WO2020055123A1 - 단백질을 포함하는 액상 조성물 - Google Patents

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WO2020055123A1
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acid
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정소윤
이재민
이현주
김용국
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삼성바이오에피스 주식회사
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    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers

Definitions

  • a composition for stabilizing a protein containing a stabilizer and a surfactant and not a buffer a composition for stabilizing and a protein containing a protein
  • a composition for stabilizing the protein It relates to a method for preparing a stabilized liquid composition of a protein.
  • Fusion protein pharmaceuticals have a higher molecular weight and complexity than general protein pharmaceuticals, and when it deviates from the optimal conditions, physicochemical instability is induced, and protein aggregation, fragments, and isomers are likely to be generated. It can reduce physiological activity. Therefore, it is important to develop optimal formulations for protein drugs based on various conditions such as pH conditions, buffer types, protein concentrations, and excipient types / concentrations.
  • the buffers included in the protein pharmaceutical composition must satisfy the following requirements: First, the buffers must be properly dissolved, and should not exhibit toxicity or form harmful complexes with metal ions. In addition, buffers should not affect the stability and effectiveness of the protein by interacting with other components in the composition. In addition, it must be stable and effective in maintaining pH under conditions exposed during formulation or storage.
  • the present specification provides a composition for stabilization that enhances the stability of a protein and a pharmaceutical composition of a stable protein containing the same.
  • the stabilizing composition is pH 4 to 8, for example, pH 5.2 to 7.2, pH 5.5 to 7, pH 5.5 to 6.6, pH 5.5 to 6.4, pH 5.5 to 6.2, pH 5.8 to 7, pH 5.8 to 6.6, pH 5.8 to 6.4, pH 5.8 to 6.2, pH 5.7 to 6.7, or pH 5.9 to 6.5.
  • the composition for stabilization may be one that does not contain a buffer.
  • the surfactant may include one or more selected from all nonionic surfactants commonly used in protein formulations.
  • the stabilizing composition may be an aqueous composition.
  • the liquid composition is pH 4 to 8, such as pH 5.2 to 7.2, pH 5.5 to 7, pH 5.5 to 6.6, pH 5.5 to 6.4, pH 5.5 to 6.2, pH 5.8 to 7, pH 5.8 to 6.6, pH 5.8 to 6.4 , pH 5.8 to 6.2, pH 5.7 to 6.7, or pH 5.9 to 6.5.
  • the liquid composition may be one that does not contain a buffer.
  • the liquid composition may be an aqueous liquid composition.
  • liquid composition For example, the liquid composition, the liquid composition, the liquid composition, and
  • the liquid composition may be one that does not contain a buffer.
  • the liquid composition may include a stabilizer in an amount of 0.5% (w / v) to 50% (w / v) based on the total composition.
  • the stabilizer may act as an isotonic agent, and may be, for example, one or more selected from the group consisting of polyols and sugars such as sugar alcohol.
  • the stabilizer may include one or more selected from the group consisting of trehalose, sucrose, mannitol, sorbitol, xylitol, glucose, glycerol, and the like.
  • the stabilizer may be one that does not contain sodium chloride.
  • the liquid composition may be an aqueous liquid composition.
  • the liquid composition may include surfactant in an amount of 0.01% (w / v) to 3% (w / v) based on the total composition.
  • the surfactant may be one containing at least one selected from all surfactants commonly used in protein formulations, such as nonionic surfactants.
  • Another example provides a pharmaceutical composition comprising the liquid composition.
  • the pharmaceutical composition has a pharmacological activity corresponding to the activity of the protein contained in the liquid composition.
  • the protein in the liquid composition or pharmaceutical composition, may have a molecular weight of 10 to 500 kDa, 10 to 400 kDa, 10 to 300 kDa, 10 to 200 kDa, or 10 to 150 kDa.
  • the protein can be a VEGF antagonist, for example, Aflibercept (molecular weight about 97-115 kDa), Bevacizumab (molecular weight about 149 kDa), Ranibizumab; molecular weight about 48 kDa) may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may be an ophthalmic composition, Specifically, it may be an injection for intravitreal administration of the eye.
  • the liquid composition or pharmaceutical composition may be for intravitreal administration.
  • Another example provides a method for stabilizing a protein or a method for preparing a stabilized aqueous liquid composition comprising the step of mixing the protein with the above-described stabilizer.
  • a stabilizing composition for enhancing the stability of a protein a stable liquid composition of a protein containing the same, and a method of manufacturing a stable liquid composition comprising a protein are provided.
  • an object of the present invention is to provide a formulation for stabilizing a protein having a proper pH and maintaining excellent formulation stability of a protein without containing a buffer, in order to minimize aggregation and physicochemical instability of the protein by the buffer. .
  • the stabilizing composition is pH 4 to 8, for example, pH 5.2 to 7.2, pH 5.5 to 7, pH 5.5 to 6.6, pH 5.5 to 6.4, pH 5.5 to 6.2, pH 5.8 to 7, pH 5.8 to 6.6, pH 5.8 to 6.4, pH 5.8 to 6.2, pH 5.7 to 6.7, or pH 5.9 to 6.5.
  • the composition for stabilization may be one that does not contain a buffer.
  • the surfactant may include one or more selected from all nonionic surfactants commonly used in protein formulations.
  • the stabilizing composition may be an aqueous composition.
  • the liquid composition is pH 4 to 8, such as pH 5.2 to 7.2, pH 5.5 to 7, pH 5.5 to 6.6, pH 5.5 to 6.4, pH 5.5 to 6.2, pH 5.8 to 7, pH 5.8 to 6.6, pH 5.8 to 6.4 , pH 5.8 to 6.2, pH 5.7 to 6.7, or pH 5.9 to 6.5.
  • the liquid composition may be one that does not contain a buffer.
  • the liquid composition may be an aqueous composition.
  • the liquid composition of the protein provided herein can maintain a pH, which is one of the important factors affecting protein stability in an appropriate range, without including a buffer, and has a characteristic that the protein in the composition has excellent stability.
  • protein stability indices such as% HMW,% charge variant and / or% main of the protein are excellent
  • the characteristics of maintaining the pH and / or excellent protein stability are characterized by being repeatedly reproducible.
  • liquid composition For example, the liquid composition, the liquid composition, the liquid composition, and
  • the liquid composition may be one that does not contain a buffer.
  • the protein content in the liquid composition is 300 mg / ml or less, 250 mg / ml or less, 200 mg / ml or less, 150 mg / ml or less, 125 mg / ml or less, 100 mg / ml or less, 90 mg / ml or less, 80 mg / ml or less, 70 mg / ml or less, 60 mg / ml or less, or 50 mg / ml or less, such as 5 mg / ml to 300 mg / ml, 5 mg / ml to 250 mg / ml, 5 mg / ml to 200 mg / ml, 5 mg / ml to 150 mg / ml, 5 mg / ml to 125 mg / ml, 5 mg / ml to 100 mg / ml, 5 mg / ml to 90 mg / ml, 5 mg / ml to 80 mg / ml, 5 mg
  • the protein content in the liquid composition is 5 mg / ml to 50 mg / ml, 5 mg / ml to 49 mg / ml, 5 mg / ml to 48 mg / ml, 5 mg / ml to 47 mg / ml, 5 mg / ml to 46 mg / ml, 5 mg / ml to 45 mg / ml, 5 mg / ml to 44 mg / ml, 5 mg / ml to 43 mg / ml, 5 mg / ml to 42 mg / ml, 5 mg / ml to 41 mg / ml, 10 mg / ml to 50 mg / ml, 10 mg / ml to 49 mg / ml, 10 mg / ml to 48 mg / ml, 10 mg / ml to 47 mg / ml, 10 mg / ml to 46 mg / ml, 10 mg / m
  • the liquid composition is pH 4 to 8, such as pH 5.2 to 7.5, pH 5.2 to 7.2, pH 5.2 to 7, pH 5.2 to 6.8, pH 5.2 to 6.6, pH 5.2 to 6.5, pH 5.2 to 6.4 , pH 5.2 to 6.2, pH 5.5 to 7.5, pH 5.5 to 7.2, pH 5.5 to 7, pH 5.5 to 6.8, pH 5.5 to 6.7, pH 5.5 to 6.6, pH 5.5 to 6.5, pH 5.5 to 6.4, pH 5.5 to 6.2 , pH 5.7 to 7.5, pH 5.7 to 7.2, pH 5.7 to 7, pH 5.7 to 6.8, pH 5.7 to 6.7, pH 5.7 to 6.6, pH 5.7 to 6.5, pH 5.7 to 6.4, pH 5.7 to 6.2, pH 5.8 to 7.5 , pH 5.8 to 7.2, pH 5.8 to 7, pH 5.8 to 6.8, pH 5.8 to 6.7, pH 5.8 to 6.6, pH 5.8 to 6.5, pH 5.8 to 6.4, pH 5.8 to 6.2, pH 5.8 to 7.5 ,
  • the liquid composition provided herein is characterized in that the stability of the protein is enhanced because it does not contain a buffer that causes aggregation of the protein.
  • the buffer excluded from the components of the liquid composition may be at least one selected from buffers having a commonly used buffering capacity, for example, the buffer is a group consisting of (1) phosphoric acid, acetic acid, citric acid, succinic acid, carbonic acid, etc.
  • a pharmaceutically acceptable salt of the acids e.g., sodium salt, potassium salt, etc.
  • amino acid selected from the group consisting of histidine, aspartic acid, glutamic acid e.g., aspartic acid, glutamic acid
  • It may include one or more selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts (eg, hydrochloride or acetate such as histidine-HCl, histidine-acetate, etc.).
  • the liquid composition is phosphoric acid, acetic acid, citric acid, succinic acid, carbonic acid, pharmaceutically acceptable salts of the acids (phosphoric acid, acetic acid, citric acid, succinic acid, carbonic acid) (e.g., sodium salt, potassium salt, etc.), histidine, aspart Acid, glutamic acid, the amino acid (histidine, aspartic acid, glutamic acid) may include one or more selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts (eg, histidine-HCl, histidine-acetate, etc.).
  • pharmaceutically acceptable salts e.g., histidine-HCl, histidine-acetate, etc.
  • the liquid composition may include a stabilizer in an amount of 0.5% (w / v) to 50% (w / v) based on the total composition.
  • the stabilizer may act as an isotonic agent, and may be, for example, one or more selected from the group consisting of polyols and sugars such as sugar alcohol.
  • the stabilizer may be at least one selected from the group consisting of trehalose, sucrose, mannitol, sorbitol, xylitol, glucose, glycerol, and the like.
  • the stabilizer is 1 to 20% (w / v), 1 to 15% (w / v), 1 to 10% (w / v), 5 to 20% (w / v), 5 to 15% (w / v), 5 to 10% (w / v), 5.5 to 20% (w / v), 5.5 to 15% (w / v), 5.5 to 10% (w / v), 6 to 20% (w / v), 6 to 15% (w / v), 6 to 10% (w / v), 7 to 20% (w / v), 7 to 15% (w / v), 7 to 10% (w / v), 7.8 to 20% (w / v), 7.8 to 15% (w / v), 7.8 to 10% (w / v), 7.8 to 8.2% (w / v), or 8% ( w / v) trehalose, 1-20% (w / v), 1-15% (w / v), 1-10% (w / v), 5-20% (w
  • the stabilizer may be one that does not contain sodium chloride.
  • the liquid composition of the protein provided herein may be one in which stability of the protein is improved (eg, ⁇ % HMW reduction) by not containing sodium chloride as a stabilizer.
  • the liquid composition is a surfactant, based on the total composition, 0.001 to 3% (w / v), 0.001 to 2% (w / v), 0.001 to 1% (w / v), 0.001 to 0.5 % (w / v), 0.001 to 0.1% (w / v), 0.001 to 0.05% (w / v), 0.01 to 3% (w / v), 0.01 to 2% (w / v), 0.01 to 1 % (w / v), 0.01 to 0.5% (w / v), 0.01 to 0.1% (w / v), 0.01 to 0.05% (w / v), or 0.03% (w / v). You can.
  • the surfactant may be selected from all pharmaceutically acceptable surfactants capable of evenly dispersing the protein in the liquid composition medium.
  • the surfactant may be a nonionic surfactant, for example, polysorbates (eg, polysorbate 20 (polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate), polysorbate 40 (polyoxyethylene (20)) Sorbitan monopalmitate), polysorbate 60 (polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate), polysorbate 80 (polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate); figures after the polyoxyethylene (20) represents the total number of oxyethylene groups (-(CH2CH2O)-)), poloxamer (PEO-PPO-PEO copolymer; PEO: poly (ethylene oxide), PPO: poly (propylene oxide)), Polyethylene-polypropylene glycol, polyoxyethylene compound (e.g., polyoxyethylene-stearate, polyoxyethylene alkyl ether (alkyl: C1-C30), polyoxyethylene
  • the liquid composition may include a protein, a stabilizer, and a surfactant in the amount described above, and a residual amount of an aqueous medium (eg, water (purified water), physiological saline, water for injection, etc.).
  • an aqueous medium eg, water (purified water), physiological saline, water for injection, etc.
  • the liquid composition provided herein may be isotonic with a living body.
  • the liquid composition has an osmotic pressure of about 200 mOsm / kg to about 400 mOsm / kg, about 200 mOsm / kg to about 350 mOsm / kg, about 200 mOsm / kg to about 300 mOsm / kg, about 250 mOsm / kg to About 400 mOsm / kg, about 250 mOsm / kg to about 350 mOsm / kg, or about 250 mOsm / kg to about 300 mOsm / kg, for example, about 270 mOsm / kg to about 290 mOsm / kg have.
  • Such osmotic pressure can be controlled by the stabilizer.
  • Liquid compositions provided herein have electrical conductivity of at least about 0 mS / cm (or more), at least about 0.0001 mS / cm, or at least about 0.001 mS / cm, such as from about 0 mS / cm to about 10 mS / cm , About 0 mS / cm to about 7 mS / cm, 0 mS / cm to about 5 mS / cm, about 0 mS / cm to about 2.5 mS / cm, about 0 mS / cm to about 1 mS / cm, about 0 mS / cm to about 0.5 mS / cm, about 0 mS / cm to about 0.1 mS / cm, about 0 mS / cm to about 0.05 mS / cm, more than about 0 mS / cm and about 10 mS / cm or less, about 0 mS More than / cm about 7 mS /
  • the protein is a protein drug, such as a protein having a molecular weight of 10 to 500 kDa, 10 to 400 kDa, 10 to 300 kDa, 10 to 200 kDa, or 10 to 150 kDa (e.g., a fusion protein) ).
  • the protein is a VEGF-specific fusion in which a VEGF binding site derived from an extracellular domain of VEGF (vascular endothelial growth factor) antagonist, such as human VEGF receptor 1 and VEGF receptor 2, and an Fc region of human IgG1 are fused. It can be a protein.
  • the VEGF-specific fusion protein comprises a region essentially comprising the immunoglobulin-like (Ig) domain 2 of human VEGF receptor 1 (Flt1) and the Ig domain 3 of human VEGF receptor 2 (Flt1 or Flt4).
  • the Fc region of human IgG1 may be a fusion protein fused, for example, may be an aflibercept having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the protein contained in the liquid composition may be produced recombinantly or synthetically.
  • the liquid composition provided herein is stably maintained at a high temperature of about 40 ° C for at least 4 weeks, and / or frozen for at least 1 cycle (e.g., at least 2 cycles, at least 3 cycles, at least 4 cycles, or at least 5 cycles) / Severe conditions such as thawing conditions, vibration conditions (over 100rpm (for example, over 200rpm, over 300rpm, or over 400rpm) and over 24 hours (for example, over 36 hours, over 48 hours, over 60 hours, or over 72 hours)) It remains stable even under conditions.
  • excellent stability or “keep stable” may mean that the structure, and / or physical, chemical, and / or biological properties of the protein in the composition is maintained upon storage (eg, during storage). Low protein polymer formation rate, low protein aggregation rate, low protein degradation rate, and / or low denaturation rate, etc.). Various analytical techniques for measuring protein stability are well known in the art.
  • the liquid composition provided herein has a protein (eg, fusion protein) content of 40 mg / ml (pH 6.2), and is measured when stored at 40 ° C. for 4 weeks with conventional size exclusion chromatography (SEC).
  • the amount of change in protein polymer formation rate or aggregation rate (High Molecular Weight% (w / v);% HMW) (% HMW at week 4 of storage-Week 0 (% HMW at initial of storage) is less than about 9%, such as , About 8% or less, about 7% or less, about 6% or less, about 5.5% or less, about 5% or less, about 4.5% or less, or about 4% or less (eg, about 0.1 to about 8%, about 0.5 to about 8%, about 1 to about 8%, about 1.5 to about 8%, about 2 to about 8%, about 2.5 to about 8%, about 3 to about 8%, about 3.5 to about 8%, about 0.1% to about 7%, about 0.5% to about 7%, about 1% to about
  • the liquid composition provided herein has a protein (eg, fusion protein) content of 40 mg / ml (pH 6.2), freeze / thaw (5 cycles; each cycle: frozen at -70 ° C for 18 hours or more) + Change in protein polymer formation rate or aggregation rate (High Molecular Weight% (w / v);% HMW) measured by normal size exclusion chromatography (SEC) after performing 1-2 hours thawing at room temperature (25 ° C) (5 % HMW after performing cycles-% HMW at initiation) is less than about 0.15%, such as about 0.13% or less, about 0.1% or less, about 0.08% or less, about 0.06% or less, about 0.05% or less, about 0.04 % Or less, or about 0.03% or less (the lower limit may be about 0.001%, about 0.005%, or about 0.01), but is not limited thereto.
  • a protein eg, fusion protein
  • the relative potency of RPGF for VEGF of aflibercept measured when stored at 40 ° C. for 4 weeks Activity) Change amount (Week 4% RPA-Initial% RPA) is about -10% to about 10%, about -10 to about 7%, about -10% to about 5%, -10% to about 4 %, -10% to about 3%, about -7% to about 10%, about -7 to about 7%, about -7% to about 5%, -7% to about 4%, -7% to about 3 %, About -6% to about 10%, about -6 to about 7%, about -6% to about 5%, -6% to about 4%, -6% to about 3%, about -5% to about 10%, about -5 to about 7%, about -5% to about 5%, -5% to about 4%, or -5% to about 3%.
  • a pharmaceutical composition comprising the liquid composition.
  • the pharmaceutical composition may have an effect of preventing or treating ophthalmic diseases.
  • an example provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of ophthalmic diseases comprising the liquid composition.
  • the ophthalmic disease may be selected from all ophthalmic diseases caused by abnormal angiogenesis, for example, retinal vein occlusion (retinal vein obstructive macular edema), diabetic macular edema, diabetic retinopathy, choroidal neovascularization, age-related macular It may be selected from the group consisting of degeneration, retinal edema, and ischemic syndrome (retinal ischemia syndrome).
  • the ophthalmic disease may be a disease occurring in mammals such as humans.
  • Another example provides a method of preventing or treating ophthalmic disease, comprising administering the liquid composition to a subject in need thereof.
  • the administration step may be by intraocular administration (injection), such as intravitreal administration (injection).
  • the subject can be selected from mammals, including humans.
  • the composition of the liquid composition, the types of proteins (eg, VEGF antagonists) contained in the liquid composition, ophthalmic diseases, etc. are as described above.
  • Another example is an intraocular or intravitreal delivery method of a protein (eg, VEGF antagonist) contained in the liquid composition or the liquid composition, comprising administering the liquid composition intraocularly or intravitreally, or the liquid composition or Provided is a method for enhancing the intraocular or intravitreal delivery of a protein (eg, VEGF antagonist) contained in the liquid composition.
  • a protein eg, VEGF antagonist
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, and / or excipient.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone , Cellulose, water (eg, purified water), physiological saline, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. However, it is not limited thereto.
  • the liquid composition or pharmaceutical composition may be for administration to a mammal such as a human.
  • the liquid composition or pharmaceutical composition may be administered by oral or parenteral routes.
  • parenteral administration e.g., injection
  • intraocular administration e.g., intravitreal administration
  • intravenous administration subcutaneous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, Intrarectal administration, intratumoral administration, and the like, for example, intravitreal administration.
  • the liquid composition or pharmaceutical composition may be an ophthalmic composition comprising the VEGF antagonist described above, in this case, an injection administered in the vitreous of the eye.
  • Another example provides a method for stabilizing a protein or a method for preparing a stabilized liquid composition comprising mixing a protein with the stabilizing composition described above.
  • a method for stabilizing a protein or a method for preparing a stabilized aqueous liquid composition comprising the step of mixing.
  • the method is characterized by not performing the step of mixing the buffer.
  • the effect of inhibiting the degradation of physiological activity due to protein aggregation, fragmentation, isomerization, etc. is a formulation containing a conventional buffer and a commercial formulation It is superior to (e.g., EYLEA®) or better than the equivalent, so that the protein can be stably provided for a relatively long time even under severe conditions.
  • Example 1 is a graph showing the percent change in% HMW (High-molecular weight%) for 4 weeks when stored at 40 ° C for 4 weeks of the test formulation measured in Example 3.
  • FIG. 2 is a graph showing% Acidic change rate ( ⁇ % Acidic) for 4 weeks when stored for 4 weeks at 40 ° C. of the test formulation measured in Example 4.
  • 3A and 3B are graphs showing% Main change rates ( ⁇ % Main1 and% Main2) for 4 weeks when stored for 4 weeks at 40 ° C of the test formulation measured in Example 4.
  • Figure 4 is a graph showing the percentage change in% RPA (Relative Potency Activity) for 4 weeks when stored at 40 ° C for 4 weeks of the test formulation measured in Example 5.
  • Example 5 is a graph showing the change rate ( ⁇ % HMW) of% HMW (High-molecular weight%) under Freeze / thaw (5 cycles) conditions of the test formulation measured in Example 6.
  • Example 6 is a graph showing the change rate ( ⁇ % HMW) of% HMW (High-molecular weight%) under the condition of Agitation Stress (400 rpm, 72 hours) of the test formulation measured in Example 6.
  • Aflibercept a fusion protein that acts as a VEGF antagonist as a protein drug (Aflibercept; a fusion protein between the VEGF binding site derived from the extracellular domains of human VEGF receptors 1 and 2 and the Fc region of human IgG1; CAS Number: 862111-32- 8; using SEQ ID NO: 1)
  • a liquid formulation of protein drug was prepared with the composition of Table 1 below:
  • Formulation Protein drug concentration pH Buffer Stabilizer Surfactants Formulation 1 (Buffer-freew / sucrose) 40 mg / ml 6.2 Not included 8% (w / v) Sucrose 0.03% (w / v) PS20 Formulation 2 (Buffer-free w / trehalose) 40 mg / ml 6.2 Not included 8% (w / v) Trehalose 0.03% (w / v) PS20 Formulation 3 (Buffer w / sucrose) 40 mg / ml 6.2 10 mM sodium phosphate 8% (w / v) Sucrose 0.03% (w / v) PS20 Formulation 4 (Buffer w / trehalose) 40 mg / ml 6.2 10 mM sodium phosphate 8% (w / v) Trehalose 0.03% (w / v) PS20 EYLEA ® (control) 40 mg / ml 6.2 10 mM sodium phosphate 5% (
  • Example 2 To confirm the pH side stability of the liquid formulation without buffer prepared in Example 1, the pH was measured while storing at 40 ° C / 4 weeks, and then additionally prepared two identical liquid formulations to confirm reproducibility, and then 40 ° C / 4 weeks , F / T 5 cycling conditions and agitation conditions were further measured. Table 2 shows the measured pH (initial pH, week 4 pH, pH after 5 cycles of F / T, pH after stirring, and pH (corresponding condition pH-initial pH).
  • the HMW content that shows the degree of aggregation of the protein drug in the formulation was measured by SE-HPLC.
  • HMW the material to be detected prior to the time the monomer is detected.
  • the measured% HMW (initial% HMW, 1st week% HMW, 2nd week% HMW, 4th week% HMW, ⁇ % HMW (corresponding parking% HMW-initial% HMW)) is shown in Table 3 and Figure 1:
  • formulations 1 to 4 were superior to EYLEA ® SE-HPLC analysis based ⁇ % HMW reduction effect.
  • Formulation 1 and Formulation 2 containing no buffer had a better ⁇ % HMW reduction effect compared to Formulation 3 and Formulation 4 with buffer.
  • the increase rate of acidic content (%) based on icIEF analysis of formulations 1 and 2 without buffer, under the conditions of protein drug concentration of 40 mg / ml and pH 6.2, is a formulation containing buffer. It was significantly lower compared to 3 and 4, and did not show a significant difference from the commercial formulation (EYLEA ® ) formulation.
  • % Main was measured by CE-SDS (Capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate) (40 °C, 4 weeks).
  • % Main was measured by the following method: SDS sample buffer (AB Sciex) and sample mixed with BME (2-mercaptoethaol, Sigma Aldrich) (mix ratio: about 1:50 (v: v)) 70 After heat treatment at ° C, the% total protein area detected under 220 nm was analyzed using a CE analysis instrument (Beckman Coulter, PA800 plus) and 32 karat software (Beckman Coulter). The measured% Main (initial, week 4, ⁇ % Main (week 4% Main-initial% Main)) are shown in Table 5 and FIGS. 3A to 3B:
  • the protein drug concentration was stored at 40 mg / ml, pH 6.2, and 40 ° C. for 4 weeks while maintaining Aflibercept's VEGF in the composition.
  • The% RPA Relative Potency Activity
  • The% RPA was measured by the following method: After loading and incubating KDR 293 cells (Promega) in a 96 well plate sequentially loaded with Aflibercept and VEGF,% RPA (using Envision microplate reader (Perkin Elmer, Envision 2014)). Relative Potency Analysis).
  • Table 6 and Figure 4 show the% RPA change rate ( ⁇ % RPA) between% RPA and Week 4 at Week 0 (initial) and Week 4 at the measured 40 ° C:
  • Example 6 HMW content( % ) Measurement (freeze / thaw or agitation stress condition)
  • HMW content (%) (% HMW;% high molecular weight; based on weight) that shows the degree of aggregation of protein drugs in the formulation under conditions of (1-2 ° C thawing at 25 ° C) or agitation stress (400 rpm, 72 hours) ) was measured by SE-HPLC.
  • the HMW content (%) was performed with reference to the method described in Example 2.

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Abstract

단백질의 안정화된 액상 제형과 관련된 것으로, 안정화제 및 계면활성제를 포함하고 완충제를 포함하지 않는 단백질의 안정화용 조성물, 상기 안정화용 조성물 및 단백질을 포함하는 단백질의 액상 조성물, 및 상기 안정화용 조성물을 사용하는 단백질의 안정화된 액상 조성물의 제조 방법이 제공된다.

Description

단백질을 포함하는 액상 조성물
단백질의 안정화된 액상 제형과 관련된 것으로, 안정화제 및 계면활성제를 포함하고 완충제를 포함하지 않는 단백질의 안정화용 조성물, 상기 안정화용 조성물 및 단백질을 포함하는 단백질의 액상 조성물, 및 상기 안정화용 조성물을 사용하는 단백질의 안정화된 액상 조성물의 제조 방법과 관련된 것이다.
융합 단백질 의약품은 일반적인 단백질 의약품에 비해 분자량이 크고 복잡하여 최적 조건에서 벗어날 경우 물리화학적 불안정성이 유도되어 단백질의 응집(aggregation), 단편(fragment) 및 이성질체(isomer)가 생성될 가능성이 높으며 이는 단백질의 생리활성을 감소시킬 수 있다. 따라서 단백질 의약품은 pH 조건, buffer 종류, 단백질 농도, excipient 종류/농도 등 다양한 조건을 기반으로 최적의 제형을 개발하는 것이 중요하다.
특히, 단백질 의약품의 안정성과 활성은 pH에 의존적이기 때문에 의약품의 유효 기간 동안 목표 pH를 유지하는 것은 단백질의 안정성 및 효율성 측면에서 매우 중요하다. 따라서 단백질 의약품의 생산(제조 및 제형 포함)시에는 한 개 이상의 완충제(buffering agent)를 사용하여 목표하는 pH를 맞추는 것이 일반적이다.
단백질 의약품 조성물 내 포함되는 완충제는 다음의 요건을 만족해야 한다: 우선, 완충제는 적절하게 용해되어야 하고, 독성을 나타내거나 금속 이온과 유해한 착물을 형성하면 안 된다. 또한, 완충제는 조성물 내 타 성분과 상호 작용하여 단백질의 안정성 및 유효성에 영향을 미쳐서는 안 된다. 또한, 제제화 혹은 저장 중에 노출되는 조건에서 pH를 유지하는데 안정적이고 효과적이어야 한다.
그러나, 단백질의 안정성에 중요한 pH 유지를 위해 첨가되는 완충제의 경우 첨가 농도 및 종류에 의존적으로 이온강도(ionic strength)를 높여 오히려 단백질의 응집(aggregation) 생성을 증가시킬 수 있다는 문제점이 있다. 실제로 EYLEA®의 경우 40℃의 가혹 조건에서 단백질 응집 증가에 의한 안정화 효과가 현저히 감소되는 문제가 발생한다.
이에, 본 명세서는 단백질의 안정성을 증진시키는 안정화용 조성물 및 이를 포함하는 안정한 단백질의 액상의 약학 조성물을 제공한다.
일 예는
안정화제; 및
계면활성제
를 포함하는, 단백질의 안정화용 조성물을 제공한다. 상기 안정화용 조성물은 pH 4 내지 8, 예컨대, pH 5.2 내지 7.2, pH 5.5 내지 7, pH 5.5 내지 6.6, pH 5.5 내지 6.4, pH 5.5 내지 6.2, pH 5.8 내지 7, pH 5.8 내지 6.6, pH 5.8 내지 6.4, pH 5.8 내지 6.2, pH 5.7 내지 6.7, 또는 pH 5.9 내지 6.5인 것일 수 있다. 상기 안정화용 조성물은 완충제를 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 계면활성제는 단백질 제형에 통상적으로 사용되는 모든 비이온성 계면활성제 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 안정화용 조성물은 수성의 조성물일 수 있다.
다른 예는 단백질; 안정화제; 및 계면활성제를 포함하는, 액상 조성물을 제공한다. 상기 액상 조성물은 pH 4 내지 8, 예컨대, pH 5.2 내지 7.2, pH 5.5 내지 7, pH 5.5 내지 6.6, pH 5.5 내지 6.4, pH 5.5 내지 6.2, pH 5.8 내지 7, pH 5.8 내지 6.6, pH 5.8 내지 6.4, pH 5.8 내지 6.2, pH 5.7 내지 6.7, 또는 pH 5.9 내지 6.5인 것일 수 있다. 상기 액상 조성물은 완충제를 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 액상 조성물은 수성의 액상 조성물일 수 있다.
예컨대, 상기 액상 조성물은,
(1) 단백질 5 mg/ml 내지 300 mg/ml;
(2) 안정화제; 및
(3) 계면활성제
를 포함하고, pH 4 내지 8, 예컨대, pH 5.2 내지 7.2, pH 5.5 내지 7, pH 5.5 내지 6.6, pH 5.5 내지 6.4, pH 5.5 내지 6.2, pH 5.8 내지 7, pH 5.8 내지 6.6, pH 5.8 내지 6.4, pH 5.8 내지 6.2, pH 5.7 내지 6.7, 또는 pH 5.9 내지 6.5인 것일 수 있다. 상기 액상 조성물은 완충제를 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 액상 조성물은 안정화제를 전체 조성물 기준으로 0.5%(w/v) 내지 50%(w/v)의 양으로 포함할 수 있다. 상기 안정화제는 등장화제 작용을 하는 것일 수 있으며, 예컨대, 당알코올 등의 폴리올 및 당으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 안정화제는 트레할로오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 글루코오스, 글리세롤 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 안정화제는 염화나트륨을 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 액상 조성물은 수성의 액상 조성물일 수 있다.
상기 액상 조성물은 계면활성제를 전체 조성물 기준으로 0.01%(w/v) 내지 3%(w/v)의 양으로 포함할 수 있다. 상기 계면활성제는 단백질 제형에 통상적으로 사용되는 모든 계면활성제, 예컨대, 비이온성 계면활성제 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 상기 액상 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 상기 액상 조성물에 포함된 단백질의 활성에 대응하는 약리적 활성을 갖는다.
예컨대, 상기 액상 조성물 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 단백질은 분자량이 10 내지 500 kDa, 10 내지 400 kDa, 10 내지 300 kDa, 10 내지 200 kDa, 또는 10 내지 150 kDa인 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 단백질은 VEGF 길항제일 수 있으며, 예컨대, 애플리버셉트(Aflibercept; 분자량 약 97 내지 115 kDa), 베바시주맙(Bevacizumab; 분자량 약 149 kDa), 라니비주맙(Ranibizumab; 분자량 약 48 kDa) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질이 VEGF 길항제, 예컨대, 애플리버셉트(Aflibercept), 베바시주맙(Bevacizumab), 라니비주맙(Ranibizumab) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 경우, 상기 약제학적 조성물은 안약 조성물일 수 있으며, 구체적으로 눈의 유리체 내 투여용 주사제일 수 있다.
상기 액상 조성물 또는 약학적 조성물은 유리체 내 투여를 위한 것일 수 있다.
다른 예는 단백질을 상기한 안정화제와 혼합하는 단계를 포함하는 단백질의 안정화 방법 또는 안정화된 수성 액상 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 명세서에서는, 단백질의 안정성을 증진시키기 위한 안정화용 조성물, 이를 포함하는 단백질의 안정한 액상 조성물, 및 단백질을 포함하는 안정한 액상 조성물의 제조 방법이 제공된다.
일반적으로, 단백질 의약 조성물 제조에 있어서 단백질 변성을 방지하기 위한 범위로 pH를 조절하기 위하여 완충제 사용이 불가피한데, 이 경우 완충제에 의한 이온강도(ionic strength) 효과로 인하여 단백질 응집이 일어나고, 단백질의 제형 안정성이 저해된다. 특히, 안구 투여(예컨대, 유리체 내 투여)를 위한 단백질 제형의 경우, 단백질 응집에 의하여 생성된 작은 입자들로 인하여 안구 내 압력이 증가하고 염증 발생 위험이 증가할 가능성이 있다. 이에, 본 발명은 완충제에 의한 단백질의 응집 및 물리화학적 불안정성을 최소화하기 위해, 완충제를 포함하지 않으면서 적정 pH가 유지되고 단백질의 제형 안정성이 우수한 단백질의 안정화용 제형을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
일 예는
안정화제; 및
계면활성제
를 포함하는, 단백질의 안정화용 조성물을 제공한다. 상기 안정화용 조성물은 pH 4 내지 8, 예컨대, pH 5.2 내지 7.2, pH 5.5 내지 7, pH 5.5 내지 6.6, pH 5.5 내지 6.4, pH 5.5 내지 6.2, pH 5.8 내지 7, pH 5.8 내지 6.6, pH 5.8 내지 6.4, pH 5.8 내지 6.2, pH 5.7 내지 6.7, 또는 pH 5.9 내지 6.5인 것일 수 있다. 상기 안정화용 조성물은 완충제를 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 계면활성제는 단백질 제형에 통상적으로 사용되는 모든 비이온성 계면활성제 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 안정화용 조성물은 수성의 조성물일 수 있다.
다른 예는 단백질; 안정화제; 및 계면활성제를 포함하는, 액상 조성물을 제공한다. 상기 액상 조성물은 pH 4 내지 8, 예컨대, pH 5.2 내지 7.2, pH 5.5 내지 7, pH 5.5 내지 6.6, pH 5.5 내지 6.4, pH 5.5 내지 6.2, pH 5.8 내지 7, pH 5.8 내지 6.6, pH 5.8 내지 6.4, pH 5.8 내지 6.2, pH 5.7 내지 6.7, 또는 pH 5.9 내지 6.5인 것일 수 있다. 상기 액상 조성물은 완충제를 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 액상 조성물은 수성의 조성물일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 단백질의 액상 조성물은, 완충제를 포함하지 않으면서도, 단백질 안정성에 영향을 미치는 중요한 인자 중 하나인 pH를 적정 범위로 유지시킬 수 있고, 조성물 내 단백질이 안정성이 우수하다는 특징을 가지며(예컨대, 단백질의 %HMW, %charge variant 및/또는 %main 등의 단백질 안정성 표시 인자가 우수함), 이러한 pH 유지 및/또는 우수한 단백질 안정성의 특성은 반복적으로 재현 가능한 것을 특징으로 한다.
예컨대, 상기 액상 조성물은,
(1) 단백질 5 mg/ml 내지 300 mg/ml;
(2) 안정화제; 및
(3) 계면활성제
를 포함하고, pH 4 내지 8, 예컨대, pH 5.2 내지 7.2, pH 5.5 내지 7, pH 5.5 내지 6.6, pH 5.5 내지 6.4, pH 5.5 내지 6.2, pH 5.8 내지 7, pH 5.8 내지 6.6, pH 5.8 내지 6.4, pH 5.8 내지 6.2, pH 5.7 내지 6.7, 또는 pH 5.9 내지 6.5인 것일 수 있다. 상기 액상 조성물은 완충제를 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 액상 조성물 내의 단백질 함량은 300 mg/ml 이하, 250 mg/ml 이하, 200 mg/ml 이하, 150 mg/ml 이하, 125 mg/ml 이하, 100 mg/ml 이하, 90 mg/ml 이하, 80 mg/ml 이하, 70 mg/ml 이하, 60 mg/ml 이하, 또는 50 mg/ml 이하일 수 있으며, 예컨대, 5 mg/ml 내지 300 mg/ml, 5 mg/ml 내지 250 mg/ml, 5 mg/ml 내지 200 mg/ml, 5 mg/ml 내지 150 mg/ml, 5 mg/ml 내지 125 mg/ml, 5 mg/ml 내지 100 mg/ml, 5 mg/ml 내지 90 mg/ml, 5 mg/ml 내지 80 mg/ml, 5 mg/ml 내지 70 mg/ml, 5 mg/ml 내지 60 mg/ml, 5 mg/ml 내지 50 mg/ml, 10 mg/ml 내지 300 mg/ml, 10 mg/ml 내지 250 mg/ml, 10 mg/ml 내지 200 mg/ml, 10 mg/ml 내지 150 mg/ml, 10 mg/ml 내지 125 mg/ml, 10 mg/ml 내지 100 mg/ml, 10 mg/ml 내지 90 mg/ml, 10 mg/ml 내지 80 mg/ml, 10 mg/ml 내지 70 mg/ml, 10 mg/ml 내지 60 mg/ml, 10 mg/ml 내지 50 mg/ml, 20 mg/ml 내지 300 mg/ml, 20 mg/ml 내지 250 mg/ml, 20 mg/ml 내지 200 mg/ml, 20 mg/ml 내지 150 mg/ml, 20 mg/ml 내지 125 mg/ml, 20 mg/ml 내지 100 mg/ml, 20 mg/ml 내지 90 mg/ml, 20 mg/ml 내지 80 mg/ml, 20 mg/ml 내지 70 mg/ml, 20 mg/ml 내지 60 mg/ml, 20 mg/ml 내지 50 mg/ml, 30 mg/ml 내지 300 mg/ml, 30 mg/ml 내지 250 mg/ml, 30 mg/ml 내지 200 mg/ml, 30 mg/ml 내지 150 mg/ml, 30 mg/ml 내지 125 mg/ml, 30 mg/ml 내지 100 mg/ml, 30 mg/ml 내지 90 mg/ml, 30 mg/ml 내지 80 mg/ml, 30 mg/ml 내지 70 mg/ml, 30 mg/ml 내지 60 mg/ml, 또는 30 mg/ml 내지 50 mg/ml일 수 있다.
또는, 일 구체예에서, 상기 액상 조성물 내의 단백질 함량은 5 mg/ml 내지 50 mg/ml, 5 mg/ml 내지 49 mg/ml, 5 mg/ml 내지 48 mg/ml, 5 mg/ml 내지 47 mg/ml, 5 mg/ml 내지 46 mg/ml, 5 mg/ml 내지 45 mg/ml, 5 mg/ml 내지 44 mg/ml, 5 mg/ml 내지 43 mg/ml, 5 mg/ml 내지 42 mg/ml, 5 mg/ml 내지 41 mg/ml, 10 mg/ml 내지 50 mg/ml, 10 mg/ml 내지 49 mg/ml, 10 mg/ml 내지 48 mg/ml, 10 mg/ml 내지 47 mg/ml, 10 mg/ml 내지 46 mg/ml, 10 mg/ml 내지 45 mg/ml, 10 mg/ml 내지 44 mg/ml, 10 mg/ml 내지 43 mg/ml, 10 mg/ml 내지 42 mg/ml, 10 mg/ml 내지 41 mg/ml, 20 mg/ml 내지 50 mg/ml, 20 mg/ml 내지 49 mg/ml, 20 mg/ml 내지 48 mg/ml, 20 mg/ml 내지 47 mg/ml, 20 mg/ml 내지 46 mg/ml, 20 mg/ml 내지 45 mg/ml, 20 mg/ml 내지 44 mg/ml, 20 mg/ml 내지 43 mg/ml, 20 mg/ml 내지 42 mg/ml, 20 mg/ml 내지 41 mg/ml, 30 mg/ml 내지 50 mg/ml, 30 mg/ml 내지 49 mg/ml, 30 mg/ml 내지 48 mg/ml, 30 mg/ml 내지 47 mg/ml, 30 mg/ml 내지 46 mg/ml, 30 mg/ml 내지 45 mg/ml, 30 mg/ml 내지 44 mg/ml, 30 mg/ml 내지 43 mg/ml, 30 mg/ml 내지 42 mg/ml, 또는 30 mg/ml 내지 41 mg/ml일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 액상 조성물은 pH 4 내지 8, 예컨대, pH 5.2 내지 7.5, pH 5.2 내지 7.2, pH 5.2 내지 7, pH 5.2 내지 6.8, pH 5.2 내지 6.6, pH 5.2 내지 6.5, pH 5.2 내지 6.4, pH 5.2 내지 6.2, pH 5.5 내지 7.5, pH 5.5 내지 7.2, pH 5.5 내지 7, pH 5.5 내지 6.8, pH 5.5 내지 6.7, pH 5.5 내지 6.6, pH 5.5 내지 6.5, pH 5.5 내지 6.4, pH 5.5 내지 6.2, pH 5.7 내지 7.5, pH 5.7 내지 7.2, pH 5.7 내지 7, pH 5.7 내지 6.8, pH 5.7 내지 6.7, pH 5.7 내지 6.6, pH 5.7 내지 6.5, pH 5.7 내지 6.4, pH 5.7 내지 6.2, pH 5.8 내지 7.5, pH 5.8 내지 7.2, pH 5.8 내지 7, pH 5.8 내지 6.8, pH 5.8 내지 6.7, pH 5.8 내지 6.6, pH 5.8 내지 6.5, pH 5.8 내지 6.4, pH 5.8 내지 6.2, pH 5.9 내지 7.5, pH 5.9 내지 7.2, pH 5.9 내지 7, pH 5.9 내지 6.8, pH 5.9 내지 6.7, pH 5.9 내지 6.6, pH 5.9 내지 6.5, pH 5.9 내지 6.4, pH 5.9 내지 6.3, pH 5.9 내지 6.2, 또는 pH 6.2인 것일 수 있다.
본원 명세서에서 제공되는 액상 조성물은 단백질의 응집을 유발하는 완충제를 포함하지 않아서 단백질의 안정성이 증진된 것을 특징으로 한다. 상기 액상 조성물의 구성 성분에서 제외된 완충제는 통상적으로 사용되는 buffering capacity를 갖는 완충제들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 상기 완충제는 (1) 인산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 탄산 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산; (2) 상기 산들의 약학적으로 허용 가능한 염(예컨대, 나트륨염, 칼륨염 등), (3) 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산, 및 (4) 상기 아미노산의 약학적으로 허용 가능한 염(예컨대, 히스티딘-HCl, 히스티딘-아세테이트 등과 같은 염산염 또는 아세테이트 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 액상 조성물은 인산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 탄산, 상기 산(인산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 탄산)들의 약학적으로 허용 가능한 염(예컨대, 나트륨염, 칼륨염 등), 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산, 상기 아미노산(히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산)들의 약학적으로 허용 가능한 염(예컨대, 히스티딘-HCl, 히스티딘-아세테이트 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 액상 조성물은 안정화제를 전체 조성물 기준으로 0.5%(w/v) 내지 50%(w/v)의 양으로 포함할 수 있다. 상기 안정화제는 등장화제 작용을 하는 것일 수 있으며, 예컨대, 당알코올 등의 폴리올 및 당으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 안정화제는 트레할로오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 글루코오스, 글리세롤 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 안정화제는 1 내지 20%(w/v), 1 내지 15%(w/v), 1 내지 10%(w/v), 5 내지 20%(w/v), 5 내지 15%(w/v), 5 내지 10%(w/v), 5.5 내지 20%(w/v), 5.5 내지 15%(w/v), 5.5 내지 10%(w/v), 6 내지 20%(w/v), 6 내지 15%(w/v), 6 내지 10%(w/v), 7 내지 20%(w/v), 7 내지 15%(w/v), 7 내지 10%(w/v), 7.8 내지 20%(w/v), 7.8 내지 15%(w/v), 7.8 내지 10%(w/v), 7.8 내지 8.2%(w/v), 또는 8%(w/v)의 트레할로오스, 1 내지 20%(w/v), 1 내지 15%(w/v), 1 내지 10%(w/v), 5 내지 20%(w/v), 5 내지 15%(w/v), 5 내지 10%(w/v), 5.5 내지 20%(w/v), 5.5 내지 15%(w/v), 5.5 내지 10%(w/v), 6 내지 20%(w/v), 6 내지 15%(w/v), 6 내지 10%(w/v), 7 내지 20%(w/v), 7 내지 15%(w/v), 7 내지 10%(w/v), 7.8 내지 20%(w/v), 7.8 내지 15%(w/v), 7.8 내지 10%(w/v), 7.8 내지 8.2%(w/v), 또는 8%(w/v)의 수크로오스, 및 0.5 내지 10%(w/v), 0.5 내지 7.5%(w/v), 0.5 내지 5%(w/v), 1 내지 10%(w/v), 1 내지 7.5%(w/v), 1 내지 5%(w/v), 3 내지 10%(w/v), 3 내지 7.5%(w/v), 3 내지 5%(w/v), 4 내지 5%(w/v), 또는 4.5%(w/v)의 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 안정화제는 염화나트륨을 포함하지 않는 것일 수 있다. 이와 같이, 본 명세서에서 제공되는 단백질의 액상 조성물은 안정화제로서 염화나트륨을 포함하지 않음으로써, 단백질의 안정성이 보다 증진(예컨대, Δ%HMW 감소)된 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 액상 조성물은 계면활성제를, 전체 조성물 기준으로, 0.001 내지 3 %(w/v), 0.001 내지 2 %(w/v), 0.001 내지 1 %(w/v), 0.001 내지 0.5 %(w/v), 0.001 내지 0.1 %(w/v), 0.001 내지 0.05 %(w/v), 0.01 내지 3 %(w/v), 0.01 내지 2 %(w/v), 0.01 내지 1 %(w/v), 0.01 내지 0.5 %(w/v), 0.01 내지 0.1 %(w/v), 0.01 내지 0.05 %(w/v), 또는 0.03 %(w/v)의 양으로 포함할 수 있다. 상기 계면활성제는 단백질을 액상 조성물 매질에 고르게 분산시킬 수 있는 약학적으로 허용 가능한 모든 계면활성제들로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제일 수 있으며, 예컨대, 폴리소르베이트류(예컨대, 폴리소르베이트 20(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트), 폴리소르베이트 40(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노팔미테이트), 폴리소르베이트 60(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노스테아레이트), 폴리소르베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레이트); 상기 폴리옥시에틸렌 뒤의 수치(20)은 옥시에틸렌기(-(CH2CH2O)-)의 총 개수를 의미함), 폴록사머(PEO-PPO-PEO 공중합체; PEO: poly(ethylene oxide), PPO: poly(propylene oxide)), 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 화합물(예컨대, 폴리옥시에틸렌-스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(알킬: C1-C30), 폴리옥시에틸렌 모노라이릴 에테르, 알킬페닐 폴리옥시에틸렌 코폴리머(알킬: C1-C30) 등), 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulphate, SDS) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트류(예컨대, 폴리소르베이트 20)일 수 있다.
상기 액상 조성물은 앞서 설명된 함량의 단백질, 안정화제, 및 계면활성제와, 잔량의 수성 매질(예컨대, 물(정제수), 생리식염수, 주사 용수 등)을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 액상 조성물은 생체와 등장성인 것일 수 있다. 예컨대, 상기 액상 조성물은 삼투압이 약 200 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 200 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 200 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg, 약 250 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 250 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 또는 약 250 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg일 수 있으며, 예컨대, 약 270 mOsm/kg 내지 약 290 mOsm/kg인 것일 수 있다. 이와 같은 삼투압은 상기 안정화제에 의하여 조절될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 액상 조성물은 전기 전도도가 약 0 mS/cm 이상(또는 초과), 약 0.0001 mS/cm 이상, 또는 약 0.001 mS/cm 이상, 예컨대, 약 0 mS/cm 내지 약 10 mS/cm, 약 0 mS/cm 내지 약 7 mS/cm, 0 mS/cm 내지 약 5 mS/cm, 약 0 mS/cm 내지 약 2.5 mS/cm, 약 0 mS/cm 내지 약 1 mS/cm, 약 0 mS/cm 내지 약 0.5 mS/cm, 약 0 mS/cm 내지 약 0.1 mS/cm, 약 0 mS/cm 내지 약 0.05 mS/cm, 약 0 mS/cm 초과 약 10 mS/cm 이하, 약 0 mS/cm 초과 약 7 mS/cm 이하, 0 mS/cm 초과 약 5 mS/cm 이하, 약 0 mS/cm 초과 약 2.5 mS/cm 이하, 약 0 mS/cm 초과 약 1 mS/cm 이하, 약 0 mS/cm 초과 약 0.5 mS/cm 이하, 약 0 mS/cm 초과 약 0.1 mS/cm 이하, 약 0 mS/cm 초과 약 0.05 mS/cm 이하, 약 0.0001 mS/cm 내지 약 10 mS/cm, 약 0.0001 mS/cm 내지 약 7 mS/cm, 0.0001 mS/cm 내지 약 5 mS/cm, 약 0.0001 mS/cm 내지 약 2.5 mS/cm, 약 0.0001 mS/cm 내지 약 1 mS/cm, 약 0.0001 mS/cm 내지 약 0.5 mS/cm, 약 0.0001 mS/cm 내지 약 0.1 mS/cm, 약 0.0001 mS/cm 내지 약 0.05 mS/cm, 약 0.001 mS/cm 내지 약 10 mS/cm, 약 0.001 mS/cm 내지 약 7 mS/cm, 0.001 mS/cm 내지 약 5 mS/cm, 약 0.001 mS/cm 내지 약 2.5 mS/cm, 0.001 mS/cm 내지 약 1 mS/cm, 약 0.001 mS/cm 내지 약 0.5 mS/cm, 약 0.001 mS/cm 내지 약 0.1 mS/cm, 또는 약 0.001 mS/cm 내지 약 0.05 mS/cm인 것일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 액상 조성물에서, 단백질은 단백질 약물, 예컨대, 분자량이 10 내지 500 kDa, 10 내지 400 kDa, 10 내지 300 kDa, 10 내지 200 kDa, 또는 10 내지 150 kDa인 단백질(예컨대, 융합 단백질)일 수 있다. 일 예에서, 상기 단백질은 VEGF(vascular endothelial growth factor) 길항제, 예컨대, 인간 VEGF 수용체 1 및 VEGF 수용체 2의 세포 외 도메인으로부터 유래하는 VEGF 결합 부위 및 인간 IgG1의 Fc 부위가 융합된 VEGF-특이적 융합 단백질일 수 있다. 일 구체예에서 상기 VEGF-특이적 융합 단백질은 인간 VEGF 수용체 1(Flt1)의 면역 글로불린-유사(Ig) 도메인 2 및 인간 VEGF 수용체 2(Flt1 또는 Flt4)의 Ig 도메인 3을 필수적으로 포함하는 부위와 인간 IgG1의 Fc 부위가 융합된 융합 단백질일 수 있으며, 예컨대, 다음의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 애플리버셉트(Aflibercept)일 수 있다.
애플리버셉트 아미노산 서열(서열번호 1)
SDTGRPFVEM YSEIPEIIHM TEGRELVIPC RVTSPNITVT LKKFPLDTLI PDGKRIIWDS
RKGFIISNAT YKEIGLLTCE ATVNGHLYKT NYLTHRQTNT IIDVVLSPSH GIELSVGEKL
VLNCTARTEL NVGIDFNWEY PSSKHQHKKL VNRDLKTQSG SEMKKFLSTL TIDGVTRSDQ
GLYTCAASSG LMTKKNSTFV RVHEKDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR
TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN
GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS
DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH
YTQKSLSLSP G
(Disulfide bridge: 30-79; 124-185; 246-306; 352-410, Dimer: 211; 214)
상기 액상 조성물에 포함되는 단백질은 재조합적 또는 합성적으로 생산된 것일 수 있다
본 명세서에서 제공되는 액상 조성물은 약 40℃의 고온에서 4주일 이상 안정하게 유지되거나, 및/또는 1 cycle 이상(예컨대, 2 cycle 이상, 3 cycle 이상, 4 cycle 이상, 또는 5 cycle 이상)의 동결/해동 조건, 진동 조건(100rpm 이상(예컨대, 200rpm 이상, 300rpm 이상, 또는 400rpm 이상) 및 24시간 이상(예컨대, 36시간 이상, 48시간 이상, 60 시간 이상, 또는 72 시간 이상)) 등의 가혹 조건 하에서도 안정하게 유지된다.
상기 용어 "안정성이 우수하다" 또는 "안정하게 유지된다" 함은 보관 시에 조성물 내의 단백질의 구조, 및/또는 물리적, 화학적, 및/또는 생물학적 특성이 유지됨을 의미할 수 있다(예컨대, 보관 중의 낮은 단백질 중합체 형성률, 낮은 단백질 응집률, 낮은 단백질 분해율, 및/또는 낮은 변성률 등). 단백질의 안정성을 측정하는 다양한 분석 기술이 관련 기술분야에 잘 알려져 있다.
예컨대, 본 명세서에서 제공되는 액상 조성물은 단백질(예컨대, 융합 단백질) 함량이 40 mg/ml인 경우(pH 6.2), 통상적인 SEC(size exclusion chromatography)로 40℃에서 4주일 동안 보관 시에 측정된 단백질 중합체 형성률 또는 응집률(High Molecular Weight %(w/v); %HMW)의 변화량(보관 4주차의 %HMW - 0주차(보관 개시 시(initial)의 %HMW)이 약 9% 미만, 예컨대, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5.5% 이하, 약 5% 이하, 약 4.5% 이하, 또는 약 4% 이하 (e.g., 약 0.1 내지 약 8%, 약 0.5 내지 약 8%, 약 1 내지 약 8%, 약 1.5 내지 약 8%, 약 2 내지 약 8%, 약 2.5 내지 약 8%, 약 3 내지 약 8%, 약 3.5 내지 약 8%, 약 0.1% 내지 약 7%, 약 0.5% 내지 약 7%, 약 1% 내지 약 7%, 약 1.5% 내지 약 7%, 약 2% 내지 약 7%, 약 2.5% 내지 약 7%, 약 3 내지 약 7%, 약 3.5 내지 약 7%, 약 0.1% 내지 약 6%, 약 0.5% 내지 약 6%, 약 1% 내지 약 6%, 약 1.5% 내지 약 6%, 약 2% 내지 약 6%, 약 2.5% 내지 약 6%, 약 3 내지 약 6%, 약 3.5 내지 약 6%, 약 0.1% 내지 약 5.5%, 약 0.5% 내지 약 5.5%, 약 1% 내지 약 5.5%, 약 1.5% 내지 약 5.5%, 약 2% 내지 약 5.5%, 약 2.5% 내지 약 5.5%, 약 3 내지 약 5.5%, 약 3.5 내지 약 5.5%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1.5% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 5%, 약 2.5% 내지 약 5%, 약 3 내지 약 5%, 약 3.5 내지 약 5%, 약 0.1% 내지 약 4.5%, 약 0.5% 내지 약 4.5%, 약 1% 내지 약 4.5%, 약 1.5% 내지 약 4.5%, 약 2% 내지 약 4.5%, 약 2.5% 내지 약 4.5%, 약 3 내지 약 4.5%, 약 3.5 내지 약 4.5%, 약 0.1% 내지 약 4%, 약 0.5% 내지 약 4%, 약 1% 내지 약 4%, 약 1.5% 내지 약 4%, 약 2% 내지 약 4%, 약 2.5% 내지 약 4%, 약 3 내지 약 4%, 또는 약 3.5 내지 약 4%)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 본 명세서에서 제공되는 액상 조성물은 단백질(예컨대, 융합 단백질) 함량이 40 mg/ml인 경우(pH 6.2), freeze/thaw(5 cycles; 각 cycle: -70℃에서 18시간 이상 냉동 + 상온(25℃)에서 1-2시간 해동) 수행 후 통상적인 SEC(size exclusion chromatography)로 측정된 단백질 중합체 형성률 또는 응집률(High Molecular Weight %(w/v); %HMW)의 변화량(5 cycles 수행 후 %HMW - 개시 시(initial)의 %HMW)이 약 0.15% 미만, 예컨대, 약 0.13% 이하, 약 0.1% 이하, 약 0.08% 이하, 약 0.06% 이하, 약 0.05% 이하, 약 0.04% 이하, 또는 약 0.03% 이하 (하한값은 약 0.001%, 약 0.005%, 또는 약 0.01일 수 있음)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 본 명세서에서 제공되는 액상 조성물이 애플리버셉트 40 mg/ml을 포함하는 경우(pH 6.2), 40℃에서 4주일 동안 보관 시 측정된 애플리버셉트의 VEGF에 대한 %RPA(Relative Potency Activity) 변화량(4주차 %RPA - 개시 시(initial) %RPA)이 약 -10% 내지 약 10%, 약 -10 내지 약 7%, 약 -10% 내지 약 5%, -10% 내지 약 4%, -10% 내지 약 3%, 약 -7% 내지 약 10%, 약 -7 내지 약 7%, 약 -7% 내지 약 5%, -7% 내지 약 4%, -7% 내지 약 3%, 약 -6% 내지 약 10%, 약 -6 내지 약 7%, 약 -6% 내지 약 5%, -6% 내지 약 4%, -6% 내지 약 3%, 약 -5% 내지 약 10%, 약 -5 내지 약 7%, 약 -5% 내지 약 5%, -5% 내지 약 4%, 또는 -5% 내지 약 3%인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 상기 액상 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 안과 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 것일 수 있다. 따라서, 일 예는 상기 액상 조성물을 포함하는 안과 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 안과 질환은 비정상적인 혈관생성에 의한 모든 안과 질환들 중에서 선택된 것일 수 있으며, 예컨대, 망막 정맥 폐쇄(망막 정맥 폐쇄성 황반 부종), 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막병증, 맥락막 혈관신생, 연령-관련 황반 변성, 망막 부종, 안허혈증후군(망막허혈증후군) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 안과 질환은 인간 등의 포유 동물에서 발생하는 질환일 수 있다.
다른 예는 상기 액상 조성물을 안과 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 안과 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 투여하는 단계는 안구 내 투여(주입), 예컨대, 유리체 내 투여(주입)에 의한 것일 수 있다. 상기 대상은 인간을 포함하는 포유 동물 중에서 선택될 수 있다. 상기 액상 조성물의 조성, 액상 조성물에 포함된 단백질(예컨대, VEGF 길항제)의 종류, 안과 질환 등은 앞서 설명한 바와 같다. 다른 예는 상기 액상 조성물을 안구 내 또는 유리체 내 투여하는 단계를 포함하는, 상기 액상 조성물 또는 상기 액상 조성물에 포함된 단백질(예컨대, VEGF 길항제)의 안구 내 또는 유리체 내 전달 방법, 또는 상기 액상 조성물 또는 상기 액상 조성물에 포함된 단백질(예컨대, VEGF 길항제)의 안구 내 또는 유리체 내 전달 강화 방법을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물(예컨대, 정제수), 생리식염수, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 액상 조성물 또는 약학적 조성물은 인간 등의 포유 동물에 투여하기 위한 것일 수 있다.
상기 액상 조성물 또는 약학적 조성물은 경구 또는 비경구적 경로로 투여되는 것일 수 있다. 비경구 투여(예컨대, 주사)인 경우에는 안구 내 투여(예컨대, 유리체 내 투여), 정맥 내 투여, 피하 투여, 근육 투여, 복강 내 투여, 내피 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여, 또는 종양 내 투여 등일 수 있으며, 예컨대, 유리체 내 투여로 투여할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 액상 조성물 또는 약학 조성물은 앞서 설명한 VEGF 길항제를 포함하는 안약 조성물일 수 있고, 이 경우, 눈의 유리체 내 투여되는 주사제일 수 있다.
다른 예는 단백질을 상기한 안정화용 조성물과 혼합하는 단계를 포함하는 단백질의 안정화 방법 또는 안정화된 액상 조성물의 제조 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 방법은,
(1) 단백질;
(2) 안정화제; 및
(3) 계면활성제
를 혼합하는 단계를 포함하는, 단백질의 안정화 방법 또는 안정화된 수성 액상 조성물의 제조 방법이 제공된다. 상기 방법은 완충제를 혼합하는 단계를 수행하지 않는 것을 특징으로 한다.
단백질의 안정화 방법 또는 안정화된 수성 액상 조성물의 제조 방법에 사용되는 각 성분의 종류 및 함량의 구체적 설명은 앞서 기재한 바와 같다.
완충제를 포함하지 않는 단백질의 액상 제형을 제공함으로써, 단백질의 응집(aggregation), 단편화(degradation), 이성질체화(isomerization) 등으로 인한 생리 활성의 저하 억제 효과가 기존의 완충제를 포함하는 제형 및 시판 제형(예컨대, EYLEA®) 대비 동등 이상으로 우수하여 해당 단백질을 가혹 조건에서도 비교적 장기간 안정하게 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 3에서 측정된 시험 제형의 40℃에서 4주 보관시의 4 주 동안의 %HMW(High-molecular weight %) 변화율(Δ%HMW)을 보여주는 그래프이다.
도 2는 실시예 4에서 측정된 시험 제형의 40℃에서 4주 보관시의 4 주 동안의 %Acidic 변화율(Δ%Acidic)을 보여주는 그래프이다.
도 3a 및 3b는 실시예 4에서 측정된 시험 제형의 40℃에서 4주 보관시의 4 주 동안의 %Main 변화율(Δ%Main1 및 %Main2)을 보여주는 그래프이다.
도 4는 실시예 5에서 측정된 시험 제형의 40℃에서 4주 보관시의 4주 동안의 %RPA(Relative Potency Activity) 변화율(Δ%RPA)을 보여주는 그래프이다.
도 5는 실시예 6에서 측정된 시험 제형의 Freeze/thaw(5 cycles) 조건 하에서의 %HMW(High-molecular weight %) 변화율(Δ%HMW)을 보여주는 그래프이다.
도 6은 실시예 6에서 측정된 시험 제형의 Agitation Stress(400 rpm, 72 hours) 조건 하에서의 %HMW(High-molecular weight %) 변화율(Δ%HMW)을 보여주는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1. 액상 조성물의 제조
단백질 약물로서 VEGF 길항제 작용을 하는 융합 단백질인 애플리버셉트(Aflibercept; 인간 VEGF 수용체 1 및 2의 세포외 도메인 유래의 VEGF 결합 부위와 인간 IgG1의 Fc 부위와의 융합 단백질; CAS Number: 862111-32-8; 서열번호 1)를 사용하여, 하기의 표 1의 조성으로 단백질 약물의 액상 제형을 제조하였다:
제형 단백질 약물 농도 pH 완충제 안정화제 계면활성제
제형 1(Buffer-freew/ sucrose) 40 mg/ml 6.2 불포함 8%(w/v) Sucrose 0.03%(w/v) PS20
제형 2(Buffer-free w/ trehalose) 40 mg/ml 6.2 불포함 8%(w/v) Trehalose 0.03%(w/v) PS20
제형 3(Buffer w/ sucrose) 40 mg/ml 6.2 10 mM 인산나트륨 8%(w/v) Sucrose 0.03%(w/v) PS20
제형 4(Buffer w/ trehalose) 40 mg/ml 6.2 10 mM 인산나트륨 8%(w/v) Trehalose 0.03%(w/v) PS20
EYLEA®(대조군) 40 mg/ml 6.2 10 mM 인산나트륨 5%(w/v) Sucrose, 40 mM NaCl 0.03%(w/v) PS20
(PS20: 폴리소르베이트 20)
실시예 2. pH 측정
실시예 1에서 제조된 완충제 불포함 액상 제형의 pH 측면 안정성을 확인하기 위해, 40℃/4주 조건에서 보관하면서 pH를 측정 후 재현성 확인을 위해 동일한 액상 제형 2종을 추가 제조하여 40℃/4주, F/T 5 cycling 조건 및 교반(agitation) 조건에서 pH를 추가 측정하였다. 상기 측정된 pH(initial pH, 4주차 pH, F/T 5 cycle 후 pH 및 교반 후 pH, 및 pH(해당 조건 pH - initial pH)를 표 2에 나타내었다
pH pH
제형 Initial 40˚C/4 Wk F/T 5 Cycles Agitation 40˚C/4 Wk F/T 5 Cycles Agitation
제형 1(N=3) 6.0[SD:0.04] 6.1[SD:0.09] N/A N/A 0.1[SD:0.097] N/A N/A
제형 2(N=3) 5.9[SD:0.02] 6.0[SD:0.03] N/A N/A 0.0[SD:0.04] N/A N/A
추가 제형 1(N=3) 6.1[SD:0.02] 6.1[SD:0.02] 6.1[SD:0.02] 6.1[SD:0.03] 0.0[SD:0.01] 0.0[SD:0.03] 0.0[SD:0.01]
추가 제형 2(N=3) 6.1[SD:0.04] 6.0[SD:0.07] 6.1[SD:0.05] 6.0[SD:0.03] 0.0[SD:0.06] 0.0[SD:0.04] 0.0[SD:0.02]
표 2 에 나타난 바와 같이, 단백질 약물 농도 40 mg/ml 조건 하에서, 완충제를 포함하지 않는 제형 1 및 2는, thermal stress(40℃/4 wk), F/T cycle 및 교반(agitation) 조건에서도 초기(initial) 대비 pH의 유의한 변화가 없는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본 발명의 제형이 단백질 안정성 측면에서 가장 중요한 인자인 pH를 유지시켜주는 완충(buffering) 효과를 갖는 완충제를 포함하지 않음에도 pH를 소망하는 범위로 유지시킬 수 있음과, 이러한 pH 유지 효과가 반복적으로 재현 가능함을 보여준다.
실시예 3. HMW 함량( % ) 측정(40℃ 조건)
실시예 1에서 제조된 액상 제형의 안정성을 시험하기 위하여, 단백질 약물 농도 40 mg/ml, pH 6.2, 및 40℃ 조건에서 4주 동안 보관하면서 제형 내의 단백질 약물의 응집 정도를 알 수 있는 HMW 함량(%)(%HMW; % high molecular weight; 중량 기준)를 SE-HPLC로 측정하였다.
보다 구체적으로, 모노머가 검출되는 시간 보다 먼저 검출되는 물질을 HMW로 정의하며, %HMW는 HPLC(Waters 2695 separation module alliance) 및 column(Tosoh, TSK-gel G3000 SWXL)을 사용하여 1.0 mL/min flow rate, 17 min injection time 조건 하에서 측정하였다(%HMW = AreaH/AreaTOTAL x 100).
상기 측정된 %HMW(initial %HMW, 1주차 %HMW, 2주차 %HMW, 4주차 %HMW, Δ%HMW(해당 주차 %HMW - initial %HMW))를 표 3에 및 도 1에 나타내었다:
제형 Initial 40℃/1 wk 40℃/2 wk 40℃/4 wk
%HMW %HMW Δ%HMW %HMW Δ%HMW %HMW Δ%HMW
제형 1(N=3) 1.04[SD:0.00] 2.09[SD:0.07] 1.05[SD:0.07] 2.89[SD:0.10] 1.85[SD:0.10] 4.96[SD:0.18] 3.92[SD:0.18]
제형 2(N=3) 1.05[SD:0.02] 2.07[SD:0.02] 1.02 [SD:0.02] 2.87[SD:0.03] 1.81[SD:0.04] 4.60[SD:0.23] 3.55[SD:0.22]
제형 3(N=3) 0.81[SD:0.09] 2.70[SD:0.08] 1.88[SD:0.03] 4.22[SD:0.14] 3.42[SD:0.05] 7.06[SD:0.14] 6.25[SD:0.05]
제형 4(N=3) 0.84[SD:0.07] 2.84[SD:0.07] 1.98[SD:0.02] 4.53[SD:0.15] 3.69[SD:0.08] 7.63[SD:0.43] 6.79[SD:0.36]
EYLEA®(N=3) 1.81[SD:0.03] 4.48[SD:0.03] 2.67[SD:0.01] 7.06[SD:0.06] 5.26[SD:0.04] 11.57[SD:0.02] 9.76[SD:0.06]
표 3 및 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 단백질 약물 농도 40 mg/ml 및 pH 6.2 조건 하에서, 제형 1 내지 4가 EYLEA® 대비 SE-HPLC 분석 기반 Δ%HMW 감소 효과가 우수하였다. 특히 완충제를 포함하지 않는 제형 1 및 제형 2가 완충제를 포함한 제형 3 및 제형 4와 비교하여 Δ%HMW 감소 효과가 더 우수함을 확인하였다.
실시예 4. Acidic 함량( % ) 및 Main 함량( % ) 측정
실시예 1에서 제조된 제형의 안정성을 시험하기 위하여, 단백질 약물 농도 40 mg/ml, pH 6.2, 및 40℃ 조건에서 4주 동안 보관하면서 조성물 내의 단백질 약물의 변성 정도를 알 수 있는 %Acidic(% Acidic variants 함량; 중량 기준)과 %Main(Charge variant 측면에서 initial 상태의 surface charge를 유지하는 형태의 함량(중량기준))를 imaged capillary isoelectric focusing(icIEF)으로 측정하였다.
보다 구체적으로, %Acidic는 Enzyme(Sialidase A, Sigma-Aldrich) 처리 후 incubation 한 sample을 icIEF instrument(Protein simple, iCE3)을 사용하여 110 sec sample injection duration, 2000 psi sample injection pressure 조건 하에서 acidic isoform을 분석하여 측정하였다.
상기 측정된 %Acidic(initial, 4주차, Δ%Acidic(4주차 %Acidic - initial %Acidic))를 표 4 및 도 2에 나타내었다:
제형 Initial 40℃/4 Wk
%Acidic %Acidic Δ%Acidic
제형 1(N=1) 65.4 78.7 13.3
제형 2(N=1) 65.6 77.5 11.9
제형 3(N=3) 66.5[SD: 1.25] 80.5[SD: 1.05] 14.0[SD: 0.69]
제형 4(N=3) 65.7[SD: 1.40] 80.8[SD: 0.97] 15.2[SD: 1.28]
EYLEA®(N=3) 76.1[SD: 0.70] 86.6[SD: 0.86] 10.5[SD: 0.97]
표 4 및 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 단백질 약물 농도 40 mg/ml 및 pH 6.2 조건 하에서, 완충제를 포함하지 않는 제형 1 및 2의 icIEF 분석 기반 acidic 함량(%) 증가율은 완충제를 포함하는 제형 3 및 4와 비교하여 현저히 낮게 나타났으며, 시판 제형인 대조군(EYLEA®) 제형과는 유의한 차이를 나타내지 않았다. %Main는 CE-SDS(Capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate)로 측정하였다(40℃, 4주). 보다 구체적으로, %Main를 다음의 방법으로 측정하였다: SDS sample buffer(AB Sciex) 및 BME(2-mercaptoethaol, Sigma Aldrich)와 mix한 sample(혼합비: 약 1:50(v:v))을 70℃에서 열처리 후 CE analysis instrument(Beckman Coulter, PA800 plus) 및 32 karat software(Beckman Coulter)를 이용하여 220 nm 하에서 detection되는 %total protein area를 분석하였다. 상기 측정된 측정된 %Main(initial, 4주차, Δ%Main(4주차 %Main - initial %Main))를 표 5 및 도 3a~3b에 나타내었다:
제형 Initial 40℃/4 Wk
%Main1 %Main2 %Main1 %Main2 Δ%Main1 Δ%Main2
제형 1 33.9 61.5 33.2 60.0 -0.7 -1.5
제형 2 34.1 62.0 32.5 60.9 -1.6 -1.1
제형 3 32.9[SD: 2.12] 61.6[SD: 1.38] 31.5[SD: 1.97] 59.3[SD: 1.29] -1.4[SD:0.15] -2.3[SD:0.10]
제형 4 32.7[SD: 2.00] 61.6[SD: 1.38] 31.3[SD: 2.06] 59.7[SD: 1.22] -1.3[SD: 0.06] -1.9[SD: 0.21]
EYLEA® 37.1[SD: 0.12] 55.7[SD: 0.15] 35.2[SD: 0.00] 54.4[SD: 0.15] -1.9[SD: 0.12] -1.3[SD: 0.10]
(Main1: N-glycan 4N form; Main 2: N-glycan 5N form)표 5 및 도 3a~3b에 나타난 바와 같이, 단백농도 40 mg/ml 및 pH 6.2 조건 하에서, 완충제를 포함하지 않는 제형 1 및 제형 2의 main 함량(%) 감소율은 완충제를 포함한 제형 3 및 4와 비교하여 낮으며, 시판 제형인 대조군 EYLEA®과 비교하여 유의한 차이가 없음이 확인되었다
실시예 5. Aflibercept의 VEGF 결합 효율 측정
실시예 1에서 제조된 제형 내의 약리학적 유효성분인 Aflibercept의 활성 유지 여부를 시험하기 위하여, 단백질 약물 농도 40 mg/ml, pH 6.2, 및 40℃ 조건에서 4주 동안 보관하면서 조성물 내의 Aflibercept의 VEGF에 대한 %RPA(Relative Potency Activity)를 측정하였다.
%RPA는 다음의 방법으로 측정하였다: Aflibercept 및 VEGF를 순차적으로 loading시킨 96 well plate에 KDR 293 cell(Promega)을 loading 및 incubation 후, Envision microplate reader(Perkin Elmer, Envision 2014)를 이용하여 %RPA(Relative Potency Analysis)를 분석하였다.
상기 측정된 40℃에서의 0주차(initial)와 4주차의 %RPA 및 4주 간의 %RPA 변화율(Δ%RPA)을 표 6 및 도 4에 나타내었다:
후보 Initial 40℃/4 Wk
%RPA %RPA Δ%RPA
제형 1 97 100 3
제형 2 101 96 -5
제형 3 100[SD: 4] 88[SD: 2] -12[SD: 5]
제형 4 104[SD: 6] 88[SD: 6] -16[SD: 6]
EYLEA® 96 82 -14
표 6 및 도 4에 나타난 바와 같이, 단백질 약물 농도 40 mg/ml 및 pH 6.2 조건 하에서, 완충제를 포함하지 않는 제형 1 및 2의 potency(%) 변화율은, 완충제를 포함하는 제형 3 및 4와 시판 제형인 대조군 EYLEA®와 비교하여, 우수한 것이 확인되었다.
실시예 6. HMW 함량( % ) 측정(freeze/thaw 또는 agitation stress 조건)
실시예 1에서 제조된 액상 제형의 다양한 조건 하에서의 안정성을 시험하기 위하여, 단백질 약물 농도 40 mg/ml, pH 6.2, 및 freeze/thaw(5 cycle; 각 cycle: -70℃에서 18시간 이상 냉동 + 상온(25℃)에서 1-2시간 해동) 또는 agitation stress(400 rpm, 72 hours) 조건하에서 제형 내의 단백질 약물의 응집 정도를 알 수 있는 HMW 함량(%)(%HMW; % high molecular weight; 중량 기준)를 SE-HPLC로 측정하였다.
HMW 함량(%)은 실시예 2에 기재된 방법을 참조로 수행하였다.
상기 측정된 Freeze/thaw(5 cycles) 조건 하에서의 각 제형의 %HMW를 표 7에 및 도 5에 나타내었다:
후보 Initial Freeze/thaw(5 Cycles)
%HMW %HMW Δ%HMW
제형 1(n=3) 0.67[SD: 0.01] 0.69[SD: 0.01] 0.02[SD: 0.00]
제형 2(n=3) 0.67[SD: 0.01] 0.69[SD: 0.01] 0.02[SD: 0.00]
제형 3(n=3) 0.81[SD: 0.09] 0.97[SD: 0.09] 0.17[SD: 0.03]
제형 4(n=3) 0.84[SD: 0.07] 0.99 [SD: 0.08] 0.15[SD: 0.03]
EYLEA®(n=3) 1.81[SD: 0.03] 1.95[SD: 0.01] 0.15[SD: 0.02]
표 7에 및 도 5에 나타난 바와 같이, 단백질 약물 농도 40 mg/ml 및 pH 6.2 조건 하에서, 완충제를 포함하지 않는 제형 1 및 2는, 완충제 포함 제형 3 및 4, 및 대조군 제형 EYLEA®와 비교하여, freeze/thaw 조건에 노출시에 SE-HPLC 분석 기반 HMW 함량(%)의 증가 정도가 낮은 것으로 나타났다. 또한, 상기 측정된 Agitation Stress 조건 하에서의 각 제형의 %HMW를 표 8에 및 도 6에 나타내었다:
후보 Control(No agitation, RT) Agitation(400 rpm, 72 hours)
%HMW %HMW Δ%HMW
제형 1(n=3) 0.81[SD: 0.00] 0.84[SD: 0.00] 0.03[SD: 0.00]
제형 2(n=3) 0.81[SD: 0.02] 0.86[SD: 0.03] 0.06[SD: 0.03]
제형 3(n=3) 1.00[SD: 0.05] 1.03[SD: 0.08] 0.04[SD: 0.03]
제형 4(n=3) 1.03[SD: 0.06] 1.11 [SD: 0.08] 0.08[SD: 0.07]
EYLEA®(n=3) 1.96[SD: 0.01] 1.95[SD: 0.01] -0.01[SD: 0.02]
표 8에 및 도 6에 나타난 바와 같이, 단백질 약물 농도 40 mg/ml 및 pH 6.2 조건 하에서, 완충제를 포함하지 않는 제형 1 및 2는, 완충제 포함 제형 3 및 4, 및 대조군 제형 EYLEA®와 비교하여, agitation stress에 노출시 SE-HPLC 분석 기반 HMW 함량(%)의 유의한 증가가 없는 것으로 나타났다.

Claims (43)

  1. (1) 단백질 5 mg/ml 내지 300 mg/ml;
    (2) 폴리올 및 당으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 안정화제; 및
    (3) 계면활성제
    를 포함하고, pH 4 내지 8인, 액상 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리올은 당알코올인, 액상 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 당알코올은 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 및 글리세롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 액상 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 당은 트레할로오스, 수크로오스, 글루코오스, 및 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 액상 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 함량은 5 mg/ml 내지 250 mg/ml인, 액상 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 함량은 5 mg/ml 내지 200 mg/ml인, 액상 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 함량은 5 mg/ml 내지 150 mg/ml인, 액상 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 함량은 5 mg/ml 내지 100 mg/ml인, 액상 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 함량은 5 mg/ml 내지 50 mg/ml인, 액상 조성물.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 함량은 10 mg/ml 내지 50 mg/ml인, 액상 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 함량은 20 mg/ml 내지 50 mg/ml인, 액상 조성물.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 함량은 30 mg/ml 내지 50 mg/ml인, 액상 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 5.2 내지 7.2인, 액상 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 5.5 내지 7인, 액상 조성물.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 5.5 내지 6.6인, 액상 조성물.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 5.5 내지 6.4인, 액상 조성물.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 5.5 내지 6.2인, 액상 조성물.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 5.8 내지 7인, 액상 조성물.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 5.8 내지 6.6인, 액상 조성물.
  20. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 5.7 내지 6.7인, 액상 조성물.
  21. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 5.9 내지 6.5인, 액상 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정화제는 1 내지 20%(w/v)의 트레할로오스, 1 내지 20%(w/v)의 수크로오스, 및 0.5 내지 10%(w/v)의 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 액상 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 안정화제는 5 내지 12%(w/v)의 트레할로오스, 5 내지 12%(w/v)의 수크로오스, 및 2 내지 7%(w/v)의 만니톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 액상 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정화제는 염화나트륨을 포함하지 않는 것인, 액상 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제인, 액상 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 전체 조성물 기준으로 0.001 내지 3 %(w/v)의 양으로 포함되는 것인, 액상 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 등장성(isotonic)인, 액상 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 분자량이 10 내지 500 kDa인 것인, 액상 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 VEGF 길항제인, 액상 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 VEGF 길항제는 애플리버셉트(Aflibercept)인, 액상 조성물.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 눈의 유리체 내 투여를 위한 것인, 액상 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 액상 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 완충제는,
    인산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 및 탄산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산,
    상기 산의 약학적으로 허용 가능한 염,
    히스티딘, 아스파르트산, 및 글루탐산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산, 및
    상기 아미노산의 약학적으로 허용 가능한 염
    으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 액상 조성물.
  34. 제32항에 있어서, 상기 완충제는 시트르산, 시트르산나트륨, 아세트산, 아세트산나트륨, 히스티딘, 히스티딘-HCl, 및 히스티딘-아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 액상 조성물.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 액상 조성물을 포함하는 눈의 유리체 내 투여용 주사제.
  36. (1) 애플리버셉트(Aflibercept);
    (2) 폴리올 및 당으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 안정화제; 및
    (3) 계면활성제
    를 포함하고, pH 5.7 내지 6.7인, 액상 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 애플리버셉트의 함량은 20mg/ml 내지 50mg/ml이고, pH 는 5.7 내지 6.7인, 액상 조성물.
  38. 제36항에 있어서, 상기 안정화제는 염화나트륨을 포함하지 않는 것인, 액상 조성물.
  39. 제37항에 있어서, 상기 안정화제는 염화나트륨을 포함하지 않는 것인, 액상 조성물.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 액상 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 완충제는,
    인산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 및 탄산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산,
    상기 산의 약학적으로 허용 가능한 염,
    히스티딘, 아스파르트산, 및 글루탐산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산, 및
    상기 아미노산의 약학적으로 허용 가능한 염
    으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 액상 조성물.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 눈의 유리체 내 투여를 위한 것인, 액상 조성물.
  43. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항의 액상 조성물을 포함하는 눈의 유리체 내 투여용 주사제.
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