WO2020009424A1 - 류마티스 관절염 치료용 펩티드 및 그의 용도 - Google Patents

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송영욱
이주연
이유진
강민정
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    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • a peptide for the treatment of rheumatoid arthritis and its use is provided.
  • Rheumatoid arthritis is a disease in which chronic, non-bacterial inflammatory reactions occur in the synovial membrane of joints or tendons, causing the synovial membrane to proliferate and the amount of synovial fluid to increase, leading to joint swelling and pain.
  • Rheumatoid arthritis is a systemic inflammatory response that affects many tissues and organs (skin, blood vessels, heart lungs, muscles) in the body, and in particular, causes irreversible proliferative synovitis in the joints, leading to destruction of joint cartilage and joint stiffness do.
  • the cause of rheumatoid arthritis is not yet known, but autoimmune reactions are known to play an important role in the chronic and progression of the disease.
  • T cells play an important role with local release of inflammatory mediators or cytokines, resulting in a sustained autoimmune response that destroys joints.
  • the main symptoms are fatigue, helplessness, pain, etc. As the arthritis progresses, it is accompanied by fever and weakness. In addition, muscle stiffness and muscle atrophy appear near the inflamed joint, affecting joint movement.
  • the main purpose for the treatment of rheumatoid arthritis is to reduce the pain and inflammation of the joint, to prevent the deformation of the joint, and more fundamentally to identify and control the intracellular mechanism of action that causes arthritis.
  • a therapeutic agent that leads to cure has not been developed yet.
  • NSAIDs nonsteroidal anti-inflammatory drugs
  • methotrexate a therapeutic agent having a problem in that side effects are taken for a long time.
  • water-soluble receptors of TNF tumor necrosis factor
  • antibodies to TNF or interleukin 6 receptor and antibodies against CD20, which are central to inflammatory mechanisms, have been produced by genetic recombination technology and developed as a therapeutic agent. Although it has improved a lot, this also has the problem that unexpected side effects such as severe infections, tuberculosis, tumors.
  • One aspect is to provide a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 5, a polynucleotide encoding the same.
  • Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating rheumatoid arthritis, comprising the peptide or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a functional food composition for preventing or improving rheumatoid arthritis comprising the peptide as an active ingredient.
  • Another aspect includes (a) contacting apolipoprotein B100 (apoB100) with a candidate substance to a sample of an individual comprising ENO1 ( ⁇ -enolase); And (b) comparing the binding level between the apolipoprotein B100 and the ENO1 measured in the sample in contact with the candidate with a control not administered with the candidate. .
  • apolipoprotein B100 apoB100
  • ENO1 ⁇ -enolase
  • One aspect provides a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 5, or a polynucleotide encoding the same, for the treatment of rheumatoid arthritis.
  • the term "peptide” refers to a polymer consisting of two or more amino acids linked by an amide bond (or peptide bond), and more specifically, the peptide is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, or It may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the inventors have identified a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 5.
  • said biologically effective activity is at least one selected from the following characteristics: (a) inhibition of inflammatory cytokine secretion; (b) alleviation of inflammatory response by rheumatoid arthritis; and (c) alleviation of pathological symptoms caused by rheumatoid arthritis.
  • the peptide may be used to prevent or treat rheumatoid arthritis. For a purpose which can be utilized.
  • the peptide may be used to obtain better chemical stability, enhanced pharmacological properties (half-life, absorbency, titer, potency, etc.), altered specificity (eg, broader biological activity spectrum), reduced antigenicity,
  • the protecting group may be bonded to the N- or C-terminus.
  • the protecting group may be an acetyl group, fluorenyl methoxy carbonyl group, formyl group, palmitoyl group, myristyl group, stearyl group or polyethylene glycol (PEG), but the modification of the peptide, in particular to enhance the stability of the peptide If it can be contained, it can include without limitation.
  • the N-terminus of the peptide is an acetyl group, a fluorenylmethoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group group), a stearyl group, and polyethylene glycol (PEG) can be combined with any one of the protecting groups selected from the group consisting of; And / or the C-terminus of the peptide may be combined with any one protecting group selected from the group consisting of an amino group (-NH 2 ), and an azide (-NHNH 2 ).
  • stability may mean not only the in vivo stability that protects the peptide of the invention from the attack of protein cleavage enzymes in vivo, but also the storage stability (eg, room temperature storage stability).
  • the peptide may further include amino acid sequences prepared for specific purposes for targeting sequences, tags, and labeled residues.
  • polynucleotide refers to a molecule to which genetic information is linked as a polymer to which nucleotides are bound, wherein the polynucleotide is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 5
  • a peptide consisting of an amino acid sequence of at least about 70%, at least about 75%, at least about 80%, at least about 85%, at least about 90%, at least about 92%, and a polynucleotide sequence encoding the peptide; At least about 95%, at least about 97%, at least about 98%, or at least about 99% sequence homology.
  • homology is intended to indicate a degree of similarity with a wild type amino acid sequence or a polynucleotide sequence, and such comparison of homology can be performed using a comparison program well known in the art. And homology between two or more sequences can be calculated as a percentage.
  • the peptides can be obtained by a variety of methods well known in the art.
  • polynucleotide recombination and protein expression systems can be prepared or synthesized in vitro through chemical synthesis such as peptide synthesis, cell-free protein synthesis, or the like (solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54 (1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd.ed., Pierce Chem. Co .: Rockford, 111 (1984), US Pat. 5,516,891).
  • compositions for preventing or treating rheumatoid arthritis comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 5, or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient.
  • the "peptide”, “polynucleotide” and the like are as described above.
  • prevention may refer to any action that inhibits or delays the onset of rheumatoid arthritis in a subject by administration of a pharmaceutical composition according to one aspect.
  • treatment may refer to any action in which an individual's symptoms for rheumatoid arthritis improve or benefit altered by administration of a pharmaceutical composition according to one aspect.
  • the term “individual” refers to a subject in need of treatment of rheumatoid arthritis, and more specifically to humans or mammals such as non-human primates, mice, dogs, cats, horses, and cattle. It may mean.
  • the peptide inhibits the binding between Epo1 and apoB100 expressed on the surface of monocyte cells in peripheral blood, thereby inhibiting inflammatory cytokines such as IL-1 ⁇ , IL-6, and / or TNF in blood. It was confirmed that the secretion amount of - ⁇ , thereby showing a therapeutic effect of rheumatoid arthritis.
  • the peptide according to one aspect or the polynucleotide encoding the same may be carried in a pharmaceutically acceptable carrier such as colloidal suspension, powder, saline, lipid, liposome, microspheres, or nano spherical particles. . They may be complexed with or related to the vehicle and are known in the art such as lipids, liposomes, microparticles, gold, nanoparticles, polymers, condensation reagents, polysaccharides, polyamino acids, dendrimers, saponins, adsorption enhancing substances or fatty acids It can be delivered in vivo using known delivery systems.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as colloidal suspension, powder, saline, lipid, liposome, microspheres, or nano spherical particles.
  • the pharmaceutical composition is a pharmaceutically acceptable carrier, i.e., lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia, rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, fine Crystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and the like may be further included.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally (eg, applied intramuscularly, intravenously, intraperitoneally, subcutaneously, intradermal, or topically) according to the desired method, and the dosage is determined by the condition of the patient and Depending on body weight, degree of disease, drug form, route of administration and time of day, it may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level refers to the type, severity, and activity of the patient's disease. , Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of the drug, and other factors well known in the medical arts.
  • the pharmaceutical composition according to one aspect may be administered as a separate therapeutic agent or in combination with other anti-inflammatory agents and may be administered simultaneously, separately, or sequentially with conventional anti-inflammatory agents, and may be single or multiple administrations. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be readily determined by one skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition may vary depending on the age, sex, condition, weight of the patient, the absorption of the active ingredient in the body, the inactivation rate, the rate of excretion, the type of disease, the drug used in combination, the route of administration, obesity It may increase or decrease depending on the severity, sex, weight, age, and the like.
  • Another aspect includes administering to a subject a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 5, or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient It provides a method for preventing or treating rheumatoid arthritis.
  • Another aspect provides a health functional food composition for preventing or improving rheumatoid arthritis, comprising as an active ingredient a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 5.
  • the term "improvement” may mean any action that at least reduces the parameters associated with the condition being treated, eg, the degree of symptoms.
  • the health functional food composition may be used simultaneously or separately with a medicament for treatment before or after the onset of the disease for the prevention or improvement of rheumatoid arthritis.
  • the active ingredient may be added to the food as it is or used with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention or improvement).
  • the health functional food composition may be added in an amount of preferably about 15% by weight or less, preferably about 10% by weight or less based on the raw material.
  • the amount may be below the above range.
  • the health functional food composition may contain other ingredients as essential ingredients in addition to containing the active ingredient without particular limitation.
  • various flavors, natural carbohydrates, and the like may be included as additional ingredients, such as ordinary beverages.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, erythritol.
  • natural flavoring agents such as, tauumatin, stevia extract (e.g., Rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) are advantageously used.
  • the proportion of the natural carbohydrate can be appropriately determined by the choice of those skilled in the art.
  • the health functional food composition is a variety of nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic and natural flavors, coloring and neutralizing agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its Salts, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks and the like.
  • nutrients vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic and natural flavors, coloring and neutralizing agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its Salts, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks and the like.
  • vitamins, minerals electrolytes
  • flavors such as synthetic and natural flavors
  • coloring and neutralizing agents cheese, chocolate, etc.
  • Another aspect includes (a) contacting apolipoprotein B100 (apoB100) with a candidate substance to a sample of an individual comprising ENO1 ( ⁇ -enolase); And (b) comparing the binding level between the apolipoprotein B100 and the ENO1 measured in the sample in contact with the candidate with a control not administered with the candidate.
  • apolipoprotein B100 apoB100
  • ENO1 ⁇ -enolase
  • ENO1 ⁇ -enolase
  • ⁇ -enolase a multifunctional protein first identified as a key element of the glycolytic pathway, expressed ubiquitously in cell substrates, and plasminogen-binding receptors. It is known to express on the cell surface.
  • the antibody against ENO1 has been found in a group of patients with autoimmune diseases such as lupus, Crohn's disease, and retinopathy. However, there is no known binding to certain proteins associated with the induction of inflammatory responses in rheumatoid arthritis.
  • sample may include whole blood, serum, plasma, saliva, urine, sputum, lymph, cells, tissues, etc., isolated from an individual, for example, peripheral blood, more specifically, Peripheral blood monocyte cells.
  • Contacting is in the general sense and refers to combining two or more agents (e.g., two polypeptides), or combining an agent and a cell (e.g., proteins and cells), etc. May be referred to. Contact may also occur in vitro. For example, two or more agents can be combined in a test tube or other container, or a test agent can be combined with a cell or cell lysate and the test agent. Contact may also occur in cells or in situ. For example, two polypeptides can be contacted in a cell or cell lysate by coexpression of recombinant polynucleotides encoding the two polypeptides in the cell. It is also possible to use protein chips or protein arrays in which the protein to be tested is arranged on the surface of the stationary phase.
  • a “candidate material” may include any substance, molecule, element, compound, entity, or combination thereof.
  • it may include proteins, polypeptides, small organic molecules, polysaccharides, polynucleotides, and the like. It may also be a natural product, synthetic compound or chemical compound or a combination of two or more substances.
  • the "method of measuring the binding level between apolipoprotein B100 and ENO1" is-hybrid method, co-immunoprecipitation assay, co-localization assay, scintillation proximity assay (scintillation proximity assay) : SPA), UV or chemical crosslinking methods, bimolecular interaction analysis (BIA), mass spectrometry (MS), nuclear magnetic resonance (NMR), fluorescence polarization assays (FPA), and It may be any one or more selected from the group consisting of in vitro pull-down assays.
  • the substance inhibiting the binding between the apolipoprotein B100 and ENO1 significantly reduced the secretion of inflammatory cytokines in the peripheral blood of the rheumatoid arthritis group, and also showed excellent therapeutic efficacy in the animal model of rheumatoid arthritis
  • the binding level between apolipoprotein B100 and ENO1 can be used as an indicator for the development of rheumatoid arthritis treatment.
  • the method may further comprise determining as a therapeutic agent for rheumatoid arthritis when the binding level between the apolipoprotein B100 and ENO1 measured in the sample in contact with the candidate substance is reduced compared to the control.
  • the change in binding level is similar to that of the control or positive control or 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, Reductions of at least 80%, 90% and 100%.
  • the inflammatory cytokine in peripheral blood is significantly reduced, and thus, it can be used to treat inflammation, bone and cartilage tissue erosion, etc. which are all symptoms of rheumatoid arthritis.
  • a screening method it is possible to find a novel therapeutic agent that can significantly reduce the inflammatory response associated with rheumatoid arthritis.
  • Figure 2 is a result of comparing the secretion changes of (A) IL-1 ⁇ , (B) IL-6, and (C) TNF- ⁇ after apoB100 treatment to peripheral blood mononuclear cells isolated from rheumatoid arthritis patients ( HC: normal control group, RA: patient group with rheumatoid arthritis, * p ⁇ 0.05).
  • Figure 4 shows the treatment of peripheral blood mononuclear cells isolated from rheumatoid arthritis patients with ENO1siRNA to inhibit ENO1 expression and after treatment with apoB100, followed by (A) IL-1 ⁇ , (B) IL-6, and (C) TNF-. It is the result of comparing the secretion amount of (consiRNA: control group, ENO1siRNA: group inhibiting ENO1 expression).
  • FIG. 7 shows the results of apoB100 binding to ENO1 in peripheral blood through peptide microarrays.
  • Figure 8 shows the treatment of peripheral blood mononuclear cells isolated from rheumatoid arthritis patients with peptides # 1 to peptide # 5 derived from apoB100, followed by (A) IL-1 ⁇ , (B) IL-6, and (C) TNF- ⁇ . It is a result of comparing the secretion amount of (HC: normal control group, RA: patients with rheumatoid arthritis group, NBP: unbound peptide treatment group, * p ⁇ 0.05, *** p ⁇ 0.001).
  • Figure 9 shows the treatment of CD14 (-) peripheral blood monocytes and CD14 (+) peripheral blood monocytes with peptides # 1 to peptide # 5 derived from apoB100, followed by (A) IL-1 ⁇ , (B) IL-6, And (C) the change in secretion amount of TNF- ⁇ (NBP: unbound peptide treated group, * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001).
  • Figure 10 shows the treatment of inflammatory cytokine secretion peptides (apoB100 # 1, apoB100 # 3, or apoB100 # 5) to peripheral blood mononuclear cells isolated from rheumatoid arthritis patients, (A) IL-1 ⁇ , (B) It is a result of comparing the secretion changes of IL-6 and (C) TNF- ⁇ (NBP: unbound peptide treatment group, * p ⁇ 0.05).
  • FIG. 11 is a (A) ankle thickness of the animal model after treatment with an inflammatory cytokine secretion inhibiting peptide (apoB100 # 1, apoB100 # 3, or apoB100 # 5) in an animal model of K / BxN rheumatoid arthritis. B) Comparison of arthritis index changes.
  • Figure 12 shows the treatment of inflammatory cytokine secretion peptides (apoB100 # 1, apoB100 # 3, or apoB100 # 5) in a K / BxN rheumatoid arthritis animal model, followed by (A) synovial inflammation (B) bone Erosion (bone erosion), (C) cartilage demage (D) leukocyte infiltration.
  • A synovial inflammation
  • B bone Erosion
  • C cartilage demage
  • apolipoprotein B100 selected as a binding ligand of ENO1 ( ⁇ -enolase) through proteomic analysis using secretion and Immunoprecipitation (IP) / mass spectroscopy (MS) method from patients with rheumatoid arthritis
  • IP Immunoprecipitation
  • MS mass spectroscopy
  • ENO1 and apoB100 were bound. As shown in FIG. 3, ENO1 and apoB100 formed relatively strong binding. .
  • ENO1 siRNA was suppressed by treating ENO1 siRNA on peripheral blood mononuclear cells isolated from rheumatoid arthritis patients, it was confirmed that apoB100 treatment increased the secretion of inflammatory cytokines.
  • apoB100 treatment increased the secretion of inflammatory cytokines.
  • the possibility that the LDL present in the bound state with the apoB100 protein is involved in the inflammatory response cannot be excluded. Therefore, the serum of K / BxN mice in LDLR knockout mice and C57BL / 6 wild-type control mice can be excluded.
  • K / BxN serum (Hereinafter referred to as K / BxN serum) and ApoB100 were treated, followed by in vivo changes. Meanwhile, the addition of K / BxN mouse serum serves to induce arthritis through the deposition of autoantibodies present in the K / BxN serum, which is one of the conventional techniques for preparing arthritis animal models by autoimmune response. One.
  • Example 1 on the basis of the experimental results of Example 1, it was intended to derive a peptide that can inhibit the secretion of inflammatory cytokines by inhibiting the binding between ENO1 and apoB100 in peripheral blood. Specifically, as shown in Figure 7, using a peptide microarray confirmed the motif of apoB100 binding to ENO1, a total of five peptides were obtained. Specific information of the peptides is shown in Table 1 below.
  • peripheral blood mononuclear cells obtained from normal and rheumatoid patients were treated with the peptides # 1 to peptide # 5 (apoB100 # 1, apo100 # 2, apoB100 # 3, apoB100 # 4, apoB100 # 5). Afterwards, the secretion changes of IL-1 ⁇ , IL-6, or TNF- ⁇ were compared. On the other hand, as a control group, the non-binding peptide treatment group (NBP) was set, and the results in this example are shown as the average value for each of the rheumatoid patients and six normal patients.
  • NBP non-binding peptide treatment group
  • CD14 (+) peripheral blood monocytes showed similar trends as the results of FIG. 8, but no change was observed in CD14 (-) peripheral blood monocytes. It was confirmed that the binding of ENO1 and apoB100 was closely involved in the reaction of.
  • apoB100 # 1, apoB100 # 3, or apoB100 # 5 could be derived as a peptide for inhibiting inflammatory cytokine secretion.
  • NBP unbound peptide treatment group
  • Induce moderate arthritis by administering K / BxN serum and apoB to the mouse, establish a K / BxN serum transfer arthritis mouse, and then secrete inflammatory cytokines in the animal model. Inhibiting peptides were injected subcutaneously into the lesion site. Thereafter, changes in the ankle thickness and arthritis score following the injection of the peptide were confirmed. In addition, changes in joint fluid inflammation, bone erosion, cartilage damage, and leukocyte infiltration were compared under the same conditions. On the other hand, as a control group, K / BxN serum, apoB, and unbound peptide treated group (NP) were set as the control group treated with K / BxN serum and apoB only.
  • apoB100 # 1, apoB100 # 3, or apoB100 # 5 significantly reduced ankle thickness and arthritis index increased by rheumatoid arthritis.
  • FIG. 12 as in the above result, joint fluid inflammation, bone erosion, cartilage damage, and leukocyte infiltration were reduced by treatment with the peptide.
  • the apoB100 # 1, apoB100 # 3, or apoB100 # 5 can be used as an active ingredient for the treatment of rheumatoid arthritis.

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Abstract

류마티스 관절염 치료용 펩티드 및 그의 용도에 관한 것으로서, 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 펩티드를 포함하는 류마티스 관절염 치료용 약학적 조성물 또는 류마티스 관절염 개선용 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.

Description

류마티스 관절염 치료용 펩티드 및 그의 용도
류마티스 관절염 치료용 펩티드 및 그의 용도에 관한 것이다.
류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis; RA)은 관절이나 힘줄의 활막에 비세균성 염증 반응이 만성적으로 나타나며, 이로 인해 활막이 증식되고 활액의 양이 증가하여 관절의 붓기와 동통을 초래하는 질환이다. 류마티스 관절염은 전신성 염증 반응으로 인체 내 많은 조직과 기관(피부, 혈관, 심장 폐, 근육)들에 영향을 주며, 특히, 관절에 비가역적인 증식성 활막염을 일으켜 관절연골의 파괴와 관절의 강직으로 진행된다. 류마티스 관절염의 원인은 아직 밝혀져 있지 않았으나, 자가면역반응이 이 질환의 만성화와 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 보다 구체적으로, 염증성 매개체 또는 사이토카인의 국소적인 방출과 함께 T 세포가 중요한 역할을 하여, 관절을 파괴시키는 지속적인 자가면역반응이 일어난다. 주요 증상으로는 피로, 무력감, 동통 등이며, 관절염이 진행되면서 발열 및 체력 쇠약을 동반한다. 또한, 염증이 일어난 관절 부근에 근육경직과 근육위축이 나타나 관절의 움직임에 영향을 준다.
류마티스 관절염을 치료하기 위한 주요 목적은 관절의 통증과 염증을 감소시키고, 관절의 변형을 방지할 뿐만 아니라 보다 근본적으로는 관절염을 유발하는 세포내 작용 메카니즘을 밝히고 그 기작을 제어하는데 있다. 그러나 류마티스 관절염의 발병 원인 및 기전에 대한 많은 연구와 그 결과를 이용한 다양한 신약개 개발에도 불구하고(한국공개특허 10-2018-003659), 아직까지 완치에 이르게 하는 치료제는 개발되어 있지 않은 상태이다.
지금까지 알려진 관절염 치료제로는 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDs)(아스피린 이부프로펜), 메토트렉세이트(methotrexate), 레프루노미드(leflunomide), 설파살라진(sulfasalazine), 스테로이드(steroid) 호르몬제 등이 있다. 그러나 이러한 치료제는 장기간 복용시 부작용이 따르는 문제점이 있다. 이에 최근에는 염증 기전의 중심 역할을 하는 TNF(tumor necrosis factor)의 수용성 수용체 혹은 TNF 나 interleukin 6 receptor에 대한 항체, CD20에 대한 항체 등을 유전자 재조합 기술로 생산하고, 이를 치료제로 개발하여 질병의 경과를 많이 호전시킨 바 있으나, 이 역시 중증 감염이나 결핵, 종양 등의 예상치 못했던 부작용이 발생하는 문제점이 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 류마티스 관절염과 관련된 핵심적인 염증 기전을 조절함으로서, 류마티스 관절염의 제반 증상인 염증, 골 및 연골조직의 침식 등을 완화시킬 수 있는 새로운 치료제의 발굴이 필요한 실정이다.
일 양상은 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 펩티드, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 (a) ENO1(α-enolase)를 포함하는 개체의 시료에, 아포지질단백질 B100(apoB100)을 후보 물질과 함께 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질과 접촉된 시료에서 측정된 아포지질단백질 B100과 ENO1간 결합 수준을 후보 물질이 투여되지 않은 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
일 양상은 류마티스 관절염 치료를 위한, 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "펩티드(Peptide)”는 아마이드 결합 (또는 펩티드 결합)으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미하며, 보다 구체적으로, 상기 펩티드는 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 펩티드를 개발하고자 예의 노력한 결과, 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 규명하였다. 여기서, 상기 생물학적으로 유효한 활성은 (a) 염증성 사이토카인의 분비 억제 ; (b) 류마티스 관절염에 의한 염증반응 완화; (c) 류마티스 관절염에 의한 병리적 증상의 완화와 같은 특성으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 나타내는 것일 수 있다. 따라서, 상기 펩티드는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료를 위한 용도로 활용될 수 있다.
또한, 상기 펩티드는 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 상기 펩티드의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 바람직하게, 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 펩티드의 개질, 특히 펩티드의 안정성 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 펩티드의 N-말단은 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있고; 및/또는 상기 펩티드의 C-말단은 아미노기(amino group, -NH2), 및 아자이드(azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있다.
상기 용어, "안정성"은 생체 내 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩티드를 보호하는 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미하는 것일 수 있다.
아울러, 상기 펩티드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기를 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "폴리뉴클레오티드(Polynucleotide)”는 뉴클레오티드가 결합된 중합체로서, 유전 정보를 전달하는 역할하는 분자를 지칭한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 코딩하며, 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 각각 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "상동성(Homology)"은 야생형 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 이러한 상동성의 비교는 당업계에서 널리 알려진 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있으며, 2개 이상의 서열간 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다.
상기 펩티드는 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 폴리뉴클레오티드 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩티드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법, 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984), US 등록특허 제5,516,891호).
다른 양상은 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 "펩티드", 및 "폴리뉴클레오티드"등에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "예방"은 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 류마티스 관절염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "치료"는 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 류마티스 관절염에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "개체"는 류마티스 관절염의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하며, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 펩티드는 말초 혈액 내 단핵구 세포 표면에 발현되어 있는 ENO1과 apoB100간의 결합을 저해함으로써, 염증성 사이토카인, 예를 들어, 혈액 내 IL-1β, IL-6, 및/또는 TNF-α의 분비량을 감소시키고, 이에 따라, 류마티스 관절염 치료 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
한편, 일 양상에 따른 펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres), 또는 나노 구형입자와 같은 약학적으로 허용될 수 있는 담체에 운반될 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 즉, 제제시 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으며, 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 피하, 피내, 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 명세서에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 양상에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 항염증제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 항염증제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있다.
또 다른 양상은 치료학적 유효량의 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 약학적 조성물에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
또 다른 양상은 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.
상기 건강 기능성 식품 조성물에 있어서, 상기 “펩티드”에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들어, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 이때, 상기 건강 기능성 식품 조성물은 류마티스 관절염의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
상기 건강 기능성 식품 조성물에서, 유효성분은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 건강 기능성 식품 조성물은 원료에 대하여 바람직하게 약 15 중량% 이하, 바람직하게는 약 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
상기 건강 기능성 식품 조성물은 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 특별한 제한없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들어, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에도, 일 양상에 따른 건강 기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
또 다른 양상은 (a) ENO1(α-enolase)를 포함하는 개체의 시료에, 아포지질단백질 B100(apoB100)을 후보 물질과 함께 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질과 접촉된 시료에서 측정된 아포지질단백질 B100과 ENO1간 결합 수준을 후보 물질이 투여되지 않은 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된, "ENO1(α-enolase)"은 해당경로(glycolytic pathway)의 핵심 요소로서 최초로 확인된 다기능성 단백질로서, 세포기질에서 편재하여(ubiquitously) 발현되고, 플라스미노겐-결합 리셉터로서 세포 표면에 발현하는 것으로 알려져 있다. 상기 ENO1에 대한 항체는 루푸스, 크론병, 및 망막증과 같은 자가면역질환 환자군에 발견된 바 있다. 그러나, 류마티스 관절염의 염증 반응 유도와 관련된 특정 단백질과의 결합에 대해서는 알려진 바가 없다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "시료"는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 세포, 조직 등을 포함할 수 있고, 예를 들어, 말초 혈액, 보다 구체적으로, 말초 혈액 단핵구 세포일 수 있다.
상기 방법에서, "접촉(Contacting)"은 일반적인 의미이며, 2개 이상의 제제(예를 들어, 2개 폴리펩티드)를 결합시키거나, 제제와 세포(예를 들어, 단백질과 세포)를 결합시키는 것 등을 지칭할 수 있다. 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 시험관(test tube) 또는 다른 컨테이너(container)에서 2개 이상의 제제를 결합시키거나 시험 제제와 세포 또는 세포 용해물과 시험 제제를 결합시킬 수 있다. 또한, 접촉은 세포 또는 인 시투(in situ)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴오티드를 세포 내에서 공동발현(coexpression)시킴으로써 세포 또는 세포 용해물에서 2개의 폴리펩티드를 접촉시킬 수 있다. 또한 테스트하고자 하는 단백질이 고정상의 표면에 배열된 단백질 칩(protein chip)이나 단백질 어레이(protein array)를 이용할 수도 있다
상기 방법에서, “후보 물질”은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 저분자 유기화합물(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함할 수 있다. 또한, 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.
상기 “아포지질단백질 B100과 ENO1간 결합 수준을 측정하는 방법”은 -하이브리드 방법, 공동면역침강 방법(co-immunoprecipitation assay), 공동-국소화 분석(co-localization assay), 섬광 근접 측정법(scintillation proximity assay: SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법, 이분자 상호작용 분석(bimolecular interaction analysis: BIA), 질량 분석법(mass spectrometry: MS), NMR(nuclear magnetic resonance), 형광 편광 분석법(fluorescence polarization assays,FPA) 및 시험관내 풀-다운 에세이(in vitro pull-down assay)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 아포지질단백질 B100과 ENO1간 결합을 저해하는 물질은 류마티스 관절염 환자군의 말초 혈액 내 염증성 사이토카인의 분비량을 유의적으로 감소시켰을 뿐만 아니라, 류마티스 관절염 동물모델에서도 우수한 치료 효능을 보여주였는 바, 아포지질단백질 B100과 ENO1간 결합 수준은 류마티스 관절염 치료제 개발을 위한 지표로 활용될 수 있다.
따라서, 상기 방법은 후보 물질과 접촉된 시료에서 측정된 아포지질단백질 B100과 ENO1간 결합 수준이 대조군에 비해 감소된 경우, 류마티스 관절염의 치료제로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 결합 수준의 변화는 대조군 또는 양성 대조군과 유사한 수준 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 이상 감소하는 것을 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 펩티드에 의하면, 말초 혈액 내 염증성 사이토카인을 유의적으로 감소시키고, 이에 따라, 류마티스 관절염의 제반 증상인 염증, 골 및 연골조직의 침식 등을 치료하는데 이용될 수 있다.
일 양상에 따른 스크리닝하는 방법에 의하면, 류마티스 관절염과 관련된 염증 반응을 유의적으로 감소시킬 수 있는 신규 치료제를 발굴할 수 있다.
도 1은 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 말초 혈액 단핵구 세포의 표면에서 ENO1의 발현을 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 2는 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 말초 혈액 단핵구 세포에 apoB100을 처리한 후, (A) IL-1β, (B) IL-6, 및 (C) TNF-α의 분비량 변화를 비교한 결과이다 (HC: 정상 대조군, RA: 류마티스 관절염 환자군, * p<0.05).
도 3은 ENO1와 apoB100간 결합 여부를 (A) 면역블롯팅, (B) 공초점 현미경, (C) BIACORE 시스템, 및 (D) ELISA 분석을 통하여 확인한 결과이다.
도 4는 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 말초 혈액 단핵구 세포에 ENO1siRNA를 처리하여 ENO1의 발현을 억제시키고 apoB100을 처리한 후, (A) IL-1β, (B) IL-6, 및 (C) TNF-α의 분비량 변화를 비교한 결과이다 (ConsiRNA: 대조군, ENO1siRNA: ENO1 발현 저해군).
도 5는 LDLR 넉아웃 마우스에 apoB100을 처리한 후, (A) 체중, (B) 발목 두께, 및, (C) 관절염 지수 변화를 비교한 결과이다 (LDLR K/O: LDLR 넉아웃 마우스, WT: 야생형 마우스).
도 6은 LDLR 넉아웃 마우스에 apoB100을 처리한 후, (A) IL-1β, (B) IL-6, 및 (C) TNF-α의 분비량 변화를 비교한 결과이다 (LDLR K/O: LDLR 넉아웃 마우스, WT: 야생형 마우스).
도 7은 말초 혈액 내 ENO1와 결합하는 apoB100의 모티프를 펩티드 마이크로 어레이를 통해 확인한 결과이다.
도 8은 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 말초 혈액 단핵구 세포에 apoB100 유래의 펩티드 #1 내지 펩티드 #5를 처리한 후, (A) IL-1β, (B) IL-6, 및 (C) TNF-α의 분비량 변화를 비교한 결과이다(HC: 정상 대조군, RA: 류마티스 관절염 환자군, NBP: 비결합 펩티드 처리군, *p<0.05, ***p<0.001).
도 9는 CD14(-) 말초 혈액 단핵구 세포 및 CD14(+) 말초 혈액 단핵구 세포에 apoB100 유래의 펩티드 #1 내지 펩티드 #5를 처리한 후, (A) IL-1β, (B) IL-6, 및 (C) TNF-α의 분비량 변화를 비교한 결과이다(NBP: 비결합 펩티드 처리군, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 10은 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 말초 혈액 단핵구 세포에 염증성 사이토카인 분비 억제용 펩티드(apoB100 #1, apoB100 #3, 또는 apoB100 #5)를 처리한 후, (A) IL-1β, (B) IL-6, 및 (C) TNF-α의 분비량 변화를 비교한 결과이다(NBP: 비결합 펩티드 처리군, *p<0.05).
도 11은 K/BxN 류마티스 관절염 동물모델에 염증성 사이토카인 분비 억제용 펩티드(apoB100 #1, apoB100 #3, 또는 apoB100 #5)를 처리한 후, 상기 동물모델의 (A) 발목 두께, 및, (B) 관절염 지수 변화를 비교한 결과이다.
도 12는 K/BxN 류마티스 관절염 동물모델에 염증성 사이토카인 분비 억제용 펩티드(apoB100 #1, apoB100 #3, 또는 apoB100 #5)를 처리한 후, (A) 관절막 염증 (synovial inflammation) (B) 골 침식(bone erosion), (C) 연골 손상(cartilage demage) (D) 백혈구 침윤(leukocyte infiltration)을 비교한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. ENO1과 apoB100의 결합이 염증성 사이토카인 분비에 미치는 영향
본 실시예에서는 류마티스 관절염과 말초 혈액 내 단핵구 세포의 ENO1 발현간 관련성을 확인하시하고 이들의 발현을 관찰하였다. 또한, 류마티스 관절염 환자로부터 분고, Immunoprecipitation (IP)/mass spectroscopy (MS) 방법을 이용한 프로테오믹 분석을 통하여 ENO1(α-enolase)의 결합 리간드로 선정된 아포지질단백질 B100(apoB100)과의 결합이 류마티스 관절염 환자의 말초 혈액 내 염증성 사이토카인 분비에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 류마티스 관절염 환자로부터 수득한 단핵구 세포를 대상으로 ENO1 면역 염색을 실리된 말초 혈액 단핵구 세포에 apoB100을 처리한 후, IL-1β, IL-6, TNF-α의 분비량 변화를 비교하였다. 한편, 대조군으로는 정상인으로부터 분리된 세포를 이용한 군(Healthy control: HC)을 설정하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 류마티스 환자의 단핵구의 표면에서 유의적으로 높은 ENO1의 발현이 관찰되었다. 또한, 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 말초 혈액 단핵구 세포에 apoB100을 처리한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α 모두의 분비량이 정상 대조군에 비해 현격하게 증가됨을 확인하였다.
또한, 면역 블롯팅, Biacore 시스템, 공초점 현미경, 및 ELISA를 통하여, ENO1와 apoB100간 결합 여부를 확인한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, ENO1과 apoB100은 상대적으로 강력한 결합을 형성함을 확인할 수 있었다.
이에 따라, 본 실시예에서는 ENO1과 apoB100의 결합이 류마티스 관절염에 의한 염증 반응에 핵심적인 역할을 하는지 여부에 대한 추가적으로 검증을 실시하였다. 우선, 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 말초 혈액 단핵구 세포에 ENO1 siRNA를 처리하여 ENO1의 발현을 억제시킨 경우, 종전과 마찬가지로 apoB100에 처리에 의해 염증성 사이토카인의 분비량이 증가하는지를 확인하였다. 또한, 생체 내에서, apoB100 단백질과 결합되어 있는 상태로 존재하는 LDL이 상기 염증 반응에 관여할 가능성도 배제할 수 없는 바, LDLR 넉아웃 마우스 및 C57BL/6 야생형 대조군 마우스에 K/BxN 마우스의 혈청(이하, K/BxN 혈청으로 명명함.) 및 ApoB100을 처리한 후, 이에 따른 생체 내 변화를 비교하였다. 한편, K/BxN 마우스 혈청의 첨가는, 상기 K/BxN 혈청 내 존재하는 자가 항체의 침착을 통하여 관절염을 유발시키는 역할을 하며, 이는 자가 면역 반응에 의한 관절염 동물 모델을 제조하기 위한 종래의 기술 중 하나이다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 말초 혈액 단핵구 세포의 ENO1 발현을 억제시킨 경우, apoB100 처리에 의한 염증성 사이토카인 분비량의 증가는 관찰되지 않았다. 또한, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 발목 두께, 관절염 지수, 및 염증성 사이토카인 분비량의 변화에 있어서, LDLR 넉아웃 마우스는 대조군과 유사하거나 오히려 더 높은 결과를 확인할 수 있었으며, 이는 상기 염증 반응은 LDL 또는 LDL 수용체와는 무관한 것임을 보여준다.
즉, 이러한 실험결과를 종합해 보면, 류마티스 관절염의 발병과 말초 혈액 내 단핵구 세포의 ENO1 발현은 밀접한 상관 관계에 있으며, 특히, 상기 말초 혈액 내 ENO1과 apoB100의 결합은 해당 질병의 염증 반응에 핵심적인 역할을 함을 나타내는 것이다.
실시예 2. 염증성 사이토카인 분비 억제용 펩티드의 도출
본 실시예에서는 상기 실시예 1의 실험 결과에 기초하여, 말초 혈액 내 ENO1과 apoB100간 결합을 저해함으로써, 염증성 사이토카인의 분비를 억제시킬 수 있는 펩티드를 도출하고자 하였다. 구체적으로, 도 7에 나타낸 바와 같이, 펩티드 마이크로어레이를 이용하여 ENO1과 결합하는 apoB100의 모티프를 확인하고, 총 5종의 펩티드를 수득하였다. 상기 펩티드의 구체적인 정보는 하기 표 1과 같다.
번호 서열 정보 비고
# 1 AICKEQHLFLPF (서열번호 1) 도 7에서 "22"로 표기
# 2 CKEQHLFLPFSY (서열번호 2) 도 7에서 "23"으로 표기
# 3 SYKNKYGMVAQV (서열번호 3) 도 7에서 "28"로 표기
# 4 KNKYGMVAQVTQ (서열번호 4) 도 7에서 "29"로 표기
# 5 TKKMGLAFESTK (서열번호 5) 도 7에서 "44"로 표기
이후, 정상인 및 류마티스 환자로부터 수득한 말초 혈액 단핵구 세포에 상기 펩티드 #1 내지 펩티드 #5 (apoB100 #1, apo100 #2, apoB100 #3, apoB100 #4, apoB100 #5로 명명함.)를 처리한 후, IL-1β, IL-6, 또는 TNF-α의 분비량 변화를 비교하였다. 한편, 대조군으로는 비결합 펩티드 처리군 (NBP)을 설정하였으며, 본 실시예에서의 결과는 류마티스 환자 및 정상인 각각 6명에 대한 평균값으로 나타낸 것이다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 상기와 마찬가지로, 류마티스 관절염 환자에서 IL-1β, IL-6, 또는 TNF-α의 분비량이 정상인(HC)에 비해 유의적으로 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한, apoB100 #2 또는 apoB100 #4를 처리한 경우, 말초 혈액 단핵구 세포의 IL-1β, IL-6, 또는 TNF-α의 분비량이 대조군에 현격하게 증가된 반면, apoB100 #1, apoB100 #3 또는 apoB100 #5를 처리한 경우에는 IL-1β, IL-6, 또는 TNF-α의 분비량이 감소됨을 확인할 수 있었다.
한편, 종전의 연구에서 류마티스 관절염 환자 혈액 내 ENO1의 발현 증가는 대부분 CD14(+) 말초 혈액 단핵구 세포로부터 유래함을 확인한 바 있다. 따라서, 본 실시예에서는 CD14(-) 또는 CD14(+) 말초 혈액 단핵구 세포에 상기 펩티드 #1 내지 펩티드 #5를 처리한 후, IL-1β, IL-6, 또는 TNF-α의 분비량 변화를 비교함으로써, ENO1과 apoB100의 결합이 상기 반응에 관여하는지를 간접적으로 확인하고자 하였다. 한편, 대조군으로는 비결합 펩티드 처리군 (NP)을 설정하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, CD14(+) 말초 혈액 단핵구 세포에서는 상기 도 8의 결과와 유사한 경향을 보여주었으나, CD14(-) 말초 혈액 단핵구 세포에서는 어떠한 변화도 관찰되지 않았는바, 상기의 반응에 ENO1과 apoB100의 결합이 밀접하게 관여함을 재차 확인할 수 있었다.
이러한 실험 결과로부터 염증성 사이토카인 분비 억제용 펩티드로서, apoB100 #1, apoB100 #3, 또는 apoB100 #5를 도출할 수 있었다.
실시예 3. 류마티스 관절염의 치료 효과 검증
본 실시예에서는 상기 실시예 2에의 염증성 사이토카인 분비 억제용 펩티드(apoB100 #1, apoB100 #3, 또는 apoB100 #5)의 류마티스 관절염 치료 효과를 확인하고자 하였다.
3-1. 류마티스 관절염 환자 유래의 말초 혈액에서 염증성 사이토카인 분비 감소
류마티스 관절염 환자 유래의 말초 혈액에 apoB100 #1, apoB100 #3, 또는 apoB100 #5를 처리한 뒤, IL-1β, IL-6, 또는 TNF-α의 분비량 변화를 확인하였다. 대조군으로는 비결합 펩티드 처리군(NBP)을 설정하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, apoB100 #1, apoB100 #3, 또는 apoB100 #5의 처리에 따라 IL-1β, IL-6, 또는 TNF-α의 분비량이 유의적으로 감소하였으며, 이 중에서도 apoB100 #3의 처리에 따른 효과가 가장 우수함을 확인할 수 있었다.
3-2. 류마티스 관절염 동물모델에서 치료 효과 확인
마우스에 K/BxN 혈청과 apoB를 투여하여 중등도의 관절염을 유도하여, K/BxN 류마티스 관절염 동물모델(K/BxN serum transfer arthritis mouse)을 확립한 뒤, 상기 동물모델을 대상으로, 염증성 사이토카인 분비 억제용 펩티드를 병변 부위에 피하 주사하였다. 이후, 상기 펩티드의 주사에 따른 발목 두께(ankle thickness), 및 관절염 지수(arthritis score)의 변화를 확인하였다. 아울러, 상기와 동일한 조건에서 관절액 염증, 골 침식, 연골 손상, 백혈구 침윤의 변화를 비교하였다. 한편, 대조군으로 K/BxN 혈청, 및 apoB 만을 처리한, 비교군으로는 K/BxN 혈청, apoB, 및 비결합 펩티드 처리군(NP)을 설정하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, apoB100 #1, apoB100 #3, 또는 apoB100 #5의 처리는 류마티스 관절염에 의해 증가한 발목 두께 및 관절염 지수를 유의적으로 감소시켰다. 또한, 도 12에 아타낸 바와 같이, 상기 결과와 마찬가지로, 상기 펩티드의 처리에 따라 관절액 염증, 골 침식, 연골 손상, 백혈구 침윤이 감소되었다. 즉, 이러한 결과를 종합해 보면, 상기 apoB100 #1, apoB100 #3, 또는 apoB100 #5는 류마티스 관절염 치료제의 유효 성분으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (12)

  1. 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
  2. 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 조성물은 염증성 사이토카인의 분비를 억제시키는 것인, 약학적 조성물.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-1β(Interleukin-1β), IL-6(Interleukin-6), TNF-α(Tumor necrosis factor-α), 이의 조합으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 펩티드의 N-말단은 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합되거나,
    상기 펩티드의 C-말단은 아미노기(amino group, -NH2), 및 아자이드(azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합되는 것인, 약학적 조성물.
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 조성물은 상기 펩티드이외 다른 항염증제와 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 병용투여되는 것인, 약학적 조성물.
  7. 청구항 2에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  8. 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품 조성물.
  9. (a) ENO1(α-enolase)를 포함하는 개체의 시료에, 아포지질단백질 B100(apoB100)을 후보 물질과 함께 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 후보 물질과 접촉된 시료에서 측정된 아포지질단백질 B100과 ENO1간 결합 수준을 후보 물질이 투여되지 않은 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염 치료제를 스크리닝하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 시료는 혈액 시료인 것인, 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 아포지질단백질 B100과 ENO1간 결합 수준은 투-하이브리드 방법, 공동면역침강 방법(co-immunoprecipitation assay), 공동-국소화 분석(co-localization assay), 섬광 근접 측정법(scintillation proximity assay: SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법, 이분자 상호작용 분석(bimolecular interaction analysis: BIA), 질량 분석법(mass spectrometry: MS), NMR(nuclear magnetic resonance), 형광 편광 분석법(fluorescence polarization assays,FPA) 및 시험관내 풀-다운 에세이(in vitro pull-down assay)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법에 의해 측정되는 것인, 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 후보 물질과 접촉된 시료에서 측정된 아포지질단백질 B100과 ENO1간 결합 수준이 대조군에 비해 감소된 경우, 류마티스 관절염 치료제로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
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