WO2020046065A1 - 2전극 시스템 및 이를 포함하는 바이오 센서 - Google Patents

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WO2020046065A1
WO2020046065A1 PCT/KR2019/011196 KR2019011196W WO2020046065A1 WO 2020046065 A1 WO2020046065 A1 WO 2020046065A1 KR 2019011196 W KR2019011196 W KR 2019011196W WO 2020046065 A1 WO2020046065 A1 WO 2020046065A1
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electrode
layer
glass substrate
pair
working
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PCT/KR2019/011196
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English (en)
French (fr)
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정택동
이다혜
이선미
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서울대학교 산학협력단
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements

Definitions

  • the present application relates to a two-electrode system and a biosensor including the same, and more particularly, to a two-electrode system and a biosensor including the plurality of working electrodes without a reference electrode and a counter electrode. .
  • Electrochemical sensors are analytical devices that act as transducers to convert signals resulting from specific biological recognition phenomena into detectable and measurable electrical signals. These electrochemical sensors have been known as the most commonly used biosensors for measurement and diagnostic testing in clinical analysis, and have overcome most of the disadvantages and problems that limit the use of other types of biosensors.
  • Electrochemical biosensors compared to most other biosensors, include high sensitivity, specificity for targeted analytes, fast response times, ability to operate in turbid or pigmented solutions, ease of use and the possibility of making them inexpensive portable devices. It offers several advantages. Moreover, the continuous response of the electrode system allows online control and makes it applicable to a wide range of samples. Based on these advantages, the field of electrochemical biosensors continues to grow rapidly.
  • a reference electrode In electrochemical analysis, a reference electrode is essential for measuring and controlling the electrochemical potential of a solution.
  • Several types of reference electrodes have been used in microfluidic chip-based electrochemical biosensors.
  • One type is the fabrication of micro thin films, such as metals or Ag / AgCl, into microfluidics with pseudo reference electrodes.
  • the quasi-reference electrode When the quasi-reference electrode is used as a raised metal on a substrate by a fine thin film process, the electrode fabrication procedure is simple, but the electrochemical potential is not fixed and unstable, and thus it is difficult to apply the intended potential to the working electrode. This is because all electrochemically active materials in solution affect the potential of the reference electrode.
  • the electrochemical potential is more stable than the previous case when the pseudo-reference electrode is made of Ag / AgCl film manufactured by a micro process, but the process is complicated because an additional chlorination process is required to make the Ag layer into AgCl.
  • the Ag / AgCl mixture may be screen printed, and the screen printed pseudo reference electrode may be washed away in the microfluid. Therefore, it is very difficult to maintain a constant electrochemical potential for a long time. The smaller the pseudo-reference electrode, the more difficult it is to maintain the electrochemical potential.
  • Another type of reference electrode is to place the reference electrode outside the microchannel.
  • the counter electrode has a problem in a similar manner.
  • the surface area of the counter electrode should be made larger than the surface area of the working electrode so that the counter electrode can have the exact phone potential intended. Therefore, it is disadvantageous to integrate the counter electrode into the microfluid.
  • Patent Document 1 Korean Patent Application No. 10-2011-0129528
  • a two-electrode system consisting only of working electrodes without a counter electrode and a biosensor including the same.
  • One aspect of the present application is a glass substrate; A pair of working electrodes formed on the glass substrate and spaced apart at predetermined intervals; A siloxane layer comprising an amine end group formed on the glass substrate; An antibody layer bonded to the amine-terminal group of the siloxane layer by a crosslinking agent; And an organic material layer formed on each of the pair of working electrodes.
  • Another aspect of the present application is a biosensor comprising the above-described two-electrode system.
  • Another aspect of the present application is to prepare a glass substrate; Forming a pair of working electrodes on the glass substrate; Treating the glass substrate on which the working electrode is formed with a silane-based compound solution to form an amine-terminal layer on the glass substrate, and heating at 100 to 150 ° C. for 15 to 45 minutes to form a siloxane layer; Forming an organic layer on the working electrode by electropolymerization; And treating the amine-terminated group of the siloxane layer with a crosslinking agent to attach the antibody.
  • the potential of the working electrode is determined, thereby driving the biosensor with two working electrodes without a separate reference electrode manufacturing process.
  • the biosensor since the electrochemical potential is determined by the fixed organic material layer, the biosensor may be constantly and stably driven.
  • the concentration of several detection target substances in the group represented by CK-MB, cTnI, myoglobin, etc. can be measured simultaneously with only one injection. Can be.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a conventional four-electrode system.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a two-electrode system that is one embodiment of the present application.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a two-electrode system that is one embodiment of the present application.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of a two-electrode system that is one embodiment of the present application.
  • 5 is a view for explaining the mechanism of the two-electrode system of one embodiment of the present application.
  • FIG. 6 is an image of a three-dimensional two-electrode system, which is one embodiment of the present application.
  • FIG. 7 is a schematic diagram of a three-dimensional two-electrode system as one embodiment of the present application.
  • FIG. 8 is a schematic diagram of a three-dimensional two-electrode system as one embodiment of the present application.
  • FIG. 9 is a graph showing results of Experimental Example 1.
  • FIG. 10 is a graph illustrating a result of measuring current against a DA concentration for an embodiment of the present application.
  • 11 is a cyclic voltammogram of an embodiment of the present application.
  • FIG. 13 is a graph of charge amount versus time for each CK-MB concentration and a graph of charge amount against CK-MB concentration according to an embodiment of the present application.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a conventional four-electrode system
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a two-electrode system that is one embodiment of the present application.
  • FIG. 1 conventionally including working electrodes WE1 and WE2, counter electrode CE, and reference electrode RE
  • the two-electrode system of the present application has a working electrode as shown in FIG. 2. (WE1, WE2) only.
  • the two-electrode system of the present application includes an siloxane layer to form an ITO electrode on a glass substrate and an amine end group on the glass substrate so that the antibody layer is bound using a crosslinking agent.
  • an organic material layer is formed on the ITO electrode, and the organic material layer on the ITO electrode serves as a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode, and the electrochemical potential can be kept constant with two working electrodes without the reference electrode.
  • the two-electrode system 1 includes a glass substrate 11.
  • Specific components and thickness of the glass substrate are not particularly limited, and any glass substrate can be applied as long as it can be applied in the technical field to which the present application belongs.
  • the two-electrode system 10 includes a pair of working electrodes 12 formed on the glass substrate 11 and spaced apart at predetermined intervals.
  • Each of the pair of working electrodes is preferably, but not limited to, made of indium tin oxide (ITO). Through this, it is possible to exhibit the effect of increasing the sensitivity of the sensor.
  • ITO indium tin oxide
  • Each size of the working electrode is preferably 15 ⁇ m or less. Through this magnitude, the signal can be amplified.
  • the predetermined interval between working electrodes is 30 micrometers or less. This may have an effect of amplifying the signal.
  • the method for forming the working electrode on the glass substrate is not particularly limited, and any method can be applied as long as it can be applied in the technical field to which the present application belongs.
  • the two-electrode system 1 includes a siloxane layer 14 including an amine end group formed on the glass substrate 11.
  • N- (6-aminohexyl) aminomethyltriethoxysilane N- (6-aminohexyl) aminomethyltriethoxysilane, AHAMTES
  • aminopropyltriethoxy which was anhydrous toluene solvent
  • the glass substrate was removed from the solution and then rinsed with ethanol, sonicated in ethanol for 3 to 7 minutes, heated at 100 ° C. to 150 ° C. for 15 to 45 minutes on a hot plate, and the siloxane layer To form.
  • Ammonium ions can be converted to neutral amines to provide more reactive amine functionalities.
  • the two-electrode system 1 includes an organic material layer 15 formed on each of the pair of working electrodes 12.
  • the organic material layer is an intermediate layer, and the electron transfer between the working electrode and the labeling material represented by the AP occurs quickly, and the potential of the working electrode is determined.
  • FIG. 5 is a view for explaining the mechanism of the two-electrode system of one embodiment of the present application.
  • an organic layer M OX + e ⁇ ⁇ M red
  • the redox reaction of this organic layer occurs before other redox materials in solution.
  • the electrochemical potential of the two working electrodes is determined by the type potential of organic matter.
  • the organic material of the organic material layer is a material capable of electropolymerization and electrochemically repeatable redox.
  • Organic materials having such properties are all applicable to the present application. Examples thereof include, but are not limited to, at least one selected from the group consisting of poly (methylene green), PMG) and poly (toluidine blue, PTB). This organic layer is redox before any other electrochemically active material in solution.
  • the method of laminating PMG in organic materials is performed by exposing the working electrode to a solution containing 0.5 mM methylene green monomer (MG) and 0.1 mM dopamine (DA) in a phosphate buffer solution (pH 7.0) containing 0.1 M KNO 3. Electropolymerization can be performed.
  • the redox species can be easily polymerized to form a layer and selectively adsorbed on the electrode surface.
  • the thickness of the layer can be easily controlled by controlling the electropolymerization conditions.
  • various materials can be laminated using the electropolymerization method.
  • PMG and PTB in particular, can serve as good electron transfer mediators for 4-aminophenol (AP).
  • DA solution is mixed with the MG solution
  • electropolymerization may be performed, whereby the PMG on the electrode may be stably fixed.
  • PDA poly (dopamine)
  • PDA may also improve the absorption of conductive polymer layers such as polypyrrole.
  • the PDA may have a similar function to that described above for the material for the other organic material layer.
  • PDA is not an electrically conductive material, electron transfer resistance may increase, so it is desirable to properly control the ratio of DA and MG.
  • the oxidation reaction of AP include PMG and PDA in a ratio of 1: 0.1 to 0.3. More preferably, it is included in the ratio of 0.5 mM: 0.1 mM. If the concentration of DA is higher than 0.3, the AP oxidation signal is weakened. This is because PDAs suppress electron transfer because of their electrical resistance. On the other hand, when the concentration of DA is less than 0.1, a sufficient PMG layer is not formed, so that it does not cover the working electrode surface sufficiently.
  • the PMG formed by the above-described method may serve as a counter electrode, a reference electrode, and the like in the two-electrode system.
  • the two-electrode system 1 includes an antibody layer 14 bonded to the amine-terminal group of the siloxane layer 13 by a crosslinking agent.
  • the antibody of the antibody layer is a substance corresponding to the detection target substance for the disease to be detected in the two-electrode system.
  • an antibody that can be applied thereto can be selected. Therefore, there is no need to specifically limit the antibodies applied to the present application.
  • the following antibodies are listed. By way of example, but not limited thereto, it may include at least one selected from the group consisting of anti CK-MB, anti cTnI and anti myoglobin.
  • the pair of working electrodes described above when included in a plurality of pairs, the plurality of detection target substances can be detected.
  • a pair of working electrodes can detect CK-MB and another pair of working electrodes can detect cTnI.
  • CK-MB Creatine Kinase-MB
  • the antibody of the present application is not limited to CK-MB.
  • crosslinking agent is not particularly limited, and may be suitably used a crosslinking agent that can be used in the technical field to which the present application belongs, and among them, it is preferable to use glutaraldehyde.
  • the glass substrate on which the organic layer is formed is rinsed with deionized water and then dried with N2 gas. This is followed by treatment with 5% glutaraldehyde solution for 30 minutes to 1.5 hours and rinsing with phosphate buffer solution. 50 ⁇ g / mL of mouse anti creatine kinase-MB containing PBS solution is incubated for 1 hour and washed with phosphate buffer solution. In addition, exposure to 1% bovine serum albumin solution for 30 hours limits the active site and inhibits nonspecific binding.
  • the two-electrode system of the present application may be two-dimensional, and may be three-dimensional as described below.
  • FIG. 6 is an image of a three-dimensional two-electrode system as an embodiment of the present application
  • FIG. 7 is a schematic diagram of a three-dimensional two-electrode system as an embodiment of the present application. 6 and 7, the lower substrate and the upper substrate may be included, and the lower substrate and the upper substrate may be coupled to face each other at a predetermined distance. These bonds can be joined by the connections of the gallium indium eutectic.
  • the lower substrate 20 and the upper substrate 30 are spaced at regular intervals and disposed to face each other.
  • the lower substrate 20 may include a first glass substrate 21; A pair of first working electrodes 22 formed on the first glass substrate 21 and spaced apart at predetermined intervals; A first siloxane layer (23) comprising an amine end group formed on the first glass substrate (21); A first antibody layer 24 bonded to the amine-terminal group of the siloxane layer 23 by a crosslinking agent; And a first organic layer 25 formed on each of the pair of first working electrodes 22.
  • the upper substrate 30 faces the lower substrate 20 spaced apart from each other at predetermined intervals, and includes a second glass substrate 31; A pair of second working electrodes 32 formed on the second glass substrate 31 and spaced apart at predetermined intervals; A second siloxane layer 33 comprising an amine end group formed on the second glass substrate 31; A second antibody layer 34 bonded to the amine-terminal group of the siloxane layer 33 by a crosslinking agent; And a lower substrate including a second organic material layer 35 formed on each of the pair of second working electrodes 32.
  • the distance between the first working electrode 22 and the second working electrode 33 is 30 ⁇ m or less.
  • one side of the upper substrate and one side of the lower substrate may be connected by a gallium indium eutectic connection.
  • the first organic material layer or the second organic material layer is a material capable of electropolymerization and electrochemically repeatable redox, poly (methylene green) (PMG) and poly (toluidine blue) (poly (toluidine blue, PTB) may comprise at least one selected from the group consisting of.
  • each of the pair of first working electrodes and the pair of second working electrodes is included in a plurality of pairs to detect a plurality of detection target substances.
  • Another aspect of the present application is a biosensor comprising the two-electrode system described above. Any configuration that can be applied to a biosensor in the art to which this application belongs may be included in this application.
  • the detection target substance of such a biosensor can be selected from the group consisting of CK-MB, cTnI and myoglobin.
  • Another aspect of the present application is a method of manufacturing a two-electrode system, the method comprising the steps of preparing a glass substrate; Forming a pair of working electrodes on the glass substrate; Treating the glass substrate on which the working electrode is formed with a silane-based compound solution to form an amine-terminal layer on the glass substrate, and heating at 100 to 150 ° C. for 15 to 45 minutes to form a siloxane layer; Forming an organic layer on the working electrode by electropolymerization; And treating the amine-terminus of the siloxane layer with a crosslinking agent to attach the antibody.
  • Silane-based compounds include, but are not limited to, N- (6-aminohexyl) aminomethyltriethoxysilane (N- (6-aminohexyl) aminomethyltriethoxysilane) or aminopropyltriethoxysilane can do.
  • the working electrode may include indium tin oxide (ITO).
  • ITO indium tin oxide
  • the crosslinking agent is not particularly limited, and any crosslinking agent applicable in the art to which the present application belongs may be applied, and it is preferable to apply glutaraldehyde.
  • the ITO electrode was formed in the shape of an interdigitated electrode array (IDA) on the glass substrate, washed, and then immersed in a siloxane solution represented by 5% AHAMTES for 24 hours at room temperature, and then amine-on the glass substrate. An end group layer was formed. It was rinsed with ethanol and sonicated in ethanol for 5 minutes. This was followed by heating on a hot plate at 120 ° C. for 30 to form a siloxane layer (denoted by reference numerals 13, 23, 33 in FIGS. 4 and 8).
  • IDA interdigitated electrode array
  • the working electrodes were made of flat and IDA structures. The following experiment was carried out and the results are shown in FIG. 9.
  • the current density of the ferric cyanide redox reaction was compared through simulation and electrochemical experiments.
  • the electrochemical experiment was performed with two working electrodes without a reference electrode.
  • the current density was largely measured in the working electrode made of the IDA structure.
  • the electrochemical potential of the two working electrodes was determined as the formal potential of ferric cyanide.
  • the working electrode of the IDA structure was composed of only two working electrodes without the reference electrode, it was confirmed that the electrochemical potential of the working electrode was determined as the formal potential of ferric cyanide.
  • DA was 0.5, 0.25, 0.1, 0.01, 0 mM solution in 0.5 mM MG solution, respectively, electropolymerized in a three-electrode system with MG to adsorb PMG / PDA to the electrode.
  • PMG / PDA-adsorbed electrodes were placed in Tris buffer (indicated by black circles in Fig. 10) and Tris buffer solution in which AP was melted (indicated by black triangles in Fig. 10), respectively. .
  • the value at which the oxidation current observed at that time is the largest is extracted and shown in FIG. This experiment confirmed that the most suitable when the concentration of DA is 0.1 mM.
  • Cyclic voltammogram obtained after exposing IDA working electrode without PMG to Tris buffer solution in which AP is dissolved (Fig. 12 (A)), obtained after exposing IDA working electrode adsorbed by PMG / PDA to Tris buffer.
  • the cyclic voltammogram (Fig. 12 (B)) and the cyclic voltammogram (Fig. 12 (C)) obtained after exposing the IDA working electrode adsorbed by PMG / PDA to the Tris buffer solution in which AP was dissolved were compared.
  • the redox of the AP was irreversible and it was difficult to determine where the type potential of the AP was. there was.
  • the AP type potential at that time was almost identical to that of PMG. It was confirmed that PMG mediates electron transfer between working electrode and AP. In addition, when constructing an electrochemical system using only two working electrodes with PMG / PDA fixed without reference electrodes, it is possible to determine where the electrochemical potential of the working electrode is.
  • an immunosensor for detecting CK-MB was produced as follows.
  • the two-electrode system manufactured in Experimental Example 1 described above was used, and an immune sensor was manufactured by using a time-charge method.
  • a graph of the charge amount versus time by CK-MB concentration and a graph of the charge amount versus the CK-MB concentration are shown in FIG. 13.
  • PMG / PDA is adsorbed on the IDA working electrode of the first substrate and incubated for 1 hour after exposure to an antigen solution having a concentration of 100 ng / mL with the antibody fixed on the glass surface. After rinsing, the antibody is incubated. Thereafter, the antibody is incubated with the labeling enzyme and at the same time catching the immediately preceding antibody. The second substrate is similarly produced.
  • Alkaline phosphatate which is a substrate for the enzyme, is injected into the channel. After 10 minutes, apply a constant voltage and read the current magnitude.
  • This immunoassay was also performed for antigen concentrations of 10, 1 ng / mL, 100, 10, 1 pg / mL. At least three sensors were prepared for each concentration.
  • FIG. 13 (A) shows one example and FIG. 13 (B) shows the average value and the deviation for each antigen concentration. Through this, it was confirmed that 3D IDA with PMG / PDA fixed was sensitively driven by the immune sensor in the two-electrode system.
  • the present invention is not limited to CK-MB, but may be applied to various detection substances including proteins or nucleic acids. The manufacturing process of such a chip was very simple, and it was confirmed that it is suitable for mass production at an appropriate cost.

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Abstract

본 출원은 2전극 시스템 및 이를 포함하는 바이오 센서 에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 기준 전극과 상대 전극을 포함하지 않으며, 복수의 작업 전극만을 포함하는 2전극 시스템 및 이를 포함하는 바이오 센서에 관한 것이다.

Description

2전극 시스템 및 이를 포함하는 바이오 센서
본 출원은 2전극 시스템 및 이를 포함하는 바이오 센서에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 기준 전극과 상대 전극을 포함하지 않으며, 복수의 작업 전극만을 포함하는 2전극 시스템 및 이를 포함하는 바이오 센서에 관한 것이다.
전기화학센서는 특이적 생물학적 인식 현상의 결과로 발생하는 신호를 검출 및 측정가능한 전기신호로 변환시키는 변환기로서 작용하는 분석장치이다. 이들 전기화학센서는 임상분석시 계측과 진단시험에 가장 통상적으로 사용되고 있는 바이오센서로서 알려져 왔고, 다른 유형의 바이오센서 사용을 제한하는 대부분의 단점과 문제점을 극복해왔다.
전기화학 바이오센서는 대부분의 다른 바이오센서에 비해 고감도, 표적 분석물질에 대한 특이성, 빠른 응답시간, 혼탁액 또는 착색 용액에서의 동작능력, 사용 용이성 및 저가의 휴대용 기기로 만들 수 있다는 가능성을 포함하는 몇 가지 이점을 제공한다. 더욱이, 전극 시스템의 연속 응답에 의해 온라인 제어가 가능하고 광범위한 표본에 대해 적용할 수 있게 한다. 이러한 이점을 바탕으로 전기화학 바이오센서 분야는 빠른 속도로 지속 성장하고 있다.
전기 화학적 분석에서, 용액의 전기 화학 전위를 측정 및 제어를 위해서 기준 전극은 필수적이다. 미세유체 칩 기반의 전기화학형 바이오센서에서 여러 종류의 기준 전극이 사용되어 왔다. 유형 중 하나는 유사 기준 전극으로 금속 또는 Ag/AgCl과 같은 미세 박막을 미세유체 내에 제작하는 것이다. 유사기준전극을 미세 박막공정으로 기판에 올린 올린 금속으로 사용 시, 전극 제작 절차는 간단하지만, 전기 화학 전위가 고정되지 않고 불안정하여, 작업 전극에 의도한 전위를 인가하기 어렵다. 이는 용액 내 전기 화학적으로 활성이 있는 모든 물질들이 기준 전극의 전위에 영향을 미치기 때문이다. 그리고 유사 기준 전극을 미세공정으로 제작된 Ag/AgCl 필름으로 제작하여 사용 시, 앞의 경우보다 전기화학전위는 안정하지만, Ag층을 AgCl로 만드는 염소화 과정이 추가적으로 필요하기 때문에 공정이 복잡하다. 또는 Ag/AgCl 혼합물은 스크린 인쇄하기도 하는데 스크린 인쇄된 유사 기준 전극은 미세 유체 내에서 씻겨내질 수 있다. 따라서, 장기간 일정한 전기화학전위를 유지하는 것은 매우 어렵다. 유사 기준 전극을 작게 만들수록 전기화학전위를 유지하기는 더욱 어렵다. 기준 전극의 다른 유형은 마이크로 채널 외부에 기준 전극을 배치하는 것이다. 그것의 전기화학전위는 유사 기준 전극보다 안정적이지만, 기준 전극과 작업 전극이 서로 멀리 떨어져 있고 얇고 긴 채널로 인하여 상당한 저항, 즉 iR 강하가 발생한다. 상대 전극도 비슷한 방식으로 문제가 있다. 상대 전극의 표면적이 작업 전극의 표면적보다 크게 제작하여야 상대 전극이 의도한 정확한 전화학전위를 가질 수 있다. 그러므로 상대 전극을 마이크로 유체로 통합하는 것은 번거롭다는 단점이 있다.
[선행기술문헌]
특허문헌 1: 한국 특허 출원 10-2011-0129528
본 출원의 일 실시예에 따르면, 기준 전극, 상대 전극 없이 작업 전극만으로 구성된 2전극 시스템 및 이를 포함하는 바이오 센서를 제공하고자 한다.
본 출원의 일 측면은 유리 기판; 상기 유리 기판 위에 형성되며 소정의 간격으로 이격되어 형성된 한 쌍의 작업 전극; 상기 유리 기판 상에 형성된 아민 말단기를 포함하는 실록산층; 가교제에 의해 상기 실록산층의 아민-말단기에 결합된 항체층; 및 상기 한 쌍의 작업 전극 각각의 위에 형성되는 유기물층을 포함하는 2전극 시스템이다.
본 출원의 다른 일 측면은 전술한 2전극 시스템을 포함하는 바이오 센서이다.
본 출원의 또 다른 일 측면은 유리 기판을 준비하는 단계; 상기 유리 기판 상에 한 쌍의 작업 전극을 형성하는 단계; 상기 작업 전극이 형성된 유리 기판을 실란계 화합물 용액으로 처리하여, 상기 유리 기판 위에 아민-말단기 층을 형성하고, 100 내지 150 ℃에서 15 분 내지 45 분 동안 가열하여, 실록산층을 형성하는 단계; 상기 작업 전극 위에 유기물층을 전기중합(electropolymerization)으로 형성하는 단계; 및 상기 실록산층의 아민-말단기에 가교제를 처리하여, 항체를 부착하는 단계를 포함하는 2전극 시스템의 제조 방법이다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 작업 전극에 전자전달이 빠른 매개체 물질을 고정시킴으로서, 작업 전극의 전위가 결정되고, 이로 인하여 별도의 기준 전극 제작 공정없이 작업 전극 2개로 바이오센서를 구동할 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 고정된 유기물층에 의하여 전기화학전위가 결정되므로 일정하고 안정적으로 바이오 센서를 구동할 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 기준 전극이 없으므로 제작이 간단하고 휴대가 가능한 칩 기반의 전기화학형 바이오 센서를 제공할 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 건전지를 이용하여 간단하게 센서를 작동시킬 수 있고, 이로 인하여 휴대하면서 센서 사용이 가능하여, 바이오 센서 사용자의 편리성을 크게 향상시킬 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 하나의 기판에 복수의 작업 전극 쌍을 제작함으로써, 한 번의 시료주입만으로 CK-MB, cTnI, myoglobin 등으로 대표되는 그룹 내의 여러 검출 표적 물질의 농도를 동시에 측정할 수 있다.
도 1은 종래의 4전극 시스템의 개략도이다.
도 2는 본 출원의 일 실시형태인 2전극 시스템의 개략도이다.
도 3은 본 출원의 일 실시형태인 2전극 시스템의 개략도이다.
도 4는 본 출원의 일 실시형태인 2전극 시스템의 개략도이다.
도 5는 본 출원의 일 실시형태인 2전극 시스템의 메커니즘을 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 본 출원의 일 실시형태인 3차원 2전극 시스템의 이미지이다.
도 7은 본 출원의 일 실시형태인 3차원 2전극 시스템의 개략도이다.
도 8은 본 출원의 일 실시형태인 3차원 2전극 시스템의 개략도이다.
도 9는 실험예 1에 대한 결과 그래프이다.
도 10은 본 출원의 일 실시예에 대한 DA농도에 대한 전류를 측정한 결과 그래프이다.
도 11은 본 출원의 일 실시형태에 대한 순환전압전류 그래프이다.
도 12는 본 출원의 일 실시형태에 대한 순환전압전류 그래프이다.
도 13은 본 출원의 일 실시형태에 대한 CK-MB 농도별 시간 대비 전하량에 대한 그래프와, CK-MB 농도 대비 전하량에 대한 그래프이다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 구성요소 등이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 구성요소 등이 존재하지 않거나 부가될 수 없음을 의미하는 것은 아니다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 출원의 2전극 시스템을 상세히 설명한다. 다만, 첨부된 도면은 예시적인 것으로, 본 출원의 2전극 시스템이 첨부된 도면에 의해 제한되는 것은 아니다.
도 1은 종래의 4전극 시스템의 개략도이며, 도 2는 본 출원의 일 실시형태인 2전극 시스템의 개략도이다. 도 1에 도시한 바와 같이, 종래에는 작업 전극(WE1, WE2), 상대 전극(CE) 및 기준 전극(RE)를 포함하는데 반하여, 본 출원의 2전극 시스템은 도 2에 도시한 바와 같이 작업 전극(WE1, WE2)만을 포함하는 차별성을 갖는다.
도 3에 도시한 바와 같이, 본 출원의 2전극 시스템은 유리 기판 상에 ITO 전극을 형성하며, 유리 기판 상에 아민 말단기를 형성하도록, 실록산층을 포함하고 가교제를 이용하여 항체층이 결합되도록 하며, ITO 전극 상에는 유기물층을 형성하여, ITO 전극상의 유기물층이 작업 전극, 상대 전극, 및 기준 전극 역할을 하며, 기준 전극 없이 작업전극 2개로 전기화학전위를 일정하게 유지할 수 있다.
이하, 2전극 시스템을 도 4를 참조하여 보다 상세히 설명한다.
도 4에 도시한 바와 같이, 2전극 시스템(1)은 유리 기판(11)을 포함한다. 유리 기판의 구체적 성분 및 두께 등은 특별히 한정되는 것은 아니며, 본 출원이 속한 기술 분야에서 적용될 수 있는 것이라면, 어떠한 유리 기판을 적용할 수 있다.
2전극 시스템(10)은 유리 기판(11) 위에 형성되며 소정의 간격으로 이격되어 형성된 한 쌍의 작업 전극(12)을 포함한다.
한 쌍의 작업 전극 각각은 이에 한정되는 것은 아니지만 인듐 주석 산화물(Indium Tin Oxide, ITO)로 이루어진 것이 바람직하다. 이를 통하여, 센서의 감도를 높이는 효과를 나타낼 수 있다.
작업 전극의 각각의 크기는 15 ㎛이하인 것이 바람직하다. 이러한 크기를 통하여 신호가 증폭되는 효과를 나타낼 수 있다.
작업 전극 사이의 소정의 간격은 30 ㎛ 이하인 것이 바람직하다. 신호가 증폭되는 효과를 나타낼 수 있다.
유리 기판 위에 작업 전극을 형성하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 본 출원이 속한 기술 분야에서 적용될 수 있는 것이라면, 어떠한 방법을 적용할 수 있다.
그리고, 2전극 시스템(1)은 상기 유리 기판(11) 상에 형성된 아민 말단기를 포함하는 실록산층(14)을 포함한다.
전술한 작업 전극이 형성된 유리 기판을 세정한 후 무수 톨루엔 용매인 5% N-(6-아미노헥실)아미노메틸트리에톡시실란 (N-(6-aminohexyl)aminomethyltriethoxysilane, AHAMTES) 또는 아미노프로필트리에톡시실란 (aminopropyltriethoxysilane)으로 대표되는 실란그룹의 용액에 상온에서 10 내지 30 시간 침지하여, 유리 기판 상에 아민-말단기가 포함된 층을 형성한다. 아민-말단기 포함층은 후술하는 항체가 유리 기판에 부착되어 떨어지지 않도록 한다.
이 후, 유리 기판을 상기 용액으로부터 빼낸 후 에탄올로 린스하고, 3 분 내지 7 분 동안 에탄올에서 초음파 처리를 하고, 고온의 플레이트에서 100 ℃ 내지 150 ℃에서 15 분 내지 45 분 동안 가열하여, 실록산층을 형성한다. 암모늄 이온을 중성의 아민으로 변화하여, 보다 반응성이 높은 아민 작용기를 제공할 수 있다.
그리고, 2전극 시스템(1)은 한 쌍의 작업 전극(12) 각각의 위에 형성되는 유기물층(15)을 포함한다.
본 출원에서 유기물층은 매개층으로서, 작업 전극과 AP로 대표되는 표지물질 사이의 전자 전달이 빠르게 일어나도록 하고, 작업 전극의 전위가 결정되도록 한다.
도 5는 본 출원의 일 실시형태인 2전극 시스템의 메카니즘을 설명하기 위한 도면이다. 도 5에 도시한 바와 같이, 2개의 작업전극 위에 전자전달이 빠른 유기물 층(MOX + e- ↔ Mred)이 흡착되어있다. 두 작업 전극은 이 유기물층으로 덮여있으므로, 이 유기물층의 산화환원 반응이 용액 중에 있는 다른 산화환원 가능한 물질들보다 먼저 일어난다. 그리고 두 작업 전극의 전기화학전위는 유기물의 형식전위로 결정된다.
상기 유기물층의 유기물은 전기중합이 가능하고 전기화학적으로 산화환원이 반복 가능한 물질이다. 이러한 특성을 갖는 유기물은 본 출원에 적용이 모두 가능하다. 이러한 예시로서, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리(메틸렌 그린) (poly(methylene green), PMG) 및 폴리(톨루이딘 블루) (poly(toluidine blue, PTB)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있다. 이 유기물층이 용액 중에 있는 다른 전기화학적으로 활성이 있는 물질들보다 먼저 산화환원된다.
이하, 유기물 중 PMG를 중심으로 설명하지만, 본 출원의 유기물이 PMG로 한정되는 것은 아니다.
유기물 중 PMG를 적층하는 방법은 0.1 M KNO3를 함유하는 포스페이트 버퍼 용액(pH 7.0)에 0.5 mM의 메틸렌 그린 모노머 (MG)와 0.1 mM의 도파민(DA)이 혼합된 용액에 작업 전극을 노출하여 전기중합(electropolymerization)을 할 수 있다.
전기중합법을 이용할 경우, 산화환원 종이 용이하게 중합되어, 층을 형성할 수 있으며, 전극 표면에서 선택적으로 흡착될 수 있다. 층의 두께는 전기중합 조건을 제어함으로써 용이하게 제어할 수 있다. 또한, 전기중합법을 이용하여, 다양한 물질을 적층할 수 있다. 특히 PMG와 PTB의 경우 4-아미노페놀(AP)에 대한 우수한 전자 전달 매개체로 역할을 할 수 있다.
또한, MG 용액에 DA 용액을 혼합한 후 같이 전기중합을 하여, 전극 위의 PMG가 안정적으로 고정할 수 있다. 이는 전기중합된 PDA가 다양한 기판에서 접착력을 부여할 수 있다. 폴리(도파민)(PDA)는 또한, 폴리피롤과 같은 전도성 폴리머 층의 흡수력을 향상시킬 수 있다.
다만, PDA는 다른 유기물층을 위한 물질에도 전술한 작용과 유사한 작용을 할 수 있다.
PDA의 경우 전기 전도성 물질이 아니기 때문에, 전자 전달 저항성이 증가할 수 있으므로, DA와 MG의 비율을 적절하게 제어하는 것이 바람직하다.
여기서, AP의 산화반응은 PMG와 PDA가 1: 0.1 내지 0.3 의 비율로 포함되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 0.5 mM : 0.1 mM의 비율로 포함되는 것이 바람직하다. DA의 농도가 0.3 보다 높아지면 AP 산화 시그널이 약해진다. 이는 PDA가 그들의 전기 저항성 때문에, 전자 전달을 억제하기 때문이다. 반면에, DA의 농도가 0.1 보다 작은 경우에는 충분한 PMG층이 형성되지 못하여, 작업 전극 표면을 충분히 커버하지 못한다.
전술한 방법에 의하여 형성된 PMG는 2전극 시스템에서 상대 전극, 기준 전극 등의 역할을 할 수 있다.
그리고, 2전극 시스템(1)은 가교제에 의해 상기 실록산층(13)의 아민-말단기에 결합된 항체층(14)을 포함한다.
상기 항체층의 항체는 2전극 시스템에서 검출하고자 하는 질병에 대한 검출 표적 물질에 대응되는 물질이다. 본 출원에서는 검출 표적 물질이 정해지면, 그에 적용될 수 있는 항체를 선택할 수 있다. 따라서, 특별히 본 출원에 적용되는 항체를 제한할 필요가 없다. 다만, 설명의 편의성을 위하여 하기와 같은 항체를 나열한다. 예시적으로 이에 한정되는 것은 아니지만, anti CK-MB, anti cTnI 및 anti myoglobin으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있다.
여기서, 전술한 한 쌍의 작업 전극이 복수의 쌍으로 포함되는 경우에는 복수의 검출 표적 물질을 검출할 수 있다. 예를 들어, 한 쌍의 작업 전극은 CK-MB를 검출할 수 있고, 다른 한 쌍의 작업 전극은 cTnI를 검출할 수 있다.
이하, 항체 중 CK-MB(Creatine Kinase-MB) 중심으로 설명하지만, 본 출원의 항체가 CK-MB로 한정되는 것은 아니다.
또한, 가교제는 특별히 한정되는 것은 아니며, 본 출원이 속한 기술 분야에서 사용될 수 있는 가교제를 적절히 사용할 수 있으며, 그 중 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 사용하는 것이 바람직하다.
유기물층이 형성된 유리 기판을 탈이온화수로 헹군 후 N2 가스로 건조한다. 이 후, 5%의 글루타르알데하이드 용액으로 30 분 내지 1.5 시간 동안 처리하고, 포스페이트 버퍼 용액으로 헹군다. 50 μg/mL의 마우스 안티 크리아틴 키나제-MB 함유 PBS 용액을 1시간 인큐베이팅하고, 포스페이트 버퍼 용액으로 세척한다. 또한, 1% bovine serum albumin 용액에 30 동안 노출하여, 초과적인 활성 부위를 제한하고, 비특이성 결합을 억제하였다.
전술한 설명과 같이, 본 출원의 2전극 시스템은 2차원일 수 있으며, 후술하는 바와 같이 3차원일 수 있다.
도 6은 본 출원의 일 실시형태인 3차원 2전극 시스템의 이미지이며, 도 7은 본 출원의 일 실시형태인 3차원 2전극 시스템의 개략도이다. 도 6 및 도 7에 도시한 바와 같이, 하부 기재와 상부 기재를 포함하며, 하부 기재와 상부기재는 소정의 거리로 이격되어 마주보도록 결합할 수 있다. 이러한 결합은 갈륨 인듐 공정 (gallium indium eutectic)의 연결부에 의해 결합될 수 있다.
이하, 이러한 3차원 2전극 시스템을 도 8을 통해 보다 상세히 설명한다. 다만, 전술한 2차원 2전극 시스템에서 설명한 부분은 발명을 명확성을 위하여, 3차원 2전극 시스템에 대한 설명시 생략한다.
도 8에 도시한 바와 같이, 3차원 2전극 시스템(2)에서, 하부 기재(20)와 상부 기재(30)가 일정한 간격으로 이격되며, 서로 마주보도록 배치된다.
하부 기재(20)는 제 1 유리 기판(21); 상기 제 1 유리 기판(21) 위에 형성되며 소정의 간격으로 이격되어 형성된 한 쌍의 제 1 작업 전극(22); 상기 제 1 유리 기판(21) 상에 형성된 아민 말단기를 포함하는 제 1 실록산층(23); 가교제에 의해 상기 실록산층(23)의 아민-말단기에 결합된 제 1 항체층(24); 및 상기 한 쌍의 제 1 작업 전극(22) 각각의 위에 형성되는 제 1 유기물층(25)을 포함한다.
상부 기재(30)는 하부 기재(20)와 소정의 간격으로 이격되어 마주보며, 제 2 유리 기판(31); 상기 제 2 유리 기판(31) 위에 형성되며 소정의 간격으로 이격되어 형성된 한 쌍의 제 2 작업 전극(32); 상기 제 2 유리 기판(31) 상에 형성된 아민 말단기를 포함하는 제 2 실록산층(33); 가교제에 의해 상기 실록산층(33)의 아민-말단기에 결합된 제 2 항체층(34); 및 상기 한 쌍의 제 2 작업 전극(32) 각각의 위에 형성되는 제 2 유기물층(35)을 포함하는 하부 기재를 포함한다.
여기서, 제 1 작업 전극(22)과 제 2 작업 전극(33) 사이의 거리는 30 ㎛이하이다. 또한, 상부 기재의 일측과 하부 기재의 일측은 갈륨 인듐 공정(gallium indium eutectic) 연결부로 연결될 수 있다.
제 1 유기물층 또는 제 2 유기물층은 전기중합이 가능하고 전기화학적으로 산화환원이 반복 가능한 물질로서, 폴리(메틸렌 그린) (poly(methylene green), PMG) 및 폴리(톨루이딘 블루) (poly(toluidine blue, PTB)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있다.
3차원 2전극의 경우에도, 한 쌍의 제 1 작업 전극 및 한 쌍의 제 2 작업 전극 각각이 복수의 쌍으로 포함되어, 복수의 검출 표적 물질을 검출할 수 있다.
본 출원의 다른 측면은 전술한 2전극 시스템을 포함하는 바이오 센서이다. 본 출원이 속한 기술분야에서 바이오 센서에 적용될 수 있는 어떠한 구성도 본 출원에 포함될 수 있다.
이러한 바이오 센서의 검출 표적 물질은 CK-MB, cTnI 및 myoglobin 으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 출원의 또 다른 측면은 2전극 시스템의 제조 방법이며, 상기 방법은 유리 기판을 준비하는 단계; 상기 유리 기판 상에 한 쌍의 작업 전극을 형성하는 단계; 상기 작업 전극이 형성된 유리 기판을 실란계 화합물 용액으로 처리하여, 상기 유리 기판 위에 아민-말단기 층을 형성하고, 100 내지 150 ℃에서 15 분 내지 45 분 동안 가열하여, 실록산층을 형성하는 단계; 상기 작업 전극 위에 유기물층을 전기중합(electropolymerization)으로 형성하는 단계; 및 상기 실록산층의 아민-말단기에 가교제를 처리하여, 항체를 부착하는 단계를 포함할 수 있다.
여기서, 실란계 화합물 용액이라나, 실란을 포함하는 화합물의 용액으로서, 그 함량이나 농도는 특별히 한정되는 것은 아니고, 다양한 함량이나 농도가 적용될 수 있다. 실란계 화합물은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예시로서, N-(6-아미노헥실)아미노메틸트리에톡시실란 (N-(6-aminohexyl)aminomethyltriethoxysilane) 또는 아미노프로필트리에톡시실란 (aminopropyltriethoxysilane)를 포함할 수 있다.
여기서, 작업 전극은 인듐 주석 산화물(Indium Tin Oxide, ITO)을 포함할 수 있다.
가교제는 특별히 한정되는 것은 아니며, 본 출원이 속한 기술분야에서 적용가능한 가교제는 어떠한 것이라도 적용될 수 있으며, 글루타르알데히드를 적용하는 것이 바람직하다.
전술한 2전극 시스템에서 설명한 부분은 발명을 명확성을 위하여, 2전극 시스템의 제조 방법에 대한 설명시 생략한다.
이하, 실험예를 통하여 본 출원을 보다 상세히 설명한다.
[ 실험예 ]
1. 3D IDA 전극내의 2전극 시스템의 형태 확인
유리 기판을 준비한 후, 유리 기판 위에 ITO 전극을 interdigitated electrode array (IDA) 모양으로 형성한 후, 세척한 후, 5% AHAMTES로 대표되는 실록산 용액내에 24시간동안 실온에서 침지하여, 유리 기판 위에 아민-말단기 층을 형성하였다. 이를 에탄올로 린스한 후 5 분간 에탄올 내에서 초음파처리하였다. 이 후, 30동안 120 ℃에서 고온의 플레이트에서 가열하여, 실록산층을 형성하였다 (도 4 및 도 8에서 도면 부호 13, 23, 33로 표시). 이 후, 0.1 M KNO3를 함유하는 포스페이트 버퍼 용액(pH 7.0)에 0.5 mM의 MG와 0.1 mM의 DA가 혼합된 용액에 이들을 노출하여, 유기물층을 형성하였다(도 4 및 도 8에서 도면 부호 15, 25, 35로 도시함). 이하, 다른 설명이 없는한 전술한 방법에 의하여 제작된 2전극 시스템을 사용하였다.
작업전극을 평평한 구조인 것과 IDA 구조로 제작된 것으로 제작하였다. 하기와 같은 실험을 실시하고 도 9에 그 결과를 도시하였다.
구체적으로 페리사이아나이드 산화환원 쌍이 녹아있는 용액에 전극을 노출시킨 후, 페리사이아나이드 산화환원 반응의 전류밀도 크기를 시뮬레이션과 전기화학 실험을 통하여 비교하였다. 이 때 전기화학실험은 기준전극 없이 2개의 작업전극을 가지고 수행하였다. 그 결과 IDA 구조로 제작된 작업전극에서 전류밀도가 크게 측정되었다. 이를 통해 IDA 구조로 인한 전류신호 증폭 효과를 확인하였다. 추가적으로, 평평한 구조의 작업전극 2개만으로 페리사이아나이드의 산화환원을 관찰했을 때 두 작업전극의 전기화학전위가 페리사이아나이드의 형식전위로 결정되는 것을 확인하였다. 이것과 마찬가지로 IDA 구조의 작업전극의 경우도 기준전극 없이 작업전극 2개만으로 전기화학 시스템을 구성하였을 때 작업전극의 전기화학전위가 페리사이아나이드의 형식전위로 결정되는 것을 확인하였다.
2. PMG의 전기중합( electropolymerization )
전기중합법에 의하여, PMG를 안정적으로 적층하기 위하여, PDA와 PMG의 관계를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 실시하였다.
0.5 mM인 MG 용액에 DA가 각각 0.5, 0.25, 0.1, 0.01, 0 mM 되는 용액을 만들어, MG와 함께 3전극 시스템에서 전기중합을 하여 전극에 PMG/PDA가 흡착하도록 하였다. PMG/PDA가 흡착된 전극을 각각 Tris buffer (도 10에서 검은 원으로 표시)와 AP가 녹아있는 Tris buffer 용액 (도 10에서 검은 세모로 표시)에 넣은 후 3전극 시스템에서 순환전압전류그림을 얻었다. 그 때 관찰되는 산화전류가 가장 클 때의 값을 추출하여 도 10에 도시하였다. 이 실험을 통해 DA의 농도가 0.1 mM일 때가 가장 적합함을 확인하였다. DA의 농도가 0.1 mM 를 초과할 때는 DA가 전기중합되면서 PDA가 생성되는데 이것은 전도성이 없기 때문에 PMG의 산화환원을 방해하고, DA의 농도가 0.1 mM 미만 일때는 PMG가 안정적으로 ITO 전극에 고정되는 것을 돕기에 부족한 것으로 관찰되었다.
또한, ITO 전극을 MG와 DA가 혼합된 용액에 노출시킨 후, 순환전압전류법을 이용하여 MG와 DA를 연속적으로 산화시키며 PDA와 함께 PMG를 전극위에 흡착시켰다. 이 과정을 보여주는 것을 도 11(A)에 나타내었다. 도 11(B)에서 확인되는 바와 같이, 첫번째 순환에서 2개의 산화 피크가 관찰되는데 이것은 MG가 PMG가 되면서 나타나는 2개의 전자반응으로 비롯된 것이다. 그리고 도 11(C)에서 확인되는 바와 같이, 두번째 순환에서 두번째 산화 피크가 첫번째 순환에서 관찰된 것에 비해서 2배이상 증가하였다. 이것은 첫번째 순환이후에 형성된 PMG의 환원 형태가 전극에 남아있고, 이것이 다시 산화되는 것과 용액 중 MG가 산화되는 것이 겹쳐져서 전류 크기가 증가하였기 때문이다.
3. PMG와 AP의 산화환원 사이클에 대한 평가
PMG가 없는 IDA 구조의 작업전극을 AP가 녹아있는 Tris buffer 용액에 노출 시킨 후 얻은 순환전압전류그림 (도 12(A)), PMG/PDA가 흡착한 IDA 작업전극을 Tris buffer에 노출 시킨 후 얻은 순환전압전류그림 (도 12(B)), PMG/PDA가 흡착한 IDA 작업전극을 AP가 녹아있는 Tris buffer 용액에 노출 시킨 후 얻은 순환전압전류그림 (도 12(C))을 비교하였다. 그 결과, PMG/PDA가 없을 때는 AP의 산화환원이 비가역적이고, AP의 형식전위가 어디인지 확인하기 어려웠던 반면 PMG/PDA가 흡착된 전극에서는 AP의 산화환원이 가역적이고 AP의 형식전위를 확인할 수 있었다. 또한, 그 때의 AP 형식전위는 PMG의 형식전위와 거의 일치하였다. 이를 통해 PMG가 작업전극과 AP 사이의 전자전달을 매개한다는 것을 확인하였다. 또한, 기준전극없이 PMG/PDA를 고정한 작업전극 2개만으로 전기화학 시스템을 구성할 때 작업전극의 전기화학전위가 어디인지를 파악할 수 있다.
4. 2전극 시스템에서 3D IDA 전극에서 인간 CK-MB의 검출
PMG/PDA 3D IDA 칩의 성능 평가하기 위하여, CK-MB를 검출하는 면역센서를 하기와 같이 제작하였다.
전술한 실험예 1에서 제작한 2전극 시스템을 이용하였으며, 시간-전하(량)법을 이용하여 면역센서를 제작하였다.
CK-MB 농도별 시간 대비 전하량에 대한 그래프와, CK-MB 농도 대비 전하량에 대한 그래프를 도 13에 도시하였다. 제 1 기판의 IDA 작업전극에는 PMG/PDA가 흡착되어있고, 유리면에는 항체가 고정되어있는 상태에서 농도가 100 ng/mL인 항원 용액에 노출시켜 1시간 동안 인큐베이팅한 후, 초과량을 포스페이트 버퍼 용액으로 헹군 후, 항체 인큐베이팅한다. 그 이후 표지효소가 붙어있으면서 동시에 직전에 붙인 항체를 잡는 항체를 인큐베이팅시킨다. 제 2 기판도 이와 마찬가지로 제작한다. 제 1 기판과 제 2 기판의 작업전극이 마주보도록 맞붙여서 미세유체 채널을 제작후, 효소에 대한 기질인 Alkaline phosphatate를 채널에 주입한다. 10분후 일정 전압을 가하여 그 때의 전류 크기를 읽는다. 이와 같은 면역분석을 항원 농도 10, 1 ng/mL, 100, 10, 1 pg/mL 에 대해서도 수행하였다. 그리고 각 농도별로 최소 3개 이상의 센서를 제작하였고, 도 13(A)는 그 중 한 예시이며 도 13(B)는 항원 농도별 평균값과 편차를 나타내었다. 이를 통해 PMG/PDA가 고정된 3D IDA가 2전극 시스템에서 민감하게 면역센서로 구동됨을 확인하였다.
이러한 실험을 통하여, 적절한 매개층을 작업 전극 상에 형성함으로써, 기준 전극이나 상대 전극이 없어서, 우수한 센싱 효과를 나타낼 수 있는 2전극 시스템 및 이를 포함하는 바이오 센서를 제작할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 페러데이 전류 시그널이 2전극 시스템으로 구동하는 3D IDA에서 증폭되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이러한 2전극 시스템이 인간 Ck-MB를 매우 높은 민감도와 신뢰성으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다. 더불어, 단순히 CK-MB에 국한 되는 것이 아니라, 단백질이나 핵산을 포함하는 다양한 검출 물질에 적용될 수 있다. 이러한 칩의 제작 공정이 매우 심플하여, 적절한 비용으로 대량 생산에 적합함을 확인할 수 있었다.
전술한 실시예 및 실험예는 본 출원을 설명하기 위한 목적으로 기재된 것일 뿐 본 출원이 이에 한정되는 것은 아니다.
[부호의 설명]
1, 2: 2전극 시스템
20: 하부 기재
30: 상부 기재
11, 21, 31: 유리 기판
12, 22, 32: 작업 전극
13. 23, 33: 실록산층
14, 24, 34: 항체층
15, 25, 35: 유기물층

Claims (15)

  1. 유리 기판;
    상기 유리 기판 위에 형성되며 소정의 간격으로 이격되어 형성된 한 쌍의 작업 전극;
    상기 유리 기판 상에 형성된 아민 말단기를 포함하는 실록산층;
    가교제에 의해 상기 실록산층의 아민-말단기에 결합된 항체층; 및
    상기 한 쌍의 작업 전극 각각의 위에 형성되는 유기물층을 포함하는 2전극 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 한 쌍의 작업 전극의 각각의 크기는 15 ㎛ 이하이며, 상기 소정의 간격은 30 ㎛ 이하인 2전극 시스템.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체는 2전극 시스템에서 검출하고자 하는 질병에 대한 검출 표적 물질에 대응되는 항체인 2전극 시스템.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체는 anti CK-MB, anti cTnI 및 anti myoglobin으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인 2전극 시스템.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 유기물층의 유기물은 전기중합이 가능하고 전기화학적으로 산화환원이 반복 가능한 물질인 2전극 시스템.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 유기물층의 유기물은 폴리(메틸렌 그린) (poly(methylene green), PMG) 및 폴리(톨루이딘 블루) (poly(toluidine blue, PTB)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 2전극 시스템.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 한 쌍의 작업 전극이 복수의 쌍으로 포함되어, 복수의 검출 표적 물질을 검출하는 2전극 시스템.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 2전극 시스템은 하부 기재; 및 상기 하부 기재와 소정의 간격으로 이격되어 마주보며 배치된 상부 기재를 포함하며,
    상기 하부 기재는:
    제 1 유리 기판;
    상기 제 1 유리 기판 위에 형성되며 소정의 간격으로 이격되어 형성된 한 쌍의 제 1 작업 전극;
    상기 제 1 유리 기판 상에 형성된 아민 말단기를 포함하는 제 1 실록산층;
    가교제에 의해 상기 실록산층의 아민-말단기에 결합된 항체층; 및
    상기 한 쌍의 제 1 작업 전극 각각의 위에 형성되는 제 1 유기물층을 포함하며,
    상기 상부 기재는:
    제 2 유리 기판;
    상기 제 2 유리 기판 위에 형성되며 소정의 간격으로 이격되어 형성된 한 쌍의 제 2 작업 전극;
    상기 기판 상에 형성된 아민 말단기를 포함하는 제 2 실록산층;
    가교제에 의해 상기 실록산층의 아민-말단기에 결합된 항체층; 및
    상기 한 쌍의 제 2 작업 전극 각각의 위에 형성되는 제 2 유기물층을 포함하는 상부 기재를 포함하며,
    상기 제 1 작업 전극과 제 2 작업 전극 사이의 거리는 30 ㎛이하인 2전극 시스템.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 제 1 유기물층 및 제 2 유기물층의 유기물 각각은 전기중합이 가능하고 전기화학적으로 산화환원이 반복 가능한 물질로서, 폴리(메틸렌 그린) (poly(methylene green), PMG) 및 폴리(톨루이딘 블루) (poly(toluidine blue, PTB)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 2전극 시스템.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 제 1 작업 전극과 제 2 작업 전극 사이의 거리를 30 ㎛이하로 이격되도록, 상기 상부 기재의 작업 전극 일측과 하부 기재의 작업 전극 일측은 공정 (eutectic)을 통해 전기적으로 연결되는 2전극 시스템.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 한 쌍의 제 1 작업 전극 및 한 쌍의 제 2 작업 전극 각각이 복수의 쌍으로 포함되어, 복수의 검출 표적 물질을 검출하는 2전극 시스템.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 2전극 시스템을 포함하는 바이오 센서.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 바이오 센서의 검출 표적 물질은 CK-MB, cTnI 및 myoglobin으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 바이오 센서.
  14. 유리 기판을 준비하는 단계;
    상기 유리 기판 상에 한 쌍의 작업 전극을 형성하는 단계;
    상기 작업 전극이 형성된 유리 기판을 실란계 화합물 용액으로 처리하여, 상기 유리 기판 위에 아민-말단기 층을 형성하고, 100 내지 150 ℃에서 15 분 내지 45 분 동안 가열하여, 실록산층을 형성하는 단계;
    상기 작업 전극 위에 유기물층을 전기중합(electropolymerization)으로 형성하는 단계; 및
    상기 실록산층의 아민-말단기에 가교제를 처리하여, 항체를 부착하는 단계를 포함하는 2전극 시스템의 제조 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 실란계 화합물은 N-(6-아미노헥실)아미노메틸트리에톡시실란 (N-(6-aminohexyl)aminomethyltriethoxysilane) 또는 아미노프로필트리에톡시실란 (aminopropyltriethoxysilane)를 포함하는 2전극 시스템의 제조 방법.
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