WO2020058076A1 - Optische anordnung für fluoreszenzmikroskopische anwendungen - Google Patents

Optische anordnung für fluoreszenzmikroskopische anwendungen Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to an optical arrangement for fluorescence microscopic applications using non-classical light.
  • the area of application is in
  • the light sheet can be formed by a line focus, a line image or a laterally scanning laser beam. Only in this light sheet can fluorescence molecules be excited by two-photon absorption and thus show fluorescence. Disadvantage of the method is the need for illumination with very high-intensity continuous wave lasers or laser systems for ultra-short laser pulses. In both cases, the sample is irradiated with high-intensity laser radiation or even laser pulses and exposed to a high radiation dose with high energy. This leads to the fading of the fluorescence as well as to phototoxicity, especially with biological samples. Here, too, the two-photon absorption probability and thus also the fluorescence intensity depend quadratically on the current stimulus. intensity. c.
  • Possibilities for photon pair fluorescence microscopy are also known from US Pat. No. 5,796,477 B.
  • the two-photon absorption is not stimulated by high-intensity or pulsed lasers, but by photon pairs from two correlated (in space, time, impulse and / or energy) photons. These can be generated in particular by spontaneous difference frequency conversion in a nonlinear crystal outside the sample.
  • Those with the photons can be spatially separated from one another during their movement from the photon pair source to the respective sample. If they have a different wavelength, this can be achieved with a dichroic mirror. If they have opposite polarization, they can be spatially separated by a polarization beam splitter.
  • both photons leave a crystal with nonlinear optical properties spatially separated and are therefore spatially separated.
  • the two photon beams are then focused crosswise into the sample.
  • the two-photon absorption can then take place in the overlap region of the photons meeting in the focus.
  • the two-photon absorption and thus the fluorescence intensity are linearly proportional to the current excitation intensity.
  • Another advantage is that the focal volume compared to that in a. described method can be smaller.
  • a disadvantage of this method is the complex experimental setup, since it must be ensured that both photons of a pair arrive at the beam overlap volume at exactly the same time and meet within the sample. This can be difficult due to the very short coherence time and possibly different but correlated wavelength of the two photons. A very precise adjustment, which is at the expense of flexibility and practicality, is therefore necessary.
  • the method proposed here is based on the use of a preferred collinear source from which in particular photon pairs or else multi-photon states are emitted simultaneously on a sample and since the principle of light-sheet microscopy can be used.
  • a source of non-classical light emits multiphoton beams, but at least photon pair beams from in particular photon pairs or else multi-photon states, preferably in collinear geometry. This can be done by spontaneous difference frequency conversion / spontaneous parametric fluorescence in a nonlinear, also periodically poled optical crystal.
  • the multiphoton beam (s) pass through a first optical system onto a sample, so that a light sheet or a light sheet-like shape is formed.
  • the light sheet or the light sheet-like shape can be designed as a line focus that is constant over time, but also as a photon beam scanned in the light sheet plane, or can be composed by the chronological sequence of small partial light sheets.
  • a suitable first optical system can be a lens or a photon reflecting optical element or polarization optics or an optical filter or any arrangement of several of these optical elements.
  • a light sheet or a light sheet-like shape can also be achieved by moving an optical element, which can be part of the first optical system.
  • an optical element which can be part of the first optical system.
  • a photon reflecting the element can be pivoted about an axis of rotation and thus the position on the sample at which the photon pairs meet at the same time can be changed, in a similar manner to that which is possible with the known scanner mirrors in laser technology.
  • a simultaneous absorption of several photons, in particular of photon pairs, and thus fluorescence excitation is possible only in the region of the sample which is illuminated in the region of the light sheet or the light sheet-like shape.
  • Part of the fluorescence radiation becomes optional
  • the second optical system can be an optical lens or a fluorescent radiation reflecting element or polarization optics or an optical filter or any arrangement of several of these optical elements.
  • a detector system should enable a spatially resolved measurement of the fluorescence radiation that has been excited within the light sheet.
  • the detector system can be a camera with sufficient sensitivity. Examples of this are a CCD, EMCCD, ICCD, CMOS camera, SPAD array. It can include an optical filter or a second optical system.
  • the second optical system and the detection system can also be designed as a unit.
  • a plurality of photon beams can also be used, so that fluorescence can be excited simultaneously in several light sheets or in areas with a light sheet-like shape on the sample.
  • the excitation of the fluorescence can also be done explicitly by multiphoton absorption of multi-photon states, in particular of photon pairs that strike a sample at the same time.
  • multiphoton states can e.g. can be realized by so-called N00N states, in which case an N-photon absorption takes place.
  • a source of non-classical light can be, for example, a non-linear crystal pumped by a laser or another source of photon pairs or multiphoton states, such as a laser-pumped waveguide structure in a non-linear crystal, or at least two identical coherently pumped quantum dots.
  • the solution according to the invention has several advantages over the prior art for fluorescence microscopy by means of multiphoton absorption. Since the fluorescence intensity scales linearly with the current illumination intensity, the radiation dose of the sample can be reduced while the signal yield remains the same, or the signal strength and image contrast of the fluorescence radiation detected with the detection system can be increased while the radiation dose remains constant.
  • the process is extremely gentle, without unnecessary light exposure of the sample and thus allows long-term studies of photosensitive samples, since both fluorescence bleaching and phototoxic can be minimized.
  • the structure is significantly simplified and more robust, so that a cost reduction and improvement of the axial resolution can be achieved.
  • the collinear structure is compatible and can be implemented with existing light sheet microscope systems.
  • Multiphoto NEN radiation can be focused with photons of a certain center wavelength to focal volumes that are otherwise only achievable with laser light of half the wavelength.
  • the axial resolution of the detectable fluorescence radiation within the respective light sheet can thus be increased. Overall, increased efficiency, increased spatial resolution and increased penetration depth are possible.
  • the linear relationship between fluorescence intensity and photon beam intensity is also advantageous for data evaluation, since there is a linear relationship between the measurement variable (fluorescence signal) and excitation variable (radiation dose).
  • FIG. 1 shows how a photon pair beam 2 is directed from a collinear source of non-classic light 1 to a first optical system 3.
  • the first optical system 3 can be designed as defined in the claims.
  • the photon pair beam 2 influenced by the first optical system 3 is directed onto / into the sample 5 such that at least one one-dimensional linear movement of the position at which the photon pair beam 2 hits the sample 5 or enters the sample to form a light sheet 4 he follows.
  • the movement can be achieved by a movement of the element reflecting the photons, in particular by means of a pivoting movement about an axis of rotation of a reflecting element.
  • Fluorescence radiation 6 generated in this way strikes a second optical system 7, which is also designed as defined in the claims.
  • Detector system 8 is a spatially resolved detection of fluorescence radiation, which can be evaluated by fluorescence microscopy.

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Abstract

Bei der optischen Anordnung für fluoreszenzmikroskopische Anwendungen ist/sind von einer Quelle nichtklassischen Lichtes ein oder mehrere Multiphotonenstrahlen, aber mindestens ein oder zwei Photonenpaarstrahlen auf ein erstes optisches System, bestehend aus einer Anordnung aus mindestens einer Linse oder einem Photonen reflektierenden Element oder einem anderem strahlformenden Element oder einer Kombination dieser, gerichtet ist. Das erste optische System (3) ist ausgebildet, das nichtklassische Licht zu einem Lichtblatt (4) oder einer lichtblattartigen Form zu formen und von dort auf eine Probe (5) zu richten, so dass mit den mehreren gleichzeitig auf/in der Probe auftreffenden Mehrphotonenzuständen Fluoreszenzstrahlung mittels Mehrphotonenabsorption angeregt wird. Durch Anregung erhaltene Fluoreszenzstrahlung (6) trifft mittels eines zweiten optischen Systems (7) auf ein Detektionssystem (8) auf, das zur ortsaufgelösten Erfassung von Fluoreszenzstrahlung ausgebildet ist.

Description

OPTISCHE ANORDN UNG FÜR FLUORESZENZM I KROSKOPISCHE
ANWENDUNGEN
Die Erfindung betrifft eine optische Anordnung für fluoreszenzmikroskopische Anwendungen mittels nichtklassischem Licht. Das Anwendungsgebiet liegt im
Bereich der Fluoreszenzmikroskopie und M ultiphotonenabsorptionsanalyse. Dies ist zum Beispiel für die mikroskopische Untersuchung von bio
chemischen Proben in den Lebenswissenschaften und der Medizin von großer Bedeutung, aber auch für chemisch-materialanalytische Untersuchungen von Stoffen.
Dabei erfolgt die Anregung und Detektion von Fluoreszenzlicht mittels M ulti-, insbesondere Zweiphotonenabsorption von Photonenpaaren für Anwendun gen, die analog zur Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden können. Es existieren bereits verschiedene Lösungsansätze, die aber alle mit prinzipiel len Nachteilen behaftet sind. Diese bereits bekannten Lösungen lassen sich prinzipiell in drei Kategorien einteilen: a. Zweiphotonenfluoreszenzmikroskpie mit klassischem Licht, wie sie in US 5,503,613 B und US 6,020591 B offenbart sind. Dabei wird die Zweiphoto nenabsorption mittels Dauerstrichlaser mit sehr hoher Intensität oder mit gepulsten Lasern mit Pulsen im Pico- oder Femtosekundenbereich realisiert. Die Zweiphotonenabsorptionswahrscheinlichkeit und somit auch die Fluores zenzintensität hängen dabei quadratisch von der momentanen Anregungsin tensität ab. Die anregende Laserstrahlung wird zur Verbesserung der Absorp tionswahrscheinlichkeit fokussiert. In der klassischen Zweiphotonenfluores zenzmikroskopie wird der Fokus axial entlang der optischen Achse des Sys tems ausgebildet. Nur im Fokus können Fluoreszenzmoleküle per Zweiphoto nenabsorption angeregt werden und somit Fluoreszenz zeigen. Es wird jedoch der gesamte Probenbereich entlang der optischen Achse mit einer hohen Strahlungsdosis und entsprechend hoher Energie beaufschlagt. Dies führt so wohl zum Ausbleichen der Fluoreszenz, als auch zu Phototoxizität, besonders bei biologischen Proben. b. Eine alternative Lösung ist der Zweiphotonen-Lichtblattmodus. Hierbei ist der Fokus der Anregungsstrahlung als Ebene - Lichtblatt genannt - senk recht zur Beobachtungsrichtung ausgebildet. Dazu wird durch ein geeignetes optisches System die zu untersuchende Probe lateral durchleuchtet. Das Lichtblatt kann durch einen Linienfokus, eine Linienabbildung oder einen late ral scannenden Laserstrahl gebildet werden. Nur in diesem Lichtblatt können Fluoreszenzmoleküle per Zweiphotonenabsorption angeregt werden und so mit Fluoreszenz zeigen. Nachteil der Methode ist die Notwendigkeit der Be leuchtung mit sehr intensitätsstarken Dauerstrichlasern oder Lasersystemen für ultrakurze Laserpulse. In beiden Fällen wird die Probe mit Laserstrahlung hoher Intensität oder gar von Laserpulsen durchstrahlt und einer hohen Be strahlungsdosis mit hoher Energie ausgesetzt. Dies führt sowohl zum Ausblei chen der Fluoreszenz, als auch zu Phototoxizität, besonders bei biologischen Proben. Auch hier hängt die Zweiphotonenabsorptionswahrscheinlichkeit und somit auch die Fluoreszenzintensität quadratisch von der momentanen Anre- gungsintensität ab. c. Möglichkeiten zur Photonenpaarfluoreszenzmikroskopie sind auch aus US 5,796,477 B bekannt. Dabei wird die Zweiphotonenabsorption nicht durch intensitätsstarke oder gepulste Laser angeregt, sondern durch Photonenpaare aus zwei korrelierten (in Raum, Zeit, Impuls und/oder Energie) Photonen. Die se können insbesondere durch spontane Differenzfrequenzkonvertierung in einem nichtlinearen Kristall außerhalb der Probe generiert werden. Die bei den Photonen können bei ihrer Bewegung von der Photonenpaarquelle zur jeweiligen Probe voneinander räumlich getrennt werden. Haben sie eine un terschiedliche Wellenlänge kann dies mit einem dichroitischen Spiegel er reicht werden. Weisen sie entgegengesetzte Polarisation auf, können sie durch einen Polarisationsstrahlteiler räumlich getrennt werden. Es ist aber ebenso möglich, dass beide Photonen einen Kristall mit nichtlinearen opti schen Eigenschaften räumlich separiert verlassen und damit bereits räumlich getrennt sind. Anschließend werden die beiden Photonenstrahlen überkreu zend in die Probe fokussiert. Im Überlappbereich der im Fokus aufeinander treffenden Photonen kann dann die Zweiphotonenabsorption stattfinden. In diesem Szenario sind die Zweiphotonenabsorption und damit die Fluoreszenz intensität linear proportional zur momentanen Anregungsintensität. Ein wei terer Vorteil ist, dass das fokale Volumen gegenüber dem in a. beschriebenen Verfahren kleiner sein kann. Nachteilig an diesem Verfahren ist der komplexe experimentelle Aufbau, da sichergestellt sein muss, dass beide Photonen ei nes Paares exakt zur gleichen Zeit im Strahlüberlappvolumen ankommen und innerhalb der Probe aufeinandertreffen. Dies kann durch die sehr kurze Kohä renzzeit und möglicherweise unterschiedlicher aber korrelierter Wellenlänge der beiden Photonen erschwert sein. Daher ist eine sehr genaue Justage, die zu Lasten der Flexibilität und Praktikabilität geht, erforderlich.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, Möglichkeiten für die Fluoreszenzmikro skopie anzugeben, mit denen der lokale Energieeintrag bei der Fluoreszenzan regung reduziert werden kann und bei denen ein einfacher optischer Aufbau mit reduziertem Justageaufwand einsetzbar ist.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit einer optischen Anordnung, die die Merkmale des Anspruchs 1 aufweist, gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Erfindung können mit in untergeordneten Ansprüchen bezeichneten Merkmalen realisiert werden.
Das hier vorgeschlagene Verfahren beruht auf der Nutzung einer vorzugswei se kollinearen Quelle von der insbesondere Photonenpaare oder aber auch Mehrphotonenzustände gleichzeitig auf eine Probe emittiert werden und da bei das Prinzip der Lichtblattmikroskopie anwendbar ist.
Dabei emittiert eine Quelle nicht klassischen Lichts Multiphotonenstrahlen, aber mindestens Photonenpaarstrahlen von insbesondere Photonenpaaren oder aber auch Mehrphotonenzuständen, bevorzugt in kollinearer Geometrie. Dies kann durch spontane Differenzfrequenzkonvertierung/spontane para metrische Fluoreszenz in einem nichtlinearen, auch periodisch gepolten opti schen Kristall geschehen. Der/die Multiphotonenstrahl(en) gelangt/gelangen durch ein erstes optisches System auf eine Probe, so dass ein Lichtblatt oder eine lichtblattartige Form ausgebildet wird.
Das Lichtblatt oder die lichtblattartige Form kann dabei als zeitlich konstanter Linienfokus aber auch als in der Lichtblattebene gescannter Photonenstrahl ausgebildet sein oder sich durch die zeitliche Abfolge kleiner Teillichtblätter zusammensetzen. Ein dazu geeignetes erstes optisches System kann eine Lin se oder ein Photonen reflektierendes optisches Element oder eine Polarisati onsoptik oder ein optischer Filter oder eine beliebige Anordnung mehrerer dieser optischen Elemente sein.
Ein Lichtblatt oder eine lichtblattartige Form lässt sich auch durch eine Bewe gung eines optischen Elements, das Bestandteil des ersten optischen Systems sein kann, erreichen. So kann man beispielsweise ein Photonen reflektieren des Element um eine Rotationsachse verschwenken und so die Position an der Probe, an der die Photonenpaare gleichzeitig auftreffen, verändern, ähnlich, wie es bei den bekannten Scannerspiegeln in der Lasertechnik möglich ist.
Nur in dem im Bereich des ausgebildeten Lichtblatts oder der lichtblattartigen Form durchleuchteten Bereich der Probe ist eine gleichzeitige Absorption mehrerer Photonen, insbesondere von Photonenpaaren und damit Fluores zenzanregung möglich. Ein Teil der Fluoreszenzstrahlung wird unter optionaler Verwendung eines zweiten optischen Systems auf ein Detektionssystem tref fen und dort detektiert werden. Das zweite optische System kann eine opti sche Linse oder ein Fluoreszenzstrahlung reflektierendes Element oder eine Polarisationsoptik oder ein optischer Filter oder eine beliebige Anordnung mehrerer dieser optischen Elemente sein. Ein Detektorsystem sollte eine ortsaufgelöste Messung der Fluoreszenzstrahlung, die innerhalb des Licht blatts angeregt worden ist, ermöglichen. Das Detektorsystem kann eine Ka mera mit genügender Empfindlichkeit sein. Beispiele dafür sind eine CCD, EMCCD, ICCD, CMOS-Kamera, SPAD-Array. Es kann ein optischer Filter oder ein zweites optisches System enthalten. Das zweite optische System sowie das Detektionssystem können auch als Einheit ausgeführt sein.
Bei einer weiteren erfindungsgemäßen Variante können auch mehrere Pho tonenstrahlen genutzt werden, so dass in mehreren Lichtblättern oder in Be reichen mit lichtblattartiger Form an der Probe gleichzeitig Fluoreszenz ange regt werden kann. Die Anregung der Fluoreszenz kann explizit auch über Mul tiphotonenabsorption von Mehrphotonenzuständen, insbesondere von Pho tonenpaaren, die gleichzeitig auf eine Probe auftreffen, geschehen. Derartige Multiphotonenzustände können z.B. durch sogenannte N00N States realisiert werden, wobei dann eine N-Photonenabsorption stattfindet.
Eine Quelle nichtklassischen Lichtes kann beispielsweise ein von einem Laser gepumpter nichtlinearer Kristall oder eine anderer Quelle von Photonenpaa ren oder Multiphotonenzuständen sein, wie beispielsweise eine von einem Laser gepumpte Wellenleiterstruktur in einem nichtlinearen Kristall, oder mindestens zwei identische kohärent gepumpte Quantenpunkte.
Die erfindungsgemäße Lösung hat gegenüber dem Stand der Technik für Fluo reszenzmikroskopie mittels Multiphotonenabsoprtion einige Vorteile. Da die Fluoreszenzintensität linear mit der momentanen Beleuchtungsintensität ska liert, kann die Bestrahlungsdosis der Probe bei gleichbleibender Signalausbeu te reduziert werden oder Signalstärke und Bildkontrast der mit dem Detekti onssystem erfassten Fluoreszenzstrahlung bei gleichbleibender Bestrahlungs dosis gesteigert werden. Das Verfahren ist damit maximal schonend, ohne unnötige Lichtbelastung der Probe und erlaubt somit Langzeitstudien von photosensitiven Proben, da sowohl Fluoreszenzbleaching als auch Phototoxizi- tät minimiert werden können. Im Gegensatz zur Photonenpaarfluoreszenz mikroskopie ist der Aufbau deutlich vereinfacht und robuster gestaltet, so dass eine Kostenreduktion und Verbesserung der axialen Auflösung erreicht werden kann. Der kollineare Aufbau ist kompatibel und mit bestehenden Lichtblatt-Mikroskopsystemen implementierbar. Außerdem kann Multiphoto nenstrahlung mit Photonen einer bestimmten Mittenwellenlänge zu fokalen Volumina fokussiert werden, welche sonst nur mit Laserlicht der halben Wel lenlänge erreichbar sind. Damit kann die axiale Auflösung der erfassbaren Fluoreszenzstrahlung innerhalb des jeweiligen Lichtblatts erhöht werden. Ins gesamt sind eine erhöhte Effizienz, erhöhte Ortsauflösung und erhöhte Ein dringtiefe möglich. Ebenso ist der lineare Zusammenhang zwischen Fluores zenzintensität und Photonenstrahlintensität von Vorteil für die Datenauswer tung, da ein linearer Zusammenhang zwischen Messgröße (Fluoreszenzsignal) und Anregungsgröße (Strahlungsdosis) vorliegt.
Nachfolgend soll die Erfindung anhand eines Beispiels näher erläutert werden. Dabei zeigt:
Figur 1 in schematischer Form ein Beispiel einer erfindungsgemäßen
Anordnung.
In Figur 1 ist gezeigt, wie ein Photonenpaarstrahl 2 von einer kollinearen Quel le nicht klassischen Lichts 1 auf ein erstes optisches System 3 gerichtet ist. Das erste optische System 3 kann, wie in den Ansprüchen definiert ausgebildet sein.
Der mit dem ersten optischen System 3 beeinflusste Photonenpaarstrahl 2 wird so auf/in die Probe 5 gerichtet, dass mindestens eine eindimensionale linienförmige Bewegung der Position, an der der Photonenpaarstrahl 2 auf die Probe 5 auftrifft oder in die Probe eintritt, zur Ausbildung eines Lichtblattes 4 erfolgt. Die Bewegung kann durch eine Bewegung eines die Photonen reflek tierenden Elements, insbesondere mittels einer Schwenkbewegung um eine Rotationsachse eines reflektierenden Elements erreicht werden.
Mit auf die Probe 5 auftreffenden oder in die Probe 5 eintretenden Photo- nenpaaren wird eine Anregung von Fluoreszenzstrahlung 6 innerhalb des Lichtblatts 4 erreicht.
So generierte Fluoreszenzstrahlung 6 trifft auf ein zweites optisches System 7 auf, das ebenfalls so ausgebildet ist, wie in den Ansprüchen definiert. Mit dem
Detektorsystem 8 erfolgt eine ortsaufgelöste Erfassung von Fluoreszenzstrah lung, die fluoreszenzmikroskopisch ausgewertet werden kann.

Claims

FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT...e.V., Friedrich-Schiller-Universität Jena 198PCT 3159 Patentansprüche
1. Optische Anordnung für fluoreszenzmikroskopische Anwendungen, bei der von einer Quelle nichtklassischen Lichtes (1) ein oder mehrere Multiphotonenstrahl(en), aber mindestens ein oder zwei Photonen- paarstrahl(en) (2)-auf ein erstes optisches System (3) bestehend aus einer Anordnung aus mindestens einer Linse oder einem Photonen re flektierenden Element oder einem anderem strahlformenden Element oder einer Kombination dieser gerichtet ist/sind und das erste optische System (3) ausgebildet ist, das nichtklassische Licht zu einem Lichtblatt (4) oder einer lichtblattartigen Form zu formen und von dort auf eine Probe (5) zu richten, so dass mit den mehreren gleichzeitig auf/in der Probe auftreffenden Mehrphotonenzuständen Fluoreszenzstrahlung mittels Mehrphotonenabsorption angeregt wird und
durch Anregung erhaltene Fluoreszenzstrahlung (6) mittels eines zwei ten optischen Systems (7) auf ein Detektionssystem (8) auftrifft, das zur ortsaufgelösten Erfassung von Fluoreszenzstrahlung ausgebildet ist.
2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Quelle nichtklassischen Lichtes (1) ein von einem Laser gepumpter nichtlinea rer Kristall oder Wellenleiterstruktur in einem nichtlinearen Kristall, oder mindestens zwei identische kohärent gepumpte Quantenpunkte sind.
3. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass ein oder mehrere Multiphotonenstrahl(en), aber mindestens ein oder mehrere Photonenpaarstrahl(en) (2), bevorzugt in kollinearer Geometrie auf das erste optische System (3) gerichtet ist/sind.
4. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass mit zwei Photonen in Form eines Photonenpaares Fluoreszenzstrahlung anregbar ist.
5. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass die Ausbildung eines Lichtblatts (4) mittels des ers ten optischen Systems (3) erfolgt, das ausgebildet ist, mindestens ei nen Multiphotonenstrahl (2) durch eine Bewegung eines optischen Elements, das Bestandteil des ersten optischen Systems (3) ist, die Po sition des Auftreffens des mindestens einen Multiphotonenstrahls (2) auf/in die Probe (5) linienförmig zu verändern, so dass ein entspre chender linienförmiger Bereich mindestens einer Linie mindestens einmal bestrahlt wird.
6. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass ein von der Photonenstrahlquelle (1) emittierter Multiphotonenstrahl (2) in mehrere Teilstrahlen aufgeteilt und die Teilstrahlen zur Ausbildung jeweils eines Lichtblatts mittels mindestens eines ersten optischen Systems (3) auf/in die Probe (5) gerichtet sind.
7. Anordnung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekenn zeichnet, dass die Ausbildung mindestens eines Lichtblattes (4) oder lichtblattartigen Form mittels mindestens eines ersten optischen Sys tems (3) erfolgt, das ausgebildet ist, die Teilstrahlen durch eine Bewe gung mindestens eines optischen Elements, das Bestandteil des ersten optischen Systems (3) ist, die Position des Auftreffens der Teilstrahlen auf/in der Probe (5) linienförmig zu verändern, so dass ein entspre chender linienförmiger Bereich mindestens einer Linie mindestens einmal mit einem Teilstrahl bestrahlt wird.
8. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass zur ortsaufgelösten Abbildung der Probe (5) eine ein- oder zwei- oder dreidimensionale Bewegung der Probe (5) erfolgt.
9. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass ein erstes optisches System (3) und/oder ein zwei tes optisches System (7) mit einem nichtlinearen optischen Kristall, ei ner optischen Linse, einem Photonen reflektierenden Element, einer Polarisationsoptik, einen optischen Filter oder eine Anordnung mehre rer dieser optischen Elemente gebildet ist/sind.
10. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass ein von der Quelle nicht klassischen Lichts (1) kolli- near emittierter Multiphotonenstrahl mittels eines dichroitischen Spiegels oder eines Polarisationsstrahlteilers in mehrere Teilstrahlen aufteilbar ist, die an verschiedenen Positionen auf/in die Probe (5) ge richtet sind.
11. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass das Detektorsystem (8) eine CCD-, eine EMCCD-, eine ICCD- oder eine CMOS-Kamera oder ein SPAD-Array ist.
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