WO2020053362A1 - Procédé de culture d'un microorganisme d'intérêt et installation associée - Google Patents

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WO2020053362A1
WO2020053362A1 PCT/EP2019/074424 EP2019074424W WO2020053362A1 WO 2020053362 A1 WO2020053362 A1 WO 2020053362A1 EP 2019074424 W EP2019074424 W EP 2019074424W WO 2020053362 A1 WO2020053362 A1 WO 2020053362A1
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WO
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interest
microorganism
culture
culture medium
contaminating microorganisms
Prior art date
Application number
PCT/EP2019/074424
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English (en)
Inventor
Pierre-Alain HOFFMANN
Evelyne GLEYSES
Original Assignee
Kyanos Biotechnologies
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Publication date
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Priority to BR112021004625-9A priority patent/BR112021004625A2/pt
Priority to US17/276,142 priority patent/US20220049211A1/en
Priority to AU2019340582A priority patent/AU2019340582B2/en
Priority to EP19769756.8A priority patent/EP3850082A1/fr
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/06—Hydrolysis; Cell lysis; Extraction of intracellular or cell wall material

Definitions

  • the present invention applies to the field of microbial biomass culture in autotrophy and heterotrophy.
  • the present invention relates to a method of culturing at least one microorganism of interest, in heterotrophy or mixotrophy, and a culture installation in particular suitable for the implementation of said culture method.
  • Heterotrophy is the need for a living organism to feed on preexisting organic constituents.
  • the concept of heterotrophy is opposed to that of autotrophy which is the mode of nutrition of living organisms which can feed only on inorganic food in the presence of an external energy source, for example light (photoautotrophy).
  • Mixotrophy is the mode of nutrition of living organisms characterized by the fact that they are capable of feeding either by autotrophy or by heterotrophy or by the two trophic modes simultaneously or even by primitive bacterial photosynthesis.
  • the heterotrophic or mixotrophic processes in an open environment are not applied today.
  • the open environment generally involves the occurrence of contamination of cultures by various contaminating microorganisms which affect the yield in terms of the culture process due to the consumption by the contaminating microorganism (s), of nutrients intended for the microorganisms of interest.
  • contaminating microorganisms also affect the expected quality of the final product (biomass of microorganisms of interest) simply because of their significant presence.
  • the present invention relates to a method of culturing at least one microorganism of interest, in heterotrophy or mixotrophy, in an aqueous culture medium, contaminating microorganisms developing naturally in said culture medium , characterized in that it comprises:
  • Culture medium is understood to mean a medium comprising nutrients allowing the development of the microorganism of interest and contaminating microorganisms.
  • portion is meant a volume withdrawn per unit of time, for example per day or per hour.
  • portion can be considered as a daily or hourly flow rate, that is to say a volume withdrawn respectively per day or per hour, from the culture medium.
  • This volume is preferably, per day, greater than or equal to once the volume of the culture medium and, preferably, greater than or equal to three times the volume of the culture medium. More preferably, the portion taken corresponds to a volume collected per hour greater than or equal to 1/24 th of the total volume of the culture medium.
  • This volume taken daily makes it possible to maintain a quantity of microorganism of interest and contaminating microorganisms compatible with correct operation of the process which is the subject of the present invention.
  • This culture process has the advantage of allowing the culture in an open or closed environment of microorganisms of interest without affecting the yield of microorganism of interest because, the contaminants being normally troublesome for the culture in an open environment, are useful for the development of or microorganisms of interest according to the process which is the subject of the present invention. Indeed, the lysate of contaminating microorganisms represents an assimilable nutritive contribution for the microorganism of interest, in particular in organic carbon. Culture in an open environment being permitted by this culture process, the investment and operating costs of said process are advantageously minimized because aseptic conditions are not necessary.
  • the invention also meets the following characteristics, carried out separately or in each of their technically operative combinations.
  • the physical separation step comprises a filtration or gravity separation step so as to obtain separately the microorganism of interest on the one hand and the contaminating microorganisms on the other hand.
  • the microorganism of interest separated by the separation step is reintroduced into the culture medium, alone or in admixture with the lysate.
  • the aqueous culture medium is initially devoid of organic carbon.
  • the microorganism of interest is left in autotrophic culture for a time t before the sampling step.
  • the time t is chosen so as to obtain a concentration of microorganism of interest in the culture medium included between 5.10 s cells per milliliter and 1.10 7 cells per milliliter.
  • the culture in autotrophy during time t advantageously makes it possible to validate the correct physiological state of the microorganism of interest and to establish reference data as to its growth performance.
  • a transition from autotrophy mode to mixotrophy mode is achieved by mixing the lysate of contaminating microorganisms with the microorganism of interest, said lysate providing in particular a nutritious supply of organic carbon to the microorganism of interest.
  • the heterotrophy mode is all the more reinforced by a step of supplying organic carbon, supplied by a source other than the lysate of contaminating microorganisms, in culture medium.
  • the method includes a step of supplying organic carbon into the culture medium.
  • This supply of organic carbon can be carried out directly in the culture medium, in the lysate, in the microorganism of interest separated by physical separation, in the lysate / microorganism mixture of separate interest, or in a combination of at least two of these.
  • the culture method comprises a step of concentrating the contaminating microorganisms separated by the physical separation step.
  • concentration step of contaminating microorganisms is advantageous in that it allows lysis of a greater number of contaminating microorganisms during the lysis step.
  • the concentration step comprises a step of filtration or gravity separation so as to obtain separately the concentrated contaminating microorganisms on the one hand and from the culture medium devoid of contaminating microorganisms on the other hand .
  • This has the advantage of allowing the recycling of the culture medium devoid of contaminating microorganisms.
  • this has the particular advantage of reducing the costs of lysis due to a reduction in the volume of contaminating microorganisms to be lysed following concentration.
  • the culture medium comprises several microorganisms of different interest, said process comprising, upstream of the physical separation step, a prior step of isolation of a single type of microorganism of interest chosen or from a set of microorganisms of different interests chosen from said sampled portion, so that when this portion is the subject of physical separation it includes only said single type of microorganism of interest chosen or said set microorganisms of different interests chosen.
  • the culture process comprises a repeated cycle of its stages.
  • the method comprises a repeated cycle of at least the steps of sampling, physical separation, lysis and reintroduction.
  • said repeated cycle also includes the concentration step, and / or the step of adding organic carbon.
  • the process which is the subject of the present invention can be qualified as a process for growing at least one microorganism of interest in cyclotrophy.
  • said at least one microorganism of interest is the cyanobacterium Aphanizomenon flos-aquae (AFA).
  • the present invention relates to an installation for culturing at least one microorganism of interest, in heterotrophy or mixotrophy, comprising:
  • At least one open or closed culture compartment configured to receive an aqueous culture medium, said at least one microorganism of interest and contaminating microorganisms;
  • At least one separation device configured to perform at least one physical separation of the microorganism of interest and the contaminating microorganisms within a portion of the culture medium
  • a lysis device configured to perform lysis of the contaminating microorganisms separated by physical separation so as to produce a lysate
  • - means of transport configured for at least:
  • o take a portion of the culture medium comprising the microorganism of interest and contaminating microorganisms
  • the invention also meets the following characteristics, implemented separately or in each of their technically operative combinations.
  • the means of transport are further configured to unify the lysate with the microorganism of interest isolated by physical separation, so as to form a mixture, and reintroduce said mixture into the culture compartment.
  • the means of transport are further configured to supply organic carbon to the culture medium directly in the culture compartment, in the lysate, in the lysate / microorganism mixture of separate interest or to the microorganism of interest separated by physical separation.
  • This supply of organic carbon comes from a source other than the lysate of contaminating microorganisms.
  • the culture installation comprises at least one concentration system configured to concentrate the contaminating microorganisms isolated by physical separation.
  • the means of transport include means:
  • the culture installation includes a device for purging contaminating microorganisms.
  • a device for purging concentrated contaminating microorganisms is a device for purging.
  • the culture installation comprises a device for purging the culture medium devoid of contaminating microorganisms and of microorganism of interest.
  • the culture installation comprises a device for collecting the microorganism of interest.
  • FIG. 1 illustrates the steps included in the culture method object of the present invention according to implementation modes.
  • FIG. 2 illustrates a culture installation object of the present invention according to one embodiment.
  • FIG. 3 graph of the evolution of the mass concentration of Aphanizomenon flos-aquae (AFA) over time in a culture medium according to the implementation of the process object of the present invention in autotrophy or in mixotrophy with reintroduction of different lysate concentrations.
  • AFA Aphanizomenon flos-aquae
  • FIG. 1 illustrates a process 20 for cultivating at least one microorganism of interest, in heterotrophy or mixotrophy, in an aqueous culture medium, contaminating microorganisms developing naturally in said culture medium, according to a particular mode of implementation artwork.
  • the method includes a step 21 of sampling a portion of the culture medium comprising the microorganism of interest and contaminating microorganisms.
  • method 20 is carried out in mixotrophy, the aqueous culture medium being initially devoid of organic carbon and the microorganism of interest is left in autotrophic culture for a time t before step 21.
  • the method 20 includes a step 22 of physical separation of the microorganism of interest and the contaminating microorganisms within the portion of the culture medium.
  • the carrying out of step 22 of physical separation can be based on a morphological or phenotypic difference between the microorganisms of interest and the contaminating microorganisms. For example, it can be a difference in size, shape, surface properties, density, propensity to aggregate or flocculation.
  • step 22 of physical separation comprises a filtration step or gravity separation so as to obtain separately the concentrated contaminating microorganisms from a on the one hand and nutrient medium on the other.
  • An example of filtration used in a preferred embodiment is tangential filtration or even frontal filtration. Filtration can be carried out using a membrane.
  • Method 20 also includes an optional step 23 for concentrating the contaminating microorganisms isolated in step 22.
  • the optional step 23 of concentration of the contaminating microorganisms can be based on a morphological or phenotypic characteristic of the contaminating microorganisms. For example, it can be their size, shape, surface properties, density, propensity to aggregate or flocculate.
  • the concentration step 23 comprises a filtration or gravity separation step so as to obtain separately the concentrated contaminating microorganisms on the one hand and from the culture medium devoid of contaminating microorganisms on the other hand .
  • a filtration or gravity separation step so as to obtain separately the concentrated contaminating microorganisms on the one hand and from the culture medium devoid of contaminating microorganisms on the other hand .
  • an example of filtration used is tangential filtration or even frontal filtration, and the filtration can in particular be carried out using a membrane.
  • the method 20 comprises a step 24 of lysis of the contaminating microorganisms separated by the physical separation so as to produce a lysate.
  • This lysate advantageously represents nutrients which can be assimilated by the microorganism of interest, in particular organic carbon.
  • the lysis step 24 may comprise chemical lysis and / or thermal lysis and / or mechanical lysis, of contaminating microorganisms.
  • Method 20 also includes a step 25 of reintroducing said lysate into the culture medium.
  • step 25 is carried out so that the lysate is reintroduced into the culture medium in admixture with the microorganism of interest isolated by step 22 of physical separation.
  • method 20 includes an optional step 26 of supplying organic carbon to the culture medium.
  • This organic carbon comes from a source other than the lysate of contaminating microorganisms. Indeed, this addition of organic carbon from step 26 is an additional contribution to the supply of nutrients (including organic carbon) present in the lysate of contaminating microorganisms.
  • step 26 of supplying organic carbon into the culture medium is done by introducing said organic carbon into the mixture of lysate and microorganism of interest, in the lysate alone, in the microorganism of interest isolated by the step 22 of physical separation or in the aqueous culture medium directly.
  • the method comprises a repeated cycle of steps 21 to 26, steps 23 and 26 remaining optional.
  • step 26 of adding organic carbon is introduced into a cycle C1 of steps 21 to 25, after the implementation of at least one cycle C1, thus creating a cycle C2 of steps 21 to 26 which is subsequently repeated as many times as necessary.
  • l step 26 of adding organic carbon is introduced from the implementation of the first cycle of steps 21 to 25, before the sampling step 21, thus causing the process 20 to start with cycle C2, said step 26 being carried out by addition of organic carbon directly into the aqueous culture medium at least in the first cycle C2.
  • the culture method comprises a step (not shown in the figures) of clarification of the lysate obtained by step 24 of lysis, a concentration and / or an adjustment of the pH of the lysate, before l 'reintroduction step 25.
  • FIG. 2 illustrates an installation 27 for culture of at least one microorganism of interest 28 in heterotrophy or mixotrophy.
  • the installation advantageously does not need to be in sanitized condition, neither beforehand, nor during its use for cultivation.
  • the installation 27 comprises an open culture compartment 29 or closed configured to receive an aqueous culture medium 30, said at least one microorganism of interest 28 and contaminating microorganisms 32.
  • the installation 27 also comprises at least one separation device 33 configured to carry out at least one physical separation of the microorganism of interest 28 and the contaminating microorganisms 32 within a portion of the culture medium 30.
  • the installation 27 includes a lysis device 34 configured to perform a lysis of the contaminating microorganisms 32 separated so as to produce a lysate 35.
  • the installation further comprises at least one concentration system 36 configured to concentrate the contaminating microorganisms 32 separated before their lysis.
  • the installation 27 comprises means of transport configured for at least:
  • o take a portion of the culture medium 30 comprising the microorganism of interest 28 and contaminating microorganisms 32;
  • the means of transport are further configured to unify the lysate 35 with the separate microorganism of interest 28, so as to form a mixture and reintroduce said mixture into the culture compartment 29.
  • the means of transport are configured to supply organic carbon to the culture medium 30 directly in the culture compartment 29 or to the lysate 35 or to the microorganism of interest 28 separated by physical separation or to the mixture of lysate 35 and microorganism of interest 28 or in a combination of at least two of these.
  • the means of transport include means:
  • the installation 27 comprises an organic carbon reservoir 45.
  • the seventh stream 43 is preferably generated so that it leaves the reservoir 45.
  • the fifth stream 41 is preferably devoid of microorganisms of interest.
  • the means for generating the various flows comprise at least one motor and / or one pump (not illustrated in the figures).
  • the installation 27 comprises a first device 46 for purging contaminating microorganisms 32, a second device 47 for purging culture medium 30 free of microorganisms of interest and contaminating microorganisms and a harvesting device 48 of the microorganism of interest 28.
  • the method 20 for cultivating at least one microorganism of interest 28, in heterotrophy or mixotrophy, is detailed below according to a method of implementation. in which an installation 27 which is the subject of the present invention is used in particular according to one of its embodiments:
  • microorganism of interest 28 is preferably left in autotrophic culture for a time t.
  • Organic carbon is then introduced directly into the culture compartment 29 according to step 26, via the seventh stream 43 of organic carbon leaving the reservoir 45.
  • the culture then goes into mixotrophy and contaminating microorganisms 32 develop in the culture medium 30 with the microorganism of interest 28.
  • step 21 a portion of the culture medium 30 comprising the microorganism of interest 28 and contaminating microorganisms 32 is removed by generation of the first flow 37 of culture medium 30 from the compartment 29 to the apparatus for separation 33.
  • the separation apparatus 33 is carried out the step 22 of physical separation of the microorganism of interest 28 and the contaminating microorganisms 32 within the portion of the culture medium 30 sampled.
  • this step 22 is carried out by tangential membrane filtration.
  • the second flow 38 of microorganism of interest 28 leaving the separation apparatus 33 is generated, as well as the third flow 39 of contaminating microorganisms 32 from the separation apparatus 33 to the system of focus 36.
  • the optional step 23 of concentration of the contaminating microorganisms 32 separated by the step 22 is carried out by tangential membrane filtration.
  • This step 23 can be considered as a second physical separation enabling the contaminating microorganisms 32 to be separated on the one hand in a concentrated manner and on the other hand from the culture medium 30 devoid of contaminating microorganisms 32 and of microorganism of interest 28.
  • the fourth stream 40 of concentrated contaminating microorganisms 32 is generated from the concentration system 36 to the lysis device 34, and the fifth stream 41 of culture medium 30 devoid of contaminating microorganisms 32 and of microorganism of interest 28, is generated from the concentration system 36 towards the culture compartment 29.
  • the lysis device 34 then takes place the step 24 of lysis of the contaminating microorganisms 32 separated and concentrated, so as to produce the lysate 35.
  • the third stream 39 is directly directed to the lysis device 34 in an embodiment where the concentration step 23 does not take place.
  • the lysis step 24 is carried out on the contaminating microorganisms 32 separated coming directly from the separation apparatus 33 via the third stream 39.
  • the lysate 35 is reintroduced into the culture medium 30 within the culture compartment 29 by generation of the sixth stream 42 of lysate 35.
  • the second stream 38 of microorganisms of interest 28 and the sixth stream 42 of lysate 35 are unified so as to form a current mixture towards the compartment 29.
  • This cycle C2 of the culture process can be repeated several times.
  • the seventh stream 43 of organic carbon leaving the reservoir 45 which is generated is preferably unified with the second stream 38 and the sixth stream 42 so as to form the eighth single flow 44 of current mixture to compartment 29 into which it is reintroduced.
  • the microorganism of interest 28 used in this study is an isolated phanizomenon flos-aquae (AFA) strain.
  • AFA is a cyanobacterium of industrial and commercial interest.
  • Contaminating microorganisms 32 models consist of a mixture of 5 strains of bacilli with different morphological and phenotypic characteristics. This mixture is in the form of a live, concentrated bacterial solution presented in liquid formulation.
  • the solution sold under the reference "Bactilit TM" by the company CG PACKAGING can for example be used.
  • the contaminating microorganisms 32 are initially introduced into the culture of cyanobacteria at the rate of a cell of the microorganism of interest 28 for a contaminating microorganism cell 32. Furthermore, it should be noted that a filament is considered like a cyanobacterium cell, whatever its size. Culture media
  • the culture medium used is a BG1 1 medium (detailed composition provided in tables A to D), native for the culture in autotrophy, or, additive of whey powder at a final concentration of 4.5 gL 1 for the culture in mixotrophy .
  • Table D composition of the BG11 nutrient solution
  • AFA cultivation is carried out in an air-conditioned room, the temperature of which is regulated at 25 ⁇ 1 ° C.
  • the culture inoculation rate was fixed at 5.10 5 and 1.10 6 cells. mL -1 .
  • the method used consists of a first tangential filtration with membrane.
  • the concentration of model contaminating microorganisms calls for a second physical separation between said contaminating microorganisms and from the BG1 1 culture medium carried out by a second tangential filtration with membrane.
  • the first filtration uses a membrane having a porosity of 5 ⁇ m. It is possible, for the first tangential filtration, to use a membrane having a porosity of between 0.65 pm and 20 pm, and preferably between 1, 2 pm and 20 pm, preferably between 3 pm and 20 pm, and more preferably between 5 pm and 20 pm.
  • the second filtration uses a membrane having a porosity of 0.2 ⁇ m. It is possible, for the second tangential filtration, to define a porosity threshold less than 5 pm, and preferably less than 3 pm, and preferably less than 1.2 pm, and preferably less than 0.65 pm , and preferably less than 0.2 ⁇ m.
  • the permeation rate to be applied for the first tangential filtration (that is to say the rate of sampling a portion of the culture medium)
  • it is preferably chosen a daily rate greater than or equal to once the volume of the culture facility 27, and preferably greater than or equal to three times the volume of the culture facility 27.
  • tangential velocities to be applied in the first tangential filtration it is preferable to apply velocities less than or equal to 2.1 ms 1 , and preferably less than or equal to 0.7 ms 1 .
  • hot alkaline lysis is used. A volume of 5N sodium hydroxide was added to the solution of concentrated contaminating microorganisms in order to reach a final concentration of 0.1 N. This solution was then kept at 70 ° C. for 10 minutes before being cooled. Results obtained
  • step 21 of sampling the culture method the microorganism of interest is left in autotrophic culture in the culture medium 30 for a time t in order to validate the correct physiological state of the strain and establish data. benchmark for growth performance.
  • time t the process is started in a cyclic manner repeatedly according to cycle C2 with step 26 of supplying organic carbon and step 23 of concentration.
  • Cell concentration in cultures is estimated by measuring the absorbance of a liquid sample.
  • Mass cell concentration is also measured by measuring suspended matter (MES).
  • MES suspended matter
  • [MES] material concentration in suspension
  • Microbial growth is evaluated in terms of doubling time (or generation time, t g ) and volume productivity (rx).
  • the autotrophic growth parameters of the AFA strain are a maximum suspended matter concentration ([M ES] max) of 0.75 gL 1 and a maximum volume productivity (r x max) of 26.10 3 gL 1 .j 1 .
  • step 26 of supplying organic carbon to the culture medium a gain in productivity is observed despite the consumption of part of the organic carbon supplied by the contaminating microorganisms.
  • the addition of lysate of contaminating microorganisms to the culture makes it possible to provide highly assimilable organic carbon and therefore, to recycle part of the initial organic carbon consumed by the contaminating microorganisms.
  • the mass concentration of AFA was recorded over time (every hour for 150 hours) in a native BG11 culture medium (autotrophy: Control).
  • the mass concentration of AFA was raised over time in BG1 1 culture media during trials for implementing the culture method which is the subject of the present invention carried out in mixotrophy, the step of reintroducing the lysate into the culture medium being carried out with different lysate concentrations (0.1 g / L or 1 g / L or 5g / L) according to the tests.

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Abstract

La présente invention vise un procédé (20) de culture d'au moins un microorganisme d'intérêt (28), en hétérotrophie ou mixotrophie, dans un milieu de culture (30) aqueux, des microorganismes contaminants (32) se développant naturellement dans ledit milieu de culture (30), caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape (21) de prélèvement d'une portion du milieu de culture (30) comprenant le microorganisme d'intérêt (28) et des microorganismes contaminants (32); - une étape (22) de séparation physique du microorganisme d'intérêt (28) et des microorganismes contaminants (32) au sein de ladite portion de milieu de culture (30); - une étape (24) de lyse des microorganismes contaminants (32) ainsi séparés de sorte à produire un lysat (35); - une étape (25) de réintroduction dudit lysat (35) dans le milieu de culture (30).

Description

Procédé de culture d’un microorganisme d’intérêt et installation associée
Domaine de l’invention
La présente invention s’applique au domaine de la culture de biomasse microbienne en autotrophie et hétérotrophie.
Plus particulièrement, la présente invention vise un procédé de culture d’au moins un microorganisme d’intérêt, en hétérotrophie ou mixotrophie, et une installation de culture notamment adapté pour la mise en oeuvre dudit procédé de culture.
Etat de l’art
L’hétérotrophie est la nécessité pour un organisme vivant de se nourrir de constituants organiques préexistants. La notion d’hétérotrophie s’oppose à celle d’autotrophie qui est le mode de nutrition des organismes vivants qui peuvent se nourrir uniquement d’aliments inorganiques en présence d’une source d’énergie externe, par exemple la lumière (photoautotrophie).
La mixotrophie quant à elle, est le mode de nutrition d’organismes vivants caractérisé par le fait qu’ils sont capables de se nourrir soit par autotrophie soit par hétérotrophie soit par les deux modes trophiques simultanément ou encore par une photosynthèse bactérienne primitive.
Lorsque l’on souhaite produire ou mettre en oeuvre une souche pure, les procédés hétérotrophiques ou mixotrophiques en milieu ouvert ne sont aujourd’hui pas appliqués. En effet, le milieu ouvert implique généralement la survenue de contaminations des cultures par divers microorganismes contaminants qui affectent le rendement en matière du procédé de culture du fait de la consommation par le ou les microorganismes contaminants, des nutriments destinés aux microorganismes d’intérêt. Ces microorganismes contaminants affectent également la qualité attendue du produit final (biomasse de microorganismes d’intérêt) du simple fait de leur présence significative.
Ce risque de contamination est aujourd’hui maîtrisé grâce au confinement des procédés et à la stérilisation des équipements. Cependant, les coûts d’investissement et d’opération de ces procédés de culture pour qu’ils soient réalisés dans des conditions aseptiques sont importants et ont une incidence directe sur le coût de production des microorganismes d’intérêt considérés ou de leurs métabolites.
Il parait donc avantageux de trouver une solution permettant la production de microorganismes d’intérêt avec un rendement acceptable au niveau industriel, en milieu de culture ouvert ou fermé, sans avoir à se soucier des conditions de stérilisation dudit milieu et des équipements de culture.
Exposé de l’invention
À cet effet, selon un premier aspect, la présente invention vise un procédé de culture d’au moins un microorganisme d’intérêt, en hétérotrophie ou mixotrophie, dans un milieu de culture aqueux, des microorganismes contaminants se développant naturellement dans ledit milieu de culture, caractérisé en ce qu’il comprend :
- une étape de prélèvement d’une portion du milieu de culture comprenant le microorganisme d’intérêt et des microorganismes contaminants ;
- une étape de séparation physique du microorganisme d’intérêt et des microorganismes contaminants au sein de ladite portion de milieu de culture ;
- une étape de lyse des microorganismes contaminants ainsi séparés de sorte à produire un lysat ;
- une étape de réintroduction dudit lysat dans le milieu de culture.
On entend par milieu de culture un milieu comportant des nutriments permettant le développement du microorganisme d’intérêt et des microorganismes contaminants.
On entend par « portion », un volume prélevé par unité de temps, par exemple par jour ou par heure. Ainsi, on peut considérer le terme « portion » comme un débit quotidien ou horaire, c'est-à-dire un volume prélevé respectivement par jour ou par heure, dans le milieu de culture. Ce volume est de préférence, par jour, supérieur ou égal à une fois le volume du milieu de culture et, de manière préférable, supérieur ou égal à trois fois le volume du milieu de culture. Encore de préférence, la portion prélevée correspond à un volume prélevé par heure supérieur ou égal à 1 /24ème du volume total du milieu de culture.
Ce volume prélevé quotidiennement permet de maintenir une quantité de microorganisme d’intérêt et de microorganismes contaminants compatible avec un fonctionnement correct du procédé objet de la présente invention.
Ce procédé de culture a pour avantage de permettre la culture en milieu ouvert ou fermé de microorganismes d’intérêt sans affecter le rendement en microorganisme d’intérêt car, les contaminants étant normalement gênants pour la culture en milieu ouvert, sont utiles au développement du ou des microorganismes d’intérêt selon le procédé objet de la présente invention. En effet, le lysat de microorganismes contaminant représente un apport nutritif assimilable pour le microorganisme d’intérêt, notamment en carbone organique. La culture en milieu ouvert étant permise par ce procédé de culture, les coûts d’investissement et d’opération dudit procédé sont avantageusement minimisés du fait que des conditions aseptiques ne sont pas nécessaires.
Suivant des modes de mise en oeuvre préférés, l’invention répond en outre aux caractéristiques suivantes, réalisées séparément ou en chacune de leurs combinaisons techniquement opérantes.
Dans un mode de mise en oeuvre particulier, l’étape de séparation physique comporte une étape de filtration ou séparation gravitaire de sorte à obtenir de façon séparée le microorganisme d’intérêt d’une part et les microorganismes contaminants d’autre part.
Selon un mode de mise en oeuvre particulier, le microorganisme d’intérêt séparé par l’étape de séparation est réintroduit dans le milieu de culture, seul ou en mélange avec le lysat.
Selon un mode de mise en oeuvre particulier, le milieu de culture aqueux est initialement dépourvu de carbone organique.
Dans un mode de mise en oeuvre particulier dans lequel le procédé de culture est en mixotrophie, et dans lequel le milieu de culture aqueux est initialement dépourvu de carbone organique, le microorganisme d’intérêt est laissé en culture autotrophe pendant un temps t avant l’étape de prélèvement.
De préférence, le temps t est choisi de sorte à obtenir une concentration en microorganisme d’intérêt dans le milieu de culture comprise entre 5.10s cellules par millilitre et 1.107 cellules par millilitre. En outre, la culture en autotrophie pendant le temps t permet avantageusement de valider l’état physiologique correct du microorganisme d’intérêt et d’établir des données de référence quant à ses performances de croissance.
Un passage du mode autotrophie au mode mixotrophie est réalisé par le mélange du lysat de microorganismes contaminants avec le microorganisme d’intérêt, ledit lysat fournissant notamment un apport nutritif en carbone organique au microorganisme d’intérêt. Le mode hétérotrophie est d’autant plus renforcé par une étape d’apport de carbone organique, fournit par une autre source que le lysat de microorganismes contaminants, dans milieu de culture.
A cet effet, selon un mode de mise en oeuvre particulier, le procédé comporte une étape d’apport de carbone organique dans le milieu de culture. Cet apport de carbone organique peut être réalisé directement dans le milieu de culture, dans le lysat, au microorganisme d’intérêt séparé par la séparation physique, dans le mélange lysat/microorganisme d’intérêt séparé, ou dans une combinaison d’au moins deux de ces derniers.
Dans un mode de mise en oeuvre particulier, le procédé de culture comprend une étape de concentration des microorganismes contaminants séparés par l’étape de séparation physique. L’étape de concentration des microorganismes contaminants est avantageuse en ce qu’elle permet une lyse d’un plus grand nombre de microorganismes contaminants lors de l’étape de lyse.
Selon un exemple de mise en oeuvre particulier, l’étape de concentration comporte une étape de filtration ou séparation gravitaire de sorte à obtenir de façon séparée les microorganismes contaminants concentrés d’une part et du milieu de culture dépourvu de microorganismes contaminants d’autre part. Cela a pour avantage de permettre le recyclage du milieu de culture dépourvu de microorganismes contaminants. De plus cela a notamment pour avantage de réduire les coûts de la lyse du fait d’une diminution du volume de microorganismes contaminants à lyser suite à la concentration. Dans un mode de mise en œuvre particulier, le milieu de culture comporte plusieurs microorganismes d’intérêt différents, ledit procédé comportant en amont de l’étape de séparation physique, une étape préalable d’isolement d’un seul type de microorganismes d’intérêt choisi ou d’un ensemble de microorganismes d’intérêts différents choisis au sein de ladite portion prélevée, de sorte que lorsque cette portion fait l’objet de la séparation physique elle ne comprend que ledit seul type de microorganismes d’intérêt choisi ou ledit ensemble de microorganismes d’intérêts différents choisis.
Selon un mode de mise en œuvre particulier, le procédé de culture comprend un cycle répété de ses étapes. Dans un exemple de mise en œuvre, le procédé comporte un cycle répété d’au moins les étapes de prélèvement, de séparation physique, de lyse et de réintroduction. De préférence ledit cycle répété comporte également l’étape de concentration, et/ou l’étape d’apport de carbone organique.
Du fait de ce mélange de modes trophiques au sein d’un procédé de culture cyclique, on peut qualifier le procédé objet de la présente invention de procédé de culture d’au moins un microorganisme d’intérêt en cyclotrophie.
Selon un exemple de mise en œuvre préféré, ledit au moins un microorganisme d’intérêt est la cyanobactérie Aphanizomenon flos-aquae (AFA).
Selon un deuxième aspect, la présente invention vise une installation de culture d’au moins un microorganisme d’intérêt, en hétérotrophie ou mixotrophie, comportant :
- au moins un compartiment de culture ouvert ou fermé configuré pour recevoir un milieu de culture aqueux, ledit au moins un microorganisme d’intérêt et des microorganismes contaminants ;
- au moins un appareil de séparation configuré pour effectuer au moins une séparation physique du microorganisme d’intérêt et des microorganismes contaminants au sein d’une portion du milieu de culture ;
- un dispositif de lyse configuré pour effectuer une lyse des microorganismes contaminants séparés par la séparation physique de sorte à produire un lysat ; - des moyens de transports configurés pour au moins :
o prélever une portion du milieu de culture comprenant le microorganisme d’intérêt et des microorganismes contaminants ;
o réintroduire ledit lysat dans le compartiment de culture.
Les avantages, buts et caractéristiques particuliers de l’installation objet de la présente invention étant similaires à ceux du procédé objet de la présente invention, ils ne sont pas rappelés ici.
Suivant des modes de réalisation préférés, l’invention répond en outre aux caractéristiques suivantes, mises en oeuvre séparément ou en chacune de leurs combinaisons techniquement opérantes.
Dans un mode de réalisation particulier, les moyens de transports sont en outre configurés pour unifier le lysat avec le microorganisme d’intérêt isolé par la séparation physique, de sorte à former un mélange, et réintroduire ledit mélange dans le compartiment de culture.
Dans un mode de réalisation particulier, les moyens de transports sont en outre configurés pour apporter du carbone organique au milieu de culture directement dans le compartiment de culture, dans le lysat, dans le mélange lysat/microorganisme d’intérêt séparé ou au microorganisme d’intérêt séparé par la séparation physique. Cet apport de carbone organique provient d’une autre source que le lysat de microorganismes contaminants.
Dans un mode de réalisation particulier, l’installation de culture comporte au moins un système de concentration configuré pour concentrer les microorganismes contaminants isolés par la séparation physique.
Dans un mode de réalisation particulier, les moyens de transport comportent des moyens :
- de générer un premier flux de milieu de culture comprenant le microorganisme d’intérêt et des microorganismes contaminants, du compartiment de culture vers l’appareil de séparation ;
- de générer un deuxième flux du microorganisme d’intérêt sortant de l’appareil de séparation ;
- de générer un troisième flux de microorganismes contaminants de l’appareil de séparation vers le système de concentration ; - de générer un quatrième flux de microorganismes contaminants concentrés du système de concentration vers le dispositif de lyse ;
- de générer un cinquième flux de milieu de culture dépourvu de microorganismes contaminants du système de concentration vers le compartiment de culture ;
- de générer un sixième flux de lysat du dispositif de lyse vers le compartiment de culture ;
- de générer un septième flux de carbone organique sortant d’un réservoir de carbone organique ;
- d’unifier le deuxième flux, le sixième flux et le septième flux de sorte à former un huitième flux unique courant vers le compartiment de culture.
Dans un mode de réalisation particulier, l’installation de culture comporte un dispositif de purge de microorganismes contaminants. De préférence il s’agit d’un dispositif de purge de microorganismes contaminants concentrés.
Dans un mode de réalisation particulier, l’installation de culture comporte un dispositif de purge de milieu de culture dépourvu de microorganismes contaminants et de microorganisme d’intérêt.
Dans un mode de réalisation particulier, l’installation de culture comporte un dispositif de récolte du microorganisme d’intérêt.
Présentation des figures
L’invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante, donnée à titre d’exemple nullement limitatif, et faite en se référant aux figures qui représentent :
- Figure 1 : illustre les étapes comprises par le procédé de culture objet de la présente invention selon des modes de mise en oeuvre.
- Figure 2 : illustre une installation de culture objet de la présente invention selon un mode de réalisation.
- Figure 3 : graphe de l’évolution de la concentration massique en Aphanizomenon flos-aquae (AFA) dans le temps au sein d’un milieu de culture selon la mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention en autotrophie ou en mixotrophie avec réintroduction de différentes concentrations en lysat.
Description détaillée de l’invention
On note dès à présent que les figures ne sont pas à l’échelle.
De manière plus générale, la portée de la présente invention ne se limite pas aux modes de mise en oeuvre et de réalisation décrits ci-dessus à titre d’exemples non limitatifs, mais s’étend au contraire à toutes les modifications à la portée de l’homme de l’art. Chaque caractéristique d’un mode de réalisation peut être mise en oeuvre isolément ou combinée à toute autre caractéristique de tout autre mode de réalisation de manière avantageuse.
La figure 1 illustre un procédé 20 de culture d’au moins un microorganisme d’intérêt, en hétérotrophie ou mixotrophie, dans un milieu de culture aqueux, des microorganismes contaminants se développant naturellement dans ledit milieu de culture, selon un mode particulier de mise en oeuvre. Le procédé comporte une étape 21 de prélèvement d’une portion du milieu de culture comprenant le microorganisme d’intérêt et des microorganismes contaminants. De préférence, le procédé 20 est réalisé en mixotrophie, le milieu de culture aqueux étant initialement dépourvu de carbone organique et le microorganisme d’intérêt est laissé en culture autotrophe pendant un temps t avant l’étape 21.
Le procédé 20 comporte une étape 22 de séparation physique du microorganisme d’intérêt et des microorganismes contaminants au sein de la portion du milieu de culture.
La réalisation de l’étape 22 de séparation physique peut être basée sur une différence morphologique ou phénotypique entre les microorganismes d’intérêt et les microorganismes contaminants. Par exemple, il peut s’agir d’une différence de taille, de forme, de propriétés de surface, de densité, de propension à l’agrégation ou à la floculation.
Selon un exemple de mise en oeuvre l’étape 22 de séparation physique comporte une étape de filtration ou séparation gravitaire de sorte à obtenir de façon séparée les microorganismes contaminants concentrés d’une part et du milieu nutritif d’autre part. Un exemple de filtration utilisée dans un mode de mise en oeuvre préféré est la filtration tangentielle ou encore la filtration frontale. La filtration peut être effectuée à l’aide d’une membrane.
Le procédé 20 comporte en outre une étape 23 facultative de concentration des microorganismes contaminants isolés dans l’étape 22.
L’étape 23 facultative de concentration des microorganismes contaminants peut se baser sur une caractéristique morphologique ou phénotypique des microorganismes contaminants. Par exemple, il peut s’agir de leur taille, de leur forme, de leurs propriétés de surface, de leur densité, de leur propension à s’agréger ou à floculer.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré l’étape 23 de concentration comporte une étape de filtration ou séparation gravitaire de sorte à obtenir de façon séparée les microorganismes contaminants concentrés d’une part et du milieu de culture dépourvu de microorganismes contaminants d’autre part. Comme pour la séparation physique, dans un mode de mise en oeuvre particulier, un exemple de filtration utilisée est la filtration tangentielle ou encore la filtration frontale, et la filtration peut notamment être effectuée à l’aide d’une membrane.
Le procédé 20 comporte une étape 24 de lyse des microorganismes contaminants séparés par la séparation physique de sorte à produire un lysat. Ce lysat représente avantageusement des nutriments assimilables par le microorganisme d’intérêt, notamment du carbone organique. Dans un mode de mise en oeuvre particulier, l’étape 24 de lyse peut comprendre une lyse chimique et/ou une lyse thermique et/ou une lyse mécanique, des microorganismes contaminants.
Le procédé 20 comporte également une étape 25 de réintroduction dudit lysat dans le milieu de culture.
Selon un exemple de réalisation préféré, l’étape 25 est réalisée de sorte que le lysat est réintroduit dans le milieu de culture en mélange avec le microorganisme d’intérêt isolé par l’étape 22 de séparation physique.
Enfin, le procédé 20 comporte une étape 26 facultative d’apport de carbone organique au milieu de culture. Ce carbone organique provient d’une source autre que le lysat de microorganismes contaminants. En effet, cet apport de carbone organique de l’étape 26 est un apport supplémentaire à l’apport de nutriments (dont du carbone organique) présents dans le lysat de microorganismes contaminants.
De préférence, l’étape 26 d’apport de carbone organique dans le milieu de culture se fait par introduction dudit carbone organique dans le mélange lysat et microorganisme d’intérêt, dans le lysat seul, dans le microorganisme d’intérêt isolé par l’étape 22 de séparation physique ou dans le milieu de culture aqueux directement.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré, le procédé comporte un cycle répété des étapes 21 à 26, les étapes 23 et 26 restants facultatives.
Selon un exemple de mise en oeuvre dans lequel le procédé de culture est en hétérotrophie, l’étape 26 d’apport de carbone organique est introduite dans un cycle C1 des étapes 21 à 25, après la mise en oeuvre d’au moins un cycle C1 , créant ainsi un cycle C2 des étapes 21 à 26 qui est par la suite répété autant de fois que nécessaire.
Selon un exemple de mise en oeuvre dans lequel le procédé 20 de culture est en mixotrophie, avec le milieu de culture aqueux initialement dépourvu de carbone organique et le microorganisme d’intérêt laissé en culture autotrophe pendant un temps t avant l’étape 21 , l’étape 26 d’apport de carbone organique est introduite dès la mise en oeuvre du premier cycle des étapes 21 à 25, avant l’étape de prélèvement 21 , faisant ainsi commencer le procédé 20 par le cycle C2, ladite étape 26 étant réalisée par apport de carbone organique directement dans le milieu de culture aqueux au moins dans le premier cycle C2.
Dans un mode de mise en oeuvre particulier le procédé 20 de culture comprend une étape (non représentée sur les figures) de clarification du lysat obtenue par l’étape 24 de lyse, une concentration et/ou un ajustement du pH du lysat, avant l’étape 25 de réintroduction.
La figure 2 illustre une installation 27 de culture d’au moins un microorganisme d’intérêt 28 en hétérotrophie ou mixotrophie. L’installation n’a avantageusement pas besoin d’être en condition aseptisée, ni préalablement, ni durant son utilisation pour la culture.
L’installation 27 comporte un compartiment 29 de culture ouvert ou fermé configuré pour recevoir un milieu de culture 30 aqueux, ledit au moins un microorganisme d’intérêt 28 et des microorganismes contaminants 32.
L’installation 27 comporte en outre au moins un appareil de séparation 33 configuré pour effectuer au moins une séparation physique du microorganisme d’intérêt 28 et des microorganismes contaminants 32 au sein d’une portion du milieu de culture 30.
L’installation 27 comporte un dispositif de lyse 34 configuré pour effectuer une lyse des microorganismes contaminants 32 séparés de sorte à produire un lysat 35.
Selon un mode de réalisation particulier, l’installation comporte en outre au moins un système de concentration 36 configuré pour concentrer les microorganismes contaminants 32 séparés avant leur lyse.
L’installation 27 comporte des moyens de transports configurés pour au moins :
o prélever une portion du milieu de culture 30 comprenant le microorganisme d’intérêt 28 et des microorganismes contaminants 32 ;
o réintroduire le lysat 35 dans le compartiment 29 de culture.
De préférence, les moyens de transport sont en outre configurés pour unifier le lysat 35 avec le microorganisme d’intérêt 28 séparé, de sorte à former un mélange et réintroduire ledit mélange dans le compartiment 29 de culture.
De préférence, les moyens de transport sont configurés pour apporter du carbone organique au milieu de culture 30 directement dans le compartiment 29 de culture ou au lysat 35 ou au microorganisme d’intérêt 28 séparé par la séparation physique ou au mélange de lysat 35 et microorganisme d’intérêt 28 ou dans une combinaison d’au moins deux de ces derniers.
Selon un mode de réalisation préféré, les moyens de transport comportent des moyens :
- de générer un premier flux 37 de milieu de culture 30 comprenant le microorganisme d’intérêt 28 et des microorganismes contaminants 32, du compartiment 29 de culture vers l’appareil de séparation 33 ;
- de générer un deuxième flux 38 du microorganisme d’intérêt 28 sortant de l’appareil de séparation 33 ;
- de générer un troisième flux 39 de microorganismes contaminants 32 de l'appareil de séparation 33 vers le système de concentration 36 ;
- de générer un quatrième flux 40 de microorganismes contaminants 32 concentrés du système de concentration 36 vers le dispositif de lyse 34 ;
- de générer un cinquième flux 41 de milieu de culture 30 dépourvu de microorganismes contaminants, du système de concentration 36 vers le compartiment 29 de culture ;
- de générer un sixième flux 42 de lysat 35 du dispositif de lyse 34 vers le compartiment de culture 29 ;
- de générer un septième flux 43 de carbone organique ;
- d’unifier le deuxième flux 38, le sixième flux 42 et le septième flux 43 de sorte à former un huitième flux 44 unique courant vers le compartiment 29 de culture.
Selon un exemple particulier de réalisation, l’installation 27 comprend un réservoir de carbone organique 45. Le septième flux 43 est de préférence généré de sorte qu’il sort du réservoir 45.
Le cinquième flux 41 est de préférence dépourvu de microorganismes d’intérêt.
Selon un mode de réalisation particulier les moyens de générer les différents flux comportent au moins un moteur et/ou une pompe (non illustrés sur les figures).
Dans un mode de réalisation particulier, l’installation 27 comporte un premier dispositif de purge 46 de microorganismes contaminants 32, un deuxième dispositif de purge 47 de milieu de culture 30 dépourvu de microorganismes d’intérêt et de microorganismes contaminants et un dispositif de récolte 48 du microorganisme d’intérêt 28.
Le procédé 20 de culture d’au moins un microorganisme d’intérêt 28, en hétérotrophie ou mixotrophie, est détaillé ci-dessous selon un mode de mise en œuvre dans lequel est notamment utilisée une installation 27 objet de la présente invention selon un de ses modes de réalisation :
Il est préalablement introduit dans le compartiment 29 de culture, un milieu de culture 30 aqueux et du microorganisme d’intérêt 28. Le microorganisme d’intérêt 28 est de préférence laissé en culture autotrophe pendant un temps t.
Du carbone organique est alors introduit directement dans le compartiment 29 de culture selon l’étape 26, via le septième flux 43 de carbone organique sortant du réservoir 45. La culture passe alors en mixotrophie et des microorganismes contaminants 32 se développent dans le milieu de culture 30 avec le microorganisme d’intérêt 28.
Dans l’étape 21 , le prélèvement d’une portion du milieu de culture 30 comprenant le microorganisme d’intérêt 28 et des microorganismes contaminants 32 est réalisé par génération du premier flux 37 de milieu de culture 30 du compartiment 29 vers l’appareil de séparation 33.
Dans l’appareil de séparation 33 est opérée l’étape 22 de séparation physique du microorganisme d’intérêt 28 et des microorganismes contaminants 32 au sein de la portion du milieu de culture 30 prélevée. De préférence, cette étape 22 est réalisée par filtration tangentielle membranaire.
Après l’étape 22 de séparation physique, le deuxième flux 38 de microorganisme d’intérêt 28 sortant de l’appareil de séparation 33 est généré, ainsi que le troisième flux 39 de microorganismes contaminants 32 de l’appareil de séparation 33 vers le système de concentration 36.
Dans le système de concentration 36 a lieu l’étape 23 facultative de concentration des microorganismes contaminants 32 séparés par l’étape 22. De préférence, cette étape 23 est réalisée par filtration tangentielle membranaire. On peut considérer cette étape 23 comme une deuxième séparation physique permettant de séparer d’une part les microorganismes contaminants 32 de façon concentrés et d’autre part du milieu de culture 30 dépourvu de microorganismes contaminants 32 et de microorganisme d’intérêt 28.
Après cette étape 23, le quatrième flux 40 de microorganismes contaminants 32 concentrés est généré du système de concentration 36 vers le dispositif de lyse 34, et le cinquième flux 41 de milieu de culture 30 dépourvu de microorganismes contaminants 32 et de microorganisme d’intérêt 28, est généré du système de concentration 36 vers le compartiment 29 de culture.
Dans le dispositif de lyse 34 a ensuite lieu l’étape 24 de lyse des microorganismes contaminants 32 séparés et concentrés, de sorte à produire le lysat 35.
Le troisième flux 39 est directement dirigé vers le dispositif de lyse 34 dans un mode de mise en oeuvre où l’étape 23 de concentration n’a pas lieu. Dans un tel mode de mise en oeuvre particulier, l’étape de lyse 24 est réalisée sur les microorganismes contaminants 32 séparés provenant directement de l’appareil de séparation 33 via le troisième flux 39.
Ensuite, dans l’étape 25 de réintroduction, le lysat 35 est réintroduit dans le milieu de culture 30 au sein du compartiment de culture 29 par génération du sixième flux 42 de lysat 35. De préférence, le deuxième flux 38 de microorganismes d’intérêt 28 et le sixième flux 42 de lysat 35 sont unifiés de sorte à former un mélange courant vers le compartiment 29.
Ce cycle C2 du procédé de culture peut être répété plusieurs fois.
Après le premier cycle C2, dans les étapes 26 de chaque cycle C2 suivant, le septième flux 43 de carbone organique sortant du réservoir 45 qui est généré est de préférence unifié avec le deuxième flux 38 et le sixième flux 42 de sorte à former le huitième flux 44 unique de mélange courant vers le compartiment 29 dans lequel il est réintroduit.
Exemple appliqué à la culture d’Aphanizomenon flos-aquae (AF A) en mixotrophie en milieu ouvert
Microorqanismes utilisés
Le microorganisme d’intérêt 28 utilisé dans cette étude est une souche d phanizomenon flos-aquae (AFA) isolée. L’AFA est une cyanobactérie d’intérêt industriel et commercial.
Des microorganismes contaminants 32 modèles sont constitués par un mélange de 5 souches de bacilles ayant des caractéristiques morphologiques et phénotypiques différentes. Ce mélange se présente sous la forme d’une solution bactérienne vivante, concentrée et présentée en formulation liquide. La solution commercialisée sous la référence « Bactilit™ » par la société CG PACKAGING peut être par exemple utilisée.
Afin de simplifier le procédé, les microorganismes contaminants 32 sont initialement introduits dans la culture de cyanobactérie à raison d’une cellule du microorganisme d’intérêt 28 pour une cellule de microorganisme contaminant 32. Par ailleurs, il faut noter qu’un filament est considéré comme une cellule de cyanobactérie, quelle que soit sa taille. Milieux de culture
Le milieu de culture utilisé est un milieu BG1 1 (composition détaillée fournie en tableaux A à D), natif pour la culture en autotrophie, ou, additivé de lactosérum en poudre à une concentration finale de 4,5 g.L 1 pour la culture en mixotrophie.
Figure imgf000016_0001
Tableau A : composition de la solution stock 1
Figure imgf000016_0002
Tableau B : composition de la solution stock 2
Figure imgf000016_0003
Figure imgf000017_0002
Tableau C : composition de la solution stock 3
Figure imgf000017_0001
Tableau D : composition de la solution de milieu nutritif BG11
Conditions opératoires des cultures
La culture d’AFA est réalisée dans un local climatisé dont la température est régulée à 25±1 °C. Le compartiment 29 de culture en verre borosilicaté (volume total = 250mL, volume de culture = 200mL, hauteur utile = 70mm, diamètre utile = 60mm) est équipé d’une agitation par pale (mobile d’agitation de type hélice marine, diamètre du mobile = 30mm, vitesse d’agitation = 60rpm).
L’apport lumineux est assuré par un panneau de diodes électroluminescentes (irradiance du rayonnement photosynthétiquement actif mesurée à la paroi externe du réacteur = 200 pmol.s 1.nr2).
Le taux d’inoculation des cultures a été fixé à 5.105 et 1.106 cellules. mL-1.
Opérations unitaires et conditions opératoires pour la séparation physique du microorqanisme d’intérêt des microorqanismes contaminants et pour la concentration des microorqanismes contaminants
Concernant la séparation physique entre I’Aphanizomenon Flos-Aquae et les microorganismes contaminants modèles (diverses souches de bacilles en mélange), la méthode utilisée consiste en une première filtration tangentielle avec membrane.
La concentration des microorganismes contaminants modèles fait appel à une deuxième séparation physique entre lesdits microorganismes contaminants et du milieu de culture BG1 1 réalisée par une deuxième filtration tangentielle avec membrane.
La première filtration fait appel à une membrane ayant une porosité de 5 pm. Il est possible, pour la première filtration tangentielle, d’utiliser une membrane ayant une porosité comprise entre 0,65 pm et 20 pm, et de manière préférable comprise entre 1 ,2 pm et 20 pm, de préférence comprise entre 3 pm et 20 pm, et encore de préférence comprise entre 5 pm et 20 pm.
La seconde filtration fait appel à une membrane ayant une porosité de 0,2 pm. Il est possible, pour la seconde filtration tangentielle, de définir un seuil de porosité inférieur à 5pm, et de manière préférable inférieur à 3 pm, et de manière préférable inférieur à 1 ,2 pm, et de manière préférable inférieur à 0,65 pm, et de manière préférable inférieur à 0,2 pm.
Concernant le débit de perméation à appliquer pour la première filtration tangentielle (c'est-à-dire le débit de prélèvement d’une portion du milieu de culture), il est de préférence choisi un débit quotidien supérieur ou égal à une fois le volume de l’installation 27 de culture, et de manière préférable supérieur ou égal à trois fois le volume de l’installation 27 de culture.
Concernant les vitesses tangentielles à appliquer dans la première filtration tangentielle, il est préférable d’appliquer des vitesses inférieures ou égales à 2,1 m.s 1, et de manière préférable inférieures ou égales à 0,7 m.s 1.
Opérations unitaires et conditions opératoires pour la lyse des microorqanismes contaminants
Concernant la lyse des microorganismes contaminants, il est utilisé une lyse alcaline à chaud. Un volume de soude 5N a été ajoutée à la solution de microorganismes contaminants concentrés afin d’atteindre une concentration finale de 0,1 N. Cette solution a ensuite été maintenue à 70°C pendant 10 minutes avant d’être refroidie. Résultats obtenus
Avant l’étape 21 de prélèvement du procédé de culture, le microorganisme d’intérêt est laissé en culture autotrophe dans le milieu de culture 30 pendant un temps t afin de valider l’état physiologique correct de la souche et d’établir des données de référence quant aux performances de croissance. Après le temps t, le procédé est lancé de façon cyclique répétée selon le cycle C2 avec l’étape 26 d’apport de carbone organique et l’étape 23 de concentration.
En autotrophie, une observation rapide permet de mettre en évidence que la souche croit avec une première phase, jusqu’à 100h, correspondant à croissance exponentielle puis, une seconde phase de croissance linéaire, entre 100h et 600h. Enfin, une phase de ralentissement s’observe après 600h. Ces tendances sont classiquement retrouvées dans le cas de croissance non balancée, c’est-à-dire dans le cas où un facteur environnemental devient limitant. Il peut s’agir de facteur nutritionnel (substrat, produit du métabolisme) ou de facteurs physico-chimiques. Dans le cas présent, il est raisonnable d’émettre l’hypothèse que l’énergie lumineuse puisse devenir limitante au-delà d’une certaine densité cellulaire (phénomène d’ombrage).
En appliquant une régression linéaire, il est possible de déterminer une équation représentative de la vitesse de croissance, à savoir : y = 0,002x + 0,4453.
Il est également possible d’évaluer la productivité volumique de la souche grâce aux mesures de concentrations massiques en microorganisme d’intérêt.
La concentration cellulaire dans les cultures est estimée par mesure de l’absorbance d’un échantillon liquide. La mesure de l’absorbance du milieu est réalisée à 600 nm par l’intermédiaire d’un spectrophotomètre. Cette absorbance (ou densité optique) est considérée comme étant en relation linéaire avec la concentration (loi de Beer-Lambert, Abs = s.l.C) pour des valeurs comprises entre 0,1 et 0,4 unité. Des dilutions sont effectuées de manière à se situer dans ce domaine de validité.
La concentration cellulaire massique est également mesurée par mesure des matières en suspension (MES). La concentration en matières en suspension ([MES]) est estimée par pesée de la masse sèche d’un volume connu de suspension cellulaire. Celui-ci est filtré sur une membrane de diamètre de pores de 0,45 pm (0=4,7 cm) préalablement séchée à 60°C et 200 mm Hg pendant 24 heures et pesée. Après filtration, la membrane et le dépôt cellulaire sont séchés dans les mêmes conditions puis pesés. La différence de masse ramenée au volume permet d’obtenir la concentration en matières en suspension dans la suspension filtrée.
La croissance microbienne est évaluée en termes de temps de doublement (ou temps de génération, tg) et de productivité volumique (rx).
Les paramètres de croissance autotrophe de la souche d’AFA sont une concentration de matière en suspension maximale ([M ES]max) de 0,75 g.L 1 et une productivité volumique maximale (rx max) de 26.10 3 g.L 1.j 1.
Lorsque l’on met en oeuvre le procédé objet de la présente invention en mixotrophie, c'est-à-dire lorsqu’on engage le premier cycle C2 en commençant par l’étape 26 d’apport de carbone organique au milieu de culture, un gain de productivité est observé malgré la consommation d’une partie du carbone organique fourni par les microorganismes contaminants. En effet, l’ajout de lysat de microorganismes contaminants à la culture permet d’apporter du carbone organique hautement assimilable et donc, de recycler une partie du carbone organique initial consommé par les microorganismes contaminants.
Calcul du gain de rendement en productivité pour une culture d’AFA avec le procédé de culture en mixotrophie
La concentration massique d’AFA a été relevée dans le temps (toutes les heures pendant 150h) dans un milieu de culture BG11 natif (autotrophie : Témoin). En parallèle, la concentration massique d’AFA a été relevée dans le temps dans des milieux de cultures BG1 1 durant des essais de mise en oeuvre du procédé de culture objet de la présente invention réalisé en mixotrophie, l’étape de réintroduction du lysat dans le milieu de culture étant réalisée avec des concentrations en lysat différentes (0,1 g/L ou 1 g/L ou 5g/L) suivant les essais.
L’évolution de la concentration massique d’AFA dans le temps est visible sur le graphe en figure 3. Ces résultats indiquent qu’un ajout de lysat permet d’augmenter la productivité et la concentration maximale en AFA dans les cultures. Cet effet est d’autant plus marqué que les concentrations en lysat sont importantes pour des valeurs comprises entre 0,1 et 5 g/L.
Une analyse stoechiométrique montre que l’ajout de 5g/L de lysat
(correspondant à 165 mg de carbone organique par litre) permet d’augmenter le titre maximal en AFA de 11 1 mg d’AFA par litre. Ceci correspondant à un rendement de production hétérotrophe de microorganisme d’intérêt de 0,6 gramme d’AFA par gramme de carbone organique fournit par le lysat.
Une analyse cinétique montre que l’ajout de 5g/L de lysat permet d’augmenter, jusqu’à 29h de culture, la productivité en AFA de 26,4 mg d’AFA par litre par heure à 91 ,2 mg d’AFA par litre par heure, soit +340%.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé (20) de culture d’au moins un microorganisme d’intérêt (28), en hétérotrophie ou mixotrophie, dans un milieu de culture (30) aqueux, des microorganismes contaminants (32) se développant naturellement dans ledit milieu de culture (30), caractérisé en ce qu’il comprend :
- une étape (21 ) de prélèvement d’une portion du milieu de culture (30) comprenant le microorganisme d’intérêt (28) et des microorganismes contaminants (32) ;
- une étape (22) de séparation physique du microorganisme d’intérêt (28) et des microorganismes contaminants (32) au sein de ladite portion de milieu de culture (30) ;
- une étape (24) de lyse des microorganismes contaminants (32) ainsi séparés de sorte à produire un lysat (35) ;
- une étape (25) de réintroduction dudit lysat (35) dans le milieu de culture (30).
2 - Procédé (20) de culture selon la revendication 1 , dans lequel le microorganisme d’intérêt (28) séparé par l’étape (22) de séparation est réintroduit dans le milieu de culture (30), seul ou en mélange avec le lysat (35).
3 - Procédé (20) de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 2, comportant une étape (26) d’apport de carbone organique dans le milieu de culture (30).
4 - Procédé (20) de culture selon la revendication 3, en mixotrophie, dans lequel le milieu de culture (30) aqueux est initialement dépourvu de carbone organique et le microorganisme d’intérêt (28) est laissé en culture autotrophe pendant un temps t avant l’étape (26) d’apport de carbone organique et l’étape (21 ) de prélèvement.
5 - Procédé (20) de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant une étape (23) de concentration des microorganismes contaminants (32) séparés par l’étape (22) de séparation physique.
6 - Procédé (20) de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le milieu de culture (30) comporte plusieurs microorganismes d’intérêt (28) différents, ledit procédé (20) comportant en amont de l’étape (22) de séparation physique, une étape préalable d’isolement d’un seul type de microorganismes d’intérêt (28) choisi ou d’un ensemble de microorganismes d’intérêts (28) différents choisis au sein de ladite portion prélevée, de sorte que lorsque cette portion fait l’objet de la séparation physique elle ne comprend que ledit seul type de microorganismes d’intérêt (28) choisi ou ledit ensemble de microorganismes d’intérêts (28) différents choisis.
7 - Procédé (20) de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant un cycle répété de ses étapes.
8 - Procédé (20) de culture objet de l’une quelconque des revendications 1 à
7, dans lequel ledit au moins un microorganisme d’intérêt (28) est la cyanobactérie Aphanizomenon flos-aquae (AFA).
9 - Installation (27) de culture d’au moins un microorganisme d’intérêt (28), en hétérotrophie ou mixotrophie, caractérisé en ce qu’elle comporte :
- au moins un compartiment (29) de culture ouvert ou fermé configuré pour recevoir un milieu de culture (30) aqueux, ledit au moins un microorganisme d’intérêt (28) et des microorganismes contaminants (32) ;
- au moins un appareil de séparation (33) configuré pour effectuer au moins une séparation physique du microorganisme d’intérêt (28) et des microorganismes contaminants (32) au sein d’une portion du milieu de culture (30) ;
- un dispositif de lyse (34) configuré pour effectuer une lyse des microorganismes contaminants (32) séparés par la séparation physique de sorte à produire un lysat (35) ;
- des moyens de transports configurés pour au moins :
o prélever une portion du milieu de culture (30) comprenant le microorganisme d’intérêt (28) et des microorganismes contaminants (32) ;
o réintroduire ledit lysat (35) dans le compartiment (29) de culture.
10 - Installation (27) de culture selon la revendication 9, dans laquelle les moyens de transports sont en outre configurés pour :
o unifier le lysat (35) avec le microorganisme d’intérêt (28) séparé, de sorte à former un mélange et réintroduire ledit mélange dans le compartiment (29) de culture ;
o apporter du carbone organique au milieu de culture (30) directement dans le compartiment (29) de culture, dans le lysat (35) ou dans le mélange ou au microorganisme d’intérêt (28) séparé par la séparation physique.
1 1 - Installation (27) de culture selon l’une quelconque des revendications 9 à
10, comportant au moins un système de concentration (36) configuré pour concentrer les microorganismes contaminants (32) séparés.
12 - Installation (27) de culture selon l’une quelconque des revendications 9 à
11 , comportant un dispositif de purge (46) de microorganismes contaminants (32), un dispositif de purge (47) de milieu de culture (30) dépourvu de microorganismes contaminants (32) et de microorganisme d’intérêt (28) et un dispositif de récolte (48) du microorganisme d’intérêt (28).
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Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2756032A1 (de) * 1977-12-15 1979-06-21 Bayer Ag Neue praeparationen von mikroorganismen
US5739019A (en) * 1994-08-08 1998-04-14 Walker; Harrell L. Method of isolating and propagating microorganisms and viruses
FR2789399B1 (fr) * 1999-02-04 2001-04-13 Alpha Biotech Procede de fabrication d'extraits de micro-organismes photosynthetiques tels que notamment de spiruline
US6656721B1 (en) * 2000-08-08 2003-12-02 Roche Vitamins, Inc. Polynucleotide portions of the biotin operon from B. subtilis for use in enhanced fermentation
JP4430914B2 (ja) * 2003-10-02 2010-03-10 昭彦 ▲吉▼田 水生生態系再生工法
CN101765661B (zh) * 2007-06-01 2014-08-06 索拉兹米公司 在微生物中生产油
CN101280278A (zh) * 2008-05-20 2008-10-08 云南大学 溶藻菌的分离方法与应用
CN102089434A (zh) * 2008-07-30 2011-06-08 华盛顿州立大学研究基金会 生物燃料原料生产的集成系统
BRPI1012026A2 (pt) * 2009-05-26 2018-07-17 Solazyme Inc fracionamento de biomassa microbiana contendo óleo
US20110081706A1 (en) * 2009-10-02 2011-04-07 TransAlgae Ltd Method and system for efficient harvesting of microalgae and cyanobacteria
US8617861B2 (en) * 2009-11-23 2013-12-31 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for producing butanol using extractive fermentation with electrolyte addition
AU2011274791A1 (en) * 2010-07-07 2013-02-07 Phycal Llc Modification of microalgae for magnetic properties
US9044694B2 (en) * 2010-09-01 2015-06-02 Life Technologies Corporation Device for capture and lysis of microorganisms from liquids
CN101991611B (zh) * 2010-11-18 2012-09-19 秦生巨 活性生物抗菌物及其生产方法
EP2546352A1 (fr) * 2011-07-15 2013-01-16 Neste Oil Oyj Procédé de production de lipides à partir de résidus de production d'huile de palme
JP2013179868A (ja) * 2012-02-29 2013-09-12 Asahi Glass Co Ltd 微生物の培養方法
CA2888493C (fr) * 2012-11-09 2022-06-07 Heliae Development, Llc Procedes de culture de microorganismes dans des conditions mixotrophes non axeniques
CN103232116B (zh) * 2013-04-08 2014-05-28 南京师范大学 用蓝藻水华制备生物净水剂处理重金属废水的方法
ITUB20155703A1 (it) * 2015-11-18 2017-05-18 Bioreweal S R L Processo per la produzione di metano mediante conversione biologica di anidride carbonica.
CN106701580A (zh) * 2017-01-08 2017-05-24 北京工业大学 污水处理厂活性污泥中自养菌与异养菌的分离方法
CN107118966A (zh) * 2017-05-05 2017-09-01 李宜芳 原位环境微生物分离方法、土壤本源石油降解微生物分离与筛选方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LUCA POLIMENE ET AL: "A substantial fraction of phytoplankton-derived DON is resistant to degradation by a metabolically versatile, widely distributed marine bacterium", PLOS ONE, vol. 12, no. 2, 3 February 2017 (2017-02-03), pages e0171391, XP055543097, DOI: 10.1371/journal.pone.0171391 *
SULCIUS SIGITAS ET AL: "Establishment of axenic cultures from cyanobacterium Aphanizomenon flos-aquae akinetes by micromanipulation and chemical treatment", ALGAL RESEARCH-BIOMASS BIOFUELS AND BIOPRODUCTS, vol. 23, April 2017 (2017-04-01), pages 43 - 50, XP002788072, ISSN: 2211-9264 *
VAZQUEZ-MARTINEZ GUADALUPE ET AL: "Strategy to obtain axenic cultures from field-collected samples of the cyanobacterium Phormidium animalis.", JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS, vol. 57, no. 1, April 2004 (2004-04-01), pages 115 - 121, XP002788073, ISSN: 0167-7012 *

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