WO2020036517A1 - Препарат на основе литического микобактериофага и способ его получения - Google Patents
Препарат на основе литического микобактериофага и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- WO2020036517A1 WO2020036517A1 PCT/RU2019/050132 RU2019050132W WO2020036517A1 WO 2020036517 A1 WO2020036517 A1 WO 2020036517A1 RU 2019050132 W RU2019050132 W RU 2019050132W WO 2020036517 A1 WO2020036517 A1 WO 2020036517A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- mycobacteriophage
- liposomes
- drug
- tuberculosis
- particles
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
Definitions
- the invention relates to medicine, in particular to the problem of treating tuberculosis.
- treatment of tuberculosis requires very long courses of specific chemotherapy using various combinations of anti-TB drugs, mainly antibiotics.
- Liposomes are also one of the most famous methods of drug transport, as well as promising antigenic carriers for vaccines, since their phospholipid membrane is well compatible with eukaryotic cells and can be modified in various ways to obtain immunoliposomes, etc. For this purpose, their size is usually not exceeds 150-200 nm (R. Nisini et al. The Multirole of liposomes in therapy and prevention of infection diseases. Review. Frontiers in Immunology, 2018, v.9 art.l55, pl-23.). Experimental studies of the use of liposomal antibiotics for the treatment of tuberculosis infection have been carried out since the early 80s of the last century, the first of which was the publication of one of the authors of this application (Vladimirsky M.A.
- liposomes as a vehicle for use Mycobacteriophages have so far been held back by the particle size of the Mycobacteriophage, since the lytic mycobacteriophage has a phage head size of 65 nm and a phage tail size of PO nm. Therefore, liposomes comprising particles of about 200 nm in size must be too large to be phagocytosed by eukaryotic cells. Therefore, the task of obtaining and using liposomes with included particles of mycobacteriophage was not trivial, and so far the use of such experimental drugs with the aim of their lytic effect on tuberculosis mycobacteria, including the intracellular population of mycobacteria, has not been described.
- the cesium gradient mycobacteriophage isolation technology used in the method provides a relatively low yield (Boulanger P. Purification of bacteriophages and SDS-PAGE analysis of phage structural proteins from ghost particles. In: Clokie MR, Kropinksi AM, editors. Bacteriophages: Methods and Protocols. Humana
- the known drug is not sterilized, since it is used only for rectal administration.
- the drug cannot be sterilized without damaging the viability of phage particles, for example, by lyophilization followed by gamma irradiation, which will also lead to damage to the DNA of the mycobacteriophage.
- liposomes of 5-10 microns in size cannot be phagocytosed by macroorganism cells - macrophages, which will not allow to fully realize the antituberculous effect of the drug. Disclosure of Invention
- the objective of the invention is the creation of a drug based on a lytic strain of mycobacteriophage that inactivates intracellular mycobacterium tuberculosis.
- the problem is solved with the help of a preparation for inactivation (lysis) of intracellular tuberculosis mycobacteria, which is mycobacteriophage D29, included in a 0.4 micron bilayer phospholipid liposome.
- the problem is solved by the method of obtaining the specified drug, which consists in the isolation and purification of phage particles from bacterial lysates of M.smegmatis using ion exchange chromatography on a Q-sepharose column.
- the resulting purified mycobacteriophage at a concentration of not less than 10 8 pfu / ml is shaken with a phospholipid film for 5-10 minutes, extruding the resulting particles through a 5 micron filter and subsequent 20-fold extrusion using 0.4 micron filters, concentration and separation of the mycobacteriophage fraction included in the liposomes by centrifugation at 13 ⁇ 2 thousand rpm for 30 ⁇ 5 minutes.
- the inventive method was obtained liposomal particles with included mycobacteriophages of optimal size - mainly with a particle size of about 400 nm, which allows their phagocytosis by macrophages, which, in in turn, it allows to fully realize the antituberculous effect of the drug.
- the inventive method achieves a high - 80% efficiency of incorporating particles of mycobacteriophage into liposomes, while in the previously described method, the liposome fraction was not separated with the included mycobacteriophage and the efficiency of its incorporation was not studied.
- the inventive preparation based on mycobacteriophage ensures the penetration of particles of mycobacteriophage into cells of transplantable macrophage culture not less than 4 times more efficiently and ensures inactivation of mycobacterium tuberculosis infecting macrophages also no less than 4-5 times more efficiently.
- FIG. 1 shows the negative contrast of bilayer liposomes without phage.
- FIG. Figure 2 shows the positive contrast of the control sample of mycobacteriophage with uranyl acetate. Visible DNA is the phage head and tail.
- FIG. 3 shows positive contrast. Bottom right - the head of the phage included in the liposome.
- FIG. 4 shows positive contrast.
- FIG. 5 shows the negative contrast of the destroyed liposome.
- the phage heads are visible.
- mycobacteriophage preparation D29 (Fast Plaque TV reagent kit, Biotec laboratories Ltd. Ipswich United Kingdom) at a concentration of phage particles of at least 10 8 plaque forming units (rGi) / ml and dialyzed against phage buffer solution, shaken for 5-10 minutes with a phospholipid film.
- the obtained multilayer liposomes are subjected to sequential extrusion through filters with a pore size of 5 microns, and then 20 times extrusion (punching) through filters with a pore size of 0.4 microns, after which, for concentration and separation of liposomes with incorporated mycobacteriophages from unincorporated particles of the mycobacteriophage, as well as to release the drug from small liposome particles, the drug is centrifuged at 13 ⁇ 2 thousand rpm. within 30 ⁇ 5 minutes Next, the concentration of mycobacteriophage included in liposomes is measured using real-time quantitative PCR and the percentage of inclusion of phage particles in liposomes, which is at least 80%, is determined.
- films formed by phosphotidylcholine can be used; to strengthen the membrane of the liposomes obtained, cholesterol taken in a mass ratio of 1 ⁇ 0.8 to 5 ⁇ 1 phosphatidylcholine is added to the film. Also, for the stability of the drug, a nonionic surfactant, tween-80, is added to the films in an amount of 1.2 ⁇ 0.2 mg per 5 ⁇ 1 mg of phosphatidylcholine.
- the MBT located is demonstrated by using, as an example, the macrophage model of mice, which used cells of the transplantable line RAW 264.7 (ATCC - American collection of cell cultures) infected with MBT (museum strain H37Rv, obtained from
- the transplantable human macrophage line THP (ATCC) can also be used, as well as the less-studied in vitro microgranuloma model, consisting of lymphocytes and human blood macrophages infected with tuberculosis mycobacteria.
- the lytic (antibacterial) effect of MBT is measured during plating of infected macrophages, after freezing and thawing them twice on 7H10 Middlebrook agar medium.
- a method of obtaining a drug for lytic action against an intracellular population of Mycobacterium tuberculosis (MBT) based on mycobacteriophage D29 is implemented by propagating it in a culture of non-tuberculous M.smegmatis mycobacteria (ATCC 101), isolation and purification using ion-exchange chromatography, obtaining multilayer liposomes at 5 -10 minutes of shaking the mycobacteriophage preparation with a specific activity of at least 10 8 plaque-forming phage particles (pfu) in ml of phage buffer solution, Ph-7.5 with a phospholipid film obtained by after evaporation of phosphatidylcholine, cholesterol and tween-80 ethanol dissolved in 96 ° on a rotary evaporator in a ratio of 5 ⁇ 1: 1 ⁇ 0.8: 1.2 ⁇ 0.2 with extrusion through a filter with 5 micron pores and subsequent 20-fold extrusion using filters with a pore size of
- liposomal mycobacteriophage 40 mg of egg phosphatidylcholine (Lipoid, Germany), 8 mg of cholesterol (Sigma) and 8.8 mg of tween 80 were dissolved in 3 ml of 96% ethanol; dried on a rotary evaporator to obtain a lipid film; 3 ml of a Mycobacteriophage preparation chromatographically purified on a Q Sepharose ion exchange column was added with an activity of at least 10 8 pfu / ml; shaken until a suspension is formed, pushed through a sterile filter 5.0 with a pore size of 5 microns, and then at least 20 times through a sterile filter with a pore size of 0.4 microns; centrifuged to release mycobacteriophage not included in the liposomes and the relative amount of phage DNA in the pellet was measured in comparison with the total amount of DNA introduced into the phage preparation.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, в частности к проблеме лечения туберкулеза. Как известно, лечение туберкулеза требует очень длительных курсов специфической химиотерапии с использованием различных комбинаций противотуберкулезных препаратов, в основном, антибиотиков. Заявляемое изобретение касается препарата для инактивации (лизиса) внутриклеточных микобактерий туберкулеза на основе литического штамма микобактериофага, инактивирующего внутриклеточные микобактерии туберкулеза, представляющего собой микобактериофаг D29, включенный в бислойную фосфолипидную липосому размером 0,4 микрон и способ его получения.
Description
ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ ЛИТИЧЕСКОГО МИКОБАКТЕРИОФАГА И
СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
Область техники
Изобретение относится к медицине, в частности к проблеме лечения туберкулеза. Как известно, лечение туберкулеза требует очень длительных курсов специфической химиотерапии с использованием различных комбинаций противотуберкулезных препаратов, в основном, антибиотиков.
Уровень техники
Длительность курсов приема антибиотиков приводит возникновению лекарственной устойчивости возбудителя - микобактерий туберкулеза (МБТ). При этом, использование при лечении больных туберкулезом новых, вновь созданных противотуберкулезных препаратов также достаточно быстро приводит к появлению лекарственно-устойчивых штаммов МБТ. Кроме того, при туберкулезной инфекции значительная часть микобактерий находится - персистирует и размножается внутриклеточно - в тканевых макрофагах.
Известно, что применение бактериофагов для лечения различных микробных инфекции, в общем, рассматривается мировой научной общественностью в качестве альтернативы эры применения антибиотиков в связи с распространением лекарственной устойчивости к этим препаратам. Однако, практически, несмотря на имеющиеся публикации об успешном применении бактериофагов для лечения некоторых воспалительных заболеваний микробной природы, их применение в настоящее время ограничено (A. Nilsson. Phage therapy. Constraints and possibilities. Upsala J. of Med. Sciences, 2014,119, 192-198).
Известны также, экспериментальные работы от 70-х годов и до 1991 г., в которых были предприняты попытки лечения туберкулезной инфекции с помощью различных штаммов микобактериофагов. Однако, полученные результаты были ограниченными по эффективности и уступали применению традиционных противотуберкулезных лекарственных веществ (Козьмин-Соколов Б.Н. и др. Влияние микобактериофагов на течение экспериментальной туберкулезной инфекции у белых мышей. Проблемы туберкулеза 1975, N° 4, с. 75-79; Земскова З.С., Дорожкова И.Р. Патоморфологическая оценка лечебного действия микобактериофагов при туберкулезе. Проблемы туберкулеза 1991, N° 11, с. 63-66).
В 2000-е годы интерес к применению микобактериофагов, в частности, к перспективе применения литического микобактериофага D 29 для лечения туберкулезной инфекции, вновь вырос и обсуждается в некоторых международных публикациях последнего времени (Gr. Hatfull. Mycobacteriophages: Windows into Tuberculosis. Plos patogens. 2014, n.10, issue 3). Обсуждаются вопросы доступности, транспорта микобактериофагов к зонам туберкулезного воспаления и к внутриклеточно расположенным микобактериям, а также к вероятной возможности элиминации микобактериофагов микро и макрофагами периферической крови.
Известны способы лекарственного транспорта с помощью различных микронных, субмикронных и наноносителей. Чаще всего используются полимеры молочной и гликолевой кислоты, альгинаты, а также частицы хитозана. (Y. Wang et al. Review. Manufacturing Techniques and Surface Engineering of Polymer Based Nanoparticles for Targeted Drug Delivery to Cancer. Nanomaterials 2016, 6, 26 p.1-18).
Липосомы также являются одним из наиболее известных методов лекарственного транспорта, а также в качестве перспективных антигенных носителей для получения вакцин, поскольку их фосфолипидная мембрана хорошо совместима с клетками эукариотов и может быть различным образом модифицирована, получением иммунолипосом и др. В этих целях их размер обычно не превышает 150-200 нм (R.Nisini et al.The Multirole of liposomes in therapy and prevention of infection diseases. Review. Frontiers in Immunology, 2018, v.9 art.l55, p.l- 23.). Экспериментальные исследования применения липосомальных антибиотиков для лечения туберкулезной инфекции проводились с начала 80-х годов прошлого века, первой из которых была публикация одного авторов настоящей заявки (Vladimirsky М.А. and Ladigina G.A. Antibacterial activity of liposomal-entrapped streptomycin mice infected with Mycobacterium tuberculosis. Biomedicine and Pharmacotherapy, 1982, v. 36, N. 8-9, p.375-377). Размеры этих липосом не превышали 100 нм. Эти работы в дальнейшем были подтверждены развивались, но препятствием к практическому применению липосомальных антибиотиков для лечения туберкулеза стало накопление препарата в печени, что позже несколько нивелировалось при использовании stealth липосом с полиэтиленгликолем. Липосомы, содержащие микобактериофаг, в качестве саморазмножающегося лекарства теоретически могли бы эффективно доставляться в мелкие бронхи дренирующие очаги специфического туберкулезного воспаления. Однако, идея использования липосом в качестве транспортного средства для применения
микобактериофагов до сих пор сдерживалась размерами частиц микобактериофага, поскольку литический микобактериофаг имеет размер головки фага - 65 нм и размер фагового хвоста - ПО нм. Следовательно, липосомы, включающие частицы размером около 200 нм должны быть слишком большими для того чтобы быть фагоцитированными клетками эукариотов. Поэтому задача получения и применения липосом с включенными частицами микобактериофага не была тривиальной и до сих пор использование таких экспериментальных препаратов с целью их литического действия на микобактерии туберкулеза, в том числе, на внутриклеточную популяцию микобактерий не было описано.
Наиболее близким к заявляемому является препарат микобактериофага, получаемый способом по патенту Ю.Н.Курунова и сотр. 2001 г. «Способ фаготерапии туберкулеза» N° 2214829, 2001 г., который заключается в очищении микобактериофага от бактериального лизата при высокоскоростном (70-100 тыс g) центрифугировании в градиенте цезия, затем полученный препарат встряхивали вместе с фосфолипидной пленкой, получая таким образом многослойные липосомы и вводили их ректально мышам, инфицированным микобактериями туберкулеза.
Использованная в способе технология выделения микобактериофагов в градиенте цезия дает относительно низкий выход (Boulanger Р. Purification of bacteriophages and SDS-PAGE analysis of phage structural proteins from ghost particles. In: Clokie MR, Kropinksi AM, editors. Bacteriophages: Methods and Protocols. Humana
Press; New York: 2009. pp. 227-238), а также повреждает жизнеспособность фаговых частиц (Carlson К. Appendix: Working with bacteriophages: common techniques and methodological approaches. In: Kutter EM, Sulakvelidze A, editors. Bacteriophages: biology and application. CRC Press; Boca Raton, FL: 2005). Кроме того, приведенный авторами патента способ получения препарата микобактериофагов, позволяет получать только очень крупные многослойные липосомы размером 5-10 микрон
(«Липосомы в биологических системах» под ред Г.Грегориадиса пер. с англ.,
Москва 1983 г.). Также известный препарат не стерилизуется, поскольку его используют только для ректального введения. Препарат невозможно стерилизовать без повреждения жизнеспособности фаговых частиц, например, путем лиофилизации с последующим гамма облучением, что также приведет к повреждению ДНК микобактериофага. Кроме того, липосомы размером 5-10 микрон не могут фагоцитироваться клетками макроорганизма - макрофагами, что не позволит в полном объеме реализовать противотуберкулезный эффект препарата.
Раскрытие изобретения
Задачей заявляемого изобретения является создание препарата на основе литического штамма микобактериофага, инактивирующего внутриклеточные микобактерии туберкулеза.
Поставленная задача решается с помощью препарата для инактивации (лизиса) внутриклеточных микобактерий туберкулеза, представляющего собой микобактериофаг D29, включенный в бислойную фосфолипидную липосому размером 0,4 микрон.
Также поставленная задача решается способом получения указанного препарата, заключающимся в выделении и очистке фаговых частиц из бактериальных лизатов M.smegmatis с помощью ионно-обменной хроматографии на колонке Q-sepharose. Полученный очищенный микобактериофаг в концентрации не менее 108 pfu/ мл встряхивают с фосфолипидной пленкой в течение 5-10 минут, экструзией полученных частиц через фильтр с порами 5 микрон и последующей 20- кратной экструзией с использованием фильтров размером пор 0,4 мк, концентрированием и отделением включенной в липосомы фракции микобактериофага с помощью центрифугирования при 13±2 тыс об/мин в течение 30±5 минут. Предпочтительно использовать фосфолипидную пленку, полученную из фосфатидилх олина, холестерина и твин-80 взятых в массовом соотношении 5±1 : 1±0,8 : 1,2 ± 0,2.
Преимуществом заявляемого технического решения является:
1. Для выделения микобактериофагов, в частности, микобактериофага D29 из бактериального лизата M.smegmatis , в суспензии которых производится размножение микобактериофага, используется альтернативная технология выделения и очистки микобактериофага: Evelien М. Adriaenssens, Susan М. Lehman et. al. CIM® Monolithic Anion-Exchange Chromatography as a Useful Alternative to CsCl Gradient Purification of Bacteriophage Particles. Virology 2012, 434(2), p. 265-270., K.Liu et al. Purification an concentration of mycobacteriophage D29 using monolithic chromatographic columns. J. of Virological Methods, 2012, n.186, р.7-13, которая позволяет сохранить жизнеспособность частиц бактериофага.
2. Заявляемым способом были получены липосомальные частицы с включенными микобактериофагами оптимального размера - в основном с размером частиц около 400 нм, что обеспечивает возможность их фагоцитоза макрофагами, что, в
свою очередь, позволяет в полном объеме реализовать противотуберкулезный эффект препарата.
3. Получение стерильного препарата, подтверждаемого размером фильтруемых частиц и сохранением стерильности в отношении банальной микрофлоры в течение 3-4-недельного периода культивирования инфицированных микобактериями макрофагов на агаровой питательной среде 7Н10, при котором определяли рост МБТ при отсутствии банальной микрофлоры.
4. Заявляемым способом достигается высокая - 80% эффективность включения частиц микобактериофага в липосомы, тогда как в ранее описанном способе не производилось отделение фракции липосом с включенным микобактериофагом и не изучалась эффективность его включения.
5. Полученный таким способом, заявляемый препарат на основе микобактериофага обеспечивает проникновение частиц микобактериофага в клетки перевиваемой культуры макрофагов не менее, чем в 4 раза более эффективно и обеспечивает е инактивацию микобактерий туберкулеза, инфицирующих макрофаги также не менее чем в 4-5 раз более эффективно.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется следующими чертежами, где на фиг. 1 представлено негативное контрастирование бислойных липосом без фага.
На фиг. 2 показано позитивное контрастирование контрольного образца микобактериофага уранилцетатом. Видны ДНК головка фага и хвост.
На фиг. 3 показано позитивное контрастирование. Справа внизу - головка фага, включенного в липосому.
На фиг. 4 показано позитивное контрастирование. Головка фага, включенного в липосому.
На фиг. 5 показано негативное контрастирование разрушенной липосомы. При затекании контрастирующего вещества видны головки фагов.
Осуществление изобретения
Для получения липосом очищенный при ионно-обменной хроматографии на колонке Q-sepharose препарат микобактериофагов D29 (набор реагентов Fast Plaque ТВ, Biotec laboratories Ltd. Ipswich United Kingdom) в концентрации фаговых частиц не менее 108 плакобразующих единиц (рГи)/мл и диализованный против фагового
буферного раствора, встряхивают в течение 5-10 минут с фосфолипидной пленкой. Полученные многослойные липосомы подвергают последовательной экструзии через фильтры с размером пор 5 микрон, а затем 20 кратной экструзии (продавливание) через фильтры с размером пор 0,4 микрон, после чего для концентрирования и отделения липосом с включившимися микобактериофагами от не включившихся частиц микобактериофага, а также для освобождения препарата от мелких липосомных частиц, препарат центрифугируют при 13±2 тыс. об/мин. в течение 30±5 мин. Далее концентрацию микобактериофага, включенного в липосомы измеряют с помощью количественной ПЦР в реальном времени и определяют процент включения частиц фага в липосомы, который составляет не менее 80%.
В качестве фосфолипидных пленок могут быть использованы пленки, образованные фосфотидилхолином, для укрепления мембраны получаемых липосом в состав пленки добавляют холестерин, взятый в массовом соотношении 1±0,8 к 5±1 фосфатидилхолина. Также для стабильности препарата в пленки дополнительно добавляют неионогенное поверхностно активное вещество - твин-80 в количестве 1,2 ± 0,2 мг на 5±1 мг фосфатидилхолина.
Размер и морфология получаемых бислойных липосом продемонстрированы с помощью электронной микроскопии при негативном и позитивном контрастировании уранилацетатом (фиг. 1-5).
Достижение литического действия микобактериофагов на внутриклеточно
МБТ, расположенные демонстрируется при использовании, в качестве примера, модели макрофагов мышей, в качестве которых были использованы клетки перевиваемой линии RAW 264.7 (АТСС - американская коллекция клеточных культур), инфицированных МБТ (музейный штамм H37Rv, получен из
Государственного института стандартизации и контроля биопрепаратов (ГИСК) им.
Л. А. Тарасевича). Для аналогичных исследований могут быть также использованы перевиваемая линия макрофагов человека ТНР (АТСС), а также возможно менее изученная модель микрогранулемы in vitro, состоящая из лимфоцитов и макрофагов крови человека, инфицированных микобактериями туберкулеза. Литическое действие микобактериофага D29, включенного в липосомы в отношении внутриклеточных микобактерий туберкулеза (МБТ), а также эффективность проникновения липосомного микобактериофага в клетки макрофагов сравнивается с микобактериофагом не включенным в липосомы при аналогичной фаговой
активности. Литическое (антибактериальное) действие МБТ измеряется при посевах инфицированных макрофагов, после их двукратного замораживания и оттаивания на агаровую питательную среду 7Н10 Миддлбрук.
Способ получения препарата для литического действия в отношении внутриклеточной популяции микобактерий туберкулеза (МБТ) на основе микобактериофага D29 реализуется путем его размножения в культуре нетуберкулезных микобактерий M.smegmatis (АТСС 101), выделения и очистки с помощью ионно-обменной хроматографии, получением многослойных липосом при 5-10 минутном встряхивании препарата микобактериофага специфической активностью не менее 108 плакобразующих фаговых частиц (pfu) в мл фагового буферного раствора, Ph-7,5 с фосфолипидной пленкой, получаемой после выпаривания на роторном испарителе растворенного в 96° этанола фосфатидилхолина, холестерина и твин-80 в соотношении 5±1 : 1±0,8 : 1,2 ± 0,2 с экструзией через фильтр с порами 5 микрон и последующей 20-кратной экструзией с использованием фильтров с размером пор 0,4 мк, концентрированием и отделением включенной в липосомы фракции микобактериофага от не включенных фаговых частиц, а также отделением более мелких липосомных частиц с помощью центрифугирования при 13 тыс об/ мин в течение 30 минут, исследованием количественного (процентного) содержания включенных в липосомы частиц микобактериофага путем определения ДНК микобактериофага с помощью количественной ПЦР в реальном времени, составляющего не менее 80% от внесенного микобактериофага, контролем полученного препарата с помощью электронной микроскопии и анализом биологической активности в культуре макрофагов перевиваемой линии, инфицированных МБТ.
Пример осуществления изобретения.
1. Модель внутриклеточной инфекции микобактерий туберкулеза: макрофаги перевиваемой линии RAW 264.7 (АТСС), инфицировали МБТ музейного штамма H37Rv при инкубации в течение 24 часов; суспензия инфицированных макрофагов выделяли с освобождением от не включившихся микобактерий с помощью центрифугирования при 2 тыс обор/мин в градиенте плотности раствора Ficoll-Paque (GE Healthcare) на разделе сред и отмывали в питательной среде RPMI 1640 с последующим культивированием в лунках 6-луночного культурального планшета с использованием среды RPMI 1640 с 20% фетальной бычьей сыворотки,
L-глютамина, MEM Vitamins, MEM NEAA, Sodium Pyruvate PenStrep (0,1) mcg/ml);
затем после суточной инкубации в лунках планшета вносили микобактериофаг D29 известной активности - 10 8 плакобразующих частиц (pfu) в мл в липосомальной форме и не включенного в липосомы в равных количествах, определяемых по числу pfu и концентрации ДНК фага.
2. Приготовление липосомального микобактерифага: 40 мг яичного фосфатидилхолина (фирма Lipoid, Германия), 8 мг холестерина (Sigma) и 8,8 мг твин 80 растворяли в 3 мл 96% этанола; высушивали на роторном испарителе до получения липидной пленки; вносили 3 мл хроматографически очищенного на ионнообменной колонке Q сефарозы препарата микобактериофага с активностью не менее 108 pfu/мл; встряхивали до образования суспензии, продавливали через стерильный фильтр 5,0 с размером пор 5 мк, а затем не менее 20 раз через стерильный фильтр с размером пор 0,4 мк; центрифугировали для освобождения от не включенного в липосомы микобактериофага и измеряли относительное количество ДНК фага в осадке в сравнении с общим количеством ДНК внесенного в препарат фага. Контроль полученного липосомального препарата микобактериофага проводили также при использовании электронной микроскопии фиг. 1-5.
3. Исследование эффективности антимикобактериального действия липосомального микобактериофага: после 24 часовой инкубации культуры макрофагов с внутриклеточными МБТ с препаратами микобактериофагов (липосомальный и свободный микобактериофаг) клетки отмывали однократно питательной средой; снимали инфицированные макрофаги с поверхности лунок в объеме 200 мкл; проводили двукратное замораживание и оттаивание материалов, после чего по 100 мкл из каждого образца засевали на чашки с питательной средой 7Н10 для определения жизнеспособности МБТ, а также по 100 мкл аналогичных материалов исследовали для определения количества ДНК микобактериофага с помощью ПЦР в реальном времени.
Результаты исследования: 1. Количество ДНК фага, включенного в липосомы, определяемого в клетках инфицированных макрофагов по данным количественного ПЦР -анализа в 4-8 раз (в разных экспериментах) превышало количество ДНК свободного, не включенного в липосомы фага.
2. Количество колоний МБТ выявленных в результате культивирования: в контрольных чашках без фага - 300 -500; в чашках с микобактериофагом не включенным в липосомы составляло - 15- 27 колоний, тогда как в чашках с после
воздействия липосомального фага число колоний - 3-4 на чашку. Различия статистически значимы.
Claims
1. Препарат для инактивации внутриклеточных микобактерий туберкулеза, представляющий собой микобактериофаг D29, включенный в бислойную фосфолипидную липосому размером 0,4 микрон.
2. Способ получения препарата по п. 1 заключающийся в выделении и очистке фаговых частиц из бактериальных лизатов M.smegmatis с последующим включением в фосфолипидные липосомы, отличающийся тем, что выделение и очистку фаговых частиц из бактериальных лизатов M.smegmatis проводят с помощью с помощью ионно-обменной хроматографии на колонке Q-sepharose, полученный очищенный микобактериофаг в концентрации не менее 108 pfu/ мл встряхивают с фосфолипидной пленкой в течение 5-10 минут, проводят экструзию полученных частиц через фильтр с порами 5 микрон и последующей 20-кратной экструзией с использованием фильтров размером пор 0,4 мк, концентрированием и отделением включенной в липосомы фракции микобактериофага с помощью центрифугирования при 13±2 тыс об/мин в течение 30±5 минут.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют фосфолипидную пленку полученную из фосфатидилхолина, холестерина и твин-80 взятых в массовом соотношении 5±1 : 1±0,8 : 1,2 ± 0,2.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018129791A RU2691439C1 (ru) | 2018-08-16 | 2018-08-16 | Препарат на основе литического микобактериофага и способ его получения |
| RU2018129791 | 2018-08-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2020036517A1 true WO2020036517A1 (ru) | 2020-02-20 |
Family
ID=66947556
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2019/050132 WO2020036517A1 (ru) | 2018-08-16 | 2019-08-16 | Препарат на основе литического микобактериофага и способ его получения |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2691439C1 (ru) |
| WO (1) | WO2020036517A1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2214829C2 (ru) * | 2001-11-05 | 2003-10-27 | Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза | Способ фаготерапии туберкулеза |
| RU2622755C1 (ru) * | 2016-05-04 | 2017-06-19 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Башкирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Средство с липосомами, содержащими изониазид |
-
2018
- 2018-08-16 RU RU2018129791A patent/RU2691439C1/ru active
-
2019
- 2019-08-16 WO PCT/RU2019/050132 patent/WO2020036517A1/ru active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2214829C2 (ru) * | 2001-11-05 | 2003-10-27 | Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза | Способ фаготерапии туберкулеза |
| RU2622755C1 (ru) * | 2016-05-04 | 2017-06-19 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Башкирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Средство с липосомами, содержащими изониазид |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BOULANGER PASCALE ET AL.: "Purification of bacteriophages and SDS-PAGE analysis of phage structural proteins from ghost particles", BACTERIOPHAGES: METHODS AND PROTOCOLS, vol. 502, 2009, New York, pages 227 - 238, XP055687218 * |
| LIU KEYANG ET AL.: "Purification and concentration of mycobacteriophage D29 using monolithic chromatographic columns", JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, vol. 186, no. 1-2, December 2012 (2012-12-01), pages 7 - 13, XP055687219 * |
| NISINI ROBERTO ET AL.: "The Multirole of Liposomes in Therapy and Prevention of Infectious Diseases", FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, vol. 9, 5 February 2018 (2018-02-05), pages 155, XP055687217 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2691439C1 (ru) | 2019-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2735139C2 (ru) | Полученные из лизата тромбоцитов человека внеклеточные везикулы для применения в медицине | |
| Wang et al. | Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune-activity of macrophage | |
| JP4889485B2 (ja) | 調節性細胞リガンドをリポソームに含有させてなる医薬 | |
| GLAVIN et al. | Ultrastructure of lung in Legionnaires' disease: observations of three biopsies done during the Vermont epidemic | |
| García-Pérez et al. | Macropinocytosis is responsible for the uptake of pathogenic and non-pathogenic mycobacteria by B lymphocytes (Raji cells) | |
| JP2005320341A (ja) | 感染症治療用組成物 | |
| CN100475840C (zh) | 胡蜂抗菌肽及其制备方法和应用 | |
| CN107875124B (zh) | 一种从细胞悬液中提取和纯化包裹药物的细胞囊泡的方法 | |
| US20190307794A1 (en) | Method for inducing transdifferentiation of immune cells based on exosomes | |
| EA018246B1 (ru) | Везикулярные составы, содержащие производные органических кислот, и процесс их приготовления | |
| Lapenkova et al. | Bactericidal activity of liposomal form of lytic Mycobacteriophage D29 in cell models of tuberculosis infection in vitro | |
| Freise | The preparation of sterile drug-containing liposomes | |
| RU2691439C1 (ru) | Препарат на основе литического микобактериофага и способ его получения | |
| Feng et al. | Exosomes: Applications in respiratory infectious diseases and prospects for coronavirus disease 2019 (COVID-19) | |
| CN112135620A (zh) | 红色诺卡氏菌细胞壁骨架在治疗热损伤中的用途 | |
| CN116515762A (zh) | 一种促进糖尿病创面愈合的工程化改造外泌体及其制备方法和应用 | |
| CN116196332A (zh) | 凋亡小体在制备治疗脓毒血症产品中的应用 | |
| JPH01104182A (ja) | 新規多糖類、それらの製造法及びそれらを有効成分として含有する医薬組成物 | |
| Faizal et al. | THE EFFECT OF INCREASING INTERLEUKIN 6 EXPRESSION WITH THE DOSES OF MACROPHAGES ON TUBERCULOSIS GRANULOMA IN VITRO. | |
| Anderson et al. | The effect of incorporation of cloxacillin in liposomes on treatment of experimental staphylococcal mastitis in mice | |
| CN117004566A (zh) | 一种具有抗结核免疫保护作用的巨噬细胞来源的外泌体和相关蛋白及用途 | |
| US20240043797A1 (en) | Method for mass production of highly pure, stem cell-derived extracellular vesicle by using peptide | |
| CN116036298B (zh) | 牛奶外泌体在制备药物载体中的应用 | |
| WO2023169594A1 (zh) | 血液来源的样品在制备囊泡中的应用 | |
| JP7220472B2 (ja) | リポソーム、抗癌剤及び癌治療用キット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 19849418 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 19849418 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |