WO2020027097A1 - 固相担体およびキット - Google Patents

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WO2020027097A1
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PCT/JP2019/029758
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和平 金子
吉憲 金澤
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富士フイルム株式会社
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    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/60—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen
    • C08F220/606—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen and containing other heteroatoms
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    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to a solid phase carrier for supporting a physiologically active substance, and a kit for measuring a substance to be measured in a biological sample.
  • Fluorescence detection is widely used as a sensitive and easy measurement method for quantifying proteins, enzymes or inorganic compounds.
  • the fluorescence detection method detects the presence of a substance to be measured by detecting fluorescence emitted when the sample, which is considered to contain the substance to be measured that emits fluorescence when excited by light of a specific wavelength, is irradiated with the excitation light of the specific wavelength. How to confirm.
  • the substance to be measured is not a fluorescent substance
  • a substance that specifically binds to the substance to be measured is contacted with a sample in a state of being labeled with a fluorescent dye, and then, as described above, when irradiated with excitation light, By detecting the emitted fluorescence, the presence of the substance to be measured can be confirmed.
  • a method utilizing the effect of electric field enhancement by plasmon resonance in order to improve sensitivity for detecting a trace amount of a substance to be measured in order to generate plasmon resonance, a sensor chip provided with a metal film in a predetermined region on a transparent support is prepared, and a metal film forming surface of the support is provided with respect to an interface between the support and the metal film. Excitation light is incident from the opposite surface at a predetermined angle equal to or greater than the total reflection angle.
  • the surface plasmon is generated on the metal film by the irradiation of the excitation light, and the signal / noise ratio (S / N ratio) is improved by enhancing the fluorescence by the electric field enhancing action due to the generation of the surface plasmon, so that highly sensitive measurement is performed.
  • S / N ratio signal / noise ratio
  • the fluorescence detection method based on surface plasmon excitation (hereinafter referred to as "SPF method”) provides about 10 times the signal enhancement compared to the fluorescence detection method based on epi-illumination excitation (also referred to as epi-illumination fluorescence method) and measures with high sensitivity can do.
  • Patent Document 1 describes, as a solid support in which non-specific adsorption is suppressed, a solid support in which a polymer containing two types of structural units represented by a predetermined formula is bonded. Patent Literature 1 further describes a ligand-bound solid support, a method for detecting or separating a target substance, and a method for producing the solid support. Further, Patent Document 2 describes an imaging agent for cells and / or tissues characterized by fibrosis, which comprises a polymer in which a retinoid and a detectable label are bound.
  • the solid phase carrier described in Patent Document 1 has a high nonspecific adsorption suppressing effect, but has a small amount of ligand binding.
  • An object of the present invention is to provide a solid phase carrier for supporting a physiologically active substance, which has both a high nonspecific adsorption suppressing effect and a high ligand binding amount.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for measuring a substance to be measured in a biological sample, which contains the solid phase carrier described above.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that a copolymer containing a structural unit in which a hydrophilic group and a physiologically active substance-reactive group are bonded to a group derived from an acidic amino acid via a predetermined linking group.
  • the present inventors have found that the above-mentioned problems can be solved by allowing the coalescence to exist on the surface of the solid phase, and have completed the present invention.
  • a solid support for supporting a physiologically active substance comprising a copolymer containing a structural unit represented by the following formula (1), wherein the copolymer is present on the surface of a solid phase.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • X represents -NH- or -O-
  • Y represents -NH- or -O-
  • m represents an integer of 1 to 5.
  • R 2 represents one of a hydrophilic group and a group represented by the following formula (R-1);
  • R 3 represents the other of a hydrophilic group and a group represented by the following formula (R-1).
  • n an integer of 1 to 12
  • R 4 represents a bioactive substance-reactive group
  • * represents a bonding position to X or Y.
  • the solid support according to [8], wherein the particles have a particle size of 50 to 300 nm.
  • the solid support according to any one of [8] to [10], wherein the particles contain a fluorescent dye.
  • the fluorescent dye is an azadipyrromethene dye or a dipyrromethene dye.
  • a kit for measuring a substance to be measured in a biological sample comprising:
  • both a high non-specific adsorption suppressing effect and a high ligand binding amount can be compatible.
  • a high signal / noise ratio can be achieved.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the sensor chip 1.
  • FIG. 2 is an exploded view of the sensor chip 1.
  • a numerical range indicated by using “to” means a range including numerical values described before and after “to” as a minimum value and a maximum value, respectively.
  • the solid phase carrier of the present invention comprises a copolymer containing a structural unit represented by the following formula (1), wherein the copolymer is present on the surface of a solid phase, and is used for supporting a physiologically active substance. It is a carrier.
  • ADVANTAGE OF THE INVENTION According to the solid support of this invention, a high nonspecific adsorption suppression effect and a high ligand binding amount can be compatible.
  • a test substance can be analyzed with high sensitivity.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • X represents -NH- or -O-
  • Y represents -NH- or -O-
  • m represents an integer of 1 to 5.
  • R 2 represents one of a hydrophilic group and a group represented by the following formula (R-1);
  • R 3 represents the other of a hydrophilic group and a group represented by the following formula (R-1).
  • n represents an integer of 1 to 12
  • R 4 represents a bioactive substance-reactive group
  • * represents a bonding position to X or Y.
  • R 1 preferably represents a methyl group.
  • X is preferably -NH-, and Y is preferably -NH-. More preferably, X is -NH- and Y is -NH-.
  • m is preferably 1 or 2.
  • the hydrophilic group represented by R 2 or R 3 preferably has a betaine structure, a sugar structure, an amino acid structure or a sulfonic acid group.
  • a betaine structure means that a positively charged part and a negatively charged part are located at positions that are not adjacent to each other in the same group, and dissociable hydrogen atoms are not bonded to the positively charged atoms. Refers to a neutral structure without charge.
  • the portion having a positive charge is, for example, a portion having a cationic structure such as quaternary ammonium, sulfonium, and phosphonium.
  • Examples of the portion having a negative charge include a sulfonic acid group (—SO 3 ⁇ ), a carboxylic acid group (—COO ⁇ ), and a group derived from phosphoric acid (—PO 4 ⁇ ⁇ ).
  • the sugar structure means a structure having a sugar group.
  • examples of the sugar include, but are not particularly limited to, monosaccharides such as glucose, galactose, fructose, and mannose, and disaccharides such as sucrose, lactose, maltose, trehalose, and fructose.
  • the amino acid structure includes natural amino acids (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, asparagine, glutamine, proline, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, and histidine. ), But may be groups derived from other unnatural amino acids.
  • n represents an integer of 1 to 12, preferably an integer of 2 to 10, and more preferably an integer of 3 to 6.
  • R 4 represents a bioactive substance reactive group.
  • the bioactive substance-reactive group is preferably a group having a carboxyl group, an active ester, an isothiocyanate, an epoxy group, or a maleimide.
  • the content of the physiologically active substance-reactive group represented by R 4 is preferably 1 to 500 ⁇ mol, more preferably 10 to 500 ⁇ mol, and still more preferably 100 to 500 ⁇ mol, per 1 g of the solid content of the solid support. It is particularly preferably from 100 to 300 ⁇ mol, most preferably from 150 to 250 ⁇ mol.
  • the shape of the solid support is preferably particles.
  • the copolymer containing the structural unit represented by the formula (1) is a solid phase carrier for supporting a physiologically active substance, which is present on the surface of the core particle.
  • the core particles for example, polymer particles such as polystyrene beads and glass particles such as glass beads can be used.
  • the material of the particles serving as the core include styrene, methacrylic acid, glycidyl (meth) acrylate, butadiene, vinyl chloride, vinyl acetate, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, phenyl methacrylate, and butyl methacrylate.
  • a synthetic polymer such as a molecule or a copolymer using two or more monomers, and a latex in which these are uniformly suspended is preferable.
  • Other examples include organic polymer powders and inorganic substance powders, microorganisms, blood cells and cell membrane fragments, and liposomes.
  • the material of the latex include polystyrene, styrene-acrylic acid copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylate copolymer, Styrene-styrene sulfonate copolymer, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, vinyl chloride-acrylate copolymer, polyvinyl acetate acrylate, and the like.
  • a copolymer containing at least styrene as a monomer is preferable, and a copolymer of styrene and acrylic acid or methacrylic acid is particularly preferable.
  • the method for producing the latex is not particularly limited, and it can be produced by any polymerization method. However, if a surfactant is present at the time of labeling the antibody, it becomes difficult to immobilize the antibody. Therefore, emulsification-free emulsion polymerization, that is, emulsion polymerization not using an emulsifier such as a surfactant, is preferable for preparing a latex.
  • the solid support of the present invention contains a copolymer containing the structural unit represented by the formula (1), and the above-mentioned copolymer exists on the surface of the solid phase.
  • the method for producing the solid phase carrier of the present invention is not particularly limited. For example, particles serving as nuclei of a solid support are prepared by the above-described method, and then, with respect to the prepared particles serving as nuclei, a monomer compound corresponding to the structural unit represented by the formula (1) and, if desired, And then polymerizing these monomer compounds to form a particle-shaped solid support in which a copolymer containing the structural unit represented by the formula (1) is present on the surface of the core particles. Can be manufactured.
  • the solid phase carrier (preferably a particle-shaped carrier, hereinafter referred to as particles) of the present invention preferably contains a fluorescent dye.
  • a fluorescent dye By adding a fluorescent dye to particles serving as nuclei, particles containing the fluorescent dye can be produced. That is, the particles containing the fluorescent dye are manufactured by impregnating the inside of the particles with the fluorescent dye, for example, by adding the fluorescent dye to a solution of the particles containing water and a water-soluble organic solvent and stirring. Is possible.
  • the type of fluorescent dye is not particularly limited, but preferably, azadipyrromethene dye or dipyrromethene dye can be used.
  • azadipyrromethene dye or dipyrromethene dye a compound represented by the following formula (2) is preferable.
  • X represents CR 17 or N.
  • R 11 to R 17 each represent a hydrogen atom, an alkyl group, a cycloalkyl group, an aliphatic heterocyclic group, an alkenyl group, a cycloalkenyl group, an alkynyl group, a hydroxyl group, a mercapto group, an alkoxy group, an alkylthio group, an aryloxy group, or an arylthio group.
  • R represents an alkyl group, a cycloalkyl group, an aliphatic heterocyclic group, an alkenyl group, a cycloalkenyl group, an alkynyl group, an aryl group or a heteroaryl group.
  • RA represents a hydrogen atom, an alkyl group, a cycloalkyl group, an aliphatic heterocyclic group, an alkenyl group, a cycloalkenyl group, an alkynyl group, an aryl group or a heteroaryl group.
  • R 18 and R 19 are an alkyl group, cycloalkyl group, aliphatic heterocyclic group, alkenyl group, cycloalkenyl group, alkynyl group, hydroxyl group, mercapto group, alkoxy group, alkylthio group, aryloxy group, arylthio group, aryl group , A heteroaryl group or a halogen atom.
  • the alkyl group may be linear or branched, and preferably has 1 to 36 carbon atoms, more preferably 1 to 18 carbon atoms, and still more preferably 1 to 12 carbon atoms. And particularly preferably 1 to 6.
  • Examples of the cycloalkyl group include cycloalkyl having 3 to 8 carbon atoms.
  • alkyl group and the cycloalkyl group include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an iso-butyl group, a sec-butyl group, a t-butyl group, and an n-pentyl group , N-hexyl group, n-heptyl group, n-octyl group, n-nonyl group, n-decyl group, n-undecyl group, n-dodecyl group, n-tridecyl group, n-tetradecyl group, n-pentadecyl group , N-hexadecyl group, n-heptadecyl group, n-octadecyl group, cyclohexyl group and the like.
  • the aliphatic heterocyclic group is not particularly limited, and includes a group derived from a 2-oxopyrrolidine ring, a piperidine ring, a piperazine ring, a morpholine ring, a tetrahydrofuran ring, a tetrahydropyran ring, a tetrahydrothiophene ring, and the like.
  • the alkenyl group may be linear or branched, and the linear or branched alkyl group preferably has 2 to 36 carbon atoms, more preferably 2 to 18 carbon atoms, and still more preferably 2 to 12 carbon atoms. And particularly preferably 2 to 6.
  • Examples of the alkenyl group include a vinyl group, an allyl group, a prenyl group, a geranyl group, an oleyl group, and the like.
  • Examples of the cycloalkenyl group include a cycloalkenyl group having 3 to 8 carbon atoms.
  • Examples of the cycloalkenyl group include a 2-cyclopenten-1-yl group and a 2-cyclohexen-1-yl group.
  • the alkynyl group may be linear or branched, and the linear or branched alkyl group preferably has 2 to 36 carbon atoms, more preferably 2 to 18 carbon atoms, and still more preferably 2 to 12 carbon atoms. And particularly preferably 2 to 6.
  • Examples of the alkynyl group include an ethynyl group and a propargyl group.
  • the alkoxy group is preferably an alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms, for example, methoxy group, ethoxy group, propoxy group, n-butoxy group, pentyloxy group, hexyloxy group, heptyloxy group and the like. .
  • the alkylthio group is preferably an alkylthio group having 1 to 30 carbon atoms, such as a methylthio group, an ethylthio group, and an n-hexadecylthio group.
  • the aryloxy group is preferably an aryloxy group having 6 to 14 carbon atoms, such as a phenoxy group, a naphthoxy group, and an anthryloxy group.
  • the arylthio group is preferably an arylthio group having 6 to 30 carbon atoms, such as a phenylthio group, a p-chlorophenylthio group, and an m-methoxyphenylthio group.
  • the aryl group is preferably an aryl group having 6 to 48 carbon atoms, more preferably an aryl group having 6 to 24 carbon atoms, and still more preferably an aryl group having 6 to 14 carbon atoms.
  • a phenyl group, a naphthyl group examples include an anthryl group, a pyrenyl group, a phenanthrenyl group, a biphenyl group, and a fluorenyl group.
  • the heteroaryl group is preferably a 5- to 7-membered substituted or unsubstituted, saturated or unsaturated, monocyclic or condensed heterocyclic group.
  • the heteroaryl group is preferably a heteroaryl group in which ring-constituting atoms are selected from a carbon atom, a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom, and have at least one heteroatom of a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom. And more preferably a 5- or 6-membered heteroaryl group having 3 to 30 carbon atoms.
  • heteroaryl group examples include an imidazolyl group, a pyridyl group, a quinolyl group, a furyl group, a thienyl group, a benzoxazolyl group, an indolyl group, a benzimidazolyl group, a benzothiazolyl group, a carbazolyl group, and an azepinyl group.
  • Halogen atoms include fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • amino group examples include an amino group; an alkyl-substituted amino group such as a mono- or dimethylamino group, a mono- or diethylamino group and a mono- or di (n-propyl) amino group; a mono- or diphenylamino group and a mono- or dinaphthylamino group.
  • An amino group substituted with an aromatic residue an alkyl group such as a monoalkylmonophenylamino group and an amino group substituted with one aromatic residue; a benzylamino group, an acetylamino group, a phenylacetylamino group, and the like.
  • the aromatic residue means a group obtained by removing one hydrogen atom from an aromatic ring.
  • R 11 to R 19 may have a substituent, and examples of the substituent include the substituents described in Substituent Group A below.
  • the substituents of the substituent group A may be further substituted by the substituents of the substituent group A.
  • Substituent group A Sulfamoyl group, cyano group, isocyano group, thiocyanato group, isothiocyanato group, nitro group, nitrosyl group, halogen atom, hydroxy group, amino group, mercapto group, amide group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, arylthio group, carbamoyl Groups, acyl groups, aldehyde groups, carbonyl groups, aryl groups, alkyl groups, alkyl groups substituted with halogen atoms, ethenyl groups, ethynyl groups, silyl groups, and trialkylsilyl groups (such as trimethylsilyl group).
  • the preferred range of the particle size in the present invention is 50 nm or more and 300 nm or less, a more preferred range is 60 nm or more and 250 nm or less, and a still more preferred range is 70 nm or more and 200 nm or less.
  • the particle size of the particle may be the particle size of a particle containing a fluorescent dye (hereinafter, also referred to as a fluorescent particle) when the particle contains a fluorescent dye, or a particle not containing a fluorescent dye. Particle size.
  • the average particle size of the particles and the fluorescent particles can be measured with a commercially available particle size distribution meter or the like.
  • Particle size distribution measurement methods include optical microscopy, confocal laser microscopy, electron microscopy, atomic force microscopy, static light scattering, laser diffraction, dynamic light scattering, centrifugal sedimentation, and electric pulse.
  • a measuring method, a chromatography method, an ultrasonic attenuation method, and the like are known, and apparatuses corresponding to each principle are commercially available.
  • the polydispersity index (PDI) of particles and fluorescent particles is an index for evaluating the width of the particle size distribution, and takes a value in the range of 0 to 1.
  • PDI polydispersity index
  • the polydispersity index is calculated from the values obtained using the Dynamic Light Scattering (DLS) method.
  • a preferable polydispersity index is 0.0001 or more and 0.2 or less, more preferably 0.001 or more and 0.15 or less, and further preferably 0.002 or more and 0.10 or less.
  • a physiologically active substance can be bound to the physiologically active substance-reactive group represented by R 4 in the formula (1).
  • a physiologically active substance is bound to a physiologically active substance reactive group represented by R 4, binding agent capable of binding with the target substance it is preferred that a (hereinafter, the first referred to as a binding agent).
  • a binding agent capable of binding with the target substance it is preferred that a (hereinafter, the first referred to as a binding agent).
  • the first binding substance an antigen, an antibody, or a complex thereof can be used, but is not limited thereto.
  • the bioactive substance ie, the first binding substance
  • the first binding substance is an antibody.
  • Antibodies can be used regardless of the animal species, subclass, etc.
  • antibodies that can be used in the present invention include antibodies derived from organisms that can cause an immune reaction such as mice, rats, hamsters, goats, rabbits, sheep, cows, chickens, and more specifically, mouse IgG, mouse IgM Rat IgG, rat IgM, hamster IgG, hamster IgM, rabbit IgG, rabbit IgM, goat IgG, goat IgM, sheep IgG, sheep IgM, bovine IgG, bovine IgM, avian IgY, etc., and either polyclonal or monoclonal is used. It is possible.
  • an antibody prepared from animal serum or culture supernatant by a known method may be used.
  • an antiserum prepared from the serum of an animal immunized with the substance to be measured, an immunoglobulin fraction purified from the antiserum, obtained by cell fusion using spleen cells of an animal immunized with the substance to be measured Antibodies can be used.
  • a fragmented antibody is a molecule derived from a whole antibody having at least one antigen-binding site, and specifically, is F (ab ') 2 , Fab, Fab', or Fv.
  • F (ab ') 2 , Fab, Fab', or Fv fragmented antibodies are molecules obtained by enzymatic or chemical treatment or by using genetic engineering techniques.
  • the antibody may be modified, as in the case of a chimeric antibody or the like.
  • a physiologically active substance-reactive group represented by R 4 By reacting a physiologically active substance-reactive group represented by R 4 with a physiologically active substance (a first binding substance, for example, an antibody), a physiologically active substance and a structural unit represented by the formula (1) are obtained. And a copolymer containing For example, an active esterified carboxyl group in a copolymer containing a structural unit represented by the formula (1) and an amino group of a physiologically active substance (a first binding substance such as an antibody) are combined with a water-soluble carbodiimide. And a method of binding by a dehydration reaction.
  • the present invention provides a biological sample, comprising: the solid support of the present invention described above; and a substrate provided with a detection region on a metal film (ie, a substrate including a metal film and a detection region on the metal film).
  • the present invention relates to a kit for measuring a substance to be measured.
  • the measurement target substance may be present in a biological sample.
  • the biological sample is not particularly limited as long as it is a sample that may contain the measurement target substance.
  • a biological sample particularly a body fluid of an animal (eg, human, dog, cat, etc.)
  • a body fluid of an animal eg, human, dog, cat, etc.
  • examples include blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, tears, sweat, urine, pus, runny nose, or sputum
  • excrement eg, feces
  • organs, tissues, mucous membranes, skin, and the like include blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, tears, sweat, urine, pus, runny nose, or sputum
  • excrement eg, feces
  • the substance to be measured is not particularly limited, but examples include cholesterol, hormones (steroid hormones, peptide hormones, etc.), proteins, bile acids, cortisol and the like.
  • the substance to be measured is particularly preferably thyroid stimulating hormone (TSH) or progesterone.
  • a substrate in order to achieve highly sensitive measurement, it is preferable to employ a measurement method for detecting surface plasmon fluorescence (SPF) described later.
  • SPF surface plasmon fluorescence
  • a substrate having a metal film on the surface is not particularly limited as long as surface plasmon resonance can occur.
  • a free electron metal such as gold, silver, copper, aluminum or platinum is used, and gold is particularly preferable.
  • gold is particularly preferable.
  • the detection area described later is on the gold film.
  • the above metals can be used alone or in combination.
  • an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the metal layer in consideration of the adhesion to the substrate.
  • the thickness of the metal film is arbitrary, it is preferably, for example, 1 nm or more and 500 nm or less, and particularly preferably 10 nm or more and 200 nm or less. If it exceeds 500 nm, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected.
  • the thickness of the intervening layer is preferably 0.1 nm or more and 10 nm or less.
  • the formation of the metal film may be performed by a conventional method, for example, a sputtering method including a magnetron sputtering method, an evaporation method, an ion plating method, an electroplating method, or an electroless plating method.
  • a sputtering method including a magnetron sputtering method, an evaporation method, an ion plating method, an electroplating method, or an electroless plating method.
  • the thickness of the mixed layer of the substrate material and the metal film is not particularly limited as long as sufficient adhesion can be ensured, but is preferably 10 nm or less.
  • the metal film is preferably disposed on the substrate.
  • disposed on the substrate means that, in addition to the case where the metal film is disposed so as to directly contact the substrate, the metal film does not directly contact the substrate, but via another layer. This includes the case where they are arranged.
  • optical glass such as BK7 (borosilicate glass), which is a kind of general optical glass, or synthetic resin, specifically, polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate
  • a material made of a material transparent to laser light such as polycarbonate or cycloolefin polymer can be used.
  • Such a substrate is preferably made of a material that does not show anisotropy with respect to polarized light and has excellent workability.
  • a preferred embodiment of the substrate for detecting SPF is a substrate in which a gold film is deposited on polymethyl methacrylate (PMMA).
  • the substrate has, on the metal film, a detection region having a second binding substance capable of binding to either the measurement target substance or the physiologically active substance (first binding substance).
  • the second binding substance is a substance that has a binding property to the measurement target substance or a substance that has a binding property to a physiologically active substance (the first binding substance).
  • a substance having a binding property with the substance to be measured can be used as the second binding substance.
  • a substance having a binding property with a physiologically active substance can be used as the second binding substance.
  • the second binding substance is not particularly limited, but preferred examples include an antigen, an antibody, and a complex thereof.
  • an antigen is used as the second binding substance, it is preferable to use a substance to be measured (this is a substance having a binding property with the first binding substance) or a hapten thereof.
  • the second binding substance is preferably a conjugate of the measurement target substance and a carrier.
  • the carrier means a substance to which a plurality of molecules of the substance to be measured can bind.
  • An example of a preferred carrier is a protein and the like, and specific examples thereof include bovine serum albumin.
  • any principle of physical adsorption or chemical bonding by covalent bonding can be adopted as a method for immobilizing the antibody on the metal film on the substrate.
  • a method of forming a self-assembled monolayer (SAM) on a metal film and fixing a second binding substance on the SAM film A method in which a hydrophilic polymer layer such as carboxymethyl dextran (CMD) is provided on the SAM and a second binding substance is fixed to the hydrophilic polymer layer can also be used.
  • SAM self-assembled monolayer
  • CMD carboxymethyl dextran
  • a self-assembled monolayer is typically used when an alkanethiol compound is brought into contact with and left on a metal film surface containing gold, and the alkanethiol compound reacts with the surface containing gold. It is known as a highly oriented monomolecular film formed on the gold surface by the formation of Au-S bonds and the interaction between long alkyl chains, and it is known as surface plasmon resonance / fluorescence and crystal oscillation. It is widely used in fields such as child microbalance (QCM; Quartz @ Crystal @ Microbalance).
  • AMSAM examples include a film made of 1-undecanethiol, 10-carboxy-1-decanethiol, 11-hydroxy-1-undecanethiol, and a film obtained by combining these.
  • the hydrophilic polymer layer is provided for forming a two-dimensional structure or a three-dimensional structure on the SAM.
  • the immobilization of the second binding substance is not limited to two-dimensional on the surface of the support, but is not limited to the three-dimensional space released from the surface of the metal film on the substrate.
  • the structure can be manufactured.
  • hydrophilic polymer examples include at least one polymer selected from the group consisting of polysaccharide, polyethylene glycol, polyacrylic acid and polymethacrylic acid.
  • the polysaccharide is preferably a hydrophilic polymer such as dextran or a dextran derivative, and a hydrophilic polymer layer composed of dextran such as carboxymethyl dextran (CMD) is preferable for improving biocompatibility. It is preferable from the viewpoint of improving the suppression of nonspecific adsorption reaction.
  • CMD carboxymethyl dextran
  • an antibody is used as the second binding substance, as a method of immobilizing the antibody on the hydrophilic polymer layer, for example, a carboxyl group of a polymer having a reactive functional group such as carboxymethyl dextran (CMD) is dissolved in water.
  • Carbodiimide (WSC) such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS), and the active esterified carboxyl group
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • a detection area (test area) for detecting the presence or absence of a substance to be measured is provided on the substrate.
  • the antigen can be quantified by, for example, capturing the antigen which is the substance to be measured and detecting and quantifying the amount of the label bound to the antigen.
  • the antigen can be quantified by a method in which only the label bound to the antigen cannot be bound, only the label not bound to the antigen is captured, and the amount of the label bound to the antigen is calculated.
  • the kit of the present invention is used in a method for measuring a substance to be measured, and is a kit for TSH measurement diagnosis when the substance to be measured is thyroid stimulating hormone (TSH).
  • the kit of the present invention includes a substrate provided with a solid phase carrier of the present invention; and a detection region having a second binding substance on a metal film, for performing measurement of a substance to be measured.
  • various devices or devices used for measurement of a substance to be measured such as a fluorescence measurement device.
  • a sample containing a known amount of a substance to be measured, an instruction manual, and the like may be included as components of the kit.
  • ⁇ Competition Law> As an example of the competitive method, a case where progesterone is quantified will be described below. The same method can be used to determine substances other than progesterone.
  • a biological sample containing progesterone and a solid phase carrier of the present invention having a fluorescent dye and an anti-progesterone antibody are brought into contact with a substrate for progesterone immunoassay on which a progesterone-albumin conjugate is immobilized. If progesterone is not present in the biological sample, an antigen-antibody reaction occurs on the substrate by the anti-progesterone antibody on the solid support and the progesterone on the substrate (ie, progesterone in the progesterone-albumin conjugate). .
  • progesterone if progesterone is present in the biological sample, an antigen-antibody reaction occurs between progesterone in the biological sample and the anti-progesterone antibody on the solid support, and the anti-progesterone antibody on the solid support and the substrate.
  • the antigen-antibody reaction between the above progesterone ie, progesterone in the progesterone albumin conjugate
  • the anti-progesterone antibody on the solid phase carrier which did not bind to albumin on the substrate, is removed.
  • the degree of formation of an immune complex on the substrate (that is, a complex of the anti-progesterone antibody on the solid support and the progesterone in the progesterone-albumin conjugate on the substrate) is detected as fluorescence intensity.
  • the concentration of progesterone in a biological sample and the like can be measured.
  • the measurement form of fluorescence in the competition method can employ either a plate reader measurement or a flow measurement, and can be measured, for example, by the following method.
  • a plurality of samples having a different progesterone concentration and a known progesterone amount are prepared in advance, and this sample and the solid phase carrier of the present invention are mixed in advance. This mixture is brought into contact with the region where the progesterone-albumin conjugate is immobilized. Fluorescent signals from the region where the progesterone-albumin conjugate is immobilized are measured as a plurality of fluorescent signals while the mixture is in contact with the conjugate at specific time intervals.
  • a time change (gradient) of the fluorescence amount at each progesterone concentration is determined.
  • the time change is plotted on the Y axis and the progesterone concentration is plotted on the X axis, and a relational expression of the progesterone concentration with respect to the time change of the fluorescence amount is obtained by using an appropriate fitting method such as a least square method. Based on the relational expression thus obtained, the amount of progesterone contained in the biological sample can be quantified using the result of the time change of the fluorescence amount using the biological sample to be tested.
  • the determination of the amount of progesterone be performed in a short time. Specifically, it is preferably performed within 10 minutes, more preferably within 8 minutes, and further preferably performed within 6 minutes.
  • the quantification time is determined by using a relational expression between the time-dependent change in the amount of fluorescence and the progesterone concentration obtained in advance using an appropriate fitting method such as the least squares method, and the sample and the fluorescent-labeled anti-progesterone antibody are converted to progesterone albumin.
  • a time for converting the amount of progesterone contained in the biological sample based on the result of the temporal change in the amount of fluorescence using the biological sample to be tested is included. Is preferred.
  • ⁇ Sandwich method> As an example of the sandwich method, a case where TSH is quantified will be described below. The same can be applied to the case where a substance other than TSH is quantified.
  • a TSH-containing biological sample and a solid phase carrier of the present invention having a fluorescent dye and an anti-TSH antibody 2 are brought into contact with the TSH immunoassay substrate on which the anti-TSH monoclonal antibody 1 is immobilized.
  • TSH is present in the biological sample, an antigen-antibody reaction occurs on the substrate by the TSH that has been subjected to the antigen-antibody reaction with the anti-TSH antibody 2 in advance and the anti-TSH antibody 1 on the substrate.
  • a mixed solution obtained by mixing a biological sample which may contain a substance to be measured and the solid phase carrier of the present invention can be applied on a substrate and developed in a flow channel.
  • the channel is not particularly limited as long as the channel allows the biological sample and the solid phase carrier of the present invention to flow down to the detection region.
  • a suction port can be provided on the side opposite to the spotting port with respect to the metal film.
  • the method for detecting a label such as fluorescence in the present invention is not particularly limited.
  • a device capable of detecting fluorescence intensity specifically, a microplate reader, or fluorescence detection (SPF) by surface plasmon excitation is used. It is preferable to detect the fluorescence intensity using a biosensor or the like for performing the measurement.
  • label information related to the amount of the substance to be measured can be obtained by fluorescence detection by surface plasmon resonance.
  • the form of fluorescence measurement may be plate reader measurement or flow measurement.
  • the fluorescence detection method by surface plasmon excitation (SPF method) can be measured with higher sensitivity than the fluorescence detection method by epi-illumination excitation (epi-fluorescence method).
  • a surface plasmon fluorescence (SPF) biosensor for example, an optical waveguide formed of a material that transmits excitation light of a predetermined wavelength, as described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-249361, and one of the optical waveguides A metal film formed on the surface, a light source that generates a light beam, and an optical system that passes the light beam through an optical waveguide and enters the interface between the optical waveguide and the metal film at an incident angle that generates surface plasmon.
  • a fluorescence detection unit that detects fluorescence generated by being excited by the evanescent wave enhanced by the surface plasmon.
  • the fluorescence detection by surface plasmon excitation (SPF) system is preferably an assay method for detecting fluorescence from a fluorescent substance depending on the amount of a substance to be measured immobilized on a metal film on a substrate.
  • This is a method different from the so-called latex agglutination method, in which the change in optical transparency is detected as turbidity due to the progress of the reaction in the medium.
  • the antibody-sensitized latex in the latex reagent and the antigen in the biological sample bind and aggregate by the antibody reaction. The aggregates increase with time, and the aggregates are irradiated with near-infrared light.
  • This is a method of quantifying the antigen concentration from the change in absorbance per unit time obtained as a result.
  • the present invention can provide a very simple method for detecting a substance to be measured as compared with the latex agglutination method.
  • Example 1 (Production of particles)
  • 0.6 g of sodium dodecyl sulfate was dissolved in 400 g of ultrapure water. After heating to 85 ° C. under nitrogen, 30 g of styrene was added and stirred for 5 minutes.
  • 1 g of potassium peroxodisulfate was dissolved in 30 g of ultrapure water, and the solution was placed in the three-necked flask and polymerized at 85 ° C. for 6 hours. After cooling to room temperature, the nylon mesh N-No. Filtration was performed at 230 T to obtain nuclear particles.
  • Example 2 As in Example 1, the monomer used was changed to Compound 2, and antibody-bound fluorescent particles were obtained.
  • Example 3 In the same manner as in Example 1, the monomer used was changed to Compound 3, and antibody-bound fluorescent particles were obtained.
  • Example 4 As in Example 1, the monomer used was changed to Compound 4, and antibody-bound fluorescent particles were obtained.
  • Antibody binding amount S 100 ⁇ g / mg or more A: 80 ⁇ g / mg or more and less than 100 ⁇ g / mg B: 60 ⁇ g / mg or more and less than 80 ⁇ g / mg C: 40 ⁇ g / mg or more and less than 60 ⁇ g / mg D: less than 40 ⁇ g / mg
  • ⁇ Evaluation of nonspecific adsorption suppression effect 500 ⁇ L of the aqueous dispersion of 2% by mass of solid content of the fluorescent particles obtained in the above Examples and Comparative Examples was diluted with 500 ⁇ L of PBS. After the dispersion was centrifuged to remove 950 ⁇ L of the supernatant, 950 ⁇ L of a BSA (bovine serum albumin, Fujifilm Wako Pure Chemical) PBS solution (1 mg / mL) was added. After redispersion by ultrasonic waves, the mixture was stirred at room temperature for 2 hours to adsorb BSA to the fluorescent particles.
  • BSA bovine serum albumin
  • Nonspecific adsorption amount (Amount of BSA added ( ⁇ g))-(Amount of BSA in centrifuged supernatant ( ⁇ g)) / (Particle weight (mg))
  • Non-specific adsorption amount S: less than 10 ⁇ g / mg A: 10 ⁇ g / mg to less than 20 ⁇ g / mg B: 20 ⁇ g / mg to less than 30 ⁇ g / mg C: 30 ⁇ g / mg to less than 40 ⁇ g / mg D: 40 ⁇ g / mg or more
  • Thyroid stimulating hormone (TSH) in a biological sample was measured by fluorescence detection by surface plasmon resonance using the above-mentioned fluorescently labeled antibody.
  • TSH TSH is determined.
  • a biological sample containing TSH and a fluorescently labeled anti-TSH antibody 2 are brought into contact with the TSH immunoassay substrate on which the anti-TSH monoclonal antibody 1 is immobilized.
  • TSH an antigen-antibody reaction occurs on the substrate by the TSH that has undergone an antigen-antibody reaction with the anti-TSH antibody 2 that has been fluorescently labeled in advance and the anti-TSH antibody 1 on the substrate.
  • a substrate of polymethyl methacrylate (PMMA) (Acrypet (registered trademark) VH manufactured by Mitsubishi Rayon Co., Ltd.) was prepared, and a gold film having a thickness of 45 nm was formed on one surface by a sputtering method and cut into a width of 7 mm. Seven identical substrates were produced.
  • the prepared substrate was previously prepared with a Tween 20 (polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) solution containing 0.05% by mass of a PBS solution (pH 7.4). Washing was repeated three times using 300 ⁇ L of the solution. After the washing is completed, 300 ⁇ L of a PBS solution (pH 7.4) containing 1% by mass casein (manufactured by Thermo Scientific) is added for blocking an unadsorbed portion of the anti-TSH antibody on the surface of the gold film, and the mixture is incubated at room temperature for 1 hour. At rest.
  • Tween 20 polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • FIG. 1 is a schematic view of the sensor chip 1
  • FIG. 2 is an exploded view of the sensor chip 1.
  • the sensor chip 1 includes an upper member 2, an intermediate member 3, and a substrate 4.
  • the upper member 2 is provided with a first container 5 and a second container 6. Note that the first container 5 and the second container 6 are collectively referred to as a container group 7.
  • a flow path 10 is formed in the substrate 4, and a detection area 8 and a reference area 9 are formed on the flow path 10.
  • test samples As test samples, dog sera with TSH concentrations of about 0 ng / mL and about 0.4 ng / mL were used.
  • dog serum serum of an Oriental beagle dog purchased from Kitayama Labes was prepared.
  • TSH evaluation Using the fluorescence-labeled antibody prepared above, TSH was measured using an IMMUNO AU10V (manufactured by FUJIFILM Corporation). A mixed solution of 100 ⁇ L of the test sample (dog serum) prepared above and a fluorescently labeled anti-TSH antibody was prepared, and the mixed solution was stirred for 10 minutes. Next, the mixed solution of the fluorescent labeled antibody and the test sample was spotted on the flow path type sensor chip enclosing the substrate prepared above.
  • the mixture was allowed to flow at a rate of 10 ⁇ L / min while pump suction was performed, and the mixture was brought into contact with the surface of the gold film on which the anti-TSH antibody was fixed, and then the fluorescence intensity was measured continuously for 1.5 minutes. The rate of increase per unit time of the fluorescence intensity obtained on the substrate was determined. The S / N was determined from the obtained increase rates of the two test samples, and the relative S / N was compared. The calculation formula and evaluation criteria used for the calculation are shown below.
  • Example 1 or Example 2 of the present invention when Example 1 or Example 2 of the present invention was used, the amount of antibody binding and the effect of suppressing nonspecific adsorption were compatible, and the test sample could be detected with high sensitivity.

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Abstract

本発明の課題は、高い非特異吸着抑制効果と、高いリガンド結合量とを両立した、生理活性物質を担持するための固相担体を提供すること、並びに上記した固相担体を含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットを提供することである。本発明によれば、酸性アミノ酸由来の基に親水性基と生理活性物質反応性基とが所定の連結基を介して結合した構造単位を含む共重合体を含み、上記共重合体が固相の表面に存在する、生理活性物質を担持するための固相担体が提供される。

Description

固相担体およびキット
　本発明は、生理活性物質を担持するための固相担体、並びに生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットに関する。
　タンパク質、酵素または無機化合物などを定量するための高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する測定対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射した際に発する蛍光を検出することによって測定対象物質の存在を確認する方法である。測定対象物質が蛍光体でない場合には、例えば、測定対象物質と特異的に結合する物質を蛍光色素で標識した状態で試料に接触させ、その後上記と同様にして、励起光を照射した際に発する蛍光を検出することにより、測定対象物質の存在を確認することができる。
　上記のような蛍光検出法において、微量に存在する測定対象物質を検出するための感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が知られている。この方法では、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属膜を設けたセンサチップを用意し、支持体と金属膜との界面に対して支持体の金属膜形成面と反対の面側から、全反射角以上の所定の角度で励起光を入射する。かかる励起光の照射により金属膜に表面プラズモンが発生するが、この表面プラズモンの発生による電場増強作用によって、蛍光を増強させることによりシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が向上し高感度な測定が可能となる。表面プラズモン励起による蛍光検出法（以下、「ＳＰＦ法」とする）は、落射励起による蛍光検出法（落射蛍光法とも称する）に対して、信号増強度が約１０倍得られ、高感度に測定することができる。
　特許文献１には、非特異吸着を抑制した固相担体として、所定の式で表される２種類の構造単位を含むポリマーが結合してなる固相担体が記載されている。特許文献１にはさらに、リガンド結合固相担体、標的物質の検出又は分離方法、及び上記固相担体の製造方法が記載されている。また、特許文献２には、レチノイドと検出可能な標識とが結合しているポリマーを含む、線維化を特徴とする細胞および／または組織のイメージング剤が記載されている。
国際公開ＷＯ２０１６／０３９２９３号公報 特表２０１２－５０１９６３号公報
　特許文献１に記載の固相担体は、高い非特異吸着抑制効果を有するが、リガンド結合量は少ないものであった。本発明は、高い非特異吸着抑制効果と、高いリガンド結合量とを両立した、生理活性物質を担持するための固相担体を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、上記した固相担体を含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットを提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、酸性アミノ酸由来の基に親水性基と生理活性物質反応性基とが所定の連結基を介して結合した構造単位を含む共重合体を、固相の表面に存在させることによって、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］　下記式(１)で表される構造単位を含む共重合体を含み、上記共重合体が固相の表面に存在する、生理活性物質を担持するための固相担体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基を表す；
Ｘは－ＮＨ－または－Ｏ－を表す；
Ｙは－ＮＨ－または－Ｏ－を表す；
ｍは１～５の整数を示す。
Ｒ２は、親水性基または下記式（Ｒ－１）で表される基の一方を表す；
Ｒ３は、親水性基または下記式（Ｒ－１）で表される基の他方を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ｎは１～１２の整数を表し、Ｒ４は生理活性物質反応性基を表し、＊はＸまたはＹとの結合位置を表す。
［２］　Ｘが－ＮＨ－であり、Ｙが－ＮＨ－である、［１］に記載の固相担体。
［３］　ｍが１または２である、［１］または［２］に記載の固相担体。
［４］　上記親水性基が、ベタイン構造、糖構造、アミノ酸構造またはスルホン酸基を有する、［１］から［３］の何れか一に記載の固相担体。
［５］　上記生理活性物質反応性基が、カルボキシル基、活性エステル、イソチオシアネート、エポキシ基、またはマレイミドを有する、［１］から［４］の何れか一に記載の固相担体。
［６］　上記式（Ｒ－１）中のｎが３～６の整数である、［１］から［５］の何れか一に記載の固相担体。
［７］　上記生理活性物質反応性基の含有量が、固相担体の固形分１ｇあたり１～５００μｍｏｌである、［１］から［６］の何れか一に記載の固相担体。
［８］　固相担体の形状が粒子である、［１］から［７］の何れか一に記載の固相担体。
［９］　上記粒子の粒径が５０～３００ｎｍである、［８］に記載の固相担体。
［１０］　上記粒子の粒径の多分散指数が０．００２以上０．１０以下である、［８］または［９］に記載の固相担体。
［１１］　上記粒子が、蛍光色素を内包している、［８］から［１０］の何れか一に記載の固相担体。
［１２］　上記蛍光色素が、アザジピロメテン色素またはジピロメテン色素である、［１１］に記載の固相担体。
［１３］　Ｒ４で表される生理活性物質反応性基に生理活性物質が結合している、［１］から［１２］の何れか一に記載の固相担体。
［１４］　上記生理活性物質が抗体である、［１３］に記載の固相担体。
［１５］　［１］から［１４］の何れか一に記載の固相担体；および
検出領域を金属膜上に備えた基板：
を含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット。
　本発明の固相担体によれば、高い非特異吸着抑制効果と、高いリガンド結合量とを両立することができる。本発明のキットを用いた測定においては、高いシグナル／ノイズ比を達成することができる。
図１は、センサチップ１の概略図である。 図２は、センサチップ１の分解図である。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を意味する。
　本発明の固相担体は、下記式(１)で表される構造単位を含む共重合体を含み、上記共重合体が固相の表面に存在する、生理活性物質を担持するための固相担体である。本発明の固相担体によれば、高い非特異吸着抑制効果と高いリガンド結合量を両立することができる。本発明の固相担体を用いた生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットによれば、高感度に被検物質を分析することが可能となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基を表す；
Ｘは－ＮＨ－または－Ｏ－を表す；
Ｙは－ＮＨ－または－Ｏ－を表す；
ｍは１～５の整数を示す。
Ｒ２は、親水性基または下記式（Ｒ－１）で表される基の一方を表す；
Ｒ３は、親水性基または下記式（Ｒ－１）で表される基の他方を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ｎは１～１２の整数を表し、Ｒ４は生理活性物質反応性基を表し、＊はＸまたはＹとの結合位置を表す。
　Ｒ１は、好ましくはメチル基を表す。
　Ｘは、好ましくは－ＮＨ－であり、Ｙは好ましくは－ＮＨ－である。Ｘが－ＮＨ－であり、かつＹが－ＮＨ－であることがより好ましい。
　ｍは好ましくは１または２である。
　Ｒ２またはＲ３が示す親水性基は、好ましくは、ベタイン構造、糖構造、アミノ酸構造またはスルホン酸基を有する。
　ベタイン構造とは、正電荷を有する部分と負電荷を有する部分とを同一基内の隣り合わせにならない位置に有し、正電荷をもつ原子には解離しうる水素原子が結合しておらず、全体としては電荷を有さず中性である構造のことを言う。正電荷を有する部分は、例えば、四級アンモニウム、スルホニウム、ホスホニウムなどのカチオン構造を有する部分である。負電荷を有する部分は、例えば、スルホン酸基（－ＳＯ３ －）、カルボン酸基（－ＣＯＯ－）、リン酸由来の基（－ＰＯ４ －－）などを挙げることができる。
　糖構造としては、糖基を有する構造を意味する。糖としては、グルコース、ガラクトース、フルクトースまたはマンノース等の単糖類、またはスクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、及びフルクトース等の二糖類などが挙げられるが、特に限定されない。
　アミノ酸構造としては、天然のアミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、およびヒスチジン）に由来する基を挙げることができるが、その他の非天然アミノ酸に由来する基でもよい。
　Ｒ２またはＲ３が示す式（Ｒ－１）で表される基において、ｎは１～１２の整数を表し、好ましくは２～１０の整数であり、より好ましくは３～６の整数である。
　Ｒ４は生理活性物質反応性基を表す。生理活性物質反応性基としては、好ましくは、カルボキシル基、活性エステル、イソチオシアネート、エポキシ基、またはマレイミドを有する基である。
　Ｒ４で表される生理活性物質反応性基の含有量は、固相担体の固形分１ｇあたり好ましくは１～５００μｍｏｌであり、より好ましくは１０～５００μｍｏｌであり、さらに好ましくは１００～５００μｍｏｌであり、特に好ましくは１００～３００μｍｏｌであり、最も好ましくは１５０～２５０μｍｏｌである。
　式(１)で表される構造単位の具体例を以下に示すが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　本発明においては、固相担体の形状は粒子であることが好ましい。この場合、式(１)で表される構造単位を含む共重合体が、核となる粒子の表面に存在する、生理活性物質を担持するための固相担体である態様となる。核となる粒子としては、例えば、ポリスチレンビーズなどの高分子粒子、ガラスビーズ等のガラス粒子を用いることができる。核となる粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、または２つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。
  核となる粒子としてラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン－アクリル酸共重合体、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸またはメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、抗体標識の際に界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合が好ましい。
　本発明の固相担体は、式(１)で表される構造単位を含む共重合体を含み、上記共重合体が固相の表面に存在している。本発明の固相担体の製造方法は特に限定されない。例えば、上記の方法により固相担体の核となる粒子を調製し、その後、調製した核となる粒子に対して、式(１)で表される構造単位に対応するモノマー化合物と、所望により他のモノマー化合物とを加え、これらのモノマー化合物を重合させることにより、式(１)で表される構造単位を含む共重合体が核となる粒子の表面に存在している粒子形状の固相担体を製造することができる。
　本発明の固相担体（好ましくは粒子形状の担体、以下粒子と表記する）は、蛍光色素を内包していることが好ましい。核となる粒子に蛍光色素を添加することによって、蛍光色素を内包している粒子を作製することができる。即ち、蛍光色素を内包している粒子は、水および水溶性有機溶剤を含む粒子の溶液に蛍光色素を添加して攪拌することなどにより、蛍光色素を粒子の内部に含浸させることにより製造することが可能である。
　蛍光色素の種類は特に限定されないが、好ましくは、アザジピロメテン色素またはジピロメテン色素を使用することができる。
　アザジピロメテン色素またはジピロメテン色素としては、下記式（２）で示される化合物が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　式中、ＸはＣＲ１７又はＮを示す。
　Ｒ１１～Ｒ１７は、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基、ハロゲン原子、シアノ基、ホルミル基、Ｒ－ＣＯ－基、カルボキシ基、Ｒ－Ｏ－ＣＯ－基、Ｒ－ＣＯ－Ｏ－基、（ＲＡ）２Ｎ－ＣＯ－基、アミノ基、ニトロ基又はシリル基を示す。ここで、Ｒは、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基を示す。ＲＡは、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、アリール基又はヘテロアリール基を示す。
　Ｒ１８およびＲ１９は、アルキル基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、水酸基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリール基、ヘテロアリール基またはハロゲン原子を示す。
　アルキル基は、直鎖または分岐鎖の何れでもよく、直鎖または分岐鎖アルキル基の炭素数は好ましくは１～３６であり、より好ましくは１～１８であり、さらに好ましくは１～１２であり、特に好ましくは１～６である。シクロアルキル基としては、例えば炭素数３～８のシクロアルキルなどが挙げられる。アルキル基およびシクロアルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｉｓｏ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基、ｎ－オクチル基、ｎ－ノニル基、ｎ－デシル基、ｎ－ウンデシル基、ｎ－ドデシル基、ｎ－トリデシル基、ｎ－テトラデシル基、ｎ－ペンタデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－ヘプタデシル基、ｎ－オクタデシル基、およびシクロヘキシル基などが挙げられる。
　脂肪族複素環基としては、特に限定されないが、２－オキソピロリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環、モルホリン環、テトラヒドロフラン環、テトラヒドロピラン環、テトラヒドロチオフェン環等から導出される基が挙げられる。
　アルケニル基は、直鎖または分岐鎖の何れでもよく、直鎖または分岐鎖アルキル基の炭素数は好ましくは２～３６であり、より好ましくは２～１８であり、さらに好ましくは２～１２であり、特に好ましくは２～６である。アルケニル基としては、例えば、ビニル基、アリル基、プレニル基、ゲラニル基、オレイル基等が挙げられる。シクロアルケニル基としては、例えば炭素数３～８のシクロアルケニル基などが挙げられる。シクロアルケニル基としては、例えば、２－シクロペンテン－１－イル基、２－シクロヘキセン－１－イル基等が挙げられる。
　アルキニル基は、直鎖または分岐鎖の何れでもよく、直鎖または分岐鎖アルキル基の炭素数は好ましくは２～３６であり、より好ましくは２～１８であり、さらに好ましくは２～１２であり、特に好ましくは２～６である。アルキニル基としては、例えば、エチニル基、プロパルギル基等が挙げられる。
　アルコキシ基としては、好ましくは、炭素数１～２０のアルコキシ基であり、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基などが挙げられる。
　アルキルチオ基としては、好ましくは、炭素数１から３０のアルキルチオ基であり、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ－ヘキサデシルチオ基等が挙げられる。
　アリールオキシ基としては、好ましくは炭素数６～１４のアリールオキシ基であり、例えば、フェノキシ基、ナフトキシ基、アントリルオキシ基などが挙げられる。
　アリールチオ基としては、好ましくは、炭素数６から３０のアリールチオ基であり、例えば、フェニルチオ基、ｐ－クロロフェニルチオ基、ｍ－メトキシフェニルチオ基等が挙げられる。
　アリール基は、炭素数が６～４８のアリール基が好ましく、炭素数が６～２４のアリール基がより好ましく、炭素数が６～１４のアリール基がさらに好ましく、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントリル基、ピレニル基、フェナントレニル基、ビフェニル基、フルオレニル基などが挙げられる。
　ヘテロアリール基としては、好ましくは５～７員の置換もしくは無置換、飽和もしくは不飽和、単環もしくは縮環のヘテロ環基の何れでもよい。ヘテロアリール基は、好ましくは、環構成原子が炭素原子、窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選択され、かつ窒素原子、酸素原子および硫黄原子の何れかのヘテロ原子を少なくとも一個有するヘテロアリール基であり、さらに好ましくは、炭素数３～３０の５もしくは６員のヘテロアリール基である。ヘテロアリール基としては、例えば、イミダゾリル基、ピリジル基、キノリル基、フリル基、チエニル基、ベンゾオキサゾリル基、インドリル基、ベンズイミダゾリル基、ベンズチアゾリル基、カルバゾリル基、アゼピニル基等が挙げられる。
　ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子が挙げられる。
　アミノ基としては、アミノ基；モノまたはジメチルアミノ基、モノまたはジエチルアミノ基並びにモノまたはジ（ｎ－プロピル）アミノ基等のアルキル置換アミノ基；モノまたはジフェニルアミノ基並びにモノまたはジナフチルアミノ基等の芳香族残基で置換されたアミノ基；モノアルキルモノフェニルアミノ基等のアルキル基と芳香族残基が一つずつ置換したアミノ基；ベンジルアミノ基、アセチルアミノ基、フェニルアセチルアミノ基等が挙げられる。ここで芳香族残基とは、芳香環から水素原子１個を除いた基を意味する。
　Ｒ１１～Ｒ１９が表す上記した基は、置換基を有していてもよく、上記置換基としては、下記の置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。置換基群Ａの置換基は、置換基群Ａの置換基によりさらに置換されていてもよい。
置換基群Ａ：
スルファモイル基、シアノ基、イソシアノ基、チオシアナト基、イソチオシアナト基、ニトロ基、ニトロシル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、アミド基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、カルバモイル基、アシル基、アルデヒド基、カルボニル基、アリール基、アルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基、エテニル基、エチニル基、シリル基、およびトリアルキルシリル基（トリメチルシリル基等）。
　本発明における粒子の粒径の好ましい範囲は、５０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であり、より好ましい範囲は、６０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下であり、更に好ましい範囲は、７０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である。
　粒子の粒径とは、粒子が蛍光色素を内包している場合においては蛍光色素を内包した粒子（以下、蛍光粒子ともいう）の粒径であってもよく、蛍光色素を内包していない粒子の粒径でもよい。
　粒子および蛍光粒子の平均粒径は、市販の粒度分布計等で計測することが可能である。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。
　粒径範囲及び測定の容易さから、本発明においては動的光散乱法を用いることが好ましい。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装株式会社）、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ－５５０（株式会社　堀場製作所）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ－１０００（大塚電子株式会社）、ＺＥＴＡ　ＳＩＺＥＲ　Ｎａｎｏ　ｓｅｒｉｅｓ（マルバーン社）等が挙げられ、本発明においては、２５℃の測定温度で測定したメジアン径（ｄ＝５０）の値として求める。
　粒子および蛍光粒子の多分散指数（Polydispersity Index：ＰＤＩ）とは、粒径分布の幅を評価するための指数であり、０から１の範囲の値をとる。多分散指数が０の値である場合、径の分布がない理想的な粒径分布を表す。０．１以下のＰＤＩ値を有する分布は単分散であり、０．１から０．３の間の値を有する分散体は、狭い径分布を有すると考えられる。０．５より大きいＰＤＩを有する分散体は、多分散性である。多分散指数は、動的光散乱（Dynamic Light Scattering: DLS）法を使用して得られた値から計算される。本発明において好ましい多分散指数は、０．０００１以上０．２以下であり、より好ましくは０．００１以上０．１５以下であり、更に好ましくは０．００２以上０．１０以下である。
＜生理活性物質＞
　本発明においては、式（１）におけるＲ４で表される生理活性物質反応性基に、生理活性物質を結合させることができる。
　Ｒ４で表される生理活性物質反応性基に結合させる生理活性物質としては、測定対象物質と結合性を有する結合物質（以下、第一の結合物質ともいう）であることが好ましい。第一の結合物質としては、抗原、抗体、またはこれらの複合体を使用できるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、生理活性物質（即ち、第一の結合物質）は抗体である。
　抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ハムスターＩｇＭ、ウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナルまたはモノクローナルのどちらも使用可能である。
　抗体としては、市販の抗体でもよく、あるいは動物血清または培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。例えば、その測定対象物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その測定対象物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られる抗体を用いることができる。
　抗体としては、断片化抗体を使用してもよい。断片化抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。抗体はキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよい。
　Ｒ４で表される生理活性物質反応性基と、生理活性物質（第一の結合物質、例えば、抗体）とを反応させることにより、生理活性物質と、式(１)で表される構造単位を含む共重合体とを結合させることができる。例えば、式(１)で表される構造単位を含む共重合体における活性エステル化したカルボキシル基と、生理活性物質（第一の結合物質、例えば、抗体）が有するアミノ基とを、水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させて結合させる方法を挙げることができる。
＜キット＞
　本発明は、上記した本発明の固相担体と、検出領域を金属膜上に備えた基板（即ち、金属膜と上記金属膜上の検出領域とを含む基板）とを含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットに関する。
　測定対象物質は、生体試料中に存在するものでもよい。生体試料としては、測定対象物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコなど）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、または喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚などを挙げることができる。
　測定対象物質としては、特に限定されないが、例えば、コレステロール、ホルモン（ステロイドホルモン、ペプチドホルモンなど）、タンパク質、胆汁酸、コルチゾールなどが挙げられる。測定対象物質としては、特に好ましくは、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）またはプロゲステロンを挙げることができる。
（基板）
　本発明では、高感度な測定を達成するために、後述する表面プラズモン蛍光（ＳＰＦ）検出を行う測定法を採用することが好ましい。この場合における基板としては、表面に金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、または白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。金を使用する場合、後記する検出領域は、金膜上にある。上記の金属は単独または組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であることが好ましい。
　金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、マグネトロンスパッタ法を含むスパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、または無電解めっき法等によって行うことができるが、基板材質と金属膜との混合層を設けて、金属膜の密着性を良くするためには、スパッタ法により金属膜を作製することが好ましい。この場合、基板材質と金属膜との混合層の厚さは十分な密着性が確保できれば特に制限はないが、１０ｎｍ以下が好ましい。
　金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む。本発明で使用することができる基板の材質としては例えば、一般的な光学ガラスの一種であるＢＫ７（ホウ珪酸ガラス）等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、またはシクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
　ＳＰＦ検出のための基板の好ましい態様としては、ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)に金膜を蒸着した基板などを挙げることができる。
　基板は、測定対象物質または生理活性物質（第一の結合物質）の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を、金属膜上に備えている。
（第二の結合物質）
　第二の結合物質は、測定対象物質と結合性を有する物質であるか、または生理活性物質（第一の結合物質）と結合性を有する物質である。定量をサンドイッチアッセイ法で行う場合には、第二の結合物質として、測定対象物質と結合性を有する物質を使用することができる。定量を競合法で行う場合には、第二の結合物質として、生理活性物質（第一の結合物質）と結合性を有する物質を使用することができる。
　第二の結合物質としては、特に限定されないが、好ましい例としては、抗原、抗体、またはこれらの複合体が挙げられる。第二の結合物質として抗原を用いる場合には、測定対象物質（これは、第一の結合物質と結合性を有する物質である）あるいはそのハプテンを使用することが好ましい。第二の結合物質として、測定対象物質あるいはそのハプテンを使用する場合には、第二の結合物質は、測定対象物質とキャリアとの結合体であることが好ましい。キャリアとは、測定対象物質の複数の分子が結合可能な物質を意味する。好ましいキャリアの一例としては、タンパク質などが挙げられ、その中でも具体的には、ウシ血清アルブミン等を挙げることができる。
　第二の結合物質として抗体を用いる場合、抗体を基板上にある金属膜上に固定する方法としては、物理吸着あるいは共有結合による化学結合の何れの原理も採用することが可能である。また、金属消光を防止する目的で、金属膜上に自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：ＳＡＭ）を形成し、ＳＡＭ膜上に第二の結合物質を固定したりする方法や、更にこのＳＡＭ上にカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）等の親水性高分子層を設け、その親水性高分子層に第二の結合物質を固定したりする方法を利用することもできる。
　自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）とは、代表的には、アルカンチオール化合物を、金を含む金属膜表面に接触、放置した際に、アルカンチオ－ル化合物と金を含む表面が反応して、Ａｕ－Ｓ結合を形成すると共に、アルキル長鎖同士の相互作用によって、金表面に形成される、高い配向性をもつ単分子膜として知られているもので、表面プラズモン共鳴／蛍光や、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ；Ｑｕａｒｔｚ　Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）等の分野で広く利用されているものである。
　ＳＡＭの具体例としては、１－ウンデカンチオールや、１０－カルボキシ－１－デカンチオール、１１－ヒドロキシ－１－ウンデカンチオールからなる膜、あるいはこれらを組み合わせた膜などを挙げることができる。
　上記のＳＡＭ上には、親水性高分子層を設けることが好ましく、この親水性高分子層は、ＳＡＭ上に２次元構造または３次元構造を形成するために設けるものであり、特に３次元構造を設ける場合には、第二の結合物質の固定化を、支持体表面の２次元に限定することなく、基板上の金属膜表面から遊離した３次元空間にまで広げられる親水性高分子層の構造を作製することが可能となる。
　この親水性高分子の具体例としては、ポリサッカライド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸からなる群から選択される少なくとも一種の高分子を挙げることができる。ポリサッカライドとしては、デキストラン、あるいはデキストラン誘導体などの親水性高分子であることが好ましく、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）などのデキストランで構成された親水性高分子層であることが、生体親和性の向上や非特異的な吸着反応の抑制性の向上の観点から好ましい。
　第二の結合物質として抗体を用いる場合、この親水性高分子層に固定化する方法としては、例えば、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）などの反応性官能基を有する高分子が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）、例えば、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などとＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）により活性エステル化し、この活性エステル化したカルボキシル基と、第二の結合物質である抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。
＜検出領域（テストエリア）＞
　本発明においては、基板上に、測定対象物質の有無を検出する検出領域（テストエリア）が設けられている。この検出領域では、例えば測定対象物質である抗原を捕まえて、抗原に結合した標識の量を検出し定量することで、抗原を定量することが可能となる。あるいは、抗原に結合した標識のみを結合できないようにし、抗原に結合していない標識のみを捕獲して、抗原に結合した標識の量を算出する方法により、抗原を定量することが可能となる。
＜キットの他の要素＞
　本発明のキットは、測定対象物質を測定する方法に用いられるものであり、測定対象物質が甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）である場合には、ＴＳＨ測定診断用のキットである。本発明のキットは、測定対象物質の測定を実施するに当たり、本発明の固相担体；および第二の結合物質を有する検出領域を金属膜上に備えた基板を含むものであるが、表面プラズモン励起装置、および蛍光測定デバイスなどの、測定対象物質の測定に使用される各種の器材または装置を含めてもよい。さらに、キットの要素として、既知量の測定対象物質を含む試料、取扱説明書などを含めてもよい。
＜競合法＞
　競合法の一例として、プロゲステロンを定量する場合を以下に説明する。プロゲステロン以外の物質を定量する場合も、同様に実施することができる。
　先ず、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されているプロゲステロン免疫測定用基板に、プロゲステロンを含む生体試料、および蛍光色素と抗プロゲステロン抗体とを有する本発明の固相担体を接触させる。その生体試料中にプロゲステロンが存在しない場合には、固相担体上の抗プロゲステロン抗体と、基板上のプロゲステロン（即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロン）とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中にプロゲステロンが存在する場合には、生体試料中のプロゲステロンと、固相担体上の抗プロゲステロン抗体との間で抗原抗体反応が起こり、固相担体上の抗プロゲステロン抗体と、基板上のプロゲステロン（即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロン）との間の抗原抗体反応が阻害される。上記の反応が終了した後、基板上のアルブミンに結合しなかった、固相担体上の抗プロゲステロン抗体を除去する。次いで基板上の免疫複合体（即ち、固相担体上の抗プロゲステロン抗体と、基板上のプロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロンとの複合体）の形成の度合いを蛍光強度として検出する。上記により、生体試料中のプロゲステロンの濃度などを測定することができる。
　競合法における蛍光の測定形態は、プレートリーダー測定、あるいはフロー測定のいずれかの測定を採用することが可能であり、例えば、以下の方法により測定することができる。予め、プロゲステロン濃度が異なるプロゲステロン量既知の試料を複数用意し、この試料および本発明の固相担体を予め混合する。この混合液を、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている領域に接触させる。プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている領域からの蛍光信号を、特定の時間間隔で混合液が結合体に接触している間、複数の蛍光信号として測定する。この複数の蛍光信号から、各プロゲステロン濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、プロゲステロン濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対するプロゲステロン濃度の関係式を取得する。このように取得した関係式に基づき、検査目的とする生体試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を用いて、生体試料に含まれるプロゲステロン量を定量することができる。
　このプロゲステロン量の定量は、短時間で行うことが好ましい。具体的には、１０分以内に行われることが好ましく、８分以内がより好ましく、更には６分以内で行われることが好ましい。この定量時間には、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて予め取得した蛍光量の時間変化とプロゲステロン濃度との関係式を利用して、試料および蛍光標識抗プロゲステロン抗体を、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている検出領域に接触させてから、検査目的とする生体試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を基に生体試料に含まれるプロゲステロン量を換算する時間が含まれていることが好ましい。
＜サンドイッチ法＞
　サンドイッチ法の一例として、ＴＳＨを定量する場合を以下に説明する。ＴＳＨ以外の物質を定量する場合も、同様に実施することができる。
　先ず、抗ＴＳＨモノクローナル抗体１が固定化されているＴＳＨ免疫測定用基板に、ＴＳＨを含む生体試料、および蛍光色素と抗ＴＳＨ抗体２とを有する本発明の固相担体を接触させる。その生体試料中にＴＳＨが存在する場合には、あらかじめ抗ＴＳＨ抗体２と抗原抗体反応したＴＳＨと、基板上の抗ＴＳＨ抗体１とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中にＴＳＨが存在しない場合には、生体試料と混合した抗ＴＳＨ抗体２と基板上の抗ＴＳＨ抗体１との間で抗原抗体反応が起こらない。上記の反応が終了した後、基板上の抗ＴＳＨ抗体１に結合しなかった抗ＴＳＨ抗体２を除去する。次いで基板上の免疫複合体（即ち、蛍光標識抗ＴＳＨ抗体２とＴＳＨ、基板上の抗ＴＳＨ抗体１との複合体）の形成の度合いを蛍光強度として検出する。上記により、測定対象物質の濃度などを測定することができる。なお、蛍光強度と測定対象物質の濃度は、正の相関関係がある。
（流路）
　本発明の好ましい態様においては、測定対象物質を含む可能性のある生体試料と、本発明の固相担体とを混合した混合液を、基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、生体試料と、本発明の固相担体とが、検出領域まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、生体試料液を点着する点着口、検出領域としての金属膜、および金属膜を超えて流路が存在し、生体試料が、金属膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口を設けることができる。
（表面プラズモン蛍光測定）
　本発明における蛍光などの標識の検出方法としては、特に限定されないが、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、または表面プラズモン励起による蛍光検出（ＳＰＦ）を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。好ましくは、表面プラズモン共鳴による蛍光検出により、測定対象物質の量に関連した標識情報を取得することができる。
　なお、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよい。表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）は、落射励起による蛍光検出法（落射蛍光法）よりも高感度に測定することができる。
　表面プラズモン蛍光（ＳＰＦ）バイオセンサーとしては、例えば、特開２００８－２４９３６１号公報に記載されているような、所定波長の励起光を透過させる材料から形成された光導波路と、この光導波路の一表面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを光導波路に通し、上記光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、上記表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されることによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、を備えたセンサーを用いることができる。
　表面プラズモン励起による蛍光検出（ＳＰＦ）系は、好ましくは、基板上の金属膜上に固定化された測定対象物質の量に依存した蛍光物質からの蛍光を検出するアッセイ方法であり、例えば、溶液中での反応の進行により、光学的な透明度の変化を濁度として検出する、いわゆるラテックス凝集法とは異なる方法である。ラテックス凝集法とは、ラテックス試薬中の抗体感作ラテックスと生体試料中の抗原が、抗体反応により結合し凝集するが、この凝集塊は時間と共に増大し、この凝集塊に近赤外光を照射して得られた単位時間当たりの吸光度変化から、抗原濃度を定量化する方法である。本発明では、ラテックス凝集法に比べて、非常に簡便な測定対象物質の検出方法を提供できる。
　以下に、本発明の実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例に示される材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
　略号は以下の意味を有する。
Ｂｎ：ベンジル
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル
ｔ－Ｂｕ：ｔｅｒｔ－ブチル
ｒ．ｔ．：室温
＜モノマー合成＞
[合成例１]
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
化合物１－Ａの合成
　１００ｍＬ三口ナスフラスコ中においてＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－アスパラギン酸１－ベンジル７００ｍｇとアミノ－ＰＥＧ３－ｔｅｒｔ－ブチルエステル９００ｍｇをメタノール（ＭｅＯＨ）に溶解させた。氷冷下、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）１．０５７ｇを加え、室温で４時間反応させた。反応終了後、溶剤を減圧留去した。残渣を酢酸エチル４０ｍＬに溶解させ、飽和重曹水、飽和塩化アンモニウム水、飽和食塩水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶剤を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（塩化メチレン→塩化メチレン/メタノール＝９６/４）で精製し、化合物１－Ａを１．３４５ｇ、９８％で得た。
化合物１－Ｂの合成
化合物１－Ａ１．３４ｇと１０％Ｐｄ/Ｃ３７０ｍｇにエタノール（ＥｔＯＨ）３０ｍＬを加え、水素雰囲気下、オートクレーブ内25℃で９時間反応させた。反応終了後、Ｐｄ/Ｃをセライトろ過で除去し、溶剤を減圧留去して、化合物１－Ｂを１．１１ｇ、収率９８％で得た。
化合物１－Ｃの合成
５０ｍＬナスフラスコ中において化合物１－Ｂ５７４ｍｇとＮ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミン１８６μＬをメタノール（ＭｅＯＨ）９ｍＬに溶解させた。氷冷下、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）５６３ｍｇを加え、室温で２４時間反応させた。反応終了後、溶剤を減圧留去した。残渣を塩化メチレンに溶解させ、飽和重曹水、飽和塩化アンモニウム水、飽和食塩水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶剤を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（塩化メチレン/メタノール＝８０/２０）で精製し、化合物１－Ｃを４７７ｍｇ、７３％で得た。
化合物１－Ｄの合成
化合物１－Ｃ４７７ｍｇと１，４－ブタンスルトン２３０μＬにアセトニトリル（ＭｅＣＮ）１ｍＬを加え、マイクロウェーブ１００℃で３時間反応させた。溶剤を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル＝９０/１０→水/アセトニトリル＝５０/５０）で精製し、化合物１－Ｄを４２８ｍｇ、収率７２％で得た。
化合物１－Ｅの合成
５０ｍＬナスフラスコ中において化合物１－Ｄ４２８ｍｇを塩化メチレン（ＤＣＭ）６ｍＬに溶解させた。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１．２ｍＬを加え、２４時間反応させた。反応終了後、塩化メチレンとトリフルオロ酢酸を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー（水→水/アセトニトリル＝９０/１０）で精製し、化合物１－Ｅを７８ｍｇ、収率２０％で得た。
化合物１の合成
　５０ｍＬナスフラスコ中において化合物１－Ｅ７８ｍｇとトリエチルアミン（ＴＥＡ）２６μＬを塩化メチレン（ＤＣＭ）２ｍＬに溶解させた。メタクリロイルクロリド１７μＬを加え、１６時間反応させた。反応終了後、溶剤を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル＝９０/１０→水/アセトニトリル＝７０/３０）で精製し、化合物１を５０ｍｇ、収率８０％で得た。
[合成例２]
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　合成例１と同様に、使用する原料を変え化合物２を合成した。
[合成例３]
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　合成例１および２と同様に、使用する原料を変え化合物３を合成した。
[合成例４]
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
化合物４－Ａの合成
　化合物１－Ｃと同様に、使用する原料を変え化合物４－Ａを合成した。
化合物４－Ｂの合成
　化合物１－Ｅと同様に、使用する原料を変え化合物４－Ｂを合成した。
化合物４の合成
　化合物１と同様に、使用する原料を変え化合物４を合成した。
＜蛍光標識抗体の作製＞
[実施例１]
（粒子の作製）
　１Ｌ三口フラスコ中においてドデシル硫酸ナトリウム０．６ｇを超純水４００ｇに溶解させた。窒素下で８５℃まで昇温した後、スチレン３０ｇを加え５分間撹拌した。別容器でペルオキソ二硫酸カリウム１ｇを超純水３０ｇに溶解させ、これを上記三口フラスコに入れ、８５℃で６時間重合した。室温まで冷却した後、ナイロンメッシュＮ－Ｎｏ．２３０Ｔでろ過を行い、核粒子を得た。
　次いで、１００ｍＬ三口ナスフラスコに上記核粒子３０ｇを加え、窒素下で８５℃まで昇温した。スチレン０．５ｇと化合物１（０．２ｇ）を加え５分間撹拌した。別容器でペルオキソ二硫酸カリウム０．０６７ｇを超純水２ｇに溶解させ、これを上記三口フラスコに入れ、８５℃で６時間重合した。室温まで冷却した後、ナイロンメッシュ（Ｎ－Ｎｏ．２３０Ｔ）でろ過を行い遠心分離により粒子を超純水で洗浄し、ポリマー単位構造として化合物１（下記構造）を表面に有する粒子を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（カルボキシル基の含有量測定）
　上記粒子固形分５質量％水分散液２．０ｇを超純水８０ｇで希釈し、さらに１ｍｏｌ／Ｌ塩酸５０μLを加え室温で5分間撹拌した。そこに、ｐＨメータＨＭ－３０Ｒ型（東亜ディーケーケー社製）で電気伝導度を測定しながら０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を滴下した。カルボキシル基の中和される０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液の量を測定し、その結果からカルボキシル基の含有量を算出した。
(蛍光粒子の作製)
１００ｍＬナスフラスコに上記粒子固形分２質量％水分散液７．５ｇとテトラヒドロフラン１．５ｍＬを加え、３０℃で２０分間撹拌した。別容器で３，３’，５，５’－テトラフェニル－メソ－アザ－２，２'－ジピロメテンジフルオロボレート０．９ｍｇをテトラヒドロフラン０．７５ｍＬに溶解させ、これを上記ナスフラスコに入れ、３０℃で３０分間撹拌した。テトラヒドロフランを減圧留去した後、桐山ろ過を行い遠心分離により粒子をＰＢＳ（リン酸生理食塩水、富士フイルム和光純薬社製）（ｐＨ７．６）で洗浄し、蛍光粒子を得た。
（蛍光粒子の粒径および多分散指数測定）
　上記蛍光粒子固形分２質量％水分散液４．０μＬをＰＢＳ（リン酸生理食塩水、富士フイルム和光純薬社製）（ｐＨ７．６）７９６μLで希釈し、ゼータサイザーナノZS（マルバーン社製）で蛍光粒子の粒径および多分散指数を測定した。
（抗体の固定化）
　上記蛍光粒子固形分２質量％水分散液２７５μＬを、５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（２－モルホリノエタノスルホン酸、同仁化学研究所社製）緩衝液(ｐＨ５．６)を８８μＬで希釈し、１０質量％の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）超純水溶液８．８μＬを加え、室温で１５分間撹拌した。その後、０．５ｍｇ／ｍＬの抗ＴＳＨモノクローナル抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ社製：Ａｎｔｉ－ＴＳＨ　Ｍａｂ ＭＡＴ０４－４１０）を１８７μＬ添加し、室温で１時間撹拌し抗体を蛍光粒子に固定化した。固定化後、２ｍｏｌ／Ｌグリシン水溶液を２７．５μＬ加え、１５分間静置し、ブロッキングを行った。反応終了後、遠心分離による精製を行い、抗体結合蛍光粒子を得た。
[実施例２]
　実施例１と同様に、使用するモノマーを化合物２に変え、抗体結合蛍光粒子を得た。
[実施例３]
　実施例１と同様に、使用するモノマーを化合物３に変え、抗体結合蛍光粒子を得た。
[実施例４]
　実施例１と同様に、使用するモノマーを化合物４に変え、抗体結合蛍光粒子を得た。
[比較例１]
（粒子の作製）
　１Ｌ三口フラスコ中においてドデシル硫酸ナトリウム０．６ｇを超純水４００ｇに溶解させた。窒素下で８５℃まで昇温した後、スチレン３０ｇを加え５分間２００ｒｐｍ撹拌した容器でペルオキソ二硫酸カリウム１ｇを超純水３０ｇに溶解させ、これを上記反応容器に入れ、８５℃で６時間重合した。室温まで冷却した後、ナイロンメッシュＮ－Ｎｏ．２３０Ｔでろ過を行い、核粒子を得た。
　次いで、１００ｍＬ三口ナスフラスコに上記核粒子３０ｇを加え、窒素下で８５℃まで昇温した。スチレン０．２５ｇとアクリル酸０．０５ｇと２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（東京化成工業）０．２ｇを加え５分間２００ｒｐｍ撹拌した。別容器でペルオキソ二硫酸カリウム０．０６７ｇを超純水２ｇに溶解させ、これを上記三口ナスフラスコに入れ、８５℃で６時間重合した。室温まで冷却した後、ナイロンメッシュ（Ｎ－Ｎｏ．２３０Ｔ）でろ過を行い遠心分離により粒子を超純水で洗浄し、ポリマー単位構造としてカルボキシル基とホスホリルコリン基（下記構造）を表面に有する粒子を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　以降、実施例１と同様に、上記粒子を使用して、蛍光標識抗体を得た。
＜抗体結合量の評価＞
　上記実施例及び比較例の蛍光標識抗体の作製過程において、遠心分離によって得られた上澄み液に含まれる抗体量をＮＡＮＯＤＲＯＰ　２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製）で定量し、蛍光粒子に固定化した抗体量を算出した。算出に用いた計算式と評価基準を以下に示す。
抗体結合量　＝　（添加した抗体量　（μｇ））－（遠心分離上澄み中の抗体量　（μｇ））／（粒子重量　（ｍｇ））
（抗体結合量）
Ｓ：１００μｇ／ｍｇ以上
Ａ：８０μｇ／ｍｇ以上１００μｇ／ｍｇ未満
Ｂ：６０μｇ／ｍｇ以上８０μｇ／ｍｇ未満
Ｃ：４０μｇ／ｍｇ以上６０μｇ／ｍｇ未満
Ｄ：４０μｇ／ｍｇ未満
＜非特異吸着抑制効果の評価＞
上記実施例及び比較例で得られた蛍光粒子固形分２質量％水分散液５００μＬをＰＢＳ５００μＬで希釈した。この分散液を遠心分離し上澄み９５０μＬを除去した後に、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、富士フイルム和光純薬）ＰＢＳ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を９５０μＬ加えた。超音波で再分散をした後、室温で２時間撹拌しＢＳＡを蛍光粒子に吸着させた。撹拌後、遠心分離し上澄み液に含まれるＢＳＡ量をＮＡＮＯＤＲＯＰ　２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製）で定量し、蛍光粒子に非特異吸着したＢＳＡ量を算出した。算出に用いた計算式と評価基準を以下に示す。
非特異吸着量　＝　（添加したＢＳＡ量　（μｇ））－（遠心分離上澄み中のＢＳＡ量　（μｇ））／（粒子重量　（ｍｇ））
（非特異吸着量）
Ｓ：１０μｇ／ｍｇ未満
Ａ：１０μｇ／ｍｇ以上２０μｇ／ｍｇ未満
Ｂ：２０μｇ／ｍｇ以上３０μｇ／ｍｇ未満
Ｃ：３０μｇ／ｍｇ以上４０μｇ／ｍｇ未満
Ｄ：４０μｇ／ｍｇ以上
＜サンドイッチ法によるＴＳＨ評価＞
　上記蛍光標識抗体を用いて、表面プラズモン共鳴による蛍光検出により生体試料中の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）測定を実施した。
　ＴＳＨを定量する場合を以下に説明する。ＴＳＨ以外の物質を定量する場合も、同様に実施することができる。先ず、抗ＴＳＨモノクローナル抗体１が固定化されているＴＳＨ免疫測定用基板に、ＴＳＨを含む生体試料及び蛍光標識抗ＴＳＨ抗体２を接触させる。その生体試料中にＴＳＨが存在する場合には、あらかじめ蛍光標識した抗ＴＳＨ抗体２と抗原抗体反応したＴＳＨと、基板上の抗ＴＳＨ抗体１とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中にＴＳＨが存在しない場合には、生体試料と混合した蛍光標識抗ＴＳＨ抗体２と基板上の抗ＴＳＨ抗体１との間で抗原抗体反応が起こらない。上記の反応が終了した後、基板上の抗ＴＳＨ抗体１に結合しなかった蛍光標識抗ＴＳＨ抗体２を除去する。次いで基板上の免疫複合体（即ち、蛍光標識抗ＴＳＨ抗体２とＴＳＨ、基板上の抗ＴＳＨ抗体１との複合体）の形成の度合いを蛍光強度として検出する。
（基板作製）
　ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)の基体（三菱レイヨン株式会社製、アクリペット（登録商標）ＶＨ）を準備し、スパッタ法により、厚さ４５ｎｍの金膜を片面に作製し７ｍｍの幅に裁断して、同じ基板を７枚作製した。この基板の金膜表面上に、調製した抗ＴＳＨモノクローナル抗体１（Ｍｅｄｉｘ社製、５４０９）を含む液（濃度：１０μｇ／ｍＬ　ｉｎ　１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）を点着して乾燥させ、抗ＴＳＨ抗体を固定化した基板を作製した。調製した基板を、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、富士フイルム和光純薬社製）を０．０５質量％の濃度で含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４））を予め調製し、この溶液３００μＬを用いて３回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金膜表面上の抗ＴＳＨ抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、１質量％カゼイン（Thermo Scientific社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を３００μＬ添加し、１時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてImmunoassay Stabilizer（ＡＢＩ社製）３００μＬを添加し、室温で３０分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除き、評価用基板を作製した。
（センサチップの作製）
　特開２０１０－１９０８８０号公報の第２の実施形態の構成となるように、流路型センサチップを作製した。その概略図を図１及び図２に示した。図１は、センサチップ１の概略図であり、図２はセンサチップ１の分解図である。センサチップ１は、上部部材２、中間部材３及び基板４から構成されている。上部部材２には、第一の容器５及び第二の容器６が設けられている。なお、第一の容器５及び第二の容器６を併せて、容器群７と称する。基板４には、流路１０が形成されており、流路１０の上には、検出領域８及び参照領域９が形成されている。
（被検試料の準備）
　被検試料として、ＴＳＨ濃度が約０ｎｇ／ｍＬと約０．４ｎｇ／ｍＬのイヌ血清を使用した。イヌ血清は、北山ラベスから購入した東洋ビーグル犬の血清を用意した。
（ＴＳＨ評価）
　上記で調製した蛍光標識抗体を用い、ＩＭＭＵＮＯ　ＡＵ１０Ｖ（富士フイルム社製）にてＴＳＨの測定を実施した。上記で準備した被検試料（イヌ血清）１００μＬと、蛍光標識した抗ＴＳＨ抗体との混合液を調製し、この混合液を１０分間攪拌した。次に、上記で作製した基板を封入した流路型センサチップに蛍光標識抗体と被検試料との混合液をそれぞれ点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液を１０μＬ／ｍｉｎの速度で流下させ、抗ＴＳＨ抗体を固定した金膜面上に接触させてから、蛍光強度を１．５分間継続して測定した。基板において得られた蛍光強度の単位時間における増加速度を求めた。得られた２被検試料の増加速度から、Ｓ／Ｎを求め、相対Ｓ／Ｎを比較した。算出に用いた計算式と評価基準を以下に示す。
Ｓ／Ｎ　＝（ＴＳＨ濃度約０．４ｎｇ／ｍＬ被検試料から得られた増加速度）／（ＴＳＨ濃度約０ｎｇ／ｍＬ被検試料から得られた増加速度）
相対Ｓ／Ｎ　＝（各実施例及び比較例のＳ／Ｎ）／（比較例１のＳ／Ｎ）
（相対Ｓ／Ｎ）
Ｓ：２．０以上
Ａ：１．７以上２．０未満
Ｂ：１．４以上１．７未満
Ｃ：１．１以上１．４未満
Ｄ：１．１未満
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
本発明における実施例１、あるいは実施例２を用いた場合に、抗体結合量と非特異吸着抑制効果が両立でき、高感度で被検試料の検出が可能であることが分かる。
１　センサチップ
２　上部部材
３　中間部材
４　基板
５　第一の容器
６　第二の容器
７　容器群
８　検出領域
９　参照領域
１０　流路

Claims (15)

  1. 下記式(１)で表される構造単位を含む共重合体を含み、前記共重合体が固相の表面に存在する、生理活性物質を担持するための固相担体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基を表す；
    Ｘは－ＮＨ－または－Ｏ－を表す；
    Ｙは－ＮＨ－または－Ｏ－を表す；
    ｍは１～５の整数を示す。
    Ｒ２は、親水性基または下記式（Ｒ－１）で表される基の一方を表す；
    Ｒ３は、親水性基または下記式（Ｒ－１）で表される基の他方を表す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ｎは１～１２の整数を表し、Ｒ４は生理活性物質反応性基を表し、＊はＸまたはＹとの結合位置を表す。
  2. Ｘが－ＮＨ－であり、Ｙが－ＮＨ－である、請求項１に記載の固相担体。
  3. ｍが１または２である、請求項１または２に記載の固相担体。
  4. 前記親水性基が、ベタイン構造、糖構造、アミノ酸構造またはスルホン酸基を有する、請求項１から３の何れか一項に記載の固相担体。
  5. 前記生理活性物質反応性基が、カルボキシル基、活性エステル、イソチオシアネート、エポキシ基、またはマレイミドを有する、請求項１から４の何れか一項に記載の固相担体。
  6. 前記式（Ｒ－１）中のｎが３～６の整数である、請求項１から５の何れか一項に記載の固相担体。
  7. 前記生理活性物質反応性基の含有量が、固相担体の固形分１ｇあたり１～５００μｍｏｌである、請求項１から６の何れか一項に記載の固相担体。
  8. 固相担体の形状が粒子である、請求項１から７の何れか一項に記載の固相担体。
  9. 前記粒子の粒径が５０～３００ｎｍである、請求項８に記載の固相担体。
  10. 前記粒子の粒径の多分散指数が０．００２以上０．１０以下である、請求項８または９に記載の固相担体。
  11. 前記粒子が、蛍光色素を内包している、請求項８から１０の何れか一項に記載の固相担体。
  12. 前記蛍光色素が、アザジピロメテン色素またはジピロメテン色素である、請求項１１に記載の固相担体。
  13. Ｒ４で表される生理活性物質反応性基に生理活性物質が結合している、請求項１から１２の何れか一項に記載の固相担体。
  14. 前記生理活性物質が抗体である、請求項１３に記載の固相担体。
  15. 請求項１から１４の何れか一項に記載の固相担体；および
    検出領域を金属膜上に備えた基板：
    を含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット。
     
     
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