) of performing a quantitative analysis of the target protein SPR imaging (imaging) analysis, surface-enhanced laser desorption-ionization (SELDI) mass spectrometry, atomic force microscope (AFM) analysis and Quantitative analysis of the target protein may be performed using at least one method selected from the group consisting of MALDI-TOF (Matrixassistedlaser desorption / ionization time-of-flight) mass spectrometry.
  • MALDI-TOF Microxassistedlaser desorption / ionization time-of-flight
  • Figure 5a shows the results of the analysis of the intensity of the signal along the surface of one metal spot for the protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • a linker is attached by SAM coating on a protein chip on which a metal pattern is formed by deposition of a metal spot, and then a fluorescently labeled antibody for the target protein is fixed. Then, a fluorescence signal according to the size of the line width is measured using a scanner.
  • the measured fluorescence signal appears uniformly. This may mean that the signal on the inner surface of the protein chip appears uniformly when the antibody is tightly immobilized.
  • the line width of the gold pattern formed on the protein chip of the present invention may be set to 7 to 12 ⁇ m.
  • the standard deviation of the signal between the metal spots in the protein chip of the present invention is 2% or less, and the standard deviation of the neoplasm between the protein chips may be 5% or less, the bioreceptor antibody is stably and uniformly fixed. As a result, the immobilization efficiency in the protein chip can be increased.
  • Figure 5b shows the results of analyzing the signal intensity according to the density of the antibody and the signal amplification effect according to the metal spot size, for the protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • the area occupied by the metal spot in the same area is the same condition, that is, the area ratio of the metal spot is the same, the smaller the size of the metal spot, the more the fluorescence bound to the metal spot.
  • the fluorescent signal detected by the labeled antibody increases and the area ratio occupied by the metal spot increases, that is, the density (concentration) of the bioreceptor fixed on the metal spot increases, the intensity of the fluorescent signal according to the reaction with the target protein Appears to increase in direct proportion.
  • the target protein may have a unique binding amount (unique slope value) according to the concentration of the bioreceptor, depending on its type. Therefore, as the user can estimate the concentration of the target protein by using the slope value of the target protein in reverse, quantitative analysis of the target protein may be possible.
  • the quantitative analysis method using the unique slope value can reduce an error in analysis due to enhancement or reduction of a signal due to equipment or other environmental factors.
  • Figure 5c shows the results of the analysis of the slope value of the regression line according to the concentration of the antigen for the protein chip according to an embodiment of the present invention.
  • DNA-Cy5 shows a slope value of about 179.3 formed by the fluorescent signal measured according to an increase in the density of the bioreceptor.
  • DNA-Cy5 of 10 nM shows a slope value of about 31.603 formed by the fluorescent signal measured according to an increase in the density of the bioreceptor.
  • the target proteins appear to have a unique slope value depending on their concentration and their kind.
  • the user can estimate the concentration of the target protein using the inclination value of the target protein (eg, 179.3 or 31.603) in reverse, quantitative analysis of the target protein may be possible.
  • the inclination value of the target protein eg, 179.3 or 31.603
  • the protein chip used in various embodiments of the present invention can detect a very small amount of target proteins from a small amount of samples with high sensitivity, and perform quantitative analysis with high sensitivity and precision for these target proteins.
  • the present invention provides a kit including a protein chip and a bioreceptor, so that a user can perform efficient quantitative analysis on a variety of proteins.
  • the present invention by placing a plurality of sub-detectors configured to gradually increase the density of metal spots in the detection section on the protein quantitative analysis chip, it is possible to provide a quantitative analysis result with improved sensitivity and precision than the conventional protein chip It works.
  • the present invention has an effect capable of overcoming the limitations of a conventional protein chip, in which a bioreceptor for detecting a specific protein is fixed.
  • the present invention when immobilizing a bioreceptor for a specific target protein, a bioreceptor having different dissociation factors, for example, immobilizing an antibody, dynamic range of signals generated according to an immune response of the target protein and the antibody (dynamic range) can be enlarged.
  • the present invention has the effect of reducing the number of repetition experiments required in a biological experiment, and tracking the concentration of the target protein based on the reaction signal of the antigen (target protein) against the density of the antibody.
  • the present invention has the effect of solving the hassle of accommodating standard protein signal values in a protein quantitative analysis method using a conventional protein chip, and performing quantitative analysis more easily than a conventional method.

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Abstract

The present invention provides a protein chip and a method using same to quantitatively analyze a target protein. The protein chip comprises a substrate including a plurality of sub-detection parts configured to detect the target protein, wherein each of the plurality of sub-detection parts includes a plurality of quantitative analysis units composed of metal spots, and the protein chip is configured such that the target protein detected by the plurality of quantitative analysis units can be quantitatively analyzed by performing optical analysis.

Description

정량 분석용 단백질 칩Protein chip for quantitative analysis
본 발명은 단백질 칩에 관한 것으로, 보다 구체적으로 표적 단백질에 대한 정밀도 높은 정량 분석을 수행할 수 있도록 기능적으로 구성된 복수의 검출부를 포함하는 단백질 칩 및 이를 이용한 표적 단백질의 정량 분석 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a protein chip, and more particularly, to a protein chip including a plurality of detection units functionally configured to perform a high-precision quantitative analysis of a target protein and a method for quantitative analysis of a target protein using the same.
단백질을 정량적으로 분석하기 위한 많은 방법이 개발되고 있고, 환자로부터 혈액 시료 (혈청, 혈장) 와 같은 복합 유체에서 단백질의 분석은 진단에서 본질적으로 중요하다.Many methods have been developed to quantitatively analyze proteins, and analysis of proteins in complex fluids such as blood samples (serum, plasma) from patients is of fundamental importance in diagnosis.
표적 단백질의 정량 분석 방법으로는 효소면역분석법 (Enzyme Immunoassay, EI), 효소결합 면역분석법 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 방사능 면역분석법 (Radioimmunoassay, RIA), 형광 면역분석법 (Fluorescence Immunoassay, FIA), RNA 풍도 (RNA abundance) 분석법과 같은 바이오어세이 등이 잘 알려져 있다. 단백질 정량 분석의 결과는, 피검물 연구 검출, 인간을 대상으로 하거나 수의학 분야의 진단 분야, 법의학적 진단, 환경 분석, 식품 분석 및 대기 또는 수중의 위험 물질의 바이오디펜스 스크리닝 등의 분야에서 중요한 역할을 할 수 있다. Quantitative analysis methods of target proteins include Enzyme Immunoassay (EI), Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA), Fluorescence Immunoassay, FIA , Bioassays such as RNA abundance analysis, and the like are well known. The results of quantitative protein analysis play an important role in areas such as detection of test subjects, human or veterinary diagnostics, forensic diagnostics, environmental analysis, food analysis, and biodefense screening of hazardous substances in the air or in water. can do.
그러나, 전술한 방법에 기초한 표적 단백질의 정량 분석 방법은, 대부분 샌드위치 분석 방식을 택함에 따라 높은 민감도 (sensitivity) 를 가지나, 여러 개의 샘플과 샘플마다 많은 양의 시료를 모아야 실험의 수행이 가능하며, 시간이 오래 걸리고 여러 단계의 지루한 과정을 거쳐야 한다는 단점이 있다. However, the method of quantitative analysis of the target protein based on the above-described method, most of which have a high sensitivity (sensitivity) by selecting the sandwich analysis method, it is possible to perform the experiment by collecting a large number of samples per sample and samples, The disadvantage is that it takes a long time and has to go through several tedious steps.
보다 구체적으로, 상기 방법들 중, 가장 민감도 (sensitivity) 가 높은 방사능 면역 분석법의 경우, 방사능 물질에 의한 위험이 문제가 될 수도 있다. 나아가, 기존의 ELISA 방식을 이용한 분석 방법에 기초한 단백질의 정량 분석 방법은, 한 번에 한 개의 단백질에 대한 분석값만 얻을 수 있기 때문에 여러 개의 단백질을 분석하려면 시료, 시간, 노동력, 소모품의 소비가 많이 필요할 뿐만 아니라, 한 개의 시료에서 각각을 분석하는 것이 아니기 때문에 결과값을 절대적으로 신뢰하기 어렵다는 문제가 있다.More specifically, among the above methods, in the case of a radioactive immunoassay with the highest sensitivity, the risk caused by the radioactive material may be a problem. Furthermore, since the quantitative analysis method of proteins based on the analysis method using the existing ELISA method can obtain only the analysis value for one protein at a time, the consumption of samples, time, labor, and consumables is required to analyze multiple proteins. Not only is it necessary, but it is difficult to trust the result absolutely because it is not analyzed in one sample.
한편, 여러 질환에 대한 분자 병태생리학적 이해가 증진되면서 질환의 진단 및 치료에 그 질환에 특이적인 바이오 마커나 타겟들이 점차 이용되기 시작하였다. 따라서 침습적 방법을 통해 얻어지는 세포나 조직 또는 비침습적 방법을 통해 얻어지는 여러 체액 등에 미량으로 존재하는 질환 바이오 마커 또는 타겟 단백질을 좀 더 빠른 시간 내에, 보다 쉽고 표준화된 방법으로 정량분석 할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 특히, 한 개의 시료에서 한 개의 단백질만 분석할 수 있는 single-plex 방식이 아니라 한 개의 시료에서 여러 개의 단백질을 동시에 분석할 수 있는 multi-plex 방식의 분석 방법의 개발이 의료 편의성, 시료 채취 시 환자의 수고 경감 등의 이유로 지속적으로 요구되고 있는 실정이다. Meanwhile, as molecular pathophysiological understanding of various diseases has been improved, biomarkers or targets specific to the disease have gradually been used for diagnosis and treatment of diseases. Therefore, the development of a method that can quantitatively analyze disease biomarkers or target proteins present in trace amounts in cells or tissues obtained through an invasive method or various body fluids obtained through a non-invasive method in a shorter time and with an easier and standardized method This situation is being demanded. In particular, the development of a multi-plex method that can analyze multiple proteins in one sample at the same time, rather than a single-plex method that can analyze only one protein in one sample, is convenient for medical and patient collection It is a situation that is constantly being demanded for reasons such as reducing labor.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.The technology that is the background of the invention was created to facilitate understanding of the invention. It should not be understood that the items described in the background of the invention are recognized as prior art.
한편, 표적 단백질의 정량 분석을 위한 새로운 방법으로, 단백질 칩 (protein chip) 이 등장하였다. 보다 구체적으로 단백질 칩은, 표적 단백질과 결합하는 수십에서 수백 종류 이상의 서로 다른 단백질, 리간드 및 항체와 같은 바이오 리셉터 (bio-receptor) 등을 고체 기판 상에 고정하고, 이들과 특이적으로 반응하는 표적 단백질의 존재를 형광 신호 측정기 등의 분석 방법을 이용하여 분석하도록 구성된 칩일 수 있다. Meanwhile, a protein chip has emerged as a new method for quantitative analysis of target proteins. More specifically, the protein chip is a target that immobilizes dozens to hundreds of different proteins, ligands and bio-receptors such as antibodies and antibodies on a solid substrate, and specifically reacts with them. It may be a chip configured to analyze the presence of the protein using an analysis method such as a fluorescence signal meter.
이러한 단백질 칩에 기초한 표적 단백질의 정량 분석 방법은, 칩 상에 배치된 바이오 리셉터와 표적 단백질의 상호 작용을 분석함으로써 수행될 수 있다. The method for quantitative analysis of the target protein based on the protein chip may be performed by analyzing the interaction of the target protein with the bioreceptor disposed on the chip.
한편, 세포 내 주요 단백질은 단일 분자 수준으로 존재할 수 있다. 정량 분석을 위해 종래의 단백질 칩을 이용하여, 단일 분자로 존재하는 단백질을 검출할 경우, 검출 효율이 낮을 수 있다. 특히, 환자의 조직, 혈액, 타액 또는, 기타 생물학적 시료 내에 존재하는 표적 단백질의 절대량을 증폭시키기는 것이 불가능함에 따라, 극소량으로 존재하는 표적 단백질을 검출하고 이들을 정량하기 위해서는 새로운 차원의 단백질 칩의 개발이 필요하다.Meanwhile, the main protein in the cell may exist at a single molecular level. When a protein existing as a single molecule is detected using a conventional protein chip for quantitative analysis, detection efficiency may be low. In particular, as it is impossible to amplify the absolute amount of target protein present in the patient's tissue, blood, saliva, or other biological sample, the development of a new level of protein chip to detect and quantify the target protein present in a very small amount This is necessary.
이를 해결하기 위해, 단백질 칩 상에서 표적 단백질과 반응하는 수용체의 밀도를 증가시키는 방법이 제안되었으나, 이와 같은 방법은 단백질 칩의 3 차원적 구조로 인한 공간적 장애, 교차 오염의 문제를 야기할 수 있다. In order to solve this, a method of increasing the density of a receptor that reacts with a target protein on a protein chip has been proposed, but such a method may cause spatial obstacles and cross contamination due to the three-dimensional structure of the protein chip.
나아가, 종래의 단백질 칩에 기초한 단백질의 정량 분석 방법은, 표적으로 하는 단백질의 바이오 리셉터가 부착된 단백질 칩을 구매함으로써 수행될 수 있음에 따라, 표적 단백질의 종류가 많아질 경우, 고가의 단백질 칩으로 인해 분석 비용도 함께 증가한다는 문제점이 있다. Furthermore, the conventional method for quantitative analysis of proteins based on protein chips can be performed by purchasing a protein chip to which a bioreceptor of a target protein is attached, and thus, when the type of target protein increases, an expensive protein chip Due to this, there is a problem that the analysis cost also increases.
본 발명의 발명자들은 이와 같은 종래의 단백질 칩이 갖는 한계점을 극복하기 위해, 단백질 칩에서 실질적으로 표적 단백질을 검출하는 기능의 검출 영역에 대하여 예의 주시하였다. 그 결과, 본 발명의 발명자들은, 단백질 칩 상에 금속을 증착시킨 새로운 단백질 칩을 개발할 수 있었다.In order to overcome the limitations of such a conventional protein chip, the inventors of the present invention closely watched for a detection region of a function for substantially detecting a target protein in a protein chip. As a result, the inventors of the present invention were able to develop a new protein chip in which metal was deposited on a protein chip.
보다 구체적으로, 본 발명의 발명자들은, 금속 스팟이 형성된 검출부가 표적 단백질을 높은 민감도 및 정밀도로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다. 나아가, 본 발명의 발명자들은, 검출부에서, 금속 스팟 각각에 대하여 최종 사용자가 정량 분석 하고자 하는 표적 단백질에 대한 바이오 리셉터가 결합할 수 있도록 구성하였다.More specifically, the inventors of the present invention were able to confirm that the detection portion with a metal spot can detect the target protein with high sensitivity and precision. Furthermore, the inventors of the present invention, in the detection unit, was configured so that the bioreceptor for the target protein to be quantitatively analyzed by the end user for each metal spot.
본 발명의 발명자들은, 동일한 영역에서 금속 스팟이 차지하는 면적이 동일한 조건, 즉 금속 스팟이 차지하는 면적율이 동일하다면, 금속 스팟의 크기가 작을수록 금속 스팟에 결합된 형광표지된 항체에 의해 검출되는 형광 신호가 증가되는 것을 확인할 수 있었다. The inventors of the present invention, if the area occupied by the metal spot in the same area is the same condition, that is, the area ratio occupied by the metal spot is the same, the smaller the size of the metal spot, the fluorescent signal detected by the fluorescently labeled antibody bound to the metal spot It was confirmed that is increased.
특히, 본 발명의 발명자들은, 단백질 정량 분석 칩 상의 검출부 내에, 금속 스팟의 밀도가 점진적으로 증가하도록 구성된 복수개의 서브 검출부를 배치함으로써, 바이오 리셉터의 서브 검출부 내에서의 고정화 밀도를 정밀하게 조절할 수 있어서 종래의 단백질 칩보다 표적 단백질의 정량 분석의 민감도 및 정밀도가 향상되는 것을 확인할 수 있었다. In particular, the inventors of the present invention can precisely adjust the immobilization density in the sub-detector of the bioreceptor by placing a plurality of sub-detectors configured to gradually increase the density of metal spots in the detector on the protein quantitative analysis chip. It was confirmed that the sensitivity and precision of the quantitative analysis of the target protein were improved than the conventional protein chip.
나아가, 본 발명의 발명자들은, 단백질 칩의 기판 위에 자가 조립 단층 (self-assembly monolayer, SAM) 막을 코팅하는 형식으로 금속 스팟 상에 표적 단백질에 대한 바이오 리셉터를 부착할 경우, 바이오 리셉터의 배향성이 증가되는 것을 인지할 수 있었다. 나아가, 본 발명의 발명자들은 금속 스팟의 크기가 작을 수록 표적 단백질과 바이오 리셉터의 결합에 따라 발생하는 신호가 균일해지고, 크게 증폭한다는 것을 확인할 수 있었다. Furthermore, the inventors of the present invention, when attaching a bioreceptor for a target protein on a metal spot in the form of coating a self-assembly monolayer (SAM) film on a substrate of a protein chip, the orientation of the bioreceptor increases I could recognize it. Furthermore, the inventors of the present invention were able to confirm that the smaller the size of the metal spot, the more uniform the signal generated according to the binding of the target protein and the bioreceptor and greatly amplified.
또한, 본 발명의 발명자들은, 단백질 칩 상에 특정한 표적 단백질에 대한 바이오 리셉터를 단위 면적 당 서로 다른 개수, 즉 밀도를 달리하여 고정시킬 경우, 상이한 해리 인자 (Dissociation factor) 를 갖는 바이오 리셉터의 성질을 갖으며, 이는 표적 단백질 및 항체의 면역 반응에 따라 발생하는 신호의 다이나믹 레인지 (dynamic range) 를 확대할 수 있음을 인지할 수 있었다. In addition, the inventors of the present invention, when a bioreceptor for a specific target protein on a protein chip is fixed with different numbers per unit area, i.e., with different densities, the properties of the bioreceptor having different dissociation factors are determined. It can be recognized that the dynamic range of signals generated according to the immune response of the target protein and antibody can be expanded.
나아가 본 발명의 발명자들은, 동일한 농도의 표적 단백질이 바이오 리셉터의 밀도에 따라 각각 고유의 결합량을 가질 수 있으며, 이것의 상관 관계를 그래프로 나타내면 회귀 직선을 구할 수 있음을 인지할 수 있었다. 그 결과, 본 발명의 발명자들은 표적 단백질의 농도에 따라 고유의 기울기 값을 갖는 회귀 직선을 확인할 수 있었다.Furthermore, the inventors of the present invention were able to recognize that a target protein of the same concentration may have a unique binding amount according to the density of the bioreceptor, and a regression line can be obtained by graphically showing the correlation thereof. As a result, the inventors of the present invention were able to identify a regression line having a unique slope value according to the concentration of the target protein.
결과적으로, 본 발명의 발명자들은, 항체의 밀도 대비 항원 (표적 단백질) 의 반응 신호를 기초로한 회귀 직선의 기울기 값으로 표적 단백질의 농도를 추적할 수 있는 표적 항원의 정량 분석 방법을 개발할 수 있었다. 이에, 본 발명의 발명자들은, 이와 같은 표적 항원의 정량 분석 방법을 제공함으로써, 종래의 단백질 칩을 이용한 단백질 정량 분석 방법에서 표준 단백질 신호값이 수반되는 번거로움을 해결하고 노이즈 신호에 의한 실제값의 왜곡을 줄일 수 있음을 확인할 수 있었다. As a result, the inventors of the present invention were able to develop a quantitative analysis method of a target antigen capable of tracking the concentration of the target protein with a slope value of a regression line based on the response signal of the antigen (target protein) versus the density of the antibody. . Thus, the inventors of the present invention, by providing such a method for quantitative analysis of the target antigen, to solve the hassle of the standard protein signal value in a protein quantitative analysis method using a conventional protein chip, and the actual value of the noise signal It was confirmed that distortion can be reduced.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 표적 단백질을 검출하도록 구성된, 금속 스팟으로 이루어진 복수개의 정량 분석 유닛을 포함하는 복수개의 서브 검출부를 포함하고, 광학적 분석을 수행함으로써 복수개의 정량 분석 유닛에 검출된 표적 단백질의 정량 분석이 가능한 단백질 칩을 제공하는 것이다. Accordingly, the problem to be solved by the present invention is to detect a target protein, a plurality of sub-detection units including a plurality of quantitative analysis units made of metal spots, and performing optical analysis to detect a plurality of quantitative analysis units It is to provide a protein chip capable of quantitative analysis of the target protein.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, 단백질 칩의 금속 스팟에, 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 바이오 리셉터를 고정하고, 표적 단백질을 포함하는 시료를 단백질 정량 분성용 칩 상에 처리하고, 복수개의 정량 분석 유닛 내에 검출된 표적 단백질의 정량 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 정량 분석 방법을 제공하는 것이다.Another problem to be solved by the present invention is to fix a bioreceptor that specifically binds to a target protein in a metal spot of a protein chip, process a sample containing the target protein on a chip for protein quantification, and provide multiple It is to provide a method for quantitative analysis of a target protein, comprising performing a quantitative analysis of the target protein detected in the quantitative analysis unit.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 단백질 칩 및 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 바이오 리셉터를 포함하는, 표적 단백질 정량분석용 키트를 제공하는 것이다.Another problem to be solved by the present invention is to provide a kit for quantitative analysis of a target protein, comprising a protein chip and a bioreceptor that specifically binds to a target protein.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The problems of the present invention are not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 일 실시예에 따른 기판을 포함하는 단백질 칩이 제공된다. 이때, 기판은, 표적 단백질을 검출하도록 구성된 복수개의 서브 검출부를 포함하고, 복수개의 서브 검출부 각각은 금속 스팟 (spot) 으로 이루어진 복수개의 정량 분석 유닛 (unit) 을 포함한다. 이러한 구성의 단백질 칩은, 광학적 분석을 수행함으로써 복수개의 정량 분석 유닛에 검출된 표적 단백질의 정량적 분석이 가능하도록 구성된다. In order to solve the problems as described above, a protein chip including a substrate according to an embodiment of the present invention is provided. At this time, the substrate includes a plurality of sub-detection units configured to detect a target protein, and each of the plurality of sub-detection units includes a plurality of quantitative analysis units (units) made of metal spots. The protein chip of this configuration is configured to enable quantitative analysis of the target protein detected in a plurality of quantitative analysis units by performing optical analysis.
본 발명의 특징에 따르면, 복수개의 정량 분석 유닛 각각은, 금속 스팟 및 표적 단백질과 특이적으로 결합하는 바이오 리셉터를 포함하고, 이들 각각은 서로 상이한 금속 스팟의 밀도를 가질 수 있다. 나아가, 바이오 리셉터는 금속 스팟 상에 부착될 수 있다.According to a feature of the present invention, each of the plurality of quantitative analysis units includes a metal spot and a bioreceptor that specifically binds a target protein, each of which may have a different density of metal spots from each other. Furthermore, the bioreceptor can be attached to the metal spot.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 복수개의 정량 분석 유닛은 하나의 서브 검출부 내에서 일련으로 배치되고, 일련으로 배치된 복수개의 정량 분석 유닛은 금속 스팟의 밀도가 점진적으로 증가하도록 구성될 수 있다.According to another feature of the present invention, a plurality of quantitative analysis units are arranged in series within one sub-detection unit, and the plurality of quantitative analysis units arranged in series may be configured to gradually increase the density of the metal spot.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 복수개의 정량 분석 유닛 각각은, 서로 상이한 밀도를 갖도록, 일정한 크기의 도트 (dot) 형태를 갖고 복수개의 분석 유닛 각각에 대하여 상이한 개수로 배치된 금속 스팟을 포함할 수 있다. 또한, 복수개의 정량 분석 유닛 각각은 서로 상이한 밀도를 갖도록, 다각형 형태를 갖고 복수개의 분석 유닛 각각에 대하여 상이한 크기로 배치된 금속 스팟을 포함할 수 있다. According to another feature of the present invention, each of the plurality of quantitative analysis units may include metal spots having a shape of dots having a predetermined size and disposed in different numbers for each of the plurality of analysis units so as to have different densities from each other. You can. In addition, each of the plurality of quantitative analysis units may include metal spots having a polygonal shape and disposed in different sizes for each of the plurality of analysis units to have different densities.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 복수개의 정량 분석 유닛은, 금속 스팟 상에 부착되도록 구성된 링커 (linker) 를 더 포함하고, 바이오 리셉터는, 링커에 의해 금속 스팟 상에 부착될 수 있다. 본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 단백질 칩은, 기판 위에 금속 스팟을 커버 (cover) 하고, 금속 스팟 상에 링커를 부착시키기도록 구성된 자가 조립 단분자층 (self-assembled monolayer) 을 더 포함할 수 있다. According to another feature of the invention, the plurality of quantitative analysis units further comprises a linker configured to be attached to the metal spot, and the bioreceptor can be attached to the metal spot by the linker. According to another feature of the present invention, the protein chip may further include a self-assembled monolayer configured to cover a metal spot on a substrate and attach a linker on the metal spot.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 표적 단백질 또는 바이오 리셉터 또는, 형광 표지된 (fluorescence-labeled) 것일 수 있다.According to another feature of the invention, it may be a target protein or bioreceptor, or fluorescence-labeled.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 금속 스팟은 기판 상에 일정한 간격으로 배치되어 패턴을 형성할 수 있다. 이때, 패턴의 선폭은 7 ㎛ 내지 12 ㎛일 수 있다. According to another feature of the invention, the metal spots may be arranged on the substrate at regular intervals to form a pattern. At this time, the line width of the pattern may be 7 μm to 12 μm.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 금속 스팟은, 직경이 500 nm 내지 10 ㎛인 도트 형태를 갖고, 패턴은 도트 형태의 금속 스팟에 의해 형성될 수 있다. According to another feature of the present invention, the metal spot has a dot shape having a diameter of 500 nm to 10 μm, and the pattern may be formed by a dot-shaped metal spot.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 금속 스팟은, Au, Ni, Cu, Zn, Fe, Al, Ti, Pt, Hg, Ag, Pb 및 이들의 합금으로 구성된 그룹 중 적어도 하나의 금속으로 이루어질 수 있다. According to another feature of the invention, the metal spot may be made of at least one metal from the group consisting of Au, Ni, Cu, Zn, Fe, Al, Ti, Pt, Hg, Ag, Pb and alloys thereof. .
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 복수개의 서브 검출부는 복수개의 검출 부 중 하나의 검출부를 구성하고, 복수개의 검출부 각각은, 서로 상이한 표적 단백질을 검출하도록 구성될 수 있다. According to another feature of the present invention, the plurality of sub-detection units constitute one of the plurality of detection units, and each of the plurality of detection units may be configured to detect different target proteins from each other.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 복수개의 서브 검출부는 하나의 검출부 내에서 0.3 mm 내지 0.9 mm의 간격으로 배치될 수 있다. 전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩을 이용한 표적 단백질의 정량 분석 방법이 제공된다. 이때, 정량 분석 방법은, 본 발명의 단백질 칩의 복수개의 정량 분석 유닛에 배치된 금속 스팟에, 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 바이오 리셉터를 고정하는 단계, 표적 단백질 및 바이오 리셉터가 반응하도록, 표적 단백질을 포함하는 시료를 단백질 정량 분성용 칩 상에 처리하는 단계, 및 복수개의 정량 분석 유닛 내에 검출된 표적 단백질의 정량 분석을 수행하는 단계를 포함한다. According to another feature of the present invention, a plurality of sub-detection units may be arranged at intervals of 0.3 mm to 0.9 mm in one detection unit. In order to solve the problems as described above, a method for quantitative analysis of a target protein using a protein chip according to an embodiment of the present invention is provided. At this time, the quantitative analysis method, the step of immobilizing a bioreceptor that specifically binds to a target protein to a metal spot disposed in a plurality of quantitative analysis units of the protein chip of the present invention, the target protein and the bioreceptor react, the target And processing the sample containing the protein on the chip for protein quantification and performing the quantitative analysis of the target protein detected in the plurality of quantitative analysis units.
본 발명의 특징에 따르면, 표적 단백질 또는, 바이오 리셉터는 형광 표지된 것이고, 정량 분석을 수행하는 단계는, 복수개의 정량 분석 유닛으로 구성된 서브 유닛에 대하여 형광의 세기를 측정함으로써, 표적 단백질의 정량 분석을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. According to a feature of the present invention, the target protein or bioreceptor is fluorescently labeled, and the step of performing quantitative analysis is to quantitatively analyze the target protein by measuring the intensity of fluorescence with respect to subunits composed of a plurality of quantitative analysis units. It may include the step of performing.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 복수개의 정량 분석 유닛 각각이 서로 상이한 금속 스팟의 밀도를 갖고, 바이오 리셉터를 고정하는 단계는 복수개의 정량 분석 유닛이 서로 상이한 바이오 리셉터의 밀도를 갖도록, 복수개의 정량 분석 유닛의 금속 스팟 상에 바이오 리셉터를 고정하는 단계를 포함할 수 있다. 나아가, 정량 분석을 수행하는 단계는, 복수개의 정량 분석 유닛에 대하여, 바이오 리셉터의 밀도에 따른 표적 단백질과의 결합량을 측정함으로써, 표적 단백질의 정량 분석을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 정량 분석을 수행하는 단계는, 서로 상이한 밀도를 갖는 바이오 리셉터에 결합하는 표적 단백질의 결합량을 측정하여 이것의 상관관계를 그래프로 나타내고 회귀 직선을 구하여 그 기울기 값으로 표적 단백질의 정량 분석을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. According to another feature of the present invention, each of the plurality of quantitative analysis units has a density of different metal spots, and the step of fixing the bioreceptor is such that the plurality of quantitative analysis units have different densities of the bioreceptors, so that the multiple quantitative analysis And fixing the bioreceptor on the metal spot of the unit. Furthermore, the step of performing the quantitative analysis may include performing a quantitative analysis of the target protein by measuring the amount of binding to the target protein according to the density of the bioreceptor for a plurality of quantitative analysis units. According to another feature of the present invention, the step of performing quantitative analysis measures a binding amount of a target protein that binds to a bioreceptor having a different density from each other, graphically displays the correlation thereof, obtains a regression line, and obtains the slope value thereof It may include the step of performing a quantitative analysis of the target protein.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 정량 분석을 수행하는 단계는, SPR 이미징 (imaging) 분석, SELDI (surface-enhanced laser desorption-ionization) 질량 분석, AFM (Atomic Force Microscope) 분석 및 MALDI-TOF (Matrixassistedlaser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석으로 이루어진 그룹 중 선택된 적어도 하나의 방법을 이용하여 표적 단백질의 정량 분석을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. According to another feature of the invention, the step of performing the quantitative analysis, SPR imaging (imaging) analysis, surface-enhanced laser desorption-ionization (SELDI) mass spectrometry, atomic force microscope (AFM) analysis and MALDI-TOF (Matrixassistedlaser) desorption / ionization time-of-flight) may include performing a quantitative analysis of a target protein using at least one method selected from the group consisting of mass spectrometry.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 표적 단백질의 정량 분석 방법은, 바이오 리셉터를 고정하는 단계 이전에 수행되는, 바이오 리셉터와 금속 스팟을 간접적으로 연결해주는 링커를 스팟 상에 배치하는 단계를 더 포함할 수 있다. 나아가, 바이오 리셉터를 고정하는 단계는 링커를 통해 바이오 리셉터를 복수개의 정량 분석 유닛에 배치된 금속 스팟 상에 고정하는 단계를 포함할 수 있다. According to another feature of the present invention, the method for quantitative analysis of a target protein further comprises placing a linker that indirectly connects the bioreceptor and the metal spot on the spot, performed before the step of immobilizing the bioreceptor. You can. Further, fixing the bioreceptor may include fixing the bioreceptor on a metal spot disposed in a plurality of quantitative analysis units through a linker.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 링커를 금속 스팟 상에 배치하는 단계는, 단백질 칩의 기판 위에 금속 스팟을 커버하고, 금속 스팟 상에 링커를 부착시키기도록, 링커 및 자가 조립가능한 분자를 포함하는 코팅 용액을 이용하여 단백질 칩의 복수개의 정량 분석 유닛 상에 코팅하는 단계를 포함할 수 있다.According to another feature of the invention, the step of placing the linker on the metal spot comprises a linker and a self-assembleable molecule to cover the metal spot on the substrate of the protein chip and attach the linker on the metal spot. Coating the protein chip onto a plurality of quantitative analysis units using a coating solution.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩을 포함하는, 표적 단백질의 정량 분석용 키트가 제공된다. 이때, 키트는 본 발명의 단백질 칩, 및 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 바이오 리셉터를 포함하한다.In order to solve the problems as described above, a kit for quantitative analysis of a target protein is provided, which includes a protein chip according to an embodiment of the present invention. At this time, the kit includes the protein chip of the present invention and a bioreceptor that specifically binds to the target protein.
본 발명의 특징에 따르면, 단백질 정량 분석용 키트는, 완충 용액을 더 포함할 수 있다.According to the characteristics of the present invention, the kit for quantitative analysis of proteins may further include a buffer solution.
본 발명은, 금속 스팟에 의해 형성된 정량 분석 유닛을 포함하는 서브 검출부가 구비된 단백질 칩을 제공함으로써, 적은 양의 시료로부터 극미량의 표적 단백질을 민감도 높게 검출할 수 있는 효과가 있다. The present invention has an effect capable of detecting a very small amount of target protein with high sensitivity from a small amount of sample by providing a protein chip equipped with a sub-detecting unit including a quantitative analysis unit formed by a metal spot.
본 발명은, 동일한 영역에서 금속 스팟이 차지하는 면적이 동일한 조건, 즉 금속 스팟이 자치하는 면적율이 동일하다면, 금속 스팟의 크기가 작을수록 금속 스팟에 결합된 형광표지된 항체에 의해 검출되는 형광 신호가 증가되는 현상을 이용하여, 검출시 복제가 가능하여 신호 증폭의 효과를 얻는 DNA 가닥과는 다르게 복제가 가능하지 않은 단백질을 검출함에 있어 신호 증폭의 효과가 있다.In the present invention, if the conditions of the same area occupied by the metal spots in the same region, that is, the area ratios of the metal spots are the same, the smaller the size of the metal spot, the more the fluorescent signal detected by the fluorescently labeled antibody bound to the metal spot. Using the increased phenomenon, unlike DNA strands that can be replicated upon detection and obtain the effect of signal amplification, it has the effect of signal amplification in detecting proteins that are not capable of replication.
특히, 본 발명은, 단백질 정량 분석 칩 상의 검출부 내에, 금속 스팟의 밀도가 점진적으로 증가하도록 구성된 복수개의 정량 분석 유닛을 포함하는 서브 검출부를 배치함으로써, 바이오 리셉터의 서브 검출부 내에서의 고정화 밀도를 정밀하게 조절할 수 있다. 이에, 본 발명은 종래의 단백질 칩보다 민감도 및 정밀도가 향상된 정량 분석 결과를 제공할 수 있는 효과가 있다. Particularly, the present invention precisely fixes the immobilization density in the sub-detector of the bioreceptor by placing a sub-detector comprising a plurality of quantitative analysis units configured to gradually increase the density of metal spots in the detection section on the protein quantitative analysis chip. Can be adjusted. Thus, the present invention has an effect capable of providing a quantitative analysis result with improved sensitivity and precision than a conventional protein chip.
또한, 본 발명은, 특정한 단백질을 검출하기 위한 바이오 리셉터가 고정된, 종래의 단백질 칩이 갖는 한계점을 극복할 수 있는 효과가 있다.In addition, the present invention has an effect capable of overcoming the limitations of a conventional protein chip, in which a bioreceptor for detecting a specific protein is fixed.
보다 구체적으로, 본 발명은, 검출부에 존재하는 금속 스팟 각각에 대하여 최종 사용자가 정량 분석 하고자 하는 표적 단백질에 대한 바이오 리셉터가 결합할 수 있도록 구성함에 따라, 분석 비용을 절감할 수 있는 효과를 제공할 수 있다. 나아가, 본 발명은, 1 회의 분석을 통해, 복수의 표적 단백질에 대한 정량 분석을 제공할 수 있는 효과가 있다. More specifically, the present invention provides an effect of reducing an analysis cost by configuring a bioreceptor for a target protein to be quantitatively analyzed by an end user for each metal spot present in the detection unit. You can. Furthermore, the present invention has an effect capable of providing quantitative analysis for a plurality of target proteins through one analysis.
나아가, 본 발명은, 특정한 표적 단백질에 대한 바이오 리셉터를 단위 면적 당 서로 다른 개수, 즉 밀도를 달리하여 고정시켜 상이한 해리 인자 (Dissociation factor) 를 가질 수 있음에 따라, 표적 단백질 및 항체의 면역 반응에 따라 발생하는 신호의 다이나믹 레인지 (dynamic range) 를 확대할 수 있다. Furthermore, according to the present invention, the bioreceptors for a specific target protein can be immobilized at different numbers per unit area, i.e., at different densities, to have different dissociation factors. The dynamic range of the resulting signal can be enlarged.
본 발명은, 항체의 밀도 대비 항원 (표적 단백질) 의 반응 신호를 기초로한 회귀 직선의 기울기 값으로 표적 단백질의 농도를 추적할 수 있는 표적 항원의 정량 분석 방법을 제공할 수 있다. The present invention can provide a method for quantitative analysis of a target antigen capable of tracking the concentration of a target protein with a slope value of a regression line based on a response signal of the antigen (target protein) to the density of the antibody.
따라서, 본 발명은, 종래의 단백질 칩을 이용한 단백질 정량 분석 방법에서 표준 단백질 신호값이 수반되는 번거로움을 해결하고, 노이즈 신호에 의한 실제값의 왜곡을 줄일 수 있음에 따라, 종래의 방법보다 용이하고 정확도 높은 정량 분석을 수행할 수 있는 효과가 있다. Therefore, the present invention is easier than the conventional method, as it solves the hassle associated with the standard protein signal value in the protein quantitative analysis method using a conventional protein chip, and reduces the distortion of the actual value due to the noise signal. And has the effect of performing accurate quantitative analysis.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.The effects according to the present invention are not limited by the contents exemplified above, and more various effects are included in the present specification.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩의 개략적인 평면도이다. 1A is a schematic plan view of a protein chip according to an embodiment of the present invention.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩의 검출부, 서브 검출부 및 정량 분석 유닛을 예시적으로 도시한 것이다.1B is an exemplary view showing a detection unit, a sub-detection unit, and a quantitative analysis unit of a protein chip according to an embodiment of the present invention.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩의 서브 검출부 내에서 금속 스팟의 밀도에 따라 점진적으로 배치되는 정량 분석 유닛을 예시적으로 도시한 것이다.1C exemplarily shows a quantitative analysis unit that is gradually disposed according to the density of a metal spot in a sub-detection unit of a protein chip according to an embodiment of the present invention.
도 1d는 기판 상에 배치된 금속 스팟의 밀도에 따라 측정된 형광 세기의 분석 결과를 도시한 것이다. Figure 1d shows the results of the analysis of the fluorescence intensity measured according to the density of the metal spot disposed on the substrate.
도 1e 내지 1g는 본 발명의 다양한에 따른 단백질 칩의 서브 검출부 내에서 금속 스팟의 밀도에 따라 점진적으로 배치되는 정량 분석 유닛을 예시적으로 도시한 것이다.1E to 1G exemplarily illustrate a quantitative analysis unit that is gradually disposed according to the density of a metal spot in a sub-detection unit of a protein chip according to various embodiments of the present invention.
도 1h 내지 1j는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩의 정량 분석 유닛에 바이오 리셉터가 고정된 것을 예시적으로 도시한 것이다. 1H to 1J illustrate that a bioreceptor is fixed to a quantitative analysis unit of a protein chip according to an embodiment of the present invention.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 단백질 칩의 검출부, 서브 검출부 및 정량 분석 유닛을 예시적으로 도시한 것이다.2 exemplarily shows a detection unit, a sub-detection unit, and a quantitative analysis unit of a protein chip according to another embodiment of the present invention.
도 3a 및 3b은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 단백질 칩에 이용되는 영역 분리 막을 예시적으로 도시한 것이다. 3A and 3B exemplarily show a region separation membrane used in a protein chip according to various embodiments of the present invention.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩을 이용한, 표적 단백질의 정량 분석의 절차를 도시한 것이다.4 shows a procedure of quantitative analysis of a target protein using a protein chip according to an embodiment of the present invention.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩에 대한, 하나의 금속 스팟 표면에 따른 신호의 강도의 분석 결과를 도시한 것이다. Figure 5a shows the results of the analysis of the intensity of the signal along the surface of one metal spot for the protein chip according to an embodiment of the present invention.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩에 대한, 금속스팟 크기에 따른 신호 증폭 효과와 항체의 밀도에 따른 신호의 강도의 분석 결과를 도시한 것이다.Figure 5b shows the results of analyzing the signal intensity according to the density of the antibody and the signal amplification effect according to the metal spot size, for the protein chip according to an embodiment of the present invention.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩에 대한, 항원의 농도에 따른 회귀 직선의 기울기 값의 분석 결과를 도시한 것이다.Figure 5c shows the results of the analysis of the slope value of the regression line according to the concentration of the antigen for the protein chip according to an embodiment of the present invention.
발명의 이점, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. Advantages of the present invention and methods for achieving them will be made clear by referring to embodiments described below in detail together with the accompanying drawings. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but will be implemented in various different forms, and only the present embodiments allow the disclosure of the present invention to be complete, and the ordinary knowledge in the technical field to which the present invention pertains. It is provided to fully inform the holder of the scope of the invention, and the invention is only defined by the scope of the claims.
본 발명의 실시예를 설명하기 위한 도면에 개시된 형상, 크기, 비율, 각도, 개수 등은 예시적인 것이므로 본 발명이 도시된 사항에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 본 명세서 상에서 언급된 '포함한다', '갖는다', '이루어진다' 등이 사용되는 경우, '~만'이 사용되지 않는 이상 다른 부분이 추가될 수 있다. 구성요소를 단수로 표현한 경우에 특별히 명시적인 기재 사항이 없는 한 복수를 포함하는 경우를 포함한다.The shapes, sizes, ratios, angles, numbers, etc. disclosed in the drawings for describing the embodiments of the present invention are exemplary and the present invention is not limited to the illustrated matters. In addition, in the description of the present invention, when it is determined that detailed descriptions of related known technologies may unnecessarily obscure the subject matter of the present invention, detailed descriptions thereof will be omitted. When 'include', 'have', 'consist of', etc. mentioned in this specification are used, other parts may be added unless '~ man' is used. When a component is expressed as a singular number, the plural number is included unless otherwise specified.
구성요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.In analyzing the components, it is interpreted as including the error range even if there is no explicit description.
본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다.Each of the features of the various embodiments of the present invention may be partially or totally combined with or combined with each other, and technically various interlocking and driving may be possible as those skilled in the art can fully understand, and each of the embodiments may be independently implemented with respect to each other. It can also be implemented together in an association relationship.
본 명세서의 해석의 명확함을 위해, 이하에서는 본 명세서에서 사용되는 용어들을 정의하기로 한다.For clarity of interpretation of the present specification, hereinafter, terms used in the specification will be defined.
본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩은, 광학적 분석을 수행함으로써 복수개의 정량 분석 유닛에 검출된 표적 단백질의 정량적 분석이 가능하도록 구성된다.The protein chip according to an embodiment of the present invention is configured to enable quantitative analysis of a target protein detected in a plurality of quantitative analysis units by performing optical analysis.
이때, 단백질 칩의 기판은 표적 단백질을 검출하도록 구성된 복수개의 서브 검출부를 포함하고, 복수개의 서브 검출부 각각은, 금속 스팟 (spot) 으로 이루어진 복수개의 정량 분석 유닛 (unit) 을 포함한다. At this time, the substrate of the protein chip includes a plurality of sub-detection units configured to detect a target protein, and each of the plurality of sub-detection units includes a plurality of quantitative analysis units made of metal spots.
본 명세서에서 사용되는 용어, "단백질 칩"은, 표적 단백질을 분리, 검출 및 정량 분석하도록 구성된 단일 칩을 의미할 수 있다. 이러한 단백질 칩은, 표면 개질된 유리, 실리콘, 실리콘, 폴리프로필렌 등의 고분자로 이루어진 기판 상에 표적 단백질과 반응할 수 있도록 구성된 바이오 리셉터가 고정되어 있을 수 있다. As used herein, the term "protein chip" may mean a single chip configured to separate, detect and quantify a target protein. In the protein chip, a bioreceptor configured to react with a target protein may be fixed on a substrate made of a polymer such as glass, silicon, silicon, polypropylene, or the like.
본 명세서에서 개시된 단백질 칩은, 정량 분석용 단백질 칩, 단백질 어레이용 슬라이드, 단백질 정량 칩과 동일하게 해석될 수도 있다. The protein chip disclosed in this specification may be interpreted in the same way as a protein chip for quantitative analysis, a slide for protein array, and a protein quantitative chip.
한편, 본원 명세서 내에서 단백질 칩은, 바이오 리셉터가 고정되지 않은 상태의 칩, 또는 특정한 단백질에 대한 바이오 리셉터가 고정되어 있는 칩 모두를 아우를 수 있다. Meanwhile, the protein chip in the present specification may encompass a chip in which the bioreceptor is not fixed or a chip in which the bioreceptor for a specific protein is fixed.
이때, 단백질 칩의 기판은 유리, 실리콘, 폴리프로필렌, 나일론, 플라스틱 및 금속으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 소재로 구성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. At this time, the substrate of the protein chip may be made of a material selected from the group consisting of glass, silicon, polypropylene, nylon, plastic, and metal, but is not limited thereto.
본 명세서에서 사용되는 용어, "표적 단백질"은, 단백질 칩을 사용하여 시료 내에 존재 여부 및 정량 분석을 하고자 하는 단백질을 의미할 수 있다. 예를 들어, 표적 단백질은 항체, 항원, 효소, 펩타이드 단위의 바이오 마커일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. As used herein, the term “target protein” may mean a protein to be present in a sample and a quantitative analysis using a protein chip. For example, the target protein may be a biomarker of an antibody, antigen, enzyme, or peptide unit, but is not limited thereto.
본 명세서에서 사용되는 용어, "바이오 리셉터"는 표적 단백질과 상호 작용하는 모든 물질을 의미할 수 있다. 예를 들어, 바이오 리셉터는 표적 단백질과 상호 작용하는 단백질, 리간드, 핵산, 탄수화물 및 항체 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 표적 단백질의 성질에 따라 다양하게 설정될 수 있다. As used herein, the term “bioreceptor” can mean any substance that interacts with a target protein. For example, the bioreceptor may be at least one of proteins, ligands, nucleic acids, carbohydrates, and antibodies that interact with the target protein, but is not limited thereto and may be variously set according to the properties of the target protein.
바람직하게, 바이오 리셉터는 항체 일 수 있다. 이때, 본 발명의 특징에 따르면, 바이오 리셉터는, 하나의 표적 단백질을 타겟으로 하고, 상이한 해리 인자를 갖는 항체일 수 있다. 이러한, 해리 인자가 다양화된 항체를 바이오 리셉터로 이용함에 따라, 본 발명의 단백질 칩은 하나의 표적 단백질에 대하여 보다 넓은 농도 영역에 대한 정량 분석이 가능할 수 있다. Preferably, the bioreceptor can be an antibody. At this time, according to the characteristics of the present invention, the bioreceptor may be an antibody targeting one target protein and having different dissociation factors. As such, by using an antibody with a diversified dissociation factor as a bioreceptor, the protein chip of the present invention may be capable of quantitative analysis of a wider concentration region for one target protein.
본 발명의 특징에 따르면, 표적 단백질 또는 바이오 리셉터는 형광 표지된 (fluorescence-labeled) 리셉터일 수 있다. 보다 구체적으로 형광 표지된 표적 단백질은, 본 발명의 단백질 칩에 처리하기 이전에 광 자극에 의한 형광을 발생하는 색소 (fluorochrome) 가 결합된 단백질일 수 있다. 나아가, 형광 표지된 바이오 리셉터는 형광을 발생하는 색소가 결합된 리셉터일 수 있다. 이때, 형광색소는 통상 형광색 소이소티오시아네이트 (FITC), 적등색 형광을 발광하는 로다민이소티오시아네이트 (RITC), 피코에리트린 (phycoerythrin) 의 색소 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. According to a feature of the invention, the target protein or bioreceptor can be a fluorescence-labeled receptor. More specifically, the fluorescently labeled target protein may be a protein to which a fluorochrome that generates fluorescence by light stimulation is bound before being processed on the protein chip of the present invention. Furthermore, the fluorescently labeled bioreceptor may be a receptor bound with a pigment that generates fluorescence. At this time, the fluorescent pigment may be a pigment protein of fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate (RITC) or picoerythrin that emits red-orange fluorescence, but is not limited thereto. .
따라서, 사용자는 형광항체법, 유동세포계수법 (flow cytometry), 면역형광측정법등의 분석 방법을 이용하여, 단백질 칩 내 바이오 리셉터와 표적 단백질의 상호 작용에 따른 신호를 검출함으로써, 표적 단백질에 대한 정량 분석을 수행할 수 있다. Therefore, the user quantifies the target protein by detecting a signal according to the interaction of the bioreceptor and the target protein in the protein chip using an analysis method such as fluorescence antibody method, flow cytometry, immunofluorescence method, etc. Analysis can be performed.
한편, 본원 명세서 내에서 표적 단백질의 질량 분석을 위해 이용되는 바이오 리셉터는 형광 표지된 리셉터에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 형광 색소가 표지되지 않은 바이오 리셉터를 이용하는 경우, SPR 이미징 (imaging) 분석, SELDI (surface-enhanced laser desorption-ionization) 질량 분석, AFM (Atomic Force Microscope) 분석 및 MALDI-TOF (Matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석을 통해, 바이오 리셉터에 결합된 표적 단백질의 정량 분석이 가능할 수 있다. 나아가, 정량 분석 이전에 표적 단백질에 대하여 형광 표지를 수행한 경우, 형광 표지된 바오 리셉터의 이용 없이도 표적 단백질의 정량 분석이 가능할 수 있다. Meanwhile, the bioreceptor used for mass spectrometry of a target protein in the present specification is not limited to a fluorescently labeled receptor. For example, when using a bioreceptor without a fluorescent dye, SPR imaging analysis, surface-enhanced laser desorption-ionization (SELDI) mass spectrometry, atomic force microscope (AFM) analysis and matrixassisted laser MALDI-TOF Desorption / ionization time-of-flight) Through mass spectrometry, quantitative analysis of a target protein bound to a bioreceptor may be possible. Furthermore, when fluorescent labeling is performed on the target protein prior to quantitative analysis, quantitative analysis of the target protein may be possible without using a fluorescently labeled Bao receptor.
본 명세서에서 사용되는 용어, "서브 검출부"는 단백질 칩 상에서 표적 단백질을 검출하도록 구성된 영역을 의미할 수 있다. 이때, 서브 검출부는, 단백질 칩의 기판 상에 금속이 증착됨으로써 형성된 복수의 금속 스팟 (spot) 을 포함하는 복수개의 정량 분석 유닛 (unit) 으로 구성될 수 있다.As used herein, the term “sub-detection unit” may mean a region configured to detect a target protein on a protein chip. At this time, the sub-detection unit may be composed of a plurality of quantitative analysis units (units) including a plurality of metal spots (spots) formed by depositing metal on a substrate of a protein chip.
이에, 본원 명세서에서 서브 검출부는, 단백질 칩 내에서 금속 스팟이 존재하는 모든 영역을 의미할 수 도 있다. Thus, in the present specification, the sub-detection unit may mean all regions in which metal spots are present in the protein chip.
한편, 이러한 서브 검출부는 복수개로 존재할 경우, 하나의 검출부를 형성할 수 있다.On the other hand, when there are a plurality of such sub-detection units, one detection unit may be formed.
본 발명의 특징에 따르면, 본 발명의 단백질 칩은, 독립적인 복수개의 검출부들을 포함할 수 있다. 이에, 한번의 분석을 통해 복수 시료의 표적 단백질에 대한 정량 분석이 이루어질 수 있다. According to a feature of the present invention, the protein chip of the present invention may include a plurality of independent detection units. Accordingly, quantitative analysis of target proteins of multiple samples may be performed through one analysis.
본 명세서에서 사용되는 용어, "정량 분석 유닛"은 서브 검출부 내에서 실질적으로 표적 단백질의 검출 및 정량 분석이 수행되는 유닛을 의미할 수 있다. 이때, 정량 분석 유닛 내에는 전술한 금속 스팟들이 배치될 수 있다. As used herein, the term “quantitative analysis unit” may mean a unit in which detection and quantitative analysis of a target protein are substantially performed in a sub-detection unit. At this time, the aforementioned metal spots may be disposed in the quantitative analysis unit.
본 명세서에서 사용되는 용어, "금속 스팟"은 전술한 바와 같이 단백질 칩의 기판 상에 금속이 증착되어 형성된 반점들을 의미할 수 있다. 이때, 금속 스팟 상에는 표적 단백질에 따른 바이오 리셉터가 부착될 수 있다. As used herein, the term “metal spot” may refer to spots formed by depositing metal on a substrate of a protein chip as described above. At this time, a bioreceptor according to the target protein may be attached on the metal spot.
본 발명의 특징에 따르면, 금속 스팟 상에는 링커가 부착되어 있을 수 있고, 바이오 리셉터는 상기 링커를 통해 금속 스팟에 고정될 수 있다. 이때, 링커는 단백질 A/G, 덱스트란 (dextran) 또는 PEG (polyethylene glycol) 가 바람직할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. According to a feature of the present invention, a linker may be attached to the metal spot, and the bioreceptor may be fixed to the metal spot through the linker. At this time, the linker may be a protein A / G, dextran (dextran) or PEG (polyethylene glycol), but is not limited thereto.
한편, 링커는, 링커 및 자가 조립가능한 분자를 포함하는 코팅 용액이 단백질 칩의 정량 분석 유닛 상에 단일 층으로 코팅됨으로써, 금속 스팟 표면에 부착될 수 있다. On the other hand, the linker can be attached to the metal spot surface by coating the coating solution comprising the linker and the self-assembleable molecule in a single layer on a quantitative analysis unit of the protein chip.
이러한 코팅에 의해, 자가 조립 단분자층 (self-assembled monolayer, SAM) 이 단백질 칩의 기판 상에 형성될 수 있다. By this coating, a self-assembled monolayer (SAM) can be formed on the substrate of the protein chip.
본 발명의 특징에 따르면, 복수개의 정량 분석 유닛 각각은, 서로 상이한 밀도를 갖도록, 일정한 크기의 도트 (dot) 형태를 갖고 복수개의 분석 유닛 각각에 대하여 상이한 개수로 배치된 금속 스팟을 포함할 수 있다. 또는, 복수개의 정량 분석 유닛 각각은 서로 상이한 밀도를 갖도록, 다각형 형태를 갖고 복수개의 분석 유닛 각각에 대하여 상이한 크기로 배치된 금속 스팟을 포함할 수 있다.According to a feature of the present invention, each of the plurality of quantitative analysis units may include metal spots having a dot shape of a certain size and disposed in different numbers for each of the plurality of analysis units to have different densities. . Alternatively, each of the plurality of quantitative analysis units may include a metal spot having a polygonal shape and disposed in different sizes for each of the plurality of analysis units so as to have different densities.
바람직하게, 금속 스팟은 500 ㎚부터 10 ㎛ 단위를 갖는 도트 형태일 수 있으나, 단백질 칩의 기판 상에 일정한 면적을 갖도록 금속이 증착되는 한 다양한 형태를 가질 수 있다. Preferably, the metal spot may have a dot shape having a unit of 10 μm from 500 nm, but may have various shapes as long as the metal is deposited to have a constant area on the substrate of the protein chip.
본 발명의 특징에 따르면, 금속 스팟이 도트 형태로 일정한 간격으로 정량 분석 유닛에 배치될 경우, 패턴을 형성할 수 있다. 이때, 도트 형태의 금속 스팟의 직경은 500 nm 내지 10 ㎛일 수도 있다. 한편, 금속 스팟 크기가 작을수록 신호 증폭 효과가 있을 수 있음에 따라, 금속 스팟의 직경은 500 nm 내지 1 ㎛일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 나아가, 형성된 패턴의 선폭은 7 ㎛ 내지 12 ㎛일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. According to a feature of the present invention, when the metal spots are arranged in the quantitative analysis unit at regular intervals in the form of dots, a pattern can be formed. At this time, the diameter of the dot-shaped metal spot may be 500 nm to 10 μm. Meanwhile, as the metal spot size is smaller, the signal amplification effect may be obtained, but the diameter of the metal spot may be 500 nm to 1 μm, but is not limited thereto. Furthermore, the line width of the formed pattern may be 7 μm to 12 μm, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 금속 스팟은 Au, Ni, Cu, Zn, Fe, Al, Ti, Pt, Hg, Ag, Pb 및 이들의 합금으로 구성된 그룹 중 적어도 하나일 수 있다. 바람직하게, 본원 명세서 내에 개시된 금속 스팟은 금일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 표적 단백질의 종류, 바이오 리셉터의 종류에 따라 다양하게 설정될 수 있다. According to another feature of the invention, the metal spot may be at least one of the group consisting of Au, Ni, Cu, Zn, Fe, Al, Ti, Pt, Hg, Ag, Pb and alloys thereof. Preferably, the metal spot disclosed in the present specification may be gold, but is not limited thereto, and may be variously set according to the type of target protein and the type of bioreceptor.
한편, 검출부는, 표적하는 단백질에 따른 바이오 리셉터의 부착이 가능한 금속 스팟이 배치된 복수의 서브 검출부를 포함할 수 있다. Meanwhile, the detection unit may include a plurality of sub-detection units on which metal spots capable of attaching bioreceptors according to target proteins are disposed.
본 명세서에서 사용되는 용어, "서브 검출부"는 검출부의 서브유닛 (subunit) 을 의미할 수 있다. As used herein, the term “sub detection unit” may mean a subunit of the detection unit.
본 발명의 특징에 따르면, 서브 검출부는 하나의 검출부 내에서 0.3 mm 내지 0.9 mm의 간격으로 배치될 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다. According to a feature of the present invention, the sub-detection units may be arranged at intervals of 0.3 mm to 0.9 mm in one detection unit. However, it is not limited thereto.
본 발명의 특징에 따르면, 복수개의 정량 분석 유닛은 하나의 서브 검출부 내에서, 일련으로 배치될 수 있고 일련으로 배치된 복수개의 정량 분석 유닛은 금속 스팟의 밀도가 점진적으로 증가하거나 감소하도록 구성될 수 있다.According to a feature of the present invention, a plurality of quantitative analysis units may be arranged in series, within one sub-detection unit, and the plurality of quantitative analysis units arranged in series may be configured to gradually increase or decrease the density of metal spots. have.
즉, 본 발명의 단백질 칩의 검출부는, 금속 스팟의 밀도가 점진적으로 변화하도록 구성된 정량 분석 유닛을 포함하는 서브 검출부들로 구성될 수 있다. 이때, 바이오 리셉터는 금속 스팟에 배치될 수 있음에 따라, 금속 스팟의 밀도의 변화는 바이오 리셉터의 밀도 변화를 의미할 수 있다. That is, the detection portion of the protein chip of the present invention may be composed of sub-detection portions including a quantitative analysis unit configured to gradually change the density of the metal spot. In this case, as the bioreceptor may be disposed on the metal spot, the change in density of the metal spot may mean a change in density of the bioreceptor.
이러한 구성에 따라, 금속 스팟의 밀도 또는 금속 스팟의 면적에 대한 표적 단백질 및 바이오 리셉터의 상호 작용에 따른 신호를 분석함으로써, 표적 단백질에 대한 정밀도 및 민감도 높은 정량 분석이 가능할 수 있다. According to this configuration, by analyzing the signal according to the interaction of the target protein and the bioreceptor with respect to the density of the metal spot or the area of the metal spot, quantitative analysis with high precision and sensitivity to the target protein may be possible.
보다 구체적으로, 바이오 리셉터의 농도의 점진적 증가에 따라, 바이오 리셉터와 표적 단백질의 반응에 따른 신호는 정비례로 증가할 수 있다. 즉, 표적 단백질은 그 종류에 따라, 바이오 리셉터의 농도에 따른 각각 고유의 결합량 (고유의 기울기 값) 을 가질 수 있다. 따라서, 사용자는 이러한 표적 단백질의 기울기 값을 역으로 이용하여 표적 단백질의 농도를 추정할 수 있음에 따라, 표적 단백질에 대한 정량 분석이 가능할 수 있다. More specifically, as the concentration of the bioreceptor gradually increases, the signal according to the reaction between the bioreceptor and the target protein may increase in direct proportion. That is, the target protein may have a unique binding amount (unique slope value) according to the concentration of the bioreceptor depending on its type. Therefore, as the user can estimate the concentration of the target protein by using the slope value of the target protein in reverse, quantitative analysis of the target protein may be possible.
이러한, 고유한 기울기 값을 이용한 정량 분석 방법은, 장비 또는 기타 환경적 요인에 의한 신호의 강화 혹은 감소에 따른 분석의 오차를 줄일 수 있다.The quantitative analysis method using the unique slope value can reduce an error in analysis due to enhancement or reduction of a signal due to equipment or other environmental factors.
이에, 사용자는, 복수의 검출부 중 하나의 검출부의 이용 및 1 회의 단일 분석만으로도 표적 단백질에 대한 정밀도 및 민감도가 향상된 정량 분석을 수행할 수 있다. Accordingly, the user can perform quantitative analysis with improved precision and sensitivity to the target protein by using only one detection unit among a plurality of detection units and one single analysis.
이와 대조적으로, 단백질 칩 내에 표적 단백질을 검출하도록 구성된 검출부가 일정한 밀도를 갖는 금속 스팟으로 구성된 서브 유닛들로 이루어질 경우, 표적 단백질에 대한 정밀도 및 민감도 높은 정량 분석을 위해서 복수회의 반복 실험이 요구될 수 있다. 즉, 일정한 밀도를 갖는 바이오 리셉터가 고정된 종래의 단백질 칩을 이용할 경우, 표적 단백질에 대한 정밀도 및 민감도 높은 정량 분석이 어려울 수 있다. 나아가, 이와 같은 종래의 단백질 칩은, 정량 분석을 위해 표준 단백질의 기준 신호값이 요구될 수도 있다. In contrast, when the detection unit configured to detect the target protein in the protein chip is composed of sub-units composed of metal spots having a certain density, multiple iterative experiments may be required for high-precision and sensitive quantitative analysis of the target protein. have. That is, when using a conventional protein chip with a fixed bioreceptor having a certain density, quantitative analysis with high precision and sensitivity to a target protein may be difficult. Furthermore, such a conventional protein chip may require a reference signal value of a standard protein for quantitative analysis.
본 발명의 특징에 따르면, 단백질 칩은 검출부 상에 배치되는 자가 조립 단분자층을 더 포함할 수 있다. According to the feature of the present invention, the protein chip may further include a self-assembled monolayer disposed on the detection unit.
*이에, 사용자는, 단일의 단백질 칩을 이용하여, 상이한 복수개의 표적 단백질을 독립적인 검출 영역 내에서 확인하고, 각각의 표적 단백질에 대한 정량 분석을 수행할 수 있다. * As a result, the user can identify a plurality of different target proteins in independent detection regions using a single protein chip, and perform quantitative analysis on each target protein.
본 명세서에서 사용되는 용어, "시료"는 표적 단백질을 포함하는 시료를 의미할 수 있다. 바람직하게, 분석 시료는 유체 시료일 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액 및 복막액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어 시료는, 본 발명의 단백질 칩의 이용 목적에 따라 사용자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. As used herein, the term "sample" may mean a sample containing a target protein. Preferably, the analysis sample can be a fluid sample. For example, cell lysate, whole blood, plasma, serum, saliva, ocular fluid, cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, ascites fluid, synovial fluid, and peritoneal fluid, but are not limited thereto. For example, the sample can be easily selected by the user according to the purpose of use of the protein chip of the present invention.
선택적으로, 시료는, 그 종류에 따라 본 발명의 단백질 칩에 처리되기 전에 용해 (lysis) 될 수도 있다. Optionally, the sample may be lysed prior to being processed on the protein chip of the present invention, depending on its type.
이하에서는, 도 1a 내지 1i를 참조하여, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 단백질 칩에 대하여 구체적으로 설명한다. Hereinafter, a protein chip according to various embodiments of the present invention will be described in detail with reference to FIGS. 1A to 1I.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩의 개략적인 평면도이다. 1A is a schematic plan view of a protein chip according to an embodiment of the present invention.
도 1a를 참조하면, 단백질 칩 (100) 은 복수개의 검출부 (110), 및 바코드부 (120) 로 구성될 수 있다. 이때, 검출부 (110) 는 복수의 서브 검출부 (112) 를 포함할 수 있다. 나아가, 서브 검출부 (112) 는 복수의 정량 분석 유닛 (112) 를 포함할 수 있다. 한편, 단백질 칩 (100) 은, 복수로 존재하는 검출부 (110) 각각에 대하여 상이한 표적 단백질을 검출하도록 구성할 수 있어, 사용자는 하나의 단백질 칩 (100) 을 이용하여 복수의 표적 단백질의 검출 및 정량 분석을 수행할 수 있다. 한편, 사용자는 바코드부 (120) 를 통해 각각의 단백질 칩 (100) 에 대한 정보를 확인할 수 있다. 예를 들어, 분석하고자 하는 시료의 종류가 많을 경우, 사용자는 바코드부 (120) 를 통해 단백질 칩 (100) 의 종류를 분류할 수 있다. Referring to FIG. 1A, the protein chip 100 may include a plurality of detection units 110 and a barcode unit 120. In this case, the detection unit 110 may include a plurality of sub-detection units 112. Furthermore, the sub-detection unit 112 may include a plurality of quantitative analysis units 112. Meanwhile, the protein chip 100 may be configured to detect different target proteins for each of the plurality of detection units 110, so that a user can detect a plurality of target proteins using one protein chip 100 and Quantitative analysis can be performed. Meanwhile, the user can check information on each protein chip 100 through the barcode unit 120. For example, when there are many types of samples to be analyzed, the user may classify the type of the protein chip 100 through the barcode unit 120.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩의 검출부, 서브 검출부 및 정량 분석 유닛을 예시적으로 도시한 것이다.1B is an exemplary view showing a detection unit, a sub-detection unit, and a quantitative analysis unit of a protein chip according to an embodiment of the present invention.
도 1b를 참조하면, 전술한 바와 같이 하나의 검출부 (110) 는 복수의 서브 검출부 (112) 를 포함할 수 있다. 이때, 서브 검출부 (112) 는, 단백질 칩 (100) 을 이루는 기판에 금속이 증착됨으로써 형성된, 금속 스팟의 밀도가 각각 상이한 복수의 정량 분석 유닛 (112 (a), 112 (b), 112 (c), 112 (d), 112 (e), 112 (f), 112 (g) 및 112 (h)) 로 구성될 수 있다. Referring to FIG. 1B, as described above, one detection unit 110 may include a plurality of sub-detection units 112. In this case, the sub-detecting unit 112 is formed by depositing metal on the substrate constituting the protein chip 100, and a plurality of quantitative analysis units 112 (a), 112 (b), and 112 (c) having different metal spot densities, respectively. ), 112 (d), 112 (e), 112 (f), 112 (g) and 112 (h)).
이때, 복수개의 정량 분석 유닛 (112 (a), 112 (b), 112 (c), 112 (d), 112 (e), 112 (f), 112 (g) 및 112 (h)) 은 하나의 서브 검출부 (112) 내에서, 일련으로 배치될 수 있고 (예를 들어, 112 (a), 112 (b), 112 (c) 및 112 (d), 또는 112 (e), 112 (f), 112 (g) 및 112 (h) 의 순서로 배치), 일련으로 배치된 복수개의 정량 분석 유닛 (예를 들어, 112 (a), 112 (b), 112 (c) 및 112 (d), 또는 112 (e), 112 (f), 112 (g) 및 112 (h)) 은 금속 스팟의 밀도가 점진적으로 증가할 수 있다.At this time, a plurality of quantitative analysis units 112 (a), 112 (b), 112 (c), 112 (d), 112 (e), 112 (f), 112 (g) and 112 (h)) are one Within the sub-detector 112, may be arranged in series (e.g., 112 (a), 112 (b), 112 (c) and 112 (d), or 112 (e), 112 (f) , 112 (g) and 112 (h)), a plurality of quantitative analysis units arranged in series (e.g., 112 (a), 112 (b), 112 (c) and 112 (d), Or 112 (e), 112 (f), 112 (g) and 112 (h)) may increase the density of metal spots gradually.
이때, 금속 스팟 상에는 표적 단백질에 따른 바이오 리셉터가 부착될 수 있다. 즉, 금속 스팟의 밀도가 점진적으로 증가함에 따라, 복수의 정량 분석 유닛 (112 (a), 112 (b), 112 (c), 112 (d), 112 (e), 112 (f), 112 (g) 및 112 (h)) 은, 바이오 리셉터의 농도 또한 점진적으로 증가할 수 있다. 이에, 복수의 정량 분석 유닛 (112 (a), 112 (b), 112 (c), 112 (d), 112 (e), 112 (f), 112 (g) 및 112 (h)) 에서 바이오 리셉터와 표적 단백질의 반응에 따른 신호를 측정함으로써, 표적 단백질에 대한 정량 분석이 이루어질 수 있다.  At this time, a bioreceptor according to the target protein may be attached on the metal spot. That is, as the density of metal spots gradually increases, a plurality of quantitative analysis units 112 (a), 112 (b), 112 (c), 112 (d), 112 (e), 112 (f), 112 (g) and 112 (h)), the concentration of the bioreceptor can also be gradually increased. Thus, in a plurality of quantitative analysis units 112 (a), 112 (b), 112 (c), 112 (d), 112 (e), 112 (f), 112 (g) and 112 (h)) bio Quantitative analysis of the target protein may be performed by measuring a signal according to the reaction between the receptor and the target protein.
보다 구체적으로, 바이오 리셉터의 농도의 점진적 증가에 따라, 바이오 리셉터와 표적 단백질의 반응에 따른 신호는 정비례로 증가할 수 있다. 즉, 표적 단백질은 그 종류에 따라, 바이오 리셉터의 농도에 따른 각각 고유의 결합량 (고유의 기울기 값) 을 가질 수 있다. 따라서, 사용자는 이러한 표적 단백질의 기울기 값을 역으로 이용하여 표적 단백질의 농도를 추정할 수 있음에 따라, 표적 단백질에 대한 정량 분석이 가능할 수 있다. More specifically, as the concentration of the bioreceptor gradually increases, the signal according to the reaction between the bioreceptor and the target protein may increase in direct proportion. That is, the target protein may have a unique binding amount (unique slope value) according to the concentration of the bioreceptor depending on its type. Therefore, as the user can estimate the concentration of the target protein by using the slope value of the target protein in reverse, quantitative analysis of the target protein may be possible.
이러한, 고유한 기울기 값을 이용한 정량 분석 방법은, 장비 또는 기타 환경적 요인에 의한 신호의 강화 혹은 감소에 따른 분석의 오차를 줄일 수 있다.The quantitative analysis method using the unique slope value can reduce an error in analysis due to enhancement or reduction of a signal due to equipment or other environmental factors.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩의 서브 검출부 내에서 금속 스팟의 밀도에 따라 점진적으로 배치되는 정량 분석 유닛을 예시적으로 도시한 것이다.1C exemplarily shows a quantitative analysis unit that is gradually disposed according to the density of a metal spot in a sub-detection unit of a protein chip according to an embodiment of the present invention.
도 1c의 (a), (b) 및 (c)를 참조하면, 금속 스팟 (114 (a)) 의 밀도가 20 %인 정량 분석 유닛 (112 (a)), 금속 스팟 (114 (b)) 의 밀도가 50 %인 정량 분석 유닛 (112 (d)) 및 금속 스팟 (114 (c)) 의 밀도가 90 %인 정량 분석 유닛 (112 (h)) 이 도시된다. Referring to (a), (b), and (c) of FIG. 1C, the quantitative analysis unit 112 (a), the density of the metal spot 114 (a) is 20%, the metal spot 114 (b) Quantitative analysis unit 112 (d) with a density of 50% and quantitative analysis unit 112 (h) with a density of metal spot 114 (c) of 90% are shown.
보다 구체적으로, 정량 분석 유닛들 (112 (a), 112 (d) 및 112 (h)) 은, 동일한 면적에 대하여 금속 스팟 (114 (a), 114 (b) 및 114 (c)) 이 상이한 개수로 배치될 수 있다. 이에, 정량 분석 유닛들 (112 (a), 112 (d) 및 112 (h)) 은 금속 스팟 (114 (a), 114 (b) 및 114 (c)) 의 밀도가 점진적으로 증가되도록 서브 검출부 (112) 내에서 구성될 수 있다. 예를 들어, 도 1d를 함께 참조하면, 기판 상에 금속 스팟의 밀도를 상이하게 배치한 후 측정된 형광 세기의 분석 결과가 나타난다. 보다 구체적으로, 금속 스팟의 밀도에 따른 표적 단백질과의 반응에 따라 형광의 세기가 점진적으로 증가하거나 감소하는 것으로 나타난다. More specifically, the quantitative analysis units 112 (a), 112 (d) and 112 (h) have different metal spots 114 (a), 114 (b) and 114 (c) for the same area. It can be arranged in number. Accordingly, the quantitative analysis units 112 (a), 112 (d), and 112 (h) are sub-detectors such that the density of the metal spots 114 (a), 114 (b), and 114 (c) is gradually increased. It can be configured within 112. For example, referring to FIG. 1D together, an analysis result of the measured fluorescence intensity appears after differently arranging the density of metal spots on the substrate. More specifically, it appears that the intensity of fluorescence gradually increases or decreases depending on the reaction with the target protein according to the density of the metal spot.
결과적으로, 정량 분석 유닛들 (112 (a), 112 (d) 및 112 (h)) 각각은, 동일한 면적에 대하여 전체 금속 스팟들 (114 (a), 114 (b) 및 114 (c)) 이 차지하는 면적이 상이할 수 있다. Consequently, each of the quantitative analysis units 112 (a), 112 (d) and 112 (h), the total metal spots 114 (a), 114 (b) and 114 (c) for the same area) This occupied area may be different.
이때, 금속 스팟들 (114 (a), 114 (b) 및 114 (c)) 에는 표적 단백질과 반응하는 바이오 리셉터가 부착되어 있음에 따라, 정량 분석 유닛들 (112 (a), 112 (d) 및 112 (h)) 의 금속 스팟들 (114 (a), 114 (b) 및 114 (c)) 각각의 밀도는, 바이오 리셉터의 밀도 (또는, 농도) 와 대응할 수 있다. At this time, as the metal spots 114 (a), 114 (b), and 114 (c) are attached with a bioreceptor that reacts with the target protein, quantitative analysis units 112 (a), 112 (d) And the density of each of the metal spots 114 (a), 114 (b) and 114 (c) of 112 (h)) may correspond to the density (or concentration) of the bioreceptor.
이러한 구성에 따라, 바이오 리셉터의 밀도 (금속 스팟의 밀도 또는 금속 스팟의 면적) 에 대한 표적 단백질 및 바이오 리셉터의 상호 작용에 따른 신호를 분석함으로써, 표적 단백질에 대한 정밀도 및 민감도 높은 정량 분석이 가능할 수 있다. 이에, 사용자는, 복수의 검출부 (110) 중 하나의 검출부 (110) 의 이용 및 1 회의 단일 분석만으로도 표적 단백질에 대한 정량 분석을 수행할 수 있다. According to such a configuration, by analyzing the signal according to the interaction of the target protein and the bioreceptor with respect to the density of the bioreceptor (density of the metal spot or the area of the metal spot), quantitative analysis with high precision and sensitivity to the target protein may be possible. have. Accordingly, the user can perform quantitative analysis on the target protein by using only one detection unit 110 among the plurality of detection units 110 and only one single analysis.
한편, 금속 스팟들 (114 (a), 114 (b) 및 114 (c)) 은, 도트 형태로, 정량 분석 유닛 (112 (a), 112 (d) 및 112 (h) 내에서 일정한 간격으로 배치됨에 따라 특정한 패턴 (pattern) 을 형성할 수 있다. 이때, 형성된 금 패턴의 선폭은 10 ㎛일 수도 있다. 그러나, 정량 분석 유닛 내에서 배치되는 금속 스팟의 형태, 및 각 정량 분석 유닛 면적에 따른 금속 스팟의 밀도 설정 방법은 전술한 것에 제한되는 것은 아니다. On the other hand, the metal spots 114 (a), 114 (b) and 114 (c) are, in dot form, at regular intervals within the quantitative analysis units 112 (a), 112 (d) and 112 (h). As it is arranged, a specific pattern may be formed, wherein the line width of the formed gold pattern may be 10 µm, however, depending on the shape of the metal spot disposed in the quantitative analysis unit and the area of each quantitative analysis unit. The method for setting the density of the metal spot is not limited to the above.
도 1e 내지 1g는 본 발명의 다양한에 따른 단백질 칩의 서브 검출부 내에서 금속 스팟의 밀도에 따라 점진적으로 배치되는 정량 분석 유닛을 예시적으로 도시한 것이다.1E to 1G exemplarily illustrate a quantitative analysis unit that is gradually disposed according to the density of a metal spot in a sub-detection unit of a protein chip according to various embodiments of the present invention.
도 1e의 (a), (b) 및 (c)를 참조하면, 금속 스팟 (114' (a)) 의 밀도가 20 %인 정량 분석 유닛 (112 (a)), 금속 스팟 (114' (b)) 의 밀도가 50 %인 정량 분석 유닛 (112 (d)) 및 금속 스팟 (114' (c)) 의 밀도가 90 %인 정량 분석 유닛 (112 (h)) 이 도시된다. Referring to (a), (b) and (c) of FIG. 1E, the quantitative analysis unit 112 (a) having a density of the metal spot 114 '(a) 20%, the metal spot 114' (b) )) A quantitative analysis unit 112 (d) with a density of 50% and a quantitative analysis unit 112 (h) with a density of metal spot 114 '(c) of 90% is shown.
이때, 직사각형의 막대 형태의 금속 스팟 (114' (a), 114' (b) 및 114' (c)) 은 정량 분석 유닛들 (112 (a), 112 (d) 및 112 (h)) 에 따라 상이한 개수로 배치될 수 있다. 이에, 정량 분석 유닛들 (112 (a), 112 (d) 및 112 (h)) 각각은, 동일한 면적에 대하여 전체 금속 스팟들 (114' (a), 114' (b) 및 114' (c)) 이 차지하는 면적이 상이함에 따라, 각각 상이한 밀도를 가질 수 있다. At this time, the metal spots 114 '(a), 114' (b), and 114 '(c) in the form of rectangular rods are attached to the quantitative analysis units 112 (a), 112 (d) and 112 (h). Accordingly, it can be arranged in different numbers. Thus, each of the quantitative analysis units 112 (a), 112 (d) and 112 (h), the total metal spots 114 '(a), 114' (b) and 114 '(c) )) As the area occupied by these may differ, each may have a different density.
도 1f의 (a), (b) 및 (c)를 참조하면, 금속 스팟 (114'' (a)) 의 밀도가 20 %인 정량 분석 유닛 (112 (a)), 금속 스팟 (114'' (b)) 의 밀도가 50 %인 정량 분석 유닛 (112 (d)) 및 금속 스팟 (114'' (c) 의 밀도가 90 %인 정량 분석 유닛 (112 (h)) 이 도시된다. Referring to (a), (b), and (c) of FIG. 1F, a quantitative analysis unit 112 (a) having a density of 20% of the metal spot 114 '' (a), and a metal spot 114 '' Quantitative analysis units 112 (d) with a density of (b)) of 50% and quantitative analysis units 112 (h) with a density of metal spots 114 '' (c) of 90% are shown.
이때, 정사각형 형태의 금속 스팟들 (114'' (a), 114'' (b) 및 114'' (c)) 은 정량 분석 유닛들 (112 (a), 112 (d) 및 112 (h)) 에 따라 상이한 면적을 갖도록 배치될 수 있다. 이에, 정량 분석 유닛들 (112 (a), 112 (d) 및 112 (h)) 각각은, 동일한 면적에 대하여 전체 금속 스팟들 (114'' (a), 114'' (b) 및 114'' (c)) 이 차지하는 면적이 상이함에 따라, 각각 상이한 밀도를 가질 수 있다. At this time, the square-shaped metal spots 114 '' (a), 114 '' (b) and 114 '' (c)) are quantitative analysis units 112 (a), 112 (d) and 112 (h). ) May have a different area. Thus, each of the quantitative analysis units 112 (a), 112 (d) and 112 (h), the total metal spots 114 '' (a), 114 '' (b) and 114 'for the same area As the area occupied by '(c)) is different, each may have a different density.
도 1g의 (a), (b) 및 (c)를 참조하면, 금속 스팟 (114''' (a)) 의 밀도가 20 %인 정량 분석 유닛 (112 (a)), 금속 스팟 (114''' (b)) 의 밀도가 50 %인 정량 분석 유닛 (112 (d)) 및 금속 스팟 (114''' (c)) 의 밀도가 90 %인 정량 분석 유닛 (112 (h)) 이 도시된다. Referring to (a), (b) and (c) of FIG. 1G, the quantitative analysis unit 112 (a) having a density of the metal spot 114 '' '(a) is 20%, the metal spot 114' '' Quantitative analysis unit 112 (d) with a density of (b)) of 50% and quantitative analysis unit 112 (h) with a density of metal spot 114 '' '(c) of 90% is shown. do.
이때, 금속 스팟들 (114''' (a), 114''' (b) 및 114''' (c)) 은 하나의 정량 분석 유닛 (112 (a), 112 (d), 또는 112 (h)) 내에서 복수의 형태를 가질 수 있다. 나아가, 금속 스팟 (114''' (a), 114''' (b) 및 114''' (c)) 은 정량 분석 유닛들 (112 (a), 112 (d) 및 112 (h)) 에 따라 상이한 면적을 갖도록 배치될 수 있다. 이에, 정량 분석 유닛들 (112 (a), 112 (d) 및 112 (h)) 각각은, 동일한 면적에 대하여 전체 금속 스팟들 (114''' (a), 114''' (b) 및 114''' (c)) 이 차지하는 면적이 상이함에 따라, 각각 상이한 밀도를 가질 수 있다. At this time, the metal spots 114 '' '(a), 114' '' (b) and 114 '' '(c)) are one quantitative analysis unit 112 (a), 112 (d), or 112 ( h)). Furthermore, the metal spots 114 '' '(a), 114' '' (b) and 114 '' '(c)) are quantitative analysis units 112 (a), 112 (d) and 112 (h)) It may be arranged to have a different area. Thus, each of the quantitative analysis units 112 (a), 112 (d) and 112 (h), the total metal spots 114 '' '(a), 114' '' (b) and As the areas occupied by 114 '' '(c)) differ, each may have a different density.
도 1h 내지 1j는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩의 정량 분석 유닛에 바이오 리셉터가 고정된 것을 예시적으로 도시한 것이다.1H to 1J illustrate that a bioreceptor is fixed to a quantitative analysis unit of a protein chip according to an embodiment of the present invention.
도 1h의 (a), (b) 및 (c)를 참조하면, 항체와 같은 바이오 리셉터 (118) 는 링커 분자 (116) 를 통해 금속 스팟 (114) 상에 부착될 수 있다. 이때, 링커 분자 (116) 는, 링커 분자 (116) 및 자가 조립 가능한 분자를 포함하는 코팅 용액이 단백질 칩의 정량 분석 유닛 (112 (a), 112 (d) 및 112 (h)) 상에 단일 층으로 코팅됨으로써, 금속 스팟 (114) 표면에 부착될 수 있다. Referring to (a), (b) and (c) of FIG. 1H, a bioreceptor 118, such as an antibody, can be attached onto a metal spot 114 through a linker molecule 116. At this time, the linker molecule 116, the coating solution containing the linker molecule 116 and self-assembleable molecule is a single on the quantitative analysis unit 112 (a), 112 (d) and 112 (h) of the protein chip By being coated with a layer, it can be attached to the metal spot 114 surface.
이러한 단일 분자층 (119) 의 코팅에 의해 바이오 리셉터 (118) 는 바이오칩 상에서 안정적으로 고정될 수 있고, 배향성을 가질 수 있다. The bioreceptor 118 can be stably fixed on the biochip by the coating of the single molecular layer 119, and may have orientation.
보다 구체적으로, 금속 스팟 (114) 이 형성된 단백질 칩 (100) 을 0.1mM HS-PEG-COOH 및 0.9mM HS-PEG-OH이 혼합된 분자 용액과 반응시킬 경우, 단백질 칩 (100) 의 기판은 단일의 분자층 (119) 으로 커버될 수 있고, 금속 스팟 (114) 에는 링커 (116) 가 부착될 수 있다. 이후 추가적인 반응을 통해 표적 단백질에 따른 바이오 리셉터 (118) 가 결합될 수 있다. More specifically, when reacting the protein chip 100 on which the metal spot 114 is formed with a molecular solution in which 0.1 mM HS-PEG-COOH and 0.9 mM HS-PEG-OH are mixed, the substrate of the protein chip 100 is It may be covered with a single molecular layer 119, and a linker 116 may be attached to the metal spot 114. Thereafter, the bioreceptor 118 according to the target protein may be combined through an additional reaction.
한편, 본원 명세서에 개시된 단백질 칩은 전술한 형태에 제한되는 것이 아니다.Meanwhile, the protein chip disclosed in the present specification is not limited to the above-described form.
예를 들어, 도 1i의 (a), (b) 및 (c)를 참조하면, 항체와 같은 바이오 리셉터 (118) 는 금속 스팟 (114) 상에 직접적으로 부착될 수 있다. 이때, 바이오 리셉터 (118) 는 자가 조립 가능한 분자를 포함하는 코팅 용액이 단백질 칩의 정량 분석 유닛 (112 (a), 112 (d) 및 112 (h)) 상에 단일 층으로 코팅됨으로써, 금속 스팟 (114) 표면에 부착될 수도 있다. 이러한 단일 분자층 (119) 의 코팅에 의해 바이오 리셉터 (118) 는 바이오칩 상에서 안정적으로 고정될 수 있고, 배향성을 가질 수 있다. 나아가, 도 1j의 (a), (b) 및 (c)를 참조하면, 바이오 리셉터 (118) 는 금속 스팟 (114) 상에 단일 분자층의 코팅 없이 직접적으로 부착될 수도 있다. For example, referring to (a), (b), and (c) of FIG. 1I, a bioreceptor 118, such as an antibody, can be attached directly onto the metal spot 114. At this time, the bioreceptor 118 is coated with a single layer on a quantitative analysis unit 112 (a), 112 (d), and 112 (h) of the protein chip by coating a coating solution containing self-assembleable molecules, thereby forming a metal spot. (114) may be attached to the surface. The bioreceptor 118 can be stably fixed on the biochip by the coating of the single molecular layer 119, and may have orientation. Furthermore, referring to (a), (b) and (c) of FIG. 1J, the bioreceptor 118 may be directly attached to the metal spot 114 without coating of a single molecular layer.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 단백질 칩의 검출부, 서브 검출부 및 정량 분석 유닛을 예시적으로 도시한 것이다.2 exemplarily shows a detection unit, a sub-detection unit, and a quantitative analysis unit of a protein chip according to another embodiment of the present invention.
도 2를 참조하면, 본 발명의 다른 실시예에 따른 단백질 칩 (200) 은, 복수개의 검출부 (210), 검출부 (210) 를 이루는 복수개의 서브 검출부 (212) 및, 서브 검출부 (210) 를 이루는 복수개의 정량 분석 유닛 (212 (a), 212 (b), 212 (c), 212 (d) 및 212 (e)) 를 포함한다.Referring to FIG. 2, the protein chip 200 according to another embodiment of the present invention comprises a plurality of detection units 210, a plurality of sub-detection units 212 forming the detection unit 210, and a sub-detection unit 210 It includes a plurality of quantitative analysis units 212 (a), 212 (b), 212 (c), 212 (d) and 212 (e).
보다 구체적으로, 검출부 (210) 내에, 금속 스팟의 밀도, 즉 바이오 리셉터의 밀도가 점진적으로 변화하도록 구성된 복수개의 정량 분석 유닛 (212 (a), 212 (b), 212 (c), 212 (d) 및 212 (e)) 이 '┏' 또는 '┛'의 모양으로 배치되어 있다.More specifically, in the detector 210, a plurality of quantitative analysis units 212 (a), 212 (b), 212 (c), 212 (d) configured to gradually change the density of the metal spot, that is, the bioreceptor density. ) And 212 (e)) are arranged in the shape of '┏' or '┛'.
이상에 구조에 따라, 바이오 리셉터의 밀도 (또는 농도) 에 따른 신호를 분석함으로써, 표적 단백질의 정량 분석이 수행될 수 있다. 또한, 각각의 검출부 (210) 에서는 서로 상이한 표적 단백질에 대한 독립적인 정량 분석이 수행될 수도 있다. According to the above structure, by analyzing the signal according to the density (or concentration) of the bioreceptor, quantitative analysis of the target protein can be performed. In addition, independent quantitative analysis of target proteins different from each other may be performed in each detection unit 210.
한편, 단백질 칩에 형성된 검출부의 형태는 이에 제한되는 것이 아니다. Meanwhile, the shape of the detection unit formed on the protein chip is not limited thereto.
*예를 들어, 도 3a 및 3b을 참조하면, 본 발명의 다른 실시예에 따른 단백질 칩 (300) 은 기판에 형성된 하나의 검출부 (310) 를 포함할 수도 있다. 이때, 단백질 칩 (300) 상에 독립적인 검출 영역을 제공하는, 영역 분리 막 (320', 320'') 이 배치됨으로써 복수개의 검출부 (310) 가 형성될 수도 있다. 한편, 영역 분리 막 (320', 320'') 은 단백질 칩 (300) 의 검출부 (310) 상에 탈부착 가능한 형태일 수 있다. * For example, referring to FIGS. 3A and 3B, the protein chip 300 according to another embodiment of the present invention may include one detection unit 310 formed on a substrate. At this time, a plurality of detection units 310 may be formed by arranging region separation membranes 320 ′ and 320 ″, which provide independent detection regions on the protein chip 300. Meanwhile, the region separation membranes 320 ′ and 320 ″ may be in a detachable form on the detection unit 310 of the protein chip 300.
이하에서는, 도 4를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 표적 단백질의 정량 분석 방법의 절차를 구체적으로 설명한다. Hereinafter, with reference to FIG. 4, the procedure of the quantitative analysis method of the target protein according to an embodiment of the present invention will be described in detail.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩을 이용한, 표적 단백질의 정량 분석의 절차를 도시한 것이다.4 shows a procedure of quantitative analysis of a target protein using a protein chip according to an embodiment of the present invention.
도 4를 참조하면, 표적 단백질의 정량 분석 방법은, 먼저, 본 발명의 단백질 칩의 검출부 상에 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 바이오 리셉터를 고정하고 (S410), 표적 단백질을 포함하는 시료를 단백질 칩 상에 처리하고 (S420), 검출된 표적 단백질의 정량 분석을 수행하도록 (S430) 구성된다.Referring to Figure 4, the quantitative analysis method of the target protein, first, to fix the bioreceptor that specifically binds to the target protein on the detection portion of the protein chip of the present invention (S410), the sample protein containing the target protein It is configured to process on a chip (S420) and perform quantitative analysis of the detected target protein (S430).
보다 구체적으로, 본 발명의 특징에 따르면, 바이오 리셉터를 고정하는 단계 (S410) 에서, 복수개의 정량 분석 유닛이 서로 상이한 바이오 리셉터의 밀도를 갖도록, 복수개의 정량 분석 유닛의 금속 스팟 상에 바이오 리셉터가 고정될 수 있다. More specifically, according to a feature of the present invention, in the step of fixing the bioreceptor (S410), the bioreceptor is placed on the metal spots of the plurality of quantitative analysis units such that the plurality of quantitative analysis units have different densities of bioreceptors. Can be fixed.
한편, 본 발명의 다른 특징에 따르면, 복수개의 정량 분석 유닛 각각이 서로 상이한 금속 스팟의 밀도를 갖가질 수 있다. 이에, 상기 바이오 리셉터를 고정하는 단계 (S410) 에서는, 복수개의 정량 분석 유닛이 서로 상이한 바이오 리셉터의 밀도를 갖도록, 복수개의 정량 분석 유닛의 금속 스팟 상에 바이오 리셉터가 고정될 수 있다. Meanwhile, according to another feature of the present invention, each of the plurality of quantitative analysis units may have a different density of metal spots. Thus, in the step of fixing the bioreceptor (S410), the bioreceptor may be fixed on a metal spot of the plurality of quantitative analysis units such that the plurality of quantitative analysis units have different densities of bioreceptors.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 본 발명의 표적 단백질의 정량 분석 방법에서는, 바이오 리셉터를 고정하는 단계 (S410) 이전에 수행되는, 바이오 리셉터와 금속 스팟을 간접적으로 연결해주는 링커를 금속 스팟 상에 배치하는 단계가 더 수행될 수 있다.According to another feature of the present invention, in the method for quantitative analysis of the target protein of the present invention, a linker that indirectly connects the bioreceptor and the metal spot is performed before the step of fixing the bioreceptor (S410) on the metal spot. The step of placing may be further performed.
이에, 바이오 리셉터를 고정하는 단계 (S410) 에서, 링커를 통해 복수개의 정량 분석 유닛에 배치된 금속 스팟 상에 바이오 리셉터가 부착될 수 있다. Thus, in the step (S410) of fixing the bioreceptor, the bioreceptor may be attached to a metal spot disposed in a plurality of quantitative analysis units through a linker.
한편, 본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 링커는, 단백질 칩의 기판 위에 금속 스팟을 커버하고, 금속 스팟 상에 링커를 부착시키기도록, 구성된 코팅 용액이 코팅됨으로써, 단백질 칩의 복수개의 정량 분석 유닛 상에 부착될 수 있다.Meanwhile, according to another feature of the present invention, the linker covers a metal spot on the substrate of the protein chip, and a coating solution configured to coat the linker on the metal spot is coated, thereby allowing a plurality of quantitative analysis units of the protein chip It can be attached to.
이때, 바이오 리셉터를 고정하는 단계 (S410) 에서 이용되는 바이오 리셉터는 형광 표지된 리셉터일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. At this time, the bioreceptor used in the step (S410) of fixing the bioreceptor may be a fluorescently labeled receptor, but is not limited thereto.
다음으로, 표적 단백질을 포함하는 시료를 단백질 정량 분석용 칩 상에 처리하는 단계 (S420) 에서는, 표적 단백질과 금속 스팟 상에 부착된 바이오 리셉터의 상호 작용이 일어날 수 있다.Next, in the step (S420) of processing a sample containing the target protein on a protein quantitative analysis chip, interaction of the target protein and the bioreceptor attached on the metal spot may occur.
예를 들어, 표적 단백질을 포함하는 시료를 단백질 정량 분석용 칩 상에 처리하는 단계 (S420) 에서는 형광 표지된 바이오 리셉터 및 표적 단백질의 면역 반응이 일어나고, 이러한 면역 반응에 의해 형광 신호가 발생할 수 있다. 또는, 표적 단백질을 포함하는 시료를 단백질 정량 분석용 칩 상에 처리하는 단계 (S420) 에서는 바이오 리셉터 및 미리 형광 표지된 표적 단백질의 면역 반응이 일어남에 따라 형광 신호가 발생할 수 있다.For example, in a step (S420) of processing a sample containing a target protein on a protein quantitative analysis chip, an immune response of the fluorescently labeled bioreceptor and the target protein occurs, and a fluorescent signal may be generated by the immune response. . Alternatively, in the step (S420) of processing a sample containing the target protein on a protein quantitative analysis chip, a fluorescence signal may be generated as the immune response of the bioreceptor and the pre-fluorescence-labeled target protein occurs.
따라서, 표적 단백질의 정량 분석을 수행하는 단계 (S430) 에서는, 복수개의 정량 분석 유닛으로 구성된 서브 유닛에 대하여 형광의 세기를 측정함으로써, 표적 단백질의 정량 분석이 수행될 수 있다.Therefore, in the step (S430) of performing a quantitative analysis of the target protein, the quantitative analysis of the target protein may be performed by measuring the intensity of fluorescence with respect to a subunit composed of a plurality of quantitative analysis units.
본 발명의 특징에 따르면, 표적 단백질의 정량 분석을 수행하는 단계 (S430) 에서는, 복수개의 정량 분석 유닛에 대하여, 바이오 리셉터의 밀도에 따른 표적 단백질과의 결합량을 측정함으로써, 표적 단백질의 정량 분석이 수행될 수 있다.According to a feature of the present invention, in the step (S430) of performing a quantitative analysis of the target protein, the quantitative analysis of the target protein is performed by measuring the amount of binding to the target protein according to the density of the bioreceptor for a plurality of quantitative analysis units This can be done.
보다 구체적으로, 바이오 리셉터의 농도의 점진적 증가에 따라, 바이오 리셉터와 표적 단백질의 반응에 따른 신호는 정비례로 증가할 수 있다. 즉, 표적 단백질은 그 종류에 따라, 바이오 리셉터의 농도에 따른 각각 고유의 결합량 (고유의 기울기 값) 을 가질 수 있다. 따라서, 사용자는 이러한 표적 단백질의 기울기 값을 역으로 이용하여 표적 단백질의 농도를 추정할 수 있음에 따라, 표적 단백질에 대한 정량 분석이 가능할 수 있다. More specifically, as the concentration of the bioreceptor gradually increases, the signal according to the reaction between the bioreceptor and the target protein may increase in direct proportion. That is, the target protein may have a unique binding amount (unique slope value) according to the concentration of the bioreceptor depending on its type. Therefore, as the user can estimate the concentration of the target protein by using the slope value of the target protein in reverse, quantitative analysis of the target protein may be possible.
이러한, 고유한 기울기 값을 이용한 본 발명의 다양한 실시예에 따른 표적 단백질의 정량 분석 방법은, 장비 또는 기타 환경적 요인에 의한 신호의 강화 혹은 감소에 따른 분석의 오차를 줄일 수 있다.The method for quantitative analysis of a target protein according to various embodiments of the present invention using such a unique slope value can reduce an error in analysis due to enhancement or reduction of a signal due to equipment or other environmental factors.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 표적 단백질의 정량 분석을 수행하는 단계 (S430) 에서는, SPR 이미징 (imaging) 분석, SELDI (surface-enhanced laser desorption-ionization) 질량 분석, AFM (Atomic Force Microscope) 분석 및 MALDI-TOF (Matrixassistedlaser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석으로 이루어진 그룹 중 선택된 적어도 하나의 방법을 이용하여 표적 단백질의 정량 분석이 수행될 수 있다.According to another aspect of the invention, in the step (S430) of performing a quantitative analysis of the target protein, SPR imaging (imaging) analysis, surface-enhanced laser desorption-ionization (SELDI) mass spectrometry, atomic force microscope (AFM) analysis and Quantitative analysis of the target protein may be performed using at least one method selected from the group consisting of MALDI-TOF (Matrixassistedlaser desorption / ionization time-of-flight) mass spectrometry.
이하에서는, 5a 내지 5c를 참조하여, 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는 단백질 칩에 대한 평가 결과를 설명한다.Hereinafter, with reference to 5a to 5c, the evaluation results for the protein chips used in various embodiments of the present invention will be described.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩에 대한, 하나의 금속 스팟 표면에 따른 신호의 강도의 분석 결과를 도시한 것이다. Figure 5a shows the results of the analysis of the intensity of the signal along the surface of one metal spot for the protein chip according to an embodiment of the present invention.
보다 구체적으로, 본 실험에서는 금속 스팟의 증착에 의해 금속 패턴이 형성된 단백질 칩상에 SAM 코팅함으로써 링커를 부착하고, 이후 표적 단백질에 대한 형광 표지된 항체를 고정한다. 그 다음, 스캐너를 이용하여 선폭의 크기에 따른 형광 신호를 측정한다.More specifically, in this experiment, a linker is attached by SAM coating on a protein chip on which a metal pattern is formed by deposition of a metal spot, and then a fluorescently labeled antibody for the target protein is fixed. Then, a fluorescence signal according to the size of the line width is measured using a scanner.
도 5a의 (a) 및 (b)를 참조하면, 단백질 칩 내의 금속 스팟들 사이의 간격, 즉 바이오 리셉터의 고정 간격이 10 ㎛ 이하로 설정될 경우, 측정된 형광 신호가 균일하게 나타난다. 이는, 항체를 촘촘하게 고정화할 때 단백질 칩 내부 표면의 신호가 균일하게 나타나는 것을 의미할 수 있다.Referring to (a) and (b) of FIG. 5A, when the interval between metal spots in the protein chip, that is, the fixed interval of the bioreceptor is set to 10 μm or less, the measured fluorescence signal appears uniformly. This may mean that the signal on the inner surface of the protein chip appears uniformly when the antibody is tightly immobilized.
이와 대조적으로, 항체간 배치 간격이 넓을 수록 단백질 칩 내부 표면의 신호가 균일하지 않고 낮으며 주변 경계면의 신호가 높게 나타난다. In contrast, the larger the spacing between the antibodies, the less the signal on the inner surface of the protein chip is non-uniform and the higher the signal on the peripheral interface.
이러한 결과에 따라, 본 발명의 단백질 칩에 형성된 금 패턴의 선폭, 즉 금속 스팟 간 간격 (바이오 리셉터간 간격) 은 7 내지 12 ㎛로 설정될 수 있다. 이에, 본 발명의 단백질 칩 내의 금속 스팟들 사이의 신호의 표준편차가 2 % 이하이고, 단백질 칩 사이의 신포의 표준 편차는 5 % 이하일 수 있음에 따라, 바이오 리셉터인 항체가 안정적이고 균일하게 고정되어, 단백질 칩 내 고정화 효율이 증가될 수 있다. According to these results, the line width of the gold pattern formed on the protein chip of the present invention, that is, the spacing between metal spots (the spacing between bio-receptors) may be set to 7 to 12 μm. Thus, as the standard deviation of the signal between the metal spots in the protein chip of the present invention is 2% or less, and the standard deviation of the neoplasm between the protein chips may be 5% or less, the bioreceptor antibody is stably and uniformly fixed. As a result, the immobilization efficiency in the protein chip can be increased.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩에 대한, 금속스팟 크기에 따른 신호 증폭 효과와 항체의 밀도에 따른 신호의 강도의 분석 결과를 도시한 것이다. Figure 5b shows the results of analyzing the signal intensity according to the density of the antibody and the signal amplification effect according to the metal spot size, for the protein chip according to an embodiment of the present invention.
도 5b의 (a) 및 (b)를 참조하면, 동일한 영역에서 금속 스팟이 차지하는 면적이 동일한 조건, 즉 금속 스팟이 자치하는 면적율이 동일하다면, 금속 스팟의 크기가 작을수록 금속 스팟에 결합된 형광표지된 항체에 의해 검출되는 형광 신호가 증가되는 것과 금속 스팟이 차지하는 면적률, 즉 금속 스팟 상에 고정된 바이오 리셉터의 밀도 (농도) 가 증가함에 따라, 표적 단백질과의 반응에 따른 형광 신호의 강도가 정비례하게 증가하는 것으로 나타난다.Referring to (a) and (b) of FIG. 5B, if the area occupied by the metal spot in the same area is the same condition, that is, the area ratio of the metal spot is the same, the smaller the size of the metal spot, the more the fluorescence bound to the metal spot As the fluorescent signal detected by the labeled antibody increases and the area ratio occupied by the metal spot increases, that is, the density (concentration) of the bioreceptor fixed on the metal spot increases, the intensity of the fluorescent signal according to the reaction with the target protein Appears to increase in direct proportion.
이러한 결과는, 표적 단백질이 그 종류에 따라, 바이오 리셉터의 농도에 따른 각각 고유의 결합량 (고유의 기울기 값) 을 가질 수 있음을 의미할 수 있다. 따라서, 사용자는 이러한 표적 단백질의 기울기 값을 역으로 이용하여 표적 단백질의 농도를 추정할 수 있음에 따라, 표적 단백질에 대한 정량 분석이 가능할 수 있다. This result may mean that the target protein may have a unique binding amount (unique slope value) according to the concentration of the bioreceptor, depending on its type. Therefore, as the user can estimate the concentration of the target protein by using the slope value of the target protein in reverse, quantitative analysis of the target protein may be possible.
이러한, 고유한 기울기 값을 이용한 정량 분석 방법은, 장비 또는 기타 환경적 요인에 의한 신호의 강화 혹은 감소에 따른 분석의 오차를 줄일 수 있다.The quantitative analysis method using the unique slope value can reduce an error in analysis due to enhancement or reduction of a signal due to equipment or other environmental factors.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 칩에 대한, 항원의 농도에 따른 회귀 직선의 기울기 값의 분석 결과를 도시한 것이다.Figure 5c shows the results of the analysis of the slope value of the regression line according to the concentration of the antigen for the protein chip according to an embodiment of the present invention.
도 5c의 (a) 및 (b)를 참조하면, 동일한 영역에서 금속 스팟이 차지하는 면적이 동일한 조건, 즉 금속 스팟이 자치하는 면적율이 동일하다면, 금속 스팟의 크기가 작을수록 금속 스팟에 결합된 형광표지된 항체에 의해 검출되는 형광 신호가 증가되는 것과 금속 스팟이 차지하는 면적, 즉 금속 스팟 상에 고정된 바이오 리셉터의 밀도 (농도) 가 증가함에 따라, 표적 단백질과의 반응에 따른 형광 신호의 강도가 정비례하게 증가하는 것으로 나타난다.Referring to (a) and (b) of Figure 5c, if the area occupied by the metal spot in the same area is the same condition, that is, the area ratio of the autonomous metal spot is the same, the smaller the size of the metal spot, the fluorescence bound to the metal spot As the fluorescent signal detected by the labeled antibody increases and the area occupied by the metal spot, i.e., the density (concentration) of the bioreceptor fixed on the metal spot increases, the intensity of the fluorescent signal according to the reaction with the target protein increases. It appears to increase in direct proportion.
보다 구체적으로, 1 μM의 DNA-Cy5는, 바이오 리셉터의 밀도의 증가에 따라 측정된 형광 신호에 의해 형성된 기울기 값이 약 179.3으로 나타난다. 나아가, 10 nM의 DNA-Cy5는, 바이오 리셉터의 밀도의 증가에 따라 측정된 형광 신호에 의해 형성된 기울기 값이 약 31.603으로 나타난다.More specifically, 1 μM of DNA-Cy5 shows a slope value of about 179.3 formed by the fluorescent signal measured according to an increase in the density of the bioreceptor. Furthermore, DNA-Cy5 of 10 nM shows a slope value of about 31.603 formed by the fluorescent signal measured according to an increase in the density of the bioreceptor.
즉, 표적 단백질은, 이들의 농도 및 이들의 종류에 따라 고유한 기울기 값을 갖는 것으로 나타난다. That is, the target proteins appear to have a unique slope value depending on their concentration and their kind.
따라서, 사용자는 이러한 표적 단백질의 기울기 값 (예를 들어, 179.3 또는, 31.603) 을 역으로 이용하여 표적 단백질의 농도를 추정할 수 있음에 따라, 표적 단백질에 대한 정량 분석이 가능할 수 있다. Therefore, as the user can estimate the concentration of the target protein using the inclination value of the target protein (eg, 179.3 or 31.603) in reverse, quantitative analysis of the target protein may be possible.
이상의 결과로, 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는 단백질 칩은 적은 양의 시료로부터 극미량의 표적 단백질을 민감도 높게 검출하고, 이들 표적 단백질에 대한 민감도 및 정밀도 높은 정량 분석을 수행할 수 있다. 특히, 본 발명은 단백질 칩 및 바이오 리셉터를 포함하는 키트를 제공함으로써, 사용자는 보다 다양한 단백질에 대한 효율적인 정량 분석을 수행할 수 있다. As a result of the above, the protein chip used in various embodiments of the present invention can detect a very small amount of target proteins from a small amount of samples with high sensitivity, and perform quantitative analysis with high sensitivity and precision for these target proteins. In particular, the present invention provides a kit including a protein chip and a bioreceptor, so that a user can perform efficient quantitative analysis on a variety of proteins.
특히, 본 발명은, 단백질 정량 분석 칩 상의 검출부 내에, 금속 스팟의 밀도가 점진적으로 증가하도록 구성된 복수개의 서브 검출부를 배치함으로써, 종래의 단백질 칩보다 민감도 및 정밀도가 향상된 정량 분석 결과를 제공할 수 있는 효과가 있다. In particular, the present invention, by placing a plurality of sub-detectors configured to gradually increase the density of metal spots in the detection section on the protein quantitative analysis chip, it is possible to provide a quantitative analysis result with improved sensitivity and precision than the conventional protein chip It works.
또한, 본 발명은, 특정한 단백질을 검출하기 위한 바이오 리셉터가 고정된, 종래의 단백질 칩이 갖는 한계점을 극복할 수 있는 효과가 있다.In addition, the present invention has an effect capable of overcoming the limitations of a conventional protein chip, in which a bioreceptor for detecting a specific protein is fixed.
나아가, 본 발명은, 특정한 표적 단백질에 대한 바이오 리셉터를 고정시킬 경우, 상이한 해리 인자를 갖는 바이오 리셉터, 예를 들어 항체를 고정함에 따라, 표적 단백질 및 항체의 면역 반응에 따라 발생하는 신호의 다이나믹 레인지 (dynamic range) 를 확대할 수 있다. 이에, 본 발명은, 생물학적 실험에서 요구되는 반복 실험의 횟수를 줄일 수 있고, 항체의 밀도 대비 항원 (표적 단백질) 의 반응 신호를 기초로 표적 단백질의 농도를 추적할 수 있는 효과가 있다.Furthermore, in the present invention, when immobilizing a bioreceptor for a specific target protein, a bioreceptor having different dissociation factors, for example, immobilizing an antibody, dynamic range of signals generated according to an immune response of the target protein and the antibody (dynamic range) can be enlarged. Thus, the present invention has the effect of reducing the number of repetition experiments required in a biological experiment, and tracking the concentration of the target protein based on the reaction signal of the antigen (target protein) against the density of the antibody.
따라서, 본 발명은, 종래의 단백질 칩을 이용한 단백질 정량 분석 방법에서 표준 단백질 신호값이 수반되는 번거로움을 해결하고, 종래의 방법보다 용이하게 정량 분석을 수행할 수 있는 효과가 있다.Therefore, the present invention has the effect of solving the hassle of accommodating standard protein signal values in a protein quantitative analysis method using a conventional protein chip, and performing quantitative analysis more easily than a conventional method.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.The embodiments of the present invention have been described in more detail with reference to the accompanying drawings, but the present invention is not necessarily limited to these embodiments, and may be variously modified within the scope of the technical idea of the present invention. Therefore, the embodiments disclosed in the present invention are not intended to limit the technical spirit of the present invention, but to explain, and the scope of the technical spirit of the present invention is not limited by these embodiments. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive. The scope of protection of the present invention should be interpreted by the claims below, and all technical spirits within the scope equivalent thereto should be interpreted as being included in the scope of the present invention.
[부호의 설명][Description of codes]
100, 200, 300: 단백질 칩100, 200, 300: protein chips
110, 210, 310: 검출부110, 210, 310: detection unit
112, 212, 312: 서브 검출부112, 212, 312: sub detection unit
112 (a), 112 (b), 112 (c), 112 (d), 112 (e), 112 (f), 112 (g), 112 (h), 112 (a), 212 (a), 212 (b), 212 (c), 212 (d) 및 212 (e): 정량 분석 유닛112 (a), 112 (b), 112 (c), 112 (d), 112 (e), 112 (f), 112 (g), 112 (h), 112 (a), 212 (a), 212 (b), 212 (c), 212 (d) and 212 (e): Quantitative Analysis Units
120: 바코드부120: barcode part
114, 114 (a), 114 (b), 114 (c), 114' (a), 114' (b), 114' (c), 114'' (a), 114'' (b), 114'' (c), 114''' (a), 114''' (b) 및 114''' (c): 금속 스팟114, 114 (a), 114 (b), 114 (c), 114 '(a), 114' (b), 114 '(c), 114' '(a), 114' '(b), 114 '' (c), 114 '' '(a), 114' '' (b) and 114 '' '(c): metal spots
116: 링커 분자116: linker molecule
118: 바이오 리셉터118: bioreceptor
119: 분자층119: molecular layer
320: 영역 분리막320: area separator
[과제정보][Task information]
과제 고유번호: S2230578Assignment ID: S2230578
부처명: 중소벤처기업부Department name: Small and Medium Venture Business Department
연구관리 전문기관: 중소기업기술정보진흥원Research Management Specialized Agency: Small and Medium Business Administration
연구사업명: 글로벌시장형 창업 R&D 사업Research Project Name: Global market-type start-up R & D business
연구과제명: 압타머 바인딩 및 용량소자센서 기반 심근경색 조기 진단기기Project Title: Early diagnosis of myocardial infarction based on aptamer binding and capacitive sensor
주관기관: 주식회사 스몰머신즈Organized by: Small Machines Co., Ltd.
연구기간: 2014.07.01~ 2016.06.30Research period: 2014.07.01 ~ 2016.06.30
과제 고유번호: 2018-0-01046Assignment ID: 2018-0-01046
부처명: 과학기술정보통신부Department name: Ministry of Science and ICT
연구관리 전문기관: 정보통신기술진흥센터Research management agency: Information and Communication Technology Promotion Center
연구사업명: ICT유망기술개발지원사업Research Project Name: ICT Promising Technology Development Support Project
연구과제명: 디지털 줄기세포 이미지 분석시스템 개발Project Title: Development of digital stem cell image analysis system
주관기관: 주식회사 스몰머신즈Organized by: Small Machines Co., Ltd.
연구기간: 2018.07.01~2019.12.31Research Period: 2018.07.01 ~ 2019.12.31

Claims (21)

  1. 기판을 포함하는, 단백질 칩으로서,A protein chip comprising a substrate,
    상기 기판은, The substrate,
    표적 단백질을 검출하도록 구성된 복수개의 서브 검출부를 포함하고, It includes a plurality of sub-detection unit configured to detect the target protein,
    상기 복수개의 서브 검출부 각각은, Each of the plurality of sub-detection units,
    금속 스팟 (spot) 으로 이루어진 복수개의 정량 분석 유닛 (unit) 을 포함하고,It comprises a plurality of quantitative analysis unit (unit) consisting of a metal spot (spot),
    상기 단백질 칩은, The protein chip,
    광학적 분석을 수행함으로써 상기 복수개의 정량 분석 유닛에 검출된 상기 표적 단백질의 정략적 분석이 가능하도록 구성된, 단백질 칩.A protein chip configured to enable quantitative analysis of the target protein detected in the plurality of quantitative analysis units by performing optical analysis.
  2. 제1항에 있어서,According to claim 1,
    상기 복수개의 정량 분석 유닛 각각은,Each of the plurality of quantitative analysis units,
    상기 금속 스팟 및 상기 표적 단백질과 특이적으로 결합하는 바이오 리셉터 (receptor) 를 포함하고,A bioreceptor specifically binding to the metal spot and the target protein,
    서로 상이한 금속 스팟의 밀도를 갖고, Have different metal spot density,
    상기 바이오 리셉터는 상기 금속 스팟 상에 부착되는, 단백질 칩.The bioreceptor is attached to the metal spot, protein chip.
  3. 제2항에 있어서,According to claim 2,
    상기 복수개의 정량 분석 유닛은,The plurality of quantitative analysis units,
    하나의 서브 검출부 내에서 일련으로 배치되고, It is arranged in series within one sub-detection unit,
    일련으로 배치된 상기 복수개의 정량 분석 유닛은, The plurality of quantitative analysis units arranged in series,
    상기 금속 스팟의 밀도가 점진적으로 증가하도록 구성된, 단백질 칩. A protein chip configured to gradually increase the density of the metal spot.
  4. 제2항에 있어서,According to claim 2,
    복수개의 정량 분석 유닛 각각은,Each of the plurality of quantitative analysis units,
    서로 상이한 밀도를 갖도록, 일정한 크기의 도트 (dot) 형태를 갖고 상기 복수개의 분석 유닛 각각에 대하여 상이한 개수로 배치된 금속 스팟을 포함하거나, 또는To have different densities, metal spots having a certain size of dot shape and arranged in different numbers for each of the plurality of analysis units, or
    서로 상이한 밀도를 갖도록, 다각형 형태를 갖고 상기 복수개의 분석 유닛 각각에 대하여 상이한 크기로 배치된 금속 스팟을 포함하는, 단백질 칩.A protein chip comprising polygonal shapes and metal spots arranged in different sizes for each of the plurality of analysis units to have different densities.
  5. 제2항에 있어서,According to claim 2,
    상기 복수개의 정량 분석 유닛은,The plurality of quantitative analysis units,
    상기 금속 스팟 상에 부착되도록 구성된 링커 (linker) 를 더 포함하고,Further comprising a linker (linker) configured to be attached to the metal spot,
    상기 바이오 리셉터는, The bioreceptor,
    상기 링커에 의해 상기 금속 스팟 상에 부착되는, 단백질 칩. A protein chip attached to the metal spot by the linker.
  6. 제5항에 있어서,The method of claim 5,
    상기 단백질 칩은, The protein chip,
    상기 기판 위에 상기 금속 스팟을 커버 (cover) 하고, 상기 금속 스팟 상에 상기 링커를 부착시키기도록 구성된 자가 조립 단분자층 (self-assembled monolayer) 을 더 포함하는, 단백질 칩. A protein chip further comprising a self-assembled monolayer configured to cover the metal spot on the substrate and attach the linker on the metal spot.
  7. 제2항에 있어서,According to claim 2,
    상기 바이오 리셉터 또는, 상기 표적 단백질은,The bioreceptor or the target protein,
    형광 표지된 (fluorescence-labeled), 단백질 칩. Fluorescence-labeled, protein chip.
  8. 제1항에 있어서,According to claim 1,
    상기 금속 스팟은, The metal spot,
    상기 기판 상에 일정한 간격으로 배치되어 패턴을 형성하고,Arranged at regular intervals on the substrate to form a pattern,
    상기 패턴의 선폭은 7 ㎛ 내지 12 ㎛인, 단백질 칩.The line width of the pattern is 7 ㎛ to 12 ㎛, protein chips.
  9. 제8항에 있어서,The method of claim 8,
    상기 금속 스팟은,The metal spot,
    직경이 500 nm 내지 10 ㎛인 도트 형태를 갖고,Dot form having a diameter of 500 nm to 10 μm,
    상기 패턴은 상기 도트 형태의 금속 스팟에 의해 형성된, 단백질 칩. The pattern is formed by the dot-shaped metal spot, protein chip.
  10. 제1항에 있어서,According to claim 1,
    상기 금속 스팟은 Au, Ni, Cu, Zn, Fe, Al, Ti, Pt, Hg, Ag, Pb 및 이들의 합금으로 구성된 그룹 중 적어도 하나의 금속으로 이루어진, 단백질 칩.The metal spot is composed of at least one metal of the group consisting of Au, Ni, Cu, Zn, Fe, Al, Ti, Pt, Hg, Ag, Pb and alloys thereof, protein chip.
  11. 제1항에 있어서,According to claim 1,
    상기 복수개의 서브 검출부는,The plurality of sub-detection units,
    복수개의 검출 부 중 하나의 검출부를 구성하고,Configures one of the plurality of detection units,
    상기 복수개의 검출부 각각은, 서로 상이한 표적 단백질을 검출하도록 구성된, 단백질 칩.Each of the plurality of detection units is configured to detect different target proteins, protein chips.
  12. 제11항에 있어서,The method of claim 11,
    상기 복수개의 서브 검출부는,The plurality of sub-detection units,
    상기 하나의 검출부 내에서 0.3 mm 내지 0.9 mm의 간격으로 배치되는, 단백질 칩.Protein chips, which are arranged at intervals of 0.3 mm to 0.9 mm in the one detection unit.
  13. 제1 항, 제 8 항 내지 12 항 중 어느 한 항에 기재된 단백질 칩의 복수개의 정량 분석 유닛에 배치된 금속 스팟에, 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 바이오 리셉터를 고정하는 단계;Fixing a bioreceptor that specifically binds a target protein to a metal spot disposed in a plurality of quantitative analysis units of the protein chip according to any one of claims 1 to 8 to 12;
    상기 표적 단백질 및 상기 바이오 리셉터가 반응하도록, 상기 표적 단백질을 포함하는 시료를 상기 단백질 정량 분성용 칩 상에 처리하는 단계;Processing a sample containing the target protein on the protein quantification chip so that the target protein and the bioreceptor react;
    상기 복수개의 정량 분석 유닛 내에 검출된 상기 표적 단백질의 정략 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 정량 분석 방법.And performing a quantitative analysis of the target protein detected in the plurality of quantitative analysis units.
  14. 제13항에 있어서,The method of claim 13,
    상기 표적 단백질 또는, 바이오 리셉터는,The target protein, or bioreceptor,
    형광 표지된 것이고,Fluorescently labeled,
    상기 정량 분석을 수행하는 단계는, The step of performing the quantitative analysis,
    상기 복수개의 정량 분석 유닛으로 구성된 서브 유닛에 대하여 상기 형광의 세기를 측정함으로써, 상기 표적 단백질의 정량 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 정량 분석 방법.And performing a quantitative analysis of the target protein by measuring the intensity of the fluorescence with respect to a sub-unit composed of the plurality of quantitative analysis units.
  15. 제13항에 있어서,The method of claim 13,
    상기 복수개의 정량 분석 유닛 각각이 서로 상이한 금속 스팟의 밀도를 갖고,Each of the plurality of quantitative analysis units has a different density of metal spots,
    상기 바이오 리셉터를 고정하는 단계는, Fixing the bio-receptor,
    상기 복수개의 정량 분석 유닛이 서로 상이한 상기 바이오 리셉터의 밀도를 갖도록, 상기 복수개의 정량 분석 유닛의 금속 스팟 상에 상기 바이오 리셉터를 고정하는 단계를 포함하고, And fixing the bioreceptors on metal spots of the plurality of quantitative analysis units so that the plurality of quantitative analysis units have different densities of the bioreceptors,
    상기 정량 분석을 수행하는 단계는,The step of performing the quantitative analysis,
    상기 복수개의 정량 분석 유닛에 대하여, 상기 바이오 리셉터의 밀도에 따른 상기 표적 단백질과의 결합량을 측정함으로써, 상기 표적 단백질의 정량 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 정량 분석 방법.Quantitative analysis method of the target protein, comprising the step of performing a quantitative analysis of the target protein by measuring the amount of binding to the target protein according to the density of the bioreceptor, for the plurality of quantitative analysis units.
  16. 제 15항에 있어서,The method of claim 15,
    상기 정량 분석을 수행하는 단계는,The step of performing the quantitative analysis,
    상기 복수개의 정량 분석 유닛에 대하여, 서로 상이한 밀도를 갖는 상기 바이오 리셉터에 결합하는 상기 표적 단백질의 결합량을 측정하는 단계;Measuring a binding amount of the target protein binding to the bioreceptors having different densities with respect to the plurality of quantitative analysis units;
    상기 결합량을 기초로 상기 표적 단백질 및 상기 바이오 리셉터의 회귀 직선을 형성하는 단계;Forming a regression line of the target protein and the bioreceptor based on the amount of binding;
    상기 상기 회귀 직선에 대한 기울기 값을 산출하는 단계, 및Calculating a slope value for the regression line, and
    상기 기울기 값을 기초로 표적 단백질의 정량 분석을 수행하는 단계를 더 포함하는, 표적 단백질의 정량 분석 방법. Further comprising the step of performing a quantitative analysis of the target protein based on the slope value, the quantitative analysis method of the target protein.
  17. 제13항에 있어서,The method of claim 13,
    상기 정량 분석을 수행하는 단계는, The step of performing the quantitative analysis,
    SPR 이미징 (imaging) 분석, SELDI (surface-enhanced laser desorption-ionization) 질량 분석, AFM (Atomic Force Microscope) 분석 및 MALDI-TOF (Matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석으로 이루어진 그룹 중 선택된 적어도 하나의 방법을 이용하여 상기 표적 단백질의 정량 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 정량 분석 방법.Selected from the group consisting of SPR imaging analysis, surface-enhanced laser desorption-ionization (SELDI) mass spectrometry, atomic force microscope (AFM) analysis, and matrixassisted laser desorption / ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry And performing a quantitative analysis of the target protein using at least one method.
  18. 제13항에 있어서,The method of claim 13,
    상기 표적 단백질의 정량 분석 방법은,The quantitative analysis method of the target protein,
    상기 바이오 리셉터를 고정하는 단계 이전에 수행되는,Is performed prior to the step of fixing the bioreceptor,
    상기 바이오 리셉터와 상기 금속 스팟을 간접적으로 연결해주는 링커를 상기 금속 스팟 상에 배치하는 단계를 더 포함하고,Further comprising the step of placing a linker that indirectly connects the bioreceptor and the metal spot on the metal spot,
    상기 바이오 리셉터를 고정하는 단계는,Fixing the bio-receptor,
    상기 링커를 통해 상기 바이오 리셉터를 상기 복수개의 정량 분석 유닛에 배치된 상기 금속 스팟 상에 고정하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 정량 분석 방법.And fixing the bioreceptor on the metal spot disposed in the plurality of quantitative analysis units through the linker.
  19. 제 18항에 있어서,The method of claim 18,
    상기 링커를 상기 금속 스팟 상에 배치하는 단계는,The step of placing the linker on the metal spot,
    상기 단백질 칩의 기판 위에 상기 금속 스팟을 커버하고, 상기 금속 스팟 상에 상기 링커를 부착시키기도록, 상기 링커 및 자가 조립가능한 분자를 포함하는 코팅 용액을 이용하여 상기 단백질 칩의 복수개의 정량 분석 유닛 상에 코팅하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 정량 분석 방법.To cover the metal spot on the substrate of the protein chip and attach the linker on the metal spot, on the plurality of quantitative analysis units of the protein chip using a coating solution containing the linker and self-assembleable molecules Comprising the step of coating, quantitative analysis method of the target protein.
  20. 제1 항 내지 12항 중 어느 한항에 기재된 단백질 칩, 및The protein chip according to any one of claims 1 to 12, and
    표적 단백질에 특이적으로 결합하는 바이오 리셉터를 포함하는, 표적 단백질 정량 분석용 키트.A kit for quantitative analysis of a target protein, comprising a bioreceptor that specifically binds to the target protein.
  21. 제20항에 있어서,The method of claim 20,
    상기 단백질 정량 분석용 키트는,The kit for quantitative analysis of proteins,
    완충 용액을 더 포함하는, 단백질 정량 분석용 키트.Kit for quantitative protein analysis, further comprising a buffer solution.
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