WO2020064987A1 - Procédé microfluidique d'analyse de métaux - Google Patents

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WO2020064987A1
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microchannel
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Floriant DOUNGMENE
Lisa GAUTRIN
Aurélie MAGNIER
Clément NANTEUIL
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Klearia
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Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing a fluid containing a metallic trace element, for example arsenic, using a microfluidic method.
  • the invention also relates to a microfluidic circuit, allowing the simple, automated handling, of very small quantities of fluids, making it possible in particular to implement such a method.
  • Arsenic is a natural element of the earth's crust that is widely present in the environment, whether in the air, in water or in the earth. It is very toxic in inorganic form.
  • inorganic arsenic People are exposed to high levels of inorganic arsenic by drinking contaminated water, using it to prepare meals, irrigating crops, during industrial processes, eating contaminated food or smoking tobacco . Prolonged exposure to inorganic arsenic, mainly by drinking contaminated water or eating foods prepared with this water or from crops irrigated with arsenic-rich waters, can lead to chronic poisoning. Skin lesions and cancers are the most characteristic effects. Other adverse health effects that may be associated with prolonged ingestion of inorganic arsenic are: developmental effects, neurotoxicity, diabetes, pulmonary and cardiovascular disease. In particular, arsenic-induced myocardial infarction can be a major cause of excess mortality (see WHO website).
  • the present invention aims to overcome these drawbacks of the prior art.
  • the present invention aims to propose a method for analyzing a fluid containing a metallic trace element (ETM), in particular arsenic, using a microfluidic method, which is simple and quick to implement. work, but also reliable, having a very good sensitivity and whose measurements are reproducible.
  • the method according to the invention does not distort the sample tested, and / or avoids the hydrolysis of the ETMs to be analyzed.
  • the detection limit of the species to be analyzed is compatible with the regulatory thresholds (pg / L or less). Finally, it requires a very small sample volume.
  • Another objective of the present invention is to provide a microfluidic circuit allowing the implementation of such a method.
  • the invention thus relates to a microfluidic method for analyzing a fluid containing at least one metallic trace element comprising the following steps:
  • step b) mixing, within the microchannel of the microfluidic circuit, of the sample of fluid introduced in step a), with reagents, and
  • step c) is carried out using at least 2 electrodes, preferably at least 3 electrodes, preferably at least 3 electrodes, one of which is made of gold.
  • step c) is carried out using at least one platinum electrode as the reference electrode.
  • the measurement in step c) is carried out using the following three electrodes:
  • step c) comprises mixing the sample obtained in b) with at least one solution comprising a known concentration of metallic trace element ("standard solution”), then the assay of the metallic trace element by electrochemical detection method.
  • standard solution a known concentration of metallic trace element
  • the invention relates to a microfluidic method for analyzing a fluid containing arsenic, comprising the following steps:
  • step b) mixing, within the microchannel of the microfluidic circuit, of the fluid sample introduced in step a), with nitric acid and L-cysteine, and
  • said step c) comprising the mixing of the sample obtained in b) with at least one solution comprising a known concentration of metallic trace element, then the assay of the metallic trace element by electrochemical detection method.
  • step c) is carried out using at least 2 electrodes, preferably at least 3 electrodes, preferably at least 3 electrodes, one of which is made of gold.
  • the electrode can be any electrode usable in electrochemistry, such as an electrode made of gold, possibly covered with gold nanoparticles; a thin layer electrode; or a carbon nanotube electrode.
  • This process can be implemented particularly easily, in a single microfluidic circuit in which the various steps are carried out. This circuit is illustrated in the detailed figure below.
  • the method according to the invention is preferably fully automated, and allows the user to dispense with the different stages of pre-treatment of the sample and the stages of analysis which are sometimes complex and require the handling of chemicals such as concentrated acids or ETM standard solutions to be analyzed.
  • fluid is meant any liquid body capable of assuming the shape of the container which contains it.
  • the fluid according to the invention is a solution.
  • the fluid according to the invention is water.
  • the water tested according to the method according to the invention can be any type of water.
  • metallic trace element also called “ETM”, is meant a toxic or toxic metal beyond a certain threshold.
  • I ⁇ TM is chosen from lead, mercury, arsenic, copper, zinc and cadmium.
  • I ⁇ TM according to the invention is arsenic.
  • the method according to the invention is a method for analyzing water containing an ETM, in particular arsenic.
  • the microfluidic circuit is implemented using a portable device including the microfluidic circuit.
  • the method according to the invention can also be used for the analysis of any ETM present in a solution or a trace fluid.
  • nitric acid as reagent used in the method according to the invention, in particular for the detection of arsenic, is particularly relevant: in fact, the analysis of trace ETMs like arsenic is most often done in an acid medium to minimize interference, to improve sensitivity and to avoid hydrolysis of the ETMs to be analyzed or of the species formed after electrochemical transformation (D. Jagner, M. Josefson, S. Westerlung, Anal. Chem. 53 (1981) 2144; J. Lexa, K. Stulik, Talanta 30 (1983) 845 and E. Munoz, S. Palmero, Talanta 65 (2005) 613-620).
  • Hydrochloric acid is the most used because it leads to the best detection limits (in English "level of detection” or LOD) (E. Munoz et al supra). However, this acid is known to attack the gold electrodes used to measure the amount of ETM, and therefore reduce the lifetime of the analysis system (E. Munoz et al supra).
  • Another acid could also be used, such as in particular hydrochloric acid, sulfuric acid or acetic acid.
  • the use of nitric acid in combination with L-cysteine and the confined nature of the reagents in the microfluidic channels (reaction and rapid diffusion of the species), has made it possible to obtain LODs comparable to those obtained with hydrochloric acid.
  • the use of nitric acid makes it possible to carry out a very large number of analyzes, ie at least 400, preferably at least 450, preferably at least 500 analyzes, without destroying the 'gold electrode.
  • the advantage of the microfluidic circuit according to the present invention lies in the fact that it is reusable, and not for single use; it typically allows at least 400 analyzes, preferably at least 450, preferably at least 500 analyzes, without destruction of the gold electrode.
  • L-cysteine is a reagent that converts arsenic (V) (AsV) to arsenic (III) (Aslll) when the solution is heated. It therefore allows the speciation of arsenic, ie to differentiate Aslll and AsV.
  • the transformation reaction is given below (Talanta 58 (2002) 45-55):
  • the method according to the invention does not use hydrazine hydrochloride (N2H4-HCl).
  • step c) of the method comprises mixing the sample obtained in b) with at least one solution comprising a known concentration of metallic trace element ("standard solution”), then the assay of the element - metallic trace by electrochemical detection method.
  • standard solution a known concentration of metallic trace element
  • standard solution is meant an ETM solution whose concentration is known. This concentration is determined upstream as a function of the concentration of ETM to be analyzed in the sample.
  • the I ⁇ TM to be measured is in a low concentration, in particular strictly less than 10 ppb ("low range"), two standard solutions are used, for example at 2 and 4 ppb of ETM.
  • the I ⁇ TM to be measured is in a higher concentration, in particular greater than or equal to 10 ppb (“high range”), for example between 10 and 20 ppb, two standard solutions are used, for example at 10 and 20 ppb of AND M.
  • microfluidic method according to the invention makes it possible to dispense with matrix effects.
  • the microfluidic method according to the invention is thus reliable and reproducible.
  • it can be placed on any type of fluid, and does not require no prior calibration.
  • Such a method is thus based on metered additions of ETM in the sample.
  • the discriminating value between the low range and the high range with respect to the regulatory value of I ⁇ TM to be measured.
  • concentration of ETM in the sample is measurable in the low range, it is not necessary to obtain its specific concentration: the simple fact of being able to measure the concentration of ETM in the low range means that the latter is less than the discriminating value, and therefore the regulatory value.
  • the method according to the invention can comprise, in step c), the detection of I ⁇ TM in the high range or in the low range.
  • the concentration of I ⁇ TM is not precisely measured.
  • the assay then only includes the detection of I ⁇ TM in the high range (range of concentrations greater than or equal to 10 ppb) or in the low range (range of concentrations less than 10 ppb).
  • the method according to the invention may comprise, in step c), the detection of I ⁇ TM in the high range or in the low range, then the measurement of concentration of I ⁇ TM within this range.
  • the assay then comprises the detection of I ⁇ TM in the high range or in the low range, then the measurement of concentration of I ⁇ TM within the range.
  • the invention also relates to a microfluidic circuit for analyzing a fluid, in particular capable of implementing the method according to the invention, comprising:
  • reagent storage tank preferably nitric acid and L-cysteine, and optionally at least one second storage tank comprising at least one standard solution
  • a premix chip comprising at least a first microchannel fluidically connected:
  • said inlet suitable for injecting a sample of fluid to be analyzed
  • At least a second microfluidic chip comprising at least a second microchannel connected to the tank and comprising at least two electrodes, preferably at least three electrodes, one of which is made of gold.
  • the first chip and the second chip according to the invention can also, according to one embodiment, be prepared on a single and same substrate.
  • a single chip comprising a first compartment (corresponding to the premix chip) and a second compartment (corresponding to the analysis chip).
  • the microfluidic circuit comprises, in the first chip, a first network of microchannels in which the sample of fluid to be analyzed and the reagents (such as nitric acid and L-cysteine) circulate; and in the second chip, a second network of microchannels comprising at least 2 electrodes, preferably at least three electrodes.
  • the reagents such as nitric acid and L-cysteine
  • the first network of microchannels is present in a first microfluidic chip, generally called “pre-treatment chip” or “mixing chip”; it is used to mix the various reagents (such as nitric acid and L-cysteine) with the sample, in particular in specific proportions.
  • pre-treatment chip or “mixing chip”; it is used to mix the various reagents (such as nitric acid and L-cysteine) with the sample, in particular in specific proportions.
  • the second network of microchannels is present in a second microfluidic chip, generally called “analysis chip”; it is the chip on which the target pollutants are detected and quantified, thanks to the presence of two or three electrodes, and in particular also thanks to the presence of calibration solutions (or standard solutions).
  • analysis chip the chip on which the target pollutants are detected and quantified, thanks to the presence of two or three electrodes, and in particular also thanks to the presence of calibration solutions (or standard solutions).
  • circuit according to the invention integrated in particular in chips as described above, allows the implementation of the method described above, in a particularly easy way.
  • Microfluidic chips also called “labs on a chip” or “lab-on-a-chip” according to the English terminology sometimes used by those skilled in the art, are miniaturized devices for biological or chemical analysis, which consist of at least one thin plate (of the order of a few tens to a few hundred micrometers), preferably made of glass (that is to say a hard, brittle and transparent substance, of vitreous structure, essentially formed of alkaline silicates, and having a high chemical resistance), and of a cover comprising at least one microfluidic channel (or microchannel).
  • Each chip is preferably as described in EP2576056.
  • the chips constituting the microfluidic circuit according to the invention each include:
  • a cover comprising at least one microfluidic channel, and - a single layer, intermediate between the plate and the cover, formed of an inorganic matrix of Si02.
  • the single layer has a thickness between 100 nm and 10 mm, and preferably between 300 nm and 400 nm.
  • each chip comprises at least one circuit in the cover and / or at least one circuit on the cover, associated with the cover by an inorganic matrix of SiO 2.
  • the microfluidic chips according to the invention are made of glass.
  • the chips fully benefit from the exceptional properties of glass, namely:
  • FIG. 1 is a plan, seen from above, of a circuit comprising the microfluidic chips making it possible to implement a method according to a preferred embodiment of the invention.
  • this circuit comprising the microfluidic chips is suitable for the detection of arsenic in a sample of fluid such as water.
  • This plan shows the different microfluidic channels which are formed inside this circuit.
  • This circuit generally consists of the following elements:
  • the reservoirs (R.3, R.4, R.5, R.7 and R.8 to R.13): their role is to store the different reagent solutions and the sample to be analyzed.
  • tank R.3 contains the sample to be analyzed.
  • the tank R.4 is used to store nitric acid (HN0 3 ), preferably with a concentration of 2.2 M.
  • Nitric acid has a double role: as indicated above, it makes it possible to clean the circuit microfluidic, but also to acidify the sample to be analyzed.
  • the circuit comprises a reservoir R.5, which contains a mixture of nitric acid (especially at 100 mM) and L-cysteine (especially at 15 mM): it serves as a measurement blank, or control solution.
  • tank R.5 contains a sample devoid of ETM, which serves as a control. It verifies that the circuit has not been contaminated by the sample to be analyzed.
  • Reservoir R.7 contains L-cysteine, preferably at 50 mM.
  • the tanks R.8 to R.1 1 contain calibration solutions (or standard solutions).
  • they contain solutions of As (lll) with respective concentrations equal to 14.48, 28.96, 72.40 and 144.80 ppb, acidified with 10 mM nitric acid.
  • These solutions are used to add 2 and 4 ppb of As (lll), or 10 and 20 ppb of As (lll), to the sample to be analyzed (by definition of unknown concentration), which depends on the concentration to be analyzed.
  • concentrations to be analyzed for a range of concentrations to be analyzed between 0 and 10 ppb, the additions of the solutions at 2 and 4 ppb are used, while the additions of the solutions at 10 and 20 ppb are used for concentrations greater than 10 ppb.
  • the reservoir R.12 contains an aqueous solution of sulfuric acid (H 2 SO4), preferably at 100 mM. It allows in particular the cleaning of the working electrode of the analysis chip, electrochemically between different measurements.
  • the reservoir R.13 contains a mixture of tetrachloroauric acid (HAuCL), preferably at 2 mM, and sulfuric acid (H 2 SO4), preferably at 100 mM. This solution is used to automatically regenerate the working electrode (in particular gold) of the analysis chip by electrochemical means, in the event that its surface deteriorates.
  • the external bin contains the excess sample to be analyzed which has been injected into the system, or which has been used to rinse the tank R.3.
  • the internal bin (bin with gas permeable cap), inaccessible to the user, contains all the solutions containing chemicals, such as acid solutions, L-cysteine solution or even the mixture of tetrachloroauric acid and sulfuric acid.
  • It is a recirculation tank with an inlet and an outlet. It is used to heat the sample to be analyzed, in the presence of L-cysteine, and thus carry out the conversion of As (V) into As (III). This heating is typically carried out by means of a heating resistor mounted on the tank.
  • the bubbles are indicated in a circle in the figure. There is one between the tank R.3 and the solenoid valve 1 (spike 8); and another at the outlet of the solenoid valve 14 (spike 10). They remove air or gas bubbles trapped in the liquid circulating in the circuit.
  • connection elements tubes, screws, unions, ferrules
  • a 12-liter bottle of nitrogen is used to generate pressure to move the different solutions through the system.
  • a positive pressure of 500 mbar is used throughout the analyzes.
  • This cylinder is connected to the circuit by means of the solenoid valve 3, which allows the injection of gas into the circuit.
  • o pretreatment chip or mixing chip (reference 50 in FIG. 1): It allows a pretreatment of the sample, by carrying out the various mixtures in the desired proportions. The user is therefore freed from these steps which are often long and require the handling of dangerous reagents, such as concentrated acids.
  • the main microchannel 59 also called “first microchannel”
  • the main microchannel 59 is the microchannel starting at the input 51 and ending at the solenoid valve 12.
  • the inlet 51 is connected to the outer trash PE, via the solenoid valve 21.
  • the inlet 52 is connected to the tank R.4 (containing the nitric acid) via the solenoid valve 7.
  • Inputs 53, 56 and 58 are not linked. They can be provided in particular for the following cases: an entry is provided for the addition of a complexing agent, such as EDTA, to complex potential metallic interferers; another inlet is provided for diluting the sample with water, in particular ultrapure, if it is very concentrated and falls outside the linearity range of the sensor; finally the last entry is suitable for a more concentrated nitric acid solution, which would be used in the event of dilution, in order to bring the final pH to an acceptable value, for example 1.
  • a complexing agent such as EDTA
  • another inlet is provided for diluting the sample with water, in particular ultrapure, if it is very concentrated and falls outside the linearity range of the sensor
  • the last entry is suitable for a more concentrated nitric acid solution, which would be used in the event of dilution, in order to bring the final pH to an acceptable value, for example 1.
  • Input 54 is connected to reservoir R.3 (containing the sample to be analyzed) via solenoid valve 1.
  • Input 55 is connected to tank R.4 (containing nitric acid) via solenoid valve 6. Finally, input 57 is connected to tank R.7 (containing L-cysteine) via solenoid valve 4.
  • This chip 50 has a channel depth of 50 ⁇ m.
  • the length between the inlet 51 and the outlet 59 is 142 mm.
  • the main microchannel 59 has a width typically between 0.7 and 2 mm, preferably between 0.7 and 1.5 mm, preferably equal to 1 mm.
  • the flow rate of the main microchannel is 11 ml / h for a pressure of 500 mbar.
  • the dimensions of the different channels of the preprocessing chip are as follows:
  • the dimensions of the different channels are chosen so that at the outlet of the main microchannel of the chip, the mixtures are homogeneous and in the proportions below:
  • This chip 60 comprises a system of three electrodes, on which the mixtures leaving the pretreatment chip 50 are analyzed.
  • the analysis chip 60 is delimited, in the figure, by the inputs 61 to 67, the input 61 being connected to a spike 10 and to the solenoid valve 14, by the inputs 70 to 75; and by the exit of the main microchannel 69 (also called “second microchannel”) in the internal trash PI.
  • the main microchannel 69 has a width typically between 0.7 and 2 mm, preferably between 0.7 and 1.5 mm, preferably equal to 1 mm.
  • the analysis chip 60 typically has 13 inputs (references 61 to 67 and 70 to 75) and an output 76. Among these inputs, there are the inputs 70 to 75 connected to the tanks R.8 to R.13, and the entries 61 to 67.
  • the inlet 61 is connected to a bubble separator 10, to the solenoid valve 14 and to the tank R.4 (containing the nitric acid) via the solenoid valve 20.
  • the input 62 is connected to the tank R.5 (containing the measurement blank) via the solenoid valve 17.
  • Inputs 63 to 67 can be connected to ultra pure water tanks, and / or for the addition of buffer solutions, such as acetates or phosphates. They allow measurements to be made on highly concentrated samples, or at pH levels close to the pH of drinking water, therefore without acidification.
  • buffer solutions such as acetates or phosphates. They allow measurements to be made on highly concentrated samples, or at pH levels close to the pH of drinking water, therefore without acidification.
  • tanks R.8 to R.1 1 (containing the calibration solutions) are connected to the main microchannel 69 via, respectively, the solenoid valves 26, 28, 27 and 25.
  • the tank R.12 (containing the aqueous sulfuric acid solution) is connected to the main microchannel 69 via the solenoid valve 18.
  • the reservoir R.13 (containing the mixture of tetrachloroauric acid and sulfuric acid) is connected to the main microchannel 69 via the solenoid valve 24.
  • the system of three electrodes comprises:
  • the depth (or width) of the analysis chip 60 is 20 ⁇ m.
  • the length between the inlet 61 and the outlet 76 is typically 178 mm, and the width of the main microchannel 69 is 1 mm.
  • the average output flow is around 400 mI / h at a pressure of 500 mbar.
  • the sample coming from the pretreatment chip enters through one of the channels of this chip, for example input 61, just like the nitric acid of the reservoir R.4.
  • each chip can be composed of two superposed plates, glued to one another.
  • each chip can be composed of a first plate, which can for example be a transparent blade microscope, and a second plate whose face in contact with the first plate is etched so as to define microchannels between the two plates which are superimposed and glued to each other.
  • the first plate can be made of a polymer material.
  • the material constituting at least one of the two plates can be transparent.
  • the dimensions of the microchannels are determined by adapting the width and the depth of the engravings in the engraved plate. It should be noted that microfluidic chips manufactured according to other methods known to those skilled in the art can obviously be used to implement the invention.
  • the microfluidic circuit according to the invention can be connected in particular to at least one element chosen from an electronic device necessary for the operation of the system, a battery, a potentiostat for controlling the electrochemical measurements, a cooling system placed on the chips to cool the solutions coming from the tank and a touch screen in particular which makes it possible to launch the desired measurement, to know the progress of the measurement and to visualize the result obtained.
  • the invention relates to a microfluidic method for analyzing a fluid containing at least one ETM comprising the following steps:
  • step b) mixing, within the microchannel of the microfluidic circuit, of the sample of fluid introduced in step a), with reagents, and
  • step c) is carried out using at least 2 electrodes, preferably at least 3 electrodes, preferably at least 3 electrodes, one of which is made of gold.
  • the invention relates to a microfluidic method for analyzing a fluid containing arsenic, comprising the following steps:
  • step b) mixing, within the microchannel of the microfluidic circuit, of the fluid sample introduced in step a), with nitric acid and L-cysteine, and c) measurement of the amount of arsenic present in the sample obtained in b), using an electrochemical detection method.
  • step c) is carried out using at least 2 electrodes, preferably at least 3 electrodes, preferably at least 3 electrodes, one of which is made of gold.
  • Step a) of introducing a fluid sample into at least one microchannel of a microfluidic circuit is preferably carried out according to the following substeps:
  • the injection of the sample into the microfluidic circuit (sub-step a1) is notably carried out by injecting said sample into the input of the first microchannel of the first chip of the circuit according to the invention.
  • this step is carried out using a syringe fitted with a 0.45 ⁇ m filter.
  • the filter removes all suspended solids with a diameter greater than 0.45 ⁇ m.
  • the solenoid valves 9, 16 and 30 are open.
  • the solenoid valve 9 allows the sample (E) to pass to the reservoir R.3. Part of this sample is used to rinse the tank and goes to the external PE bin through the solenoid valves 16 and 30, while the rest of the sample remains in the tank R.3 and is used for analysis.
  • this operation can last a few minutes or seconds, then the solenoid valves 9, 16 and 30 are closed.
  • the sample is pressurized (sub-step a2).
  • the sample can be pressurized by any means, for example by injection of a gas, in particular an inert gas, or by suction.
  • the pressurization can be carried out using a pump or a syringe. Thanks to its pressurization, the sample is set in motion.
  • the sample is stored in a tank (R.3) connected to a microchannel of the microfluidic circuit.
  • a reservoir (R.3) connected to the first microchannel of the first chip, and the pressurization of the reservoir R.3 is carried out in particular by the opening of a solenoid valve (the solenoid valve 3) , which is connected to the nitrogen gas bottle (G).
  • the other tanks, except tank R.3, are always under pressure during the whole process (ie before and after the measurement).
  • the solenoid valve 3 remains open for the time of the analysis; it is closed at the end of the measurement.
  • step N) this is the cleaning step.
  • This step N preferably comprises at least one, preferably at least two, preferably at least three, preferably the following four substeps:
  • N1 a sub-step for cleaning the microfluidic circuit
  • N2 a substep for cleaning the measurement electrodes, in particular the gold electrode;
  • N3 a sub-step of electrochemical gold deposition
  • N4 a control sub-step, in particular by measuring a control solution.
  • the sub-step N1 is carried out as follows:
  • the solenoid valves 1, 21 and 30 are open.
  • the sample inlet channel in the pretreatment chip 50 (inlet 54 of the pretreatment chip) is cleaned with the sample, then the fraction of the sample used for cleaning is returned to the external bin, in particular to through the solenoid valves 21 and 30. This operation typically lasts about 30 seconds, then the solenoid valves are closed.
  • the solenoid valves 2, 5 and 29 are opened.
  • the sample is pushed towards the tank, in particular through the solenoid valve 2, and conveyed to the internal bin, in particular thanks to the solenoid valves 5 and 29.
  • This operation typically lasts 30 seconds, then the solenoid valves are closed.
  • the solenoid valve 15 sends the gas G (like the solenoid valve 3) into the tank; the gas then exerts a pressure on the liquid contained in the tank, and pushes it towards the external bin, in particular passing through the solenoid valves 13 and 30. This operation typically lasts 15 seconds, then the solenoid valves are closed.
  • the sub-step N2 is carried out as follows:
  • At least one electrode used in step c) of the method according to the invention is made of gold.
  • sulfuric acid (contained in the tank R.12) is used to clean the gold electrode present in the main microchannel 69 of the analysis chip 60, in particular by cyclic voltammetry (voltammetry).
  • the solenoid valves 18 and 29 are open to allow this acid to pass. Cycling is typically carried out between -0.4 and 1.5 V at 200 mV / s. This operation generally lasts 3 minutes, then the solenoid valves are closed.
  • the sub-step N3 is carried out as follows:
  • This sub-step N3 is to increase the electrochemically active surface of the gold, obtained by electrochemical deposition under vacuum.
  • the measurement surface will no longer be flat, but in relief (in 3D), because the electrochemical deposition leads to a non-planar surface.
  • the solenoid valves 24 and 29 are open for approximately 3 minutes, the mixture of tetrachloroauric acid and sulfuric acid from the reservoir R.13 is then released in the inlet 74 then in the main microchannel 69, and the gold deposit is made by chronoamperometry for about 300 seconds at the Au (III) deposit peak potential on the working electrode. This potential is determined by cyclic voltammetry.
  • the deposition of gold can also be carried out when after a certain number of measurements the active gold surface is reduced, which results in a reduction in the area of reduction peak of the gold oxides by measurement in voltammetry. cyclic. In this case, the system automatically launches a gold deposit to regenerate.
  • the sub-step N4 is carried out as follows:
  • a measurement of the control solution (white) can be carried out to check the cleanliness of the previously cleaned circuit.
  • the solenoid valves 17 and 29 are generally open for about 5 minutes.
  • the analysis of the blank (control solution) (contained in the tank R.5) is typically done by SW V (Square Wave Voltammetry, or square wave voltammetry in French).
  • the content of the reservoir R.5 is released in the inlet 62 and then in the main microchannel 69, to be measured, before being eliminated in the internal bin.
  • step b) The analysis of the blank is done with a deposit potential (Edep) of -1.1 V, for 90 seconds (Tdep), with an amplitude of 0.02 V. The signal is recorded between -0.2 and 0, 7 V. If a peak appears, then the sub-steps N1 to N3 are restarted, preferably automatically, otherwise we go to step b) of the method according to the invention.
  • the second step (step b) mixing, within the microchannel of the microfluidic circuit, of the sample with reagents, preferably nitric acid and L-cysteine.
  • the two reagents in particular present in the two reservoirs fluidly connected to one end of the first chip are released in the first microchannel of said first chip, and mix with the sample injected into the inlet.
  • the mixture obtained is then conveyed in a tank, preferably in the tank connected to the second end of the first microchannel of the first chip.
  • the first microchannel of the first chip is the main microchannel (microchannel 59 in FIG. 1), and has a width typically between 0.7 and 2 mm, preferably between 0.7 and 1.5 mm, preferably equal to 1 mm ; and a length typically between 30 and 60 ⁇ m, preferably between 40 and 55 ⁇ m.
  • the flow rate of the microchannel of the first chip is 11 ml / h for a pressure of 500 mbar.
  • the solenoid valves 4, 1, 5, 6, 12 and 29 are opened.
  • the sample, the nitric acid and the L-cysteine are thus mixed in the desired proportions thanks to the chip.
  • mixture 50 then routed into the tank through the solenoid valve 12. This operation generally lasts a few minutes, typically 2 to 5 minutes, preferably 2 to 3 minutes, more preferably 2 minutes and 15 seconds, then the solenoid valves are closed.
  • the solenoid valves 1 1, 15 and 29 are opened, in particular for 15 seconds.
  • the pretreated sample is thus sent to the internal bin.
  • the tank is filled again by opening the solenoid valves 4, 1, 5, 6, 12 and 29, generally for a few minutes, typically from 2 to 5 minutes, preferably from 2 to 3 minutes, more preferably 2 minutes and 15 seconds, then the pretreated sample is routed, this time to the analysis chip 60 by opening the solenoid valves 14, 15 and 29.
  • the dimensions of the different channels are chosen so that at the outlet of the main microchannel 59 of the chip 50, the mixtures are homogeneous and in specific proportions.
  • the mixture of sample, nitric acid (at 2.2 mM) and L-cysteine (at 50 mM) is produced in a respective volume ratio of 0.6-0.7: 0.03- 0.05: 0.25-0.40.
  • this respective volume ratio is equal to 0.63: 0.04: 032.
  • the method comprises a step c) of measuring the amount of ETM present in the sample obtained in b), using at least 3 electrodes, one of which is gold.
  • Step c) preferably includes the circulation of the sample obtained in b), from the tank through the second microchannel of the analysis chip, comprising at least three electrodes, one of which is made of gold.
  • the second microchannel of the second chip is the main microchannel (microchannel 69 in FIG. 1), and has a width typically between 0.1 and 2 mm, preferably between 0.12 and 1.5 mm; and a length typically between 5 and 80 mm, preferably between 9 and 60 mm.
  • the sample obtained in b) (also called pretreated sample), once in the analysis chip 60, is analyzed using at least 3 electrodes, one of which is made of gold.
  • step c at least one standard solution is mixed with the sample obtained in b).
  • the pretreated sample is analyzed using at least 3 electrodes, one of which is made of gold, and according to the following substeps:
  • c1) measure the amount of arsenic (III) present in the sample, called As (III), then c2) convert the arsenic (V) remaining in the sample into arsenic (III), then measure the amount of arsenic (III) obtained, called As early, and finally
  • step c1) the amount of As (lll) is determined; this is step c1).
  • this step c1) involves at least one standard solution.
  • step c1) comprises mixing the sample obtained in b) with at least one standard solution, preferably two standard solutions of different concentrations, then determining the concentration of As (III) present in the sample.
  • standard solution is meant a solution comprising a known concentration of As (III).
  • first standard solution comprising an As (III) concentration of between 5 and 15 ppb
  • second standard solution comprising an As (III) concentration of between 15 and 25 ppb
  • first standard solution comprising an As (lll) concentration of between 1 and 3 ppb
  • second standard solution comprising an As (lll) concentration of between 3 and 5 ppb
  • the quantity of As (III) is measured by circulating the sample obtained in b) by SWV, in particular with the same electrochemical parameters as the control solution (white), with the exception of Tdep (deposition time ), i.e. a deposition potential (Edep) of -1.1 V, for 120 seconds (Tdep), with an amplitude of 0.02 V, and the signal is recorded between -0.2 and 0.7 V.
  • Tdep deposition time
  • Edep deposition potential
  • the mean of the area (Amoy) of the peak measured during the desorption of arsenic on the gold electrode is compared with threshold values.
  • the system opens the solenoid valves 27 and 25, which provide concentrations of additions (standard solutions) in the mixture of 10 and 20 ppb respectively (ie tanks R.10 and R .1 1). With each addition, Amoy (addition) is measured. Thus, the values of Amoy, Amoy (addition 1) and Amoy (addition 2) are used to determine the concentration of As (III) in the sample;
  • the Amoy measurement is repeated using a deposition time of 360 seconds.
  • the signal obtained gives an Amoy ⁇ 3x10 -4 pAV
  • the sample contains As (III) in concentration below the limit of quantification of 0.85 ppb.
  • Amoy> 3x10 -4 pAV then the system opens the solenoid valves 26 and 28, which provide concentrations of additions in the mixture of 2 and 4 ppb respectively (ie reservoirs R.8 and R.9) . With each addition, Amoy (addition) is measured.
  • the values of Amoy, Amoy (addition 1) and Amoy (addition 2) are used to determine the concentration of As (III) in the sample; - if Amoy> 3x10 2 pAV, the sample is automatically diluted at the level of the pretreatment chip 50, and according to the measured Amoy. Then a Tdep of 360 seconds or 120 seconds is applied.
  • step c2 the amount of As (V) is determined; this is step c2).
  • Total arsenic (early As) is obtained by converting all of the As (V) to As (lll).
  • an incubation step of the sample obtained in b) takes place in the tank, preferably by heating. Typically, this incubation step is carried out for a few minutes.
  • the solenoid valves 7, 12, 5 and 29 are open, in particular for 30 seconds, to clean the tank and the microchannels containing nitric acid.
  • the nitric acid remaining in the tank is used to clean the analysis chip 60, typically by opening the solenoid valves 14, 15 and 29, for about 30 seconds.
  • This chip is cleaned again, then filled with nitric acid for storage, generally for 30 minutes, by opening the solenoid valves 20 and 29.
  • Example 1 implementation of the method according to the invention for measuring the arsenic level in a water sample
  • As (lll) is chosen in this test because it is the most toxic form of arsenic.
  • 40 mL of As (III) water sample is injected using a syringe into the microfluidic analysis system according to the invention.
  • the method according to the invention is implemented for the analysis of these samples in turn on the glass chip.
  • the response of the sensors is recorded in triplicate for each sample and the results below are obtained:
  • the arsenic introduced is almost completely detected by the method described here.
  • the method according to the invention can be used effectively for the automatic detection of ETM in water.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé microfluidique d'analyse d'un fluide contenant un élément-trace métallique, notamment l'arsenic, comprenant les étapes suivantes : a) introduction d'un échantillon de fluide dans au moins un microcanal d'un circuit microfluidique; b) mélange, au sein du microcanal du circuit microfluidique, de l'échantillon de fluide introduit avec de l'acide nitrique et de la L-cystéine; et c) mesure de la quantité d'élément-trace métallique présent dans l'échantillon, en utilisant une méthode de détection électrochimique.

Description

Procédé microfluidique d’analyse de métaux
La présente invention concerne un procédé d'analyse d'un fluide contenant un élément- trace métallique, par exemple l’arsenic, mettant en œuvre une méthode microfluidique. L'invention concerne également un circuit microfluidique, permettant la manipulation simple, automatisée, de très petites quantités de fluides, permettant notamment de mettre en œuvre un tel procédé.
L’arsenic est un élément naturel de la croûte terrestre largement présent dans l’environnement, que ce soit dans l’air, dans l’eau ou dans la terre. Il est très toxique sous forme inorganique.
Les populations s’exposent à des niveaux élevés d’arsenic inorganique en buvant de l’eau contaminée, en l’utilisant pour préparer les repas, irriguer les cultures, au cours des procédés industriels, en mangeant des aliments contaminés ou en fumant du tabac. L’exposition prolongée à l’arsenic inorganique, principalement en buvant de l’eau contaminée ou en mangeant des aliments préparés avec cette eau ou provenant de cultures irriguées avec des eaux riches en arsenic, peut entraîner une intoxication chronique. Les lésions et les cancers de la peau en sont les effets les plus caractéristiques. Les autres effets indésirables pour la santé qu’on peut associer à une ingestion prolongée d’arsenic inorganique sont les suivants: effets sur le développement, neurotoxicité, diabète, atteintes pulmonaires et atteintes cardiovasculaires. En particulier, l’infarctus du myocarde induit par l’arsenic peut être une cause importante de surmortalité (cf site internet de l’OMS).
La plus grande menace de l’arsenic pour la santé publique provient des eaux souterraines contaminées. L’arsenic inorganique est naturellement présent à des teneurs élevées dans les eaux souterraines d’un certain nombre de pays, parmi lesquels l’Argentine, le Bangladesh, le Chili, la Chine, les États-Unis d’Amérique, l’Inde et le Mexique (cf site internet de l’OMS).
Dans ses Directives de qualité pour l’eau de boisson, l’OMS estime que la limite actuellement recommandée pour l’arsenic dans l’eau potable est fixée à 10 pg/litre, bien que cette valeur soit provisoire en raison des difficultés de dosage et des complications pratiques pour l’éliminer de l’eau potable. Classiquement, le dosage de l’arsenic dans l’eau de boisson est effectué par des prélèvements, qui sont transmis et analysés en laboratoire. Par conséquent, ce type de tests nécessite de multiples manipulations de l’échantillon (notamment lors du transport, du conditionnement...), au risque d’en modifier sa composition. Par ailleurs, de tels tests sont longs à mettre en oeuvre (au moins quelques jours), avant d’obtenir les résultats.
La présente invention a pour objectif de pallier ces inconvénients de l'art antérieur. En particulier, la présente invention a pour objectif de proposer un procédé d'analyse d'un fluide contenant un élément-trace métallique (ETM), notamment l’arsenic, mettant en oeuvre une méthode microfluidique, qui soit simple et rapide à mettre en oeuvre, mais aussi fiable, ayant une très bonne sensibilité et dont les mesures soient reproductibles. En particulier, le procédé selon l’invention ne dénature pas l’échantillon testé, et/ou évite l’hydrolyse des ETM à analyser. La limite de détection de l’espèce à analyser est compatible avec les seuils règlementaires (pg/L ou moins). Enfin, il nécessite un très petit volume d’échantillon.
Un autre objectif de la présente invention est de fournir un circuit microfluidique permettant la mise en oeuvre d'un tel procédé.
L'invention se rapporte ainsi à un procédé microfluidique d'analyse d'un fluide contenant au moins un élément-trace métallique comprenant les étapes suivantes :
a) introduction d’un échantillon de fluide dans au moins un microcanal d'un circuit microfluidique ;
b) mélange, au sein du microcanal du circuit microfluidique, de l’échantillon de fluide introduit à l’étape a), avec des réactifs, et
c) mesure de la quantité d’élément-trace métallique présent dans l’échantillon obtenu en b), en utilisant une méthode de détection électrochimique.
De préférence, l’étape c) est effectuée en utilisant au moins 2 électrodes, de préférence au moins 3 électrodes, de préférence au moins 3 électrodes dont une en or. De préférence, l’étape c) est effectuée en utilisant au moins une électrode en platine comme électrode de référence. De préférence, la mesure de l’étape c) est effectuée en utilisant les trois électrodes suivantes :
- une électrode en or, comme électrode de travail,
- une électrode en platine, comme électrode de référence, et
- une contre-électrode en platine. De préférence, l’étape c) comprend le mélange de l’échantillon obtenu en b) avec au moins une solution comprenant une concentration connue en élément-trace métallique (« solution étalon »), puis le dosage de l’élément-trace métallique par méthode de détection électrochimique.
De préférence, l'invention se rapporte à un procédé microfluidique d'analyse d'un fluide contenant de l’arsenic, comprenant les étapes suivantes :
a) introduction d’un échantillon de fluide dans au moins un microcanal d'un circuit microfluidique ;
b) mélange, au sein du microcanal du circuit microfluidique, de l’échantillon de fluide introduit à l’étape a), avec de l’acide nitrique et de la L-cystéine, et
c) mesure de la quantité d’arsenic présent dans l’échantillon obtenu en b), en utilisant une méthode de détection électrochimique.
De préférence, ladite étape c) comprenant le mélange de l’échantillon obtenu en b) avec au moins une solution comprenant une concentration connue en élément-trace métallique, puis le dosage de l’élément-trace métallique par méthode de détection électrochimique.
De préférence, l’étape c) est effectuée en utilisant au moins 2 électrodes, de préférence au moins 3 électrodes, de préférence au moins 3 électrodes dont une en or.
L’électrode peut être toute électrode utilisable en électrochimie, comme une électrode faite d’or, éventuellement recouverte de nanoparticules d’or ; une électrode en couche mince ; ou bien une électrode en nanotubes de carbone.
Ce procédé peut être mis en œuvre particulièrement facilement, dans un seul circuit microfluidique dans lequel sont réalisées les différentes étapes. Ce circuit est illustré dans la figure détaillée ci-dessous.
Le procédé selon l’invention est de préférence entièrement automatisé, et permet à l’utilisateur de s’affranchir des différentes étapes de prétraitement de l’échantillon et des étapes d’analyse qui sont parfois complexes et nécessitent la manipulation de produits chimiques tels que des acides concentrés ou des solutions étalons d’ETM à analyser.
Par « fluide », on entend tout corps liquide capable de prendre la forme du récipient qui le contient. De préférence, le fluide selon l’invention est une solution. De préférence, le fluide selon l’invention est l’eau. L’eau testée selon le procédé selon l’invention peut être tout type d’eau. Par « élément-trace métallique », appelé aussi « ETM », on entend un métal toxique ou toxique au-delà d’un certain seuil. De préférence, IΈTM est choisi parmi le plomb, le mercure, l’arsenic, le cuivre, le zinc et le cadmium. De préférence, IΈTM selon l’invention est l’arsenic.
De préférence, le procédé selon l’invention est un procédé d’analyse de l’eau contenant un ETM, notamment l’arsenic.
De préférence, il est mis en œuvre grâce à un dispositif portatif incluant le circuit microfluidique.
Le procédé selon l’invention peut également être utilisé pour l’analyse de tout ETM présent dans une solution ou un fluide à l’état de traces.
L’utilisation d’acide nitrique comme réactif utilisé dans le procédé selon l’invention, en particulier pour la détection d’arsenic, est particulièrement pertinente : en effet, l’analyse des ETM à l’état de traces comme l’arsenic se fait le plus souvent en milieu acide pour minimiser les interférences, pour améliorer la sensibilité et pour éviter l’hydrolyse des ETM à analyser ou des espèces formées après transformation électrochimique (D. Jagner, M. Josefson, S. Westerlung, Anal. Chem. 53 (1981 ) 2144; J. Lexa, K. Stulik, Talanta 30 (1983) 845 et E. Munoz, S. Palmero, Talanta 65 (2005) 613-620). L’acide chlorhydrique (HCl) est le plus utilisé car il conduit aux meilleures limites de détection (en anglais « level of détection » ou LOD) (E. Munoz et al précité). Cependant, cet acide est connu pour attaquer les électrodes en or utilisées pour mesurer la quantité d’ETM, et donc diminuer la durée de vie du système d’analyse (E. Munoz et al précité).
On pourrait aussi utiliser un autre acide, tel que notamment l’acide chlorhydrique, l’acide sulfurique ou l’acide acétique.
Cependant, de façon avantageuse, l’utilisation de l’acide nitrique, en combinaison avec la L-cystéine et le caractère confiné des réactifs dans les canaux microfluidiques (réaction et diffusion rapide des espèces), a permis d’obtenir des LOD comparables à celles obtenues avec l’acide chlorhydrique. En outre, contrairement à l’acide chlorhydrique, l’utilisation d’acide nitrique permet de réaliser un très grand nombre d’analyses, i.e. au moins 400, de préférence au moins 450, de préférence au moins 500 analyses, sans destruction de l’électrode d’or. En effet, l’intérêt du circuit microfluidique selon la présente invention réside dans le fait qu’il est réutilisable, et non à usage unique ; il permet typiquement de réaliser au moins 400 analyses, de préférence au moins 450, de préférence au moins 500 analyses, sans destruction de l’électrode d’or.
La L-cystéine est un réactif qui permet de convertir l’arsenic (V) (AsV) en arsenic (III) (Aslll) lorsque la solution est chauffée. Elle permet donc la spéciation de l’arsenic, i.e. de différencier l’Aslll et l’AsV. La réaction de transformation est donnée ci-dessous (Talanta 58 (2002) 45-55):
Figure imgf000006_0001
- CH{ -NH 1 COOH (cystinc) -+- H20
soit de façon simplifiée : AsV + cystéine => Aslll + cystine.
De préférence, le procédé selon l’invention n’utilise pas de chlorhydrate d’hydrazine (N2H4-HCI).
De préférence, l’étape c) du procédé comprend le mélange de l’échantillon obtenu en b) avec au moins une solution comprenant une concentration connue en élément-trace métallique (« solution étalon »), puis le dosage de l’élément-trace métallique par méthode de détection électrochimique.
De préférence, on utilise au moins une solution étalon, de préférence au moins deux solutions étalons. Par « solution étalon », on entend une solution d’ETM dont la concentration est connue. Cette concentration est déterminée en amont en fonction de la concentration d’ETM à analyser dans l’échantillon.
Typiquement, lorsque IΈTM à mesurer est en concentration faible, notamment strictement inférieure à 10 ppb (« gamme basse »), on utilise deux solutions étalons, par exemple à 2 et 4 ppb d’ETM.
Typiquement, lorsque IΈTM à mesurer est en concentration plus importante, notamment supérieure ou égale à 10 ppb (« gamme haute »), par exemple comprise entre 10 et 20 ppb, on utilise deux solutions étalons, par exemple à 10 et 20 ppb d’ETM.
L’utilisation d’au moins une solution étalon selon l’invention permet de s’affranchir des effets de matrice. Le procédé microfluidique selon l’invention est ainsi fiable et reproductible. En outre, il peut être mis en place sur tout type de fluide, et ne nécessite pas de calibration préalable. Un tel procédé repose ainsi sur des ajouts dosés d’ETM dans l’échantillon.
Selon une variante de réalisation, il est possible de fixer la valeur discriminante entre la gamme basse et la gamme haute par rapport à la valeur règlementaire de IΈTM à mesurer. Lorsque la concentration d’ETM dans l’échantillon est mesurable en gamme basse, il n’est pas nécessaire d’obtenir sa concentration spécifique : le simple fait de pouvoir mesurer la concentration d’ETM en gamme basse signifie que cette dernière est inférieure à la valeur discriminante, et donc à la valeur règlementaire.
Selon un premier mode de réalisation, le procédé selon l’invention peut comprendre, dans l’étape c), la détection de IΈTM dans la gamme haute ou dans la gamme basse. Selon ce premier mode, typiquement, la concentration de IΈTM n’est pas mesurée précisément. Le dosage comprend alors seulement la détection de IΈTM dans la gamme haute (gamme de concentrations supérieures ou égales à 10 ppb) ou dans la gamme basse (gamme de concentrations inférieures à 10 ppb).
Selon un second mode de réalisation, le procédé selon l’invention peut comprendre, dans l’étape c), la détection de IΈTM dans la gamme haute ou dans la gamme basse, puis la mesure de concentration de IΈTM au sein de cette gamme. Le dosage comprend alors la détection de IΈTM dans la gamme haute ou dans la gamme basse, puis la mesure de concentration de IΈTM au sein de la gamme.
L'invention concerne également un circuit microfluidique d’analyse d’un fluide, notamment apte à la mise en œuvre du procédé selon l’invention, comprenant :
- au moins un réservoir de stockage de réactif(s), de préférence l’acide nitrique et la L-cystéine, et optionnellement au moins un second réservoir de stockage comprenant au moins une solution étalon ;
- au moins une première puce microfluidique, dite puce de prémélange, comprenant au moins un premier microcanal relié fluidiquement :
o à une première extrémité, aux deux réservoirs et à une entrée, et o à la seconde extrémité, à une cuve,
ladite entrée convenant à l’injection d’un échantillon de fluide à analyser ; et
- au moins une seconde puce microfluidique, dite puce d’analyse, comprenant au moins un second microcanal relié à la cuve et comprenant au moins deux électrodes, de préférence au moins trois électrodes dont une en or.
La première puce et la seconde puce selon l’invention peuvent également, selon un mode de réalisation, être préparées sur un seul et même substrat. Dans un tel cas, on obtient ainsi une puce unique, comprenant un premier compartiment (correspondant à la puce de prémélange) et un second compartiment (correspondant à la puce d’analyse).
De préférence, le circuit microfluidique comprend, dans la première puce, un premier réseau de microcanaux dans lesquels circulent l’échantillon de fluide à analyser et les réactifs (comme l’acide nitrique et la L-cystéine) ; et dans la seconde puce, un second réseau de microcanaux comprenant au moins 2 électrodes, de préférence au moins trois électrodes.
De préférence, le premier réseau de microcanaux est présent dans une première puce microfluidique, généralement appelée « puce de prétraitement » ou « puce de mélange »; elle sert à mélanger les différents réactifs (tels que l’acide nitrique et la L-cystéine) avec l’échantillon, notamment dans des proportions spécifiques.
De préférence, le second réseau de microcanaux est présent dans une seconde puce microfluidique, généralement appelée « puce d’analyse » ; c’est la puce sur laquelle se fait la détection et la quantification des polluants cibles, grâce à la présence des deux ou trois électrodes, et notamment aussi grâce à la présence de solutions de calibration (ou solutions étalons).
Le circuit selon l’invention, intégré notamment dans des puces telles que décrites ci- avant, permet la mise en œuvre du procédé décrit ci-dessus, de façon particulièrement facile.
Les puces microfluidiques, également appelées « laboratoires sur puce » ou « lab-on-a- chip » selon la terminologie anglo-saxonne parfois utilisée par l’homme du métier, sont des dispositifs miniaturisés d’analyse biologique ou chimique, qui sont constituées d’au moins une plaque de faible épaisseur (de l’ordre de quelques dizaines à quelques centaines de micromètres), constituée de préférence de verre (c’est-à-dire une substance dure, cassante et transparente, de structure vitreuse, essentiellement formée de silicates alcalins, et ayant une résistance chimique élevée), et d’un capot comprenant au moins un canal microfluidique (ou microcanal). Chaque puce est de préférence telle que décrite dans EP2576056.
De préférence, les puces constituant le circuit microfluidique selon l’invention (i.e. puce de prétraitement et puce d’analyse) comportent chacune :
- une plaque,
- un capot comportant au moins un canal microfluidique, et - une couche unique, intermédiaire entre la plaque et le capot, formée d’une matrice inorganique de Si02.
De préférence, la couche unique a une épaisseur comprise entre 100 nm et 10 mm, et préférentiellement comprise entre 300 nm et 400 nm. De préférence, chaque puce comporte au moins un circuit dans le capot et/ou au moins un circuit sur le capot, associé au capot par une matrice inorganique de Si02.
De préférence, les puces microfluidiques selon l’invention sont en verre. En effet, lorsque la plaque et le capot de ladite puce sont en verre, les puces bénéficient intégralement des propriétés exceptionnelles du verre, à savoir :
- une transparence optique élevée permettant de bonnes observations ;
- une résistance mécanique élevée, présentant un module d’Young élevé et une contrainte à la rupture élevée (en fonction du type de verre utilisé) ;
- une porosité faible, ce qui rend la puce parfaitement adaptée à des applications d’analyse chimique dans des conditions de très faible concentration (analyse de toxines faiblement concentrées par exemple) qui évite toute pollution de la part de l’extérieur de la puce et toute fuite de produits dangereux vers l’extérieur ;
- une inertie chimique à la plupart des composés chimiques (à l’exception des dérivés de l’acide fluorhydrique), par exemple tels que les acides concentrés et les solvants non aqueux. On peut donc faire circuler dans les microcanaux diverses solutions chimiques. Par exemple les surfaces des canaux fluidiques sont naturellement hydrophiles suite aux traitements chimiques réalisés pour la fabrication de la puce. Cette spécificité est importante pour l’analyse d’échantillons biologiques. Toutefois, si nécessaire, il est possible aussi de traiter les canaux fluidiques pour les rendre hydrophobes, par circulation d’une solution adaptée. Enfin la puce peut subir des nettoyages chimiques, et peut être biopassivées en surface par une simple circulation de liquide adapté et connu de l’homme du métier, pour obtenir à volonté une biocompatibilité. On voit ici l’avantage du caractère d’inertie chimique de la puce ;
- une isolation électrique importante qui permet notamment un fonctionnement correct des circuits et l’application de champs électriques externes forts (comme dans le cas d’une électrophorèse capillaire sur puce par exemple).
La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante de modes de réalisation préférés, donnés à titre illustratif et non limitatif, et accompagnée de la figure ci-jointe, qui est un plan, en vue de dessus, d'un circuit comprenant les puces microfluidiques permettant la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention. Circuit microfluidiaue
La figure 1 est un plan, en vue de dessus, d'un circuit comprenant les puces microfluidiques permettant de mettre en œuvre un procédé selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention. De préférence ce circuit comprenant les puces microfluidiques convient pour la détection de l’arsenic dans un échantillon de fluide tel que l’eau. Ce plan montre les différents canaux microfluidiques qui sont ménagés à l'intérieur de ce circuit.
Ce circuit est généralement constitué des éléments suivants :
- les réservoirs (R.3, R.4, R.5, R.7 et R.8 à R.13) : ils ont pour rôle de stocker les différentes solutions de réactifs et l’échantillon à analyser.
En particulier, le réservoir R.3 contient l’échantillon à analyser.
Typiquement, le réservoir R.4 est utilisé pour stocker l’acide nitrique (HN03), de préférence de concentration 2,2 M. L’acide nitrique a un rôle double: comme indiqué ci- dessus, il permet de nettoyer le circuit microfluidique, mais également d’acidifier l’échantillon à analyser.
De préférence, le circuit comprend un réservoir R.5, qui contient un mélange d’acide nitrique (notamment à 100 mM) et de L-cystéine (notamment à 15 mM) : il sert de blanc de mesure, ou solution témoin. En d’autres termes, le réservoir R.5 contient un échantillon dénué d’ETM, qui sert de témoin. Il permet de vérifier que le circuit n’a pas été contaminé par l’échantillon à analyser.
Le réservoir R.7 contient de la L-cystéine, de préférence à 50 mM.
De préférence, les réservoirs R.8 à R.1 1 contiennent des solutions de calibration (ou solutions étalons). En particulier, ils contiennent des solutions d’As(lll) de concentrations respectives égales à 14.48, 28.96, 72.40 et 144.80 ppb, acidifiées à l’acide nitrique 10 mM. Ces solutions sont utilisées pour réaliser des ajouts de 2 et 4 ppb d’As(lll), ou de 10 et 20 ppb d’As(lll), dans l’échantillon à analyser (par définition de concentration inconnue), qui dépend de la concentration à analyser. Pour une gamme de concentrations à analyser comprise entre 0 et 10 ppb, les ajouts des solutions à 2 et 4 ppb sont utilisés, tandis que les ajouts des solutions à 10 et 20 ppb sont utilisés pour des concentrations supérieures à 10 ppb.
De préférence, le réservoir R.12 contient une solution aqueuse d’acide sulfurique (H2SO4), de préférence à 100 mM. Il permet notamment le nettoyage de l’électrode de travail de la puce d’analyse, par voie électrochimique entre différentes mesures. Enfin, de préférence, le réservoir R.13 contient un mélange d’acide tétrachloroaurique (HAuCL), de préférence à 2 mM, et d’acide sulfurique (H2SO4), de préférence à 100 mM. Cette solution est utilisée pour régénérer de façon automatique par voie électrochimique l’électrode de travail (notamment en or) de la puce d’analyse, au cas où sa surface se détériorerait.
- les poubelles interne (PI) et externe (PE) :
La poubelle externe contient l’excédent d’échantillon à analyser qui a été injecté dans le système, ou qui a été utilisé pour rincer le réservoir R.3.
La poubelle interne (poubelle munie de bouchon perméable aux gaz), inaccessible à l’utilisateur, contient toutes les solutions contenant des produits chimiques, comme les solutions d’acides, la solution de L-cystéine ou encore le mélange d’acide tétrachloroaurique et d’acide sulfurique.
- la cuve (C) :
Il s’agit d’une cuve à recirculation avec une entrée et une sortie. Elle est utilisée pour chauffer l’échantillon à analyser, en présence de L-cystéine, et ainsi réaliser la conversion d’As(V) en As(lll). Ce chauffage est typiquement réalisé grâce à une résistance chauffante montée sur la cuve.
- les débulleurs (références 8 et 10 sur la figure 1 ) :
Les débulleurs sont indiqués dans un cercle sur la figure. Il y en a un entre le réservoir R.3 et l’électrovanne 1 (débulleur 8) ; et un autre au niveau de la sortie de l’électrovanne 14 (débulleur 10). Ils permettent d’enlever les bulles d’air ou de gaz piégées dans le liquide circulant dans le circuit.
- les électrovannes (EVs), représentées par des croix sur la figure :
Il s’agit de systèmes commandés électriquement, qui permettent le passage ou non du liquide dans le circuit. Ainsi, lorsqu’une électrovanne est ouverte, elle va permettre au liquide de passer à travers, tandis que lorsqu’elle est fermée le liquide est bloqué et ne peut passer.
- les éléments de connexion (tubes, vis, unions, ferrules), représentés par un sablier comme la référence 22 sur la figure 1 :
Ce sont les différents éléments qui permettent de connecter les différentes parties du circuit. Le liquide peut ainsi circuler dans tout le circuit. - une bouteille de gaz (G) :
Une bouteille d’un litre à 12 bars d’azote est utilisée pour générer une pression pour déplacer les différentes solutions dans le système. Préférentiellement, une pression positive de 500 mbars est utilisée tout au long des analyses. Cette bouteille est connectée au circuit par le biais de l’électrovanne 3, ce qui permet l’injection du gaz dans le circuit.
- les puces microfluidiques (50 et 60) :
o puce de prétraitement ou puce de mélange (référence 50 sur la figure 1 ) : Elle permet un prétraitement de l’échantillon, en réalisant les différents mélanges dans les proportions désirées. L’utilisateur est donc affranchi de ces étapes qui sont souvent longues et nécessitent la manipulation de réactifs dangereux, tels que les acides concentrés.
Elle est délimitée, sur la figure, par les entrées 51 à 58, l’entrée 51 étant connectée à l’électrovanne 21 ; et par la sortie du microcanal principal 59 (appelé également « premier microcanal ») sur l’électrovanne 12. Le microcanal principal 59, appelé également « premier microcanal », est le microcanal commençant à l’entrée 51 et se terminant à l’électrovanne 12.
Plus précisément, l’entrée 51 est reliée à la poubelle extérieure PE, via l’électrovanne 21. L’entrée 52 est reliée au réservoir R.4 (contenant l’acide nitrique) via l’électrovanne 7.
Les entrées 53, 56 et 58 ne sont pas reliées. Elles peuvent être prévues notamment pour les cas suivants : une entrée est prévue l’ajout d’un complexant, comme l’EDTA, pour complexer de potentiels interférents métalliques ; une autre entrée est prévue pour diluer l’échantillon avec de l’eau notamment ultrapure, si celui-ci est très concentré et sort de la gamme de linéarité du capteur ; enfin la dernière entrée convient pour une solution d’acide nitrique plus concentrée, qui serait utilisée en cas de dilution, afin de ramener le pH final à une valeur acceptable, par exemple 1.
L’entrée 54 est reliée au réservoir R.3 (contenant l’échantillon à analyser) via l’électrovanne 1.
L’entrée 55 est reliée au réservoir R.4 (contenant l’acide nitrique) via l’électrovanne 6. Enfin, l’entrée 57 est reliée au réservoir R.7 (contenant la L-cystéine) via l’électrovanne 4.
Cette puce 50 a une profondeur de canaux de 50 pm. Typiquement, la longueur entre l’entrée 51 et la sortie 59 est de 142 mm. Le microcanal principal 59 a une largeur typiquement comprise entre 0.7 et 2 mm, de préférence comprise entre 0.7 et 1.5 mm, de préférence égale à 1 mm.
De préférence, le débit du microcanal principal est de 1 1 ml/h pour une pression de 500 mbars.
De préférence, les dimensions des différents canaux de la puce de prétraitement sont les suivants :
Figure imgf000013_0001
De préférence, les dimensions des différents canaux sont choisies de sorte qu’à la sortie du microcanal principal de la puce, les mélanges soient homogènes et dans les proportions ci-dessous :
Figure imgf000013_0002
De préférence, les dimensions de la puce de mélange 50 sont telles que pour un volume total normalisé sortant de la puce (égal à 1 ), le volume d’échantillon à analyser soit de 0,63, le volume d’acide nitrique soit de 0,04 et le volume de L-cystéine soit de 0,32. Dans ce cas, on a une dilution de l’échantillon de 1 ,58 (=1/0.63). o puce d’analyse 60 :
Cette puce 60 comprend un système de trois électrodes, sur lequel les mélanges sortant de la puce de prétraitement 50 sont analysés.
La puce d’analyse 60 est délimitée, sur la figure, par les entrées 61 à 67, l’entrée 61 étant connectée à un débulleur 10 et à l’électrovanne 14, par les entrées 70 à 75 ; et par la sortie du microcanal principal 69 (appelé également « second microcanal ») dans la poubelle interne PI.
Le microcanal principal 69 a une largeur typiquement comprise entre 0.7 et 2 mm, de préférence comprise entre 0.7 et 1.5 mm, de préférence égale à 1 mm.
La puce d’analyse 60 dispose typiquement de 13 entrées (références 61 à 67 et 70 à 75) et une sortie 76. Parmi ces entrées, on a les entrées 70 à 75 reliées aux réservoirs R.8 à R.13, et les entrées 61 à 67.
L’entrée 61 est reliée à un débulleur 10, à l’électrovanne 14 et au réservoir R.4 (contenant l’acide nitrique) via l’électrovanne 20.
L’entrée 62 est reliée au réservoir R.5 (contenant le blanc de mesure) via l’électrovanne 17.
Les entrées 63 à 67 peuvent être reliées à des réservoirs d’eau ultra pure, et/ou pour l’ajout de solutions tampons, comme les acétates ou les phosphates. Ils permettent en effet d’effectuer des mesures sur des échantillons très concentrés, ou à des pH proches du pH de l’eau de boisson, donc sans acidification.
En outre, les réservoirs R.8 à R.1 1 (contenant les solutions de calibration) sont reliés au microcanal principal 69 via, respectivement, les électrovannes 26, 28, 27 et 25.
Le réservoir R.12 (contenant la solution aqueuse d’acide sulfurique) est relié au microcanal principal 69 via l’électrovanne 18.
Enfin, le réservoir R.13 (contenant le mélange d’acide tétrachloroaurique et d’acide sulfurique) est relié au microcanal principal 69 via l’électrovanne 24.
Dans le détail, de préférence, le système de trois électrodes comprend:
une électrode de travail en or de dimension 1 ,06 mm x 1 mm,
une électrode de référence en platine de dimension 2,96 mm x 1 mm, et une contre-électrode en platine de dimension 6,74 mm x 1 mm,
toutes les électrodes étant situées dans le microcanal principal 69 (non représentées sur la figure 1 ). La profondeur (ou largeur) de la puce d’analyse 60 est de 20 pm. La longueur entre l’entrée 61 et la sortie 76 est typiquement de 178 mm, et la largueur du microcanal principal 69 est de 1 mm.
De préférence, le débit moyen en sortie est d’environ 400 mI/h pour une pression de 500 mbars.
Typiquement, l’échantillon provenant de la puce de prétraitement entre par l’un des canaux de cette puce, par exemple l’entrée 61 , tout comme l’acide nitrique du réservoir R.4.
Un autre canal (i.e. l’entrée 62 via l’électrovanne 17) est dédié au blanc de mesure (réservoir R.5) (solution témoin), qui sert de témoin pour s’assurer qu’il n’y a pas de contamination provenant du système.
Les dimensions des différents canaux de la puce d’analyse nécessaires à l’obtention des ratios permettant une LOD satisfaisante sont les suivants :
Figure imgf000015_0001
Typiquement, chaque puce (puce de prétraitement et/ou puce d’analyse) peut être composée de deux plaques superposées, collées l'une à l'autre. Ainsi, chaque puce peut être composée d'une première plaque, qui peut par exemple être une lame transparente de microscope, et d'une seconde plaque dont la face en contact avec la première plaque est gravée de façon à définir des microcanaux entre les deux plaques qui sont superposées et collées l'une à l'autre. La première plaque peut être constituée d'un matériau polymère. Le matériau constituant au moins l'une des deux plaques peut être transparent. Les dimensions des microcanaux sont déterminées en adaptant la largeur et la profondeur des gravures dans la plaque gravée. Il est à noter que des puces microfluidiques fabriquées selon d'autres méthodes connues de l'homme du métier peuvent évidemment être utilisées pour mettre en œuvre l'invention.
En complément des éléments cités ci-dessus, le circuit microfluidique selon l’invention peut être connecté notamment à un moins un élément choisi parmi un dispositif électronique nécessaire pour le fonctionnement du système, une batterie, un potentiostat pour le pilotage des mesures électrochimiques, un système de refroidissement placé sur les puces pour refroidir les solutions provenant de la cuve et un écran notamment tactile qui permet de lancer la mesure souhaitée, de connaître l'état d'avancement de la mesure et de visualiser le résultat obtenu.
Procédé microfluidique
Comme indiqué précédemment, l'invention se rapporte à un procédé microfluidique d'analyse d'un fluide contenant au moins un ETM comprenant les étapes suivantes :
a) introduction d’un échantillon de fluide dans au moins un microcanal d'un circuit microfluidique ;
b) mélange, au sein du microcanal du circuit microfluidique, de l’échantillon de fluide introduit à l’étape a), avec des réactifs, et
c) mesure de la quantité d’ETM présent dans l’échantillon obtenu en b), en utilisant une méthode de détection électrochimique.
De préférence, l’étape c) est effectuée en utilisant au moins 2 électrodes, de préférence au moins 3 électrodes, de préférence au moins 3 électrodes dont une en or.
De préférence, l'invention se rapporte à un procédé microfluidique d'analyse d'un fluide contenant de l’arsenic, comprenant les étapes suivantes :
a) introduction d’un échantillon de fluide dans au moins un microcanal d'un circuit microfluidique ;
b) mélange, au sein du microcanal du circuit microfluidique, de l’échantillon de fluide introduit à l’étape a), avec de l’acide nitrique et de la L-cystéine, et c) mesure de la quantité d’arsenic présent dans l’échantillon obtenu en b), en utilisant une méthode de détection électrochimique.
De préférence, l’étape c) est effectuée en utilisant au moins 2 électrodes, de préférence au moins 3 électrodes, de préférence au moins 3 électrodes dont une en or.
L’étape a) d’introduction d’un échantillon de fluide dans au moins un microcanal d'un circuit microfluidique est de préférence effectuée selon les sous-étapes suivantes :
a1 ) injection de l’échantillon dans le circuit microfluidique ; puis
a2) mise sous pression de l’échantillon dans le circuit.
L’injection de l’échantillon dans le circuit microfluidique (sous-étape a1 ) est notamment effectuée en injectant ledit échantillon dans l’entrée du premier microcanal de la première puce du circuit selon l’invention. Notamment, cette étape est effectuée à l’aide d’une seringue munie d’un filtre 0,45 pm. Le filtre permet d’éliminer toutes les matières en suspension ayant un diamètre supérieur à 0,45 pm.
Plus précisément, en se référant à la figure, initialement les électrovannes 9, 16 et 30 sont ouvertes. L’électrovanne 9 laisse passer l’échantillon (E) vers le réservoir R.3. Une partie de cet échantillon est utilisée pour rincer le réservoir et va vers la poubelle externe PE à travers les électrovannes 16 et 30, tandis que le reste de l’échantillon reste dans le réservoir R.3 et sert pour l’analyse.
Typiquement, cette opération peut durer quelques minutes ou secondes, puis les électrovannes 9, 16 et 30 sont fermées.
Ensuite, ledit échantillon est mis sous pression (sous-étape a2). La mise sous pression de l’échantillon peut être effectuée par n’importe quel moyen, par exemple par injection d’un gaz, notamment inerte, ou bien par aspiration. Par exemple, la mise sous pression peut être effectuée grâce à une pompe ou une seringue. Grâce à sa mise sous pression, l’échantillon est mis en mouvement.
Par exemple, l’échantillon est stocké dans un réservoir (R.3) connecté à un microcanal du circuit microfluidique. De préférence, il est stocké dans un réservoir (R.3) connecté au premier microcanal de la première puce, et la mise sous pression du réservoir R.3 est réalisée notamment par l’ouverture d’une électrovanne (l’électrovanne 3), qui est reliée à la bouteille d’azote gazeux (G). De préférence, les autres réservoirs, excepté le réservoir R.3, sont toujours sous pression pendant tout le procédé (i.e. avant et après la mesure). L’électrovanne 3 reste ouverte le temps de l’analyse ; elle est fermée à la fin de la mesure.
Entre les étapes a) et b) du procédé selon l’invention, une étape N) peut être réalisée : c’est l’étape de nettoyage.
Cette étape N comprend de préférence au moins une, de préférence au moins deux, de préférence au moins trois, de préférence les quatre sous-étapes suivantes :
N1 : une sous-étape de nettoyage du circuit microfluidique ; et/ou
N2 : une sous-étape de nettoyage des électrodes de mesure, notamment de l’électrode en or ; et/ou
N3 : une sous-étape de dépôt d’or par voie électrochimique ; et/ou
N4 : une sous-étape de contrôle, notamment par mesure d’une solution témoin.
De préférence, la sous-étape N1 est effectuée comme suit :
Les électrovannes 1 , 21 et 30 sont ouvertes. Le canal d’entrée de l’échantillon dans la puce de prétraitement 50 (entrée 54 de la puce de prétraitement) est nettoyé avec l’échantillon, puis la fraction l’échantillon ayant servi au nettoyage est renvoyée vers la poubelle externe, notamment à travers les électrovannes 21 et 30. Cette opération dure typiquement environ 30 secondes, ensuite les électrovannes sont fermées.
Par la suite, les électrovannes 2, 5 et 29 sont ouvertes. L’échantillon est poussé vers la cuve, notamment à travers l’électrovanne 2, et acheminé vers la poubelle interne, notamment grâce aux électrovannes 5 et 29. Cette opération dure typiquement 30 secondes, puis les électrovannes sont fermées.
Par la suite la cuve est vidée, notamment à l’aide des électrovannes 15, 13 et 30. L’électrovanne 15 envoie le gaz G (comme l’électrovanne 3) dans la cuve ; le gaz exerce alors une pression sur le liquide contenu dans la cuve, et le pousse vers la poubelle externe, notamment en passant par les électrovannes 13 et 30. Cette opération dure typiquement 15 secondes, puis les électrovannes sont fermées.
De préférence, la sous-étape N2 est effectuée comme suit :
De préférence, au moins une électrode utilisée dans l’étape c) du procédé selon l’invention, dite électrode de travail, est en or. Dans ce cas, il est préférable de la nettoyer avant toute mesure, pour éliminer de potentiels oxydes formés à sa surface au cours du temps, ou pour éliminer les traces d’ETM (arsenic notamment) restées au cours de la précédente mesure sur l’électrode.
Pour cela, l’acide sulfurique (contenu dans le réservoir R.12) est utilisé pour nettoyer l’électrode en or présente dans le microcanal principal 69 de la puce d’analyse 60, notamment par voltammétrie (voltampérométrie) cyclique. Les électrovannes 18 et 29 sont ouvertes pour laisser passer cet acide. Le cyclage est typiquement réalisé entre -0,4 et 1 ,5 V à 200 mV/s. Cette opération dure en général 3 minutes, puis les électrovannes sont fermées.
De préférence, la sous-étape N3 est effectuée comme suit :
Le but de cette sous-étape N3 est d’augmenter la surface électrochimiquement active de l’or, obtenue par dépôt électrochimique sous vide.
La surface de mesure ne sera alors plus plane, mais en relief (en 3D), car le dépôt électrochimique conduit à une surface non plane. Pour ce faire, en général les électrovannes 24 et 29 sont ouvertes pendant environ 3 minutes, le mélange d’acide tétrachloroaurique et d’acide sulfurique du réservoir R.13 est alors libéré dans l’entrée 74 puis dans le microcanal principal 69, et le dépôt d’or se fait par chronoampérométrie pendant environ 300 secondes au potentiel de pic de dépôt de Au(lll) sur l’électrode de travail. Ce potentiel est déterminé par voltammétrie cyclique. Le dépôt d’or peut aussi être réalisé lorsqu’après un certain nombre de mesures la surface d’or active est réduite, ce qui se traduit par une diminution de l’aire de pic de réduction des oxydes d’or par mesure en voltammétrie cyclique. Dans ce cas, le système lance de façon automatique un dépôt d’or pour procéder à une régénération.
De préférence, la sous-étape N4 est effectuée comme suit :
Une mesure de la solution témoin (blanc) peut être réalisée pour vérifier la propreté du circuit préalablement nettoyé. Pour cela, les électrovannes 17 et 29 sont généralement ouvertes pendant environ 5 minutes. L’analyse du blanc (solution témoin) (contenu dans le réservoir R.5) se fait typiquement par SW V (Square Wave Voltammetry, ou voltammétrie à ondes carrées en français).
Le contenu du réservoir R.5 est libéré dans l’entrée 62 puis dans le microcanal principal 69, pour être mesuré, avant d’être éliminé dans la poubelle interne.
L’analyse du blanc se fait avec un potentiel de dépôt (Edep) de -1 ,1 V, pendant 90 secondes (Tdep), avec une amplitude de 0,02 V. Le signal est enregistré entre -0,2 et 0,7 V. Si un pic apparaît, alors les sous-étapes N1 à N3 sont relancées, de préférence de façon automatique, sinon on passe à l’étape b) du procédé selon l’invention. Une fois l’échantillon introduit, et l’(es) éventuelle(s) étape(s) de nettoyage effectuée(s), s’ensuit la deuxième étape (étape b) : le mélange, au sein du microcanal du circuit microfluidique, de l’échantillon avec des réactifs, de préférence l’acide nitrique et la L- cystéine.
Typiquement, lors de cette étape b), les deux réactifs notamment présents dans les deux réservoirs reliés fluidiquement à une extrémité de la première puce sont libérés dans le premier microcanal de ladite première puce, et se mélangent à l’échantillon injecté dans l’entrée.
De préférence, le mélange obtenu est ensuite acheminé dans une cuve, de préférence dans la cuve reliée à la seconde extrémité du premier microcanal de la première puce.
De préférence, le premier microcanal de la première puce est le microcanal principal (microcanal 59 sur la figure 1 ), et a une largeur typiquement comprise entre 0.7 et 2 mm, de préférence comprise entre 0.7 et 1.5 mm, de préférence égale à 1 mm ; et une longueur typiquement comprise entre 30 et 60 pm, de préférence entre 40 et 55 pm.
De préférence, le débit du microcanal de la première puce est de 1 1 ml/h pour une pression de 500 mbars.
Typiquement, lors de cette étape b), on ouvre les électrovannes 4, 1 , 5, 6, 12 et 29. L’échantillon, l’acide nitrique et la L-cystéine sont ainsi mélangés dans les proportions désirées grâce à la puce de mélange 50 puis acheminés dans la cuve à travers l’électrovanne 12. Cette opération dure généralement quelques minutes, typiquement de 2 à 5 minutes, de préférence de 2 à 3 minutes, plus préférentiellement 2 minutes et 15 secondes, puis les électrovannes sont refermées.
Ensuite, on rince les tubes de connexion et la cuve avec l’échantillon prétraité.
Par suite, on ouvre les électrovannes 1 1 , 15 et 29, notamment pendant 15 secondes. L’échantillon prétraité est ainsi acheminé vers la poubelle interne.
On remplit à nouveau la cuve en ouvrant les électrovannes 4, 1 , 5, 6, 12 et 29, généralement pendant quelques minutes, typiquement de 2 à 5 minutes, de préférence de 2 à 3 minutes, plus préférentiellement 2 minutes et 15 secondes, puis on achemine l’échantillon prétraité, cette fois-ci, vers la puce d’analyse 60 en ouvrant les électrovannes 14, 15 et 29. De préférence, les dimensions des différents canaux sont choisies de sorte qu’à la sortie du microcanal principal 59 de la puce 50, les mélanges soient homogènes et dans des proportions spécifiques.
En particulier, le mélange d’échantillon, d’acide nitrique (à 2,2 mM) et de L-cystéine (à 50 mM) est réalisé dans un ratio volumique respectif de 0,6-0, 7 : 0,03-0,05 : 0,25-0,40. De préférence, ce ratio volumique respectif est égal à 0,63 : 0,04 : 032.
Enfin, une fois l’échantillon mélangé avec des réactifs, de préférence l’acide nitrique et la L-cystéine, le procédé comprend une étape c) de mesure de la quantité d’ETM présent dans l’échantillon obtenu en b), en utilisant au moins 3 électrodes dont une en or.
L’étape c) comprend de préférence la circulation de l’échantillon obtenu en b), depuis la cuve à travers le second microcanal de la puce d’analyse, comprenant au moins trois électrodes dont une en or.
De préférence, le second microcanal de la seconde puce (puce d’analyse) est le microcanal principal (microcanal 69 sur la figure 1 ), et a une largeur typiquement comprise entre 0.1 et 2 mm, de préférence comprise entre 0.12 et 1.5 mm; et une longueur typiquement comprise entre 5 et 80 mm, de préférence comprise entre 9 et 60 mm.
Typiquement, lors de l’étape c), l’échantillon obtenu en b) (appelé également échantillon prétraité), une fois dans la puce d’analyse 60, est analysé en utilisant au moins 3 électrodes dont une en or.
De préférence, lors de l’étape c), au moins une solution étalon est mélangée avec l'échantillon obtenu en b).
Plus spécifiquement, dans le cas de l’arsenic, lors de l’étape c), l'échantillon prétraité est analysé en utilisant au moins 3 électrodes dont une en or, et selon les sous-étapes suivantes :
c1 ) mesure de la quantité d’arsenic (III) présent dans l'échantillon, appelée As(lll), puis c2) conversion de l’arsenic (V) restant dans l’échantillon en arsenic (III), puis mesure de la quantité d’arsenic (III) obtenue, appelée As tôt, et enfin
c3) la détermination de la quantité d’arsenic effectivement présente dans l’échantillon par la formule As(V) = As tôt - As(lll).
Tout d’abord, la quantité d’As(lll) est déterminée ; c’est l’étape c1 ). De préférence, cette étape c1 ) fait intervenir au moins une solution étalon. De préférence, l’étape c1 ) comprend le mélange de l’échantillon obtenu en b) avec au moins une solution étalon, de préférence deux solutions étalons de concentrations différentes, puis la détermination de la concentration en As(lll) présente dans l’échantillon. Par « solution étalon », on entend une solution comprenant une concentration connue d’As(lll). Par exemple, on peut utiliser une première solution étalon comprenant une concentration en As(lll) comprise entre 5 et 15 ppb, et une seconde solution étalon comprenant une concentration en As(lll) comprise entre 15 et 25 ppb ; ou bien on peut utiliser une première solution étalon comprenant une concentration en As(lll) comprise entre 1 et 3 ppb, et une seconde solution étalon comprenant une concentration en As(lll) comprise entre 3 et 5 ppb
De préférence, la quantité d’As(lll) est mesurée en faisant circuler l’échantillon obtenu en b) par SWV, notamment avec les mêmes paramètres électrochimiques que la solution témoin (blanc), à l’exception de Tdep (temps de dépôt), à savoir un potentiel de dépôt (Edep) de -1 ,1 V, pendant 120 secondes (Tdep), avec une amplitude de 0,02 V, et le signal est enregistré entre -0,2 et 0,7 V.
La moyenne de l’aire (Amoy) du pic mesurée au cours de la désorption de l’arsenic sur l’électrode en or est comparée à des valeurs seuils.
En particulier :
- si 3x103 pAV < Amoy < 3x102 pAV, alors le système ouvre les électrovannes 27 et 25, qui fournissent des concentrations d’ajouts (solutions étalons) dans le mélange de 10 et 20 ppb respectivement (i.e. réservoirs R.10 et R.1 1 ). A chaque ajout, Amoy (ajout) est mesuré. Ainsi, les valeurs de Amoy, Amoy (ajoutl ) et Amoy (ajout2) sont utilisés pour déterminer la concentration de l’As(lll) dans l’échantillon ;
- si Amoy < 3x103 pAV, alors on refait la mesure d’Amoy en utilisant un temps de dépôt de 360 secondes. Dans ce cas, si le signal obtenu donne une Amoy< 3x10-4 pAV, alors l’échantillon contient de l’As(lll) en concentration inférieure à la limite de quantification de 0,85 ppb. A l’opposé, si Amoy > 3x10-4 pAV, alors le système ouvre les électrovannes 26 et 28, qui fournissent des concentrations d’ajouts dans le mélange de 2 et 4 ppb respectivement (i.e. réservoirs R.8 et R.9). A chaque ajout, Amoy (ajout) est mesuré. Ainsi, les valeurs de Amoy, Amoy (ajoutl ) et Amoy (ajout2) sont utilisés pour déterminer la concentration de l’As(lll) dans l’échantillon ; - si Amoy > 3x102 pAV, l’échantillon est dilué de façon automatique au niveau de la puce de prétraitement 50, et en fonction de Amoy mesuré. Ensuite, un Tdep de 360 secondes ou de 120 secondes est appliqué.
Ensuite, la quantité d’As(V) est déterminée ; c’est l’étape c2).
La mesure de l’As(V) est obtenue de façon indirecte en faisant la soustraction du contenu en As(lll) réel par rapport au contenu en arsenic total (As tôt) (soit As(V) = As tôt - As(lll)). L’arsenic total (As tôt) est obtenu en convertissant tout l’As(V) en As(lll).
Pour convertir l’arsenic (V) en arsenic (III), de préférence une étape d’incubation de l’échantillon obtenu en b) a lieu dans la cuve, préférentiellement par chauffage. Typiquement, cette étape d’incubation est effectuée pendant quelques minutes.
Pour cela, lorsque le mélange se trouve dans la cuve, les électrovannes sont fermées, et la cuve est chauffée à l’aide de la résistance chauffante, notamment pendant 10 minutes. Ainsi tout l’As(V) est transformé en As(lll), qui, combiné à l’As(lll) déjà présent dans l’échantillon, donne la quantité d’arsenic totale. Ce mélange est par la suite acheminé dans la puce d’analyse 60 comme précédemment décrit (i.e. en ouvrant les électrovannes 14, 15 et 29), pour être dosé. La puce d’analyse 60, disposant d’un système de refroidissement, permet de refroidir le mélange autour de 22-23°C, puis d’effectuer la mesure en As(lll), de la même façon que décrit ci-dessus.
Enfin, typiquement, après analyse, les électrovannes 7, 12, 5 et 29 sont ouvertes, notamment pendant 30 secondes, pour nettoyer la cuve et les microcananux contenant de l’acide nitrique. L’acide nitrique restant dans la cuve est utilisé pour nettoyer la puce d’analyse 60, typiquement en ouvrant les électrovannes 14, 15 et 29, pendant environ 30 secondes. Cette puce est nettoyée à nouveau, puis remplie d’acide nitrique pour stockage, généralement pendant 30 minutes, en ouvrant les électrovannes 20 et 29.
L’invention est maintenant illustrée par l’exemple suivant.
Exemple 1 : mise en œuyre du procédé selon l’invention pour mesurer le taux d’arsenic dans un échantillon d’eau
Des analyses d’échantillons d’eau dopés à l’arsenic ont été effectuées. Le choix s’est porté sur l’eau ulptrapure et deux eaux minérales (Volvic et Evian). Avant analyse, ces eaux sont analysées au préalable par ICP-MS pour s’assurer qu’elles ne contiennent pas d’arsenic, ou bien que la quantité d’arsenic contenue est inférieure à la limite de quantification de l’instrument utilisée (0,1 ppb). Par la suite, ces eaux à analyser sont dopées avec 10 ppb de As(lll) pour obtenir une eau ultrapure contenant 10 ppb de As(lll) et deux échantillons d’eau minérale contenant chacun 10 ppb. Le choix de 10 ppb de As (III) est relatif à la norme de l’OMS qui fixe les seuils d’arsenic dans l’eau potable à 10 ppb. As(lll) est choisi dans ce test car c’est la forme la plus toxique d’arsenic. Pour l’analyse, 40 mL d’échantillon d’eau à l’As(lll) sont injectés à l’aide d’une seringue dans le système microfluidique d’analyse selon l’invention. Le procédé selon l’invention est mis en œuvre pour l’analyse de ces échantillons tour à tour sur la puce en verre. La réponse des capteurs est enregistrée en triplicate pour chaque échantillon et les résultats ci-dessous sont obtenus :
Figure imgf000024_0001
L’arsenic introduit est quasiment totalement détecté par le procédé décrit ici.
En conclusion, le procédé selon l’invention peut être utilisé de façon efficace pour la détection automatique des ETM dans l’eau.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé microfluidique d'analyse d'un fluide contenant au moins un élément-trace métallique comprenant les étapes suivantes :
a) introduction d’un échantillon de fluide dans au moins un microcanal d'un circuit microfluidique ;
b) mélange, au sein du microcanal du circuit microfluidique, de l’échantillon de fluide introduit à l’étape a), avec des réactifs, et
c) mesure de la quantité d’élément-trace métallique présent dans l’échantillon obtenu en b), en utilisant une méthode de détection électrochimique,
ladite étape c) comprenant le mélange de l’échantillon obtenu en b) avec au moins une solution comprenant une concentration connue en élément-trace métallique, puis le dosage de l’élément-trace métallique par méthode de détection électrochimique.
2. Procédé microfluidique selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l’élément-trace métallique est l’arsenic, et en ce que le procédé comprend les étapes suivantes :
a) introduction d’un échantillon de fluide dans au moins un microcanal d'un circuit microfluidique ;
b) mélange, au sein du microcanal du circuit microfluidique, de l’échantillon de fluide introduit à l’étape a), avec de l’acide nitrique et de la L-cystéine, et
c) mesure de la quantité d’arsenic présent dans l’échantillon obtenu en b), en utilisant une méthode de détection électrochimique, de préférence au moins 2 électrodes, de préférence au moins 3 électrodes dont une en or.
3. Procédé microfluidique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la mesure de l’étape c) est effectuée en utilisant les trois électrodes suivantes :
- une électrode en or, comme électrode de travail,
- une électrode en platine, comme électrode de référence, et
- une contre-électrode en platine.
4. Procédé microfluidique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape a) est effectuée selon les sous-étapes suivantes :
a1 ) injection de l’échantillon dans le circuit microfluidique ; puis
a2) mise sous pression de l’échantillon dans le circuit.
5. Procédé microfluidique selon l’une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que, entre les étapes a) et b), une étape de nettoyage N) est réalisée et comprend de préférence au moins une, de préférence au moins deux, de préférence au moins trois, de préférence les quatre sous-étapes suivantes :
N1 : une sous-étape de nettoyage du circuit microfluidique ; et/ou
N2 : une sous-étape de nettoyage des électrodes, notamment de l’électrode en or ; et/ou
N3 : une sous-étape de dépôt d’or par voie électrochimique ; et/ou
N4 : une sous-étape de contrôle, notamment par mesure d’une solution témoin.
6. Procédé microfluidique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le circuit microfluidique comprend :
- au moins un réservoir de stockage de réactif (s), de préférence l’acide nitrique et la L- cystéine et optionnellement au moins un second réservoir de stockage comprenant au moins une solution étalon ;
- au moins une première puce microfluidique, dite puce de prémélange, comprenant au moins un premier microcanal relié fluidiquement :
o à une première extrémité, aux deux réservoirs et à une entrée, et o à la seconde extrémité, à une cuve,
ladite entrée convenant à l’injection de l’échantillon; et
- au moins une seconde puce microfluidique, dite puce d’analyse, comprenant au moins un second microcanal relié à la cuve et comprenant au moins deux électrodes, de préférence au moins trois électrodes dont une en or.
7. Procédé microfluidique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu’il comprend deux réservoirs de stockage de deux réactifs distincts et en ce que, lors de l’étape b), les deux réactifs présents dans les deux réservoirs reliés à une extrémité de la première puce sont libérés dans le premier microcanal de ladite première puce, et se mélangent à l’échantillon injecté dans l’entrée, et de préférence le mélange obtenu est ensuite acheminé dans une cuve, de préférence dans la cuve reliée à la seconde extrémité du premier microcanal de la première puce.
8. Procédé microfluidique selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que le mélange d’échantillon, d’acide nitrique utilisé à 2,2 mM et de L-cystéine utilisée à 50 mM de l’étape b) est réalisé dans un ratio volumique respectif de 0,6-0, 7 : 0,03-0,05 : 0,25-0,40, de préférence ce ratio volumique respectif est égal à 0,63 : 0,04 : 032.
9. Procédé microfluidique selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que l’étape c) comprend :
c1 ) mesure de la quantité d’arsenic (III) présent dans l’échantillon, appelée As(lll), puis c2) conversion de l’arsenic (V) restant dans l’échantillon en arsenic (III), puis mesure de la quantité d’arsenic (III) obtenue, appelée As tôt, et enfin
c3) la détermination de la quantité d’arsenic effectivement présente dans l’échantillon par la formule As(V) = As tôt - As(lll).
10. Procédé microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l’étape c) comprend le mélange de l’échantillon obtenu en b) avec au moins deux solutions comprenant chacune une concentration connue en élément-trace métallique, puis le dosage de l’élément-trace métallique par méthode de détection électrochimique.
1 1. Procédé microfluidique selon la revendication 10, caractérisé en ce que les deux solutions comprenant chacune une concentration connue en élément-trace métallique présentent une concentration inférieure à 10 ppb, par exemple à 2 et 4 ppb ; ou bien une concentration supérieure ou égale à 10 ppb, par exemple comprise entre 10 et 20 ppb, par exemple à 10 et 20 ppb.
12. Procédé microfluidique selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce que le dosage de l’élément-trace métallique comprend seulement sa détection dans la gamme de concentrations inférieures à 10 ppb ou dans la gamme de concentrations supérieures ou égales à 10 ppb.
13. Circuit microfluidique d’analyse d’un fluide, notamment apte à la mise en œuvre du procédé selon l’une des revendications 2 à 12, comprenant :
- au moins deux réservoirs de stockage de l’acide nitrique et de la L-cystéine ;
- au moins une première puce, dite puce de prémélange, comprenant au moins un premier microcanal relié fluidiquement :
o à une première extrémité, aux deux réservoirs et à une entrée, et o à la seconde extrémité, à une cuve,
ladite entrée convenant à l’injection d’un échantillon de fluide à analyser ; et
- au moins une seconde puce, dite puce d’analyse, comprenant au moins un second microcanal relié à la cuve et comprenant au moins trois électrodes dont une en or.
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